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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO
SENSU EM CIÊNCIAS GENÔMICAS E
BIOTECNOLOGIA
EXPRESSÃO
DE PROTEÍNAS NÃO ES
TRUTURAIS DO VÍRUS D
O DENGUE
E
BUSCA DE GENES CANDI
DATOS A SUPRESSÃO
DE RNA INTERFERENTE
Autora: Aline d
os Santos Ribeiro
Orientador: Prof. Dr. Tatsuya Nagata
BRASÍLIA
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Aline dos Santos
Ribeiro
EXPRESSÃO
DE PROTEÍNAS NÃO ES
TRUTURAIS DO
VÍRUS DO DENGUE E BUSCA DE GENES CAN
DIDATOS
A SUPRESSÃO
DE RNA INTERFERENTE
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação
Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da
Universidade Católica de Brasília,
como requisito para obtenção do
Título de Mestre em Ciências
Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Tatsuya
Nagata
Brasília
2008
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Dissertação defendida e aprovada como requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia, defendida e aprovada em 12 de
maio de 2008, pela banca examinadora constituída por:
Prof. Dr. Renato de Oliveira Resende
Un
iversidade de Brasília -
UNB
Profa. Dra. Eliane Ferreira de Noronha
Universidade Católica de Brasília
Prof. Dr. Tats
uya Nagata
Universidade Católica de Brasília
Brasília
UCB
I
Ofereço a Deus esse trabalho, reconhecendo que Ele é a fonte de toda sabedoria e
conhecimento, minha força e motivação. Quando duvidei que pudesse chegar
ao fim, então pude
respirar por saber que Ele é o começo e que dele,
por meio dele e para Ele são todas as coisas.
Dedico à família Ochsendorf por ser a maior expressão de amor e milagre que eu vivi
nessa trajetória. Olhando para vocês entendo que amor é mais do que um se
ntimento,
ser família não depende de hereditariedade e que generosidade é uma semente
pequena que dá frutos grandes. Esse trabalho é fruto da generosidade de vocês.
II
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por
ter
criado esse intervalo
de tempo na minha história p
ara provar
que nele não há impossíveis
.
Aos meus pais por me ensinarem que grandes
conquistas não são feitas por meio de força,
mas com atitudes de fé.
Ao professor Tatsuya pela orientação e
oportunidade de realizar esse projeto.
A professora Eliane
Noronha pela forma carinhosa
com que me ajudou na etapas de expressão.
A professora Danielle Cordeiro pela orientação durante
a monitoria TA. Agradeço muito por tudo que me ensinou.
Aos queridos Jurandir, Vera, Érica e Karine
por serem o abraço, o sorr
iso e o aconchego
quando não havia mais ninguém.
A minha irmã Alana por realizar todos os dias
o meu sonho de não andar só.
A minha avó por sempre acreditar e
investir em tudo que faço.
Aos primos Jurandir e Eduarlinda por caminharem
junto durante to
da a trajetória.
Aos pastores Marco Antônio e Juçara Peixoto pelas
palavras que trouxeram vida a esse tempo.
Aos líderes Tony e Alcina por todo cuidado e amor.
A minha amiga Giselle por fazer do meu projeto seu
próprio alvo de conquista e por me fazer
acreditar
todos os dias que andar junto é possível
mesmo quando não estamos perto.
Agradeço a minha Mani Elisa o melhor ouvido
e a primeira voz de encorajamento que recebi
quando tudo parecia impossível.
Agradeço aos amigos Mauro e Vicky por nu
nca
precisarem de nada além do amor para ser
braços que dão suporte a minha vida.
III
Às amigas Simone,Thaís e Michele por serem
a minha família durante esse tempo.
Amo muito vocês meninas!
Agradeço a Fernanda pelo companheirismo
e cuidado sincero.
À
Bruna por sempre ser a voz no meu ouvido dizendo:
Agüenta só mais um pouquinho.
Você não é uma amiga,
tornou
-
se uma irmã.
À Dione por todo apoio e orações.
À Keilly por ser uma excelente companheira
de quarto e tornar muito agradável
o tempo da noss
a convivência.
Agradeço a toda equipe do laboratório, Sandra, Karoline, Layssa, Natália,
Fernanda, Ana, Grazzy,Camila, Patrícia, Francisca Aline e Francielle.
Quero que saibam o quanto foram importantes nessa trajetória
e que reconheço que esse trabalh
o tem as digitais de vocês.
Agradeço ao Fábio, Secretário do curso de Biotecnologia, por ter feito
sempre mais do que o seu trabalho, sendo um mediador
em todas as coisas desde o princípio.
À Ida por facilitar meus experimentos,
auxiliando sempre per
to e longe dos olhos.
À Universidade Católica de Brasília e todos os seus funcionários,
lugar que passou a ser minha casa, pessoas com as quais
convivi mais do que com minha família.
IV
A fé é a certeza de que vam
os receber as coisas que esperamos e a
prova de que existem coisas que não podemos ver . Hebreus 11:1
Ser sábio é melhor do que ser forte; o conhecimento é mais importante
do que a força. Afinal, antes de entrar numa batalha, é preciso planejar bem, e ,
quando há muitos conselheiros, é mais fácil vencer . Provérbios 24:21
V
ÍNDICE
RESUMO..............................................................................................................................
VIII
ABSTRACT.............................................................................................................................
IX
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................
X
LISTA DE TABELAS...........................................................................................................
XIV
INTRODUÇÃO..........................................................................................................................
1
Histórico do Dengue
..........................................................................................................................
1
Dengue no Brasil
...............................................................................................................................
3
Dengue
................................................................................................................................................
7
Vírus do Dengue
................................................................................................................................
8
A importância de proteínas não
-
estruturais do vírus
..................................................................10
Silenciamento de genes
....................................................................................................................14
Supressores do silenciamento de genes
..........................................................................................19
Expressão de proteínas
...................................................................................................................26
JUSTIFICATIVA ....................................................................................................................28
OBJETIVO GERAL ................................................................................................................29
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................
.29
MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................30
Clonagem de cDNA de genes do vírus da Dengue
........................................................................30
Extração de RNA viral
....................................................................................................................30
Amplificação de genes candidatos a supressores de RNAi
..........................................................31
Clonagem dos genes de proteínas não estruturais do Dengue
.....................................................35
Digestão de insertos e vetor de clonagem
......................................................................................35
Cálculo de proporção inserto: vetor
..............................................................................................36
Transformação de bactérias
E.coli
................................................................................................38
Subclonagem dos genes correspondentes as proteínas não
-
estruturais
.....................................39
Agroinfecção de Nicotiana benthamiana (Agrobacterium tumefaciens transient
Assay)
.............................................................................................................................................42
Análise de fluorescência em folhas de
N. bethamiana
agroinculadas
........................................45
Extração de Proteínas totais de
N. be
thamiana
............................................................................46
Transferência de proteínas para membrana de nitrocelulose
.....................................................46
Análises de Western Blot
.......................................................................................................47
Dot Imunobinding Assay (DIBA)
...................................................................................................48
Expressão da proteína NS2A em bactéria
.....................................................................................48
RESULTADOS E DIS
CUSSÃO..............................................................................................51
Clonagem de genes de proteínas não
-
estruturais do Dengue vírus
............................................51
VI
Digestão das construções em vetor de clonagem
..........................................................................52
Clonagem e Subclonagem dos genes das proteínas não estruturais do Dengue
........................55
Agroinoculação
................................................................................................................................55
Detecção das proteínas expressas em plantas
...............................................................................61
Detecção de proteína expressa em bactérias
.................................................................................65
CONSIDER
AÇÕES FINAIS ..................................................................................................68
PERSPECTIVAS.....................................................................................................................71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................72
AP
ÊNCICE I............................................................................................................................81
Meios de Cultura e Soluções
...........................................................................................................81
Meio LB com ampicilina (Sambrook & Russell, 2001)
...............................................................................81
Meio LB com ágar e ampicilina (Sambrook & Russell, 2001)
....................................................................82
Meio SOC (Sambrook & Russell, 2001)
......................................................................................................82
Meio de cultura LBman
................................................................................................................................83
Tampão de Indução
......................................................................................................................................83
Tampão de indução completo
.......................................................................................................................83
MES
.............................................................................................................................................................84
MS Completo
...............................................................................................................................................84
Tampão Alcalino
..........................................................................................................................................84
Tampão d
e Transferência
.............................................................................................................................84
PBS 10x (pH 7,4)
.........................................................................................................................................85
Tampão de Lise (pH 8,0)
..............................................................................................................................85
Tampão de Amostra
.....................................................................................................................................85
APÊNDICE II..........................................................................................................................87
A- Alinhamento da proteína NS1 com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS1 obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................87
B- Alinhamento da proteína NS2A com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS2A obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................88
C- Alinhamento da proteína NS2B com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS2B obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................89
D- Alinhamento da proteína NS3 com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS3 obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................90
E- Alinhamento da proteína NS4A com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS4A obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................91
F- Alinhamento da proteína NS4B com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS4B obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................92
VII
G- Alinhamento da proteína NS5 com seqüências de proteína do Dengue
depositadas no banco de dados do NCBI. Query: seqüência de NS5 obtida no
seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue
proveniente do banco de dados do NCBI.
.......................................................................93
VIII
RESUMO
O genoma do vírus do Dengue é constituído de uma fita simples positiva
de RNA, capaz de codificar sete proteínas não-estruturais que assumem papel
importante na replicação, transmissão por mosquito, caráter de virulência e
outras funções essenciais à manutenção do vírus dentro do hospedeiro.
Devido a funções conhecidas, essas proteínas são alvos para o
desenvolvimento de controle do vírus e com a descoberta do envolvimento de
proteínas não estruturais na supressão do silenciamento de genes, tornou-se
ainda mais interessante o estudo de suas funções. Nesse trabalho, a atividade
supressora desse mecanismo nas sete proteínas não estruturais do Dengue foi
verificada, utilizando o sistema de Agrobacterium tumefaciens transient assay
(ATTA) em Nicotiana benthamiana. O silenciamento gênico na planta foi
confirmado através do baixo nível de expressão de Green Fluorescent
protein , comparando com o controle inoculado com a proteína supressora
HcPro de potyvirus, que após o período de seis dias pós inoculação foi capaz
de resgatar a fluorescência de GFP. Nenhuma das proteínas não estruturais do
Dengue apresentou capacidade de resgatar a fluorescência de GFP nas folhas,
o que parece indicar ausência de atividade supressora de interferência de
RNA identificada pelo sistema utilizado (ATTA). Paralelamente aos testes
realizados com as proteínas não estruturais foi realizada a expressão da
proteína NS2A em sistema procariótico, resultando nos primeiros indícios de
detecção da mesma através de ensaio imunológico a partir de proteínas totais
de Escherichia coli extraídas após diferentes tempos de indução.
IX
ABSTRACT
The genome of the Dengue virus is constituted of a simple positive
strand
of RNA,
capable of encode seven nonstructural proteins that assume important function in the
replication process, transmission by mosquito, character of virulence and other essential
functions to the maintenance of the virus inside the host. Due to known functions, those
proteins are aim for the development of control of the virus and with the discovery of the
involvement of nonstructural proteins in the suppression of genes silencing, became still more
interesting the study of its functions. In that work, the suppressive activity of that mechanism
in the seven nonstructural proteins of Dengue was noticed, utilizing the system of
Agrobacterium tumefaciens transient assay
(ATTA)
with Nicotiana benthamiana. The genes
silencing in the plant was confirmed through short level of expression of "Green Fluo
rescent
Protein", comparing with the control inoculated with the suppressive protein HcPro of
Potyvirus
, which after the period of six days of inoculation was capable of rescue the
fluorescence of GFP. None of the nonstructural proteins of Dengue showed capacity of
rescue the fluorescence of GFP in the leaves, what seem to indicate absence of suppressive
activity of interference of RNA ide
ntified by the system utilized (ATTA)
. Concomitantly was
carried out the expression of the protein NS2A in prokaryotic system, resulting first sign of
detection of the protein through immunological assay from total proteins of Escherichia coli
extracted after different times of induction.
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Quadro da evolução do Dengue no período de 1980-2007 (Organização
Pan Americana de Saúde, 2007).
...................................................................................................
4
Figura 2: Mapa ilustrando a co-circulação dos sorotipos do Dengue entre os países
de maior incidência da doença no período de 2006-2007 (Organização Pan
Americana de Saúde).
........................................................................................................................
5
Figura 3: Número de casos de Dengue registrado entre os países do Cone Sul, em
2007 (OPAS, 2008).
...........................................................................................................................
6
Figura 4: Vírion do Dengue. (Fonte:Vírus Taxonomy, 2005). A- Esquema do virion
maduro e imaturo: E- Envelope, prM- pré-Membrana, C- Capsídeo, M- Membrana;
B- Imagem da superfície do vírus.
................................................................................................
9
Figura 5: Estrutura esquemática do genoma do vírus do dengue. (Fonte: Vírus
Taxonomy, 2005).
.............................................................................................................................11
Figura 6: Esquema do processo de silenciamento mediado por RNA. A dupla fita de
RNA (dsRNA) é degrada pela ribonuclease DICER, gerando pequenos RNAs
(siRNAs) que são incorporados no complexo enzimático RISC, podendo ser
utilizados como primer pela RNA polimerase dependente de RNA (RdRp).
Adaptado de Gitlin e Andino (2003).
........................................................................................17
Figura 7: As proteínas HCpro de Potivirus, NSs de Tospovirus NS3 de Tenuivirus e
p19 de Tombusvirus ilustram os três possíveis caminhos utilizados por supressores
de silenciamento: Inativação de DICER, degradação de pequenos RNAs (siRNAs) e
bloqueio de sua incorporação no complexo enzimático RISC.(Cedido e autorizado
por Marcel Prins)
..............................................................................................................................21
Figura 8: Células C6/36 de Aedes albopictus infectadas com vírus do Dengue
.........30
Figura 9: Esquema das etapas para realização da amplificação dos genes candidatos
a supressores de RNA interferente.
............................................................................................33
Figura 10
: Mapa genético do vetor pRAPs. 35S- Promotor de cauliflower mosaic
virus, Tnos- Terminador de Nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens, Amp-
gene de resistência à ampicilina. NcoI ,NotI e SacI representam os sítios de
XI
restrição utilizados para clonagem; AscI e PacI são os sítios de restrição utilizados
para a subclonagem em vetor de expressão pBINplus.
........................................................37
Figura 11
: Mapa genético do vetor de expressão pBIN plus ligado à parte do vertor
pRAPs utilizado para clonagem das proteínas não estruturais. Inserto NS1, Asc I e
PacI representam os sítios de restrição para a subclonagem.
...........................................40
Figura 12: Esquema de agroinoculação das construções baseadas em pBINplus. A-
Controle negativo: Duplicata de Nicotiana benthamiana inoculada com
Agrobacterium tumafaciens transformada pela construção pBINGFP. B- Nicotiana
benthamiana inoculada com as construções pBINGFP e pBINHcPro, proteína
supressora de silenciamento. C- Duplicatas de Nicotiana benthamiana inoculadas
com as construções pBINGFP e o vetor pBINplus ligado a cada um dos genes
candidatos a supressão do silenciamento de RNAi............................................44
Figura 13: Vetor de expressão pET-17b . Tamanho de 3306 bases, sítio de
resistência à ampicilina e múltiplos sítios de enzimas de restrição, promotor e
terminador T7.
...................................................................................................................................50
Figura 14: Os sete genes das proteínas não estruturais amplificados por RT-PCR e
os vetores quantificados para clonagem e subclonagem dos genes. 1: NS1, 2 a 10,
respectivamente: NS2A, NS4A, NS3, NS2B, NS4B, NS5, vetor pBINplus e vetor
pRAPs, respectivamente. Poço 5: Produto de PCR de fragmento não utilizado na
clonagem. M- marcador de massa molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)
..51
Figura 15: Digestão do vetor pRAPs contendo fragmentos NS2A, NS2B e NS4A
com as enzimas AscI e PacI. 1 : Marcador de massa molecular 1kb plus DNA
Ladder (Invitrogen); 2: vetor pRAPsNS2A digerido com AscI e PacI; 3: vetor
pRAPsNS2B digerido com AscI e PacI; 4: vetor pRApsNS4A. O tamanho esperado
na digestão de NS2A é de 2053 pb, de NS2B é de 1800 pb e NS4A é de 1849 pb.
..53
Figura 16: Digestão do vetor pRAPs contendo fragmentos NS4B e NS5 com as
enzimas AscI e PacI. 1: Marcador de massa molecular 1kb plus DNA Ladder
(Invitrogen); 2: Vetor pBINplus digerido com AscI e PacI; 3: Vetor pRAPsNS4B
digerido com AscI e PacI; 4: Vetor pRAPsNS5 digerido com AscI e PacI Os
XII
tamanhos esperados para a digestão de NS4B e NS5 foi de 2146 pb e 4099 pb,
respectivamente.
................................................................................................................................53
Figura 17: Digestão do vetor pRAPs contendo gene NS1 com as enzimas AscI e
PacI. 1: 1kb plus DNA Ladder (Invitrogen), marcador de massa molecular; 2:
Vetor pRAPsNS1 digerido com AscI e PacI. O produto da digestão purificado para
clonagem tem tamanho esperado de 2455 pb.
.........................................................................54
Figura 18: Digestão do vetor pRAPS contendo gene NS3 com as enzimas AscI e
PacI. 1: Marcador de massa molecular 1kb plus DNA Ladder (Invitrogen); 2: Vetor
pRAPsNS3 digerido com AscI e PacI. O produto da digestão purificado para
clonagem tem tamanho esperado de 3256 pb.
.........................................................................54
Figura 19: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS1. B- Controle positivo: folha inoculada com a construção pBINHcPro e
pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
........57
Figura 20: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS2A. B- Controle positivo: folha inoculada com a proteína HcPro e GFP.
Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
..............................57
Figura 21: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS2B. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro
e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
..58
Figura 22: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções GFP e
pBINNS3. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro e
pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
.......58
Figura 23: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS4A. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções
pBINHcPro e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a
inoculação.
..........................................................................................................................................59
Figura 24: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS4B. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro
e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
..59
XIII
Figura 25: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS5. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro
e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
...60
Figura 26: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com Agrobacterium
tumefaciens LBA 4404 e a construção pBINGFP. B- Controle positivo: folha
inoculada com as construções pBINHcPro e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz
ultravioleta seis dias após a inoculação.
..................................................................................60
Figura 27: Eletroforese em gel de poliacrilamida, com as proteínas resultantes da
extração das folhas inoculadas com as proteínas testadas. MM: Marcador de massa
molecular BenchMark protein Ladder (Invitrogen).
.............................................................62
Figura 29: Proteínas expressas nos períodos de 4, 6, 18 e 24 horas pós indução.
Possível produto da expressão com massa equivalente a 25 KDa. Controle negativo:
Produto da expressão de proteínas totais de E.coli transformada com pET17b sem a
proteína NS2A. MM: Marcador de massa molecular BenchMark protein Ladder
(Invitrogen).
........................................................................................................................................66
Figura 30: Dot Imunobinding Assay. Detecção da proteína NS2A fusionada a uma
cauda de histidina, em ensaio imunológico utilizando anticorpo anti-Histag.
Controle positivo: Proteína Envelope do Dengue fusionada a cauda de polihistidina
(Proteína purificada); Controle negativo: Produto da expressão de proteínas totais
de E.coli transformada com pET17b sem a proteína NS2A.
............................................66
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Proteínas supressoras de RNA interferente identificadas em diferentes
gêneros de vírus. Adaptada de Li e Ding (2006).
.............................................................24
Tabela 2: Primers para amplificação de fragmentos não estruturais.
........................32
Tabela 3: Componentes da solução de PCR para amplificação das proteínas não-
estruturais.
......................................................................................................................................34
Tabela 4: Enzimas de restrição utilizadas para digestão dos fragmentos
................35
1
INTRODUÇÃO
Histórico do Dengue
O primeiro marco epidêmico do Dengue ocorreu em 1779 no Cairo e na
Batavia citado por Siler et al. (1926). Registros posteriores foram
encontrados na Filadélfia, Zanzibar, Calcutá, Índi e Hong Kong (1901).
Embora os primeiros registros epidêmicos da doença tenham ocorrido em três
continentes (Ásia, África e América do Norte) em 1779 e 1780, foram
encontrados registros anteriores na enciclopédia chinesa publicada durante a
Dinastia Chinesa (265-420 A.D). A doença foi chamada pelos chineses de
água envenenada
e foi pensado estar associada aos insetos que sobrevoavam
essas águas (HENCHAL & PUTNAK, 1990)
Foi citado por Henchal (1990), que a doença foi considerada um dos
maiores problemas de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais,
contudo somente a partir de 1906 foi demonstrado que o mosquito Aedes
aegypti era o agente transmissor do vírus.
As condições ambientais geradas após a II guerra mundial criaram um
cenário propício à propagação de doenças transmitidas por mosquitos e esse
contexto deu início a uma pandemia global do Dengue. Até 1997, o vírus já
havia alcançado uma ampla distribuição no mundo e atualmente estima-se a
ocorrência de 50-100 milhões de casos por ano em regiões tropicais e
subtropicais, dentre os quais 500.000 resultam em febre hemorrágica e choque
do Dengue, com mais de 20.000 mortes (GUZMAN & KOURI, 2003)
O vírus do Dengue apresenta quatro sorotipos conhecidos como DENV-1,
DENV-2, DENV-3 e DENV-4 (BLOK, 1985), que embora sejam considerados
2
tipos sorológicos de um mesmo vírus, geralmente são designados como
espécies diferentes que são antigenicamente relacionadas (KURANE, 2007).
A relação sorológica entre o vírus do Dengue e outros Flavivirus foi
demonstrada por Sabin (1950), que observou a existência de reações
sorológicas cruzadas entre soro humano com anticorpos contra Dengue e
antígenos do vírus de Febre Amarela, Encefalite Japonesa e West Nile virus.
O compartilhamento de epítopos comuns, presentes na proteína do envelope
desses vírus, ocasiona que os testes sorológicos feitos para diagnosticar a
doença sejam positivos para diferentes vírus da mesma família (GUBLER,
1998).
A infecção com um dos sorotipos apresenta manifestações clínicas
restritas, cujos sintomas são brandos e na maioria dos casos não são
facilmente distinguidas de outras infecções virais (SETIATI et al., 2007).
Essa primeira exposição a um dos sorotipos não é capaz de conferir
imunidade contra a doença, podendo o indivíduo ser reinfectado por um
diferente sorotipo do vírus e durante a infecção secundária desenvolver um
quadro ainda mais grave. Temos como exemplo, registros de que a co-
circulação dos sorotipos 1, 2 e 3 tem sido apontada como a causa do aumento
das formas severas da doença no Brasil (GUZMAN et al., 1991).
O contexto atual aponta que a existência dessas variações sorológicas do
vírus constitui-se na maior dificuldade para o desenvolvimento de uma vacina
contra o vírus do Dengue, cuja eficiência é restrita a um caráter tetravalente
(WHITEHEAD et al., 2007). Tentativas recentemente direcionadas ao
combate da doença, utilizando proteínas como elicitores da resposta imune do
hospedeiro, não obtiveram o resultado estimado, devido ao fenômeno
3
conhecido pelo aumento da infecção dependente de anticorpos, que além dos
efeitos desejáveis também induziram a produção de anticorpos não-
neutralizantes, aumentando o surgimento de febre hemorrágica como um
efeito de infecção secundária (COSTA et al., 2007). Portanto, até os dias
atuais, as medidas de controle e prevenção da doença permanecem focadas no
agente transmissor Aedes aegypti, evidenciando a necessidade de
desenvolvimento de novas estratégias contra o vírus e tratamento da doença.
Dengue no Brasil
O histórico do Dengue no Brasil teve início em 1846, com os primeiros
registros de surtos do Dengue ocorridos na cidade do Rio de Janeiro. O país
permaneceu livre do vetor Ae. aegypti até 1976 através de um programa de
erradicação contra Febre Amarela (RIGAU-PÉREZ et al., 1998). Contudo, as
áreas urbanas sofreram uma reinfestação do vetor nos anos 80, resultando
numa explosão da doença, segundo a Organização Pan-americana de Saúde
(Figura 1).
4
Figura 1: Quadro da evolução do Dengue no período de 1980-2007 (Organização
Pan Americana de Saúde, 2007).
Observa-se que a doença tornou-se um problema de saúde pública com a
introdução do sorotipo DENV-1 em 1986, DENV-2 em 1990 e DENV-3 em
2000, registrados na região sudeste
(MIAGOSTOVICH
et al., 2002). Em 2003, o
vírus foi isolado em 16% dos casos analisados e os levantamentos estatísticos
feitos pela Organização Pan-americana de Saúde (OPAS), indicavam que no
Brasil estava estabelecida a predominância do sorotipo DENV-3,
representando 76,8% dos casos, seguido por DENV-1 (17,4%) e DENV-2
(5,8%). Atualmente, o Brasil permanece livre do sorotipo DENV-4 (Figura 2),
mas os riscos de uma repentina introdução tornam-se cada vez maiores,
devido ao índice de turismo no país e a existência de uma frágil fronteira com
locais onde já predomina a circulação dos quatro sorotipos.
5
Figura 2: Mapa ilustrando a co-circulação dos sorotipos do Dengue entre os países
de maior incidência da doença no período de 2006-2007 (Organização Pan
Americana de Saúde).
O Brasil tem sido apontado como o país de maior índice de casos da
doença entre os países da América do Sul (Figura 3). Em 2007, foram
reportados 76.626 casos do Dengue na região que compreende a Bolívia,
Colômbia, Equador, Peru e Venezuela. Dentre esses casos, 5.821 foram
identificados como Dengue hemorrágica e houve um registro de 25 mortes.
Contudo a região do cone Sul (Argentina, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai) é
responsável por 63% dos casos de morte pelo Dengue, com 94% dos casos
concentrados no Brasil, onde foi registrado no ano de 2007, um aumento de
6
136.488 casos comparado a 2006 (Dados fornecidos pela Organização
Mundial de Saúde, 2008).
Figura 3: Número de casos de Dengue registrado entre os países do Cone Sul, em
2007 (OPAS, 2008).
7
Dengue
A transmissão da doença é dada quando a fêmea da espécie Aedes aegypti
alimenta-se do sangue de um indivíduo infectado, tornando-se hospedeira
intermediária do vírus, o qual se replica no seu mesentério e depois se espalha
para outros órgãos até alcançar as glândulas salivares. Então, o vírus passa a
ser transmitido através da saliva, enquanto a fêmea alimenta-se do sangue de
um novo hospedeiro (BANCROFT, 1906).
A infecção causada pelo vírus do Dengue pode ser assintomática, mas
costuma ser conhecida por manifestações de febre, dores de cabeça, dor retro-
orbital, mialgia, leucopenia e dores nas articulações. Esses sintomas
costumam aparecer no indivíduo infectado após um período de incubação de
2-7 dias e normalmente a recuperação é alcançada uma semana após essas
manifestações. Ainda que a maioria dos casos não represente um grande risco
para população, alguns pacientes desenvolvem a forma severa da doença,
conhecida como Febre Hemorrágica do Dengue (FHD). Podendo evoluir para
Síndrome de Choque do Dengue que é capaz de levar um indivíduo a morte
em 24 horas (Organização Mundial de Saúde, 1997).
A Febre Hemorrágica é caracterizada por um quadro de febre aguda,
tendências hemorrágicas seguidas de perda de plasma, devido ao aumento da
permeabilidade vascular que também pode acarretar em efusão pleural,
ascites, hipoproteinemia e aumento do hematócrito. Quando o quadro descrito
evolui para o choque, todos os sintomas são mantidos além de uma grave
hipotensão, levando a falência circulatória (GUBLER, 1998).
Duas teorias têm sido apontadas como explicação para o surgimento de
manifestações severas do Dengue. Uma destaca a existência de cepas
8
virulentas causando Febre do Dengue e cepas avirulentas provocando Febre
Hemorrágica (COLOGNA et al., 2005), outra, considera a própria resposta
imune do hospedeiro como o agente intensificador da infecção. Foi reportada
por Mady (1991), a formação de um complexo vírus-anticorpo não
neutralizante, que se liga a receptores celulares aumentando a infecção
causada pelo vírus do Dengue. Esse fenômeno é conhecido como Aumento
Dependente de Anticorpo, ocorrendo durante uma infecção secundária.
Devido ao caráter infeccioso e a ampla disseminação anteriormente
citada, Dengue já havia sido considerada a mais importante doença viral
transmitida por artrópodes desde 1928, quando 650.000 moradores de Atenas
contraíram Febre do Dengue e 1061 pessoas foram mortas pelo agente
causador da doença (HALSTEAD & PAPAEVANGELOU, 1980)
Vírus do Dengue
O agente causal do Dengue é um vírus da família Flaviviridae e tal
como outros Flavivirus, são pequenas partículas (50 nm em diâmetro)
envelopadas, contendo o genoma de fita simples positiva de RNA com
aproximadamente 11 Kb (HAHN et al., 1988). Esse genoma codifica uma
poliproteína precursora com cerca de 3.000 aminoácidos, que é processada
durante e após a tradução por proteases virais, gerando as proteínas
estruturais e não estruturais do vírus (Figura 5). Como característica
usualmente encontrada em Flavivirus, essa poliproteína está contida em um
único quadro de leitura aberta (ORF), codificando as proteínas estruturais do
9
capisídio (C), premembrana (prM) e envelope (E), formadoras do vírion
(Figura 4), além de sete proteínas não-estruturais, NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4A, NS4B e NS5 (Rice et al., 1985).
Figura 4: Vírion do Dengue. (Fonte:Vírus Taxonomy, 2005). A- Esquema do virion
maduro e imaturo: E- Envelope, prM- pré-Membrana, C- Capsídeo, M- Membrana;
B- Imagem da superfície do vírus.
A glicoproteína E, presente na superfície do vírus media a fusão celular, apresentando
três domínios: o domínio central, o domínio de dimerização e o domnio de ligação, citado por
Hung
(1999)
O vírion entra na célula por endocitose mediada por receptor, processo no qual o
domínio de ligação da proteína E atua efetivamente. Dentro da vesícula endossomal,
mudanças conformacionais do vírion induzidas por pH, fusão entre a membrana do vírus e da
célula hospedeira e dissociação de partículas virais ocorrem dando início ao ciclo de vida do
vírus
dentro célula. O genoma é liberado no citoplasma, contudo a replicação ocorre dentro de
uma membrana intracelular. Após a replicação, ocorre reunião das partículas virais na
superfície do Retículo Endoplasmático (RE) e as partículas virais imaturas são conduzidas do
A
B
10
RE através do Golgi, onde é promovida a maturação por clivagem de furinas do hospedeiro e
logo após a maturação, o vírion é liberado por exocitose
(MUKHOPADHYAY
et al
., 2005)
.
A importância de proteínas não-
estruturais do vírus
Proteínas não-estruturais de Flavivirus são conhecidas por desempenhar
papéis importantes na replicação do vírus e por serem determinantes de
patogenicidade. A atividade de polimerase, realizada por proteínas não
estruturais, foi detectada pela primeira vez em Flavivirus pelos pesquisadores
Chu e Westaway (1985), que observaram sua existência na membrana
perinuclear do Retículo Endoplasmático, onde foram co-localizadas NS3 e
NS5 (CHAMBERS et al., 1990). Estudos feitos com antisoro de coelho para
essas proteínas foram capazes de inibir a atividade da polimerase,
confirmando que essas proteínas estão envolvidas na replicação de RNA
(BARTHOLOMEUSZ & WRIGHT, 1993).
NS5 é a maior proteína codificada pelo genoma do Dengue virus,
possuindo 104 kDa, com a região amino terminal apresentando similaridade
com metiltransferases de inúmeras espécies e oito motivos conservados
encontrados em muitas RNA polimerases dependentes de RNA (RdRP). A
proteína NS5 foi encontrada formando um complexo com NS3 em células de
macaco infectadas com DENV-2 (KAPOOR et al., 1995).
A proteína NS3 é a segunda maior proteína encontrada em Flavivirus
com cerca de 70 kDa, apresenta 1/3 da porção N-terminal com características
de protease cuja atividade requer a presença da proteína NS2B, atuando como
11
um co-fator para a clivagem das junções NS2A-NS2B, NS2B-NS3, NS3-NS4A
e NS4B-NS5 da poliproteína (Figura 5). A porção restante de NS3 forma um
domínio helicase que age em conjunto NS5, durante a polimerização
(JOHANSSON et al., 2001).
Figura 5: Estrutura esquemática do genoma do vírus do dengue. (Fonte: Vírus
Taxonomy, 2005).
Proteínas estruturais: Capsídeo, Membrana, Envelope
Proteínas não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5
12
Estudos realizados na FIOCRUZ do Rio de Janeiro demonstraram que a
proteína NS1 também está envolvida na replicação do vírus, através da
construção de um DNA complementar infeccioso, que continha mutações em
regiões conservadas de NS1 (SUZUKI et al., 2007). Quando essa proteína
mutante foi introduzida em células Vero, resultou na redução da replicação do
RNA. A presença dessa proteína em altos níveis no soro de pacientes tem sido
correlacionada com a severidade da doença em casos de infecções pelo DENV
(ALCON et al., 2002). Além do seu envolvimento na replicação, muitos
estudos têm relatado que NS1 é uma proteína secretada, encontrada em
células de mamíferos associada à membrana e na circulação (SCHLESINGER
et al., 1987). Por ser secretada, NS1 entra em contato com células de defesa
circulantes e é alvo da resposta imune promovida pelo hospedeiro.
Considerando essa afirmativa, anticorpos produzidos contra NS1 foram
analisados e demonstraram conferir proteção contra doenças induzidas por
Flavivirus e foram usadas profilaticamente e terapeuticamente em modelo
animal (FALGOUT et al., 1990).
Pequenas proteínas hidrofóbicas compõem a parte restante do genoma,
essas proteínas são NS2A, NS2B, NS4A e NS4B. As funções dessas proteínas
ainda não estão bem elucidadas, mas alguns esforços têm sido feitos
identificando o envolvimento delas na formação do complexo de replicação ou
atuando como co-fatores. O processamento eficiente da proteína NS1 requer a
participação de NS2A e análises mutacionais indicaram que a própria NS2A
apresenta atividade proteolítica (FALGOUT et al., 1989). Ambas, NS2A e
NS4A foram localizadas dentro de uma vesícula, formando um suposto
complexo de replicação com NS3 e NS5 (MACKENZIE et al., 1998).
13
Muitas funções como as que foram aqui destacadas têm sido atribuídas às
proteínas não estruturais, contudo ainda existem inúmeras perguntas que
encontraram lugar no cenário das pesquisas realizadas nos últimos anos. Um
desses questionamentos está centrado no envolvimento de proteínas não
estruturais em mecanismos contra defesa antivirais.
O comportamento dos vírus e seu caráter de virulência têm sido alvos de
pesquisa desde as primeiras manifestações infecciosas e têm sido bem
descrito através de estudos utilizando patógenos de plantas (REAVY et al.,
2004). Um exemplo bem-sucedido na utilização de sistemas de plantas para
avaliação da indução e supressão do silenciamento de RNA por vírus que
infectam células humanas foi descrito recentemente, utilizando uma proteína
não estrutural do vírus da influenza humana. Comparado aos padrões de
supressão do silenciamento de genes encontrados em vírus de plantas, a
proteína NS1 da influenza humana apresentou capacidade de proteger RNA
viral contra degradação e aumentar significativamente a expressão de
proteínas cujo gene havia sido suprimido (BUCHER et al., 2004). A
viabilidade desses estudos rendeu, nos últimos tempos, grande esclarecimento
quanto aos mecanismos de defesa e escape, como uma das maiores expressões
da co-evolução estabelecida entre vírus e hospedeiro (PRUSS et al., 1997).
Muitos outros estudos feitos com proteínas não-estruturais têm
consolidado a idéia de que além das funções relacionadas à virulência, essas
proteínas podem fazer parte do mecanismo de escape dos vírus contra
estratégias de defesa do hospedeiro (BRIGNETI et al., 1998). Portanto,
considerando o caráter essencial de cada uma delas para a sobrevivência do
vírus, tem sido proposto que elas podem funcionar como alvos no
14
desenvolvimento de novos medicamentos e a identificação de atividade
supressora de silenciamento de genes oferecem possibilidades, ainda mais
relevantes no tratamento à doença causada pelo vírus do Dengue.
Silenciamento d
e genes
RNA interferente é um mecanismo que atua na indução do silenciamento
de genes. Foi descrito originalmente em plantas e designado como co-
supressão (NAPOLI et al., 1990) e depois como silenciamento pós-
transcricional de genes, em animais, conhecido como interferência de RNA
mediada por uma dupla fita de RNA. Foi observado em fungos e nematóides,
quando seqüências de oligonucleotídeos foram inseridas em células resultando
na redução da expressão de genes (FIRE et al., 1998).
Em experimentos de super expressão de genes de Chalcona sintase,
relacionados à síntese de pigmentos, pela primeira vez foi observado o
fenômeno de silenciamento mediado por RNA, resultando na hipopigmentação
de petúnias. Surpreendentemente, a introdução desses genes em plantas
pigmentadas levou ao bloqueio da síntese de antocianina e esse fenômeno foi
relacionado aos níveis de mRNA que demonstraram ser 50 vezes menores nas
plantas sem pigmentos comparadas ao tipo selvagem (NAPOLI et al., 1990).
Fire e colaboradores (1998) descobriram que a introdução de uma dupla
fita de RNA dentro de Caenorhabditis elegans, diferente de injeções contendo
uma fita simples de RNA, levava a degradação de mRNA homólogos. Os
15
efeitos de manipulação da expressão nesses experimentos não foram
observados apenas nos animais injetados, mas também na sua progênie.
Esses primeiros estudos revolucionaram a pesquisa devido a
possibilidade de manipulação do controle da expressão gênica pela introdução
de uma seqüência nucleotídica exógena e após a descoberta desse fenômeno
em plantas, Tuschl e coloboradores (1999) mostraram que RNAi também
ocorre em mamíferos, corroborando com a idéia de conservação desse
mecanismo em células eucarióticas (ELBASHIR et al., 2001).
Tem sido afirmado que a interferência de RNA é usada naturalmente
como forma de imunidade primitiva para proteger o genoma contra invasões
de ácidos nucléicos exógenos, introduzidos por vírus ou retrotransposons. A
maior evidência de que o silenciamento mediado por RNA é um mecanismo
natural de defesa contra vírus, reside no fato de que mutações em genes que
codificam componentes dessa maquinaria resultam em aumento da
susceptibilidade ao vírus (GITLING & ANDINO, 2003).
Além do papel antiviral, diversas funções têm sido apontadas como
conseqüência do silenciamento de RNA em muitos organismos. Isso inclui a
defesa do genoma contra transposons (VOINNET, 2002) estabilidade do
genoma por regulação da formação de heterocromatina (HAMILTON et al.,
2002), controle do desenvolvimento em plantas e animais, e baixa regulação
da expressão de genes por clivagem específica e repressão traducional de
RNAs mensageiros complementares por pequenos e micro RNAs (LI & DING,
2005).
Na busca pela elucidação de como o RNA interferente atua, foi
descoberta a participação de uma dupla fita de RNA como guia na destruição
16
das seqüências exógenas (Figura 6), iniciando um processo de degradação de
RNA mensageiro com seqüência específica (TUSCHL et al., 1999). A dupla
fita de RNA é clivada, em seqüências que variam entre 21-24 nucleotídeos,
por uma RNase chamada Dicer (KETTING et al., 2001). Esses pequenos
RNAs são incorporados dentro de um complexo efetor do silenciamento
chamado RISC e guiam a maquinaria em direção a seqüências complementares
a fim de promover a supressão (ZAMORE et al., 2000).
Tem sido proposto para invertebrados que esses pequenos RNAs
(siRNAs) funcionem como primers, sendo estendidos ao longo do RNA alvo
por uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), contudo isso não foi
observado em animais (LIPARDI et al., 2001). A presença da RNA
polimerase evidencia uma das formas existente para formação da dupla fita de
RNA que inicia a maquinaria do silenciamento. Outro caminho é trilhado por
vírus de RNA em sua fase replicativa, onde uma dupla fita de RNA também é
formada e é proposto para vírus de DNA que uma transcrição bidirecional do
seu genoma seja feita para gerar a dupla fita (COLBY et al., 1971).
17
Figura 6: Esquema do processo de silenciamento mediado por RNA. A dupla fita de
RNA (dsRNA) é degrada pela ribonuclease DICER, gerando pequenos RNAs
(siRNAs) que são incorporados no complexo enzimático RISC, podendo ser
utilizados como primer pela RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). Adaptado
de Gitlin e Andino (2003).
Replicação
viral
Transposon
RNAs
Ab
errantes
DICER
RISC
dsRNA
siRNA
Degradação
RdRp
18
Além da conservação do mecanismo observada em muitos organismos, o
esclarecimento de como se dá o processo de silenciamento utilizando sistemas
de plantas, tem favorecido novas aplicações biotecnológicas. Utilizando esses
recursos, vírus que infectam plantas têm sido muito bem estudados e grande
parte tem apresentado capacidade de recrutar os componentes do
silenciamento de genes em seus hospedeiros (ROTH et al., 2004). Contudo,
atualmente vírus que infectam outros organismos, além das plantas, têm sido
testados quanto à capacidade de indução e supressão desse mecanismo
(BUCHER et al., 2004).
Como resultado desse novo direcionamento, foi demonstrado que é
possível inibir a produção do vírus do Dengue por transfecção de uma dupla
fita de RNA em células do vetor (CAPLEN et al., 2001). Tem sido até mesmo
proposta uma nova estratégia baseada em silenciamento de RNA para o
controle da transmissão da doença por Aedes aegypti, visto que a interferência
mediada pelo RNA pode servir como mecanismo de resistência em células do
mosquito (ADELMAN et al., 2002). Além disso, a transdução das fêmeas de
Aedes aegypti com um vetor de expressão contendo a seqüência de uma
proteína do vírus do Dengue, conteve a replicação do vírus na glândula
salivar, tornando a fêmea incompetente para a transmissão do vírus
(TRAVANTY et al., 2004). Todos esses avanços têm sugerido que o
silenciamento mediado por RNA é um processo que pode ser naturalmente
induzido, mas não prevalente devido à existência de um possível mecanismo
de escape.
19
Supressores do silenciamento de genes
Muitos supressores de interferência de RNA têm sido identificados em
resposta a estratégias de defesa de plantas infectadas por vírus. A primeira
proteína a apresentar capacidade de suprimir o silenciamento mediado por
RNA foi uma proteinase (Hc-Pro) de Potyvirus, essa proteína demonstrou
capacidade de reversão do silenciamento de genes já estabelecido no
hospedeiro (BRIGNETI et al., 1998).
A proteína 2b de Cucumber mosaic virus também foi encontrada
assumindo atividades supressoras do silenciamento e constitui-se num dos
exemplos mais estudados desse mecanismo. Diferente da proteína Hc-Pro, 2b
promove a inibição de etapas iniciais do silenciamento e não se demonstrou
capaz de suprimir etapas já estabelecidas do processo, evidenciando que
supressores podem assumir caminhos distintos para bloquear a interferência
de RNA (BRIGNETI et al., 1998).
Alguns supressores reduzem o acúmulo de pequenos RNAs interferentes
(siRNAs), sugerindo que a supressão ocorre durante o processamento da dupla
fita de RNA pela enzima Dicer (BUCHER et al., 2003). Outras proteínas não
interferem no acúmulo de siRNAs, mas interceptam sua incorporação no
complexo enzimático RISC, bloqueando uma etapa distinta do processo
(LAKATOS et al., 2004).
Inicialmente, dois grupos de supressores foram identificados. Aqueles
que degradam um componente requerido para a manutenção do silenciamento,
afetando folhas novas e velhas. Enquanto, aqueles que bloqueiam a síntese
20
e/ou a ativação do componente requerido para o silenciamento, são restritos
as folhas novas (VOINNET et al., 1999).
A existência de um mecanismo de supressão do silenciamento de genes
tem sido bem elucidada, utilizando vírus que infectam plantas como modelo
experimental. Contudo já tem sido feita a aplicação desse mesmo modelo na
busca de supressores produzidos por vírus que infectam humanos. O vírus da
influenza humana foi recentemente testado quanto à existência de atividade
supressora pela proteína não-estrutural NS1 (BUCHER et al., 2004) os
resultados positivos desses estudos abriram caminho para novos
questionamentos, gerando a necessidade de novos testes capazes de identificar
o potencial de supressão em proteínas de outros vírus.
Consistente com a hipótese de que determinantes de patogenicidade são
candidatos a supressores, diversas proteínas foram encontradas exercendo
papéis de supressão no silenciamento e atuando como fatores essenciais na
patogênese (Tabela 1). Alguns mecanismos só foram esclarecidos através da
manipulação de determinadas proteínas, apontando pelo menos três supostos
caminhos pelos quais esses supressores têm interferido no silenciamento
(Figura 7).
21
Figura 7: As proteínas HCpro de Potivirus, NSs de Tospovirus NS3 de Tenuivirus e
p19 de Tombusvirus ilustram os três possíveis caminhos utilizados por supressores
de silenciamento: Inativação de DICER, degradação de pequenos RNAs (siRNAs) e
bloqueio de sua incorporação no complexo enzimático RISC.(Cedido e autorizado
por Marcel Prins)
22
Através do estudo de função da proteína p19 de tombusvirus foi proposto
que o silenciamento suprimido durante a infecção com esses vírus, é efetuado
pela ligação da proteína p19 a dupla fita de siRNA, impedindo que esta seja
incorporada ao complexo enzimático RISC (SILHAVY et al., 2002). Durante
a infecção com tombusvirus, as folhas superiores são completamente
invadidas por este, indicando que o seqüestramento de siRNAs previne o
desenvolvimento do silenciamento sistêmico, atuando como o próprio sinal
móvel (LAKATOS et al., 2004). É possível que esse sinal seja gerado pela
RNA polimerase dependente de RNA, sendo guiada pelos siRNAs ao
silencimento de RNAs e dessa forma a depleção de siRNAs por p19 resulta
na inativação da geração do sinal (VOINNET, 2001).
Supressão de silenciamento por alguns vírus de mamíferos foi
primariamente demonstrada com a descoberta das proteínas supressoras B2
Flock House virus, NS1 de Influenza virus, e E3L de Vaccinia virus, testadas
em sistemas heterólogos como células de insetos e plantas. Todos esses
supressores demonstraram ser requeridos para a infecção do vírus nas células
de mamíferos e alguns deles também são conhecidos por funcionar no
hospedeiro como inibidores da imunidade antiviral inata regulada por
interferon (GARCIA et al., 2002).
Concomitante com as evidências de que existe uma estratégia de defesa
consistente na presença de supressores, alguns vírus demonstraram ter
desenvolvido outros caminhos, como evitar o silenciamento executando a
replicação dentro de vesículas no Retículo Endoplasmático. Dessa forma a
dupla fita de RNA é protegida do processo de clivagem pela ribonuclease
DICER (SCHWARTZ et al., 2002).
23
A neutralização desse mecanismo de escape tem sido considerada um
alvo promissor para o desenvolvimento de novos controles para vírus
(DYKXHOORN & LIEBERMAN, 2005). Além do esclarecimento da
dinâmica do vírus frente ao silenciamento, o qual tem sido provado estar
presente tanto em humanos, quanto nos artrópodes (FRANZ et al., 2006;
GITLING & ANDINO, 2003).
24
Tabela 1. Proteínas supressoras de RNA interferente identificadas em
diferentes gêneros de vírus. Adaptada de Li e Ding (2006).
Gênero
Nome
Proteína
Atividade
RNA viral de fita positiva em animais
Aureusvirus
Porthos latent virus
P14
Ligante de RNA
dupla fita
Carmovirus
Turnip crinkle virus
CP
Não Determinada
Closteovirus
Beet yellows virus
Citrus tristeza virus
P21
P20, P23, CP
Ligante d
e RNA
dupla fita
Crinivirus
Grapevine leafroll
-
associated virus 2
Beet yellow stunt
vírus
Sweet potato
chlorotic stunt virus
P24
P22
P22, RNase3
Não Determinada
Comovirus
Cowpea mosaic
virus
CP
Não Determinada
Cucumovirus
Cucumber mosaic
virus
To
mato aspermy
virus
2b
Ligante de RNA
dupla fita
Furovirus
Soil
-
borne wheat
mosaic virus
19k
Não Determinada
Hordeivirus
Barley stripe mosaic
virus
b
Não Determinada
Pecluvirus
Peanut clump virus
P15
Não Determinada
Polerovirus
Beet western yellow
virus
Cucurbit aphid
-
born
yellows virus
P0
Não Determinada
Potexvirus
Potato virus X
P25
Não Determinada
Potyvirus
Tobacco etch vírus
Potato virus Y
Turnip mosaic vírus
HcPro
Não Determinada
Sobemovirus
Rice yellow mottle
virus
P1
Não Determinada
Tobamovirus
Tobacco mosaic
viruses
Tomato mosaic
viruses
P130
Não Determinada
Tobravirus
Tobacco ratlle virus
16K
Não Determinada
Tombusvirus
Tomato busby
stunt
vírus
Cymbidium ringspot
virus
P19
Não Determinada
25
Tymovirus
Turnip yellow
mosaic virus
P69
Não Determinada
Vitiviruses
Grapevine vírus A
P10
Não Determinada
RNA viral de fita negativa em plantas
Tenuivirus
Rice hoja blanca
vírus
NS3
Não Dete
rminada
Tospovirus
Tomato spotted wilt
vírus
NSs
Não Determinada
Dupla fita de RNA viral em plantas
Phytoreovirus
Rice dwar virus
Pns10
Não Determinada
Virus de DNA em plantas
Begomovirus
Curtovirus
Tomato leaf curl
virus
Tomato yellow leaf
curl virus
Mungbean yellow
mosaic virus
Tomato golden
musaic virus
Beet curly top virus
C2
C1
AC2
AC4
L2
Ligante de DNA
Ligante de DNA
Ligante de DNA
Ligante de miRNA
Ligante de Proteína
Fita positiva de virus de RNA em animais
Nodavirus
Flock house virus,
Nodamura virus,
Stripd Jack nervous
nerosis virus,Greasy
grouper ne rvous
necrosis virus
B2
Ligante de RNA
dupla fita
Fita negativa de vírus de RNA em animais
Orthomyxovirus
Infuenza virus A
NS1
Ligante de RNA
dupla fita
Orthobunyavirus
La Crosse virus
NSs
Não Determinada
Dupla fita de de Rna em animais
Orthoreovir
us
3
Ligante de RNA
dupla fita
Retrovirus em animais
Lentivirus
HIV
-1
Tat
Não Determinada
Spumavirus
PFV
-1
Tas
Não Determinada
Vírus de DNA em animais
Adenovirus
Adenovius
VA1 RNA
Ligante de Dicer
Poxvirus
Vaccinia virus
E3L
Ligante de RNA
dupla fita
26
Expressão de proteínas
O sistema procariótico é um sistema amplamente utilizado para produção de proteínas
heterólogas, possuindo algumas vantagens como o requerimento de uma fonte de baixo custo
de carbono e uma rápida acumulação de biomassa por cult
ura
(SAHDEV
et al., 2008).
Esse
sistema dispõe de grande quantidade de cepas comercializadas, apresentando diferentes
vantagens e aplicabilidades segundo o interesse em produção de proteínas recombina
ntes.
Um
exemplo dessa diversidade é a bactéria Escherichia coli BL21, uma cepa não patogênica
capaz de crescer vigorosamente em meio mínimo e deficiente em proteases capazes de
interferir no isolamento de proteínas recombinantes intactas
(CHART
et al.
, 2000)
.
Diferentes
padrões de fusão são utilizados para facilitar a purificação de
ssas
proteínas expressas,
sendo
comum a inserção de caudas
de
histidina (His-tag) para cromatografia de afinidade a níquel
ou purificação em resina baseado em glutationa, para proteínas fusionadas com caudas de
glutationa S
-
transferase (GST)
(TERPE, 2003)
.
A expressão de proteínas em sistemas heterólogos possui diversos atributos e a
finalidade de gerar anticorpos tornou-se uma das resultantes desse processo após uma intensa
busca para disponibilização de ferramentas terapêuticas, em alguns casos culminando no
desenvolvimento de vacinas. Recentemente, o domínio III da proteína E do sorotipo 2 do
DENV, que representa um alvo promissor para o desenvolvimento de vacinas devido a sua
capacidade de elicitar anticorpos neutralizantes e papel de interação com a célula hospedeira,
foi expressa em Escherichia coli BL21. A forma purificada da proteína expressa foi
empregada na imunização de camundongos, resultando na indução de anticorpos e proteção
de camundongos desafiados com o sorotipo 2 do DENV
(ZHANG
et al
., 2007)
Um resultado semelhante foi obtido mediante a imunização de coelhos com uma
proteína não estrutural de vírus sincicial respiratório humano, ligada a uma cauda de poli
27
histidina. Foi observada a geração de um anti-soro específico que reconhece a proteína não
estrutural de células infectadas com o vírus. Mais de 1mg de proteína purificada pôde ser
isolado de 1L de cultura de E. coli com mais de 98% de pureza
(LING
et al., 2008). Pode
então ser observado que embora a produção de anticorpos possa ser feita em células de
mamíferos, outros sistemas são preferidos, podendo oferecer um alto rendimento do produto
em baixo custo comparado a culturas de células de mamíferos (CHADD & CHAMOW,
2001)
.
28
JUSTIFICATIVA
O desenvolvimento de novas estratégias de controle capazes de promover
a prevenção e contenção da severidade da doença provocada pelo vírus do
Dengue, ainda é um desafio, considerando os altos índices de morbidade e
mortalidade provocados pelo vírus. Proteínas não-estruturais são conhecidas
por seu papel determinante da patogenicidade e sua importância na replicação
do vírus dentro da célula hospedeira. Esse caráter faz com que essas proteínas
sejam possíveis alvos para o desenvolvimento de antivirais, tendo essa visão
reforçada pelo conhecimento de que algumas proteínas virais atuam como
supressores do silenciamento mediado por RNA, mecanismo conhecido por
desempenhar um papel natural de defesa contra vírus de RNA.
O mecanismo de interferência de RNA observado em plantas demonstrou
ser conservado em mamíferos e já foi observada a indução de silenciamento
de genes em células do vetor Ae. albopictus, corroborando com os indícios de
que esse mecanismo pode ocorrer naturalmente durante uma infecção
provocada pelo Flavivirus. Algumas proteínas produzidas por vírus que
infectam humanos foram identificadas como supressores de RNA interferente,
contudo ainda não foi determinado o papel das proteínas não-estruturais do
vírus do Dengue como supressores do silenciamento de genes.
Visando a oportuna neutralização do mecanismo de escape do vírus,
favorecida pela estratégia de interferência de RNA, esse trabalho propõe a
identificação de proteínas não-estruturais como possíveis supressores do
silenciamento de genes, bem como a expressão de proteínas do Dengue
utilizando o sistema procariótico de expressão, com a finalidade de promover
o estudo de função e futura produção de anticorpos.
29
OBJETIVO GERAL
Estudos recentes têm identificado que vírus de RNA fita simples positiva
produzem proteínas supressoras do silenciamento mediado por RNA, contudo,
ainda não foi identificada a existência desses supressores no genoma do vírus
do Dengue.
Esse trabalho propõe-se a expressar proteínas do Dengue em sistema de
bactéria e de plantas, investigando o papel das proteínas não-estruturais como
agentes supressores de interferência de RNA e identificando o possível gene
candidato ao conhecido mecanismo de supressão.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Clonar sete genes (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) de
proteínas não estruturais do vírus do Dengue em vetor de expressão em
plantas;
Testar a expressão das proteínas não-estruturais em plantas;
Monitorar o efeito de supressão de genes em plantas expressando
proteínas não-estruturais do vírus do Dengue;
Expressar a proteína NS2A utilizando Escherichia coli
30
MATERIAL E MÉTODOS
Clonagem de cDNA de genes do
vírus da Dengue
Extração de RNA
viral
O RNA foi extraído de células C6/36 de Aedes albopictus infectadas com o vírus do
Dengue sorotipo1 (Figura 8), autóctone do Distrito Federal (Isolado HUB 01021093), sendo
utilizado como molde para síntese de um DNA complementar através de transcrição reversa
.
As amostras foram preparadas n
o Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal
.
Figura 8: Células C6/36 de Aedes albopictus infectadas com vírus do Dengue
Uma alíquota de 125 L de células infectadas com o vírus do Dengue em meio de
cultura
foi transferida para um microtubo de 1,5 ml contendo 375 L de Trizol LS, onde o
volume foi homogeneizado e o RNA total foi extraído, seguindo as instruções do fabricante
(Invi
trogen)
.
Após a secagem da amostra na etapa final, o
pellet
foi ressuspendido em 20 L
de água
destilada e deionizada
Milli
-
Q.
31
Amplificação de genes candidatos a supressores de RNAi
Os fragmentos não-estruturais do vírus foram amplificados através de
transcrição
reversa e reação em cadeia da polimerase. A transcrição reversa foi feita com o auxílio da
Transcriptase Reversa SuperScript III (Invitrogen) por 1 hora à 42°C em condições livre de
RNase, seguindo as instruções do fabricante
.
Foram construídos primers específicos para regiões não estruturais de interesse no
genoma do vírus, com os quais foram feitas amplificações dos fragmentos NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5, a partir do cDNA resultante da transcrição reversa e a
confirmação do tamanho
dos fragmentos feita por eletroforese em gel de agarose 1%, segundo
o protocolo descrito por Sambrook e colaboradores
(1989)
. Foi inserida uma cauda de
pepitídeo de hexa-
histidina
nas seqüências de primers utilizados para amplificar cada gene
correspondente as proteínas não estruturais do vírus (Tabela 2), com a finalidade de favorece
r
a recuperação de cada uma delas após a introdução nas plantas.
32
Tabela 2: Primers para amplificação de genes que codificam as
proteínas não estruturais do Dengue.
Primers Reverse Primers Forward
NS1 Rev (SacI)
5 GGG GAG CTC TTA ATG ATG
ATG ATG ATG ATG TGC AGA GAC
CAT TGA CCT AAC T 3
NS1 For (NotI)
5 CAA AAA GGG CGG CCG ACT
GGA CTC GGG ATG TGT AAT
CAAA CT 3
NS2A Rev ( SacI)
5 CCC GAG CTC TTA ATG ATG
ATG ATG ATG ATG ATG TTT Y CT
TCC CCA GAT TTT GTT T 3
NS2A For (NcoI)
5 GTT GCC ATG GAT GGG GTC
AGG AGA AGT GGA CAG TT 3
NS2B Rev (SacI)
5 CCC GAG CTC TTA ATG ATG
ATG ATG ATG ATG ATG TCT CTG
TTT CTT TTT CTG CCA A 3
NS2B For (NcoI)
5 ACA CCC ATG GAT GAG TTG
GCC CCT CAA TGA AGG AA 3
NS3 Rev (NotI)
5 CAA AAG GGC GGC CGC TTA
ATG ATG ATG ATG ATG ATG TCT
TCT TCC TGC TGC AAA CTC T 3
NS3 For (NcoI)
5 GTT GCC ATG GAT GTC AGG
AGT GTT ATG GGA CAC AC 3
NS4A Rev (SacI)
5 GGG GAG CTC TTA ATG ATG
ATG ATG ATG ATG GGC TGC CAC
TGT CAG TAT CAT GAA 3
NS4A For (NcoI)
5 GTT GCC ATG GAT GAG TGT
CTC AGG TGA CCT AAT AT 3
NS5 Rev (SacI)
5 TAC GAG CTC TTA ATG ATG ATG
ATG ATG ATG CCA GAG TGC CCC TTC
GGG AT 3
NS5 For (NotI)
5 CAA AAA GGG CGG CCG CAT GGG
TAC GGG GGC TCA AGG GGA AA 3
33
A reação em cadeia da polimerase (Tabela 3) foi feita utilizando a
enzima Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen), que
apresenta atividade de auto-correção aumentando em seis vezes a fidelidade
das seqüências amplificadas, comparada à Taq DNA polimerase. Foi utilizado
um programa de 25 ciclos (Figura 9), realizado no termociclador Master
cycler (Eppendorf). O DNA dos produtos amplificados foram eluídos do gel
utilizando-se o kit Quick Gel Extration (Invitrogen), segundo o protocolo
oferecido pelo fabricante e o conteúdo resultante foi submetido a uma etapa
de digestão por enzimas de restrição específicas para cada seqüência
amplificada (Tabela 4).
80ºC 94ºC 94ºC 68°C 68°C
1min 2min 15 seg
50° 1 min 20 min
2 min 4°C
Figura 9: Esquema das etapas para realização da amplificação dos genes candidatos
a supressores de RNA interferente.
25 X
34
Tabela 3. Componentes da solução de PCR para amplificação das
proteínas não-estruturais.
Reagentes
Volume ( L)
Água M
ili
-
Q autoclavada
15,4
Tampão da Enzima 10x
2,5
dNTP 2,5 mM
4,0
Platinun High Fidelity
0,1
Primer Forward
0,5
Primer Reverse
0,5
cDNA
1,0
Total da Reação
25,0
35
Clonagem
dos genes de proteínas não estruturais do Dengue
Dige
stão
de insertos e vetor de clonagem
Os produtos da PCR e o vetor de clonagem pRAPs foram submetidos a uma etapa de
digestão,
na qual cada fragmento amplificado foi digerido com um par de enzimas de
restrição
, de acordo com o sítio de restrição determinado pela seqüência de primers utilizados
na etapa de amplificação (Tabela 4). As enzimas foram utilizadas de acordo com o protocolo
fornecido pela New England Biolabs. Após a digestão, os fragmentos foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 1%
(SAMBROOK
et al., 1989) para confirmar a eficiência de
corte de cada par de enzimas. Tendo produzido fragmentos de tamanhos esperados e tendo
sido confirmados, foram eluídos do gel, utilizando o Purelink DNA Gel extraction kit
(I
nvitrogen), com a finalidade de eliminar os resíduos da digestão.
Tabela 4: Enzimas de restrição utilizadas para digestão dos fragmentos
Gene 5 fosfato 3 hidroxila
NS1
NotI
SacI
NS2A
NcoI
SacI
NS2B
NcoI
SacI
NS3
NcoI
NotI
NS4A
NcoI
SacI
NS4B
NotI
SacI
NS5
NotI
SacI
36
Ligação
dos genes candidatos a atividade supressora em vetor de clonagem
Os fragmentos digeridos foram ligados
com
T4 DNA ligase
(
New England Biolabs
)
ao
vetor de clonagem pRAPs (F
igura
10) que havia sido d
igerido
com as mesmas enzimas
utilizada
s para os insertos (Tabela 4). Portanto, foram feitas sete ligações distintas do vetor a
cada proteína não estrutural com a finalidade de avaliar a função de cada uma delas
separadamente, quando inoculadas na planta. A reação de ligação foi feita segundo o
protocolo oferecido pelo fabricante e a quantidade de inserto e vetor utilizada foi determinada
utilizando uma fórmula que considera o tamanho do vetor e do inserto, resultando na
quantidade
em nano gramas, cuja prop
orção
inserto:
vetor é 3:1. Em cada transformação
utilizou
-
se 100 ng do vetor pRAPs que possui 4107 pb.
Cálculo de proporção inserto: vetor
Quantidade do vetor
(100ng)
X Tamanho do inserto X 3
/1 = Quantidade de inserto (ng
)
Tamanho do vetor (Kb)
37
Figura 10: Mapa genético do vetor pRAPs. 35S- Promotor de cauliflower mosaic
virus, Tnos- Terminador de Nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens, Amp-
gene de resistência à ampicilina. NcoI ,NotI e SacI representam os sítios de
restrição utilizados para clonagem; AscI e PacI são os sítios de restrição utilizados
para a subclonagem em vetor de expressão pBINplus.
4107 pb
pRAPs
38
Transformação de bactérias
E.coli
Tendo sido efetuada a ligação dos genes
candidatos ao vetor pRAPs, essas construções
foram utilizadas separadamente para transformação de bactérias. Para a realização deste
procedimento, fez-se o uso de células de E. coli cepa DH5
competentes para eletroporação.
Estas células foram previamente preparadas seguindo o protocolo de Sambrook e Roussel
(2001)
e estocadas a -
80°C.
O plasmídeo pRAPs ligado ao inserto foi desalinizado em
membrana de nitrocelulose 0,025
m
(Millipore) por 15 minutos.
O eletroporador Bio-Rad Gene Pulser II foi utilizado
na
s
seguintes condições
:
capacitância de 25 F; resistência de 200 ; voltagem de 1.80 K
V.
Foi aliquotado 1 l da
reação de ligação desalinizada em 50 l de células DH5
eletro-
competentes
e após a
eletroporação realizada na curveta (Gene Pulser Curvette (Bio-
Rad)
, foi adicionado 1 ml
de
meio de cultura SOC (Apêndice I), misturado delicadamente e transferido para um
microtubo
estéril. O tubo contendo o meio SOC e células competentes foi incubado com
agitação de 240
rpm por 1 hor
a a
37°C.
As
bactérias foram plaqueadas em meio LB contendo ampicilina (100 g/mL) e
mantidas vertidas em estufa a 37° por
cerca de
12 horas. Este processo foi realizado para cada
uma das construções feitas com as proteínas não-estruturais em vetor pRAPs. Logo, uma
grande quantidade de colônias foi selecionada e submetida a um processo de extração do
DNA plasmidial de acordo com Sambrook & Maniats (1989), para confirmação de suas
seqüências
atrav
és de seqüenciamento automático
(
Perkin Elmer ABI
-modelo 377).
39
S
ubclonagem dos genes correspondentes as
proteínas não
-
estruturais
A etapa de subclonagem foi realizada com as construções obtidas na
clonagem em vetor pRAPs, somente após a confirmação das seqüências feita
por análise do seqüenciamento, com o auxílio do programa Staden Package. A
seqüência consenso determinada pelo programa foi comparada com a
seqüência do genoma do vírus do Dengue, depositada no GenBank do NCBI
(www.ncbi.nih.gov).
Clones de bactérias DH5 transformantes, contendo as proteínas não
estruturais NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 em pRAPs, foram
utilizados e após a confirmação das seqüências clonadas, as construções
foram submetidos a digestão, utilizando as enzimas de restrição AscI e PacI,
cujos sítios de restrição também estão presentes no vetor de expressão
pBINplus (Figura 11). A digestão foi feita utilizando o conteúdo resultante da
extração de DNA plasmidial realizada com as colônias selecionadas após a
clonagem e as condições para utilização das enzimas foram de acordo com o
protocolo oferecido pelo fabricante (New England Biolabs). Após a
confirmação do produto da digestão, conferindo o tamanho das bandas
visualizadas em gel de agarose 1%, os fragmentos gerados pelos genes
clonados contendo parte do vetor pRAPs (1400 pb), foram purificados do gel
utilizando-se o kit Quick Gel Extration (Invitrogen). Posteriormente, os
produtos purificados da digestão foram utilizados para ligação em pBINplus,
isto é, as sete proteínas não estruturais ligadas separadamente a 1400 pb do
vetor pRAPs (Figura 11).
40
A segunda ligação dos genes candidatos a um novo vetor caracteriza o
passo inicial da subclonagem e foi utilizada para transformação de novas
células de E. coli cepa DH5 . Nessa nova etapa de transformação utilizando as
construções em vetor pBINplus foram assumidos os mesmos procedimentos
realizados na etapa de clonagem anteriormente descrita. Contudo, a seleção
das colônias transformadas foi feita com a utilização de placas contendo meio
LB Ágar e canamicina (100 g/mL), pois o vetor pBINplus apresenta gene de
resistência a esse antibiótico.
Figura 11: Mapa genético do vetor de expressão pBIN plus ligado à parte do vertor
pRAPs utilizado para clonagem das proteínas não estruturais. Inserto NS1, Asc I e
PacI representam os sítios de restrição para a subclonagem.
pBINplus
pBINplus
41
Transformação de
Agrobacterium tumefaciens
O DNA plasmidial extraído de colônias selecionadas após a subclonagem, foi enviado
para uma nova confirmação das seqüências através de seqüenciamento automático. Após a
confirmação da presença das sete proteínas não estruturais ligadas separadamente ao vetor de
expressão pBINplus, o produto dessa ligação foi utilizado para a transformação de
Agrobacterium tumefaciens
.
O procedimento utilizado foi semelhante ao anteriormente descrito para transformação
de
E. coli
com algumas modificações nas etapas de crescimento e el
e
troporação. As condições
de eletroporação foram: capacitância de 25 F; resistência de 400 ; voltagem de 1.25KV. O
eletroporador utilizado foi Bio-Rad Gene Pulser II. Foi aliquotado 1 l do DNA plasmidial
extraído das bactérias transformadas pelo vetor de expressão pBINplus, ligado ao gene das
prote
ínas candidatas, em um microtubo de 1,5 ml
contendo
40 l de
Agrobacterium
tumefaciens
cep
a LBA4404 eletro-competentes. Foi incubado no gelo por 5 minutos e então
transferido para uma curveta específica para eletroporação, Gene Pulser Curvette (Bio-
Rad).
Em seguida foi adicionado a curveta 1mL de meio de cultura LBman (Apêndice I), misturado
delicadamente e transferido para um microtubo estéril. O tubo contendo o meio LBman e
células
eletroporadas
foi incubado com agitação de 200 rpm por 3 hora a 28
°C
. Após esse
período, 200 L da cultura foi transferido para uma placa contendo
LBman Àgar com
canamicina (100 g/mL) e deixada em uma estufa à 28°C por 2 dias, para o crescimento das
colônias transformadas.
42
Agroinfecção de Nicotiana benthamiana (Agrobacterium tumefaciens
transient Assay)
Plantas da espécie Nicotiana benthamiana são freqüentemente utilizadas
em ensaios de agroinfecção por apresentarem folhas que são facilmente
infiltradas e por produzirem grandes quantidades de proteínas em resposta à
agroinfecção (ROTH et al., 2004). Nos ensaios realizados nesse trabalho, a
superfície abaxial das folhas de Nicotiana benthamiana foram agroinoculadas
com construções do gene repórter GFP (Green fluorescent protein) em um
cassete de expressão constituído pelo promotor 35S de Cauliflower mosaic
virus e terminador da nopalina sintase. Além da proteína de fluorescência
verde (GFP), foram agroinoculadas a proteína supressora de silenciamento
HcPro de Potivirus e as sete proteínas não estruturais do Dengue subclonadas
no vetor de expressão pBINplus, para identificação da função supressora de
silenciamento nas folhas inoculadas.
A agroinoculação em folhas de Nicotiana benthamiana necessitou de
uma etapa prévia de indução da expressão das proteínas ligadas ao vetor de
expressão pBINplus, na qual agrobactérias transformadas separadamente com
as construções pBINGFP, pBINHcPro pBINNS1, pBINNS2A, pBINNS2B,
pBINNS3, pBINNS4A, pBINNS4B e pBINNS5 foram crescidas em 3 mL de
meio LBman, contendo canamicina 100 g/mL em agitação de 200 rpm a 28°C
por 48 horas. A indução de 600 L dessa cultura foi feita em 3mL de meio de
indução completa (Apêndice I), num período de um dia em agitação sob as
mesmas condições de crescimento da cultura. Após o tempo de indução, a
cultura foi centrifugada por 10 minutos em 1960 G à 4°C e ressuspendida em
43
2,5 mL de meio completo Murashige-Skoog (MS) (Apêndice I). A OD600 foi
medida e a cultura foi diluída com MS até atingir OD600=0,5.
As plantas foram umidificadas por um período de 45 minutos para
promover a abertura dos estômatos e em seguida, uma mistura das culturas
previamente induzidas contendo a construção pBINGFP, pBINHcPro e
culturas contendo cada supressor candidato subclonado em pBINplus foi
utilizada para infiltração das folhas por meio de uma seringa sem agulha
(Figura 12). A proporção da mistura feita, contendo o gene repórter e o gene
candidato a supressão do silenciamento foi de 1:1 e o volume final para cada
infiltração foi 2mL.
44
Figura 12: Esquema de agroinoculação das construções
baseadas em pBINplus. A- Controle negativo: Duplicata
de Nicotiana benthamiana inoculada com Agrobacterium
tumefaciens transformada pela construção pBINGFP. B-
Nicotiana benthamiana inoculada com as construções
pBINGFP e pBINHcPro, proteína supressora de
silenciamento. C- Duplicatas de Nicotiana benthamiana
inoculadas com as construções pBINGFP e o vetor
pBINplus ligado a cada um dos genes candidatos a
supressão do silenciamento de RNAi.
45
Análise de fluorescência
em folhas de
N. bethamiana
agroinculadas
As plantas infiltradas com Agrobacterium tumefaciens transformadas
pelas construções contendo GFP, HcPro e as proteínas candidatas foram
monitoradas quanto à fluorescência seis dias após a infiltração. Com o auxílio
de microscópio de fluorescência Zeiss Axiovert 40 e uma câmera fotográfica
Canon EOS KissX com ISO1600 e filtro Amarelo, para captação da luz
ultravioleta incidida sobre as folhas infiltradas, foi realizada uma busca pela
fluorescência verde emitida pela expressão do gene repórter GFP nos tecidos
das plantas, onde o silenciamento teria sido suprimido.
A metodologia desse ensaio de supressão do silenciamento pós-
transcricional de genes (PTGS) foi descrita por Gianinna Brigneti e
colaboradores (1998) como uma estratégia para testar a hipótese de que as
proteínas HcPro de Potyvirus e a proteína 2b de Cucumber mosaic virus eram
supressores do PTGS. O método foi baseado em plantas exibindo
silenciamento da proteína verde fluorescente (GFP), infiltradas com o vetor
Potato vírus contendo os genes de HcPro e 2b. Os resultados revelaram a
capacidade dessas proteínas de suprimirem o silenciamento GFP, observada
pela recuperação da fluorescência nas folhas de Nicotiana benthamiana
inoculadas com as construções contendo os genes candidatos. A iluminação
com luz ultravioleta nas folhas agroinfectadas permitiu a visualização da
fluorescência 2 semanas após a inoculação das folhas.
46
Extração de Proteínas
totais de
N. bethamian
a
As áreas das folhas de Nicotiana benthamiana apresentando coloração
amarelada, como indício da agroinfecção, foram retiradas da planta seis dias
após a inoculação das construções contendo pBINHcPro junto com pBINGFP
como controle positivo, apenas pBINGFP como controle negativo e pBINplus
ligado aos genes candidatos inoculado junto com pBINGFP. Essas regiões
expressando lesão clorótica foram maceradas em microtubos de 1,5 mL
contendo 100 L de PBS 1x (Apêndice I), pois essas regiões das folhas tinham peso
equivalente a 0,01g. O macerado foi centrifugado por 1 minuto a 2300 G e o sobrenadante foi
concentrado em centrífuga com vácuo. O
pellet
obtido foi ressuspendido em 20 L de
tampão de amostra (Apêndice I) e fervido por 15 minutos para aplicação das
proteínas totais em gel de poliacrilamida 12% (LAEMMLI, 1970). As
proteínas foram visualizadas no gel após a coloração com azul de comassie.
Transferência de proteínas para membrana de nitrocelulose
As proteínas separadas por eletroforese foram transferidas para uma
membrana de Nitrocelulose Hybond-C (Amersham Biosciences). Utilizando o
sistema semi-seco de transferência, com o auxílio de um transferidor (Bio-
Rad) nas condições: 35 volts, 2 mA por 45 minutos. Antes de serem
sobrepostos no transferidor, os filtros, o gel e a membrana permaneceram em
solução de transferência (Apêndice I) por 20 minutos. Após a transferência,
47
foi feita a tentativa de identificação das proteínas através de Western Blot,
utilizando o anticorpo anti-HisTag contra a cauda de hexahistidina, inserida
nas sete proteínas não estruturais do Dengue.
Análises de Western Blot
As proteínas identificadas no gel de poliacrilamida e transferidas para
membrana de Nitrocelulose Hybond-C (Amersham Biosciences) foram
incubadas em uma solução de bloqueamento, preparada com 20 mL de PBS 1x
(Apêndice I), 1 g de leite em pó desnatado e 40 L de Triton X-100. A
membrana foi deixada na solução de bloqueamento em agitação por 1 hora.
Após esse período de bloqueamento, a membrana foi incubada com anticorpo
primário anti-polihistidina (Sigma) em 20 mL de PBS (Diluição do anticorpo
recomendada pelo fabricante, 1:3000), 1g de leite em pó desnatado. Essa
solução ficou em agitação durante 4 horas em temperatura ambiente e depois
a membrana foi lavada três vezes com PBS 1x, contendo 0,1% de Tween 20.
Uma nova incubação foi feita com anticorpo secundário conjugado à fosfatase
alcalina (Anti-Mouse IgG, alkaline phosphatase conjugate/Sigma), diluído em
PBS 1x e 1g de leite em pó desnatado em proporção de 1:5000 (Diluição
recomendada pelo fabricante). Essa incubação foi realizada sob agitação por 2
horas em temperatura ambiente. A membrana foi lavada três vezes com a
mesma solução de PBS 1x e Tween anteriormente utilizada, e a revelação foi
feita em 10 mL de tampão alcalino pH 9,5 e os substratos da fosfatase
alcalina: 40 L de Nitroblue Tetrazolium (NBT) (10mg/mL) e 20 L de
5-
48
Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato (BCIP) (10mg/mL). A revelação foi
realizada no escuro.
Dot Imunobinding Assay (DIBA)
As proteínas resultantes da extração foram utilizadas para o ensaio
imunológico (Dot Imunobinding Assay), no qual foram aplicados 2 L de
cada amostra em diferentes quadrantes delimitados dentro de uma membrana
de Nitrocelulose Hybond-C (Amersham Biosciences). O mesmo procedimento
realizado no Western Blot foi feito nesse ensaio, a fim de identificar a
presença das proteínas testadas nas folhas através do anticorpo anti-HisTag. A
proteína E do Dengue apresentando uma cauda de poli histidina, purificada e
cedida pela Dra. Flávia Barreto dos Santos da Fundação Oswaldo Cruz (DOS
SANTOS et al., 2004) foi utilizada nesse ensaio como controle positivo.
Expressão da
proteína
NS2A
em bactéria
Com o objetivo de estudar a função de uma proteína não estrutural, a
proteína NS2A fusionada a uma cauda de hexahistidina foi clonada em vetor
pET 17b (Figura 13) e expressa utilizando um sistema procariótico de
expressão. Essa expressão foi realizada paralelamente aos testes para
identificação da função supressora das proteínas não estruturais. A construção
pETNS2A foi realizada seguindo o mesmo protocolo para clonagem das
49
proteínas não estruturais no vetor pRAPs, contudo a cepa utilizada para
expressão foi Escherichia coli BL21 (DE3) pLYsS. Após a confirmação da
seqüência de NS2A ligada ao vetor pET17b nos sítios de restrição de NheI e
XhoI, foi feito um pré-inóculo da colônia selecionada em 5 mL de meio LB
com ampicilina (100 g/mL), sob agitação a 37°C em 240 rpm durante à noite.
Após o período de crescimento, a cultura foi transferida para um frasco
contendo 200 mL de meio LB com ampicilina (100 g/mL), mantido sob
agitação a 37°C em 240 rpm até atingir OD600 0.8. Atingida a densidade
ótica esperada, foi acrescentado à cultura 1mM de Isopropil- -D-
Thiogalactopiranosídeo (IPTG) para etapa de indução de expressão, sendo
realizada a 37°C em 240 rpm de agitação até 24 horas. Amostras com volume
de 50 mL foram coletadas após 4, 6, 18 e 24 horas de indução. O volume
coletado em tubos de 50 mL foi centrifugado a 720 G por 15 minutos. Cada
precipitado foi ressuspendido com 1mL de tampão de lise (Apêndice I) e
tratado com 50 L de ácido deoxicólico (40mg/mL) por 30 minutos a 37°C.
Após o rompimento da membrana as amostras foram submetidas a uma etapa
de quebra do DNA, utilizando 2 L de DNase (Invitrogen) sob agitação em
temperatura ambiente. O volume resultante foi transferido para tubos de 1,5
mL e centrifugado por 15 minutos a 200G. O sobrenadante foi aplicado em
gel de poliacrilamida 12% e corado com azul de Comassie. O produto da
extração foi submetido ao Dot Imunobinding Assay, para confirmação da
expressão em bactérias.
50
Figura 13: Vetor de expressão pET-17b . Tamanho de 3306 bases, sítio de resistência à ampicilina e múltiplos sítios de enzimas
de restrição, promotor e terminador T7.
51
RESULTADOS E DISCUSSÃO
C
lonagem de genes d
e proteínas não
-
estruturais do Dengue
vírus
A partir da extração do RNA de células infectadas com o sorotipo 1 do
DENV, foi obtido através de transcrição reversa um DNA complementar
utilizado como molde para amplificação por PCR de cada gene candidato à
atividade supressora de RNAi. A PCR feita a partir desse DNA complementar
gerou fragmentos de tamanhos esperados para cada gene amplificado: NS1
(1055 pb), NS2A (653 pb), NS2B (389 pb), NS3 (1856 pb), NS4A (449 pb),
NS4B (746 pb), NS5 (2699 pb), conforme ilustrado na figura 14. Os vetores
de expressão e clonagem, pRAPS e pBINplus também foram quantificados por
eletroforese e apresentaram aproximadamente 4000 bases e 12000 bases, a
massa molecular esperada para ambos.
Figura 14: Os sete genes das proteínas não estruturais amplificados por RT-PCR e
os vetores quantificados para clonagem e subclonagem dos genes. 1: NS1, 2 a 10,
respectivamente: NS2A, NS4A, NS3, NS2B, NS4B, NS5, vetor pBINplus e vetor
pRAPs, respectivamente. Poço 5: Produto de PCR de fragmento não utilizado na
clonagem. M- marcador de massa molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2000
1200
4000
1000
650
400
300
Kb
52
Digestão
das construções em vetor de clonagem
A digestão do vetor pRAPs realizada com as enzimas AscI e PacI após a
confirmação de seqüências das proteínas candidatas clonadas nesse vetor, foi
confirmada através de eletroforese em gel de agarose 1%, liberando
fragmentos de tamanhos esperados como ilustrado nas figuras 15-18. O
tamanho do fragmento foi estimado para a digestão de cada construção de
genes candidatos ligado ao vetor pRAPs, levando em consideração a distância
entre os sítios das enzimas AscI e PacI presentes no vetor, adicionado ao tamanho do
gene clonado. Entre os sítios de restrição de AscI e PacI estão contidas a região do promotor
35S de CaMV duplicada e o terminador de nopalina sintase de
Ag
robacterium tumefaciens
,
resultando no aumento de 1
400 pb além dos genes inseridos.
A proteína NS2A que possui 653 pb somados a distância de 1400 pb existente entre
os sítios de restrição de AscI e PacI , gerou como produto da digestão um fragmento de 2053
pb. NS2B com 389 pb, somado ao mesmo tamanho do
vetor digerido, gerou um fragmento de
aproximadamente 1800 pb e NS4A possuindo 449 pb liberou um fragmento de 1849 pb
(Figura 15). NS4B que possui 746 pb, liberou um fragmento de 2146 pb após a digestão do
vetor pRAPsNS4B com as enzimas
AscI e Pac I
e NS5
com 2699 pb liberou um fragmento de
4099 pb (Figura 16). NS1 com 1055 pb liberou um fragmento de 2455 pb após a digestão do
vetor pRAPsNS1 (Figura 17) e um fragmento de 3256 pb do vetor pRAPsNS3 foi obtido
(Figura 18)
,
tendo NS3 tamanho de 1856 pb. Todos os fragmentos de interesse recuperados
do gel foram purificados e utilizados na etapa de subclonagem em vetor de expressão
pBINplus.
53
Figura 15: Digestão do vetor pRAPs contendo fragmentos NS2A, NS2B e NS4A
com as enzimas AscI e PacI. 1 : Marcador de massa molecular 1kb plus DNA
Ladder (Invitrogen); 2: vetor pRAPsNS2A digerido com AscI e PacI; 3: vetor
pRAPsNS2B digerido com AscI e PacI; 4: vetor pRApsNS4A. O tamanho esperado
na digestão de NS2A é de 2053 pb, de NS2B é de 1800 pb e NS4A é de 1849 pb.
Figura 16: Digestão do vetor pRAPs contendo fragmentos NS4B e NS5 com as
enzimas AscI e PacI. 1: Marcador de massa molecular 1kb plus DNA Ladder
(Invitrogen); 2: Vetor pBINplus digerido com AscI e PacI; 3: Vetor pRAPsNS4B
digerido com AscI e PacI; 4: Vetor pRAPsNS5 digerido com AscI e PacI Os
tamanhos esperados para a digestão de NS4B e NS5 foi de 2146 pb e 4099 pb,
respectivamente.
12000
2000
3000
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1
2
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54
Figura 17: Digestão do vetor pRAPs contendo gene NS1 com as enzimas AscI e
PacI. 1: 1kb plus DNA Ladder (Invitrogen), marcador de massa molecular; 2: Vetor
pRAPsNS1 digerido com AscI e PacI. O produto da digestão purificado para
clonagem tem tamanho esperado de 2455 pb.
Figura 18: Digestão do vetor pRAPS contendo gene NS3 com as enzimas AscI e
PacI. 1: Marcador de massa molecular 1kb plus DNA Ladder (Invitrogen); 2: Vetor
pRAPsNS3 digerido com AscI e PacI. O produto da digestão purificado para
clonagem tem tamanho esperado de 3256 pb.
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3000
55
Clonagem e Subclonagem
dos genes das proteínas não estruturais do Dengue
As etapas de clonagem e subclonagem foram confirmadas através de
seqüenciamento, onde cada seqüência obtida foi previamente avaliada no
programa STADEN package , eliminando as seqüências com baixa
confiabilidade de leitura. A seqüência consenso determinada pelo STADEN
foi alinhada com seqüências do genoma do vírus do Dengue depositadas no
GenBank do NCBI e todas as seqüências consenso submetidas foram
compatíveis com a poliproteína do Dengue.
A fim de obter fidelidade do alinhamento, foi utilizada a ferramenta do
BLAST, fornecendo um alinhamento baseado na seqüência traduzida em
proteínas. Todas as sequências consenso, obtidas no seqüenciamento,
apresentaram identidade com a poliproteína do vírus do Dengue, como pode
ser observado no Apêndice II A-G.
Agroinoculação
As seqüências de proteínas utilizadas para os testes de supressão do silenciamento
foram submetidas ao seqüenciamento após a etapa de clonagem em pRAPs e após a
subclonagem das mesmas em pBINplus e tendo sido confirmadas foram utilizadas para a
transformação de Agrobacterium tumefaciens e posteriormente inoculadas em folhas de
Nicotiana benthamiana
.
O
teste foi realizado através da co-infiltração de
A.
tumefaciens contendo cada
construção de proteínas não estruturais do vírus do Dengue em pBINplus e a construção de
56
GFP em pBIN19. Para proteínas que não apresentam função de supressão de RNAi, a
expressão de GFP seria silenciada, resultando em baixa emissão de fluorescência pelo GFP.
Porém, quando a proteína viral apresenta função de supressão de RNAi, a intensidade de G
FP
em folhas co-infiltradas apresenta-
se
alta. Logo, a intensidade de GFP foi sempre avaliada
em comparação com os controles negativos e positivos. As duplicatas de
Nicotiana
benthamiana
inoculadas com cada construção contendo os genes candidatos, a proteína
supressora HcPro como controle positivo e apenas agrobactéria com a construção pBINGFP
(Controle negativo), foram avaliadas seis dias após a agroinfecção nas folhas. Uma folha de
cada planta que demonstrava sinais de infecção (Clorose) foi retirada e irradiada com luz
ultravioleta de onda longa para visualização da fluorescência emitida por GFP, anteriormente
inse
rida nas plantas juntamente com cada gene candidato e nos controles positivo e negativo.
Nenhuma das proteínas não estruturais do Dengue demonstrou capacidade de
suprimir o silenciamento de GFP efetuado nas plantas testadas seis dias após a inoculação
(F
iguras 19-26). Isso foi observado mediante a baixa intensidade de fluorescência nas folhas
irradiadas com luz ultravioleta, diferentemente da proteína HcPro de
Potyvirus
que possui
atividade supressora de silenciamento de RNAi conhecida (BRIGNETI et al., 1998), sendo
portanto utilizada nesse trabalho como controle positivo. A fim de assegurar a efetividade do
sistema de silenciamento naturalmente presente na planta utilizada, somente a construção
pBINGFP utilizada para transformar a agrobactéria, foi inoculada em duplicata e a
fluorescência emitida por GFP também pôde ser observada em baixa intensidade (Figura 26),
evidenciando a existência de um mecanismo de silenciamento agindo sobre o gene de GFP
introduzido na planta.
57
Figura 19: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS1. B- Controle positivo: folha inoculada com a construção pBINHcPro e
pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
Figura 20: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS2A. B- Controle positivo: folha inoculada com a proteína HcPro e GFP.
Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
A
B
A
B
58
Figura 21: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS2B. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro
e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
Figura 22: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções GFP e
pBINNS3. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro e
pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
A
B
A
B
59
Figura 23: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS4A. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções
pBINHcPro e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a
inoculação.
Figura 24: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS4B. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro
e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
A
B
A
B
60
Figura 25: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com as construções pBINGFP
e pBINNS5. B- Controle positivo: folha inoculada com as construções pBINHcPro e
pBINGFP. Folhas irradiadas com luz ultravioleta seis dias após a inoculação.
Figura 26: A- Folha de N. bethamiana agroinfectada com Agrobacterium
tumefaciens LBA 4404 e a construção pBINGFP. B- Controle positivo: folha
inoculada com as construções pBINHcPro e pBINGFP. Folhas irradiadas com luz
ultravioleta seis dias após a inoculação.
A
B
A
B
61
Detecção das proteínas expressas em plantas
As á
reas
das folhas inoculadas com os genes candidatos e os controles foram
submetidas a uma etapa de extração de proteínas totais, para a confirmação de sua expressão
na
s folhas de
N.
benthamiana. O produto da extração de proteínas totais foi analisado por
eletroforese em gel de poliacrilamida 12% e Dot Imunobinding Assay (DIBA), utilizando
anticorpo monoclonal anti-HisTag. A área da folha que apresentava a lesão clorótica foi
utilizada para extração de proteínas e essa área equivale a aproximadamente 0,01g de folha,
resultando em baixa concentração de proteínas como pode ser observado no gel (Figura 27).
Essas proteínas identificadas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose
Hybond
-C (Amersham Biosciences) para tentativa de detecção através de Western Blotting
que não mostrou sinais positivos das proteínas contendo hexahistidina (dados não mostrados).
Contudo, essa detecção foi realizada no Dot Imunobinding Assay (Figura 28), realizado com
o mesmo produto da extração de proteínas da folha, aplicado no gel de poliacrilamida.
Considerando que esse gel ilustra o resultado da extração de proteínas totais da folha e não
das proteínas não estruturais purificadas, a imagem gerada não é suficiente para afirmar a
presença das proteínas inoculadas para teste, visto que outras de mesma massa molecular
estão sendo juntamente visualizadas.
62
Figura 27: Eletroforese em gel de poliacrilamida, com as proteínas resultantes da
extração das folhas inoculadas com as proteínas testadas. MM: Marcador de massa
molecular BenchMark protein Ladder (Invitrogen).
Figura 28: Dot Imunobinding Assay. Detecção das proteínas não estruturais
fusionadas a uma cauda de histidina, em ensaio imunológico utilizando
anticorpo anti-Histag. Controle positivo: Proteína Envelope do Dengue
fusionada a cauda de polihistidina (Proteína purificada).
Contro
le
Positivo
NS3
NS1
NS4A
NS2A
NS4B
NS2B
NS5
MM
NS1
NS2A
NS2B
NS3
NS4A
NS4B
NS5
25
kDa
220
50
30
63
As proteínas do Dengue apresentam diferentes massas, podendo ser pequenas tais
como NS2A (22 kDa), NS2B (14 kDa), NS4A (16 kDa) e NS4B (27 kDa) ou podem
apresentar 103 kDa como NS5, a maior proteína não estrutural, seguida de NS3 (70 kDa) e
NS1 (46 kDa) (LINDENBACH & RICE, 2001). A baixa intensidade das bandas no gel de
poliacrilamida não permite clara visualização de todas as massas moleculares das proteínas
não estruturais inoculadas nas folhas (Figura 27). Além da baixa concentração de proteínas
re
sultante da extração e a interferência oferecida pelas proteínas constitutivas da folha, o
baixo potencial imunodetector do anticorpo utilizado contra a cauda de histidina (Anti-
HisTag) representa um fator limitante para a detecção das proteínas expressas nas folhas de
Nicotiana benthamiana. Tornando necessária a maior concentração das proteínas, seguida de
uma etapa de purificação utilizando uma coluna de níquel para sua captação, através da cauda
com seis histidinas presente na
região C
-
terminal das prote
ínas.
A presença das proteínas não estruturais e a detecção de fluorescência de GFP em
baixa intensidade nas folhas inoculadas não são indícios determinantes para caracterização da
ausência de uma função supressora para as proteínas não estruturais do Dengue. Contudo
esses testes podem ser acrescentados a uma detecção mais precisa através de Western Blot
realizado após a purificação das proteínas extraídas das folhas.
Sabe
-se que uma das características do mecanismo de silenciamento é a presença
de pequenos RNAs (siRNAs) de seqüência complementar ao RNA alvo da maquinaria de
silenciamento (Lipardi et al., 2001). Logo, a detecção desses pequenos RNAs, juntamente
com a quantificação do RNA mensageiro de GFP pode ser utilizada para confirmação do
silencia
mento ativo ou inativo nas folhas testadas e essa confirmação somada aos resultados
adquiridos nesse trabalho são ferramentas capazes de afirmar que o silenciamento está
presente, porém não suprimido, tendo respaldo numa análise realizada em nível molecula
r.
64
A comprovada presença do silenciamento no vetor do Dengue Aedes aegypti
(TRAVANTY
et al., 2004) implica na existência de um mecanismo de escape utilizado pelo
vírus, provendo dessa forma a sua capacidade de replicação no mesentério das fêmeas do
gênero, possibilitando sua sobrevivência e propagação. Tal mecanismo permanece encoberto,
contudo existem relatos que apontam para existência de uma estratégia contra o silenciamento
que não está baseada na atividade de proteínas supressoras, mas sim na capacidade que
o
vírus pode apresentar de realizar sua replicação dentro de uma membrana, o viroplasma
(UCHIL & SATCHIDANANDAM, 2003). Dessa forma, protegendo o seu RNA do
reconhecimento realizado pelo sistema de silenciamento presente no vetor e sabidamente
presente em células de mamíferos
(LECELLIER
et al., 2005), visto que na fase de replicação
o RNA de vírus com fita simples apresenta-se em forma de fita dupla, tornando o vírus
vulnerável ao reconhecimento e clivagem efetuado pela ribonuclease D
ICER. Segundo Vance
(1991)
, a habilidade dos vírus para infectar seus hospedeiros indica que eles realmente têm
desenvolv
ido meios de evitar ou suprimir essa
defesa mediada por RNA.
Uma hipótese levantada por Li e Ding
(2005)
consiste na diferença existente entre
os vírus que infectam insetos e os arbovírus que apenas os utilizam como vetores sem causar
o desenvolvimento da doença. A base molecular dessa diferença não foi esclarecida, contudo
esses pesquisadores propõem que os supressores do silenciamento não estão ativos ou são
menos ativos nos insetos do que nos hospedeiros vertebrados, tendo sido indicado em seus
trabalhos que o genoma viral do Dengue não deve codificar supressores do silenciamento,
visto que nenhuma das proteínas virais maduras foi capaz de recuperar a infecção em um
mutante depletado para proteína B2, um supressor de silenciamento encontrado em
Flock
house
virus
.
O sistema de plantas demonstrou ser eficaz em estudos de busca de função para
proteínas supressoras de outros vírus
(BUCHER
et al., 2003), porém até o presente não havia
65
sido utilizado para realizar estudos desse interesse com proteínas do Dengue. Mesmo
considerando o sistema vegetal eficaz, não desconsideramos a possibilidade desse sistema não
ser o mais adequado para realização de estudos do nosso interesse, portanto existe o interesse
de realização de testes semelhantes em células C6/36 de
Ae.
albopictus
, onde o mecanismo de
silenciamento também se faz presente
(ADELMAN
et al., 2002). Embora muitas tentativas
tenham nos levado a identificar mecanismos como o silenciamento e sua supressão, tomando
como exemplo os resultados obtidos nesse projeto, a presença ou ausência da fluorescência
nas folhas de
N.
benthamiana testadas, auxilia numa visão superficial do processo, revelando
um fenótipo e não como se dá o mecanismo. Logo o desafio que segue a diante é esclarecer
como esses mecanismos estão ocorrendo no organismo e de que maneira podem estar
relacionados com a interação vírus-
hospedeiro,
a biologia do desenvolvimento viral e a
competência do vetor.
Detecção de proteína expressa em bactérias
Paralelamente aos ensaios de identificação de atividade supressora de RNAi, a
proteína não estrutural NS2A, uma pequena proteína hidrofóbica de aproximadamente 25
kDa, foi utilizada para expressão em sistema procariótico. Não há grande conhecimento a
respeito das funções desempenhadas por essa proteína além das que já foram descritas nesse
trabalho. NS2A clonada em vetor de expressão pET17b foi exp
ressa em
Echerichia coli
BL21
(DE3) pLysS num período de até 24 horas após a indução com IPTG. As amostras foram
coletadas em quatro diferentes tempos (4, 6, 18 e 24 horas pós indução) e o produto da
extração de proteínas totais não revelou diferença da intensidade das proteínas em gel de
poliacrilamida nem nos ensaios imunológicos realizados com essas amostras (Figuras 29
-
30).
66
Figura 29: Proteínas expressas nos períodos de 4, 6, 18 e 24 horas pós indução.
Possível produto da expressão com massa equivalente a 25 KDa. Controle negativo:
Produto da expressão de proteínas totais de E.coli transformada com pET17b sem a
proteína NS2A. MM: Marcador de massa molecular BenchMark protein Ladder
(Invitrogen).
Figura 30: Dot Imunobinding Assay. Detecção da proteína NS2A fusionada a uma
cauda de histidina, em ensaio imunológico utilizando anticorpo anti-Histag.
Controle positivo: Proteína Envelope do Dengue fusionada a cauda de polihistidina
(Proteína purificada); Controle negativo: Produto da expressão de proteínas totais
de E.coli transformada com pET17b sem a proteína NS2A.
Controle
+
Con
trole
-
-
-
6 Horas
18 Horas
24 Horas
kDa
KK
220
50
K
25
M
M C
-
4h C
-
6h C
-
18h C
-
24 h
67
O possível produto da expressão foi visualizado em gel de poliacrilamida, onde as
proteínas resultantes da extração após diferentes tempos de e
xpressão foram contrastadas com
as proteínas totais extraídas de E. coli sem a proteína do Dengue. Foi visualizada a presença
de uma proteína
com massa de 25kDa, compatível com a massa da proteína não estrutural.
Os resultados obtidos na eletroforese não são suficientes para detectar a proteína
expressa, visto que o gel ilustra o perfil resultante da extração de proteínas totais e não da
proteína purificada. Contudo, o primeiro indício da expressão de NS2A em BL21 foi obtido
através do Dot Imunobinding Assay (DIBA), onde o anticorpo primário anti-HisTag detectou
a cauda de histidina presente na porção C-terminal da proteína. O controle positivo utilizado
foi a proteína Envelope fusionada a uma cauda de histidina e o controle negativo continha o
resultado da extração de proteínas totais de
E.coli
transformada apenas com o vetor pET17b
sem o inserto (NS2A). Os períodos mais tardios de indução da expressão das proteínas não
revelaram diferença de intensidade através da detecção feita com anticorpo anti-
Histag,
não
evidenciando aparente aumento da quantidade de proteínas expressas com o aumento do
tempo de indução, o que também foi observado na eletroforese em gel de poliacrilamida 12
%. Contudo, essa detecção não é conclusiva sendo necessária uma identificação mais precisa
através de Western Blot.
Os métodos de detecção para o Dengue, normalmente utilizados baseiam-se em
testes sorológicos e existem propostas de tornar esses métodos mais rápidos e eficazes,
promovendo o desenvolvimento de novos kits diagnósticos construídos a partir de anticorpos
específicos contra Dengue
(CHEN
et al., 2007; VIDEA et al., 2005). As próprias técnicas
com
umente utilizadas em nossos laboratórios, como Western Blotting, DIBA e outras
ferramentas que visam à detecção de proteínas virais expressas em diferentes sistemas, não
disponibilizam de anticorpos específicos do Dengue, sendo necessário o uso de caudas d
e
histidina, glutationa S-transferase (GST) ou outras estratégias que gerem proteínas de fusão
68
capazes de serem detectadas com facilidade. Considerando essa necessidade, a expressão da
proteína NS2A, que teve seu primeiro indício de expressão observado nos resultados do
DIBA (Figura 14), tem como finalidade a posterior produção de anticorpos através da
inoculação de sua forma purificada em coelhos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nesse momento é crescente a fila dos hospitais públicos com pacientes infectados
pe
lo vírus do Dengue. No mês de abril de 2008, mais de 3000 casos foram registrados na
cidade do Rio de Janeiro, entre os quais mais de 100 casos levaram ao óbito. A despeito da
situação econômica e educacional, o maior desafio desse histórico de infecções por Dengue
consiste na descoberta de agentes antivirais para o tratamento da doença, bem como a
disponibilização de uma vacina tetravalente. O esclarecimento da biologia do vírus, de suas
estratégias de sobrevivência no hospedeiro, a existência ou ausência da capacidade de induzir
e suprimir mecanismos de defesa como o silenciamento, podem ser alvos vitais passíveis de
ser afetados, tornando o vírus suscetível a ação de medicamentos.
O silenciamento mediado por RNA tornou-se um dos focos da ciência nos últi
mos
anos rendendo o Prêmio Nobel de medicina em 2006 aos pesquisadores Andrew Fire e Craig
Mello pela identificação do fenômeno observado em Caenorhabditis elegans.
Atualmente, esse mecanismo tem sido utilizado como ferramenta para o estudo de genética
rev
ersa, determinando a função de genes através de sua interrupção, além de sua aplicação em
uso terapêutico em infecções virais, sendo apontado como uma ferramenta no tratamento de
Hepatite C e HIV
(KANZAKI
et al
., 2008; MA
et al
., 2007; TREJO
-AVILA
et al
., 2007)
.
A descoberta de supressores do silenciamento em vírus de mamíferos foi
primeiramente demonstrada em células de insetos e posteriormente confirmada em células de
69
mamíferos
(SULLIVAN & GANEM, 2005) e todos os supressores identificados foram
requeridos para infecção dos vírus nessas células. Sabemos que semelhantemente, essas
características podem
ser observadas em diferentes vírus, assim como a confirmada existência
do silenciamento mediado por RNA nos hospedeiros.
Não existe um modelo animal para estudos do comportamento do Dengue virus e
devido a esse fator limitante, ainda sabemos muito pouco sobre os processos que permitem a
infecção e mantém sua sobrevivência na célula hospedeira, visto que já foi identificada a
existência do silenciamento tanto em células do vetor como em células de mamíferos. Esse
trabalho foi uma tentativa de identificação de um possível mecanismo de escape do
silenciamento, além do que já pôde ser observado quanto ao processo de replicação do vírus,
mantendo a dupla fita de RNA fora do alcance da maquinaria de silenciamento.
Não podemos descartar a possibilidade de existência de supressores para Dengue
até que seja claramente observada a expressão das proteínas não estruturais nas folhas
inoculadas, visto que as análises de detecção aqui realizadas ainda não são conclusivas.
Consideramos também a importância da realização de uma busca semelhante, utilizando as
proteínas estruturais que desempenham papéis importantes para interação do vírus com a
célula hospedeira e podem também apresentar capacidade de suprimir o silenciamento
mediado por RNA.
Foi observado por pesquisadores na Holanda, em tentativas semelhantes de
expressão de proteínas heterólogas contendo HisTag na porção C-terminal, que esse tipo de
fusão comprometeu a função da proteína expressa tornando
-
a inativa, o que contrastou com os
resultados obtidos quando as mesmas foram fusionadas a cauda de histidina na porção N-
terminal. Logo, podemos inferir que a presença da cauda de hexahistina em cada proteína
testada pode ter comprometido sua função durante a expressão nas folhas de N. benthamiana.
Não descartamos também a possibilidade da existência de co-fatores atuando no processo de
70
supressão e nesse trabalho as proteínas não estruturais foram avaliadas separadamente,
impedindo que fosse observada a possível interação realizada entre elas nesse processo.
Esses resultados, portanto abrem caminho para uma nova etapa de investigações
que tragam uma visão mais aprofundada da relação que se estabelece entre o vírus e a célula
hospedeira, permitindo sua infecção mesmo mediante a existência do mecanismo de
silenciamento
ativo nas células do vetor e também do hospedeiro humano.
71
PERSPECTIVAS
Testar as construções obtidas nesse projeto em células de inseto e células de
mamíferos
Pur
ificar as proteínas não estrutur
ais expressas em plantas para melhor detecção
através de W
estern Blotting.
Purificar
a proteína não estrutural NS2A
e injetar
em coelhos para produção de
anticorpos
72
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81
APÊNCICE I
Meios de
Cultura
e Soluções
Meio LB com ampicilina
(Sambrook & Russell, 2001)
Composição:
NaCl 10,0 g
Triptona 10,0 g
Extrato de levedura 5,0 g
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Ampicilina a 100 mg/ mL. 1,0 mL
Preparação:
Em um erlenmeyer foram colocados todos os componentes do meio, exceto a
ampicilina, e a eles adicionou-se água destilada e ajustou-se o pH para 7,0 com solução
de NaOH 5N. O meio foi autoclavado a 121ºC por 20 minutos. Depois de autoclavado,
este foi colocado em repouso até que esfriasse atingindo 55°C e só então adicionou-se a
ampicilina Este meio foi utilizado para realização de Seleção das Colônias Bacterianas (
item 5.9.3.).
82
Meio LB com ágar e ampicilina (Sambrook & Russell, 2001)
Composição: A mesma do item 5.2.1. com a adição de 15,0g de ágar
Preparação:
Em
um erlenmeyer foram colocados todos os componentes do meio, exceto a
ampicilina, e a eles adicionou-se água destilada. Ajustou-se o pH para 7,0 com solução
de NaOH 5N e o meio foi autoclavado a 121ºC por 20 minutos. Depois de autoclavado,
este foi colocado em repouso até que esfriasse atingindo 55°C e só então adicionou-se a
ampicilina. Em seguida o meio foi distribuído em placas de Petri de 9 cm de diâmetro
previamente esterilizadas. Este meio foi utilizado para realização de transformação de
bactérias
Esc
herichia coli
cepa
DH5
por eletropora
ção
.
Meio SOC (Sambrook & Russell, 2001)
Composição:
NaCl 0,5 g
Triptona 20,0 g
Extrato de levedura 5,0 g
MgCl
2
2M 5,0 mL
Glicose 1M 20,0 mL
Água destilada q.s.p. 1000mL
83
Meio de cultura LBman
Peptona
10g
Extrato de levedura 5g
NaCl 2,5g
Manitol 10g
Tampão de Indução
10,5g
de K2HPO4
4,5g de KH2PO4
1g de (NH4)2SO4
0,5g de Citrato de Sódio: 2H2O
0,5g de MgSO4: H2O
2g de Sacarose
5mL de glicerol
Autoclavar
Tampão de indução completo
40 mL de tampão de indução
Adicionar 10 L de acetosyringone 200mM
400 L de M
ÊS 1M pH 5,6
84
MES
MES 1 M, pH 5,6
Equilibrar o pH com KOH 5M
Filtrar e manter no escuro
MS
Comple
to
30 g de sacarose
4g de MS powder
Adicionar 10 mL de MES pH 5,8 e 750 L de acetosyringone 200mM
Tampão Alcalino
Tris 0,1 M
Nacl 0,1M
MgCl
2
5 mM
Tampão de Transfer
ência
Tris 48 mM
Glicina 39 mM
Metanol 20%
85
PBS 10x (pH 7,4)
NaCl 80g
KCl 2g
Na
2
HPO
4
+ 7H
2
O 26,8g
KH
2
PO
4
2,4g
Solução preparada para um volume final de 1 L
Tampão de Lise (pH 8,0)
Fosf
ato de Sódio
50 mM
NaCl 300mM
Imidazol 10mM
Tampão de Amostra
Tris
-
HCl (pH 6,8) 0,5 M
1 mL
Glicerol 10% -
0,8 mL
SDS 10%
- 1,6
mL
2-
Beta
-
Mercaptoetanol
-
0,4 mL
Azul de Bromofenol ( 0,05%) 0,
2
mL
Solução preparada para um volume final de 8mL
86
87
APÊNDICE II
NS1
Query 1 EGQRTKCGSGSFVTNEVHTWTEQYKFQADSPKRLSAAIGRAWEEGVCGIRSATRLENIMW 180
+G+ KCGSG FVTNEVHTWTEQYKFQADSPKRLSAAIGRAWEEGVCGIRSATRLENIMW
Sbjct 784 KGRELKCGSGIFVTNEVHTWTEQYKFQADSPKRLSAAIGRAWEEGVCGIRSATRLENIMW 843
Query 181
KQISNELNHILLENDMKFTVVVGNANGILAQGKKMIKPQPMEHKYSWKSWGKAKIIGADI 360
KQISNELNHILLEND+KFTVVVGNANGILAQGKKMI+PQPMEHKYSWKSWGKAKIIGADI
Sbjct 844 KQISNELNHILLENDIKFTVVVGNANGILAQGKKMIRPQPMEHKYSWKSWGKAKIIGADI 903
Query 361 QNATFIIDGPDTPECPDEQRAWNIWE
VEDYGFGIFTTNIWLKLRDFYTQMCDHRLMSAAI 540
QN TFIIDGPDTPECPDEQRAWNIWEVEDYGFGIFTTNIWLKLRD YTQMCDHRLMSAAI
Sbjct 904 QNTTFIIDGPDTPECPDEQRAWNIWEVEDYGFGIFTTNIWLKLRDSYTQMCDHRLMSAAI 963
Query 541 KDSKAVHADMGYWIESEKNETWK 609
KDSKAVHADMG
YWIESEKNETWK
Sbjct 964 KDSKAVHADMGYWIESEKNETWK 986
A- Alinhamento da proteína NS1 com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS1 obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de dados
do NCBI.
88
NS2A
>
gb|ABW82094.1|
polyprotein [Dengue virus type 1]
Length=3392
Score = 386 bits (992), Expect = 5e
-
106
Identities = 198/208 (95%), Positives = 202/208 (97%), Gaps = 0/208 (0%)
Frame = +3
Query 48 GVQEKWTFFIGILCVSILIEEVMRSRWSRKMLMTGTLAVFLLLIMGQLTWNDLIRLCIMV 227
G E +F +GILCVSILIEEVMRSRWSRKMLMT
GTLAVFLLLIMGQLTWNDLIRLCIMV
Sbjct 1128 GSGEVDSFSLGILCVSILIEEVMRSRWSRKMLMTGTLAVFLLLIMGQLTWNDLIRLCIMV 1187
Query 228 GANASDRMGMGTTYLALMATFKMRPMFAVGLLFRRLTSREVLLLTIGLSLVASVELPNSL 407
GANASDRMGMGTTYLALMATFKMRPM AVGLLFRRLTSREVLLLTIGLSLVASVEL
PNSL
Sbjct 1188 GANASDRMGMGTTYLALMATFKMRPMLAVGLLFRRLTSREVLLLTIGLSLVASVELPNSL 1247
Query 408 EELGDGLAMGIMMLKLLTDFQPHQLWTTLLSLTFIRTSLSLDYAWKTMAMALSIVSLFPL 587
EELGDGLAMGIMMLKLLTDFQPHQLWTTLLSLTFI+T+LSLDYAWKTMAMALSIVSLFPL
Sbjct 1248 EELG
DGLAMGIMMLKLLTDFQPHQLWTTLLSLTFIKTTLSLDYAWKTMAMALSIVSLFPL 1307
Query 588 CLSTTSQKTTWLPVLLGSFGCKPLTMFL 671
CLSTTSQKTTWLPVLLGSFGCKPLTMFL
Sbjct 1308 CLSTTSQKTTWLPVLLGSFGCKPLTMFL 1335
B- Alinhamento da proteína NS2A com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS2A obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de
dados do NCBI.
89
NS2B
>
gb|ABO38806.1|
polyprotein [Dengue virus type 1]
Length=3392
Score = 193 bits (490), Expect = 7e
-
48
Identities = 108/108 (100%), Positives = 108/108 (100%), Gaps = 0/108 (0%)
Frame = +3
Query 45 KNDVPLAGPLIAGGMLIACYVISGSSADLSLEKAAEVSWEEEAEHSGTSHNILVEVQDDG 224
KNDVPLAGPLIAGGMLIACYVISGSSADLSLEK
AAEVSWEEEAEHSGTSHNILVEVQDDG
Sbjct 1368 KNDVPLAGPLIAGGMLIACYVISGSSADLSLEKAAEVSWEEEAEHSGTSHNILVEVQDDG 1427
Query 225 TMKIKDEERDD
tltillkatlla
VSGVYPMSIPATLFVWYFWQKKKQR 368
TMKIKDEERDDTLTILLKATLLAVSGVYPMSIPATLFVWYFWQKKKQR
Sbjct 1428 TMKIK
DEERDDTLTILLKATLLAVSGVYPMSIPATLFVWYFWQKKKQR 1475
C- Alinhamento da proteína NS2B com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI.
Query: seqüência de NS2B obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente
do banco de dados do NCBI.
90
NS3
>
gb|ABO38806.1|
polyprotein [Dengue virus type 1]
Length=3392
Score = 156 bits (394), Expect(2) = 9e
-
48
Identities = 76/83 (91%), Positives = 76/83 (91%), Gaps = 0/83 (0%)
Frame =
-3
Query 283 NPTVDGIVAIDLDPVVYDAKFXKQXGQIMLLILCTSQILLMRTTWXLCESITLXTGPLTT 104
NPTVDGIVAIDLDPVVYDAKF KQ GQIMLLILCTSQ
ILLMRTTW LCESITL TGPLTT
Sbjct 2389 NPTVDGIVAIDLDPVVYDAKFEKQLGQIMLLILCTSQILLMRTTWALCESITLATGPLTT 2448
Query 103 XWEGSPGKXWNTTIAXSMANIFR 35
WEGSPGK WNTTIA SMANIFR
Sbjct 2449 LWEGSPGKFWNTTIAVSMANIFR 2471
D- Alinhamento da proteína NS3 com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS3 obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de dados
do NCBI.
91
NS4A
>
gb|ACA48886.1|
polyprotein [Dengue virus 1]
Length=3392
Score = 193 bits (490), Expect = 4e
-
48
Identities = 98/103 (95%), Positives = 98/103 (95%), Gaps = 0/103 (0%)
Frame = +3
Query 3 LDNLVMLHXXEQGGKAYRHAMEELPDTIETLMLLXLIAVLTGGVTLFFLSGKGLGKTSIG 182
LDNLVMLH EQGGKAYRHAMEELPDTIETLMLL LI
AVLTGGVTLFFLSGKGLGKTSIG
Sbjct 2119 LDNLVMLHNSEQGGKAYRHAMEELPDTIETLMLLALIAVLTGGVTLFFLSGKGLGKTSIG 2178
Query 183 LLCVTASSALLWMASVEPHWIXASIILEFFLMVLLIPXPDRQR 311
LLCVTASSALLWMASVEPHWI ASIILEFFLMVLLIP PDRQR
Sbjct 2179 LLCVTASSALLWMASVEPH
WIAASIILEFFLMVLLIPEPDRQR 2221
E- Alinhamento da proteína NS4A com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS4A obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de
dados do NCBI.
92
NS4B
>
gb|AAO20974.1|
polyprotein [Dengue virus type 1]
Length=3392
Score = 428 bits (1101), Expect(2) = 3e
-
122
Identities = 226/228 (99%), Positives = 227/228 (99%), Gaps = 0/228 (0%)
Frame =
-1
Query 725 NEMGLLEPTKKDLGIGHVAAENHQHATMLDVDLHPASAWTLYAVATTVITPMMRHTIENT 546
NEMGLLE TKKDLGIGHVAAENHQHATMLD
VDLHPASAWTLYAVATTVITPMMRHTIENT
Sbjct 2245 NEMGLLETTKKDLGIGHVAAENHQHATMLDVDLHPASAWTLYAVATTVITPMMRHTIENT 2304
Query 545 TANISLTAIANQAAILMGLDKGWPISKMDLGVPLLALGCYSQVNP
ltltaavlmlv
AHYA 366
TANISLTAIANQAAILMGLDKGWPISKMDLGVPLLALGCYSQVNPLTLTAAV
LMLVAHYA
Sbjct 2305 TANISLTAIANQAAILMGLDKGWPISKMDLGVPLLALGCYSQVNPLTLTAAVLMLVAHYA 2364
Query 365 IIGPGLQAKATREAQKRTAAGIMKNPTVDGIVAIDLDPVVYDAKFEKQLGQIMLLILCTS 186
IIGPGLQAKATREAQKRTAAGIMKNPTVDGIVAIDLDPVVYDAKFEKQLGQIMLLILCTS
Sbjct 2365
IIGPGLQAKATREAQKRTAAGIMKNPTVDGIVAIDLDPVVYDAKFEKQLGQIMLLILCTS 2424
Query 185 QILLMRTTWALCESITLATGPLTTLWEGSPGKFWNTTIAVSMANIFQG 42
QILLMRTTWALCESITLATGPLTTLWEGSPGKFWNTTIAVSMANIF+G
Sbjct 2425 QILLMRTTWALCESITLATGPLTTLWEGSPGKFWNTTIAVSMANIFR
G 2472
F- Alinhamento da proteína NS4B com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS4B obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de
dados do NCBI.
93
NS5
>
gb|ACA48886.1|
polyprotein [Dengue virus 1]
Length=3392
Score = 365 bits (937), Expect = 7e
-
100
Identities = 169/172 (98%), Positives = 169/172 (98%), Gaps = 0/172 (0%)
Frame =
-3
Query 517 HFHQLIMKDGREIVVPCRNQDELVGRXRVSQGAGWSLRETACLGKSYAQMWQLMYFHRRD 338
HFHQLIMKDGREIVVPCRNQDELVGR RVSQGAG
WSLRETACLGKSYAQMWQLMYFHRRD
Sbjct 3204 HFHQLIMKDGREIVVPCRNQDELVGRARVSQGAGWSLRETACLGKSYAQMWQLMYFHRRD 3263
Query 337 LRLAANAXCSAVPVDWVPTSRTTWSIHAHHQWMTTEDMLSVWNRVWIEENPWMEDKTHVS 158
LRLAANA CSAVPVDWVPTSRTTWSIHAHHQWMTTEDMLSVWNRVWIEENPWMEDK
THVS
Sbjct 3264 LRLAANAICSAVPVDWVPTSRTTWSIHAHHQWMTTEDMLSVWNRVWIEENPWMEDKTHVS 3323
Query 157 SWEEVPYLGKREDQWCGSLIGLTARATWATNTQVAINQVRRLIGNENYLDYM 2
SWEEVPYLGKREDQWCGSLIGLTARATWATN QVAINQVRRLIGNENYLDYM
Sbjct 3324 SWEEVPYLGKREDQWCGSLIGL
TARATWATNIQVAINQVRRLIGNENYLDYM 3375
G- Alinhamento da proteína NS5 com seqüências de proteína do Dengue depositadas no banco de dados do NCBI. Query:
seqüência de NS5 obtida no seqüenciamento automático. Subjct: seqüência de proteína do Dengue proveniente do banco de dados
do NCBI.
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