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Flávia Barboza Camargo
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ESTUDOS ESTRUTURAIS DA
CHAPERONA MOLECULAR HSP65 DE Mycobacterium leprae
&
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA NUDEL – NUCLEAR
DISTRIBUTION ELEMENT-LIKE
São José do Rio Preto
2008
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FLÁVIA BARBOZA CAMARGO
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ESTUDOS ESTRUTURAIS DA
CHAPERONA MOLECULAR HSP65 DE Mycobacterium leprae
&
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA NUDEL – NUCLEAR
DISTRIBUTION ELEMENT-LIKE
Dissertação apresentada para obtenção do título
de Mestre em Microbiologia junto ao Programa
de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto
de Biociências, Letras e Ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio
Preto.
Orientador: Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy
Arni
Co-orientadora: Mirian Akemi Furue Hayashi
São José do Rio Preto
2008
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Camargo, Flávia Barboza.
Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular
Hsp65 de Mycobacterium leprae e caracterização da proteína NUDEL –
nuclear distribution element-like/ Flávia Barboza Camargo. - São José do
Rio Preto : [s.n.], 2008.
79 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni
Co-orientador: Mirian Akemi Furue Hayashi
Dissertação (mestrado – Microbiologia) – Universidade Estadual
Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Proteínas - Estrutura. 2. Proteínas - Purificação. 3. Chaperona. I.
Arni, Raghuvir Krishnaswamy. II. Hayashi, Mirian Akemi Furue. III.
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas. IV. Título.
CDU - 577.112
FLÁVIA BARBOZA CAMARGO
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E ESTUDOS ESTRUTURAIS DA
CHAPERONA MOLECULAR HSP65 DE Mycobacterium leprae
&
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA NUDEL – NUCLEAR
DISTRIBUTION ELEMENT-LIKE
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestre em Microbiologia junto ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni
UNESP – São José do Rio Preto
Orientador
Prof
a
. Dr
a
. Andréa Regina Baptista Rossit
FAMERP – São José do Rio Preto
Prof. Dr. Patrick Jack Spencer
IPEN – São Paulo
São José do Rio Preto, 18 de abril de 2008.
DADOS CURRICULARES
A autora desse trabalho, Flávia Barboza Camargo, nasceu em Catanduva – SP, no ano de
1982. No ano de 2002, ingressou na Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho –
UNESP IBILCE, campus de São José do Rio Preto, no curso de Ciências Biológicas. Ao final de
cinco anos concluiu a Licenciatura e o Bacharelado em Ciências Biológicas. Durante a
graduação, realizou vários estágios em diferentes laboratórios do IBILCE até que no ano de 2005
apresentou a monografia de conclusão do Bacharelado sob orientação do Prof. Dr. Raghuvir
Krishnaswamy Arni e, nesse mesmo ano, ingressou no curso de Pós-Graduação de Mestrado em
Microbiologia na Universidade Estadual Paulista – UNESP/IBILCE, com o auxílio financeiro da
FAPESP. Nesse período, realizou estágio no Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada
(CAT/CEPID - Instituto Butantan), sob a co-orientação da Prof
a
. Dr
a
. Mirian Akemi Furue
Hayashi. Vários projetos paralelos foram executados durante os dois anos de mestrado, além dos
dois trabalhos que são apresentados nessa dissertação.
Dedico esse
trabalho à quatro pessoas essenciais na minha
formação pessoal e profissional. Pra vocês, com todo meu amor:
Meu Pai: Sebastião J.V. Camargo
Minha Mãe: Marta Clarete B. Camargo
Minhas duas irmãs: Karen e Marina
AGRADECIMENTOS
Inicio os meus agradecimentos começando por uma pessoa que muito me ensinou, e que hoje,
muito do que eu aprendi durante os dois anos de mestrado eu vou levar para vida toda. Ao Prof.
Arni agradeço a paciência e seriedade com que sempre lidou comigo e às grandes oportunidades
que ele me proporcionou nesse período...
A um amigo mais que especial, Lars Redecke, que só quem o conhece pode saber o tamanho da
sua generosidade e inteligência... “just be yourself... just believe in you…”
Á Prof
a
. Mirian pelos milhões de esclarecimentos e paciência em me ensinar que os
’’problemas’’ que eu achava que eram problemas, não passavam de simples más
interpretações...
Ao Prof. Camargo pela confiança, carinho e atenção que sempre demonstrou!
Karine e Mário, sempre... todo o meu agradecimento pelos ensinamentos, momentos de
descontração, almoços, discussões de laboratório que fortaleceram minha bagagem científica e
todo o carinho que me trataram e que me tornou uma pessoa mais doce, mais calma...
Aos novos e antigos companheiros de laboratório: Sá, Tomada, Renato, Joice, Lili, Paty e Dani
sempre companheiros, prestativos e atenciosos... e aos amigos de todos os outros laboratórios da
UNESP/IBILCE.. .aos amigos do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada – Instituto
Butantan - pela ótima convivência.
Ás eternas amigas de infância.. .minha turma linda: Ana Luiza, Ana, Renata, Mari, Ce, Larissa,
Livia Maria, Lívia, Suzana, Karime, Mariana. E às antigas companheiras de faculdade: Aline,
Fer, Simone e Lívia, por todos os bons momentos da graduação, pelas risadas... pelos momentos
juntas que me fizeram tão feliz!!!
À Fran e em especial, á Pri... minhas amigas de república... todos os dias foram especiais e cada
um, com seu valor diferente... inesquecível...
A uma nova e inesquecível amiga: Fatiminha, que esteve presente em vários momentos durante
essse dois anos e à Prof
a
Paula Rahal pelos conselhos e ajudas infindáveis...
À FAPESP pelo auxilio financeiro sem o qual não seria possível a execução desse trabalho...
Aos professores da Pós Gradução em Microbiologia que me proporcionaram uma execelente
formação, formação essa que se reflete de maneira consistente pela base sólida construída pelos
professores da graduação do IBILCE... à todos, o meu muito obrigada...
Em especial gostaria de agradecer à minha familia... base sólida de toda a minha formação,
como ser humano, como amiga, como estudante, como filha, como irmã..... Que eu nunca
esqueça a concepção de humildade, seriedade, dignidade, sinceridade e amor que vocês me
ensinaram... Que eu nunca esqueça que vocês me ensinaram que tem um Ser Superior em algum
lugar olhando por nós... e que eu nunca esqueça de agradecê-Lo todos os dias pela minha vida,
pela força e guarra para vencer obstáculos. Obrigada!!!!!!!!!!
“O que for a profundeza do teu ser, assim será teu desejo.
O que for o teu desejo, assim será tua vontade.
O que for a tua vontade, assim serão teus atos.
O que foram teus atos, assim será teu destino“
- Brihadarnyaka Upanishad IV, 4.5
Resumo
RESUMO
A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais,
econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção
contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock
protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de
radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins
(Hsp´s). A principal função das Hsp´s é manter a estrutura e função das proteínas e,
conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas
moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em
infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi
evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa
forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em
grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de
condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD)
foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a
estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi
realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio
hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização
dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em
fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais.
Além do projeto principal, trabalhos paralelos com a proteína NUDEL (do inglês nuclear
distribution element-like) foram realizados com o objetivo de estabelecer um procedimento de
expressão e purificação com alto rendimento e pureza para estudos estruturais. A proteína foi
altamente expressa, purificada a partir de corpos de inclusão e renaturada pelo método da
diluição. Como agente estabilizador dos estados intermediários para renaturação utilizou-se a L-
arginina. Estudos de espalhamento dinâmico de luz mostraram que, na presença de 0,1 mM de
zinco e 1 mM de DTT, a proteína apresenta-se monomérica e monodispersa. Análises de
dicroísmo circular mostraram a presença de estrutura secundária com predominância de folhas-
β,
o que indica que a proteína está enovelada após o processo de renaturação. Ensaios de
cristalização dessa proteína com o uso dos aditivos DTT e zinco estão em andamento com o
objetivo de conseguir cristais difratáveis para os posteriores estudos estruturais.
Abstract
ABSTRACT
Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic
and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against
tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a
vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The
production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high
temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is
to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular
functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a
remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and
activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated
that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression,
purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure
protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of
the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe
the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the
oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse
with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample
are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in
process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel
with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was carried out with the aim of
establishing an experimental procedure for obtaining high amounts of pure protein for
crystallization studies. The protein was over expressed, purified from inclusion bodies and
refolded by the dilution method using L-arginine as a stabilizing agent for the intermediary steps
of the refolding process. Dynamic light scattering studies demonstrated that the protein was
monomeric and monodisperse in the presence of 0.1 mM of zinc and 1 mM of DTT. Circular
dichroism analysis showed the presence of secondary structure composed mainly of
β
-sheets
indicating that the protein was folded after the process. Crystallization assays of the protein in the
presence and absence of the additives DTT and zinc are currently being carried out in order to
obtain crystals suitable for X-ray diffraction analysis.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Alinhamento apresentado por Portaro et al, 2002 .........................................................6
Figura 02: Esquema simplificado do resultado do processo de duplicação do gene que codifica
para a Hsp65 de M. tuberculosis e M. leprae. .................................................................................7
Figura 03:
Gel SDS-PAGE 10% mostrando (1) fração não induzida, (2) fração induzida com 0,5
mM de IPTG após 4 horas..............................................................................................................28
Figua 04: Gel SDS-PAGE 10% representando o marcador de peso molecular (1), a fração de
proteínas insolúveis (2) e a fração solúvel (3) que corresponde às proteínas que remaneceram em
solução após o processo de rompimento das células......................................................................29
Figura 05: Gel SDS-PAGE 10% mostrando a Hsp65 M. leprae, após o processo de
enovelamento protéico, indicada pela seta e o marcador de peso molecular usado como
referência........................................................................................................................................30
Figura 06: Espectros de CD no UV distante da proteína Hsp65 de Mycobacterium leprae à 0,1
mg/ml em tampão 15 mM Tris HCl em temperatura ambiente......................................................31
Figura 07: Medidas de DLS da Hsp65 de Mycobcaterium lepraeà 12 mg/ml em tampão Tris HCl
50 mM pH 7,5 contendo 20 mM de NaCl......................................................................................34
Figura 8: Alinhamento das seqüências das proteínas Hsp65 de Mycobacterium leprae e Hsp65
de M. tuberculosis mostrando alto grau de similaridade................................................................36
Figura 9: Figura gerada, pelo programa PyMol, utilizando o modelo do pdb da Hsp65 de
Mycobacterium tuberculosis (1sjp)................................................................................................38
Figura 10: Gel SDS-PAGE 12,5 % . (1) fração não induzida (0 horas – sem IPTG), (2) a fração
induzida após 4 horas da adição de 1 mM de IPTG e o (3) representa o marcador de peso
molecular usado como referência para checar o peso da
proteína...........................................................................................................................................39
Figura 11: Gel SDS-PAGE
12,5 %
que representa a purificação da NUDEL-HUM feita da fração
protéica insolúvel............................................................................................................................40
Figura 12: Gel SDS-PAGE 12,5 % apresentado a proteína NUDEL-HUM em alto grau de pureza
e concentrada a 10 mg/ml...............................................................................................................41
Figura 13:
Medidas de DLS da proteína NUDEL a 1 mg/ml em diferentes pHs, pH 9,5 (a); pH
8,5 (b); pH 7,5 (c) e pH 6,0 (d).......................................................................................................42
Figura 14: Medidas de DLS da proteína NUDEL a 10 mg/ml em pH 7,5 contendo 100 mM de
NaCl................................................................................................................................................44
Lista de Figuras
Figura 15: Espectros de CD no UV distante da proteína NUDEL na ausência de aditivos (preto),
presença de Zinco (vermelho) e DTT+Zinco (verde).....................................................................45
Figura 16: Espectro de emissão de fluorescência da proteína NUDEL na ausência de aditivos
(preto), presença de Zinco (vermelho) e presença de Zinco e DTT...............................................47
Figura 17: Comparação da seqüência de aminoácidos da proteína NUDEL de Homo sapiens
(código de acesso no GenBank
TM
NP110435), Pan troglodytes (código de acesso no GenBank
TM
XP001166739), Canis familiaris (código de acesso no GenBank
TM
XP850046) e Bos taurus
(código de acesso no GenBank
TM
XP5879).................................................................................51
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição de estrutura secundária da Hsp65 de Mycobacterium leprae. Os valores
são dados em porcentagem (%) e o erro é de 5,9% para as medidas adquiridas de 190 a 260
nm...................................................................................................................................................32
Tabela 2: Composição de estrutura secundária da proteína nudel na ausência e presença de
aditivos. Os valores são dados em porcentagem (%) e o erro é de 6,20 % para as medidas
adquiridas de 195 a 260 nm............................................................................................................46
Lista de Abreviações
LISTA DE ABREVIAÇÕES
BCG - Bacilo de Calmette-Guérin
CAT/CEPID - Center of Applied Toxinology/Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão
CD – Dicroísmo Circular
Cpn -
Chaperona
DISC1 - disrupted-in-schizophrenia 1
DLS – Dynamic light scattering/Espalhamento Dinâmico de Luz
E. coli - Escherichia coli
Hsp – Heat shock protein
IPTG -
Isopropylthio-B-D-galactoside
LIS1 - lissencephaly isolated sequence 1
M. leprae – Mycobacterium leprae
M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis
NBT - Nitroblue terazolium
Ni-NT
A - ácido níquel-nitrilotriacético
NUDEL - Nuclear Distribution Element-like
nudE – Nuclear distribution protein E
O.D. – Optical density
O.N. – Over night
SDS
- Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE - SDS polyacrylamide gel electrophoresis
T.B. - Tuberculose
TEMED - N, N, N´, N´-tetrametiletilenediamina
vc – volume de coluna
Índice
Índice
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO...................................................................................................1
1.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae ...............................................................................................2
1.1.1 Tuberculose...........................................................................................................................2
1.1.2 Heat shock proteins...............................................................................................................3
1.1.3 Hsp65 de Mycobacterium leprae ..........................................................................................4
1.1.4 Estudo Filogenético da Hsp65...............................................................................................7
1.2 NUDEL (nuclear distribution element-like ) .............................................................................9
1.2.1 Esquizofrenia e doenças neurológicas relacionadas..............................................................9
1.2.2 Nudel...................................................................................................................................10
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS......................................................................................................13
CAPÍTULO 3 – PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS.....................................................14
3.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae .............................................................................................15
3.1.1 Preparação de células competentes (HANAHAN 1983) ....................................................15
3.1.2 Transformação por choque térmico.....................................................................................16
3.1.3 Expressão-Teste da Proteína Recombinante .......................................................................17
3.1.4 Maxi-Expressão da Proteína Recombinante .......................................................................17
3.1.5 Extração da Proteína na Fração Insolúvel...........................................................................18
3.1.6 Diálise..................................................................................................................................19
3.1.7 Gel de poliacrilamida desnaturante (Soduim dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis - SDS-PAGE)........................................................................................................20
3.1.8 Concentração.......................................................................................................................21
3.1.9 Quantificação ......................................................................................................................21
3.1.10 Dicroísmo Circular (CD)...................................................................................................22
3.1.11 Espalhamento Dinâmico de Luz (DynamicLlight Scattering - DLS)...............................22
3.1.12 Ensaios de Cristalização....................................................................................................23
3.2 NUDEL (nuclear distribution element-like) ............................................................................24
3.2.1 Isolamento e purificação de corpos de inclusão..................................................................24
3.2.2 Experimentos de Renaturação.............................................................................................25
3.2.3 Emissão intrínseca de fluorescência....................................................................................25
3.2.4 Cristalização........................................................................................................................26
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................27
4.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae .............................................................................................28
4.1.1 Expressão e Purificação da Hsp65 de Mycobaterium leprae..............................................28
4.1.2 Dicroísmo Circular..............................................................................................................31
4.1.3 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ..............................................................................33
4.1.4 Cristalização........................................................................................................................35
Índice
4.1.5 Estudo comparativo da Hsp65 de Mycobacterium leprae com a Hsp65 de Mycobacterium
tuberculosis ....................................................................................................................................36
4.2 NUDEL (nuclear distribution element-like) ............................................................................39
4.2.1 Expressão e Purificação da proteína NUDEL-HUM ..........................................................39
4.2.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ..............................................................................42
4.2.3 Dicroísmo Circular..............................................................................................................45
4.2.4 Fluorescência.......................................................................................................................47
4.2.5 Ensaios de Cristalização......................................................................................................49
4.2.6 Alinhamento múltiplo de seqüências da NUDEL...............................................................50
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÃO..................................................................................................52
5.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae .............................................................................................53
5.2 NUDEL (nuclear distribution element-like) ............................................................................54
CAPÍTULO 6 – RECONHECIMENTO....................................................................................55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................56
Capítulo 1 – Introdução - 1
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO
Essa dissertação de mestrado apresenta, em paralelo, o estudo de duas proteínas
não-correlacionadas que são de grande importância para a saúde pública. Uma está
relacionada com a produção de uma nova vacina contra tuberculose, atuando como um
possível adjuvante - Hsp65 de Mycobacterium leprae. A Hsp65 de Mycobacterium leprae
apresenta as funções básicas de chaperona molecular e atua como um potente antígeno
altamente estudado para o desenvolvimento de uma possível vacina contra tuberculose que
seja mais eficiente que a BCG. A outra proteína, NUDEL (do inglês Nuclear Distribution
Element like), isolada do cérebro de humano está relacionada com o desenvolvimento
neural em mamíferos e sua interação com outras proteínas citosólicas possivelmente
implica na relação dessa proteína com a etiologia da esquizofrenia. Nas seções seguintes
desse capítulo será feita uma descrição mais detalhada de cada uma das proteínas
estudadas.
O capítulo 2 apresenta, de maneira clara e direta, os objetivos do trabalho. O
capítulo 3 descreve os procedimentos experimentais, em forma de protocolo, usados para o
desenvolvimeto dos projetos. Os resultados e discussões são abordados no capítulo 4 e,
finalmente, as conclusões são apresentadas no capítulo 5.
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 2
1.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae
1.1.1 Tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa que representa um dos principais
problemas sociais, econômicos e de saúde publica do mundo (WHO, 2000). Considerando
sua marcha desafiadora, estima-se que dois bilhões de pessoas (1/3 da população mundial)
estão infectadas com o bacilo causador da doença, e que, desses, um em cada 10 adoecerá.
Em 2005, 1,6 milhões de pessoas morreram de tuberculose, o que siginifica 4 400 mortes
por dia (WHO, 2007)
O conhecimento sobre a dinâmica dessa doença tem como marco a identificação do
bacilo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) por Robert Koch, em 1882. A TB é
causada primeiramente pelo M. tuberculosis (bacilo de Koch), entretanto, em muitas partes
do mundo, uma quantidade significativa da doença ocorre devido à infecção por
microrganismos altamente relacionados como Mycobacterium africanum e Mycobacterium
bovis. Juntamente com espécies de menor importância, esses microoganismos são
coletivamente referidos como complexo Mycobacterium tuberculosis. Estudos genômicos
têm demonstrado que a vasta maioria de genes dessas espécies é idêntica, ou muito similar,
e que diferenças mais intensas entre espécies e linhagens são inserções e deleções de DNA
codificando um pequeno número de proteínas (COLE et al., 1998). Embora o significado
funcional dessas diferenças, bem como as diversas substituições de nucleotídeos ocorridas
entre espécies ainda não tenham sido esclarecidas, muitas dessas podem resultar em
alterações na patogenicidade observadas entre espécies e linhagens distintas
(FLEISCHMANN et al., 2002).
O tratamento da tuberculose é realizado com o uso de diferentes antibióticos por no
mínimo seis meses. O longo período de tratamento e os efeitos colaterais dos medicamentos
utilizados resultam no abandono do mesmo. Por outro lado, a profilaxia da TB é realizada
pela administração da vacina BCG (bacilo de Calmette-Guérin) que foi desenvolvida por
Albert Calmette e Camille Guérin no Instituto Pasteur entre 1906 e 1919 (CHUNG &
BIGGERS, 2001; BANNON, 1999). Essa vacina consiste de uma cepa atenuada de M.
bovis por meio do cultivo do bacilo in vitro por vários anos. Estima-se que mais de três
bilhões de doses da vacina BCG já foram administradas em todo o mundo (FINE, 1989).
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 3
Apesar da relativa segurança e baixo custo da vacina BCG, sua eficácia é altamente
variável (FINE, 1989). A variabilidade na proteção conferida pela BCG está associada a
vários fatores, tais como o contato prévio com micobacterias ambientais (principalmente
nas regiões tropicais), características genéticas na população vacinada, inexistência de
padronização na produção da vacina e a perda de segmentos gênicos durante as sucessivas
culturas do bacilo (HESS & KAUFMANN, 1999).
Embora exista a vacina BCG e também medicamentos para a terapia de indivíduos
doentes, alguns fatores estão associados ao elevado número de casos de TB, como o
abandono da quimioterapia, o surgimento de novas cepas e a eficácia variável da BCG.
Esse contexto levou à necessidade do desenvolvimento de uma nova vacina contra a TB,
mais eficiente e segura que a BCG e que possa ser empregada em indivíduos
imunocomprometidos. Nos últimos anos, foram testadas mais de 170 vacinas experimentais
contra a TB, baseadas em microrganismos vivos recombinantes ou proteínas, em diferentes
modelos animais, muitas das quais estão em fase de ensaio clínico (REED & LOBET 2005;
GINSBERG, 2002).
1.1.2 Heat shock proteins
As proteínas do choque térmico ou, como são chamadas no Inglês heat shock
proteins (Hsp), pertencem a várias famílias classificadas de acordo com seu peso molecular
mensurado em kilodalton (kDa). Essas famílias são: pequenas Hsp’s de 27 kDa, Hsp60
kDa, Hsp70 kDa, Hsp90 kDa entre outras (NEUER et al., 2000). Devido à alta homologia
entre as seqüências das Hsp´s de vários grupos de organismos, as mesmas são consideradas
proteínas altamente conservadas filogeneticamente (POCKLEY et al., 1999).
Elas recebem esse nome pois são proteínas cuja expressão é induzida por altas
temperaturas, ou seja, sob estresse térmico. Porém, uma variedade de estímulos estressantes
elevam a produção das Hsp’s como, por exemplo, estímulos do meio ambiente (variação
brusca de temperatura, radiação ultravioleta, metais pesados), patológicos (vírus, bactérias,
infecções parasitárias, febre, inflamação, auto-imunidade) ou estímulos fisiológicos (fatores
de crescimento, diferenciação celular, estímulo hormonal ou desenvolvimento tecidual)
(ASEA et al., 2000).
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 4
As Hsp’s possuem várias funções: fazem o transporte de peptídeos, previnem a
agregação protéica, auxiliam na preservação da estrutura/função de proteínas celulares em
condições de estresse e, como chaperonas moleculares, auxiliam no enovelamento de outras
proteínas sem alterar sua função final (VAN ÉDEN, 2000; NEUER et al., 1998). Atuam
também na síntese protéica e no transporte entre compartimentos intracelulares (VAN
ÉDEN et al., 1998). O termo “chaperona molecular” foi primeiramente descrito devido à
função especializada de uma proteína nuclear denominada nucleoplasmina, que promove a
união da cromatina (HARTL, 1996).
Uma forma particular de estresse é presenciada quando um microrganismo
patogênico invade o hospedeiro. A alteração no ambiente celular do patógeno acarreta um
aumento da produção de Hsp’s. É nesse contexto que se destaca a principal função das
Hsp’s que atuam na ativação do sistema imune do hospedeiro, operando como um alarme,
sinalizando as células do sistema imune a um perigo potencial e não usual nos tecidos
(ZUGEL & KAUFMANN, 1999).
Essas Hsp’s são consideradas importantes antígenos imunodominantes, visto que
induzem uma forte resposta imunológica celular e humoral por parte do hospedeiro. De
fato, estudos recentes demonstram que as Hsp’s, principalmente das famílias Hsp60 e 70
kDa, são potentes desencadeadoras de resposta imune (ASEA et al., 2000).
1.1.3 Hsp65 de Mycobacterium leprae
Nos últimos 10 anos, a comunidade científica tem explorado os estudos para
melhorar as pesquisas em relação a uma possível vacina contra tuberculose. Uma vacina
com beneficios clínicos deve preencher no mínimo dois benefícios ou dois componentes:
codificar o antígeno de interesse e, os adjuvantes, que aumentam a resposta imune através
do recrutamento e da ativação das células apresentadoras de antígenos. Muitos antígenos
potentes e estratégias imunogênicas demonstraram proteção contra tuberculose em modelos
experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa da
Mycobacterium leprae (LIMA et al., 2003a).
A Hsp65 de Mycobacterium leprae pertence à família Hsp60 kDa e tem sido
identificada como um antígeno imunodominante notório, dado que provoca resposta imune
humoral e ativação de células T no hospedeiro durante a infecção micobacteriana
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 5
(NAGABHUSHANAM et al., 2001). Silva et al. 1999 revelaram uma proteção importante
conferida pela Hsp65 de M. leprae, a qual estimula o hospedeiro mamífero a resistir a uma
infecção causada por M. tuberculosis. O mecanismo exato pelo qual essa particular Hsp, e
não outra, regula a resposta imune gerando proteção contra a tuberculose não está
elucidado, mas sua eficiência é impressionante e reprodutível (LIMA et al., 2003b). Sendo
assim, uma importante aplicação para a Hsp65 de M. leprae é seu uso como adjuvante ou
vacina contra tuberculose devido ao seu alto poder imunogênico (PORTARO et al., 2002).
A partir dos estudos q objetivaram determinar o mecanismo molecular que acarreta
a eficiência da vacina de cDNA de Hsp65 de M. leprae contra tuberculose, notou-se que o
citosol de macrófagos de camundongos expressando Hsp65 de M. leprae exibia uma alta
atividade oligopeptidásica em relação ao controle (SILVA et al., 1999; LOWRIE et al.,
1999). Cogitou-se, então, que essa elevada atividade seja, provavelmente, devido à própria
Hsp 65. Portaro et al., 2002 caracterizaram a Hsp65 de M. leprae recombinante como sendo
a responsável por essa atividade. O teste de atividade, que identificou a apresença de
fragmentos gerados a partir dos polipeptídeos usados como substratos, foi o estudo que
evidenciou a provável atividade oligopeptidase. Um alinhamento entre as seqüências de
resíduos de aminoácidos de Hsp65 e da protease Hs1VU, também uma heat shock protein,
de Escherichia coli sugeriu os prováveis resíduos catalíticos responsáveis pela possível
atividade proteolítica de Hsp65 de M. leprae (Figura 01) (PORTARO et al., 2002).
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 6
Figura 01: Alinhamento apresentado por Portaro et al., 2002 entre a Hsp65 de Mycobacterium
leprae e a protease Hs1VU apresentando a indicação da suposta tríade catalítica.
A tríade catalítica dessa protease consiste do resíduo nucleofílico T
1
, ativado pelo
aminácido básico K
33
e do resíduo responsável pela formação de ligação de hidrogênio S
124
(BOCHTLER et al., 1997). Embora a Hs1VU e Hsp65 de M. leprae apresentem baixa
similaridade de seqüência de resíduos de aminoácidos (20 %), os resíduos reativos de
Hs1VU (T
1
, K
33
e S
124
) alinham-se com T
136,137
, K
168
e Y
264
no N-terminal e com T
375,376
,
R
407
ou K
409
e S
502
no C-terminal da molécula de Hsp65 de M. leprae (Figura 01). Esses
dois prováveis sítios catalíticos da Hsp65 foram alvos de estudos de mutagênese sítio-
dirigida e os melhores resultados foram obtidos com mutações dirigidas à tríade catalítica
do C-terminal. Nenhuma mutação foi dirigida aos resíduos de treonina, pois, como
demonstrado para Hs1VU, substituições T
1
/A e T
2
/A causaram pouca redução na atividade
enzimática (MISSIAKAS et al., 1996).
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 7
A substituição K
409
/A, no C-terminal, acarretou uma perda completa de atividade
proteolítica, enquanto a substituição R
407
/A foi menos efetiva (72% de perda de atividade).
Contrariamente, a substituição K
168
/A, na tríade hipotética do N-terminal, foi muito menos
efetiva (25% da perda de atividade). Assim, esses resultados sugerem que os aminoácidos
T
375
, K
409
e S
502
formam a tríade responsável pela possível atividade proteolítica de Hsp65
de M. leprae (PORTARO et al., 2002).
1.1.4 Estudo Filogenético da Hsp65
Durante um estudo filogenético, realizado por Hughes 1993, revelou-se que a Hsp65
kDa de M. tuberculosis é codificada por dois genes diferentes provenientes de uma
duplicação gênica no ancestral comum entre Mycobacterium tuberculosis, M. leprae e
Streptomyces albus. Um dos genes, que codifica a proteína, está localizado em um
cromossomo no mesmo operon que codifica a Hsp10 kDa (ou, também chamada de Cpn
10). Essa Hsp65 (ou também chamada de Cpn 60-1), na atuação do mesmo operon que a
Cpn 10, forma um complexo similar ao complexo GroEL/ES de E. coli que se trata de
chaperona molecular típica. O outro gene que codifica para a Hsp65 (chamada Cpn 60-2)
se localiza em outro cromossomo (Figura 02) (modificado de KONG et al., 1993).
Figura 02: Esquema simplificado do resultado do processo de duplicação do gene que codifica para
a Hsp65 de M. tuberculosis e M. leprae. No gene ancestral, a Hsp65 (ou Cpn 60-1) está sob
atuação do mesmo operon que a Cpn10 codificando uma proteína similar à GroEL/ES. O produto
da duplicação do gene que codifica para a Hsp65 (ou Cpn 60-2) não está sob atuação desse operon,
localizando-se em outro cromossomo.
Capítulo 1 – Introdução: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 8
A proteína Hsp65 kDa (Cpn 60-2) é o maior alvo de estudo para a resposta imune
do hospedeiro vertebrado durante infecção por patógenos como a Mycobacterium
tuberculosis e a M. leprae (Young et al., 1988). Nesse sentido, o gene que codifica a Hsp65
(Cpn 60-2) de Mycobacterium leprae, está sob extensivo estudo na tentativa de se
caracterizar novas funções, como a já relatada de possível oligopeptidase, mas nenhum
estudo da estrutura tridimensional foi feito até o momento, a fim de que se confirmem os
determinantes estruturais dessa função.
Capítulo 1 – Introdução: NUDEL - 9
1.2 NUDEL (nuclear distribution element-like )
1.2.1 Esquizofrenia e doenças neurológicas relacionadas
A esquizofrenia é uma desordem psíquica que afeta cerca de 1 % da população
mundial (BRANDON et al., 2004) sendo caracterizada por distúrbios do funcionamento
emocional e social. É considerada também uma doença genética complexa, com
herdabilidade consideravelmente alta, que se relaciona às más formações do hipocampo e
do córtex dorsolateral (LIPSKA et al., 2006). A doença se manifesta, na maioria das vezes,
na adolescência e início da fase adulta, mas raramente na infância. Recentemente, vários
genes foram identificados como genes candidatos à susceptibilidade para a esquizofrenia,
incluindo neuregulin 1 (STEFANSSON et al., 2002), dysbindin (STRAUB et al., 2002),
G72 (CHUMAKOV et al., 2002), catechol-O-methyltransferase (EGAN et al., 2001;
BILDER et al., 2002; SHIFMAN et al., 2002), e outros (CRADDOCK et al., 2005;
HARRISON & WEINBERGER, 2005). Embora esses genes candidatos tenham sido
identificados, os mecanismos moleculares nos quais se baseia a doença são desconhecidos.
O DISC1 é um dos genes candidatos mais prováveis para a suscetibilidade à
esquizofrenia e doenças relacionadas (MILLAR et al., 2000; BLACKWOOD et al., 2001;
CRADDOCK et al., 2005). Em uma família escocesa, a translocação cromossômica
(1;11)(q42.1;q14.3) foi associada com doenças psíquicas graves, como a esquizofrenia, a
desordem bipolar e a depressão recorrente, porém com predominância da sintomatologia da
esquizofrenia (BLACKWOOD et al., 2001). Essa translocação interrompe a seqüência que
codifica a proteína DISC1, acarretando diminuição na expressão da mesma ou na deleção
de 257 resíduos de aminoácidos da região C-terminal da mesma (MILLAR et al., 2005).
Análises usando polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) da região 1q42 indicaram
que o gene DISC1 tem um papel importante na etiologia da esquizofrenia (HENNAH et al.,
2003; HODGKINSON et al., 2004; CALLICOTT et al., 2005).
O gene DISC1 codifica uma proteína de 854 aminoácidos que não apresenta
homologia com outras proteínas conhecidas e pouca homologia entre espécies (MILLAR et
al., 2005). A seqüência de aminoácidos da DISC1 prediz que esta pode atuar como uma
“plataforma” de interação com múltiplos motivos de ligação, facilitando a formação de
complexos com outras proteínas. O domínio N-terminal, supostamente globular,
Capítulo 1 – Introdução: NUDEL - 10
(aminoácidos 1-347) contém sinais de localização nuclear, enquanto o C-terminal
(aminoácidos 348-854) é formado por coiled coil, o que sugere um papel de interação com
outras proteínas, além de ser importante para o endereçamento de complexos para os
microtúbulos. Em culturas celulares, mutantes da DISC1 que possuem o C-terminal
truncado (como predito pela translocação no cromossomo 1q42) dificultam ou impedem o
transporte intracelular, a arquitetura e migração neural. A hipótese de que a forma
patológica da DISC1 encontrada na família escocesa seja incapaz de interagir com
proteínas parceiras recebeu suporte em estudos de duplo-híbrido em levedura que
confirmaram as proteínas NUDEL (OZEKI et al., 2003; MILLAR et al., 2003; MORRIS et
al., 2003), Fasciculation and elongation protein zeta 1 (FEZ1) (MIYOSHI et al., 2003),
lissencephaly isolated sequence 1 (LIS1) (BRANDON et al., 2004) e fosfodiesterase 4B
(PD4B) (MILLAR et al., 2005) como ligantes da DISC1.
O complexo DISC1/NUDEL existe no cérebro de camundongo e é regulado de
acordo com os estágios do desenvolvimento neural. O complexo é expresso no córtex
cerebral e está, majoritariamente, presente na embriogênese tardia, quando ocorre o
desenvolvimento do córtex no embrião, apresentando-se em nível bem reduzido na vida
pós-natal. Importantes evidências que relacionam a translocação em DISC1 com
anormalidades corticais provêm de estudos que mostram que a DISC1 mutante afeta a
migração neural.
1.2.2 Nudel
A proteína NUDEL recebeu esse nome devido à homologia com a proteína nudE de
Aspergillus, a qual é produto do gene nudE, membro de um grupo de genes importantes na
migração nuclear em fungos (EFIMOV & MORRIS, 2000; KITAGAWA et al., 2000). Ela
foi, primeiramente, isolada devido à sua habilidade em inativar peptídeos bioativos, como a
bradicinina e neurotensina e, também, em converter peptídeos opióides em encefalinas
(OLIVEIRA et al., 1976, CAMARGO et al., 1979). A NUDEL é responsável por cerca de
70% da atividade peptidásica encontrada no cérebro de rato e coelho, sendo essa atividade
enzimática maior no cérebro de rato e do coelho do que em qualquer tecido periférico, o
que foi confirmado por análises imunoquímicas, por Western e Northern blotting e por
hibridização in situ (HAYASHI et al., 2000).
Capítulo 1 – Introdução: NUDEL - 11
Originalmente descrita como conversora de encefalinas e metabolizadora de
neuropeptídeos, a NUDEL interage com proteínas neuronais sendo essencial no
desenvolvimento e organização do córtex cerebral durante a embriogênese (GUERREIRO
et al., 2005). Recentemente, estudos mostraram evidências de seu possível envolvimento
em processos como rotas metabólicas, sinalização celular e mudança do citoesqueleto, além
da modulação de processos fisiopatológicos, de desordens neurológicas e neuroespecíficas
como a Esquizofrenia e a Lisencefalia.
A NUDEL é uma oligopeptidase ativada por tiol que cliva oligopeptídeos de 7 a 13
resíduos de aminoácido. O resíduo C273 é essencial para a atividade enzimática, sugerindo
que a proteína pertença à família das cisteíno-peptidases. A NUDEL está, possivelmente,
envolvida na modulação da atividade neuropeptídica, uma vez que essa enzima não está
confinada apenas ao citosol de neurônios, sendo encontrada também fora da célula
(HAYASHI et al., 2005).
A relação da NUDEL com a gênese da esquizofrenia deve-se a interação dessa
proteína com produto do gene DISC1. Um zíper de leucina na região C-terminal da DISC1
é essencial para a interação com NUDEL. Essa região seria inexistente em uma proteína
afetada pela translocação descrita anteriormente, o que impediria as funções celulares
dependentes do complexo DICS1/NUDEL. O sítio de ligação da DISC1 na NUDEL é
altamente conservado entre espécies, sendo os resíduos L266 e E267, essenciais para a
interação DISC1/NUDEL, conservados em todos os homólogos conhecidos (SWEENEY et
al., 2001). Esse domínio de ligação da NUDEL com a DISC1 é compartilhado com a cadeia
pesada da dineína (proteína motora) (SASAKI et al., 2000), sugerindo que a DISC1 pode
inibir ou modular a interação da NUDEL com a dineína e, conseqüentemente, interferir na
localização celular do complexo.
A atividade de oligopeptidase da NUDEL é exercida pela sua forma monomérica,
sugerindo que, quando presente em complexos, como DISC1/NUDEL, não apresenta
atividade enzimática. A inibição da atividade enzimática perante ligação com DISC1 é
explicada pela proximidade entre o sítio de ligação da DISC1 na NUDEL (L266 e E267) e
o sítio catalítico situado próximo ao resíduo 273 (HAYASHI et al., 2005). Dessa forma, a
translocação em DISC1 produz uma proteína mutante incapaz de ligar à NUDEL e,
conseqüentemente, de inibir sua atividade, acarretando em um aumento da atividade
Capítulo 1 – Introdução: NUDEL - 12
oligopeptidásica da NUDEL e em alterações no nível de seus substratos. Sabe-se que,
dentre os substratos da NUDEL, existem alguns neuropetídeos que estão implicados na
patofisiologia da esquizofrenia, como a neurotensina (HAYASHI et al., 2005).
Além de seu papel na migração neural, o complexo DISC1/NUDEL também está
envolvido nos mecanismos que acarretam o crescimento neural (alongamento axonal), uma
vez que a NUDEL foi, primeiramente, identificada como uma proteína de ligação à LIS1
(lissencephaly isolated sequence 1) (NIETHAMMER et al., 2000; SASAKI et al., 2000)
por meio de sua porção amino-terminal, uma região de coiled coil que compreende o sítio
de ligação para a LIS1. Mutações em LIS1 acarretam lisencefalia tipo 1, que é caracterizada
por má formação do cérebro humano devido a uma redução ou ausência das convoluções
do córtex cerebral devido à interrupção na migração e crescimento cerebral (REINER et al.,
1993; HATTORI et al., 1994, KHOLMANSKIKH et al., 2003). Essas mesmas mutações
impedem a interação entre LIS1 e NUDEL, correlacionando a não formação do complexo
DICS1/NUDEL/LIS1 com a doença (FENG et al., 2000; SASAKI et al., 2000; SWEENEY
et al., 2001).
Assim, pode-se concluir que a NUDEL possui dois papéis fisiológicos fortemente
entrelaçados. O primeiro relaciona-se a sua associação com proteínas citosólicas como
DISC1 e LIS1 essencial para o funcionamento normal do cérebro devido ao envolvimento
em processos como crescimento e migração neural. O segundo diz respeito à sua atividade
peptidásica, sugerindo sua participação na regulação da ação de neuropetídeos do sistema
nervoso central. Esses dois papéis desempenhados pela NUDEL associam-na a duas
doenças relacionadas ao desenvolvimento do córtex cerebral: esquizofrenia e lisencefalia.
Portanto, estudos estruturais da proteína NUDEL podem confirmar as predições sobre a
disposição e organização dos motivos importantes para interação com DISC1 e LIS1 além
de desvendar seu mecanismo catalítico. Essas informações estruturais podem complementar
os dados funcionais da proteína e ajudar no entendimento da dinâmica neural responsável
pela etiologia de doenças mentais.
Capítulo 2 – Objetivos 13
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS
Nesse projeto de mestrado, os alvos principais foram a expressão e a purificação em
grande escala e alta pureza da proteína recombinante Hsp65 (Cpn 60-2) de M. leprae e da
proteína NUDEL Homo sapiens (NUDEL-HUM) para estudos estruturais.
Como objetivo paralelo, um dos alvos do projeto de mestrado foi treinar a aluna a
trabalhar com as mais variadas técnicas que estão descritas no Capítulo 3 – Procedimentos
Experimentais. Com isso, a aluna pôde trazer esses conhecimentos e aplicá-los no
laboratório de Biologia Molecular da UNESP/IBILCE que não possuia estudantes bem
treinados e preparados para trabalhar nessa área de pesquisa.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais - 14
CAPÍTULO 3 – PROCEDIMENTOS
EXPERIMENTAIS
Esse capítulo descreve, de maneira detalhada, os materiais e os métodos descritos
como protocolos, usados para a execução dos projetos apresentados nessa dissertação de
mestrado.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 15
3.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae
3.1.1 Preparação de células competentes (HANAHAN 1983)
Materiais:
- tubos de cultivo estéreis com capacidade para 15 ml,
- meio de cultivo Luria Broth (LB): 1,0% triptona, 1% de extrato de levedura e 0,5%
de NaCl,
- incubadora com temperatura (37 ºC ) e agitação controladas,
- banho de gelo,
- espectrofotômetro para leitura da densidade óptica (D.O.) em 600nm,
- centrifuga Sorval modelo RC 5B Plus,
- solução 1: 100 mM de MgCl
2
estéril,
- solução 2: 100 mM de CaCl
2
estéril,
- solução 3: 15% (v/v) de glicerol 100% e 85% (v/v) de 100 mM de CaCl
2,
- tubos estéreis com capacidade de 1,7 ml,
- nitrogênio líquido,
- freezer - 80ºC
Métodos:
Transferir 100 µl de um estoque de célula competente BL21 (DE3) para um tubo de
cultura contendo 3 ml de meio LB. Essa cultura foi mantida por 16 horas em icubadora. A
seguir transferiu-se esse conteúdo para um frasco contendo 200 ml de meio LB que foi
incubado até atingir um valor de densidade ótica - D.O.
(600 nm)
em torno de 0,3. Nesse
instante, interrompeu-se o crescimento celular colocando o frasco em banho de gelo.
Centrifugou-se a cultura a 4000 x g por 15 minutos à 4 ºC para decantar as células.
Descartou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se as células em 50,75 ml da solução 1, onde
permanceu no gelo por 5 minutos e, a seguir, centrifugou-se a suspensão nas mesmas
condições. As células foram ressolubilizadas em 10,15 ml da solução 2, em banho de gelo,
assim permanecendo por 20 minutosn sendo então centrifugada nas mesmas condições.
Novamente o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 1,5 ml da solução 3
.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 16
Aliquotou 100
µ
l em tubos com capacidade de 1,7 ml que foram congeladas e estocadas em
freezer – 80 ºC.
3.1.2 Transformação por choque térmico
Materiais:
- 200 ng de DNA plasmidial,
- linhagem BL21 (DE3) competentes de Escherichia coli,
- banho de gelo,
- banho térmico à 42ºC,
- SOC (0,5% extrato de levedura, 2% triptona, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM
MgCl
2
, 10 mM MgSO
4
e 20 mM glicose),
- tubos de cultivo estéreis,
- incubadora com temperatura (37 ºC ) e agitação controladas,
- centrifuga eppendorf modelo 5415D,
- placas de petri estéreis,
- LB-ágar (1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7,5 e 1,8% ágar p/v,
- antibióticos: ampicilina na concentração de 100 µg/ml e cloranfenicol a 34 µg/ml,
- estufa de incubação com temperatura controlada à 37ºC,
Métodos:
O vetor pUC19 contendo o gene codificante foi utilizado para transformar, por
choque térmico, linhagens BL21 (DE3) competentes de Escherichia coli com o fim de
expressar a proteína. Para tanto, 2
µ
l de cada DNA plasmidial foram incubados com 100
µ
l
de bactérias competentes no gelo por trinta minutos seguidos de um minuto em banho à
42ºC e, por fim, mais três minutos no gelo. Após o choque térmico, 950
µ
l de SOC foram
adicionados às células e essas foram incubadas por uma hora. A seguir, centrifugou-se a
amostra por três minutos a 4000 x g com a finalidade de precipitar as células bacterianas,
descartou-se o sobrenadante deixando apenas 100
µ
l para ressuspender as células. Esse
material foi plaqueado em meio LB-ágar contendo ampicilina e cloranfenicol e incubado
em estufa por 12 horas.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 17
3.1.3 Expressão-Teste da Proteína Recombinante
Essa etapa foi feita com o objetivo de verificar a expressão da proteína
recombinante por análise em SDS-PAGE 10% da fração não-induzida e induzida com
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e para analisar a quantidade de proteína na
fração solúvel e insolúvel.
Materiais:
- alça estéril,
- tudos de cultivo estéreis,
- meio de cultivo LB,
- antibióticos: ampicilina na concentração de 100 µg/ml e cloranfenicol a 34 µg/ml,
- incubadora com temperatura (37 ºC ) e agitação controladas,
- espectrofotômetro para leitura da densidade óptica (D.O.) em 600nm,
- solução de IPTG (Isopropylthio-B-D-galactoside – Invitrogen) a 1 M.
Métodos:
Uma colônia da placa transformada foi transferida, com o auxílio de uma alça,
estéril, para um inóculo de 3 ml de LB contendo ampicilina e cloranfenicol. O crescimento
foi feito em incubadora por um período de 12 horas. Posteriormente, uma alíquota de 100
µ
l desse inóculo foi usado para inocular 20 ml de meio LB, contendo ampicilina e
cloranfenicol e deixado em incubadora até que se atingisse um valor de D.O. em torno de
0,6-0,8. Nesse instante, adicionou-se IPTG a uma concentração final de 0,5 mM e incubou-
se a cultura por quatro horas, à 37
o
C, sob agitação.
3.1.4 Maxi-Expressão da Proteína Recombinante
A maxi-expressão da proteína recombinante iniciou-se partindo do mesmo inóculo
que foi usado para fazer a expressão-teste.
Materiais:
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 18
- meio de cultivo LB,
- tubos de cultivo estéreis,
- antibióticos: ampicilina na concentração de 100 µg/ml e cloranfenicol a 34 µg/ml,
- incubadora com temperatura (37 ºC ) e agitação controladas,
- centrifuga Sorval modelo RC 5B Plus,
- solução salina (0,9% de NaCl),
- freezer - 20
o
C
Métodos:
Uma alíquota de 100
µ
l, do pré-inóculo da expressão-teste, foi usada para inocular
um meio de 20 ml de LB, contendo ampicilina e cloranfenicol, para ser incubada por 12
horas. Esse meio foi usado para inocular a maxi-expressão que se deu em um litro de LB
contendo os mesmos antibióticos. A cultura foi mantida na incubadora por
aproximadamente 3 horas até que a D.O.
(600nm)
atingisse valor próximo de 0,6-0,8
seguindo-se, então, a adição IPTG. Todos os parâmetros foram mantidos iguais para
garantir que a proteína alvo fosse expressa nas mesmas condições.
Após a indução por quatro horas, a cultura foi centrifugada a 4000 x g, por quinze
minutos a 4 ºC. Descartou-se o sobrenadante e a fração celular foi ressuspendida em 15 ml
de solução salina e transferida para um tubo de centrifugação. Foi feita uma nova
centrifugação a 4000 x g, por vinte minutos para descartar o sobrenadante e congelar a
fração celular.
3.1.5 Extração da Proteína na Fração Insolúvel
Materiais:
- tampão A: Tris-HCl 20 mM pH 7,5
- tubos com capacidade de 50 ml,
- sonicador: VirSonic
- banho de gelo
- centrifuga Sorval modelo RC 5B Plus,
- tampão B (4 M guanidina, 50 mM citrato de sódio e 20 mM EDTA, pH 7,0);
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 19
Médotos:
O primeiro passo foi ressuspender a fração celular em 20 ml de tampão A e
transferir para um tubo com capacidade de 50 ml.A seguir as células foram sonicadas em
aparelho VirSonic no gelo em 10 ciclos de 30 segundos com intervalos de 30 segundos.
Centrifugou-se a amostra por quinze minutos a 6000 x g à 4ºC. O sobrenadante foi
descartado e a fração celular insolúvel foi lavada com o mesmo tampão A por mais três
vezes. Seguiu-se a solubilização da proteína do corpúsculo de inclusão adicionando-se 20
ml de tampão B. Centrifugou-se por dez minutos a 6000 x g à 4ºC e reservou-se o
sobrenadante.
3.1.6 Diálise
Matérias:
- membrana de diálise: MWCO 6,000 – 8,000 Fisherbrand
- tampão A: 2,5 M guanidina, 50mM de Tris HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 50 mM
glicina, 20 mM NaCl,
- tampão B: 1,5 M guanidina, 50mM de Tris HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 20 mM
NaCl,
- tampão C: 0,5 M guanidina, 50mM de Tris HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 20 mM
NaCl,
- tampão D: 50 mM de Tris HCl pH 7,5, 20 mM de NaCl, 3 % de glicerol
Método:
A solução protéica foi colocada em membrana de diálise para a retirada do agente
desnaturante de maneira gradual. Assim sendo, de 12 em 12 horas foi feita a troca do
tampão A ao D, mantida sempre, a 4 ºC.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 20
3.1.7 Gel de poliacrilamida desnaturante (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis - SDS-PAGE)
Usou-se a eletroforese como ferramenta metodológica essencial não só para
avaliação da expressão heteróloga como também para a análise da homogeneidade das
várias preparações obtidas após a etapa de purificação usada. Nesse trabalho, usou-se o
protocolo descrito por Laemmli (com modificações), U.K., 1970 para a confecção de SDS-
PAGE 10%.
Materiais:
- aparato de eletroforese da Bio-Rad (cuba, fonte, placas de vidro),
- solução de gel separador 10%: 3,45 ml de 30% acrilamida/0,8% bis-acrilamida, 5
ml de Tris-HCl/SDS pH 8.8 (1,5 M Tris-Cl contendo 0,4% de SDS), 1,5 ml de água,
50 ul de persulfato de amônio a 10% e 15 ul de TEMED (N, N, N´, N´-
tetrametiletilenediamina)
- solução do gel concentrador 4%: 0,75 ml de 30% acrilamida/0,8% bis-acrilamida,
2,5 ml de Tris-Cl/SDS pH 6.8 (0,5 M Tris-Cl contendo 0,4% de SDS), 1,83 ml de
água, 30 ul de persulfato de amônio a 10% e 6 ul de TEMED,
- tampão de amostra 3X: 25 ml de Tris-HCl/SDS pH 6.8 (0,5 M Tris-Cl contendo
0,4% de SDS), 20 ml de glicerol, 4 g de SDS, 1 mg de azul de bromofenol.
Adicionar água para um volume de 100 ml,
- tampão de corrida: 5 g de Tris, 15 g de Glicina, 10 ml de SDS 10%, completar para
1 L de água
- solução de Comassie Blue R-250: 0.25g coomassie brilliant blue R-250 em 100 ml
de uma solução 45% metanol e 10% ácido acético,
- Solução descorante: 5% (v/v) de metanol, 7% (v/v) ácido acético, 88% água.
Métodos:
A corrida de eletroforese foi realizada por aproximadamente duas horas, à
temperatura ambiente, em corrente de 30 mA e voltagem 120 V. Após a corrida, o gel de
poliacrilamida foi colocado em uma solução de coomassie-blue R-250 para coloração por
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 21
5 horas à temperatura ambiente. A remoção do excesso de corante foi obtida em solução
descorante até o aparecimento nítido das bandas de proteínas.
3.1.8 Concentração
Métodos:
Após a diálise, a amostra foi concentrada a 4 ºC utilizando o concentrador Amicon
Ultra –15 de 10000 Da (Millipore) a uma rotação de 5000 x g.
3.1.9 Quantificação
Métodos:
A concentração da proteína foi determinada através da medida de absorbância da
mesma a 280 nm. Os espectros de absorbância foram obtidos em um espectrofotômetro
Espectronic Genesys 2, com varredura de comprimento de onda de 340-200 nm, utilizando-
se uma cubeta de quartzo de 1 cm de caminho ótico. O espectro de absorbância da proteína
foi corrigido com a subtração do espectro de absorbância do tampão correspondente
(“branco”) contendo 50 mM de Tris HCl pH 7,5, 20 mM de NaCl, 3 % de glicerol. A partir
dos valores dos coeficientes de extinção molar (ε) obtidos através do programa ProtParam
(http://ca.expasy.org) e dos valores de absorbância a 280 nm, determinou-se a concentração
molar da proteína de acordo com a equação de Beer-Lambert:
A
280
=
ε
x L x C
onde A
280
é a absorbância medida a 280 nm,
ε
é o coeficiente de extinção molar em 280 nm
(M
-1
cm
-1
), L é o caminho ótico em centímetros (cm) e C é a concentração molar da amostra
de proteína. A amostra de proteína foi centrifugada a 5000 x g por 10 minutos antes de ser
utilizada para medir a concentração.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 22
3.1.10 Dicroísmo Circular (CD)
Materiais:
- proteína a 0,1 mg/ml.
Métodos:
Os experimentos de dicroísmo circular foram realizados no espectropolarímetro
JASCO J-810 (JASCO), com um controlador de temperatura Peltier type control system
PFD 425S. O programa utilizado para registro dos dados foi o Spectra manager
(JASCO).
Os espectros de dicroísmo circular no UV distante (260-190 nm) foram adquiridos
utilizando-se uma cubeta de quartzo de 2 mm de caminho ótico, em temperatura ambiente,
com velocidade de varredura de 20 nm/minuto, tempo de resposta de 1 segundo. O espectro
final foi obtido pela acumulação de 6 varreduras. A contribuição do solvente foi eliminada
subtraindo seu espectro daquele da proteína.
Os valores obtidos na leitura de CD (mili graus) foram convertidos em elipticidade
molar residual [
θ
] através da expressão (ADLER et al., 1973):
onde
θ
é a elipticidade medida (graus), L é o caminho ótico em centímetros (cm), C é a
concentração molar (M) e N é o número de aminoácidos da proteína. Os dados convertidos
foram graficados utilizando-se o programa ORIGIN 7.1. Para determinar a porcentagem de
estrutura secundária da proteína de fusão, utilizou-se o programa CDNN deconvolution
(http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn/). Os erros intrínsecos ao cálculo de
porcentagem de estrutura secundária foram indicados em cada tabela.
3.1.11 Espalhamento Dinâmico de Luz (DynamicLlight Scattering - DLS)
Materiais:
- solução protéica, em tampão 50 mM Tris HCl pH 7,5 contendo 20 mM NaCl e 3 %
glicerol, à 12 mg/ml,
Métodos:
[ ]
NCL10
θ
θ =
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 23
As medidas de DLS foram realizadas em cubeta de quartzo de 1 cm de caminho
óptico a 20 ºC utilizando-se o equipamento ProteinSolutions Dynapro 99 (Dynapro
Molecular Sizing Instrument), portando um controlador de temperatura, em comprimento
de onda de 781,2 nm e ângulo de detecção do espalhamento de 90º . O programa usado
para a execução das medidas do raio hidrodinâmico foi o Dynamics V6.3.4.
3.1.12 Ensaios de Cristalização
Materiais:
- solução protéica, em tampão 50 mM Tris HCl pH 7,5 contendo 20 mM NaCl e 3 %
glicerol, a 12 mg/ml,
- Kits comerciais da Hampton Research (Crystal Screen 1 e 2) totalizando 96
condições diferentes,
Métodos:
Os ensaios iniciais de cristalização foram realizados a 14 ºC, testando-se 96
condições de cristalização obtidas dos Kits comerciais da Hampton Research (Crystal
Screen 1 e 2), pelo o método de difusão de vapor em gota pendurada em placas de cultura
Linbro de 24 poços, sendo o volume de proteína usado por poço de 1
µ
l e 1
µ
l de solução
saturante e o volume da solução saturante, no poço, foi de 500
µ
l.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: NUDEL - 24
3.2 NUDEL (nuclear distribution element-like)
Os protocolos de preparação de células competentes, transformação por choque
térmico, maxi-expressão da proteína recombinante (com mudança apenas na temperatura de
indução que foi de 30 ºC), gel de poliacrilamida desnaturante (12,5%), concentração,
quantificação, dicroísmo circular e espalhamento dinâmico de luz são os mesmos descritos
nas seções anteriores.
3.2.1 Isolamento e purificação de corpos de inclusão
Materiais:
− Tampão de Lise: 20 mM de Tris-HCl pH 7.5
− Tampão A: 100 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 100 mM de Tris-HCl pH 7,5,
8 M de uréia e 5 mM de β-mercaptoetanol.
−
Tampão B: 100 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, 100 mM de Tris-HCl pH
7,5, 8 M de uréia e 5 mM de β-mercaptoetanol.
Métodos:
O protocolo de isolamento e purificação de corpos de inclusão foi elaborado com
base em outros protocolos descritos na literatura (CHOW et al., 2006, LIU et al. 2007,
WARNER et al., 2007, MARK et al., 2007, ARAKAWA et al., 2007), e adaptado para a
purificação da proteína NUDEL. As bactérias coletadas por centrifugação após o período
de 4 horas de indução por IPTG foram ressuspendidas em tampão de lise. A amostra foi,
então, sonicada no aparelho VirSonic e centrifugada por 15 minutos a 18600 x g, 4ºC. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 30 ml de tampão de lise,
repetindo o mesmo procedimento de centrifugação e lavagem por mais três vezes. Depois
da última lavagem com o tampão de lise, o precipitado foi resuspendido em tampão de
extração (tampão A) e a amostra foi centrifugada a 13700 x g, 4 ºC, por 20 minutos. O
sobrenadante contendo a proteína NUDEL em fusão com a cauda de poli-histidina foi,
então, purificado por cromatografia de afinidade utilizando-se a resina comercial Ni-NTA
(Nitrilo triacetato) Agarose Beads (Quiagen), sob condições desnaturantes.
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: NUDEL - 25
Em 1 ml de resina Ni-NTA, sendo essa equilibrada com 10 volumes de coluna (vc)
com tampão A, acrescentou-se a amostra da proteína NUDEL desnaturada e a fração da
mesma não retida na matriz foi coletada e reservada. Lavou-se a coluna com 30 vc de
tampão A sem imidazol e, em seguida, com 20 vc de tampão A. Eluiu-se a proteína com 10
ml de tampão B em frações de 1 ml para posterior análise em SDS-PAGE.
3.2.2 Experimentos de Renaturação
Materiais:
−
Tampão de Diluição: 100 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl pH 7,5, 30 % de
glicerol, 1 mM de Glutationa Reduzida, 1 mM de EDTA, 500 mM de l-arginina.
− Tampão de Diálise: 100 mM de NaCl e 50 mM de Tris-HCl pH 7,5
Métodos:
Após purificação da NUDEL sob condições desnaturantes e análise da pureza por
SDS-PAGE, as frações puras da eluição foram diluídas 60 vezes, gota a gota, em tampão de
diluição por 24 horas a 4 ºC sob agitação. A solução de diluição foi, então, dialisada contra
2 L de tampão de diálise por 12 horas, seguidos de mais 2 L de tampão por 12 horas, a 4 ºC.
3.2.3 Emissão intrínseca de fluorescência
Materiais:
- proteína concentrada à 0,05 mg/ml em tampão 15 mM de Tris-HCl pH 7,5 contendo
30 mM de NaCl, na presença e ausência de 0,1 mM de ZnCl
2
e 1 mM de DTT.
Métodos
Os estudos de emissão intrínseca de fluorescência foram realizados no
espectrômetro de fluorescência AMINCO-Bowman Series 2, utilizando-se uma cubeta de
quartzo 1 x 0,4 cm em temperatura ambiente.
A proteína foi excitada com uma radiação incidente de 295 nm (excitação do
aminoácido triptofano, de forma majoritária) e os espectros de emissão foram coletados em
Capítulo 3 – Procedimentos Experimentais: NUDEL - 26
um intervalo de comprimento de onda de 300 e 500 nm, com velocidade de varredura de 1
nm/segundo e tempo de resposta automático. A contribuição do solvente foi eliminada
subtraindo seu espectro daquele da proteína. Os dados foram graficados utilizando-se o
programa ORIGIN 7.1. Os valores de λ
máx
de emissão foram obtidos dos espectros de
emissão de fluorescência.
3.2.4 Cristalização
Materiais:
- As concentrações da proteína utilizadas para os experimentos foram de 8,5 mg/ml
(em tampão 50 mM de Tris-HCl pH 7,5 e 100 mM de NaCl) e 10,0 mg/ml (em
tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl e 0,1 mM de ZnCl) e 10,0 mg
(em tampão 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de ZnCl e 1 mM
de DTT).
- Kits comerciais da Hampton Research (Crystal Screen 1 e 2) totalizando 96
condições diferentes,
Métodos
Os ensaios iniciais de cristalização foram realizados a 14 ºC, testando-se 96
condições de cristalização obtidas dos Kits comerciais da Hampton Research (Crystal
Screen 1 e 2), pelo o método de difusão de vapor em gota pendurada em placas de cultura
Linbro de 24 poços, sendo o volume de proteína usado por poço de 1
µ
l e 1
µ
l de solução
saturante e o volume da solução saturante, no poço, foi de 500
µ
l.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão - 27
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Esse capítulo tem como objetivo apresentar os resultados dos experimentos realizados
tanto da proteína Hsp65 de Mycobacterium leprae quanto da proteína NUDEL-HUM. Na
primeira parte da apresentação dos resultados, destaca-se a expressão, purificação e solubilização
da proteína Hsp65 de Mycobacterium leprae e os experimentos que foram realizados com a
amostra protéica em alto grau de pureza e concentração. Para a complementação dos
experimentos práticos, várias consultas bibliográficas foram feitas, paralelamente, com o firme
propósito de se enriquecer a discussão dos resultados. Essa etapa, na execução do projeto, foi
extremamente importante para o entendimento do processo e conclusão do experimento.
Na seção seguinte do capítulo, descrevemos de maneira mais direta e objetiva, os
experimentos realizados para a obtenção da proteína NUDEL-HUM em altas quantidades e
pureza para a realização dos estudos estruturais. As discussões desses resultados enriquecem os
dados literários, uma vez que, muito dessa proteína ainda está sob intensa investigação.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 28
4.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae
4.1.1 Expressão e Purificação da Hsp65 de Mycobaterium leprae
A primeira etapa, na execução do projeto de pesquisa, foi a obtenção da proteína
recombinate por expressão heteróloga. Para isso, linhagem competente de Escherichia coli, BL21
(DE3), foi usada como hospedeiro para a produção da proteína. Após a inserção do plasmídeo,
que contém o gene codificante da Hsp65 de Mycobacterium leprae, por um processo chamado de
transformação, foi possível o cultivo dessas células. Assim que uma população celular bacteriana
apropriada foi alcançada, a indução da proteína foi feita com o uso de IPTG e a presença da
proteína foi analisada em gel de poliacrilamida 10%.
A figura 3 mostra a fração celular não-induzida, usada como padrão de produção de
proteínas bacteriana, e a fração induzida, que caracteriza as proteínas produzidas após a adição de
IPTG no meio de cultivo. Foi possível observar, que após um período de 4 horas da adição do
indutor, a maquinaria celular operou no sentido de produzir a proteína recombinante em alta
escala. Com isso, obteve-se um sucesso na produção da proteína por expressão heteróloga.
Figura 03: Gel SDS-PAGE 10% mostrando (1) fração não induzida, (2) fração induzida com 0,5 mM de
IPTG após 4 horas e (3) o marcador de peso molecular usado como referência.
Com a presença da proteína, após a indução, fez-se necessário checagem da solubilidade
da mesma. Para isso, foram analisadas a fração celular solúvel e a insolúvel. Esse teste consistiu
em analisar os componentes protéicos que ficam em solução, após o processo de rompimento das
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 29
células bacterianas por sonicação, formando a fração solúvel e as que ficam precipitadas, na
forma de corpúsculos de inclusão formando a fração insolúvel.
A figura 4 mostra que, em sua totalidade, a proteína se encontra na fração celular
insolúvel, ou seja, na forma de corpúsculos de inclusão.
Figua 04: Gel SDS-PAGE 10% representando o marcador de peso molecular (1), a fração de proteínas
insolúveis (2) e a fração solúvel (3) que corresponde às proteínas que remaneceram em solução após o
processo de rompimento das células.
Com esses experimentos iniciais, observou-se que a proteína Hsp65 de M. leprae foi
obtida por expressão heteróloga e que se encontra na forma de corpúsculos de inclusão. Sabe-se
que, quando se trabalha com proteínas que são insolúveis, uma etapa importante no processo de
extração da proteína alvo é a lavagem da fração celular insolúvel. Essa lavagem se torna
extremamente importante, pois elimina as proteínas que não são de interesse e, quando bem
sucedida, elimina a etapa de purificação por métodos tradicionais.
A maxi-expressão deu-se da mesma maneira como feito pelo teste-expressão, inclusive
utilizando-se do mesmo pré-inóculo para garantir a reprodutibilidade do experimento. Como
citado anteriormente, a lavagem da fração celular insolúvel se torna uma etapa imprescindível no
processo de extração da proteína. Assim sendo, após o rompimento das células e descarte da
fração solúvel, a fração insolúvel foi ressuspensa várias vezes em tampão de lavagem, descrito
nos procedimentos experimentais, para a eliminação de grande parte de proteínas que não são de
interesse. Ao final desse processo, ressuspendeu-se a fração celular insolúvel em tampão
contendo agente desnaturante guanidina para a solubilização da proteína.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 30
Como a guanidina é um composto desnaturante, ela age no sentido de desestabilizar a
estrutura da proteína, provocando seu desenovelamento. Para dar continuidade aos estudos, foi
necessário realizar a retirada desse composto, para posterior processo de enovelamento e
reconstituição da sua estrutura protéica. O método de enovelamento testado foi o da diálise
gradual. A solução protéica foi colocada em membrana de diálise, mantida sob baixa
temperatura, em tampão contendo vários componentes, descritos nos procedimentos
experimentais. Esse tampão foi trocado de 12 em 12 horas até a retirada gradual e completa da
guanidina.
A diálise em tampão final, ou seja, sem agente desnaturante, foi mantida por 12 horas e
nenhum padrão de precipitação protéica foi observado, o que pode nos indicar um sucesso na
etapa de enovelamento protéico.
A figura 5 apresenta a análise da proteína após o processo de diálise e conseqüente
enovelmanento protéico. Pode-se assim, concluir que a proteína se encontra em alto grau de
pureza e adequada para dar continuidade aos experimentos.
Figura 05: Gel SDS-PAGE 10% mostrando a Hsp65 M. leprae, após o processo de enovelamento
protéico, indicada pela seta, e o marcador de peso molecular usado como referência.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 31
4.1.2 Dicroísmo Circular
O experimento de dicroísmo circular (CD) no UV distante (190-260 nm) foi realizado
com o objetivo de verificar se a proteína exibe algum padrão de estrutura secundária após
expressão heteróloga e, principalmente, após o processo de renaturação. Essas medidas fornecem
informações estruturais úteis, uma vez que, mostram se a proteína recombinante apresenta
estrutura secundária, que seria um indício da presença de proteína enovelada em solução
permitindo, assim, o prosseguimento dos experimentos.
O espectro de CD da proteína recombinante está apresentado na figura 6, esse
experimento foi realizado com proteína à 0,1 mg/ml em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5
contendo 20 mM de NaCl. Uma análise qualitativa do espectro (figura 06) indica que a proteína
exibe um enovelamento com estrutura secundária composta, tipicamente, por
α
-hélices e folhas
β
.
Figura 06: Espectros de CD no UV distante da proteína Hsp65 de Mycobacterium leprae à 0,1 mg/ml em
tampão 15 mM Tris HCl em temperatura ambiente.
Para compreender melhor os espectros, uma análise quantitativa do conteúdo de estrutura
secundária da proteína, apresentando a porcentagem de cada tipo de estrutura secundária predita,
foi feita utilizando o programa CDNN deconvolution (http://bioinformatik.biochemtech.uni-
halle.de/cdnn/) e é apresentada na tabela 1.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 32
Tabela 1: Composição de estrutura secundária da Hsp65 de Mycobacterium leprae. Os valores são dados
em porcentagem (%) e o erro é de 5,9% para as medidas adquiridas de 190 a 260 nm.
Proteínas Recombinantes Alfa-Hélice
Folha Beta
Antiparalela
Folha Beta Paralela Beta-turn Random Coil
Hsp65 15,0 27,2 5,1 20,4 32,3
Para enriquecer os dados que foram obtidos com a análise quantitativa dos constituintes
secundários da Hsp65 de Mycobactyerium leprae foi feita uma análise comparativa com uma
outra proteína da mesma família e que apresenta alto grau de similaridade com a Hsp65 de
Mycobacterium tuberculosis (QAMRA et al., 2004a). Os espectros de CD das proteínas são
similiares apesar de que, uma análise da estrutura terciária da Hsp65 de M. tuberculosis mostra
que a proteína apresenta uma predominância de α-hélices (QAMRA et al., 2004b).
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 33
4.1.3 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Recentemente, esta técnica não-destrutiva tem obtido popularidade por explorar algumas
propriedades, como tamanho e forma, de moléculas em solução (MURPHY 1997). O
espalhamento dinâmico de luz (DLS) é uma técnica que mede o seu raio hidrodinâmico, o qual é
geralmente calculado baseado em modelos esféricos. A maior vantagem do espalhamento de luz,
além de fornecer informações estruturais, é o curto tempo necessário para a obtenção dos dados, a
modesta quantidade de proteína utilizada (de 1 a 10 mg/ml), os pequenos volumes de amostra
requeridos (30
µ
l), e a relativa simplicidade de manipulação.
Assim sendo, o DLS é uma técnica muito usada como diagnóstico para determinar se uma
amostra de proteína é adequada para cristalização pelo fornecimento de informações sobre a
distribuição de tamanhos e estado de agregação da proteína em solução. Essas informações são
importantes, pois estão intimamente relacionadas ao processo de cristalização, já que quanto mais
homogênea (monodispersa) for a amostra, maior é a probabilidade de nucleação e crescimento
dos cristais.
O mesmo tampão do experimento de CD foi mantido para os experimentos de DLS. A
proteína foi usada em uma concentração de 12 mg/ml que seria a condição inicial para realizar os
experimentos de cristalização.
A figura 7 apresenta os resultados obtidos em termos do percentual de massa em função
do raio hidrodinâmico médio das distribuições de tamanho. A distribuição de tamanho obtida
indica que a proteína apresenta-se, majoritariamente, em estado oligomérico monodisperso.
Observa-se que a proteína apresenta um raio hidrodinâmico em torno de 10 nm (agregados da
ordem de 180 kDa) o que representaria uma forma trimérica da Hsp65 de Mycobacterium leprae.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 34
Figura 07: Medidas de DLS da Hsp65 de Mycobcaterium leprae à 12 mg/ml em tampão Tris HCl 50 mM
pH 7,5 contendo 20 mM de NaCl.
A figura apresenta os resultados obtidos em termos do percentual
de massa (eixo Y) em função do raio hidrodinâmico médio (eixo X).
Este resultado sugere que a amostra Hsp65 de Mycobacterium leprae a uma concentração
de 12 mg/ml é ideal para dar início aos ensaios de cristalização, apesar não se encontrar
monomérica, apresenta-se em solução como única entidade estrutural trimérica (monodispersa)
que é favorável à cristalização.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 35
4.1.4 Cristalização
Como os dados obtidos a partir dos experimentos de dicroísmo circular e espalhamento
dinâmico de luz demonstraram que a proteína se encontra devidamente enovelada e em uma
condição monodispersa, deu-se continuidade aos experimentos. Assim sendo, a primeira tentativa
de cristalização foi feita com a proteína concentrada à 12 mg/ml em tampão Tris HCl 50 mM pH
7,5 contendo 20 mM de NaCl e 3 % de glicerol usando-se dois diferentes screens comerciais. As
placas foram incubadas em sala refrigerada a uma temperatura constante de 14 °C e, após uma
semana, pôde-se perceber a presença de precipitados cristalinos e alguns precipitados escuros,
além da presença de pequenos cristais em forma de agulha.
Essas placas estão sob intensa observação e algumas condições de refinamento estão em
andamento com o objetivo de se conseguir cristais difratáveis para os futuros estudos estruturais.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 36
4.1.5 Estudo comparativo da Hsp65 de Mycobacterium leprae com a Hsp65 de
Mycobacterium tuberculosis
Paralelamente aos experimentos realizados para alcançar o objetivo final do projeto de
mestrado, foi realizado um estudo comparativo entre a Hsp65 de Mycobacterium leprae e a
Hsp65 de Mycobacterium tuberculosis com o objetivo de complementar e dar suporte aos
resultados dos experimentos práticos.
A partir de um alinhamento das sequências das proteínas Hsp65 de Mycobacterium leprae
e M. tuberculosis realizado pelo ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html), foi
possível checar a similaridade apresentada por elas. Observou-se que a Hsp65 de Mycobacterium
leprae apresenta 95 % de similaridade com a Hsp65 de Mycobacterium tuberculosis (figura 8).
Figura 8: Alinhamento das seqüências das proteínas Hsp65 de Mycobacterium leprae e Hsp65 de M.
tuberculosis mostrando alto grau de similaridade. Em destaque a caixa verde corresponde ao resíduo
catalítico
K
168
e a caixa azul ao resíduo K
409
.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 37
Considerando essa alta similaridade pôde-se fazer uma análise da estrutura trimensional
da Hsp65 de Mycobacterium tuberculosis, já resolvida por Qamra et al 2004b e, com isso,
inferir algumas informações relevantes no que diz respeito à provavel atividade oligopeptidásica
da Hsp65 de Mycobacterium leprae.
Como mencionado, Portaro et al 2002, com base em 20 % de similaridade com a protease
Hs1VU, sugereriam duas tríades catalíticas, uma localizada no N-terminal que consiste em T
136
,
K
168
e Y
264
e outra no C-terminal que corresponde à T
375
, K
409
e S
502
como sendo as responsáveis
pela possível atividade proteolítica da Hsp65 de Mycobacterium leprae. Segundo Qamra et al
2004b, as tríades correspondente em Hsp65 de Mycobacterium tuberculosis são respectivamente
T
88
,K
120
e Y
216
e T
327
, K
361
e S
454
.
Em relação suposta tríade, localizada no N-terminal, os resíduos sugeridos como sendo os
responsáveis pela atividade proteolítica estão muito distantes espacialmente. Os resíduos T
88
e
K
120
estão localizados no domínio equatorial a 23 Å de distância, enquanto que o resíduo Y
216
está localizado no domínio apical a 44 Å e 54 Å de distância dos resíduos T
88
e K
120
respectivamente. Analisando-se a tríade do C-terminal, Qamra et al 2004b discute, com base na
estrutura cristalográfica, que os resíduos T
327
e K
361
estão localizados no domínio apical a uma
distância de 18 Å e que o resíduo S
454
está localizado no domínio equatorial e está distante 42 Å e
50 Å dos resíduos T
327
e K
361
respectivamente.
Em ambas supostas tríades, os resíduos estão espacialmente muito distantes, localizados
em domínios diferentes (Figura 09) e a estrutura não parece sugerir nenhuma movimentação
conformacional que possa promover uma proximidade entre esses resíduos. Isso indica que esses
resíduos sugeridos não formam uma tríade catalítica em Hsp65 de Mycobacterium tuberculosis,
mas que, podem ter outros resíduos que contribuem para essa possível função.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 38
Figura 9: Figura gerada, pelo programa PyMol, utilizando o modelo do pdb da Hsp65 de Mycobacterium
tuberculosis (1sjp). O modelo mostra o monômero com destaque para os domínios apical, intermediário e
equatorial.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 39
4.2 NUDEL (nuclear distribution element-like)
4.2.1 Expressão e Purificação da proteína NUDEL-HUM
As mesmas condições de expressão e indução realizadas para a obtenção da proteína
Hsp65 de Mycobacterium leprae foram mantidas para a produção da proteína NUDEL-HUM.
Apenas pequenas modificações na temperatura de indução e na quantidade de IPTG foram
testadas. Assim sendo, para a produção da proteína NUDEL-HUM em altas quantidas, realizou-
se a expressão em BL21 (DE3) em densidades óticas de 0,8 a 37 ºC por 4 horas. A indução foi
otimizada e, deu-se com 1 mM de IPTG a 30 ºC. Pela análise do SDS-PAGE (figura 10), fica
evidente a produção da proteína por expressão heteróloga após a indução.
Figura 10: Gel SDS-PAGE 12,5 % . (1) fração não induzida (0 horas – sem IPTG), (2) a fração induzida
após 4 horas da adição de 1 mM de IPTG e o (3) representa o marcador de peso molecular usado como
referência para checar o peso da proteína.
Os experimentos prosseguiram no sentido de checar a solubilidade da proteína e iniciar os
testes de purificação. Assim sendo, após lise celular por sonicação para determinação da
solubilidade da proteína, observou-se que a NUDEL-HUM está presente tanto na fração solúvel
quanto na fração insolúvel. Nesse sentido, vários testes de purificação, por cromatografia de
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 40
afinidade de Ni-NTA, foram executados com o objetivo de se conseguir maior rendimento em
relação à pureza e quantidade de proteína.
Ao final de todos os testes realizados a melhor condição de purificação foi obtida com a
proteína proveniente da fração celular insolúvel. A figura 11 representa as eluições feitas com
500 mM de imidazol. As eluições foram coletadas de 1 em 1 ml e analisadas em gel de
poliacrilamida, separadamente. Após a análise, as proteínas foram reunidas e concentrada para
dar continuidade aos experimentos.
Figura 11: Gel SDS-PAGE 12,5% que representa a purificação da NUDEL-HUM feita da fração protéica
insolúvel. No gel estão representadas as eluições de 1, 3, 5 ,7 e 10 além do marcador de peso molecular
usado como referência para analisar o peso molecular da proteína.
Com a obtenção da proteína pura e em quantidade suficiente, a próxima etapa na execução
do projeto foi conseguir a proteína no seu estado enovelado, uma vez que foi necessário o uso de
agente desnaturante para a solubilização da protéina. O método para a renaturação protéica usado
foi o da diluição, em tampão descrito nos procedimentos experimentais, seguido de diálise para a
retirada dos aditivos usados nesse tampão. Não se observou qualquer indicativo de precipitação
protéica durante a diluição da amostra, no tampão de renaturação, nem na posterior diálise, para a
retirada dos aditivos.
O sucesso da etapa de renaturação da proteína deve-se, particularmente, à presença de um
aditivo chamado de l-arginina. Esse aditivo é considerado um estabilizador dos estágios
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 41
intermediários do processo de renovelamento e está sendo amplamente utilizado em
experimentos de renaturação (LIU et al., 2007, ARAKAWA et al., 2007).
A proteína proveniente da diálise foi concentrada a 10 mg/ml (Figura 12) e essas amostras
submetidas a ensaios espalhamento dinâmico de luz (DLS), dicroísmo circular (CD) e
fluorescência.
Figura 12: Gel SDS-PAGE 12,5 % apresentado a proteína NUDEL-HUM em alto grau de pureza e
concentrada à 10 mg/ml e adequada para dar início aos estudos estruturais.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 42
4.2.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Primeiramente, medidas com a proteína em baixa concentração foram realizadas para
determinar os efeitos do pH na distribuição de tamanhos da proteína (presença de monômeros
e/ou oligômeros). A proteína foi diluída para 1 mg/ml, a partir da solução da proteína concentrada
a 10 mg/ml, em tampões com 100 mM de NaCl e diferentes pHs (pH 4,5, 6,0, 7,5, 8,5 e 9,5).
Observou-se que no pH 4,5, a proteína precipita da solução, indicando a proximidade desse pH
ao pI da proteína (pI teórico de 5,3).
A figura 13 apresenta os resultados obtidos em termos do percentual de massa em função
do raio hidrodinâmico médio das distribuições de tamanho. As distribuições de tamanho obtidas
para os diferentes pHs testados indicam que a proteína apresenta-se, majoritariamente, em estado
polidisperso, na forma de grandes oligômeros e em tamanhos de agregação diferente, nos pHs
9,5, 8,5 e 6,0 (Figura 13a, b e d respectivamente). Em pH 7,5 apresenta-se em condição
monodispersa, formada por oligômeros de mesmo peso molecular (Figura 13c).
Figura 13: Medidas de DLS da proteína NUDEL a 1 mg/ml em diferentes pHs, pH 9,5 (a); pH 8,5 (b); pH 7,5 (c) e
pH 6,0 (d). O gráfico exemplifica a porcentagem (eixo Y) da proteína que apresenta determinado raio hidrodinâmico
(eixo X).
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 43
Para os ensaios de cristalização são, geralmente, utilizadas concentrações de proteínas
acima de 1 mg/ml. Condições de alta concentração protéica favorecem a interação entre as
proteínas o que pode levar a uma diferente distribuição de tamanho da amostra em solução.
Assim, a caracterização da proteína em alta concentração se fez necessária. Para esses estudos, a
condição de pH 7,5 foi escolhida, pois apresentou agregados menores (em torno de 5 nm) e
monodispersos. Além disso, estudos de atividade da NUDEL indicam que a proteína encontra-se
em sua forma ativa em pH 7,4 (HAYASHI et al., 2005) e 7,5 (HAYASHI et al., 2000).
Assim sendo, a curva de distribuição de tamanhos, para proteína em alta concentração
(10,0 mg/ml) é mostrada na figura 14a. Como pode ser visto, aproximadamente 92,5 % da
proteína em solução, em tampão pH 7,5 com 100 mM de NaCl, apresentou-se na forma de
agregados com raio hidrodinâmico de 15,7 nm mostrando que ocorre agregação perante aumento
da concentração da NUDEL.
Uma alternativa para reduzir a formação de múltiplos oligômeros em solução foi a
aplicação de aditivos que interagem com a proteína. Sabendo-se que a NUDEL possui um sítio
predito de ligação a zinco em sua seqüência e que essa proteína é ativada na presença de DTT,
ambos aditivos foram testados. Dessa forma, experimentos em alta concentração (10 mg/ml)
foram realizados nas mesmas condições (pH 7,5 e 100mM NaCl ) na presença de cloreto de zinco
(0,1 mM) e DTT (1 mM). Os resultados estão apresentados na figuras 14b e 14c.
Observou-se que a presença de cloreto de zinco no tampão de diálise, após renaturação da
proteína, reduziu o raio hidrodinâmico para 3,7 nm (peso molecular calculado 74 kDa) (Figura
14b). A proteína na presença de zinco mostrou-se relativamente homogênea de forma que 90,0%
apresentou-se com raio hidrodinâmico de 3,7 nm. Os outros 10 % consistem de 7% do total de
proteínas portando um raio de 15 nm e 3 % com raio de 20 nm.
A adição de 1 mM de DTT na amostra concentrada a 10 mg/ml proveniente da diálise
com tampão contendo zinco (incubada por 24 horas a 4 ºC após adição de DTT) forneceu a
medida de 2,8 nm do raio hidrodinâmico, correspondente ao peso molecular calculado de 39 kDa,
aproximadamente o peso molecular predito para o monômero da NUDEL com cauda de 6
histinas (39,187 kDa). A proteína nessa condição demonstrou-se monodispersa, pois 89,9 % da
amostra apresentou um raio hidrodinâmico de 2,8 nm, 6,8 % com raio de 11,5 nm e 4,3 % com
raio de 15 nm (Figura 14c). Acredita-se que essa seja a melhor condição para os ensaios de
cristalização, uma vez que é a proteína monomérica que apresenta atividade em pH 7,5 na
presença de 0,5 ou 1 mM de DTT (HAYASHI et al., 2000, HAYASHI et al., 2005).
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 44
Figura 14: Medidas de DLS da proteína NUDEL a 10 mg/ml em pH 7,5 contendo 100 mM de NaCl na ausência de
aditivos (a); presença de zinco a 0,1 mM (b) e presença de zinco e DTT (c). O gráfico exemplifica a porcentagem
(eixo Y) da proteína que apresenta determinado raio hidrodinâmico (eixo X).
É importante ressaltar que a NUDEL possui outras funções, além da atividade
oligopeptidásica, que se relacionam à formação de complexos macromoleculares, tais como os
formados com LIS1 e DISC1. Assim, na condição em que a NUDEL apresenta-se em estado
oligomérico monodisperso, as interações entre os monômeros podem favorecer a estabilização de
possíveis regiões mais flexíveis de associação com outras proteínas citoplasmáticas. Isto faz com
que a NUDEL em estados oligoméricos monodispersos seja, também, um bom candidato para
ensaios de cristalização.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 45
4.2.3 Dicroísmo Circular
Os espectros de CD no UV distante (195 a 260 nm) foram realizados para analisar a
condição estrutural apresentada pela proteína após o processo de enovelamento, visto que foi
necessário o uso de condição desnaturante para o processo de solubilização protéico. Para a
análise da presença de estrutura secundária após renaturação, foi feito o uso do espectro protéico
por dicroísmo circular (Figura 15 – curva preta). Pode-se observar que a proteína apresenta
estruturas secundárias típicas como α-hélices e folhas β o que é um indício da estruturação
proteíca e renovelamento. Esses resultados foram usados em programas de deconvolução de
dados para analisar quantitativamente as porcentagens das estruturas secundárias (tabela 2).
Figura 15: Espectros de CD no UV distante da proteína NUDEL na ausência de aditivos (preto), presença
de Zinco (vermelho) e DTT+Zinco (verde) em 15 mM de Tris-HCl pH 7,5 e 30 mM de NaCl em
temperatura ambiente.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 46
Tabela 2: Composição de estrutura secundária da proteína nudel na ausência e presença de aditivos. Os valores são
dados em porcentagem (%) e o erro é de 6,20 % para as medidas adquiridas de 195 a 260 nm.
A figura 15 apresenta duas outras condições que foram testadas (curvas em vermelho e
verde). A intenção de se analisar os espectros com o uso de dois aditivos diferentes foi analisar se
eles interferem na estruturação da proteína. Foi importante observar esses dados, pois mesmo
com o uso de um agente precipitante (zinco) a proteína apresentou o mesmo padrão de estruturas
secundárias. Os espectros apresentam picos negativos bem definidos próximos a 206 e 224 nm e
o pico máximo em 195 nm indicando que a proteína é composta tipicamente de α-hélices e
folhas-
β
.
Para compreender melhor a influência do DTT e do zinco, análises quantitativas do
conteúdo de estrutura secundária das proteínas foram realizadas. Os resultados da quantificação,
apresentados na Tabela 2, mostram que o conteúdo de estrutura secundária da proteína NUDEL
na ausência e presença dos aditivos zinco e DTT é bem similar. Assim, infere-se que os aditivos
não estão envolvidos na estruturação, mas sim na estabilidade na proteína.
Proteínas Recombinantes Alfa-Hélice
Folha Beta
Antiparalela
Folha Beta Paralela Beta-turn Random Coil
Nudel 17,7 23,2 6,1 18,4 33,8
Nudel+Zn 17,5 24,6 6,2 18,7 32,6
Nudel+Zn+DTT 19,3 23,8 6,7 16,4 33,1
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 47
4.2.4 Fluorescência
Experimentos de emissão intrínseca de fluorescência também foram realizados nas
mesmas condições do CD, ou seja, na ausência/presença de aditivos, com o objetivo de obter
informações sobre a localização do resíduo de triptofano na estrutura terciária. Os espectros
apresentados na figura 16 ilustram que a adição de aditivos causa um pequeno deslocamento do
máximo de emissão, o que pode estar relacionado à mudança do estado oligomérico da amostra.
Um pico em 333 nm é observado na ausência de aditivos, enquanto picos em 335 e 337 nm, são
observados na presença de zinco e zinco e DTT, respectivamente.
Figura 16: Espectro de emissão de fluorescência da proteína NUDEL na ausência de aditivos (preto), presença de
Zinco (vermelho) e presença de Zinco e DTT (verde) em 15 mM de Tris-HCl pH 7,3 e 30 mM de NaCl em
temperatura ambiente. Os máximos de emissão observados para a proteína na ausência de aditivos é 333 nm, na
presença de Zinco e Zinco/DTT é 335 e 337 nm, respectivamente.
Esses dados indicam que a proteína encontra-se enovelada e que o resíduo de triptofano
apresentam-se pouco acessível ao solvente, já que seus espectros não mostram um pico a 350 nm,
típico de proteína desnaturada ou da presença de aromáticos na superfície da proteína. Dessa
forma, a presença do pico de máximo de emissão na faixa de 330 a 340 nm, constitui uma
evidência de que o resíduo de triptofano apresenta pouca acessibilidade ao solvente, ou seja,
apresenta-se enterrado no núcleo hidrofóbico da proteína (Figura 16).
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 48
De maneira geral, os experimentos de CD e emissão intrínseca de fluorescência mostram
que a proteína apresenta uma estrutura secundária definida composta, majoritariamente, de
folhas-
β,
e o resíduo de triptofano pouco acessível ao solvente, sendo que o conteúdo de estrutura
secundária e a localização do resíduo de triptofano permanecem pouco alterados na presença de
aditivos. Isto indica que as mudanças na distribuição de tamanhos da proteína em solução
induzidas pelos aditivos, como observado pelos experimentos de DLS (Figura 14), não são
acompanhadas por mudanças expressivas na composição de estrutura secundária da proteína.
Dessa forma, as medidas de CD e fluorescência forneceram informações estruturais úteis
da proteína nas condições testadas que favorecem o prosseguimento dos experimentos de
cristalização.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 49
4.2.5 Ensaios de Cristalização
Após a análise conjunta dos experimentos de DLS, CD e fluorescência, concluiu-se que a
proteína NUDEL na ausência de aditivos, presença de zinco e zinco + DTT em pH 7,5 apresenta-
se estruturada e monodispersa. Assim, as três amostras constituem soluções protéicas com
potencial de cristalização. Os testes iniciais de cristalização foram feitos com a proteína nas
seguintes condições:
- 8,5 mg/ml em 50 mM de Tris-HCl pH 7,5 e 100 mM de NaCl.
- 10,0 mg/ml em 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl e 0,1 mM de cloreto de zinco.
- 10,0 mg/ml em 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de cloreto de zinco e 1
mM de DTT.
Os ensaios de cristalização foram feitos em placas de 24 poços utilizando-se os kits
comerciais da Hampton Research Crystal Screen e Crystal Screen 2.
Os experimentos de cristalização estão em andamento com o objetivo de conseguir
cristais difratáveis para os futuros estudo estruturais.
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 50
4.2.6 Alinhamento múltiplo de seqüências da NUDEL
Com o intuito de enriquecer as informações coletadas com os experimentos práticos foi
feita uma análise da seqüência da proteína NUDEL de outros organismos. Esse alinhamento foi
feito com base nas seqüências encontradas pelo PSI-Blast (ALTSCHUL et al., 1990) que
demonstrou uma alta homologia da proteína em estudo. As espécies, em análise na figura 17,
foram escolhidas devido a alta similaridade de seqüências. Em particular, NUDEL-RAT e HUM
compartilham 95% de aminoácidos que são idênticos.
A figura 17 ilustra uma região do N-terminal altamente conservada da NUDEL em Homo
sapiens, Rattus novergicus, Bos taurus, Pan troglodytes e Canis familiaris. De acordo com
estudos de duplo híbrido realizados (NIETHAMMER et al., 2000; SASAKI et al., 2000) a região
N-terminal da NUDEL inclui o sítio de ligação da LIS1 (Figura 17 – região grifada), assim
sendo, considera-se que a função do complexo LIS1-NUDEL é altamente conservada durante a
evolução.
Uma outra análise, usando o Programa Coils (Lupas et al., 1991), demonstrou que o N-
terminal conservado contém uma região coiled-coil entre os resíduos 20 e 180. Essa região é
também chamada de super estrutura secundária sendo formada por duas fitas
α
-hélices que estão
altamente interligadas resultando em uma estrutura altamente reforçada.
O C-terminal da NUDEL mostra algumas substituições de aminoácido e contém o sítio
de ligação da DISC1. Nessa região, todos os aminoácidos são conservados, em especial, os
principais resíduos envolvidos na ligação da DISC1, que são L266 e E267 (Figura 17 – caixa
preta). Outro resíduo conservado é a cisteína catalítica C273 o que também é um indício da sua
importância evolutiva (Figura 17 – caixa amarela).
Capítulo 4 - Resultados e Discussão: NUDEL - 51
Figura 17: Comparação da seqüência de aminoácidos da proteína NUDEL de Homo sapiens (código de
acesso no GenBank
TM
NP110435
), Pan troglodytes (código de acesso no GenBank
TM
XP001166739
),
Canis familiaris (código de acesso no GenBank
TM
XP850046
) e Bos taurus (código de acesso no
GenBank
TM
XP587963
). Os resíduos idênticos estão em cinza claro. O sítio de ligação da DISC1 está
representado pela caixa em preto e o domínio de interação com a LIS1 está grifado. Em amarelo destaca-
se a cisteína catalítica. O alinhamento foi gerado o ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html.
Capítulo 5 – Conclusão - 52
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÃO
Esse capítulo apresenta um resumo de todas as atividades executadas no decorrer desse
trabalho com destaque para os resultados mais relevantes. Como demostrado em todo o trabalho,
a conclusão também se divide em duas, a primeira parte refere-se à proteína Hsp65 de
Mycobacterium leprae e a segunda conclui os resultados da caracetrização da proteína NUDEL-
HUM. Além disso, ao final de cada conclusão são sugeridos o andamento e a perspectiva futura
dos trabalhos.
Capítulo 5 – Conclusão: Hsp65 de Mycobacterium leprae - 53
5.1 Hsp65 de Mycobacterium leprae
Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos e acertados durante a
execução do projeto. A Hsp65 de Mycobacteirum leprae é passível de obtenção por expressão
heteróloga em E.coli em corpúslos de inclusão.
A etapa de lavagem dos corpúsculos de inclusão antes da solubilização proteíca garantiu a
eliminação da purificação por métodos tradicionais. A figura 05 ilustra a proteína, alvo do estudo,
com alto grau de pureza.
Devido ao uso de agente desnaturante para a solubilização proteíca, foi necessário
experimento de renovelamento. A forma enovelada da proteína, foi assegurada pelos
experimentos de CD que confirmaram uma estruturação secundária tipicamente formada por
α
-
hélices e folhas
β
(Figura 06). Estudos de espalhamento dinâmico de luz contribuiram para
observar a presença de uma solução monodispersa formada de trímeros (Figura 07). Essa amostra
foi concentrada até o ponto máximo de saturação para dar início aos testes de cristalização.
Os experimentos de cristalização, até o momento, não resultaram em cristais difratáveis,
sendo apenas possível observar a presença de precipitados cristalinos e a formação de pequenos
cristais em forma de agulha. As placas estão sob intensa obervação e algumas condições de
refinamento estão em andamento com o objetivo de obter cristas difratáveis para os estudos
estruturais.
Capítulo 5 – Conclusão: NUDEL- 54
5.2 NUDEL (nuclear distribution element-like)
A metodologia aplicada para a expressão da proteína NUDEL em sistema heterólogo foi
bem sucedida na obtenção de altas quantidades da proteína na fração insolúvel.
A purificação da NUDEL foi realizada sob condições desnaturantes a partir da proteína
presente no corpo de inclusão e foi possível a obtenção de grande quantidade de proteína
purificada e um alto grau de pureza.
Não houve precipitação da proteína durante a renaturação pelo método da diluição
usando-se L-arginina ou diálise na presença e ausência de cloreto de níquel. A proteína foi
concentrada a 10 mg/ml para os experimentos de DLS que mostraram que a proteína apresenta-se
monomérica e monodispersa (89,9%) na presença de zinco e DTT. Os espectros de CD e
fluorescência indicaram que a proteína apresenta-se estruturada após a renaturação nas condições
testadas e que os aditivos usados não influenciam nas porcentagens dos constituintes secundários
da protéina e nem no enovelamento da mesma, respectivamente.
Tentativas de cristalização na ausência de aditivos, na presença de 0,1 mM de cloreto de
zinco ou cloreto de zinco e 1 mM de DTT estão em andamento, a condição mais promissora para
formação dos cristais, é a plca que contém solução protéica com cloreto de zinco e 1 mM de
DTT. Uma possibilidade para futuros experimentos seria a prévia caracterização espectroscópica
da solução protéica na presença de inibidores e posteriores ensaios de cristalização com a adição
dos mesmos.
Capítulo 6 - Reconhecimento - 55
CAPÍTULO 6 – RECONHECIMENTO
Para a realização desse trabalho, o apoio e a orientação do Prof. Dr. Camargo do
CAT/CEPID – Instituto Butantan e da Prof
a
. Dr
a
. Mirian Hayashi UNIFESP-CAT/CEPID foram
de fundamental importância, além da contribuição de vários pesquisadores que enriqueceram a
discussão científica e deram uma base sólida para o entendimento e conclusão dos experimentos.
Finalmente, agradecemos à FAPESP pelo apoio financeiro (Processo: 2006/01839-0).
Referências Bibliográficas - 56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adler, A. J., Greenfield, N. J., Fasman, G. D. 1973. Circular dichroism and optical rotatory
dispersion of proteins and polypeptides. Methods Enzymol., 27, 675-735.
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. 1990. Basic local alignment
search tool. J. Mol. Biol., 215, 403–410.
Arakawa, T., Ejima, D., Tsumoto, K., Obeyama, N., Tanaka, Y., Kita, Y., Timasheff, N. 2007.
Suppression of protein interactions by arginine: A proposed mechanism of the arginine effects.
Protein Expr. Purif., 127, 1-8.
Asea, A., Kraeft, S., Kurt-Jones, E.A., Stevenson, M.A., Chen, L.B., Finberg, R.W., Koo, G.C.,
Calderwood, K.S. 2000. HSP 70 stimulates cytokine production through a CD 14-dependent
pathway, demonstrating its dual role as chaperone and cytokine. Natural Medicine, 6, 435-442.
Bannon, M.J. 1999. BCG and tuberculosis. Arch. Dis. Child., 80, 80-83.
Bilder, R. M., Volavka, J., Czobor, P., Malhotra, A.K., Kennedy, J.L., Ni, X., Goldman, R.S.,
Hoptman, M.J., Sheitman, B., Lindenmayer, J.P., Citrome, L., McEvoy, J.P., Kunz, M., Chakos,
M., Cooper, T.B., Lieberman, J.A. 2002. Neurocognitive correlates of the COMT Val(158)Met
polymorphism in chronic schizophrenia. Biol. Psychiatry, 52, 701-707.
Blackwood, D. H., Muir, W. J., Porteous, D. J. 2005. DISC1 and PDE4B are interacting genetic
factors in schizophrenia that regulate cAMP signaling. Science, 310, 1187-1191.
Bochtler, M., Ditzel, L., Groll, M., Huber, R. 1997. Crystal structure of heat shock locus V
(HslV) from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A,
94
, 6070-6074.
Brandon, N.J., Hanford, E.J., Schurov, I., Rain, J.-C., Pelling, M., Duran- Jimeniz, B., Camargo,
M., Oliver, K.R., Beher, D., Shearman, M.S., Whiting, P.J., 2004. Disrupted in Schizophrenia 1
and Nudel form a neurodevelopmentally regulated protein complex: implications for
schizophrenia and other major neurological disorders. Mol. Cell. Neurosci., 25, 42–55.
Callicott, J. H., Straub, R. E., Pezawas, L., Egan, M. F., Mattay, V. S., Hariri, A. R., Verchinski,
B. A., Meyer-Lindenberg, A., Balkissoon, R., Kolachana, B., Goldberg, T. E., Weinberger, D. R.
2005. Variation in DISC1 affects hippocampal structure function and increases risk for
schizophrenia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 8627-8632.
Camargo, A. C., Reis, M. L., Caldo, H. 1979. Susceptibility of a peptide derived from bradykinin
to hydrolysis by brain endo-oligopeptidases and pancreatic proteinases. J. Biol. Chem., 254,
5304-5307.
Referências Bibliográficas - 57
CDNN deconvolution – Program for Circular Dichroism data deconvolution. Disponível em:
http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn/ Acesso em 20 Jul. 2007.
Chow, M.K.M., Amin, A.A., Fulton, K.F., Whisstock, J.C. 2006. Refold: An analytical database
of protein refolding methods. Protein Expr. Purif.,
46
, 166-171.
Chumakov, I., Blumenfeld, M., Guerassimenko, O., Cavarec, L., Palicio, M., Abderrahim, H.,
Bougueleret, L., Barry, C., Tanaka, H., La Rosa, P., Puech, A., Tahri, N., Cohen-Akenine, A.,
Delabrosse, S., Lissarrague, S., Picard, F.P., Maurice, K., Essioux, L., Millasseau, P., Grel, P.
2002. Genetic and physiological data implicating the new human gene for D-amino acid oxidase
in schizophrenia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13675-13680.
Chung, K.T., Biggers, C.J. 2001. Albert Léon Charles Calmette (1893-1933) and the
antituberculous BCG vaccination. Perspect. Biol. Med., 44, 379-389.
ClustalW - EBI server for multiple sequence alignment on the web.
Disponível em:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html Acesso em 12 jan 2008.
Cole, S.T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S.V., Eigimeier,
K., Gas, S., Barry III, C.E., Tekia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T.,
Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby,
T., Jagels, K., Krogh, A., Mclaen, J., Moule, S., Murphy, L., Oliver, K., Osborne, J., Quail,
M..A., Rajandream, M.A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K., Skelton, J., Squares, R., Squares,
S., Sulston, J.E., Taylor, K., Whitehead, S., Barrel, B.G. 1998. Deciphering the biology of
Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 393, 537-544.
Craddock, N., O’Donovan, M. C., Owen, M J. 2005. The genetics of schizophreni bipolar
disorder: dissecting psychosis. J. Med. Genet., 42, 193-204.
Egan, M. F., Goldberg, T. E., Kolachana, B. S., Callicott, J. H., Mazzanti, C. M., Straub, R .E.,
Goldman, D., Weinberger, D.R. 2001. Effect of COMT Val108/158 Met genotype on frontal lobe
function and risk for schizophrenia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
98
, 6917-6922.
Efimov, V. P., Morris, N. R., 2000. The LIS1-related NUDF protein of Aspergillus nidulans
interacts with the coiled-coil domain of the NUDE/RO11 protein. J. Cell Biol., 150,681–688.
Feng, Y., Olson, E.C., Stukenberg, P.T., Flanagan, L.A., Kirschner, M.W., Walsh, C.A. 2000.
LIS1 regulates CNS lamination by interacting with mNudE, a central component of the
centrosome. Neuron, 28, 665-679.
Fine, P.E.M. 1989. Rev. Infect. Dis., 11, 353-359.
Referências Bibliográficas - 58
Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., Deboy, R.,
Dodson, R., Gwinn, M., Haft, D., Hickey, E., Kolonay, J.F., Nelson, W.C., Umayam, L.A.,
Ermolaeva, M., Salzberg, S.L., Delcher, A., Utterback, T., Weidman, J., Khouri, H., Gill, J.,
Mikula, A., Bishai, W., Jacobs, Jr, W.R., Jr., Venter, J.C., Fraser, C.M. 2002. Whole-genome
comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and loboratory strain. J. Bacteriol., 184,
5470-5490.
Guerreiro, J. R., Winnischofer, S. M. B., Bastos, M. F., Portaro, F. C. V., Sogayar, M. C.,
Camargo, A. C. M., Hayashi, M. A. F. 2005. Cloning and characterization of the human and
rabbit NUDEL-oligopeptidase promoters and their negative regulation. Biochim. Biophys. Acta,
1730, 77-84.
Hayashi, M. A. F., Portaro, F. C. V., Tambourgi, D. V., Sucupira, M., Yamane, T., Fernandes, B.
L., Ferro, E. S., Reboucas, N. A., Camargo, A. C. M. 2000. Molecular and immunochemical
evidences demonstrate that endooligopeptidase A is the predominant cytosolic oligopeptidase of
rabbit brain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 269, 7-13.
Hayashi, M. A. F., Portaro, F. C. V., Bastos, M. F., Guerreiro, J. R., Oliveira, V., Gorrao, S. S.,
Tambourgi, D. V., Sant'Anna, O. A., Whiting, P. J., Camargo, L. M., Konno, K., Brandon, N. J.,
Camargo, A. C. M. 2005. Inhibition of NUDEL (nuclear distribution element-like)-
oligopeptidase activity by disrupted-in-schizophrenia 1. Proc. Nat. Acad. Sci., 102 3828-3833.
Hanahan, D., 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J.Mol.Biol., 166,
557-580.
Hartl, F.U. 1996. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 381, 571-580.
Harrison, P.J., Weinberger, D.R. 2005. Schizophrenia genes, gene expression, and
neuropathology: on the matter of their convergence. Mol. Psychiatry, 10, 40-68.
Hattori, M., Adachi, H., Tsujimoto, M., Arai, H., Inoue, K. 1994. Miller-Dieker lissencephaly
gene encodes a subunit of brain platelet-activating factor acetylhydrolase. Nature, 370, 216-218.
Hess, J., Kaufmann, S.H.E. 1999. Development of novel tuberculosis vaccine. C. R. Acad. Sci.
Paris, 322, 953-958.
Hennah, W., Varilo, T., Kestila, M., Paunio, T., Arajarvi, R., Haukka, J., Parker, A., Martin, R.,
Levitzky, S., Partonen, T., Meyer, J., Lonnqvist, J., Peltonen, L., Ekelund, J. 2003. Haplotype
transmission analysis provides evidence of association for DISC1 to schizophrenia and suggests
sex-dependent effects. Hum. Mol. Genet., 12, 3151-3159.
Referências Bibliográficas - 59
Hodgkinson, C.A., Goldman, D., Jaeger, J., Persaud, S., Kane, J.M., Lipsky, R.H., Malhotra,
A.K. 2004. Disrupted in schizophrenia 1 (DISC1): association with schizophrenia,
schizoaffective disorder, and bipolar disorder. Am. J. Hum. Genet., 75, 862-872
Hughes, A.L. 1993. Contrasting evolutionary rates in the duplicate chaperonin genes of
Mycobacterim tuberculosis and M. Leprae. Mol. Biol. 6, 1343-l 359.
Ginsberg, A.M. 2002. What’s new in tuberculosis vaccine. Bull. Who 80, 483-488.
Kitagawa, M., Umezu, M., Aoki, J., Koizumi, H., Arai, H., Inoue, K., 2000. Direct association of
LIS1, the lissencephaly gene product, with a mammalian homologue of a fungal nuclear
distribution protein, rNUDE. FEBS Lett., 479, 57-62.
Kholmanskikh, S.S., Dobrin, J.S., Wynshaw-Boris, A., Letourneau, P.C., Ross, M. 2003.
Disregulated RhoGTPases and actin cytoskeleton contribute to the migration defect in Lis1-
deficient neurons. J. Neurosci., 23, 8673-8681.
Kong, T.H., Coates, A.R.M., Butcher, P.D., Hickman, C.J., Shinnick, T.M. 1993. Mycobacterim
tuberculosis expresses two chaperonin-60 homologs. Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 2608-2612.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
Lima, K.M., dos Santos, S.A., Santos, R.R., Jr., Rodrigues, J.M., Silva, C.L. 2003. Efficacy of
DNA-hsp65 vaccination for tuberculosis varies with method of DNA introduction in vivo. 2003.
Vaccine, 22, 49-56. (a)
Lima, K.M., Santos, S.A., Lima, V.M., Coelho-Castelo, A.A., Rodrigues, Jr. J.M., Silva, C.L.
2003. Single dose of vaccine based on DNA enconding mycobacterial hsp65 protein plus TDM-
loaded PLGA microspheres protects against a virulent strain of Mycobacterium
tuberculosis.Gene Ther, 8, 678-685. (b)
Lipska, B.K., Tricia Peters, T., Hyde, T..M., Halim, N.,Horowitz C., Mitkus, S.,Weickert, C.S.,
Matsumoto, M., Sawa, A., Straub, R.E., Vakkalanka, R., Herman, M.H., Weinberger, D.R.,
Kleinman, J. E. 2006. Expression of DISC1 binding partners is reduced in schizophrenia and
associated with DISC1 SNPs. Hum. Mol. Genet., 15, 1245–1258.
Liu, Y., Li, J., Wang, F., Chen, J., Li, P., Su, Z. 2007. A newly proposed mechanism for arginine-
assisted protein refolding- not inhibiting soluble oligomers although promoting a correct
structure. Protein Expr. Purif., 51, 235-242.
Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. 1991. Predicting Coled Coils from Protein Sequences.
Science, 252, 1162-1164.
Referências Bibliográficas - 60
Lowrie, D.B., Tascon, R.E., Bonato, V.L., Lima, V.M., Faccioli, L.H., Stavropoulos, E., Colston,
M.J., Hewinson, R.G., Moelling, K., Silva, C.L. 1999. Therapy of tuberculosis in mice by DNA
vaccination. Nature, 400, 269-271.
Mark, J.K., Smith, S., Hefford, M.A. 2007. Over-expression and refolding of MAP kinase
phosphatase 3. Protein Expr. Purif., 54, 253-260.
Millar, J. K., Christie, S., Anderson, S., Lawson, D., Hsiao-Wei Loh, D., Devon, R. S., Arveiler,
B., Muir, W. J., Blackwood, D. H., Porteous, D. J., 2001. Genomic structure and localisation
within a linkage hotspot of Disrupted In Schizophrenia 1, a gene disrupted by a translocation
segregating with schizophrenia. Mol. Psychiatry, 6, 173–178.
Millar, J. K., Christie, S., Porteous, D. J. 2003. Yeast two-hybrid screens implicate DISC1 in
brain development and function. Biochem. Biophys. Res. Commun., 311, 1019-1025.
Millar, J. K., Pickard, B. S., Mackie, S., James, R., Christie, S., Buchanan, S. R., Malloy, M. P.,
Chubb, J. E., Huston, E., Baillie, G. S., Thomson, P. A., Hill, E. V., Brandon, N. J., Rain, J. C.,
Camargo, L. M., Whiting, P. J., Houslay, M. D., Blackwood, D. H., Muir, W. J., Porteous, D. J.
2005. DISC1 and PDE4B are interacting genetic factors in schizophrenia that regulate cAMP
signaling. Science, 310, 1187-1191.
Millar, J. K., Wilson-Annan, J. C., Anderson, S., Christie, S., Taylor, C. A., Semple, C. A.,
Devon, R. S., Clair, D. M., Muir, W. J., Blackwood, D. H., Porteous, D. J. 2000. Disruption of
two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum. Mol. Genet., 9,
1415-1423.
Missiakas, D., Schwager, F., Betton, J.-M., Georgopoulos, C., Raina, S. 1996. Identification and
characterization of HsIV HsIU (ClpQ ClpY) proteins involved in overall proteolysis of misfolded
proteins in Escherichia coli. Embo J.,
15
, 6899-6909.
Miyoshi, K., Honda, A., Baba, K., Taniguchi, M., Oono, K., Fujita, T., Kuroda, S., Katayama, T.,
Tohyama, M. 2003. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia,
participates in neurite outgrowth. Mol. Psychiatry, 8, 685-694.
Morris, J. A., Kandpal, G., Ma, L., Austin, C. P. 2003. DISC1 (Disrupted-In- Schizophrenia 1) is
a centrosome-associated protein that interacts with MAP1A, MIPT3, ATF4/5 and NUDEL:
regulation and loss of interaction with mutation. Hum. Mol. Genet. 12, 1591-1608.
Murphy, R.M. 1997. Static and dynamic light scattering of biological macromolecules: what can
we learn. Current Opinion in Biotechnology 8, 25-30.
Referências Bibliográficas - 61
Nagabhushanam, V., Praszkier, J., Cheer, C. 2001. Molecular and Immunological
Characterization of Mycobacterium avium 65 kDa heat shock protein (Hsp65). Immunology and
Cell Biology 79, 454-461.
Neuer, A., Mele, C., Rosenwaks, Z., Witilin, S.S. 1998. Monoclonal antibodies to mammalian
heat shock proteins impair mouse embryo development in vitro. Hum. Reproduction Update, 14,
987-990.
Neuer, A., Spandorfer, S.D., Giraldo, P., Dieterle, S., Rosenwalks, Z., Witkin, S.S. 2000. The
role of heat shock protein in reproduction. Hum. Reproduction Update, 6, 149-159.
Niethammer, M., Smith, D. S. R., Ayala, R., Peng, J., Ko, J., Lee, M. S., Morabito, M.,Tsai L. H.
2000. NUDEL is a novel Cdk5 substrate that associates with LIS1 and cytoplasmic dynein.
Neuron, 28 697–711.
Oliveira, E. B., Martins, A. R., Camargo, A. C. M. 1976. Isolation of brain endopeptidases:
influence of size and sequence of substrates structurally related to bradykinin. Biochemistry,
16
,
1967-1974.
Ozeki, Y., Tomoda, T., Kleiderlein, J., Kamiya, A., Bord, L., Fujii, K., Okawa, M., Yamada, N.,
Hatten, M. E., Snyder, S. H., 2003. Disrupted-in-Schizophrenia-1 (DISC-1): mutant truncation
prevents binding to NudE-like (NUDEL) and inhibits neurite outgrowth. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100, 289–294.
Pockley, A.G., Bulmer, J., Hanks, B.M., Wright, B.H. 1999. Identification of human heat shock
protein 60 (HSP 60) and anti-HSP 60 antibodies in the peripheral circulation of normal
individuals. Cell Stress & Chaperones, 4, 29-35.
Portaro, F.C.V., Hayashi, M.A.F., Arauz, L.J., Palma, M.S., Assakura, M.T., Silva, C.L.,
Camargo, A.C.M. 2002. The Mycobacterium leprae hsp65 displays proteolytic activity.
Mutagenesis studies indicate that the M. leprae hsp65 proteolytic activity is catalytically related
to the HslVU protease. Biochemistry, 41, 7400-7406.
Qamra, R., Mande, S. C. 2004. Crystal Structure of the 65-Kilodalton Heat Shock Protein,
Chaperonin 60.2, of Mycobacterium tuberculosis. J. Bacteriol., 23, 8105-8113. (a)
Qamra, R., Mande, S.C., Coates, A.R.M., Henderson, B. 2004. The Unusual Chaperonins of
Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, 5, 385-394. (b)
Referências Bibliográficas - 62
Reed, S., Lobet, Y. 2005. Tuberculosis vaccine development: from mouse to man. Microbes and
Infect., 7, 922-931.
Reiner, O., Carrozzo, R., Shen, Y., Wehnert, M., Faustinella, F.,Dobyns, W.B., Caskey, C.T.,
Ledbetter, D.H. 1993. Isolation of a Miller-Dieker lissencephaly gene containing G protein beta-
subunit-like repeats. Nature, 364, 717-721.
Sasaki, S., Shionoya, A., Ishida, M., Gambello, M.J., Yingling, J., Wynshaw-Boris, A. Hirotsune,
S. 2000. A LIS1/NUDEL/cytoplasmic dynein heavy chain complex in the developing and adult
nervous system. Neuron, 28, 681-696.
Shifman, S., Bronstein, M., Sternfeld, M., Pisante-Shalom, A., Lev-Lehman, E., Weizman, A.,
Reznik, I., Spivak, B., Grisaru, N., Karp, L., Schiffer, R., Kotler, M., Strous, R.D., Swartz-
Vanetik, M., Knobler, H.Y., Shinar, E., Beckmann, J.S., Yakir, B., Risch, N., Zak, N.B. 2002. A
highly significant association between a COMT haplotype and schizophrenia. Am. J. Hum. Genet.
71, 1296-1302.
Silva. C.L., Portaro, F.C., Bonato, V.L., de Camargo, A.C., Ferro, E.S. 1999. Thimet
oligopeptidase (EC 3.4.24.15), a novel protein on the route of MHC class I antigen presentation.
Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 255, 591-595.
Stefansson, H., Sigurdsson, E., Steinthorsdottir, V., Bjornsdottir, S., Sigmundsson, T., Ghosh, S.,
Brynjolfsson, J., Gunnarsdottir, S., Ivarsson, O., Chou, T.T., Hjaltason, O., Birgisdottir, B.,
Jonsson, H., Gudnadottir, V.G., Gudmundsdottir, E., Bjornsson, A., Ingvarsson, B., Ingason, A.,
Sigfusson, S., Hardardottir, H. 2002. Neuregulin 1 and susceptibility to schizophrenia. Am. J.
Hum. Genet., 71, 877-892.
Straub, R.E., Jiang, Y., MacLean C.J., Ma, Y., Webb, B.T., Myakishev, M.V., Harris-Kerr, C.,
Wormley, B., Sadek, H., Kadambi, B., Cesare, A. J., Gibberman, A., Wang, X., O’Neill, F.A.,
Walsh, D., Kendler, K. S., 2002. Genetic variation in the 6p22.3 gene DTNBP1, the human
ortholog of the mouse dysbindin gene, is associated with schizophrenia. Am. J. Hum. Genet., 71,
337–348.
Sweeney, K. J.; Prokscha, A. & Eichele, G. NudE-L. 2001. A novel Lis1-interacting protein,
belongs to a family of vertebrate coiled-coil proteins. Mech. Dev, 101, 21-33.
Van Eden, W. 2000. Stress proteins as targets for anti-inflammatory therapies. Drug Discovery
Today, 5, 115-120.
Van Eden, W., Van Der Zee, R., Paul, A.G.A., Prakken, B.J., Wendling, U.W., Anderton, S.M.,
Wauben, M.H.M. 1998. Do heat shock proteins control the balance of t-cell regulation in
inflammatory disease. Immunoloy Today, 19, 303-307.
Referências Bibliográficas - 63
Zugel, U., Kaufamnn, S.H. 1999. Immune response against heat shock protein in infection
diseases. Immunobioloy, 1, 22-35.
Warner, L.R., Blasick, C.M., Brown, R.J., Oxford, J.T. 2007. Expression, purification and
refolding of recombinant collagen alpha 1 (XI) amino terminal domain splice variants. Protein
Expr. Purif., 52, 403-409.
WHO (World Health Organization) – The Word Report - Health Systems: improving
performance. Geneva, Switzerland, 2000.
WHO (World Health Organization) – The Word Report – 2007 Tuberculosis Facts.
(http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/ visita em 10/01/2008).
Young, D., Lathigra, R., Hendrix, R., Sweetser, D., Young, R.A. 1988. Stress proteins are
immune targets in leprosy and tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A
.,
12, 4267-4270
.
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