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Fundação Universidade Federal do Rio Grande
Programa de Pós-graduação em Aqüicultura
CARACTERIZAÇÃO DO POTENCIAL DE
ABSORÇÃO DO DIÓXIDO DE CARBONO
ATMOSFÉRICO POR MICROALGAS
UTILIZADAS NA AQÜICULTURA PARA A
GERAÇÃO DE UM MECANISMO DE
DESENVOLVIMENTO LIMPO (MDL).
Autor: Lucélia do Valle Borges
Orientador: Prof. Paulo César Abreu
Co-orientadora: Prof. ª Clarisse Odebrecht
Rio Grande - RS.
Março, 2005.
Dissertação apresentada
como parte dos requisitos
para obtenção do grau de
mestre em Aqüicultura no
Programa de Pós Graduação
em Aqüicultura da Fundação
Universidade Federal do
Rio Grande.
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ÍNDICE
RESUMO ............................................................................................................
VI
ABSTRACT .........................................................................................................
VII
INTRODUÇÃO .....................................................................................................
9
OBJETIVOS ........................................................................................................
13
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................
13
- Crescimento ...................................................................................................... 15
- Produção primária ........................................................................................... 16
Método do Oxigênio ........................................................................................ 17
Método do
14
Carbono .......................................................................................
18
Quociente fotossintético ....................................................................................
19
- Lipídios Totais e produção de biodiesel ............................................................ 20
- Analises estatísticas ........................................................................................... 20
RESULTADOS ....................................................................................................
21
- Descrição das espécies ......................................................................................
21
- Crescimento ...................................................................................................... 25
- Produção primária ............................................................................................. 27
Método do Oxigênio ......................................................................................... 27
Método do
14
Carbono ....................................................................................... 30
Quociente fotossintético ................................................................................... 40
- Lipídios Totais e produção de biodiesel ........................................................... 41
DISCUSSÃO ....................................................................................................... 42
- Crescimento .................................................................................................... 42
- Produção primária ............................................................................................ 43
Medidas de produção primária por variação no oxigênio dissolvido ............ 44
Método de produção primária pelo método
14
Carbono................................... 47
Quociente fotossintético .................................................................................. 48
- Potencialidade das espécies para cultivo em larga escala: .............................. 49
- Potencial para a produção de Biodiesel pelas espécies que apresentaram
maiores valores de Produção Primária: ...............................................................
51
CONCLUSÕES .................................................................................................. 52
- Perspectivas futuras........................................................................................... 52
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Literatura Citada .................................................................................................
53
Anexo ....................................................................................................................
58
RESUMO:
O aumento das concentrações de CO
2
na atmosfera nos últimos anos tem gerado
uma intensificação no efeito estufa. Devido as altas taxas de fixação de carbono pelas
microalgas, o cultivo em larga escala e em condições semi-controladas destes
microorganismos surge como uma alternativa para reduzir os níveis de CO
2
atmosféricos. Na aqüicultura o alto custo de produção dos cultivos de microalgas afeta a
rentabilidade da produção de organismos cultivados. Para aumentar o rendimento e
reduzir os custos são necessárias pesquisas que resultem na utilização de espécies de
microalgas mais produtivas. O objetivo deste trabalho foi determinar quais as espécies
de microalgas fitoplanctônicas utilizadas na aqüicultura, que apresentam as maiores
taxas de absorção de CO
2
, têm algum valor comercial e que possam ser cultivadas em
larga escala. Os experimentos foram realizados com as espécies Nannochloropsis
oculata (Droop) Hibberd, 1955), Chaetoceros affinis Lauder, 1864, C. muelleri
Lemmermann, 1898, Phaeodactilum tricornutum Bohlin, 1897, Skeletonema costatum
(Greville) Cleve, 1873, Thalassiosira fluviatilis Hustedt, 1926, T. pseudonana (Husted)
Hasle & Heimdal, 1970), Tetraselmis chuii Butcher, 1958, T. tetrathele (G.S. West)
Butcher 1959 e Isochrysis galbana Parke, 1949 .As espécies foram mantidas em meio
f/2, temperatura constante (ótima para cada espécie), luminosidade média de 100
µmol/m-2/s
-1
e fotoperíodo de 12L/12E. Medidas de produtividade primária em
diferentes intensidades luminosas, pelo método do oxigênio e do
14
C (produção
dissolvida, particulada e total), foram realizadas com amostras de cultivo que estavam
na fase logarítmica. Também foram determinados o Quociente Fotossintético (QF) e a
fração lipídica das algas mais produtivas. N. oculata, S. costatum e C. muelleri foram as
espécies que atingiram maior rendimento do crescimento celular, enquanto que C.
affinis foi a espécie de menor taxa de crescimento. N. oculata e I. galbana foram as
espécies mais produtivas, em termos de produção de O
2
, e N. oculata e T. fluviatilis
obtiveram os maiores valores de produção de carbono. A maioria das espécies
apresentaram valores de QF superiores a 1,0. De acordo com os resultados de
crescimento e produção primária, quatro espécies apresentaram maior potencial para
produção em larga escala: N. oculata, S. costatum, T. fluviatilis e I. galbana. Por
apresentarem maior crescimento em menor luminosidade N. oculata e S. costatum
poderiam ser cultivadas em períodos de menor luminosidade, enquanto que T. fluviatilis
e I. galbana, espécies adaptadas à luz, poderiam ser cultivada na primavera/verão. Além
disso, os resultados mostram que N. oculata produz grande quantidade de lipídeos e
ácidos graxos, indicando uma grande capacidade para a produção de bio-combustíveis.
ABSTRACT:
The increase in atmospheric CO
2
concentration in the last years has intensified
the "greenhouse effect". Due to their high carbon fixation rates, the large-scale
cultivation of microalgae, under semi-controlled conditions, appears as an alternative to
diminish the CO
2
levels in the atmosphere. High costs of microalgae production affects
the aquaculture profitability. To increase the production yield and reduce costs new
research is necessary to find more productive microalgae species. The main objective of
this study was to determine which phytoplankton species used in aquaculture that
present the highest CO
2
uptake rates, as well as commercial value and that could be
produced in large-scale systems. The experiments were conducted with the species
Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd, 1955), Chaetoceros affinis Lauder, 1864, C.
muelleri Lemmermann, 1898, Phaeodactilum tricornutum Bohlin, 1897, Skeletonema
costatum (Greville) Cleve, 1873, Thalassiosira fluviatilis Hustedt, 1926, T. pseudonana
(Husted) Hasle & Heimdal, 1970), Tetraselmis chuii Butcher, 1958, T. tetrathele (G.S.
West) Butcher 1959 and Isochrysis galbana Parke, 1949 . The cells were kept in f/2
medium, constant temperature (optimum of each species), light intensity of ca. 100
µmol/m
-2
/s
-1
and 12L/12D photoperiod. Primary production measurements were
conducted in different light intensities using oxygen and
14
C (dissolved, particulate and
total production) methods. Measurements were carried out when culture were in the
LOG phase. The Photosynthetic Quotient and lipid fraction of most productive species
were also determined. N. oculata, S. costatum e C. muelleri reached the highest growth
yield, while C. affinis was the less productive species. N. oculata and I. galbana showed
the highest oxygen production rates, while N. oculata e T. fluviatilis presented the
highest carbon fixation rates. The most species showed PQ values bigger than 1.0.
According to the results of growth and primary production rates, four species showed
high potential for large-scale production: N. oculata, S. costatum, T. fluviatilis and I.
galbana. Since N. oculata and S. costatum showed highest growth rates under low light
intensity, these species could be cultivated during periods of low luminosity. On the
other hand, T. fluviatilis and I. galbana, light adapted species, could be grown during
spring/summer periods. Furthermore, the results indicate that N. oculata produces high
amounts of lipid and fatty acid, indicating its great capacity for biofuels production .
AGRADECIMENTOS:
Agradeço ao meu orientador o Professor Paulo César Abreu pelos valorosos
ensinamentos e pela amizade, obrigada também pela paciência.
Aos professores participantes da banca examinadora, Daniel Conde e Virginia
Garcia pelas correções e sugestões.
A professora Clarisse Odebrecht pela contribuição durante o desenvolvimento
do trabalho e nas correções.
Aos professores Marcelo D’Oca e Joaquim Cruz do Departamento de Química
pelo auxilio e troca de informações.
Aos amigos do Laboratório de ecologia do fitoplâncton e de microorganismos
marinhos: Valnei, Bia, Odete, Sirlei, Joana Flor, Viviane, Marli, Bianca, Marcio,
Carlos, Giuliano, Caroline, Amália e em especial a Simone. Obrigada pela harmoniosa
convivência e por me receberam com tanta simpatia.
Aos professores e colegas do curso de pós-graduação em Aqüicultura, pelos
ensinamentos e pela amizade.
A Petrobrás e a Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior
(CAPES) pelo apoio financeiro.
A minha família e meus amigos pelo carinho, apoio e incentivo: Amo todos
vocês!!!
INTRODUÇÃO:
Na atmosfera da Terra alguns gases, principalmente o dióxido de carbono (CO
2
)
o metano (CH
4
) e o óxido nitroso (N
2
O), funcionam como uma capa protetora
impedindo que o calor absorvido da irradiação solar escape para o espaço, mantendo
uma situação de equilíbrio térmico sobre o planeta, tanto durante o dia como durante a
noite. Sem estes gases na atmosfera, a superfície da Terra estaria coberta de gelo e seria
impossível a existência de vida no planeta. A essa particularidade da atmosfera que é
benéfica para a vida dá-se o nome de "efeito estufa".
Entretanto, os níveis atmosféricos do dióxido de carbono e de outros gases têm
aumentado muito desde a Revolução Industrial (Kirschbaum, 2003). Por exemplo, sabe-
se que desde 1800 a concentração atmosférica de CO
2
aumentou de 280 ppm para 380
ppm hoje em dia (Takahashi, 2004). Este aumento tem causado uma intensificação do
"efeito estufa" já que, quanto maior a concentração de gases, maior o aprisionamento do
calor, gerando um aumento acentuado da temperatura média do globo.
O aumento da temperatura global tem pode resultar em sérios problemas
climáticos como intensificação de chuvas e secas, com graves quebras na produção
agrícola, que poderão levar à fome generalizada em algumas regiões mais pobres do
planeta.. O agravamento do "efeito estufa" está acelerando também o derretimento de
geleiras, o que acarretará no aumento do nível médio do mar. Com isso, ilhas e áreas
litorâneas de baixa altitude podem desaparecer. O aumento da temperatura global
também provocaria a proliferação de ervas daninhas e insetos e a transferência de
pragas de clima quente para regiões de clima frio (Adams et al. 2003).
Algumas medidas para a redução dos níveis atuais de CO
2
na atmosfera foram
propostas no Protocolo de Kyoto em 1997, que entrou em vigor recentemente. O
Protocolo de Kyoto, um acordo mundial para a redução da emissão dos gases que
provocam o "efeito estufa", estabelece que os países desenvolvidos terão a obrigação de
reduzir em 5% a emissão de gases que causam o efeito estufa até 2012. Uma das
possibilidades do tratado é que nações que emitem CO
2
poderão comprar "cotas" de
países que atualmente representam um "sumidouro" de dióxido de carbono. Além disso,
no Protocolo de Kyoto, principalmente por ação do Governo Brasileiro, instituiu-se o
conceito de Mecanismo de Desenvolvimento Limpo (MDL), que são alternativas
tecnológicas para o desenvolvimento de fontes de energia “limpas”, isto é, que não
emitam dióxido de carbono, ou que reduzam os níveis deste e outros gases da
atmosfera.
Um exemplo de MDL seriam os projetos de reflorestamento, que visam a
redução dos níveis de CO
2
pela absorção deste gás pelas plantas, através do processo de
fotossíntese (Araújo, 2000). Entretanto, ao se lavrar o solo para o plantio, grande
quantidade de CO
2
é liberada para a atmosfera o que, em muitos casos, anularia o efeito
benéfico da absorção de dióxido de carbono e sua incorporação na biomassa das plantas,
ao longo de sua vida (Araújo, 2000).
Em função destes problemas, seria interessante utilizar a produção de outros
organismos autotróficos para a retenção de CO
2
da atmosfera. Na verdade, apesar de seu
diminuto tamanho (a maioria não mais que 200 µm), as microalgas são responsáveis
pela absorção do CO
2
atmosférico nos oceanos, uma vez que estas estão presentes em
grande número na coluna de água que cobrem 3/4 partes da superfície do globo terrestre
(Falkowski & Raven 1997).
Uma parte do dióxido de carbono absorvido pelas microalgas é transferida para
o fundo oceânico num processo conhecido como "Bomba Biológica" (Lalli & Parsons
1993). Este processo, juntamente com a difusão direta do CO
2
para a água, impede que
o acúmulo de gases do "efeito estufa" seja maior do que o previsto, considerando-se
todas as emissões mas, principalmente, a queima de combustíveis fósseis.
Recentemente, alguns pesquisadores propuseram incrementar a atividade da "Bomba
Biológica" adicionando-se Ferro em determinadas regiões oceânicas ricas em nutrientes
(especialmente N e P), mas com baixa biomassa fitoplanctônica. Esta hipótese ganhou
força especialmente após o trabalho de Martin & Fitzwater (1988), que demonstraram
existir uma estreita relação entre as maiores taxas de produção e sedimentação do
fitoplâncton em diferentes eras geológicas e o maior aporte de Ferro no ambiente
aquático, devido a atividade vulcânica.
Vários experimentos foram realizados para testar esta hipótese. Estudos recentes
mostraram que, de fato, a “fertilização” de extensas áreas oceânicas com Fe resultou
num incremento significativo na produção primária fitoplanctônica, mas não na
transferência da biomassa nova formada para o fundo oceânico (Boyd et al. 2000, Boyd
2004). Na verdade, o destino da matéria orgânica produzida permanece desconhecido e
não se sabe que efeitos, positivos ou negativos, esse aumento da abundância de
produtores primários pode ter no ecossistema aquático oceânico e no funcionamento das
cadeias alimentares destes ambientes.
De maneira similar, processos naturais ou antrópicos que resultam em um
grande aporte de nutrientes em áreas costeiras geram um aumento de biomassa
fitoplanctônica (eutrofização) e, conseqüentemente, um maior seqüestro de CO
2
pelas
microalgas. Entretanto, este aumento de microalgas nem sempre apresenta resultados
positivos para o meio ambiente. O aumento acelerado de biomassa fitoplanctônica em
ambientes rasos ou com baixa circulação resulta, na maioria das vezes, em baixos níveis
de oxigênio dissolvido na água, o que pode levar à morte de peixes, crustáceos e
moluscos. Além disso, o aumento descontrolado da biomassa fitoplanctônica pode
modificar significativamente a composição específica das microalgas permitindo,
muitas vezes, o surgimento de espécies tóxicas que podem afetar até mesmo o ser
humano.
Pode-se concluir, então, que a manipulação de ambientes costeiros ou oceânicos
com o objetivo de aumentar a produtividade fitoplanctônica e, conseqüentemente
reduzir os níveis locais de dióxido de carbono, ainda depende de muita pesquisa que
permita, no futuro, um gerenciamento destes ambientes sem o perigo de produzir
situações que afetem negativamente os ecossistemas aquáticos e também o homem.
Desta forma, o cultivo em larga escala de microalgas em condições semi-
controladas surge como uma alternativa para se utilizar estes microorganismos para
reduzir os níveis de CO
2
da atmosfera. Além do rápido crescimento, as microalgas
apresentam uma ampla tolerância a fatores ambientais extremos e a possibilidade de
serem cultivadas de maneira intensiva, o que pode representar uma contribuição para a
diminuição do "efeito estufa", mesmo em condições adversas (Kurano et al.1995).
Para se ter uma idéia da capacidade de absorção de CO
2
pelas microalgas,
medidas de produção primária anual realizadas em ambientes aquáticos apresentam os
seguintes valores: Ambientes costeiros 1 - 4 T C ha
-1
ano
-1
; Lagos Eutróficos 5 - 8 T C
ha
-1
ano
-
1; Microalgas cultivadas 11 - 36.5 T C ha
-1
ano
-1
(Margalef, 1977), enquanto
que áreas reflorestadas apresentam uma produtividade média de 3 - 4 T C ha
-1
ano
-1
.
Como podemos verificar os valores de produção primária das microalgas são da mesma
magnitude que os do reflorestamento, sendo que a absorção de dióxido carbono pelo
fitoplâncton em condições de cultivo supera as taxas de produção de plantas superiores.
Além de sua capacidade de absorver dióxido de carbono, as microalgas podem
ser utilizadas no consumo humano, principalmente como fonte suplementar de
proteínas, carboidratos, ácidos graxos, pigmentos, vitaminas, entre outras substâncias,
sendo algumas espécies utilizadas como matéria-prima na indústria de alimentação e
farmacêutica (Borowitzka & Borowitzka, 1988). Além disso, estudos sobre a produção
e qualidade dos lipídios produzidos pelas microalgas indicam que o cultivo destes
microorganismos pode resultar na produção de bio-combustíveis como, por exemplo, o
biodiesel que poderia substituir combustíveis fósseis provenientes do refino de petróleo.
(Brown & Zeiler, 1993).
Na aqüicultura as microalgas podem ser empregadas como fonte primária de
alimento para larvas, juvenis e até de adultos de moluscos, crustáceos e peixes. Também
são a dieta primária do zooplâncton usado como alimento para crustáceos e peixes
(Brown et al. 1997). Outra função das algas unicelulares na aqüicultura, refere-se à
melhoria da qualidade da água, através da absorção de produtos nitrogenados tóxicos
(amônia e nitrito) (Lavens & Sorgeloos, 1996) e combate a bactérias patogênicas pela
produção de substâncias antibióticas (Reitan et al. 1997).
O alto custo de produção dos cultivos de microalgas afeta a rentabilidade dos
produtores. Assim, para aumentar o rendimento e reduzir os custos são necessárias
pesquisas que resultem na utilização de espécies mais produtivas (Borowitzka, 1997).
Um grande número de espécies de microalgas está disponível hoje para uso na indústria
da aqüicultura. Entretanto, para algumas aplicações particulares ou setores desta
indústria, seria interessante a utilização de novas espécies com uma melhor qualidade
nutricional ou rápido crescimento, que poderiam melhorar as taxas produtivas dos
organismos alimentados com as microalgas (Brown, 2002).
Assim, com o crescimento da aqüicultura em nosso país, o cultivo de microalgas
em condições controladas e em larga escala, surge como uma alternativa que, além de
permitir uma maior absorção de CO
2
, pode ser empregado por empresas que procuram
empregar tecnologias "limpas" em sua produção, e se beneficiar da produção de
elementos de interesse comercial gerados pelas microalgas como, por exemplo,
corantes, ácidos graxos, aminoácidos e proteínas, entre outros.
OBJETIVOS:
Geral:
Identificar quais espécies de microalgas utilizadas na aqüicultura presentes na
região estuarina da Lagoa dos Patos ou que fazem parte da coleção de cultivo do
Laboratório de Ecologia do Fitoplâncton e de Microorganismos Marinhos da Fundação
Universidade Federal do Rio Grande (FURG) apresentam maior potencial para serem
empregadas em cultivo de larga escala, como um Mecanismo de Desenvolvimento
Limpo.
Específicos:
Determinar quais as espécies estudadas que apresentam:
1) maiores taxas de absorção de CO
2
;
2) potencial para cultivo em larga escala e
3) algum valor comercial (aqüicultura, indústria, aplicação biotecnológica).
MATERIAL E MÉTODOS:
Os experimentos foram realizados com dez espécies de microalgas utilizadas na
aqüicultura e que fazem parte da coleção de cultivo do Laboratório de Ecologia do
Fitoplâncton e de Microorganismos Marinhos: Eustigmastophyceae: Nannochloropsis
oculata (Droop) Hibberd, 1955 ); Bacillariophyceae: Chaetoceros affinis Lauder, 1864,
C. muelleri Lemmermann, 1898, Phaeodactilum tricornutum Bohlin, 1897,
Skeletonema costatum (Greville) Cleve, 1873, Thalassiosira fluviatilis Hustedt, 1926, T.
pseudonana (Husted) Hasle & Heimdal, 1970 ); Prasinophyceae: Tetraselmis chuii
Butcher, 1958, T. tetrathele (G.S. West) Butcher 1959 e Prymnesiophyceae: Isochrysis
galbana Parke, 1949 .
Nos cultivos as condições de temperatura e salinidade utilizadas para cada
espécie eram as ótimas para o crescimento, de acordo com a bibliografia. Para as
espécies Thalassiosira fluviatilis e Chaetoceros muelleri não foram encontradas estas
informações na literatura, sendo usado as condições de temperatura e salinidade em que
estas espécies eram mantidas no banco de cultivo do laboratório (Tabela 1).
Tabela 1: Valores de temperatura e salinidade usados nos experimentos de crescimento.
Espécie T ºC Salinidade
Referência
Nannochloropsis oculata 20 28 Abu-Resq et al. 1999
Chaetoceros affinis 15 22 Brunel, 1970
Chaetoceros muelleri 20 28 -
Phaeodactylum tricornutum
20 28 Goldman, 1977
Skeletonema costatum 20 28 Goldman, 1977
Thalassiosira fluviatilis 20 28 -
Thalassiosira pseudonana 27 28 Goldman, 1977
Tetraselmis chuii 20 28 Abu-Resq et al. 1999
Tetraselmis tetrathele 20 28 Abu-Resq et al. 1999
Isochrysis galbana 27 28 Kaplan et al. 1986
Os cultivos foram mantidos em câmara ambiente para germinação (modelo 347-
CDG, Fanem) em condições controlas de temperatura e luz e com fotoperíodo de 12
horas luz e 12 escuro (Fig. 1) e irradiância de 100mol/m
-2
/s
-1
. Estas condições foram
repetidas em todos os experimentos.
Figura 1: Câmara ambiente para germinação (modelo 347-CDG, Fanem) com
os cultivos das espécies analisadas.
Crescimento:
Para determinação da fase logarítmica das espécies foi realizada contagem
celular em cultivos. Para cada espécie foi iniciado um cultivo com aproximadamente
150ml de meio f/2 (Guillard 1975) e cinco mL de inóculo. Para a contagem celular foi
retirada, diariamente e aproximadamente no mesmo horário, uma alíquota (5 ml)
durante cinco dias, a qual foi fixada com formalina. Um ml foi colocado em uma
câmara de Sedgewick-Rafter e esta sub-amostra foi quantificada utilizando microscópio
óptico (Zeiss) com magnificação final de 200x. Foram contados aleatoriamente um
mínimo de 30 campos, ou 100 células. O crescimento de cada espécie foi acompanhado
até alcançar a biomassa máxima. A taxa de crescimento foi determinada a partir do
incremento do número de células por unidade de tempo, durante a fase exponencial de
crescimento (Stein, 1984).
Foram calculados de acordo com Schlegel (1986):
- Rendimento:
X = X
máx
– X
0
onde X
máx
é a densidade máxima e X
0
a densidade mínima.
- Taxa de crescimento exponencial:
= log Xt – log X
0
/ log e (T-T
0
) = ln Xt – ln X
0
) / (T-T
0
)
onde: Xt e X
0
são as concentrações nos tempos inicial (T
0
) e final (T) e log e = 0,43429.
- Tempo de duplicação:
Td = ln2 /
- Fase LAG:
T1 = tr – ti = tr – (ln X
r
– ln X
0
/ )
Onde: r = crescimento real e i = crescimento ideal, t= tempo e X = densidade.
Produtividade primária:
Medidas de produtividade primária, para se estimar o potencial de absorção de
carbono, foram realizadas com amostras de cultivo que estavam na fase logarítmica,
determinada de acordo com os experimentos de crescimento. Para isso, as microalgas
foram cultivadas adicionando-se inicialmente 50 mL do inóculo da alga em 300 mL de
meio f/2 (Guillard, 1975). Esse volume foi gradualmente aumentado com intervalos de
aproximadamente quatro dias até alcançar um volume de 9 litros de cultivo, os quais
eram suficientes para o desenvolvimento dos experimentos. Aeração constante foi
utilizada a partir do volume de 1000L.
Os experimentos de produtividade foram realizados com incubação dos cultivos
durante um período de três horas. Imediatamente antes da realização de cada
experimento eram retiradas do cultivo duas amostras de cinco ml, uma para contagem
celular e a outra para medições de clorofila a. Este pigmento foi extraído durante 24
horas no escuro a -12ºC com acetona 90% (Strickland & Parsons, 1972), a leitura foi
realizada em fluorímetro calibrado Turner modelo TD-700 sem adicificação
(Welschmeyer, 1994).
As medidas de produção primária foram feitas empregando-se os métodos de
oxigênio (Strickland & Parsons, 1972) e do
14
C em oito diferentes intensidades
luminosas (curvas PxI). Para tal, amostras de cultivo foram colocadas em frascos de
DBO de 250 mL, para medidas de oxigênio e de 110 mL, para medidas de
14
C (Steeman
Nielsen 1952) (em duas repetições para cada método). Estes frascos foram colocados
em um aquário de vidro e com água circulante com temperatura igual a do cultivo, esta
sendo mantida através de um Banho termostatizado (Tecnal TE 184). Na frente desta
cuba foi colocada uma lâmpada de halogênio de 250 W como fonte de luz. A disposição
em fila das garrafas de DBO determina um gradiente de luz desde valores mais altos
(início da fila) até mais baixos (fim da fila) (Fig. 2). A intensidade luminosa foi
determinada no lugar em que estava cada garrafa utilizando um aparelho Li-Cor com
sensor esférico de luz e variou entre 30 e 780 µmol/m
-2
/s
-1
.
Figura 2: Aquário com as garrafas DBO dispostas em fila e iluminadas por uma
lâmpada de halogênio.
Método do Oxigênio:
Os níveis de oxigênio dissolvido (O.D.) foram determinados antes e após o
período de incubação (em torno de três horas) nos frascos DBO de 250 mL através de
leituras feitas com um eletrodo de oxigênio (Metler Toledo MO128). As leituras foram
feitas nos frascos claros e também em frascos escuros. Foram calculadas a produção
primária líquida (concentração no claro – concentração inicial), produção primária bruta
(concentração no claro – concentração no escuro) e respiração (concentração no escuro
– concentração inicial).
Método do
14
C:
Frascos DBO de 100ml foram incubados (em duas repetições) juntamente com
os frascos DBO usados para as medições de oxigênio. Em cada frasco foi adicionado
1ml de bicarbonato de sódio radioativo (NaH
14
CO
3
) em água estéril com atividade de
5µCi/ml. Inicialmente foram retiradas seis amostras de 50µl para calculo do conteúdo
de carbono inicial. Os frascos DBO foram colocados para incubar em cada
luminosidade determinada. Após o período de incubação, foi adicionado em cada frasco
1 ml de formalina 37% para matar as células e terminar o processo de fotossíntese. De
cada frasco foram retiradas duas amostras de 10ml, as quais foram filtradas em filtros
de fibra de vidro (Whatman GF/F) com auxilio de bomba à vácuo. Estes filtros foram
deixados por três horas em atmosfera saturada de HCl para eliminar o
14
C inorgânico e
formalina 37% para evitar contaminação bacteriana, sendo posteriormente transferidos
para “vials” onde foi adicionado o coquetel de cintilação Ready Safe (Beckman), para
leitura da radioatividade em cintilômetro Beckman - LS 6500.
Da parte da amostra que passou pelo filtro (o filtrado) foram retirados oito mL,
utilizados para a estimativa do carbono orgânico dissolvido excretado pelas algas
durante o período de incubação. Para a retirada do
14
C inorgânico foi adicionado, neste
filtrado, um ml de HCl e realizado o borbulhamento das amostras por 20 minutos. Após
a amostra foi neutralizada com um ml de NaOH 6N e finalmente foi completado o
volume de 20 ml do “vial” com liquido de cintilação (Schindler et al. 1972)
A produtividade total (ABM) foi determinada com a retirada de duas amostras
de oito ml de cada garrafa, sem passar por filtração, e colocadas em vials. O mesmo
procedimento usado para o filtrado foi seguido para eliminar o
14
C inorgânico. Após a
adição do liquido de cintilação foi realizada a leitura da absorção do carbono.
As taxas de produção primária foram calculadas de acordo com Nielsen &
Bresta (1984) para os valores dos filtros (produção particulada), filtrados (produção
dissolvida) e sem filtração (produção primária total - ABM) segundo a fórmula:
mgC/L.h = A x C x D x E x F x k
1
B x k
2
Onde:
A =
14
C incorporado no organismo (dpm).
B =
14
C inicial (dpm).
C = Concentração do carbono na água.
D = Peso atômico do carbono (12).
E e F = Fatores de correção (1,05 e 1,06).
k
1
= mL amostra + mL NaOH
14
CO
3
mL filtrado
k
2
= Tempo de incubação
O carbono inorgânico total presente nas amostras foi estimado a partir de
medidas de alcalinidade, a qual foi calculada a partir de dados de temperatura (ºC),
salinidade (refratômetro) e pH (Medidor de pH, Digimed DMPH-3) antes e após a
adição de HCl 0,01N à amostra conforme descrito em Strickland & Parsons (1972).
Os resultados de produção obtidos tanto pelo método de oxigênio quando o de
14
C foram padronizados dividindo-se as taxas de produção primaria pela biomassa
fitoplanctônica (índice de assimilação). O rendimento quântico (inclinação inicial da
curva PxI) foi calculado pela fórmula ∆P/∆I. A máxima taxa da fotossíntese (P
máx
) e a
intensidade luminosa neste ponto (Ic_ P
máx
) foram determinados para cada espécie.
Quociente Fotossintético:
O quociente fotossintético foi calculado como a razão molar entre o oxigênio
liberado (produção bruta) e o carbono absorvido para cada intensidade luminosa e
também considerando a produção de carbono total (ABM) ou pela fração particulada.
Lipídios totais e produção de Biodiesel:
Os lipídios totais de amostras das algas mais produtivas (Nannochloropsis oculata,
Thalassiosira fluviatilis e Skeletonema costatum) foram extraídos pelo método de Bligh
& Dyer (1959). A amostra foi homogeneizada como uma mistura de clorofórmio,
metanol e água (2:10:0,5), por 30 minutos em agitador magnético sendo transferida para
um funil de separação, acrescentando 50mL de uma mistura de clorofórmio e água
destilada (1:1) para separar a fase apolar e polar. A fase inferior (extrato lipídio) foi
transferida para um balão previamente seco e tarado e acrescentado um pouco de sulfato
de magnésio para retirar a umidade da amostra que foi filtrada posteriormente. O extrato
lipídio foi então seco em rota-evaporador e após em estufa até peso constante. Depois
de frio o balão foi pesado e o peso dos lipídios foi determinado gravimetricamente por
diferença.
A fração lipídica foi convertida em Biodiesel utilizando catálise ácida, acido
sulfúrico, e etanol em refluxo por 1h (Ma & Hanna, 1990). A presença do Biodiesel e o
desaparecimento da fração lipídica foram verificados por cromatografia em camada fina
(TLC) (Collins et al. 1995).
Análise Estatística:
Foi feita uma análise comparativa não paramétrica das diversas variáveis
medidas para as diferentes espécies de microalgas (oxigênio, produção particulada,
produção dissolvida de produção total) empregando-se o teste de Kruskal-Wallis (Teste
H) que compara amostras independentes e do mesmo tamanho.
RESULTADOS:
Descrição das espécies:
(A:400x)
(A:400x)
Espécie: Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd:
Segundo Chrétiennot-Dinet et al. (1993):
Divisão: Eustigmatophyta
Classe: Eustigmatophyceae
Ordem: Eustigmatales
Família: Monopsidaceae
Espécie marinha, faz parte do picoplâncton. Esféricas a
levemente ovóides, 2 – 4
µm de diâmetro. Um cloroplasto por
célula. Somente clorofila a
e o principal pigmento acessório é
a violaxantina.
Amplamente distribuída nos oceanos (Van Den
Hoek et al. 1995).
Espécie: Chaetoceros affinis Lauder 1864:
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Bacillariophyta
Classe: Coscinodiscophyceae
Ordem: Chaetoceratales
Família: Chaetocerotaceae
Espécie marinha, pelágica, neritica, células 7 – 30
µm largura, unidas em cadeias retas. Cosmopolita
porem não se desenvolve bem em temperaturas
muito elevadas (Horner, 2002).
Espécie: Chaetoceros muelleri Lemmermann 1898
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999).
Divisão: Bacillariophyta
Classe: Coscinodiscophyceae
Ordem: Chaetoceratales
Família: Chaetocerotaceae
Espécie unicelular, eixo apical 4 – 6 µm. Ocasionalmente
encontrada em águas salgadas, mais freqüente em águas
continentais (Rines & Hargraves, 1988).
(A:400x)
A(400x)
Espécie: Phaeodactylum tricornutum Bohlin 1897:
Segundo Tomas (1996):
Divisão: Chromophyta
Classe: Bacillariophyceae
Ordem: Bacillariales
Família: Phaeodactylaceae
Células solitárias, de três tipos: ovóides (naviculoides),
fusiforme
s e, mais raramente, triradiadas. Um
cloroplasto. Células fusiformes de 25 –
35 µm de
comprimento. Cosmopolita (Tomas, 1996).
Espécie: Thalassiosira fluviatilis Hustedt 1926:
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Bacillariophyta
Classe: Coscinodiscophyceae
Ordem: Thalassionales
Família: Thalassiosiraceae
Células retangulares, eixo pervalvar usualmente menor que
o diâmetro, valva achatadas no centro (Tomas, 1996).
Espécie: Skeletonema costatum (Greville 1866) Cleve 1873:
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Bacillariophyta
Classe: Coscinodiscophyceae
Ordem: Thalassionales
Família: Skelenetonemaceae
Células cilíndricas, 2 –
21 µm de diâmetro, unidas em longas
cadeias por tubos externos arranjados em um anel marginal.
Dois cloroplastos por célula. Co
smopolita em regiões costeiras
ao redor do mundo exceto em mares polares. Pode formar
extensivas florações na primavera (Horner, 2002).
(A:400x)
(A:400x)
(A:400x)
Espécie: Tetraselmis chuii Butcher, 1959.
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Chlorophyta
Classe: Prasinophyceae
Ordem: Chlorodendrales
Família: Chlorodendraceae
Células com 10-12 x 6-6,5 x 5-6 , comprimida,
elipsóide a ovóide, arredondada na vista dorsal. Com
quatro flagelos 1,2 vezes o comprimento da célula.
Presença de cromatóforo e estigma. Eurihalina com
Espécie: Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal
1970:
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Bacillariophyta
Classe: Coscinodiscophyceae
Ordem: Thalassionales
Família: Thalassiosiraceae
Células retangulares, 3,3 –
6,2 µm de diâmetro. Eixo
pervalvar mais curto que ou igual ao diâmetro da célula.
Superfície valvar achatada ou levemente convexa. Não
formam colônias (Tomas, 1996).
A: (400x)
(A:400x)
(A:400x)
Espécie: Tetraselmis terathele (G. S. West) Butcher 1959:
Segundo Bérard-Therriault et al. (1999):
Divisão: Chlorophyta
Classe: Prasinophyceae
Ordem: Chlorodendrales
Família: Chlorodendraceae
Células de 10 – 16 µm de comprimen
to, com quatro
flagelos, teca com escamas. Comprimida, profundos e
amplos sulcos apicais lobado em quatro. Ocorre
principalmente em marismas, poças mareais, Europa
(Tomas, 1996).
Espécie: Isochrysis galbana Parke, 1949:
Segundo Van Den Hoek et al. (1995)
Divisão: Haptophyta
Classe: Haptophyceae
Ordem: Prymnesiales
Família: Isochrysidaceae
Células com 5 –
6 µm de diâmetro, com dois flagelos
de aproximadamente 7 µm
de comprimento. Alongada,
variável na forma. Costeira, Atlântico (Tomas, 1996).
Crescimento:
Nannochloropsis oculata apresentou a maior taxa de crescimento, alcançando
829.000 células/mL após o quinto dia de repicagem (Fig 3a), enquanto que no mesmo
período Chaetoceros affinis atingiu o máximo de 44.600 células/mL (Fig 3f). As outras
espécies variaram entre estes valores (Fig 3).
0
300
600
900
1 2 3 4 5
0
50
100
150
1 2 3 4 5
0
50
100
150
1 2 3 4 5
0
100
200
300
1 2 3 4 5
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4 5
0
100
200
300
400
1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
0
50
100
150
200
1 2 3 4 5
0
100
200
300
1 2 3 4 5
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
Figura 3
: Curvas de crescimento das espécies analisadas. No
eixo Y os números de células por mL (multiplicar por 10
3
). No
eixo X os dias após a repicagem. (a = Nannochloropsis oculata
,
b = Thalassiosira pseudonana, c = Thalassiosira fluviatilis
, d =
Skeletonema costatum, e = Phaeodactylum tricornutum
, f =
Chaetoceros affinis, g = Chaetoceros muelleri, h =
Tetraselmis
chuii, i = Tetraselmis tetrathele e j = Isochrysis galbana)
Na Tabela 2 estão os parâmetros das curvas de crescimento. Nannochloropsis
oculata alcançou a maior abundância celular e o maior rendimento, seguida pela espécie
Chaetoceros muelleri, porém esta ultima apresentou uma fase LAG mais curta.
Thalassiosira pseudonana obteve a maior taxa de crescimento exponencial, porem
apresentou um baixo rendimento e uma fase LAG longa. Chaetoceros affinis apresentou
reduzida abundância, rendimento e taxa de crescimento exponencial, além de maior
tempo de duplicação mas não mostra uma longa fase LAG.
Tabela 2: Parâmetros das curvas de crescimento. = Taxa de crescimento exponencial;
Td = tempo de duplicação; Lag = Duração da fase LAG (tempo de geração - dias).
Espécie Crescimento
máximo
(cél/mL)
Rendimento
(cél/mL*10
3
)
Td(dias)
Lag (g)
N. oculata 829 713,2 1,6801
0,41 0,89
T. pseudonana
132,5 77,5 2,4433
0,28 1,64
T. fluviatilis 112 72 1,5728
0,44 0,57
S. costatum 316 298 1,9186
0,36 0,73
P. tricornutum
196 161 1,3195
0,53 1,81
C. affinis 44,6 34,8 0,9494
0,73 0,83
C. muelleri 371 301 1,9721
0,35 0,68
T. chuii 90,2 70,4 1,1255
0,62 1,74
T. tetrathele 162 129,8 1,2719
0,54 1,95
I. galbana 247,8 192,4 1,8376
0,38 0,66
Produção Primária:
Na Tabela 3 estão listadas as abundâncias celulares, as concentrações de
clorofila a e o pH dos cultivos no momento do inicio dos experimentos de produção
primária. Além disso, estão listados os números de dias após ultima repicagem quando
foram feitos os experimentos.
Tabela 3: Valores das contagens celulares (células/mL), clorofila a (µg/L), pH e os dias
depois da ultima repicagem para cada espécie.
Espécie Dias
(experimento)
Contagem
(células/mL)
Clorofila a
(µg/L)
pH
cultivo
Nannochloropsis oculata 4 289.000 ± 9.450 95,66 8,88
Thalassiosira fluviatilis 4 106.800 ± 12.990 965,4 ± 23,08 8,78
Thalassiosira pseudonana. 3 46.600 ± 14.910 152,27 ± 3,96 8,7
Phaeodactylum tricornutum
4 444.000 ± 102.060
345,04 ± 40,17
8,86
Skeletonema costatum 4 375.000 ± 89.960 530,03 8,52
Chaetoceros affinis 4 55.200 ± 8.150 162 ±22,23 7,87
Chaetoceros muelleri 3 74.800 ± 21.080 148,4 ± 4,04 8,87
Tetraselmis chuii 4 90.400 ± 10.310 286,86 8,4
Tetraselmis tetrathele 4 28.600 ± 14.960 34,47 ± 3,4 8,7
Isochrysis galbana 3 90.800 ± 21.120 142,32 ± 2,41 8,57
Para cada espécie os dados de produção por oxigênio e
14
C (particulada,
dissolvida e total) foram padronizados dividindo-se os resultados pelas concentrações
de clorofila a, obtendo-se o índice de assimilação.
Oxigênio:
A espécie Tetraselmis tetrathele mostrou os maiores valores de produção bruta
de oxigênio, apresentando o máximo de produção de 58,99 mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
em
319,5 mol/m
-2
/s
-1
de intensidade luminosa (Fig 4a). Isochrysis galbana e Chaetoceros
muelleri apresentaram 22,46 mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
em 511,4 mol/m
-2
/s
-1
e 19,47
mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
em 653,6 mol/m
-2
/s
-1
de luminosidade, respectivamente (Fig 4a).
Nannochloropsis oculata teve uma produção mais alta (18,64 mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
) em
níveis mais baixos de luz apresentando uma fotoinibição a partir de 231 mol/m
-2
/s
-1
de
luminosidade, diferentemente de I. galbana e C. muelleri que mostraram uma maior
produção em altas intensidades luminosas.
Skeletonema costatum, Thalassiosira fluviatilis, Thalassiosira pseudonana,
Phaeodactilum tricornutum e Tetraselmis chuii mostraram valores máximos de
liberação de oxigênio de 9,55 a 17,43 mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
(Fig 4a). Entretanto, T.
fluviatilis e T. pseudonana mostram uma maior produção em intensidades luminosas
acima de 600 mol/m
-2
/s
-1
.
Chaetoceros affinis apresentou os menores valores de produção sendo 3,63
mgO
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
o pico máximo, aos 135,9 mol/m
-2
/s
-1
(Fig. 4a), e uma
fotoinibição a intensidades luminosas maiores que esta (Fig. 4b).
Figura 4: Produção bruta de oxigênio (mgO
2
/mg Chl-a
-1
L
-1
h
-1
) pelas diferentes
espécies nas diferentes intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b =
escala log-decimal).
a b
O Teste de Kruskal-Wallis (Fig 5) mostrou que a produção de oxigênio de
Chaetoceros affinis foi significativamente diferente (p<0,05) de Nannochloropsis
oculata, Chaetoceros muelleri, Tetraselmis chuii, Tetraselmis tetrathele e Isochrysis
galbana. Já a espécie T. tetrathele diferiu significativamente (p<0,05) de Thalassiosira
fluviatilis, Thalassiosira pseudonana, Skeletonema costatum, Phaeodactylum
tricornutum, e Chaetoceros affinis. Estes resultados mostraram uma separação entre
dois grupos, o primeiro com espécies com valores mais baixos formado pelas
microalgas T. fluviatilis, T. pseudonana, S. costatum, P. tricornutum, e C. affinis e um
segundo grupo com espécies com valores mais altos formado por N. oculata, C.
muelleri, T. chuii, T. tetrathele e I. galbana.
Figura 5: Gráfico das diferenças entre as médias das espécies para a liberação de
oxigênio, segundo o Teste de Kruskal-Wallis, onde ns indica diferença não significativa
e p<0,05 diferença significativa (1 =Nannochloropsis oculata, 2 = Thalassiosira
pseudonana, 3 = Thalassiosira fluviatilis, 4 = Skeletonema costatum, 5 =
Phaeodactylum tricornutum, 6 = Chaetoceros affinis, 7 = Chaetoceros muelleri, 8 =
Tetraselmis chuii, 9 = Tetraselmis tetrathele e 10 = Isochrysis galbana.
14
Carbono:
- Produção Particulada:
Nos resultados de produção particulada as espécies Nannochloropsis oculata, com
o máximo de 33,81 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
na intensidade luminosa de 368,5 mol/m
-2
/s
-1
, e
Thalassiosira fluviatilis, com 17,68 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
em 542 mol/m
-2
/s
-1
de luz,
apresentaram os maiores valores (Fig 6a).
Chaetoceros affinis e Chaetoceros muelleri foram as espécies com menor
produção particulada. Os valores máximos apresentados por essas microalgas foram
0,2166 e 0,1483 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
respectivamente (Fig 6b).
Figura 6: Produção particulada (mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
) pelas diferentes espécies nas
diferentes intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b = escala log-
decimal).
Para a produção particulada o Teste de Kruskal-Wallis (Fig 7) mostrou que T.
tetrathele apresentou diferença significativa (p<0,05) de N. oculata, S. costatum, T.
fluviatilis e T. chuii. Enquanto que N. oculata foi significativamente diferente (p<0,05)
de N. oculata, C. affinis, C. muelleri, T. tetrathele e I. galbana. Estes resultados
indicaram uma separação em dois grupos, porém a espécie T. pseudonana não apresenta
diferença significativa entre nenhuma espécie de ambos. O primeiro grupo de espécies,
b
a
as quais apresentaram valores mais baixos, foi formado por S. costatum, C. affinis, C.
muelleri, T. tetrathele e I. galbana. O segundo grupo formado pelas espécies N. oculata,
P. tricornutum, T. fluviatilis, T. chuii apresentou os valores mais altos.
Figura 7: Gráfico das diferenças entre as médias das espécies para a produção
particulada, segundo o Teste de Kruskal-Wallis, onde ns indica diferença não
significativa e p<0,05 diferença significativa (1 =Nannochloropsis oculata, 2 =
Thalassiosira pseudonana, 3 = Thalassiosira fluviatilis, 4 = Skeletonema costatum, 5 =
Phaeodactylum tricornutum, 6 = Chaetoceros affinis, 7 = Chaetoceros muelleri, 8 =
Tetraselmis chuii, 9 = Tetraselmis tetrathele e 10 = Isochrysis galbana.
- Produção Dissolvida:
As espécies T. fluviatilis com o valor máximo de 6,67 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
em
162,9 mol/m
-2
/s
-1
de luminosidade, S. costatum com 2,58 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
em 244,5
mol/m
-2
/s
-1
e N. oculata com 1,82 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
em 194,9 mol/m
-2
/s
-1
foram as
microalgas que apresentaram os maiores valores de produção dissolvida (Fig 8a).
C. affinis e C. muelleri apresentaram os menores valores de produção dissolvida
sendo os valores máximos 0,1330 e 0,1131 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
respectivamente (Fig
8b).
Figura 8: Produção dissolvida (mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
) pelas diferentes espécies nas
diferentes intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b = escala log-
decimal).
O Teste de Kruskal-Wallis para a produção dissolvida (Fig 9) mostrou que a
microalga T. tetrathele apresentou diferença significativa (p<0,05) das espécies N.
oculata,T. pseudonana, S. costatum, T. fluviatilis, T. chuii e I. galbana. E a espécie T.
fluviatilis foi estatisticamente diferente (p<0,05) de P. tricornutum, C. affinis, C.
muelleri e T. tetrathele. Novamente havendo uma separação entre dois grupos onde, P.
tricornutum, C. affinis, C. muelleri e T. tetrathele formaram um com espécies com
produção mais baixa e N. oculata, S. costatum, T. fluviatilis, T. chuii e I. galbana o
outro com microalgas com produção mais alta.
b
a
Figura 9: Gráfico das diferenças entre as médias das espécies para a produção
dissolvida, segundo o Teste de Kruskal-Wallis, onde ns indica diferença não
significativa e p<0,05 diferença significativa (1 =Nannochloropsis oculata, 2 =
Thalassiosira pseudonana, 3 = Thalassiosira fluviatilis, 4 = Skeletonema costatum, 5 =
Phaeodactylum tricornutum, 6 = Chaetoceros affinis, 7 = Chaetoceros muelleri, 8 =
Tetraselmis chuii, 9 = Tetraselmis tetrathele e 10 = Isochrysis galbana.
- Produção Total (ABM):
Nos resultados de produção total (ABM) os maiores valores foram encontrados
nas espécies T. fluviatilis, com o máximo de 22,68 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
com 162,9
mol/m
-2
/s
-1
de luz, e N. oculata, com 21,99 mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
em 368,5 mol/m
-2
/s
-1
(Fig. 10a).
Os valores mais baixos de produção total foram 0,3110 e 0,1442 mgC/mg Chl-a
-
1
h
-1
encontrados nas espécies C. affinis e C. muelleri respectivamente (Fig 10b).
a
b
Figura 10: Produção total (mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
) pelas diferentes espécies nas diferentes
intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b = escala log-decimal).
Nas análises estatísticas para a produção total (Fig 11) o Teste de Kruskal-Wallis
mostrou que a microalga T. tetrathele apresentou diferença significativa (p<0,05) das
espécies N. oculata,T. pseudonana, S. costatum, T. fluviatilis, T. chuii e I. galbana. E a
espécie T. fluviatilis foi estatisticamente diferente (p<0,05) de P. tricornutum, C. affinis,
C. muelleri e T. tetrathele. Novamente havendo uma separação entre dois grupos onde,
P. tricornutum, C. affinis, C. muelleri e T. tetrathele formaram um com espécies com
produção mais baixa e N. oculata, S. costatum, T. fluviatilis, T. chuii e I. galbana o
outro com microalgas com produção mais alta.
Figura 11: Gráfico das diferenças entre as médias das espécies para a produção total,
segundo o Teste de Kruskal-Wallis, onde ns indica diferença não significativa e p<0,05
diferença significativa (1 = Nannochloropsis oculata, 2 = Thalassiosira pseudonana, 3
= Thalassiosira fluviatilis, 4 = Skeletonema costatum, 5 = Phaeodactylum tricornutum,
6 = Chaetoceros affinis, 7 = Chaetoceros muelleri, 8 = Tetraselmis chuii, 9 =
Tetraselmis tetrathele e 10 = Isochrysis galbana.
Os valores de produção total pelo método ABM e somando as frações particulada
e dissolvida foram semelhantes em valores mais baixos (0 a 5 mg C mg chla
-1
h
-1
) de 8
a 20 mg C mg chla
-1
h
-1
são maiores na ABM e acima de 25 mg C mg chla
-1
h
-1
na soma
das frações particulada e dissolvida (Fig 12).
Figura 12: Gráfico de dispersão da produção total (ABM) pela produção (particulada +
dissolvida) y = 0,7497x + 0,5229 e r
2
= 0,8925.
A produção particulada na maioria das espécies representa quase toda produção
total chegando a 100% em P. tricornutum (Tabela 4). Porém as espécies Chaetoceros
affinis, C. muelleri, Skeletonema costatum e Thalassiosira fluviatilis apresentaram alta
produção dissolvida alcançando até 58% em C. muelleri.
Tabela 4 – Produção total (ABM), particulada dissolvida e total em mgC/mg Chl-a
-1
h
-1
e percentual das diferentes frações na produção total nas diferentes intensidades
luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) e para cada espécie.
Espécie
Luz ABM
Part Disol
Part+Dis.
% part(P+D).
% disol.(P+D)
N. oculata
82,5 11,73
13,73
0,34 14,07 98 2
101,5 12,17
15,31
0,33 15,64 98 2
139,6 14,10
18,46
0,42 18,88 98 2
194,9 17,43
20,54
1,82 22,36 92 8
262,6 19,63
29,18
1,68 30,86 95 5
368,5 21,99
33,81
1,61 35,42 95 5
549,1 18,12
26,95
1,37 28,31 95 5
780,4 15,60
26,35
0,94 27,30 97 3
C. affinis
68,8 0,18 0,09 0,09 0,18 52 48
89,8 0,02 0,02 0,01 0,03 71 29
101,5 0,06 0,06 0,01 0,07 90 10
110,9 0,10 0,09 0,01 0,10 93 7
135,9 0,22 0,14 0,08 0,21 64 36
235,1 0,31 0,22 0,13 0,35 62 38
350,7 0,01 0,01 0,00 0,01 69 31
610,9 0,00 0,01 0,00 0,01 85 15
C. muelleri
104,2 0,09 0,08 0,11 0,19 42 58
131,4 0,07 0,10 0,11 0,20 48 52
147,6 0,12 0,11 0,10 0,21 53 47
197,2 0,13 0,07 0,07 0,14 48 52
260,9 0,14 0,11 0,04 0,15 73 27
354,0 0,09 0,11 0,04 0,15 72 28
469,1 0,14 0,10 0,05 0,15 68 32
596,0 0,12 0,15 0,02 0,17 86 14
P. tricornutum
74,9 1,72 2,99 0,03 3,02 99 1
94,7 2,24 3,85 0,03 3,88 99 1
125,2 2,50 3,25 0,04 3,29 99 1
177,3 2,07 4,46 0,02 4,49 99 1
262,2 2,11 3,76 0,02 3,77 100 0
383,9 1,88 4,33 0,03 4,35 99 1
522,5 2,11 4,15 0,02 4,17 99 1
717,0 1,78 3,24 0,03 3,27 99 1
S. costatum
81,7 3,24 1,95 1,26 3,21 61 39
83,4 2,93 1,83 1,11 2,95 62 38
90,1 3,92 2,26 1,52 3,78 60 40
114,7 4,08 2,31 1,50 3,81 61 39
159,0 4,35 2,40 1,63 4,03 60 40
244,5 6,08 3,26 2,58 5,85 56 44
425,3 5,38 2,92 2,00 4,92 59 41
634,5 3,58 1,98 1,33 3,31 60 40
T. fluviatilis
65,0 11,58
7,50 3,57 11,07 68 32
77,6 12,75
7,45 3,52 10,97 68 32
89,1 10,65
5,99 2,40 8,39 71 29
113,8 17,22
10,91
5,69 16,60 66 34
162,9 22,68
12,69
6,67 19,37 66 34
241,7 19,77
14,24
5,96 20,20 71 29
339,9 19,46
13,44
3,42 16,86 80 20
542,0 19,65
17,68
1,89 19,57 90 10
T. pseudonana
90,2 1,74 1,69 0,42 2,11 80 20
111,7 2,49 2,05 0,64 2,69 76 24
141,0 3,00 2,64 0,47 3,11 85 15
194,5 3,23 2,91 0,59 3,50 83 17
248,3 3,29 2,63 0,25 2,88 91 9
335,8 3,34 3,32 0,20 3,52 94 6
469,4 2,56 2,60 0,13 2,73 95 5
648,3 3,35 3,18 0,17 3,35 95 5
T. chuii
72,3 2,03 2,00 0,34 2,34 85 15
90,4 2,12 2,14 0,26 2,40 89 11
113,2 2,98 3,23 0,33 3,56 91 9
143,5 3,39 3,97 0,27 4,24 94 6
207,4 3,01 3,93 0,31 4,24 93 7
290,6 4,71 5,12 0,41 5,53 93 7
461,0 3,38 4,19 0,29 4,48 93 7
643,7 3,62 5,07 0,69 5,76 88 12
T. tetrathele
91,58
1.77 0.04 1.37 1.82 98 2
106,7
1.81 0.06 1.40 1.87 97 3
128,1
1.97 0.04 1.42 2.01 98 2
163,7
2.16 0.05 1.92 2.22 98 2
223,8
2.66 0.05 1.93 2.71 98 2
330,8
2.88 0.06 2.13 2.93 98 2
516,2
2.73 0.05 1.42 2.78 98 2
676,4
2.49 0.04 1.63 2.54 98 2
I. galbana
109,4 1,83 1,82 0,40 2,22 82 18
135,0 2,00 2,07 0,51 2,58 80 20
189,9 2,60 2,45 0,53 2,98 82 18
226,3 2,95 2,20 0,72 2,92 75 25
291,7 3,60 2,51 0,87 3,38 74 26
380,0 4,14 2,50 1,01 3,51 71 29
502,3 3,98 2,36 1,01 3,37 70 30
669,6 2,77 2,53 0,64 3,17 80 20
Na Tabela 5 estão listados os parâmetros das curvas PxI. Tetraselmis tetrathele
apresentou o maior P
máx
para a produção bruta de oxigênio e obteve a maior taxa de
respiração. Nannochloropsis oculata mostrou o maior P
máx
para o carbono particulado e
Thalassiosira fluviatilis para o total (ABM).
Isochrysis galbana mostrou o maior rendimento quântico para o oxigênio e
Chaetoceros muelleri para o carbono particulado, além disso, estas duas espécies
apresentaram P
máx
em altas intensidades luminosas para oxigênio, carbono particulado e
total. No carbono total (ABM) Skeletonema costatum apresentou o maior rendimento
quântico esta espécie também apresentou menor taxa de respiração e mais baixa
irradiância no ponto de compensação.
Tabela 5: Parâmetros das curvas de produção x intensidade luminosa (PxI) do oxigênio
(produção bruta), carbono particulado e carbono total (ABM). P
máx
= máxima taxa
fotossintética (mg O
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
ou mg C/mg Chl-a
-1
h
-1
); I_ P
máx
= intensidade
luminosa no P
máx
(mol/m
-2
/s
-1
); Rendimento quântico ou inclinação inicial da curva
P/ I (mg O
2
/mg Chl-a
-1
/M); R = respiração (mg O
2
/mg Chl-a
-1
h
-1
); Ic = ponto de
compensação (mol/m
-2
/s
-1
).
Espécie P
máx
(O
2
)
I_ P
máx
(O
2
) Rendimento
quântico
R
Ic
N. oculata 18,64 231 0,098 0,0016 155,2
T. fluviatilis 9,76 627,2 0,05 0,0057 66,9
T. pseudonana 13,35 645,6 0,06 0,0006 54
P. tricornutum 10,62 297,5 0,086 0,0012 41,7
S. costatum 9,55 188,2 0,058 0 32,3
C. affinis 3,63 135,9 0,034 0,0016 101,5
C. muelleri 19,47 653,6 0,069 0,0042 94,9
T. chuii 17,43 432,9 0,081 0,0006 47,8
T. tetrathele 58,99 319,5 0,12 0,0155 64,16
I. galbana 22,46 511,4 0,903 0,0014 66,8
Espécie P
máx
(part)
I_ P
máx
(part) Rendimento
quântico
N. oculata 33,807 368,5 0,0606
T. fluviatilis 17,6832 542 0,0909
T. pseudonana 3,3207 335,8 0,0187
P. tricornutum 3,8534 94,7 0,0438
S. costatum 3,2644 244,5 0,1757
C. affinis 0,2166 235,1 0,0033
C. muelleri 0,1483 596 1,671
T. chuii 5,1186 290,6 0,0344
T. tetrathele 2,8759 330,8 0,0053
I. galbana 2,5327 669,6 0,0099
Espécie P
máx
(ABM) I_ P
máx
(ABM) Rendimento
quântico
N. oculata 21,988 368,5 0,0507
T. fluviatilis 22,6811 162,9 0,1630
T. pseudonana 3,3516 648,3 0,0248
P. tricornutum 2,5000 125,2 0,0267
S. costatum 6,0765 244,5 0,3882
C. affinis 0,3110 235,1 0,0035
C. muelleri 0,1442 469,1 0,0034
T. chuii 4,7074 290,6 0,0231
T. tetrathele 2,1347 330,8 0,0073
I. galbana 4,1361 380 0,0085
Quociente Fotossintético:
As espécies Chaetoceros affinis e C. muelleri apresentaram uma grande variação
nos resultados dos quocientes fotossintéticos. C. affinis com valores de 1,61 a 35,44 M
para a fração particulada e de 1,1 a 45,3 M para a produção total (ABM). Já C. muelleri
mostrou uma variação de 6,11 a 15,66 na produção particulada e 5,35 a 14,36 na
produção total (Fig 13a e 13a).
Os quocientes fotossintéticos mais baixos na produção particulada e total foram
apresentados pelas espécies Nannochloropsis oculata e Thalassiosira fluviatilis. N.
oculata com valores entre 0,23 e 0,66 M para produção particulada e 0,39 e 0,78M para
produção total. T. fluviatilis com valores de 0,41 a 0,86M na fração particulada e 0,31 a
0,49 M na produção total (Fig 14b e 14b).
As demais espécies apresentaram seus valores de quociente fotossintético entre
1,31 a 7,14M para fração particulada e 0,78 a 6,0M para produção total (ABM).
Figura 13: Quociente fotossintético para produção particulada das diferentes espécies
nas diferentes intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b = escala log-
decimal).
a
b
Figura 14: Quociente fotossintético para produção total das diferentes espécies nas
diferentes intensidades luminosas (mol/m
-2
/s
-1
) (a = escala linear, b = escala log-
decimal).
Lipídios totais e produção de biodiesel:
A extração da fração lipídica apresentou os seguintes resultados mostrou que a
espécie Nannochloropsis oculata tem a maior presença de lipídios que as outras duas
espécies testadas (Tabela 6).
Tabela – 6: Fração lipídica das algas mais produtivas.
Espécie Fração lipídica (mg/g
-1
de peso seco) % da fração lipídica
N.oculata 161,9 16,2
S. costatum 28,9 2,9
T. fluviatilis 27 2,7
Para a espécie Nannochloropsis oculata foi realizado um teste qualitativo para
produção de biodiesel com resultados positivos.
a
b
DISCUSSÃO:
Crescimento:
As espécies estudadas apresentaram curvas de crescimento com padrão similar
ao estabelecido para cultivos de fitoplâncton do tipo “batelada”, com as seguintes fases:
1) LAG ou de indução, fase inicial na qual não há aumento celular aparente; 2) LOG ou
Logarítmica, observada após a fase LAG, na qual a divisão celular é rápida e onde há
um aumento acentuado no número de células; 3) Estacionária, posterior a fase LOG,
onde o crescimento atinge um equilíbrio e 4) Declínio, ou Senescência, subseqüente a
fase Estacionária, onde ocorre a morte da maioria das células devido a algum fator
limitante (Fogg & Thake 1987). Entretanto, verifica-se que as espécies de microalgas
estudadas apresentaram tempos de duração diferentes de algumas das fases. Por
exemplo, Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Tetraselmis chuii e T.
tetrathele apresentaram fases LAG mais longas, enquanto que Thalassiosira fluviatilis,
Isochrysis galbana e Chaetoceros muelleri tiveram uma fase LAG muito curta. Além
disso, nem todas as espécies estudadas atingiram as fases Estacionária e de Declínio
durante o período de cultivo. É possível que alguns fatores como temperatura de cultivo,
salinidade, fotoperíodo e mesmo disponibilidade de nutrientes possa ter afetado o
crescimento destas algas de maneira diferente.
Apesar de não ter a maior taxa de crescimento, uma fase LAG curta
provavelmente possibilitou a Nannochloropsis oculata atingir o maior rendimento entre
todas as espécies estudadas ao final de cinco dias de cultivo. Por outro lado, T.
pseudonana apresentou uma alta taxa de crescimento exponencial e um curto tempo de
duplicação, mesmo assim obteve um baixo rendimento. O curto tempo de duração do
cultivo (5 dias) e a longa duração da fase LAG desta espécie influenciaram no resultado,
impedindo que um maior rendimento máximo fosse alcançado. Diferentemente, o baixo
rendimento da espécie Chaetoceros affinis pode ser explicado pela sua pequena taxa de
crescimento e conseqüentemente longo tempo de duplicação.
Considerando-se as 10 (dez) espécies testadas, Nannochloropsis oculata atingiu
os maiores valores de abundância celular, enquanto que Chaetoceros affinis foi a
espécie com menor taxa de crescimento no período de cinco dias. Nestes casos, parece
ter havido uma relação inversa entre o tamanho das células e a máxima abundância
alcançada, isto é, N. oculata, que foi a menor espécie estudada (2 – 3 m) atingiu a
maior abundância celular, enquanto que C. affinis, com diâmetro de 7 – 30 m,
apresentou o menor crescimento para o mesmo tempo de cultivo. Sabe-se que em
condições ótimas de cultivo o crescimento celular de células do fitoplâncton é
inversamente proporcional ao tamanho das células (Morris 1980). Isto se deve ao fato
de que uma maior área de superfície celular influencia positivamente a fotossíntese, já
que define a área que a energia da luz deverá ultrapassar para ser absorvida. Desta
forma, uma maior razão área/volume da célula aumenta o processo de absorção de luz e
entrada de nutrientes, acelerando o processo de divisão e crescimento (Andrews 1991).
Considerando-se os resultados de crescimento celular obtidos, pode-se dizer que
Nannochloropsis oculata, Skeletonema costatum e Chaetoceros muelleri foram as
espécies que atingiram maior crescimento celular e rendimento em curto espaço de
tempo sendo, por isso, indicadas para estudos posteriores de cultivos em larga escala.
Produção primária:
Produção primária é a quantidade de matéria orgânica acrescida pela fotossíntese
em um dado volume de água por intervalo de tempo (Lalli & Parsons 1993). A principal
forma para se medir produção primária é usar os elementos envolvidos na fotossíntese,
seja na forma de liberação do oxigênio ou como fixação do carbono e, em ambos os
casos, envolve a incubação de amostras de água durante um período de tempo (Williams
et al. 2002).
Medidas de produção primária pelo método de oxigênio são mais baratas e
rápidas em comparação com o método que utiliza o isótopo radioativo
14
C. Entretanto,
para transformarmos os valores de oxigênio em carbono é necessário se aplicar um fator
de conversão, conhecido como quociente fotossintético (QF), que é a razão molar entre
as taxas de produção de oxigênio e absorção de CO
2
. Este fator de conversão é
determinado a partir de medidas simultâneas de produção de O
2
e absorção de
14
CO
2
para uma mesma cultura de células, como realizado neste estudo. Desta forma com os
resultados aqui obtidos será possível determinar valores mais precisos de quociente
fotossintético, que poderão ser utilizados para a determinação dos valores de absorção
de CO
2
a partir de medidas de produção primária por oxigênio.
A avaliação da relação fotossíntese x irradiância (curvas PxI) é fundamental em
estudos de produção primária, porque mostra a eficiência com a qual uma espécie
consegue transformar a energia luminosa em energia química. Uma curva PxI apresenta
informações sobre a fisiologia da alga, qual sua capacidade fotossintética, o ponto
máximo de saturação de luz, isto é, onde ocorre a produção fotossintética máxima e
também como é seu comportamento em condições de pouca ou intensa luminosidade.
Variações nessas curvas podem indicar as respostas celulares às mudanças nas
condições ambientais, como mudanças de temperatura, salinidade, concentração de
nutrientes e disponibilidade de luz, podendo alterar os níveis de produção primária nas
diferentes intensidades luminosas (Macedo et al. 2002). Além disso, a análise destas
curvas apresenta particular relevância para se predizer os fluxos de carbono nos
oceanos, uma vez que ao se saber em que condições ocorre a máxima taxa fotossintética
de uma espécie é possível prever o seu florescimento do fitoplâncton nos oceanos. Tal
fato é importante principalmente para grandes microalgas que possuem rápida taxa de
sedimentação. Em um florescimento destas microalgas no oceano, há uma grande
fixação do carbono inorgânico da água através da fotossíntese e, conseqüentemente,
retirada deste gás da atmosfera. Através da sedimentação, grande parte do carbono
fixado pelas algas é transferido para o fundo dos oceanos, um processo conhecido como
“Bomba Biológica” (Falkowski & Raven 1997).
Neste estudo a realização de medidas de produção primária em diferentes
condições luminosas teve por objetivo identificar o nível ótimo de luz onde ocorrem as
maiores taxas de produtividade primária principalmente para se estabelecer quais
espécies poderão ser melhor cultivadas no verão (espécies adaptadas à luz), ou no
inverno (espécies adaptadas à sombra).
Medidas de Produção Primária por variação do Oxigênio dissolvido:
Tetraselmis tetrathele apresentou a maior produção de oxigênio, apesar de ter
apresentado a menor abundância celular e de concentração de clorofila no inicio dos
experimentos de produção. Além disso, como se verá adiante, esta espécie de microalga
não apresentou elevada taxa de incorporação de carbono medido pelo método de
14
C. A
fotossíntese é um processo químico que consiste na conversão de dióxido de carbono e
água em carboidratos, com produção de oxigênio (Hall & Rao 1980). Porém, em
experimentos que utilizam garrafas DBO, nem todo oxigênio medido provem da
fotossíntese. A fonte de nitrogênio utilizada pelas algas pode influenciar o resultado.
Por exemplo, quando o nitrato é a fonte principal de nitrogênio ele será reduzido à
amônia antes de ser assimilado, essa conversão resulta na produção de oxigênio
(Williams & Robertson 1991). Nesse trabalho a fonte de nitrogênio do meio utilizado
para o cultivo (f/2) foi nitrato o que, provavelmente, influenciou no resultado das
espécies que apresentaram uma alta liberação de oxigênio mas baixa fixação de carbono
como T. tetrathele.
As duas propriedades mais importantes de um curva de produção x intensidade
são a inclinação inicial da reta (α) e o P
máx
(Parsons et al.1984). Jassby e Platt (1976)
recomendam o uso de formulações matemáticas para o esclarecimento destes
parâmetros fisiológicos nos experimentos de fotossíntese. Entretanto, neste estudo os
parâmetros das curvas P x I são dados com base nas observações experimentais sem a
aplicação de nenhum modelo matemático para a padronização das curvas.
P
máx
é a taxa máxima de fotossíntese exibida por uma população de fitoplâncton,
este valor representa a capacidade fotossintética máxima por unidade de biomassa
(usualmente clorofila). Nem sempre o P
máx
alcançado em um experimento representa
exatamente o valor para a espécie, ele provavelmente será um valor aproximado, uma
vez que o P
máx
real pode estar entre duas intensidades luminosas medidas. Além disso,
mesmo havendo um controle sobre as condições ótimas desejadas para o experimento,
as variações de temperatura, nutrientes e luz podem alterar o cultivo.
Populações naturais apresentam um P
máx
entre 0,5 e 30 mg O
2
mg chla
-1
h
-1
,
(Morris, 1980). Neste trabalho Nannochloropsis oculata apresentou P
máx
de 18,64 mg
O
2
mg chla
-1
h
-1
um resultado maior do que o apresentado por Yamasaki & Yamaoka
(2001) (13,8 mg O
2
mg chla
-1
h
-1
) em experimento para avaliar o efeito da concentração
de carbono inorgânico dissolvido (DIC) na produção de oxigênio
A inclinação inicial de uma curva PxI é definida como o “rendimento quântico”
ou “eficiência fotossintética” (Parsons et al.1984), e depende do conteúdo de pigmentos
da célula e de suas características de absorção. Esta é uma medida da máxima eficiência
quântica da fotossíntese (Morris 1980) e, em geral, resultaria das mudanças fisiológicas
e bioquímicas da célula (Lalli & Parsons 1993). Diversos fatores podem afetar o valor
do rendimento quântico como, por exemplo, a presença de pigmentos acessórios que
aumentam a eficiência fotossintética. Além disso, o rendimento quântico pode mudar,
dependendo do estado fisiológico da alga e as suas condições de crescimento.
Chaetoceros muelleri apresentou o maior rendimento quântico considerando a sua
produção de oxigênio. A presença de pigmentos acessórios pode ter contribuído para a
maior eficiência quântica desta espécie.
A luz é um dos principais fatores limitantes do crescimento de microalgas, tanto
num nível máximo quanto no mínimo. Segundo Morris (1980), espécies adaptadas à
sombra mostram fotoinibição já em baixas intensidades luminosas, enquanto que
espécies adaptadas à luz tendem a ter menor eficiência fotossintética, mas parecem ser
menos suscetíveis a fotoinibiçao. No ambiente, a intensidade luminosa que atinge a
camada eufótica controla o ecossistema aquático por meio da sua influência sobre a
produção primária. Em comunidades mistas sob condições de sombreamento as algas
adaptadas a sombra são mais competitivas (Odum 1988). Enquanto que em situações de
altas intensidades, as microalgas adaptadas à luz não são inibidas e crescem melhor.
Com os dados de produção de oxigênio foi possível observar adaptações às
intensidades luminosas nas espécies estudadas. Por exemplo, C. muelleri, Tetraselmis
chuii e Isochrysis galbana, mostraram uma maior produção de oxigênio em altas
intensidades luminosas, indicando uma adaptação à elevada luminosidade na coluna de
água. Thalassiosira pseudonana e T. fluviatilis não foram tão produtivas mas também
apresentaram uma maior produtividade em altas intensidades. Já Nannochloropsis
oculata foi mais produtiva em intensidades luminosas mais baixas, indicando uma
adaptação à sombra.
Considerando-se a possibilidade de que os elevados valores de produção de
oxigênio não seja resultado direto da fotossíntese, não seria indicado utilizarmos
Tetraselmis tetrathele para um cultivo em larga escala. Neste caso, Nannochloropsis
oculata e Isochrysis galbana aparecem como as espécies mais produtivas, em termos de
liberação de O
2
.
Medidas de produção primária pelo método de
14
C:
Nannochloropsis oculata apresentou a mais alta taxa de produção particulada.
Com este resultado podemos calcular uma absorção aproximada de 17 a 32 Ton.C ha
-
1
.ano
-1
, este valor está de acordo com o citado por Margalef (1977) para microalgas
cultivadas (11 – 36 Ton.C ha
-1
.ano
-1
). Devido ao seu tamanho (2 – 4 m) essa espécie é
classificada como picoplâncton. Em muitos ecossistemas pelágicos (oceano aberto) as
algas do picoplâncton são os principais produtores primários (Van Den Hoek et al.
1995).
A diatomácea Thalassiosira fluviatilis apresentou valores altos para fixação de
carbono. Na produção particulada apresentou maior fixação de carbono em altas
intensidades luminosas, assim como na liberação de oxigênio, o que comprova sua
adaptação à condições de maior luminosidade. Da mesma forma, os altos valores de
P
máx
para o carbono particulado e total em altas intensidades luminosas encontrados
para Chaetoceros muelleri, Tetraselmis chuii e Isochrysis galbana reforçam a afirmação
de que estas espécies também estão adaptadas à condições de maior luminosidade.
Para microalgas em cultura o P
máx
pode variar de 1,1 a 6,2 mg C mg chla
-1
h
-1
e
de 0,1 a 6,0 mg C mg chla
-1
h
-1
para populações naturais, entretanto alterações podem
ocorrer. Neste estudo S. costatum apresentou P
máx
de 6,08 mg C mg chla
-1
h
-1
mas em
florações massivas desta alga esse valor pode variar de 9,0
a 16,9 mg C mg chla
-1
h
-1
(Parsons et al. 1984).
Um alto rendimento quântico encontrado para C. muelleri na produção
particulada, provavelmente pelos motivos expostos anteriormente, ou seja, influência de
pigmentos acessórios na absorção da luz.
O método ABM (Schindler et al. 1972) para medidas de produção primária total
com
14
C foi uma técnica alternativa criada para reduzir os erros associados com a
filtração e para acrescentar a fração dissolvida da produção primária não considerada
pela técnica de filtração de Steeman Nielsen (1952). Na maioria das espécies não foram
encontradas grandes diferenças entre os resultados de produção particulada e produção
total (ABM). Entretanto, no caso das espécies Chaetoceros affinis, C. muelleri,
Skeletonema costatum e Thalassiosira. fluviatilis a produção dissolvida representou
grande parte da produção total chegando a 58% em C. muelleri, o que demonstra a
importância de se medir esta fração também. Desta forma, como também sugerido por
Abreu et al. (1994), o método ABM seria mais acurado por considerar as duas frações
da produção primária.
Nos valores mais baixos de produção, comparando os resultados da produção
total (ABM) com a produção total (particulada + dissolvida), a disperssão dos dados é
menor. A medida que aumentam os valores de produção aumenta a disperssão dos
dados, isto indica que quanto maior os resultados de produção maior a possibilidade de
ocorrer erros ao se utilizar somente um dos métodos de
14
C, principalmente em
experimentos com microalgas em cultivo ou que tenham uma alta produção de carbono.
Considerando os valores de fixação de carbono, N. oculata e T. fluviatilis
parecem ser as espécies mais indicadas para um cultivo em larga escala visando uma
grande absorção de carbono.
Quociente fotossintético:
O quociente fotossintético é a razão molar da taxa de oxigênio produzida e o
carbono assimilado e varia como uma função da fonte de nitrogênio utilizada (Macedo
et al. 2002).
Os altos quocientes fotossintéticos encontrados na maioria das espécies
provavelmente são resultado da conversão de nitrato para amônia o que resulta na
produção de duas moléculas de oxigênio por átomo de nitrogênio assimilado, além
disso, a formação de produtos fotossintéticos ou compostos orgânicos também elevam
os valores dos quocientes fotossintéticos (Williams & Robertson 1991).
Apesar de nitrato ser a fonte de nitrogênio do meio de cultivo utilizado nos
experimentos, N. oculata e T. fluviatilis apresentaram quocientes fotossintéticos baixos,
inferiores a 1,0. Segundo Williams et al. (2002) valores de quociente fotossintético
menores que 0,75 resultam da fotorespiração. Fotorespiração é um metabolismo
semelhante à respiração mitocondrial, com consumo de oxigênio e liberação de dióxido
de carbono, porem ocorrendo somente na presença de luz. O substrato inicial para o
metabolismo fotorespiratório é a RuBP (ribulose bifosfato), a qual não é somente um
aceptor de CO
2
mas também de oxigênio. A oferta de CO
2
e de O
2
direciona o
comportamento da enzima RuBP carboxilase/oxigenase como catalisadora de
carboxilação (fotossíntese) ou de oxidação (fotorespiração) (Larcher 2000). Valores
altos de oxigênio favorecem a fotorespiração. A fixação do gás carbônico e liberação do
oxigênio aumentam com o incremento da atividade fotossintética. Desta forma, o
aumento da produção de oxigênio dentro das garrafas devido a alta atividade
fotossintética pode ter iniciado um processo de fotorespiração com o consumo deste O
2
em excesso e liberação de CO
2
, o que provavelmente resultou em baixos valores de
oxigênio, reduzindo o quociente fotossintético. Desta forma, pode-se dizer que a
fotorespiração é um importante processo que pode limitar a fixação do carbono
(Williams et al. 2002).
Abreu (1992) também observou valores mais baixos de quociente fotossintético
quando incluiu os resultados de carbono orgânico dissolvido no cálculo desta razão, ou
seja ao calcular o QF com a produção total (ABM) os valores são mais baixos. Isto
confirma a importância de considerar a fração dissolvida da produção primária para
melhor estimar o quociente fotossintético.
Entretanto, podemos dizer que as grandes variações nos valores dos quocientes
fotossintéticos deve-se as diferenças observadas entre os dois métodos. Principalmente
pelo fato de que cada um mede diferentes processos metabólicos, ou seja, o método de
oxigênio mede o fluxo total de energia nas células durante a fotossíntese, enquanto que
o método de
14
C indica a quantidade de carbono fixado como matéria orgânica.
A eficiência com a qual o aparato fotossintético de uma célula pode fazer uso da
energia absorvida para fixar carbono varia de uma espécie para outra e depende das
condições ambientais e de seu estado fisiológico, ou seja, fatores como temperatura, luz,
nutrientes e condições de cultivo podem acentuar maiores diferenças na produção de
oxigênio e absorção de carbono por uma mesma espécie (Kirk 1994).
Potencialidade das espécies para cultivo em larga escala:
De acordo com os resultados de crescimento e produção primária quatro
espécies apresentam potencial para a produção em larga escala. São estas:
Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae), Thalassiosira fluviatilis, Skeletonema
costatum (Bacillariophyceas) e Isochrysis galbana (Haptophyceae). Estas espécies
alcançaram altas abundâncias celulares e rápido crescimento, além de apresentaram uma
alta fixação de carbono e boa produção de oxigênio. Outras vantagens de cada uma
estão detalhadas abaixo.
Nannochloropsis oculata é amplamente utilizada na aqüicultura, principalmente
como alimento para o zooplâncton que é fornecido a peixes e crustáceos cultivados.
Esta espécie apresenta uma boa qualidade nutricional (Rocha et al. 2003), é fonte de
importantes ácidos graxos polinsaturados (Brown 2002) e de pigmentos (Lubián et al.
2000). Esta espécie mostrou uma adaptação à sombra, o que recomendaria o seu cultivo
em estações do ano em que há menor radiação solar e temperaturas amenas, já que a
temperatura ótima para esta espécie é 20 ºC. A grande produção de ácidos graxos
polinsaturados de cadeia longa (Tonon et al. 2002) indica a potencialidade desta alga
para a produção de produtos para consumo humano de interesse nutricional e
terapêutico, uma vez que estes estão associados com menores incidências de problemas
do coração (Metting & Pyne 1986).
Thalassiosira fluviatilis mostrou uma alta fixação de carbono. Por ser uma
diatomácea, as quais são consideradas peças chave no ciclo biogeoquimico do carbono
de acordo com o conceito de “bomba-biológica” (Smetacek 1999), e tendo aplicação
prática na aqüicultura como alimento devido ao alto teor de proteína e ácidos graxos
(Brown 2002) esta microalga pode ser indicada para o cultivo em larga escala e em
estações do ano com intensidades luminosas mais altas uma vez que essa espécie
mostrou-se adaptada a luz.
Outra diatomácea indicada para o possível cultivo em larga escala é a espécie
Skeletonema costatum, que possui a vantagem de ser encontrada em grande quantidade
na região do estuário da Lagoa dos Patos. Ela é abundante em águas costeiras próximas
a desembocadura do Estuário da Lagoa dos Patos (Odebrecht & Garcia, 1998) e na
primavera e verão é comum a sua floração com a entrada de águas marinhas no estuário
(Odebrecht & Abreu 1998). Além disso, é uma microalga eurihalina, ou seja, aceita
grande variação de salinidade. Nesse estudo essa microalga cresceu bem em intensidade
luminosa média, porém, segundo Abreu (1992) esta espécie parece estar adaptada a alta
intensidade o que torna possível seu cultivo no verão. Esta espécie tem boa qualidade
nutricional (Borowitzka 1997; Brown 2002), apresenta propriedade antibacteriana
(Metting & Pyne 1986) e é usada na aqüicultura como alimento para larvas de
crustáceos e moluscos bivalves, principalmente Crassostrea gigas (Muller-Feuga 2000).
Outra microalga indicada para um cultivo em larga escala é Isochrysis galbana.
que apresentou um rápido crescimento, uma alta liberação de oxigênio e de fixação de
carbono. Esta espécie tem amplo uso na aqüicultura (Borowitzka 1997; Duerr et al.
1998; Wikfors & Ohno 2001; Brown 2002) e é adaptada a altas intensidades luminosas,
podendo ser cultivada no verão já que sua temperatura ótima é 27 ºC (Kaplan et al.
1986).
Potencial para a produção de Biodiesel pelas espécies que apresentaram maiores
valores de Produção Primária:
Os cultivos de microalgas em larga escala requerem um barato e eficiente
método, o qual seja compatível com a aplicação final da alga, uma vez que o principal
problema dos cultivos é o custo de produção (Borowitzka 1997). Neste sentido, investir
em pesquisas para produzir um produto de valor comercial agregado a espécie cultivada
tornaria a produção de microalgas mais rentável.
Devido sua alta produtividade e com os resultados dos níveis de lipídios
podemos dizer que a espécie Nannochloropsis oculata tem grande potencial na
produção de bio-combustíveis. Testes preliminares de produção de lipídio por esta
microalga mostram que a quantidade de lipídios representa aproximadamente 16% de
seu peso seco. Além disso, foi realizado um teste qualitativo que atestou a possibilidade
de produzir biodiesel com esta espécie.
As espécies T. fluviatilis e S. costatum apesar da boa produtividade apresentaram
apenas cerca de 2,8% de peso seco em fração lipídica, um valor aparentemente baixo
para possibilitar a produção de biocombustivel. Entretanto, sabe-se que o teor lipídio
das microalgas varia de acordo com seu estado fisiológico e condições do meio como
nutrientes, luz, temperatura, salinidade, fase de cultivo etc. Assim, estudos para testar
esses parâmetros visando à obtenção de uma maior produção de ácidos graxos nestas
espécies teriam grande relevância.
CONCLUSÕES:
As espécies N. oculata, T. fluviatilis, S. costatum e I. galbana seriam as
indicadas entre as espécies estudadas para futuros estudos visando cultivos em larga
escala na região por preencher os requisitos propostos nos objetivos do trabalho:
maiores taxas de absorção de carbono e valor comercial. Podendo potencialmente ser
empregadas como um mecanismo de desenvolvimento limpo (MDL).
Perspectivas futuras:
É necessário testar estas espécies mais produtivas em cultivos em média escala
Além disso, testes com resultados quantitativos precisam ser realizados para que estas
microalgas possam ser utilizadas como matéria-prima para produção de biodiesel ou de
outros produtos com interesse econômico.
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Anexo 1: Dados brutos de oxigênio (mgO
2
/mg Chl-a
-1
L
-1
h
-1
), de carbo
no particulado, dissolvido e
total (mgC/mg Chl-a
-1
L
-1
h
-1
) e de quociente fotossintético.
Espécie Part Disol Total O
2
Luz
14
C
Luz O
2
QF. Part
QF. Total
13,728 0,341 11,725 7,49 82,5 47,2 0,41 0,48
15,313 0,331 12,167 9,93 101,5 63,6 0,49 0,61
18,463 0,419 14,098 12,54 139,6 91,3 0,51 0,67
20,539 1,819 17,428 18,12 194,9 155,2 0,66 0,78
29,184 1,679 19,631 18,64 262,6 231,0 0,48 0,71
33,807 1,609 21,988 14,81 368,5 368,8 0,33 0,51
26,946 1,367 18,117 13,07 549,1 507,4 0,36 0,54
Nannochloropsis
oculata
26,353 0,943 15,598 8,19 780,4 750,9 0,23 0,39
1,6875 0,4188 1,7375 5,58 90,2 54,0 2,48 2,41
2,0527 0,6371 2,4921 6,90 111,7 68,6 2,52 2,08
2,6412 0,4724 2,9990 8,32 141,0 107,0 2,36 2,08
2,9116 0,5934 3,2259 12,04 194,5 163,0 3,10 2,80
2,6336 0,2453 3,2887 12,92 248,3 237,9 3,68 2,95
3,3207 0,2022 3,3441 12,92 335,8 313,8 2,92 2,90
2,5955 0,1345 2,5630 13,24 469,4 450,5 3,83 3,88
Thalassiosira
pseudonana
3,1813 0,1683 3,3516 13,35 648,3 645,6 3,15 2,99
7,4975 3,5715 11,5815
5,12 65,0 31,8 0,51 0,33
7,4494 3,5213 12,7528
5,74 77,6 43,6 0,58 0,34
5,9868 2,4040 10,6501
6,90 89,1 66,9 0,86 0,49
10,9089
5,6933 17,2154
8,47 113,8 98,7 0,58 0,37
12,6946
6,6712 22,6811
9,38 162,9 164,0 0,55 0,31
14,2449
5,9562 19,7745
9,51 241,7 210,4 0,50 0,36
13,4371
3,4220 19,4591
9,68 339,9 335,7 0,54 0,37
Thalassiosira
fluviatilis
17,6832
1,8873 19,6478
9,76 542,0 627,2 0,41 0,37
1,9546 1,2583 3,2412 3,70 81,7 32,3 1,42 0,86
1,8335 1,1121 2,9314 4,08 83,4 44,6 1,67 1,04
2,2611 1,5222 3,9187 4,08 90,1 62,4 1,35 0,78
2,3091 1,4960 4,0817 5,34 114,7 83,4 1,73 0,98
2,4023 1,6250 4,3468 7,92 159,0 128,8 2,47 1,37
3,2644 2,5809 6,0765 9,55 244,5 188,2 2,19 1,18
2,9193 2,0043 5,3797 8,99 425,3 320,6 2,31 1,25
Skeletonema
costatum
1,9756 1,3307 3,5817 8,39 634,5 622,2 3,19 1,76
2,9864 0,0330 1,7163 4,53 74,9 41,7 1,14 1,98
3,8534 0,0253 2,2449 5,79 94,7 57,7 1,13 1,93
3,2501 0,0425 2,5000 7,82 125,2 79,9 1,80 2,34
4,4612 0,0248 2,0721 9,22 177,3 115,2 1,55 3,34
3,7569 0,0180 2,1145 10,47 262,2 178,8 2,09 3,71
4,3253 0,0280 1,8829 10,62 383,9 297,5 1,84 4,23
4,1482 0,0237 2,1079 10,28 522,5 475,2 1,86 3,66
Phaeodactylum
tricornutum
3,2358 0,0341 1,7821 9,65 717,0 709,4 2,24 4,06
Continuação...
Part Disol Total O2 Luz 14C
Luz O2
QF. Part
QF. Total
0,0912 0,0855 0,1767 3,12 3,65 1,9
0,0188 0,0077 0,0222 2,81 14,68 11,9
0,0599 0,0070 0,0636 3,22 5,67 5,1
0,0886 0,0070 0,0967 3,53 4,24 3,8
0,1354 0,0771 0,2160 3,63 2,87 1,8
0,2166 0,1330 0,3110 3,22 1,61 1,1
0,0074 0,0033 0,0128 3,12 35,44 20,7
Chaetoceros
affinis
0,0053 0,0009 0,0009 1,99
68,8
89,8
101,5
110,9
135,9
235,1
350,7
610,9 29,40 45,3
0,0807 0,1131 0,0927 6,78 104,2 75,1 6,11 5,35
0,0980 0,1051 0,0651 8,69 131,4 94,9 6,48 9,67
0,1121 0,0976 0,1202 11,61 147,6 124,8 7,60 7,11
0,0665 0,0716 0,1345 14,42 197,2 185,7 15,66 7,90
0,1069 0,0395 0,1395 16,78 260,9 288,8 11,50 8,87
0,1064 0,0408 0,0912 17,90 354,0 384,8 12,32 14,36
0,0985 0,0472 0,1442 18,58 469,1 526,7 13,79 9,50
Chaetoceros
muelleri
0,1483 0,0236 0,1169 19,47 596,0 653,6 9,68 12,25
1,9973 0,3446 2,0331 4,94 72,3 47,8 1,85 1,82
2,1379 0,2606 2,1167 7,73 90,4 61,0 2,71 2,74
3,2258 0,3332 2,9777 9,12 113,2 83,4 2,12 2,30
3,9674 0,2696 3,3887 10,23 143,5 126,0 1,93 2,26
3,9299 0,3123 3,0051 15,05 207,4 172,4 2,87 3,76
5,1186 0,4140 4,7074 14,64 290,6 268,8 2,15 2,33
4,1859 0,2930 3,3761 17,43 461,0 432,9 3,12 3,87
Tetraselmis
chuii
5,0705 0,6891 3,6183 15,63 643,7 651,7 2,31 3,24
1,7746 0,0425 1,3714 38,20 91,58 64,165 1,61 2,09
1,8132 0,0553 1,3962 42,55 106,7 99,27 1,76 2,29
1,9703 0,0432 1,4216 39,65 128,1 129,17 1,51 2,09
2,1622 0,0546 1,9216 48,35 163,7 167,55 1,68 1,89
2,6621 0,0523 1,9276 47,38 223,8 240,3 1,33 1,84
2,8759 0,0573 2,1347 58,99 330,8 319,5 1,54 2,07
2,7333 0,0512 1,4160 47,87 516,2 467,35 1,31 2,54
Tetraselmis
tetrathele
2,4924 0,0445 1,6314 53,19 676,4 774,9 1,60 2,45
1,8171 0,4006 1,8348 6,30 109,4 66,8 2,60 2,58
2,0719 0,5084 1,9968 8,88 135,0 86,3 3,21 3,33
2,4454 0,5315 2,5973 12,51 189,9 123,4 3,84 3,61
2,1956 0,7249 2,9490 14,97 226,3 162,8 5,11 3,81
2,5144 0,8670 3,5968 20,00 291,7 243,0 5,97 4,17
2,5038 1,0069 4,1361 21,52 380,0 365,2 6,45 3,90
2,3595 1,0066 3,9806 22,46 502,3 511,4 7,14 4,23
Isochrysis
galbana
2,5327 0,6391 2,7655 22,11 669,6 726,4 6,55 6,00
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