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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL - UFRGS
Avaliação da Influência de Polimorfismos dos Genes do Receptor α
2A
-
Adrenérgico e da Subunidade β
3
da Proteína G nas Dependências de Álcool
e Nicotina e Transtornos Associados
Alexandre Pôrto Prestes
Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da UFRGS como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre
Orientador: Prof. Dr. Claiton H. D. Bau
Porto Alegre
Março de 2006
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2
INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS
As pesquisas foram realizadas no Laboratório de DNA do Departamento de
Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e subvencionadas pelo
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX) e Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
O aluno recebeu bolsa de estudos concedida pelo CNPq.
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3
AGRADECIMENTOS
Agradeço à ajuda prestimosa do meu orientador, Claiton, pela paciência,
altruísmo e dedicação com que sempre me auxiliou.
Agradeço aos colegas da sala 107, pois apesar de ser um “estranho no
ninho”, me acolheram tão bem e de braços abertos.
Agradeço às minhas colegas do grupo de pesquisa, pela ajuda inestimável
para o aprendizado das técnicas de laboratório.
Agradeço aos colegas de mestrado, pela solidariedade e acolhida.
Agradeço a todos os demais professores do departamento, que sempre
foram muito amáveis e gentis.
Agradeço ao pessoal da secretaria, o Elmo, a Elen e a Lúcia, pela
disponibilidade e eficiência.
Agradeço à minha esposa, Karítima, pelo seu carinho, companheirismo e
apoio em todas as circunstâncias.
Agradeço ao meu filho, Thomas, conosco desde julho de 2005, que com
sua tranqüilidade, alegria e esperteza tem sido grande motivo de alegria para nós.
Agradeço a meus pais, irmãs e cunhado, que sempre torceram por mim e
sempre me ajudaram no limite de suas possibilidades.
Agradeço aos meus sogros, pelos cuidados excepcionais que têm tido para
com a nossa prole.
Agradeço ao apoio dos amigos, que não foram poucos.
Agradeço a Deus, pela vida afortunada que tem me proporcionado.
4
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................ 05
ABSTRACT ......................................................................................................... 06
1INTRODUÇÃO . ................................................................................................. 07
1.1 Considerações Iniciais . ....................................................................... 07
1.1.1 Álcool ..................................................................................... 07
1.1.2 Nicotina .................................................................................. 07
1.2 Definições ........................................................................................... 08
1.3 Epidemiologia ...................................................................................... 10
1.3.1 Álcool ..................................................................................... 10
1.3.2 Nicotina .................................................................................. 11
1.4 Neurobiologia da Dependência - Recompensa Cerebral ..................... 13
1.5 Estudos Genéticos ............................................................................... 14
1.5.1 Estudos em Famílias .............................................................. 14
1.5.2 Estudos em Gêmeos .............................................................. 14
1.5.3 Estudos de Adoção ................................................................ 15
1.6 Estudos Moleculares ........................................................................... 16
1.7 Receptor α
2A
-Adrenérgico ................................................................... 20
1.8 Subunidade β
3
da Proteínas G ............................................................ 24
2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 28
3 PRELIMINARY EVIDENCE THAT THE ADRA2A C-1291G POLYMORPHISM
INFLUENCES NICOTINE DEPENDENCE ………………………………………… 29
4 THE GNB3 C825T POLYMORPHISM AND DEPRESSION AMONG SUBJECTS
WITH ALCOHOL DEPENDENCE …………………………………………………… 46
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 69
ANEXOS .............................................................................................................. 82
5
RESUMO
Transtornos por uso de álcool e nicotina apresentam alta prevalência e estão
entre os principais problemas de saúde pública. Na presente dissertação foram
estudadas possíveis associações envolvendo os polimorfismos C-1291G do gene
do receptor α
2A
-adrenérgico (ADRA2A) e C825T do gene da subunidade β
3
da
proteína G (GNB3) em amostras de indivíduos com (i) dependências de álcool e
nicotina, (N
ADRA2A
= 110; N
GNB3
= 109), dependência específica de nicotina
(N
ADRA2A
= 121; N
GNB3
= 117) e (iii) controles (N
ADRA2A
= 114; N
GNB3
= 108). Na
amostra de indivíduos com dependência de álcool também foram investigadas
possíveis associações destes polimorfismos com outros transtornos mentais
comórbidos. O DNA dos indivíduos foi amplificado através de reação em cadeia
de polimerase, e os produtos clivados com enzimas de restrição específicas. A
genotipagem foi realizada por eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida.
Foi verificada uma associação entre o alelo G do polimorfismo C-1291G do gene
ADRA2A com a dependência de nicotina (χ2= 7,18; p= 0,007). Não foram
detectadas diferenças nas freqüências alélicas e genotípicas quanto ao
polimorfismo C825T do gene GNB3 nos indivíduos com ou sem dependência. No
entanto, os indivíduos com dependência de álcool e transtorno depressivo maior
associado apresentaram maior freqüência do genótipo heterozigoto (χ
2
= 12,34; p=
0,002). Ambos os resultados positivos são consistentes com evidências obtidas
em estudos prévios.
6
ABSTRACT
Alcohol and nicotine use disorders have high prevalence and are among the most
important health problems in the world. In the present study we studied possible
associations between the C-1291G polymorphism of the α
2A
-adrenergic receptor
gene (ADRA2A) and C825T polymorphism of the G-protein β
3
subunit
gene
(GNB3) in samples of individuals with (i) alcohol and nicotine dependencies
(N
ADRA2A
= 110; N
GNB3
= 109), (ii) nicotine dependence only (N
ADRA2A
= 121; N
GNB3
=
117) and (iii) non-dependent controls (N
ADRA2A
= 114; N
GNB3
= 108). In the sample of
individuals with alcohol dependence, we also investigated possible associations of
these polymorphisms with other comorbid mental disorders. The subjects’ DNA
was amplified by the polymerase chain reaction. Products were digested with the
specific restriction enzymes and genotyped by electrophoresis in polyacrylamide
or agarose gels. The results showed an association between the G allele of the
ADRA2A C-1291G polymorphism and nicotine dependence (χ2= 7.18; p= 0.007).
No differences were found in allele and genotype frequencies of the GNB3 C825T
polymorphism between subjects with or without dependencies. However,
individuals with alcohol dependence and comorbid major depressive disorder
presented a higher frequency of the heterozygous genotype (χ
2
= 12.34; p= 0.002).
Both positive results are consistent with evidences obtained in previous studies.
7
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Iniciais
1.1.1 Álcool
O etanol, álcool etílico, ou simplesmente álcool para os propósitos do
presente trabalho, é uma substância psicoativa que faz parte da civilização desde
a antigüidade (Hoffman, 2001). Na mitologia grega as figuras de Dionísio, Icário e
o Rei Anfictião representam exemplos da visão da cultura helênica sobre o vinho
(Bulfinch, 2001).
O álcool apresenta uma grande aceitação social e mesmo religiosa. Nos
dias de hoje, é prática de muitas famílias a iniciação de crianças no consumo de
bebidas alcoólicas (Best e cols., 2001). O amplo uso e os prejuízos físicos,
psiquiátricos e sociais decorrentes dos transtornos relacionados ao etanol é um
dos principais problemas de saúde pública das sociedades modernas (Meloni e
Laranjeira, 2004). No entanto, embora amplamente utilizado na cultura ocidental,
a maioria das pessoas não desenvolve transtornos relacionados ao álcool (Grant
e cols., 2004a).
1.1.2 Nicotina
A Nicotina, alcalóide derivado das folhas de tabaco pertencentes à família
Nicotiana tabacum, é uma substância psicoativa com grande potencial de
dependência (Jain e Mukherjee, 2003).
8
O tabaco é originário das Américas e conhecido há cerca de oito mil anos
pela maioria das culturas que habitavam o continente no período pré-colombiano.
Foi introduzido na Europa após os Grandes Descobrimentos luso-espanhóis,
utilizado para fins medicinais e recreacionais durante os séculos XVIII e XIX e
popularizado mundialmente durante o século XX (Moyer, 2005). Por mais que se
soubesse dos malefícios causados pelo cigarro, através de relatos de casos e da
propaganda antitabagista movida pelos proibicionistas desde o final do século
XIX, a ciência pouco se interessou pelo tabagismo na primeira metade do século
XX. Os primeiros estudos epidemiológicos acerca do tabagismo só apareceram a
partir de 1950, e as propriedades de dependência e os prejuízos físicos
ocasionados foram estabelecidos definitivamente apenas a partir da segunda
metade do século XX (Henningfield e cols., 2004).
O tabaco é considerado a segunda maior causa de mortes no mundo.
Trata-se também da maior causa prevenível de morte (Murray, 2006).
1.2 Definições
Os transtornos relacionados ao álcool e à nicotina estão descritos nas duas
principais classificações de transtornos mentais em uso atualmente: a
Classificação Internacional de Doenças – 10ª. Edição (CID-10), da Organização
Mundial de Saúde (World Health Organization, 1992), e o “Diagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition” (DSM-IV), da Associação
Americana de Psiquiatria (American Psychiatric Association, 1994). Estas
classificações foram desenvolvidas para melhorar a comunicação para fins
9
clínicos, de pesquisa e estatísticos. Os elaboradores das duas classificações
trabalharam em estreita colaboração e os termos e códigos foram considerados
completamente compatíveis. No ano de 2000 foi feita uma revisão no texto do
DSM-IV, chamada de DSM-IV-TR (Text Revision) (American Psychiatric
Association, 2000), mas os critérios diagnósticos permaneceram os mesmos.
Segundo o DSM-IV-TR, os transtornos relacionados a substâncias são
divididos em dois grupos: transtornos por uso e transtornos induzidos por
substância. Quanto ao etanol, os transtornos por uso de álcool são a dependência
e o abuso. Os transtornos induzidos pelo álcool incluem quadros de intoxicação,
abstinência, delirium, demência persistente, transtorno amnéstico persistente,
transtorno psicótico, transtorno do humor, transtorno de ansiedade, disfunção
sexual e transtorno do sono. No caso da nicotina, a dependência é o transtorno
por uso de substância e a abstinência é o transtorno induzido pela mesma.
A característica principal da dependência de uma substância segundo o
DSM-IV-TR consiste na presença de um agrupamento de sintomas cognitivos,
comportamentais e fisiológicos indicando que um indivíduo continua utilizando
uma substância, apesar de problemas significativos relacionados a ela. Existe um
padrão de auto-administração repetida que geralmente resulta em tolerância,
abstinência e comportamento compulsivo de consumo da substância (Anexo 1).
A síndrome de dependência de uma substância psicoativa, segundo a CID-
10, caracteriza-se por um conjunto de fenômenos fisiológicos, comportamentais e
cognitivos, no qual o uso de uma substância ou uma classe de substâncias
alcança uma prioridade muito maior para um determinado indivíduo que outros
comportamentos que antes tinham maior valor. Uma característica descritiva
10
central da síndrome de dependência é o desejo (freqüentemente forte, algumas
vezes irresistível) de consumir drogas psicoativas (as quais podem ou não ter sido
medicamente prescritas), álcool ou tabaco. Pode haver evidência de que o retorno
ao uso da substância após um período de abstinência leve a um reaparecimento
mais rápido de outros aspectos da síndrome do que o que ocorre com indivíduos
não dependentes (Anexo 2).
O presente trabalho se concentrou nas condições de dependência de
álcool e nicotina, segundo os critérios do DSM-IV-TR.
1.3 Epidemiologia
1.3.1 Álcool
O número de norte-americanos adultos que apresentam abuso ou
dependência de álcool cresceu de 13,8 milhões (7,41%) em 1991-1992 para 17,6
milhões (8,46%) em 2001-2002, de acordo com os resultados do “National
Epidemiologic Survey on Alcohol and Related Conditions” (NESARC) 2001-2002.
Os novos dados revelam que a taxa de abuso de álcool aumentou de 3,03% para
4,65% através da década, enquanto que a taxa de dependência de álcool caiu de
4,38% para 3,81% (Grant e cols., 2004a).
O abuso e a dependência de álcool são mais comuns em indivíduos do
sexo masculino, com a razão de homens para mulheres chegando a 5:1
(American Psychiatric Association, 2000).
Padrões de uso de álcool e prevalência de problemas relacionados ao
álcool variam entre os grupos étnicos. Além dos fatores genéticos, outros
11
elementos que podem contribuir para as diferenças étnicas são as tradições
sociais ou culturais (Galvan e Caetano., 2003). Tais diferenças caracterizam a
quantidade, freqüência e padrão de consumo alcoólico nos diversos países do
mundo (Bloomfield e cols., 2003).
Quanto à prevalência de dependência de álcool no Brasil, em 2001 foi
realizado um estudo domiciliar com uma amostra de 8589 indivíduos maiores de
12 anos, procedentes de 107 cidades brasileiras com mais de 200 mil habitantes
(Carlini e cols., 2002). A prevalência de indivíduos portadores de dependência de
álcool foi de 11,2% para a população geral, ocorrendo a maior taxa (15,5%) na
faixa de 18 a 24 anos. Nesta pesquisa também foi evidenciada diferença entre os
sexos, sendo que o percentual de dependência foi de 17,1% para o sexo
masculino e 5,7% para o feminino. A prevalência de dependentes foi mais alta
nas regiões Norte e Nordeste, com porcentagens acima dos 16% na população
geral. Na região Sul a porcentagem de indivíduos com dependência foi de 9,5%.
Um fato preocupante nesta pesquisa foi a observação de que, no Brasil, 48,3%
dos adolescentes entre 12 e 17 anos já haviam utilizado bebidas alcoólicas e
5,2% apresentavam dependência de álcool, sendo que na região Sul a
porcentagem de dependentes foi de 4,5%.
1.3.2 Nicotina
A prevalência do hábito de fumar está diminuindo nos países
desenvolvidos, mas aumentando naqueles em desenvolvimento. A prevalência
mais alta de uso de nicotina ocorre entre indivíduos mais velhos, ao contrário de
12
outras substâncias psicoativas. A prevalência do hábito de fumar é levemente
maior nos homens do que nas mulheres (American Psychiatric Association, 2000).
Nos Estados Unidos, em 2001, uma pesquisa com 4414 indivíduos entre
15 e 54 anos de idade demonstrou uma prevalência para toda a vida para
dependência de nicotina de 24% (Breslau e cols., 2001). Outra pesquisa com
43.093 indivíduos demonstrou uma prevalência ponto de 12,8% (intervalo de
confiança a 95% de 12,0 a 13,6%) para dependência de nicotina na população
geral desse país (Grant e cols., 2004b).
Segundo dados do I Levantamento Domiciliar sobre o Uso de Drogas no
Brasil – 2001 (Carlini e cols., 2002) estima-se que 41,1%, da população brasileira
(46,2% dos homens e 36,3% das mulheres), com idade entre 12 e 65 anos, já
usaram tabaco ao menos uma vez na vida. A prevalência encontrada de
indivíduos com dependência de nicotina nas 107 cidades do Brasil com mais de
200 mil habitantes foi de 10,1% para homens e 7,9% para mulheres.
Outros dados sobre o uso de tabaco foram obtidos pelo Inquérito Domiciliar
sobre Comportamentos de Risco e Morbidade Referida de Doenças e Agravos
Não Transmissíveis, do Instituto Nacional do Câncer (INCA), vinculado ao
Ministério da Saúde, nos anos de 2002 e 2003 (Ministério da Saúde, 2003). A
pesquisa revelou que as cidades brasileiras mais industrializadas foram as que
apresentaram maiores taxas de uso de tabaco. A prevalência de fumantes
regulares na população de 15 anos ou mais variou de 12,9% em Aracaju a 25,2%
em Porto Alegre. A pesquisa estimou também que a proporção de homens que
fumam regularmente é superior à das mulheres. A faixa etária de maior consumo
regular de cigarros é a de pessoas com idade superior a 24 anos. Indivíduos com
13
menor escolaridade (ensino fundamental incompleto) também foram os que
apresentaram consumo regular mais elevado.
1.4 Neurobiologia da Dependência - Recompensa Cerebral
O sistema de recompensa cerebral está presente desde os mamíferos
mais primitivos. Ele tem participação fundamental na busca de estímulos
causadores de prazer, tais como alimentos, sexo e relaxamento. Por meio do
reforço positivo da recompensa, obtida durante essas experiências, o organismo é
impelido a buscá-las repetidas vezes, criando-se uma memória específica para
isso. O sistema de recompensa, desse modo, é um importante mecanismo de
autopreservação (Esch e Stefano, 2004).
O sistema límbico, área tegmental ventral e o nucleus accumbens são as
regiões cerebrais relacionadas com o mecanismo de recompensa, sendo a
dopamina o principal neurotransmissor desse mecanismo (Vetulani, 2001). No
entanto, outros sistemas neurotransmissores podem contribuir sobre os
mecanismos de recompensa, possivelmente por interferência sobre a
neurotranmissão dopaminérgica (Stahl, 2000). O trato mesolímbico-mesocortical é
a via dopaminérgica relacionada à recompensa (Kiyatkin, 1995).
Diferentemente de um estímulo prazeroso natural, que leva posteriormente
à saciedade, o uso de substâncias psicoativas tende a produzir uma busca
adicional do estímulo. Assim, a dependência de substâncias em indivíduos
predispostos pode ser considerada uma doença do sistema de recompensa
cerebral (Vetulani, 2001).
14
1.5 Estudos Genéticos
1.5.1 Estudos em Famílias
Os estudos em famílias vêm demonstrando a agregação familiar nas
dependências de álcool e nicotina, encontrando aumento de três a quatro vezes
na prevalência em parentes de primeiro grau de dependentes quando comparado
a indivíduos da população geral (Bierut e cols., 1998; Tyndale, 2003). Além disso,
outras condições psiquiátricas que apresentam comorbidade com as
dependências de álcool e nicotina (Kessler, 1995; Dani e Harris, 2005), como
transtorno de humor, transtornos de ansiedade e personalidade anti-social,
também apresentam recorrência familiar (Edwards e Lader, 1994).
1.5.2 Estudos em Gêmeos
As taxas de concordância de transtornos por uso de álcool são maiores em
gêmeos monozigóticos do que em gêmeos dizigóticos (O’Brien, 2001). Por
exemplo, Hrubec e Omenn (1981) avaliaram 7962 pares de gêmeos do sexo
masculino, verificando uma concordância para o alcoolismo em gêmeos
monozigóticos de 26,3% e em gêmeos dizigóticos de 11,9%. Koskenvuo e cols.
(1984) obtiveram resultados semelhantes, com concordância de alcoolismo de
23,1% em gêmeos monozigóticos e de 10,8% em gêmeos dizigóticos. As
estimativas de herdabilidade no conjunto de estudos variam de 40 a 60% (Messas
e Vallada, 2004). Estudos em gêmeos e de adoções têm indicado
consistentemente uma contribuição genética substancial para o início e
15
continuação do hábito de fumar, com estimativa de herdabilidade variando de
46% a 84% (Carmelli e cols., 1992; Batra e cols., 2003). Uma revisão de 14
estudos de gêmeos estimou que os fatores genéticos contribuem com 56% da
variância para o início e uso regular do tabaco (Sullivan e Kendler, 1999). Um
estudo encontrou evidências para uma vulnerabilidade comum para dependências
de álcool e nicotina no sexo masculino (True e cols., 1999).
Os estudos em gêmeos para dependência de outras substâncias também
apresentaram resultados positivos, com estimativas de herdabilidade variando de
30% para sedativos em mulheres (Van den Bree e cols., 1998) a 79% para abuso
de cocaína em mulheres (Kendler e Prescott, 1998).
1.5.3 Estudos de Adoção
Vários estudos de adoção demonstraram que as dependências de álcool e
de nicotina apresentam uma influência genética importante (Li, 2003). Goodwin e
cols. (1973) foram um dos primeiros grupos a utilizar esta abordagem, tendo
demonstrado que crianças separadas de seus pais biológicos, quando adultas,
apresentavam um risco maior de alcoolismo do que um grupo controle de
adotados cujos pais biológicos não eram dependentes de álcool. O estudo de
adoção de Bohman (1978) avaliou o abuso de álcool em uma amostra de 2324
adotados, nascidos em Estocolmo entre 1930 e 1949, que foram colocados em
lares adotivos antes da idade de 3 anos. Os adotados do sexo masculino com
pais e mães biológicos diagnosticados como portadores de abuso de álcool
tinham maior probabilidade de ser considerados como apresentando o mesmo
problema. Posteriormente Cloninger e cols. (1981) reexaminaram e ampliaram os
16
dados de Bohman (1978), concluindo pela existência de dois tipos de alcoolismo:
um de início tardio, usualmente leve, que apareceria tanto em homens quanto em
mulheres e predominantemente influenciado pelo meio, e outro de início precoce,
limitado ao sexo masculino, com alta herdabilidade e que tenderia a ser de
intensidade moderada a grave.
Quanto à nicotina, os estudos de gêmeos e de adoção demonstraram alta
predisposição genética tanto para o início quanto para a persistência do hábito de
fumar (Sullivan e Kendler, 1999).
Em 1995 Cadoret e cols. demonstraram que o abuso ou a dependência de
substância podem ser transmitidos por duas vias genéticas diferentes: uma via
direta, proveniente de pais biológicos com diagnóstico de transtornos por uso de
substância, e outra indireta, em que indivíduos com pais biológicos com
diagnóstico de transtorno de personalidade anti-social têm maior probabilidade de
também apresentarem agressividade, transtorno de conduta e personalidade anti-
social, condições estas que predispõem para abuso e dependência de
substâncias.
1.6 Estudos Moleculares
Com base nos estudos genéticos clássicos, que encontraram evidências da
contribuição genética nos transtornos por uso de álcool, têm sido realizados
estudos moleculares em genes candidatos para a predisposição a esses
transtornos. O sistema dopaminérgico tem merecido destaque nos estudos
moleculares devido ao sistema de recompensa cerebral (Kiyatkin, 1995; Vetulani,
17
2001). Alguns estudos têm encontrado associação de determinados
polimorfismos em receptores dopaminérgicos com transtornos por uso de
substâncias.
Blum e cols. (1990) encontraram uma associação entre o alelo TaqIA1 do
gene do receptor dopaminérgico D
2
(DRD2) e o alcoolismo, fazendo com que a
associação entre alelos desse gene e dependência de substâncias passasse a
ser muito estudada. Foram realizados trabalhos semelhantes sobre a
dependência de álcool em outros centros, mas os resultados iniciais não foram
replicados (Bolos e cols., 1990; Gelernter e cols., 1991). Em uma meta-análise
compreendendo 15 estudos americanos e europeus, num total de 1015 indivíduos
portadores de alcoolismo e 898 controles, Noble (1998a) encontrou uma
prevalência três vezes maior do alelo A1 desse gene em indivíduos com
dependência grave de álcool, em relação a controles, ao passo que nenhuma
diferença foi observada entre os controles e indivíduos com dependência leve de
álcool. Igualmente, encontraram associação entre uma outra variante, o alelo B1,
e dependência de álcool. Noble e cols. (1991), analisando sujeitos com
diagnóstico de abuso de álcool ou outras substâncias, encontraram evidência de
metabolismo regional cerebral de glicose reduzido em portadores do alelo A1
desse receptor em áreas envolvidas no sistema de recompensa cerebral, como o
nucleus accumbens, ou reguladoras de função frontal, como o córtex pré-frontal.
Em outro artigo, Noble e cols. (1994) relataram associação do alelo A1 com o
hábito de fumar. No entanto, outros dois artigos não observaram associação entre
este polimorfismo e dependência de nicotina (Singleton e cols., 1998; Bierut e
18
cols., 2000), sugerindo que esta associação não seja tão forte como referida pelos
trabalhos iniciais.
Bau e cols. (2000), estudando a mesma amostra de homens brasileiros de
ascendência caucasóide a ser utilizada no presente trabalho, também
identificaram uma maior prevalência do alelo TaqIA1 do gene DRD2 em
indivíduos com dependência de álcool quando comparados com controles. Além
disso, esse estudo também identificou uma interação entre presença de alelo A1
com o estresse e evitação de dano influenciando na intensidade dos sintomas de
dependência fisiológica ao álcool. Posteriormente, o mesmo grupo (Freire e cols.,
2006) analisou separadamente as dependências de álcool e nicotina combinadas,
dependência de nicotina isolada e um grupo de controles normais. Eles
verificaram que a associação observada previamente (Bau e cols., 2000)
envolvendo o alelo TaqIA1 poderia ser explicada pela dependência de nicotina,
associada ou não ao alcoolismo.
Quanto ao gene do receptor dopaminérgico D
4
(DRD4), a maioria dos
estudos, incluindo Parsian e cols. (1997) e Luciano e cols. (2004) não
encontraram associação entre polimorfismos neste gene e alcoolismo. Um estudo
com a presente amostra de indivíduos brasileiros também não demonstrou
associação entre alelos de um VNTR no éxon 3 do gene DRD4 e susceptibilidade
ao alcoolismo (Roman e cols., 1999). Por outro lado, Kottler e cols. (1997)
verificaram uma associação entre os alelos longos do VNTR e dependência de
opióides, enquanto que Shields e cols. (1998) encontraram que, considerando
apenas os indivíduos afro-americanos, aqueles com pelo menos um alelo longo
apresentavam menor idade de início e maior predisposição para o hábito de
19
fumar. Bau e cols (2001) realizaram um estudo envolvendo o mesmo VNTR e um
outro polimorfismo de VNTR na região 3’ do gene da proteína transportadora da
dopamina (DAT1). Os autores encontraram uma interação entre genótipos
contendo o alelo de 7 repetições do DRD4 e homozigotos 10/10 para o DAT1 com
procura de novidades na predição do consumo de álcool em indivíduos com
dependência.
Também foram realizadas investigações de polimorfismos com os outros
subtipos de receptores dopaminérgicos. Thome e cols. (1999) encontraram uma
associação entre um polimorfismo do receptor dopaminérgico D
3
(DRD3) em
pacientes com dependência de álcool em relação a controles, enquanto Parsian e
cols. (1997) não encontraram nenhuma associação. Vanyukov e cols. (1998)
avaliaram o gene do receptor dopaminérgico D
5
(DRD5) para uma possível
associação entre um polimorfismo do gene e abuso de substâncias, mediado pelo
traço de personalidade de busca de novidade. Eles obtiveram um achado positivo
para o sexo feminino, sugerindo diferentes vias de vulnerabilidade entre os sexos.
Outros genes relacionados com o transporte e metabolismo da dopamina,
como os genes do transportador de dopamina (DAT1), tirosina hidroxilase (TH),
dopamina β-hidroxilase (DBH), catecol-O-metiltransferase (COMT),
monoaminoxidase A (MAOA) e monoaminoxidase B (MAOB) também têm sido
estudados para transtornos por uso de álcool e nicotina, com resultados
controversos (Batra e cols., 2003; Freire e cols., 2005; Contini e cols., no prelo).
Além dos genes relacionados à dopamina, também têm sido investigados
genes de outros sistemas neurotransmissores quanto à associação com
transtornos por uso de substâncias. Noble e cols. (1998b) encontraram uma
20
menor prevalência do alelo GABRB3-G1 do gene da subunidade β
3
do receptor
gabaérgico (GABRB3) em dependentes graves do álcool, quando comparados a
controles sem o fenótipo. Em outro trabalho, Schuckit e cols. (1999) investigaram
a interação de diferentes sistemas na gênese de um traço de vulnerabilidade à
dependência de álcool chamado nível de resposta. Eles encontraram associações
com baixo nível de resposta e maior prevalência de dependência de álcool
envolvendo o genótipo LL em um polimorfismo na região promotora do gene do
transportador de serotonina (5-HTT) e o polimorfismo Pro/Ser do gene do receptor
gabaérgico α
6
(GABRA6).
1.7 Receptor α
2A
-Adrenérgico
Os receptores de noradrenalina e adrenalina são referidos simplesmente
como adrenérgicos. De maneira geral, os receptores adrenérgicos são divididos
em receptores α
1
, α
2
e β−adrenérgicos, cada um apresentando 3 subtipos,
diferenciados por suas propriedades farmacológicas e sua distribuição (Sadock e
Sadock, 2003). Os receptores α
2
adrenérgicos são subdivididos em α
2A
, α
2B
e α
2C
,
com base nos padrões de ligação do neurotransmissor e nas propriedades
fisiológicas. Todos os subtipos dos receptores α
2
-adrenérgicos afetam os mesmos
sistemas efetores, isto é, inibição da adenilciclase, ativação dos canais de K
+
operados pelos receptores e inibição dos canais de Ca
++
sensíveis à voltagem
(Hoffman, 2001).
Os receptores adrenérgicos, assim como os dopaminérgicos, pertencem a
uma família de receptores chamados receptores 7TM, assim chamados por
21
apresentarem uma estrutura de sete hélices transmembrana (Lefkowitz, 2000). Os
receptores 7TM fazem parte da via de transmissão de sinal de várias funções
biológicas e apresentam como característica adicional a acoplagem de proteínas
G (Berg e cols., 2002).
O sistema adrenérgico participa da neuromodulação e regulação
endócrina. Entre outras funções, é fundamental para a resposta comportamental
de luta ou fuga em situações de estresse. Ao nível central, a maior parte da
noradrenalina é produzida por neurônios cujos corpos celulares estão localizados
no locus ceruleus. As projeções noradrenérgicas vão principalmente para
estruturas do sistema límbico, córtex frontal e hipotálamo (Wong-Riley, 2000).
Além disso, a noradrenalina é o principal neurotransmissor do sistema nervoso
simpático.
Os receptores α
2
-adrenérgicos desempenham importante papel na
regulação da atividade do sistema nervoso simpático (Altman e cols., 1999). A
ativação dos receptores α
2
na região pontobulbar do SNC inibe a atividade do
sistema nervoso simpático e provoca queda da pressão arterial (Hoffman, 2001).
Em indivíduos que apresentam uso prolongado de álcool, a síndrome de
abstinência é esperada, com intensidades variáveis, toda vez que a alcoolemia
cai. O quadro inclui hiperatividade autonômica, tremores, insônia, ansiedade,
agitação psicomotora e, em casos graves, convulsões (Soibelman e cols., 2004).
Os sintomas e a intensidade da abstinência são determinados pela quantidade e
duração do consumo de álcool (Fleming e cols., 2001). No entanto, diferenças
genéticas para tolerância e abstinência têm sido identificadas em camundongos
(Crabbe e cols., 1999). As mudanças fisiológicas que levam à síndrome de
22
abstinência são resultado de várias adaptações no sistema nervoso central. Por
exemplo, o aumento da função dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA)
glutamatérgicos e a diminuição da influência inibitória dos receptores gabaérgicos
pela ingestão crônica de álcool contribuem para a hiperexcitabilidade e
neurotoxicidade do sistema nervoso central durante a abstinência alcoólica
(Tabakoff e Hoffman, 1996; Chandler e cols., 1998). Por outro lado, alterações na
liberação de catecolaminas levam a um estado hiperadrenérgico, provocando
uma série de sintomas autonômicos. O uso prolongado de álcool provoca uma
redução no número de receptores pré-sinápticos α
2
-adrenérgicos, gerando como
conseqüência uma resposta hiperadrenérgica em caso de abstinência (Erwin e
cols., 1998). A clonidina, um agonista α
2
-adrenérgico, tem sido utilizada como
terapia coadjuvante para diminuir os sintomas autonômicos da abstinência de
álcool (Kosten e O'Connor, 2003). Considerando a influência do álcool sobre o
receptor α
2
-adrenérgico e a contribuição deste no sistema simpático, podemos
supor que polimorfismos neste receptor também possam influir em pelo menos
alguns sintomas de abstinência de álcool. Isso poderia ser importante para uma
previsão de cuidados clínicos para indivíduos com abstinência.
Além disso, devido à freqüente comorbidade entre transtornos por uso de
álcool e transtornos depressivos, é possível que uma vulnerabilidade genética
comum possa estar presente. Quanto ao humor, existem muitas evidências sobre
a contribuição do sistema noradrenérgico. A forte correlação demonstrada entre a
regulação para baixo dos receptores β-adrenérgicos e a resposta clínica aos
antidepressivos é provavelmente o dado mais convincente indicando uma função
direta do sistema noradrenérgico na depressão (Sadock e Sadock, 2003). A
23
eficácia clínica de medicamentos antidepressivos com efeitos noradrenérgicos,
como os tricíclicos, também reforça a função da noradrenalina na fisiopatologia da
depressão (Schatzberg e cols., 1997). Além disso, sabe-se que o anti-hipertensivo
reserpina, que acarreta depleção de monoaminas, induz sintomas depressivos
importantes em 10 a 20 % dos pacientes. Outra evidência que reforça a hipótese
da contribuição do sistema noradrenérgico na depressão é a de que em pelo
menos um subgrupo de pacientes deprimidos é possível encontrar diminuição dos
níveis urinários de 3-metoxi-4-hidroxi-fenilglicol (MHPG) - um metabólito da
noradrenalina, que parece refletir a taxa de renovação da noradrenalina cerebral
(Graeff e Brandão, 1993). Outra evidência é de que certos polimorfismos do gene
que codifica a enzima tirosina hidroxilase, fator limitante na síntese de
noradrenalina e dopamina, têm sido implicados com uma maior vulnerabilidade
para transtornos do humor (Persson e cols., 1997; Serretti e cols., 1998).
O gene do receptor α
2A
-adrenérgico (ADRA2A) mostrou-se associado a
escores mais elevados de desatenção em crianças com transtorno de déficit de
atenção e hiperatividade (Roman e cols., 2003; 2006). Considerando que esse
transtorno apresenta também comorbidade com transtornos por uso de álcool e
nicotina, sendo um de seus fatores predisponentes (Comings e cols., 1996;
Biederman e cols., 2006a), é possível que o gene ADRA2A esteja envolvido na
predisposição para a dependência destas substâncias.
Além da relação do ADRA2A com outras condições psiquiátricas
comórbidas, existem trabalhos demonstrando associação entre este receptor e
consumo de etanol. Hu e cols. (1993) demonstraram que o álcool interfere na
regulação de expressão gênica do receptor α
2A
-adrenérgico. Em outro trabalho,
24
os dados sugerem uma relação entre polimorfismos do gene desse receptor e
dependência de álcool (Feng e cols., 1998). Diferenças entre polimorfismos do
gene ADRA2A também foram implicadas com escores de memória, irritabilidade e
impulsividade (Comings e cols., 2000).
O gene ADRA2A codifica o receptor α
2A
-adrenérgico e está localizado no
cromossomo 10q23-25 (Garenc e cols., 2002). A referência da seqüência no
NCBI é AF281308. Na presente dissertação foi estudado um polimorfismo de sítio
de restrição MspI na região promotora, devido a uma transversão C para G na
posição -1291 (Lario e cols., 1997). A presença do sítio de restrição MspI na
posição -1291 determina o alelo G. A ausência desse sítio corresponde ao alelo
C.
Com base nestas evidências da literatura, um dos focos da presente
dissertação foi a avaliação deste polimorfismo na região promotora do gene
ADRA2A em indivíduos com diagnóstico de dependência de álcool e nicotina.
1.8 Subunidade β
3
da Proteína G
Proteínas G são uma família de proteínas de estruturas similares que se
encontram ligadas ao trifosfato de guanosina (GTP) ou ao difosfato de guanosina
(GDP). Estas proteínas interagem com receptores 7TM mencionados
anteriormente, incluindo os receptores adrenérgicos e dopaminérgicos (Sadock e
Sadock, 2003). As proteínas G são heterotrímeros constituídas de subunidades
chamadas α, β e γ. A subunidade α é que se liga ao nucleotídeo, sendo GDP no
estado não ativado e GTP no estado ativado. A ligação do neurotransmissor ao
25
receptor 7TM leva à substituição de GDP por GTP na subunidade α, fazendo com
que ela se dissocie do dímero β−γ. A dissociação do heterotrímero da proteína G
em subunidade α+GTP e dímero β−γ transmite a informação de que o receptor
está ligado ao seu ligante. Assim, as proteínas G são os intermediários na
transmissão de sinais procedentes dos receptores 7TM (Berg e cols., 2002).
As subunidades da proteína G são codificadas, em células de mamíferos,
por famílias de genes relacionados. As subunidades α são codificadas por 16
genes, as subunidades β por 5 genes e as subunidades γ por 12 genes (Downes
e Gautam, 1999).
Tem sido considerada a possibilidade de que vias anormais de transdução
de sinais intracelulares possam estar implicadas na patogênese dos transtornos
psiquiátricos. As proteínas G são elementos essenciais na regulação da
transmissão dos sinais dos receptores de neurotransmissores para as proteínas
efetoras intracelulares. Existe uma hipótese de que pelo menos alguns casos de
depressão poderiam ocorrer devido a uma deficiência pseudomonoaminérgica, ou
seja, uma deficiência da transdução do sinal do neurotransmissor
monoaminérgico até o núcleo do neurônio pós-sináptico, na presença de
quantidades normais de neurotransmissor e receptores (Stahl, 2000). A
deficiência nos eventos moleculares subseqüentes, a partir da ocupação dos
receptores pelo neurotransmissor, poderia levar a uma resposta celular deficiente.
A deficiência no funcionamento de sinalização intracelular tem sido descrita
em determinadas doenças endócrinas como o hipoparatireoidoismo (deficiência
do hormônio paratiroidiano), pseudohipoparatireoidismo (receptores
paratireoidianos deficientes, mas níveis do hormônio paratireoidiano normais) e
26
pseudopseudohipoparatireoidismo (deficiência da transdução de sinal levando ao
estado clínico de hipoparatireiodismo, apesar dos níveis normais do hormônio e
dos receptores) (Vilar e cols., 2001). Quanto à patologia endócrina, o
pseudohipoparatireiodismo tipo I tem sido considerado um exemplo bem
caracterizado de uma doença devido a uma mutação de um gene de subunidade
de proteína G, no caso GNAS1, responsável pela codificação de uma subunidade
α (Carter e cols., 1987).
A dopamina é o principal neurotransmissor do sistema de recompensa
cerebral (Kiyatkin, 1995; Vetulani, 2001). Os 5 receptores dopaminérgicos
atualmente conhecidos são receptores 7TM, utilizando-se da acoplagem de
proteínas G para a transdução do sinal pós-sináptico (Berg e cols, 2002).
Portanto, é possível que variações na ação da proteína G tenham influência no
sistema de recompensa cerebral.
A subunidade β
3
da proteína G é um polipeptídeo de 340 aminoácidos,
sendo codificada pelo GNB3, mapeado no cromossomo 12p13 no genoma
humano (Downes e Gautam, 1999). O gene GNB3 já foi totalmente caracterizado,
tendo 7,5 kb e sendo composto por 11 éxons e 10 íntrons (Rosskopf e cols.,
2000). Sua descrição encontra-se no NCBI com o número de acesso AY631872.
É provável que muitas mutações em subunidades da proteína G sejam
letais, devido à função central destas proteínas na fisiologia dos mamíferos. Por
outro lado, têm sido encontrados polimorfismos em populações humanas. Uma
variação interessante devido ao seu significado funcional foi descrita por Siffert e
cols. (1995), que identificaram uma mutação de ponto de citosina para timina na
posição 825 do cDNA, correspondente ao éxon 9 do gene que codifica a
27
subunidade β
3
(GNB3). O alelo T deste polimorfismo está associado ao splicing
alternativo Gβ3s, o qual, embora tenha uma deleção de 41 aminoácidos, é
funcionalmente ativo e relacionado ao aumento da transdução de sinal pela
proteína G (Siffert e cols., 1998). Diferentes estudos têm demonstrado que o alelo
T desse gene encontra-se associado à hipertensão essencial (Beige e cols., 1999;
Dong e cols., 1999). Existem também alguns estudos que sugerem relação entre
este polimorfismo e obesidade (Siffert e cols, 1999). Um trabalho apresentou
evidência de associação entre o alelo T do gene GNB3 e depressão sazonal
(Willeit e cols., 2003), enquanto outro demonstrou uma associação entre este
alelo com transtornos do humor e como indicador de resposta ao tratamento
antidepressivo (Zill e cols., 2000). No entanto, outros dois estudos não
encontraram associação entre este polimorfismo e transtornos do humor (Lin e
cols, 2001; Kunugi e cols, 2002). As freqüências alélicas do polimorfismo C825T
do gene GNB3, em amostra da população geral da cidade Porto Alegre
correspondem a 0,67 para o alelo C e 0,33 para o alelo T (Mattevi e cols., 2006).
Com base neste conjunto de dados, o polimorfismo C825T do gene GNB3
também foi estudado na presente dissertação.
28
2 OBJETIVOS
Como mencionado na introdução, as dependências de substâncias têm
etiologia multifatorial e se desenvolvem a partir de uma predisposição genética
envolvendo a participação de muitos genes, sob influência do ambiente. O estudo
de variações genéticas com efeito plausível sobre as dependências, e com efeito
funcional já estabelecido (como o polimorfismo C825T do gene GNB3) ou já
implicadas em outros transtornos psiquiátricos (como o C-1291G do gene
ADRA2A) apresenta uma probabilidade razoável de associação, justificando esse
tipo de estudo. Para tornar a abordagem ainda mais consistente, investigamos
também outros transtornos psiquiátricos associados, como a depressão maior,
previamente sugerida como associada ao polimorfismo C825T do gene GNB3.
Assim, os objetivos do presente trabalho são:
• Comparar as freqüências alélicas e genotípicas dos polimorfismos C825T do
gene GNB3 e o polimorfismo C-1291G do gene ADRA2A em indivíduos com
dependência combinada de álcool e nicotina, dependência exclusiva de nicotina
e controles brasileiros não dependentes;
• Avaliar a possível associação entre os polimorfismos estudados e o transtorno
depressivo maior e outras comorbidades em pacientes com dependência de
álcool.
29
3 PRELIMINARY EVIDENCE THAT THE ADRA2A C-1291G POLYMORPHISM
INFLUENCES NICOTINE DEPENDENCE
Manuscrito em preparação para ser submetido à revista American Journal of
Medical Genetics
30
Preliminary Evidence that the ADRA2A C-1291G Polymorphism Influences
Nicotine Dependence
Alexandre P. Prestes, Francine Z. C. Marques, Mara H. Hutz, Tatiana Roman,
Claiton H. D. Bau
Department of Genetics, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
RS, Brazil; Department of Morphological Sciences, Federal School of Medical
Sciences, Porto Alegre, RS, Brazil
Running title: ADRA2A C-1291G Polymorphism and Nicotine Dependence
Correspondence to Claiton H. D. Bau, Departamento de Genética, Instituto de
Biociências, UFRGS, Caixa Postal 15053, 91501-970 Porto Alegre, RS, Brazil.
Tel: (55) 51 3316 6718 Fax: (55) 51 3316 7311
E-mail: claiton.bau@ufrgs.br
Funding sources: CNPq, FAPERGS, PRONEX
31
Abstract
The aim of the present study is to test for possible associations
between the C-1291G polymorphism in the alpha2A-adrenergic receptor
gene (ADRA2A) with alcohol and nicotine dependencies. The genotype and
allele frequencies were compared in three groups of European-derived
Brazilians: individuals with combined alcohol and nicotine dependencies
(N=110), with nicotine dependence only (N=121) and controls (N=114). The
frequency of the G allele was higher in the group with both dependencies,
intermediate among subjects with nicotine dependence only, and lower
among controls (χ
2
= 8.00; p= 0.02). The χ
2
partitioning did not reveal
significant differences between the groups with alcohol and nicotine
dependencies and nicotine dependence only (χ
2
= 0.82; p= 0.36). However,
combining these groups, the difference to the non-smoking controls is
higher than the one observed in the whole-groups analysis (χ
2
= 7.18; p=
0.007). The results suggest a role for the ADRA2A C-1291G polymorphism,
notably the G allele, in nicotine dependence. The influence of the ADRA2A
gene in nicotine and other substance dependencies should be more
extensively assessed in future studies.
Key-words: adrenergic, norepinephrine, tobacco, addiction
32
INTRODUCTION
Nicotine, the main addictive substance in tobacco, has a very high potential
to cause dependence, comparable to heroin and cocaine (Straub et al., 1999).
Furthermore, tobacco use carries considerable health risks, specially related to
cancer and cardiovascular diseases (Centers for Disease Control and Prevention,
2002).
Data from family, adoption and twin studies have consistently shown a
substantial genetic component in the smoking habit, with heritability estimates
varying from 46% to 84% (Batra et al., 2003). Interestingly, the heritability of
nicotine and alcohol dependencies are partly shared (True et al., 1999)
The brain reward system is strongly related to dependencies, and dopamine
is its main neurotransmitter (Marsden, 2006; Picciotto and Corrigall, 2002). The
mesolimbic dopaminergic projection from the ventral tegmental area is a part of
the brain reward system related to the nicotine-induced positive reinforcement
(Johnson et al., 2005). Moreover, the ventral tegmental area also receives
noradrenergic projections from the locus coeruleus (Vetulani, 2001). It is
noteworthy that nicotine increases norepinephrine release in several regions of the
SNC (Picciotto and Corrigall, 2002), including the locus coeruleus (Stein et al.,
1998; Fu et al. 1998a,b). Therefore, the nicotine-induced norepinephrine release
could also influence the brain reward system.
Medications with predominantly noradrenergic activity have been used in
nicotine dependence treatment (Foulds et al., 2004; George and O’Malley, 2004).
The selective norepinephrine reuptake inhibitor reboxetine attenuates nicotine self-
administration in animal models (Rauhut et al., 2002). Bupropion, a first line
33
nicotine treatment medication (Hughes et al., 2005), is proposed to act through
multiple systems, including the adrenergic inhibition in the locus coeruleus (Cryan
et al., 2003). Nortriptyline, a predominantly noradrenergic antidepressant drug, has
also been effective in the treatment of nicotine dependence (Foulds et al., 2004;
Hughes et al., 2005).
There are also evidences that the alpha2-adrenergic self-receptors are
remarkably down-regulated in smokers (Klimek et al., 2001). Indeed, the alpha2-
adrenergic receptor agonists clonidine and guanfacine are effective in reducing
nicotine abstinence symptoms (Gourlay et al., 2004). This receptor is codified by
the alpha2A-adrenergic receptor gene (ADRA2A), a small, intronless gene
mapped to 10q24-26. The ADRA2A gene has a promoter region single nucleotide
polymorphism (SNP), namely C-1291G (rs 1800544), that has been associated
with higher inattention scores in children with attention-deficit/hyperactivity
disorder (Roman et al., 2003, 2006) and increased scores of irritability and
impulsivity (Comings et al., 2000), conditions with substantial comorbidity with
substance dependencies (Kollins et al., 2005). An additional suggestion for the
possible contribution of this gene in smoking is the presence of a linkage signal for
nicotine dependence in a region of chromosome 10, close to the ADRA2A locus
(Straub et al., 1999; Uhl et al., 2001; Uhl, 2004). The aim of the present study is to
test for possible associations between the C-1291G polymorphism in the ADRA2A
gene with alcohol and nicotine dependencies.
34
MATERIALS AND METHODS
Subjects
This study compared the genotype and allele frequencies in three groups of
European-derived Brazilians: individuals with combined alcohol and nicotine
dependencies (N=110), with nicotine dependence only (N=121) and controls
(N=114). All these samples were ascertained in Porto Alegre, the capital of Brazil’s
southernmost state, Rio Grande do Sul. Differently from Brazil as a whole, the
population of Rio Grande do Sul is composed mainly of people from European
ancestry (82%). For this reason, the possibility of bias due to population
stratification is smaller (Dornelles et al., 1999). All the individuals evaluated were
males.
The sample with both dependencies was assessed in a specialized
alcoholism treatment ward. The diagnosis of alcohol dependence followed DSM-IV
criteria (American Psychiatric Association, 2000), and interviews were performed
with the Semi-Structured Assessment for the Genetics in Alcoholism (SSAGA)
(Bucholz et al., 1994). In this sample, 28 individuals presented other substance
abuse (mostly Cannabis, followed by cocaine), 20 had antisocial personality and
44 had major depressive disorder. Other psychiatric disorders were either not
assessed or were too infrequent.
A group of 232 individuals (121 non-alcoholic smokers and 114 non-
smoking controls) was assessed in a blood bank. This sample was designed to be
non-screened, representative of the gene frequencies of individuals from
European descent in Porto Alegre. These individuals are replacement donors, that
is, they are people that replaced the blood used by a hospitalized family member
35
or friend. For this reason, a behavior-related bias is not likely. The criterion for
smoking in the alcoholic and non-alcoholic samples was daily use for at least one
month. Daily smoking is strongly related to nicotine dependence, since it usually
starts when dependence is already established (Mayhew et al., 2000, Wellman et
al., 2004). For this reason, we consider that these individuals fulfilled DSM-IV
criteria for nicotine dependence.
Written informed consent was obtained from every subject. The study
protocol was approved by the institutional ethical committees.
Laboratory Methods
High molecular weight genomic DNA was isolated from total blood
lymphocytes following the salting-out method described by Lahiri and Nurnberger
(1991). The region of ADRA2A gene including the C-1291G polymorphism was
amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) with primers and protocols
described by Lario et al. (1997) and Roman et al. (2003). The 522 bp fragments
originated in PCR reactions were digested with the MspI restriction endonuclease,
since the transversion C→G creates a MspI restriction site. After this procedure,
four constant fragments (5, 62, 116 and 165 bp) were obtained. The ‘C’ allele was
defined by a polymorphic band of 174 bp, characterized by the absence of MspI
site at -1291 position. The presence of a guanine in this location creates a MspI
restriction site, breaking the 174 bp fragment in bands of 121 and 53 bp and
defining the ‘G’ allele. The fragments resultant from endonuclease digestion were
subjected to electrophoresis in 10% polyacrylamide gels, stained with ethidium
bromide and visualized under UV light.
36
Statistical Analyses
The analyses of Hardy-Weinberg equilibrium and comparisons among
individuals with combined alcohol and nicotine dependencies, nicotine
dependence only and controls were performed using the chi-square test. The
comparison between alcohol dependent patients with or without comorbid
disorders was also performed with the chi-square test.
RESULTS
The three samples were in Hardy-Weinberg equilibrium for the C-1291G
polymorphism. Allele and genotype frequencies for all three samples are
presented in Table I. The frequency of the G allele was higher in the group with
both dependencies, intermediate among subjects with nicotine dependence only,
and lower among controls (χ
2
= 8.00; p= 0.02). The χ
2
partitioning did not reveal
significant differences between the group with alcohol and nicotine dependencies
and the group with nicotine dependence only (χ
2
= 0.82; p= 0.36). However,
combining these groups, the difference to the non-smoking controls is more
significant than the one observed in the whole-groups analysis (χ
2
= 7.18; p=
0.007).
There was no significant association between the C-1291G polymorphism
and comorbid disorders (other substance abuse, antisocial personality and major
depressive disorder) in the sample of patients with alcohol and nicotine
dependencies.
37
DISCUSSION
The results of the present study suggested an involvement of the alpha2A-
adrenergic receptor gene in nicotine dependence in a Brazilian sample. The
frequency of the G allele of the C-1291G polymorphism was significantly higher
among individuals with alcohol and nicotine dependences and individuals with
nicotine dependence only, compared to controls.
Although there are no previous investigations in the literature with ADRA2A
gene and nicotine dependence, evidences from some molecular studies give
support to our findings. Two genome scan studies revealed that there are some
consecutive markers at chromosome 10 very close to ADRA2A that yield small but
positive results of linkage to a dichotomous outcome of nicotine dependence
(Straub et al., 1999; Uhl et al., 2001; Uhl, 2004; Sullivan et al., 2004). Thus, our
results represent the first association study to confirm the linkage signal in
chromosome 10 (10q24-26) with nicotine dependence.
At least two neurobiological mechanisms could explain the association
presented in this study between a noradrenergic receptor gene and nicotine
dependence. The first would be a contribution of the noradrenergic system in the
nicotine dependence, through the brain reward system. The ventral tegmental
area, which is related to the brain reward system, receives noradrenergic
projections from the locus coeruleus (Vetulani, 2001), while nicotine increases
norepinephrine release in the locus coeruleus (Stein et al., 1998; Fu et al.,
1998a,b). The second possibility is that, in addition to reward, a possible reason
for smoking initiation might be the improvement of cognitive and mood states.
Nicotine improves vigilance and concentration (Jain and Mukherjee, 2003) and
38
mediate ‘calming’ effects (Fu et al., 1998a). Nicotine increases attention in
individuals with attention-deficit/hyperactivity disorder, a condition highly
associated with substance dependencies (Kollins et al., 2005). Interestingly, the G
allele was also associated with significantly higher inattention scores in probands
with attention-deficit/hyperactivity disorder (Roman et al., 2003, 2006; Park et al.,
2004).
The functional effect of the C-1291G polymorphism of the ADRA2A gene
has been suggested in physiological studies, since carriers of the genotypes differ
in the distribution of body fat, glucose and insulin levels and cortisol response to
dexamethasone test (Rosmond et al., 2002). This transversion has also been
speculated to change the density of alpha2A-adrenergic receptors in the
membrane of noradrenergic neurons (Garenc et al., 2002). However, the
association observed in our study might be due to the effect of another
polymorphism in linkage disequilibrium with the C-1291G. Belfer et al. (2005)
showed that there is a single haplotype block that captures the signal of any
functional polymorphism in ADRA2A gene. This haplotype includes the
polymorphism investigated here (C-1291G), but eight other SNPs are also
comprised, thus making difficult to this point to determine which variant per se is
contributing to the functionality of ADRA2A locus. Nevertheless, the C-1291G
polymorphism seems to represent most of the haplotype variation in ADRA2A
(Park et al., 2004; Belfer et al., 2005). Genotyping other polymorphisms would
generate additional potentially relevant haplotypes, but their frequencies would be
too small for the analysis with the present sample size.
39
The results observed in the present work suggest an association between
the ADRA2A C-1291G polymorphism, notably the G allele, in nicotine
dependence. The influence of the ADRA2A gene in nicotine and other substance
dependencies should be more extensively assessed in future haplotype-based
studies with higher sample sizes.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank the Hospital Espírita de Porto Alegre for allowing the data
collection to occur. The sample collection of patients with alcohol dependence was
obtained with the help of Alessandra Spode, Alexandra C. Ponso, Carlos E.D.
Garcia, Evenise P. Elias and Fabiana T. Costa. Verônica Contini and Maria Paula
Quiroga helped in the laboratory procedures. This research was supported by
CNPq, FAPERGS and PRONEX.
40
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mental disorders, fourth edition, text revision. American Psychiatric Association,
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45
Table I: Allele and genotype frequencies of the C-1291G polymorphism in
individuals with dependence combined of alcohol and nicotine, nicotine
dependence and controls
Alcohol and nicotine
dependence (AND)
Nicotine dependence
(ND)
Controls (C)
n
%
n
%
n
%
Alleles
C 131 59.6 154 63.7 164 71.9
G 89 40.4 88 36.3 64 28.1
Total 220 100 242 100 228 100
Genotypes
CC 38 34.5 47 38.8 59 51.8
CG 55 50.0 60 49.6 46 40.3
GG 17 15.5 14 11.6 9 7.9
Total 110 100 121 100 114 100
Chi-squares for comparisons:
Alleles:
AND x ND x C: χ
2
= 8.00; p= 0.02
AND + ND x C: χ
2
= 7.18; p= 0.007
Genotypes:
AND x ND x C: χ
2
= 8.56; p= 0.07
AND + ND x C: χ
2
= 7.56; p= 0.02
46
4 THE GNB3 C825T POLYMORPHISM AND DEPRESSION AMONG
SUBJECTS WITH ALCOHOL DEPENDENCE
Manuscrito em preparação para ser submetido à revista Journal of Neural
Transmission
47
The GNB3 C825T Polymorphism and Depression among Subjects with
Alcohol Dependence
Alexandre P. Prestes, Francine Z. C. Marques, Mara H. Hutz, Claiton H. D.
Bau
Genetics Department, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS,
Brazil.
Running title: GNB3 C825T Polymorphism and Depression
Correspondence to Claiton H. D. Bau, Departamento de Genética, Instituto de
Biociências, UFRGS, Caixa Postal 15053, 91501-970 Porto Alegre, RS, Brazil.
Tel: (55) 51 3316 6718 Fax: (55) 51 3316 7311
E-mail: claiton.bau@ufrgs.br
Funding sources: CNPq, FAPERGS, PRONEX
48
Summary
The T allele of the C825T polymorphism in the G-protein β
3
subunit
gene
(GNB3) is functionally active and related to the increase of signal
transduction by the G-protein. Various studies suggest that this allele is
involved in arterial hypertension and some of the results also indicate a
connection to obesity and major depressive disorder. G-proteins are
intermediary paths in signal transduction from dopaminergic, cannabinoid
and opioid receptors, involved in the development of dependencies. We
studied the C825T polymorphism in individuals with (i) alcohol and nicotine
dependence (n = 109), (ii) nicotine dependence only (n = 117) and (iii) non-
dependent controls (n = 108). We also tested for possible associations with
psychiatric comorbidities among alcohol-dependent individuals. No
differences were detected for allele and genotype frequencies in individuals
with or without dependencies. Alcohol-dependent individuals with the
heterozygous genotype presented more frequently major depressive
disorder (χ
2
= 12.34; p= 0.002). The preliminary, positive association with
depression is consistent with previous findings on the GNB3 gene. The lack
of association with the homozygous genotype may be related to an
underrepresentation of more severe depressive disorder in this sample of
alcohol dependence. In this case, the specificity of the association with the
heterozygous genotype would be explained by a particular subtype of major
depressive disorder associated with alcohol dependence.
Key-words: GNB3, C825T, alcohol, nicotine, dependence
49
Introduction
G-proteins are a family of proteins which are bound to guanosine
triphosphate (GTP) or to guanosine diphosphate (GDP). They are intermediate
paths for the transmission of signals from the receptors of 7 transmembrane
domains (7TM) including the biogenic amine receptors (Berg et al., 2002; Sadock
and Sadock, 2003).
The brain reward system is one of the main mechanisms implicated in
substance dependence (Koob, 2003). Several neurotransmitter receptors, as the
dopaminergic (Kiyatkin, 1995; Marsden, 2006), cannabinoid (Yamamoto and
Takada, 2000) and opioid (Zastawny et al., 1994) operate in the brain reward
system. These receptors use G-protein coupling for transduction of the
postsynaptic signal (Berg et al., 2002). Therefore, G-protein related function can
be regarded as part of the brain reward system. It is possible that a malfunction in
the cascade of biochemical postsynaptic events could interfere in the operation of
this mechanism.
Abnormal paths of intracellular signal transduction have been implicated in
the pathogenesis of psychiatric conditions, especially mood disorders (Stahl, 2000;
Zill et al, 2000). One hypothesis suggests that at least some cases of depression
may occur due to a pseudomonoaminergic deficiency, that is, a deficiency in the
transduction of the monoaminergic neurotransmitter signal to the nucleus of the
postsynaptic neuron, notwithstanding the presence of normal numbers of
neurotransmitters and receptors (Stahl, 2000).
The human G-protein β
3
subunit
gene (GNB3) is mapped in the
chromosome 12p13 (Downes and Gautam, 1999). The β
3
subunit
is a polypeptide
50
of 340 amino acids (Levine et al., 1990). The GNB3 gene spans 7.5 kb and is
composed of 11 exons and 10 introns (Rosskopf et al., 2000). The C825T
polymorphism, located in exon 9 of the gene, corresponds to a cytosine-to-thymine
transition in position 825 of cDNA (Siffert et al., 1995). The T allele of this
polymorphism is associated to the Gβ3-s alternative splicing, and despite a
deletion of 41 amino acids, is functionally active and increases the transduction of
the signal by the G-protein (Siffert et al., 1998).
Associations were observed between the GNB3 C825T polymorphism and
major depressive disorder, its severity and response to treatment (Lee et al.,
2004); seasonal alterations of mood (Lee et al., 2005); seasonal depression
(Willeit et al., 2003) and depressed mood (Exton et al., 2003). Other studies,
however, did not find an association between the polymorphism and mood
variations (Lin et al., 2001; Kunugi et al., 2002).
The importance of this polymorphism is also suggested by studies related to
non-psychiatric disorders. The 825T allele was reported as associated to essential
hypertension (Beige et al., 1999; Dong et al., 1999, Siffert, 2005) and obesity
(Siffert et al., 1999; Snyder et al., 2004).
This study tested for a possible association between the GNB3 C825T
polymorphism in individuals with alcohol and nicotine dependencies as compared
to non-dependent controls. In addition, we looked for possible associations
between this polymorphism and the presence of other substance abuse, antisocial
personality and major depressive disorder in individuals with alcohol dependence.
51
Material and methods
Subjects
The alcohol dependent sample (N= 123; 109 nicotine dependents plus 14
non smokers) was investigated in an alcoholism treatment ward. This sample was
also investigated for the presence of other psychiatric disorders (28 individuals
presented other substance abuse (mostly Cannabis, followed by cocaine), 20 had
antisocial personality and 44 had major depressive disorder). Other psychiatric
disorders were either not assessed or were too infrequent. All the diagnoses
followed the DSM-IV criteria (American Psychiatric Association, 2000). The
diagnostic interview for alcohol dependence and lifetime comorbidities was
performed with the Semi-Structured Assessment for the Genetics in Alcoholism
(Bucholz et al., 1994).
A sample of 225 European-derived men (117 non-alcoholic nicotine
dependents and 108 non-dependent controls) was assessed in a blood bank. This
sample was designed to be non-screened, representative of the gene frequencies
of individuals of European descent in Porto Alegre. These subjects are
replacement donors, that is, they are people that replaced the blood used by a
hospitalized family member or friend. For this reason, a behavior-related bias is
not likely.
The criterion for smoking among blood donors was daily use for at least one
month. Daily smoking is strongly related to nicotine dependence, since it usually
starts when dependence is already established (Mayhew et al. 2000, Wellman et
al. 2004). For this reason, we consider that these individuals fulfilled DSM-IV
criteria for nicotine dependence.
52
Written informed consent was obtained from every subject. The study
protocol was approved by the institutional ethical committees.
Laboratory Methods
The high molecular weight genomic DNA was isolated from total blood
lymphocytes following the salting-out method described by Lahiri and Nurnberger
(1991). The Polymerase Chain Reaction (PCR) was employed to amplify a DNA
genomic region of 267 bp in the GNB3 gene. The protocol used was described by
Schunkert et al. (1998) and adapted by Mattevi et al. (2006). The C825T
polymorphism was shown in the PCR products by digestion with the BsaJI
restriction enzyme. The restriction fragments were separated by electrophoresis in
2.5% agarose gels stained with ethidium bromide and visualized under ultraviolet
light. The C allele presents the restriction site resulting in two fragments of 115 bp
and 153 bp. The T allele does not present the restriction site and resulted in a non-
digested fragment of 267 bp.
Statistical Analyses
The analyses of Hardy-Weinberg equilibrium and comparisons among
individuals with combined alcohol and nicotine dependencies, nicotine
dependence only and controls, as well as among patients with and without
comorbidities, were performed using the chi-square test.
53
Results
The samples were in Hardy-Weinberg equilibrium. There were no
differences in the genotype (χ
2
= 2.104; p = 0.717) or allelle (χ
2
= 0.420; p = 0.811)
frequencies among individuals with alcohol and nicotine dependencies, nicotine
dependence only and controls (table 1).
The heterozygous genotype of the GNB3 C825T polymorphism was more
frequent among alcohol dependent individuals with comorbid major depressive
disorder (χ
2
= 12.34; p= 0.002). There were no differences in the allele frequencies
of this polymorphism between individuals with or without depression (χ
2
= 0.004; p=
0.95) (table 2). The GNB3 polymorphism was not associated with illegal drug
abuse or antisocial personality disorder.
Discussion
The lack of association between the C825T polymorphism with substance
dependence suggests that these conditions are not influenced by the T allele-
related increase in the signal transduction of the G-Protein. However, a higher
prevalence of the heterozygous genotype was observed among alcohol dependent
patients with major depressive disorder.
The observed association of the GNB3 C825T polymorphism with major
depressive disorder is consistent with previous works which suggested a specific
association of the heterozygous genotype with seasonal variation of mood (Lee et
al., 2005) and seasonal depression (Willeit et al., 2003). These findings, taken
together with other studies suggesting an influence of the C825T polymorphism in
54
major depressive disorder (Exton et al. 2003; Lee et al., 2004), support the
hypothesis of the involvement of G-proteins in mood regulation (Stahl, 2000).
On the other hand, the association was not observed for the allele
frequencies. It is possible that this is due to a peculiarity of the heterozygote
genotype as was found in the studies by Willeit et al. (2003) and Lee et al. (2005).
The lack of association with the homozygous genotype may be related to an
underrepresentation of more severe depressive disorder in this sample of alcohol
dependence. In this case, the specificity of the association with the heterozygous
genotype would be explained by a particular subtype of major depressive disorder
associated with alcohol dependence. A similar hypothesis could explain the
previous findings with seasonal variation of mood (Willeit et al., 2003; Lee et al.,
2005). This hypothesis should be tested in independent samples of patients with
major depressive disorder with or without substance dependence.
A potential weakness present in case-control association studies regards to
the issue of population stratification. However, population stratification is not likely
to be a confounder in this study, because the samples were carefully limited to
Brazilians of European descent. The gene frequencies in the control sample were
similar to those reported in a sample of healthy European descendents from Porto
Alegre (Mattevi et al., 2006). Studies with a larger sample size could show a
positive association with substance dependence. Nevertheless, the similarity of
allele and genotype frequencies in our comparison groups suggests that if there is
an effect of the polymorphism, it should be extremely small. Another limitation is
the small number of patients with major depressive disorder. We cannot rule out
55
the possibility that the intriguing, specific association observed with the
heterozygous genotype might be a false-positive result.
While our results suggest that the C825T polymorphism of GNB3 is unlikely
to be involved in substance dependence, they also underscore previous studies
indicating this locus as a candidate for major depressive disorder.
Acknowledgements
We thank the Hospital Espírita de Porto Alegre for allowing the data
collection to occur. The sample collection of patients with alcohol dependence was
obtained with the help of Alessandra Spode, Alexandra C. Ponso, Carlos E.D.
Garcia, Evenise P. Elias and Fabiana T. Costa. Verônica Contini and Maria Paula
Quiroga helped in the laboratory procedures. This research was supported by
CNPq, FAPERGS and PRONEX.
56
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Table 1: Genotype and allele frequencies of the C825T polymorphism among
subjects with alcohol and nicotine dependence, nicotine dependence only and
non-dependent controls
alcohol and nicotine
dependence (n = 109)
nicotine dependence
only (n = 117)
Controls (n = 108)
Genotypes
CC 40 (36.7 %) 46 (39.3 %) 48 (44.4 %)
CT 57 (52.3 %) 57 (48.7 %) 46 (42.6 %)
TT 12 (11.0 %) 14 (12.0 %) 14 (13.0 %)
Alleles
C 137 (62.8 %) 149 (63.7 %) 142 (65.7 %)
T 81 (37.2 %) 85 (36.3 %) 74 (34.3 %)
Genotypes:
CC x CT x TT: χ
2
= 2.10; gl= 4; p= 0.72
CC x CT + TT: χ
2
= 1.40; gl= 2; p= 0.50
Alleles:
C x T: χ
2
= 0.42 ; gl = 2 ; p = 0.81
61
Table 2: Genotype and allele frequencies of the C825T polymorphism
and major depressive disorder in subjects with alcohol dependence
Major Depressive Disorder
No (n = 79) Yes (n = 44)
Genotypes
CC 33 (41,8 %) 11 (25,0 %)
CT 33 (41,8 %) 32 (72,7 %)
TT 13 (16,4 %) 1 (2,3 %)
Alleles
C 99 (62,7 %) 54 (61,4 %)
T 59 (37,3 %) 34 (38,6 %)
Genotypes:
CC x CT x TT: χ
2
= 12.34 ; gl= 2 ; p= 0.002
CC x CT + TT: χ
2
= 2.77 ; gl= 1 ; p= 0.096
Alleles:
C x T: χ
2
= 0.004 ; gl= 1 ; p= 0.95
62
5 DISCUSSÂO
Os artigos que compõem a presente dissertação contam com uma
discussão mais específica para os achados envolvendo cada um dos genes
estudados. Nesse momento, será realizada uma discussão mais ampla,
integrando os achados referentes aos dois genes. É preciso ter em mente que a
mesma amostra de pacientes com dependência de álcool já foi estudada quanto a
vários polimorfismos em outros genes, parte deles com resultados positivos para
associações com as dependências ou fenótipos relacionados. Os polimorfismos
estudados incluem os localizados nos genes DRD2, DRD4, DAT1, DBH, 5-HTT e
MAOA (Bau e cols., 1999, 2000, 2001; Freire e cols., 2005, 2006; Contini e cols.,
no prelo; Marques e cols., no prelo). De maneira geral, os resultados positivos
obtidos nos artigos mencionados são coerentes com a literatura prévia na área,
dando suporte para um significado biológico compatível entre a presente amostra
e aquelas obtidas em outras partes do mundo.
O presente trabalho apresenta dois achados principais. O primeiro se
refere à associação entre o alelo G do polimorfismo C-1291G do gene ADRA2A
com a dependência de nicotina. O segundo, com evidências menos seguras,
sugere uma associação entre o genótipo heterozigoto para o polimorfismo C825T
do gene GNB3 com o transtorno depressivo maior entre pacientes com
dependência de álcool. Vale destacar que em ambos os casos as associações
observadas estavam incluídas nas hipóteses estabelecidas a priori, tanto do ponto
de vista dos fenótipos envolvidos como também dos alelos dos polimorfismos
63
implicados. Tratam-se, assim, de resultados que merecem ser considerados à luz
da literatura pré-existente e futura nos tópicos abordados.
Por outro lado, algumas das hipóteses estabelecidas antes do trabalho, e
descritas no capítulo introdutório da dissertação, não puderam ser confirmadas.
São elas a falta de associação entre o polimorfismo C-1291G do gene ADRA2A
com transtorno depressivo maior e sintomas de abstinência de álcool, e a
inexistência de associação entre o GNB3 e as dependências. Tendo em conta a
grande similaridade das freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos
comparados, é pouco provável que o aumento do tamanho amostral pudesse
modificar os resultados obtidos.
O achado mais consistente do presente trabalho (associação entre o
polimorfismo C-1291G do gene ADRA2A com a dependência de nicotina) era
também o mais plausível tendo em conta a literatura disponível. Esse
polimorfismo já havia sido implicado no TDAH, condição que predispõe às
dependências de substâncias (Biederman e cols., 2006a). O vínculo entre o
sistema noradrenérgico e o tabagismo também é sugerido pelo fato de que a
nortriptilina (medicamento com atividade predominantemente noradrenérgica) é
eficaz no tratamento do tabagismo (Foulds e cols., 2004). Além disso, os
agonistas α
2
-adrenérgicos clonidina and guanfacina são eficazes na redução dos
sintomas de abstinência da nicotina nicotine (Gourlay e cols., 2004).
A ocorrência conjunta de alcoolismo e tabagismo é muito freqüente.
Estima-se que 80% dos alcoolistas fumem regularmente (Daeppen e cols., 2000).
Além disso, alcoolistas dependentes de nicotina apresentam maior gravidade da
dependência de álcool do que alcoolistas não fumantes (Daeppen e cols., 2000).
64
O hábito de fumar mostrou-se um fator de risco para a progressão dos sintomas
de alcoolismo (True e cols., 1999), o que pode ocorrer pela diminuição dos efeitos
do etanol (Madden e cols., 1995), enquanto a dependência de álcool revelou-se
associada com uma síndrome de abstinência de nicotina mais acentuada
(Madden e cols., 1997).
Com os dados obtidos no estudo de associação envolvendo o gene
ADRA2A, não é possível afirmar se o alelo G também estaria associado à
dependência de álcool em pacientes sem dependência de nicotina. O teste dessa
hipótese dependeria de uma amostra de dependentes de álcool não tabagistas,
não disponível em nosso laboratório. Há dados que sugerem que a dependência
de nicotina seja um fator de risco para a dependência de álcool (Biederman e
cols., 2006b). É interessante destacar que a mesma dúvida persiste quanto a
outra associação observada pelo nosso grupo (Bau e cols., 2000; Freire e cols.,
2006) entre o alelo TaqIA1 do gene DRD2 e as dependências de álcool e nicotina.
Infelizmente, como já foi mencionado, é difícil a obtenção de um grande tamanho
amostral de pacientes com dependência de álcool porém não tabagistas.
Alguns estudos com gêmeos já haviam sugerido que fatores genéticos
influenciam não apenas as suscetibilidades ao abuso do álcool e do tabaco
separadamente, mas também à dependência das duas substâncias ao mesmo
tempo (Swan e cols., 1997; True e cols., 1999; Hopfer e cols., 2001). O conjunto
de resultados sobre a progressão das dependências estimula a realização de
mais estudos visando à caracterização de um perfil genético e fenotípico dos
indivíduos com tabagismo sob alto risco de desenvolvimento de dependência de
álcool e/ou outras drogas.
65
Ao contrário da nossa hipótese prévia, o gene GNB3 não se mostrou
associado com as dependências estudadas. Vale ressaltar, no entanto, que a
maior parte das hipóteses plausíveis não se confirmam nos estudos genéticos de
associação. Isso porque a enorme complexidade tanto do genoma humano como
também da fisiologia e bioquímica cerebrais tornam possível a existência de
muitos mecanismos fisiopatológicos alternativos, possivelmente mais importantes
do que aquele da hipótese sugerida. Também não é possível descartar, em
princípio, que a falta de associação se deva à insuficiência do tamanho amostral.
No entanto, o fato de que as freqüências alélicas e genotípicas foram muito
semelhantes nos grupos estudados sugere que dificilmente o aumento do n
pudesse tornar as associações positivas.
Por outro lado, a associação entre o genótipo heterozigoto para o
polimorfismo C825T do gene GNB3 e o transtorno depressivo maior é compatível
com publicações prévias (Willeit e cols., 2003; Lee e cols., 2004). No entanto, o
fato de que a associação ocorre exclusivamente para os heterozigotos demanda
cautela na interpretação. Não é possível descartar a possibilidade de que a
homozigose para o alelo T esteja associada a uma forma mais grave de
depressão não representada na presente amostra de pacientes com dependência
de álcool. Essa hipótese deve ser estudada em amostras envolvendo pacientes
com transtorno depressivo maior associado ou não a dependências de
substâncias.
Os estudos de associação entre casos e controles têm como um de seus
principais desafios o correto pareamento quanto à composição étnica da amostra.
Isso é necessário para evitar o risco de viés de confusão devido à eventual
66
estratificação populacional, a qual pode gerar resultados tanto falso-positivos
quanto falso-negativos (Colhoun e cols., 2003). No nosso estudo, tal problema foi
minimizado pelo pareamento cuidadoso entre controles e pacientes quanto à
etnia. Ainda que não tenhamos estudado marcadores genéticos para confirmar
essa similaridade, estudos na mesma população não puderam demonstrar uma
estratificação populacional significativa em Porto Alegre (Zembrzuski e cols., no
prelo). Apesar dessa limitação, os estudos de associação também apresentam
vantagens quando comparados a outros métodos. O poder estatístico é
substancialmente maior do que os métodos de ligação e associação baseados em
famílias (Cardon e Bell, 2001). Além disso, no caso dos transtornos psiquiátricos
em adultos, especialmente as dependências de substâncias, é relativamente
difícil obter-se a colaboração e participação de familiares em projetos de
pesquisa.
Os transtornos por uso de substâncias apresentam etiologia multifatorial.
Como ocorre na maioria dos transtornos mentais, a contribuição genética se dá
pela participação de vários genes com pequeno efeito, produzindo diferentes
graus de vulnerabilidade ao transtorno (Strachan e Read, 2004). Uma perspectiva
existente é o estudo das interações entre diferentes genes. Por exemplo,
variações na proteína G poderiam potencializar o efeito de polimorfismos em
genes de receptores dopaminérgicos, inclusive aqueles já estudados pelo nosso
grupo de pesquisa. Evidentemente, essas abordagens demandam, em primeiro
lugar, que os polimorfismos incluídos nos modelos de interação tenham
evidências sólidas de funcionalidade e influência no transtorno, consenso que
ainda não foi alcançado. Além disso, é necessário um tamanho amostral
67
substancialmente maior do que no caso das associações pesquisadas
individualmente.
Embora existam evidências a favor de uma contribuição genética para os
transtornos por uso de álcool e nicotina, fatores ambientais também devem ser
considerados. Pretendemos avaliar em estudos subseqüentes possíveis
associações ou interações envolvendo os genes aqui descritos e as
características relacionadas com o ambiente disponíveis no banco de dados.
Estudos de farmacogenômica poderão ser úteis para a identificação de
alelos indicativos de uma melhor resposta a determinados tratamentos. Por
exemplo, existem evidências de que o alelo T do polimorfismo C825T do GNB3
esteja relacionado com melhor resposta ao tratamento de pacientes com
depressão (Lee e cols., 2004) e predição de sucesso na redução de peso com
uso de sibutramina em pacientes com obesidade (Hauner e cols., 2003). Muito
tempo e esforço ainda terá de ser dispensado para abordar o efeito de tantos
polimorfismos genéticos na resposta terapêutica às dependências. Vale destacar
que, de maneira geral, o conhecimento existente sobre a heterogeneidade clínica
não tem favorecido uma abordagem terapêutica muito mais específica e eficaz
para cada paciente (Cutler e Fishbain, 2005). Essa complexidade faz com que a
expectativa gerada pelos estudos genéticos seja ainda maior. Espera-se também
que, no futuro, os transtornos mentais possam ser melhor classificados, tendo em
conta dados derivados de estudos moleculares e de farmacogenômica (Greenber,
2001). O volume crescente de informações provenientes das investigações sobre
a heterogeneidade clínica e genética tem aberto novas hipóteses de investigação,
68
as quais muito provavelmente resultarão em uma medicina mais efetiva e
personalizada.
69
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82
ANEXO I: CRITÉRIOS DO DSM-IV-TR PARA DEPENDÊNCIA
Critérios para Dependência de Substância segundo o DSM-IV-TR
Um padrão maladaptativo de uso de substância, levando a comprometimento ou
sofrimento clinicamente significativo, manifestado por três (ou mais) dos seguintes
critérios, ocorrendo em qualquer momento no mesmo período de 12 meses:
(1) tolerância, definida por qualquer um dos seguintes aspectos:
(a) necessidade de quantidades progressivamente maiores da substância, para
obter a intoxicação ou o efeito desejado
(b) acentuada redução do efeito com o uso continuado da mesma quantidade da
substância,
(2) abstlnência, manifestada por qualquer dos seguintes aspectos:
(a) síndrome de abstinência característica da substância (consultar os Critérios A e
B dos conjuntos de critérios para Abstinência das substâncias específicas)
(b) a mesma substância (ou uma substância estreitamente relacionada) é
consumida para aliviar ou evitar sintomas de abstinência
(3) A substância é freqüentemente consumida em maiores quantidades ou por um
período mais longo do que o pretendido
(4) existe um desejo persistente ou esforços mal-sucedidos no sentido de reduzir ou
controlar o uso da substâncla
(5) muito tempo é gasto em atividades necessárias para a obtenção da substância
(por exemplo, consultas a vários médicos ou longas viagens de automóvel), na
utilização da substância (por exemplo, fumar em grupo) ou na recuperação de seus
efeitos
(6) importantes atividades sociais, ocupacionais ou recreativas são abandonadas ou
reduzidas em virtude do uso da substância
(7) o uso da substância continua, apesar da consciência de ter um problema físico
ou psicológico persistente ou recorrente que tende a ser causado ou exacerbado
pela substância (por exemplo, uso atual de cocaína, embora o indivíduo a
reconheça como indutora da sua depressão, ou consumo continuado de bebidas
alcoólicas, embora o indivíduo reconheça que uma úlcera piorou devido ao consumo
do álcool)
Especificar se:
Com Dependência Fisiológica: evidências de tolerância ou abstinência (isto é,
presença de item 1ou 2)
Sem Dependência Fisiológica: não existem evidências de tolerância ou abstinência
(isto é, nem item 1 nem item 2 estão presentes)
Especificadores de curso:
Remissão Completa Inicial
Remissão Parcial Inicial
Remissão Completa Mantida
Remissão Parcial Mantida
EmTerapia com Agonista
Em Ambiente Protegido
83
ANEXO 2: CRITÉRIOS DA CID-10 PARA DEPENDÊNCIA
Diretrizes diagnósticas para Síndrome de Dependência segundo a CID-10
Um diagnóstico definitivo de dependência deve usualmente ser feito somente se
três ou mais dos seguintes requisitos tenham sido experenciados ou exibidos em
algum momento durante o ano anterior:
(a) um forte desejo ou senso de compulsão para consumir a substância;
(b) dificuldades em controlar o comportamento de consumir a substância em
termos de seu início, término ou níveis de consumo;
(c) um estado de abstinência fisiológico (ver F1x.3e F1x.4) quando o uso da
substância cessou ou foi reduzido, como evidenciado por: a síndrome de
abstinência característica para a substância ou o uso da mesma substância (ou
de uma intimamente relacionada) com a intenção de aliviar ou evitar sintomas de
abstinência;
(d) evidência de tolerância, de tal forma que doses crescentes da substância
psicoativa são requeridas para alcançar efeitos originalmente produzidos por
doses mais baixas (exemplos claros disto são encontrados em indivíduos
dependentes de álcool e opiáceos, que podem tomar doses diárias suficientes
para incapacitar ou matar usuários não tolerantes);
(e) abandono progressivo de prazeres ou interesses alternativos em favor do uso
da substância psicoativa,aumento da quantidade de tempo necessária para obter
ou tomar a substância ou para se recuperar de seus efeitos:
(f) persistência no uso da substância, a despeito de evidência clara de
conseqüências manifestamente nocivas, tais como dano ao fígado por consumo
excessivo de bebidas alcoólicas, estados de humor depressivos conseqüentes a
períodos de consumo excessivo da substância ou comprometimento do
funcionamento cognitivo relacionado à droga; deve-se fazer esforços para
determinar se o usuário estava realmente (ou se poderia esperar que
estivesse)consciente da natureza e extensão do dano.
84
ANEXO 3: MÉTODOS LABORATORIAIS: ADRA2A
O DNA genômico de alto peso molecular foi isolado de linfócitos de sangue
total por procedimento de extração descrito por Lahiri e Nurnberger (1991).
A região que apresenta o polimorfismo C-1291G, localizada no promotor do
gene ADRA2A, foi amplificada por reação de polimerase em cadeia (PCR)
utilizando os primers e protocolos descritos por Lario e cols. (1997) e Roman e
cols., (2003). O primer senso, na posição -1417 upstream do início da transcrição,
é 5’ TCA CAC CGG AGG TTA CTT CCC TCG 3’ e o primer antisenso, na posição
-913, é 5’ TCC GAC GAC AGC GCG AGT T 3’.
A reação de PCR foi realizada em um volume total de 50 µl, contendo 50
ng de DNA, 30 pmol de cada primer, 250 µM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), 2,5 U de Taq DNA polimerase e 1x tampão de Taq. As condições de PCR
consistiram de uma etapa inicial de desnaturação a 94
o
C por 4 min, seguida de 35
ciclos que incluíram uma etapa de 30 seg de desnaturação a 94
o
C, uma etapa de
reanelamento a 60
o
C e uma etapa de 1 min de extensão a 72
o
C. Uma etapa de
extensão final a 72
o
C por 5 min foi incluída. A PCR originou fragmentos
amplificados de 522 pb. Estes fragmentos foram digeridos com a enzima de
restrição MspI por 3 horas a 37
o
C, usando 12 µl do produto da PCR, 10 U da
endonuclease de restrição e tampão MspI 1x, gerando cinco fragmentos, de 5,
62, 116, 165 e 174 bp. O fragmento de 174 pb pode ser também clivado em
fragmentos de 121 e 53 pb, dependendo da presença de guanina na posição –
1291, correspondendo ao alelo G. A presença de citosina e a conseqüente
ausência do sítio de restrição MspI corresponde ao alelo C (Garenc e cols., 2002).
Os 5 ou 6 fragmentos resultantes foram separados por eletroforese em géis de
poliacrilamida a 10%. Os géis foram corados com brometo de etídio e
visualizados sob luz ultravioleta.
85
ANEXO 4: MÉTODOS LABORATORIAIS: GNB3
Foi utilizada a reação de polimerase em cadeia (PCR) para amplificar uma
região de DNA genômico de 267 pb, do nucleotídeo 5348 ao nucleotídeo 5615 do
gene GNB3. A posição do nucleotídeo 5500 da seqüência genômica corresponde
à posição 825 do cDNA desse gene (Rosskopf e cols., 2000). Foram utilizados os
seguintes primers: 5’ TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC 3’ (primer senso) e 5’
GCA GCA GCC AGG GCT GGC 3’ (primer antisenso), segundo protocolo descrito
por Schunkert e cols. (1998) e adaptado por Mattevi e cols. (2006). Para a PCR,
foram utilizados 80 ng de DNA genômico e 0,5 U de Taq polimerase em 35 ciclos
de amplificação. Depois de período inicial de desnaturação a 94°C, cada ciclo
incluiu desnaturação a 94°C por 1 minuto, reanelamento a 61°C por 1 minuto e
extensão a 72°C por 1 minuto. Foi utilizada uma etapa de extensão final de 7
minutos. O polimorfismo C825T foi evidenciado nos produtos da PCR pela
digestão com a enzima de restrição BsaJI, separados por eletroforese em gel de
agarose a 2,5%. Os géis foram corados com brometo de etídio e visualizados sob
luz UV. O alelo C apresenta o sítio de restrição, resultando em 2 fragmentos de
115 e 152 pb. O alelo T não apresenta o sítio de restrição, resultando em um
fragmento não digerido com 267 bp.
86
ANEXO 5: TERMO DE CONSENTIMENTO - PROBANDOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
Termo de consentimento __________ Nome/Nº:____________________
Assinando este documento, eu terei concordado em participar de uma
pesquisa médica intitulada Estudo Colaborativo sobre Fatores Genéticos no
Alcoolismo (ECGA). O estudo tem a supervisão dos Drs. Claiton H.D. Bau e Mara
H. Hutz, do Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. A minha assinatura também autoriza os membros do ECGA a entrar em
contato com meus parentes biológicos para determinar se eles também desejam
participar. Qualquer parente que eu não queira que seja contactado não será
procurado pela equipe do ECGA.
1. Objetivo da pesquisa: O objetivo principal do estudo é compreender como o
alcoolismo pode ser transmitido de geração em geração ou de pais para filhos.
Todas as informações obtidas permanecerão confidenciais e não serão reveladas
a ninguém de nenhuma maneira que possa identificar a mim ou minha família,
exceto em situações em que riscos potenciais possam resultar a outros ou a mim
mesmo. Eu compreendo que as informações que eu fornecer serão utilizadas
somente para objetivos estatísticos e os resultados da pesquisa não incluirão
nenhuma informação que possa ser usada para identificar a mim ou minha
família. Todos os formulários receberão um número de identificação e serão
usados somente por membros da equipe de pesquisa. Eu também compreendo
que o conteúdo das entrevistas ou resultados de qualquer outro teste não serão
revelados a nenhum dos meus parentes.
87
2. Procedimentos envolvidos e duração da minha participação:
Entrevista: Eu serei entrevistado por um membro do ECGA que fará perguntas
sobre a minha história passada e presente, incluindo uso de álcool e drogas,
traços de personalidade, humor, pensamentos, relações familiares, bem como
informações sobre a história passada e presente do uso de álcool e drogas dos
meus parentes. O tempo total de entrevista é de aproximadamente 5 a 7 horas.
Testes laboratoriais: Será solicitado que eu me submeta a uma coleta de 10 ml de
sangue. A amostra servirá para testes bioquímicos e análises genéticas. Parte do
material será congelado e utilizado no futuro, em estudos sobre a genética do
alcoolismo.
3. Os riscos que sofrerei: Os testes utilizados no estudo não envolvem riscos
maiores, físicos ou psicológicos. No entanto, se eu considerar algumas das
perguntas como sendo desagradáveis, eu poderei recusar-me a respondê-las. A
coleta de sangue pode gerar um pequeno desconforto, ou ferimento ou
sangramento mínimo. Se eu considerar a entrevista muito longa ou estressante,
eu poderei interromper e marcar outra ocasião. Para qualquer informação
adicional, eu posso telefonar para o Departamento de Genética da UFRGS,
telefone 051-316-6731.
4. Possíveis benefícios: Os resultados deste estudo poderão ajudar a mim e a
outros membros da minha família a decidir sobre o uso do álcool. O estudo
também pode ajudar a encontrar fatores que possam determinar os indivíduos
que apresentem uma vulnerabilidade ao desenvolvimento da dependência de
álcool. Os maiores benefícios serão para a sociedade como um todo. Se todos os
objetivos forem atingidos, muito se saberá sobre a prevenção e tratamento de um
dos maiores problemas mundiais de saúde.
5. Consentimento para liberação de informações familiares: Eu dou permissão
aos membros do Estudo Colaborativo em Genética do Alcoolismo para informar
para outros membros da família:
* meu nome e data de nascimento
* nomes, datas de nascimento e de óbito de outros
membros da família
88
Fui informado de que estas informações serão liberadas de tal maneira que os
dados familiais possam ser combinados com os de outros membros da família.
Isto ajudará a desenvolver a árvore genealógica mais correta. No entanto, se há
alguma razão pela qual eu prefira não dar estas informações (por exemplo, eu
poderia ter um (a) filho (a) ou esposa (o) anterior a respeito de quem ninguém
sabe), a equipe do ECGA me assegura de que estas informações não serão
mostradas a ninguém.
Eu, ______________________________________, fui informado dos objetivos
especificados acima e da justificativa desta pesquisa, de forma clara e detalhada.
Recebi informações específicas sobre cada procedimento no qual estarei
envolvido, dos desconfortos ou riscos previstos, tanto quanto dos benefícios
esperados. Todas as minhas dúvidas foram respondidas com clareza e sei que
poderei solicitar novos esclarecimentos a qualquer momento. Além disso, sei que
novas informações, obtidas durante o estudo, me serão fornecidas e que terei
liberdade de retirar meu consentimento de participação na pesquisa, face a estas
informações.
O pesquisador ________________________________________ certificou-me de
que as informações por mim fornecidas terão caráter confidencial.
Fui informado que caso existam danos à minha saúde, causados diretamente pela
pesquisa, terei direito a tratamento médico e indenização conforme estabelece a
lei. Também sei que caso existam gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo
orçamento da pesquisa.
ASSINATURA DO PACIENTE _____________________________
ASSINATURA DO INVESTIGADOR ________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR __________________________
89
ANEXO 6: TERMO DE CONSENTIMENTO - CONTROLES
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
Termo de consentimento nº
Assinando este documento, eu concordo em que uma pequena amostra do
sangue doado por mim seja utilizado pelo Departamento de Genética da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul para formar um banco de material
biológico representativo da população de Porto Alegre, a ser utilizado em um
projeto denominado “Heterogeneidade Genética e Fenotípica no Alcoolismo”.
O material genético (DNA) será extraído do sangue, para serem realizados
estudos comparando alcoolistas e não alcoolistas quanto a variações em genes
possivelmente importantes para o alcoolismo.
Os resultados serão divulgados em nível científico, mas o meu nome não
será divulgado para ninguém. Todas as informações serão identificadas apenas
por um número.
Eu, ................................................................. fui informado do objetivo
especificado acima, e da sua justificativa. Fui informado também de que a minha
participação não implica nenhum risco adicional à doação de sangue.
Doador de sangue
Pesquisador
Data:
90
ANEXO 7: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA - HCPA
91
ANEXO 8: APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA DA UFRGS
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