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ANA ELISA BARREIROS BUENO DA SILVA
ASPECTOS MOLECULARES
DA TRANSFORMAÇÃO CELULAR
INDUZIDA POR BCR-ABL
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo para a obtenção do Título de
Doutor em Ciências (Imunologia)
São Paulo
2008
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ANA ELISA BARREIROS BUENO DA SILVA
ASPECTOS MOLECULARES
DA TRANSFORMAÇÃO CELULAR
INDUZIDA POR BCR-ABL
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto
de Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo para a obtenção do Título de
Doutor em Ciências (Imunologia)
Orientador: Prof. Dr. Gustavo P. Amarante-Mendes
São Paulo
2008
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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
© reprodução total
Bueno da Silva, Ana Elisa Barreiros.
Aspectos moleculares da transformação celular induzida por Bcr-Abl
/ Ana Elisa Barreiros Bueno da Silva. -- São Paulo, 2007.
Orientador: João Gustavo Pessini Amarante Mendes.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências
Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração:
Imunologia. Linha de pesquisa: Controle molecular da apoptose pela
tirosina-quinase Bcr-Abl.
Versão do título para o inglês: Molecular aspects of Bcr-Abl-induced
cell transformation.
Descritores: 1. Bcr-Abl 2. Transformação celular 3. Leucemia
mielóide crônica 4. Tirosina-quinase 5. Apoptose 6. Proteoma I.
Mendes, João Gustavo Pessini Amarante II. Universidade de São
Paulo.Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação
em Imunologia. III. Título.
ICB/SBIB013/2008
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
______________________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Ana Elisa Barreiros Bueno da Silva.
Título da Tese: Aspectos moleculares da transformação celular induzida
por Bcr-Abl .
Orientador(a): João Gustavo Pessini Amarante Mendes.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão
pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Presidente: Assinatura: ................................................................................................
Nome: .......................................................................................................
Instituição: ................................................................................................
Aos meus pais, Maria José e Luiz Carlos,
pessoas maravilhosas, a quem admiro
profundamente e adoro estar ao lado
Aos meus irmãos, Gui e Alê, a cada dia me sinto mais orgulhosa dos
homens que vocês se tornaram! E à minha irmã Fernandinha, a mais
especial das criaturas e o melhor abraço do mundo!
Ao Felipe, meu grande amigo e amor,
companheiro de todas as horas.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Gustavo P. Amarante-Mendes, uma pessoa apaixonada pela vida e pela Ciência.
Muito obrigada pela orientação, amizade e ótima convivência pessoal e científica. É muito
bom fazer parte do seu grupo de pesquisa.
À FAPESP, pela bolsa de doutorado e auxílio à pesquisa concedidos.
À CAPES, pela bolsa de doutorado-sanduíche (PDEE) concedida.
À Dra Junia V. Melo (Imperial College, Londres) que me recebeu em seu laboratório em
Londres durante o doutorado sanduíche. Obrigada pela oportunidade única de aprendizado e
amadurecimento profissional.
Aos Professores Dra. Alicia J. Kowaltowski, Dr. José Alexandre Marzagão Barbuto e Dr.
Roger Chammas, obrigada pelas sugestões e análise crítica deste trabalho durante o exame de
Qualificação (passagem de mestrado para doutorado).
Aos Professores Dr. Edecio Cunha-Neto, Dr. Kald Ali Abdallah e Dr. Luiz Fernando Lima
Reis, agradeço pelas sugestões e análise crítica deste trabalho durante o exame de
Qualificação (doutorado).
Ao Prof. Dr. Edecio Cunha-Neto por disponibilizar seu laboratório para a realização dos
experimentos de proteômica e pela valiosa colaboração científica.
À Priscila Camilo Teixeira e à Andréia C. K. Kuramoto, minhas colaboradoras e amigas,
muito obrigada pela enorme ajuda.
À Profa. Dra. Ana Campa e às Dras. Alziana Moreno da Cunha Pedrosa e Sueli de Oliveira
Silva, obrigada pelo convívio e pelas colaborações científicas.
À Profa. Dra Mahasti S. Macedo, que junto com o Prof. Dr. Gustavo P. Amarante-Mendes,
me orientou durante a Iniciação Científica.
Aos docentes do Departamento de Imunologia, em especial aos Professores Dra. Ises
Abrahamsohn, Dra. Lourdes Isaac, Dra. Regina D’Império Lima, Dr. Momtchilo Russo e Dr.
Luiz Vicente Rizzo.
Aos meus amigos do Laboratório: Claudinha, sempre muito divertida, adoro as suas piadas e
neuras; Jackie, o que falar de você, é o porto seguro de todos, a quem recorremos nas horas de
aperto, obrigada por ser essa amiga maravilhosa; Fabíola, um coração enorme, quer sempre
ajudar...quero ser igual a você quando crescer!; Marcita, a “honey”, muito engraçada e um
exemplo de determinação; Moki, minha amiguinha desde as épocas da Bio, amiga leal e que
adoro muito; Janine, a “JanJan”, chiquetérrima, torço muito por você; Ricardão, meu assessor
para assuntos culturais e “computadorescos”, obrigada pelas ajudas; Daniel, boa sorte no
futuro e você me deve uma viagem à Argentina!; Welbert, uma pessoa de sensibilidade
incrível e um talento musical admirável; Júlia, Maíra e Bruna, muito sucesso para vocês três
nessa vida. À todas as outras pessoas que passaram pelo laboratório nesses anos, em especial
às duas Gabrielas, à Sônia Baueb, ao Axel e ao Ulisses. É muito bom ter amigos como vocês.
Obrigada por toda ajuda, discussões científicas e ótimas risadas. Obrigada Satie, Áurea e
Marilú pelo suporte técnico dado ao laboratório e a esse trabalho.
Às duas Gabrielas, 1 e 2, trabalhar com vocês foi sempre divertido. Me lembro com saudades.
Que bom que continuamos amigas! Obrigada por todos os bons momentos!
Ao Axel, uma pessoa muito culta e de um bom gosto louvável. Obrigada por todas as
conversas e por me fazer rir com o seu mau-humor!
À todas as pessoas que conheci nesses anos de Departamento. Obrigada Eliana, Valdênia,
Carla, Gi, Lilia, Dri, Claudinho, Vláudia, Ulisses, Henrique, Ademir, Luciana, Alessandra,
Karina, Daniel, Pira, Luizão, Rosa e todos os outros que tornaram os corredores do ICB lugar
de conversas e pessoas agradáveis.
Aos meus amigos de “Cursão”, Leuridan, Simone, Fernando e Andréia. Foi muito bom
aprender Imunologia na companhia de vocês.
Aos funcionários do ICB IV: Andréas, Milton, Moisés, Nelson, Otacílio, Roberto e todo
pessoal da segurança do Departamento de Imunologia. “Miltão” e Otacílio, é sempre uma
alegria chegar no ICB e encontrar vocês!
Aos meus amigos de Londres: Eva, Nahla, Steve, Dan, Manuel, Eugenio, David, Valéria,
Daniela, Maria, Catarina, Oscar e Tânia.
À Jotelma Leite Ribeiro, à Valéria Machado dos Santos e à Eni do Sacramento Santos,
obrigada por toda ajuda e suporte nesses anos. Ao Amarildo Utiama, secretário da pós-
graduação, obrigada pela ajuda na fase final da tese.
Aos funcionários da Biblioteca do Instituto de Ciências Biomédicas, pela seriedade e
eficiência de seus serviços e no tratamento dado aos alunos.
Às minhas “hermanas” de Arquidiocesano: Beta, Di, Dri, Mi, Teca, Júlia, Koga, Renata, Dri,
Di, Mariana, Marcella e Andresa. É muito bom ter vocês na minha vida.
Aos meus amigos da Biologia-USP, em especial, ao Gustavinho e ao Rodrigo, obrigada pelas
conversas e risadas.
À toda minha família, sempre presente e maravilhosa. Agradeço a cada um de vocês: minhas
avós, avôs, tias, tios, primos e primas, obrigada por tudo!
À família Oliveira, Laura, Pedro e Andrea. Pelos dias e conversas agradáveis.
Ao Felipe, com quem tenho tantas histórias e aventuras. Obrigada pelo companheirismo e pela
enorme paciência e ajuda durante a confecção desta tese. Nem sei como te agradecer.
Aos meus irmãos, minhas cunhadas e minha linda sobrinha que enfeitam o meu dia. Obrigada
pelo carinho de vocês. E Sofia...seja bem-vinda!
Aos meus pais, Maria José e Luiz Carlos, obrigada pelo incentivo constante, carinho e
dedicação. É muito bom ter vocês por perto.
RESUMO E ABSTRACT
RESUMO
Bueno-da-Silva, AEB. Aspectos Moleculares da Transformação Celular Induzida por Bcr-Abl
[Tese]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008.
As leucemias positivas para o cromossomo Philadelphia, como a Leucemia Mielóide Crônica,
estão intimamente associadas à proteína Bcr-Abl. Essa molécula apresenta atividade tirosina-
quinase elevada e é capaz de induzir transformação maligna. Em células hematopoéticas, a
expressão de Bcr-Abl induz independência de fatores de crescimento, alterações nas propriedades
de adesão e alta resistência à apoptose. Os mecanismos moleculares pelos quais essa proteína
promove transformação celular parecem envolver vias dependentes e independentes de sua
atividade tirosina-quinase; contudo, essas vias, principalmente as independentes, ainda não foram
completamente esclarecidas. O objetivo principal deste trabalho foi investigar alterações
moleculares envolvidas na transformação celular induzida por Bcr-Abl, com enfoque especial para
aquelas relacionadas ao seu potencial anti-apoptótico. Para tanto, foram adotadas duas linhas de
investigação. A primeira concentrou-se no estudo da contribuição da sinalização independente da
atividade quinase de Bcr-Abl para a indução de resistência à apoptose. A segunda envolveu o uso
de uma abordagem proteômica para identificar alterações no padrão de expressão protéica global
associadas com a ação de Bcr-Abl. Para a primeira investigação, analisamos o comportamento de
células positivas para Bcr-Abl frente a estímulos pró-apoptóticos, enquanto sua função quinase
estava inibida farmacológica (mesilato de imatinibe) ou geneticamente (mutante quinase-
deficiente). Células que expressam Bcr-Abl se mostraram resistentes a indutores de morte mesmo
na presença do mesilato de imatinibe, sugerindo que a resistência à apoptose não depende da
manutenção constante da atividade tirosina-quinase, nem tampouco da presença de proteínas
fosforiladas em tirosina. Similarmente, a expressão de Bcr-Abl quinase-deficiente foi capaz de
bloquear a morte em alguns contextos celulares, indicando a existência de sinalização
independente desta atividade, a qual contribui parcialmente para a resistência à apoptose. Essa
inibição da sinalização apoptótica não parece estar associada à expressão de nenhuma das
moléculas analisadas, incluindo as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL. A comparação do
proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a presença de Bcr-Abl acarreta em
alterações profundas no padrão de expressão protéica. As proteínas cuja expressão foi afetada por
Bcr-Abl estão associadas a diversos processos celulares, como adesão, mobilidade, transdução de
sinais, resposta a estresse, metabolismo, proliferação e morte celular. Os achados deste trabalho
ampliam o conhecimento sobre as moléculas-alvo de Bcr-Abl e podem contribuir para o
entendimento dos mecanismos envolvidos na transformação celular e para a identificação de
novos marcadores de prognóstico e possíveis alvos terapêuticos.
Palavras-chave: Bcr-Abl. Apoptose. Tirosina-quinase.
ABSTRACT
Bueno-da-Silva, AEB. Molecular Aspects of Bcr-Abl-induced Cell Transformation [Thesis]. São
Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008.
Philadelphia chromosome positive leukemias, especially Chronic Myeloid Leukemia, are closely
associated with Bcr-Abl oncoprotein. This molecule is a constitutively activated tyrosine-kinase
and induces cell transformation in a variety of cell lines. In haematopoietic cells Bcr-Abl
promotes growth factor independence, alters cell adhesion properties and confers resistance to
apoptosis. Although it has been suggested that cell transformation by Bcr-Abl involves both
tyrosine-kinase-dependent and -independent pathways, the precise mechanisms are not fully
understood, specially the ones apparently not connected with its kinase activity. The aim of this
study was to investigate molecular alterations induced by Bcr-Abl that may be important for
malignant transformation and required for resistance to apoptosis. For this purpose we used two
different strategies. First, we addressed whether Bcr-Abl-positive cells would remain resistant to
apoptosis in the absence of Bcr-Abl tyrosine-kinase activity (inhibition by imatinib or the
expression of a kinase-deficient Bcr-Abl molecule). We found that Bcr-Abl-positive cells, despite
responding to imatinib with a blockage of Bcr-Abl kinase activity and consequent disappearance
of pY-containing proteins, remained extremely resistant to apoptogenic insults; additionally, our
data suggest that phosphotyrosine-containing proteins may not be responsible for the antiapoptotic
effect of Bcr-Abl. In accordance to this data, expression of a kinase-deficient Bcr-Abl molecule
induced resistance to apoptosis, suggesting the existence of kinase independent signals driven by
Bcr-Abl and related to the blockage of cell death. Our results suggest that Bcl–xL and Bcl-2 are
not involved in the short-term resistance to apoptosis observed in the absence of Bcr-Abl tyrosine
kinase. In the second part of the study, we used a proteomic approach to identify changes in
protein expression patterns associated with Bcr-Abl. The comparison between HL-60.vector and
HL-60.Bcr-Abl cells revealed that Bcr-Abl interfered on the expression of a great variety of
proteins. The molecules that were differentially expressed are associated with signal transduction
pathways, cell death, cellular motility, adhesion, communication, growth, stress response and
metabolism. The findings of this work improve the understanding of the signaling cascades
initiated by Bcr-Abl and might help to find new prognostic markers and therapeutic targets.
Key words: Bcr-Abl. Apoptosis. Tyrosine-kinase.
ABREVIATURAS E SIGLAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abl – Abelson leukemia
Act-D – Actinomicina D
ACN – Acetonitrila
AIF – “Apoptosis Inducing Factor”
Apaf-1 – “Apoptotic protease activating factor-1”
Ara-C – Citarabina
ATP – Trifosfato de adenosina
Bcl-2 – “B-cell lymphoma”
Bcr – “Breakpoint cluster region”
BH3 – “Bcl-2 homology”
BSA – Albumina de soro bovino
CaCl2 – Cloreto de Cálcio
CD – “Cluster of Differentiation”
CHX – Cicloheximida
CDK – “Cyclin-Dependent Kinase”
CO2 – Dióxido de carbono
DD – “Death Domain” (Domínio de Morte)
DED – “Death Effector Domain” (Domínio Efetor de Morte)
Diablo – “Direct IAP-binding protein with low pI”
DISC – “Death Inducing Signaling Complex” (Complexo de indução de sinalização)
DMEM – “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium”
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DTT – “Dithiothreitol”
DR – “Death receptor” (Receptor de Morte)
EDTA – Ácido etileno-diaminotetraacético
EGTA – Ácido etilenoglicol-bis
EGFP – “Enhanced Green Fluorescent Protein”
FACS – “Fluorescence-Activated Cell Sorting”
FADD – “Fas-Associated Death Domain”
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
FLICE – “FADD like ICE” (caspases-8)
FLIP – Proteína inibidora de FLICE (FLICE-inhibitory protein)
FSC – “Forward Scatter”
G418 – Gentamicina
GFP – “Green Fluorescent Protein”
Grb2 – “Growth Factor Receptor-Bound protein 2”
HEPES – Hidroxietilpiperazina
HFS – “Hypotonic Fluorescent Solution” (Solução Hipotônica Fluorescente)
IAP – “Inhibitor of Apoptosis” (Inibidor da apoptose)
IEF – “Isoelectric focusing”
IFN-α
αα
α – Interferon alfa
I-κB – Inibidor de NF- κB
IL – Interleucina
KCL – Cloreto de potássio
kDa – KiloDaltons
LB – Luria Bertani
LLA – Leucemia Linfocítica Aguda
LMC – Leucemia Mielóide Crônica
LNC – Leucemia Neutrofílica Crônica
MALDI – “Matrix assisted laser desorption/ionization”
MAPK – “Mitogen Activated Protein Kinase”
MCL-1 – “Myeloid Cell Leukemia-1”
MM – Massa molecular
NaCl – Cloreto de sódio
NF- κB – “Nuclear Factor kappa B”
NRTKs – “Non-receptor Tyrosine Kinases”
PBS – “Phosphate Buffered Saline” (Salina tamponada com fosfato)
pI – Ponto isoelétrico
PI – Iodeto de propídeo
PI3-k – Fosfatidil Inositol-3-quinase
PKB – Proteína quinase B
PMF – “peptide mass fingerprint”
PTKs – “Protein Tyrosine Kinases”
PVDF – DifluoridoPolividileno
RTKs – “Receptor Tyrosine Kinases”
SBF – Soro Bovino Fetal
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SH – “SHC-homology (domain)”
SMAC – “Second Mitochondria-derived Activator of Caspases”
SPK1 – “Sphingosine kinase-1”
SSC – “Side Scatter”
STAT – “Signal transducer and activator of transcription”
STI571 – “Signal Transduction Inhibitor 571”
STS – Estaurosporina
TAE – “Tris Acetate EDTA”
TBS – Salina tamponada com Tris
TE – Tris EDTA
TGF – Fator de crescimento de tumor
TNF – Fator de necrose tumoral
ToF – “Time-of-Flight”
TRAIL – “TNF-related apoptosis inducing ligand”
Tris HCl – Tris hidroclorídrico
UV – Ultravioleta
VDAC – “Voltage-dependent anion channel”
VM26 – Teniposídeo
VP16 – Etoposídeo
SUMÁRIO
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................
22
1.1 Câncer e apoptose ..................................................................................... 22
1.2 Câncer e tirosina-quinases ....................................................................... 30
1.3 Leucemia mielóide crônica ....................................................................... 35
1.4 Bcr-Abl: estrutura, atividade enzimática e efeitos celulares ..................... 39
1.5 Vias de sinalização ativadas por Bcr-Abl ................................................. 43
1.5.1 Bcr-Abl e a via de Ras .............................................................................. 43
1.5.2 Bcr-Abl e a via de PI3-k/Akt ................................................................... 45
1.5.3 Bcr-Abl e a ativação de NF-κB .................................................................
47
1.5.4 Bcr-Abl e a via de STAT .......................................................................... 48
1.5.5 Vias de sinalização ativadas por Bcr-Abl: considerações finais ...............
49
1.6 Inibidores de tirosina-quinase – resultados e perspectivas ...................... 50
2
OBJETIVOS ................................................................................................
56
3
MATERIAIS E MÉTODOS ...........................................................................
58
3.1 Linhagens celulares .................................................................................. 58
3.1.1 Células de mamíferos ............................................................................... 58
3.1.2 Bactérias .................................................................................................... 60
3.2 Plasmídeos utilizados ................................................................................ 60
3.3 Agentes indutores de apoptose ................................................................. 61
3.4 Inibidor da atividade tirosina-quinase .......................................................
62
3.5 Transformação bacteriana ......................................................................... 62
3.6 Purificação de DNA plasmidial ................................................................ 62
3.6.1 Preparação do pré-inóculo e inóculo .........................................................
62
3.6.2 Obtenção do DNA plasmidial ................................................................... 63
3.7 Digestões enzimáticas ............................................................................... 63
3.8 Eletroforese de DNA .................................................................................
64
3.9
Sequenciamento do plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR .................
64
3.10 Transfecções celulares, obtenção de partículas retrovirais e infecções de
células-alvo ...............................................................................................
64
3.11 Eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e Western-blot ........................... 67
3.12 Quantificação da morte celular por citometria de fluxo ........................... 68
3.13 Análise do padrão de expressão protéica global e de proteínas
fosforiladas em tirosina - eletroforese em gel bidimensional .................
69
3.13.1 Eletroforese bidimensional ....................................................................... 70
3.13.1.1
Preparo das amostras .................................................................................
70
3.13.1.2
Focalização isoelétrica: primeira dimensão .............................................. 70
3.13.1.3
Eletroforese SDS-PAGE: segunda dimensão ........................................... 71
3.13.2 Coloração dos géis com azul de Coomassie e marcação com anticorpo
anti-fosfotirosina .......................................................................................
72
3.13.3 Aquisição das imagens ..............................................................................
72
3.13.4 Análise e comparação dos géis ................................................................. 73
3.13.5 Processamento dos “spots”........................................................................ 75
3.13.6 Análise por espectrometria de massas e identificação das proteínas ........ 76
4
RESULTADOS .............................................................................................
80
Parte 1: Contribuição da sinalização independente da atividade tirosina-
quinase de bcr-abl para a resistência à apoptose .......................................
80
4.1 Estratégia 1: inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl pelo
mesilato de imatinibe ................................................................................
80
4.1.1 Expressão de Bcr-Abl confere resistência à apoptose .............................. 80
4.1.2 Inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl pelo mesilato de
imatinibe é dose-dependente, rápida e duradoura .....................................
82
4.1.3 Efeito do tratamento com mesilato de imatinibe na viabilidade de
células Bcr-Abl-positivas ..........................................................................
84
4.1.4 A inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl não sensibiliza as
células à indução de apoptose por diferentes drogas ................................
86
4.1.5 Mesilato de imatinibe não sensibiliza células que expressam Bcr-Abl à
ativação de caspase-3 por drogas quimioterápicas ...................................
89
4.1.6 Análise da expressão de proteínas da família Bcl-2 em células tratadas
com mesilato de imatinibe ........................................................................
91
4.2 Estratégia 2: Expressão de Bcr-Abl-quinase-deficiente ........................... 97
4.2.1
Seqüenciamento do plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KD .................
97
4.2.2 Transfecção de células 293T para obtenção de partículas retrovirais
utilizadas para a infecção de células alvos ................................................
98
4.2.3 Infecção e seleção de células HL-60 incubadas com o sobrenadante
viral de células empacotadoras .................................................................
101
4.2.4 Efeito da expressão de Bcr-Abl/KR em células HeLa .............................. 104
4.2.4.1 Expressão de Bcr-Abl-quinase-deficiente confere resistência à apoptose
induzida por luz ultravioleta .....................................................................
105
4.2.5 Células Jurkat, Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-Abl/KR e Jurkat.Bcr-Abl:
caracterização e resistência à apoptose .....................................................
111
4.2.6 Células THP-1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e
THP-1.Bcr-Abl – caracterização e resistência à apoptose ........................
114
Parte 2: Impacto da expressão de Bcr-Abl no proteoma de células HL-
60 .Bcr-Abl (OW) .....................................................................................
119
4.3.1 Proteoma e fosfoproteoma de células HL-60.vetor e
HL-60.Bcr-Abl ..........................................................................................
119
4.3.1.1 “Spots” com maior intensidade em células HL-60.Bcr-Abl ..................... 136
4.3.1.2 “Spots” regulados negativamente em células HL-60.Bcr-Abl ................. 141
5
DISCUSSÃO ................................................................................................
147
5.1 Contribuição da sinalização independente da atividade tirosina-quinase
de Bcr-Abl para a resistência à apoptose ..................................................
147
5.2 Impacto da expressão de Bcr-Abl no proteoma de células HL-60 ........... 172
6
CONCLUSÕES ............................................................................................
185
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................
187
ANEXOS .....................................................................................................
217
Artigo publicado: “Bcr-Abl-mediated resistance to apoptosis is
independent of constant tyrosine-kinase activity” ....................................
217
Lista completa de publicações .................................................................. 223
INTRODUÇÃO
22
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER E APOPTOSE
Câncer é um termo genérico utilizado para designar um conjunto de doenças que
podem afetar diferentes partes do organismo (OMS – Organização Mundial da Saúde) e cuja
fisiopatologia está associada a um processo dinâmico e progressivo de alterações genéticas,
como anormalidades cromossômicas e mutações em genes supressores de tumor e oncogenes
(Vogelstein e Kinzler, 1993).
Apesar de décadas dedicadas à pesquisa do câncer e à investigação de novos
tratamentos para essa doença, as taxas de mortalidade continuam altas, fazendo com que as
neoplasias representem atualmente uma das principais causas de morte no mundo. Em 2005,
segundo relatório da OMS, das 58 milhões de pessoas que morreram no mundo, 7,6 milhões
(13%) tiveram como causa da morte o câncer. Esse número de mortes por câncer também foi
citado nas estimativas da “American Cancer Society” para o ano de 2007. O diagnóstico
tardio, o pouco entendimento da epidemiologia e da etiologia molecular dos cânceres
humanos são apontados como potenciais razões para a alta mortalidade (Lim, 2005).
A maioria das neoplasias humanas tem sua fisiopatologia ligada à mutações somáticas
pontuais e apenas 1% à mutações na linhagem germinativa (Blume-Jensen e Hunter, 2001).
Mutações que promovem o ganho de função de produtos gênicos foram as primeiras
alterações genéticas descritas como fatores desencadeadores do câncer. Com base nessa
observação definiu-se um grupo de oncogenes que representam versões mutadas de genes
celulares normais. Esses últimos, pelo potencial de se transformarem em oncogenes, passaram
a ser denominados de proto-oncogenes. Posteriormente, foi demonstrado que mutações que
induzem a perda de função de genes conhecidos como genes supressores de tumor,
contribuem igualmente para o processo de carcinogênese (Collins et al., 1997; Bertram,
2000).
A transformação de uma célula normal em tumoral (tumorigênese) é um processo
multifatorial e altamente complexo, relacionado a alterações genéticas que podem, portanto,
ativar oncogenes ou inativar genes supressores de tumor. Os produtos desses genes mutantes
conferem características malignas específicas às células, como: a proliferação descontrolada,
o bloqueio da diferenciação e da morte celular, a indução de neoangiogênese, a instabilidade
genômica e a invasão de tecidos (Bertram, 2000; Shachaf e Felsher, 2005).
A compreensão de que o câncer é uma doença genética sugere que a tumorigênese
pode ser revertida pela inativação ou reparo do(s) gene(s) mutante(s) específico(s) (Shachaf e
23
Felsher, 2005). Nesse contexto, a indústria farmacêutica e a comunidade científica têm se
empenhado muito para o desenvolvimento de terapias que atuem direta e exclusivamente no
circuito celular que está alterado nas células neoplásicas (“target therapy”).
Nos últimos anos diversos estudos relataram que, além das alterações genéticas,
fenômenos epigenéticos, como o silenciamento gênico por hipermetilação de seqüências
presentes nos promotores de diversos genes, são importantes para o início, manutenção e
progressão de tumores (Baylin e Ohm, 2006). Desse modo, a célula tumoral seria resultante da
somatória de numerosas influências genéticas, epigenéticas e micro-ambientais (Irish et al.,
2004).
A despeito da grande variedade de neoplasias, o que se observa em todos os cânceres é
a existência de acúmulo celular, o qual parece estar associado à redução da sensibilidade das
células tumorais aos mecanismos regulatórios normais de proliferação, adesão, diferenciação
e morte (Collins et al., 1997).
Hanahan e Weinberg propuseram seis modificações na fisiologia celular que
induziriam a transformação de células normais em tumores malignos e que seriam
compartilhadas pela maioria, senão por todos os tipos de câncer humano. São elas: 1) auto-
suficiência na geração de sinais de crescimento, 2) insensibilidade ou redução da sensibilidade
a estímulos inibitórios do crescimento, 3) escape da morte celular por apoptose, 4) potencial
replicativo ilimitado, 5) angiogênese, e 6) invasão tecidual e metástase (Hanahan e Weinberg,
2000). Células neoplásicas apresentam, portanto, defeitos em vias de sinalização que
controlam os processos de proliferação, homeostase e morte celular (Hanahan e Weinberg,
2000). Essas alterações são adquiridas por uma seleção gradativa de mutações gênicas e
oferecem vantagens replicativas para as células tumorais sobre as células normais
(Blagosklonny, 2003).
Um dos maiores avanços na pesquisa do câncer foi o reconhecimento de que a
apoptose tem um papel central tanto na formação do tumor, uma vez que algumas mutações
oncogênicas bloqueiam a apoptose, contribuindo para o inicio e progressão de tumores
(Debatin et al., 2003), quanto na resposta ao tratamento, visto que a indução de morte de
células tumorais por diversas estratégias citotóxicas, como drogas anticâncer, irradiação-γ,
genes suicidas ou imunoterapia, é mediada, em grande parte, pela indução de apoptose nas
células-alvo (Debatin et al., 2003).
A apoptose é um processo ativo e molecularmente controlado de eliminação celular,
que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase de organismos
multicelulares (Samali et al., 1997). Em condições fisiológicas esse tipo de morte representa,
provavelmente, o principal mecanismo de compensação da geração de células por mitose,
24
sendo crucial em diversos processos biológicos, como: desenvolvimento embrionário, durante
o qual é essencial para a organogênese; manutenção da homeostase tecidual; seleção e
estabelecimento do repertório imunológico; controle da hematopoese e das respostas imunes;
citotoxicidade mediada por linfócitos T e células NK (Samali et al., 1997; Meier et al., 2000;
Creagh et al., 2003; Danial e Korsmeyer, 2004). Morfologicamente as células apoptóticas são
caracterizadas pelos seguintes eventos: degradação do DNA genômico em fragmentos
oligonucleossomais, condensação da cromatina, a diminuição do volume e o aumento da
granulosidade celular, manutenção da estrutura das organelas, formação de pregas
citoplasmáticas e conseqüente fragmentação das células nos chamados corpos apoptóticos
(Kerr et al., 1972; Wyllie et al., 1980). Outra característica importante de células em apoptose
é o fato de serem reconhecidas e fagocitadas por células adjacentes ou fagócitos profissionais,
evitando a instalação de um processo inflamatório (Savill et al., 1993; Fadok et al., 1998).
Uma grande variedade de estímulos pode induzir a morte por apoptose, incluindo a
sinalização via receptores de morte, retirada de fatores de crescimento e agentes causadores de
dano no DNA, como a irradiação e as drogas citotóxicas. Esses sinais desencadeiam uma
cascata de sinalização intracelular, conservada evolutivamente e controlada geneticamente,
muito semelhante nos diversos tipos celulares e que depende da ação de proteases distribuídas
nos compartimentos celulares (Herr e Debatin, 2001; Debatin et al., 2003).
Em mamíferos, diversos estímulos de morte induzem apoptose por meio da ativação de
membros de uma família de proteases denominadas caspases. As caspases são cisteíno-
proteases encontradas no citoplasma e no retículo endoplasmático que possuem um resíduo de
cisteína em seu sítio ativo e apresentam a particularidade de clivar após ácido aspártico
(Cohen, 1997; Thornberry, 1998; Thornberry e Lazebnik, 1998). Essas proteases são
sintetizadas na forma de precursores inativos ou zimógenos, que são constituídos
estruturalmente por três regiões: um pró-domínio na extremidade amino-terminal, uma
subunidade grande na porção central da molécula e uma subunidade pequena na porção
carboxi-terminal (Cohen, 1997; Nicholson e Thornberry, 1997). De modo geral, a ativação
dessas proteases por indutores de apoptose envolve: o processamento proteolítico da região
contendo o resíduo de ácido aspártico, a remoção do pró-domínio e a associação das
subunidades grandes e pequenas para a formação do sítio ativo. Como durante a ativação há o
agrupamento dessas subunidades em tetrâmeros, o arranjo final possui dois sítios ativos
(Cohen, 1997; Thornberry e Lazebnik, 1998; Danial e Korsmeyer, 2004). Quatorze caspases
já foram identificadas em mamíferos, no entanto, nem todas são encontradas em humanos, e
somente parte delas está envolvida na regulação da apoptose, enquanto as demais parecem
estar mais relacionadas ao processamento de citocinas pró-inflamatórias (Slee et al., 2001).
25
Com base em seu arranjo estrutural e atividade biológica, as caspases foram divididas em dois
grandes grupos: caspases envolvidas no controle da apoptose (caspase-2, -3, -6, -7, -8, -9 e -
10) e caspases envolvidas nas respostas inflamatórias (caspase-1, -4, -5 e -11) (Belmokhtar et
al., 2001; Creagh et al., 2003). No contexto da morte celular, as caspases participam como
iniciadoras do programa de morte, como elementos regulatórios e elementos efetores, sendo
responsáveis pelas alterações morfológicas e bioquímicas que ocorrem no núcleo, citoplasma,
organelas e na membrana plasmática de células apoptóticas. (Slee et al., 1999). De modo
geral, as caspases iniciadoras (caspase-2, -8, -9 e -10) se auto-ativam após serem agregadas
por moléculas adaptadoras (FADD e Apaf-1, ver adiante) e, após acionadas, promovem a
ativação de caspases efetoras (caspases-3, -6 e -7), as quais clivam substratos celulares
necessários para o funcionamento normal das células, incluindo proteínas estruturais do
citoesqueleto e proteínas nucleares (Slee et al., 2001). Por exemplo, as mudanças na
morfologia do núcleo durante a apoptose, estão associadas à clivagem de lamina nuclear,
enquanto as alterações na forma geral da célula estão provavelmente relacionadas com a
clivagem de proteínas do citoesqueleto, como fodrina, actina, gelsolina e citoqueratina (Herr e
Debatin, 2001). Além disso, as caspases ativam outras enzimas, como DNAses, que iniciam a
clivagem do DNA em regiões específicas (Riccardi e Nicoletti, 2006). Uma das características
típicas de células em apoptose é a fragmentação do DNA em fragmentos oligossomais (Wyllie
et al., 1980), fenômeno atribuído a ação da endonuclease CAD (“caspase-dependent
deoxiribonuclease”). Em condições normais CAD se encontra no citoplasma ligada ao seu
inibidor, ICAD (“Inhibitor of CAD”). ICAD, por sua vez, é um dos substratos de caspase-3 e,
quando clivado, libera CAD que transloca para o núcleo, onde promove a degradação do
DNA (Wyllie et al., 1980; Sakahira et al., 1998). A ativação de caspases pode ser inibida por
membros de uma família de inibidores endógenos de caspases conhecidos por IAPs
(“Inhibitors of Apoptosis”), que incluem XIAP, c-IAP1, c-IAP2, que inibem caspase-3, -7 e -
9, e survivina que está envolvida na regulação do ciclo celular e mitose (Herr e Debatin,
2001).
Em mamíferos foram identificadas duas vias principais de sinalização da apoptose que
envolvem a ativação de caspases, são elas: a Via Intrínseca (via mitocondrial) e a Via
Extrínseca (via dos receptores de morte) (Figura 1) (Hengartner, 2000; Puthalakath e Strasser,
2002).
26
FIGURA 1: Vias principais de sinalização da apoptose. Esquema geral das vias Extrínseca (à esquerda) e
Intrínseca (à direita). Figura adaptada de (Hengartner, 2000).
A Via Intrínseca inicia-se pela ação de diferentes sinais de estresse intra e
extracelulares, tais como irradiação, agentes quimioterápicos, anóxia, vírus, bactérias e
retirada de fatores de crescimento celular, os quais, após sensibilizarem moléculas
regulatórias, são convergidos para a mitocôndria, podendo resultar na ativação do programa
de morte (Puthalakath e Strasser, 2002). Dependendo da intensidade do estresse celular, a
mitocôndria, ao receber os estímulos apoptóticos, pode sofrer alterações nas propriedades da
sua membrana externa, acarretando na liberação para o citosol de fatores apoptogênicos que
antes se encontravam aprisionados no espaço intermembranar, desencadeando assim o
processo apoptótico. Dentre os fatores mitocondriais que são liberados para o citosol durante a
apoptose, destacam-se: citocromo c, Smac/Diablo (“second mitochondria-derived activator of
caspases”/“direct IAP-binding protein with a low isoelectric point”), AIF (“apoptosis-
27
inducing factor”), Omi/HtrA2 e endonuclease G (Endo G) (Liu et al., 1996; Breckenridge e
Xue, 2004).
O citocromo c, quando no citossol, desencadeia uma série de reações que culminam
com a formação de um complexo de ativação de caspases, denominado apoptossomo,
formado por citocromo-c, Apaf-1 (“apoptosis protease-activating factor-1”), dATP e pró-
caspase-9 (Li et al., 1997). Uma vez clivada e ativada nesse complexo multi-molecular, a
caspase-9 promove a ativação de caspases executoras (efetoras), como caspase-3, -6 e -7 que
clivam uma série de substratos celulares críticos, levando ao desmantelamento da célula e às
características fenotípicas que definem a apoptose (Figura 1) (Liu et al., 1996; Slee et al.,
2001). Dentre esses substratos, destacam-se: PARP (“poly-(ADP-ribose) polimerase”), uma
enzima de reparo clivada preferencialmente por caspase-3 e -7 (Lazebnik et al., 1994) e
laminas, que são componentes da lâmina nuclear e são clivadas preferencialmente por
caspase-6 (Belmokhtar et al., 2001).
Smac/Diablo e Omi/HtrA2, por sua vez, atuam como neutralizadores dos efeitos
inibitórios dos IAPs e contribuem, dessa forma, para a ativação das caspases. Enquanto
citocromo c e Smac/DIABLO atuam em última análise como ativadores de caspases, AIF e
Endo G podem mediar a indução de morte caspase-independente. Já Omi/HtrA2 tem um papel
duplo: como ativador de caspases, na medida em que age como um inibidor de IAPs, e um
efetor de morte independente de caspase, por meio de sua atividade de protease (Herr e
Debatin, 2001; Breckenridge e Xue, 2004).
Algumas moléculas que atuam na mitocôndria exercem um papel central no controle
da apoptose pela via intrínseca. Esse é o caso das proteínas da família Bcl-2, que apresenta
membros que inibem a apoptose, regulando e prevenindo a translocação dos fatores
apoptogênicos da mitocôndria para o citossol; e membros que promovem a morte celular.
Com base nas suas funções e na quantidade de domínios de homologia do tipo BH (“Bcl-2
Homology”) que apresentam em sua estrutura, os componentes dessa família podem ser
reunidos em três grupos (Reed, 1997). Os membros anti-apoptóticos, como Bcl-2, Bcl-x
L
,
Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1, Boo/Diva/Bcl2-L-10 e Bcl-B, compartilham 3-4 domínios BH (BH1-
4), enquanto os membros pró-apoptóticos são divididos em duas sub-famílias: uma que inclui
Bax, Bak, Bok/Mtd, Bcl-x
S
e Bcl-G
L
, cujos membros possuem 2 a 3 domínios BH; e o
terceiro grupo que caracteriza-se pela presença de um único domínio BH (“BH-3 only”), do
qual fazem parte as proteínas Bad, Bik/Nbk, Blk, Hrk/DP5, Bid, Bim/Bod, Noxa, Puma/Bbc3,
Bcl-G
S
e Bmf (Figura 2) (Puthalakath e Strasser, 2002).
28
FIGURA 2: Proteínas anti- e pró-apoptóticas da família Bcl-2. Figura adaptada de (Cory e Adams, 2002).
A maioria das proteínas da família Bcl-2 é capaz de interagir fisicamente com outras
proteínas da mesma família, formando homo- ou heterodímeros. Essas interações podem fazer
com que os membros dessa família atuem como agonistas ou antagonistas uns dos outros,
sendo que a proporção entre os componentes pró- e anti-apoptóticos nos dímeros é crítica para
a indução da morte celular (Antonsson e Martinou, 2000).
Os mecanismos pelos quais os membros da família Bcl-2 regulam a permeabilização
das membranas da mitocôndria e a liberação dos fatores apoptogênicos para o citosol, ainda
não foram completamente desvendados (Herr e Debatin, 2001; Breckenridge e Xue, 2004).
No entanto, sabe-se que proteínas das duas sub-famílias de membros pró-apoptóticos
colaboram e são necessárias para a indução da apoptose e liberação dos fatores apoptogênicos
pela mitocôndria. Enquanto as proteínas do grupo “BH3-only” parecem agir como sensores de
danos celulares e antagonistas diretos das proteínas anti-apoptóticas, sendo essenciais para o
início da sinalização apoptótica, os membros da família de Bax atuam “downstream”
provavelmente na ruptura da mitocôndria (Cory e Adams, 2002).
Em células saudáveis Bak e Bax são, geralmente, mantidos na mitocôndria e no
citosol, respectivamente, na forma monomérica (inativa ou dormente), por meio de interações
com outras proteínas. Em resposta a estímulos pró-apoptóticos, Bak e Bax formam homo-
oligômeros na membrana externa da mitocôndria e isso parece ser essencial para a indução de
morte. A importância dessas duas proteínas para o processo apoptótico, foi observada em uma
série de estudos que mostraram que, enquanto a inativação individual de Bax e Bak tem pouco
efeito sobre a apoptose, a inativação concomitante de ambos, bloqueia drasticamente a
29
liberação de citocromo c e a apoptose induzida por diversos estímulos da via intrínseca
(Lindsten et al., 2000; Wei et al., 2001; Cory e Adams, 2002). Quanto ao papel dos
oligômeros de Bak e Bax na permeabilização da membrana da mitocôndria e na indução da
apoptose, foi proposto que esse arranjo estaria envolvido na formação de poros (canais) na
membrana externa da mitocôndria, os quais permitiriam a saída dos fatores apoptogênicos
(Antonsson et al., 2000; Pavlov et al., 2001). Uma hipótese alternativa, seria a interação de
Bax com componentes de poros de transição de permeabilidade já presentes na mitocôndria,
como, por exemplo, VDAC (“voltage-dependent anion channel”), para a formação de canais
maiores (Shimizu et al., 1999; Cory e Adams, 2002).
Quanto ao controle negativo da morte celular na Via Intrínseca, diversas evidências
sugerem que as proteínas anti-apoptóticas se utilizam de duas estratégias principais para
prevenir a liberação de citocromo c e bloquear a apoptose, são elas: a interação e seqüestro de
proteínas da família “BH3-only” e a inibição da oligomerição de Bak e Bax na mitocôndria
(Cory e Adams, 2002; Breckenridge e Xue, 2004).
A Via Extrínseca é desencadeada pela interação de receptores localizados na superfície
celular, denominados “Receptores de Morte” (DR, “death receptors”), com seus ligantes
específicos. Esses receptores pertencem à superfamília dos receptores TNF (“tumor necrosis
factor”), como CD95 (Fas/APO-1), TNF-R1, DR3, TRAIL (“TNF-related apoptosis-inducing
ligand”)-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5) e DR6 e possuem um domínio de morte (DD, “death
domain”) na cauda citoplasmática (Ashkenazi e Dixit, 1998; Golks et al., 2005). A
estimulação dos receptores de morte por seus respectivos ligantes (CD95/CD95L, por
exemplo) resulta na trimerização dos DR, a qual permite o recrutamento para a membrana de
duas proteínas sinalizadoras, a molécula adaptadora FADD (“Fas-associated death domain”) e
pró-caspase-8 (em humanos, caspase-10 também pode ser recrutada), formando o complexo
sinalizador para a indução de morte, DISC (“Death Inducing Signaling Complex”)
(Chinnaiyan et al., 1995). A interação entre os receptores de morte e a molécula FADD é
realizada via os domínios DD de ambos, enquanto que a interação entre FADD e a pró-
caspase-8 é mediada pelos domínios DED (“death effector domain”). Além de FADD, outras
moléculas adaptadoras, como TRADD, podem ser recrutadas para o DISC, dependendo do
receptor de morte envolvido (Ashkenazi e Dixit, 1998). Após o seu recrutamento, a pró-
caspase-8 é convertida em sua forma ativa e é liberada para o citossol, onde pode agir
diretamente na fase executora da apoptose ao ativar caspase-3, ou então promover o
desencadeamento da via intrínseca por meio da clivagem da molécula Bid. Quando truncado
pela ação de caspase-8, Bid (tBid) se dirige à mitocôndria, promove a oligomerização das
proteínas pró-apoptóticas Bak e Bax, o que resulta em alterações nas funções mitocondriais e
30
na liberação de citocromo c (Wei et al., 2001). A caspase-8 também pode ser ativada em
outros contextos, como na morte induzida por grânulos de células citotóxicas (linfócitos T e
células NK), durante a qual caspase-8 é processada diretamente pela protease granzima B
presente nos grânulos, e na morte induzida por estresse celular, durante a qual pode ser
ativada proteoliticamente por caspase-6 (Murphy et al., 2004). O recrutamento e ativação da
pró-caspase-8 são alvos de proteínas anti-apoptóticas, como a proteína c-FLIP (“FADD-like
ICE inhibitory protein”) que, apesar de ser estruturalmente semelhante a caspase-8, não possuí
domínio catalítico ativo. Dessa forma, c-Flip pode se ligar ao complexo CD95-FADD por
meio de interações DED-DED, inibindo o recrutamento e a conseqüente clivagem e ativação
da pró-caspase-8, impedindo assim o desencadeamento dos sinais apoptóticos (Figura 1)
(Golks et al., 2005).
Diversas patologias estão associadas à perturbações na regulação do processo de
apoptose. Enquanto a resistência anormal à apoptose está associada ao aparecimento de
neoplasias e doenças auto-imunes, devido a persistência de células mutantes ou
transformadas, a sua exacerbação pode acarretar no surgimento de doenças degenerativas
agudas e crônicas, como imunodeficiências e infertilidade (Danial e Korsmeyer, 2004).
Um grande número de genes está envolvido no controle molecular da apoptose e
alguns deles já foram identificados como oncogenes ou estão desregulados em alguns tipos de
câncer. Considera-se que os oncogenes podem utilizar duas estratégias de transformação
celular, uma que inclui independência de fatores de crescimento, aumento da taxa de mitose e
outros eventos que levam à desregulação da proliferação celular, e outra baseada na geração
de sinais anti-apoptóticos (Amarante-Mendes et al., 1997). A maioria das neoplasias,
incluindo as leucemias associadas à tirosina-quinase Bcr-Abl, apresenta mais de uma dessas
estratégias ativadas.
Muitos trabalhos têm mostrado que a desregulação da atividade de proteínas quinases
exacerba a proliferação celular, bloqueia a diferenciação celular e suprime a apoptose,
levando a carcinogênese (Blume-Jensen e Hunter, 2001).
1.2 CÂNCER E TIROSINA-QUINASES
Determinadas classes de proteínas e vias de sinalização são mais freqüentemente alvos
de mutações oncogênicas do que outras. Um exemplo são as proteínas tirosina-quinases
(PTKs, “protein tyrosine kinases”), cuja atividade enzimática está fortemente regulada em
células não transformadas, mas quando mutadas ou alteradas estruturalmente apresentam
31
atividade quinase constitutivamente ativa e se tornam potentes oncoproteínas, promovendo a
transformação celular (Blume-Jensen e Hunter, 2001).
As proteínas tirosina-quinases são enzimas que transferem grupos fosfato da molécula
de ATP para resíduos de tirosina localizados em substratos protéicos (Hunter e Cooper, 1985;
Hubbard, 2002). A habilidade das proteínas quinases de fosforilar outras proteínas pode ser
considerada a base da transmissão de sinais celulares (Hunter, 1987), sendo utilizada por
organismos multicelulares para comunicação celular e importante para inúmeros processos
biológicos como o desenvolvimento embrionário, metabolismo, regulação do sistema imune e
manutenção dos tecidos adultos.
A fosforilação em resíduos de tirosina é uma modificação pós-traducional essencial e
finamente regulada, capaz de modular praticamente todas as propriedades de uma proteína,
incluindo sua atividade enzimática, estabilidade protéica, localização subcelular e atividade
transcricional, além de promover a criação de sítios de ligação para outras proteínas
sinalizadoras, modificando, assim, a interação entre proteínas (Hunter, 1987; Lim, 2005). Os
substratos fosforilados participam da regulação de processos celulares fundamentais como:
proliferação, diferenciação e sobrevivência (Mauro e Druker, 2001).
O Projeto Genoma Humano revelou que aproximadamente 20% dos nossos genes
codificam proteínas que participam na transdução de sinais e, dentre elas, existem mais de 520
proteínas quinases e 130 fosfatases envolvidas no controle da fosforilação de substratos
protéicos (Blume-Jensen e Hunter, 2001). Muitos dos sinais celulares envolvidos no
crescimento, diferenciação, adesão, motilidade e morte celular, são freqüentemente
transmitidos por tirosina-quinases (Robinson et al., 2000). Além disso, as PTKs possuem
relevância particular no aparecimento e desenvolvimento de inúmeras doenças humanas, tais
como: diabetes, retinopatia, ateroesclerose e câncer (Hubbard e Till, 2000; Robinson et al.,
2000; Hubbard, 2002).
Cerca de 90 proteínas tirosina-quinases foram identificadas, dentre as quais 58 são do
tipo receptor transmembrânico (Figura 3) e 32 do tipo não receptor (Figura 4), as quais são
geralmente encontradas no citoplasma (Robinson et al., 2000; Blume-Jensen e Hunter, 2001;
Hubbard, 2002; Vlahovic e Crawford, 2003).
A família de proteínas PTK do tipo receptor (RTKs – “receptor tyrosine kinases”)
inclui os receptores para insulina e para os diversos fatores de crescimento, como EGF
(“epidermal growth factor”), PDGF (“platelet-derived growth factor”), FGF (“fibroblast
growth factor”) e VEGF (“vascular endothelial growth factor”) que ativam vias de sinalização
intracelular, regulando proliferação, diferenciação, migração e metabolismo (Hubbard e Till,
2000).
32
Quanto a sua organização, as RTKs são moléculas de superfície que possuem uma
porção extracelular composta por múltiplos domínios, envolvida na interação com ligantes
polipeptídicos, uma porção transmembrânica e uma região citoplasmática que contém um
domínio tirosina-quinase cercado por seqüências regulatórias dispostas nas porções C-
terminal e N-terminal desse domínio enzimático (Figura 3) (Hubbard e Till, 2000; Hubbard,
2002). Essas glicoproteínas de membrana são geralmente monoméricas e, após serem ativadas
pela interação com seus ligantes, transmitem os sinais extracelulares para o citoplasma por
meio da fosforilação de resíduos de tirosina presentes nos próprios receptores
(autofosforilação) ou em outras proteínas sinalizadoras (Hubbard e Till, 2000).
FIGURA 3: Organização dos domínios de tirosina-quinases do tipo receptor. O protótipo do receptor de cada
família está indicado acima do esquema do receptor e os membros de cada família estão listados
abaixo. A parte superior refere-se à porção extracelular e a inferior à porção citoplasmática dos
receptores. Abreviaturas: EGFR, “epidermal growth factor receptor”; InsR, “insulin receptor”;
PDGFR, “platelet-derived growth factor receptor”; VEGFR; “vascular endothelial growth factor
receptor”; FGFR, “fibroblast growth factor receptor”; KLG/CCK, “colon carcinoma kinase”; NGFR,
“nerve growth factor receptor”; HGFR, “hepatocyte growth factor receptor”, EphR, “ephrin
receptor”; Axl, a Tyro3 PTK; TIE, “tyrosine kinase receptor in endothelial cells”; RYK, “receptor
related to tyrosine kinases”; DDR, “discoidin domain receptor”; Ret, “rearranged during
transfection”; ROS, RPTK “expressed in some epithelial cell types”; LTK, “leukocyte tyrosine
kinase”; ROR, “receptor orphan”; MuSK, “muscle-specific kinase”; LMR, “Lemur”. Destacam-se
em negrito, os membros dessa família implicados em doenças malignas humanas. Figura retirada de
(Blume-Jensen e Hunter, 2001).
O grupo das PTK do tipo não receptor (NRTKs - “nonreceptor tyrosine kinases”)
engloba, além de outras, as proteínas Src, Abl, Fak e Janus quinases (Jaks) (Hubbard, 2002).
Essas moléculas são componentes integrais das cascatas de sinalização desencadeadas por
tirosina-quinases receptoras e por outros receptores de superfície. A maior subfamília é Src
33
que apresenta nove membros e participa da regulação de processos celulares como mitose,
ativação de linfócitos B e T e organização do citoesqueleto. Dentre os substratos dos membros
dessa subfamília, destacam-se: a quinase de adesão focal (Fak), receptores de EGF e PDGF e
p130Cas, uma molécula adaptadora envolvida na sinalização mediada por integrinas e fatores
de crescimento (Hubbard e Till, 2000).
A maioria das NRTKs está localizada no citoplasma, no entanto, algumas podem ser
encontradas ancoradas na membrana citoplasmática por via de modificações amino-terminais
como miristoilação e palmitoilação. A organização dos domínios dessas tirosina-quinases
varia consideravelmente (Figura 4). Além de um domínio tirosina-quinase (SH1), essas
proteínas possuem freqüentemente domínios sinalizadores adicionais, importantes para
interações proteína-proteína, proteína-lipídeo e proteína-DNA, tais como SH2 (ligação a
fosfotirosina), SH3 (ligação a seqüências ricas em prolina) e o PH (se liga a fosfatidilinositol)
(Hubbard e Till, 2000).
FIGURA 4: Tirosina-quinases citoplasmáticas humanas. Organização dos domínios dos membros das
principais subfamílias de tirosina-quinases do tipo não-receptor. Os membros de cada família estão
listados à direita (região carboxi-terminal) e o nome da família está à esquerda (região amino-
terminal) de cada tirosina-quinase. Destacam-se em negrito, os membros dessa família que foram
implicados em doenças malignas humanas. Figura adaptada de (Blume-Jensen e Hunter, 2001).
O domínio tirosina-quinase das PTKs adota uma arquitetura bilobada, na qual o ATP
se liga na fenda formada entre os dois lobos e a porção do substrato protéico contendo o
resíduo de tirosina, interage com seqüências presentes no lobo C-terminal (Hubbard, 2002).
A maioria das PTKs é mantida no interior das células em um estado de baixa atividade
por meio de mecanismos de autoregulação que previnem a adoção da configuração da forma
ativa. De acordo com Hubbard e Till, dois processos são necessários para a ativação das
34
PTKs: o aumento de sua atividade catalítica intrínseca e a criação de sítios de ligação
envolvidos no recrutamento de proteínas sinalizadoras (Hubbard e Till, 2000).
Geralmente a ativação das RTKs é alcançada pela oligomerização do receptor, a qual é
desencadeada pela interação do ligante com o seu domínio extracelular. A estabilização do
arranjo oligomérico facilita a autofosforilação em “trans” do domínio citoplasmático do
receptor, resultando na ativação de seu potencial tirosina-quinase e na geração de resíduos de
tirosina fosforilada. Essas tirosinas fosforiladas servem de sítio de ligação para proteínas
sinalizadoras citoplasmáticas contendo domínios SH2 e PTB (“protein tyrosine-binding”), que
interagem com resíduos de fosfotirosina (Blume-Jensen e Hunter, 2001). Para muitas RTKs, a
fosforilação da cauda citoplasmática em resposta à interação com o ligante promove o re-
posicionamento do “loop” de ativação que deixa de bloquear o sítio ativo da molécula e
permite o acesso do substrato ou do ATP, dependendo da quinase considerada. Já para as
NRTKs o mecanismo de ativação é mais complexo e pode envolver tanto interações
heterólogas proteína-proteína, como também a homo-oligomerização para promover a
fosforilação em “trans” do “loop” de ativação. Para muitas PTKs (receptores ou não) o “loop”
de ativação, que serve de plataforma para a ligação do substrato, não está na configuração
apropriada em seu estado basal. A fosforilação em “trans” de uma ou mais tirosinas no “loop”
de ativação promove um re-posicionamento dessa porção da molécula e um aumento na
eficiência catalítica (Hubbard, 2002).
Como as proteínas tirosina-quinases desempenham um papel fundamental na
transdução de sinais, a desregulação de sua atividade enzimática tem sido associada ao
desenvolvimento de câncer em muitos sistemas (Wong e Witte, 2004). De maneira geral, para
as PTKs envolvidas no câncer, a desregulação oncogênica está associada à perda ou
afrouxamento dos mecanismos de auto-controle que, em condições normais, garantiam a
regulação de sua atividade enzimática (Hubbard e Till, 2000; Blume-Jensen e Hunter, 2001;
Vlahovic e Crawford, 2003). Nessa linha, um dado que merece destaque é que mais de 50%
das tirosina-quinases descritas na literatura já foram associadas à fisiopatologia de cânceres
humanos, como resultado de sua atividade enzimática descontrolada, que surge de mutações e
re-arranjos genômicos (deleções, translocações e inserções virais e/ou superexpressão)
(Blume-Jensen e Hunter, 2001; Lim, 2005).
Um exemplo de tirosina-quinase do tipo não receptor com grande relevância clínica é
a proteína Bcr-Abl. Essa proteína está intimamente associada às leucemias positivas para o
cromossomo Philadelphia, como a Leucemia Mielóide Crônica.
35
1.3 LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia hematológica
mieloproliferativa caracterizada pelo acúmulo de células mielóides maduras no sangue
periférico resultante da expansão clonal de células tronco hematopoéticas positivas para o
cromossomo Ph (Mauro e Druker, 2001). Com incidência de 1 a 2 casos a cada 100000
pessoas por ano, essa leucemia é mais comum em pessoas com uma idade média de 65 anos
(Mauro e Druker, 2001; Hehlmann et al., 2007) e representa, nas populações ocidentais, 15-
20% dos casos de leucemia em adultos (Quintas-Cardama et al., 2007).
Essa doença apresenta um curso clínico trifásico: fases crônica, acelerada e blástica. A
maioria dos pacientes é diagnosticada na fase crônica, que pode durar muitos anos e na qual
ainda há produção de granulócitos maduros, mas o número de células progenitoras mielóides
presentes no sangue periférico está aumentado. As principais manifestações clínicas nessa
fase são: aumento do baço, fadiga, perda de peso, leucocitose e blastos no sangue periférico e
contagem de plaquetas normal ou aumentada. Com a progressão da doença para as fases
acelerada e crise blástica, que são mais agressivas, a hematopoese fica seriamente
comprometida, uma vez que os clones leucêmicos perdem a capacidade de diferenciação
levando a substituição das células maduras por blastos e ao acúmulo de células diferenciadas
anormalmente ou de blastos imaturos na medula óssea e no sangue periférico (Wong e Witte,
2004; Jagani et al., 2007). Na crise blástica, que representa o estágio final da doença e pode ou
não ser precedida de uma fase acelerada, há agravamento dos sinais e sintomas, que incluem
trombocitopenia, anemia e esplenomegalia. Os critérios para o diagnóstico de crise blástica,
segundo a OMS, incluem mais de 20% de blastos no sangue periférico ou medula óssea; e/ou
proliferação extramedular dos blastos (Melo e Barnes, 2007). A crise blástica pode ser
linfóide ou mielóide e nessa fase o paciente é refratário à maioria dos tratamentos, podendo
morrer num período que varia de 6 a 12 meses (Mclaughlin et al., 1989; Melo et al., 2003).
A LMC foi a primeira neoplasia humana associada a uma anormalidade
cromossômica, o cromossomo Philadelphia (Ph) (Nowell e Hungerford, 1960). Esse
cromossomo é detectado em praticamente todos os casos de LMC (90-95%) e em 10-25% dos
casos de Leucemia Linfocítica Aguda (LLA). Alguns anos após sua descrição e com o avanço
dos métodos de bandeamento cromossômico, o cromossomo Ph foi identificado como sendo o
produto da translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 (9;22)
(q34;q11) (Rowley, 1973; Bartram et al., 1983; Groffen et al., 1984). Essa translocação resulta
em um cromossomo 22 menor (cromossomo Ph) do que seu homólogo (Figura 5) e na
formação de um gene híbrido, bcr-abl, consistindo das seqüências 5’ do gene bcr, presente no
36
cromossomo 22 (Groffen et al., 1984), unidas à porção 3’ do proto-oncogene c-abl, localizado
no cromossomo 9 (Bartram et al., 1983).
FIGURA 5: Cromossomo Ph. A) Cariótipo de paciente no qual foi detectado o cromossomo Ph. B) Destaque dos
pares de cromossomos 9 e 22, mostrando o resultado da translocação recíproca presente em pacientes
com LMC. As setas indicam as porções envolvidas na translocação, com enfoque especial para o
encurtamento do cromossomo 22 (Ph). Figura adaptada de www.emedicine.com (acessado em
Janeiro, 2008).
O mecanismo responsável pela translocação cromossômica que induz a formação do
cromossomo Ph ainda não é conhecido, no entanto, foi sugerido que a radiação ionizante seria
uma possível causa, devido ao aumento da incidência de LMC no Japão após a bomba
atômica de Hiroshima e Nagasaki (Hehlmann et al., 2007).
Translocações recíprocas entre cromossomos não homólogos são observadas em várias
doenças malignas, incluindo leucemias, linfomas e sarcomas e têm sido implicadas na
fisiopatologia dessas enfermidades (Gollin, 2007). O mecanismo pelo qual essas translocações
são formadas ainda não foi completamente esclarecido, mas acredita-se que um pré-requisito
para a translocação entre cromossomos não homólogos é que os cromossomos envolvidos
sofreriam quebra concomitante e os locais lesados estariam próximos durante o núcleo
interfásico. Nessa linha, alguns estudos sugerem que o arranjo topográfico dos cromossomos
37
9 e 22 no interior do núcleo favoreceria a translocação recíproca entre eles. Da mesma forma,
foi também observado que durante fases críticas do ciclo celular a distância entre os genes abl
e bcr em células hematopoéticas humanas (linfócitos e células progenitoras CD34
+
) é menor
do seria esperado e tal proximidade poderia favorecer a translocação dos cromossomos e a
fusão desses genes (Bartova et al., 2000; Melo e Deininger, 2004).
Dependendo do local de quebra do gene bcr (“breakpoint cluster region”), o neogene
bcr-abl resultante da translocação pode codificar proteínas quiméricas de 190 kDa, 210 kDa
ou 230 kDa. Essas isoformas estão associadas a tipos distintos de leucemia (Melo, 1996; Pane
et al., 1996; Gollin, 2007).
Em 95% dos pacientes com LMC e em aproximadamente um terço dos pacientes com
LLA Ph
+
, a quebra do gene bcr ocorre em uma região denominada “major breakpoint cluster
region” e o RNAm gerado consiste de uma seqüência de 8.5 kb que codifica a proteína Bcr-
Abl de 210 kDa (p210
Bcr-Abl
). No restante dos pacientes com LLA Ph
+
e em casos raros de
LMC, a quebra de bcr ocorre em uma região localizada “upstream” do “major breakpoint
cluster region” conhecida por “minor breakpoint cluster region”. Nesse caso, o RNAm
apresenta cerca de 7 kb e sua tradução resulta em um proteína quimérica de 190 kDa (p190
Bcr-
Abl
ou p185
Bcr-Abl
), cuja presença está associada a um pior prognóstico. A LLA Ph
+
é
caracterizada pelo acúmulo de células linfóides imaturas na medula óssea, sangue e órgãos
linfóides, e é particularmente refratária aos tratamentos quando comparada a LLA Ph
-
(Hehlmann et al., 2007). A terceira região de quebra de bcr foi denominada “micro breakpoint
cluster region”, na qual verifica-se que as quebras ocorrem entre os exons e19 e e20 e o gene
híbrido bcr-abl codifica a proteína de 230 kDa (p230
Bcr-Abl
), culminando com o
desenvolvimento de uma forma mais branda de LMC definida como Leucemia Neutrofílica
Crônica (LNC) Ph
+
(Melo e Deininger, 2004). Em todos os casos, no RNAm do gene bcr-abl,
a seqüência de abl presente é constante, visto que independentemente do local em que ocorreu
a quebra do gene abl, o transcrito do gene híbrido formado consiste dos exons de bcr fundidos
com o exon 2 de abl. Desse modo a variação de tamanho das isoformas de Bcr-Abl está
diretamente associada a região de quebra do gene bcr. Além desses pontos de quebra, que são
mais comuns, já foram descritos pacientes com transcritos de bcr-abl atípicos (Holyoake,
2001).
O fato das três isoformas de Bcr-Abl (p190, p210 e p230) compartilharem o mesmo
segmento Abl mas diferirem quanto a porção Bcr, sugere que as diferenças na agressividade e
na linhagem celular (mielóide ou linfóide) afetada nas leucemias Ph
+
podem ser atribuídas à
seqüência Bcr que está presente na proteína quimérica (Melo e Deininger, 2004).
38
A prova definitiva de que a molécula Bcr-Abl é a responsável pela fisiopatologia da
LMC veio com os modelos murinos nos quais camundongos transplantados com células de
medula óssea transduzidas com o gene bcr-abl desenvolveram uma síndrome
mieloproliferativa com características semelhantes à LMC (Daley et al., 1990).
Alterações citogenéticas e moleculares adicionais ao cromossomo Ph são
freqüentemente encontradas em pacientes na crise blástica da LMC, assim como o aumento da
expressão e da atividade tirosina-quinase da proteína Bcr-Abl expressa (Elmaagacli et al.,
2000). Os mecanismos responsáveis pela progressão da LMC da fase crônica para a crise
blástica ainda não foram esclarecidos, mas foi proposto que o aumento da expressão de Bcr-
Abl nas fases avançadas da doença aumentaria a instabilidade genética e promoveria
alterações moleculares e cromossômicas secundárias, importantes para a expansão dos clones
leucêmicos (Hehlmann et al., 2007).
Com base nos conhecimentos adquiridos e citados acima, o diagnóstico da LMC é
realizado pela observação dos resultados do hemograma (contagens global e diferencial dos
leucócitos, número de plaquetas), mielograma e a pela detecção do cromossomo Ph e/ou dos
transcritos de bcr-abl nas células do sangue periférico ou medula óssea dos pacientes
(Hehlmann et al., 2007).
Quando o diagnóstico é confirmado, o tratamento da LMC pode ser realizado por meio
de quimioterápicos (hidroxiuréia e bussulfano), interferon-alfa (IFN-α), interferon-alfa
associado à citarabina e inibidores de tirosina-quinase (mesilato de imatinibe e dasatinibe).
Inicialmente o tratamento da LMC visa o controle do número de leucócitos circulantes
durante a fase crônica e o fármaco quimioterapêutico utilizado com maior freqüência é a
hidroxiuréia, um inibidor de ribonucleotídeo-redutase, que auxilia na diminuição da alta
contagem de leucócitos e na redução do tamanho do baço que estava aumentado. Geralmente
essa droga é bem tolerada pela maioria dos pacientes e é eficiente no controle do número de
elementos sanguíneos, mas, com raras exceções, não produz uma resposta citogenética e nem
tem efeito sobre a progressão da doença para a fase blástica.
O IFN-α foi durante um tempo a abordagem terapêutica preferida para o tratamento da
LMC, principalmente para os pacientes que não eram candidatos ao transplante de medula.
Em 10-20% dos pacientes, a terapia com IFN-α induz resposta citogenética completa e
aumenta o tempo de duração da fase crônica (atrasando a progressão da doença) e de
sobrevivência dos pacientes, quando comparada à quimioterapia convencional. Apesar dos
bons resultados, o índice de intolerância ao IFN-α é alto, fazendo com que muitos pacientes
tenham que interromper o tratamento. O IFN-α reduz o crescimento e a proliferação das
células leucêmicas e é freqüentemente utilizado em associação com a droga quimioterápica
39
citarabina (Ara-C). O seu mecanismo de ação ainda é pouco compreendido, mas acredita-se
que o IFN-α pode agir diretamente, por meio de seus efeitos anti-proliferativos ou restaurando
as propriedades adesivas de células de LMC, ou indiretamente, melhorando a resposta do
sistema imune contra as células leucêmicas (Salesse e Verfaillie, 2002).
O transplante de medula óssea representa ainda a única terapia comprovadamente
curativa para LMC, promovendo uma porcentagem de sobrevivência de 65-80%, para
pacientes jovens, com idade inferior a 40 anos, na fase crônica da doença. No entanto, a
maioria dos pacientes não é elegível para essa estratégia terapêutica, devido a idade avançada
ou falta de doadores compatíveis (Thiesing et al., 2000; Ren, 2005).
O conhecimento de que o gene bcr-abl é a principal molécula envolvida na
fisiopatologia da LMC permitiu o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras,
como os inibidores de tirosina-quinase Abl, que serão abordados no item 1.6 dessa introdução.
1.4 BCR-ABL: ESTRUTURA, ATIVIDADE ENZIMÁTICA E EFEITOS CELULARES
A proteína Bcr-Abl é uma tirosina-quinase constitutivamente ativa, expressa nas
leucemias positivas para o cromossomo Ph. Essa proteína é codificada pelo neogene bcr-abl,
resultante da fusão dos genes celulares bcr e abl, a qual ocorre durante a translocação
cromossômica responsável pelo aparecimento do cromossomo Ph. Os mecanismos envolvidos
na indução de leucemia por Bcr-Abl não estão completamente esclarecidos, mas se sabe que a
inibição da apoptose é uma das estratégias utilizadas por essa proteína para prolongar a
sobrevivência de células hematopoéticas.
Bcr-Abl possui o potencial de ativar múltiplas cascatas de sinalização e isso depende
não só da sua atividade tirosina-quinase, mas de diversos domínios estruturais provenientes
tanto da porção Bcr da molécula, quanto das seqüências Abl. O gene bcr é amplamente
expresso e codifica uma proteína citoplasmática de 160 kDa composta por diversos domínios
funcionais. Os domínios mais críticos de Bcr são o domínio de dimerização, envolvido na
oligomerização “coiled-coil” da proteína Bcr (Mcwhirter et al., 1993), um domínio de ligação
a SH2 (“SH2 binding domain”), um domínio de serina-treonina-quinase, um domínio
homólogo a “DBL- or GTPase-activating protein (GAP)” e um domínio pleckstrina (PH). As
propriedades e funções de Bcr ainda são pouco conhecidas, mas alguns trabalhos sugerem que
o mesmo atue na regulação do ciclo celular visto que em células quiescentes Bcr se encontra
no citoplasma e durante a mitose essa molécula pode ser detectada próxima aos cromossomos
(Holyoake, 2001).
40
c-Abl é uma proteína tirosina-quinase de 145 kDa do tipo não receptor muito
conservada evolutivamente e amplamente expressa nos variados tipos celulares. Duas
isoformas foram descritas que diferem quanto ao primeiro exon (1a e 1b) e pela presença, em
somente uma delas (1b), de um sítio de miristoilação que possibilita a ancoragem na
membrana plasmática. Essa proteína localiza-se preferencialmente no núcleo, entretanto pode
ser detectada no citoplasma, onde está associada a filamentos de actina. Além disso, outros
trabalhos já relataram sua presença no retículo endoplasmático e na mitocôndria (Hantschel e
Superti-Furga, 2004).
A molécula c-Abl é composta por múltiplos domínios, sendo alguns deles
compartilhados com proteínas envolvidas na transdução de sinais. A regulação dessa proteína
envolve diversos domínios homólogos a domínios existentes em proteínas da família Src e,
por isso, denominados SH (“Src Homology”). O domínio SH1 é a região mais conservada
evolutivamente e é onde se encontra o sítio catalítico responsável pela atividade tirosina-
quinase de c-Abl. O domínio SH2 reconhece e se liga a resíduos de fosfotirosina e apresenta
aparentemente um efeito positivo na transformação celular. O domínio SH3 interage com
seqüências ricas em resíduos de prolina, encontradas em proteínas como Crk e Crkl, e,
contrastando com o domínio SH2, apresenta um efeito regulador negativo sobre a atividade
tirosina-quinase de c-Abl. Esse efeito inibitório foi demonstrado por estudos em que a deleção
ou mutação do domínio SH3 de c-Abl, ativa esta proteína para a transformação celular
(Amarante-Mendes et al., 1997; Samali et al., 1997).
Além dos domínios SH, c-Abl possui espalhados por sua região C-terminal, domínios
de ligação ao DNA, necessários para a ligação entre esta proteína e a cromatina, um domínio
de associação a filamentos de actina, três sinais de localização nuclear (NLS, “nuclear
localization signals”) e uma seqüência de exportação nuclear (NES, “nuclear export signal”)
(Zhu et al., 1996; Hantschel e Superti-Furga, 2004). Esses últimos sinais mencionados estão
envolvidos no transporte de c-Abl entre o núcleo e o citoplasma (Taagepera et al., 1998).
Ainda na porção C-terminal, Abl possui seqüências ricas em prolina que funcionam como
sítios de ligação para o domínio SH3 de diversas proteínas adaptadoras, como Crk, Grb2 e
Nck (Holyoake, 2001).
Por meio de seus diversos domínios, c-Abl interage com uma grande variedade de
proteínas celulares, incluindo moléculas adaptadoras, fosfatases, quinases, fatores de
transcrição, proteínas do citoesqueleto e reguladores do ciclo celular e participa do controle de
muitos processos celulares, dentre eles a regulação do crescimento e sobrevivência celular,
resposta a danos no DNA (genotoxicidade) e ao estresse oxidativo, sinalização por receptores
de crescimento e integrinas, dinâmica de actina e migração celular (Kurzrock et al., 2003;
41
Hantschel e Superti-Furga, 2004). A importância de c-Abl para o crescimento e
desenvolvimento normais foi observada em estudos nos quais camundongos nocautes para c-
abl apresentaram fenótipos variados, incluindo o aumento da incidência de mortalidade
perinatal, linfopenia, osteoporose e desenvolvimento anormal do olho e da cabeça
(Tybulewicz et al., 1991; Ren, 2005).
In vivo a atividade tirosina-quinase de c-Abl é mantida sob intenso controle, sendo
ativada somente em determinadas situações, tais como em resposta ao estresse genotóxico
(Dierov et al., 2004). Análises estruturais e funcionais revelaram que a atividade enzimática
de Abl é mantida em um estado de inibição por meio de interações intramoleculares
complexas que envolvem, além do domínio SH1, os domínios SH2 e SH3 e outras seqüências
localizadas na metade amino-terminal da proteína, incluindo os conectores que unem SH2-
SH3 e SH1-SH2, o grupo “miristoil” e uma região próxima de SH3 conhecida como “Cap”
(Nagar et al., 2003). Além da auto-inibição por interações intramoleculares, outros grupos
propõem a existência de proteínas intracelulares que atuam como inibidores da atividade
enzimática de c-Abl (Wang, 2004).
Diversos domínios funcionais foram identificados na proteína Bcr-Abl que podem
contribuir para seus efeitos transformantes. Na porção Abl, esses domínios são: SH1 (domínio
quinase), SH2 e o domínio de ligação à actina. Na porção Bcr, inclui o domínio de
oligomerização “coiled-coil”, a tirosina na posição 177 e o domínio rico em
fosfoserina/treonina que serve de ligação para domínios SH2 de outras proteínas.
O mecanismo envolvido na ativação da atividade tirosina-quinase de Abl pela fusão
com as seqüências de Bcr ainda não está completamente esclarecido, mas sabe-se que os
domínios provenientes tanto da porção Bcr quanto da porção Abl de Bcr-Abl e suas interações
são importantes para funcionamento da tirosina-quinase. Buscando analisar a contribuição da
porção Bcr para os efeitos de Bcr-Abl, Witte e colaboradores mostraram que seqüências
codificadas pelo primeiro exon de bcr potencializam a atividade tirosina-quinase de c-Abl e o
seu potencial transformante em fibroblastos e células hematopoéticas (Muller et al., 1991).
Presente em todas as isoformas de Bcr-Abl, a região N-terminal contendo 426 aa
codificada pelo primeiro exon de bcr, contém o domínio serina/treonina-quinase que tem
como substratos Bcr e Bap-1 (um membro da família das proteínas 14-3-3) e duas regiões
ricas em resíduos de serina-treonina que servem de sítio de ligação para o domínio SH2 de
outras proteínas, dentre elas Abl e Bcr-Abl (Deininger et al., 2000). Dois motivos codificados
pelo primeiro exon de bcr são elementos-chave para os efeitos oncogênicos de Bcr-Abl, são
eles: a tirosina 177 e o domínio “coiled-coil” contido nos primeiros 63 aminoácidos da porção
Bcr. O resíduo de tirosina encontrado na posição 177 quando fosforilado forma um sítio de
42
ligação para a molécula adaptadora Grb2, importante para a ativação da via de Ras por Bcr-
Abl e, conseqüentemente, para a indução do fenótipo leucêmico (Pendergast et al., 1993). O
motivo “coiled-coil” medeia a homo-oligomerização de Bcr-Abl, permitindo a formação de
dímeros e/ou tetrâmeros e, conseqüentemente, a ativação da sua atividade tirosina-quinase
(Chopra et al., 1999).
Mutações e deleções no domínio “coiled-coil” da porção Bcr bloqueiam a capacidade
de Bcr-Abl de formar dímeros e inibem, conseqüentemente, a sua atividade tirosina-quinase e
a capacidade de transformar células e de induzir a leucemia mielóide em camundongos. Isso
porque a dimerização de Bcr-Abl permite, dentre outras coisas, a fosforilação em “trans” de
um resíduo de tirosina regulatório presente no “loop” de ativação. Van Etten e Smith
mostraram, utilizando um indutor químico de dimerização, que só a dimerização de c-Abl já é
suficiente para promover a ativação de sua atividade tirosina-quinase, induzir transformação
celular e alterar a localização de c-Abl do núcleo para o citoplasma (Smith e Van Etten,
2001).
Embora grande parte da proteína Abl seja mantida na proteína quimérica Bcr-Abl, os
efeitos celulares de Abl e Bcr-Abl são muito diferentes, senão completamente opostos.
Contrastando com Abl, a proteína Bcr-Abl exibe atividade tirosina-quinase
constitutivamente ativa e elevada (Ben-Neriah et al., 1986) sendo encontrada exclusivamente
no citoplasma complexada a proteínas do citoesqueleto (Van Etten et al., 1989). A alta
atividade enzimática de Bcr-Abl e sua localização citoplasmática são essenciais para seus
efeitos leucemogênicos, pois possibilitam a fosforilação de diversos substratos celulares, a
autofosforilação da proteína Bcr-Abl e o recrutamento e ligação de moléculas e proteínas
adaptadoras, propiciando, assim, a ativação de múltiplas vias de sinalização (Salesse e
Verfaillie, 2002).
As principais vias ativadas por Bcr-Abl são: Ras, PI3-k/Akt, NF-κB e STAT
(Kawauchi et al., 2003). É por meio da ativação dessas vias de sinalização que Bcr-Abl
interfere em processos celulares fundamentais, como: proliferação, sobrevivência,
diferenciação, reparo de DNA, adesão e circulação de células hematopoéticas, utilizando
mecanismos transcripcionais e pós-transcripcionais que dependem da atividade tirosina-
quinase e da formação de complexos multi-protéicos (Perrotti e Calabretta, 2002; Salesse e
Verfaillie, 2002). Bcr-Abl pode transformar fibroblastos Rat-1 (Lugo e Witte, 1989), células
linfóides primárias (Mclaughlin et al., 1987) e células hematopoéticas dependentes de IL-3
(Daley e Baltimore, 1988). Em células hematopoéticas, a expressão de Bcr-Abl, além de
induzir independência de fatores de crescimento (Sirard et al., 1994), promove alterações na
adesão de células progenitoras à matriz extracelular e às células estromais (Verfaillie et al.,
43
1992; Skorski et al., 1998), inibição da apoptose (Bedi et al., 1995) e leucemogênese (Skorski
et al., 1998).
Dentre as características de células que expressam Bcr-Abl, a redução da sensibilidade
à quimioterápicos é uma característica compartilhada por linhagens celulares hematopoéticas
expressando Bcr-Abl ectopicamente e por células progenitoras de LMC nas fases crônica e
blástica da doença (Perrotti et al., 2005). A resistência a apoptose é, portanto, uma
característica marcante das células que expressam Bcr-Abl, fazendo com que esta proteína
seja considerada uma das mais potentes moléculas anti-apoptóticas descritas (Amarante-
Mendes et al., 1998a; Amarante-Mendes et al., 1998b; Amarante-Mendes et al., 1998c;
Quackenbush et al., 2000), exercendo um efeito protetor maior do que a superexpressão de
outras moléculas anti-apoptóticas como Bcl-2 e Bcl-x
L
(Brumatti et al., 2003). Tal resistência
à indução de morte seria a principal responsável pela baixa eficácia de quimioterápicos
convencionais no tratamento de leucemias Ph
+
(Bedi et al., 1995).
1.5 VIAS DE SINALIZAÇÃO ATIVADAS POR BCR-ABL
1.5.1 BCR-ABL E A VIA DE RAS
A via de sinalização Ras/Raf/MEK/ERK é uma via central de transdução de sinais que
transmite estímulos de inúmeros receptores celulares para fatores de transcrição e que pode,
portanto, ser estimulada por mitógenos, citocinas e fatores de crescimento.
Ras é uma proteína de baixo peso molecular que se liga a GTP e apresenta um papel
crítico na transmissão de estímulos mitóticos provenientes de tirosina-quinases do tipo
receptor, transduzindo sinais para moléculas como Raf1 e proteínas quinases ativadas por
mitógeno (MAPKs, “mitogen-activated protein kinases”) (Ehrhardt et al., 2002). A família
MAPK inclui três serina-treonina-quinases: Erk (“extracellular signal regulated kinase”), JNK
(“Jun-terminal kinase”)/SAPK e p38. ERK é ativada por estímulos mitóticos levando a
transformação e diferenciação celular, enquanto as outras duas são ativadas por estresse
(Chang e Karin, 2001).
O estado de ativação de Ras é controlado negativamente por GTPases, que removem o
fosfato do GTP que está acoplado a Ras, e positivamente por fatores GEF (“guanine
nucleotide exchange factors”), que estimulam a troca de GDP para GTP e são, portanto,
ativadores das funções de Ras. Dessa forma, quando Ras está ativo se encontra ligado a GTP e
quando inativo se encontra acoplado a GDP (Chopra et al., 1999; Steelman et al., 2004).
Estima-se que em cerca de 25-30% dos tumores humanos podem ser encontradas
formas alteradas de Ras que desencadeiam sinais mitóticos, mesmo na ausência de seus
44
reguladores normais (Hanahan e Weinberg, 2000). Mutações que ativam Ras resultam em
aumento da proliferação e sobrevivência celular. Em células que expressam Bcr-Abl a via de
Ras está constitutivamente ativa e a inibição dessa via interfere na habilidade de Bcr-Abl de
transformar fibroblastos e células hematopoéticas (Sawyers et al., 1995).
O mecanismo molecular pelo qual Bcr-Abl ativa a via de Ras envolve proteínas
adaptadoras, como Grb2 e Shc (Fernandez-Luna, 2000). Pendergast e colaboradores (Cortez
et al., 1995) mostraram que Bcr-Abl ativa a via de Ras por meio de sua ligação com Grb2 e
que essa ligação de Grb2 com Bcr-Abl é mediada por um resíduo de tirosina fosforilada
localizado na posição 177 (Y177) da porção Bcr da oncoproteína. A autofosforilação de Bcr-
Abl na tirosina 177 gera um sítio de ligação para a molécula adaptadora Grb2. Grb2, por sua
vez, se associa com a proteína Sos (uma “guanine nucleotide exchange factor”) que estimula a
conversão da forma inativa de Ras (ligada a GDP) para sua forma ativa (ligada a GTP). Outras
proteínas adaptadoras podem ativar Ras, como Shc e CrkL. Ras ativado se liga a
serina/treonina-quinase Raf-1 recrutando-a para a membrana plasmática, onde é ativada pela
fosforilação em tirosina e inicia uma cascata de sinalização pela via de MAPK. A importância
desse resíduo de tirosina foi observada em experimentos em que a substituição da tirosina 177
de Bcr-Abl por fenilalanina (Y177F), bloqueou o recrutamento de Grb2 e, por conseqüência, a
ativação de Ras em fibroblastos (Pendergast et al., 1993; Jagani et al., 2007). No entanto, em
um outro estudo foi observado que, em células hematopoéticas, Bcr-Abl mantém a capacidade
de ativar Ras e de promover independência de citocinas, mesmo na presença dessa mutação
(Cortez et al., 1995). Isso indica que, na ausência de Grb2, outras moléculas adaptadoras
fornecem vias alternativas de ativação de Ras para a transformação de células hematopoéticas
(Chopra et al., 1999).
Outra molécula que em células positivas para Bcr-Abl é recrutada pelo complexo
formado entre a tirosina 177 fosforilada e Grb2, é Gab2. Grb2 recruta Gab2 que é então
fosforilada por Bcr-Abl, resultando na ativação das vias de PI3-k/Akt e Ras/Erk. A mutação
da tirosina por fenilalanina na posição 177 diminui a fosforilação de Gab2 e reduz a ativação
das vias de Ras/Erk e PI3-k/Akt, o que resulta na diminuição da proliferação e migração
celular. Além disso, células progenitoras mielóides derivadas de medula óssea de
camundongos deficientes em Gab2 são resistentes à transformação por Bcr-Abl (Sattler et al.,
2002).
As vias ativadas por Ras que estão envolvidas na transformação celular mediada por
Bcr-Abl parecem envolver as vias de Erk e JNK. A ativação de Erk envolve Raf 1, um dos
alvos diretos de Ras. Em células positivas para o cromossomo Ph, a inibição de Ras inibe o
crescimento celular. Outras moléculas ativadas por Ras são c-myc e ciclina D1, sugerindo que
45
diversos componentes do ciclo celular atuam abaixo das vias de sinalização dependentes do
domínio SH2 de Bcr-Abl, para induzir a transformação maligna (Chopra et al., 1999). A
ativação de JNK mediada por Bcr-Abl necessita de Ras, MEK quinase e JNK e é importante
para a atividade transformante de Bcr-Abl (Raitano et al., 1995).
Quanto à participação de Ras na geração de sinais anti-apoptóticos, foi demonstrado
que a expressão constitutiva de Mcl-1, um membro anti-apoptótico da família Bcl-2, depende
da via de Ras/Raf/MEK e que a inibição de Mcl-1 diminui a sobrevivência e aumenta a
sensibilidade de células que expressam Bcr-Abl à indução de morte pelo mesilato de imatinibe
(Aichberger et al., 2005).
1.5.2 BCR-ABL E A VIA DE PI3-K/AKT
A via de fosfatidilinositol-3 quinase (PI3-k) participa da regulação de diversos
processos celulares, incluindo sobrevivência, proliferação, diferenciação, adesão, motilidade,
apoptose e outros eventos envolvendo tirosina-quinases (Chopra et al., 1999; Jagani et al.,
2007).
PI3-k é uma lipídeo-quinase heterodimérica formada, de maneira geral, por uma
subunidade catalítica com 110 kDa (p110) e uma subunidade regulatória de 85 kDa (p85). É
por meio de seus domínios SH2 e SH3 que a p85 atua como uma molécula adaptadora,
permitindo que a subunidade catalítica p110 interaja com proteínas tirosina-quinases que
promovem a ativação enzimática de PI3-k. Quando ativada, por exemplo, por receptores do
tipo tirosina-quinase de fatores de crescimento, PI3-k fosforila o fosfatidilinositol bifosfato
(PIP2) a fosfatiodilinositol trifosfato (PIP3) e esse último promove o recrutamento de
quinases, como Akt e PDK (“3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1”) (Chopra et al.,
1999).
Akt, uma das moléculas alvo de PI3-k, é uma serina/treonina-quinase que atua na
regulação de sinais de sobrevivência celular em resposta a diversos estímulos internos e
externos, incluindo perda de adesão, danos no DNA, retirada de fatores de crescimento e
descompasso no ciclo celular (Datta et al., 1997; Franke et al., 1997). Um dos mecanismos
pelo qual Akt promove a sobrevivência das células é através da inativação de componentes da
maquinaria da apoptose, incluindo a inibição da proteína pró-apoptótica Bad (Datta et al.,
1997) e o bloqueio da via de apoptose dependente de caspase (Cardone et al., 1998;
Yamaguchi e Wang, 2001). Além de Bad outros substratos de Akt foram descritos, dentre os
quais, destacam-se caspase-9, Mdm2, mTOR e a sub-classe de fatores de transcrição
“forkhead” FoxO (FoxO1, FoxO3a e FoxO4) (Jagani et al., 2007).
46
A molécula Bad, quando não fosforilada, se liga a Bcl-x
L
e a outros membros anti-
apoptóticos da família Bcl-2, inibindo sua função de bloqueio da morte, e promovendo a
morte celular (Yang et al., 1995). Sinais de sobrevivência (citocinas, fatores de crescimento,
oncogenes) promovem a fosforilação de Bad em resíduos de serina através da via dependente
de PI3k/Akt (Datta et al., 1997). Akt é o responsável pela fosforilação de Bad na serina 136
que fosforilado é seqüestrado no citosol pela ligação com proteínas da família 14-3-3 não
sendo mais capaz de se ligar a Bcl-x
L
e de seqüestrá-lo no citossol (Datta et al., 2000). A via
PI3k/Akt/Bad representa uma ponte entre os sinais de sobrevivência extracelulares e os
moduladores da apoptose na mitocôndria.
Nas células hematopoéticas que expressam Bcr-Abl, Bad está constitutivamente
fosforilado e esse efeito depende da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, visto que a
expressão de mutantes de Bcr-Abl quinase–deficientes não induz sua fosforilação. No entanto,
a capacidade de Bcr-Abl de fosforilar essa molécula não é suficiente para a proteção completa
das células leucêmicas da apoptose, sugerindo a existência de vias dependentes e
independentes de Bad, mas dependentes de PI3-k (Neshat et al., 2000), que participam na
geração de sinais anti-apoptóticos. Essa observação é reforçada por dados que mostram que a
ativação de Akt não resulta necessariamente em fosforilação de Bad (Neshat et al., 2000).
Além dos efeitos sobre Bad, Akt suprime apoptose pela regulação positiva do potencial de
transativação de NF-κB, o que aumenta a expressão de moléculas inibidoras da apoptose,
como Bcl-x
L
e A1 (Fernandez-Luna, 2000).
Um outro alvo de Akt é mTOR (“mammalian target of rapamycin”), uma
serina/treonina-quinase cuja inibição por rapamicina, bloqueia o crescimento de células
primárias derivadas de LMC e células leucêmicas resistentes ao inibidor de Bcr-Abl, mesilato
de imatinibe (Kantarjian et al., 2007).
Interessante observar que em muitos tipos de neoplasias, incluindo a LMC, há a
ativação constitutiva da via de PI3-k/Akt (Skorski et al., 1995). Skorski e colaboradores
mostraram que a proliferação de linhagens e células primárias Bcr-Abl-positivas é dependente
de PI3-k (Skorski et al., 1995). O mecanismo envolvido na ativação da via PI3-k/Akt por Bcr-
Abl ainda não foi completamente esclarecido. Alguns estudos apontam para uma interação
direta entre Bcr-Abl e PI3-k, na qual Bcr-Abl se liga a subunidade regulatória (p85) de PI3-k,
enquanto outros pesquisadores apostam na participação de moléculas adaptadoras
intermediando essa conexão. Atualmente existem fortes evidências da participação da
molécula adaptadora Gab2, a qual é recrutada indiretamente para a sítio Y177 por meio da
formação de complexo com Grb2. A fosforilação de Gab2 em tirosina promove sítios de
ligação para o domínio SH2 de p85 de PI3-k, o que leva à ativação de PI3-k. Assim como
47
para a ativação da via de Ras, a tirosina 177 localizada na porção Bcr parece ser de grande
importância para a ativação de PI3-k por Bcr-Abl. Apesar de caspase-9 ser um substrato de
Akt, não foram observadas em células positivas para Bcr-Abl alterações na expressão, nem no
estado de fosforilação dessa caspase que pudessem explicar a resistência a apoptose (Brumatti
et al., 2003; Deming et al., 2004).
Mdm2 é uma proteína reguladora de p53, que além de inibir diretamente a transcrição
dessa proteína, se liga a p53 e atua como uma ubiquitina ligase E3 direcionando-a para a via
de degradação pelo proteassoma. Foi observado em linhagens celulares dependentes de
fatores de crescimento que, tanto a retirada de IL-3 como a inibição de Bcr-Abl pelo mesilato
de imatinibe, promovem a redução da expressão de Mdm2, e que tal efeito precede a indução
de apoptose pelo inibidor. Nesse mesmo trabalho foi mostrado que a morte induzida pelo
mesilato de imatinibe depende em parte de p53 (Goetz et al., 2001).
A relevância da via PI3-k/Akt para os efeitos tumorigênicos de Bcr-Abl foi também
observada em ensaios que mostram que inibidores de PI3-k (LY294002 e Wortmannin)
sinergizam com o mesilato de imatinibe para a indução de morte de células de LMC nas fases
crônica e crise blástica da doença (Klejman et al., 2002a).
1.5.3 BCR-ABL E A ATIVAÇÃO DE NF-ΚB
Os fatores de transcrição da família NF-κB (“nuclear factor-κB”) são ativados por uma
ampla gama de estímulos (citocinas, estresse e vírus) e regulam a expressão de genes
envolvidos em diversos processos, como proliferação, sobrevivência e diferenciação celular,
angiogênese, inflamação e modulação da resposta imune. NF-κB é regulado negativamente
por I-κB (“inhibitor of κB”) que o seqüestra no citoplasma. A fosforilação e degradação de I-
κB promovem a liberação de NF-κB e permitem a sua translocação para o núcleo, no qual
induz a transcrição de genes-alvo. Os alvos anti-apoptóticos de NF-κB incluem os membros
da família Bcl-2, Bcl-x
L
, A1/Bfl-1, e inibidores da apoptose da família dos IAPs (c-IAP-1, c-
IAP-2 e XIAP). Bcr-Abl ativa a via de NF-κB de maneira dependente de sua atividade
tirosina-quinase e a transcrição gênica mediada por esta família de fatores de transcrição
parece ser necessária tanto para os efeitos transformantes de Bcr-Abl em células primárias
derivadas de medula óssea quanto para o desenvolvimento de tumores em modelos animais
(Reuther et al., 1998; Chopra et al., 1999; Brumatti et al., 2003; Kirchner et al., 2003).
48
1.5.4 BCR-ABL E A VIA DE STAT
STATs (“signal transducers and activators of transcription”) são fatores de transcrição
citoplasmáticos latentes que se tornam ativados após serem recrutados para um complexo
receptor e fosforilados em resíduos de aminoácidos específicos. Os STATs quando ativados
por citocinas ou fatores de crescimento se dimerizam, migram para o núcleo e induzem
alterações no padrão de expressão gênica ao se ligarem aos promotores de genes-alvo
(Darnell, 1997). Inúmeros processos, incluindo crescimento, diferenciação e apoptose celular,
desenvolvimento, inflamação e resposta imune envolvem a participação dos fatores de
transcrição dessa família (Baskiewicz-Masiuk e Machalinski, 2004).
A família STAT é composta por sete membros: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4,
STAT5a, STAT5b e STAT6. Estruturalmente essas proteínas são formadas por um domínio
de oligomerização amino-terminal, um domínio de ligação ao DNA, um domínio SH2 e um
domínio de transativação. Esse último domínio varia de tamanho entre os diferentes STATs e
é o responsável pela ativação da transcrição dos genes-alvos. O domínio de oligomerização
contém uma tirosina que é fosforilada por Jaks, o que permite a sua interação com o domínio
SH2 de outras proteínas STAT (Steelman et al., 2004).
As proteínas tirosina-quinase Janus, também conhecidas por Jak, são proteínas
citoplasmáticas envolvidas na sinalização por receptores de citocinas e proteínas PTKs do tipo
receptor transmembrânico. Além das Jaks, outras proteínas podem ativar proteínas STATs
direta ou indiretamente, como RTKs e PTKs citoplasmáticas, como Src e Abl.
STAT5 é um fator de transcrição que é ativado em resposta a diversas citocinas
hematopoéticas. STAT5A e STAT5B são produtos de dois genes diferentes que podem
apresentar múltiplas funções na transdução de sinais (Gesbert e Griffin, 2000). A ativação de
STAT5 já foi associada com o aumento da expressão de várias proteínas, incluindo ciclina
D1, Bcl-x
L
, CIS, A1, pim-1, Id-1, OSM, c-fos e c-jun (Horita et al., 2000; Jagani et al., 2007).
Em linhagens celulares derivadas de pacientes com LMC ou transduzidas com o
oncogene bcr-abl, STAT5 está constitutivamente ativo (Chopra et al., 1999). A ativação de
STAT5 por Bcr-Abl induz a expressão de Bcl-x
L
, uma importante molécula anti-apoptótica,
além de A1 e da serina/treonina-quinase pim-1 (Horita et al., 2000).
Fisiologicamente STATs são fosforiladas por Jak (Janus kinases) que agem na via de
sinalização de receptores de fatores de crescimento. No entanto, em células Bcr-Abl-positivas
a fosforilação de STAT5 parece ser mediada por Hck, uma quinase da família Src, que se liga
aos domínios SH2 e SH3 de Bcr-Abl (Klejman et al., 2002b).
49
Estudos utilizando mutantes dominante-negativo e dominante-positivo de STAT5
mostraram que esse fator de transcrição é essencial para a transformação de células
hematopoéticas por Bcr-Abl e que sua inibição bloqueia a transformação por essa
oncoproteína (Sexl et al., 2000).
1.5.5 VIAS DE SINALIZAÇÃO ATIVADAS POR BCR-ABL: CONSIDERAÇÕES FINAIS
Dentre as vias de sinalização ativadas por Bcr-Abl, Ras e PI3-k parecem ser essenciais
para a transformação celular mediada por Bcr-Abl (Kawauchi et al., 2003). Quanto à
resistência à apoptose, Bad e Bcl-x
L
parecem ser os principais reguladores da apoptose sob o
controle de Bcr-Abl. A via de sinalização PI3-k/Akt induz a fosforilação e a conseqüente
inativação de Bad e contribui para a expressão de Bcl-x
L
, por meio da ativação da via de
NFκB. Além disso, a expressão de Bcl-x
L
é aumentada pela ativação constitutiva de STAT5
em células que expressam Bcr-Abl
(Fernandez-Luna, 2000).
Resultados obtidos por Sonoyama e colaboradores (Sonoyama et al., 2002) indicam
que, embora as vias de Ras, PI3-k e STAT5 participem individualmente da sobrevivência e
crescimento dependentes de Bcr-Abl, a cooperação dessas vias de sinalização é necessária
para a completa atividade leucêmica dessa tirosina-quinase. Além disso, a contribuição de
cada uma das diferentes vias de sinalização, depende do contexto celular em que Bcr-Abl está
expressa (Fernandez-Luna, 2000).
A atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é crítica para seus efeitos oncogênicos, visto
que a expressão de formas mutantes desta proteína com atividade enzimática sensível a
temperatura ou com o domínio tirosina-quinase inativo não são oncogênicas in vitro e in vivo
(Wertheim et al., 2002). Diversos estudos utilizando inibidores de tirosina-quinase têm sido
feitos na tentativa de elucidar a relação entre a alta atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl e o
fenótipo de transformação celular e resistência à apoptose observado em células que
expressam esta molécula. A análise mutacional de Bcr-Abl sugere que os sinais responsáveis
pela proteção da apoptose podem ser separados daqueles responsáveis por alguns dos
fenótipos da transformação celular (Neshat et al., 2000). De acordo com Lugo e
colaboradores, o potencial transformante desta oncoproteína está diretamente relacionado com
sua atividade enzimática (Lugo et al., 1990). No entanto, estudos recentes indicam que
algumas das alterações nas propriedades de adesão decorrentes da expressão de Bcr-Abl são
independentes da atividade tirosina-quinase desta molécula (Weinstein, 2002).
50
1.6 INIBIDORES DE TIROSINA-QUINASE – RESULTADOS E PERSPECTIVAS
A descoberta de que a proteína Bcr-Abl é necessária para a patogênese da LMC e de
que a atividade tirosina-quinase é essencial para seus efeitos leucemogênicos, tornou-a um
alvo muito atraente para intervenções terapêuticas. Atualmente, diversas estratégias estão
sendo empregadas no desenvolvimento de tratamentos para leucemias Ph
+
, que atuem direta e
exclusivamente sobre as células leucêmicas, tendo como alvo a molécula Bcr-Abl e,
principalmente, sua alta atividade tirosina-quinase.
Nesse sentido, uma das drogas utilizadas com grande sucesso no tratamento de
pacientes com LMC é o mesilato de imatinibe (CGP57148, STI571, Glivec
®
, Novartis Pharma
AG, Switzerland). O mesilato de imatinibe é um inibidor de tirosina-quinase, derivado de 2-
fenilaminapirimidina, que apresenta especificidade pela tirosina-quinase Abl (Druker et al.,
1996), inibindo a ligação do ATP ao domínio quinase de Abl, bloqueando, assim, a atividade
enzimática de Bcr-Abl (Mahon et al., 2000).
Os compostos da classe 2-fenilaminopirimidina foram desenhados com base na
estrutura do sítio de ligação das proteínas quinases ao ATP, e o mesilato de imatinibe (na
época chamado de CGP57148) foi identificado e caracterizado como um poderoso composto
anti-tumoral por sua habilidade de inibir a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, bloquear a
proliferação e induzir morte em células derivadas de LMC (Carroll et al., 1997; Gollin, 2007).
Apesar da alta seletividade, o mesilato de imatinibe não é um inibidor exclusivo de Bcr-Abl,
bloqueando também a atividade tirosina-quinase de c-Kit (“stem-cell factor receptor”), c-
FMS, PDGFR (“platelet-derived growth factor receptor”), Abl e Arg, mas com pouco efeito
sobre outras quinases (Mauro e Druker, 2001).
Em Junho de 1998 foi iniciado um estudo clínico de fase I, no qual foram incluídos
pacientes com LMC na fase crônica que não tinham respondido ao tratamento com interferon-
α (refratários, resistentes ou intolerantes a essa droga). Num estágio mais avançado desse
estudo foram incluídos também pacientes com LMC na crise blástica e pacientes com LLA
Ph
+
. Os benefícios do mesilato de imatinibe para o tratamento da LMC são claros e
significantes, 98% dos pacientes na fase crônica da doença que receberam doses diárias de
mesilato de imatinibe iguais ou superiores a 300 mg atingiram resposta hematológica
completa e em 96% deles a resposta durou mais de um ano. Em pacientes com crise blástica
seu efeito é mais limitado, apenas 55% dos pacientes responderam ao tratamento com doses
diárias iguais ou superiores a 300mg, dentre os quais 18% tiveram respostas com duração
maior do que um ano. Nos estudos de fase II foram incluídos pacientes refratários ou
intolerantes a terapia com interferon-α, pacientes na crise blástica e com LLA Ph
+
. Nos
51
pacientes com diagnóstico de LMC na crise blástica, foram obtidas taxas de resposta
citogenética de 6% e 18% para as doses de 400 e 600 mg/dia de mesilato de imatinibe,
respectivamente. O seguimento dos pacientes indicou uma taxa de sobrevivência de 14% e
17% em 24 a 36 meses. Respostas hematológicas na fase acelerada foram obtidas em 65% do
pacientes tratados com a dose de 400 mg/dia e em 71% dos pacientes tratados com 600
mg/dia. Na fase II com pacientes com LMC na fase crônica tratados com imatinibe após falha
ou intolerância ao IFN-α, a taxa de resposta hematológica completa foi de 95%, a de resposta
citogenética completa, após 5 anos, foi de 57% e a de sobrevivência foi de 79% (Druker,
2002; Kantarjian et al., 2007).
No estudo denominado IRIS (“International Randomized Study of IFN versus
STI571”), os efeitos do mesilato de imatinibe em pacientes na fase crônica da doença foram
comparados aos de IFN-α associado à citarabina, tendo sido observadas taxas de resposta
citogenética completa em 87% dos pacientes tratados com imatinibe contra 35% para
pacientes tratados com IFN-α associado à citarabina. Ainda nesse estudo foi detectado que a
porcentagem de pacientes que utilizou mesilato de imatinibe e que não progrediu para as fases
acelerada ou blástica foi de 97% (Kantarjian et al., 2007). Com base nos ótimos resultados
obtidos nos estudos clínicos de fase I, II e III, o mesilato de imatinibe foi aprovado no início
de 2001 para ser utilizado no tratamento de pacientes com LMC, fazendo dessa neoplasia a
primeira doença para a qual uma “targeted therapy”, ou terapia alvo, foi desenvolvida. O uso
do mesilato de imatinibe revolucionou a abordagem terapêutica para LMC e é atualmente a
primeira linha de tratamento para pacientes com LMC na fase crônica e a droga escolhida para
induzir uma resposta rápida, embora de curta duração, em estágios mais avançados da doença
(Vigneri e Wang, 2001).
De modo geral essa droga induz remissão hematológica e citogenética na maioria dos
pacientes com LMC na fase crônica, no entanto, estudos clínicos com este inibidor de
tirosina-quinase Abl, mostraram que pacientes na fase avançada da LMC (crise blástica)
respondiam inicialmente ao tratamento, mas depois recaiam. Através de análises bioquímicas
e moleculares, Sawyers e colaboradores associaram esta resistência clínica ao inibidor a uma
reativação do sinal de transdução de Bcr-Abl, que em alguns casos resultava de uma mutação
no domínio quinase de Abl e em outros estava ligada a uma amplificação progressiva do gene
bcr-abl (Gorre et al., 2001). Um outro estudo mostrou que a resistência ao mesilato de
imatinibe, entre as células que expressam Bcr-Abl, pode se desenvolver através de múltiplos
mecanismos, como: superexpressão de Bcr-Abl (amplificação gênica ou por outros
mecanismos pós-transcricionais), redução na captura do composto devido a superexpressão de
glicoproteína P (Pgp) ou, alternativamente, por degradação excessiva (Mahon et al., 2000).
52
Além disso, foi proposto que células tronco leucêmicas quiescentes e insensíveis ao
tratamento com imatinibe, podem estar associadas à persistência da LMC (“molecular residual
disease”) (Kantarjian et al., 2007).
O aparecimento de resistência à terapia com mesilato de imatinibe é uma grande
preocupação atual e os mecanismos envolvidos têm sido amplamente investigados. Em um
estudo em amostras de pacientes foi observado que 50-90% dos casos de resistência ao
imatinibe estavam associados a presença de mutações pontuais no domínio tirosina-quinase de
Bcr-Abl. Mais de 50 mutações pontuais distintas codificando substituições de aminoácidos no
domínio tirosina-quinase de Bcr-Abl foram detectadas em pacientes com LMC resistentes ao
mesilato de imatinibe. Como resultado dessas mutações, a proteína Bcr-Abl, em especial o
domínio quinase, sofre alterações em sua estrutura o que impede a adoção da configuração
apropriada para a ligação do inibidor. Algumas dessas mutações, como a T315I, são
freqüentemente observadas em pacientes refratários ao inibidor, mas também podem ser
detectadas em pacientes antes mesmo do início do tratamento (Quintas-Cardama et al., 2007).
A análise da estrutura cristalográfica do domínio quinase de Abl em complexo com o
mesilato de imatinibe mostrou que essa droga se liga à conformação inativa da quinase.
Portanto, espera-se que mutações que interfiram no mecanismo de autoregulação e favoreçam
a adoção do estado ativo conduzam a resistência ao tratamento com mesilato de imatinibe
(Hubbard, 2002).
A necessidade de novas estratégias terapêuticas para o tratamento dos pacientes
resistentes ao imatinibe estimulou a comunidade científica e as indústrias farmacêuticas na
descrição de novos inibidores de Bcr-Abl. Dois novos agentes, dasatinibe (Sprycel; BMS-
354825) e nilotinibe (Tasigna), parecem ser promissores pois mostraram-se efetivos em
grande parte dos pacientes com LMC resistentes ao mesilato de imatinibe.
O nilotinibe é um inibidor estruturalmente relacionado ao imatinibe, 20 a 50 vezes
mais potente do que esse último na ação contra o Bcr-Abl e que apresenta atividade contra a
maioria das mutações pontuais que conferem resistência ao imatinibe, tendo inibido, em
ensaios de proliferação, 32 das 33 linhagens mutantes resistentes ao imatinibe, com exceção
da T315I. O dasatinibe, um inibidor sintético de quinases das famílias Src e Abl, age
competindo com o ATP pelo sítio de ligação na enzima. Sua ação sobre a atividade quinase de
Bcr-Abl não está tão restrita à conformação de Abl quanto a ação do mesilato de imatinibe e
por isso possui potencial inibitório 100 vezes maior do que esse fármaco. Além dos inibidores
da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl que atuam competindo com o ATP pela ligação à
quinase, outras modalidades terapêuticas estão sendo investigadas e desenvolvidas para o
tratamento de pacientes com leucemias Ph
+
, dentre elas inibidores de Bcr-Abl que
53
reconhecem o sítio da quinase responsável pela ligação ao substrato e inibidores de vias de
sinalização que são alteradas por Bcr-Abl, como inibidores de Src quinases, proteínas Ras
(inibidores de farnesiltransferases) e da via de PI3-k (rapamicina), além de agentes
hipometilantes (Kantarjian et al., 2007).
Embora o desenvolvimento de resistência ao mesilato de imatinibe represente novos
desafios terapêuticos, o fato de Bcr-Abl continuar ativo nas células resistentes ao mesilato de
imatinibe sugere que esta oncoproteína continua um valioso alvo para drogas terapêuticas
(Gorre et al., 2001).
Apesar de todos esses estudos envolvendo inibidores de tirosina-quinase, o mecanismo
de ação anti-leucêmica e pró-apoptótica desses inibidores, em especial do mesilato de
imatinibe, ainda não foi completamente descrito (Donato et al., 2001). Isso, provavelmente
porque ainda não se conhece integralmente a relação entre a alta atividade enzimática de Bcr-
Abl e o fenótipo de transformação celular e resistência à apoptose induzido por essa tirosina-
quinase.
Sabe-se que a atividade quinase é crítica para os efeitos oncogênicos de Bcr-Abl. Em
um estudo realizado por Pendergast e colaboradores utilizando diversas formas mutantes de
Bcr-Abl, foi demonstrado que células expressando uma versão quinase-deficiente de Bcr-Abl
não apresentam independência de fatores de crescimento, resistência à apoptose induzida pela
retirada de IL-3 e nem são tumorigênicas (Cortez et al., 1995). Em contraste, alterações na
adesão à filamentos de fibronectina e a associação à F-actina são atividades de Bcr-Abl
independentes da sua função tirosina-quinase (Wertheim et al., 2002). Isso sugere que a
transformação celular induzida por Bcr-Abl envolve a ação conjunta de mecanismos
dependentes e independentes de sua atividade tirosina-quinase.
Os sinais gerados por Bcr-Abl de maneira independente de sua atividade enzimática
são de particular interesse quando consideramos que a monoterapia com o mesilato de
imatinibe é incapaz de eliminar completamente as células leucêmicas (Graham et al., 2002; Li
e Li, 2007). Por razões desconhecidas, mas não associadas à mutações no domínio quinase de
Bcr-Abl, o mesilato de imatinibe é muito menos eficaz em pacientes com LMC na crise
blástica e em pacientes com LLA-B Ph
+
. Isso provavelmente ocorre porque algumas das vias
ativadas por Bcr-Abl, como Src quinases em células linfóides-B, não têm sua atividade
reduzida pela inibição de Bcr-Abl pelo mesilato de imatinibe. Essa observação sugere que
para a eliminação dessas células leucêmicas é necessária a inibição conjunta de Bcr-Abl e da
outra via por ela ativada.
O estudo aprofundado dos mecanismos moleculares envolvidos na transformação
celular mediada por Bcr-Abl, em particular os independentes de sua atividade tirosina-
54
quinase, poderá fornecer informações importantes, tanto para compreendermos a resistência à
quimioterapia encontrada em leucemias Ph
+
, como para o desenvolvimento de marcadores de
prognóstico e de novas estratégias terapêuticas mais eficientes no tratamento dessas
neoplasias.
OBJETIVOS
56
2 OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi investigar mecanismos moleculares envolvidos
na transformação celular induzida por Bcr-Abl, com enfoque especial para aqueles
relacionados ao seu potencial anti-apoptótico. Para tanto, foram adotadas duas linhas
principais de investigação, as quais serão abordadas na seção “Resultados” em duas partes. O
tema de cada parte e seus objetivos específicos estão descritos a seguir.
PARTE 1: CONTRIBUIÇÃO DA SINALIZAÇÃO INDEPENDENTE DA ATIVIDADE
TIROSINA-QUINASE DE BCR-ABL PARA A RESISTÊNCIA À APOPTOSE
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar se a inibição farmacológica da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é
capaz de sensibilizar células à indução de morte por agentes apoptogênicos;
• Analisar o impacto da inibição farmacológica da atividade tirosina-quinase de Bcr-
Abl na expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas;
• Estabelecer linhagens celulares que expressem as versões selvagem e quinase-
deficiente da proteína Bcr-Abl;
• Analisar o impacto da expressão da forma mutante quinase-deficiente de Bcr-Abl
sobre a resistência à morte e a expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas;
• Avaliar o papel do contexto celular na resistência à apoptose mediada pela
expressão de Bcr-Abl.
PARTE 2: IMPACTO DA EXPRESSÃO DE BCR-ABL NO PROTEOMA DE CÉLULAS HL-60
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar os padrões de expressão protéica global e de proteínas fosforiladas em
tirosina de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl;
• Identificar proteínas diferencialmente expressas em células HL-60.vetor e HL-
60.Bcr-Abl, por meio da comparação dos perfis de expressão protéica global;
• Procurar por moléculas-alvo de Bcr-Abl que possam estar envolvidas nos efeitos
oncogênicos dessa tirosina-quinase;
• Investigar, de maneira exploratória, vias de sinalização intracelular possivelmente
alteradas por Bcr-Abl e que possam estar associadas à transformação celular.
MATERIAIS E MÉTODOS
58
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 LINHAGENS CELULARES
3.1.1 CÉLULAS DE MAMÍFEROS
293T: linhagem que expressa o antígeno T de SV40, utilizada nos ensaios de transfecção
transitória e para a produção de partículas retrovirais. Derivada de células 293 (ref. ATCC n
o
CRL-11268), uma linhagem estabelecida a partir de células embrionárias renais humanas
transformadas por adenovírus tipo 5.
293 GAG/POL: linhagem derivada de células 293 que foram transfectadas com pCMVgag-pol e
que, portanto, expressam estavelmente os genes gag e pol que codificam proteínas virais.
Utilizada nos ensaios de transfecção e produção de retrovírus.
HELA: linhagem de células malignas humanas derivadas de adenocarcinoma de colo cervival.
Utilizada por ser facilmente transfectada e infectada com partículas retrovirais (ref. ATCC n
o
CCL-2).
HELA.BCR-ABL: linhagem estabelecida pela doutoranda Gabriela Brumatti resultante da
infecção de células HeLa com retrovírus presentes no sobrenadante de células 293T
transfectadas com o plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl. Expressa Bcr-Abl.
HL-60: linhagem promielocítica humana, estabelecida do sangue periférico de uma paciente
com leucemia aguda pró-mielocítica (ref. ATCC n
o
CCL-240) (Collins et al., 1977).
HL-60.BCR-ABL (OW): linhagem resultante da infecção de células HL-60 selvagens com
retrovírus recombinante produzido por meio da transfecção por eletroporação de uma
combinação de células empacotadoras das linhagens PA317 e ψ2 com o plasmídeo
pSRαMSVp185bcr-abl tkneo, contendo o gene bcr-abl (Amarante-Mendes et al., 1998).
HL-60.VETOR: linhagem controle das células HL-60.Bcr-Abl (OW) estabelecidas usando o
plasmídeo pSRαMSV.tkneo (Amarante-Mendes et al., 1998).
59
HL-60.BCR-ABL (JW): linhagem resultante da infecção de células HL-60 selvagens com
retrovírus recombinante produzido por meio da transfecção por eletroporação de uma
combinação de células empacotadoras das linhagens PA317 e ψ2 com o plasmídeo pSLX-
CMV.Bcr-Abl. Essa linhagem difere da OW pelo fato do gene bcr-abl ser resultado de uma
construção artificial, contendo a porção bcr humana associada à porção truncada de c-abl de
origem murina.
K562 (ref. ATCC n
o
CCL-243), KCL22 (ref. DSMZ n
o
ACC 519), LAMA-84 (ref. DSMZ n
o
ACC 168): linhagens celulares derivadas de pacientes com LMC na crise blástica.
JURKAT: linhagem celular humana estabelecida do sangue periférico de paciente com leucemia
linfoblástica aguda (ref. DSMZ n
o
ACC 282).
PA317: linhagem empacotadora anfotrópica derivada de fibroblasto de camundongo, utilizada
para a produção de partículas retrovirais, por expressar os genes gag, pol e env (ref. ATCC n
o
CRL-907).
THP-1: linhagem humana de origem monocítica, derivada de paciente com leucemia
monocítica aguda (ref. DSMZ n
o
ACC 16).
O cultivo das células 293T, 293 gag/pol, PA317, HeLa e HeLa.Bcr-Abl foi feito em
meio DMEM (“Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium” - Life Technologies Gibco-BRL). As
linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW), K562, KCL22,
LAMA-84, Jurkat e THP-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies Gibco).
Em ambos os casos os meios foram suplementados com 10% de soro bovino fetal (SBF), 2
mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina/100 µg/mL estreptomicina e 25 mM HEPES (Life
Technologies Gibco). Os meios foram esterilizados por filtração em membranas com poros de
0,22 µm. No caso das linhagens 293T, 293 gag/pol e PA317 utilizadas para a produção de
partículas retrovirais recombinantes, é importante ressaltar que para a produção de partículas
virais foi utilizado o soro bovino fetal defined da Hyclone para a suplementação do meio de
cultura utilizado durante as transfecções. As linhagens acima citadas foram mantidas em
estufa a 37
o
C e 5% CO
2
.
60
3.1.2 BACTÉRIAS
Células competentes da linhagem bacteriana DH5-α (Life Technologies), derivada de
Echerichia coli, foram utilizadas para a amplificação e propagação dos plasmídeos utilizados
nesse trabalho.
Para o cultivo dessa linhagem foi utilizado o meio de cultura Luria Bertani (LB) (171,1
mM NaCl, 1% bacto-peptona, 0,5% de extrato de levedura, pH 7,0), líquido e/ou sólido (LB
ágar: meio LB acrescido de 1,5% de bacto-ágar) contendo, quando necessário, ampicilina
(100 µg/ml) ou kanamicina (50 µg/ml), dependendo do plasmídeo utilizado. Além disso,
durante a transformação das bactérias foram utilizados os meios SOB (2% peptona; 0,5%
extrato de levedura; 8,56 mM NaCl; 2,5 mM KCl – pH 7,0) e SOC (SOB + 10 mM MgCl
2
+
20 mM de glicose) (Sambrook et al., 1989).
3.2 PLASMÍDEOS UTILIZADOS
• pSRαMSVtkneo: plasmídeo retroviral deficiente em replicação, utilizado
como vetor para transduzir o gene de interesse. Esse plasmídeo contém o gene de
resistência a neomicina e foi gentilmente cedido pelo Dr. Owen Witte (Howard
Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, CA, USA).
• pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl: plasmídeo retroviral deficiente em replicação,
contendo o gene bcr-abl selvagem, gentilmente cedido pelo Dr. Owen Witte (Howard
Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, CA, USA).
• pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KD e pSLX-CMV.Bcr-Abl/KD: plasmídeos
retrovirais deficientes em replicação, contendo o gene bcr-abl mutado, gentilmente
cedidos pelos Drs. Owen Witte (Howard Hughes Medical Institute, University of
California Los Angeles, CA, USA) e Jean Wang (University of California, San Diego,
CA, USA), respectivamente. No primeiro plasmídeo o gene bcr-abl apresenta uma
mutação pontual que resulta na substituição de uma lisina por uma arginina na posição
671 de Bcr-Abl (K671R) . No segundo plasmídeo, a mutação presente resulta na
substituição de uma lisina por uma histidina na posição 295 de Abl (K295H). Para
simplificação e melhor identificação desses dois plasmídeos foi adotada a
denominação KR para o plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KD que apresenta uma
substituição de uma lisina (K) por uma arginina (R), como acima explicado, e a
denominação KH para o outro plasmídeo cuja mutação leva à substituição de uma
lisina (K) por uma histidina (H). Nos dois casos, a mutação promove a a inibição da
61
atividade quinase de Bcr-Abl que, portanto, não apresenta qualquer atividade
enzimática (KD, “kinase deficient”).
• pEGFPN-1 (Clontech): plasmídeo contendo o gene que codifica a proteína
verde fluorescente (EGFP – “enhanced green fluorescent protein”) utilizado para a
confirmação das eficiências de transfecção. Essa proteína emite fluorescência verde
quando excitada por luz ultravioleta. Tal emissão pode ser observada tanto em
microscópio de fluorescência quanto no citômetro de fluxo.
• pCL-ampho: plasmídeo contendo os genes gag, pol e env, necessários para
formação e replicação da partícula viral. O gene gag codifica proteínas estruturais, pol
codifica a transcriptase reversa/integrase e o env codifica uma glicoproteína do
envelope viral (gp70). Esse plasmídeo foi gentilmente cedido pela Profa Dra Eugênia
Costanzi-Straus e foi utilizado para complementação das células empacotadoras na
produção de partículas retrovirais recombinantes.
• pMX-IRES-EGFP: plasmídeo retroviral bicistrônico que, por conter o
elemento IRES (“internal ribosome entry site”), permite a expressão da proteína EGFP
e de um gene de interesse nele clonado, a partir do mesmo transcrito. No caso do
presente trabalho nenhum outro gene foi clonado nesse plasmídeo e o uso dele ficou
restrito aos ensaios de eficiência de transfecção e infecção celular. Esse plasmídeo foi
gentilmente cedido pelo Dr. Douglas Green (La Jolla Institute for Allergy and
Immunology, San Diego, CA, EUA).
• pVSV-G (Clontech): plasmídeo que expressa a glicoproteína G do vírus da
estomatite vesicular. Essa proteína interage com fosfolipídios presentes na membrana
da célula alvo, facilitando a fusão da membrana viral com a membrana celular.
3.3 AGENTES INDUTORES DE APOPTOSE
Para os ensaios de resistência à apoptose, foram utilizados indutores de morte com
diferentes mecanismos de ação, dentre eles: a) inibidores de topoisomerase II: teniposídeo
(VM26) e etoposídeo (VP16); b) inibidor de síntese protéica: cicloheximida (CHX); c)
inibidor de mitose: (Ara-C); d) inibidor de transcrição: actinomicina D (Act D); e) inibidor de
proteínas quinases: estaurosporina (STS) e indutor de danos no DNA: irradiação ultravioleta
(UV)
62
3.4 INIBIDOR DA ATIVIDADE TIROSINA-QUINASE
Para a inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl foi utilizada a droga mesilato
de imatinibe (CGP57148B, STI571, Glivec
), cujo modo de ação e especificidade já foram
abordados na Introdução desse trabalho. Esse composto foi gentilmente cedido pela Dra.
Anna Maria Suter (Novartis Pharma AG, Suíça), tendo sido preparada uma solução estoque de
10 mM em DMSO.
3.5 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
As transformações foram feitas a partir de bactérias competentes da linhagem DH5-α,
utilizando-se o método do choque térmico. Esse procedimento consistiu na adição do DNA
plasmidial (0,5 – 1 µg) de interesse a 50 µl de células competentes, seguida da incubação no
gêlo por 30 minutos. Prosseguiu-se com um choque térmico a 42
o
C por 2 minutos, para
permitir a internalização do plasmídeo e nova exposição à temperatura de 0
o
C por 5 minutos.
A seguir foi adicionado meio SOC em quantidade igual a 9 X o volume de bactérias e a
suspensão foi incubada sob agitação orbital por 1 hora a 37
o
C para permitir a expressão do
gene de resistência ao antibiótico. Após esse período de incubação, 50 µl dessa solução
contendo bactéria + DNA plasmidial, foram distribuídos em placas de Petri contendo meio LB
agar com antibiótico de seleção. As placas foram, então, incubadas na estufa a 37
o
C por um
período de 14 – 16 horas.
3.6 PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL
3.6.1 PREPARAÇÃO DO PRÉ-INÓCULO E INÓCULO
Para a preparação do pré-inóculo, uma colônia de bactérias de cada placa de Petri
obtida na transformação, foi colocada em um tubo separado, contendo 3 ml de meio LB
líquido com o antibiótico de seleção adequado. Foi também feito um controle negativo
contendo somente meio e antibiótico. Os tubos foram, então, incubados a 37
o
C por 8 horas
sob agitação constante (300 rpm).
Após esse período de incubação, 1ml de cada pré-inóculo foi transferido para 500 ml
de meio LB com 100 µg/ml de ampicilina ou 50 µg/ml de kanamicina. Cada inóculo foi
incubado por 14-16 horas a 37
o
C sob agitação constante (300 rpm). Esse procedimento tem
63
por objetivo aumentar a quantidade de cópias das bactérias que carregam o plasmídeo de
interesse, a fim de se obter uma alta concentração de DNA plasmidial.
3.6.2 OBTENÇÃO DO DNA PLASMIDIAL
Para a obtenção e purificação dos DNAs plasmidiais foi adotado o procedimento
padrão, que consiste em uma adaptação do protocolo de lise alcalina geralmente empregado,
servindo para preparações em pequena escala. Para isso, foram utilizadas colunas QIAGEN de
MIDI ou MAXI Kit. Num primeiro momento as suspensões de bactérias foram centrifugadas
a 6000 g por 15 minutos. Após o descarte do sobrenadante, as bactérias foram ressuspendidas
no reagente 1 (50mM Tris-Cl, 10mM EDTA e 100µg/ml de RNAse) e receberam
posteriormente os reagentes 2 (200mM NaOH, 1% SDS) e 3 (3,0 M acetato de potássio, pH
5.5) nessa ordem, para que houvesse a lise bacteriana e a precipitação das proteínas. Após a
lise das bactérias, o DNA foi ligado a uma resina de sílica, sendo posteriormente lavado com
uma solução composta de 1 M NaCl, 50 mM MOPS (pH 7,0) e 15% de isopropanol e eluído
em uma solução contendo 1,6 M NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 8,5) e 15% isopropanol. Para a
obtenção do precipitado de DNA, acrescentou-se à solução de eluição 0,7 volume de
isopropanol. Prosseguiu-se com a centrifugação por 30 minutos a 15000 g a 4ºC.
O pellet de DNA foi recuperado e lavado com uma solução de etanol 70% (15000g por
10 minutos). Após a secagem do sobrenadante, o DNA plasmidial foi ressuspendido em 50 µl
de um tampão de baixo sal (TE pH 8,0: 10 mM Tri-Cl, 0.1mM EDTA) e posteriormente
dosado por espectrofotometria.
3.7 DIGESTÕES ENZIMÁTICAS
Para confirmar o tamanho dos vetores, bem como dos insertos, os plasmídeos foram
submetidos a digestões com enzimas de restrição específicas, de acordo com o protocolo do
fabricante (New England, Biolabs). Resumidamente, as digestões consistiram na incubação
por 1 hora a 37ºC de 1 µg de DNA, em um volume final de 50 µl contendo, além do DNA, 1
unidade de enzima de restrição, tampão de digestão (específicos para cada enzima) e, quando
necessário, 100 µg/mL de BSA (Sambrook et al., 1989).
64
3.8 ELETROFORESE DE DNA
Para a eletroforese de DNA foram preparados géis de agarose de concentrações de 0,7
a 0,8%, em tampão tris-acetato-EDTA, TAE 1X (40 mM Tris-Base, 0,1% ácido acético
glacial e 1 mM EDTA), conforme os procedimentos descritos por Sambrook e colaboradores
(Sambrook et al., 1989).
As corridas foram realizadas em cubas de eletroforese submetidas à voltagem
constante (40-60 V). Para a comparação do tamanho dos fragmentos de DNA, foram
utilizados os seguintes padrões da Gibco BRL: 1 Kb Ladder para formas lineares, quando o
DNA foi digerido por enzimas de restrição, e o padrão de DNA “supercoiled” para a análise
de DNAs circulares.
3.9 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO PSRα
αα
αMSVTKNEO.BCR-ABL/KR
O sequenciamento do plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR foi realizado no
Laboratório de Evolução Molecular e Bioinformática do Prof. Dr. Paolo Marinho de Andrade
Zanotto, pela técnica Cláudia Pantaleão.
Para o sequenciamento da região do gene bcr-abl contendo a mutação de interesse
foram utilizados 250 ηg do plasmídeo e 3,2 ρmol/µl do primer
(TGGTGTGAAGCCCAAACC). A reação foi feita com o auxílio do kit Big Dye versão 3 e
envolveu 30 ciclos de amplificação. Cada ciclo seguiu o seguinte procedimento: 1 minuto de
desnaturação a 94
o
C, 1 minuto de anelamento a 52
o
C e 1 minuto de extensão a 70
o
C. Após os
30 ciclos, foi feito um ciclo final de 5 minutos a 72
o
C. As seqüências obtidas foram analisadas
com o auxílio do ABI Prism 3100 Genetic Analyzer.
3.10 TRANSFECÇÕES CELULARES, OBTENÇÃO DE PARTÍCULAS RETROVIRAIS E
INFECÇÕES DE CÉLULAS-ALVO
Para as transfecções de células 293T foi adotado o método do fosfato de cálcio (Jordan
e Wurm, 2004). Para obtenção de uma confluência celular de 50-80% no dia da transfecção,
as células 293T foram distribuídas, 48 horas antes da transfecção, em placas de cultura de 10
cm na concentração de 1 x 10
6
células/placa em 9 ml de meio DMEM completo suplementado
com soro defined (Hyclone). No dia da transfecção, 2-4 horas antes de acrescentar o
precipitado, o meio dessas células foi completamente substituído pelo mesmo volume de meio
fresco. Para o preparo do precipitado, adicionou-se 10 µg do plasmídeo de interesse em 50 µl
65
de 2,5 M CaCl
2,
completando com água deionizada estéril para um volume final de 500 µl.
Essa solução que contém DNA, foi adicionada, gentilmente, a um tubo contendo 500 µl do
tampão 2x HeBS (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na
2
HPO
4
– pH 7,05). Após seu
preparo, a solução contendo DNA foi incubada por 30 minutos a temperatura ambiente, para
que fosse formado o precipitado. Passado esse período de incubação, o precipitado formado
foi despejado sobre as células 293T das placas.
Com o intuito das células 293T produzirem partículas virais com o vetor vazio ou com
o gene que codifica a proteína Bcr-Abl (selvagem ou mutada) essas foram co-transfectadas
com 10 µg de um dos plasmídeos de interesse (pSRαMSVtkneo, pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl/KR, pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl, pSLX.CMV.Bcr-Abl/KH) e 10 µg do pCL-ampho, o qual
fornece os genes que codificam proteínas essenciais para a produção de retrovírus.
Após a adição do precipitado, as células foram incubadas na estufa a 37
o
C por 6 horas
e, após esse período, o meio de cultura foi completamente substituído por meio DMEM
completo fresco. No dia seguinte, o meio das células 293T transfectadas foi trocado
novamente, sendo que, com o intuito de aumentar a quantidade de partículas virais presentes
por ml de sobrenadante, foi colocado um volume menor de meio fresco por placa (5 ml). As
células foram incubadas na estufa por mais 18 horas para obtenção das partículas virais.
Após esse período, as amostras das células controle e transfectadas com pEGFP-NI ou
pMX-IRES-EGFP foram tripsinizadas (Tripsina 0,25%) e separadas para análise da eficiência
de transfecção no citômetro de fluxo e no microscópio de fluorescência. O sobrenadante das
células 293T co-transfectadas com um dos plasmídeos de interesse (pSRαMSVtkneo,
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR, pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl, pSLX.CMV.Bcr-Abl/KH) e com o
pCL-ampho foi recolhido para ser utilizado na infecção de células-alvo. O mesmo foi feito
com plasmídeo pMX-IRES-EGFP para a obtenção de retrovírus carregando o gene para
proteína verde fluorescente (EGFP).
Após coletar os sobrenadantes contendo as particulas virais produzidas pelas células
empacotadoras co-transfectadas, este sobrenadante foi centrifugado a 500 g por 5 minutos e
transferido para um novo tubo. Para cada 1 ml de sobrenadante das células 293T transfectadas
utilizou-se 1 x 10
6
células das linhagens HL-60, Jurkat e THP-1 e 1 x 10
5
de células HeLa, que
por serem aderentes foram plaqueadas no dia anterior à infecção. Antes da infecção, todas as
linhagens a serem infectadas foram lavadas em DMEM suplementado com soro defined para,
então, serem ressuspendidas no sobrenadante disponível, sempre acrescido de polibrene na
concentração final de 8 µg/ml. As células infectadas foram, então, plaqueadas em placa de 6
poços (1ml/poço) e incubadas na presença das partículas virais por 4 horas na estufa. Ao
término desse período, cada poço foi acrescido de 1ml de meio fresco com polibrene (8
66
µg/ml). Após uma incubação de aproximadamente 20 horas, o meio das células foi totalmente
substituído por meio de cultura fresco.
A seleção das células expostas ao sobrenadante contendo partículas retrovirais, foi
iniciada 48-72 horas após a infecção e, para isso, as células em suspensão foram plaqueadas
em placa de 6 poços na concentração de 5 x 10
5
células/2ml/poço e as células HeLas foram
plaqueadas um dia antes do início da seleção na concentração de 1 x 10
5
células/2 ml/poço e
submetidas a dose de G418 apropriada para cada tipo celular.
O G418 é um antibiótico análogo à neomicina, que interfere na atividade ribossomal e,
conseqüentemente, mata células de mamíferos através do bloqueio da síntese de proteínas. Os
plasmídeos pSRαMSVtkneo (vetor), pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl, pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR
e pSLX-CMV.Bcr-Abl/KD aqui utilizados apresentam um gene marcador (neo) que codifica
uma enzima (fosfotransferase) que destrói o G418. Portanto, as células
transfectadas/infectadas com os plasmídeos acima citados podem ser selecionadas por serem
resistentes ao tratamento com esse antibiótico. A dose de G418 necessária para a seleção de
células transfectadas ou infectadas varia de acordo com o tipo celular. Sendo assim, para cada
linhagem foi estabelecida uma concentração de G418 capaz de matar as células controles após
5-7 dias de tratamento. No caso das células THP-1 foi utilizada a dose de 400 µg/ml, enquanto
que para Jurkat e HeLa foi utilizada a dose de 800 µg/ml e para as HL-60 foram testadas
diversas doses, dentre elas 400, 800 µg/ml e 1 mg/ml. Uma nova dose do antibiótico foi
administrada a cada três dias. De dez a trinta dias depois do início da seleção foram
preparadas amostras das células selecionadas para análise da expressão de Bcr-Abl por
Western-blot.
A eficiência de transfecção das células 293T com os plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl, pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pSLX.CMV.Bcr-Abl/KH foi confirmada em cada
transfecção através da análise da expressão transitória de Bcr-Abl por Western-blot. Para isso
uma alíquota de 1 x 10
6
dessas células e das 293T controle.
Cabe aqui ressaltar que durante o desenvolvimento desse trabalho foram feitos diversos
ensaios de transfecção e infecção celular até serem obtidas as linhagens desejadas. De maneira geral o
protocolo adotado foi o descrito acima, no entanto, em algumas ocasiões esse protocolo foi adaptado
proporcionalmente conforme tamanho da placa na qual foi feita a transfecção, a quantidade de células
a serem transfectadas ou infectadas, o volume de sobrenadante disponível. Esse mesmo procedimento
foi adotado para as transfecções em PA317 e 293 gag/pol.
67
3.11 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE) E WESTERN-BLOT
Este método foi utilizado para verificar a expressão das proteínas de interesse, bem
como a atividade fosforilativa de Bcr-Abl e a ativação e clivagem de substratos característicos
da via de apoptose.
Para a preparação das amostras (lisado total), alíquotas da ordem de 10
6
células foram
centrifugadas imediatamente após o seu recolhimento, por 5 minutos a 240 g, e o sedimento
celular obtido solubilizado em 80-100 µl de tampão de amostra, de acordo com a linhagem
celular utilizada, contendo SDS (50mM Tris-Cl, pH 6,8; 2% SDS, 10% glicerol e 2,5% de β-
mercaptoetanol). As amostras foram, então, aquecidas a 100
o
C por 5 minutos e estocadas no
freezer –20
o
C. O azul de bromofenol foi adicionado às amostras no momento da eletroforese.
A análise das proteínas presentes nos extratos celulares foi realizada por meio da
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE - “Sodium dodecyl sulphate
gel electrophoresis“), seguida de Western-blot. Como resultado da presença de um detergente
neutralizante, o SDS, as proteínas das amostras são desnaturadas e suas cargas neutralizadas,
fazendo com que elas migrem no gel de acordo apenas com a sua massa molecular.
Após o preparo do gel de corrida (mix de acrilamida 30% (1% bisacrilamida: 29%
acrilamida); Tris-Cl 1,5 M (pH 8,8); SDS 10%; água miliQ; persulfato de amônio 10% e
TEMED), esse foi acoplado a um sistema vertical (Mini Protean II, Bio Rad) no qual fica em
contato com o tampão de eletroforese (25 mM Tris; 250 mM glicina; 0.1% SDS; pH 8,3).
Nessa fase foram aplicadas nas cavidades, 20-50 µg de proteína dos extratos celulares.
Seguiu-se com a eletroforese a 80-100 V, voltagem constante por cerca de 2 horas. Como as
proteínas de interesse possuem diferentes pesos moleculares, a porcentagem de poliacrilamida
dos géis variou de 6 -15%. Para as proteínas c-Abl, Bcr-Abl e proteínas fosforiladas em
tirosina foram utilizados géis de 8-10% poliacrilamida, enquanto que para a análise de
proteínas com massa molecular pequena, como Bcl-2 e Bcl-x
L
, foram preparados géis de 15%.
Após a eletroforese, as proteínas dos géis foram transferidas para membranas de PVDF
0,45 µm (Pierce) por 3-6 horas em uma amperagem constante de 100-200 mA (Tampão de
transferência - 39 mM glicina; 48 mM Tris base; 0.037% SDS e 20 % metanol, pH 8,3). Após
a transferência, as membranas foram colocadas por 16-18 horas na solução de bloqueio
adequada. Nesse sentido, para a marcação com os anticorpos aqui descritos, utilizou-se para o
bloqueio uma solução 5% leite desnatado em pó em TBS-Tween (150 mM NaCl; 50 mM
Tris-Cl; 0,05% Tween 20, pH 7,5); 0,1% Azida, enquanto que as membranas marcadas com
anticorpo anti-fosfotirosina foram bloqueadas com uma solução de 5% BSA em TBS-Tween;
68
0,1% Azida. A seguir, as membrana foram incubadas com os anticorpos primários por 1-2
horas a temperatura ambiente ou overnight a 4°C, lavadas em TBS-Tween e marcadas por 1
hora a temperatura ambiente com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase alcalina
apropriado. As membranas foram, então, novamente submetidas à lavagem por 3-4 vezes
consecutivas em TBS-Tween.
A detecção dos imunecomplexos foi feita pelo método de quimioluminescência e
seguido da exposição das membranas a filmes de auto-radiografia. Os anticorpos primários
utilizados foram: anti-A1 (Clone N-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-c-Abl
(Calbiochem, San Diego, CA, EUA), anti-actina (ICN, Costa Mesa, CA, EUA), anti-Apaf-1
(BD Pharmingen
TM
), anti-Bad (BD Transduction Laboratories), anti-Bak (Upstate
Biotechnology), anti-Bax (Upstate Biotechnology), anti-Bcl-2 (Dako e BD Pharmingen), anti-
Bcl-x
L
(BD Pharmingen
TM
), anti-Bcl-w (clone N-19, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bid
(BD Transduction Laboratories e BD Pharmingen), anti-Bim (BD Pharmingen
TM
), anti-
caspase-3 (Calbiochem, San Diego, CA, EUA), anti-caspase-9 (BD Pharmingen
TM
), anti-
CRKL (clone C-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Flip (Upstate Biotechnology),
anti-fodrina (Chemicon), anti-fosfotirosina (purificado no laboratório a partir do sobrenadante
do hibridoma 4G10), anti-c-IAP-1 (BD Pharmingen
TM
), anti-c-IAP-2 (R&D), anti-Mcl-1
(clone K20, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-PARP (BD Pharmingen
TM
), anti-SET
(Santa Cruz Biotechnology, Inc., gentilmente cedido pela Profa Andréia Machado
Leopoldino, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP), anti-survivina
(clone D-8, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-XIAP (hILP/XIAP – clone 48, BD
Transduction Labs). Os anticorpos secundários espécie-específicos, anti-camundongo, anti-
coelho e anti-cabra, estavam conjugados a peroxidase alcalina.
3.12 QUANTIFICAÇÃO DA MORTE CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO
Uma das características de células em apoptose é a fragmentação do DNA. Os
produtos formados são fragmentos de DNA nucleossomais ou oligonucleossomais (180 pares
de base e múltiplos de 180 pares de base) e geram um padrão de escada quando observado em
eletroforese em gel de agarose. O método que escolhemos para quantificar a indução de
apoptose por citometria de fluxo está baseado no uso de um tampão hipotônico, que lisa as
células deixando somente os núcleos, e na marcação do DNA com o iodeto de propídeo. Este
último é um composto fluorogênico que se liga estequiometricamente a ácidos nucléicos e,
por isso, a emissão de fluorescência é proporcional à quantidade de DNA de uma célula.
Como células em apoptose perdem parte do conteúdo de DNA, os núcleos definidos como
69
apoptóticos, são hipodiplóides e, por isso, quando é analisado o ciclo celular, se encontram à
esquerda do pico G0-G1 que representa as células com conteúdo de DNA normal (diplóide)
(Nicoletti et al., 1991).
De maneira simplificada uma amostra da ordem de 10
5
células da suspensão
analisada, foi submetida a centrifugação por 5 minutos a 240g a 4ºC. Após o descarte do
sobrenadante, as células foram ressuspendidas em 150-300 µl de solução hipotônica
fluorocrômica (HFS, “hypotonic fluorochromic solution” - 0,1% citrato de sódio, 0,1% Triton
X-100, 50 µg/ml iodeto de propídeo) e incubadas sob o abrigo da luz por pelo menos 1 hora a
4º C. Após esse período, o conteúdo de DNA foi determinado por citometria de fluxo por
análise do ciclo celular (aparelho FACScalibur da Becton & Dickinson). A porcentagem de
apoptose foi avaliada pela porcentagem de núcleos hipodiplóides.
3.13 ANÁLISE DO PADRÃO DE EXPRESSÃO PROTÉICA GLOBAL E DE PROTEÍNAS
FOSFORILADAS EM TIROSINA - ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL
Com o intuito de comparar a expressão protéica global das linhagens HL-60.vetor e
HL-60.Bcr-Abl (OW) e identificar moléculas cuja expressão é alterada por Bcr-Abl, foi
utilizada a técnica de eletroforese em géis bidimensionais seguida da análise por
espectrometria de massas e identificação de proteínas. Esses experimentos foram realizados
em colaboração com o grupo do Prof. Dr. Edecio Cunha-Neto, especialmente com o auxílio
da doutoranda Priscila Camilo Teixeira e da técnica Andréia C. K. Kuramoto, do Laboratório
de Imunologia do Instituto do Coração da Universidade de São Paulo. Uma das facilidades
encontradas nesse laboratório foi a disponibilidade de um sistema automatizado de retirada e
processamento dos “spots” dos géis, o que possibilita a análise de proteínas em larga escala.
A eletroforese bidimensional é um método que permite a análise de misturas de
proteínas extraídas de células, tecidos e outras amostras biológicas. Essa técnica separa as
proteínas de acordo com duas propriedades independentes: na primeira dimensão, ou
focalização isoelétrica, as proteínas são separadas de acordo com o seu ponto isoelétrico (pI),
que é o pH específico no qual a carga total de uma proteína é zero; e na segunda dimensão,
SDS-PAGE, as proteínas são separadas de acordo com o sua massa molecular. Cada “spot” no
gel corresponde, de maneira geral, a uma única proteína da amostra.
70
3.13.1 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
3.13.1.1 PREPARO DAS AMOSTRAS
Para obtenção das amostras utilizadas na eletroforese bidimensional, 24 horas antes as
células foram centrifugadas, ressuspendidas em meio de cultura fresco, contadas e ajustadas
para a concentração de 1 x 10
6
células/mL e recolocadas em estufa umidificada. Os extratos
protéicos de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl (OW) foram obtidos de acordo com uma
adaptação do protocolo descrito por Unwin e colaboradores (Unwin et al., 2005).
Resumidamente, amostras com 1 a 2 x 10
7
células foram centrifugadas (240 g, 5
minutos a 4ºC), lavadas duas vezes em PBS gelado e, então, lisadas em 850 µl de tampão
contendo 9M uréia, 4% CHAPS e 65 mM DTT. Após serem sonicadas (2 ciclos de 15
segundos a 1-2Watts, gêlo entre os ciclos), as amostras foram incubadas por 15 minutos a
temperatura ambiente, e a seguir centrifugadas por 10 minutos a 14000 rpm (20000 g). O
sobrenadante protéico recuperado foi armazenado no freezer –80
o
C.
A concentração de proteína presente nas amostras foi determinada pelo método de
Bradford modificado (Bio Rad modified Bradford protein assay), de acordo com as instruções
contidas no manual do fabricante. A leitura da absorbância foi realizada a 595 nm e a
concentração de proteínas estimada em relação a uma curva padrão de albumina de soro
bovino (BSA), contendo os pontos com as concentrações de: 1, 2, 4, 8 e 10 µg/µl.
3.13.1.2 FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA: PRIMEIRA DIMENSÃO
A focalização isoelétrica, ou primeira dimensão, foi realizada em sistema “Ettan
IPGphor Isoeletric Focusing System” (Amersham Biosciences, GE Health Care, USA),
seguindo os procedimentos do manual “2D Electrophoresis – using immobilized pH gradients
– Principles and Methods” do fabricante.
Para análise do padrão global de expressão protéica e das proteínas fosforiladas em
tirosina, foram utilizadas tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7, de 13 cm
(Immobiline DryStrip gels, Amersham Biosciences). As tiras foram reidratadas em uma
solução contendo 9M uréia; 4% CHAPS; 65 mM DTT; 0,5% IPG Buffer pH 4-7; 0,002% de
azul de bromofenol e 450 µg de proteína dos extratos celulares, num volume total de 250 µl.
As amostras foram, portanto, carregadas durante o procedimento de reidratação (reidratação
passiva) das tiras de pH imobilizado, o qual foi realizado a temperatura ambiente por 12-20
horas. Para evitar o ressecamento do sistema, as tiras foram cobertas com um óleo especial
(“DryStrip Cover Fluid”).
71
Após a reidratação, as tiras foram transferidas para o sistema de focalização
isoelétrica, com a face contendo o gel voltada para cima, e os eletrodos foram posicionados
em suas extremidades. Novamente as tiras foram cobertas pelo óleo “Cover Fluid”.
A focalização isoelétrica das amostras foi realizada a 20ºC e diferentes voltagens,
seguindo os seguintes passos: 1) 500V mantidos por 1hora (Voltagem constante), 2) gradiente
até 1000V por 1 hora (Voltagem em gradiente), 3) gradiente até 8000V, 2:30 horas (Voltagem
em gradiente), 4) 8000V, por 1 hora (Voltagem constante). Ao final foram acumulados cerca
de 20000 V.
3.13.1.3 ELETROFORESE SDS-PAGE: SEGUNDA DIMENSÃO
Antes da segunda dimensão, as tiras foram submetidas ao processo de “equilíbrio” que
consiste na redução das pontes dissulfeto das proteínas seguida por uma alquilação. O
procedimento envolve duas etapas de 15 minutos cada, em um tampão contendo 50 mM Tris-
HCl, pH 8,8; 6M uréia; 30% glicerol (v/v); 2% SDS (w/v); 0,002% de azul de bromofenol
(w/v), na presença de 10 mg/mL de DTT (solução redutora), na primeira etapa, ou de 25
mg/ml de iodoacetamida (alquilante), na segunda etapa.
A segunda dimensão foi realizada em sistema vertical (SE 600 Ruby, géis de 14 cm ×
16 cm x 1,5 mm, GE Health Care, USA), utilizando géis de 10% poliacrilamida e tampão de
eletroforese (Tris-HCl 25mM pH 8,3; glicina 192mM; SDS 0,1%). Terminada a fase de
equilíbrio, as tiras foram posicionadas sobre os géis de poliacrilamida e o conjunto foi selado
com uma solução de 0,5% agarose em tampão de eletroforese. Ao lado das tiras foram
colocados papéis-filtro contendo o padrão de peso molecular adsorvido.
Para a retirada e processamento dos “spots” pelo sistema automatizado, os géis foram
fixados às placas de vidro. Para isso, antes da montagem dos géis, algumas das placas foram
tratadas com uma solução contendo o reagente “Bind Silane”.
A eletroforese (SDS-PAGE) foi iniciada com uma corrente de 15 mA/gel que
posteriormente foi aumentada para 30 mA/gel. Um resfriador “MultiTemp III” (GE Health
Care, USA) na temperatura de 10ºC foi utilizado para manutenção da temperatura de 20ºC nas
cubas.
72
3.13.2 COLORAÇÃO DOS GÉIS COM AZUL DE COOMASSIE E MARCAÇÃO COM ANTICORPO ANTI-
FOSFOTIROSINA
Com o objetivo de obter os perfis em gel bidimensional tanto do proteoma total como
das proteínas fosforiladas em tirosina de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, foram
preparados dois géis idênticos, por experimento, de cada extrato celular. Um dos géis foi
corado com a solução de azul de Coomassie (0,1% Coomassie
TM
Briliant Blue R-250
Ultrapure; 40% metanol e 10% ácido acético) e o outro foi transferido para uma membrana de
PVDF e marcado com o anticorpo anti-fosfotirosina (ver protocolo para Western-blot).
Para a visualização das proteínas totais, após a eletroforese, os géis foram fixados por 1
hora em solução fixadora (40% metanol e 10% ácido acético) e, então, corados overnight com
a solução de azul de Coomassie. Após esse período os géis foram descorados inicialmente em
água deionizada e posteriormente em soluções descorantes fraca (20% metanol e 5% ácido
acético) e/ou forte (20% metanol e 7,5% ácido acético). Uma vez descorados, os géis foram
mantidos em uma solução de 15% etanol em água deionizada.
No caso dos géis utilizados para a detecção das proteínas fosforiladas em tirosina, a
transferência das proteínas dos géis para as membranas de PVDF (0,45 µm) foi realizada em
um sistema semi-seco por 2 horas a 204 mA (0,8 mA/cm
2
de membrana), utilizando tampão
de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol, 0,1% SDS). Após a
transferência, seguiu-se com o protocolo usual de Western-blot já descrito aqui, que consiste
no bloqueio das membranas e marcação com os anticorpos primários e secundários
apropriados. Para poder comparar a quantidade e intensidade dos substratos fosforiladas
encontrados nas linhagens HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, os filmes de auto-radiografia foram
expostos pelo mesmo período de tempo nas duas membranas.
3.13.3 AQUISIÇÃO DAS IMAGENS
As imagens dos géis corados com azul de Coomassie foram adquiridas no digitalizador
de imagem “Image Scanner” (Amersham Biosciences), previamente calibrado com tira Kodak
2, utilizando o programa Lab Scan 5.0 no modo transparente, com filtro verde e resolução de
300 dpi. Duas referências adesivas foram grudadas nas placas onde os géis estavam fixados
(uma referência de cada lado, como mostra a Figura 6). Essas referências servem de
orientação para o sistema automatizado de retirada de “spots”, que as utiliza para determinar
as coordenadas de cada “spot” a ser extraído do gel.
73
FIGURA 6: Referências utilizadas pelo sistema automatizado de retirada e processamento de “spots”
“Ettan Spot Handling Workstation”. As referências (indicadas com setas) foram aderidas às
placas dos géis de HL-60.vetor (à esquerda) e HL-60.Bcr-Abl (à direita) antes destes serem
digitalizados.
3.13.4 ANÁLISE E COMPARAÇÃO DOS GÉIS
A análise e comparação dos géis foi feita com o software “ImageMaster 2D Platinum
Ed.” (Amersham Biosciences, GE Healthcare). A detecção dos “spots” foi realizada
inicialmente com o uso da ferramenta de auto-detecção do próprio programa, de acordo com
os parâmetros de saliência, tamanho e smooth que pareciam mais adequados. Tais parâmetros
se referem, dentre outras coisas, ao tamanho, intensidade e curvatura dos “spots” e foram
sendo ajustados para minimizar a seleção de outras coisas que não “spots” pelo programa, tais
como: manchas, resíduos, bordas, e outras imperfeições dos géis. Após a detecção automática,
todos os “spots” selecionados pelo equipamento foram conferidos minuciosamente um a um e,
quando necessário, foram editados (excluídos, ampliados, diminuídos, divididos em outros
“spots” ou fundidos a outros “spots”) para minimizar diferenças no formato de “spots”
correspondentes em géis diferentes. Durante a detecção, cada “spot” dos géis recebe uma
identificação numérica (ID) e seus dados de intensidade, área e volume são computados.
A abundância de uma dada proteína foi avaliada pelo volume de marcação de seu
respectivo “spot”, calculado a partir dos valores de intensidade e área. Para avaliar diferenças
de expressão entre géis foi utilizada a porcentagem de volume (% de volume) dos “spots” que
HL-60.vetor HL-60.Bcr-AblHL-60.vetor HL-60.Bcr-Abl
74
é o parâmetro mais indicado e eficiente. A % volume é definida como o volume de cada
“spot” normalizado em relação à soma do volume total dos “spots” detectados no gel.
A normalização do volume dos “spots” é um tipo de calibração para tornar os dados
independentes de variações entre géis causadas por condições tais como: diferenças na
quantidade de proteína carregada ou na coloração dos géis. Por exemplo, um “spot” poderia
ser mais intenso não porque representa uma proteína que está mais expressa, mas sim porque
aquele gel está mais corado ou recebeu uma quantidade inicial de proteínas maior do que o
outro. Com base nisso, para todas as análises posteriores foram utilizados os valores de % de
volume dos “spots”.
Para encontrar os “spots” diferencialmente expressos e calcular o valor de alteração da
expressão das proteínas, os géis foram comparados e os “spots” que podiam ser observados
nas duas linhagens celulares (“spots” correspondentes) foram pareados/agrupados. O
pareamento (“matching”) entre os géis das duas linhagens foi feito manualmente usando o
programa “ImageMaster 2D Platinum” e, para isso, o gel da linhagem HL-60.vetor foi
utilizado como gel de referência.
Algumas ferramentas desse programa foram utilizadas para auxiliar no pareamento dos
“spots”. Uma delas foi a sobreposição dos géis em transparência (Figura 7). Nessa estratégia
os “spots” de um dos géis ficam marcados em vermelho, os pertencentes ao outro gel são
visualizados em azul e as áreas de sobreposição aparecem em preto. O modo transparência é
utilizado para encontrar as similaridades e diferenças entre os géis.
FIGURA 7: Modo transparência. Nesse modo de visualização, os géis de HL-60.vetor (azul) e HL-60.Bcr-Abl
(vermelho) foram sobrepostos no modo transparência. O local de sobreposição dos “spots” fica
marcado em preto.
Cada grupo ou par de “spots” recebe o mesmo número que aquele “spot” possui no gel
de referência. Os “spots” agrupados possuem, portanto, dois números: o seu número de “spot”
+
=
+
=
75
individual e o número do grupo ao qual pertencem. No caso do gel de referência o número do
“spot” e o número do grupo coincidem.
Na análise diferencial, considerou-se como “spots” diferencialmente expressos aqueles
cuja % de volume foi alterada em um valor igual ou maior a duas vezes entre as amostras.
3.13.5 PROCESSAMENTO DOS “SPOTS”
Como o Bcr-Abl possui uma alta atividade tirosina-quinase e é uma molécula que
conhecidamente gera alterações pós-traducionais, optamos por fazer o processamento e a
identificação de todos os “spots” detectados nos géis que representavam uma % de volume
maior do que 0,02%. Além disso, foram também incluídos os “spots” que, apesar de
representarem menos que 0,02% do volume dos géis, estavam diferencialmente expressos.
Os “spots” escolhidos para identificação foram retirados dos géis e depois de
descorados e digeridos, os peptídeos resultantes da digestão tríptica de cada “spot” foram
submetidos à análise no espectrômetro de massa para identificação das proteínas. A retirada e
o processamento dos “spots” foram feitas pelo sistema automatizado “Ettan Spot Handling
Workstation”.
Na etapa de retirada dos “spots” (“picking”), amostras de 1,4 mm de diâmetro de cada
“spot” (“spot picker” de 1,4 mm) foram extraídas dos géis e transferidas para placas de 96
poços. O processamento dos “spots” foi iniciado com as incubações em solução contendo
bicarbonato de amônio (AMBIC) e acetonitrila (ACN) para descorá-los. Nessa etapa são
usadas seqüencialmente uma solução de 200 mM AMBIC e 50% ACN e uma solução de 50
mM AMBIC e 50% ACN. Depois de descorados, os “spots” foram desidratados e então
submetidos à etapa de digestão de proteínas in gel, utilizando a enzima tripsina. Para isso foi
adicionado ao “spot” seco uma solução de 20 mM AMBIC contendo tripsina (0,3 – 0,5 µg de
tripsina/“spot”; “trypsin, sequencing grade” - Amersham Biosciences.) e a digestão
prosseguiu por 6 horas a 37º C. Prosseguiu-se com a extração dos produtos da digestão tríptica
utilizando uma solução de 50% acetonitrila e 0,45% TFA. Terminada a extração, os
fragmentos peptídicos obtidos foram secos e depois ressuspendidos em 5µL da solução de
50% acetonitrila e 0,5% TFA.
76
3.13.6 ANÁLISE POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS E IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Para a análise dos peptídeos no espectrômetro de massas, alíquotas dos produtos da
digestão tríptica dos “spots” foram aplicadas sobre lâminas especiais de metal (slides) e
acrescidas de matriz, que nesse caso foi o ácido cinâmico (“ACH - Cinnamic Acid”). As
amostras foram então analisadas em um espectrômetro de massas do tipo MALDI-ToF,
“Matrix assisted laser desorption/ionization – Time-of-Flight, Ettan MALDI-ToF/Pro” (GE
Health Care, USA). Nesse tipo de aparelho o modo de ionização é o MALDI (Matrix-Assisted
Laser Desorption Ionization), visto que para a ionização e vaporização do material a ser
analisado é utilizado um segundo composto, a matriz. Já o modo de separação é o TOF
(tempo de vôo ou “time of flight”) que separa íons baseado no tempo que eles levam para voar
em um tubo de vôo. O que determina a diferença no tempo de vôo é a relação massa/carga de
cada peptídeo. Os espectros de massa foram adquiridos no modo reflectron, positivo
(reflectron positive ion mode), que detecta massas de até 3000 Da.
Como resultado da análise de cada amostra, foram obtidas listas de valores
correspondentes à relação massa/carga (m/z) de cada peptídeo presente nas amostras.
Considerando que a ionização deste aparelho adiciona apenas uma carga ao peptídeo, o valor
da relação m/z é igual a massa molecular do peptídeo em questão acrescido de um próton.
Para a identificação das proteínas utilizou-se a massa monoisotópica de cada peptídeo,
que é a massa de um peptídeo no qual todos os átomos são os isótopos mais abundantes na
natureza (C12, N14, H1). Na maioria das vezes, é o primeiro pico da distribuição dos
isótopos. Para assegurar a precisão do aparelho, o espectrômetro de massas foi calibrado
usando calibrantes externos (ACTH [M + H
+
] = 2465,191; e angiotensina III, [M + H
+
] =
897,523) e internos (picos da auto-digestão da tripsina, Figura 8) à amostra.
A lista do conjunto das massas obtida para cada “spot”/proteína compõe o “PMF”
(impressão digital peptídica, “peptide mass fingerprint”) e é característica desta proteína, visto
que a enzima tripsina hidroliza polipeptídeos na porção carboxi-terminal dos aminoácidos
lisina e arginina. Assim, as massas geradas a partir da digestão de uma proteína desconhecida
com uma enzima específica são comparadas com massas de peptídeos previstas a partir da
digestão teórica de proteínas presentes em bancos de dados. A identificação é realizada
quando um número significativo de peptídeos do espectro de massa real se sobrepõe ao do
teórico.
Os “PMFs” experimentais obtidos foram comparados com bancos de dados de
proteínas. Os picos contaminantes conhecidos, tais como, produtos da matriz, queratina e
77
fragmentos da auto-digestão da tripsina (auto-proteólise), foram removidos da lista de massas
antes da busca na base de dados (Figura 8).
842,509
2211,104
1045,564
2225,119
842,509
2211,104
1045,564
2225,119
FIGURA 8: Espectro de massas obtido para uma das amostras analisadas. Os picos apontados com as setas
correspondem a picos (m/z= massa/carga) da auto-proteólise da tripsina ou a picos contaminantes e,
por isso, não fazem parte da lista de PMF utilizada para a identificação da proteína nos bancos de
dados. Os picos de 842,509 e 2211,104 correspondentes a peptídeos derivados da auto-digestão da
tripsina foram utilizados como calibrantes internos do espectro.
Uma ferramenta de identificação de proteínas (MALDI-ToF Evaluation, Amersham
Biosciences), que utiliza como base de dados o banco de proteínas do NCBInr (não
reduntante), está associada ao próprio programa de análise do espectrômetro de massas. Além
disso, foram também utilizados os bancos de dados do SwissProt e NCBInr, com o auxílio da
ferramenta MASCOT (Matrix Science, London, UK, www.matrixscience.org). A investigação
quanto à função das proteínas analisadas foi conduzida com as ferramentas do NCBI, UCSC,
SwissProt e Uniprot.
Nos programas de identificação foram lançados os valores de m/z obtidos para cada
amostra e colocadas algumas das características das amostras, como a enzima utilizada na
digestão (tripsina) e se os valores de massas são as massas monoisotópicas.
Nesses programas de identificação, as proteínas são ranqueadas com base na
probabilidade da proteína candidata ser a proteína da amostra testada. A probabilidade
estatística é apresentada como um valor de “expectation”. O valor de “expectation” é a
probabilidade da identificação ter sido um evento ao acaso. Sendo assim, quanto menor o
78
valor do “expectation”, melhor a identificação. Nesses programas são obtidas informações
sobre as proteínas, tais como o seu nome completo, número de acesso na base de dados, ponto
isoelétrico (pI) e massa molecular (MM) da suposta proteína, cobertura (“coverage”), lista dos
peptídeos usados na identificação. A cobertura (“coverage”) se refere a porcentagem da
seqüência de aminoácidos da proteína candidata que é coberta pelos peptídeos lançados
durante a busca. Também é analisado quantas das massas lançadas no banco de dados
coincidiram com as massas geradas pela digestão teórica da proteína candidata (“Matched
versus Searched”).
Foram utilizados como parâmetros para a busca: a) de 0,1 até 1 Da de tolerância de
desvio da massa do peptídeo e b) de 0 a, no máximo, 2 sítios de clivagem perdidos. Os
parâmetros variaram de acordo com a qualidade dos espectros analisados. Para a identificação
das proteínas foi utilizado exclusivamente o banco de dados para Homo sapiens. Como
possível modificação pós-traducional foi considerada a oxidação pela iodoacetamida. No
Mascot foram considerados os valores de score (“expectation” values) maiores que 55, que
representam, no banco do SwissProt, p ≤ 0,05. No Evaluation, por sua vez, considerou-se as
identificações com “expectation” menor do que 0,05.
RESULTADOS
80
4 RESULTADOS
Como citado anteriormente essa seção está dividida em duas partes, a primeira relata
os dados referentes à contribuição dos sinais independentes da atividade tirosina-quinase para
resistência à apoptose mediada por Bcr-Abl e o segundo capítulo aborda a busca por novos
alvos moleculares de Bcr-Abl com o uso de abordagem proteômica.
PARTE 1: CONTRIBUIÇÃO DA SINALIZAÇÃO INDEPENDENTE DA ATIVIDADE
TIROSINA-QUINASE DE BCR-ABL PARA A RESISTÊNCIA À APOPTOSE
Para investigar o papel da atividade tirosina-quinase na resistência à apoptose, foram
adotadas duas estratégias principais: 1) inibição farmacológica da atividade enzimática de
Bcr-Abl pelo inibidor mesilato de imatinibe e 2) determinação dos efeitos da expressão de
Bcr-Abl mutado sem atividade tirosina-quinase (quinase-deficiente), obtido por manipulação
genética. Essas duas abordagens permitiram analisar a resposta de células Bcr-Abl-positivas
frente a estímulos pró-apoptóticos, quando a atividade enzimática de Bcr-Abl está bloqueada
farmacológica ou geneticamente.
4.1 ESTRATÉGIA 1: INIBIÇÃO DA ATIVIDADE TIROSINA-QUINASE DE BCR-ABL PELO
MESILATO DE IMATINIBE
A primeira parte do trabalho foi confirmar a resistência à apoptose conferida por Bcr-
Abl e caracterizar os efeitos do mesilato de imatinibe sobre o padrão de fosfoproteínas e
viabilidade celular. O segundo passo foi avaliar se a inibição da atividade tirosina-quinase de
Bcr-Abl é capaz de sensibilizar as células à drogas apoptogênicas, interferindo no fenótipo de
resistência à apoptose.
4.1.1 EXPRESSÃO DE BCR-ABL CONFERE RESISTÊNCIA À APOPTOSE
Sabe-se que a expressão de Bcr-Abl torna as células resistentes a agentes
quimioterápicos. Um exemplo disso é que células HL-60, apesar de transformadas, são muito
sensíveis à apoptose induzida por diversas drogas, porém a expressão de Bcr-Abl nessas
células (HL-60.Bcr-Abl) faz com que elas passem a ser altamente resistentes a esses agentes
pró-apoptóticos (Amarante-Mendes et al., 1997; Amarante-Mendes et al., 1998a).
81
Com o intuito de avaliar e confirmar a resistência à apoptose conferida por Bcr-Abl,
células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW) e K562 foram incubadas por
18-24 horas na presença ou ausência de alguns agentes quimioterápicos. A morte celular foi
avaliada por diferentes metodologias, dentre elas: a externalização de resíduos de
fosfatidilserina, a perda do potencial da membrana mitocondrial (dados não mostrados) e a
fragmentação do DNA (% de núcleos hipodiplóides, Figura 9).
Para mostrar que o efeito de Bcr-Abl é amplo, protegendo de drogas que atuam por
mecanismos diversos, foram utilizados como indutores de morte: Ara-C, um inibidor de DNA
polimerases, Act-D, um inibidor de transcrição, CHX, um inibidor de síntese protéica e
VM26, um inibidor de topoisomerase II.
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
(OW)
HL-60.Bcr-Abl
(JW)
K562
Controle Ara-C
Act-D CHX
VM26
M1
6 ± 0.9
M1
47 ± 0.8
M1
91 ± 0.4
M1
30 ± 1.3
M1
91 ± 1.1
M1
4 ± 0.2
M1
6 ± 0.3
M1
10 ± 0.3
M1
6 ± 0.4
M1
6 ± 0.6
M1
3 ± 0.5
M1
4 ± 0.1
M1
12 ± 0.8
M1
4 ± 0.2
M1
5 ± 0.4
M1
4 ± 0.5
M1
5 ± 1.0
M1
5 ± 1.0
M1
7 ± 0.4
M1
5 ± 0.9
Intensidade de fluorescência (Log FL2-H)
Número de eventos
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
(OW)
HL-60.Bcr-Abl
(JW)
K562
Controle Ara-C
Act-D CHX
VM26
M1
6 ± 0.9
M1
47 ± 0.8
M1
91 ± 0.4
M1
30 ± 1.3
M1
91 ± 1.1
M1
4 ± 0.2
M1
6 ± 0.3
M1
10 ± 0.3
M1
6 ± 0.4
M1
6 ± 0.6
M1
3 ± 0.5
M1
4 ± 0.1
M1
12 ± 0.8
M1
4 ± 0.2
M1
5 ± 0.4
M1
4 ± 0.5
M1
5 ± 1.0
M1
5 ± 1.0
M1
7 ± 0.4
M1
5 ± 0.9
Intensidade de fluorescência (Log FL2-H)
Número de eventos
FIGURA 9: Expressão de Bcr-Abl confere resistência à apoptose. Células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW),
HL-60.Bcr-Abl (JW) e K562 foram incubadas por 18-24 horas na ausência ou presença de 100 µM
de Ara-C, 1µM de Act D, 50µM de CHX ou 10 µM de VM26. O conteúdo de DNA foi quantificado
através da análise do ciclo celular por citometria de fluxo. A porcentagem de apoptose refere-se a
quantidade de núcleos hipodiplóides. Os valores representam a média ± desvio padrão das
porcentagens de núcleos hipodiplóides (% de apoptose) obtidas nas triplicatas. Resultado
representativo de três experimentos independentes.
A análise do conteúdo de DNA e da porcentagem de núcleos hipodiplóides revelou
que células HL-60.vetor são muito sensíveis à indução de morte pelas quatro drogas
utilizadas, com índices de até 90% de células em apoptose quando expostas aos tratamentos
com Act-D e VM26. Por outro lado, células que expressam Bcr-Abl, HL-60.Bcr-Abl (OW),
HL-60.Bcr-Abl (JW), K562, apresentam resistência à apoptose frente aos estímulos testados,
82
não ultrapassando o valor de 15% de morte. A resistência à apoptose promovida pela
expressão de Bcr-Abl também foi observada nas demais linhagens derivadas de pacientes com
LMC, como: KCL22 e LAMA-84 (dados não mostrados).
4.1.2 INIBIÇÃO DA ATIVIDADE TIROSINA-QUINASE DE BCR-ABL PELO MESILATO DE IMATINIBE É
DOSE-DEPENDENTE, RÁPIDA E DURADOURA
Uma vez confirmada a resistência à morte de células que expressam Bcr-Abl e
estabelecidas as condições de cultura celular e avaliação da resposta apoptogênica, a
caracterização do efeito do inibidor mesilato de imatinibe sobre a atividade tirosina-quinase
de Bcr-Abl foi realizada.
Com o objetivo de determinar a dose de mesilato de imatinibe capaz de reduzir os
níveis de fosforilação protéica em resíduos de tirosina, células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl
(OW), HL-60.Bcr-Abl (JW) e K562 foram tratadas por 18-24 horas com diversas doses (0,4; 2
ou 10 µM) dessa droga. Ao término do período de incubação, as amostras foram recolhidas,
submetidas à eletroforese em géis de poliacrilamida e analisadas quanto à quantidade de
fosfoproteínas presente nos extratos celulares.
Ao contrário das células que expressam Bcr-Abl, que apresentam uma grande
quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina, células HL-60.vetor são escassas nesse tipo
de fosfoproteína (Figura 10). A alta atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl fica evidente
quando se compara a marcação das células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl com anticorpos
anti-fosfotirosina. É importante destacar que, nesse sistema experimental, o “background”
celular é o mesmo e, assim, as diferenças observadas são essencialmente decorrentes da
expressão ectópica de Bcr-Abl.
Quanto à ação do mesilato de imatinibe em células que expressam Bcr-Abl, observa-se
uma redução na intensidade das bandas correspondentes as proteínas fosforiladas em tirosina,
incluindo tanto a banda referente à própria autofosforilação de Bcr-Abl quanto as bandas
referentes aos seus substratos, de maneira dependente da dose utilizada. Como pode ser
observado, a exposição das células a dose de 0,4 µM foi capaz de promover uma queda
drástica na atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl se comparada ao controle, resultando na
redução de mais da metade da quantidade de proteínas fosforiladas detectadas. Na presença da
dose de 2 µM ainda foram detectadas proteínas fosforiladas em tirosina, cuja presença foi
completamente inibida pela dose de 10 µM de mesilato de imatinibe. Essa dose foi tão eficaz
na inibição da atividade tirosina-quinase, que as células HL-60.Bcr-Abl passaram a apresentar
um perfil de marcação com anti-fosfotirosina semelhante ao das células HL-60.vetor. Baseado
83
nesses resultados e em outros dados da literatura, foi escolhida, então, a dose de 10 µM de
mesilato de imatinibe para os experimentos seguintes.
HL60.
Bcr-Abl (JW)
HL60.
vetor K562
- 10 - 0,4 2 10 - 0,4 2 10 - 0,4 2 10
HL60.
Bcr-Abl (OW)
HL60.
Bcr-Abl (JW)
HL60.
vetor K562
- 10 - 0,4 2 10 - 0,4 2 10 - 0,4 2 10
HL60.
Bcr-Abl (OW)
FIGURA 10: Mesilato de imatinibe bloqueia a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl de maneira dose-
dependente. Células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW) e
K562 foram incubadas por 18-24 horas na presença de diferentes doses (0,4; 2 ou 10 µM) do
inibidor mesilato de imatinibe. Western-blot dos extratos celulares utilizando anticorpo anti-
fosfotirosina.
Uma vez definida a dose de mesilato de imatinibe capaz de reduzir a níveis
indetectáveis o aparecimento de proteínas fosforiladas em tirosina, em uma segunda etapa
procuramos estimar em quanto e por quanto tempo essa droga é capaz de inibir a atividade
tirosina-quinase de Bcr-Abl sem a necessidade de re-estimulação por uma nova dose. Para
tanto foi realizada uma cinética na qual células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl foram
incubadas por 5, 15, 30 minutos, 1, 2 ou 24 horas na presença de 10 µM de mesilato de
imatinibe e a expressão de Bcr-Abl e de fosfoproteínas foi analisada por Western blot. Como
controle foram utilizadas células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl que não receberam o
tratamento e que foram incubadas por 24 horas.
Como pode ser observada (Figura 11) a ação do mesilato de imatinibe sobre a
atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é incrivelmente rápida, visto que o tratamento por 5
minutos levou não só a uma drástica redução na quantidade de fosfoproteínas detectadas,
como parece também ter atingido o máximo do potencial inibitório dessa droga num curto
período de incubação.
Tal efeito foi mantido nos outros períodos de tratamento, sendo visto mesmo após 24
horas de exposição à droga, sem a necessidade de administrar uma nova dose do inibidor. Isso
mostra a rápida ação e a grande estabilidade da ligação do mesilato de imatinibe com a
molécula de Bcr-Abl.
84
- 24h - 5’ 15’ 30’ 1h 2h 24h Mesilato de imatinibe
Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Anti-fosfotirosina
Anti-c-Abl
Anti-actina
HL
-
60.
vetor
HL-60.Bcr-Abl
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
- 24h - 5’ 15’ 30’ 1h 2h 24h Mesilato de imatinibe
Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Anti-fosfotirosina
Anti-c-Abl
Anti-actina
HL
-
60.
vetor
HL-60.Bcr-Abl
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 11: Inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl pelo mesilato de imatinibe é rápida e
duradoura. Células das linhagens HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl (OW) foram incubadas na
presença de 10 µM de mesilato de imatinibe por 5, 15, 30 minutos, 1, 2 ou 24 horas. Ao término de
cada período de incubação, as células foram recolhidas, centrifugadas e preparadas para a análise
da quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina por Western-blot. Os controles (-) foram
incubados por 24 horas. Western-blot dos extratos celulares utilizando anticorpo anti-c-Abl, anti-
fosfotirosina e anti-actina.
Apesar do efeito desse inibidor sobre a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, verifica-
se por meio da marcação com o anticorpo anti-c-Abl que a expressão da proteína Bcr-Abl nas
células HL-60.Bcr-Abl não foi afetada pelo tratamento com mesilato de imatinibe, reforçando
a idéia de que seu mecanismo de ação está direcionado apenas a inibição da atividade
enzimática dessa oncoproteína. Essa figura também confirma a presença de Bcr-Abl somente
nas células HL-60.Bcr-Abl.
4.1.3 EFEITO DO TRATAMENTO COM MESILATO DE IMATINIBE NA VIABILIDADE DE CÉLULAS BCR-
ABL-POSITIVAS
Uma vez determinados a dose e o tempo de incubação necessários para o bloqueio da
atividade enzimática de Bcr-Abl pelo mesilato de imatinibe, o passo seguinte foi a análise dos
efeitos desse inibidor sobre a viabilidade celular. Para isso, células das linhagens HL-60.vetor,
HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW), K562, KCL22 e LAMA-84 foram incubadas por
24, 48 ou 72 horas na presença ou ausência de 10 µM de mesilato de imatinibe. Ao término
dos períodos de incubação, as amostras foram recolhidas e as células ressuspendidas em
tampão HFS para a análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo.
85
A análise do conteúdo de DNA como medida da porcentagem de apoptose revelou
que, enquanto a viabilidade das células HL-60 não foi alterada pelo tratamento com mesilato
de imatinibe em nenhum dos períodos de incubação analisados, células positivas para Bcr-Abl
começaram a morrer quando expostas a este inibidor por um tempo superior a 24 horas
(Figura 12). Esse fato reforça o conceito de que o mesilato de imatinibe tem uma ação bem
específica sobre Bcr-Abl, interferindo pouco na ação de outras quinases e, portanto, na
viabilidade de células que não expressam essa proteína.
Tempo (horas)
% de células em apoptose
K562
0
20
40
60
80
100
24 48 72
KCL22
0
20
40
60
80
100
24 48 72
LAMA-84
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.neo
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.Bcr-Abl (JW)
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.Bcr-Abl (OW)
0
20
40
60
80
100
24 48 72
Controle
Mesilado de
imatinibe
Tempo (horas)
% de células em apoptose
K562
0
20
40
60
80
100
24 48 72
KCL22
0
20
40
60
80
100
24 48 72
LAMA-84
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.neo
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.Bcr-Abl (JW)
0
20
40
60
80
100
24 48 72
HL-60.Bcr-Abl (OW)
0
20
40
60
80
100
24 48 72
Controle
Mesilado de
imatinibe
FIGURA 12: Efeito do tratamento com mesilato de imatinibe na viabilidade de células Bcr-Abl-positivas.
Células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW), K562, KCL22 e
LAMA-84 foram incubadas na estufa por 24, 48 ou 72 horas na ausência (símbolos vazados) ou
presença (símbolos preenchidos) de 10 µM do inibidor de tirosina-quinase. A porcentagem de
apoptose refere-se a quantidade de núcleos hipodiplóides analisados por citometria de fluxo. Os
valores representam a média ± desvio padrão das porcentagens de núcleos hipodiplóides (% de
apoptose) obtidas nas triplicatas. Resultado representativo de três experimentos independentes.
86
No caso das células HL-60.Bcr-Abl (OW) a porcentagem de morte induzida em 48
horas foi muito semelhante à observada em 72 horas, cerca de 50%. As células HL-60.Bcr-
Abl (JW) também apresentaram cerca de 50% de núcleos hipodiplóides após 48 horas de
tratamento, no entanto, contrastando com o resultado obtido para células HL-60.Bcr-Abl
(OW), essa porcentagem aumentou para aproximadamente 70% no tempo de 72 horas.
Linhagens celulares derivadas de pacientes com LMC apresentaram um padrão de
resposta ao mesilato de imatinibe semelhante ao descrito para as células HL-60.Bcr-Abl (OW
e JW). As linhagens KCL22 e LAMA-84 apresentaram cerca de 50% e 80% de células em
apoptose, respectivamente, após a exposição ao mesilato de imatinibe por 48 horas e, assim
como observado para células HL-60.Bcr-Abl (OW), não houve um incremento significativo
na porcentagem de morte em decorrência da maior exposição ao inibidor. Já para K562 a
porcentagem de células mortas passou de 45% a 60% nos tempos de 48 e 72 horas.
Portanto, de maneira geral, as células derivadas de pacientes com LMC e as linhagens
de HL-60 que expressam Bcr-Abl ectopicamente se comportaram de maneira semelhante, não
sendo afetadas pelo tratamento com mesilato de imatinibe por 24 horas, mas mostrando uma
diminuição da viabilidade em decorrência da exposição ao inibidor por 48-72 horas. Algumas
pequenas variações foram observadas, tais como: células LAMA-84 parecem um pouco mais
sensíveis ao tratamento, apresentando uma maior porcentagem de células em apoptose nos
tempos de 48 e 72 horas, do que as demais linhagens; e para algumas células, houve um
aumento na porcentagem de células mortas em 72 horas comparado com a obtida em 48
horas, enquanto que para outras linhagens não houve diferença na porcentagem de células
mortas em decorrência da maior exposição ao inibidor.
A capacidade do mesilato de imatinibe de promover a morte de células Bcr-Abl-
positivas é bem conhecida e, de fato, é a base de seu uso para o tratamento de pacientes com
LMC. No entanto, um aspecto que nos chama bastante a atenção e é muito interessante é que a
inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl por 24 horas, embora promova o
desaparecimento das proteínas fosforiladas em tirosina, não induz morte nessas células.
4.1.4 A INIBIÇÃO DA ATIVIDADE TIROSINA-QUINASE DE BCR-ABL NÃO SENSIBILIZA AS CÉLULAS
À INDUÇÃO DE APOPTOSE POR DIFERENTES DROGAS
Tendo em vista que a expressão de Bcr-Abl confere resistência à apoptose induzida
por drogas apoptogênicas e que o tratamento com mesilato de imatinibe por 24 horas reduz
drasticamente a atividade enzimática dessa proteína, sem induzir alterações significativas na
87
viabilidade celular, o próximo passo foi testar se células que expressam Bcr-Abl são capazes
de manter a resistência à estímulos pró-apoptóticos mesmo na ausência de sua atividade
enzimática.
Com essa finalidade, células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl
(JW), K562, KCL22 e LAMA-84 foram pré-tratadas ou não por 1-2 horas com 10 µM de
mesilato de imatinibe, garantindo a inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl e da
fosforilação de seus substratos, e incubadas por mais 22 horas na presença ou ausência do
indutor de apoptose teniposídeo (VM26) (Figura 13).
HL-60.vetor
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
HL-60.Bcr-Abl (OW)
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
K562
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
LAMA-84
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
HL-60.Bcr-Abl (JW)
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
% de células em apoptose
KCL22
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
HL-60.vetor
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
HL-60.Bcr-Abl (OW)
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
K562
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
LAMA-84
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
HL-60.Bcr-Abl (JW)
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
% de células em apoptose
KCL22
0
20
40
60
80
100
Controle VM26
FIGURA 13: Inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl não sensibiliza as células à indução de
apoptose. Células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), HL-60.Bcr-Abl (JW), K562,
KCL22 e LAMA-84 foram tratadas (barras pretas) ou não (barras brancas) por 1-2 horas com 10
µM mesilato de imatinibe e incubadas por 22 horas na presença ou ausência de um indutor de
apoptose (10 µM VM26). O mesilato de imatinibe permaneceu na cultura durante todo o
experimento. O nível de fragmentação do DNA foi quantificado através da análise do ciclo celular
por citometria de fluxo. A porcentagem de apoptose refere-se a quantidade de núcleos
hipodiplóides. Os valores representam a média ± desvio padrão das porcentagens de núcleos
hipodiplóides (% de apoptose) obtidas nas triplicatas. Resultado representativo de três
experimentos independentes.
88
Analisando os resultados (Figura 13), nota-se que as células HL-60.vetor são altamente
susceptíveis a indução de apoptose pelo tratamento com VM26 e que tal resultado não foi
alterado pelo tratamento com mesilato de imatinibe. Já as células que expressam Bcr-Abl
mantiveram a resistência à apoptose mesmo quando previamente tratadas com o inibidor da
atividade tirosina-quinase. Isso demonstra que mesmo quando a atividade tirosina-quinase de
Bcr-Abl está totalmente inibida e não é mais possível detectar proteínas fosforiladas em
resíduos de tirosina, as células Bcr-Abl-positivas continuam resistentes à indução de apoptose.
Esses resultados não se restringem apenas ao uso do teniposídeo como agente indutor de
apoptose, mas também são verdadeiros para todas as drogas que foram testadas, como
demonstra a figura 14.
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
Controle
VM26 VP16
CHX Estaurosporina
% de células em apoptose
Controle
Mesilato de
imatinibe
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
0
20
40
60
80
100
HL60 HL60.Bcr-Abl
Controle
VM26 VP16
CHX Estaurosporina
% de células em apoptose
Controle
Mesilato de
imatinibe
Controle
Mesilato de
imatinibe
FIGURA 14: Efeito da inibição da atividade tirosina-quinase na resistência à apoptose observada em células
positivas para Bcr-Abl. Células HL60 e HL60.Bcr-Abl (OW) foram pré-tratadas (+) ou não (-) por
1-2 horas com mesilato de imatinibe e incubadas “overnight” na presença ou ausência de 10 µM de
teniposídeo (VM26), 50 µM de etoposídeo (VP16), 50 µM de cicloheximida (CHX) ou 1 µM de
estaurosporina. O nível de fragmentação do DNA foi quantificado através da análise do ciclo celular
por citometria de fluxo. A porcentagem de apoptose refere-se a quantidade de núcleos
hipodiplóides. Os valores representam a média ± desvio padrão das porcentagens de núcleos
hipodiplóides (% de apoptose) obtidas nas triplicatas. Resultado representativo de três experimentos
independentes.
89
Nesse experimento células das linhagens HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl foram
incubadas na estufa por 1-2 horas na ausência ou presença de 10 µM de mesilato de imatinibe
e, então, tratadas com drogas indutoras de apoptose. Mais uma vez, as células HL-60.vetor se
mostraram susceptíveis à morte induzida por todas as drogas utilizadas, enquanto as células
HL-60.Bcr-Abl mantiveram a resistência aos tratamentos, mesmo quando a atividade
enzimática de Bcr-Abl estava bloqueada pela exposição ao inibidor mesilato de imatinibe.
4.1.5 MESILATO DE IMATINIBE NÃO SENSIBILIZA CÉLULAS QUE EXPRESSAM BCR-ABL À
ATIVAÇÃO DE CASPASE-3 POR DROGAS QUIMIOTERÁPICAS
Um dos principais eventos que ocorre durante a apoptose é a ativação de caspases,
particularmente de caspase-3, uma caspase efetora responsável por grande parte das alterações
morfológicas observadas em células apoptóticas. É sabido que a expressão de Bcr-Abl previne
a liberação de citocromo-c da mitocôndria para o citosol, impedindo assim, a ativação de
caspase-3 e, conseqüentemente, a clivagem de PARP e fodrina (Amarante-Mendes et al.,
1998b).
Com base nas informações mencionadas acima, foi investigado se, na presença do
mesilato de imatinibe, células que expressam Bcr-Abl ficam mais sensíveis à ativação de
caspase-3 por drogas pró-apoptóticas. Além da ativação de caspase-3, utilizamos também
como indicadores da sinalização apoptótica a clivagem de dois substratos: PARP (poly-ADP
ribose polymerase), uma enzima de 116 kDa envolvida no reparo do DNA que é clivada por
caspase-3 durante a apoptose e cujo processamento proteolítico produz fragmentos de 85 e 31
kDa, e a clivagem de fodrina, uma proteína de 240 kDa envolvida na estrutura do
citoesqueleto e que também é clivada por caspases durante o processo apoptótico. Os produtos
de clivagem de fodrina têm 150 e 120 kDa.
A análise dos resultados (Figura 15) revelou que nas células HL-60.vetor incubadas
com o indutor de apoptose (VM26) houve a ativação de caspase-3 e a clivagem de PARP e
fodrina, independentemente das células terem sido pré-tratadas com o mesilato de imatinibe.
Tal ativação de caspase-3 nas células HL-60.vetor pelo VM26 era esperada, já que o
tratamento com essa droga induziu uma porcentagem significativa de morte nessa linhagem
celular (Figuras 9, 13 e 14). Contrastando com as células HL-60.vetor, as linhagens que
expressam Bcr-Abl não mostraram nenhuma alteração na expressão da forma inativa de
caspase-3 em decorrência dos tratamentos utilizados, ou seja, não houve ativação de caspase-3
e, portanto da via de apoptose, mesmo quando essas células foram submetidas a estímulos
apoptogênicos e estavam com a atividade enzimática de Bcr-Abl inibida, como demonstrado
90
com o anticorpo anti-fosfotirosina. Os resultados estão de acordo com os dados de
porcentagem de morte apresentados anteriormente, utilizando como parâmetro a análise do
conteúdo de DNA. Nenhum dos tratamentos aos quais as células Bcr-Abl-positivas foram
submetidas induziu ativação de caspase-3, nem a exposição ao mesilato de imatinibe e VM26
isolados e nem mesmo a combinação dos dois tratamentos.
FIGURA 15: Inibição da atividade tirosina-quinase pelo mesilato de imatinibe não sensibiliza as células a
ativação de caspase-3 por drogas quimioterapêuticas. As linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl
(OW), KCL22 e K562 foram tratadas ou não com 10 µM de STI571 e incubadas “overnight” na
presença ou ausência de VM26. Western-blot dos extratos celulares utilizando anticorpos anti-
caspase-3, anti-PARP, anti-fodrina, anti-fosfotirosina e anti-actina.
Tal diferença entre HL-60.vetor e as células que expressam Bcr-Abl não está associada
a quantidade de caspase-3, visto que na situação controle as células que expressam Bcr-Abl
apresentam uma quantidade igual ou maior de caspase-3 na forma inativa.
Na tentativa de desvendar os mecanismos responsáveis pela resistência à apoptose
conferida por Bcr-Abl e especialmente aqueles envolvidos na manutenção do fenótipo de
resistência à morte durante o bloqueio farmacológico da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl
(tratamento com mesilato de imatinibe), foi analisado o efeito de Bcr-Abl e de seu inibidor
sobre a expressão de moléculas reguladoras do processo apoptótico. Os primeiros candidatos
KCL22 K562
Mesilato de imatinibe
- - + + - - + + - - + + - - + +
VM26
- + - + - + - + - + - + - + - +
HL60
Bcr-Abl
(116 kDa)
Anti-PARP
(85 kDa)
Anti-fosfotirosina
(200 kDa)
(122 kDa)
Anti-actina
(45 kDa)
Anti-fodrina
(240 kDa)
(150 kDa)
(120 kDa)
(32 kDa)
(20 kDa)
Anti-caspase-3
HL60
vetor
KCL22 K562
Mesilato de imatinibe
- - + + - - + + - - + + - - + +
VM26
- + - + - + - + - + - + - + - +
HL60
Bcr-Abl
(116 kDa)
Anti-PARP
(85 kDa)
Anti-fosfotirosina
(200 kDa)
(122 kDa)
Anti-actina
(45 kDa)
Anti-fodrina
(240 kDa)
(150 kDa)
(120 kDa)
(32 kDa)
(20 kDa)
Anti-caspase-3
HL60
vetor
91
analisados foram Bcl-2 e Bcl-x
L
, que sabidamente são regulados por Bcr-Abl (Amarante-
Mendes et al., 1998a).
4.1.6 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DA FAMÍLIA BCL-2 EM CÉLULAS TRATADAS COM
MESILATO DE IMATINIBE
Com o intuito de compreender como células que expressam Bcr-Abl permanecem
resistentes à apoptose na ausência de proteínas fosforiladas em tirosina, foram analisadas
inicialmente a expressão de Bcl-2 e Bcl-x
L
, após o tratamento das células com mesilato de
imatinibe. Para isso células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562 e
LAMA-84 foram incubadas por 18 horas, na ausência ou presença de 10 µM do inibidor
mesilato de imatinibe.
Os resultados mostraram que a expressão de Bcr-Abl, tanto ectópica (HL-60.Bcr-Abl)
como endógena (K562 e LAMA-84) está associada a altos níveis de Bcl-x
L
e a níveis quase
indetectáveis de Bcl-2 (Figura 16).
FIGURA 16: Tratamento com mesilato de imatinibe inibe a expressão de Bcl-x
L
. Células das linhagens HL-
60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562 e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na presença (+)
ou ausência (-) de 10 µM de mesilato de imatinibe. Western-blot utilizando anticorpos anti-
fosfotirosina, anti-Bcl-2 e anti-Bcl-x
L
.
Anti-fosfotirosina
Anti-Bcl-2
HL-60.
Bcr-Abl
HL-60.
vetor
LAMA-84K562
Mesilato de imatinibe
Anti-Bcl-x
L
- + - + - + - +
Bcl-x
L
(28 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Anti-fosfotirosina
Anti-Bcl-2
HL-60.
Bcr-Abl
HL-60.
vetor
LAMA-84K562
Mesilato de imatinibe
Anti-Bcl-x
L
- + - + - + - +
Bcl-x
L
(28 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
92
A inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, evidenciada pelo desaparecimento
das bandas referentes às proteínas fosforiladas em tirosina, levou a uma diminuição nos níveis
de Bcl-x
L
nas três linhagens Bcr-Abl-positivas (HL-60.Bcr-Abl (OW), K562 e LAMA-84).
Nenhuma dessas linhagens apresentou níveis detectáveis de Bcl-2, uma potente molécula anti-
apoptótica, nem antes e nem após o tratamento com mesilato de imatinibe.
Como a manutenção da resistência à apoptose em células positivas para Bcr-Abl
tratadas com mesilato de imatinibe não parece estar associada a expressão de Bcl-x
L
, foi
investigada nesse trabalho a expressão de outras moléculas que de alguma forma regulam ou
estão associadas ao processo de morte celular por apoptose, dentre elas membros da família
Bcl-2 (anti- e pró-apoptóticos) e dos IAPs. Assim sendo, células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl,
K562, KCL22 e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na presença ou ausência de 10 µM
de mesilato de imatinibe e, ao final desse período, foram preparados os extratos protéicos dos
lisados totais para análise da expressão das proteínas supracitadas por Western-blot (Figuras
17, 18, 19 e 20). Esse experimento permitiu a análise do impacto de Bcr-Abl e do mesilato de
imatinibe sobre a expressão de proteínas reguladoras da apoptose.
A marcação com o anticorpo anti-fosfotirosina confirmou o efeito do mesilato de
imatinibe sobre a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, levando a uma diminuição na
intensidade e quantidade das bandas referentes a proteínas fosforiladas em tirosina nas células
que expressam Bcr-Abl (Figura 17). Já as células HL-60, que não expressam Bcr-Abl, mais
uma vez mostraram uma baixa expressão de fosfoproteínas, a qual não foi afetada pelo
tratamento com mesilato de imatinibe. Assim como o observado para as células HL-60.Bcr-
Abl na figura 11, o tratamento com mesilato de imatinibe alterou os níveis de fosfoproteínas
sem modificar a expressão de Bcr-Abl nas linhagens derivadas de pacientes com LMC,
reforçando seu modo de ação.
A análise dos membros da família Bcl-2 (Figura 18) revelou que cada uma das
linhagens positivas para Bcr-Abl apresenta um perfil de expressão diferente para essas
moléculas. Quanto aos membros anti-apoptóticos, a proteína Bcl-2 é expressa em altos níveis
nas linhagens HL-60 e KCL22, mas sua expressão é baixa em LAMA-84 e quase indetectável
em HL-60.Bcr-Abl e K562. Foi possível notar que o tratamento com mesilato de imatinibe
não alterou os níveis de expressão dessa proteína em nenhuma das linhagens analisadas.
Apesar de não ter sido possível a marcação com anti-Bcl-x
L
nesse experimento, os resultados
apresentados na figura 16, mostram que células que expressam Bcr-Abl apresentam uma
maior quantidade de Bcl-x
L
e que esta expressão depende da atividade tirosina-quinase de
Bcr-Abl, uma vez que o tratamento com mesilato de imatinibe diminui seus níveis de
expressão.
93
Anti-actina
Anti-fosfotirosina
Anti-c-abl
HL60.
Bcr-Abl
K562
KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
Bcr-Abl (210 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Anti-actina
Anti-fosfotirosina
Anti-c-abl
HL60.
Bcr-Abl
K562
KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
Bcr-Abl (210 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 17: Tratamento de células que expressam Bcr-Abl com mesilato de imatinibe. Células das linhagens
HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562, KCL22 e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na
presença (+) ou ausência (-) de 10 µM de mesilato de imatinibe. Western-blot utilizando anticorpos
anti-c-Abl, anti-fosfotirosina e anti-actina.
Anti-Bad
Anti-Bcl-2
Anti-Bid
Anti-Bim
Anti-Bak
Anti-Bax
Bad (23 kDa)
Bax (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Bak (30 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Bid (23 kDa)
HL60.
Bcr-Abl
K562 KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
Anti-Bad
Anti-Bcl-2
Anti-Bid
Anti-Bim
Anti-Bak
Anti-Bax
Bad (23 kDa)
Bax (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Bak (30 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Bid (23 kDa)
HL60.
Bcr-Abl
K562 KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
FIGURA 18: Efeito da inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl na expressão de reguladores da
apoptose da família Bcl-2. Células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562,
KCL22 e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na presença (+) ou ausência (-) de 10 µM de
mesilato de imatinibe. Western-blot utilizando anticorpos anti-Bcl-2, anti-Bid, anti-Bad, anti-Bak,
anti-Bax e anti-Bim.
94
Quanto aos membros pró-apoptóticos da família Bcl-2, Bax e Bad não tiveram de
maneira geral sua expressão alterada pelo inibidor, enquanto que Bak mostrou uma leve
diminuição de sua expressão em células HL-60.Bcr-Abl e K562, mas não em KCL22 e
LAMA-84. Na verdade essa última linhagem apresentou níveis de Bak muito baixos mesmo
na situação controle, onde não foram submetidas ao inibidor de Bcr-Abl. Esses resultados
estão de acordo com diversos estudos que mostram que os efeitos de Bcr-Abl sobre a ação
dessas moléculas é realizada no nível pós-traducional.
Células HL-60.Bcr-Abl apresentaram níveis menores de Bid e Bad e, aparentemente,
um pouco maiores de Bax e Bak quando comparadas às células HL-60.vetor. A menor
expressão de Bid nessas células sugere que Bcr-Abl regula negativamente a expressão dessa
proteína em células HL-60. No entanto, nas linhagens derivadas de pacientes com LMC, os
níveis de expressão de Bid foram semelhantes ou até maiores do que o observado em células
HL-60. Quanto aos efeitos da inibição de Bcr-Abl, enquanto Bid não parece ter a expressão
afetada pelo tratamento com mesilato de imatinibe em células HL-60.Bcr-Abl e LAMA-84,
sua expressão parece diminuir nas células K562 e KCL22 tratadas.
A molécula Bim de modo geral se mostrou mais expressa em células Bcr-Abl-
positivas do que em HL-60 e, de acordo com resultados descritos na literatura, Bim teve sua
expressão aumentada com a inibição da atividade enzimática de Bcr-Abl. Além da diferença
na quantidade de proteína, é possível identificar uma alteração na migração dessa proteína no
gel, uma vez que nas células Bcr-Abl-positivas não tratadas, Bim parece ter um tamanho um
pouco maior (migrou menos) e, na presença do inibidor, seu tamanho parece menor (migrou
mais), o que indica que essa proteína estava fosforilada antes do tratamento e que a incubação
com o mesilato de imatinibe reverteu seu estado fosforilativo. Interessantemente, quando
analisamos as amostras de HL-60.vetor parece que o padrão se inverte e com o tratamento
passamos a ter uma menor migração da proteína Bim expressa.
Considerando o grupo dos IAPs (Figura 19), células que expressam Bcr-Abl parecem
ter mais survivina do que as células HL-60 e tal expressão é reduzida pelo tratamento com
mesilato de imatinibe. Nas células HL-60 o tratamento com mesilato de imatinibe não induziu
alterações na expressão de survivina, indicando que o aumento na expressão dessa proteína
nas demais linhagens está associado à ação de Bcr-Abl. O mesmo fenômeno foi observado
para XIAP, ou seja, uma maior expressão dessa proteína nas células que expressam Bcr-Abl e
uma redução na expressão após o tratamento com mesilato de imatinibe. c-IAP-1 também
parece ser mais expresso em células que expressam Bcr-Abl, mas na maioria dos casos não
teve sua expressão alterada pelo tratamento com mesilato de imatinibe.
95
Além de moléculas pertencentes às famílias Bcl-2 e IAP de reguladores da apoptose,
outras proteínas tiveram a sua expressão analisada (Figura 20).
A expressão de FLIP não parece ser alterada pelo tratamento com mesilato de
imatinibe, mas células que expressam Bcr-Abl, em especial a HL-60.Bcr-Abl, quando
comparadas com HL-60 parecem ter níveis aumentados de FLIP-s. Analisamos também a
expressão do inibidor da fosfatase PP2A, conhecida como SET. Células que expressam Bcr-
Abl apresentam uma maior quantidade de SET, no entanto, a incubação com o inibidor de
Bcr-Abl, não induziu alterações na expressão dessa molécula no tempo de tratamento
utilizado nesse ensaio.
Quanto a expressão de caspase-3, foi confirmado novamente que o tratamento com
mesilato de imatinibe por esse período de incubação, não é capaz de induzir a ativação dessa
molécula, uma vez que os níveis de caspase-3 na forma inativa não foram alterados em
resposta ao tratamento. Além disso, como mencionado anteriormente, a resistência à apoptose
de células positivas para Bcr-Abl, também não pode ser atribuída a uma menor expressão de
caspase-3, visto que a expressão dessa proteína parece ser até maior nas células que
expressam Bcr-Abl do que nas células HL-60.vetor analisadas. Da mesma forma, Apaf-1, uma
molécula que participa da formação do apoptossomo juntamente com caspase-9 e citocromo-
c, também não foi alterada pela expressão de Bcr-Abl e nem pelo tratamento com mesilato de
imatinibe.
Analisamos também a expressão de CRKL, uma molécula muito conhecida por ser um
dos principais alvos de fosforilação da quinase Bcr-Abl. A expressão dessa proteína é muito
maior em células HL-60.Bcr-Abl do que em células HL-60.vetor e, além da diferença em
intensidade, também pode ser observada uma alteração da migração da proteína no gel. A alta
expressão de CRKL também foi vista nas outras linhagens que expressam Bcr-Abl. O
tratamento com mesilato de imatinibe parece diminuir a expressão de CRKL, mas seu efeito
mais evidente é sobre a migração da proteína no gel, reforçando dados da literatura que
apontam CKRL como alvo de Bcr-Abl. Nesse sentido, CRKL está fosforilado nas células Bcr-
Abl-positivas e o tratamento com mesilato de imatinibe altera seu estado fosforilativo
(desfosforila).
96
Anti-survivina
Anti-XIAP
Anti-c-IAP-1
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Survivina (16.5 kDa)
HL60.
Bcr-Abl K562 KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
Anti-survivina
Anti-XIAP
Anti-c-IAP-1
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Survivina (16.5 kDa)
HL60.
Bcr-Abl K562 KCL22 LAMA-84
- + - + - + - + - +
HL60.
vetor
Mesilato de imatinibe
FIGURA 19: Efeito da inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl na expressão de reguladores da
apoptose do grupo dos IAPs. Células das linhagens HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562,
KCL22 e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na presença (+) ou ausência (-) de 10 µM de
mesilato de imatinibe. Western-blot utilizando anticorpos anti-c-IAP-1, anti-XIAP e anti-survivina.
Anti-fodrina
Anti-Crkl
Anti-caspase-3
Crkl (36 kDa)
Caspase-3 (32 kDa)
Fodrina (240 kDa)
Anti-SET
Anti-apaf-1
Anti-flip
Apaf-1 (130 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
(30 kDa)
SET (39 kDa)
HL60.
Bcr-Abl
K562 KCL22 LAMA-84
HL60.
vetor
- + - + - + - + - +
Anti-fodrina
Anti-Crkl
Anti-caspase-3
Crkl (36 kDa)
Caspase-3 (32 kDa)
Fodrina (240 kDa)
Anti-SET
Anti-apaf-1
Anti-flip
Apaf-1 (130 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
(30 kDa)
SET (39 kDa)
HL60.
Bcr-Abl
K562 KCL22 LAMA-84
HL60.
vetor
- + - + - + - + - +
FIGURA 20: Efeito da inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl na expressão de reguladores da
apoptose e outras moléculas. Células das linhagens HL-60, HL-60.Bcr-Abl (OW), K562, KCL22
e LAMA-84 foram incubadas por 18 horas na presença (+) ou ausência (-) de 10 µM de mesilato de
imatinibe. Western-blot utilizando anticorpos anti-flip, anti-apaf-1, anti-caspase-3, anti-fodrina,
anti-SET e anti-Crkl.
97
4.2 ESTRATÉGIA 2: EXPRESSÃO DE BCR-ABL – QUINASE-DEFICIENTE
Na parte anterior desse trabalho foram apresentados os resultados obtidos com o
inibidor da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, o mesilato de imatinibe. Nossos dados
indicam a existência de componentes independentes da atividade enzimática de Bcr-Abl que
contribuem de alguma forma para a manutenção do fenótipo de resistência à apoptose.
Para investigar se Bcr-Abl consegue induzir resistência à apoptose na ausência de sua
atividade enzimática, estabelecemos diferentes linhagens celulares expressando uma versão
mutada do Bcr-Abl. A mutação presente nessa versão leva a substitutição de um aminoácido
na região da proteína responsável pela ligação ao ATP, fazendo com que a proteína expressa
não tenha atividade tirosina-quinase.
4.2.1 SEQUENCIAMENTO DO PLASMÍDEO PSRαMSVTKNEO.BCR-ABL/KD
Antes de iniciarmos os ensaios de transfecção e infecção celular utilizando o
plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR, uma parte do gene bcr-abl clonado nesse vetor foi
seqüenciada para confirmar a presença da mutação responsável pela inativação da atividade
tirosina-quinase. O sequenciamento da região de ligação ao ATP da molécula Bcr-Abl,
permitiu a confirmação da mutação do gene bcr-abl codificado pelo plasmídeo
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR. Ao compararmos a seqüência de bases do bcr-abl selvagem
(linha p185 Bcr-Abl) com o mutado (linha 4F_140203) (Figura 21), podemos observar que
na posição 671 da seqüência de aminoácidos de Bcr-Abl (posições 2014 a 2016 da seqüência
de bases), há originalmente uma lisina (AAG), que na forma mutada foi substituída por uma
arginina (CGC) (troca de base na posição 2015). Essa mutação no domínio de ligação do ATP
é responsável pela incapacidade desta forma mutante de fosforilar seus substratos e, portanto,
pela inativação da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl.
98
FIGURA 21: Confirmação da mutação responsável pela inativação de Bcr-Abl. Alinhamento das seqüências
da região de ligação ao ATP do gene bcr-abl presente no plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR
(linhas inferiores) em comparação ao selvagem (linhas superiores). A linha p185 Bcr-Abl contém as
seqüências do gene bcr-abl selvagem, enquanto a linha 4F_140203 contém a seqüência do gene
mutado. Em destaque, na posição 671 da seqüência de aminoácidos de Bcr-Abl, a substituição de
uma lisina (K) por uma arginina (R), pela troca da base 2015.
4.2.2 TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS 293T PARA OBTENÇÃO DE PARTÍCULAS RETROVIRAIS
UTILIZADAS PARA A INFECÇÃO DE CÉLULAS ALVOS
A técnica de transferência gênica utilizando retrovírus é uma ferramenta altamente
eficiente utilizada para introduzir genes estavelmente em células em divisão. Embora o
genoma de retrovírus seja feito de RNA, logo após infectarem uma célula-alvo, os retrovírus
produzem uma cópia de DNA do seu material genético, a qual pode se integrar no genoma da
célula hospedeira.
O protocolo de produção de partículas virais é baseado na transfecção de células
empacotadoras com vetores de expressão retrovirais. No interior dessas células, o RNA viral é
envolvido por proteínas estruturais virais e os retrovírus formados são liberados para o
1521 1531 1541 1551 1561 1571 1581 1591
p185 Bcr-Abl CCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGG -AGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC
4F_140203 ------------------------------- CCGNNCAACAGTCTGGTAGAAACACTCCTGGTACTTTGGGCCTGTGTCC
1601 1611 1621 1631 1641 1651 1661 1671
p185 Bcr-Abl CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCT GAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCA
4F_140203 CGCCNTGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCA
1681 1691 1701 1711 1721 1731 1741 1751
p185 Bcr-Abl GAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCT
4F_140203 GAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCT
1761 1771 1781 1791 1801 1811 1821 1831
p185 Bcr-Abl CCTCCGAGAGCCGCTTCAACACCCTGGCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTC
4F_140203 CCTCCGAGAGCCGCTTCAACACCCTGGCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTC
1841 1851 1861 1871 1881 1891 1901 1911
p185 Bcr-Abl CATTATCCAGCCCCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCAC
4F_140203 CATTATCCAGCCCCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCAC
1921 1931 1941 1951 1961 1971 1981 1991
p185 Bcr-Abl GGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGG -AGGTGTACGAGGGCGTGTGGAAGAAATACAGCCTG
4F_140203 GGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGGAGGTGTACGAGGGC GTGTGGAANAAATACAGCCTG
2001 2011 K 2021 2031 2041 2051 2061 2071
p185 Bcr-Abl ACGGTGG -CCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGG -AGGTGGAAGAGTTCTTGAAAGAA -GCTGCAGTCATGAAAGA
4F_140203 ACGGTGGGCCGTG CGCACCTTGAAGGAGG ACACCATNGGAGGTGGAAAAGTTCTTGAAAGAAANCTGCAGTCATGAAANA
R
2081 2091 2101 2111 2121 2131 2141 2151
p185 Bcr-Abl GA -TCAAACACCCTAACCTAGTGCAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC TGAGTTCATG
4F_140203 AAATCAAACACCCC -------T--A---------------- ACCTGGGGGCNACN----------------------- T
2161 2171 2181 2191 2201 2211 2221 2231
p185 Bcr-Abl ACCTACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACC GGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTGCTGCTGTACATGGCCAC
4F_140203 ------N---------------- CTTGGGGGTNTGCA-CCC---------------------------------------
1521 1531 1541 1551 1561 1571 1581 1591
p185 Bcr-Abl CCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGG -AGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC
4F_140203 ------------------------------- CCGNNCAACAGTCTGGTAGAAACACTCCTGGTACTTTGGGCCTGTGTCC
1601 1611 1621 1631 1641 1651 1661 1671
p185 Bcr-Abl CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCT GAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCA
4F_140203 CGCCNTGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCA
1681 1691 1701 1711 1721 1731 1741 1751
p185 Bcr-Abl GAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCT
4F_140203 GAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCT
1761 1771 1781 1791 1801 1811 1821 1831
p185 Bcr-Abl CCTCCGAGAGCCGCTTCAACACCCTGGCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTC
4F_140203 CCTCCGAGAGCCGCTTCAACACCCTGGCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTC
1841 1851 1861 1871 1881 1891 1901 1911
p185 Bcr-Abl CATTATCCAGCCCCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCAC
4F_140203 CATTATCCAGCCCCAAAGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCAC
1921 1931 1941 1951 1961 1971 1981 1991
p185 Bcr-Abl GGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGG -AGGTGTACGAGGGCGTGTGGAAGAAATACAGCCTG
4F_140203 GGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTACGGGGGAGGTGTACGAGGGC GTGTGGAANAAATACAGCCTG
2001 2011 K 2021 2031 2041 2051 2061 2071
p185 Bcr-Abl ACGGTGG -CCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGG -AGGTGGAAGAGTTCTTGAAAGAA -GCTGCAGTCATGAAAGA
4F_140203 ACGGTGGGCCGTG CGCACCTTGAAGGAGG ACACCATNGGAGGTGGAAAAGTTCTTGAAAGAAANCTGCAGTCATGAAANA
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2081 2091 2101 2111 2121 2131 2141 2151
p185 Bcr-Abl GA -TCAAACACCCTAACCTAGTGCAGCTCCTTGGGGTCTGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC TGAGTTCATG
4F_140203 AAATCAAACACCCC -------T--A---------------- ACCTGGGGGCNACN----------------------- T
2161 2171 2181 2191 2201 2211 2221 2231
p185 Bcr-Abl ACCTACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAGTGCAACC GGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTGCTGCTGTACATGGCCAC
4F_140203 ------N---------------- CTTGGGGGTNTGCA-CCC---------------------------------------
99
sobrenadante. Esse sobrenadante é, então, recolhido e as partículas virais presentes são
utilizadas para infectar células-alvo, transmitindo, assim, os genes de interesse.
Como já mencionado, um dos objetivos do presente trabalho era o estabelecimento de
linhagens celulares, expressando a versão mutada da proteína Bcr-Abl que não apresenta
atividade tirosina-quinase (quinase-deficiente). Para isso foram utilizados os sobrenadantes de
células empacotadoras da linhagem 293T transfectadas com os plasmídeos retrovirais de
interesse.
Para a produção de partículas virais, células 293T foram co-transfectadas, pelo método
do fosfato de cálcio, com um dos plasmídeos retrovirais de interesse (pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl/KR, pSRαMSVtkneo ou pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl) e o plasmídeo pCL-ampho. Enquanto
os plasmídeos de interesse carregam o gene a ser introduzido nas células-alvo, o plasmídeo
pCL-ampho fornece os genes gag, que codifica proteínas do capsídeo, pol, que codifica as
proteínas envolvidas na transcrição (transcriptase reversa) e na integração do genoma viral no
genoma do hospedeiro (integrases) e env, que codifica as glicoproteínas do envelope viral,
proteínas essas que são necessárias para a produção das partículas virais. Um outro elemento
importante é o sinal de empacotamento (ψ) que deve estar presente no RNA viral e é
imprescindível para a montagem da partícula retroviral.
Para avaliar a eficiência das transfecções com os plasmídeos de interesse, foram
realizadas em paralelo, transfecções com plasmídeos que carregam o gene egfp (pEGFP-NI ou
pMX-IRES-EGFP), que codifica a proteína verde fluorescente e cuja expressão pode ser
analisada tanto em microscópio de fluorescência como por citometria de fluxo. Apesar de não
ser uma medida direta da eficiência de transfecção com os plasmídeos de interesse, essa
ferramenta foi utilizada tanto para estimar as eficiências de transfecção, como para
padronizar, melhorar ou detectar problemas nesse protocolo. Além disso, outro ponto
importante é que por se tratar de um plasmídeo retroviral, o pMX-IRES-EGFP foi utilizado
também em testes para avaliar a eficiência de infecção de células-alvo. A eficiência das
transfecções foi na maioria dos casos analisada 48-72 horas após a transfecção.
O sobrenadante viral também foi recolhido e utilizado para a infecção de células-alvo
48 horas após a transfecção das células empacotadoras. As infecções foram realizadas na
presença de polibrene (8 µg/ml), uma molécula pequena carregada positivamente que se liga a
membrana celular neutralizando a carga da superfície. Esse efeito parece facilitar a ligação
das glicoproteínas virais com os seus receptores presentes na membrana celular, aumentando a
eficiência de infecção. Após cerca de 18-24 horas de contato com o sobrenadante viral, o meio
de cultura das células foi trocado e 48-72 horas após o procedimento de infecção, foi iniciado
o protocolo de seleção com o antibiótico G418.
100
Como será mostrado ao longo dessa seção da tese, foram estabelecidas diversas
linhagens celulares expressando a proteína Bcr-Abl (quinase-deficiente ou ativa) ou com o
vetor vazio. Muitas dessas linhagens, apesar de expressarem a mesma proteína, foram
infectadas com sobrenadantes virais produzidos em dias diferentes, resultantes de transfecções
diferentes que variaram, dentre outras coisas, em sua eficiência, dada pela menor ou maior
quantidade de células que expressavam a proteína verde fluorescente 48 horas após o
protocolo de transfecção (dados não mostrados).
Como uma medida mais direta do sucesso da transfecção de células 293T com os
plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl, também foi usada a
análise da expressão transitória de Bcr-Abl por Western-blot. Para essa análise, o preparo das
amostras das células empacotadoras foi realizado logo após a coleta do sobrenadante que seria
utilizado na infecção das células-alvo. Em alguns desses ensaios, células 293T foram
transfectadas com os plasmídeos pSRαMSVtkneo (vetor vazio), pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl/KR e pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl e após 48 horas foram lisadas para análise da expressão
de Bcr-Abl por Western blot.
A transfecção das células 293T com os plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR,
pSRαMSVtkneo, pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl foi confirmada por Western-blot, através da
marcação com os anticorpos anti-c-Abl e anti-fosfotirosina (Figura 22). Como podemos notar,
células 293T que foram transfectadas transitoriamente com o plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl/KR (Figura 22A), apesar de passarem a expressar altos níveis de Bcr-Abl, mantiveram a
mesma quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina manifestada por células controle ou
transfectadas com o vetor vazio (Figura 22B), confirmando o caráter quinase-deficiente da
molécula Bcr-Abl expressa. Por outro lado, as células 293T transfectadas com
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl (Figura 22B), além de expressarem muito Bcr-Abl, passaram a
apresentar também uma grande quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina, já que a
versão expressa representa a forma quinase ativa dessa oncoproteína.
101
c-Abl (145 kDa)
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em tirosina
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 22: Expressão transitória de Bcr-Abl (quinase-deficiente e mutado). Células 293T foram co-
transfectadas com pCL-ampho e um dos seguintes plasmídeos: (A) pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR,
(B) pSRαMSVtkneo (vetor vazio) ou pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl. Western-blot dos extratos
celulares de células 293T controle e transfectada (48 horas), utilizando anticorpos anti-c-Abl e anti-
fosfotirosina.
4.2.3 INFECÇÃO E SELEÇÃO DE CÉLULAS HL-60 INCUBADAS COM O SOBRENADANTE VIRAL DE
CÉLULAS EMPACOTADORAS
Visto que os ensaios com mesilato de imatinibe apresentados no bloco anterior e
muitos dos trabalhos sobre os efeitos de Bcr-Abl realizados pelo nosso grupo de pesquisa
estão baseados na comparação de células HL-60 e HL-60.Bcr-Abl, nossa proposta inicial
estava focada no desenvolvimento de células HL-60 expressando a versão quinase-deficiente
de Bcr-Abl. Com isso poderíamos, dentre outras coisas, comparar a resistência à apoptose das
células HL-60, HL-60.Bcr-Abl e HL-60.Bcr-Abl/KR e examinar qual é a contribuição da
atividade tirosina-quinase para os efeitos anti-apoptóticos de Bcr-Abl, além de comparar o
perfil de expressão de proteínas envolvidas no processo apoptótico. Diversas tentativas foram
feitas com o objetivo de obter células HL-60.Bcr-Abl/KR. Inicialmente foram utilizados os
sobrenadantes de células 293T co-transfectadas com os plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-
Abl/KR e pCL-ampho. As células HL-60 submetidas ao protocolo de infecção celular foram
selecionadas com o antibiótico G418 e após cerca de 3-4 semanas de seleção, amostras dos
extratos celulares foram preparadas para análise da expressão de Bcr-Abl por Western-blot.
Em praticamente todas as vezes em que células HL-60 foram submetidas ao protocolo
de infecção, foi possível a seleção de células resistentes ao antibiótico G418. Apesar do
102
aparente sucesso das infecções e da seleção, todas as células HL-60 selecionadas, apesar de
resistentes ao antibiótico, inexplicavelmente não expressavam a proteína Bcr-Abl. É
importante ressaltar que durante o período de seleção das células infectadas, em paralelo,
células HL-60 controle, não submetidas a infecções, também foram expostas às mesmas doses
de G418 e condições de cultivo, mas em nenhuma das vezes foram obtidas células resistentes
ao antibiótico a partir dessa população.
Em uma dessas tentativas, células HL-60 e HeLa foram submetidas ao protocolo de
infecção com o mesmo sobrenadante viral, proveniente de células 293T co-transfectadas com
os plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCL-ampho. Após a seleção com G418, as
populações de HL-60 e HeLa selecionadas foram examinadas para a presença de Bcr-Abl por
Western-blot (Figura 23A). A marcação com anticorpo anti-c-Abl confirmou o
estabelecimento de células HeLa expressando Bcr-Abl/KR (HeLa.Bcr-Abl/KR). Já as células
HL-60 selecionadas, apesar de infectadas com o mesmo sobrenadante de células HeLa, não
expressavam a proteína Bcr-Abl.
As células HeLa.Bcr-Abl/KR serão abordadas novamente mais adiante nesse trabalho,
mas a sua obtenção confirmou a presença de partículas virais no sobrenadante das células
empacotadoras e o funcionamento do protocolo de infecção e seleção celular.
Após algumas tentativas frustradas de estabelecer uma linhagem de células HL-60
expressando o gene bcr-abl mutado, em que conseguimos obter diversas populações de
células HL-60 resistentes ao antibiótico de seleção, mas que não expressam Bcr-Abl (Figura
23A), decidimos fazer uma nova tentativa de infecção celular utilizando duas estratégias: uma
seguindo o protocolo descrito acima e já bem estabelecido em nosso laboratório, na qual as
células HL-60 foram expostas ao sobrenadante de células 293T co-transfectadas com os
plasmídeos pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCL-ampho e outra na qual as células HL60
foram co-cultivadas por 48 horas com as células produtoras de partículas virais.
Ao final dos dois protocolos de infecção, as células infectadas foram submetidas ao
mesmo procedimento de seleção com G418, ou seja, foram distribuídas em placas de 6 poços
numa concentração de 1 x 10
6
célula/poço/2 ml de meio de cultura e submetidas a uma dose
de 1 mg/ml de G418. Após uma semana, as células HL-60 controle estavam completamente
mortas, enquanto as células submetidas a qualquer um dos protocolos de infecção
apresentavam uma quantidade expressiva de células vivas. Ao longo da seleção as populações
de células vivas foram crescendo e após um mês obtivemos as duas populações de células
resistentes ao antibiótico e que supostamente expressavam nossa proteína de interesse.
Entretanto, novamente a marcação com o anticorpo anti-c-Abl (Figura 23C) revelou que as
células HL-60 selecionadas, apesar de resistentes ao G418, não expressavam, pelo menos em
103
níveis detectáveis, a proteína Bcr-Abl, independentemente do protocolo utilizado para
infecção. Como controle positivo para a expressão de Bcr-Abl foi utilizada uma amostra da
linhagem HL-60.Bcr-Abl (OW).
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A
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em tirosina
FIGURA 23: Tentativas de obtenção de células HL-60 expressando Bcr-Abl-quinase-deficiente. A) Células
HL-60 e HeLa foram incubadas com o sobrenadante de células 293T co-transfectadas com
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCl-ampho e selecionadas por 10-20 dias com 1mg/ml de G418.
Western blot dos extratos celulares de HeLa (controle), HeLa.Bcr-Abl/KR (selecionada), HL-60
(controle), HL-60 (selecionada) e HL-60.Bcr-Abl (OW). B) Células PA317.Bcr-Abl/KR foram
obtidas pela transfecção de células PA317 com o plasmídeo pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e
selecionadas com 800 µg/mL de G418. C) Células HL-60 foram co-cultivadas ou incubadas com o
sobrenadante de células 293T co-transfectadas com pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCl-ampho e
selecionadas com 1mg/ml de G418. Western blot dos extratos celulares de HL-60 (controle), HL-60
(infectada com o sobrenadante), HL-60 (co-cultivada com células produtoras de vírus) e HL-
60.Bcr-Abl (OW). Western blot utilizando anticorpos anti-c-Abl, anti-fosfotirosina e anti-actina.
Em paralelo ao uso de células 293T para a produção de partículas virais, foram obtidas
por transfecção com fosfato de cálcio e seleção com 800 µg/mL de G418, células da linhagem
PA317 expressando Bcr-Abl/KR (Figura 23B). As células PA317.Bcr-Abl/KR obtidas
apresentam uma alta expressão de Bcr-Abl e uma quantidade de proteínas fosforiladas em
tirosina semelhante as células controle. Pelo fato da PA317 ser uma linhagem capaz de
produzir partículas retrovirais, tentamos também utilizar o sobrenadante das células
104
PA371.Bcr-Abl/KR para produzir células HL-60.Bcr-Abl/KR, mas não obtivemos sucesso
(dados não mostrados).
Diversas alterações nos protocolos de transfecção de células 293T, infecção de células-
alvo e seleção com G418 foram testadas com o intuito de aumentar a eficiência de infecção de
células HL-60. Essas alterações incluem até a adoção de um outro sistema de produção de
retrovírus envolvendo o uso de células empacotadoras 293 gag/pol e o plasmídeo pVSV-G,
que carrega o gene para uma proteína de envelope, no caso, a glicoproteína G do vírus da
estomatite vesicular (VSV). A grande vantagem que esse sistema oferecia para a infecção de
células HL-60 é que, ao contrário da proteína de envelope codificada pelo pCL-ampho (gp70),
que utiliza um receptor celular específico, a glicoproteína G do VSV não utiliza um receptor
específico para entrar na célula-alvo, mas sim fosfolipídios de membrana que propiciam a
fusão do vírus com a membrana citoplasmática da célula-alvo. Mesmo assim, em todas as
tentativas as células HL-60 infectadas e selecionadas não expressavam a proteína Bcr-Abl,
apesar da resistência ao G418.
Em paralelo às tentativas de obtenção de células HL-60.Bcr-Abl/KR, utilizamos os
sobrenadantes virais de células 293T para a infecção de diversas linhagens celulares, tais
como: HeLa, Jurkat e THP-1. A primeira linhagem expressando a versão quinase-deficiente
de Bcr-Abl estabelecida, como mostrado na figura 23A, foi a HeLa.Bcr-Abl/KR.
4.2.4 EFEITO DA EXPRESSÃO DE BCR-ABL/KR EM CÉLULAS HELA
As células HeLa submetidas ao protocolo de infecção com os sobrenadantes virais
foram selecionadas com 800 µg/ml do antibiótico G418. Duas semanas após o início da
seleção foi confirmada a expressão de Bcr-Abl nas células selecionadas (Figuras 23A e 24).
Pode-se notar que, apesar da alta expressão de Bcr-Abl nessas células, não houve diferença na
quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina entre as células HeLa controle e as HeLa.Bcr-
Abl/KR selecionadas.
O estabelecimento de uma linhagem de células HeLa expressando o gene bcr-abl
mutado foi de grande importância pois, a partir desse momento puderam ser iniciados alguns
experimentos de resistência à apoptose comparando as células HeLa controle, HeLa.Bcr-
Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl.
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Anti-fosfotirosina
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 24: Estabelecimento da linhagem HeLa.Bcr-Abl/KR. Expressão estável de Bcr-Abl nas células HeLa
infectadas com o sobrenadante de células 293T co-tranfectadas com os plasmídeos
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCL-ampho. Western-blot dos extratos celulares de células HeLa
controle, HeLa.Bcr-Abl/KR, utilizando anticorpos anti-c-Abl e anti-fosfotirosina.
4.2.4.1 EXPRESSÃO DE BCR-ABL-QUINASE DEFICIENTE CONFERE RESISTÊNCIA À APOPTOSE
INDUZIDA POR LUZ ULTRAVIOLETA
Células das linhagens HeLa, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl foram submetidas a
ensaios de indução de morte pela irradiação com luz ultravioleta (UV). É importante ressaltar
que o estímulo pró-apoptótico só foi dado quando as células já estavam aderidas às placas.
Após o período de incubação, que variou de 18 a 48 horas, as células foram recolhidas,
ressuspendidas em tampão HFS e analisadas quanto ao conteúdo de DNA por citometria de
fluxo. Para recuperar tanto as células vivas como as mortas, foram recolhidas tanto as células
que estavam no sobrenadante de cada amostra, como as que ainda estavam aderidas à placa.
A incubação das células HeLa por 18-20 horas após irradiação com luz ultravioleta
induziu uma porcentagem de morte de aproximadamente 60%, enquanto o controle não
tratado manteve uma porcentagem de 10 % de células mortas (Figura 25). Como esperado, as
células HeLa.Bcr-Abl se mostraram muito resistentes à apoptose induzida por esse estímulo,
não havendo diferença na viabilidade entre as células que receberam ou não o tratamento com
UV. Interessantemente, as células que expressam o Bcr-Abl quinase-deficiente (HeLa.Bcr-
Abl/KR), apresentaram uma resistência à apoptose intermediária entre a encontrada nas
células HeLa controle e células HeLa.Bcr-Abl, com aproximadamente 30% das células em
apoptose pós tratamento.
106
FIGURA 25: Células HeLa.Bcr-Abl-quinase deficiente exibem resistência à apoptose induzida por UV. As
linhagens HeLa, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl foram incubadas por 18 horas, após terem sido
ou não submetidas a 200 mJ/cm
2
de irradiação ultravioleta. A porcentagem de apoptose foi
analisada por citometria de fluxo, através do nível de fragmentação do DNA. Os resultados
apresentados representam a média ± desvio padrão dos valores obtidos nas triplicatas. Experimento
representativo de 2 experimentos independentes.
Posteriormente foram obtidas células HeLa.vetor (Figura 26) para serem utilizadas
como controle no lugar das células HeLa. Essas células foram obtidas pela infecção com o
sobrenadante de células 293T co-transfectadas com os plasmídeos pCL-ampho e
pSRαMSVtkneo (vetor) e seleção com o antibiótico G418 numa concentração de 800 µg/ml.
Como optamos por fazer a seleção de populações resistentes ao G418, ao invés da
clonagem das células infectadas e/ou selecionadas, isso pode às vezes resultar na obtenção de
populações celulares que expressam níveis diferentes da proteína de interesse. Na marcação
com anti-c-Abl fica claro que a expressão de Bcr-Abl é bem mais intensa na população de
células HeLa.Bcr-Abl/KR selecionada do que na população de HeLa.Bcr-Abl (Figura 26).
Como estamos particularmente interessados nos efeitos da expressão de Bcr-Abl/KR, essa
diferença, apesar de considerada na análise dos dados, não prejudicou o estudo em questão.
Quanto à marcação com o anticorpo anti-fosfotirosina, diferentemente do que foi visto
para as células HL-60, as células HeLa já possuem uma atividade tirosina-quinase alta e tal
atividade, como esperado, não parece ser aumentada em decorrência da expressão de Bcr-Abl-
quinase-deficiente. O aumento na atividade enzimática em conseqüência da expressão da
forma selvagem do Bcr-Abl também não ficou tão evidente, parecendo ser só um pouco maior
do que o das células controle, o que talvez possa ser explicado pelo fato das células controle já
apresentarem grandes quantidade de fosfoproteínas, dificultando a visualização do ganho em
proteínas fosforiladas em tirosina. Entretanto, não podemos descartar a possibilidade de que
substratos específicos de Bcr-Abl estejam fosforilados apenas nas HeLa.Bcr-Abl (selvagem).
0
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20
30
40
50
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70
HeLa HeLa.Bcr-Abl/KR HeLa.Bcr-Abl
% de células em apotose
Controle
UV
107
H
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Bcr-Abl (210 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
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Bcr-Abl (210 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
FIGURA 26: Linhagens obtidas a partir da infecção de células HeLa. Western-blot das linhagens HeLa,
HeLa.vetor, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl, utilizando anticorpos anti-c-Abl, anti-fosfotirosina
e anti-actina.
Após a obtenção da linhagem HeLa.vetor, foram repetidos os experimentos de
resistência a UV. Novamente as células HeLa.Bcr-Abl/KR mostraram uma porcentagem de
células em apoptose (cerca de 35%) intermediária aos valores obtidos para células
HeLa.vetor, que são mais sensíveis (cerca de 70%), e HeLa.Bcr-Abl, que são mais resistentes
(cerca de 20%) (Figura 27). O mesmo perfil foi obtido em ensaios mais longos.
0
10
20
30
40
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70
80
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HeLa.vetor HeLa.Bcr-
Abl/KR
HeLa.Bcr-Abl
% de células em apoptose
Controle
UV
FIGURA 27: Células HeLa.Bcr-Abl quinase-deficiente exibem resistência à apoptose induzida por UV.
Células HeLa.vetor, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl foram plaquedas na concentração de 1,5 x
10
5
células/mL e incubadas por 18-20 horas, após terem sido ou não submetidas a 200 mJ/cm
2
de
irradiação ultravioleta. Os resultados apresentados representam a média ± desvio padrão dos
valores obtidos nas triplicatas. Experimento representativo de 3 experimentos independentes.
108
Visando a melhor compreensão do mecanismo pelo qual a molécula Bcr-Abl quinase-
deficiente confere resistência à apoptose, foram analisadas nas células HeLa, HeLa.vetor,
HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl as expressões de diversas proteínas que classicamente
participam na regulação/sinalização da morte celular por apoptose (Figuras 28 e 29).
Apesar da altíssima expressão de Bcr-Abl/KR nas células HeLa.Bcr-Abl/KR, não
foram observadas alterações nas expressões de Bax, Bak, Bcl-x
L
, Bid, A1, c-IAP-1, XIAP,
CRKL, Mcl-1, caspase-3, caspase-9 e Flip nas células HeLa.Bcr-Abl/KR quando comparadas
às células HeLa e HeLa.vetor. Já a expressão de Bcr-Abl selvagem parece ter induzido apenas
um aumento da expressão de c-IAP-1. A proteína Bcl-2 não foi detectada em nenhuma das
linhagens celulares testadas.
Actina (45 kDa)
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Bcl-x
L
(28 kDa)
Bax (23 kDa)
XIAP (57 kDa)
Mcl-1
L
(40 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
Crkl (36 kDa)
Bak (30 kDa)
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Mcl-1
S
(32 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Bcr-Abl (185 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Actina (45 kDa)
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Bcl-x
L
(28 kDa)
Bax (23 kDa)
XIAP (57 kDa)
Mcl-1
L
(40 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
Crkl (36 kDa)
Bak (30 kDa)
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Mcl-1
S
(32 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Bcr-Abl (185 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 28: Expressão de proteínas reguladoras do processo de apoptose. Western-blot dos lisados totais de
células HeLa, HeLa.vetor, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl, utilizando anticorpos anti-c-Abl,
anti-fosfotirosina, anti-actina, anti-Bax, anti-Bak, anti-Bcl-x
L
, anti-Mcl-1, anti-CRKL, anti-c-IAP-1
e anti-XIAP.
109
Flip
L
( 55 kDa)
Caspase-3 (32 kDa)
Caspase-9 (48 kDa)
Actina (45 kDa)
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L
(28 kDa)
Bax (23 kDa)
XIAP (57 kDa)
Bak (30 kDa)
A1 (20 kDa)
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Flip
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( 55 kDa)
Caspase-3 (32 kDa)
Caspase-9 (48 kDa)
Actina (45 kDa)
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Bcl-x
L
(28 kDa)
Bax (23 kDa)
XIAP (57 kDa)
Bak (30 kDa)
A1 (20 kDa)
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FIGURA 29: Expressão de proteínas reguladoras do processo de apoptose. Western-blot dos lisados totais de
células HeLa, HeLa.vetor, HeLa.Bcr-Abl/KR e HeLa.Bcr-Abl, utilizando anticorpos, anti-Bcl-x
L
anti-Bax, anti-Bak, anti-Bid, anti-XIAP, anti-A1, anti-FLIP, anti-caspase-3, anti-caspase-9 e anti-
actina.
Em conjunto os resultados de resistência à apoptose obtidos em HeLa.Bcr-Abl/KR,
indicam que a proteína Bcr-Abl quinase-deficiente é capaz de conferir resistência à apoptose.
Um conceito bem estabelecido é o de que o efeito da expressão de uma proteína pode
variar de acordo com o contexto celular. Assim, com o intuito de confirmar os resultados de
resistência à apoptose obtidos com expressão de Bcr-Abl-quinase-deficiente em células HeLa
e analisar se a expressão de Bcr-Abl, tanto o quinase-deficiente como o selvagem, induz
efeitos diferentes de acordo com o tipo celular, foram estabelecidas outras linhagens celulares
expressando os genes de interesse.
Como as células HeLa são derivadas de carcinoma de colo de útero e o oncogene bcr-
abl está associado à leucemias, decidimos complementar os estudos realizados em HeLa,
focando no estabelecimento de linhagens celulares de origem hematopoética expressando a
molécula Bcr-Abl-quinase deficiente. Foram incluídas nos ensaios de infecção celular com
retrovírus, as células Jurkat, uma linhagem humana derivada de leucemia linfocítica aguda e
THP-1, derivada de paciente com leucemia monocítica aguda.
Em um dos ensaios de transfecção de células 293T co-transfectadas com
pSRαMSVtkneo.Bcr-Abl/KR e pCL-ampho (Figura 30A), o sobrenadante viral produzido foi
utilizado para a infecção de células HeLa, HL-60, Jurkat e THP-1. Após o protocolo de
infecção, as células foram cultivadas com G418 para a seleção das células expressando Bcr-
Abl/KR.
110
As células HeLa foram utilizadas somente como controle de infecção e a expressão de
Bcr-Abl/KR foi confirmada após dez dias de seleção (Figura 30A).
2
9
3
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c-Abl (145 kDa)
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Bcr-Abl (185 kDa)
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
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fosforiladas
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Bcr-Abl (185 kDa)
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
C
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 30: Análise da expressão de Bcr-Abl nas células 293T co-transfectadas com os plasmídeos
pSRα
αα
αMSV.tkneo.Bcr-Abl/KR e pCL-ampho transfectadas e em células infectadas e
selecionadas com G418. (A) Extratos celulares de células 293T, 293T transfectadas, HeLa e
HeLa.Bcr-Abl/KR selecionada com 800 µg/mL de G418. (B) Extratos celulares de células HL-60,
HL-60 submetidas a infecção e selecionadas com 400 e 800 µg/mL de G418, respectivamente e
HL-60.Bcr-Abl (OW). (C) Expressão estável de Bcr-Abl/KR nas linhagens Jurkat e THP-1
infectadas com sobrenadante das células 293T transfectadas. As células HL-60 apesar de
infectadas com o mesmo sobrenadante e selecionadas com G418 não expressam Bcr-Abl. Western-
blot dos extratos celulares utilizando anticorpos anti-c-Abl e anti-fosfotirosina.
111
Quanto às demais linhagens que foram infectadas, após cerca de trinta dias de seleção
foram preparadas amostras das células selecionadas para análise da expressão de Bcr-Abl/KR
por Western-blot. Novamente as células HL-60 selecionadas não expressam a proteína de
interesse (Figura 30B). No entanto, foram obtidas com sucesso, linhagens derivadas de Jurkat
e THP-1 expressando a proteína Bcr-Abl/KR. São elas: Jurkat.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-
Abl/KR (Figura 30C). Posteriormente foram obtidas as linhagens, Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-
Abl, THP-1.vetor e THP-1.Bcr-Abl para os ensaios de comparação com as células que
expressam Bcr-Abl/KR. Os ensaios realizados com cada grupo de células estão apresentados a
seguir.
4.2.5 CÉLULAS JURKAT, JURKAT.VETOR, JURKAT.BCR-ABL/KR E JURKAT.BCR-ABL –
CARACTERIZAÇÃO E RESISTÊNCIA À APOPTOSE
As células estabelecidas a partir da infecção de células Jurkat com o sobrenadante
contendo retrovírus estão apresentadas na Figura 31. Com a marcação com o anticorpo anti-c-
Abl observa-se que células Jurkat.Bcr-Abl/KR expressam grandes quantidades de Bcr-Abl,
mas apresentam o mesmo perfil de proteínas fosforiladas em tirosina das células controle ou
que expressam só o vetor. Já as células Jurkat.Bcr-Abl, além de expressarem uma altíssima
quantidade de Bcr-Abl, superior a de Jurkat.Bcr-Abl/KR, passaram a apresentar um perfil de
fosfoproteínas diferente do observado nas outras três linhagens e marcado pelo aumento
expressivo de proteínas fosforiladas em tirosina. Essa característica é uma das marcas da
expressão de Bcr-Abl e sua atividade tirosina-quinase.
Com o objetivo de analisar se a expressão de Bcr-Abl protege as células Jurkat da
indução de morte por agentes pró-apoptóticos, células das linhagens Jurkat, Jurkat.vetor,
Jurkat.Bcr-Abl/KR e Jurkat.Bcr-Abl foram expostas a diferentes agentes indutores de
apoptose e a porcentagem de morte foi determinada pela análise do conteúdo de DNA por
citometria de fluxo. Como pode ser observado (Figura 32), as células Jurkat.Bcr-Abl se
mostraram, como esperado, mais resistentes à indução de morte do que as demais linhagens
celulares analisadas. Isso indica que em Jurkat, assim como em HL-60, HeLa e tantas outras
linhagens celulares descritas na literatura, a expressão de Bcr-Abl é capaz de modificar a
resposta celular à agentes apoptogênicos, bloqueando a indução de morte. No experimento
aqui apresentado, o aumento na resistência à morte foi observado para três (Act-D, CHX e
UV) das quatro drogas testadas. Estranhamente, em Jurkat a expressão de Bcr-Abl parece não
ter muito efeito sobre a indução de morte por Ara-C. O efeito protetor de Bcr-Abl em Jurkat
também foi observado para o VM26 (dado não mostrado).
112
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Actina (45 kDa)
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Anti-actina
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Anti-fosfotirosina
Anti-c-Abl
Anti-actina
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 31: Expressão de Bcr-Abl nas linhagens derivadas de Jurkat. Western-blot das linhagens Jurkat,
Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-Abl/KR e Jurkat.Bcr-Abl, utilizando anticorpos anti-c-Abl, anti-
fosfotirosina e anti-actina.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle ActD AraC CHX UV
% de núcleos hipodiplóides
Jurkat
Jurkat.vetor
Jurkat.Bcr-Abl/KR
Jurkat.Bcr-Abl
FIGURA 32: Expressão de Bcr-Abl, mas não de Bcr-Abl-quinase deficiente (Bcr-Abl/KR) confere
resistência à apoptose em células Jurkat. Células Jurkat, Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-Abl/KR e
Jurkat.Bcr-Abl foram incubadas por 18-20 horas na ausência ou presença de de 1µM de Act D,
100 µM Ara-C, 50 µM de CHX ou após terem submetidas a 100 mJ/cm
2
de UV. A porcentagem
de células em apoptose foi analisada por citometria de fluxo, através da análise do ciclo celular.
Os resultados apresentados representam a média ± desvio padrão dos valores obtidos nas
triplicatas. Experimento representativo de 3 experimentos independentes.
113
Contrastando com os resultados obtidos para a célula HeLa.Bcr-Abl/KR, na qual a
expressão de Bcr-Abl-quinase-deficiente é capaz de induzir resistência à apoptose, as células
Jurkat.Bcr-Abl/KR se comportaram frente a grande maioria dos tratamentos testados de
maneira muito semelhante às linhagens Jurkat e Jurkat.vetor, indicando que em células Jurkat
a expressão de Bcr-Abl/KR não foi capaz de induzir resistência à apoptose. Apesar disso, as
células Jurkat.Bcr-Abl/KR só se mostraram consistentemente mais resistentes do que células
controle e vetor quando o estímulo utilizado foi a Act-D.
A expressão das moléculas Bad, Bax, Bim, survivina, c-IAP-1, XIAP, Apaf-1 e Flip,
envolvidas na regulação da apoptose, foi analisada por Western-blot (Figura 33).
Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bax (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
J
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J
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k
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Actina (45 kDa)
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
J
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B
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A
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bax (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
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Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bax (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
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Actina (45 kDa)
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Actina (45 kDa)
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
J
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A
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Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 33: Expressão de proteínas reguladoras do processo de apoptose. Western-blot dos lisados totais de
células Jurkat, Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-Abl/KR e Jurkat.Bcr-Abl, utilizando anticorpos anti-c-Abl,
anti-fosfotirosina, anti-actina, anti-Bad, anti-Bax, anti-Bim, anti-survivina, anti-c-IAP-1, anti-XIAP,
anti-Apaf-1 e anti-Flip. Foram aplicadas duas amostras das linhagens Jurkat.Bcr-Abl/KR e
Jurkat.Bcr-Abl.
114
Como pode ser observado, a expressão de Bcr-Abl/KR não induziu alterações no
padrão de expressão de nenhuma das proteínas analisadas. Por outro lado, a expressão de Bcr-
Abl induziu um aumento da expressão das moléculas anti-apoptóticas survivina e c-IAP-1 e
uma diminuição da expressão de Bim, um membro pró-apoptótico da família Bcl-2.
Estranhamente a expressão de Bcr-Abl (quinase-ativo) em células Jurkat induziu a expressão
de níveis altíssimos de Bax e um leve aumento na expressão de Bad, duas moléculas pró-
apoptóticas. Também foram observadas alterações no padrão de marcação de Apaf-1 e XIAP.
Nas linhagens Jurkat, Jurkat.vetor e Jurkat.Bcr-Abl/KR a marcação com anticorpo anti-XIAP
revelou duas bandas, sendo que a banda inferior se mostrava bem mais intensa do que a
superior nessas linhagens. Já a marcação da Jurkat.Bcr-Abl revelou a existência de uma banda
única, intensa e com tamanho similar ao da banda superior observada nas outras linhagens.
Quanto ao Apaf-1, foram observadas duas bandas nas linhagens Jurkat, Jurkat.vetor e
Jurkat.Bcr-Abl/KR, sendo a banda superior um pouco mais intensa do que a inferior.
Enquanto isso a expressão do Bcr-Abl parece ter induzido o desaparecimento da banda
superior e um aumento da intensidade da banda inferior. Em uma das amostras de Jurkat.Bcr-
Abl também apareceram duas bandas, a mais forte e superior de mesmo tamanho que a banda
inferior encontrada nas outras linhagens e uma banda inferior mais fraca.
4.2.6 CÉLULAS THP-1, THP-1.VETOR, THP-1.BCR-ABL/KR E THP-1.BCR-ABL –
CARACTERIZAÇÃO E RESISTÊNCIA À APOPTOSE
Como grande parte dos trabalhos realizados com Bcr-Abl em nosso laboratório foi
feita em células HL-60, uma linhagem mielóide que fica resistente à apoptose na presença de
Bcr-Abl, realizamos também ensaios de resistência à morte nas linhagens de THP-1, uma
outra linhagem mielóide, para ver se os resultados seriam semelhantes. A análíse por Western-
blot das linhagens THP-1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl, confirmou a
expressão de Bcr-Abl (selvagem e mutado) (Figura 34).
Com o objetivo de analisar se a expressão de Bcr-Abl protege as células THP-1 da
indução de morte por agentes pró-apoptóticos, células das linhagens THP-1, THP-1.vetor,
THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl foram expostas a diferentes doses de UV e de VM26 e
incubadas por 16-20 horas na estufa.
Contrastando com o conceito bem estabelecido de que a expressão de Bcr-Abl induz
resistência à morte (Figura 35), as quatros linhagens celulares se comportaram de maneira
muito semelhante frente aos dois tratamentos testados, indicando que em células THP-1, a
expressão de Bcr-Abl não é capaz de bloquear a indução de morte.
115
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1
Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Anti-actina
Anti-fosfotirosina
Anti-c-Abl
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1
Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
Anti-actina
Anti-fosfotirosina
Anti-c-Abl
FIGURA 34: Expressão de Bcr-Abl nas linhagens de THP-1 selecionadas. Western-blot das linhagens THP-1,
THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl, utilizando anticorpos anti-c-Abl, anti-
fosfotirosina e anti-actina.
UV (mJ/cm
2
) VM26 (µ
µµ
µM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 12.5 25 50 100 1 2,5 5
% de células em apoptose
THP-1
THP-1.vetor
THP-1.Bcr-Abl/KR
THP-1.Bcr-Abl
UV (mJ/cm
2
) VM26 (µ
µµ
µM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle 12.5 25 50 100 1 2,5 5
% de células em apoptose
THP-1
THP-1.vetor
THP-1.Bcr-Abl/KR
THP-1.Bcr-Abl
FIGURA 35: Efeito da expressão de Bcr-Abl na resistência à apoptose de células THP-1. Células THP-1,
THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl foram incubadas por 18-20 horas na ausência
ou presença de um indutor de apoptose. A porcentagem de apoptose foi analisada por citometria de
fluxo, através do nível de fragmentação do DNA. Os resultados apresentados representam a média e
o desvio padrão dos valores obtidos nas triplicatas.
116
Uma hipótese levantada para explicar esse fenômeno é que o bloqueio da apoptose por
Bcr-Abl seria um processo gradual e que, portanto, a célula precisaria de um tempo maior de
exposição ao Bcr-Abl para que ocorresse a indução do fenótipo de resistência à apoptose. Para
testar essa hipótese, as linhagens THP-1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl
foram mantidas em cultura por cerca de 4 meses e, então, submetidas a novos testes de
resistência à apoptose. A porcentagem de morte foi novamente determinada por citometria de
fluxo (Figura 36).
FIGURA 36: Efeito da expressão de Bcr-Abl na resistência à apoptose de células THP-1. Células THP-1,
THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl foram incubadas por 18-20 horas na ausência
ou presença de um indutor de apoptose. A porcentagem de apoptose foi analisada por citometria de
fluxo, através do nível de fragmentação do DNA. Os resultados apresentados representam a média e
o desvio padrão dos valores obtidos nas triplicatas.
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle VM26 VP16 UV
% d e células em apoptose
THP-1
THP-1.vetor
THP-1.Bcr-Abl/KR
THP-1.Bcr-Abl
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle Act-D VP16
% de células em apoptose
THP-1
THP-1.vetor
THP-1.Bcr-Abl/KR
THP-1.Bcr-Abl
117
Como pode ser observado, mais uma vez as células THP-1.Bcr-Abl se comportaram
de maneira semelhante às linhagens controle (THP-1 e THP-1.vetor) frente aos estímulos
apoptogênicos. Esse resultado reforça a idéia de que nessa linhagem celular (THP-1), a
expressão de Bcr-Abl não é capaz de bloquear a indução de morte, pelo menos, utilizando os
estímulos adotados nesse estudo.
Como discutido anteriormente, um dos fatores relevantes para o fenótipo de
resistência à apoptose promovido por Bcr-Abl é a regulação da expressão de proteínas da
família Bcl-2 que atuam como reguladores do sinal apoptótico na mitocôndria. Dentre os
membros dessa família, Bcl-x
L
, parece estar aumentado em células que expressam Bcr-Abl e
são resistentes à apoptose, tais como as linhagens HL-60.Bcr-Abl e K562.
Na tentativa de compreender os resultados obtidos, verificamos inicialmente a
expressão de alguns membros da família Bcl-2 nas quatro linhagens de THP-1. Células THP-
1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl apresentaram o mesmo nível de
expressão das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-x
L
, e Mcl-1 e da proteína pró-apoptótica
Bax (Figura 37), mostrando que a expressão de Bcr-Abl em células THP-1 não modificou a
expressão de nenhuma das proteínas analisadas. Também não foram observadas alterações no
padrão de expressão de Bad, Bim, survivina, c-IAP-1, XIAP, Apaf-1 e Flip em decorrência
da expressão de Bcr-Abl (Figura 38). Somente survivina parece ter tido um leve aumento de
sua expressão em células THP-1.Bcr-Abl. Já o nível de expressão de c-IAP-1 foi baixo em
todas as linhagens.
118
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Bax (23 kDa)
Bcl-x
L
(28 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Mcl-1
L
(40 kDa)
Mcl-1
S
(32 kDa)
Anti-Mcl-1
Anti-c-Abl
Anti-actina
Anti-Bcl-2
Anti-Bcl-x
L
Anti-Bax
T
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Bax (23 kDa)
Bcl-x
L
(28 kDa)
Bcl-2 (26 kDa)
Mcl-1
L
(40 kDa)
Mcl-1
S
(32 kDa)
Anti-Mcl-1
Anti-c-Abl
Anti-actina
Anti-Bcl-2
Anti-Bcl-x
L
Anti-Bax
FIGURA 37: Expressão de Bcr-Abl em células THP-1 não altera o padrão de expressão de proteínas
reguladoras da apoptose. Western-blot de células THP-1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e
THP-1.Bcr-Abl, utilizando anti-c-Abl, anti-Bcl-2, anti-Bcl-x
L
, anti-Bax, anti-Mcl-1 e anti-actina
T
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1
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K
R
Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
(30 kDa)
T
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
T
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1
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K
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Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
(30 kDa)
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Survivina (16.5 kDa)
c-IAP1 (72 kDa)
XIAP (57 kDa)
Apaf-1 (130 kDa)
Bad (23 kDa)
Bim (23 kDa)
Flip
L
(55 kDa)
Flip
S
(30 kDa)
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
T
H
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1
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A
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Bcr-Abl (185 kDa)
c-Abl (145 kDa)
Actina (45 kDa)
Proteínas
fosforiladas
em tirosina
FIGURA 38: Expressão de proteínas reguladoras do processo de apoptose. Western-blot de células THP-1,
THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1.Bcr-Abl, utilizando anti-c-Abl, anti-fosfotirosina, anti-
actina, anti-Bad, anti-Bim, anti-survivina, anti-c-IAP-1, anti-XIAP, anti-Apaf-1 e anti-Flip.
119
PARTE 2: IMPACTO DA EXPRESSÃO DE BCR-ABL NO PROTEOMA DE CÉLULAS HL-60
Diversas alterações fenotípicas são observadas em células que expressam Bcr-Abl,
destacando-se o aumento da proliferação, a resistência à indução de apoptose por drogas
quimioterápicas e as modificações nas propriedades de adesão celular (Wong e Witte, 2004).
Com base no fato de que a maioria das vias ativadas por Bcr-Abl transmite sinais para a
maquinaria de transcrição e tradução da célula transformada, é plausível que o fenótipo
maligno de células que expressam Bcr-Abl possa ser explicado, pelo menos em parte, por
alterações no padrão de expressão protéica induzidas por Bcr-Abl.
Com o intuito de estudar o impacto da expressão de Bcr-Abl no padrão global de
expressão de proteínas foram comparados os géis bidimensionais das linhagens celulares HL-
60.vetor e HL-60.Bcr-Abl (OW).
4.3.1 PROTEOMA E FOSFOPROTEOMA DE CÉLULAS HL-60.VETOR E HL-60.BCR-ABL
Nos experimentos preliminares, utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na
faixa de 3-10 e de 7 cm de comprimento, durante a focalização isoelétrica, foi observado que
a maioria das proteínas presentes no lisado total de células HL-60.Bcr-Abl e, em especial, as
proteínas fosforiladas em tirosina, está concentrada na faixa de pH de 4-7 (Figura 39). Com
base nesses dados, utilizamos nos experimentos de comparação do proteoma de células HL-
60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, tiras de gradiente de pH imobilizado de 4-7 e com um
comprimento de 13 cm, para uma melhor separação das proteínas na primeira e na segunda
dimensões da eletroforese bidimensional.
120
FIGURA 39: Padrão da expressão protéica global (A) e de proteínas fosforiladas em tirosina (B) de células
HL-60.Bcr-Abl. Foram feitos dois géis bidimensionais idênticos utilizando tira de gradiente de pH
imobilizado na faixa de 3-10, de 7cm, de um extrato protéico de HL-60.Bcr-Abl (250 µg). Um gel
foi corado com azul de Coomassie (A) para a visualização das proteínas globalmente expressas e o
outro foi utilizado para Western-blot, no qual houve marcação com anticorpo anti-fosfotirosina (B).
MM
(kDa)
A
B
210 -
118 -
82 -
40 -
31 -
pH 3
pH 10
210 -
118 -
82 -
40 -
31 -
MM
(kDa)
A
B
210 -
118 -
82 -
40 -
31 -
pH 3
pH 10
210 -
118 -
82 -
40 -
31 -
121
Sendo assim, para identificar alterações induzidas por Bcr-Abl, 450 µg dos extratos
protéicos de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl foram separados por eletroforese
bidimensional utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7, de 13 cm. Após
o equilíbrio das tiras, a segunda dimensão foi realizada em géis de 10% poliacrilamida. Foram
feitos dois géis idênticos de cada linhagem, sendo que um deles foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das proteínas totais e o outro foi transferido para uma
membrana de PVDF e marcado com anticorpo anti-fosfotirosina. O padrão de expressão das
proteínas totais e das proteínas fosforiladas em tirosina das células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-
Abl pode ser observado nas figuras 40 e 41.
Nas células HL-60.vetor podemos observar uma grande quantidade de “spots” no gel
corado com azul de Coomassie, os quais estão distribuídos principalmente na faixa de massa
molecular entre 20 e 90 kDa e em pH de 4-6 (Figura 40). Apesar da alta quantidade de
proteína detectada nessa linhagem, a marcação com anti-fosfotirosina demonstra que somente
uma fração muito pequena dessas proteínas está fosforilada em tirosina. Células HL-60.Bcr-
Abl também apresentaram um grande número de “spots” no gel corado com azul de
Coomassie e do mesmo modo ao observado para células HL-60.vetor, as proteínas expressas
estão localizadas preferencialmente na faixa de pH de 4-6 e de massa molecular de 20-90 kDa
(Figura 41). A alta atividade tirosina-quinase da molécula Bcr-Abl presente nessa linhagem
fica evidente na marcação com o anticorpo anti-fosfotirosina, que revelou a grande quantidade
de “spots” que representam proteínas fosforiladas em tirosina. Essas fosfoproteínas estão
distribuídas por todo o gel, sendo visualizadas inclusive em áreas do gel que na marcação com
azul de Coomassie não foram detectados “spots”. Tal contraste entre o padrão do proteoma e
do fosfoproteoma, pode ser explicado pela enorme diferença na sensibilidade e especificidade
dos dois métodos de detecção de proteínas aqui utilizados. Contrastando esses dados com os
obtidos em eletroforese unidimensional, nota-se que o número de “spots” que representam
proteínas fosforiladas em tirosina detectados na técnica de gel bidimensional é muito superior
à quantidade de bandas visualizada em um gel de uma dimensão. Para poder comparar os
resultados de HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, as membranas foram marcadas exatamente nas
mesmas condições e os filmes mostrados nas figuras 40 e 41 representam filmes que foram
expostos simultaneamente por 30 minutos nas membranas das duas linhagens. A diferença na
quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl fica
ainda mais marcante quando analisamos o seu perfil em gel bidimensional.
122
40: Perfil da expressão protéica global (A) e de proteínas fosforiladas em tirosina (B) de células HL-60.vetor. Foram feitos dois géis bidimensionais idênticos
utilizando 450 µg de lisado total de células HL-60.vetor e tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Um dos géis foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das proteínas globalmente expressas (A) e o outro foi utilizado para western-blot com anticorpo anti-fosfotirosina (B). À esquerda do
gel estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60.vetor
40: Perfil da expressão protéica global (A) e de proteínas fosforiladas em tirosina (B) de células HL-60.vetor. Foram feitos dois géis bidimensionais idênticos
utilizando 450 µg de lisado total de células HL-60.vetor e tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Um dos géis foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das proteínas globalmente expressas (A) e o outro foi utilizado para western-blot com anticorpo anti-fosfotirosina (B). À esquerda do
gel estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60.vetor
123
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.Bcr-Abl
HL-60. Bcr-Abl
41: Perfil da expressão protéica global (A) e de proteínas fosforiladas em tirosina (B) de células HL-60.Bcr-Abl. Foram feitos dois géis bidimensionais idênticos
utilizando 450 µg de lisado total de células HL-60.Bcr-Abl e tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Um dos géis foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das proteínas globalmente expressas (A) e o outro foi utilizado para western-blot com anticorpo anti-fosfotirosina (B). À esquerda do
gel estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.Bcr-Abl
HL-60. Bcr-Abl
41: Perfil da expressão protéica global (A) e de proteínas fosforiladas em tirosina (B) de células HL-60.Bcr-Abl. Foram feitos dois géis bidimensionais idênticos
utilizando 450 µg de lisado total de células HL-60.Bcr-Abl e tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Um dos géis foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das proteínas globalmente expressas (A) e o outro foi utilizado para western-blot com anticorpo anti-fosfotirosina (B). À esquerda do
gel estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
124
Inicialmente esse trabalho estava focado em dois pontos principais: a análise de moléculas
cuja expressão é modulada pela presença do Bcr-Abl e a descrição de substratos que se
encontram fosforilados em células positivas para essa tirosina-quinase. No entanto, devido a
dificuldades e imprecisões na sobreposição dos “spots” visualizados por azul de Coomassie e
na marcação com antifosfotirosina, decidimos concentrar as análises no impacto de Bcr-Abl
na expressão protéica global, deixando o estudo das fosfoproteínas para outro momento.
Para encontrar as proteínas diferencialmente expressas relacionadas aos efeitos de Bcr-
Abl, foram comparados os géis de HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl corados com azul de
Coomassie. Todas as figuras de gel ou de áreas de gel apresentadas a seguir foram feitas a
partir das imagens utilizadas nas figuras 40 e 41. A instantânea e superficial comparação entre
os géis de HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl corados com azul de Coomassie já permite que
semelhanças e diferenças na distribuição e intensidade dos “spots” sejam vislumbradas
(Figura 42).
A análise mais refinada e precisa dos géis e das alterações observadas em células que
expressam Bcr-Abl pôde ser realizada com o emprego do programa “ImageMaster 2D
Platinum”. Esse programa possibilita tanto a detecção dos “spots”, como a comparação entre
os géis e a quantificação das alterações nas intensidades dos “spots”, sendo uma ferramenta
eficiente para encontrar proteínas diferencialmente expressas. Utilizando a ferramenta de
auto-detecção de “spots” disponível no programa, foram detectados 592 “spots” no gel de HL-
60.vetor e 532 no gel de HL-60.Bcr-Abl. A grande maioria dos “spots” é bem definida, no
entanto, em alguns casos, os “spots” fazem parte de rastros de proteínas e em muitos casos
todos os “spots” encontrados nos rastros representam a mesma proteína. Na figura 43 estão
apresentados os dois géis lado a lado e seus respectivos “spots”.
125
A
B
pH 4 pH 7 pH 4 pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
42: Proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas utilizando tiras de
gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie. À esquerda dos géis estão
indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A
B
pH 4 pH 7 pH 4 pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
42: Proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas utilizando tiras de
gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie. À esquerda dos géis estão
indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
126
A
B
pH 4 pH 7 pH 4 pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
43: Proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas utilizando tiras de
gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e analisados com o auxílio
do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão todos os “spots” que foram detectados em cada um dos géis. À esquerda dos géis estão indicados os
tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
39 -
65 -
94 -
122 -
A
B
pH 4 pH 7 pH 4 pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
43: Proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas utilizando tiras de
gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e analisados com o auxílio
do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão todos os “spots” que foram detectados em cada um dos géis. À esquerda dos géis estão indicados os
tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
39 -
65 -
94 -
122 -
127
Visto que a expressão de Bcr-Abl ativa diversas vias de sinalização e dentre outras
coisas provoca alterações pós-traducionais em uma série de proteínas (fosforilação, em
tirosina, por exemplo), optamos por extrair a maioria dos “spots” presentes nos dois géis para
serem analisados por espectrometria de massas e identificados. Dessa forma, foram
selecionados para serem retirados dos géis, os “spots” com valor maior que 0,02 % de volume
e aqueles que, embora tivessem uma porcentagem de volume menor do que o valor
mencionado, pareciam interessantes para a investigação por algum motivo, como o fato de
estarem diferencialmente expressos nas duas linhagens. O valor de 0,02% foi definido com
base nos dados dos “spots” que eram considerados de baixa intensidade e de pouca chance de
identificação. A retirada e processamento de 495 “spots” do gel de HL-60.vetor e de 510
“spots” do gel de HL-60.Bcr-Abl, foram realizadas pelo sistema automatizado “Ettan Spot
Handling Workstation”. As proteínas foram digeridas in gel pela enzima tripsina e os produtos
da digestão tríptica foram analisados em um espectrômetro de massas do tipo MALDI-
ToF/Pro. Para a identificação das proteínas foram utilizados os banco de dados do NCBInr e
do SwissProt.
Duas estratégias principais foram aplicadas para descrição das proteínas
diferencialmente expressas: 1) o pareamento dos “spots” comuns às células HL-60.vetor e
HL-60.Bcr-Abl e 2) a análise dos “spots” visualizados somente em uma das linhagens.
A primeira estratégia foi o pareamento dos “spots” que podiam ser observados nas
duas linhagens. Nesse tipo de análise, os “spots” correspondentes, ou seja, presentes nas duas
linhagens, são reunidos em grupos. Utilizando-se os valores de % de volume de cada “spot”
foi analisado quantas vezes um dado “spot” está aumentado ou diminuído em células HL-
60.Bcr-Abl em relação às células HL-60.vetor, propiciando, portanto, a quantificação do valor
de alteração dos “spots”. A outra estratégia foi a identificação dos “spots” encontrados em
somente uma das duas linhagens, que denominamos “exclusivos”. É importante ressaltar que
esse termo se refere tão-somente à presença do “spot” em uma região específica do gel de
cada linhagem, conforme a resolução dos métodos de detecção utilizados. Essa exclusividade
não significa, portanto, a inexistência definitiva do “spot” na outra linhagem, pois existe a
possibilidade de que ele pudesse ser detectado com outros métodos mais sensíveis (ex:
detecção com prata ou reagentes fluorescentes). Da mesma forma, não é possível afirmar que
a proteína representada por um “spot exclusivo” seja de fato expressa em apenas uma das
linhagens, visto que uma mesma proteína pode ser representada por mais de um “spot” e,
como não obtivemos a identificação de todos eles, não podemos excluir a presença de uma
certa proteína em outras áreas dos géis. Portanto, a presença de um “spot exclusivo” pode
128
resultar de dois possíveis efeitos da ação de Bcr-Abl: o aparecimento ou desaparecimento de
uma proteína em uma dada linhagem, ou alterações (ex: fosforilação) que acarretem mudanças
na massa molecular e/ou ponto isoelétrico das proteínas.
A comparação entre os géis de HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl permitiu, por meio do
pareamento dos “spots”, a formação de 267 grupos (Figura 44). Para evitar erros de
pareamento, os rastros e os “spots” localizados em regiões dos géis que estavam muito
diferentes entre as duas linhagens não foram agrupados e nem considerados na análise dos
“exclusivos”, sendo agrupados somente os “spots” bem definidos e cujo pareamento não era
duvidoso.
Os “spots” que foram agrupados puderam ser analisados quanto ao fator de alteração e
para a análise diferencial foram utilizados os valores de volume relativo (% de volume). As
alterações nas intensidades dos “spots” foram consideradas significativas quando o valor de %
de volume de um “spot” foi alterado para valor maior ou igual a 2 vezes entre as amostras.
Dentre os “spots” agrupados, 111 estavam diferencialmente expressos e os demais 156
“spots” não foram alterados pela expressão de Bcr-Abl (Figura 45). Dos 111 “spots”
diferencialmente expressos nas duas linhagens, 64 tiveram sua intensidade aumentada (Figura
46) e 47 (Figura 47) estavam diminuídos nas células HL-60.Bcr-Abl em comparação às
células HL-60.vetor.
129
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
44: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão todos os “spots” que podiam ser observados em ambos os géis e que foram
pareados. No total foram encontrados 267 “spots” comuns às duas linhagens celulares. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de
massa molecular (kDa).
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
44: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão todos os “spots” que podiam ser observados em ambos os géis e que foram
pareados. No total foram encontrados 267 “spots” comuns às duas linhagens celulares. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de
massa molecular (kDa).
130
A
B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
45: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
não alterados. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A
B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
45: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
não alterados. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
131
122 -
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
46: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
aumentados em células HL-60.Bcr-Abl. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
122 -
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
46: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
aumentados em células HL-60.Bcr-Abl. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
46: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
aumentados em células HL-60.Bcr-Abl. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
132
A
B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
47: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
diminuídos em células HL-60.Bcr-Abl. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
A
B
pH 4
pH 7 pH 4
pH 7
39 -
65 -
94 -
122 -
MM
(kDa)
MM
(kDa)
HL-60.vetor
HL-60. Bcr-Abl
39 -
65 -
94 -
122 -
47: Comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Proteínas do lisado total de células HL-60.vetor (A) e HL-60.Bcr-Abl (B) foram separadas
utilizando tiras de gradiente de pH imobilizado na faixa de 4-7 de 13 cm. Após a eletroforese os géis bidimensionais foram corados com azul de Coomassie e
analisados com o auxílio do programa ImageMaster 2D Platinum. Em destaque estão os “spots” que foram agrupados e que na análise diferencial apareceram como
diminuídos em células HL-60.Bcr-Abl. À esquerda dos géis estão indicados os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (kDa).
133
Para ilustrar como as proteínas foram identificadas, o espectro de massas de um dos
“spots” identificados e que tem intensidade aumentada em células HL-60.Bcr-Abl (grupo
3085) está mostrado na Figura 48. A lista de massas obtida foi usada para a identificação da
proteína no banco de dados do SwissProt com a ferramenta Mascot. Parte do relatório da
identificação está relatado nas figuras 49 e 50. A primeira parte (Figura 49) contém a lista dos
parâmetros utilizados na busca e uma relação de proteínas candidatas. No entanto, como pode
ser observado, nessa identificação só uma das proteínas listadas, a peroxiredoxina-2,
apresentava valores de “score” e “expectation” significativos. Na segunda parte do relatório
(Figura 50) são mostrados alguns detalhes da identificação, incluindo os dados específicos da
proteína candidata bem como a sua seqüência de aminoácidos e o quanto dessa seqüência foi
coberta pelos peptídeos utilizados na busca (cobertura ou “coverage”).
FIGURA 48: Espectro de massas utilizado na identificação dos “spots” do grupo 3085.
134
FIGURA 49: Identificação do “spot” 3085 pelo Mascot. O produto da digestão triptica do “spot” 3085 foi
analisado por espectrometria de massas e a lista de valores de m/z obtida foi utilizada para a
identificação da proteína no Mascot. Relatório do Mascot (Parte 1) usando o banco de dados de
proteínas do SwissProt.
135
FIGURA 50: Identificação do “spot” 3085 pelo Mascot. O produto da digestão triptica do “spot” 3085 foi
analisado por espectrometria de massas e a lista de valores de m/z obtida foi utilizada para a
identificação da proteína no Mascot. Relatório do Mascot (Parte 2) usando o banco de dados de
proteínas do SwissProt.
136
4.3.1.1 “SPOTS” COM MAIOR INTENSIDADE EM CÉLULAS HL-60.BCR-ABL
Dos 64 “spots” agrupados que estão aumentados em células HL-60.Bcr-Abl, 25 foram
identificados, representando 24 proteínas distintas (Tabela 1, Figura 51).
Tabela 1 : Proteínas de “spots” aumentados em células HL-60.Bcr-Abl.
Cov: Coverage. Exp.: Expectation. pI (T): ponto isoelétrico teórico. MM (T): massa molecular teórica.
Fator de alteração: quantas vezes está mais expresso em células HL-60.Bcr-Abl do que em HL-60.vetor.
n
o
grupo
Identidade Cov.
(%)
Exp. pI
(T)
MM
(T)
Número de
acesso
Símbolo da
proteína
Fator de
alteração
2997 Heat-shock protein beta-1 33 0.000 6.0 22.8 P04792
HSPB1_HUMAN
11.6
2551 Vimentin 24 0.000 5.1 53.6 P08670
VIME_HUMAN
10.4
3069 Glutathione S-transferase P 30 0.001 5.4 23.3 P09211
GSTP1_HUMAN
6.0
2543 Vimentin 21 0.000 5.1 53.6 P08670
VIME_HUMAN
5.0
3085 Peroxiredoxin-2 44 0.000 5.7 21.9 P32119
PRDX2_HUMAN
4.6
2717 Mannose-6-phosphate receptor-binding
protein 1
28 0.000 5.3 47.0 O60664
M6PBP_HUMAN
4.3
2582 Tubulin alpha-1C chain 34 0.000 5.0 49.9 Q9BQE3
TBA1C_HUMAN
3.2
2367 Zinc finger protein 442 14 0.028 9.0 72.8 Q9H7R0
ZN442_HUMAN
3.0
2990 Chain A. 14-3-3 Protein Epsilon (Human)
Complexed to Peptide
32.5 0.020 4.9 26.9 P62258
1433E_HUMAN
3.0
3561 40S ribosomal protein SA (p40) 22 0.000 4.8 32.8 P08865
RSSA_HUMAN
2.9
2449 Heat shock cognate 71 kDa protein 19 0.000 5.4 70.9 P11142
HSP7C_HUMAN
2.8
2972 nuclear chloride channel 23.7 0.000 5.0 27.3 O00299
CLIC1_HUMAN
2.8
2425 Stress-induced-phosphoprotein 1 16 0.000 6.4 62.6 P31948
STIP1_HUMAN
2.6
2894 Serpin B12 13 0.027 5.4 46.2 Q96P63
SPB12_HUMAN
2.6
3019 Peroxiredoxin-4 13 0.046 5.9 30.5 Q13162
PRDX4_HUMAN
2.6
2826 Protein SET (Phosphatase 2A inhibitor
I2PP2A)
22 0.000 4.2 33.5 Q01105
SET_HUMAN
2.5
2617 PDZ and LIM domain protein 2 14 0.030 9.0 37.4 Q96JY6
PDLI2_HUMAN
2.4
2523 Chain B, Crystal Structure Of Constant
Regulatory Domain Of Human Pp2a.
Pr65alpha
16 0.077 5.0 66.0 P30153
2AAA_HUMAN
2.4
2595 Nucleosome assembly protein 1-like 1 10 0.013 4.4 45.3 P55209
NP1L1_HUMAN
2.4
2505 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K 11 0.008 5.4 50.9 P61978
HNRPK_HUMAN
2.4
2581 RAD23B protein 16.1 0.033 4.8 43.2 P54727
RD23B_HUMAN
2.3
2919 Splicing factor. arginine/serine-rich 7
(Splicing factor 9G8)
26 0.000 11.8 27.4 Q16629
SFRS7_HUMAN
2.3
2625 Tubulin beta chain 25 0.000 4.8 49.6 P07437
TBB5_HUMAN
2.1
2587 Tubulin alpha-1C chain 26 0.000 5.0 49.9 Q9BQE3
TBA1C_HUMAN
2.1
2774 BAG family molecular chaperone regulator 5 13 0.032 5.8 51.2 Q9UL15
BAG5_HUMAN
2.0
137
FIGURA 51: Análise diferencial das proteínas expressas em células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Áreas dos
géis de HL-60.vetor (à esquerda) e HL-60.Bcr-Abl (à direita). Os “spots” encontrados nas duas
linhagens foram agrupados e comparados quanto aos seus valores de % de volume. As setas
mostram alguns dos “spots” cuja expressão está aumentada em células que expressam Bcr-Abl. Ao
lado de cada área, a identificação dos “spots” marcados e o fator de alteração (quantas vezes está
mais expresso em células HL-60.Bcr-Abl do que em células HL-60.vetor).
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
1- Glutathione S-transferase P (6,0 x)
2- Peroxiredoxin-2 (4,6 x)
1
2
1
2
3
3
3- Mannose 6 phosphate receptor binding
protein 1 (4,3 x)
4
4
4- Chain A, 14-3-3 Protein Epsilon (Human)
Complexed to Peptide (3,0 x)
5 -Chloride intracellular channel
protein 1 (2,8 x)
5
5
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
1- Glutathione S-transferase P (6,0 x)
2- Peroxiredoxin-2 (4,6 x)
1- Glutathione S-transferase P (6,0 x)
2- Peroxiredoxin-2 (4,6 x)
1
2
1
2
1
2
1
2
33
33
3- Mannose 6 phosphate receptor binding
protein 1 (4,3 x)
44
44
4- Chain A, 14-3-3 Protein Epsilon (Human)
Complexed to Peptide (3,0 x)
5 -Chloride intracellular channel
protein 1 (2,8 x)
55
55
138
Dos 13 “spots” potencialmente interessantes encontrados somente no gel de HL-
60.Bcr-Abl e que foram selecionados para análise, nove foram identificados (Tabela 2, Figura
52). Alguns dos “spots” visualizados somente em HL-60.Bcr-Abl representam a mesma
proteína de “spots” que estavam aumentados nessa linhagem na análise dos grupos. Dentre
eles a proteína vimentina que em dois “spots” está mais expressa e é também uma proteína de
um “spot” exclusivo de células que expressam Bcr-Abl. Outro exemplo é “Heat shock protein
beta-1”.
Tabela 2: Proteínas de “spots” exclusivos de HL-60.Bcr-Abl.
Cov: Coverage. Exp.: Expectation. pI (T): ponto isoelétrico teórico. MM (T): massa molecular teórica. NI=
“spot” não identificado.
n
o
spot
Identidade Cov. (%) Exp. pI (T) PM (T)
Número de
acesso
Símbolo da
proteína
3692 Vimentin 24 0.000 5.06 53.6 P08670
VIME_HUMAN
3819 NI
4195 Serpin B9 25 0.000 5.61 42.4 P50453
SPB9_HUMAN
4992 Glyoxalase I 36.4 0.004 5.1 21.0 Q04760
LGUL_HUMAN
4083 Keratin, type I cytoskeletal 18 33 0.000 5.34 48.0 P05783
K1C18_HUMAN
3848 Keratin, type II cytoskeletal 8 27 0.000 5.52 53.7 P05787
K2C8_HUMAN
3769 Retinal dehydrogenase 2 11 0.041 5.79 56.7 O94788
AL1A2_HUMAN
4192 NI
4236 NI
4345 Tubulin alpha-1C chain 26 0.000 4.96 49.9 Q9BQE3
TBA1C_HUMAN
4444 Elongation factor 1-delta 16 0.037 4.9 31.1 P29692
EF1D_HUMAN
4665 NI
4819 Heat-shock protein beta-1 36 0.000 5.98 22.8 P04792
HSPB1_HUMAN
139
FIGURA 52: Análise diferencial das proteínas expressas em células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl.
Comparação de áreas dos géis de HL-60.vetor (à esquerda) e HL-60.Bcr-Abl (à direita). As setas
indicam os “spots” que foram observados exclusivamente em células HL-60.Bcr-Abl. Os “spots”
circulados são aqueles que foram agrupados por serem visualizados em ambos os géis. Ao lado de
cada área, a identificação dos “spots” indicados com as setas e entre parênteses o número do
“spot”. NI= “spot” não identificado.
5 - Retinal dehydrogenase 2 (3769)
6 - Keratin, type II cytoskeletal 8 (3848)
7 - Keratin, type I cytoskeletal 18 (4083)
8 - NI (4192)
5
6
7
8
9
10
9 - Tubulin alpha-1C chain (4345)
10 - Elongation factor 1-delta (4444)
1
2
11
1 - Vimentin (3692)
2 - NI (3819)
3 - Serpin B9 (4195)
4 - NI (4236)
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
11 - Glyoxalase I (4992)
3
4
13
12
12 - NI (4665)
13 - Heat-shock protein beta-1 (4819)
5 - Retinal dehydrogenase 2 (3769)
6 - Keratin, type II cytoskeletal 8 (3848)
7 - Keratin, type I cytoskeletal 18 (4083)
8 - NI (4192)
5
6
7
8
5
6
7
8
9
10
9
10
9 - Tubulin alpha-1C chain (4345)
10 - Elongation factor 1-delta (4444)
1
2
1
2
1111
1 - Vimentin (3692)
2 - NI (3819)
3 - Serpin B9 (4195)
4 - NI (4236)
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
11 - Glyoxalase I (4992)
3
4
3
4
13
12
13
12
12 - NI (4665)
13 - Heat-shock protein beta-1 (4819)
140
As proteínas moduladas positivamente por Bcr-Abl estão relacionadas a diversos
processos celulares e podem ser agrupadas conforme as suas funções em:
• Proteínas estruturais e moléculas relacionadas à adesão e mobilidade celular: vimentina
(2 “spots”), alfa-tubulina (2 “spots”), beta-tubulina, “PDZ and LIM domain protein 2”,
citoqueratina 8 e citoqueratina 18.
• Crescimento e Proliferação celular: “Nucleosome assembly protein 1-like 1”.
• Processamento de RNA e controle da transcrição e tradução: “Zinc finger protein 442”,
“40S ribosomal protein SA”, SET, Ribonucleoproteína nuclear heterogênea K, “Splicing
factor, arginine/serine-rich 7” e “Elongation factor 1-delta”.
• Metabolismo: “Glutathione S-transferase P”, Glioxalase I e desidrogenase retinal 2.
• Transdução de sinais: 14-3-3 épsilon, “40S ribosomal protein SA”, Serpina B9, Serpina
B12 e SET.
• Chaperonas e moléculas envolvidas na resposta a estresse: Proteína de choque térmico
beta-1, “Glutathione S-transferase P”, Peroxiredoxina-2, “Heat shock cognate 71 kDa
protein”, Fosfoproteína 1 induzida por estresse, Peroxiredoxina-4, homólogo B de
RAD23 e “BAG family molecular chaperone regulator 5”.
• Reparo de DNA: homólogo B de RAD23.
• Transporte: “Mannose-6-phosphate receptor-binding protein 1” e Proteína de canal de
cloreto intracelular 1.
141
4.3.1.2 “SPOTS” REGULADOS NEGATIVAMENTE EM CÉLULAS HL-60.BCR-ABL
Quanto às proteínas que foram reguladas negativamente pela expressão de Bcr-Abl,
dos 47 “spots” agrupados, foram identificados 23 “spots” representando 19 proteínas distintas
(Tabela 3, Figura 53).
Tabela 3: Proteínas de “spots” regulados negativamente em células HL-60.Bcr-Abl.
Cov: Coverage. Exp.: Expectation. pI (T): ponto isoelétrico teórico. MM (T): massa molecular teórica.
Fator de alteração: quantas vezes está menos expresso nas células HL-60.Bcr-Abl do que em HL-60.vetor.
n
o
grupo
Identidade Cov. (%) Exp. pI (T) PM (T)
Número de
acesso
Símbolo da
proteína
Fator de
alteração
2461 Plastin-2 25 0.000 5.2 70.2 P13796
PLSL_HUMAN
18.4
2424 Heat shock cognate 71 kDa protein 19 0.000 5.37 70.9 P11142
HSP7C_HUMAN
7.5
2565 Protein disulfide-isomerase precursor 20 0.000 4.76 57.1 P07237
PDIA1_HUMAN
5.0
2948 Purine nucleoside phosphorylase 24.9 0.000 7.1 32.4 P00491
PNPH_HUMAN
4.5
2784 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)/ Actin,
cytoplasmic 2 (Gamma-actin)
30 0.000 5.29/
5.31
41.7/
41.8
P60709/
P63261
ACTB_HUMAN/
ACTG_HUMAN
4.3
2585 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)/ Actin,
cytoplasmic 2 (Gamma-actin)
20 0.000 5.29/
5.31
41.7/
41.8
P60709/
P63261
ACTB_HUMAN/
ACTG_HUMAN
4.1
2861 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH)
18 0.014 8.57 36.0 P04406
G3P_HUMAN
3.9
2654 Actin-like protein 3 (Actin-related protein 3) 14 0.031 5.61 47.3 P61158
ARP3_HUMAN
3.9
2750 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)/ Actin,
cytoplasmic 2 (Gamma-actin)
20 0.000 5.29/
5.31
41.7/
41.8
P60709/
P63261
ACTB_HUMAN/
ACTG_HUMAN
3.6
2407 Annexin A6 23 0.000 5.42 75.8 P08133
ANXA6_HUMAN
3.6
2635 RuvB-like 2 22 0.000 5.49 51.1 Q9Y230
RUVB2_HUMAN
3.4
2553 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)/ Actin,
cytoplasmic 2 (Gamma-actin)
10 0.030 5.29/
5.31
41.7/
41.8
P60709/
P63261
ACTB_HUMAN/
ACTG_HUMAN
2.9
2536 PRAME family member 14 14 0.048 8.7 49.4 Q5SWL7
PRA14_HUMAN
2.7
2460 Lamin-B2 13 0.006 5.29 67.6 Q03252
LMNB2_HUMAN
2.6
2816 Serine/threonine protein kinase MASK 20. 0 0.068 5.1 46.8 Q9P289
MST4_HUMAN
2.4
2978 Proteasome activator complex subunit 1 22 0.002 5.78 28.7 Q06323
PSME1_HUMAN
2.4
2690 26S protease regulatory subunit 6B 35 0.000 5.09 47.3 P43686
PRS6B_HUMAN
2.3
2724 Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)/ Actin,
cytoplasmic 2 (Gamma-actin)
20 0.000 5.29/
5.31
41.7/
41.8
P60709/
P63261
ACTB_HUMAN/
ACTG_HUMAN
2.3
3071 TCTP 37.2 0.002 5 19.7 P13693
TCTP_HUMAN
2.3
2584 Protein disulfide-isomerase precursor 31 0.000 4.76 57.1 P07237
PDIA1_HUMAN
2.2
2534 T-complex protein 1 subunit theta 22 0.000 5.42 59.6 P50990
TCPQ_HUMAN
2.1
3026
Rho GDP-dissociation inhibitor 1 (Rho GDI 1)
25 0.019 5.02 23.2 P52565
GDIR_HUMAN
2.0
2507 Lactase-like protein precursor 10 0.042 8.17 65.0 Q6UWM7
LCTL_HUMAN
2.0
142
FIGURA 53: Análise diferencial das proteínas expressas em células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. Áreas dos
géis de HL-60.vetor (à esquerda) e HL-60.Bcr-Abl (à direita). Os “spots” encontrados nas duas
linhagens foram agrupados e comparados quanto à sua intensidade. As setas mostram alguns dos
“spots” cuja expressão está diminuída em células que expressam Bcr-Abl. Ao lado de cada área, a
identificação dos “spots” marcados e o fator de alteração (quantas vezes está menos expresso em
células HL-60.Bcr-Abl do que em células HL-60.vetor).
HL-60.vetor HL-60. Bcr-Abl
1
1- Plastin-2 (18,4 x)
1
2
2
2- Protein disulfide-isomerase
precursor (5,0 x)
3
3
3- RuvB-like 2 (48 kDa TATA box-
binding protein-interacting protein)
(3,4 x)
4
4
4- Rho GDP-dissociation inhibitor 1
(2,0 x)
HL-60.vetor HL-60. Bcr-Abl
11
1- Plastin-2 (18,4 x)
11
22
2
2- Protein disulfide-isomerase
precursor (5,0 x)
33
33
3- RuvB-like 2 (48 kDa TATA box-
binding protein-interacting protein)
(3,4 x)
44
44
4- Rho GDP-dissociation inhibitor 1
(2,0 x)
143
Dos oito “spots” potencialmente interessantes encontrados somente em HL-60 e que
foram selecionados para análise, cinco foram identificados (Tabela 4, Figura 54). Alguns
desses “spots” representam a mesma proteína que estava diminuída no gel das células HL-
60.vetor na análise dos grupos, como a proteína Plastina-2.
Tabela 4: Proteínas de “spots” exclusivos de HL-60.vetor.
Cov: Coverage. Exp.: Expectation. pI (T): ponto isoelétrico teórico. MM (T): massa molecular teórica.
NI= “spot” não identificado. NA= “spot” não analisado.
n
o
spot
Identidade Cov. (%) Exp. pI (T) PM (T)
Número de
acesso
Símbolo da
proteína
2781 Plastin-2 19 0.000 5.2 70.2 P13796
PLSL_HUMAN
3141 NI
3133 NSFL1 cofactor p47 29 0.000 5.0 40.5 Q9UNZ2
NSF1C_HUMAN
2778 NA
2777 NI
3637 Rho GDP-dissociation inhibitor 2 11 0.058 5.1 23.0 P52566
GDIS_HUMAN
3565 Prohibitin 55 0.000 5.6 29.8 P35232
PHB_HUMAN
2928 T-complex protein 1 subunit beta 32 0.000 6.0 57.5 P78371
TCPB_HUMAN
144
FIGURA 54: Análise diferencial das proteínas expressas em células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl.
Comparação de áreas dos géis de HL-60.vetor (à esquerda) e HL-60.Bcr-Abl (à direita). As setas
indicam os “spots” que foram observados exclusivamente em células HL-60.vetor. Os “spots”
circulados são aqueles que foram agrupados por serem visualizados em ambos os géis. Ao lado de
cada área a identificação dos “spots” indicados com as setas e entre parênteses o número do spot.
NI= “spot” não identificado. NA= “spot” não analisado.
1
1 - Plastin-2 (2781)
2
3
2 - NSFL1 cofactor p47 (3133)
3 - NI (3141)
4 - NA (2778)
5 - NI (2777)
4
5
6 - Prohibitin (3565)
8
8 – Rho GDP-dissociation inhibitor 2 (3637)
7
7 – T-complex protein 1 subunit beta (2928)
6
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
11
1 - Plastin-2 (2781)
2
3
2
3
2 - NSFL1 cofactor p47 (3133)
3 - NI (3141)
4 - NA (2778)
5 - NI (2777)
4
5
4
5
6 - Prohibitin (3565)
88
8 – Rho GDP-dissociation inhibitor 2 (3637)
77
7 – T-complex protein 1 subunit beta (2928)
66
HL-60.vetor
HL-60.Bcr-Abl
145
As proteínas reguladas negativamente por Bcr-Abl estão principalmente associadas às
seguintes funções:
• Proteínas estruturais e moléculas relacionadas à adesão e mobilidade celular: Actina,
“Actin-related protein 3”, Lamina-B2, plastina-2, “Rho GDP-dissociation inhibitor 1” e
“Rho GDP-dissociation inhibitor 2”.
• Crescimento e proliferação celular: “RuvB-like 2”, “Serine/threonine-protein kinase
MST4” e “Prohibitin”.
• Processamento de RNA, controle da transcrição e tradução e “folding” de proteínas:
“Protein disulfide-isomerase precursor”, “Purine nucleoside phosphorylase”, “RuvB-like
2”, “T-complex protein 1 subunit theta”, “T-complex protein 1 subunit beta” e
“Prohibitin”.
• Metabolismo: “Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase”.
• Transdução de sinal: Anexina A6 e “Rho GDP-dissociation inhibitor 1”.
• Regulação da apoptose: “Serine/threonine-protein kinase MST4”, “Translationally-
controlled tumor protein (TCTP)” e “Rho GDP-dissociation inhibitor 1”.
• Degradação de proteínas: “26S protease regulatory subunit 6B”.
• Resposta imune: “Proteasome activator complex subunit 1”.
• Resposta a estresse: “Heat shock cognate 71 kDa protein”.
DISCUSSÃO
147
5 DISCUSSÃO
5.1 CONTRIBUIÇÃO DA SINALIZAÇÃO INDEPENDENTE DA ATIVIDADE TIROSINA-QUINASE DE
BCR-ABL PARA A RESISTÊNCIA À APOPTOSE
O equilíbrio entre os sinais gerados por proteínas quinases e fosfatases é essencial para
o controle apropriado da sobrevivência, proliferação e diferenciação celular (Hunter, 1995).
A relevância desse balanço de atividades enzimáticas pode ser exemplificada pelo fato de que
sua alteração está associada à fisiopatologia de algumas leucemias humanas. Nessas doenças
observa-se freqüentemente translocações cromossômicas cujo produto gênico codifica
proteínas tirosina-quinases constitutivamente ativadas. Nesse contexto, a Leucemia Mielóide
Crônica (LMC) é o protótipo das neoplasias desencadeadas por quinases oncogênicas, na qual
a translocação cromossômica resulta na produção da oncoproteína quimérica Bcr-Abl que
possui elevada atividade tirosina-quinase. (Perrotti e Neviani, 2006).
O potencial oncogênico de Bcr-Abl e seu papel na patogênese das leucemias
cromossomo Ph
+
são incontestáveis. Em células hematopoéticas, a expressão de Bcr-Abl
induz resistência à apoptose, independência de fatores de crescimento, alterações nas
interações célula-célula e célula-matriz e leucemogênese, sendo, portanto, importante para a
transformação maligna celular (Verfaillie et al., 1992; Sirard et al., 1994; Skorski et al., 1998).
Além disso, cada vez mais há evidências indicando que a expressão de Bcr-Abl está envolvida
na progressão da LMC da fase crônica para a crise blástica.
A habilidade de Bcr-Abl em induzir e sustentar o fenótipo leucêmico parece depender
diretamente de sua atividade tirosina-quinase constitutiva e de sua localização citoplasmática.
A proteína Bcr-Abl recruta e aciona múltiplas vias de sinalização que transmitem os sinais
oncogênicos, promovendo proliferação celular independente de fatores de crescimento,
resistência à apoptose, aumento da sobrevivência e alteração da diferenciação dos precursores
mielóides (Bedi et al., 1994; Mcgahon et al., 1994; Perrotti e Neviani, 2006).
A proteína c-Abl pode ser encontrada no núcleo e no citoplasma. Isso porque essa
proteína possui seqüências de localização nuclear (NLS) e uma seqüência de exportação
nuclear (NES), que medeiam o seu trânsito entre esses compartimentos celulares. c-Abl
nuclear pode ser ativada por meio de certas lesões no DNA e, juntamente com p73 ativado,
está envolvida no desencadeamento da apoptose por dano ao DNA (Wang, 2000). Embora
Bcr-Abl conserve em sua estrutura os três sinais de localização nuclear de Abl e o sinal de
exportação, essa oncoproteína está localizada exclusivamente no citoplasma e é uma potente
molécula anti-apoptótica. A retenção citoplasmática de Bcr-Abl parece estar associada à
148
ausência de sua importação para o núcleo e depende, pelo menos em parte, de sua atividade
tirosina-quinase, uma vez que o tratamento de células transformadas por Bcr-Abl com o
mesilato de imatinibe, restaura parcialmente a importação de Bcr-Abl para o núcleo.
Utilizando o agente leptomicina B, que inibe a exportação nuclear via Crm1/exportina-1,
Vigneri e Wang demonstraram que o aprisionamento de Bcr-Abl no núcleo, seguido da re-
ativação de sua atividade tirosina-quinase pela remoção do mesilato de imatinibe da cultura,
promove a morte celular. Esse resultado mostra a importância da localização citoplasmática e
da atividade tirosina-quinase constitutivamente elevada de Bcr-Abl para seus efeitos
oncogênicos e demonstra que os efeitos antagônicos de Bcr-Abl e Abl sobre a apoptose, estão
fortemente associados às diferenças na atividade enzimática e na localização dessas proteínas
no interior da célula (Vigneri e Wang, 2001).
A transformação do fenótipo celular, de normal para maligno, mediada por Bcr-Abl se
dá por meio da ativação de diversas vias de sinalização, incluindo as vias Ras, PI3-k/Akt,
STATs e NFκB. Diversas abordagens experimentais já foram utilizadas para descrever os
alvos de fosforilação diretos ou indiretos de Bcr-Abl. Algumas das moléculas identificadas
como alvos de Bcr-Abl são: Grb2, Shc, Sos, Ras, Raf-1, Cbl, Crkl, Akt, STAT5 e Fak
(Deininger et al., 2000; Jagani et al., 2007)
Uma das provas irrefutáveis da relevância de Bcr-Abl na fisiopatologia da LMC é a
capacidade do inibidor de tirosina-quinase Abl, mesilato de imatinibe, de induzir apoptose
seletivamente em células transformadas por Bcr-Abl e promover remissão molecular e
citogenética em pacientes na fase crônica da doença (Jagani et al., 2007). Embora o mesilato
de imatinibe seja eficaz no tratamento de pacientes com LMC, uma porcentagem significativa
dos pacientes desenvolve resistência ao inibidor e/ou ainda progride para a crise blástica. Os
mecanismos envolvidos na resistência variam, estando freqüentemente associados a mutações
no domínio quinase de Bcr-Abl ou à superexpressão dessa oncoproteína. Por razões
desconhecidas o mesilato de imatinibe não é tão eficiente no tratamento de pacientes com
LMC na crise blástica e B-ALL Ph
+
, o que não parece estar associado a mutações no domínio
quinase, sugerindo que talvez, para essas doenças, a inativação somente de Bcr-Abl não seja
suficiente para controlar a patologia (Li e Li, 2007). Além disso, alguns trabalhos sugerem
que as células tronco leucêmicas na LMC são resistentes ao tratamento com mesilato de
imatinibe, o que explicaria a persistência da doença (Copland et al., 2006).
O grande potencial anti-apoptótico de Bcr-Abl limita também a eficácia do uso de
drogas quimioterapêuticas para o tratamento de LMC (Bedi et al., 1995). Sendo assim, a
compreensão das vias de sinalização utilizadas por Bcr-Abl para inibir a apoptose é
149
fundamental para a obtenção de novas estratégias terapêuticas para pacientes resistentes ao
mesilato de imatinibe.
Apesar da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl ser essencial para a indução do
fenótipo leucêmico, surgem cada vez mais dados que confirmam ou sugerem propriedades da
molécula Bcr-Abl que não estão relacionadas diretamente à sua atividade enzimática. As
primeiras evidências de que Abl tem funções independentes de sua atividade tirosina-quinase,
vieram de estudos em Drosófila (Henkemeyer et al., 1990). Zhelev e colaboradores mostraram
em um estudo de microarray que a supressão da síntese de bcr-abl por siRNAs ou a inibição
da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl pelo mesilato de imatinibe, alteram de modo
diferente a expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose e na proliferação e
crescimento celular, sugerindo que nem todos os sinais enviados por Bcr-Abl dependem de
sua atividade enzimática (Zhelev et al., 2004). Wertheim e colaboradores mostraram que os
defeitos de adesão de células que expressam Bcr-Abl, como o aumento da ligação à
fibronectina, são independentes da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl. Além disso, esses
autores sugerem que a localização de Bcr-Abl nos filamentos de actina também ocorre por
meio de mecanismos independentes da sua atividade quinase (Wertheim et al., 2002).
Embora muitos trabalhos tenham sido publicados sobre as vias de sinalização ativadas
por Bcr-Abl, os mecanismos moleculares envolvidos na transformação celular e, em especial,
na resistência à apoptose mediada por essa oncoproteína ainda não estão completamente
esclarecidos. Com o intuito de avaliar a importância da atividade tirosina-quinase para a
resistência à apoptose induzida por Bcr-Abl, foram adotadas, neste trabalho, duas estratégias
experimentais: a inibição farmacológica da sua atividade enzimática e o estudo dos efeitos da
expressão da forma mutante quinase-deficiente de Bcr-Abl.
Para os estudos envolvendo o inibidor mesilato de imatinibe, utilizamos células HL-
60.vetor, HL-60.Bcr-Abl (OW e JW) e as linhagens derivadas de pacientes com LMC na crise
blástica: K562, KCL22 e LAMA-84. Por serem de origem mielóide e negativas para o
cromossomo Ph e para Bcr-Abl, células HL-60 são muito utilizadas como controle nos
estudos comparativos entre células positivas para Bcr-Abl e células que não expressam essa
oncoproteína. A comparação de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl foi a ferramenta
empregada na análise dos efeitos de Bcr-Abl e de sua inibição pelo mesilato de imatinibe. Isso
porque, por apresentarem o mesmo “background” genético, diferenças fenotípicas observadas
entre essas duas linhagens estão possivelmente associadas à expressão de Bcr-Abl. Além
disso, para analisar a relevância clínica dos dados obtidos com a expressão ectópica de Bcr-
Abl, foram incluídas nesse estudo algumas linhagens derivadas de pacientes com LMC que,
portanto, possuem o cromossomo Ph e expressam Bcr-Abl de maneira endógena. Uma
150
particularidade de células HL-60, que as torna especialmente interessante para o estudo das
propriedades anti-apoptóticas de Bcr-Abl, é que elas são muito sensíveis a uma grande
variedade de estímulos pró-apoptóticos, mas se tornam extremamente resistentes à indução de
morte, quando expressam Bcr-Abl ectópicamente (Amarante-Mendes et al., 1997; Amarante-
Mendes et al., 1998b; Brumatti et al., 2003; Bueno-Da-Silva et al., 2003).
Nos ensaios de resistência à morte confirmamos que a expressão de Bcr-Abl, tanto
ectópica como endógena, confere alta resistência à indução de apoptose pela Via Intrínseca.
Essa resistência foi observada frente a drogas que possuem mecanismos de ação distintos, tais
como: inibidores de DNA polimerase, inibidores de topoisomerase II, inibidores de proteína
quinase e inibidores de transcrição e tradução. Além de bloquear a indução de apoptose pela
Via Intrínseca, Bcr-Abl também promove resistência a estímulos iniciados pela Via
Extrínseca, uma vez que células que expressam essa tirosina-quinase são mais resistentes à
indução de morte por Fas e TRAIL (Fang et al., 2000; Brumatti et al., 2003).
Utilizando o modelo de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, além da linhagem
K562, Amarante-Mendes e colaboradores mostraram que a expressão de Bcr-Abl é capaz de
bloquear a liberação de citocromo-c das mitocôndrias para o citosol, prevenindo, assim, a
ativação de caspases executoras e a indução de morte em células tratadas com drogas
quimioterápicas (Amarante-Mendes et al., 1998b). Além de bloquear a liberação de citocromo
c, Bcr-Abl inibe também a saída de Smac/Diablo da mitocôndria para o citosol (Yon, M,
dados não publicados). O mecanismo pelo qual Bcr-Abl previne a saída dos fatores
apoptogênicos da mitocôndria envolve a regulação dos membros da família Bcl-2.
Embora grande parte do potencial anti-apoptótico de Bcr-Abl possa ser atribuída à sua
capacidade de regular a expressão e função de proteínas que coordenam os eventos
mitocondriais desencadeados durante a apoptose, o bloqueio da morte por essa oncoproteína
não parece ocorrer somente nessa organela. Uma evidência disso é que Bcr-Abl é capaz de
prevenir também a indução de morte pela injeção direta de citocromo c no citoplasma. Esse
efeito protetor pós-mitocondrial parece ocorrer no nível do apoptosomo executor, formado por
pró-caspase-9, Apaf-1, citocromo-c e dATP, por meio de mecanismos pós-traducionais que
inibem o recrutamento da pró-caspase-9 pelo Apaf-1 e impedem a formação desse
apoptosomo. Apesar de Akt e Erk serem alvos de Bcr-Abl e poderem fosforilar caspase-9 e
inibir sua atividade enzimática, não foi observada a fosforilação de caspase-9 nesse modelo.
Como a expressão de Bcr-Abl também não afetou os níveis de expressão de Apaf-1 e caspase-
9, uma das hipóteses levantadas pelos autores para explicar como Bcr-Abl interfere e bloqueia
o recrutamento de caspase-9 por Apaf-1, foi a fosforilação de Apaf-1 na presença de Bcr-Abl
151
(Deming et al., 2004). O possível efeito protetor extra-mitocondrial de Bcr-Abl é também
evidenciado quando analisamos os resultados obtidos por Brumatti e colaboradores, em nosso
laboratório, que mostram que, comparado às moléculas anti-apoptóticas Bcl-x
L
e Bcl-2, Bcr-
Abl é um inibidor mais potente da morte celular, sugerindo que seu modo de ação pode não
estar restrito apenas ao controle dos eventos mitocondriais (Brumatti et al., 2003).
Confirmado o fenótipo de resistência à apoptose conferido por Bcr-Abl, os efeitos do
mesilato de imatinibe sobre a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl foram investigados. Nos
ensaios de western-blot, observamos que células que expressam Bcr-Abl apresentam grande
quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina, contrastando com células HL-60.vetor, que
são escassas nesse tipo de fosfoproteína. Nas células que expressam Bcr-Abl, o tratamento
com o mesilato de imatinibe por 18-24 horas reduziu drasticamente a quantidade de substratos
fosforilados em tirosina e tal inibição foi dependente da dose do inibidor utilizada. Nessa
curva de dose-resposta a menor dose do inibidor utilizada foi a de 0,4 µM que reduziu os
substratos fosforilados em tirosina em mais de 50%. Esses dados estão de acordo com os
primeiros estudos com mesilato de imatinibe da literatura, nos quais foi demonstrado que,
para diversas linhagens celulares derivadas de LMC, incluindo K562, a concentração dessa
droga necessária para a inibição de 50% (IC50) da autofosforilação de Bcr-Abl é de 0,25-0,35
µM (Carroll et al., 1997) e que a inibição completa da autofosforilação de Bcr-Abl é atingida
com 1 a 10 µM (Le Coutre et al., 1999). Nos nossos experimentos, verificamos que com a
dose de 10 µM do inibidor de tirosina-quinase, a fosforilação de proteínas em resíduos de
tirosina fica impedida e as células HL-60.Bcr-Abl passam a apresentar um perfil de marcação
com anticorpo anti-fosfotirosina semelhante ao das células HL-60.vetor. O efeito dessa droga
sobre a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é rápido, ocorre após 5 minutos de tratamento, e
duradouro, uma vez que seu efeito inibitório perdura por pelo menos 24 horas, mostrando a
grande estabilidade da ligação do mesilato de imatinibe com sua molécula alvo, o Bcr-Abl.
Apesar dos efeitos inibitórios do mesilato de imatinibe sobre a atividade tirosina-quinase de
Bcr-Abl, a expressão de c-Abl e Bcr-Abl, como esperado e relatado na literatura, permanece
inalterada (Fang et al., 2000).
A exposição ao mesilato de imatinibe por um tempo maior do que 24 horas induz
morte em células que expressam Bcr-Abl, inclusive nas HL-60.Bcr-Abl, mas não afeta a
viabilidade de células HL-60.vetor. Apesar dos efeitos tóxicos do mesilato de imatinibe ao
longo do tempo, células que expressam Bcr-Abl mantêm a viabilidade celular quando tratadas
com esse inibidor por um período curto (18-24 horas). Beran e colaboradores mostraram que,
para a indução de apoptose nas células que expressam Bcr-Abl, é necessária a incubação com
152
mesilato de imatinibe por um período superior a 24 horas e que a remoção da droga antes
deste tempo, resulta na recuperação do crescimento celular (Beran et al., 1998).
Para investigar se a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é crucial para seus efeitos
anti-apoptóticos, analisamos se células que expressam Bcr-Abl são capazes de manter a
resistência à apoptose quando a atividade enzimática de Bcr-Abl está bloqueada. Para isso,
células HL-60.vetor, HL-60.Bcr-Abl, K562, KCL22 e LAMA-84 foram tratadas
simultaneamente com o inibidor mesilato de imatinibe e drogas pró-apoptóticas por um
período de 20-24 horas e analisadas quanto à porcentagem de morte por citometria de fluxo. A
escolha do período de incubação foi baseada nos seguintes fatos: nesse tempo de tratamento o
mesilato de imatinibe é capaz de inibir a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, mas sem
afetar a viabilidade celular, e as células Bcr-Abl não morrem quando tratadas somente com os
indutores de morte. Nossos resultados mostram que, apesar do mesilato de imatinibe bloquear
a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl e o conseqüente aparecimento de proteínas
fosforiladas em tirosina, as células que expressam essa oncoproteína continuam extremamente
resistentes aos agentes apoptogênicos utilizados. Para complementar os resultados obtidos
com a utilização da porcentagem de núcleos hipodiplóides como medida da porcentagem de
células apoptóticas, foram também analisados alguns dos eventos moleculares característicos
da ativação da via apoptótica, tais como a ativação de caspase-3 e a clivagem de PARP e
fodrina. Nessa análise, observamos que Bcr-Abl, mesmo quando inibido, previne a ativação
de caspase-3 e a clivagem dos substratos PARP e fodrina. O fenômeno da manutenção da
resistência à apoptose durante a inibição da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl foi
observada tanto na presença do inibidor específico de Abl, mesilato de imatinibe, quanto na
presença de herbimicina A e genisteína, que são considerados pan-inibidores de tirosina-
quinases (Bueno-Da-Silva et al., 2003).
Embora os mecanismos envolvidos na resistência à apoptose mediada por Bcr-Abl não
estejam esclarecidos, diversos trabalhos mostraram que essa tirosina-quinase é capaz de
regular a expressão de proteínas envolvidas no controle da apoptose, tanto no nível
transcricional quanto nos níveis traducional e pós-traducional. Amarante-Mendes e
colaboradores demonstraram que a expressão de Bcr-Abl nas células HL-60 conduz ao
aumento da expressão de Bcl-x
L
e à diminuição da expressão de Bcl-2. Além disso, esses
autores mostraram, com o uso de oligonucleotídeos anti-senso para bcl-x
L
, que esse aumento
na expressão da molécula anti-apoptótica Bcl-x
L
colabora somente em parte para o fenótipo
de resistência à morte observado em células positivas para Bcr-Abl (Amarante-Mendes et al.,
1998a).
153
Sendo assim, na tentativa de explicar a manutenção da resistência à apoptose de
células que expressam Bcr-Abl tratadas com mesilado de imatinibe, analisamos o efeito da
inibição da atividade enzimática de Bcr-Abl sobre a expressão de diversas moléculas que
participam na regulação da apoptose ou que já foram descritas como alvos dessa
oncoproteína.
De maneira geral e de acordo com a literatura, nossos resultados mostram que a
expressão de Bcr-Abl, ectópica ou endógena, está associada a altos níveis de Bcl-x
L
e a
quantidades extremamente baixas ou não detectáveis de Bcl-2. O efeito de Bcr-Abl sobre a
expressão dessas duas moléculas anti-apoptóticas fica evidente quando células HL-60.vetor,
que apresentam altos níveis de Bcl-2 e baixos de Bcl-x
L
, são comparadas às células HL-
60.Bcr-Abl que, como já mencionado, expressam grandes quantidades de Bcl-x
L
, mas não
expressam Bcl-2 em níveis detectáveis. Curiosamente, a superexpressão de Bcl-x
L
em células
HL-60 também provoca uma diminuição nos níveis de Bcl-2 (Brumatti et al., 2003),
sugerindo que mecanismos compensatórios atuam na regulação da expressão de moléculas
anti-apoptóticas. Embora em nosso modelo de estudo Bcl-2 não pareça relevante para os
efeitos anti-apoptóticos de Bcr-Abl, alguns trabalhos sugerem a sua participação na
transformação maligna mediada por essa tirosina-quinase (Cirinna et al., 2000).
Em nosso estudo, o tratamento com mesilato de imatinibe reduziu a expressão de Bcl-
x
L
e não alterou a expressão de Bcl-2. Contrastando com as demais linhagens positivas para
Bcr-Abl, células KCL22 expressam altas quantidades de Bcl-2, a qual não é alterada pela
exposição dessa linhagem celular ao mesilato de imatinibe, sugerindo que o alto nível de
expressão de Bcl-2 não está associado aos efeitos de Bcr-Abl nesta linhagem.
Resultados obtidos em nosso laboratório mostram que o tratamento de células HL-
60.Bcr-Abl com mesilato de imatinibe por 15 minutos, reduz drasticamente a transcrição de
bcl-x
L
, que atinge um nível de expressão semelhante ao observado em HL-60 (Ulbrich, A,
dados não publicados). Esses resultados sugerem que a diminuição na quantidade de proteína
Bcl-x
L
observada após o tratamento com mesilato de imatinibe, está associada à inibição de
sua transcrição.
O aumento na expressão de Bcl-x
L
induzido por Bcr-Abl já foi observado em outras
linhagens celulares, como K562 (Benito et al., 1996), e está associado a ativação de STAT5
por Bcr-Abl (Gesbert e Griffin, 2000; Horita et al., 2000). Em células transformadas pelo Bcr-
Abl, o fator de transcrição STAT5 está constitutivamente fosforilado e ativo (Carlesso et al.,
1996). A expressão de Bcl-x
L
é induzida pela ativação de fatores de transcrição da família dos
STATS, principalmente de STAT1, STAT3 e STAT5, que se ligam diretamente a uma
seqüência consenso presente no promotor de bcl-x
L
. Apesar dessas diferentes STATs estarem
154
associadas a transcrição de Bcl-x
L
, o tratamento com mesilato de imatinibe bloqueia
particularmente a fosforilação de STAT5, mas não de STAT1 e STAT3, as quais permanecem
fosforiladas na presença do inibidor de Bcr-Abl (Horita et al., 2000). Esse resultado indica
que, embora STAT1 e STAT3 estejam fosforiladas em células Bcr-Abl-positivas, o aumento
de expressão de Bcl-x
L
nessas células, não está ligado diretamente à ação dessas STATs, mas
sim de STAT5. Os mesmos autores relataram ainda que a inibição da atividade tirosina-
quinase de Bcr-Abl em linhagens celulares que expressam Bcr-Abl e em células CD34
+
derivadas de pacientes na fase crônica ou crise blástica da LMC, induz apoptose por suprimir
a capacidade de STAT5 de interagir com o promotor de bcl-x
L
. Consistente com esses dados,
também foi observada que a expressão de um mutante dominante negativo de STAT5 em
células K562, promove a redução dos níveis intracelulares de Bcl-x
L
e induz apoptose,
confirmando a importância de STAT5 na modulação dessa molécula anti-apoptótica por Bcr-
Abl (Horita et al., 2000). A ativação constitutiva de STAT5 sozinha já é suficiente para
induzir em células BaF3, o crescimento e sobrevivência independentes de IL-3, embora em
uma extensão menor do que Bcr-Abl (Gesbert e Griffin, 2000). Utilizando o sistema
condicional, Gesbert e Griffin mostraram que a expressão de Bcr-Abl induz aumento da
expressão de Bcl-x
L
, mas não altera Bcl-2. Com a forma mutante, ativa de STAT5 só houve
indução de Bcl-x
L
na presença de IL-3, indicando que, embora STAT5 contribua para a
indução de Bcl-x
L
, uma segunda via ativada pelo receptor de IL-3 ou por Bcr-Abl é necessária
para o aumento de Bcl-x
L
. A indução de Bcl-x
L
parece envolver a ação conjunta de sinais
fornecidos pelas vias de PI3-k e STAT5 que sinergizam para aumentar a expressão de Bcl-x
L
,
possivelmente diminuindo a degradação protéica e aumentando a transcrição ou via outros
mecanismos (Gesbert e Griffin, 2000). A importância de STAT5 para as células leucêmicas
foi também observada em um estudo no qual a inibição de STAT5 por oligonucleotideos
antisenso, inibiu o crescimento celular e induziu apoptose em blastos derivados de pacientes
com LMC (Baskiewicz-Masiuk e Machalinski, 2004).
O padrão de aumento de expressão de Bcl-x
L
e diminuição de Bcl-2 também foi
observado em células mononucleres de pacientes com LMC. Resultados obtidos em nosso
laboratório por Castro e colaboradores (dados não publicados), utilizando pacientes nas três
fases da doença (crônica, acelerada e blástica), mostram que há um aumento na expressão de
bcl-x
L
e diminuição de bcl-2 de acordo com a progressão da doença para fases mais
avançadas. Nesse mesmo estudo foi observado que pacientes em remissão após mesilato de
imatinibe, apresentam um padrão de expressão dessas moléculas semelhante ao de pessoas
saudáveis, ou seja, uma alta expressão de bcl-2 e baixa expressão de bcl-x
L
. Por outro lado,
pacientes refratários ao tratamento apresentam altos níveis de bcl-x
L
e baixos de bcl-2.
155
A inibição da expressão de Bcl-x
L
pelo tratamento com mesilato de imatinibe e a baixa
expressão de Bcl-2 na maioria das células positivas para Bcr-Abl, sugerem que a manutenção
da resistência à apoptose na ausência da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, não envolve a
expressão dessas moléculas anti-apoptóticas.No presente estudo, outras moléculas da família
Bcl-2 de reguladores da apoptose foram também avaliadas, como Bid, Bak, Bax, Bad e Bim.
Bid participa da indução de apoptose iniciada por receptores de morte e conecta a Via
Extrínseca à Via Intrínseca. A trimerização dos receptores de morte, induzida pela interação
com seus ligantes, ativa caspase-8 no complexo de sinalização de morte (DISC). Quando
ativada, caspase-8 processa a forma citosólica de Bid convertendo-na em um forma truncada
(tBid, “truncated Bid”) que transloca para a mitocôndria onde interage com membros pró- e
anti-apoptóticos da família Bcl-2 e promove a liberação de citocromo c para o citosol (Li et
al., 1998). Células HL-60.Bcr-Abl apresentaram níveis de expressão de Bid menores do que o
observado em células HL-60.vetor, indicando que Bcr-Abl regula negativamente a expressão
dessa proteína. No entanto, células K562, KCL22 e LAMA-84 apresentaram quantidades de
Bid semelhantes ao de células HL-60.vetor. Em três das quatro linhagens de células que
expressam Bcr-Abl, o tratamento com mesilato de imatinibe induziu uma diminuição na
quantidade de Bid expressa. Esse fenômeno não foi observado em células HL-60.vetor, nem
em LAMA-84.
Embora camundongos deficientes em Bak ou Bax sejam normais ou apresentem
pequenas anormalidades no programa de morte celular, animais duplo nocautes, que não
expressam nenhuma das duas proteínas, exibem um acúmulo substancial de células em
diversos tecidos, causando a persistência das membranas interdigitais e linfoadenopatias
progressivas. Além disso, as células desses animais se mostram extremamente resistentes a
inúmeros estímulos apoptóticos, reforçando que essas proteínas são componentes essenciais
na indução de apoptose (Lindsten et al., 2000). Em nossos experimentos, as linhagens Bcr-
Abl-positivas apresentaram níveis ligeiramente aumentados de Bax, quando comparadas às
células HL-60.vetor. O aumento dos níveis protéicos de Bax em células HL-60.Bcr-Abl já
havia sido observado pelo nosso grupo de pesquisa (Brumatti et al., 2003). No entanto, em um
outro trabalho realizado em nosso laboratório foi observado que tal alteração não ocorre no
âmbito transcricional, uma vez que células HL-60.Bcr-Abl apresentam quantidades de
transcritos de bax inferiores aos observados em HL-60 (Ulbrich, A, dados não publicados).
Essa diferença entre os níveis de RNAm e de proteína de Bax poderiam ser explicados por
mecanismos pós-traducionais que atuariam nas células HL-60.Bcr-Abl, por exemplo,
aumentando a estabilidade do RNAm e/ou da proteína. Uma possibilidade seria a prevenção
da degradação de Bax pelo proteassoma por meio de sua fosforilação, o que resultaria em seu
156
acúmulo no citoplasma. Em neutrófilos, foi demonstrado que Bax pode ser fosforilado pela
via PI3k/Akt no resíduo Ser
184
e que, na forma fosforilada, essa molécula é detectada no
citoplasma e forma heterodímeros com as proteínas anti-apoptóticas Mcl-1, Bcl-x
L
e A1
(Gardai et al., 2004). Baseado nesses achados os autores sugerem a fosforilação de Bax como
um mecanismo de inibição da apoptose, uma vez que essa modificação impede a translocação
de Bax para a mitocôndria e promove a heterodimerização com proteínas anti-apoptóticas da
família Bcl-2 (Gardai et al., 2004).
Apesar das diferenças de expressão de Bax, o tratamento com mesilato de imatinibe
não alterou a expressão dessa proteína nas linhagens analisadas, com exceção da linhagem
KCL22 que apresentou uma diminuição dessa proteína frente ao tratamento. A comparação da
expressão de Bax em pacientes nas fases crônica, acelerada e blástica mostrou que não há
correlação entre a expressão dessa molécula pró-apoptótica e a progressão da LMC (Ravandi
et al., 2001).
A expressão de Bak variou entre as linhagens testadas. Enquanto células HL-60.vetor,
HL-60.Bcr-Abl e KCL22 apresentaram quantidades semelhantes de Bak, com as duas células
que expressam Bcr-Abl expressando até um pouco mais de Bak do que células HL-60.vetor, a
linhagem K562 mostrou uma expressão menor dessa proteína e a linhagem LAMA-84
apresentou níveis quase não detectáveis de Bak. Em HL-60.Bcr-Abl e K562, o tratamento
com mesilato de imatinibe promoveu uma diminuição da expressão de Bak. Uma
possibilidade é que a diminuição dos níveis de Bak e Bid pelo mesilato de imatinibe, colabore,
pelo menos em parte, para a manutenção da resistência à indução de morte durante o co-
tratamento desse inibidor com indutores de apoptose. Uma outra alternativa é que a
diminuição dessas proteínas seria o reflexo do início da sinalização de morte nessas células.
Na ausência de um sinal apoptótico, as moléculas pró-apoptóticas Bax e Bad estão
predominantemente localizadas no citosol. No entanto, após um estímulo apoptótico essas
proteínas pró-apoptóticas são redistribuídas para a mitocôndria. Células que expressam
grandes quantidades de Bcr-Abl são capazes de bloquear a translocação de Bax e Bad para a
membrana da mitocôndria após estímulos citotóxicos (Keeshan et al., 2002).
Os membros da família Bcl-2 podem ser regulados por alterações na transcrição,
modificações pós-traducionais, dimerização e distribuição subcelular (Keeshan et al., 2002).
Sabe-se que para algumas moléculas a regulação por Bcr-Abl ocorre no nível pós-traducional,
o que explicaria a não alteração da expressão dessas moléculas quando são analisados os
níveis de RNAm e/ou de proteína. Um exemplo é a regulação de Bad, uma molécula pró-
apoptótica cuja atividade está diretamente relacionada com seu estado de fosforilação. Bad
não fosforilado pode formar heterodímeros com Bcl-x
L
e Bcl-2, impedindo que essas
157
proteínas exerçam suas funções anti-apoptóticas e possibilitando a homodimerização de Bax
na mitocôndria para promover a apoptose (Yang et al., 1995). Sinais de sobrevivência
mediados por citocinas, como IL-3, promovem a fosforilação de Bad de modo dependente da
via PI3-k/Akt. A conseqüência da fosforilação de Bad em dois resíduos de serina (Ser
112
e
Ser
136
) é a inibição da sua ligação com Bcl-x
L
e seu seqüestro no citosol pela interação com a
proteína 14-3-3, que interage com resíduos de fosfoserina. A fosforilação de Bad na Ser
136
é
mediada por Akt e na Ser
112
, parece envolver a proteína quinase A (PKA) (Datta et al., 1997).
Neshat e colaboradores mostraram que Bad está constitutivamente fosforilado em células que
expressam Bcr-Abl e que essa fosforilação depende da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl e
necessita da participação de PI3-k, Ras e Raf. Nesse trabalho, observaram que quando a
capacidade de Bcr-Abl de fosforilar Bad foi inibida pelo uso de um dominante negativo de
Raf, uma subpopulação das células permaneceu viva, sugerindo a existência de vias de
sobrevivência independentes de Bad (Neshat et al., 2000). Nos nossos resultados, de maneira
geral, a expressão de Bad não parece ter sido modulada pela expressão de Bcr-Abl, nem por
sua inibição pelo mesilato de imatinibe. Esses resultados estão de acordo com a literatura que,
como exposto acima, indica que a regulação de Bad por Bcr-Abl é principalmente no nível
pós-traducional, por meio da sua fosforilação e seqüestro no citosol. Apesar de não termos
feito a marcação para Bad fosforilado, outros trabalhos mostram que a fosforilação dessa
molécula pró-apoptótica depende da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, sendo, portanto
inibida na presença do mesilato de imatinibe e/ou pela expressão de formas mutantes de Bcr-
Abl quinase-deficientes (Neshat et al., 2000). Baseado nisso, a permanência das células em
um estado de resistência não está associada à manutenção de Bad em seu estado fosforilado.
Apesar dos diversos trabalhos mostrando a importância da sinalização mediada pela via de
PI3-k para os efeitos de Bcr-Abl, Amarante-Mendes e colaboradores demonstraram que,
embora Bcr-Abl promova a ativação de PI3-k em células HL-60, a resistência à apoptose
induzida pela expressão dessa tirosina-quinase não depende da atividade de PI3-k, uma vez
que o tratamento com wortmanina, um inibidor potente dessa via, não interferiu na resposta
das células à agentes apoptogêncios. Baseado nesses resultados, os autores sugerem que
embora PI3-k participe da resposta anti-apoptótica mediada por alguns fatores de crescimento
e parece importante para o crescimento de células que expressam Bcr-Abl, essa via não tem
papel fundamental na resistência à apoptose mediada por Bcr-Abl (Amarante-Mendes et al.,
1997). É importante destacar, no entanto, que alguns trabalhos sugerem que Bad pode ser
fosforilado de maneira independente de PI3-k/Akt.
A molécula Bim (“Bcl-2 interacting mediator of cell death”) é um membro da família
“BH3-only” de proteínas pró-apoptóticas. A expressão de Bim e suas funções são reguladas
158
tanto no nível transcricional como no pós-traducional. A regulação da transcrição de Bim é
um processo relativamente complexo, sendo que três proteínas são sintetizadas a partir do
mesmo transcrito: Bim-
EL
, Bim-
L
e Bim-
S
(O'connor et al., 1998), onde Bim-
EL
é a forma
predominante. Foi observado que a privação de fatores de crescimento aumenta a expressão
de Bim em linhagens neuronais e hematopoéticas (Putcha et al., 2001) contudo, foi mostrado
que a estimulação de células hematopoéticas por IL-3, reprime a expressão de Bim por meio
da via de Erk (Shinjyo et al., 2001). Luciano e co-autores mostraram que a fosforilação de
Bim-
EL
no resíduo Ser
69
(resíduo presente só na forma EL) pela Erk1/2 é necessária e
suficiente para promover a sua rápida degradação pelo proteassoma e proteger as células da
indução de apoptose (Luciano et al., 2003). Nesse manuscrito relataram que, em K562, o
tratamento com imatinibe bloqueia a fosforilação de Bim-
EL
e sua degradação e ainda induz
ativação de caspases e apoptose, sugerindo que a fosforilação de Bim via Erk representa outro
mecanismo de repressão da apoptose utilizado por Bcr-Abl (Luciano et al., 2003).
Posteriormente, foi sugerido que a função pró-apoptótica de Bim-
EL
também pode ser
regulada pela sua fosforilação no resíduo Ser
87
, e que essa fosforilação é intermediada por
Akt, não envolvendo Erk (Qi et al., 2006).
A indução de morte celular é uma atividade farmacológica crítica do mesilato de
imatinibe e fundamental para a eliminação de células que expressam Bcr-Abl. Kuroda e
colaboradores mostraram que o mesilato de imatinibe mata as células leucêmicas por meio da
ativação de algumas proteínas pró-apoptóticas da família “BH3-only”. Nesse estudo
observaram que a exposição ao inibidor promove aumento da transcrição de bim e bmf e
ativação pós-traducional de Bim e Bad (Kuroda et al., 2006). Portanto, a expressão de Bcr-
Abl promove a diminuição da expressão de Bim e induz a sua fosforilação. Com o uso de
células transfectadas com bcr-abl, derivadas de camundongos que eram deficientes para Bim,
Bad ou para a combinação dos dois fatores, Kuroda e colaboradores mostraram que células
deficientes para uma das duas moléculas são parcialmente susceptíveis à indução de morte
pelo mesilato de imatinibe, no entanto, células que não expressam Bim e Bad
simultaneamente, são altamente resistentes ao inibidor. O aumento da transcrição de Bim
parece ser mediado por FoxO3a, o qual está constitutivamente fosforilado em células Bcr-
Abl-positivas (BV173 e BaF3.Bcr-Abl). A inibição de Bcr-Abl pelo mesilato de imatinibe
resulta na ativação de FoxO3a, indução da expressão de Bim e apoptose. Por outro lado, o
silenciamento de FoxO3a em células que expressam Bcr-Abl bloqueia o aumento de Bim e
inibe a indução de apoptose mediada pelo mesilato de imatinibe (Essafi et al., 2005).
Nossos resultados mostram que o tratamento com mesilato de imatinibe induz o
aumento da expressão de Bim e a perda da fosforilação, estando de acordo, portanto, com os
159
dados da literatura apresentados acima. Essas alterações na expressão de Bim são importantes
para que essa proteína exerça suas funções pró-apoptóticas. Dessa forma, a manutenção da
resistência à apoptose na ausência da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl não parece estar
associada à perda ou alterações dos mecanismos de controle da atividade de Bim por essa
oncoproteína.
A1 e Mcl-1, membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, embora não tenham sido
analisados no nosso trabalho, nos ensaios com o mesilato de imatinibe, parecem ser
importantes para o efeito anti-apoptótico de Bcr-Abl em alguns modelos celulares. A1 protege
as células da morte por diversos agentes, tais como TNF-α e retirada de fatores de
crescimento. Essa proteína está localizada na mitocôndria e é capaz de inibir a despolarização
mitocondrial e a liberação de citocromo c (Duriez et al., 2000). A expressão da serina/treonina
quinase pim-1 está correlacionada com a divisão celular e sobrevivência independente de
fatores de crescimento, além de proteção de células hematopoéticas da morte por agentes
genotóxicos. Nieborowska-Skorska e colaboradores observaram que Bcr-Abl induz, de
maneira dependente de STAT5, a expressão de A1 e pim-1, os quais são necessários para a
leucemogênese mediada por Bcr-Abl e parecem se complementar na proteção a apoptose e
promoção da independência de fatores de crescimento (Nieborowska-Skorska et al., 2002).
Células mononucleares derivadas de medula óssea de pacientes com LMC expressam
níveis mais altos de Mcl-1 do que células de indivíduos saudáveis, e tal expressão independe
da fase da doença. O tratamento com mesilato de imatinibe promove a redução na quantidade
de Mcl-1 expressa em células que possuem Bcr-Abl (K562, KU812), mas não em células
negativas para essa oncoproteína (HL-60, U937, KG1). Algumas evidências sugerem que
além da via Ras/Raf/MEK/ERK, a ativação de STAT5 pode contribuir para a expressão de
Mcl-1 dependente de Bcr-Abl nas células leucêmicas. Em K562, o efeito do STI571 sobre a
expressão de Mcl-1 é dose-dependente e está associado à diminuição da viabilidade celular e
aumento da porcentagem de células em apoptose, sendo que a diminuição de Mcl-1 precedeu
a indução de morte, indicando que Mcl-1 atua como uma importante molécula anti-apoptótica
na LMC (Aichberger et al., 2005). Aichberger e colaboradores observaram também que a
diminuição dos níveis protéicos de Mcl-1 em K562, com a dose de 1 µM de mesilato de
imatinibe, pode ser observada em 8, 12 e em 24 horas. Considerando que em nosso trabalho
também utilizamos a linhagem K562, podemos imaginar que no tempo de incubação do nosso
experimento e com a dose de inibidor utilizada (10 µM), a expressão de Mcl-1 estava reduzida
e, portanto, a resistência aos indutores de morte não poderia ser atribuída a essa proteína anti-
apoptótica. Em um trabalho publicado recentemente, foi observado que a expressão de Bcr-
Abl em NIH-3T3, uma linhagem de fibroblasto, BaF3, linhagem pró-B murina, e HL-60
160
promove um aumento da expressão e atividade de SPK1 (“sphingosine kinase-1”) e o
tratamento de células K562 e células primárias derivadas de LMC com mesilato de imatinibe
reduz a expressão e a atividade de SPK1. A superexpressão de SPK1 em BaF3 e HL-60 induz
o aumento de Mcl-1 e sua inibição leva a uma redução na expressão dessa molécula anti-
apoptótica, indicando que SPK1 contribui para o aumento de Mcl-1 induzido por Bcr-Abl. O
silenciamento de SPK1, seguido do tratamento com mesilato de imatinibe por 12 horas,
induziu cerca de 15% de apoptose em K562 (Li et al., 2007).
Além dos reguladores da apoptose pertencentes à família Bcl-2, investigamos os
efeitos de Bcr-Abl e de sua inibição, na expressão de proteínas anti-apoptóticas da família dos
IAPS.
Nossos resultados mostram que células HL-60.Bcr-Abl expressam quantidades
maiores de survivina do que células HL-60.vetor, confirmando a indução de survivina pela
expressão de Bcr-Abl. Em K562, os níveis de survivina parecem ligeiramente maiores do que
os de HL-60.vetor, já os de KCL22 e LAMA-84 parecem menores ou similares ao expresso
pelas células controle. Enquanto o tratamento de células HL-60.vetor com o mesilato de
imatinibe não afetou as quantidades intracelulares de survivina, a inibição da atividade
tirosina-quinase de Bcr-Abl promoveu uma redução dos níveis dessa proteína em todas as
linhagens que expressam Bcr-Abl. A intensidade da redução variou entre as linhagens
analisadas.
Survivina é um membro da família de inibidores de apoptose (IAP) que apresenta um
papel importante na proliferação e morte celular (Altieri e Marchisio, 1999), sendo
normalmente expressa em grandes quantidades durante o desenvolvimento fetal e tornando-se
quase imperceptível em tecidos adultos diferenciados (Carter et al., 2006). No entanto, em
células transformadas e em diversos tipos de câncer essa proteína é expressa em níveis
elevados, tendo sido associada a um pior prognóstico em algumas neoplasias. Quanto à
associação da expressão da survivina com LMC, alguns trabalhos indicam que essa proteína é
expressa em pacientes nas fases acelerada e crise blástica da LMC, enquanto seus níveis são
baixos ou não detectados em pacientes na fase crônica (Conte et al., 2005; Carter et al., 2006).
Em um trabalho recente, foi observado que a exposição de células que expressam Bcr-Abl ao
mesilato de imatinibe, está associada a uma inibição dose-dependente dos níveis de survivina,
que atingem o máximo da redução após 48 horas de tratamento, e a diminuição da viabilidade
celular e aumento da morte celular em 48 horas. Em células negativas para Bcr-Abl, o
tratamento com o mesilato de imatinibe não alterou a expressão de survivina. Nesse trabalho
mostraram que a expressão ectópica de Bcr-Abl induz o aumento da expressão de survivina
em células HL-60 e que o mesilato de imatinibe não afeta os níveis de survivina nem o
161
crescimento e sobrevivência de HL-60, enquanto induz morte e reduz os níveis de survivina
em HL-60.Bcr-Abl. A regulação da expressão de survivina pelo Bcr-Abl parece ocorrer tanto
no nível do RNAm quanto no da proteína, o que parece envolver o proteassoma. O tratamento
com STI571 diminui survivina reduzindo a quantidade de RNAm e a estabilidade da proteína,
induzindo a sua degradação. A survivina é altamente expressa em células KBM5, que são
derivadas de paciente com LMC na crise blástica, e a sua expressão parece ser regulada pela
cascata de sinalização Bcr-Abl-MAPK. Nessas células a inibição de survivina (anti-senso)
resultou em parada do ciclo e morte, tanto em KBM5 quanto em KBM5 resistente ao
imatinibe.
A expressão de XIAP não parece ser alterada por Bcr-Abl e nem pelo inibidor. A não
alteração da expressão de XIAP e de c-IAP1 em células HL-60.Bcr-Abl em comparação às
células HL-60.vetor, já havia sido relatada (Fang et al., 2000; Brumatti et al., 2003). No
entanto, Fang e colaboradores mostraram que o tratamento com mesilato de imatinibe por 48
horas, promove a redução dos níveis de expressão de c-IAP1 e XIAP em células HL-60.Bcr-
Abl e K562, mas não em HL-60 (Fang et al., 2000). A diferença desses dados com os nossos
resultados pode ser explicada pelo tempo de incubação com a droga, que no nosso caso foi de
até 24 horas e não de 48 horas.
Outras moléculas que participam da regulação da apoptose ou estão de alguma forma
associadas a esse processo também foram analisadas. Não foram observadas alterações
significativas nos níveis de expressão de caspase-3, Apaf-1 e fodrina em decorrência da
presença de Bcr-Abl ou de sua inibição. No entanto, não podemos descartar que mecanismos
pós-traducionais regulem essas proteínas.
c-Flip existe no nível de RNAm na forma de múltiplas variantes, enquanto que no
nível protéico três isoformas foram detectadas: c-FLIP
L
, c-FLIP
R
e c-FLIP
S
(Golks et al.,
2005). Ao analisarmos a expressão de c-FLIP, observamos que células que expressam Bcr-
Abl, incluindo a linhagem HL-60.Bcr-Abl expressam uma quantidade maior de c-FLIP
S
do
que células HL-60.vetor. c-FLIP
S
bloqueia o processamento e ativação de caspase-8 no DISC.
O aumento dessa proteína poderia explicar a resistência que essas células apresentam em
relação à indução de morte pela via de Fas, mas não pela via intrínseca.
A molécula Crkl foi identificada como a principal proteína fosforilada em tirosina em
neutrófilos de pacientes com LMC (Oda et al., 1994) e muito fosforilada também em K562
(Ten Hoeve et al., 1994). Células HL-60.Bcr-Abl apresentaram, em relação às células HL-
60.vetor, quantidades muito superiores de Crkl. Esse aumento na expressão de Crkl foi
também observado nas demais linhagens positivas para o Bcr-Abl. Além de uma maior
expressão de Crkl nas linhagens que expressam Bcr-Abl, também é possível notar que, na
162
situação controle (não tratadas), as bandas referentes a essa proteína, apresentam uma menor
migração no gel nas células que expressam Bcr-Abl do que nas células HL-60.vetor. Essa
menor migração provavelmente está associada à fosforilação de Crkl nas células que
expressam Bcr-Abl. O tratamento com mesilato de imatinibe promoveu uma leve alteração da
expressão da proteína, reduzindo a intensidade da banda referente ao Crkl, mas o maior efeito
desse inibidor foi, com certeza, sobre a fosforilação dessa proteína que passou a migrar mais
no gel, indicando a sua desfosforilada quando Bcr-Abl foi inibido.
Além das proteínas citadas acima, foi analisada a molécula SET, inibidor da fosfatase
PP2A. A expressão de SET é induzida por Bcr-Abl de maneira dependente da dose e da
atividade tirosina-quinase e aumenta com a progressão da doença (Neviani et al., 2005). No
presente modelo experimental, a expressão de SET foi maior em HL-60.Bcr-Abl e K562 do
que em células HL-60.vetor, mas tal expressão não foi modulada pela ação do mesilato de
imatinibe. Esse resultado contrasta com o dado obtido por Neviani e colaboradores que mostra
que o tratamento com 1 µM de mesilato de imatinibe promove a redução da expressão de SET
em células K562 (Neviani et al., 2005). Outros detalhes da regulação de SET por Bcr-Abl,
serão discutidos juntamente com os resultados da análise proteômica.
Embora não possamos descartar definitivamente a possibilidade de que haja
quantidades indetectáveis de fosfoproteína na presença do inibidor da atividade tirosina-
quinase de Bcr-Abl, os resultados obtidos com o mesilato de imatinibe sugerem que a
atividade enzimática de Bcr-Abl não precisa estar constantemente ativa para a manutenção da
resistência à apoptose e que proteínas fosforiladas em tirosina não são responsáveis diretas
pelo efeito anti-apoptótico dessa tirosina-quinase. Uma possível explicação para esses
resultados seria a existência de mecanismos independentes da atividade enzimática de Bcr-
Abl que colaboram para o fenótipo de resistência à morte. Outra possibilidade é que os
substratos fosforilados em tirosina seriam importantes nos eventos iniciais de geração e
manutenção dos sinais anti-apoptóticos e que esses últimos poderiam permanecer ativos por
um período curto de tempo, mesmo na ausência da atividade enzimática de Bcr-Abl e das
proteínas fosforiladas em tirosina. Dessa forma, os sinais anti-apoptóticos secundários,
iniciados pela atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl, seriam responsáveis pelo fenótipo de
resistência às drogas quimioterápicas observado em células que expressam Bcr-Abl e sua
identificação poderia auxiliar na compreensão da patologia da LMC e no desenvolvimento de
novas estratégias terapêuticas. O fato da exposição prolongada ao mesilato de imatinibe
induzir morte em células positivas para Bcr-Abl indica que a re-estimulação dos sinais anti-
apoptóticos depende da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl.
163
O grande sucesso do mesilato de imatinibe como uma droga anti-LMC pode ser
atribuído à alta dependência das células leucêmicas derivadas da LMC da atividade tirosina-
quinase de Abl e ao alto grau de especificidade desse inibidor (Hubbard, 2002).
O tratamento da LMC com mesilato de imatinibe está embasado na alta especificidade
do fármaco pela tirosina-quinase Abl, que faz com que esse inibidor induza morte das células
que expressam Bcr-Abl sem afetar ou com mínimos efeitos sobre as células normais. Nos
nossos resultados sobre os efeitos do mesilato de imatinibe na viabilidade celular, mostramos
que células positivas para Bcr-Abl, tanto as HL-60 transfectadas com Bcr-Abl quanto as
células derivadas de pacientes, não têm a viabilidade afetada pelo tratamento com mesilato de
imatinibe por 24 horas, no entanto passam a morrer após 48 horas de exposição ao inibidor.
Uma discussão interessante que surge a partir da análise desses resultados é a de que células
HL-60 já são transformadas, não expressam Bcr-Abl e não têm a viabilidade afetada pelo
tratamento com mesilato de imatinibe, por outro lado, células HL-60.Bcr-Abl morrem quando
a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é inibida pelo mesilato de imatinibe, ao invés de
voltarem a se comportar como células HL-60 “selvagens”. Essas considerações sugerem que,
de alguma forma, células HL-60.Bcr-Abl se tornaram dependentes da atividade enzimática de
Bcr-Abl, não sobrevivendo quando a atividade tirosina-quinase dessa proteína é inibida.
Atualmente um dos focos de debate da comunidade científica é até que ponto um
oncogene que é crucial para o início e desenvolvimento de um tumor específico é também
necessário para a manutenção do fenótipo maligno desse tumor. Essa questão surge tendo em
vista a publicação e realização de diversas pesquisas que indicam que, freqüentemente, as
células cancerosas são dependentes ou estão “viciadas” na atividade contínua de oncogenes
específicos.
Nessa linha de pensamento, Felder e Bishop divulgaram que camundongos
transgênicos expressando o oncogene myc em células hematopoéticas, desenvolveram
leucemias de células T e leucemia mielóide aguda. No entanto, quando o gene myc foi
desligado, as células leucêmicas pararam de proliferar e entraram em diferenciação e apoptose
(Felsher e Bishop, 1999). Um resultado semelhante foi observado em um outro modelo
transgênico, no qual a expressão condicional de bcr-abl, resultou no desenvolvimento de
leucemia nos camundongos, seguida da morte dos animais. Do mesmo modo descrito no
experimento anterior, quando a expressão de Bcr-Abl foi bloqueada, mesmo em estágios
avançados da doença, as células leucêmicas entraram em apoptose e os camundongos
sobreviveram (Huettner et al., 2000; Weinstein, 2002).
Baseado nesse conceito de dependência de oncogene, atribui-se o sucesso do mesilato
de imatinibe à vulnerabilidade das células tumorais à ruptura da via oncogênica dominante,
164
um fenômeno conhecido por “oncogene dependence” ou “oncogene addiction” (Weinstein,
2002). Tal dependência de um oncogene resultaria da subversão e reorganização das redes de
sinalização normais, através da introdução de um oncogene dominante, fazendo com que a
remoção ou modulação do oncogene leve a alterações na sinalização aberrante que são
prejudiciais à proliferação e/ou sobrevivência celular (Weinstein, 2002; Hingorani e Tuveson,
2003). Outra hipótese levantada para explicar a dependência de Bcr-Abl está relacionada ao
fato dessa quinase bloquear a apoptose em diversos níveis, funcionando como uma barreira
para os sinais pró-apoptóticos. Nessa hipótese, o autor propõe que os estímulos apoptogênicos
que agem acima do bloqueio por Bcr-Abl, embora não causem apoptose, promoveriam o
acúmulo de moléculas pró-apoptóticas acima do controle por Bcr-Abl e, com isso, assim
como uma corrente de água bloqueada por uma barragem, a pressão pró-apoptótica acumulada
seria liberada caso o Bcr-Abl fosse removido bruscamente, e com isso haveria a ativação da
cascata apoptótica. Do mesmo modo, a inibição de Bcr-Abl eliminaria também as forças que
direcionam o ciclo celular e que são ativadas por Bcr-Abl, como a Cdk2, por exemplo. Dessa
forma, é a repentina inativação de proteínas que promovem o crescimento e a sobrevivência
das células leucêmicas que causa a parada no ciclo e morte celular (Blagosklonny, 2004).
Alguns estudos sugerem uma via comum relacionada a dependência de oncogenes e que
envolve sinais de sobrevivência gerados por Erk, Akt e Stat3/5 e estímulos pró-apoptóticos
provenientes de p38 fosforilada (Sharma et al., 2006). Recentemente Baylin e Ohm discutiram
também a possibilidade de alterações epigenéticas, desencadeadas durante o processo de
carcinogênese, participarem e contribuírem para dependência oncogênica (Baylin e Ohm,
2006). Além disso, é possível que a expressão de Bcr-Abl promova o acúmulo de lesões no
DNA, as quais impossibilitariam a reversibilidade das vias de sinalização celulares normais no
momento em que Bcr-Abl fosse inibido.
O grau de dependência e de necessidade da atividade contínua de um oncogene
específico para a manutenção do câncer pode depender de outros fatores, tais como a função
do próprio oncogene, contexto celular e outros fatores envolvidos na formação do tumor
(Weinstein, 2002).
Os resultados obtidos com o tratamento das células com o mesilato de imatinibe por
até 24 horas, indicam que Bcr-Abl é capaz de manter o fenótipo de resistência à apoptose
mesmo na ausência de sua atividade enzimática. Para observar se a molécula Bcr-Abl
quinase-deficiente é capaz de conferir resistência à apoptose e comparar seus efeitos àqueles
produzidos pela expressão de Bcr-Abl selvagem, foram estabelecidas diversas linhagens
celulares expressando a versão de Bcr-Abl sem atividade enzimática. Essa versão de Bcr-Abl
alterada origina-se de um gene bcr-abl com mutação pontual que culmina com a inativação da
165
função tirosina-quinase, sendo por isso denominada de Bcr-Abl-quinase deficiente. Além das
linhagens expressando a oncoproteína de interesse, foram estabelecidas durante o estudo as
respectivas linhagens com o vetor vazio e a versão selvagem de Bcr-Abl.
Como grande parte dos trabalhos do nosso grupo de pesquisa envolvem a comparação
das linhagens HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl, decidimos em um primeiro momento focar no
estabelecimento de uma linhagem de células HL-60 expressando a versão quinase-deficiente
de Bcr-Abl. Inexplicavelmente em todas as tentativas de infecção foram selecionadas células
HL-60 resistentes ao antibiótico de seleção, mas que não expressavam a proteína de interesse
(Bcr-Abl/KR). Com base nos manuais de transfecção e em artigos relacionados, diversas
alterações foram feitas no protocolo de transfecção e infecção, mas sem proporcionar o
sucesso desejado. Dentre as alterações, destacam-se: a adição de cloroquina durante a
transfecção de células 293T, visto que alguns trabalhos e manuais de transfecção sugerem que
a cloroquina aumenta de duas a três vezes o título viral e que tal efeito está relacionado a sua
ação neutralizante sobre a atividade lisossomal (Pear et al., 1993); mudanças no tempo de
incubação do precipitado antes de ser adicionado às células 293T e o uso de diferentes doses
de G418 (de 400 µg/mL a 1,25 mg/mL) para a seleção de células HL-60. Com a ferramenta da
co-transfecção do plasmídeo retroviral pMX-IRES-EGFP com o pCL-ampho avaliamos a
eficiência de infecção de células HL-60, a qual era muito baixa. Sabe-se que uma das coisas
determinantes para a infecção viral é a proteína de envelope do vírus. Diversos grupos já
mostraram que células HL-60 são altamente resistentes a transferência gênica mediada por
retrovírus. O baixo nível de transdução tem sido atribuído a: dificuldades na seleção após a
transfecção, inibição da transcrição reversa do genoma viral e baixos níveis de receptores para
retrovírus (Collins, 1988; Sabatino et al., 1997). A proteína de envelope codificada pelo pCL-
ampho é a glicoproteína gp70 que interage com moléculas receptoras presentes na superfície
de células-alvo. A gp70 anfotrópica se liga a proteína PiT-2, sendo que a região de PiT-2 com
a qual gp70 interage é bem conservada entre mamíferos, permitindo que as partículas virais
anfotrópicas infectem diversas espécies. Em um estudo realizado por Sabatino e
colaboradores, foi observado que células HL-60 apresentam baixos níveis de RNAm para PiT-
2, o que estaria correlacionado com a baixa eficiência de transferência gênica mediada por
retrovírus. Isso sugere que uma das barreiras para a infecção das células HL-60 pelo retrovírus
é a quantidade de receptores para a proteína do envelope viral (Sabatino et al., 1997).
Baseado nisso, decidimos testar um outro sistema de produção de retrovírus que envolve o uso
de células 293 gag/pol e o plasmídeo pVSV-G, que carrega o gene para uma proteína de
envelope, no caso, a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular-VSV. A grande
vantagem que esse sistema oferecia para a infecção de células HL-60 é que, ao contrário da
166
gp70, proteína de envelope codificada pelo pCL-ampho, a glicoproteína G do VSV não utiliza
um receptor específico para entrar na célula-alvo, mas sim fosfolipídios de membrana que
propiciam a fusão do vírus com a membrana citoplasmática da célula-alvo. No entanto,
infelizmente, essa abordagem também não rendeu resultados positivos.
Curiosamente os mesmos sobrenadantes utilizados para tentar infectar células HL-60
foram utilizados com sucesso na infecção de outras linhagens celulares. As primeiras
linhagens obtidas foram estabelecidas a partir da infecção de células HeLa (HeLa.vetor,
HeLa.Bcr-Abl e HeLa.Bcr-Abl/KR) e, interessantemente, nos ensaios de resistência à
apoptose, as células que expressam Bcr-Abl/KR (quinase-deficiente) se comportam de
maneira intermediária quando submetidas a indutores de morte, morrendo menos do que as
linhagens controle (HeLa e HeLa.vetor) e mais do que as que expressam Bcr-Abl ativo.
Quando foi comparado o perfil dessas células quanto a expressão de moléculas envolvidas no
controle da apoptose, as quatro linhagens testadas não apresentaram diferenças na expressão
de Bax, Bak, Bid, Bcl-x
L
, A1, Crkl, XIAP, Mcl-1, Flip
L
, caspase-3 e caspase-9. Sendo assim,
a resistência à apoptose de células HeLa.Bcr-Abl/KR não pode ser explicada por alterações
nessas proteínas. Células HeLa.Bcr-Abl apresentaram uma maior expressão de c-IAP1, o que
pode colaborar para a sua resistência à apoptose, mas não a explica completamente, indicando
que outras moléculas devem estar alteradas em resposta à expressão de Bcr-Abl. Esse
aumento na expressão de c-IAP1 parece ser dependente da atividade tirosina-quinase de Bcr-
Abl, uma vez que a versão quinase-deficiente não alterou os níveis dessa molécula anti-
apoptótica. Diferente do que é observado em células HL-60, células HeLa já apresentam uma
grande quantidade de proteínas fosforiladas em tirosina o que, possivelmente, explica o fato
de não haver um ganho tão visível na expressão dessas proteínas em células HeLa.Bcr-Abl.
Da mesma forma, células HeLa expressam muito Bcl-x
L
e essa expressão se mantém nas
demais linhagens. As células HeLa.Bcr-Abl/KR que foram selecionadas nesse trabalho
expressam níveis altíssimos de Bcr-Abl, muito superiores ao observado em HeLa.Bcr-Abl.
Como as proteínas testadas não explicam a resistência à apoptose induzida pela expressão de
Bcr-Abl-quinase-deficiente, outras moléculas serão analisadas no futuro.
Como pôde ser visto no item Materiais e Métodos, nessa pesquisa, também foram
estabelecidas diferentes linhagens celulares derivadas de Jurkat (Jurkat.vetor, Jurkat.Bcr-Abl e
Jurkat.Bcr-Abl/KR) e THP-1 (THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl e THP-1.Bcr-Abl/KR),
expressando as proteínas de interesse. Em contraste com os resultados obtidos nas linhagens
derivadas de HeLa, a expressão de Bcr-Abl-quinase-deficiente não induziu resistência à
apoptose em células Jurkat. Todavia, as células Jurkat.Bcr-Abl foram mais resistentes aos
agentes apoptogênicos testados do que células Jurkat controle, Jurkat.vetor e Jurkat.Bcr-
167
Abl/KR. Quando comparadas às células Jurkat, Jurkat.vetor e Jurkat.Bcr-Abl/KR, as células
Jurkat.Bcr-Abl apresentam uma expressão maior das proteínas anti-apoptóticas survivina e c-
IAP1. De acordo com o descrito na literatura, a expressão de Bcr-Abl ativo promoveu a
diminuição de Bim nessas células, enquanto células Jurkat.Bcr-Abl/KR, mantiveram a mesma
quantidade de Bim das células Jurkat e Jurkat.vetor, mostrando que a modulação dessa
proteína por Bcr-Abl é dependente da sua atividade tirosina-quinase (Kuroda et al., 2006).
Estranhamente, a expressão de Bcr-Abl induziu a superexpressão da molécula pró-apoptótica
Bax. No entanto, o aumento de Bax também foi observado em células HL-60.Bcr-Abl,
embora em uma proporção bem menor, o que pode estar relacionado com a quantidade de
Bcr-Abl expressa por Jurkat.Bcr-Abl, que é bem superior à expressa por HL-60.Bcr-Abl.
Contrariando o conceito bem estabelecido de que a expressão de Bcr-Abl promove resistência
à apoptose, células THP-1.Bcr-Abl se mostraram susceptíveis à indução de morte por agentes
apoptogênicos de maneira similar à verificada em células THP-1, THP-1.vetor e THP-1.Bcr-
Abl/KR. Isso pode estar relacionado ao fato de Bcr-Abl não ter promovido nessas células, as
alterações na expressão de moléculas reguladoras da apoptose que já foram descritas como
alvos dessa oncoproteína, como a redução de Bim e o aumento de Bcl-x
L
. Também não foram
alteradas as expressões de Bcl-2, Bad, Bax, Bim, c-IAP1, XIAP, Apaf-1 e Flip. Somente
survivina parece ter sofrido um aumento em decorrência da expressão da tirosina-quinase,
mas isso não contribuiu para mudar a sensibilidade das células às drogas testadas. Entretanto,
não podemos descartar que a expressão de Bcr-Abl tenha afetado outras propriedades
celulares, visto que só abordamos nesse trabalho a resistência à apoptose.
O fato de Bcr-Abl não ter protegido as células THP-1 da indução de apoptose foi
surpreendente e difere da grande maioria dos resultados publicados nessa área, que apontam
essa molécula como uma das mais potentes proteínas anti-apoptóticas. No entanto, de maneira
semelhante ao observado para as linhagens derivadas de THP-1, em um outro trabalho
realizado em nosso laboratório foi mostrado que em células SKW6.4, uma linhagem linfóide
humana, a expressão de Bcr-Abl também não promove resistência a apoptose (Brumatti, G.,
dados não publicados). Com base nesses dados, a célula THP-1 não parece uma linhagem
adequada para o estudo dos efeitos anti-apoptóticos de Bcr-Abl independentes da atividade
quinase. Os mecanismos responsáveis pela ausência de resistência à apoptose nessas duas
linhagens positivas para Bcr-Abl estão sendo exploradas em estudos paralelos no nosso
laboratório.
A versão de Bcr-Abl quinase-deficiente com a mutação K671R já foi utilizada em
outros estudos para verificar a importância da atividade tirosina-quinase para os efeitos
transformantes de Bcr-Abl.
168
Quando extratos de ovos de Xenopus são incubados à temperatura ambiente, o
citocromo c é liberado da mitocôndria, resultando na ativação de caspases, clivagem dos
substratos e fragmentação do núcleo, de modo independente de transcrição ou tradução de
novos fatores. Kornbluth e colaboradores, utilizando extratos citosólicos de ovos de Xenopus,
mostraram que o tratamento com Bcr-Abl recombinante é capaz de inibir esse programa de
morte espontânea. Nesse mesmo sistema, foi observado que o tratamento com a proteína Bcr-
Abl-quinase deficiente (K671R) causou um atraso na apoptose, sugerindo que alguns efeitos
quinase-independentes contribuem para o potencial anti-apoptótico de Bcr-Abl (Deming et al.,
2004). Por outro lado, a expressão da versão mutada de Bcr-Abl não protege da injeção de
citocromo c direto no citoplasma, sugerindo que se existem sinais anti-apoptóticos
independentes da atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl eles provavelmente exercem seus
efeitos acima ou na mitocôndria e que os efeitos de Bcr-Abl pós a liberação de citocromo-c
são dependentes da atividade quinase.
A maioria dos trabalhos utilizando mutantes de Bcr-Abl quinase-deficientes foram
feitos em linhagens de células dependentes de IL-3. Um exemplo foi o estudo feito por Cortez
e colaboradores utilizando as linhagens murinas BaF3 e 32D. Nessas células, a expressão de
Bcr-Abl ativo induziu independência de fatores de crescimento (IL-3) e resistência à apoptose
pela retirada de IL-3 do meio. Já a expressão do Bcr-Abl quinase-deficiente não induz
independência de IL-3, nem resistência à apoptose induzida pela remoção deste fator de
crescimento. Sabe-se que a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é essencial para tornar as
células independentes de fatores de crescimento, sendo assim é esperado que as células que
expressam Bcr-Abl mutado morram quando IL-3 é removida do meio. Nesse trabalho, os
autores mostram que nos ensaios utilizando como indutor de apoptose radiação gama, células
BaF3 controle e BaF3.Bcr-Abl mutante (KR) morrem quando submetidas a irradiação, quando
incubadas na ausência de IL-3. No entanto, na presença de IL-3 nenhuma das células morreu
com a dose de irradiação gama utilizada, nem mesmo o controle, não permitindo analisar se o
Bcr-Abl mutante protege de apoptose na presença de IL-3. Para isso deveria ter sido escolhida
uma dose de irradiação capaz de matar as células controle na presença de IL-3 (Cortez et al.,
1995). Neste mesmo estudo feito por Cortez e colaboradores, a expressão de Bcr-Abl-quinase
deficiente, além de não ser capaz de induzir independência de IL-3, bloqueio da apoptose por
retirada de fator de crescimento e não apresentar tumorigenicidade, não promoveu a ativação
da via de Ras. A ativação de Ras é um componente central de diversas vias de sinalização,
estando em muitos tumores anormalmente ativada. Uma das vias de ativação da via de Ras é
através da interação do domínio SH2 da proteína adaptadora Grb2 com a tirosina fosforilada
177 de Bcr-Abl. Contrastando com o conceito bem estabelecido de que a tirosina 177 é o sítio
169
de autofosforilação da tirosina-quinase Abl, Warmuth e colaboradores observaram que, em
células expressando a molécula Bcr-Abl quinase-deficiente, uma quantidade expressiva de
Grb2 estava complexada com a proteína Bcr-Abl mutada. Nestas células, as quinases Src,
especialmente Hck (quinase de células hematopoéticas) foram ativadas por um mecanismo
independente da atividade enzimática de Bcr-Abl e foram capazes de fosforilar a tirosina 177
de Bcr-Abl (Warmuth et al., 1997). Apesar destes resultados, ainda não está claro se as
quinases Src cooperam com Bcr-Abl para a ativação da via de Ras. No entanto, a inibição da
quinase Hck parece bloquear alguns dos efeitos transformantes de Bcr-Abl (Lionberger et al.,
2000). Quanto à ligação de Hck com Bcr-Abl, foram identificadas pelo menos quatro regiões
de ligação independentes, uma em Bcr, uma entre os domínios SH2 e SH3 de Abl, uma em
SH1 e uma na região C-terminal de Abl (Stanglmaier et al., 2003). Os domínios SH2 e SH3
de Bcr-Abl interagem com Hck, levando à estimulação da atividade catalítica de Hck, que
quando ativada fosforila STAT5B na Tyr
699
, representando um passo inicial na estimulação de
STAT5B. O mutante Hck quinase-deficiente e o inibidor de Hck (PP2) bloqueiam a ativação
de STAT5 dependente de Bcr-Abl (Klejman et al., 2002).
Cada vez mais surgem na literatura, trabalhos apontando que os efeitos causados por
Bcr-Abl não dependem somente de sua atividade enzimática e que, portanto, são vistos tanto
na presença do inibidor mesilato de imatinibe, quanto de formas mutantes de Bcr-Abl
quinase-deficientes. Essa idéia foi reforçada por um trabalho que, utilizando células primárias
humanas CD34
+
expressando Bcr-Abl quinase deficiente, mostrou que a atividade quinase de
Bcr-Abl é necessária para a proliferação e sobrevivência anormais das células progenitoras da
LMC, mas que a adesão e migração anormais dessas células contam com mecanismos
independentes da atividade catalítica de Bcr-Abl (Ramaraj et al., 2004).
A análise do padrão de resistência/susceptibilidade à apoptose das linhagens
estabelecidas nesse trabalho disponibiliza dados relevantes acerca da importância do contexto
celular para os efeitos oncogênicos de Bcr-Abl. No caso das linhagens THP-1, a expressão de
Bcr-Abl não foi capaz de induzir resistência a apoptose, contrastando com o conceito bem
estabelecido e observado em células HL-60, HeLa e Jurkat, de que a expressão dessa
oncoproteína geralmente está associada à inibição da apoptose. Da mesma forma a expressão
de Bcr-Abl/KR induziu resistência à apoptose em células HeLa, mas não em células Jurkat.
Essa diferença ainda pode estar relacionada às quantidades de Bcr-Abl expressas,
considerando que as células HeLa.Bcr-Abl/KR expressam mais Bcr-Abl do que as células
Jurkat.Bcr-Abl/KR.
Algumas hipóteses foram aventadas na tentativa de explicar porque na linhagem THP-
1, a expressão de Bcr-Abl não promoveu resistência à apoptose. Uma delas especula que a
170
quantidade de Bcr-Abl expressa na população de THP-1.Bcr-Abl selecionada não seria o
suficiente para bloquear a apoptose. De fato há trabalhos na literatura que sugerem que,
enquanto baixas doses de Bcr-Abl são suficientes para tornar uma célula independente de
fatores de crescimento (IL-3) e tumorigênica, somente doses altas dessa proteína são capazes
de promover resistência à indução de morte celular por estímulos apoptogênicos (Cambier et
al., 1998). Em um trabalho publicado pelo grupo da Dra Junia Melo foi demonstrado que
alguns dos efeitos de Bcr-Abl, como alterações na adesão e na capacidade de induzir tumores,
dependem diretamente da quantidade de Bcr-Abl expressa pela célula (Barnes et al., 2005). Se
isso for verdadeiro, no nosso modelo as células THP-1 expressando quantidades maiores de
Bcr-Abl poderiam ser menos susceptíveis à apoptose do que as células controle ou células da
mesma linhagem expressando baixos níveis de Bcr-Abl. Essa explicação poderia ser testada
com o estabelecimento de outra linhagem de THP-1.Bcr-Abl expressando uma maior
quantidade de Bcr-Abl do que a linhagem estabelecida em nosso estudo. Uma segunda
hipótese é que a ação de Bcr-Abl como uma potente molécula anti-apoptótica, depende
diretamente da sua interação com outras moléculas intracelulares e que, nesse caso, não
estariam presentes em células THP-1. Bcr-Abl não é capaz de transformar fibroblastos NIH
3T3, enquanto uma variante oncogênica de Abl contendo seqüências gag miristoiladas na
porção N-terminal, consegue transformar essa linhagem (Daley et al., 1987). Recentemente
foi mostrado por Arlinghaus e colaboradores que a expressão das cadeias α e β do receptor de
IL-3 humano em NIH 3T3, tornou-as susceptíveis à transformação por Bcr-Abl e que
enquanto Bcr-Abl era capaz de ativar Stat5, a ativação de Jak2 nessa linhagem só foi atingida
quando o receptor de IL-3 foi expresso, mostrando a importância de um outro sinal no caso de
NIH 3T3 para a transformação por Bcr-Abl (Tao et al., 2007). Sabe-se que parte dos efeitos
anti-apoptóticos de Bcr-Abl são mediados pelo aumento da proteína anti-apoptótica Bcl-x
L
.
Células THP-1 já expressam níveis altos dessa molécula e a expressão de Bcr-Abl não parece
gerar um aumento da expressão dessa proteína e nem alterar a expressão de outros membros
da família Bcl-2. Como todas as linhagens aqui utilizadas são células tumorais, uma
possibilidade é que algumas das alterações que seriam causadas por Bcr-Abl e importantes
para seu efeito anti-apoptótico, já estão presentes em células THP-1 e, por isso, não é possível
observar um ganho de resistência.
Outra possibilidade proposta seria de que o bloqueio da apoptose por Bcr-Abl é
processo lento e gradual e, portanto, maior tempo de exposição das células aos efeitos de
Bcr-Abl seria necessário para o estabelecimento do fenótipo de resistência à apoptose. Para
testar essa última hipótese, as células THP-1, THP-1.vetor, THP-1.Bcr-Abl/KR e THP-1Bcr-
Abl, foram mantidas em cultura por alguns meses, após os quais foram testadas novamente
171
quanto a resposta à estímulos apoptogênicos e avaliadas quanto ao perfil de expressão de
algumas proteínas envolvidas no controle da apoptose. Apesar da maior exposição ao Bcr-
Abl, as células THP-1.Bcr-Abl continuaram com a mesma resistência à apoptose de suas
linhagens comparativas e a expressão de proteínas reguladoras da apoptose foi mantida.
Whetton e colaboradores mostraram que os efeitos de Bcr-Abl podem variar de
acordo com o tempo de exposição da célula a essa oncoproteína. Esses autores observaram
que, em células multi-potentes, a exposição de curta duração ao Bcr-Abl tem pouco efeito
sobre a diferenciação e a expressão de marcadores de diferenciação, mas após uma exposição
prolongada, as células adquirem independência de fatores de crescimento e alteram a resposta
a estímulos promotores de diferenciação para macrófagos ou granulócitos, resultando em
diferenciação anormal ou retardada (Smith et al., 2002). É importante destacar que,
aparentemente, essa diferença de efeito de Bcr-Abl sobre a resistência à apoptose, não está
relacionado com a origem das linhagens, uma vez que temos no laboratório tanto linhagens
linfóides e mielóides que ficaram mais resistentes ou permaneceram sensíveis à morte com a
expressão de Bcr-Abl. Contudo cabe aqui comentar que, até o momento, foram analisados
somente os efeitos da expressão de Bcr-Abl sobre a resistência à apoptose, mas não sobre as
demais características inerentes a transformação celular.
Os resultados obtidos com as linhagens de células HeLa indicam que a resistência à
apoptose induzida por Bcr-Abl pode ocorrer na ausência de sua atividade enzimática. Esses
resultados complementam os resultados obtidos com o mesilato de imatinibe, pois enquanto
os estudos com o inibidor mostram que a manutenção da resistência à apoptose não requer
uma atividade tirosina-quinase constante, os estudos com os mutantes quinase-deficientes são
diferentes na medida em que as células que expressam a proteína Bcr-Abl mutante, nunca
tiveram contato com a atividade enzimática dessa molécula e, portanto, não sofreram
nenhuma das alterações decorrentes dela.
Os experimentos envolvendo a exposição prolongada das células ao mesilato de
imatinibe indicam que a atividade tirosina-quinase de Bcr-Abl é importante para uma re-
estimulação dos sinais anti-apoptóticos. No entanto, quando comparamos esses dados com os
resultados obtidos com a molécula Bcr-Abl quinase-deficiente, parece que atividade
enzimática de Bcr-Abl é importante, principalmente, para a manutenção da resistência à
apoptose quando ela já esteve presente e modificou a célula de uma certa maneira que a
tornou dependente de sua ativação. Isso porque, a atividade tirosina-quinase é responsável
pela ativação de diversas vias de sinalização, sendo responsável, por exemplo, pela
independência de fatores de crescimento observada em células que expressam Bcr-Abl ativo.
Sendo assim, quando se inibe esta atividade por um tempo mais longo com o uso do mesilato
172
de imatinibe, é difícil dissociar se as células estão morrendo por que a via de sinalização anti-
apoptótica foi afetada ou se as células perderam algumas das características de transformação
celular e voltaram, por exemplo, a ser dependentes de fator de crescimento. Outro argumento
é se a dependência causada por Bcr-Abl está totalmente relacionada à sua atividade quinase,
levantando a questão se a expressão de Bcr-Abl quinase-deficiente também é capaz de induzir
certo grau de dependência. O fato das células HL-60.Bcr-Abl terem ficado dependentes da
atividade enzimática de Bcr-Abl reforça a idéia de que uma vez presente, essa proteína é
capaz de modificar totalmente uma célula.
Em conjunto, os resultados obtidos sugerem que a resistência à apoptose conferida por
Bcr-Abl possui componentes dependentes e independentes de sua atividade tirosina-quinase,
indicando o envolvimento de outros domínios da molécula no controle da morte celular.
5.2 IMPACTO DA EXPRESSÃO DE BCR-ABL NO PROTEOMA DE CÉLULAS HL-60
Além da resistência à apoptose, outras alterações fenotípicas são observadas em
células que expressam Bcr-Abl, como desregulação da proliferação, redução da dependência
de fatores de crescimento, alterações no reparo do DNA e anormalidades nas interações com
a matriz extracelular e com o estroma (Jagani et al., 2007). Com base no fato de que a maioria
das vias ativadas por Bcr-Abl transmite sinais para as maquinarias de transcrição e tradução
da célula transformada, é plausível que o fenótipo maligno de células positivas para Bcr-Abl
possa ser explicado, pelo menos em parte, por alterações no padrão de expressão protéica
global. Sabe-se que algumas das principais alterações moleculares desencadeadas por essa
tirosina-quinase não resultam de modificações na transcrição gênica, ocorrendo diretamente
no nível protéico (Unwin et al., 2005). Como exemplos dessas alterações podem ser citadas a
redução da expressão de proteínas inibitórias de c-Abl por mecanismo mediado via
proteassoma (Dai et al., 1998) e a regulação negativa de p53 por meio de alterações pós-
transcricionais, associadas à superexpressão de mdm2 induzida por Bcr-Abl (Goetz et al.,
2001).
Considerando essas possibilidades, optamos por adotar uma abordagem proteômica
para identificar proteínas cuja expressão é modificada por Bcr-Abl. Para isso, analisamos e
comparamos o padrão de expressão protéica global de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl,
focando em dois objetivos: 1) a identificação de substratos e moléculas-alvo da atividade
tirosina-quinase de Bcr-Abl e 2) a identificação de proteínas diferencialmente expressas,
como conseqüência da exposição prolongada à oncoproteína Bcr-Abl.
173
Como resultado dessa abordagem, foram obtidos os perfis de expressão de proteínas
totais e de proteínas fosforiladas em tirosina de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl
(Figuras 40 e 41). Como os dois géis de cada linhagem eram supostamente iguais, nós
esperávamos, por meio da sobreposição das imagens de proteínas totais e das proteínas
fosforiladas em tirosina, encontrar e extrair do gel corado com azul de Coomassie os “spots”
que correspondiam a proteínas fosforiladas em tirosina, para posterior identificação. Por meio
da comparação dos “spots” que representavam proteínas fosforiladas em tirosina entre as duas
linhagens, poderíamos identificar aqueles que estavam diferencialmente fosforilados e
atribuir essa diferença à expressão de Bcr-Abl. Entretanto, não foi possível realizar uma
sobreposição confiável das duas imagens. A diferença de sensibilidade dos dois métodos de
detecção de proteínas (azul de Coomassie e Western-blot) resultou em pequenas diferenças
no padrão de distribuição dos “spots” (Figuras 40 e 41). Como conseqüência da maior
sensibilidade da marcação com o anticorpo anti-fosfotirosina, alguns “spots” só foram
detectados com esse método. Além disso, heterogeneidades sutis nos géis de poliacrilamida
também causaram diferenças no padrão de distribuição dos “spots” que, embora pequenas,
foram suficientes para inviabilizar a comparação das imagens.
Optamos então por nos concentrar na comparação do perfil de expressão global de
proteínas das linhagens HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl. De maneira geral, a análise
comparativa da expressão protéica mostrou que a expressão de Bcr-Abl é capaz de alterar os
níveis de expressão de proteínas envolvidas em uma grande variedade de processos celulares.
Entre as proteínas diferencialmente expressas, encontramos chaperonas e moléculas
envolvidas na resposta a estresse, proteínas estruturais, moléculas relacionadas à adesão e à
mobilidade celular, ao metabolismo energético, ao processamento de RNA e controle da
transcrição e tradução. Identificamos ainda proteínas associadas à transdução de sinais,
transporte de substâncias, crescimento, proliferação e até mesmo morte celular (Tabelas 1, 2,
3 e 4). A associação de Bcr-Abl com a expressão diferencial de algumas dessas proteínas
corrobora outros estudos, reforçando a idéia de que essa quinase pode afetar o funcionamento
celular por meio de uma ampla gama de alterações. Outras proteínas que identificamos,
contudo, ainda não foram estudadas a fundo; a investigação das vias em que estão envolvidas
pode ser um caminho promissor para entender como Bcr-Abl promove a transformação
celular.
A seguir, discutimos como algumas das proteínas que foram detectadas como
diferencialmente expressas entre as duas linhagens podem estar relacionadas à transformação
celular.
174
Proteínas de citoesqueleto - aspectos gerais
Microfilamentos de actina, filamentos intermediários e microtúbulos são os principais
componentes do citoesqueleto de células eucarióticas e formam uma rede estrutural que
interconecta as membranas celulares, as organelas citoplasmáticas e o núcleo (Leung et al.,
1992). Essas proteínas estão envolvidas na regulação de diversos processos, como
manutenção da morfologia, mobilidade celular, fagocitose, transporte intracelular, localização
das organelas, e formação do fuso mitótico durante a divisão celular. Adicionalmente, o
citoesqueleto também desempenha um papel importante no processo de crescimento e
diferenciação, e pode estar envolvido na regulação da transdução de sinais. As diversas
proteínas que compõem o citoesqueleto incluem: actina em microfilamentos, tubulina em
microtúbulos, e um grupo heterogêneo de proteínas de filamentos intermediários que estão
associadas aos diferentes tipos celulares (queratina nas células epiteliais, vimentina em
fiblosblastos, desmina em células musculares, proteína glial em células da glia e
neurofilamento no tecido nervoso).
Em células HL-60, a expressão de Bcr-Abl parece ter modificado o balanço entre os
diferentes componentes do citoesqueleto celular. Comparada às células HL-60.vetor, células
HL-60.Bcr-Abl apresentam um aumento na expressão de vimentina, tubulina e citoqueratina,
enquanto que apresentam uma diminuição da expressão de actina e lamina-B2. Dos três
“spots” identificados como vimentina, dois estavam aumentados em HL-60.Bcr-Abl e um era
exclusivo dessa linhagem. Também as citoqueratinas K8 e K18 foram identificadas em
“spots” exclusivos de HL-60.Bcr-Abl. Essas observações são de especial importância, se
considerarmos que as alterações das propriedades de adesão e mobilidade de células
leucêmicas derivadas de LMC têm sido associadas ao seu escape prematuro da medula óssea e
à perda da regulação pelo microambiente da medula (Unwin et al., 2005). Além disso,
modificações nessa rede de proteínas têm conseqüências no controle do crescimento, invasão
e metástase de tumores (Bernal e Stahel, 1985). É possível concluir, portanto, que a
transformação celular mediada por Bcr-Abl provavelmente causa alterações significativas no
citoesqueleto.
Vimentina
O aumento da expressão da vimentina induzida por Bcr-Abl também foi observado em
um estudo proteômico que comparou os efeitos de 6 tirosina-quinases no proteoma de células
BaF3 (Pierce et al., 2007). A vimentina é um dos principais componentes do citoesqueleto de
leucócitos, possuindo um papel fundamental tanto na adesão ao endotélio vascular como na
175
migração dessas células através dele (Nieminen et al., 2006). Além disso, a vimentina interage
com várias moléculas envolvidas na transdução de sinais, como Raf1, PKC e 14-3-3 (Janosch
et al., 2000; Tzivion et al., 2000; Ivaska et al., 2005) e regula as funções de integrinas
(Brakebusch e Fassler, 2003; Nieminen et al., 2006). A clivagem de vimentina por caspases
representa um evento-chave durante a apoptose, contribuindo para as alterações morfológicas
características desse processo (Byun et al., 2001). Outra possível função da vimentina é como
regulador de transcrição, visto que essa proteína é capaz de interagir e seqüestrar fatores que
interferem na transcrição gênica, tais como p53 e menina (Ivaska et al., 2007). A habilidade
de se ligar à p53 também levanta suspeitas sobre um possível efeito de vimentina na regulação
da morte e sobrevivência celular. Em pacientes com Leucemia Linfocítica Crônica (LLC),
foram observadas anormalidades na mobilidade dos linfócitos relacionadas à alterações na
expressão e no arranjo dos filamentos de vimentina (Stark et al., 1984). Posteriormente, a alta
expressão de vimentina em LLC também foi associada à progressão da doença e a uma maior
rigidez linfocítica, sugerindo que as células leucêmicas com maior expressão de vimentina
seriam menos susceptíveis à ruptura, e, conseqüentemente, estariam associadas a um pior
prognóstico (Nowakowski et al., 2007). Além disso, sabe-se que as funções da vimentina
podem ser reguladas por meio de alterações no seu estado de fosforilação (Ivaska et al., 2007).
Dado o número de processos biológicos dos quais os filamentos de vimentina participam e sua
susceptibilidade à regulação por quinases, podemos imaginar que parte das alterações que
Bcr-Abl promove na sinalização intracelular podem efetivamente estar associadas ao aumento
da expressão de vimentina.
Citoqueratinas
De maneira semelhante à vimentina, também a expressão de citoqueratina foi
incrementada em células HL-60.Bcr-Abl. As citoqueratinas (K), são proteínas de filamentos
intermediários de células epiteliais e constituem a maior família de proteínas do citoesqueleto
(K1-K22). Embora sejam típicas de epitélios, essas proteínas são expressas em outros tecidos
e parecem modular o comportamento celular durante o desenvolvimento. Em trofoblastos, por
exemplo, contribuem para a mobilidade celular (Lane et al., 1983); em células tumorais
derivadas de vários epitélios, a persistência das queratinas K8 e K18 é uma marca associada à
inúmeras características de células cancerosas, incluindo a habilidade de invasão (Hendrix et
al., 1996; Galarneau et al., 2007). K8 e K18 já foram observadas em amostras de medula
óssea, linfonodos, células de sangue periférico e linhagens celulares leucêmicas, inclusive a
HL-60 (Traweek et al., 1993). Células K562, que possuem Bcr-Abl, expressam citoqueratina
K8 e K18 e a exposição dessas células a indutores de diferenciação eritrocítica, reduz
176
drasticamente a expressão dessas proteínas, mostrando o impacto da diferenciação celular
sobre a expressão dos filamentos intermediários. Com base nesses resultados, Jarvinen e
colaboradores sugerem que a presença dessas queratinas em células K562, talvez represente
uma diferenciação anormal ou retrodiferenciação na direção de células mesenquimais
embrionárias (Jarvinen et al., 1990). A linhagem K562 é derivada de um paciente com LMC
na crise blástica, uma fase que tem como característica justamente a perda da capacidade de
diferenciação. Portanto, o aumento na expressão dessas proteínas associado à Bcr-Abl,
conforme observado em células HL-60.Bcr-Abl, sugere que K8 e K18 possam contribuir para
o bloqueio da diferenciação observado nas células leucêmicas na fase blástica.
Além da função estrutural, existem evidências de que as queratinas K8 e K18 exercem
também funções não mecânicas. Filamentos intermediários de queratina têm um papel
importante na adesão celular e nas interações entre células, atuando nas associações com
desmossomos e hemidemossomos (Ivaska et al., 2007). Hepatócitos nocauteados para K8 se
aderem de maneira mais rápida, mas se espalham mais lentamente sobre a fibronectina e
exibem uma transição G1/S mais eficiente do que os que possuem essa proteína (Galarneau et
al., 2007). Além disso, hepatócitos que não expressam K8 e K18 são mais sensíveis à
apoptose induzida por Fas e apresentam uma densidade aumentada de Fas na superfície
celular e alterações na via de regulação da sinalização anti-apoptótica de Erk1/2 (Gilbert et al.,
2001). Células L fibroblásticas transfectadas com K8 e K18 apresentam uma maior resistência
a agentes quimioterápicos (Bauman et al., 1994), e a perturbação na expressão dessas
queratinas aumenta a sensibilidade à indução de morte (Caulin et al., 2000). Essas evidências
sugerem que, assim como Bcr-Abl, também K8 e K18 possuem ação anti-apoptótica. É
possível, portanto, levantar a hipótese de que a maior expressão das citoqueratinas K8 e K18
observada nas células HL-60.Bcr-Abl, contribui para os efeitos de Bcr-Abl sobre a resistência
à apoptose.
Arp3
Unwin e colaboradores observaram que a presença de Bcr-Abl em células BaF3
alterou a expressão de 32 proteínas, dentre as quais várias relacionadas ao citoesqueleto,
incluindo a diminuição dos níveis de gelsolina, “adseverin” e Arp2 (“actin-related protein 2”)
(Unwin et al., 2005). Gelsolina e “adseverin” são proteínas intimamente relacionadas com
agregação e desagregação dos filamentos de actina e, portanto, estão envolvidas na
mobilidade celular. Arp2 é parte do complexo Arp2/3 que está associado à formação de novos
filamentos de actina (Mullins et al., 1998). Embora não tenhamos identificado
especificamente nenhuma dessas três proteínas, também observamos alterações na expressão
177
de moléculas envolvidas no citoesqueleto, incluindo a diminuição da expressão de actina
(Tabela 3). Um dos “spots” que está diminuído em células HL-60.Bcr-Abl é Arp3 que, como
mencionado acima, forma complexo com Arp2 e está associada à formação de filamentos de
actina (Machesky e Gould, 1999). A diminuição da expressão de Arp3 em células HL-60.Bcr-
Abl pode estar associada à redução dos níveis de actina e às alterações na mobilidade celular.
As diferenças entre as proteínas identificadas neste estudo e no de Unwin e colaboradores,
podem estar vinculadas à linhagem celular estudada, às diferenças no tamanho e faixa de pH
das tiras utilizadas ou no método de detecção de proteínas adotado (usamos azul de
Coomassie, enquanto Unwin e colaboradores utilizaram marcação com prata).
14-3-3 épsilon
Observamos também que células HL-60.Bcr-Abl expressam quantidades maiores de
14-3-3 épsilon do que células HL-60.vetor (Tabela 1; Figura 51). O aumento da expressão
dessa proteína também foi observado em células BaF3 com Bcr-Abl (Unwin et al., 2005). Os
membros da família 14-3-3 são moléculas citoplasmáticas capazes de formar homo e hetero-
dímeros e de interagir com outras proteínas, controlando diversos processos celulares por
seqüestrarem proteínas no citosol. As proteínas 14-3-3 podem se associar e serem fosforiladas
por Bcr-Abl, estando envolvidas na regulação da progressão do ciclo celular, apoptose e
transdução de sinais. Algumas evidências sugerem que essas proteínas podem interagir com
Raf-1 e auxiliar na via de Ras, uma via de sinalização ativada por Bcr-Abl. Podem também
inibir a morte celular, interagindo diretamente com reguladores da apoptose, como Bad e Bax,
ou pela regulação das cascatas que envolvem MAP quinases (Nomura et al., 2003).
Inibidores da dissociação de Rho-GDI
Unwin e colaboradores observaram que a expressão de Bcr-Abl promove a
desfosforilação do inibidor 1 da dissociação de Rho-GDI (Rho-GDI1, GDIR) (Unwin et al.,
2005); embora não tenhamos informação sobre o status de fosforilação dessa proteína,
observamos a diminuição de sua expressão, bem como de Rho GDI2, em células HL-60.Bcr-
Abl (Tabelas 3 e 4; Figuras 53 e 54). As proteínas Rho GDI regulam a reação de troca de
GDP/GTP de proteínas Rho, inibindo a dissociação do GDP dessas proteínas e impedindo,
conseqüentemente, a sua ligação com GTP (Dovas e Couchman, 2005). Portanto, a associação
de Rho GDI com proteínas Rho é capaz de mantê-las em uma forma citosólica inativa. A
expressão de Bcr-Abl em células BaF3 promove a ativação constitutiva de Rho GTPase e a
sinalização de Rho é importante para os efeitos celulares de Bcr-Abl, desempenhando um
178
papel fundamental no crescimento e desenvolvimento de leucemias (Unwin et al., 2005).
Dessa forma, a menor expressão de Rho GDI1 e Rho GDI2 em células HL-60.Bcr-Abl,
observada neste estudo, pode ser uma evidência da perda da atividade inibitória de Rho GDI,
o que possivelmente contribui para a ativação da via de Rho nessa linhagem celular.
Fosfoproteína-1 induzida por estresse
Nossos resultados mostram o aumento da expressão de Hop associado à expressão de
Bcr-Abl. A proteína Hop (“Hsp70/Hsp90 organizing protein”), também conhecida como
fosfoproteína-1 induzida por estresse (STIP1) é uma proteína adaptadora co-chaperona que
pode se ligar a Hsp70 e Hsp90 simultaneamente, regulando as funções dessas proteínas.
Hsp90 é uma molécula modulada positivamente por Bcr-Abl, tendo sido identificada como
um potencial alvo terapêutico em LMC, uma vez que se liga e protege Bcr-Abl da degradação
pelo proteassoma (Blagosklonny et al., 2001; George et al., 2005). A proteína Hsp70, por sua
vez, foi descrita como uma molécula com funções anti-apoptóticas, capaz de proteger da
indução de morte tanto pela via intrínseca como pela via extrínseca (Ray et al., 2004). Com
base no aumento da expressão dessa chaperona em células que expressam Bcr-Abl e são
resistentes ao mesilato de imatinibe, foi sugerido um possível papel de Hsp70 no
desenvolvimento de resistência a esse inibidor de tirosina-quinase (Pocaly et al., 2007). É
plausível elaborar a hipótese, portanto, de que o aumento da expressão de Hop na linhagem
HL-60.Bcr-Abl poderia auxiliar na estabilização do complexo formado com Hsp70 e Hsp90;
isso poderia favorecer os efeitos anti-apoptóticos de Hsp70 e aumentar a proteção de Bcr-Abl
contra a degradação pelo proteassoma.
Canais de cloreto intracelulares
Nossos dados trazem também a possibilidade de que as alterações celulares mediadas
por Bcr-Abl estejam relacionadas ao transporte de íons, pois observamos aumento na
expressão de CLIC1 (Tabela 1; Figura 51). Os membros da família CLIC de canais iônicos
(“chloride intracellular channels”) podem existir na forma solúvel ou ligados à membrana
plasmática ou de organelas (Cromer et al., 2002). O transporte de íons, como o cloreto, para
formar e manter gradientes eletroquímicos, é um elemento importante da regulação das
atividades celulares. Esse transporte, que é promovido por canais protéicos como o CLIC1,
determina o potencial de membrana, mantém o pH intracelular e regula o volume da célula.
Dessa forma, os canais intracelulares de cloreto contribuem para a regulação do ciclo celular,
179
apoptose, adesão e mobilidade celular (Jentsch et al., 2002; Suh e Yuspa, 2005). Não é
surpreendente, portanto, que já tenha sido documentada a associação de canais CLIC e o
câncer: foi observado, por exemplo, que CLIC1 está aumentado em cânceres de estômago e
que sua expressão está fortemente correlacionada com metástase no linfonodo, invasão
linfática e o estágio patológico; a associação de CLIC1 a esses casos é tão clara que essa
proteína já foi sugerida como um potencial marcador de prognóstico para esse tipo de câncer
(Chen et al., 2007). As funções celulares de CLIC1 ainda não são bem conhecidas, mas
trabalhos sugerem o seu envolvimento na regulação do ciclo celular (Valenzuela et al., 2000).
É possível, portanto, que algumas das alterações celulares mediadas por Bcr-Abl propaguem-
se por vias em que haja a participação de canais de cloreto como o CLIC1. Todavia, estudos
mais detalhados são necessários para esclarecer exatamente como se dá essa participação.
Ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas
Bcr-Abl parece também alterar vias relacionadas às ribonucleoproteínas nucleares
heterogêneas (hnRNPs), a julgar por nossos resultados que apontam para um incremento na
expressão de hnRNPK na linhagem HL-60.Bcr-Abl (Tabela 1). As ribonucleoproteínas
nucleares heterogêneas são proteínas que se ligam ao RNAm ainda no núcleo, influenciando o
metabolismo e transporte desses ácidos nucléicos; trata-se de proteínas indutoras de
transcrição e reguladoras da tradução. Altos níveis de hnRNPs têm sido associados com
progressão de tumores e resistência a indução de apoptose por quimioterapia em várias
neoplasias (Mandal et al., 2001). Notari e colaboradores, por exemplo, mostraram que a
presença de Bcr-Abl aumenta a expressão e a atividade de hnRNPK em linhagens
transfectadas e em células primárias CD34
+
de pacientes com LMC na crise blástica. Esse
aumento de hnRNPK mediado por Bcr-Abl ocorre de maneira dose e quinase-dependente, por
meio da ativação da via de MAPK (Erk1/2) (Notari et al., 2006). Nesse trabalho, os autores
mostraram ainda que a inibição de hnRNPK ou de sua atividade reguladora da tradução
bloqueia o potencial proliferativo independente de citocinas, o potencial clonogênico e a
atividade leucemogênica in vivo de células positivas para Bcr-Abl. Tal fenômeno está
relacionado com a diminuição da tradução do RNA de myc (Notari et al., 2006). Esses
achados são consistentes com a interpretação de que, nas células HL-60.Bcr-Abl que
estudamos, o aumento de hnRNPK contribui para os efeitos leucemogênicos dessa tirosina-
quinase.
“Gluthatione S-transferase P”
180
Nossos resultados mostram uma associação entre a presença de Bcr-Abl e o aumento
na expressão de “Glutathione S-transferase P”(GST). Trata-se de uma enzima citossólica
envolvida na desintoxicação celular, expressa em um grande número de tecidos, incluindo
placenta, mama, intestino e bexiga urinária. Essa enzima, e outras da mesma família,
participam da remoção de produtos do estresse oxidativo, modulam a proliferação celular e as
vias de sinalização apoptótica (Zhao et al., 2006). A superexpressão de GSTP1 tem sido
associada ao processo de carcinogênese e ao desenvolvimento de diversos tipos de tumores
humanos, sendo que, geralmente, a sua expressão está inversamente correlacionada com o
prognóstico e com a sobrevivência dos pacientes. Além disso, essa proteína também parece
estar envolvida na aquisição de resistência a drogas anti-tumorais; sua superexpressão foi
observada em linhagens de câncer gástrico, e pode estar associada a um aumento do potencial
metastático e invasivo induzido por TGF-β1 (Wang et al., 2007). GSTP1 aparentemente
exerce sua função anti-apoptótica inibindo a ativação de MEKK1 em resposta a agentes
genotóxicos, como o etoposídeo (Zhao et al., 2006). É de especial importância o fato de que o
aumento na expressão de GSTP1 já foi relacionado antes de nosso estudo a doenças
mieloproliferativas (Wrobel et al., 2004), envolvendo inclusive a associação com Bcr-Abl, em
células de pacientes com diferentes condições clínicas (Marche-Cova et al., 2000). O aumento
de GSTP1 mediado por Bcr-Abl provavelmente está relacionado aos efeitos anti-apoptóticos
dessa tirosina-quinase, uma vez que foi observado que inibidores de GST têm atividade pró-
apoptótica sobre algumas células tumorais, incluindo a linhagem K562 (Turella et al., 2005).
Peroxiredoxinas
Peroxiredoxinas (PRDXs), que representam uma família de peroxidases anti-oxidantes
dependentes de tioredoxina, também apareceram expressas em quantidade relativamente
maior nas células HL-60.BcrAbl. PRDXs eliminam peróxidos gerados durante o metabolismo
celular, protegendo contra estresse oxidativo, modulando a sinalização intracelular mediada
por peróxido de hidrogênio e regulando a proliferação (Immenschuh e Baumgart-Vogt, 2005).
PRDX1 e PRDX2 estão superexpressas em tumores de mama e podem ser importantes
inibidores da morte celular durante a resposta ao estresse oxidativo (Bae et al., 2007). Da
mesma forma, PRDX2 protege linhagens de câncer de cabeça e pescoço da indução de morte
por radiação gama (Park et al., 2000), bem como células de câncer gástrico da morte induzida
por cisplatina (Yo et al., 2002). PRDX4, que é expressa em diversas linhagens celulares
humanas (incluindo as leucêmicas HL-60, K562 e MOLT-4), está envolvida na regulação da
ativação do fator de transcrição NFκB por peróxido de hidrogênio
(Jin et al., 1997). Essas
181
evidências são congruentes com a expressão aumentada de PRDXs na linhagem HL-
60.BcrAbl, pois PRDX2 e PRDX4, por exemplo, poderiam também estar contribuindo para os
efeitos de Bcr-Abl sobre as vias de sinalização e bloqueio da morte celular. Alguns trabalhos
sugerem que Bcr-Abl também poderia regular outras peroxiredoxinas, como PRDX1 e
PRDX3. Li e colaboradores mostraram que c-Abl exerce um efeito negativo sobre a indução
de PRDX1, uma proteína antioxidante com atividade supressora de tumor (Li, 2005). Por
outro lado, o tratamento com mesilato de imatinibe promove o aumento na expressão de
PRDX3, indicando que Bcr-Abl pode ter efeitos contrários sobre as diferentes
peroxiredoxinas (Griffiths et al., 2007). Outra interpretação, contudo, também é possível:
como a presença de Bcr-Abl está associada ao aumento da quantidade de ROS intracelular
(Sattler et al., 2000), os altos níveis de expressão de PRDXs podem ser uma resposta ao
estresse oxidativo, sendo mais uma reação aos efeitos de Bcr-Abl que propriamente parte da
via de transformação celular.
SET
A proteína SET é um inibidor de PP2A (proteína fosfatase 2A, “protein phosphatase
2A”), uma serina/treonina-fosfatase que regula proliferação, sobrevivência e diferenciação
celular e cuja perda de função tem sido associada à transformação celular em muitos sistemas.
Nossos resultados indicam um aumento na expressão dessa proteína associado a Bcr-Abl, o
que já foi detectado por outros estudos. A inativação de PP2A é mediada pela proteína SET,
que tem sua expressão induzida por Bcr-Abl de maneira dose e quinase dependente, o que foi
observado em linhagens positivas para Bcr-Abl e em células CD34
+
de pacientes com LMC
nas fases crônica e blástica (Neviani et al., 2005). A expressão de SET aumenta
progressivamente durante a transição para a fase blástica e, como resultado desse aumento,
ocorre a perda progressiva da atividade supressora de tumor de PP2A. A importância da
regulação negativa de PP2A para os efeitos transformantes de Bcr-Abl foi reafirmada por
estudos em que se observou que a reativação de PP2A suprimiu o crescimento, aumentou a
apoptose e bloqueou o potencial clonogênico e leucemogênico de células que expressam Bcr-
Abl (Neviani et al., 2005; Perrotti e Neviani, 2006). Isso parece estar associado à indução de
desfosforilação e degradação de Bcr-Abl por PP2A, a qual ocorre de maneira dependente da
ação de SHP-1, uma tirosina fosfatase (Perrotti e Neviani, 2006).
O aumento da atividade de PP2A, induzida pelo tratamento com mesilato de imatinibe
ou redução da expressão de SET, diminuiu os níveis de Rb hiperfosforilado e suprimiu a
expressão de Myc e a fosforilação de STAT5, ERK1/2, Akt, Bad e Jak2, sem afetar a
182
expressão dessas proteínas (Neviani et al., 2005). Esses resultados mostram que vários dos
alvos de Bcr-Abl são compartilhados com PP2A e, dada a importância desses alvos para os
efeitos de Bcr-Abl, pode-se considerar que a inativação de PP2A é uma das principais
estratégias de Bcr-Abl para prevenir a inativação dos sinais mitóticos e de sobrevivência.
Sendo assim, a maior expressão de SET observada nas células HL-60.Bcr-Abl está, portanto,
de acordo com o que já se sabe sobre essas proteínas; nesse caso, restam poucas dúvidas de
que SET contribui para os efeitos transformantes de Bcr-Abl e para seu potencial anti-
apoptótico.
Proteína de choque térmico beta-1
A linhagem HL-60.Bcr-Abl apresentou também níveis aumentados da proteína de
choque térmico beta-1 (HSPB1 ou Hsp27) em comparação à HL-60.vetor. Essa proteína está
envolvida na resposta celular a situações de estresse e na organização do citoesqueleto de
actina. Em células normais, é expressa em baixos níveis, mas a exposição a estresses
fisiológicos e ambientais promove o seu acúmulo rapidamente; em células tumorais,
entretanto, ela é expressa em altos níveis mesmo na ausência de estímulos de estresse. A alta
expressão dessa proteína está associada a piores prognósticos em alguns tipos de câncer, o que
está relacionado principalmente à proteção que essa proteína confere contra drogas anti-
tumorais (Ciocca e Calderwood, 2005). Os trabalhos da literatura sugerem que Hsp27
desempenha dois papéis principais durante o estresse: 1) a manutenção do funcionamento
normal das células, por meio da sua interação com proteínas do citoesqueleto (ex: actina e
tubulina) e da facilitação do reparo ou remoção de proteínas danificadas e 2) a prevenção da
apoptose, tanto por ligar-se e seqüestrar citocromo c e pró-caspase-3, quanto regular o
conteúdo intracelular de espécies reativas de oxigênio (Concannon et al., 2003). Hsp27 parece
desempenhar um papel crucial na regulação do balanço entre morte e sobrevivência celular,
onde a sua superexpressão está associada com a supressão da apoptose, aumento da
citoproteção e resistência a tratamentos (Kamada et al., 2007).
A hipótese de que o incremento na expressão de Hsp27 induzido por Bcr-Abl contribui
para a resistência à apoptose em células HL-60.Bcr-Abl, torna-se bastante plausível se
considerarmos o que se sabe sobre essa proteína. Hsp27 bloqueia a via de sinalização
apoptótica em diversos pontos, incluindo inibição da formação do apoptossomo e,
conseqüentemente, da ativação de caspases pelo seqüestro de citocromo c no citosol (Bruey et
al., 2000), prevenção da ativação de Bid dependente de caspase-8, bloqueio da ativação de
caspase-3 pela interação com pró-caspase-3, além de proteger da apoptose induzida por
183
radiação, por meio da supressão da produção de espécies reativas de oxigênio, a qual é
mediada por proteína quinase C (PKC). Adicionalmente, Hsp27 modula a via de p53,
protegendo da indução de senescência (O'callaghan-Sunol et al., 2007), e regula a ativação de
Akt, promovendo a sobrevivência celular (Wu et al., 2007). Apesar de Hsp27 não prevenir a
ativação de caspase por granzima B, sua expressão protege da indução de apoptose por uma
variedade de estímulos, incluindo ΤNF-α, FasL, estresse oxidativo, estaurosporina e drogas
citotóxicas (Bruey et al., 2000; Concannon et al., 2003). O aumento da expressão de Hsp27
tem ainda efeito positivo sobre a degradação de I-κBα e, conseqüentemente, sobre a ativação
de NF-κB (Parcellier et al., 2003). Essas informações deixam claro que há efeitos celulares
compartilhados entre a expressão de Bcr-Abl em células leucêmicas e a superexpressão de
Hsp27 em diversos tipos de tumores. Nossos resultados indicam, portanto, que Hsp27 pode
ser uma molécula-chave das vias afetadas por Bcr-Abl durante a transformação celular.
Considerações finais
Nossos resultados são compatíveis com a interpretação de que Bcr-Abl promove
alterações em múltiplas funções celulares; a relação de proteínas discutidas acima não é e nem
pretende ser exaustiva. O caráter exploratório deste estudo não permite extrair conclusões
definitivas a respeito da exata influência de Bcr-Abl sobre cada proteína identificada como
diferencialmente expressa e nem a contribuição de cada uma para a transformação celular. Em
vez disso, ele procura apontar alterações de caráter geral causadas por Bcr-Abl e busca indicar
vias possivelmente alteradas e que podem ser estudadas mais detalhadamente. Além disso, as
proteínas identificadas neste trabalho podem contribuir tanto para o entendimento dos
mecanismo moleculares envolvidos nos efeitos celulares de Bcr-Abl, quanto para a
identificação de novos marcadores de prognóstico e alvos terapêuticos.
CONCLUSÕES
185
6 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos com a inibição farmacológica da atividade enzimática de Bcr-
Abl sugerem que a resistência à apoptose induzida por essa tirosina-quinase não depende da
manutenção constante dessa atividade, tampouco da presença momentânea de proteínas
fosforiladas em resíduos de tirosina. Isto significa que não é a atividade enzimática per se a
responsável pela inativação ou bloqueio da maquinaria apoptótica que se observa em células
positivas para Bcr-Abl, mas sim algum(ns) evento(s) secundário(s) ao aparecimento desta
atividade. Por outro lado, os resultados observados com as novas linhagens celulares
expressando ectopicamente a forma mutada, quinase-deficiente de Bcr-Abl apontam para a
existência de uma sinalização independente desta atividade, a qual contribui parcialmente para
o fenótipo de resistência à apoptose.
Portanto, a resistência à apoptose observada em células Bcr-Abl-positivas é obra de
uma somatória de fatores, dependentes e independentes da atividade tirosina-quinase dessa
oncoproteína. Além disso, esta resistência é sujeita à presença de eventos/modificações
secundárias à expressão de Bcr-Abl. Porém, a atividade tirosina-quinase dessa oncoproteína
parece ser importante para a sobrevivência celular a longo prazo, uma vez que as células
tratadas cronicamente com o inibidor farmacológico morrem. Neste sentido, podemos dizer
que a expressão de Bcr-Abl induz uma “dependência” à sua atividade enzimática. É
importante destacar que a análise da expressão de proteínas reguladoras do processo
apoptótico sugere que a manutenção da resistência à morte na ausência da atividade tirosina-
quinase de Bcr-Abl não está associada à expressão de nenhuma das moléculas analisadas,
incluindo as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-x
L
.
A comparação do proteoma de células HL-60.vetor e HL-60.Bcr-Abl revelou que a
presença de Bcr-Abl é capaz de alterar profundamente o padrão de expressão de proteínas
envolvidas em diversos processos celulares. Entre as proteínas diferencialmente expressas,
encontramos chaperonas, proteínas envolvidas na resposta a estresse, proteínas estruturais,
proteínas relacionadas à adesão e à mobilidade celular, ao metabolismo energético, ao
processamento de RNA e ao controle da transcrição e tradução. Identificamos ainda proteínas
associadas à transdução de sinais, transporte de substâncias, crescimento, proliferação e até
mesmo à morte celular. Consultando a literatura, constatamos que algumas dessas proteínas já
foram associadas à presença de Bcr-Abl, enquanto outras sabidamente estão envolvidas na
fisiopatologia de outras neoplasias. Os achados deste trabalho ampliam o conhecimento sobre
as moléculas-alvo de Bcr-Abl e trazem novas possibilidades de vias de atuação envolvidas na
transformação celular mediada por essa molécula. Dessa forma, as proteínas identificadas
neste trabalho podem contribuir tanto para o entendimento dos mecanismos moleculares
envolvidos na transformação por Bcr-Abl, quanto para a identificação de novos marcadores de
prognóstico e alvos terapêuticos.
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ANEXOS
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