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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS, AMBIENTAIS E BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DENSIDADE POPULACIONAL, DIVERSIDADE GENÉTICA E
ATIVIDADE DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE
ACTINOMICETOS ASSOCIADOS À RIZOSFERA DE
CACAUEIRO
TÂMARA RODRIGUES BARRETO
CRUZ DAS ALMAS - BAHIA
MARÇO - 2007
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DENSIDADE POPULACIONAL, DIVERSIDADE GENÉTICA E
ATIVIDADE DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE
ACTINOMICETOS ASSOCIADOS À RIZOSFERA DE
CACAUEIRO
TÂMARA RODRIGUES BARRETO
Engenheiro Agrônomo
Universidade Estadual de Santa Cruz, 2003
Dissertação submetida à Câmara de Ensino de
Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade
Federal do Recôncavo da Bahia como requisito
parcial para obtenção do Grau de Mestre em
Ciências Agrárias, Área de Concentração:
Fitotecnia.
Orientador: Prof
ª
Drª. Ana Cristina Fermino Soares
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CRUZ DAS ALMAS - BAHIA - 2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
B273 Barreto, Tâmara Rodrigues
Densidade populacional, diversidade genética e atividade de
promoção de crescimento de actinomicetos associados à rizosfera
de cacaueiro / Tâmara Rodrigues Barreto. - Cruz das Almas, BA,
2007.
56f. : il., tab.
Orientador: Prof. Dr. Ana Cristina Fermino Soares
Dissertação (Mestrado) – Centro de Ciências Agrárias,
Ambientais e Biológicas, Universidade Federal do Recôncavo da
Bahia, 2007.
1. Cacau – diversidade populacional. 2. Cacau – diversidade
genética 3. Cacau – crescimento. I. Universidade Federal do
Recôncavo da Bahia, Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e
Biológicas. II. Título.
CDD 20.ed. 633.74
Esta dissertação dedico aos
meus amados Pais, Ademir
Barreto e Noélia Barreto e ao
meu querido irmão Tarcizo
Barreto pelo significado único
que tens em minha vida. O que
sou e o que serei devo a vocês.
Ofereço ao meu noivo
Augusto César que tem
dado um novo sentido a
minha vida.
AGRADECIMENTOS
A DEUS que me concedeu o Dom da Vida;
Aos meus pais Ademir Barreto e Noélia Barreto pelo amor,
ensinamentos, exemplos e incentivos concedidos em todas as horas;
Ao meu irmão Tarcizo Barreto pela grande amizade e companheirismo;
A Augusto César pelo importante apoio emocional e profissional,
tornando essa caminhada mais agradável;
À orientadora Profª. Drª. Ana Cristina F. Soares pela amizade, atenção e
valiosos ensinamentos;
Ao co-orientador Prof. Dr. Jorge T. de Souza pela amizade, dedicação,
paciência e exemplo de profissionalismo;
Ao Prof. Pesquisador George Sodré e a Msc. Carla Sousa pela atenção
e presteza nos trabalhos realizados;
Aos meus Tios e Primos que torceram por mais esta vitória;
Aos colegas de mestrado, em especial a Edivânia, Cândice, Geógenes,
Lauro, Leônidas, Márcio Gil, Maria Alice e Zuzinaide pelo convívio amigável
durante o curso;
Aos estagiários e técnicos do Laboratório de Fitopatologia e
Microbiologia Agrícola da UFRB por estarem sempre dispostos a ajudar;
À Universidade Federal do Recôncavo da Bahia – UFRB pela
oportunidade da realização do Curso de Mestrado;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pela bolsa de estudos concedida desde a iniciação científica;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela
concessão do auxílio ao projeto de dissertação;
À CEPLAC e ao IBC pela infra-instrutura e auxílio dos seus funcionários,
sem os quais não seria possível a conclusão desta dissertação;
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho.
...............
Três Coisas
”De tudo, ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que é preciso continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto, devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro... “
(Fernando Pessoa)
SUMÁRIO
Página
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO ...........................................................................................
01
Capítulo 1
Densidade populacional, diversidade genética e atividade de promoção
de crescimento de actinomicetos associados à rizosfera do cacaueiro.....
11
CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................ 42
ANEXO........................................................................................................ 44
DENSIDADE POPULACIONAL E DIVERSIDADE GENÉTICA E ATIVIDADE
DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE ACTINOMICETOS ASSOCIADOS À
RIZOSFERA DE CACAUEIRO
Autor: Tâmara Rodrigues Barreto
Orientadora: Ana Cristina Fermino Soares
RESUMO: Apesar da reconhecida importância das bactérias promotoras de
crescimento, apenas um reduzido número de estudos foi conduzido com este
grupo de microrganismos na cultura do cacaueiro. Os objetivos deste trabalho
foram o estudo da densidade populacional, diversidade genética, atividade
fisiológica e o potencial de actinomicetos associados à rizosfera de cacaueiro
no crescimento de mudas desta cultura. A densidade populacional de
actinomicetos foi semelhante no solo e nas raízes de cacaueiro. Entretanto,
houve uma tendência da densidade populacional destes microrganismos ser
maior em amostras onde ocorreram menores densidades de bactérias totais.
Todos os isolados selecionados para este estudo foram classificados através
de análises de seqüências da
-subunidade do gene rpoB como pertencentes
ao gênero Streptomyces. Dentre os isolados testados, constatou-se in vitro, a
produção de celulase, xilanase, quitinase, ácido indolacético e a capacidade de
solubilização de fosfato. Apenas os isolados AC 103 e AC 26 foram capazes de
promover o crescimento de mudas vegetativas de cacaueiro. Estes isolados
apresentam potencial para serem utilizados na produção de mudas clonais de
cacaueiro a partir de estacas.
Palavras-Chave: Streptomyces spp., gene rpoB, Theobroma cacao.
POPULATION DENSITY, GENETIC DIVERSITY AND ACTIVITY FOR
GROWTH PROMOTING OF ACTINOMYCETES ASSOCIATED TO CACAO
Author: Tâmara Rodrigues Barreto
Advisor: Ana Cristina Fermino Soares
ABSTRACT: In spite of the acknowledged importance of growth-promoting
bacteria, only a reduced number of studies were conducted with these
microorganisms on cacao. The objectives of this work were to study the
population densities, genetic diversity, physiological activity and the potential of
actinomycetes associated with cacao rhizosphere on growth of cacao clones
obtained from stem cuttings. The populations densities of actinomycetes were
similar in soil and on cacao roots. However, actinomycete population densities
tended to be higher in samples with the lowest densities of total aerobic
bacteria. All isolates selected and used in this study were classified through
sequence analyses of the -subunit of the rpoB gene as species belonging to
the genus Streptomyces. In vitro cellulolytic, xilanolytic and chitinolytic activity,
indolacetic acid production and phosphate solubilization activity were observed
for the isolates tested in this study. Only isolates AC 103 and AC 26 were able
to induce better growth of cacao clones from stem cuttings. These isolates
show potential to be applied on the production of cacao clones propagated
through stem cuttings.
Key-words: Streptomyces spp., gene rpoB, Theobroma cacao.
INTRODUÇÃO
O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma espécie nativa da floresta
tropical úmida americana e representa uma cultura de importância mundial,
pois sua amêndoa é matéria prima para fabricação de chocolate. Tem um
enorme valor social e ecológico para o Brasil, por empregar mão-de-obra local
e por ser uma planta cultivada em sub-bosque, preservando a floresta. O
declínio da produção cacaueira brasileira, causado pela doença vassoura-de-
bruxa (Moniliophthora perniciosa), aliado à queda dos preços internacionais
vem contribuindo para o êxodo rural no Sul da Bahia, principal região produtora
de cacau neste Estado (SANTOS FILHO et al., 1998).
O uso de variedades resistentes aos patógenos é a forma mais efetiva e
duradoura de controle de enfermidades (ALMEIDA et al., 2001). Visando à
recuperação da lavoura no sul da Bahia, variedades clonais de cacaueiro,
resistentes à vassoura-de-bruxa vêm sendo lançadas pela CEPLAC (Comissão
Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira) e distribuídas pelo Instituto
Biofábrica de Cacau (IBC). O IBC é uma Instituição sem fins lucrativos criada
pelo Governo do Estado da Bahia para a produção em larga escala, de mudas
de clones de cacaueiros resistentes à vassoura-de-bruxa, por via vegetativa.
Contudo, algumas etapas do protocolo do IBC para a produção de mudas de
cacaueiro por estaquia necessitam de melhor adequação para atender às
exigências da cultura e diminuir os custos de produção da muda. O elevado
custo do substrato comercial utilizado pelo IBC e a baixa taxa de enraizamento
de alguns clones de cacaueiro estão entre os principais fatores que afetam
negativamente a produção dessas mudas.
Estudos relatam que os índices de enraizamento aumentam com a
utilização de plantas matrizes mais jovens e que o uso de reguladores de
crescimento pode incrementar consideravelmente o índice de enraizamento
(EVANS, 1953). Sodré et al. (2006) sugerem o uso de miniestacas para a
formação de mudas de cacaueiro permitindo desta maneira, explorar melhor a
maior capacidade de enraizamento do material propagativo juvenil,
aumentando os níveis de enraizamento e diminuindo os custos da formação de
mudas de materiais clonais. De acordo com estes autores, as miniestacas são
retiradas de ramos plagiotrópicos coletados de plantas matrizes e medem
aproximadamente 4 a 6 cm de comprimento.
O enraizamento de estacas de cacaueiro tem sido utilizado
comercialmente em Trinidad, Granada, Jamaica e na República Dominicana.
Nesses países, são utilizadas estacas semilenhosas, com folhas reduzidas à
metade e tratadas com uma mistura de ácido indolbutírico (AIB): ácido
indolacético (AIA) na proporção de 1:1 em solução de álcool e água. O
substrato utilizado é composto de areia e pó de serra (MOOLEEDHAR, 2000).
No equador, as estacas de cacaueiro são herbáceas com folhas reduzidas a
40-50 % do tamanho original e tratadas com mistura de AIB + ANA (ácido
naftaleno acético) na proporção de 1:1, em solução de álcool 50 %. O substrato
utilizado é composto de solo franco limoso, esterco curtido, areia e casca de
arroz na proporção de 8:3:2:2 (CRESPO, 2000).
Substratos são utilizados no mundo todo para o cultivo de plantas e são
chamados de cultivo sem solo ou “soiless culture”. Este termo refere-se a
qualquer sistema de produção de plantas baseado em meios distintos de solo
para o estabelecimento das raízes, embalado em recipientes de qualquer
material, forma e tamanho (MILNER, 2006). A substituição do solo por
substratos para a produção de mudas apresenta diversas vantagens, como a
possibilidade de cultivo em áreas com más condições físicas e químicas, em
locais com doenças de solo e com má qualidade de água para irrigação. Em
sistemas de produção de mudas em substratos, tem se observado elevada
produtividade e qualidade nutricional e fitossanitária das mudas, quando
comparadas àquelas produzidas em solo, devido à otimização das condições
na rizosfera, como a relação ar/água, concentração de nutrientes e adequados
valores de CE e pH, além de poder produzir novas plantas que não se
desenvolveriam bem em solos locais (MILNER, 2006).
Independente do tipo e origem da matéria-prima, as principais
características de um bom substrato devem ser a ausência de patógenos,
2
custo reduzido, acessibilidade no mercado, resistências a variações químicas e
físicas, elevada porcentagem de água disponível à planta, boa aeração, alta
capacidade de troca catiônica, presença de macro e micronutrientes
assimiláveis e pH entre 5 e 7 (REJOVOT, 1994). Além disso, a relação C/N
deve estar próxima de 40:1 e os teores de tanino devem ser baixos, isto
porque, estes compostos presentes nos substratos diminuem a atividade
microbiana e reduzem o crescimento de raízes, enquanto a alta relação C/N
promove imobilização do nitrogênio com danos ao crescimento da planta
(SODRÉ et al., 2006).
Estudos desenvolvidos por Sodré et al. (2006) indicam que a utilização
do substrato alternativo à base de tegumento de amêndoa de cacau e
serragem de madeira, beneficia significativamente o processo de produção de
mudas de cacaueiro, diminuindo o custo de produção da muda e melhorando a
sua qualidade fitossanitária e nutricional.
O melhor aproveitamento de substratos orgânicos para a produção de
mudas pode ainda ser obtido com a inoculação das plantas e do substrato com
microrganismos benéficos como as Bactérias Promotoras do Crescimento de
Plantas (BPCPs) (SOUSA et al., 2006). Estas possuem um importante papel
como promotoras de crescimento vegetal, pela ação direta através da
solubilização de nutrientes do substrato, produção de substâncias reguladoras
de crescimento de plantas (CATTELAN, 1999) e pela ação indireta, através do
controle de patógenos que limitam o crescimento das plantas. Além disso, a
associação de plantas com estes microrganismos que apresentam a
capacidade de seqüestrar ou degradar moléculas tóxicas às plantas pode
tornar possível a recuperação de áreas contaminadas, permitindo o
desenvolvimento de culturas de importância econômica nestes ambientes
(OLIVEIRA et al., 2003).
A promoção de crescimento em plantas tem sido observada em diversos
trabalhos com as BPCPs. Os principais grupos destes microrganismos
promotores de crescimento de plantas são as Pseudomonas spp., Bacillus spp.
e Streptomyces spp. (PIZZINATTO et al., 1996). Foram obtidos incrementos de
21,53 % no crescimento da parte aérea e de 94 % na produção de matéria de
seca de raízes de tomateiro, com a inoculação de Streptomyces spp. (LIMA,
2003). Na cultura da cenoura foi observado um aumento de 48 % na produção
3
com a inoculação de Bacillus subtilis (TURNER et al., 1991) e de até 150 % em
plantas de rabanete inoculadas com Pseudomonas spp. (KLOEPPER et al.,
1981).
Espécies do gênero
Streptomyces, coletivamente denominadas de
estreptomicetos, são actinomicetos comumente encontrados no solo, porém
podem também ocorrer em diferentes ambientes aquáticos, como pântanos e
folhagens em decomposição (OTINIANO, 2006). No solo, a população de
Streptomyces spp. pode atingir valores variando entre 10
4
a 10
7
UFC/g de solo
seco, ocorrendo principalmente na forma de esporos (ARAÚJO, 1998).
Os estreptomicetos são bactérias Gram-positivas, aeróbicas estritas,
filamentosas, que sofrem mudanças morfológicas em todo seu ciclo de vida. O
gênero
Streptomyces é o mais estudado entre os actinomicetos, devido à
elevada produção de antibióticos e enzimas extracelulares (WATVE et al.,
2001). A produção desses compostos pelos actinomicetos tem sido associada
à diferenciação na sua morfologia celular, tal como a produção de esporos,
podendo ser limitada ou inibida por deficiências nutricionais. Na rizosfera, dada
à quantidade de nutrientes exsudados, a deficiência nutricional não se
apresenta como um fator limitante à produção de metabólitos secundários
pelos actinomicetos (WILLIAMS & VICKERS, 2000).
Dentre as importantes características dos estreptomicetos, enumera-se
a capacidade de degradação de moléculas complexas e recalcitrantes,
especialmente a celulose, lignina e xilana, fazendo com que tenham um papel
importante nos processos de compostagem (CRAWFORD, 1988; RAMÍREZ et
al., 2003), além de produzirem sideróforos, quitinase, -glucanases e
antibióticos que agem no controle de organismos antagônicos (OLIVEIRA et al.,
2003; CRAWFORD et al., 1993).
A quitina depois da celulose é o polímero mais abundante da natureza,
sendo encontrada como constituinte do exoesqueleto de insetos, de crustáceos
e conchas de moluscos, sendo também o maior componente da parede celular
de fungos. As quitinases produzidas por muitos organismos, entre eles os
estreptomicetos, são enzimas hidrolíticas com a propriedade de hidrolisar a
quitina em oligômeros de N-acetilglicosamina (NAG), que assim podem ser
absorvidos e metabolizados (GOODAY, 1990; GOODAY et al., 1992).
4
Sideróforos são moléculas sequestradoras de ferro de baixa massa
molecular (400 a 1000 Daltons), secretadas por microrganismos em resposta a
baixa disponibilidade de Fe
+3
em solução. Estes compostos atuam como
promotores de crescimento pela capacidade de prevenir a proliferação de
fitopatógenos no ambiente rizosférico (OLIVEIRA et al., 2003). Adicionalmente
aos mecanismos de antibiose, a competição por nutrientes e nichos ecológicos
amplia o potencial de proteção contra fitopatógenos (BETTIOL, 1991).
Outros estudos realizados com rizobactérias indicam também a
produção de importantes substâncias reguladoras de crescimento vegetal,
como as auxinas, citocininas, giberelinas e etileno (CATTELAN, 1999).
A caracterização das BPCPs e o seu papel no aproveitamento de
substratos orgânicos exige a identificação ao nível de gênero e espécie dos
isolados de bactérias obtidos. Muitos métodos vêm sendo utilizados para
identificação de bactérias, sendo os métodos tradicionais em geral, muito
laboriosos e requerem uma série de testes especializados, que podem
apresentar resultados variados e de difícil interpretação, em função das
condições de cultivo dos microrganismos (WILSON et al., 1998; HARVEY et al.,
2001). Além disso, a utilização de tais metodologias fornece informações
limitadas para identificação dos microrganismos. Como alternativa, foram
desenvolvidas novas tecnologias, dentre as quais se destacam as baseadas
em técnicas de biologia molecular. A análise do material genético oferece maior
vantagem para o estudo e identificação dos microrganismos, pois não está
sujeita às variações fenotípicas e apresenta maior precisão (REIS JR. et al.,
2002). Essas técnicas receberam grande impulso com o desenvolvimento da
técnica conhecida como PCR (Polymerase Chain Reaction). Descrita por SAKI
et al. (1985), esta técnica permite amplificar pequenos e específicos segmentos
do genoma, permitindo a obtenção in vitro de várias cópias de determinada
região do DNA. Seqüências do DNA de determinados microrganismos podem
ser amplificadas, usando primers (seqüências iniciadoras) complementares a
essas seqüências, localizadas em locais específicos do genoma. Os
fragmentos do DNA são amplificados a partir dos primers, pela ação da enzima
Taq DNA polimerase (isolada originalmente do microrganismo Thermus
aquaticus). A técnica de PCR tem oferecido resultados rápidos e precisos na
5
identificação de bactérias (STEINGRUBE et al., 1995, 1997; WILSON et al.,
1998; LAURENT et al., 1999).
Nos primeiros estudos de identificação molecular de bactérias
empregando técnicas de seqüenciamento, foi utilizado o gene 16S rDNA, que
codifica o RNA estrutural da subunidade menor dos ribossomos bacterianos
(WOESE, 1987). Os ácidos ribonucléicos ribossomais (rRNA) são
universalmente distribuídos entre os diferentes grupos de seres vivos, sendo a
molécula com o maior grau de conservação existente (REIS JR. et al., 2002).
Uma das vantagens de se usar informações sobres as seqüências do rRNA é a
sua disponibilização gratuita em bases de dados (RDP, Gen-Bank, EMBL),
permitindo a comparação de novas seqüências obtidas com as seqüências
presentes nessas bases (COUTINHO et al. 1999). Porém, pesquisas recentes
têm demonstrado que o uso do 16S rDNA pode não ser satisfatório na maioria
dos casos (UEDA et al., 1999), fato este devido à evolução diferenciada das
múltiplas cópias deste gene encontradas em uma única célula bacteriana. Por
esse motivo, outros genes estão sendo adotados na identificação e em estudos
taxonômicos de microrganismos (DAHLLOF et al., 2000; SOUZA et al., 2003).
Esses genes apresentam inúmeras vantagens em relação ao 16S, entre elas a
presença de uma única cópia por célula, evolução mais acelerada que o 16S,
permitindo a identificação de espécies filogeneticamente próximas (FOX et al.,
1992).
Estudos realizados por Kim et al. (1999) demonstraram que o
seqüênciamento da β-subunidade do gene da RNA polimerase produz
ferramentas acuradas e convincentes para análise filogenética do gênero
Mycobacterium pertencente ao grupo dos actinomicetos. Portanto, o método
baseado no rpoB pode ser utilizado mais eficientemente que o baseado no 16S
rDNA para o delineamento de algumas espécies de actinomicetos.
Os objetivos deste estudo foram: isolar actinomicetos da região
rizosférica do cacaueiro e quantificar a sua população em plantios de cacaueiro
do Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) e do Instituto Biofábrica de Cacau
(IBC), avaliar o efeito de actinomicetos na promoção de crescimento de mudas
de cacaueiro, identificá-los ao nível de gênero e estudar a atividade fisiológica
e a diversidade genética dos isolados de actinomicetos.
6
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10
Capítulo 1
DENSIDADE POPULACIONAL, DIVERSIDADE GENÉTICA E ATIVIDADE DE
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE ACTINOMICETOS ASSOCIADOS À
RIZOSFERA DE CACAUEIRO
1
1
Artigo submetido ao Comitê Editorial do periódico cientifico Brazilian Journal of Microbiology
DENSIDADE POPULACIONAL, DIVERSIDADE GENÉTICA E ATIVIDADE DE
PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE ACTINOMICETOS ASSOCIADOS À
RIZOSFERA DE CACAUEIRO
RESUMO
Novos materiais clonais de cacaueiro resistentes à doença vassoura-
de-bruxa (
Moniliophthora perniciosa) estão sendo propagados por estaquia e
distribuídos para o produtor, visando o controle da doença. O aprimoramento
do protocolo de produção de mudas é necessário para suprir a demanda dos
produtores por essas mudas. Alguns estudos relatam que os índices de
enraizamento de estacas de diversas espécies de plantas aumentam com a
utilização de bactérias promotoras de crescimento. Os objetivos deste trabalho
foram: isolar e identificar ao nível de gênero, actinomicetos do solo e de raízes
de cacaueiro, determinar a densidade populacional, a diversidade genética e a
atividade fisiológica desses actinomicetos e estudar o efeito desses
microrganismos no crescimento de mudas vegetativas de cacaueiro. As
densidades populacionais de actinomicetos foram semelhantes nas amostras
de solo e de raízes de cacaueiro, apresentando valores médios de 1,0 x 10
6
UFC.g
-1
e de 9,6 x 10
5
UFC.g
-1
, respectivamente. Diversos isolados de
actinomicetos apresentaram a capacidade de produção de celulase, xilanase,
quitinase, ácido indolacético e de solubilização de fosfato. Baseado na análise
de seqüências da β-subunidade do gene rpoB, os isolados de actinomicetos da
rizosfera de cacaueiro foram identificados como pertencentes ao gênero
Streptomyces. Mudas vegetativas de cacaueiro mostraram incrementos de
117,7 % e 68,3 % na altura do lançamento quando cultivadas em substrato
incubado com os isolados AC 103 e AC 26, respectivamente, ambos
pertencentes ao gênero Streptomyces. Estes isolados, apesar de terem sido
obtidos de tomateiro, apresentam potencial para serem aplicados na promoção
de crescimento de mudas de cacaueiro.
Palavras-chave: Streptomyces spp., quantificação, filogenia, Theobroma
cacao
12
POPULATION DENSITY, GENETIC DIVERSITY AND ACTIVITY FOR
GROWTH PROMOTING OF ACTINOMYCETES ASSOCIATED OF CACAO
ABSTRACT
New cacao genotypes with increased tolerance to witches broom
(Moniliophthora perniciosa) disease are being multiplied vegetatively and
distributed to farmers for control of this disease. Improvements of the protocol to
propagate cacao from stem cuttings are necessary to meet farmers` demands
for these cacao plants. Some studies have reported increased rooting on
cuttings of several plant species, when treated with growth-promoting bacteria.
This study aimed to isolate and identify actinomycetes at the genus level, from
soil of cacao orchards and cacao roots, to determine the population density,
genetic diversity, and physiological activity of these actinomycetes, and to study
the effect of these microorganisms on growth promotion of cacao plants from
stem cuttings. Population densities of actinomycetes were similar in soil and on
cacao roots, showing mean values of 1.0 x 10
6
CFU.g
-1
and 9.6 x 10
5
CFU.g
-1
,
respectively. Several actinomycete isolates presented the ability to produce
cellulase, xilanase, chitinase, and indolacetic acid, and to solubilize phosphate.
Based on the analyses of sequences from the -subunit of the rpoB gene, all
actinomycetes isolated from cacao roots and soil belong to the genus
Streptomyces. Cacao clones obtained from stem cuttings, when grown in the
plant potting mix inoculated and incubated with the streptomycete isolates
codified as AC 103 and AC 26, both belonging to the genus Streptomyces,
presented 117.7 % and 68.3 % increase in shoot length, respectively. Although
these two isolates were originally obtained from tomato plants, they are
potential agents for growth promotion of cacao clones from stem cuttings.
Keywords: Streptomyces spp., quantification, phylogeny, Theobroma cacao
13
INTRODUÇÃO
O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma planta perene, arbórea, típica de
clima tropical e nativa da região da floresta úmida da América (Souza & Dias,
2001), a qual apresenta elevada importância econômica, social e ambiental
para o Sul da Bahia, Brasil. O surgimento da doença vassoura-de-bruxa,
causada pelo fungo
Moniliophthora perniciosa, levou a perdas de até 70 % na
produção de cacao (Andebrhan et al., 1999).
Nos últimos anos, a CEPLAC (Comissão Executiva do Plano da Lavoura
Cacaueira) vem desenvolvendo e lançando clones resistentes à vassoura-de-
bruxa, sendo estes distribuídos pelo Instituto Biofábrica de Cacau (IBC) aos
produtores da região, na forma de mudas propagadas por estaquia (Marrocos
et al., 2004). Contudo, a produção de mudas de clones de cacaueiro por
estaquia em larga escala, exige estudos de otimização do sistema de
produção. Dentre estes, destacam-se os estudos com substratos alternativos
em substituição ao substrato orgânico comercial, os quais podem ser
formulados a partir de resíduos industriais locais, constribuindo para a
minimização da poluição decorrente do acúmulo desses materiais no meio
ambiente e para a redução do custo de produção da muda de cacao (Fermino
et al., 2000). Estes substratos ainda podem ser enriquecidos com
microrganismos do solo benéficos ao crescimento vegetal, como por exemplo,
as bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCPs).
O efeito direto das BPCPs no crescimento vegetal pode ser devido a
produção de fithormônios, mineralização de nutrientes, solubilização de
fosfatos, fixação do nitrogênio e aumento da capacidade de absorção de
nutrientes pelas raízes, entre outros (Conn et al., 1997; Lazarovitz & Nowak,
1997). Os efeitos indiretos no crescimento podem ocorrer devido à proteção da
planta contra fitopatógenos por estes microrganismos, através da produção de
ácido cianídrico, bacteriocinas e antibióticos, competição por espaço, Fe
+3
e
outros nutrientes, parasitismo e indução de resistência (Mariano, 2004). As
bactérias promotoras de crescimento de plantas podem ser utilizadas para
tratamento de sementes, explantes e mudas micropropagadas, incorporadas
ao substrato de plantio, utilizadas no tratamento de estacas, tubérculos e
14
raízes, pulverizações na parte aérea incluindo folhagem e frutos, e em pós-
colheita (Pereira, 2000).
Dentre os principais representantes do grupo de BPCPs encontram-se
os actinomicetos, que são procariotos Gram positivos, aeróbios e importantes
decompositores da matéria orgânica. Estes são encontrados em diversos
habitats, mas principalmente no solo onde são menos dominantes que as
populações fúngicas e bacterianas, atingindo densidade variando entre 10
4
a
10
7
UFC/g de solo seco (Araújo, 1998). Os actinomicetos compreendem mais
de 30 % da população de microrganismos do solo, sendo o gênero
Streptomyces o mais abundante (70-90 %) e também o mais estudado entre os
gêneros, devido principalmente a sua produção de antibióticos (Kennedy, 1999;
Padilha, 1998).
Poucos são os estudos de densidade populacional e diversidade
genética destes microrganismos do solo, o que deixa uma lacuna de
informações sobre sua ocorrência no solo, raízes e sua interação com culturas
de interesse econômico. Para a cultura do cacau, não foram encontrados
trabalhos na literatura científica envolvendo estes estudos no solo e na
rizosfera.
Estudos envolvendo a biologia molecular têm se mostrado importantes
na análise da estrutura e composição das espécies de microrganismos. Entre
estes estudos, destaca-se à análise de seqüências do rDNA, que tem sido
explorada para inferir a relação filogenética entre microrganismos (Muyzer et
al., 1993). O sequenciamento do gene 16S rDNA tem sido muito utilizado em
estudos de diversidade, porém, pesquisas recentes têm demonstrado que este
gene pode não oferecer resultados satisfatórios (Ueda et al., 1999), fato este
devido à evolução diferenciada das múltiplas cópias deste gene encontradas
em uma única célula bacteriana. Por esse motivo, outros genes estão sendo
adotados na identificação e em estudos taxonômicos de microrganismos
(Souza et al., 2003). Estudos realizados por Kim et al. (1999) relatam que o
sequenciamento da β-subunidade do gene da RNA polimerase (rpoB) produz
resultados acurados e convincentes para análise filogenética de actinomicetos.
Neste contexto, este trabalho objetivou estudar a densidade
populacional, a diversidade genética, a caracterização fisiológica de
15
actinomicetos associados ao cacaueiro e avaliar o efeito de alguns isolados na
promoção de crescimento de mudas de cacaueiro propagadas por estaquia.
MATERIAL E MÉTODOS
Densidade populacional e isolamento de actinomicetos de solo e raiz
Para o estudo das populações bacterianas foram coletadas quatro
amostras de solo e de raízes, sendo cada uma delas composta de seis sub-
amostras, dos jardins clonais do Instituto Biofábrica de Cacau (IBC) e da
Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPEC/CEPLAC). Em
cada local (CEPLAC e IBC) foram definidos dois plantios de cacaueiro para a
coleta de amostras: plantio de cacaueiro com mais de três anos de idade
(velho) e plantio com até três anos de idade (novo), sendo estes denominados:
Velho IBC; Novo IBC; Velho Ceplac e Novo Ceplac. A Tabela 1 apresenta as
características físicas e químicas das amostras de solo coletadas nesses
locais.
Tabela 1. Análise química das amostras de solo coletadas para isolamento de actinomicetos.
pH
cmol
c
/dm
3
g/dm
3
mg/dm
3
g/kg
Local*
(H
2
0)
Al Ca Mg K C P Fe Zn Cu Mn Areia Silte Argila
Velho
IBC
4,8 0,8 4,4 1,6 6,0 18,2 115 73 6 6 63 569 212 219
Novo
IBC
4,9 1,2 4,2 1,0 5,2 21,4 184 87 5 25 31 559 221 220
Velho
CEPLAC
5,5 0 14,9 3,9 18,8 39,5 20 30 27 129 185 333 511 156
Novo
CEPLAC
5,4 0 13,2 4,0 17,2 25,2 17 93 29 18 206 381 448 171
*
Amostras de solo coletadas no IBC e na CEPLAC em área de plantio de cacaueiro com
menos de três anos de idade (Novo) e com mais de três anos de idade (Velho).
Para a quantificação de actinomicetos, as amostras de solo foram
submetidas a um tratamento térmico, sendo colocadas em estufa à
temperatura de 60 °C por 4 horas, para a redução do número de bactérias
presentes. Em seguida, fez-se a diluição seriada com amostras de 10 g de
raízes e amostras de 10 g de solo, sendo estas transferidas para frascos de
Erlenmeyer com 90 mL de solução salina (NaCl a 0,85 %) estéril e agitadas por
30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram feitas as diluições
decimais em série (1:10), em tubos de ensaio contendo 9 mL da solução salina,
16
obtendo-se diluições de 10
-1
a 10
-4
. Foi realizado o plaqueamento de 50 l de
cada diluição em meio extrato de solo (Pramer & Schmidt, 1964), adicionado de
ciclohexamida na concentração de 100 µg/mL. Para a contagem de bactérias
totais não foi utilizado o tratamento térmico, efetuando-se a diluição seriada
(10
-1
a 10
-5
), conforme descrito acima e o plaqueamento em meio agar
nutriente (Levine, 1954) com ciclohexamida na concentração de 100 mg/mL.
Para o crescimento de actinomicetos e bactérias totais, as placas foram
incubadas por 12 dias a 30 °C em câmara de crescimento tipo B.O.D. e por 48
horas à temperatura de 28±2 °C, respectivamente.
Os actinomicetos crescidos no meio extrato de solo foram preservados
para os demais estudos. As colônias individualizadas dos actinomicetos foram
repicadas para meio AGS (Arginine-Glycerol-Mineral Salt Agar) (Poter, 1960),
sendo estas incubadas a 30
°
C por 12 a 14 dias. Para a preservação dos
isolados de actinomicetos, fez-se a raspagem das colônias com água estéril e o
auxílio da alça de platina flambada. A suspensão de esporos foi transferida
para aproximadamente 10 g de solo estéril (esterilizado em autoclave por 50
minutos, duas vezes consecutivas) em frascos de vidro tipo penicilina, sendo
estes vedados com tampa de borracha e filme PVC e mantidos em temperatura
ambiente. As suspensões de esporos também foram transferidas para glicerol
estéril na concentração final de 20 %, em tubos criogênicos com tampa de
rosca, sendo estes mantidos a temperatura de – 20
°
C.
As populações de actinomicetos e de bactérias totais no solo e raízes
foram estimadas pela contagem das unidades formadoras de colônias (UFC).
Este cálculo foi resultante da seguinte formula: UFC.g
-1
solo seco = N x 10 x F x
Y, sendo: N = número de colônias, F = 20 (fator de correção do plaqueamento
de 50 mL de suspensão por placa para 1 mL de suspensão), Y = fator de
diluição da amostra. Para a análise estatística, os dados foram transformados
em log (x + 1), em que x corresponde ao número de UFC. Os dados foram
analisados pelo programa estatístico SISVAR (Ferreira, 2000), sendo realizada
a análise de variância e, em seguida, a comparação das médias pelo teste de
Tukey (Tukey, 1962) a 5 % de probabilidade. A quantificação da densidade
populacional de bactérias totais e actinomicetos foi realizada duas vezes e os
experimentos foram analisados separadamente.
17
Diversidade genética dos actinomicetos
1. Extração de DNA
Para extração de DNA, 38 isolados de actinomicetos obtidos das
amostras de raízes e de solo de cacaueiro e da coleção de culturas do
Laboratório de Fitopatologia e Microbiologia Agrícola da UFRB, foram crescidos
em frascos de Erlenmeyer contendo 30 mL de meio líquido de Amido-Caseína
(Kuster & Williams, 1964) e após 20 dias de crescimento foram centrifugados a
14 000 rpm por 15 minutos para coleta das células, que foram liofilizadas por
18 horas. Após a liofilização, o micélio foi macerado em cadinho de porcelana
em contato com N
2
líquido. Em seguida, foram adicionados aproximadamente
20 mg do macerado em tubos de microcentrífuga de 2,0 mL para a extração do
DNA através do método do pó de vidro (
glass dust) descrito por Rehner &
Buckley (2003). A fase aquosa da extração foi transferida para novos tubos e o
DNA foi precipitado usando isopropanol. O DNA foi ressuspendido em 80 µl de
água contendo RNAse na concentração de 40
g/ml e incubado em banho-
maria por meia hora a 37 ºC para a completa ressuspensão.
Bandas de DNA genômico total, separadas por eletroforese em gel de
agarose 0,8 %, foram usadas para a quantificação e como indicadoras da
integridade do DNA extraído.
2. Sequenciamento e análise das sequências obtidas
Para a identificação molecular e análises filogenéticas, foram utilizadas
sequências de fragmentos do gene rpoB, amplificadas através dos primers
SRPOF1 e SRPOR1 (Kim et al., 2004). As amplificações de PCR foram
realizadas em um volume total de 50 μl contendo 50 mM de KCl, 1,5 mM
MgCl
2
, 200 mM de cada dNTP (Promega, Madison, WI, USA), 20 pmol de cada
primer, 6 μl de DNA genômico (10ng. μl
-1
), e 2 U de Taq DNA polimerase
(Phoneutria). Todas as amplificações de PCR foram feitas em um termociclador
PTC-100 (MJ Research Inc., Watertown, MA). As amplificações consistiram de
uma desnaturação inicial a 94 ºC por 2 minutos, 10 ciclos de desnaturação a
94 ºC por 45 segundos, anelamento de primer a 58 ºC por 45 segundos,
diminuindo 1 ºC a cada ciclo sucessivo, alongamento a 72 ºC por 1 minuto,
18
seguido por 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 45 segundos, anelamento a
48 ºC por 45 segundos, alongamento a 72 ºC por 1 minuto e uma extensão
final de 72 ºC por 5 minutos. Os produtos amplificados foram separados em gel
de agarose de baixo ponto de fusão (NuSieve) a 1,5 %. Em seguida, as bandas
foram cortadas do gel, congeladas a -80 ºC por 1 hora e centrifugadas por 15
minutos a 1400 rpm em uma microcentrífuga (Eppendorf, modelo 5417R). O
sobrenadante foi utilizado diretamente para o sequenciamento com os
primers
anteriormente utilizados para a amplificação. O sequenciamento foi feito com o
BigDye Deoxy terminator sequencing kit (Applied Biosystems), de acordo com
as recomendações do fabricante, em um volume total de 5 μl, contendo 0,5 μl
de
BigDye Deoxy terminator sequencing kit (Applied Biosystems), 1 μl de
tampão de sequenciamento (5X), 2 pmol de primer e 30 ng de DNA. As
reações de sequenciamento foram feitas em um termociclador PTC-100 e
consistiram na desnaturação inicial de 95 ºC por 2 minutos, 30 ciclos de
desnaturação a 95 ºC por 15 segundos, anelamento a 58 ºC por 30 segundos e
extensão a 72 ºC por 4 minutos. Após a amplificação, as amostras foram
precipitadas com 20
μl de isopropanol a 65 % e a seguir permaneceram em
ambiente protegido de luz, à temperatura ambiente por 15 minutos.
Posteriormente, as placas de 96 poços contendo as reações foram
centrifugadas por 40 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado e a
placa invertida sobre papel toalha. Acrescentou-se 100 μl de etanol 60 % e
centrifugou-se à mesma velocidade por 8 minutos. O etanol foi descartado e a
placa foi centrifugada sobre o papel toalha a 700 rpm por 10 segundos para
remover o excesso de etanol. Após secagem a temperatura ambiente por 15
minutos, foram adicionados 10 μl de formamida a cada amostra e a placa
colocada no termociclador para a desnaturação a 94 ºC por 3 minutos. Após
essa etapa, a placa foi levada para o Seqüenciador Automático de DNA,
modelo ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer.
Para a análise das sequências provenientes dos dois primers (forward e
reverse), foi utilizado o programa BioEdit versão 5.0.9 (Hall, 1999) para unir as
seqüências. Os alinhamentos foram feitos com o programa MEGA versão 3.1
(Kumar et al., 2004). O programa BLAST (Altschul et al., 1997) foi utilizado para
comparar as seqüências de cada isolado com aquelas encontradas nos bancos
de dados públicos.
19
As seqüências dos seguintes acessos foram encontradas nos bancos de
dados públicos e utilizadas para fim de comparação com as seqüências dos
isolados estudados: Streptomyces coelicolor (AY280745), S. albiflavus
(DQ978980), S. netropsis (AY280782), S. fradiae (AY280750), S.
violaceusniger (DQ242003), S. purpureus (AY280795), S. lividans (AY280745),
S. coelicolor (AL939121), S. setonii (AY280766), S. violaceusniger
(DQ242003), S. violaceusniger (DQ241994) e Micromonosporae chinospora
(AY280788).
As análises filogenéticas foram feitas com o programa Mega 3.1 pelo
método de Máxima Parcimônia com os parâmetros de Jukes-Cantor e análise
de
bootstrap com 1000 repetições.
Caracterização fisiológica dos actinomicetos
1. Produção de Xilanase e Celulase
Foi avaliada a presença da atividade xilanolítica e celulolítica de 26
isolados de actinomicetos: Act 32, Act 35, Act 36, Act 37, Act 38, Act 39, Act
40, Act 41, Act 42, Act 46, Act 47, Act 48, Act 49, Act 51, Act 52, Act 53, Act 54,
Act 55, Act 56, Act 57, Act 58, Act 59, Act 61, Act 63, Act 65 e Act 66. Estes
foram isolados de solo e de raízes de cacaueiro, dos jardins clonais da
CEPLAC e do Instituto Biofábrica de Cacau (IBC), Ilhéus, BA, conforme
descrito acima. As atividades enzimáticas foram determinadas conforme
metodologia descrita por Lewis (1988). Os isolados foram multiplicados em
meio mínimo de sais (Tuite, 1969), suplementado com xilana (Sigma) ou
celulose microcristalina (Vetec) como única fonte de carbono e incubadas em
câmara B.O.D. (28 ± 2°C), durante aproximadamente 10 dias. Após este
período, foram adicionados 10 mL da solução vermelho congo 0,5 % em cada
placa, seguido de incubação a temperatura ambiente por 15 minutos. Após a
incubação, foi removido o excesso da solução de vermelho congo e
adicionados 10 mL da solução salina (NaCl a 1 M) em cada placa, sendo estas
mantidas a temperatura ambiente por 30 minutos. Após a remoção da solução
salina, observou-se a formação ou não de uma zona de hidrólise de coloração
alaranjada em torno das colônias, indicando a redução da concentração do
polímero.
20
2. Produção de Quitinase
Para detectar a produção de quitinase pelos isolados de actinomicetos,
utilizou-se a metodologia descrita por Renwick et al. (1991). Os actinomicetos
foram multiplicados em meio mínimo de sais (Tuite, 1969), suplementado com
quitina coloidal (Hsu & Lockwood, 1975) como única fonte de carbono. As
culturas foram incubadas em câmara B.O.D. (28 ± 2°C) durante 10 dias. Após
este período, a atividade quitinolítica dos isolados foi detectada pela
visualização de uma zona de hidrólise hialina em torno das colônias crescidas.
3. Solubilização de Fosfato Inorgânico
A capacidade de solubilização de fosfato de cálcio foi determinada
segundo o método proposto por Katznelson & Bose (1959). Os 26 isolados
listados acima foram cultivados em meio de cultura triptocaseína de soja ágar
(10 %) acrescido de CaHPO
4
e incubados em câmara B.O.D. a 28 ± 2 ºC por 7
dias. Após esse período, a solubilização do fosfato foi detectada pela formação
de uma zona de solubilização de aspecto opaco em torno das colônias dos
isolados de actinomicetos.
4. Produção de Ácido Indolacético
A capacidade de produção de ácido indolacético foi determinada
segundo o método proposto por Bric et al. (1991) para os isolados de
actinomicetos listados acima. Estes foram crescidos em meio triptocaseína de
soja (10 %), acrescido de 5 mM de L-triptofano. Posteriormente, as colônias
foram cobertas por uma membrana de nitrocelulose e as placas incubadas em
câmara B.O.D. a 28 ± 2ºC por 10 dias. Após incubação, as membranas foram
removidas e saturadas com solução de Salkowski (Gordon e Welber, 1951). Os
isolados que formaram um halo de coloração avermelhada na membrana no
período de 30 minutos, foram considerados produtores de ácido indolacético.
Promoção de crescimento de mudas de cacaueiro
Para avaliar o efeito da inoculação e incubação do substrato com
isolados de actinomicetos no crescimento de mudas de cacau propagadas
21
vegetativamente, foram conduzidos dois experimentos. No primeiro
experimento foram avaliados seis isolados de actinomicetos, sendo dois
oriundos de raízes de cacaueiro (Act 18 e Act 28) e quatro isolados (AC 26, AC
92, AC 95 e AC 103) provenientes da coleção de culturas do Laboratório de
Fitopatologia e Microbiologia Agrícola da UFRB, selecionados como potenciais
agentes de promoção de crescimento para o tomateiro (Lima, 2003; Sousa et
al., 2006). Este experimento foi conduzido em delineamento experimental
inteiramente casualizado com sete tratamentos sendo seis isolados de
actinomicetos e uma testemunha, utilizando-se quatro repetições e quatro
plantas por parcela. A testemunha foi composta por substrato incubado com
água, sem inoculação com actinomicetos e a estaca de cacaueiro tratada com
AIB (ácido indolbutírico) na concentração de 6.000 mg.kg
-1
, conforme o
protocolo do IBC.
No segundo experimento avaliou-se o efeito de sete isolados de
actinomicetos oriundos de raízes de cacaueiro (Act 45, Act 48, Act 52, Act 53,
Act 58, Act 61 e Act 62). Este foi conduzido em delineamento experimental
inteiramente casualizado com oito tratamentos, sendo sete isolados de
actinomicetos e uma testemunha sem inoculação, utilizando-se cinco
repetições e quatro plantas por parcela. A testemunha foi constituída por
substrato incubado com água, sem inoculação com actinomicetos e a estaca
tratada com AIB, conforme descrito acima.
Em ambos os experimentos, para obtenção do inóculo, os isolados
foram cultivados em meio AGS sólido por um período de 12 dias em câmara
B.O.D. a 30
°
C e posteriormente foram multiplicados em arroz umedecido e
esterilizado, conforme descrito por Sousa (2006). Após este período, o
substrato composto por serragem de madeira misturado com areia lavada na
proporção de 9:1 (V/V), conforme recomendações do CEPEC/CEPLAC (Sodré,
2006), foi inoculado com os isolados de actinomicetos e incubado por um
período de 30 dias. Para tanto, foi adicionado 1 L de suspensão de cada
isolado para 8 kg de substrato, sendo esta preparada conforme descrito por
Sousa et al. (2006). O substrato foi mantido em bandejas plásticas em casa de
vegetação por um período de 30 dias, mantendo-se a umidade na capacidade
de campo, com a adição de água potável.
22
No primeiro experimento, após os 30 dias de incubação, o substrato foi
distribuído em sacos pretos de polietileno de 15 x 0,9 cm, colocando-se 500
cm
3
de substrato por saco de muda. No segundo experimento, o substrato foi
distribuído em vasos plásticos com capacidade para 500 cm
3
de substrato.
Para ambos os experimentos, mini-estacas de cacaueiro medindo
aproximadamente 4 a 6 cm de comprimento foram retiradas de ramos
plagiotrópicos de plantas do Clone CEPEC 2006, mantidas no banco de
germoplasma do CEPEC/CEPLAC. Foi utilizada uma mini-estaca por saco de
muda ou vaso e estes foram mantidos em câmara de nebulização com
umidade em torno de 90 %, temperatura de 28 °C e com irrigação de 30
segundos a cada 15 minutos de intervalo. No vigésimo dia, foi aplicado 1 g por
estaca do adubo Osmocote
®
de liberação lenta. Após o plantio, as estacas
permaneceram por 45 dias em câmara de nebulização, sendo em seguida
transferidas para casa-de-vegetação, permanecendo por mais 45 dias, sendo
progressivamente reduzido o turno de irrigação em até três vezes ao dia.
Após 90 dias, avaliou-se a altura do lançamento (brotamamento da
estaca) (HL). A parte aérea e as raízes foram removidas do substrato, lavadas
e secas em estufa de secagem com ventilação forçada a 65 °C por 72 horas,
sendo posteriormente determinado o peso da matéria seca da haste (MSH), e
da raiz (MSR). Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e
as médias comparadas pelo teste Scott & Knott a 5 % de probabilidade pelo
programa Sisvar (Ferreira, 2000).
Foi realizada a análise da densidade populacional dos isolados de
actinomicetos no substrato após a coleta das mudas. Para tanto, foram
pesadas 10 g de substrato fresco de cada tratamento, com três repetições.
Utilizou-se o método de diluição seriada e plaqueamento em meio Amido-
Caseína-Ágar, como descrito anteriormente.
23
RESULTADOS
Densidades populacionais
Os dados de densidade populacional de bactérias totais e de
actinomicetos são apresentados na Tabela 2. A densidade populacional de
bactérias totais diferiu (P<0,05) no solo e nas raízes de cacaueiro, para
algumas amostras (Tabela 2). Na quantificação de actinomicetos não foram
encontradas diferenças populacionais significativas entre as amostras de solo e
de raízes de cacaueiro (P<0,05), com valores médios de 1,0 x 10
6
UFC g
-1
de
solo e de 9,6 x 10
5
UFC g
-1
de raízes. A porcentagem da população total de
bactérias representada por actinomicetos variou de 0,3 a 5,2 % no solo e de
0,02 a 2,46 % nas raízes (Tabela 2).
Tabela 2. Densidade populacional de bactérias totais e actinomicetos em solo
e raízes de cacaueiro.
Densidade Populacional (UFC.g
-1
solo seco)
1
Bactérias Actinomicetos
Relação
Actinomicetos/Bactérias
Amostras
2
Solo Raízes Solo Raízes Solo Raízes
Velho IBC
2,51x10
7
a 5,28x10
7
a 1,3x10
6
a 1,3x10
6
a 5,20 % 2,46 %
Novo IBC
1,90x10
8
a 8,23x10
8
a 5,6x10
5
a 8,2x10
5
a 0,30 % 0,10 %
Velho
CEPLAC
1,53x10
8
a
1,21x10
9
b 5,3x10
5
a 2,1x10
5
a 0,34 % 0,02 %
Novo
CEPLAC
2,10x10
8
a 7,07x10
8
a 1,6x10
6
a 1,5x10
6
a 0,76 % 0,21 %
1
Médias seguidas da mesma letra nas linhas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de
probabilidade.
2
Amostras coletadas no IBC e na Ceplac em áreas de plantio de cacaueiro com
menos de três anos de idade (Novo) e com mais de três anos de idade (Velho).
Identificação e análise filogenética
A análise das seqüências de 315 pb alinhadas, pertencentes à região da
β-subunidade do gene rpoB, indicaram serem os isolados de actinomicetos
pertencentes ao gênero Streptomyces. Observa-se na árvore filogenética
24
(Figura 1) a formação de cinco grupos entre os isolados de Streptomyces
associados ao cacaueiro. A comparação entre as sequências destes isolados e
dos isolados da coleção de culturas do Laboratório e as sequências
encontradas nos bancos de dados públicos, mostra identidade de 97 % para os
isolados Act 46, Act 58, Act 42, Act 65, Act 38, Act 56, Act 43, Act 36, Act 62,
Act 35, AC 95, Act 53, Act 57, Act 39, Act 31, Act 48, Act 47, Act 59, Act 54, Act
40, Act 66, Act 52, Act 61, Act 60, Act 32 e Streptomyces coelicolor
(AY280745). Para Act 11, Act 41 e Act 9, as sequências obtidas apresentaram
até 94 % de identidade quando comparadas com as sequências do acesso S.
albidiflavus (DQ978980). A mesma identidade (94 %) foi encontrada para Act
37, Act 45 e
S. violaceusniger (DQ242003). Para o isolado Ac 103 e S.
purpureus (AY280795) foi encontrada identidade de 93 %. Identidade de 92 %
foi obtida entre o isolado AC 26 e
S.violascens (AY280773) e para Act 30 e S.
netropsis (AY280782). Para os isolados AC 29, Act 50, Act 49 e S. fradiae
(AY280750) a identidade foi de 91 % e de 84 % entre Act 28 e S.
violaceusniger (DQ241994).
Caracterização fisiológica dos actinomicetos
A maioria dos isolados de Steptomyces spp. testados apresentaram a
capacidade de produção de celulase, xilanase e quitinase, de solubilização de
fosfato e produção do ácido indolacético (Tabela 3). Todos os isolados de
Streptomyces spp. apresentaram atividade celulolítica (Figura 2). Dentre os 26
isolados testados, 24 apresentaram produção de xilanase (Figura 3). Com
exceção de Act 36, Act 46, Act 49 e Act 51, todos os isolados apresentaram
atividade quitinolítica (Figura 4). Nos testes de solubilização de fosfato de
cálcio, os isolados Act 32, Act 37, Act 41 e Act 61 não apresentaram a
capacidade de solubilização deste mineral (Figura 5). Dentre os 26 isolados
testados, 23 apresentaram a capacidade de produzir ácido indolacético (Tabela
3).
25
Figura 1.
Filograma genético dos isolados de Streptomyces spp. baseado no alinhamento de 315 pb de
nucleotídeos da
β-subunidade do gene rpoB. O método utilizado para construção foi o da Máxima
Parcimônia com os parâmetros de Jukes-Cantor. Os valores apresentados nas ramificações do
filograma correspondem ao
bootstrap e foram calculados com base em 1000 repetições. A escala indica
o número de substituições de nucleotídeos por sítio.
26
Tabela 3. Produção de enzimas extracelulares, ácido indolacético (AIA) e
solubilização de fosfato por 26 isolados de
Streptomyces spp. associados ao
cacaueiro.
Enzimas extracelulares
Streptomyces
spp.*
Celulase Xilanase Quitinase
Solub. de
Fosfato
Àcido
Indolacético
Act 32
+ - + - +
Act 35
+ + + + +
Act 36
+ + - + -
Act 37
+ + + - +
Act 38
+ + + + +
Act 39
+ + + + +
Act 40
+ + + + +
Act 41
+ - + - +
Act 42
+ + + + +
Act 46
+ + - + +
Act 47
+ + + + +
Act 48
+ + + + +
Act 49
+ + - + +
Act 51
+ + - + -
Act 52
+ + + + +
Act 53
+ + + + +
Act 54
+ + + + +
Act 55
+ + + + +
Act 56
+ + + + +
Act 57
+ + + + +
Act 58
+ + + + +
Act 59
+ + + + +
Act 61
+ + + - +
Act 63
+ + + + -
Act 65
+ + + + +
Act 66
+ + + + +
*Os isolados foram cultivados em meio mínimo de sais com os respectivos substratos para as enzimas
e a atividade foi verificada através da presença de zonas de hidrólise em torno das colônias para a
produção das enzimas celulase, xilanase e quitinase. Para a capacidade de solubilização de fosfato, foi
utilizado o meio de cultura triptocaseína de soja ágar (10 %) acrescido de CaHPO
4
, a atividade foi
observada pela formação de zona de solubilização de aspecto opaco em torno das colônias. Para
produção de AIA utilizou-se o meio meio triptocaseína de soja (10 %), acrescido de 5 mM de L-
triptofano e a atividade foi indicada pela presença de halo avermelhado na membrana de nitrocelulose.
O sinal positivo indica produção e o negativo a não produção das enzimas extracelulares, ácido
indolacético e solubilização de fosfato.
27
Figura 2.
Teste para produção de celulase pelos isolados de Streptomyces
spp.: (a) Negativo para produção de celulase, (b) Positivo para produção de
celulase.
a
b
a
a
b
b
Figura 3.
Teste para produção de xilanase pelos isolados de Streptomyces
spp.: (a) Negativo para produção de xilanase, (b) Positivo para produção de
xilanase.
Figura 4.
Teste para produção de quitinase pelos isolados de
Streptomyces spp.: (a) Negativo para produção de quitinase, (b) Positivo
para produção de quitinase.
28
Promoção de crescimento de mudas de cacaueiro
Para o primeiro experimento, apenas os isolados AC 103 e AC 26
promoveram incrementos significativos na altura do lançamento das mudas de
cacaueiro em 117,7 % e 68,3 %, respectivamente, quando comparados com a
testemunha. Para os isolados Act 18, Act 28, AC 92 e AC 95, não foram
observadas diferenças significativas, quando comparados com a testemunha,
para a matéria seca do brotamento das estacas (lançamento) e das raízes (Figura
7).
A densidade populacional dos isolados de Streptomyces spp. no substrato
revelou populações de 3,97 x 10
4
, 3,21 x 10
4
, 0,7 x 10
4
, 1,09 x 10
4
, 2,38 x 10
4
e 5
x 10
4
UFC/g solo seco para os isolados Act 18, AC 26, Act 28, AC 92, AC 95 e
AC 103, respectivamente.
a
b
a
b
Figura 5.
Teste para solubilização de fosfato por isolados de Streptomyces
spp. (a) Negativo para solubilização, (b) Positivo para solubilização.
Figura 6.
Teste para produção de ácido indolacético (AIA) por isolados de
Streptomyces spp. (a) Negativo, (b) Positivo.
29
Figura
7
.
Crescimento de mudas de cacaueiro cultivadas em substrato incubado com
actinomicetos. O substrato utilizado foi composto por serragem e areia incubado por 30 dias com
os isolados de
Streptomyces spp. Act 18, AC 26, Act 28, AC 92, AC 95 e AC 103. O tratamento
testemunha (TEST) foi formado por estacas tratadas com ácido indolbutírico (AIB) e plantadas em
substrato sem inoculação com actinomicetos. As avaliações foram feitas 90 dias após a instalação
do experimento. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste de Scott & Knott
(P<0,05).
c
c
b
c
c
c
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
TEST Act 18 Ac 26 Act 28 Ac 92 Ac 95 Ac 103
Altura do lançamento (cm)
a
a
a
a
a
a
a
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
TEST Act 18 Ac 26 Act 28 Ac 92 Ac 95 Ac 103
Matéria seca do lançamento (g.planta
-1
)
a
a
a
a
a
a
a
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
TEST Act 18 Ac 26 Act 28 Ac 92 Ac 95 Ac 103
Tratamentos
Matéria seca da raiz (g.planta
-1
)
30
No segundo experimento não foi constatada diferença significativa entre os
isolados de actinomicetos avaliados e a testemunha (P<0,05), para a altura e
matéria seca do lançamento (Figura 8).
Figura 8. Crescimento de mudas vegetativas de cacaueiro em substrato incubado com
isolados de actinomicetos. O substrato foi composto por serragem e areia, incubado por 30
dias com isolados de
Streptomyces spp. Act 45, Act 48, Act 52, Act 53, Act 58, Act 61, Act 62.
O tratamento testemunha (TEST) foi formado por estacas tratadas com ácido indolbutírico
(AIB) e plantadas em substrato sem inoculação com actinomicetos. A avaliação foi realizada
após 90 dias. Médias seguidas por letras diferentes diferem entre si pelo teste de Skott &
Knott (P<0,05).
b
a
a
a
b
b
b
a
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
TEST Act 45 Act 48 Act 52 Act 53 Act 58 Act 61 Act 62
Tratamentos
Matéria seca da raiz (g.planta
-1
)
a
a
a
a
a
a
a
a
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
TEST Act 45 Act 48 Act 52 Act 53 Act 58 Act 61 Act 62
Matéria seca do lançamento (g.planta
-1
)
a
a
a
a
a
a
a
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
TEST Act 45 Act 48 Act 52 Act 53 Act 58 Act 61 Act 62
Altura do lançamento (g.planta-1)
31
Para matéria seca da raiz, as mudas produzidas em substrato inoculado e
incubado com os isolados Act 52, Act 53 e Act 58 apresentaram valores
semelhantes ao da testemunha, enquanto que as mudas produzidas nos
substratos tratados com os isolados Act 45, Act 48, Act 61 e Act 62 apresentaram
valores inferiores à testemunha.
A quantificação dos isolados de
Streptomyces spp. no substrato, após a
coleta das mudas, revelou as seguintes densidades populacionais: 5,0 x 10
4
, 4,3 x
10
4
, 4,7 x 10
4
, 5,2 x 10
4
,
3,8 x 10
4
, 1,0 x 10
4
e 2,1 x 10
4
UFC/g solo seco, para os
isolados Act 45, Act 48, Act 52, Act 53, Act 58, Act 61 e Act 62, respectivamente.
DISCUSSÃO
Apesar da grande importância na agricultura dos microrganismos do solo,
benéficos às plantas, nenhuma informação existe sobre a variabilidade genética e
densidade populacional de actinomicetos associados à rizosfera de cacaueiro.
Neste estudo, investigou-se a densidade populacional e a diversidade genética de
actinomicetos associados à rizosfera do cacaueiro, bem como a capacidade de
produção de algumas enzimas, de solubilização de fosfato, produção de ácido
indolacético e o efeito de alguns isolados sobre o crescimento de mudas de
cacaueiro propagadas vegetativamente. A identificação dos isolados como
espécies do gênero Streptomyces já era esperada, uma vez que
aproximadamente 90 % dos actinomicetos encontrados no solo e em raízes
pertencem a este gênero (Gava & Neves, 2007). Atualmente, a identificação de
actinomicetos ao nível de espécie é muito difícil, devido à falta de trabalhos
completos de sistemática molecular para este grupo de microrganismos. São mais
de 3000 espécies descritas de actinomicetos e não se sabe quais espécies são
válidas (Christova et al., 1995).
A quantificação de bactérias totais nas amostras de solo e de raízes
revelou maior população nas amostras da CEPLAC, dos plantios novo e velho,
tanto em solo quanto em raízes, quando comparadas aos valores obtidos para as
amostras do IBC, de ambos os plantios. Para actinomicetos, não foram
observadas diferenças populacionais entre as amostras dos dois locais (Ceplac e
IBC) e nem entre as amostras de solo e de raízes de cacaueiro. Em geral, a
influência da rizosfera sobre as populações de actinomicetos é menor do que
32
sobre as populações das demais bactérias, visto que esses são microrganismos
de crescimento lento com baixa capacidade competitiva (Pereira, 2000). O estudo
de correlação entre a população de bactérias e actinomicetos nas amostras de
solo e de raízes, indicou uma correlação positiva, porém não significativa.
Em geral, os actinomicetos são produtores de celulase, como foi observado
nos testes
in vitro com 26 isolados de solo ou raiz de cacaueiro (Tabela 3). A
produção de celulase tem um papel importante na degradação da matéria
orgânica de origem vegetal, podendo ser este um dos mecanismos que atuam na
promoção de crescimento de plantas por estes microrganismos. Murashima et al.
(2002) descrevem a celulose como um dos componentes mais abundantes da
biomassa vegetal, composto de moléculas de glicose unidas através de ligações
glicosídicas β (1-4), formando cadeias lineares, longas e rígidas (Moreira &
Siqueira, 2002) e que pode ser degradada por uma série de microrganismos
mediante a ação da celulase. A ação da celulase
(β-1,4 glucosidase) ocorre com
a clivagem da celulose, molécula complexa e recalcitrante, desdobrando-a em um
dissacarídio chamado celobiose e uma glicose. As reações envolvidas na
degradação da celulose do solo tornam o carbono disponível para o crescimento
de microrganismos (Deng & Tabatabai, 1994). Os microrganismos que são
capazes de degradar este composto, a exemplo dos isolados de Streptomyces
spp. avaliados neste trabalho, podem ter um papel importante na degradação da
matéria orgânica do solo, beneficiando o desenvolvimento de plantas pela
disponibilização de nutrientes, podendo ter ação também de biocontrole de
fitopatógenos que possuem celulose na sua parede celular (Berg et al., 2000).
A capacidade de degradação da xilana não foi observada nos isolados Act
41 e Act 32. Para os demais, constatou-se atividade xilanolítica, correspondendo
a 92 % do total de isolados avaliados. A xilana é o segundo maior constituinte das
plantas e sua estrutura básica consiste de uma cadeia principal linear de resíduos
β-D-xilopiranosil, unidos por ligações glicosídicas β-1,4 (Haltrich et al., 1996).
Esse polissacarídeo é degradado pelo complexo xilanolítico, as xilanases, que
são enzimas extracelulares, produzidas principalmente por fungos e bactérias
(Brochini, 2007), as quais atuam na decomposição da matéria orgânica. As
xilanases agem clivando as ligações glicosídicas internas da cadeia principal da
heteroxilana, resultando em uma diminuição no grau de polimerização do
substrato (Sunna & Antranikian, 1997). A atividade xilanolítica é mais uma
33
característica dos actinomicetos que pode atuar na promoção de crescimento de
plantas e, conseqüentemente, pode ter influenciado no crescimento das mudas de
cacaueiro produzidas em substrato inoculado com esses actinomicetos.
Dos isolados de Streptomyces spp. testados, 22 apresentaram atividade
quitinolítica. A quitinase degrada a quitina pela quebra das ligações glicosídicas
β,-1,4 existentes nos polímeros de N-acetilglucosamina (Cohen-Kupiec, 1998).
Nos testes de avaliação da solubilização de fosfato de cálcio pelos actinomicetos,
84,6 % dos isolados apresentaram atividade positiva. O fósforo (P) é um elemento
essencial para os seres vivos, desempenhando várias funções, tanto estruturais
quanto funcionais (Domingos et al., 2003). No solo, o P é encontrado nas formas
orgânicas (P-org), geralmente formando complexos com a matéria orgânica do
solo e inorgânica (Pi), representada principalmente pela fração fosfato (PO
4
=
).
Tendo em vista a sua baixa disponibilidade nos solos, particularmente nos solos
brasileiros, o P é um dos componentes essenciais e mais críticos para a nutrição
de plantas e microrganismos, depois do nitrogênio (Domingos et al., 2003).
Bactérias, fungos e actinomicetos, envolvidos nos processos de solubilização do
P inorgânico, excretam ácidos orgânicos que atuam dissolvendo diretamente o
material fosfático ou quelando os cátions que acompanham o ânion fosfato
(Kucey, 1983).
Na avaliação da produção do ácido indolacético, 84,6 % dos isolados de
Streptomyces demonstraram ser produtores deste hormônio que atua no
crescimento vegetal. Isto é mais um dos mecanismos de promoção de
crescimento vegetal que estes microrganismos podem oferecer quando
associados ao cultivo de plantas. O ácido indolacético afeta a morfologia das
raízes, aumentando o comprimento e o número de pêlos radiculares (Barbieri et
al., 1986), tornando as plantas menos susceptíveis ao déficit hídrico e à escassez
de nutrientes (Cattelan, 1999). A produção desta auxina por actinomicetos pode
ter influenciado o crescimento das mudas de cacaueiro. Neste trabalho, foram
observados incrementos na produção de massa seca da raiz e da parte aérea e
também foram observados valores semelhantes à testemunha tratada com o
ácido indolbutírico.
Este estudo sobre o crescimento de mudas de cacaueiro produzidas por
estaquia, em substrato alternativo (pó se serragem com areia lavada) inoculado e
incubado com isolados de
Streptomyces spp., mostrou efeitos benéficos ao
34
crescimento das mudas de cacaueiro, evidenciado pelo incremento na altura do
lançamento das mudas de 117,7 % e 68,3 %, proporcionado pela inoculação do
substrato com os isolados AC 103 e AC 26, respectivamente. Trabalhos com
isolados de Streptomyces spp. em tomateiro também demonstraram incrementos
significativos, com valores entre 96,9 % e 165 % para altura das plantas e entre
31,6 % e 51,3 % para matéria seca das raízes, além de um efeito de biocontrole
da meloidoginose no tomateiro (Sousa et al., 2006). Outros autores também
relataram a promoção de crescimento por estreptomicetos nesta cultura (Lima,
2003; Igarashi et al., 2003). Entretanto, para a cultura do cacaueiro, não foram
encontrados na literatura científica estudos com bactérias promotoras de
crescimento de plantas.
Sousa (2006), avaliando o tempo de incubação do substrato Plantmax
®
com isolados de actinomicetos, demonstrou a necessidade de um período de
incubação variando de 30 a 40 dias para que houvesse o efeito benéfico dos
actinomicetos na promoção de crescimento do tomateiro. Este período está
provavelmente associado ao ciclo de vida dos actinomicetos do gênero
Streptomyces e a produção de enzimas extracelulares, a exemplo das celulases,
xilanases e outras que estão envolvidas na decomposição dos compostos
orgânicos presentes no substrato e na liberação de nutrientes para a planta
(Sousa, 2006; James et al., 1991). Os microrganismos são os principais
responsáveis pela mineralização dos nutrientes do solo, tornando-os disponíveis
na solução do solo (Lavelle, 2000). Além dessas enzimas extracelulares, os
actinomicetos também produzem substâncias reguladoras de crescimento
vegetal. Sousa (2006) demonstrou que os isolados AC 103 e AC 26 produzem
ácido indolacético. Essas substâncias proporcionam o melhor desenvolvimento de
raízes laterais e alongamento das raízes primárias (Oliveira et al., 2003) e, como
conseqüência, proporcionam a melhor exploração do solo ou substrato pela
planta (Cattelan & Hartel, 2000). A promoção de crescimento do sistema radicular,
principalmente do crescimento de raízes secundárias e aumento dos pêlos
radiculares, tem sido observada por diversos autores, em trabalhos com
rizobactérias (Silveira, 2001).
Apesar dos isolados AC 26 e AC 103 terem sido obtidos e selecionados
como promotores de crescimento de tomateiro (Lima, 2003; Sousa, 2006), estes
foram capazes de induzir crescimento em mudas de cacaueiro propagadas por
35
estaquia. Entretanto, o mesmo efeito de promoção não foi observado entre os
isolados obtidos do cacaueiro. Isto se deve provavelmente à ausência de uma
pré-seleção dos isolados para esta atividade, visto que a grande maioria das
bactérias isoladas da rizosfera não apresenta a capacidade de promover o
crescimento de plantas (Chen et al., 1996).
O substrato composto por serragem misturada com areia lavada mostrou-
se promissor para produção de mudas de cacaueiro por estaquia. Este poderá
substituir outros compostos comerciais de custo elevado, já que a serragem é
proveniente de subprodutos de serrarias, sendo um material de baixo custo e
disponível em elevadas quantidades na região, e apresenta boas características
para o desenvolvimento de mudas (Sodré et al., 2005).
Os isolados de
Streptomyces spp. AC 103 e AC 26, selecionados neste
trabalho como os mais promissores deverão ser mais estudados, visando a sua
possível utilização no processo de produção de mudas de cacaueiro por estaquia
com o substrato alternativo pó de serra. Entretanto, outros fatores deverão ser
analisados como o período de incubação do substrato, o qual foi definido
anteriormente para o substrato Plantmax
®
(Sousa, 2006), devendo-se avaliar
diferentes períodos para o substrato alternativo, considerando que este possui
uma composição física e química diferente do Plantmax
®
que é composto por
casca de Pinus sp. processada, vermiculita expandida, turfa processada e
enriquecida e carvão granulado. O substrato alternativo inoculado com
actinomicetos e enriquecido com nitrogênio e outros nutrientes ou com diferentes
fontes de matéria orgânica também deverá ser avaliado, principalmente levando-
se em consideração a relação C:N do substrato na época da inoculação e
incubação com os actinomicetos. Outros fatores também poderão ser estudados
como a avaliação do desenvolvimento das mudas após um período mais longo
(superior a 90 dias) em casa de vegetação.
REFERÊNCIAS
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41
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho teve como objetivo o estudo da densidade populacional,
caracterização fisiológica, diversidade genética e do potencial de actinomicetos
associados ao cacaueiro para a promoção de crescimento de mudas desta cultura
propagadas por estaquia.
A baixa influência das raízes sobre as populações de actinomicetos,
evidenciada na diferença não significativa entre as populações encontradas nas
amostras de solos e de raízes, diferente do que ocorre com outras populações de
bactérias e até mesmo sobre populações fúngicas, se deve provavelmente, pelo
crescimento lento dos actinomicetos e baixa capacidade competitiva (PEREIRA,
2000).
A utilização de seqüências do gene
rpoB para a identificação molecular do
actinomicetos permitiu a classificação ao nível de gênero, sendo todos os isolados
pertencentes ao gênero
Streptomyces. Apesar das vantagens de utilização do
gene rpoB sobre o 16S rDNA (KIM et al., 1999), a falta de uma coleção universal
de isolados padrão de espécies de Streptomyces, bem como de seqüências
confiáveis nos bancos de dados públicos, fazem da identificação de isolados de
Streptomyces ao nível de espécie, uma tarefa muito difícil (ANDERSON &
WELLINGTON, 2001).
A produção in vitro de celulase, xilanase, quitinase e do ácido indolacético
e a capacidade de solubilização de fosfato pelos isolados de actinomicetos foram
avaliadas como características indicadoras dos possíveis mecanismos de ação
destes isolados. Contudo, geralmente não existe correlação entre a atividade in
vivo e in vitro para a maioria dos organismos (VESSEY, 2003).
Observou-se nos testes em mudas de cacaueiro, promoção de crescimento
de até 117,7 % em relação à testemunha, em substrato composto por serragem e
areia e inoculado com os isolados AC 26 e AC 103, previamente selecionados
para promoção de crescimento e controle da meloidoginose em mudas de tomate
(Sousa et al., 2006). Entretanto, para os isolados de Streptomyces spp. obtidos de
cacaueiro não houve diferença significativa entre os tratamentos e a testemunha
tratada com ácido indolbutírico. Isto pode ter ocorrido devido à baixa colonização
dos actinomicetos nas raízes das plantas, considerando que a colonização das
raízes é essencial para que ocorram uma série de benefícios mediados por
42
rizobactérias (WELLER, D.M, 1998; LUGTENBERG et al., 2001). Portanto, é
necessário testar um maior número de isolados para o crescimento de mudas de
cacaueiro, uma vez que, de acordo com CHEN et al. (1996), apenas 1 % das
bactérias isoladas da rizosfera de plantas é capaz de induzir crescimento.
Este é o primeiro estudo envolvendo actinomicetos e a cultura do
cacaueiro, sua densidade populacional na rizosfera, diversidade genética e
avaliação da promoção de crescimento em mudas. Assim, outros estudos devem
ser conduzidos para complementar o que foi iniciado neste trabalho.
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tomateiro. Pesquisa Agropecuaria Brasileira., Brasília, v. 41, n. 12, p. 1759-
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VESSEY, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and
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WELLER, D.M. Biological control of soiborne plant pathogens in rhizosphere with
bacteria. Annual Review of Phytopathology. Palo Alto, v. 26, p. 79407, 1998.
43
ANEXO
Meios de cultura e soluções
Extrato de Solo (1000 mL)
- Glicose........................................................................................................1 g
- K
2
HPO
4
....................................................................................................0,5 g
- KNO
3
........................................................................................................0,1 g
- MgSO
4
.7H
2
O................................................................. .............................7 g
- Agar...........................................................................................................20 g
- Extrato de Solo*....................................................................................500 mL
- H
2
O destilada........................................................................................500 mL
*Extrato de Solo:
- Solo estéril...............................................................................................100 g
- H
2
O destilada........................................................................................500 mL
Agar Nutriente (1000 mL)
- Extrato de carne..........................................................................................3 g
- Peptona.......................................................................................................5 g
- Agar...........................................................................................................15 g
- H
2
O destilada......................................................................................1000 mL
Arginine-Glycerol-Mineral Salt Ágar - AGS (1000 mL)
- Arginina HCl………………………………………………………..………......0,5 g
- Glicerol………………………………………………………..………...……..6,25 g
- K
2
HPO
4
.....................................................................................................0,5 g
- NaCl..........................................................................................................0,5 g
- MgSO
4
7H
2
O...........................................................................................0,25 g
- Fe(SO
4
)
3
6H
2
O..........................................................................................5 mg
- CuSO
4
5H
2
0.........................................................................................0,05 mg
- ZnSO
4
7H
2
O.........................................................................................0,05 mg
- MnSO
4
H
2
O..........................................................................................0,05 mg
- Agar...........................................................................................................15 g
- H20 destilada…………………………………………...………………….1000 mL
45
Amido Caseína (1000 mL)
- Amido Solúvel….........…………………………………………………………10 g
- Caseína……………….........…………...……………………………………..0,3 g
- KNO
3
…………………….........………………………………………….……….2 g
- NaCl…………………….........…………………………………………………...2 g
- K
2
HPO
4
………………….........……………………………………..……………2 g
- MgSO
4
7H
2
O………….........……………………………………..……...…..0,05 g
- CaCl
2
…………………..........……………………………………….……….0,002 g
- FeSO
4
7H
2
O………….........…………………….……………….…………0,002 g
- Agar……………….........………………………….…………………………….15 g
- H
2
O destilada….........…………………………….……………………….1000 mL
Mínimo de Sais (1000 mL)
- Xilana, Celulose ou Quitina..........................................................................1 g
- NaNO
3
.......................................................................................................0,5 g
- K
2
HPO
4
.........................................................................................................1 g
- MgSO
4
7H
2
O.............................................................................................0,5 g
- FeSO
4
7H
2
O............................................................................................0,01 g
- Extrato de Levedura.....................................................................................1 g
- Agar............................................................................................................15 g
- H
2
O destilada.......................................................................................1000 mL
Triptocaseína de Soja – TSA (1000 mL)
- Peptona.......................................................................................................5 g
- Triptona.....................................................................................................15 g
- NaCl............................................................................................................5 g
- Agar...........................................................................................................12 g
- H
2
O destilada.....................................................................................1000 mL
Solução de Salkowski
- FeCl
3
.6H
2
O 0,5 M.....................................................................................1 mL
- HClO
4
35 %.............................................................................................50 mL
46
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