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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Avaliação de risco de infecção por Salmonella sp. em consumidores de lingüiça frescal
de carne suína em Porto Alegre, RS
Lisandra Mürmann
PORTO ALEGRE, 2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Avaliação de risco de infecção por Salmonella sp. em consumidores de lingüiça frescal
de carne suína em Porto Alegre, RS
Lisandra Mürmann*
PORTO ALEGRE, 2008
*Médica Veterinária Msc.
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso
Co-Orientador: Prof. Dr. Luis Gustavo Corbellini
Tese apresentada como requisito
parcial para a obtenção do grau
de Doutor em Ciências
Veterinárias Especialidade na
área de Bacteriologia
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Lisandra Mürmann
Avaliação de risco de infecção por Salmonella sp. em consumidores de lingüiça
frescal de carne suína em Porto Alegre, RS
Aprovada em 26 de fevereiro de 2008.
APROVADA POR
Profa. Dra. Marisa R. I. Cardoso
Orientadora e Presidente da Comissão
APROVADA POR
Profa. Dra. Verônica Schmidt
Membro da Comissão
APROVADA POR
Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva
Membro da Comissão
APROVADA POR
Prof. Dr. Eduardo César Tondo
Membro da Comissão
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que me acompanha a todos os instantes, revigorando,
fortalecendo e auxiliando a transpor todos os obstáculos.
À minha orientadora Profa. Dra. Marisa Cardoso, exemplo de muita
competência e dignidade, que me proporcionou ensinamentos valorosos, os quais
levarei para sempre.
Ao Prof. Dr. Luis Gustavo Corbellini, pela amizade e grande apoio estatístico.
À Profa. Dra. Verônica Schmidt pela amizade.
À Profa. Dra. Ana Paula Ravazzolo pela disponibilização do sistema de captura
de imagem.
À Dra. Geovana Michael pela gentil disponibilização sempre que solicitada.
À Cecília pela amizade e dedicação.
À Dra. Marjo, pela amizade, disponibilidade e grande auxílio técnico desde o
início, sempre sendo um grande exemplo de dedicação.
As grandes amizades que fiz no Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva,
durante estes 4 anos. Levarei todos no coração!
Ao CNPq pelo auxílio financeiro que permitiu que este trabalho fosse realizado
com dedicação integral.
Aos meus pais, Celso (in memorian) e Nelsinda, que com muito amor
transmitiram a mim educação, respeito e humildade e estão comigo em todos
momentos. Devo tudo á vocês!!!
A minha irmã, Márcia, meu cunhado Eduardo e minha sobrinha Giovanna (nossa
grande alegria!), por estarem sempre presentes.
Ao meu grande amor, Leandro, pela amizade, amor, apoio e por fazer parte de
minha vida. Te amo!!!
RESUMO
O isolamento de Salmonella enterica em suínos abatidos tem sido reportado
no sul do Brasil, o que torna a carne suína uma fonte potencial de contaminação para os
consumidores. Nesse contexto, o trabalho propôs estimar o risco da ocorrência de
infecção alimentar pelo consumo de lingüiça frescal suína, através da análise de dados
de prevalência, quantificação, cinética de crescimento e destruição e de surtos
alimentares que envolveram Salmonella no Rio Grande do Sul. Das 336 amostras de
lingüiça frescal de carne suína adquiridas no comércio, 24,4% apresentaram Salmonella
sp. com contagens variando entre 0,03 e 460 Número mais Provável (NMP).g
-1
, com
mediana de 0,23 NMP.g
-1
. Os sorovares mais prevalentes foram Brandenburg, Derby,
Panama e Typhimurium. Em simulações de crescimento e destruição realizadas em
caldo nutriente, isolados dos 12 sorovares encontrados no produto, apresentaram
cinética de crescimento semelhante em temperatura ambiente. Até duas horas todos os
sorotipos permaneceram em fase lag e, após, iniciou-se a fase exponencial. Em
temperatura de refrigeração, todos os isolados mantiveram a contagem inicial até 30
dias. A destruição térmica em 60°C ocorreu após 20 minutos em todos os ensaios. As
mesmas simulações foram conduzidas em amostras do produto contaminadas
artificialmente com Salmonella sp. não havendo alterações significativas nas
quantidades de Salmonella em temperatura ambiente e de refrigeração durante todo o
período de observação. Após a preparação em forno (200°C), por 15 minutos, a
população total inoculada foi destruída. Nos surtos ocorridos por Salmonella, os
alimentos a base de ovos, maionese e frango predominaram. Os resultados obtidos na
quantificação variaram de <3 NMP até 4,6x10
9
.g
-1
desses alimentos, com mediana de
4,6x10
6
.g
-1
. S. Enteritidis foi o sorovar identificado em todos os surtos, apresentando um
único perfil de macro-restrição. Os dados obtidos foram utilizados para simular
diferentes cenários no programa @Risk. Considerando-se o costume da população
estudada de ingerir este produto após tratamento térmico, o risco encontrado foi muito
baixo (6,12 x 10
-7
). Para uma pequena parte da população que costuma ingerir o produto
sem qualquer tratamento térmico, em uma simulação realizada com 10.000 refeições,
poderá haver 8,78 casos da doença, considerando a ingestão de uma única unidade. Em
um perfil típico de preparação e consumo de lingüiça frescal de carne suína pela
população de Porto Alegre, ou seja, como acompanhamento de churrasco, após
tratamento térmico mínimo de 15 minutos, calculou-se a probabilidade de ocorrência de
doença. Dentre os 3.354.716,98 churrascos estimados consumidos mensalmente em
Porto Alegre, o resultado do modelo indicou um mínimo de 0,01, média de 2,05 e
máximo de 11,08 casos de doença por mês. Esse cenário infere que a lingüiça frescal de
carne suína pode estar causando um baixo número de casos isolados em Porto Alegre,
os quais podem estar sendo subnotificados.
Palavras Chave: análise de risco, Salmonella, lingüiça frescal de carne suína
ABSTRACT
In Southern Brazil, a high prevalence of Salmonella isolation has been reported in
slaughter pigs, indicating that pork may represent a hazard to the consumers. In this
sense, this study aimed to conduct a risk analysis of the consumption of pork sausage in
Southern Brazil. For this purpose, Salmonella prevalence on pork sausages collected at
retail level was estimated, growth and death curves for representative porcine
Salmonella strains were constructed, the consumption patterns of pork sausages by the
population were investigated, and foods involved in salmonellosis outbreaks were
analysed. From a total of 336 samples of fresh pork sausage examined, Salmonella
enterica was detected in 82 (24.4%) of the samples, with a Most Probable Number
count ranging from 0.03 (MPN).g
-1
to 460 MPN.g
-1
, and a median of 0.23 MPN .g
-1
.
Strains belonging to serovars Brandenburg, Panama, Derby and Typhimurium were the
most prevalent. Growth and death curves of 12 strains representing Salmonella
serovars isolated in this study were similar in assays conducted in nutrient broth. At
room temperature, all Salmonella serovars started the exponential phase after a two
hours period of lag phase. Under refrigeration, all isolates mantained the initial
population counts up to 30 days. The heat destruction was observed after 20 minutes in
all assays. Similar assays conducted in fresh pork sausages inoculated with Salmonella
demonstrated that no growth of Salmonella sp. could be detected at room temperature
and under refrigeration troughout the observation period. After cooking in the oven
(200
°
C) for 15 minutes the inoculated Salmonella population was completely destroyed.
Foods containing eggs, mayonnaise or chicken were the most implicated in outbreaks
investigated in Rio Grande do Sul. Salmonella counts variaded from <3 MPN to
4.6x10
9
.g
-1
of foods involved in these outbreaks, with a median value of 4.6x10
6
.g
-1
. All
strains were identified as S. Enteritidis, and presented a unique macrorestriction
profile, demonstrating the predominance of one clonal group in foods involved in the
salmonellosis outbreaks. Data obtained in the conducted assays were used to simulate
different cenarios, using the @Risk software. Considering that the population usually
consums pork sausage after termic treatment (roasting), the estimated risk was very low
(6.12 x 10
-7
). Another simulation, conducted for the low percentage of the population
(3%) that declared to consum raw pork sausage, indicated that for 10,000 meal
consumption events of one sausage, the probability is 8.78 disease cases. Finally,
considering the typical consumption pattern of pork sausage by the population of Porto
Alegre city (roasted for at least 15 minutes during a barbecue called “churrasco”) the
number of disease cases was simulated. Among 3,354,716.98 “churrascos” prepared
monthly in Porto Alegre city, the model indicated a probability of a minimum of 0.01
cases, a media of 2.05 and a maximum of 11.08 disease cases occurring each month.
Results of risk assessment show that fresh pork sausage may have been a cause of few
undernotificated individual salmonellosis cases in Porto Alegre city.
Keywords: Pork, Risk assessment, fresh pork sausage
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
TABLE 1- Distribution and quantification of Salmonella enterica subsp. enterica
serovars isolated from fresh pork sausages samples collected in Porto Alegre,
Brazil……………………………………………………………………………...……41
TABLE 2- Antimicrobial resistance frequency among Salmonella isolates from fresh
pork sausages by
serovars……………………………….………………………………………………...42
CAPÍTULO 4
TABLE 1: Salmonella quantification in foods involved in outbreaks that occurred in Rio
Grande do Sul, Brazil, in 2005…………………………………………………………77
CAPÍTULO 5
TABELA 1- Distribuição das variáveis..........................................................................92
TABELA 2- Descrição e distribuição das variáveis e modelos da avaliação de risco de
salmonelose devido ao consumo de lingüiça frescal suína.............................................92
TABELA 3- Resultado do modelo ilustrando a estimativa de riscos de doença na
população conforme intervalos de tempo de aquecimento. Simulação computacional
com 10.000 iterações.......................................................................................................92
TABELA 4- Resultado do modelo ilustrando o número de casos de doença conforme
intervalos de tempo de aquecimento. Simulação computacional com 10.000 iterações.93
10
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 2
FIGURA 1- XbaI-macrorestriction profiles identified in the most representative
Salmonella serovars (De, S. Derby; Br, S. Brandenburg; Ty, S. Typhimurium; Pa, S.
Panama) isolated from fresh pork sausage samples in Porto Alegre, Brazil. The
dendrogram presents the similarity determined by Dice coefficient and UPGMA
clustering………………………………………………………………………………43
CAPÍTULO 3
FIGURA 1- Curva de crescimento médio de isolados dos sorovares Brandenburg,
Panama, Derby, Typhimurium, Agona, Senftenberg, Schwarzengrund, Infantis, Ohio,
Orion, Cerro e Muenster de Salmonella, em água peptonada 0,1%, na temperatura
ambiente (1A), sob refrigeração (1B) e destruição térmica
(1C).................................................................................................................................60
CAPÍTULO 4
FIGURE 1: XbaI-macrorestriction profiles identified in Salmonella Enteritidis strains
isolated from foods involved in outbreaks in Rio Grande do Sul,
Brazil…………………………………………………………………………………...76
CAPÍTULO 5
FIGURA 1- Algoritmo representativo do processo de introdução e exposição à
Salmonella na população estudada..................................................................................93
FIGURA 2- Curva de destruição do isolado do sorovar Typhimurium inoculado em
lingüiça frescal suína......................................................................................................94
FIGURA 3- Distribuição de probabilidade de casos por mês de salmonelose na cidade
de Porto Alegre devido a ingestão de lingüiça frescal suína conforme o número de
churrascos, com tempo de aquecimento de 15 minutos..................................................94
11
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE 1- Questionário epidemiológico................................................................113
APÊNDICE 2- Curva de crescimento em temperatura ambiente, 26 á 31°C (A) e sob
refrigeração, 8 á 12°C (B) do isolado se Salmonella Typhimurium inoculado em
lingüiça frescal suína.....................................................................................................114
APÊNDICE 3- Outras produções realizadas durante o doutorado................................115
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: Introdução e Revisão Bibliográfica........................................................13
1 Introdução ................................................................................................................14
2 Revisão Bibliográfica...............................................................................................16
2.1 Características Gerais........................................................................................16
2.2 Contaminação na granja....................................................................................16
2.3 Salmonelose em suínos .....................................................................................17
2.4 Contaminação dos animais durante o transporte e espera pré-abate.................18
2.5 Importância de animais portadores de Salmonella ao abate .............................18
2.6 Salmonella sp. como causa de toxinfecções alimentares..................................19
2.7 Embutidos .........................................................................................................22
2.8 Salmonella em produtos suínos.........................................................................23
2.9 Segurança dos alimentos...................................................................................24
2.10 Análise de Risco..............................................................................................24
2.11 Temperatura de Armazenamento....................................................................25
CAPÍTULO 2- Prevalence, genetic characterization and antimicrobial resistance of
Salmonella isolated from fresh pork sausages in Porto Alegre, Brazil...........................27
CAPÍTULO 3 – Crescimento e de destruição térmica de sorovares de Salmonella sp.
isolados de lingüiça frescal de carne suína .....................................................................49
CAPÍTULO 4- Quantification and molecular characterization of Salmonella isolated
from food samples involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, Brazil..61
CAPÍTULO 5- Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp. em lingüiça
frescal suína em Porto Alegre/RS ...................................................................................79
CAPÍTULO 6- Discussão Geral .....................................................................................95
CONCLUSÕES ............................................................................................................101
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................101
APÊNDICES.................................................................................................................113
Apêndice 1 ................................................................................................................113
Apêndice 2 ................................................................................................................114
Apêndice 3 ................................................................................................................115
13
CAPÍTULO 1: Introdução e Revisão Bibliográfica
14
1 Introdução
Salmonella é considerada um relevante patógeno encontrado em diversos tipos de
alimentos, estando envolvida em grande parte das toxinfecções alimentares no Brasil e
em diversos países.
Pela legislação brasileira, Salmonella sp. tem que estar ausente em 25g da amostra
de alimento. Entretanto, existe uma quantidade mínima necessária do microrganismo
para a ocorrência de doença em humanos. Esta quantidade, ou dose infectante pode
variar com o sorovar e com o estado de saúde ou tolerância de cada indivíduo.
Dependendo do sorovar e do alimento, a dose infectante em pessoas saudáveis pode
variar de 10
5
à 10
7
unidades formadoras de colônia (UFC). Diversos fatores de risco
como a contaminação cruzada, a falta de higiene na preparação do alimento e o
armazenamento em temperatura inadequada, podem permitir que o microrganismo se
multiplique até atingir doses infectantes. Por outro lado, o processamento dos alimentos
e o tratamento térmico antes do consumo podem contribuir para a redução da população
de microrganismos presentes nos alimentos.
Os fatores que podem contribuir para aumentar ou reduzir a probabilidade da
ocorrência de doenças causadas por um dado microrganismo transmitidas por
determinado alimento são avaliados através da análise de risco. Esta análise compreende
quatro etapas: identificação do perigo, a avaliação de risco, o gerenciamento do risco e a
comunicação de risco. Enquanto o gerenciamento e a comunicação de risco são
usualmente conduzidos pela indústria e pelas autoridades sanitárias de um país, a
identificação do perigo e a avaliação de risco baseiam-se nas investigações conduzidas
pela comunidade científica.
O isolamento de Salmonella enterica em suínos abatidos tem sido reportado no
sul do Brasil, demonstrando que este patógeno pode estar presente no alimento
causando risco à saúde do consumidor. Por outro lado, a maioria dos surtos notificados
e investigados no Rio Grande do Sul aponta o sorovar Enteritidis e os alimentos
preparados a partir de ovos como os mais implicados nos casos de salmonelose humana.
A partir disso, é preciso investigar a discrepância entre o elevado número de suínos
positivos para Salmonella ao abate encontrado na região e a ausência de surtos
relacionados aos seus produtos.
Sendo assim, este estudo teve por objetivo avaliar o risco que a ingestão de
lingüiça frescal de carne suína pode representar para a infecção do consumidor por
15
Salmonella sp. e seus resultados foram apresentados em quatro artigos científicos
abaixo relacionados:
1- Prevalência, caracterização genética e resistência a antimicrobianos de Salmonella
enterica isolada em lingüiça frescal de carne suína no sul do Brasil.
2- Curvas de crescimento e de destruição térmica de sorovares de Salmonella sp.
isolados de lingüiça frescal de carne suína.
3- Quantificação e caracterização molecular de Salmonella enterica presente em
alimentos envolvidos em surtos de salmonelose ocorridos no Rio Grande do Sul.
4- Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp. em lingüiça frescal suína.
16
2 Revisão Bibliográfica
2.1 Características Gerais
Atualmente, o gênero Salmonella está dividido em três espécies: S. enterica, S.
bongori e S. subterranea (SHELOBOLINA et al., 2004) e em mais de 2.500 sorovares
identificados, com vasta distribuição na natureza (POPOFF; BOCKEMÜHL;
GHEESLING, 2003), podendo estar presentes no trato gastrintestinal de diversos
animais, incluindo peixes, répteis, pássaros e mamíferos (HIRSH, 1990; CLARKE &
GYLES, 1993). A maioria dos sorovares não é adaptada a um único hospedeiro,
podendo causar doença tanto no homem como em animais (WRAY & SOJKA, 1977;
SCHWARTZ, 2000). No entanto, apenas um pequeno número dentre estes sorovares
está freqüentemente associado à doença, como Typhimurium e Enteritidis (WRAY &
SOJKA, 1977). Estes podem causar infecções intestinais de severidade variada, estando
envolvidos nos casos clássicos de toxinfecções alimentares (VARNAM, 1991).
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende bacilos
Gram negativos, predominantemente móveis pela presença de flagelos peritríquios,
anaeróbios facultativos, que apresentam metabolismo respiratório e fermentativo
(HOLT et al., 1994). A partir da fermentação de D-glicose e outros carboidratos
produzem ácido e gás (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Geralmente não fermentam
a lactose (CLARKE & GYLES, 1993). São indol negativos, oxidase negativos, catalase
positivos e produzem gás sulfídrico (HOLT et al., 1994).
A temperatura ótima para crescimento é 37
o
C (FRANCO & LANDGRAF,
1996), porém desenvolvem-se numa faixa de crescimento de 7
o
C a 45
o
C, são resistentes
à dessecação e ao congelamento, possuindo a capacidade de sobreviver no ambiente por
anos (WILCOCK & SCHWARTZ, 1993). No entanto, são sensíveis à luz solar e à
maioria dos desinfetantes como fenóis, clorados e iodados (SOBESTIANSKY et al.,
1999).
O crescimento de Salmonella sp. ocorre em um pH ótimo entre 6,5 e 7,5,
admitindo uma variação entre 4,5 e 9,0. Valores inferiores a 4,1 inativam e destroem a
Salmonella sp. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
2.2 Contaminação na granja
O contato com as fezes de animais infectados, limpeza e desinfecção inadequada
das instalações, introdução de animais portadores no rebanho e fornecimento de ração
contaminada com Salmonella sp. são fatores importantes na disseminação do
17
microrganismo para os suínos (HIRSH, 1990; SOBESTIANSKY et al., 1999;
BERENDS et al., 1997). Estima-se que entre 1 e 10% da contaminação de suínos
terminados tem origem ainda nas Unidades de Produção de Leitões (UPLs), até 30% das
infecções podem ser devidas à alimentação com rações contaminadas e as restantes
provenientes da microbiota da granja, via contato direto ou indireto com animais
portadores (BERENDS et al., 1997).
Baggesen et al. (1996) isolaram Salmonella nos dejetos (34%), fezes (25%), baias
(24%), equipamentos (19%) e sistema de ventilação (12%), comprovando que a
disseminação deste agente pode ser grande em uma propriedade, principalmente onde a
infecção é clínica.
Do ponto de vista de um programa APPCC (Análise de Perigos e Pontos Críticos
de Controle) o primeiro ponto de perigo em relação à Salmonella sp. é a granja, mais
precisamente o índice de portadores presentes nas mesmas. É neste ponto que os
programas de prevenção e controle devem iniciar com vistas à obtenção de um produto
de boa qualidade e livre de Salmonella sp.
2.3 Salmonelose em suínos
Em geral a Salmonella não causa doença clínica em suínos (VAN DER GAAG et
al., 2004; McDOWELL et al., 2007), sendo poucos os sorovares que constituem causa
significativa de doença, como Choleraesuis e Typhimurium (SOBESTIANSKY et al.,
1999).
A forma clínica da doença nos suínos pode se manifestar como uma septicemia
aguda ou como uma enterocolite aguda ou crônica (SOBESTIANSKY et al., 1999). No
Rio Grande do Sul, existem registros de formas entéricas e septicêmicas (BARCELLOS
et al., 1984), o que ocorre também em outras áreas do Brasil e do mundo. A infecção
por S. Typhimurium dissemina-se rapidamente entre os suínos, mas a mortalidade é
baixa (SCHWARTZ, 1991). Os suínos podem recuperar-se totalmente, mas alguns
poderão permanecer como portadores e excretores intermitentes por meses (WILCOCK
& SCHWARTZ, 1993).
Vários tipos de portadores têm sido identificados: portadores ativos, portadores
passivos e portadores latentes. Os portadores ativos excretam Salmonella sp. por meses
ou anos. Geralmente, os animais desenvolvem este estado após a recuperação da
infecção clínica. Os portadores passivos são os animais que ingerem Salmonella sp. e
esta passa através do intestino, nas fezes, com pouca ou nenhuma invasão nos
18
linfonodos mesentéricos. E os portadores latentes são animais que têm Salmonella. em
seus tecidos, mas geralmente não excretam em suas fezes (WRAY & SOJKA, 1977).
É na condição de portadores hígidos que os suínos representam uma maior
preocupação, pois neste estado se comportam como reservatórios de Salmonella e,
conseqüentemente, disseminadores do microrganismo pelas fezes (ZEBRAL;
FREITAS; HOFER, 1974). Estes portadores podem contaminar o ambiente, os
equipamentos e as carcaças no abatedouro (WILCOCK & SCHWARTZ, 1993).
2.4 Contaminação dos animais durante o transporte e espera pré-abate
Outra etapa preocupante é o transporte até o abatedouro, o qual reduz a resistência
do animal (LÁZARO; TIBANA; HOFER, 1997) podendo levá-lo a disseminar o
microrganismo, contaminando os caminhões (WILCOCK & SCHWARTZ, 1993).
Estes, por sua vez, tornam-se fonte de contaminação para os demais suínos e para o
ambiente (SCHWARTZ, 1991) facilitando, desta forma, a transmissão oro-fecal de
Salmonella (LÁZARO; TIBANA; HOFER, 1997). Morrow et al. (1999) concluíram que
o transporte e a espera para o abate podem provocar uma infecção inicial das tonsilas
podendo atingir o cólon e reto em duas horas.
Trabalhos realizados por Swanenburg et al. (2001a) e Rostagno et al. (2002),
relatam que a permanência no pré-abate em curral de espera com alto nível de
contaminação com Salmonella sp., pode ter efeito significativo no número de suínos
infectados no abate, não somente através do efeito associado ao estresse, mas também
como uma fonte de infecção. Mesmo a limpeza e desinfecção regular do curral de
espera são medidas insuficientes para eliminar toda a contaminação por Salmonella
presente (SWANENBURG et al., 2001b).
A diminuição da entrada de animais portadores no frigorífico é um ponto crucial
entre as medidas de controle de Salmonella, uma vez que os esforços adotados dentro
do frigorífico, para evitar a contaminação cruzada, não são capazes de eliminar o risco
se a prevalência de entrada de portadores for muito alta.
2.5 Importância de animais portadores de Salmonella ao abate
Animais portadores contaminados na propriedade ou nas baias de espera podem
contaminar o ambiente, os equipamentos e a carcaça no abatedouro (WILCOCK &
SCHWARTZ, 1993). Através da inspeção da carne, pode haver exposição dos
linfonodos contaminados e contaminação cruzada da carcaça (MÔO et al., 1980). A
ocorrência de Salmonella sp. em linfonodos intactos na carcaça foi analisada,
19
demonstrando o risco em saúde pública do abate de animais portadores (ALVES et al.,
1994). Da mesma forma a contaminação cruzada pelo conteúdo intestinal é de grande
importância durante o processamento. Swanenburg et al. (1999), observaram que
carcaças de suínos com tonsilas onde há presença de Salmonella sp. são mais sujeitas à
contaminação após o abate, do que carcaças de suínos sem a presença do microrganismo
nas tonsilas. A explicação para a associação entre tonsilas e carcaças com Salmonella
sp. pode ser o fato da contaminação de ambas ser causada mais de forma cruzada, do
que por uma extensa infecção por Salmonella sp. nos animais.
Em estudo prévio realizado no Rio Grande do Sul, a prevalência de suínos
portadores assintomáticos de Salmonella sp. em linfonodos mesentéricos e conteúdo
intestinal, no momento do abate, foi de 55,6% (BESSA; COSTA; CARDOSO, 2004).
Linfonodos mesentéricos e conteúdo intestinal positivos podem ser responsáveis pela
contaminação cruzada de carcaças durante o processamento, mas não são produtos que
chegam até o consumidor.
Castagna et al. (2004a) demonstraram que a presença de Salmonella sp. em
linfonodos mesentéricos e conteúdo intestinal de suínos ao abate estava correlacionada
com a presença desse organismo em tonsilas e linfonodos mandibulares. Da mesma
forma, Swanenburg et al. (2001a), indicaram o risco potencial destes animais durante o
processamento, encontrando correlação significativa entre presença de Salmonella sp.
em tonsilas e conteúdo intestinal com carcaças positivas na linha de abate.
A redução de patógenos em carnes vermelhas e de aves é a prioridade das
indústrias, a qual não é considerada uma tarefa simples. Quando a produção,
processamento, distribuição e a cadeia de preparação entender seus respectivos papéis
na segurança alimentar, a possibilidade do fornecimento de carnes vermelhas e de aves
mais seguras será possível (AMI, 2007).
2.6 Salmonella sp. como causa de toxinfecções alimentares
Salmonella é conhecida como causa de doença a mais de 100 anos (CDC, 2007), é
o mais importante contaminante de produtos alimentares e um dos principais agentes
bacterianos responsáveis por surtos de toxinfecções alimentares em diversos paises
(LACONHA et al., 2000; LOPALCO et al., 2000). Todo ano, aproximadamente 40.000
casos de salmonelose são relatados nos Estados Unidos e é estimado que
aproximadamente 600 pessoas morrem por ano com salmonelose aguda (CDC, 2007).
20
A transmissão de Salmonella sp. ao homem, através da população animal, pode
ocorrer pelo contato direto com os animais tanto nas granjas como nos frigoríficos. Mais
freqüentemente ocorre pela ingestão de produtos de origem animal contaminados
(WEGENER & BAGER, 1997), o que pode resultar em toxinfecções alimentares
(LEITÃO, 1988).
Em humanos, os sintomas iniciais da doença são náusea e vômito, que ocorrem de
8 a 24 horas após a ingestão do alimento contaminado e, geralmente, não persistem após
o início da diarréia. Durante a salmonelose aguda, as fezes podem conter um bilhão de
células de Salmonella por grama (ATLAS, 1997). A duração é, usualmente, de 4 à 7
dias e a maioria das pessoas se recupera sem tratamento. No entanto, em alguns
indivíduos a diarréia pode ser tão severa que o paciente precisa ser hospitalizado. Nestes
pacientes a infecção pode invadir a corrente sanguínea levando à septicemia e
aumentando o risco de óbito, a não ser que o paciente seja tratado rapidamente com
antibióticos. Idosos, crianças e aqueles com o sistema imune comprometido são mais
suscetíveis à doença severa (CDC, 2007).
O risco de desenvolver uma salmonelose pelo consumo de alimento é influenciado
por diversos fatores: a quantidade de Salmonella sp. presente, a composição do produto,
manipulação e práticas no preparo do alimento, suscetibilidade dos consumidores
primários, entre outros (WEGENER & BAGER, 1997).
Dependendo do sorovar e do alimento, a dose infectante em pessoas saudáveis
pode variar de menos de 10
3
unidades formadoras de colônia (UFC) no caso de
sorovares adaptados ao homem, até 10
5
– 10
7
UFC para sorovares não adaptados. Em
alimentos com elevado teor de gordura e proteínas, a dose infectante pode ser menor
devido à proteção das células contra o suco gástrico (VARNAM, 1991).
Doenças transmitidas por alimentos causadas por Salmonella são consideradas um
grande problema para a saúde pública (EUROPEAN COMMISSION, 2000). Embora os
produtos derivados de frangos sejam os mais envolvidos em surtos na Itália (SCUDERI;
SQUARCIONE; GRECO, 1993), a contaminação por produtos suínos também é
comum (CANTONI; D’AUBERT; TRALDI, 1993).
Devido ao aumento da incidência de casos em humanos durante os últimos 15
anos, Salmonella tem sido o microrganismo mais pesquisado na Dinamarca (HALD et
al., 2004). Desde 1998, na Dinamarca, aproximadamente 25.000 amostras têm sido
analisadas pela vigilância nacional de carne suína fresca. Adicionalmente, 37.000
“pools” de amostras exportadas (cada “pool” consistindo de cinco amostras) têm sido
21
examinados por ano. A Salmonella foi isolada em aproximadamente 1% das amostras
(ANON, 2000b).
Em pesquisas realizadas na Inglaterra e País de Gales, dos 101 surtos alimentares
analisados, Salmonella foi responsável por mais da metade desses (RYAN et al., 1996;
HUGHES; GILLESPIE; O'BRIEN, 2007). Segundo Hughes, Gillespie e O'brien (2007),
S. enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis fagotipo 4 foi o mais comum, enquanto
outros fagotipos de S. Enteritidis e S. Typhimurium foram identificados no restante das
amostras.
No Brasil, um notável aumento na incidência de S. Enteritidis em toxinfecções
alimentares em humanos e em produtos avícolas tem sido relatado desde a década de 90
(FUZIHARA; FERNANDES; FRANCO, 2000; SANTOS et al., 2000). A ocorrência de S.
Enteritidis, no Estado de São Paulo, tem aumentado acentuadamente desde 1994, sendo
este o sorovar mais freqüente, responsável por surtos de toxinfecções alimentares e
casos esporádicos de doenças gastrointestinais em humanos (TAVECHIO et al., 1996;
PERESI, et al., 1998).
No Rio Grande do Sul (2001), baseado em análises e dados microbiológicos,
relatórios anuais da DVS/RS demonstraram Salmonella sp. como o principal agente
etiológico responsável por toxinfecções alimentares nos últimos anos. Segundo Gottardi
(2003), em Porto Alegre foram notificados 303 surtos no período de 1995 a 2002,
envolvendo 7.373 pessoas. O principal agente etiológico identificado nos surtos foi a
Salmonella sp. (24,22 %), seguida por Staphylococcus aureus (12,42%). Os alimentos
mais freqüentemente envolvidos nestes surtos foram aqueles que continham
ingredientes de origem animal (60%), como os pratos preparados, produtos de
confeitaria, carne, leite e derivados. Foi possível relacionar 11 diferentes fatores
predisponentes durante os oito anos de estudo, sendo o mais prevalente a refrigeração
inadequada (33,33%) e a manutenção dos alimentos em temperatura ambiente por um
período superior a duas horas (28,3%).
Em trabalho realizado por Geimba et al. (2004), no Rio Grande do Sul, durante
1999 e 2000, foram investigadas 75 isolados de Salmonella provenientes de alimentos
envolvidos em surtos, onde 73 (97%) foram classificados como S. Enteritidis. Todas as
cepas de Salmonella isoladas em 1999 foram sorotipadas como Enteritidis, no entanto,
duas amostras, em 2000, foram classificadas como S. Derby e S. Typhimurium. Este
resultado aponta S. Enteritidis como causa predominante de gastrenterite em humanos
22
no RS durante o período investigado. Este sorovar de Salmonella tem sido reconhecido
como a maior causa de salmonelose em todo o mundo (AGRON et al., 2001) e tem sido
o sorovar mais isolado em intoxicações alimentares na Inglaterra e País de Gales
(LIEBANA et al., 2002), França (BOUVET et al., 2002) e EUA (LIN et al., 1996).
No Brasil a preocupação com a segurança dos alimentos é crescente. Os
Ministérios da Saúde (MS) e da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA),
encarregados de gerenciar as questões de segurança dos alimentos, têm revisado e
atualizado a legislação e têm implementado programas para avaliar o comportamento e
a condição do perigo em determinados elos da cadeia. O MAPA implantou o programa
para avaliar o problema relacionado com Salmonella no abate de aves, enquanto o MS
está trabalhando a questão deste mesmo perigo, buscando a quantificação de Salmonella
nos produtos expostos à comercialização (PAS, 2004).
2.7 Embutidos
Embutidos ou carnes preparadas embutidas são produtos elaborados com carnes
ou outros tecidos animais comestíveis, curados ou não, condimentados, cozidos ou não,
defumados e dessecados ou não, tendo como envoltório natural tripas, bexigas ou outras
membranas animais ou envoltório plástico apropriado (SÃO PAULO, 1978).
Os embutidos de carne compreendem basicamente duas classes, aqueles
preparados a partir de misturas de carnes moídas em maior ou menor grau como as
lingüiças frescas, lingüiças defumadas e salames; e os embutidos preparados a partir de
emulsões, como as mortadelas, salsichas e similares, também chamados de embutidos
cozidos (MARTINS & TERRA, 1985).
Os principais componentes da emulsão ou massa são a carne, água, gordura, sal,
aditivos e condimentos, proteínas suplementares e os amidos. A massa dos embutidos é
uma emulsão de gordura em água, portanto do tipo óleo-água, onde as gotículas de
gordura estão distribuídas de maneira relativamente uniforme e são mantidas em
suspensão pelas proteínas solúveis da carne (MARTINS & TERRA, 1985).
De acordo com Haack, Bernardi e Rivero (1991), as características das matérias-
primas, carne e gordura, são de importância decisiva para a elaboração de embutidos
crus em condições adequadas. A carne deve proceder de animais hígidos. Além disso, a
carne dos animais submetidos a extremas condições fisiológicas, isto é, às chamadas
influências de estresse, exibe uma maturação deficiente que se traduz em uma
acidificação deficiente ou num elevado valor do pH.
23
2.8 Salmonella em produtos suínos
Os suínos têm sido identificados em diversos paises como importantes portadores
de Salmonella (HALD et al., 2003; DAVIES et al., 2004) e nos últimos anos a carne
suína, cada vez mais, reconhecida como potencial origem de salmonelose humana
(HALD et al., 2003).
No México, Bello-Pérez (1993) verificou que de 9.322 amostras de alimentos,
encontrou-se Salmonella sp. em 30% das lingüiças e 33% dos salsichões. Da mesma
forma, Escartín et al. (1999), no mesmo país, encontraram 88,3% de embutidos
positivos.
Chaves et al. (2000), no Rio de Janeiro, encontraram 10% das amostras de
lingüiça frescal de origem suína positivas para Salmonella sp., enquanto Tavechio et al.
(2002) relataram 5% de ocorrência de Salmonella em salsicha em São Paulo e Lobo et
al. (2001) encontraram a mesma percentagem em salames coloniais positivos no Rio
Grande do Sul. Lírio et al. (1999) observaram que a lingüiça crua (10%) foi o segundo
alimento que originou maior número de isolamentos de Salmonella em São Paulo.
Surtos devido a lingüiças contaminadas têm sido relatados nos Estados Unidos,
onde a S. Typhimurium foi isolada (SAUER et al., 1997). Na Itália, Salmonella tem sido
isolada de lingüiças de carne de suínos e também em curados (GIOVANNINI et al.,
2004).
Em trabalho realizado por Giovanninni et al. (2004), na Itália, de um número total
de 595 amostras de produtos suínos, 58 (9,7%) foram encontradas contaminadas por
Salmonella. Quarenta (17,6%) das 227 lingüiças frescas, 9 (8,9%) das 101 lingüiças
secas e 9 (5%) das 180 carnes frescas foram positivas para Salmonella sp. S.
Typhimurium foi a mais freqüentemente isolada (35,5%), sorovar esse que é o segundo
maior causador de salmonelose em humanos (20,3% dos casos) na Itália (SCUDERI;
SQUARCIONE; GRECO, 1993).
Assim sendo, disponibilizar produtos livres de patógenos ou com baixos níveis
de contaminação tornou-se uma necessidade para entrar no mercado, uma vez que a
demanda por produtos suínos seguros e de qualidade constituem um filtro do
consumidor para o produtor. Desta forma, produtores de suínos que enviam ao mercado
um alimento seguro (com reduzido ou não detectável nível de Salmonella) podem ter
vantagens na comercialização (GORTON; KLIEBENSTEIN; BERAN, 1996).
24
2.9 Segurança dos alimentos
A segurança dos alimentos trata da proteção e preservação da vida e da saúde
humana dos riscos representados por possíveis perigos estarem presentes nos alimentos
(PAS, 2004).
É considerado perigo o agente de natureza biológica, física ou química, com
potencial para causar danos à saúde do consumidor. A existência do perigo é um alerta
que, no geral, significa realmente a possibilidade de ocorrer o dano (PAS, 2004), sendo
o risco a possibilidade do perigo se manifestar (NOTERMANS et al., 1996). A questão
do número ou concentração do perigo biológico é complexa e, no geral, considera-se
que o nível aceitável do perigo é aquele inferior á concentração capaz de causar danos à
saúde (PAS, 2004).
O conhecimento da dimensão e a possibilidade da ocorrência do risco em
alimentos demandam, portanto, um estudo estruturado e consistente dos dados
científicos e de um julgamento de valor. O fortalecimento e o encaminhamento da
ciência para o conhecimento que visa à solução desses problemas é uma necessidade
crescente nos dias atuais. Para tanto é necessário direcionar, dirigir e gerenciar estes
conhecimentos (PAS, 2004).
O aumento da preocupação dos efeitos decorrentes da presença de perigos em
alimentos e da globalização da economia tem estimulado os órgãos internacionais, os
governos e o setor produtivo de alimentos a considerar novas estratégias, assim como
aprimorar as existentes, para a redução dos riscos associados aos agentes de
toxinfecções alimentares. A estratégia mais importante da atualidade é o processo de
análise de risco (PAS, 2004), que tem alcançado cada vez mais importância na
microbiologia de alimentos (SERRA et al., 1999).
2.10 Análise de Risco
A análise de risco é um processo que objetiva estimar o risco da doença em dada
população por determinado patógeno e entender os fatores que influenciam esse
processo (FORSYTHE, 2002). É ordenada e envolve gestores e avaliadores de risco,
envolvidos e interessados, que tem a finalidade de obter as bases científicas para
dimensionar risco, avaliar as medidas sanitárias e facilitar a opção das formas de
controle (PAS, 2004). Segundo Murray et al. (2006), conforme estrutura da OIE, este
processo tem quatro componentes: Identificação do Perigo, Avaliação, Gestão e
Comunicação de Riscos.
25
A Identificação do Perigo é o processo que identifica os agentes patogênicos,
capazes de transmitir doença (MURRAY et al., 2006).
A Avaliação de Risco objetiva a avaliação de toda informação científica
disponível, relacionada com o perigo no alimento, objeto do desencadeamento do
processo de Análise de Risco (PAS, 2004). Conforme Murray et al. (2006) e Toma et al.
(1999) na estrutura da OIE, a avaliação de risco compreende quatro etapas:
- Probabilidade de introdução- descrição e quantificação da probabilidade de
introdução de um agente patogênico, a partir de animais ou de produtos de origem
animal submetidos a análise de risco.
- Avaliação da exposição: compreende uma descrição e uma quantificação da
probabilidade de exposição aos agentes patogênicos envolvidos.
- Avaliação das conseqüências: descrição dos efeitos adversos, incluindo as
conseqüências econômicas associadas ao agente patogênico associado as produtos de
origem animal submetidos a análise de risco.
- Estimativa do risco: feita pela integração das etapas de avaliação de riscos
descritos. Utiliza modelos matemáticos e estatísticos para estimar a probabilidade dos
efeitos adversos e da severidade de um perigo que pode ocorrer em indivíduos de uma
determinada população.
A gestão de Riscos é um processo distinto da avaliação de risco, de ponderação e
seleção das alternativas e políticas de proteção à saúde, por consulta aos interessados e
envolvidos e considerando a avaliação de riscos. Quando necessário, é processo de
seleção das opções para o controle e prevenção de risco por consumo de alimentos
(PAS, 2004).
A Comunicação de Riscos é o processo de troca interativa de informações e
opiniões durante o processo de análise, a respeito do risco, dos fatores relacionados a
eles, e da percepção do risco entre gestores e avaliadores, consumidores, indústrias,
comunidade acadêmica e científica e outras partes envolvidas e interessadas
(FORSYTHE, 2002).
2.11 Temperatura de Armazenamento
O armazenamento em temperatura adequada é importante, pois aumenta a vida
útil de prateleira e mantém a qualidade dos alimentos expostos á venda. Germano &
Germano (2001) mencionam que os alimentos podem ser inspecionados sob o aspecto
sanitário e industrializados de acordo com as técnicas mais modernas, mas se não forem
26
armazenados adequadamente no varejo, ou até na residência do próprio consumidor,
podem perder toda a sua qualidade em razão de estocagem.
O uso correto dos equipamentos de frio reduz significativamente a deterioração
dos alimentos e os riscos à saúde do consumidor (HAZELWOOD & McLEAN, 1996;
HOBBS & ROBERTS, 1998). Os alimentos, ainda que devidamente processados e
embalados, têm presença de bactérias em maior ou menor quantidade, que são inerentes
a sua natureza. Quanto menor for a temperatura de armazenamento, mais lentas serão as
reações químicas, a atividade enzimática e a multiplicação dos microrganismos e maior
será o tempo que os alimentos poderão ser armazenados antes do seu consumo
(THOMSON; WHITEHEAD; MERCURI, 1974; INMETRO, 1996).
Carnes e subprodutos de carnes são relatados freqüentemente como responsáveis
por intoxicações alimentares por Salmonella em humanos (BRYAN, 1980), usualmente
devido à contaminação pós-processamento do alimento cru combinada com o
armazenamento em temperatura inadequada (JUNEJA et al., 2007). A refrigeração
incorreta, bem como o armazenamento e transporte de carne suína em temperatura >7ºC
podem permitir a multiplicação de Salmonella (ICMSF, 1998).
Em trabalho realizado por Mürmann, Mallmann e Dilkin (2005), na cidade de
Santa Maria, RS, observou-se que 29,7% dos equipamentos de resfriamento
apresentaram temperaturas médias inadequadas, segundo o recomendado pela
Legislação Sanitária vigente, o que concorda com Desire & Tondo (2001) que, no
mesmo Estado, encontraram desacordo em 25% das câmaras frias analisadas. Em
pesquisa realizada por Carreira et al. (2003), 37,5% dos balcões de refrigeração, na
cidade de Belém/PA, encontravam-se em temperatura acima de 7°C.
Hiluy (1997) afirma que os alimentos perecíveis necessitam condições especiais
de armazenagem e é necessário que a refrigeração acompanhe esses produtos desde sua
produção até o consumo. A organização técnica e econômica que executa essa tarefa é
denominada “cadeia de frio” que inclui os frigoríficos, meio de transporte, câmaras e
balcões frigoríficos, em supermercados, panificadoras, restaurantes, etc., e as geladeiras
e congeladores domésticos. AMI (2007) afirma que é considerado ponto crítico a
temperatura de refrigeração da carne para controle da multiplicação bacteriana e,
segundo Flynn, Blair e Mcdowell (1992) e Johnson et al. (1998), muitos refrigeradores
domésticos são incorretamente ajustados, operando abaixo da temperatura
recomendada, permitindo um crescimento significativo de microrganismos mesófilos
como a Salmonella.
27
CAPÍTULO 2- Prevalence, genetic characterization and antimicrobial resistance
of Salmonella isolated from fresh pork sausages in Porto Alegre, Brazil
SUBMETIDO: FOOD CONTROL, 2007
28
Prevalence, genetic characterization and antimicrobial
resistance of Salmonella isolated from fresh pork sausages in
Porto Alegre, Brazil
Lisandra Mürmann
1
, Maria Cecília dos Santos
1
, Marisa Cardoso
1*
1
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
*Corresponding Author: Marisa Cardoso, Faculdade de Veterinária, UFRGS, Av.
Bento Gonçalves 9090, 90540-000. Porto Alegre, RS, Brazil. Tel: +55-513-316-6123,
Fax: +55-513-316-7305.
E-mail address: [email protected]
29
Abstract
A total of 336 samples of fresh pork sausage randomly obtained from supermarkets and
butcher shops in Porto Alegre city, Brazil, was examined for the presence of Salmonella
serovars. Salmonella enterica was detected in 82 (24.4%) samples, with a Most
Probable Number (MPN) count ranging from 0.03 MPN.g
-1
to 460 MPN.g
-1
. Strains
belonging to the most isolated S. enterica serovars (Brandenburg, Panama, Derby and
Typhimurium) were further characterized by XbaI-macrorestriction, resulting in a total
of 17 profiles. Resistance to tetracycline was the most prevalent among the Salmonella
isolates. S. Panama and S. Typhimurium presented the greatest number of resistance
phenotypes.
Keywords: Antimicrobial resistance, PFGE, pork sausage, Salmonella
30
1. Introduction
Salmonella is the leading cause of food-borne illness in Southern Brazil, with
foods of animal origin being reported as the major vehicle of this pathogen (Costalunga
and Tondo, 2002; Geimba, Tondo, Oliveira, Canal and Brandelli, 2004). Although
contaminated eggs and raw or undercooked poultry are the most involved food vehicles
human salmonellosis cases worldwide (Rabsch, Tschäpe and Bäumler, 2001), it was
estimated that pork causes 15-20% of all human cases of Salmonella infection (Berends,
Urlings, Snijders and van Knapen, 1996).
The Southern region of Brazil is the most important area for swine production in
the country. Its pork output accounted for two thirds of the country’s total production,
which consisted of 2.8 million tons in 2006. Approximately 70% of the pork in Brazil is
consumed in the form of processed meat products (sausages, bacon and ham). Among
these, fresh pork sausages are widely consumed in Southern Brazil, and are usually
roasted in restaurants and households.
Pork contamination by Salmonella can occur at multiple stages along the
production chain. Moreover, the level of Salmonella infection of pigs on farms can be
increased during transport, lairage and slaughtering-plant operations (Swanenburg,
Urlings and Snijders, 2001; Vieira-Pinto, Tenreiro and Martins, 2006).
Studies conducted in Southern Brazil have show a high carriage rate of
Salmonella in pigs at slaughter (Bessa, Costa and Cardoso, 2004), which was associated
with the increased isolation of Salmonella from batches of minced meat included in the
production of fresh sausage (Castagna, Schwarz, Canal and Cardoso, 2004). Thus, a
survey to estimate the frequency and level of Salmonella contamination of fresh pork
sausage at retail outlets in Porto Alegre, Southern Brazil, was conducted.
31
2. Material and methods
2.1. Sample collection
Fresh pork sausage samples (n=336) prepared in industrial food processing
plants, including prepackaged (n=155) and store-packaged sausage samples (n=181),
were randomly purchased from 36 butcher’s shops and supermarkets in Porto Alegre
city, Brazil. Stores were located in five central boroughs of the city and were identified
using phone books. Thirty three retail stores were visited twice and in three stores only
one sampling was conducted. Sampling visits were made every Monday for eight
months (April to November 2005). On each sampling day, three stores were randomly
chosen in one of the five boroughs. Five prepackaged or store-packaged raw pork
sausages were randomly selected in each store and transported on ice to the laboratory.
All sampled pork sausages were stored under refrigeration at the stores.
2.2 Salmonella isolation
Approximately 8 g of minced meat were removed aseptically from the casing of
three sausages belonging to the same purchased sample and put in a stomacher bag,
until a 25 g-aliquot was obtained. The remaining sausage portions were stored in sterile
flasks for up to seven days at 4ºC. To each stomacher bag, 250 ml of buffered peptone
water (BPW, Merck, Darmstadt, Germany) was added as pre-enrichment media, and the
mixture was homogenized. After incubation at 37ºC for 18 h, aliquots of 0.1 ml or 1.0
mL were transferred to Rappaport-Vassiliadis broth (RV, Merck) or Tetrathionate broth
(Difco Laboratories, Detroit, USA), respectively. After incubation at 42ºC for 24 h,
broth cultures were streaked onto both Xilose-Lisina-Tergitol 4 (XLT4, Difco) agar and
Brilliant Green Lactose Saccharose (BPLS, Merck) agar. Plates were incubated at 37ºC
for 24 h. Up to 5 colonies were selected from each plate and were streaked on Triple
32
Sugar Iron agar (TSI, Merck), Lysine Decarboxylase Iron agar (LIA, Merck) and
inoculated into urea broth (Merck). Colonies presumptively identified as Salmonella
were submitted to slide agglutination tests using poly-O antiserum (Probac, São Paulo,
Brasil) and were serotyped at the Brazilian Salmonella Reference Institute (Instituto
Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil).
2.3 Salmonella quantification
Fresh pork sausage samples, from which Salmonella was isolated, were
submitted to estimation of Salmonella using a Most Probable Number (MPN) technique
(Sinell, Pietzsch, Klingbeil and Benner, 1990). From each positive sample, which was
kept refrigerated, three portions of each 10 g, 1 g and 0.1 g were taken aseptically and
added individually to pre-enrichment tubes with BPW. After incubation of the pre-
enrichment tubes at 37ºC for 18 h, aliquots of 0.1 ml were transferred to 9.9 ml of RV.
Following incubation of the tubes of selective enrichment media at 42ºC for 24 h, the
samples were streaked onto XLT4 agar. After 24 h incubation at 37ºC, suspected
colonies from each plate were confirmed as Salmonella by biochemical tests and
agglutination using poly O-antiserum (Probac). The number of tubes in each dilution,
from which colonies were confirmed as Salmonella, was used to estimate Salmonella
quantification using the MPN table (BAM, 1998).
2.4. Macrorestriction analysis
Genomic DNA of Salmonella isolates, belonging to representative serovars, was
prepared as previously described (Schwarz and Liebisch, 1994; Liebisch and Schwarz,
1996). Slices of DNA-containing agarose plugs were digested with 20 units of XbaI
(Promega, Madison, WI, USA) at 37°C for 18 h. The respective fragments were
33
separated by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) in 1% PFGE-certified Agarose gel
(BioRad, Hercules, CA, USA) in a CHEF DR II system (BioRad, California, USA) at
5.6 V/cm with 0.5× TBE as the running buffer. In order to avoid the DNA degradation
of Salmonella Panama isolates, 50 μm of Thiourea (Acros Organics, Geel, Belgium)
was added to the running buffer. The pulse times were increased from 10 to 30 s during
the first 11 h and subsequently from 30 to 50 s during the next 13 h. The gel was stained
with ethidium bromide (2 μg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) and photographed under
UV-illumination. The XbaI fragments of S. Typhimurium LT2 served as size standards
(Liu, Hessel and Sanderson, 1993). Patterns produced by PFGE were compared using
the GelCompar II software package (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Dendrograms
were constructed by the unweighted pair-group method with arithmetic averages
(UPGMA) using the Dice coefficient.
2.5. Antimicrobial susceptibility testing
Antimicrobial resistance was determined by agar disk diffusion tests using disks
with the following antimicrobials (Cefar Diagnóstica, São Paulo, Brazil): amikacin
(Am, 30 μg), ampicillin (Ap, 10 μg), cefaclor (Ce, 30 μg), ciprofloxacin (Ci, 5 μg),
chloramphenicol (Cm, 30 μg), gentamicin (Ge, 10 μg), nalidixic acid (Na, 30 μg),
tetracycline (Te, 30 μg), tobramycin (To, 10 μg), streptomycin (Sm, 10 μg),
sulfamethoxazole-trimethoprim (St, 25 μg), and sulfonamide (Su, 300 μg). The testing
was conducted and evaluated according to the document M2-A8 of the Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI/NCCLS, 2005). Escherichia coli ATCC 25922
was used at a control.
3. Results
34
Salmonella enterica was detected in 82 (24.4%) samples of the fresh pork
sausages collected at retail level in Porto Alegre city, Brazil. Positive samples were
identified in fresh pork sausages belonging to 12 of 22 brands included in this study. No
statistical difference (p=0.64) was detected in the frequency of S. enterica isolation
between prepackaged (36/155) and store-packed (45/181) samples. Except for one strain
identified as belonging to the subspecies houtenae, the remaining strains belonged to the
subspecies enterica. Isolates were assigned to 12 serovars of S. enterica subsp. enterica
(Table 1), most of them belonging to serogroups B (58%) and D1 (22.2%).
S. enterica could not be re-isolated from 20 samples during the quantification
assays. In the remaining 62 positive samples the level of S. enterica varied from 0.03
MPN.g
-1
to 460 MPN.g
-1
(Table 1), with a median value of 0.23 MPN.g
-1
. The single
fresh pork sausage sample with a previous isolation of S. enterica subsp. houtenae
demonstrated a low level of contamination (0.03 MPN.g
-1
).
Strains belonging to the four most commonly isolated S. enterica serovars
(Brandenburg, Panama, Derby and Typhimurium) were further characterized by XbaI-
macrorestriction, resulting in a total of 17 profiles with 10-24 fragments each (Figure 1).
S. Derby (De patterns) and S. Brandenburg (Br patterns) presented the highest diversity.
The similarities among the different profiles in these serovars varied in the range 38.7-
96.8%. Contrarily, S. Panama (Pa patterns) was the most homogeneous with only two
different profiles and an overall similarity of 83.3%. Similar XbaI-macrorestriction
profiles were distributed among fresh pork sausages samples of different brands (Figure
1). Nevertheless, members of some profiles (Br3, De3 and Pa1) were obtained from
sausage samples of the same brand collected during different sampling events (data not
shown).
35
One isolate from each positive sausage sample was submitted to antimicrobial
susceptibility testing. Of a total of 82 strains analyzed, sixty-four (82%) displayed
resistance to at least one antimicrobial agent. The isolates showed an overall resistance
to 11 of the 14 drugs tested. The highest frequency of resistance was observed to
tetracycline (70.7%) followed by sulfonamide (54.9%). None of the strains were
resistant to amikacin, cefaclor or ciprofloxacin. The frequency of resistance against
antimicrobials varied among serovars (Table 2).
Among the 64 strains which showed resistance, 55 (85.9%) were found to be
resistant to more than one antimicrobial. Thirty different multidrug-resistance (MDR)
patterns were found, and most of them were represented by only one strain. Among the
most prevalent serovars, the MDR pattern StSuTe was the most commonly found.
4. Discussion
The present study demonstrated that Salmonella enterica was isolated from
24.4% of fresh pork sausages obtained from supermarkets and butcher’s shops in Porto
Alegre city, Brazil. Fresh pork sausages were chosen because of their wide availability
in grocery stores and common consumption in this region. Frequencies of Salmonella
isolation from pork sausages vary widely among different countries, and rates between
1.7% in Ireland (Boughton, Leonard, Egan, Kelly, O’Mahony, Markley et al., 2004) to
88.3% in Mexico (Escartin, Castillo, Hinojosa-Puga and Saldaña-Lozano, 1999) have
been reported.
Among the 82 Salmonella isolates from pork sausages in this study, only one
strain did not belong to S. enterica subsp. enterica. The relevance of this finding is
uncertain, since in Brazil less than 1% of 4,581 Salmonella strains isolated from non-
human sources have been identified as S. enterica subsp. houtenae (Tavechio, Ghilardi,
36
Peresi, Fuzihara, Yonamine, Jakabi et al., 2002), and human infections associated with
this subspecies are considered rare. Nevertheless, a case of bacteremia in a 33-year-old
HIV-infected patient caused by S. enterica subsp. houtenae was diagnosed in Rio de
Janeiro (Lourenço, Reis, Valls, Asensi and Hofer, 2004). In this case, close contact with
animal reservoirs or contamination through ingested food were indicated as possible
sources of infection.
Salmonella enterica subsp. enterica strains belonging to serogroups B and D1
accounted for 77.8% of all isolates. These serogroups were also the most prevalent in
porcine samples collected at slaughterhouses in southern Brazil (Bessa et al., 2004;
Castagna et al., 2004), and seem to be the most relevant to the swine industry in this
region. The most isolated serovars in our study are frequently isolated from pork
(Escartin et al., 1999; Botteldoorn, Herman, Rjipens and Heyndrickx, 2004) and were
reported as the cause of several outbreaks in humans (Herikstad, Motarjemi and Tauxe,
2002). S. Typhimurium specifically constitutes a major pathogen responsible for
salmonellosis in humans (Mead, Slutsker, Dietz and McCaig, 1999; Rabsch et al.,
2001). Contrary to this, only S. Typhimurium is among the top 10 serovars isolated
from human patients and from non-human sources in Brazil (Taunay, Fernandes,
Tavechio, Neves, Dias and Irino, 1996; Tavechio, Fernandes, Neves, Dias and Irino,
1996). In this country, S. Enteritidis has been the most prevalent serovar from every
kind of source (Tavechio et al., 2002), and was also identified in 97% of foods involved
in outbreaks occurring in the same region of our study (Geimba et al., 2004). In both
studies poultry meat, eggs and homemade mayonnaise accounted for the majority of
foods implicated in food borne outbreaks, while pork represented less than 1% of the
samples.
37
In accordance to other reports (Sinell et al., 1990; Escartin et al., 2000),
Salmonella could not be re-isolated from 20 sausage samples in our study using the
quantitative assay, although corresponding portions of the same samples had been
positive in the qualitative assay. The heterogeneous distribution and the overall low
number of salmonellae in the sample may be pointed as the cause of failure in the re-
isolation of salmonellae from meat (Sinell et al., 1990). Similar to other studies of
Salmonella quantification in pork, the great majority of samples in our study
demonstrated a level of contamination below 100 MPN.g
-1
(Sinell et al., 1990; Escartin
et al., 1995; Giovannini et al., 2004). In spite of the generally low level of
contamination found, and the habit of eating pork sausages well-done in Southern
Brazil, every Salmonella-positive sample may represent a potential health hazard.
Furthermore, contaminated sausages may also represent a potential source of cross
contamination in the kitchen environment and for ready-to-eat foods.
The potential sources of the high Salmonella prevalence found in pork sausages
were investigated by analyzing XbaI-macrorestriction profiles of strains belonging to
the most isolated Salmonella serovars. Although strains of some profiles (Br3, De3 and
Pa1) were obtained from sausage samples of the same brand, in most cases similar
profiles were distributed among fresh pork sausages samples of different brands.
Furthermore, most Salmonella strains isolated from sausage samples of the same brand
presented different profiles or belonged to different serovars. These results reflect the
complexity of the Salmonella transmission chain, which provides many opportunities
for infection/reinfection and cross contamination on pre-harvest and post-harvest stages.
Moreover, as demonstrated in previous studies (Duffy, Belk, Sofos, Bellinger, Pape and
Smith, 2001; Castagna et al., 2004), pork products, such as sausages, which are exposed
to more extensive handling than regular meat have a higher risk of Salmonella
38
contamination at food processing plants. Furthermore, in butchers’ shops many
opportunities for cross contamination of store-packed products are also present. During
cutting and handling, the microbial load is redistributed throughout the product and can
increase due to exposure to other contamination sources, such as knives and work tables
(Berends et al., 1996; Reij, den Aantrekker and ILSI Europe Risk Analysis in
Microbiology Task Force, 2004). In this sense, cross contamination at retail level could
explain store-packed sausage samples of different brands purchased in the same store
which presented Salmonella strains with a common XbaI-macrorestriction profile in two
sampling events of our study.
Multidrug-resistant Salmonella spread by food animals represents an additional
public health risk (Cruchaga, Echeita, Aladueña, García-Peña, Frias and Usera, 2001).
In this study, we demonstrated the widespread occurrence of antimicrobial resistance to
tetracycline and sulfonamide in Salmonella strains isolated from fresh pork sausages.
This finding is in accordance with previous studies of Salmonella strains isolated from
slaughtered pigs in Brazil (Oliveira, Carvalho, Fernandes, Tavechio, Menezes and
Domingues Jr., 2002; Michael, Cardoso and Schwarz, 2006; Bessa, Michael, Canu,
Canal, Cardoso, Rabsch et al., 2007). Moreover, a relatively high frequency of
chloramphenicol resistance in isolates tested in this study and elsewhere (Bessa et al.,
2007) was also detected. Tetracycline and sulfonamide have been widely used in pig
production in Brazil, and this fact can explain the high rates of resistance which were
found. On the other hand, chloramphenicol was banned from animal production in
Brazil more than a decade ago. The occurrence of resistance against this antimicrobial
could possibly be due to the emergence and spread of multi-drug resistant Salmonella
isolates that harbour physically linked resistance to this drug, as previously reported
(Briggs and Fratamico, 1999). Contrary to the increasing incidence of ciprofloxacin-
39
resistant S. Typhimurium reported in other countries (Threlfall, Ward and Rowe, 1997;
Angulo, Johnson, Tauxe and Cohen, 2000), we did not find resistance to ciprofloxacin.
However, a marked resistance to nalidixic acid was detected in the most prevalent
serovars (except for S. Derby) isolated from fresh pork sausages. This is a matter of
concern, since nalidixic acid resistance has been associated with a decrease in
susceptibility to fluoroquinolones, which is used to treat salmonellosis in humans
(Gorman and Adley, 2004).
In our study, 30 different MDR patterns were found, and two serovars
commonly involved in food borne outbreaks, S. Panama and S. Typhimurium, presented
the greatest number of resistance phenotypes, and may reflect a reservoir of resistance
in animals which can be transmitted to humans. Contrarily, the most common resistant
phenotype presented by S. Typhimurium DT104 strains (resistance to ampicillin,
chloramphenicol, streptomycin, sulfamethoxazole, and tetracycline) (Beaudin,
Brosnikoff, Grimsrud, Heffner, Rennie and Talbot, 2002) was not detected in strains of
our study. As antibiotic usage varies among countries, different patterns of resistance
phenotypes and genotypes can be expected. Thus, the monitoring of antimicrobial
resistance patterns presented by pathogenic strains isolated from different sources and
regions is an important issue.
Our data confirms that raw pork sausages may be vehicles for transmitting
Salmonella enterica in Southern Brazil. To diminish contamination rates by Salmonella
in fresh pork sausages, it is critical that risk reduction strategies are used throughout the
food chain. These strategies should include on-farm practices which reduce pathogen
carriage, increased hygiene at slaughter and meat processing, continued implementation
of Hazard Analysis Critical Control Points (HACCP), and increased consumer
education efforts.
40
Acknowledgements
The authors thank to Beatriz M. Falavigna (Fundação Instituto Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, Brazil) for serotyping the Salmonella strains. This study was supported by the
Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq (L. Mürmann).
41
Table 1 Distribution and quantification of Salmonella enterica subsp. enterica serovars
isolated from fresh pork sausages samples collected in Porto Alegre city, Brazil
Salmonella enterica
serovars (Serogroup)
Isolation
Positive
Samples
Reisolation
Negative
Samples
MPN.g
-1*
0.03 -0.1 0.1-1.0 1.0-10 10-100 460
Brandenburg (B) 14 6 3 5
Panama (D1) 12 2 4 5 1
Derby (B) 11 1 3 6 1
Typhimurium (B) 8 1 4 3
Agona (B) 6 1 2 2 1
Infantis (C1) 5 - 2 2 2
S. enterica O:4,5 (B) 5 2 - 1 1
S. enterica O:9,12 (D1) 4 - 2 2
Schwarzengrund (B) 3 1 2
Senftenberg (E4) 3 2 1
Ohio (C1) 2 - 1 1
Orion (E1) 2 - 2
Cerro (K) 2 1 1
S. enterica rough 2 1 1
Münster (E1) 1 1
S. enterica O:6,7 (C1) 1 - 1
Total 81 19 22 31 3 4 2
*Most Probable Number
42
Table 2 Antimicrobial resistance frequency among Salmonella isolates from fresh pork
sausages by serovars
Number of resistant isolates (%) from different
Salmonella Serovar
Antimicrobial
Brandenburg
(n=14)
Panama
(n=12)
Derby
(n=11)
Typhimurium
(n=8)
All other
serovars
(n=36)
Ampicillin 0 10 (83.0) 1 (9.1) 5 (62.5) 9 (25.0)
Chloramphenicol 1 (7.1) 9 (75.0) 2 (18.2) 3 (37.5) 10 (27.8)
Gentamicin 0 1 (8.0) 0 1 (12.5) 0
Nalidixic acid 5 (35.7) 6 (50.0) 0 4 (50.0) 5 (13.9)
Tetracycline 13 (92.9) 9 (75.0) 11 (100) 7 (87.5) 18 (50.0)
Tobramycin 0 0 0 1 (12.5) 1 (2.8)
Streptomycin 1 (7.1) 9 (75.0) 5 (45.5) 1 (12.5) 7 (19.4)
Sulfamethoxazole-
trimethoprim
12 (85.7) 4 (33.0) 2 (18.2) 1 (12.5) 5 (13.9)
Sulfonamide 12 (85.7) 10 (83.0) 9 (81.8) 3 (37.5) 11 (30.6)
43
Fig. 1. XbaI-macrorestriction profiles identified in the most representative Salmonella serovars (De,
S. Derby; Br, S. Brandenburg; Ty, S. Typhimurium; Pa, S. Panama) isolated from fresh
pork sausage samples in Porto Alegre, Brazil. The dendrogram presents the similarity
determined by Dice coefficient and UPGMA clustering.
A(1); B(3)
A(1)
B(3)
I(1)
F(1); G(1); E(1); J(1);
H(1)
A(1); G(2); J(1); H(1)
A(1)
G(1)
G(1)
A(6); D(3)
G(2); I(1)
Br2
Br3
Br4
Br1
Br5
45.7
69.3
90.6
96.0
1009080706050
Ty1
Ty2
Ty3
Ty4
85.7
83.8
62.2
100908070
Dice similarity coefficient (%)
XbaI-macrorestriction profiles
Pa1
Pa2
10095 90 85
83.3
Sausage brand
(
number of strains
)
De1
De2
De3
De4
De5
De6
94.9
71.1
48.6
38.7
100 90 80
70
60 50 40
96.8
A(1); B(1); G(2)
C(1)
B(1)
A(3)
J(1)
K(1)
44
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49
CAPÍTULO 3 – Crescimento e de destruição térmica de sorovares de Salmonella
sp. isolados de lingüiça frescal de carne suína
SUBMETIDO: ACTA SCIENTIAE VETERINARIAE, 2007
50
Crescimento e de destruição térmica de sorovares de Salmonella sp. isolados de
lingüiça frescal de carne suína
Growth and death curves of Salmonella serovars isolated from fresh pork sausages
Lisandra Mürmann¹, Maria Cecília Magagnin dos Santos
1
; Marisa Cardoso
1
1
Setor de Medicina Veterinária Preventiva. UFRGS. Av. Bento Gonçalves, 9090. Agronomia. CEP:
91540.000. Porto Alegre/RS. Correspondência: [email protected]r; Fax: 52-3308-6123.
51
RESUMO
Análises conduzidas em produtos de origem suína têm demonstrado a ocorrência de
Salmonella sp. em baixas contagens. Entretanto, fatores relacionados ao armazenamento
e preparo dos alimentos podem influenciar a população de Salmonella sp. presente no
alimento, determinando que doses suficientes para causar infecção alimentar sejam
alcançadas. Desta forma, para a condução de uma análise de risco, essas variáveis
precisam ser estudadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a cinética de crescimento e
destruição de isolados de Salmonella encontrados em lingüiça frescal de carne suína.
Foram utilizados isolados de doze sorovares distintos de Salmonella, os quais após
cultivados em caldo nutriente foram ajustados até uma concentração de 4 log
10
para os
ensaios de crescimento e 8 log
10
para inativação térmica. Os ensaios de crescimento
foram conduzidos na temperatura ambiente (22-33°C) e de refrigeração (6-11°C),
enquanto a destruição térmica foi avaliada a 60°C. Após diferentes intervalos de tempo
na temperatura ambiente (0-10 horas); refrigeração (0-30 dias) e temperatura de
destruição (0-30 minutos) foram retiradas alíquotas e realizadas contagens pelo método
de Miles-Misra. A cinética de crescimento em temperatura ambiente foi semelhante
para os diferentes sorovares que permaneceram até duas horas em fase lag e, após, foi
iniciada a fase exponencial. Em temperatura de refrigeração, todos os isolados
apresentaram o mesmo comportamento, mantendo a contagem inicial até 30 dias. A
inativação térmica total ocorreu após o tempo de 20 minutos em todos os ensaios. Os
resultados obtidos neste trabalho inferem que isolados dos diferentes sorovares de
Salmonella apresentam cinética de crescimento e de destruição térmica semelhante.
Descritores: Salmonella, temperatura, cinética de crescimento, cinética de destruição
52
ABSTRACT
Low counts of Salmonella sp. has been detected in assays conducted with pork
products. However, storage condition and food preparation can affect Salmonella
populations in contaminated foods, allowing the multiplication until the infectious dose
level. For this reason, the aforementioned variables must be included in food risk
analysis. The aim of this study was to evaluate the growth and death curves of
Salmonella isolates from fresh pork sausages. Isolates belonging to twelve Salmonella
serovars were grown in nutrient broth and diluted until a concentration of 4log
10
or
8log
10
for the growth assays and heat destruction test, respectively. The growth curve
was determinate at room temperature (22-33°C) and under refrigeration (6-11°C), while
the death curve was evaluated at 60°C. After different intervals at room temperature (0-
10 h), under refrigeration (0-30 days) and at 60°C (0-30 min), aliquots were taken from
each assay for bacterial enumeration using the Miles-Misra method. At room
temperature, all Salmonella serovars started the exponential phase after a two hours
period of lag phase. Under refrigeration all isolates remained with the initial population
counts up to 30 days. The total heat inactivation was observed after 20 min in all assays.
The results indicated that isolates belonging to the analyzed Salmonella serovars present
similar growth and heat destruction curves.
Key words: Salmonella, temperature, growth curve, heat death curve
INTRODUÇÃO
Salmonella sp. é um importante contaminante de alimentos, principalmente de origem
animal, e é um dos principais agentes bacterianos responsáveis por toxinfecções em
muitos países [11,13]. Segundo dados da Secretaria Estadual da Saúde no Estado do Rio
Grande do Sul, desde 1993, a salmonelose tem sido a doença transmitida por alimentos
53
de maior ocorrência [6,17]. Apesar da maioria dos surtos estar relacionada com
alimentos contendo ovos [3, 17], produtos de origem suína podem ser igualmente
veiculadores de Salmonella [2]. O risco de desenvolver salmonelose pelo consumo de
um alimento é influenciado por diversos fatores, entre eles a quantidade de Salmonella
sp. presente e práticas de armazenamento e preparo do alimento [20,3]. O binômio
tempo/temperatura ao qual o alimento está exposto, associado à velocidade de
crescimento do isolado bacteriano, pode determinar que o alimento contaminado, no
momento da ingestão, apresente contagens de Salmonella sp. capazes de causar infecção
[5]. Dessa forma, para a avaliação do risco que um alimento representa deve-se levar em
consideração a influência de eventos que propiciem a multiplicação e a destruição da
bactéria e a dose infectante presente no momento da ingestão desse alimento. Como
uma das etapas para a análise desse risco, o objetivo desse trabalho foi avaliar o
crescimento, em temperatura ambiente e de refrigeração e a inativação térmica de
sorovares de Salmonella isolados de lingüiça frescal de carne suína.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados isolados de doze sorovares distintos de Salmonella sp.
(Brandenburg, Panama, Derby, Typhimurium, Agona, Senftenberg, Schwarzengrund,
Infantis, Ohio, Orion, Cerro e Muenster), oriundos de lingüiça frescal suína. Alíquotas
(1mL) de culturas de 24 horas em Infusão Cérebro e Coração (BHI) de cada isolado
foram diluídas seriadamente em água peptonada 0,1%, em triplicata. Para os ensaios de
crescimento utilizou-se a concentração de 4 log
10
e para inativação térmica 8 log
10
. As
amostras mantidas à temperatura ambiente (22-33°C) foram monitoradas após os
tempos de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 horas. As armazenadas sob refrigeração (6-11°C) foram
verificadas nos dias 0, 1, 10, 20, 30. Nos ensaios de destruição térmica em banho-maria
(60°C) foram utilizados os intervalos de 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. A cada
54
um dos referidos tempos, alíquotas dos ensaios realizados foram semeadas, em
triplicata, em Ágar Triptose de Soja (TSA), pelo método de plaqueamento em gotas
[15]. Foram calculadas as médias das repetições obtidas para cada sorovar, utilizando o
programa Microsoft Office Excel.
RESULTADOS
A partir da população inicial de 4 log
10
, a cinética de crescimento em
temperatura ambiente foi semelhante para todos os sorovares. Até duas horas todos os
isolados permaneceram em fase lag e, a partir desse período, foi iniciada a fase
exponencial. Nas 6 horas a contagem esteve entre 5-7 log
10
e, após 10h, foi alcançado 7-
8 log
10
(Figura 1A). Em temperatura de refrigeração, os isolados de todos os sorovares
mantiveram contagens iniciais até os 30 dias (Figura 1B).
Em relação aos resultados obtidos na curva de destruição térmica, a partir da
população inicial de 7-8 log
10
, todos os sorovares de Salmonella submetidos á
temperatura de 60°C, foram totalmente inativados após o tempo de 20 minutos (Figura
1C).
DISCUSSÃO
Em estudos conduzidos anteriormente observou-se que baixas contagens de
Salmonella sp. podem estar presentes em lingüiça frescal de carne suína [16]. Desta
forma, o risco que esse produto oferece ao consumidor estará relacionado à existência
de condições que permitam a multiplicação da bactéria no alimento. Nesse contexto, o
estudo da cinética de crescimento do microrganismo é de grande importância [18] uma
vez que um alimento será submetido a fatores extrínsecos variáveis que influenciarão na
sua sobrevivência. Ao lado disso, o parâmetro de crescimento obtido para as populações
de microrganismos pode diferir [12]. Dessa forma, para as simulações necessárias para a
análise do risco que o consumo de lingüiça frescal de carne suína pode oferecer para a
55
ocorrência de salmonelose, os diversos sorovares de Salmonella encontrados nesse
produto foram analisados quanto ao seu comportamento quando submetidos a diferentes
temperaturas.
Em temperatura ambiente, os diferentes isolados apresentaram comportamento
semelhante iniciando a multiplicação após duas horas. Tempo de duração semelhante na
fase lag havia sido observado em isolados dos sorovares Enteritidis, Bredeney e
Typhimurium, seguido de uma fase exponencial que durou aproximadamente 12 horas
[14]. Além disso, esse período de fase lag corrobora dados anteriores [3] demonstrando
que mais de 20% das toxinfecções alimentares ocorridas no Rio Grande do Sul, entre
1997 e 1999, foram causadas pelo armazenamento dos alimentos em temperatura
ambiente por mais de duas horas. Também considerando que a fase lag das bactérias é
curta, a RDC 216 [1] institui que produtos perecíveis devem ser expostos à temperatura
ambiente somente pelo tempo mínimo necessário, a fim de não comprometer a
qualidade higiênico-sanitária do alimento.
Por outro lado, quando os isolados foram mantidos em temperatura de
refrigeração, como preconiza a legislação, a população de Salmonella manteve-se
constante pelos 30 dias de observação. Em condições de baixas temperaturas, as reações
químicas, a atividade enzimática e a multiplicação dos microrganismos são mais lentas,
levando a um maior tempo em que os alimentos poderão ser armazenados antes do seu
consumo [10,19]. Entretanto, o armazenamento sob refrigeração não resultou na
diminuição das populações de Salmonella sp., demonstrando que, uma vez
contaminado, o alimento poderá representar risco durante toda sua vida de prateleira.
A dose infectante de Salmonella para humanos saudáveis varia entre 10
6
e 10
8
unidades formadoras
de colônia (UFC), embora já tenham sido relatados casos de
salmonelose com doses inferiores [9]. Neste estudo, a dose infectante foi alcançada após
56
período de 6-8 horas na temperatura ambiente, demonstrando que mesmo os alimentos
com uma população inicial reduzida de Salmonella, poderão ser potenciais causadores
de toxinfecção alimentar, caso tenham um armazenamento prolongado na temperatura
de risco.
A maioria da população costuma consumir a lingüiça frescal após a cocção,
sendo importante, para compor as simulações da análise de risco, o conhecimento da
cinética de destruição do microrganismo. A população inicial adotada no estudo de
destruição térmica esteve acima daquela considerada como dose infectante, bem como
das contagens encontradas em amostras de lingüiça frescal [16]. Entretanto, no presente
estudo simulações de armazenamento inadequado, anterior ao tratamento térmico,
demonstraram o aumento expressivo da população inicial. Por conta disso, o
experimento de inativação térmica partiu de um cenário mais adverso, onde as
contagens iniciais teriam sido ampliadas em mais de 5 log
10
. Mesmo nessas condições,
porém, após 20 minutos numa temperatura inferior ao preconizado pela RDC 216 [1] a
ser atingida em todas as partes do alimento (70ºC), houve a completa inativação de
todos os isolados pertencentes aos sorovares de Salmonella provenientes desse tipo de
alimento. Este resultado é semelhante ao encontrado para S. Enteritidis [14], onde uma
população inicial de 6-7 log
10
foi destruída em 15 minutos. Porém o tempo encontrado
foi superior ao reportado por outros autores para uma população de 5 log
10
de S.
Enteritidis [8]. Deve-se considerar, ainda, que a condução do experimento no presente
estudo em água peptonada não incluiu na simulação à proteção que a matriz do alimento
pode oferecer contra a inativação térmica da bactéria. Desta forma, num próximo passo
da análise de risco, a matriz do alimento deverá ser incluída na simulação.
Finalmente, mesmo considerando a destruição que a bactéria sofrerá durante o
tratamento térmico do alimento, riscos como a contaminação cruzada [4,7] de outros
57
alimentos em contato com a mesma superfície de preparo onde esteve a lingüiça frescal
contaminada, bem como a recontaminação desse alimento, após o tratamento térmico,
não podem ser esquecidos.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que isolados dos diferentes
sorovares encontrados na lingüiça frescal suína apresentam cinética de crescimento e
destruição térmica semelhantes.
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60
A B C
024681012
2
3
4
5
6
7
8
9
Log
10
(UFC/mL)
Tempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30
2
3
4
5
6
7
8
Log
10
(UFC/mL)
Tempo (dias)
0 2 4 6 8 101214161820
0
1
2
3
4
5
6
7
8
LOG
10
(UFC/mL)
Tempo (minutos)
Figura 1- Curva de crescimento médio de isolados dos sorovares Brandenburg, Panama,
Derby, Typhimurium, Agona, Senftenberg, Schwarzengrund, Infantis, Ohio,
Orion, Cerro e Muenster de Salmonella, em água peptonada 0,1%, na
temperatura ambiente (1A), sob refrigeração (1B) e destruição térmica (1C).
61
CAPÍTULO 4- Quantification and molecular characterization of Salmonella
isolated from food samples involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do
Sul, Brazil
SUBMETIDO: BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, 2007
62
Quantification and molecular characterization of Salmonella isolated from food
samples involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, Brazil
Lisandra Mürmann
1
, Maria Cecília dos Santos
1
, Solange Mendes Longaray
2
, Jane Mari
Corrêa Both
2
, Marisa Cardoso
1*
1
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Instituto de Pesquisas Biológicas- Laboratório Central do Estado, Fundação Estadual
de Produção e Pesquisa em Saúde, Secretaria Estadual da Saúde do Estado do Rio
Grande do Sul (IPB-LACEN/RS)
*Corresponding Author: Marisa Cardoso, Faculdade de Veterinária, UFRGS, Av.
Bento Gonçalves 9090, 90540-000. Porto Alegre, RS, Brazil. Tel: +55-51-3308-6123,
Fax: +55-51-3308-7305.
E-mail address: [email protected]
63
ABSTRACT
Data concerning the prevalence and populations of Salmonella in foods implicated in
outbreaks may be important to the development of quantitative microbial risk
assessments. In this sense, the objective of the present study was to assess the amount of
Salmonella sp. in different foods implicated in foodborne outbreaks in Rio Grande do
Sul and to characterize the isolated strains using phenotypic and genotypic methods.
Nineteen food samples involved in ten foodborne outbreaks occurred in 2005, and
positive on Salmonella isolation at the Central Laboratory of the Health Department of
the State of Rio Grande do Sul, were included in this study. Food samples were
submitted to estimation of Salmonella using the Most Probable Number (MPN)
technique. Moreover, one confirmed Salmonella colony of each food sample was
serotyped, characterized by XbaI-macrorestriction profile, and submitted to
antimicrobial susceptibility testing. Foods containing eggs, mayonnaise or chicken were
contaminated with Salmonella in eight outbreaks. Higher counts (>10
7
MPN.g
-1
) of
Salmonella were detected mostly in foods containing mayonnaise. The isolation of
Salmonella from multiple food items in five outbreaks probably resulted from the cross-
contamination, and the high Salmonella counts detected in almost all analyzed samples probably
resulted from storing in inadequate temperature.
All strains were identified as S. Enteritidis,
and presented a unique macrorestriction profile, demonstrating the predominance of one
clonal group in foods involved in the salmonellosis outbreaks. A low frequency of
antimicrobial resistant S. Enteritidis strains was observed and nalidixic acid was the
only resistance marker detected.
Key words: Salmonella, foodborne outbreak, quantification, PFGE.
64
INTRODUCTION
In Southern Brazil, a high prevalence of Salmonella isolation has been found in
pigs (2), pork (6) and pork products (24). In opposite to that, pork is rarely involved in
salmonellosis outbreaks reported in this region (8, 25). Data collected in Rio Grande do
Sul, a State located in Southern Brazil, during the period of 1997 to 1999, pointed salad
prepared with homemade mayonnaise as the most often implicated in salmonellosis
outbreaks, accounting for 42.45% of all identified food vehicles (8). Factors responsible
for the discrepancy between Salmonella prevalence in pork and the frequency of
foodborne outbreaks attributed to pork consumption need to be better investigated.
It is well documented that exposure to larger quantities of foodborne pathogens
usually results in a greater risk to human health (14, 32). Consequently, the final
concentration of Salmonella in food is an important parameter contributing to overall
disease risk. In this sense, data on the prevalence and populations of Salmonella in
foods implicated in outbreaks may be important to the development of quantitative
microbial risk assessments.
Another aspect contributing to the understanding of Salmonella epidemiology is
the characterization of the strains involved in outbreaks. Serotyping is traditionally
conducted as a first approach in the characterization and usually forms the background
for all other typing methods (27). Over the past two decades genotyping has been
associated to the traditional typing methods to achieve a better discrimination of strains
and to identify bacterial clones (27). Among the molecular methods, pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) is considered the standard method for DNA fingerprinting in
Salmonella, and has been performed to investigate salmonellosis outbreaks (17, 21).
65
Based on this, the objective of the present study was to assess the amount of
Salmonella sp. in different foods implicated in foodborne outbreaks in Rio Grande do
Sul and to characterize the isolated strains using phenotypic and genotypic methods.
MATERIAL AND METHODS
Food samples
Nineteen food samples involved in ten food-borne outbreaks occurred in Rio
Grande do Sul in 2005, and positive on Salmonella isolation at the Central Laboratory
of the Health Department of the State of Rio Grande do Sul (LACEN/RS) were included
in this study. Food samples were stored during the analysis period in sterile flasks at
4ºC. Data available for each confirmed salmonellosis outbreak were obtained from the
epidemiological investigation report received with the food samples by LACEN.
Salmonella quantification
Food samples were submitted to estimation of Salmonella using the Most
Probable Number (MPN) technique. From each positive sample, 25 g were added to 225
mL of Buffered Peptone Water (BPW, Merck, Darmstadt, Germany). The samples were
homogeneized for 1 min (Stomacher, Interscience) and decimal dilutions up to 10
-8
were prepared in BPW. Triplicate tubes of all dilutions were incubated at 35 °C for 18
h. From each dilution tube, aliquots of 0.1 ml were transferred to 9.9 ml of Rappaport-
Vassiliadis broth (Merck). Following incubation on the selective enrichment media at
42ºC for 24 h, samples were streaked onto XLT4 agar (Difco). After 24 h incubation at
37ºC, suspected colonies from each plate were confirmed as Salmonella by biochemical
tests and agglutination using poly O-antiserum (Probac). One confirmed Salmonella
colony of each food sample was serotyped at the Brazilian Salmonella Reference
Institute (Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil). The number of tubes in each
66
dilution, from which colonies were confirmed as Salmonella, was used to estimate
Salmonella quantification using the MPN table (1).
Macrorestriction analysis
Genomic DNA of one Salmonella isolate obtained from each positive food
sample was prepared as previously described (22, 34). Slices of DNA-containing
agarose plugs were digested with 20 units of XbaI (Promega, Madison, WI, USA) at
37°C for 18 h. The respective fragments were separated by pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE) in 1% PFGE-certified Agarose gel (BioRad, Hercules, CA,
USA) in a CHEF DR II system (BioRad, California, USA) at 5.6 V/cm with 0.5× TBE
as the running buffer. In order to avoid the DNA degradation of Salmonella isolates, 50
μm of Thiourea (Acros Organics, Geel, Belgium) was added to the running buffer. The
pulse times were increased from 10 to 30 s during the first 11 h and subsequently from
30 to 50 s during the next 13 h. The gel was stained with ethidium bromide (2 μg/ml,
Sigma, St. Louis, MO, USA) and photographed under UV-illumination. Patterns
produced by PFGE were compared using the GelCompar II software package (Applied
Maths, Kortrijk, Belgium).
Antimicrobial susceptibility testing
Antimicrobial resistance was determined by agar disk diffusion tests using disks
with the following antimicrobials (Cefar Diagnóstica, São Paulo, Brazil): amikacin (30
μg), ampicillin (10 μg), cefaclor (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), chloramphenicol (30
μg), gentamicin (10 μg), nalidixic acid (30 μg), tetracycline (30 μg), tobramycin (10
μg), streptomycin (10 μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (25 μg), and sulfonamide
(300 μg). The testing was conducted and evaluated according to the document M2-A8
of the Clinical and Laboratory Standards Institute (7). Escherichia coli ATCC 25922
was used as control.
67
RESULTS
In eight salmonellosis outbreaks analyzed in the present study, a total of 212
people were exposed and 15 patients needed hospitalization. In two outbreaks,
epidemiological data regarding the city of origin or the number of exposed people were
not available. The major symptoms observed were fever, diarrhea and abdominal pain,
while nausea and vomiting were reported in six outbreaks. The median incubation
period varied from 9 to 24 hours, and in the majority of the outbreaks, symptoms
appeared between 13 and 17 hours after the food ingestion.
Foods containing eggs, mayonnaise or chicken were contaminated with
Salmonella in eight outbreaks (Table 1). Higher counts (>10
7
MPN.g
-1
) of Salmonella
were detected mostly in foods containing mayonnaise. Other food items with high
counts were the cake in outbreak #8, and the pork sausage in outbreak #4. In five
outbreaks more than one food item were positive on Salmonella isolation. In these
cases, food items with low as well as high Salmonella counts were detected in a same
outbreak.
All fourteen Salmonella strains submitted to serotyping were classified as S.
Enteritidis and resulted in a single PFGE profile (Figure 1). Six S. Enteritidis strains
were resistant only to nalidixic acid, while the remaining eight strains were sensible to
all tested antimicrobials.
DISCUSSION
In the present study we analyzed foods collected in ten confirmed salmonellosis
outbreaks investigated in Rio Grande do Sul in the year 2005. These outbreaks probably
represent a small fraction of all salmonellosis cases that occurred in this region, since
the lack of reporting to the sanitary authority and failure on identification of the
responsible food is not a rare event in foodborne disease surveillance (33).
68
Salmonellosis has been the most important foodborne disease, in Rio Grande do
Sul, since 1993 (8, 25). In most salmonellosis outbreaks investigated in Brazil (8, 25,
29) and in other countries (3, 28), foods prepared with eggs were implicated as the
Salmonella vehicle. Similarly, in the present study mayonnaise and cakes are among the
foods with Salmonella isolation in six outbreaks, and together with chicken were
implicated in all except two outbreaks analyzed. In contrast to that, only in outbreak #4
Salmonella was isolated from pork and pork sausage. However, Salmonella has been
frequently isolated from pigs and pork (2, 6, 24), demonstrating that this pathogen
circulates throughout the swine production chain. Possible reasons for these conflicting
results are the low Salmonella counts found in pork products sampled in Rio Grande do
Sul (24), and the habit of preparing pork products well-done, allowing the destruction of
any Salmonella that is present in the food.
The isolation of Salmonella from multiple food items in five outbreaks
demonstrated the cross-contamination due to improper manipulation. Moreover, the
high Salmonella counts detected in almost all analyzed samples probably resulted from
temperature abuse by holding foods at ambient temperature for more than two hours or
by their inadequate refrigeration. This kind of processing failures has been commonly
pointed among the factors contributing for salmonellosis outbreaks in Rio Grande do
Sul (8, 25). The association of cross-contamination and temperature abuse can explain
the Salmonella counts found on the cooked beet and on the cooked peas in outbreaks #2
and #9, respectively. In both outbreaks, animal derived products were also involved,
thus the contact with raw animal-derived foods as well as with contaminated surfaces in
the kitchen may have allowed the cross-contamination of the cooked foods. Afterwards,
the holding of the contaminated cooked foods at ambient temperature permitted the
69
multiplication of Salmonella, which attained high population counts prior the
consumption.
The number of involved people in an outbreak and the severity of the symptoms
are related to susceptibility of the individuals (37), food composition and Salmonella
number on the food (13). Moreover, persons who had eaten higher amounts of
contaminated foods were found more likely to have shorter incubation periods and
higher hospitalization risk (14). Considering that an infecting dose between 10
5
and 10
7
colony formation units (CFU) is usually accepted for immunocompetent adults (37),
most foods analyzed in the present study had Salmonella counts above the proposed
infecting dose.
All Salmonella strains analyzed were serotyped as Enteritidis, demonstrating the
predominance of this serovar in foods involved in salmonellosis outbreaks occurring in
Rio Grande do Sul in the year 2005. Previous studies reported that S. Enteritidis has
become the main cause of salmonellosis outbreaks (9, 10, 12, 29) and this serovar has
been also the most prevalent among poultry-related samples in Brazil (36). Furthermore,
a high adaptation of S. Enteritidis to colonize the chicken oviduct has been proposed,
indicating that poultry may be an important reservoir of this pathogen (20).
In spite of being isolated from not related outbreaks, all strains characterized in
this study presented a common PFGE pulse-type, demonstrating a clonal relationship
among them. In a previous study conducted in Rio Grande do Sul (38), strains isolated
from poultry and humans have also demonstrated a clonal relationship. Since strains
from poultry were reported as clonal due to the possible spread of one clone by
international trade of breeding lines (30), a common clone causing foodborne outbreaks
transmitted by egg products is not unexpectedly. Moreover, predominant PFGE patterns
are also found in strains isolated from outbreaks in other countries (17) indicating that
70
common clones may be responsible for the disease cases. Such results reinforce the
limited diversity of S. Enteritidis strains, and point to the need of further studies to
investigate other characteristics of these clones such as survival and colonization
capability.
A low frequency of antimicrobial resistant S. Enteritidis strains was observed
and nalidixic acid was the only resistance marker detected. A shift in the resistance level
was observed in S. Enteritidis strains isolated in the same region over time (5, 26, 38).
In general, antimicrobial resistance was higher in samples of animal origin than those
related to food products, demonstrating the high selective pressure caused by the use of
antimicrobials in the food production chain. However, also in poultry samples a
reduction on the frequency of resistant strains could be found after 1998, when many
antimicrobials were banished for growth promotion in Brazil (38). The reduction of
antimicrobial use occurred in the poultry production chain in recent year may explain
the low frequency of resistance that we found in our study.
On the other hand, the resistance to nalidixic acid reflects the still widespread
use of this antimicrobial in poultry therapy in Brazil and other countries. It is a matter of
concern, since emergence of resistance to nalidixic acid has been associated to
decreased susceptibility to fluoroquinolones, which are used for treatment of human
patients suffering of severe salmonellosis cases (15). The prevalence of these strains in
foods involved in outbreaks represents a risk of salmonellosis cases caused by strains
resistant to the drug used in therapy.
In conclusion, high counts (>10
3
MPN.g
-1
) of Salmonella were detected in most
foods implicated in the reported salmonellosis outbreaks occurred in 2005 in Rio
Grande do Sul. Our results suggest that one PFGE clonal group of S. Enteritidis was
involved in all those salmonellosis outbreaks.
71
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank to Beatriz M. Falavigna (Fundação Instituto Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, Brazil) for stereotyping the Salmonella strains. This study was supported by the
Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq (L. Mürmann scholarship).
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76
Figure 1: XbaI-macrorestriction profiles identified in Salmonella Enteritidis strains isolated
from foods involved in outbreaks in Rio Grande do Sul, Brazil.
E1
E2
E3
100
Dice similarity
coefficient (%)
XbaI patterns
77
Table 1: Salmonella quantification in foods involved in outbreaks that occurred in Rio Grande do Sul,
Brazil, in 2005.
Outbreak
#
City Date
(month/day)
Number
of
exposed
Number of
hospitalizations
Involved
food
Salmonella
serovar
Salmonella
quantification
MPN.g
-1
1 Alecrim 01/24 5 0 Potatoes with
mayonnaise
Enteritidis 4.6x10
9
2 Camaquã 02/21 5 0 Chicken Enteritidis 1.1 x10
5
Cooked beet Enteritidis 2.4x10
6
3 Frederico
Westphalen
04/19 10 0 Cake Enteritidis 2.4x10
5
4 Teutônia 04/23 9 1 Potatoes with
mayonnaise
Enteritidis 2.4x10
7
Sausage Enteritidis 3.6x10
7
Chicken Enteritidis 4.6x10
6
Pork ND <3
5 Ipê 04/25 6 3 Cassava with
mayonnaise
Enteritidis 2.8x10
8
Roasted beef Enteritidis 4.3x10
3
Turkey ND <3
6 ND 05/15 ND ND Chicken ND <3
Roasted beef Enteritidis 4.6x10
5
7 São Pedro
da Serra
10/16 160 3 Potatoes with
mayonnaise
Enteritidis 1.1x10
8
8 Santa Rosa 11/27 ND ND Cake Enteritidis 1.5x10
8
9 Palmeira
das
Missões
11/27 15 8 Cooked pea Enteritidis 1.1x10
3
Minced meat Enteritidis 3x10
2
Tomato ND <3
10 Porto
Alegre
12/28 2 0 Salami ND <3
ND- Not Determinated
RESUMO
Quantificação e perfil molecular de Salmonella isolada de alimentos envolvidos em surtos
de salmonelose no Rio Grande do Sul
Dados sobre a prevalência e a população de Salmonella em alimentos implicados em
surtos podem contribuir na condução de análises de risco. Dessa forma, o objetivo desse
estudo foi determinar a quantidade de Salmonella sp. presente em alimentos implicados
em surtos ocorridos no Rio Grande do Sul e caracterizar os isolados por meio de
técnicas fenotípicas e genotípicas. Dezenove amostras de alimentos obtidos em dez
surtos ocorridos em 2005 e identificados como positivos para Salmonella no
Laboratório Central da Secretaria da Saúde do Estado do Rio Grande do Sul foram
incluídos no estudo. A quantificação de Salmonella foi feita pela técnica do Número
Mais Provável (NPM). Ao lado disto, uma colônia de Salmonella obtida de cada
amostra de alimento foi submetida à sorotipificação, macro-restição com Xba-I e
determinação de resistência a antimicrobianos. Alimentos a base de ovos, maionese e
frango tiveram presença de Salmonella em oito surtos. As contagens mais elevadas
(>10
7
NMP.g
-1
) foram detectadas principalmente em alimentos contendo maionese. O
isolamento de Salmonella de vários alimentos em cinco surtos resultou provavelmente
da contaminação cruzada, enquanto as elevadas contagens encontradas, em quase todos
os alimentos, podem ser explicadas por armazenamento em temperatura inadequada.
Todos os isolados foram identificados como S. Enteritidis, e apenas um perfil foi
encontrado na macro-restrição, demonstrando a predominância de um grupo clonal
desse sorovar nos surtos de salmonelose. Uma baixa freqüência de isolados resistentes à
antimicrobianos foi encontrada, sendo a resistência ao ácido nalidíxico o único perfil
encontrado.
Palavras-chave: Salmonella, surtos, quantificação, PFGE
79
CAPÍTULO 5- Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp. em
lingüiça frescal suína em Porto Alegre/RS
Artigo não submetido
80
Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp. em lingüíça
frescal suína
Lisandra Mürmann¹, Maria Cecília Magagnin dos Santos
1
; Alexandre Ávila
Collor
1
; Luis Gustavo Corbellini
1
; Marisa Cardoso
1
1
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
81
RESUMO
Salmonella é uma das causas mais freqüentes de surtos alimentares em todo o mundo.
Uma das formas de transmissão de Salmonella sp. ao homem ocorre pela ingestão de
produtos de origem animal contaminados. Os fatores que podem contribuir para a
probabilidade da ocorrência de doença causada por um dado microrganismo transmitido
por determinado alimento são avaliados através da análise de risco. Foram utilizados
dados referentes a 336 amostras de embutidos, do tipo lingüiça frescal suína,
comercializadas no varejo da cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Cada amostra
foi submetida ao protocolo de isolamento e de estimativa do número mais provável
(NMP) de Salmonella. A estimativa de freqüência de consumo do embutido foi obtida
através da aplicação de questionário a 424 entrevistados, os quais geraram dados de
probabilidade de exposição. Para a avaliação de resistência térmica uma amostra de
Salmonella Typhimurium foi inoculada em unidades do produto (10 unidades para cada
tempo), que foram colocadas em forno pré-aquecido em 200°C. As quantidades de
bactérias presentes foram mensuradas nos seguintes tempos: 0, 5, 10 e 15 minutos. O
modelo utilizado para análise foi o recomendado pela Organização Mundial para Saúde
Animal – OIE. Para a quantificação dos riscos, foram aplicadas distribuições de
probabilidade que se adequassem a cada variável avaliada. Das 336 amostras analisadas,
82 (24,4%) foram positivas para Salmonella com níveis de Salmonella encontrados
variaram de 0.03 a 460 NMP/g. A maioria dos entrevistados (87,5%) declarou que
costumava ingerir lingüiça frescal, sendo que 36% dos entrevistados ingerem uma
unidade por refeição. Após 15 minutos de cozimento as bactérias inoculadas no produto
foram destruídas. O risco da população apresentar salmonelose devido à ingestão de
lingüiça frescal suína, aquecendo por pelo menos 15 minutos, é de 6,12 x 10
-7
. A cada
10.000 refeições nos diferentes intervalos de tempo de aquecimento obteve-se, para o
cozimento de 5, 10 e 15 minutos uma média de 400,07; 258,64 e 0,01 casos de doença,
respectivamente. Em relação ao número de churrascos a média de casos de doenças por
mês foi de 2,05. Conclui-se que o risco de salmonelose pela ingestão de lingüiça frescal
suína é muito baixo quando observado o tratamento térmico adequado do produto.
82
INTRODUÇÃO
Salmonella é uma das causas mais freqüentes de surtos alimentares em todo o
mundo (BEMRAH et al., 2003). No Estado do Rio Grande do Sul, desde 1993, a
salmonelose tem sido a Doença Transmitida por Alimentos (DTA) de maior ocorrência,
segundo dados da Secretaria Estadual da Saúde (FEPPS/IPB/LACEN, 1999).
A transmissão de Salmonella sp. ao homem ocorre, mais freqüentemente, pela
ingestão de produtos de origem animal contaminados (WEGENER & BAGER, 1997), o
que pode resultar em toxinfecções alimentares (LEITÃO, 1988). Febre, náuseas, ás
vezes vômito, dores abdominais e diarréia caracterizam a salmonelose humana
(BEMRAH et al., 2003).
Embora os produtos derivados de frangos sejam as causas mais comuns de surtos
(SCUDERI; SQUARCIONE; GRECO, 1993; MEAD et al., 1999; COSTALUNGA &
TONDO, 2002), a transmissão por produtos suínos também é comum (CANTONI;
D’AUBERT; TRALDI, 1993; WEGENER & BAGER, 1997). Surtos devido a lingüiças
contaminadas têm sido relatados nos Estados Unidos, onde a S. Typhimurium foi
isolada (SAUER et al., 1997). Na Itália, a Salmonella tem sido isolada de lingüiças de
carne de suínos e também em curados (GIOVANNINI et al., 2004). Em outros paises,
inclusive o Brasil, a Salmonella tem sido encontrada em produtos suínos (CHAVES et
al., 2000; MÜRMANN; SANTOS; CARDOSO, 2005).
Os fatores que podem contribuir para aumentar ou reduzir a probabilidade da
ocorrência de doenças causadas por um dado microrganismo transmitido por
determinado alimento são avaliados através da análise de risco. A partir disso, é
possível supor que a avaliação de risco pode ser uma ferramenta valiosa para levantar
hipóteses a respeito da discrepância que tem sido observada entre dados de prevalência
de Salmonella encontrada em suínos e a implicação de seus produtos em surtos de DTA.
A análise de risco é um processo que objetiva estimar a probabilidade de uma
doença ocorrer em uma dada população e entender os fatores que influenciam nos
riscos. É um processo ordenado que envolve gestores e avaliadores de risco e que tem a
finalidade de obter as bases científicas para dimensionar o risco, avaliar as medidas
sanitárias e facilitar a opção das formas de controle (FORSYTHE, 2002; PAS, 2004).
Para estimar o risco são necessárias várias informações, cuja síntese conduz ao risco
estimado. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo estimar o risco de
infecção alimentar em uma dada população pelo consumo de lingüiça frescal suína.
83
MATERIAIS E MÉTODOS
1- Estimativa da freqüência e quantificação de Salmonella em lingüiça frescal suína:
O resultados da análise de 336 amostras de embutidos, do tipo lingüiça frescal
suína, comercializadas no varejo da cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul foram
provenientes de estudo anterior (MÜRMANN; SANTOS; CARDOSO, 2005). Neste
estudo, cada amostra foi submetida ao protocolo de isolamento de Salmonella descrito
por Michael et al. (2003). As amostras de embutidos em que se isolou Salmonella foram
submetidas ao protocolo testado por Borowsky, Schmidt e Cardoso (2007) com
modificações, para estimativa do número mais provável (NMP) de bactérias.
2- Perfil de consumo de lingüiça frescal suína em Porto Alegre-RS
A estimativa de freqüência de consumo do embutido foi obtida através da
aplicação de um questionário epidemiológico (Apêndice 3). O tamanho da amostra foi
calculado utilizando uma precisão de 5% (BARBETTA, 2006). Ao todo, foram 424
entrevistados escolhidos aleatoriamente que responderam questões diretas, as quais
contribuíram para a identificação do perfil do consumidor, gerando dados de
probabilidade de exposição. O local escolhido para as entrevistas foi considerado
representativo da população de Porto Alegre, uma vez que vários estratos
socioeconômicos e de faixa etária freqüentam este local.
3- Resistência térmica
Para esta etapa foi selecionada uma amostra de Salmonella Typhimurium oriunda
de lingüiça frescal suína. Unidades individuais do produto foram utilizadas e em cada
uma destas foi inoculado um volume de 500 μL de BHI contendo aproximadamente 10
6
UFC deste isolado. As unidades de embutidos inoculadas foram colocadas em um forno
pré-aquecido por vinte minutos em 200°C. As quantidades de bactérias presentes nestas
amostras foram mensuradas nos seguintes tempos: 0, 5, 10 e 15 minutos, utilizando-se
10 unidades para cada tempo.
4- Estimativa do risco
4.1. Distribuição das variáveis
84
O modelo utilizado para análise foi o recomendado pela Organização Mundial
para Saúde Animal - OIE (MURRAY et al., 2006). Os caminhos de risco foram
representados através da construção de um algoritmo (Figura 1), ou árvore decisória,
que ilustra de maneira lógica o processo de introdução e exposição á Salmonella na
população estudada.
Para a quantificação dos riscos, foram aplicadas distribuições de probabilidade
que se adequassem a cada variável avaliada (Tabela 1). A distribuição Beta (x + 1, n – x
+ 1) foi utilizada para estimar a probabilidade p de Salmonella na lingüiça frescal, onde
x significa o número de isolados e n o número de amostras.
Para a modelagem do NMP, a distribuição considerada mais adequada para
obtenção do valor mais provável foi a cumulativa (mínimo, máximo, xi, pi). Os valores
mínimos e máximos representam a menor e maior quantidade de NMP,
respectivamente, e xi abrange todos os valores de NMP encontrado nas amostras e pi
representa a probabilidade cumulada. A quantidade de bactéria presente na unidade do
produto foi calculada através da distribuição Poisson (λ x t), onde λ é o valor mais
provável obtido pela distribuição cumulativa e t é a medida por grama.
O valor D, que é o tempo em minutos necessário para reduzir a população
microbiana por um fator de 10 foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula:
D = t / (log A – log B), (1)
onde o valor t é o tempo de aquecimento em minutos, A é o número inicial de
microrganismos e B é o número de microrganismos ao final do intervalo de tempo.
Para efeito de comparação entre as diferentes fases de tratamento térmico, usou-se
o valor de D para o cálculo da eficiência de cozimento (Ec), que representa a redução
decimal da carga microbiana resultante de cada fase da operação. Foi utilizada a
seguinte equação:
Ec = (t
f
- t
i
) / D, (2)
onde: D = tempo de redução decimal; t
f
= tempo final; t
i
= tempo inicial
Foi, então, calculada a concentração resultante (CR) após cada intervalo de
cozimento através da equação abaixo, conforme Bemrah et al. (2003):
CR(t
i
) = CR
i-5
/ 10
Eci
, i = 5, 10, 15 (3)
85
4.2. Descrição do modelo
A descrição do modelo encontra-se na tabela 2.
4.2.1. Utilizando os dados das variáveis anteriormente obtidas, calcularam-se as
probabilidades de infecção (PI) através da distribuição Beta–Poisson, conforme Rose,
Haas e Regli (1991). A seguinte equação descreve a distribuição utilizada:
PI = 1 - (1 + d/ β)
- α
, (4)
onde α = 0,33 e β = 139,9, de acordo com ROSE & GERBA (1991).
4.2.2. A probabilidade de doença (PD) foi estimada através da distribuição Pert, que
utiliza um valor mínimo, mais provável e máximo de casos de doença após a ingestão
de alimento contaminado. Esses valores foram obtidos com base em dados da literatura
(McCULLOUGH & EISELE, 1951), conforme tabela 2.
4.2.3. O risco individual de apresentar doença ingerindo uma unidade de lingüiça frescal
suína contaminada está condicionado a freqüência (Fr) de contaminação do produto, PI
e PD, que é dado por:
RD = Fr x PI x PD (5)
5. Risco de doença na população
O risco da doença na população foi obtido através do perfil de consumo de
lingüiça frescal e o risco de obtenção de unidades contaminadas conforme o número
ingerido. Esse risco foi calculado através da distribuição binomial
P(x≥i), 1 ≤ i ≥ 6 = Binomial (x; n; p; 0), (6)
onde x é o número de unidades contaminados, n unidades ingeridas e p é o RD.
5.1. Número de casos:
5.1.1. Cenário 1
O número de casos foi obtido através da distribuição binomial (n; p), onde n é o
número de refeições e p é a probabilidade de adoecer na população, ou seja, o risco de
doença (RD). Foi utilizado no modelo 10.000 refeições.
86
5.1.2. Cenário 2:
Para um cenário mais realista, utilizou-se como parâmetro de perfil de consumo a
ingestão de lingüiça frescal em churrasco, por ser esta uma forma de consumo do
produto comum na região. O número de churrasco mensal, extrapolado dos resultados
das entrevistas, foi estimado para a população de Porto Alegre [N = 1,4 milhão, segundo
IBGE (2007)]. O risco foi calculado considerando o tempo de aquecimento de 15
minutos.
6. Simulação:
Simulações de Monte Carlo com 10.000 iterações foram realizadas utilizando-se o
programa @Risk (Palisade Corporation).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No caso de infecção alimentar causada por Salmonella, a probabilidade de
introdução corresponde à freqüência e intensidade da contaminação nos produtos de
origem animal, enquanto a probabilidade de exposição à freqüência e importância do
consumo do produto (TOMA et al., 1999).
Utilizou-se o resultado obtido em 336 amostras de lingüiça frescal suína
analisadas das quais 82 (24,4%) amostras havia Salmonella com quantidades que
variaram de 0,03 a 460 NMP/g (MÜRMANN; SANTOS; CARDOSO, 2005). Estudos
indicam que a dose infectante de Salmonella é altamente variável. Embora 10
5
-10
7
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) seja considerada uma dose infectante típica
para humanos, diversos surtos de salmonelose foram relatados com doses muito
menores (VARNAM, 1991).
Os dados obtidos através do questionário aplicado identificaram que a maioria dos
entrevistados (87,5%) costuma ingerir lingüiça frescal, independente da faixa etária. O
consumo de lingüiça frescal por refeição variou de uma a seis unidades, sendo que 36%
dos entrevistados (153/424) declararam que costumam ingerir uma unidade por
refeição. Uma das formas mais comuns de ingestão de lingüiça frescal na cidade de
Porto Alegre é no churrasco, onde 29% da população entrevistada declarou que costuma
consumir churrasco quatro vezes por mês.
Uma pequena porcentagem da população avaliada (3%) admitiu o hábito de
ingerir o produto sem qualquer tratamento térmico, mas a maioria realiza o cozimento, o
87
qual controla os níveis de contaminação, pois o uso de altas temperaturas para conservar
alimentos está baseado em seu efeito destrutivo sobre os microrganismos (JAY, 2005).
Neste trabalho, o resultado das curvas de destruição da Salmonella na unidade do
produto, indicou que a redução mais significativa ocorre entre os 10 e 15 minutos de
aquecimento (Figura 2). Isto ocorre porque o centro geométrico do produto demora
mais tempo para atingir uma temperatura capaz de destruir os microrganismos presentes
(JAY, 2005), sendo que, quanto maior o tempo de aquecimento, maior o efeito de morte
pelo calor.
O risco estimado de se obter uma salmonelose através da ingestão de lingüiça
frescal encontra-se descritos na tabela 3. Considerando-se a diferença de intervalos de
tempo de aquecimento, observa-se um risco extremamente baixo. Acredita-se que este
produto seja aquecido por um tempo mínimo de 15 minutos, logo o risco da população
contrair salmonelose é mínimo (6,12 x 10
-7
). O mesmo cenário foi alcançado em
trabalho semelhante realizado por Bemrah (2003), em “cordon bleu” após o cozimento
em forno onde, em qualquer distribuição inicial de Salmonella, o risco de salmonelose
calculado foi igual a zero.
A cada 10.000 refeições em cada diferente intervalo de tempo de aquecimento
obteve-se, para o cozimento de 5, 10 e 15 minutos, uma média de 400,07; 258,64 e 0,01
casos de doença, respectivamente (Tabela 4). Observa-se significativa semelhança entre
os efeitos de cozimento nos tempos de 5 e 10 minutos e grande diferença entre estes e o
efeito de cozimento por 15 minutos, tempo ao final do qual praticamente anula-se a
possibilidade doença causada por Salmonella devido à ingestão de lingüiça frescal
suína. Com esse período de aquecimento, o número máximo de dois casos só surgiu
após terem ocorrido 99,99% das iterações. Estes resultados atestam a eficiência que a
prática comum de assar o produto por, pelo menos, 15 minutos tem em tornar o produto
seguro.
Também foram estimados a probabilidade do surgimento de casos de salmonelose
e o número de casos entre a população que ingere o produto sem qualquer tratamento
térmico. A situação mais provável é que haja a ingestão de um número menor de
unidades crua em relação às até seis inicialmente consideradas durante o consumo de
churrasco, uma vez que a probabilidade de ingerir um grande número de lingüiça frescal
crua é remota. O risco de ingerir uma única unidade contaminada do produto cru é
mostrado juntamente com os dados da tabela 4, a qual indica que o número médio de
88
casos de salmonelose, considerando a ingestão de uma única unidade é de 8,78 a cada
10.000 refeições.
Um segundo cenário foi proposto devido ao costume na região sul do Brasil da
ingestão da lingüiça frescal suína, como entrada para refeição conhecida por churrasco,
que consiste em carne assada em espetos na churrasqueira. Esta técnica também é usada
para preparar a própria lingüiça que é normalmente assada por tempo maior que 15
minutos. Os resultados desta simulação foram baseados na estimativa de churrasco
consumidos por mês (conforme questionário), população total de Porto Alegre (IBGE,
2007) e risco de doença no tempo de cozimento de 15 minutos. Dentre os 3.354.716
churrascos estimados consumidos mensalmente em Porto Alegre, o resultado do modelo
foi no mínimo de 0,01, médio de 2,05 e máximo de 11,08 casos de doenças por mês. A
distribuição de probabilidade do número de casos de doença por mês encontra-se na
figura 3.
Outros trabalhos relacionados à análise de risco em produtos suínos também
foram desenvolvidos por outros grupos de pesquisa. Giovannini et al. (2004), que
realizaram uma avaliação de risco da ingestão de lingüiça fresca crua de suínos na
região de Abruzzi na Itália, concluíram que estas podem ser uma das causas de
salmonelose em humanos naquela região. Por outro lado, Alban et al. (2002) realizaram
uma avaliação de risco da ingestão de lingüiças secas curadas de suínos na Dinamarca,
observando que houve uma baixa prevalência de DT104 nas lingüiças, sendo que estas
não constituíam um risco a saúde do consumidor.
Dessa forma, observa-se que o risco que um determinado alimento oferece à
população está relacionado não apenas a presença e a quantidade do patógeno estudado,
mas é influenciado também pela forma de preparo e de consumo do alimento, o que está
relacionado ao costume de uma determinada população. Por esta razão, a análise de
risco conduzida no presente estudo indica que assar a lingüiça frescal, conforme o
método tradicional da região, torna remota a possibilidade de ocorrência de salmonelose
a partir da ingestão desse alimento, elucidando o baixo envolvimento deste produto em
surtos alimentares notificados.
CONCLUSÃO
O risco de ocorrer salmonelose após a ingestão de lingüiça frescal suína
submetida à tratamento térmico (200 °C) por no mínimo 15 minutos é muito baixo.
89
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92
Tabela1 - Distribuição das variáveis.
Variável Definição Unidade Distribuição/modelo
Fr Freqüência de contaminação - Beta (83; 255)
Qmp Determinação do valor mais provável NMP/g Cumulativa (0,03;460;xi; pi)
Qu Quantidade por unidade NMP/g Poisson (Qmp; 1)
D Tempo de redução decimal minutos t/(log A - log B)
Ec Eficiência de Cozimento - Ec = (t
f
- t
i
)/D
Cr Concentração Resultante NMP Cr(t
i
) = Cr
i-5
/10
Eci
, i = 5, 10, 15
Tabela 2- Descrição e distribuição das variáveis e modelos da avaliação de risco de
salmonelose devido ao consumo de lingüiça frescal suína.
Variável Definição Distribuição/modelo
PI Probabilidade de infecção 1 - (1 + Cr/139,9)
- 0,33
PD Probabilidade de doença Pert (0; 0,16; 0,75)
RI Risco individual Fr x PI x PD
RD Risco de doença na população ∑ [Consumo x ∑Binomial (x; n; RI)].
N1 N casos cenário 1 Binomial (10000; RD)
N2 N casos cenário 2 N refeições/mês x RD
Tabela 3:
Resultado do modelo ilustrando a estimativa de riscos de doença na população
conforme intervalos de tempo de aquecimento. Simulação computacional com 10.000
iterações.
Cenário Mínimo Média Máximo IC (95%)
Cru* 4,88E-06 8,79E-04 3,26E-03 1,20E-04 2,05E-03
T5 1,25E-04 4,00E-02 1,35E-01 5,34E-03 9,13E-02
T10 1,44E-04 2,59E-02 1,01E-01 3,49E-03 6,15E-02
T15 2,34E-09 6,12E-07 3,30E-06 7,20E-08 1,60E-06
* Simulação levando a consideração apenas a população que ingere cru e a ingestão de
uma única unidade do produto.
93
Tabela 4: Resultado do modelo ilustrando o número de casos de doença conforme
intervalos de tempo de aquecimento. Simulação computacional com 10.000 iterações.
Cenário Mínimo Média Máximo Moda
N casos cru* 0 8,78 37 5
N casos (T5) 0 400,07 1347 294
N casos (T10) 0 258,64 996 153
N de casos (T15) 0 0,01 2 0
* Simulação levando a consideração apenas a população que ingere cru e a ingestão de
uma única unidade do produto.
Figura 1 - Algoritmo representativo do processo de introdução e exposição à Salmonella
na população estudada.
N
S
Consumo
linguiça
Lingüiça
Contamina
da
N
S
Dose
respos
ta
Preparo
N
S
Temperatura
destruição
N
S
RISCO
N
S
RISCO
94
0 5 10 15 20
0
1
2
3
4
5
6
LOG
10
(UFC/mL)
Tempo (minutos)
Figura 2- Curva de destruição do isolado do sorovar Typhimurium inoculado em
lingüiça frescal suína.
Figura 3- Distribuição de probabilidade de casos por mês de salmonelose na cidade de
Porto Alegre devido a ingestão de lingüiça frescal suína conforme o número
de churrascos, com tempo de aquecimento de 15 minutos.
Densidade da probabilidade
Número de casos
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
Mean=2,053365
0 4 8 120 4 8 12
90% 5%
,3672 4,6566
Mean=2,053365
95
CAPÍTULO 6- Discussão Geral
96
Discussão Geral
Durante os últimos anos tem sido registrado grande aumento no número de
pessoas acometidas por toxinfecções alimentares, levando ao desenvolvimento de novas
estratégias para prevenir e controlar os microrganismos envolvidos. Nesse contexto, as
análises microbiológicas ainda constituem uma importante ferramenta no controle da
contaminação dos alimentos (ANDERSEN et al., 2007). A exemplo de vários países
desenvolvidos, na Dinamarca a prevalência de microrganismos patogênicos
transmitidos por alimentos tem sido monitorada e programas de controle e vigilância
têm sido implementados sempre que elevados índices de isolamento sejam detectados
(HALD et al., 2004).
Salmonella sp. é um dos principais microrganismos envolvidos em toxinfecções
alimentares em diversos países e já há vários anos é responsável pela maioria dos surtos
investigados no Rio Grande do Sul (LACONHA et al., 2000; LOPALCO et al., 2000;
RIO GRANDE DO SUL, 2001). Nos relatos disponíveis, observa-se a predominância
de alimentos contendo ovos entre os veiculadores dessa bactéria, ao passo que a carne
suína e seus derivados têm apresentado uma baixa participação nos surtos investigados
nesse Estado. No entanto, isso não significa uma baixa prevalência de Salmonella sp.
em suínos criados nessa região. Ao contrário, estudo realizado no Rio Grande do Sul
(BESSA; COSTA; CARDOSO, 2004) constataram um número expressivo de suínos
portadores de Salmonella sp. ao abate, representando uma fonte potencial de
contaminação para os produtos de origem suína. Essa relação foi demonstrada por
Castagna et al. (2004b) que, avaliando produtos elaborados a partir de matéria-prima
proveniente de lotes suínos com elevada prevalência de animais portadores ao abate,
encontraram uma freqüência média de 94% de amostras de massa de embutidos com
presença de Salmonella sp.
A discrepância entre os resultados de isolamento a partir de amostras provenientes
da cadeia de produção de suínos e participação de alimentos derivados dessa espécie
nos surtos investigados no Rio Grande do Sul motivou a proposta do presente estudo:
conduzir análise de risco do consumo de lingüiça de carne suína, produto que não sofre
tratamento térmico durante sua elaboração na indústria e que é altamente consumido na
região.
A partir disso, iniciou-se a coleta dos dados necessários para a condução da
análise de risco, primeiramente pela avaliação da prevalência e do nível de
97
contaminação de lingüiça frescal de carne suína comercializada no Rio Grande do Sul.
Houve a presença de Salmonella em 24,4% das amostras analisadas, indicando que a
carne suína pode ser efetivamente um potencial veiculador de Salmonella sp. até a mesa
do consumidor. Esse dado está de acordo com outros estudos conduzidos, como os de
Mrema, Mpuchane e Gashe (2006), em Botswana, que encontraram 26% de salsichas
contaminadas com Salmonella. Já Escartín et al. (1999), no México, encontraram 88,3%
dos embutidos suínos amostrados em açougues positivos para Salmonella. Outros
autores encontraram níveis menores de contaminação, entre 1,7 e 17,6%, demonstrando
que as freqüências reportadas podem ser altamente variáveis, de acordo com o produto
analisado e a origem das amostras (BOUGHTON et al., 2004; RANUCCI et al., 2004;
GIOVANNINNI et al., 2004). No presente estudo, optou-se por avaliar um produto
inspecionado e oferecido no comércio regular de Porto Alegre, no intuito de estimar o
possível risco existente para um consumidor consciente, que busca produtos de
qualidade e seguros. Por essa razão, a freqüência de isolamento encontrada é
considerada elevada representando, de acordo com a legislação, produtos inadequados
ao consumo.
Para obter resultados precisos em uma análise de risco os dados de prevalência
devem ser complementados com a determinação da quantidade do microrganismo
presente no alimento. Dessa forma, paralelamente à pesquisa da presença de Salmonella
sp. no produto analisado, foi avaliada a quantidade presente pela técnica do Número
Mais Provável (NMP). Observou-se a presença de uma quantidade baixa de Salmonella,
onde os níveis encontrados variaram entre 0,03 e 460 NMP.g
-1
, com mediana de 0,23
NMP.g
-1
. Estes níveis estão distantes da dose considerada infectante, a qual, segundo
Varnam (1991) pode variar de 10
5
– 10
7
UFC. Verificou-se que entre as amostras
analisadas havia uma percentagem elevada de produtos que não atendiam à legislação,
ou seja, que apresentavam presença de Salmonella sp. detectável pelos métodos de
isolamento, porém numa quantidade que não corresponde àquela usualmente associada
ao desencadeamento de doença. Entretanto, fatores relacionados com o armazenamento
e processamento podem influenciar diretamente nas contagens presentes no alimento no
momento do consumo, alterando o risco que o mesmo representa para o consumidor.
Essa dinâmica de multiplicação e destruição, portanto, não pode ser desprezada ao
avaliar o risco de um alimento.
98
Tendo conhecimento de que a microbiologia preditiva é uma ferramenta básica
para estimar o comportamento microbiano em alimentos durante armazenamento e
processamento (BOVIL; BEW; BARANYI, 2001), dados referentes à cinética de
crescimento e destruição da Salmonella em diferentes tempos e temperaturas têm sido
considerados essenciais para simular diferentes cenários em uma análise de risco.
A partir disso, estudou-se o comportamento de isolados de Salmonella sp.
provenientes de lingüiça frescal suína, cultivados em caldo nutriente, em diferentes
temperaturas. Os resultados evidenciaram que, após duas horas em temperatura
ambiente a multiplicação do microrganismo tem início, e em algumas horas poderá
alcançar a dose infectante. Devido a esta multiplicação, é importante que os alimentos
perecíveis não sejam armazenados por muito tempo fora da refrigeração, devendo,
segundo a RDC 216 (BRASIL, 2004), ser expostos à temperatura ambiente somente
pelo tempo mínimo necessário, a fim de não comprometer a qualidade higiênico-
sanitária do alimento.
Na temperatura de refrigeração a população de Salmonella manteve-se constante
pelos 30 dias de observação, indicando que, caso um alimento tenha níveis altos de
contaminação antes do armazenamento, estas quantidades serão mantidas, não sendo,
portanto, a refrigeração uma ferramenta para “melhorar” a qualidade de um alimento
que sofreu abuso de temperatura ou má manipulação.
Levando-se em consideração que o produto pesquisado (lingüiça frescal suína) é
supostamente consumido após tratamento térmico, também foram realizadas simulações
de destruição térmica do microrganismo em caldo nutriente. Pelos resultados obtidos
observou-se que, após 20 minutos, a uma temperatura de 60°C, a bactéria foi totalmente
destruída. As quantidades inoculadas nesse ensaio foram elevadas, simulando um
provável abuso na temperatura de conservação do alimento antes de sua preparação.
Assim, em cenários onde o alimento tenha uma quantidade inferior de bactérias, o
tempo de destruição será menor.
Considerando que a matriz do alimento tem influência sobre o padrão de
multiplicação e morte das populações microbianas presentes, as simulações de
armazenamento e cozimento foram repetidas em lingüiça frescal de carne suína
inoculada com quantidades estabelecidas de Salmonella Typhimurium. Os resultados
dessas simulações indicaram uma variação muito baixa da quantidade de Salmonella
quando o alimento foi submetido a diferentes temperaturas de armazenamento por
diferentes tempos, tanto em temperatura ambiente como sob refrigeração (Apêndice 2).
99
Nesse caso, observou-se que a matriz do alimento dificultou a multiplicação da bactéria
na temperatura ambiente, o que não havia ocorrido com a simulação em caldo nutriente.
Já em temperatura de cozimento em forno elétrico (200°C), no tempo de 15 minutos, a
população total de Salmonella presente no alimento foi destruída. Desta forma, é preciso
enfatizar a importância de temperatura e tempo adequado para a inativação do
microrganismo, pois, segundo Germano & Germano (2001) a contaminação de um
alimento, pode persistir caso a temperatura ou tempo de cocção não sejam suficientes
para sua destruição. A partir dessa etapa do estudo, comprovou-se que as atitudes
adotadas pelo consumidor em relação ao produto podem influenciar diretamente o risco
que este oferece. Ou seja, mesmo numa situação altamente indesejável, onde exista a
presença de Salmonella sp. no produto, caso essa população bacteriana seja mantida em
baixo nível (pela refrigeração) e posteriormente eliminada por temperatura de destruição
pelo tempo necessário no centro geométrico do alimento, poderá não ocorrer a doença.
Como etapa paralela do estudo buscou-se avaliar o perfil dos casos onde ocorreu
doença como desfecho do consumo de alimentos. Para isto, dados referentes aos surtos
de salmonelose que ocorreram na mesma época das análises realizadas em amostras de
lingüiça frescal de carne suína obtidas no mercado foram coletados, e conduziu-se a
quantificação e identificação de cepas de Salmonella sp. presentes em alimentos
envolvidos nos referidos surtos. Nessa etapa, confirmou-se a predominância de
alimentos a base de ovos entre os implicados nos surtos, bem como a elevada contagem
de Salmonella sp. presente, indicando prováveis deficiências de armazenamento e
preparo dos mesmos.
Segundo Heriskstad, Motarjemi e Tauxe (2002), Salmonella enterica, subsp.
enterica dos sorovares Enteritidis e Typhimurium são os principais causadores de
infecção em humanos e animais em todo o mundo. Esta afirmação está de acordo com
os resultados obtidos no presente estudo, onde todos os surtos analisados foram
causados por S. Enteritidis, indicando a predominância desse sorovar nos surtos
ocorridos no Estado. Estes isolados, quando submetidos à análise de macro-restrição,
apresentaram um perfil único, podendo significar a predominância de linhagens clonais
envolvidas em surtos na região. Ao contrário, entre os isolados provenientes de lingüiça
frescal de carne suína, doze diferentes sorovares com diferentes perfis de macro-
restrição, haviam sido identificados, sendo que S. Enteritidis, não foi encontrada. Este
resultado confirma os dados já previamente reportados na região (BESSA et al., 2004;
100
CASTAGNA et al., 2004) e, mais uma vez, demonstra a baixa participação de produtos
de origem suína em surtos investigados.
Para permitir a montagem dos cenários de risco era, ainda, necessário determinar
a quantidade usualmente ingerida do alimento, bem como sua forma de preparo do
mesmo pela população. Para isso, conduziram-se entrevistas num local de grande
freqüência da população de Porto Alegre. As informações obtidas indicaram que a
maioria dos entrevistados (87,5%) costuma ingerir lingüiça frescal, independente da
faixa etária. O consumo de lingüiça frescal por refeição (churrasco) variou de 0 a 6
unidades, sendo que 36% dos entrevistados (153/424) costuma ingerir uma unidade por
refeição. Uma pequena porcentagem da população avaliada (3%) admitiu o hábito de
ingerir o produto sem qualquer tratamento térmico. Dessa forma, confirmou-se que o
alimento estudado é amplamente consumido pela população após tratamento térmico,
indicando que a destruição de Salmonella sp. pela forma usual de preparo é altamente
provável.
Como última etapa, a tendência indicada pelos resultados obtidos até aqui pode
ser quantificada pela análise de risco. Nessa fase, partindo dos dados colhidos, foram
possíveis a construção do algoritmo e a simulação do risco de adquirir salmonelose
através da ingestão de lingüiça frescal suína. Levando-se em consideração o costume da
população estudada de ingerir este produto após tratamento térmico, o risco encontrado
foi muito baixo (6,12 x 10
-7
). Esse resultado contribui para explicar o baixo
envolvimento do produto pesquisado em toxinfecções alimentares.
Para uma pequena parte da população que costuma ingerir o produto sem qualquer
tratamento térmico, em uma simulação realizada com 10.000 refeições, poderá haver
8,78 casos da doença, considerando a ingestão de uma única unidade. Esse cenário
demonstra claramente a influência da forma de preparo e consumo de um alimento no
risco que o mesmo oferece.
Finalmente, dentro de um perfil típico de preparação e consumo de lingüiça
frescal de carne suína pela população de Porto Alegre, ou seja, como acompanhamento
de churrasco, após tratamento térmico por 15 minutos, calculou-se a probabilidade de
ocorrência de doença. Dentre os estimados 3.354.716,98 churrascos consumidos
mensalmente em Porto Alegre, o resultado do modelo indicou um mínimo de 0,01,
média de 2,05 e máximo de 11,08 casos de doenças por mês. Nesse cenário é possível
que o baixo número de casos que estejam ocorrendo passem desapercebidos pelas
101
autoridades sanitárias, uma vez que talvez ocorram sob forma de casos isolados que não
sejam notificados, investigados e incluídos nos relatórios divulgados.
A qualidade do alimento ingerido deve ser uma preocupação constante dos
consumidores e das autoridades sanitárias. Assim, a busca por produtos livres de
agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos é importante tanto para a
saúde do consumidor como para a disputa de mercados, não devendo ser abandonada.
Nesse contexto, a análise de risco participa demonstrando a probabilidade de ocorrência
de doença a partir das condições de produção e consumo de um dado alimento, podendo
ser uma ferramenta para estabelecer prioridades, bem como forma de simular o efeito
que qualquer variação no cenário encontrado (prevalência de positivos, quantidade,
consumo, etapas de controle) pode exercer sobre a ocorrência de doença transmitida por
alimentos na população.
CONCLUSÕES
A análise de risco demonstrou que a ingestão de lingüiça frescal suína
comercializada em Porto Alegre consumida na forma de preparo mais utilizada pela
população apresenta probabilidade de causar poucos casos isolados de salmonelose,
justificando a baixa freqüência de envolvimento deste produto em surtos de doenças
transmitidas por alimentos notificados na região.
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113
APÊNDICES
Apêndice 1
QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO Aplicado por:
1- Sexo-
( ) Feminino ( ) Masculino
2- Qual a sua faixa etária?
( ) <20 ( ) 21-30 ( ) 31-40 ( ) 41-50 ( ) 51-60 ( ) >60
3- Qual seu grau de instrução?
( ) 1° grau incompleto
( ) 1° grau completo
( ) 2° grau incompleto
( ) 2º grau completo
( ) Graduação incompleta
( ) Graduação completa
( ) Pós-graduação
4- Quantas pessoas moram em sua residência?
( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5 ( ) mais de 5
5- Quantas vezes você costuma comer churrasco por mês?
( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) mais de 4 ( ) não sei
6-Você costuma incluir salsichão no churrasco?
( ) Sim ( ) Não ( ) ás vezes
7- Quantas unidades você consome?
( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5 ( ) mais de 5
8-Você costuma preparar salsichão de outra maneira?( )Sim ( ) não
9- Qual? ( ) assado forno ( ) com arroz ( ) frito ( ) outros
10- Você ingere salsichão cru?
( ) Sim ( ) não ( ) ás vezes
11- Quantas vezes você compra salsichão por mês?
( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4
12- Quantas vezes você vai ao supermercado por semana?
( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ou mais ( ) 15 em 15 dias
114
Apêndice 2
A B
0123456
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Log
10
(UFC/mL)
Tempo (horas)
0 5 10 15 20 25 30
1
2
3
4
5
6
7
Log
10
(UFC/mL)
Tempo (dias)
Figura 1- Curva de crescimento em temperatura ambiente, 26 á 31°C (A) e sob
refrigeração, 8 á 12°C (B) do isolado se Salmonella Typhimurium inoculado em
lingüiça frescal suína.
115
Apêndice 3 (Outras Produções)
AVALIAÇÃO DAS PRÁTICAS DE FRACIONAMENTO DE PRODUTOS DE
ORIGEM ANIMAL EM SUPERMERCADOS EM PORTO ALEGRE
EVALUATION OF PRACTICES ADOPTED FOR SLICING OF ANIMAL-
DERIVED FOODS IN SUPERMARKETS OF PORTO ALEGRE, BRAZIL
Carina Philomena Thebich Gottardi, Vanessa Daniele Mottin, Lisandra Mürmann,
Cláudia Ache Saldanha ,Verônica Schimidt & Marisa Cardoso
116
RESUMO
Os setores de fiambreria dos supermercados e hipermercados fracionam quantidades de
alimento em escala próxima à industrial, estando submetidos ao mesmo risco de
manipulação e contaminação cruzada. A partir disso, o objetivo desse estudo foi avaliar
as práticas adotadas para manipular produtos fracionados de origem animal. Foi
conduzido um estudo observacional onde foram aplicados questionários em 37
supermercados de Porto Alegre. A maioria dos estabelecimentos contava com
responsável técnico (78,4%), treinava (67,6%) e supervisionava (78,4%) os
manipuladores e não tinha Manual de Boas Práticas de Fabricação (83,3%). Quanto aos
procedimentos de higienização, 62,2% utilizavam protocolo de higienização que
consistia em uso de detergente com posterior aplicação de sanificante para
equipamentos e mesas de manipulação e 70,3% utilizavam produto específico para
higienização das mãos dos manipuladores. As concentrações e freqüências adotadas
para esses procedimentos eram geralmente desconhecidas. A partir disso, conclui-se que
procedimentos de treinamento, controle e avaliação devem ser implementados para
garantir a segurança dos alimentos manipulados nesses estabelecimentos.
Descritores: supermercado, produtos de origem animal, manipulação, condições
higiênico-sanitárias.
ABSTRACT
Retail establishments, like supermarkets, process product amounts almost as
high as food factories. Thus, food products processed in these establishments are
exposed to the same recontamination risk as in the industrial environment. The aim of
this study was to verify the environmental contamination level in supermarket areas,
where animal-derived products are sliced and packed. An observational study was
conducted in 37 supermarkets located in Porto Alegre (Brazil). Most establishments had
a supervisor (78.4%), had training activities for the employees (67.6%) and supervising
the manipulation activities (78.4%). Most (83.3%) supermarkets did not have a Good
Manufacture Practice Manual. Regarding the sanitization in processing areas, 62.2%
had a cleaning and disinfection protocol based on the application of a liquid detergent
followed by a disinfectant, and 70% adopted a commercial product for hand antisepsis.
However, the concentration of the disinfectants and the frequency of their application
were not known by the employees. It was concluded that a better monitoring of
117
sanitization procedures in these areas have to be adopted to guarantee the safety of
processed food.
Key-words: supermarkets, animal-derived products, manipulation, hygienic-
sanitaries conditions.
INTRODUÇÃO
Alimento seguro é definido como aquele, onde constituintes ou contaminantes que
causem mal à saúde do consumidor estão ausentes ou abaixo do limite de risco [7].
O Manual de Boas Práticas de Fabricação (BPF) é um documento que descreve as
operações realizadas pelo estabelecimento, incluindo a manutenção e higienização das
instalações, dos equipamentos e dos utensílios, o controle da higiene e saúde dos
manipuladores, entre outros aspecto para a garantia de qualidade do alimento preparado.
O Manual de BPF passou a ser exigido pela Resolução RDC nº 216 de 15 de setembro
de 2004 e aplica-se a todos os serviços de alimentação incluindo supermercados e
congêneres [5].
O setor supermercadista brasileiro tem apresentado constante expansão, sendo
responsável por parcela considerável do mercado de varejo de alimentos. Os
supermercados convencionais são estabelecimentos de porte médio caracterizados pelo
comércio de alimentos, ofertando uma média de 10.000 itens ao consumidor [11]. Nos
últimos anos, observou-se o surgimento de lojas maiores denominadas hipermercados,
onde uma média de 60.000 itens é oferecida, abrangendo alimentos e produtos têxteis e
eletrônicos [9]. Nesses estabelecimentos o movimento de vendas implica no
fracionamento de grande quantidade de produtos, notadamente aqueles de origem
animal. Esses produtos, recebidos da indústria onde haviam sido processados sob
condições controladas, são submetidos a novo risco de manipulação e contaminação
cruzada no setor de fracionamento. Apesar disso, as condições higiênicas dos ambientes
de fracionamento de produtos de fiambreria de supermercados é pouco estudada. Com
isso, o objetivo do estudo foi avaliar as condições relacionadas às práticas de
manipulação e higienização desses setores em supermercados do município de Porto
Alegre.
118
MATERIAIS E MÉTODOS
Foi conduzido um estudo observacional, onde foram aplicados questionários em
37 lojas pertencentes a redes de supermercados e hipermercados considerados
representativos em Porto Alegre. O questionário visou à obtenção de informações sobre
as práticas de limpeza e higiene da área de manipulação de fiambres e procedimentos de
fracionamento, tendo sido aplicado em todas as lojas classificadas como hipermercado
ou supermercado convencional de acordo com o critério de Parente (2002) [11] e
Lukianocenko (2005) [9]. As visitas foram realizadas em conjunto com a Equipe de
Vigilância de Alimentos da Secretaria Municipal da Saúde de Porto Alegre. O
questionário foi conduzido sempre pelo mesmo entrevistador sendo aplicado
preferencialmente ao encarregado do setor de fracionamento. Foram incluídas perguntas
gerais a respeito do estabelecimento tais como: número de clientes/dia, volume de
produtos fatiados/dia e perguntas específicas a respeito dos protocolos de lavagem e
manipulação das áreas de fatiamento. Também foi questionada a existência de
responsável técnico e Manual de Boas Práticas de Fabricação. Paralelamente, o estado
de conservação das mesas de manipulação, material adequado da mesa, piso e paredes,
presença de sabão líquido, papel toalha foram observadas e anotadas pelo entrevistador.
RESULTADOS
Dos 37 estabelecimentos visitados, somente em um não houve a concordância
em responder ao questionário. Neste estabelecimento foram considerados apenas os
itens que envolviam a observação por parte do entrevistador.
Dois estabelecimentos eram centrais de fatiamento, isto é, os produtos eram
fracionados e posteriormente distribuídos para várias lojas da rede. Mais da metade dos
estabelecimentos que foram entrevistados (59,5%) recebia entre 1001 e 3000
clientes/dia sendo que nos cinco hipermercados eram atendidas mais de 6000 pessoas
diariamente (Figura 1 A). Quanto à quantidade de produtos fatiados por dia, a maioria
dos estabelecimentos processava entre 50 e 500 kg de produtos, apenas uma central de
fatiamento e dois hipermercados processavam quantidades superiores (Figura 1B). Os
produtos mais freqüentemente fatiados nos estabelecimentos eram queijo, presunto e
outros embutidos cárnicos, que não sofrem qualquer tipo de processamento térmico
posterior, sendo destinados ao pronto consumo.
119
Em 11 estabelecimentos (29,7%) foi informado que havia área exclusiva para a
atividade de fracionamento. No entanto, encontraram-se indícios que a maioria das
lojas realizava outras atividades nessa área, como o preparo de sanduíches, pizzas e
outros lanches. Durante as entrevistas, pode-se constatar a presença de diversos
alimentos como vegetais, pães, molhos e outros ingredientes nestas áreas.
A maioria (78,4%) das salas de fracionamento era climatizada e 62,2%
informaram registrar as temperaturas aferidas em planilhas, no entanto somente
43,2% apresentavam termômetro em local visível. Em dez estabelecimentos, onde
houve a aferição da temperatura ambiente, observou-se variação entre 11ºC e 22ºC,
com média de 15,46ºC.
A maioria das lojas (78,4%) contava com responsável Técnico (RT), cumprindo
o que está previsto na Portaria nº 1428/MS de 1993 para estabelecimentos
relacionados à área de alimentos [4]. Entretanto, 83,8% não contavam ainda com
manual de BPF como previsto por BRASIL (2004) [5].
Nos 25 estabelecimentos que realizam algum tipo de treinamento para
manipuladores, foram citados: curso na própria empresa ministrado pelo
Responsável Técnico (RT), cursos em empresas fornecedoras, além da palestra
ministrada pela Equipe de Vigilância de Alimentos da Secretaria Municipal da
Saúde. No entanto, onze lojas (29,7%) ainda não ofereciam treinamento a seus
funcionários. A maioria das lojas (78,4%) informou que havia supervisão dos
manipuladores para o cumprimento das normas de higiene, ausência de uso de
adornos e esmalte, integridade da pele e estado de saúde. Na maioria das lojas
visitadas (78,4%) os manipuladores não utilizavam luvas para o processamento dos
alimentos.
Em 70,3% (26) dos estabelecimentos constatou-se a presença de pessoas
estranhas à atividade de fracionamento no local onde ocorria essa operação. Entre as
pessoas estranhas, os promotores, isto é, funcionários das empresas fornecedoras de
produtos de fiambreria, também circulavam nestas áreas.
A maioria das lojas (97,3 %) contava com mesas de manipulação com material
adequado, isto é, liso, lavável, impermeável, resistente, de fácil higienização e não
contaminante, estando em conformidade com a Resolução 275 de 2002 [2].
120
Dos estabelecimentos visitados, 59,5% tinham fatiadora de produtos de
fiambreria com uso específico para queijos ou para produtos cárnicos. As lojas que
utilizavam o mesmo equipamento para fracionar diferentes produtos informaram
que processavam primeiro os queijos e realizavam higienização antes de fracionar
os cárnicos. No entanto, não higienizavam a fatiadora entre diferentes produtos
cárnicos, pois consideravam não haver necessidade, uma vez que os ingredientes
eram os mesmos.
As informações obtidas pelo questionário demonstraram que, para a
higienização de equipamentos e mesas de manipulação, a maioria dos
estabelecimentos (62,2%) utilizava detergente com posterior aplicação de um
sanificante, geralmente a base de hipoclorito de sódio (Tabela 1). O responsável pela
higienização era o manipulador que estava encarregado de realizar os procedimentos
previstos no protocolo imediatamente após o uso do equipamento. No entanto,
quando questionada sobre a freqüência da realização dos procedimentos, a grande
parte dos entrevistados não soube informar, relatando que a higienização era feita no
final do turno e sempre que necessário, indicando que não havia uma padronização
nesse procedimento.
Para higienização das mãos dos manipuladores, 70,3% dos estabelecimentos
utilizava produto específico para este fim, indicado por uma empresa fornecedora de
produtos de limpeza, a base de 2,4,4’-tricloro-2’-hidroxidifenil. Quanto à freqüência
de higienização das mãos, verificou-se que semelhante ao caso dos equipamentos,
não havia padronização.
A respeito da concentração dos produtos utilizados, a maioria dos entrevistados
relatou que utilizava aquela recomendada pelo fabricante. No entanto, foi verificado
que as respostas dadas nessa etapa não correspondiam aos procedimentos realmente
adotados na rotina. Em duas lojas amostradas, os produtos citados no questionário
não estavam presentes no setor de fracionamento, estando em seu lugar detergente
neutro comum. Em outra loja que relatou na entrevista que usava o protocolo
detergente com posterior aplicação de sanificante, observou-se o uso exclusivo de
álcool em concentração desconhecida. Nesse sentido, observou-se que a maioria dos
estabelecimentos não seguia uma concentração previamente definida dos produtos
utilizados.
121
DISCUSSÃO
As entrevistas conduzidas no presente estudo demonstram a parcela importante
da população atendida pelos estabelecimentos visitados, bem como o volume de
alimentos manipulados. Isto enfatiza a importância desse tipo de estabelecimento
comercial para garantia da segurança dos alimentos consumidos pela população e a
abrangência potencial de contaminações que venham a ocorrer em produtos por eles
manipulados.
A quantidade de produtos fracionados, acima de 100 Kg diariamente na maioria
dos estabelecimentos, é comparável ao volume processado em escala industrial.
Entretanto, ao contrário das indústrias sob inspeção federal e estadual, muitas vezes
não existem Procedimentos Operacionais Padrão (POP), Procedimento-padrão de
Higiene Operacional (PPHO) ou programas de Análises de Perigos e Pontos Críticos
de Controle (APPCC) estabelecidos. Constata-se, ainda, que não há uma
regulamentação sanitária específica para setores de fracionamento de
estabelecimentos desse porte.
Os resultados obtidos demonstram que a maioria dos estabelecimentos visitados
respeitava os itens previstos em regulamentações existentes para a comercialização
de alimentos. Nesse sentido, a maioria das lojas contava com Responsável Técnico,
realizava algum tipo de treinamento para os funcionários, supervisionava os
manipuladores quanto às normas de higiene e estado de saúde e tinha estrutura de
ambiente e superfície de manipulação de alimentos de acordo com a legislação
vigente [4; 13; 2].
Apenas a existência de Manual de BPF, também exigido pela legislação [5], não
era cumprida pela maioria dos estabelecimentos. Entretanto a realização dos
questionários coincidiu com o período previsto para a vigência da lei e, por isso
estava em fase de implementação na maioria dos estabelecimentos. Segundo a
legislação vigente, os serviços de alimentação devem dispor do Manual de BPF, o
qual deve estar acessível aos funcionários envolvidos e disponível às autoridades
sanitárias, quando requerido.
Na prática, o Manual de BPF é o documento que descreve todas as ações
previstas em programa de Boas Práticas de Fabricação, o qual deve ter sido
implantado no estabelecimento que fabrica ou comercializa alimentos. As normas
que estabelecem as chamadas BPF, por sua vez, envolvem requisitos fundamentais,
122
inclusive regras de higiene pessoal e de limpeza do local de trabalho [10]. Justamente
nesses aspectos observa-se que houve a concentração das falhas observadas no
presente estudo.
A evidente ausência de padronização no que diz respeito aos procedimentos
adotados para o fracionamento dos alimentos, como a existência, no ambiente de
manipulação, de pessoas e produtos estranhos ou a inexistência de um procedimento
padronizado e cronograma na utilização de equipamentos de fracionamento, podem
favorecer a contaminação cruzada de alimentos [14; 3]. Além disso, podem propiciar
a transferência de agentes causadores de Doenças Transmitidas por Alimentos
(DTA) que podem estar aderidos às superfícies comumente encontradas em plantas
de processamento de alimentos, formando biofilmes [8].
Os aspectos relacionados à higienização de equipamentos e manipuladores
também demonstrou estar aquém do requerido para garantir um alimento seguro.
Apesar de a maioria dos estabelecimentos adotar o uso de detergente associado à
sanificante a base de hipoclorito de sódio, como é largamente utilizado na indústria
de alimentos [1], a concentração adotada e a freqüência de utilização eram
desconhecidas pelos operadores. Quanto à higienização das mãos a mesma situação
foi constatada, indicado que a transferência de patógenos por manipuladores poderia
ocorrer. Esse é um aspecto relevante, pois a ausência de lavagem das mãos ou
higienização deficiente têm sido apontadas como causas da transferência de
patógenos para alimentos manipulados [12], tornando esse procedimento de
fundamental importância nos estabelecimentos que processam alimentos [6].
A elaboração do Manual de BPFs certamente poderá contribuir para a correção
dos aspectos deficientes que foram constatados, entretanto é preciso que o mesmo
seja resultado de um programa de BPF implantado. Caso contrário será apenas um
documento desconhecido e pouco utilizado pelos manipuladores de alimentos. Para
tanto, gerências, chefias e supervisão devem estar engajadas para que ocorra o êxito
do programa, bem como ações para motivação e treinamento de funcionários
precisam ser estabelecidos [10].
Em conclusão, os resultados obtidos demonstram a importância da fiscalização e
orientação realizadas nesses estabelecimentos, uma vez que a população
potencialmente exposta a um possível agente causador de DTA veiculado por
produtos manipulados nesses locais é extremamente elevada.
123
REFERÊNCIAS
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Paulo: Varela, 182p.
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Acessado em 07/10/2005.
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L.L., Mshar P., Lambert-Fair M.A., Green J.H., Bean N.H. & Tauxe R.V.
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Escherichia coli O157:H7 infection. The Journal of Infectious Diseases. 173: 480-
483.
4 Brasil. 1993. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Portaria nº 1428/MS, de 26 de novembro de 1993. Disponível em
http://www.anvisa.gov.br/legis/portarias/1428_93.htm. Acessado em 22/11/2003.
5 Brasil. 2004. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Resolução: RDC n°216 de 15 de setembro de 2004. Dispõe sobre: Regulamento
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<http://www.anvisa.gov.br>. Acessado em: 18/11/2004.
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variability analysis of bacterial cross-contamination rates in common food service
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Atheneu, 181p.
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Ogawa M. 1999. Bacterial contamination in the environmental of food factories
processing ready-to-eat fresh vegetables. Journal of Food Protection. 62: 800-804.
124
9 Lukianocenko M. 2005. A evolução nos formatos continua. Superhiper. 357: 18-
20.
10 Nascimento G.A. & Barbosa J.S. 2007. BPF: Boas práticas de fabricação: uma
revisão. Higiene Alimentar. 21: 24-30.
11 Parente J. 2000. Varejo no Brasil: gestão e estratégia. São Paulo: Atlas, 388p.
12 Reij M.W. & Den Aantrekker E.D. 2004. Recontamination as a source of
pathogens in processed foods. International Journal of Food Microbiology. 91: 1-
11.
13 Rio Grande do Sul. 2001. Governo do Estado. Secretaria da administração e dos
recursos humanos. Decreto nº 23430 Regulamento sobre a promoção, proteção e
recuperação da saúde pública. Porto Alegre: CORAG. 400p.
14 Scott E. & Bloomfield S. 1990. The survival and transfer of microbial
contamination via cloths, hands and utensils. Journal of Applied Bacteriology. 68:
271-278.
125
5%
60%
16%
8%
11%
0-1000
1001-3000
3001-6000
>6000
NS/NR
36%
19%
32%
8%
5%
0-50
51-100
101-500
>500
NS/NR
Figura 1: Distribuição dos estabelecimentos onde foram aplicados os questionários, de
acordo com o número de clientes atendidos por dia (A) e de acordo com a
quantidade (kg) de produtos fracionados por dia (B).
Tabela 1:Tipos de protocolos de higienização adotados para ambiente e manipuladores
de alimentos adotados em 37 supermercados e hipermercados de Porto Alegre.
Protocolo Equipamento/Mesas (%) Mãos (%)
Detergente 13,5 24,3
Detergente e sanificante 62,2 0
Detergente e vinagre 2,7 0
Detergente e álcool 18,9 2,7
Produto específico* 0 70,3
NR/NS** 2,7 2,7
Total 100 100
* Produto comercial a base de 2,4,4’-tricloro-2’-hidroxidifenil.
** NS/NR: não sabe ou não respondeu
B
A
126
OUTRAS PRODUÇÕES REALIZADA DURANTE O DOUTORADO
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(completo)
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., CORBELLINI, L. G., CARDOSO.M.
Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp.em lingüiça frescal suína:
dados preliminares In: 13 Congresso da ABRAVES, 2007, Florianopolis.
13 Congresso da ABRAVES. , 2007.
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., MOTTIN, V.D., CARDOSO.M.
Avaliação do crescimento de diferentes sorovares de Salmonella em temperatura
ambiente de refrigeração In: III Congresso Latino Americano e IX Congresso Brasileiro
de Hgiene de Alimentos, 2007, Porto Seguro.
III Congresso Latino Americano e IX Congresso Brasileiro de Higiene de
Alimentos , 2007.
MOTTIN, V.D., FISH, MÜRMANN, L., CARDOSO.M.
Pesquisa de Listeria monocytogenes e Salmonella em embutidos de carne suína cozidos
e fatiados comercializados em supermercados no município de Porto Alegre/RS In: III
Congresso Latino Americano e IX Congresso Brasileiro de Higiene de Alimentos, 2007,
Porto Seguro/BA.
III Congresso Latino Americano e IX Congresso Brasileiro de Higiene de
Alimentos , 2007.
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., CARDOSO.M.
Resistência térmica de isolados pertencentes a diferentes sorovares de Salmonella
provenientes de lingüiça frescal suína In: 13 Congresso da ABRAVES, 2007,
Florianópolis.
13 Congresso da ABRAVES. , 2007.
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., CARDOSO.M.
Prevalence and level of Salmonella enterica in pork fresh sausages purchased in
southern Brazil. In: 13S International Symposium Salmonella and Salmonellosis., Sain
Malo.
13S International Symposium Salmonella and Salmonellosis. , 2005. p.443 – 444
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos
(resumo)
MÜRMANN, L., MOTTIN, V.D., MALLMANN, C A
Organização Sanitária em estabelecimentos que comercializam alimentos na cidade de
Santa Maria, RS In: XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos
(CBCTA)., 2006, Curitiba.
XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos (CBCTA). , 2006.
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., CARDOSO.M.
Prevalência e nível de contaminação de Salmonella enterica em lingüiça frescal de
127
carne suína em Porto Alegre/RS In: XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia
de Alimentos (CBCTA)., 2006, Curitiba.
XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos (CBCTA). , 2006.
MÜRMANN, L., SANTOS, M.C., CARDOSO.M.
Quantificação e perfil genotípico de Salmonella entérica presente em alimentos
envolvidos em surtos de salmonelose ocorridos no Rio Grande do Sul. In: XX
Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos (CBCTA)., 2006, Curitiba.
XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos (CBCTA).. , 2006.
SANTOS, M.C., MÜRMANN, L., CARDOSO.M.
Quantificação, perfil genotípico e perfil de resistência a antimicrobianos de Salmonella
enterica presente em alimentos envolvidos em surtos de salmonelose ocorridos no Rio
Grande do Sul. In: XVIII Salão de Iniciação Científica XV Feira de Iniciação Científica.
XVIII Salão de Iniciação Científica XV Feira de Iniciação Científica. Livro de
Resumos. , 2006. p.137 - 137
SANTOS, M.C., MÜRMANN, L., CARDOSO.M.
Quantificação de Salmonella sp. presente em alimentos envolvidos em surtos de
salmonelose ocorridos no Rio Grande do Sul. In: XVII Salão de Iniciação Científica
XIV Feira de Iniciação Científica., Porto Alegre.
Livro de resumos. Porto Alegre: , 2005. p.158 - 158
Artigos aceitos para publicação
1. MÜRMANN, Lisandra, SANTOS, Maria Cecília dos, CARDOSO, Marisa
Curvas de crescimento e destruição térmica de sorovares de Salmonella sp. isolados de
lingüiça frescal de carne suína. Acta Scientiae Veterinariae. , 2008.
2.GOTTARDI, Carina, MOTTIN, Vanessa Danielle, MÜRMANN, Lisandra,
CARDOSO, Marisa
Avaliação das práticas de fracionamento de produtos de origem animal em
supermercados em Porto Alegre. Acta Scientiae Veterinariae. , 2008
Artigos submetidos para publicação
1. MÜRMANN, Lisandra, SANTOS, Maria Cecília dos, CARDOSO, Marisa
Prevalence, genetic characterization and antimicrobial resistance of Salmonella isolated
from fresh pork sausages in Porto Alegre, Brazil. Food Control. , 2008.
2. MÜRMANN, Lisandra, SANTOS, Maria Cecília dos, CARDOSO, Marisa
Quantification and molecular characterization of Salmonella isolated from food samples
involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology. , 2008.
Outras Produções
MÜRMANN, L. Análise de risco quantitativa da presença de Salmonella sp. em
lingüíça frescal suína: dados preliminares, 2007. Palestra ministrada- ABRAVES.
128
MÜRMANN, Lisandra
Pragas em Serviços de Alimentação. 2005, 2006, 2007. (Palestra para Curso de
Nutrição- UFRGS)
MÜRMANN, Lisandra
Tópicos Atuais em Inocuidade dos Alimentos, 2006. (Palestra ministrada no Programa
de Educação Médica Continuada)
MÜRMANN, Lisandra.
Seminário sobre Salmonella em suínos: resultados de pesquisa e perspectivas. 2006.
Palestra ministrada na EMBRAPA- Concórdia.
MÜRMANN, Lisandra
Avaliação de Risco em Alimentos, 2006. (Palestra para Curso de Nutrição- UFRGS)
MÜRMANN, Lisandra
Controle de Roedores, 2004, 2005, 2006. (Palestra ministrada –Curso de Medicina
Veterinária. UFRGS)
MÜRMANN, Lisandra
O Papel do Médico Veterinário na Saúde Pública, 2004. (Palestra ministrada na Semana
Acadêmica da Medicina Veterinária- UFSM).
MÜRMANN, Lisandra
Atividade de extensão universitária no laboratório de Medicina Veterinária Preventiva
/FAVET/ UFRGS, 2004, 2005, 2006, 2007.
Livros Grátis
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