( PDF ) Atividade in vitro, individual ou em combinação, de voriconazol, itraconazol e terbinafina contra isolados brasileiros de Pythium insidiosum

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Atividade in vitro, individual ou em combinação, de voriconazol, itraconazol

e terbinafina contra isolados brasileiros de Pythium insidiosum

JULIANA SIQUEIRA ARGENTA

PORTO ALEGRE

2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Atividade in vitro, individual ou em combinação, de voriconazol, itraconazol

e terbinafina contra isolados brasileiros de Pythium insidiosum

Autor: JULIANA SIQUEIRA ARGENTA

Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Subárea: Microbiologia.

Especialidade: Micologia.

Orientador: PROF. DR. LAERTE FERREIRO

PORTO ALEGRE

2008

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“Só é útil o conhecimento que nos torna melhores”.

-Sócrates-

Dedico a meus avós:

Abílio (in memorian) e Maria Helena Siqueira

Pela incansável dedicação, amor e incentivo para que eu aqui chegasse.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a:

Meus pais, Nilia e Jânio Argenta, e meu irmão, Miguel Argenta: pelo carinho,

apoio constante e especialmente por serem parte fundamental da minha vida.

Igor Carlotto: pela dedicação, paciência e, sobretudo por ser alguém que torna a

minha vida muito melhor.

Professor Laerte Ferreiro, pela confiança, amizade e oportunidade de

desenvolver este trabalho.

Professor Janio M. Santurio, pela oportunidade, pelos exemplos, por ter me

apresentado à micologia e me fazer acreditar que com esforço e dedicação atingimos

nossos objetivos.

Professor Sydney Hartz Alves, pelos ensinamentos, pela incansável ajuda para a

realização deste trabalho e por ser alguém que admiro muito.

Daniela Pereira, pelo companheirismo, amizade e auxílio indispensáveis.

Marina Copetti, por tudo que me ensinou principalmente o valor da amizade.

Ayrton Cavalheiro, Stela Schwendler, Deise Santurio, Maria Isabel Azevedo,

João Eckhardt Jr, Flávio Silveira, Ricardo Dotto, Régis Zanette, Patrique Pereira,

Vanessa Laviniki, Franciele Bess, Patrícia Pozzati, Liliane Scheid, Érico Loretto, Paulo

Guilherme Lopes. Muito obrigada a cada um dos citados, e aqueles que não citados, que

estão ou passaram pelo LAPEMI, por todo apoio para a conclusão deste trabalho.

Leticia Saccol, Naíme Trevisan, Alexandre da Silva, Andréia Henzel, Marcelo

Weiss, Caroline Zielinski, Luiz Felipe Borges, Gisane Lanes, Osvaldo Jardim, pela

amizade e por todas as palavras de incentivo.

Professores e Funcionários do PPGCV da UFRGS, por possibilitarem e

facilitarem a realização do mestrado.

CNPq, pelo apoio financeiro.

“A glória da amizade não é somente a mão estendida, o sorriso carinhoso ou a

prazerosa companhia. É a inspiração que vem quando você descobre que alguém

acredita e confia em você”.

RESUMO

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenopila e Classe Oomycetes, é

o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em eqüinos,

caninos e humanos. As atividades in vitro do voriconazol, itraconazol e terbinafina,

sozinhos ou em combinação, foram estudadas empregando uma metodologia de

macrodiluição baseada na técnica M 38-A (CLSI, 2002) contra 30 isolados clínicos de

Pythium insidiosum, com o objetivo de avaliar novas medidas para tratar infecções

causadas por este agente utilizando quimioterapia. As combinações (terbinafina e

voriconazol; terbinafina e itraconazol) tiveram suas interações avaliadas utilizando a

técnica de checkerboard seguindo o modelo da macrodiluição em caldo. Terbinafina foi

ativa quando testada sozinha, mostrando uma concentração inibitória mínima (CIM) e

concentração fungicida mínima ≤ 8,0 mg/L para todos os isolados. Voriconazol e

itraconazol foram inativos contra os isolados testados quando usados sozinhos. A

combinação de voriconazol com terbinafina foi sinérgica contra 17% das amostras e

indiferente em 25 (83%) amostras. O uso concomitante de terbinafina e itraconazol foi

sinérgico contra 17% e indiferente contra 83% das amostras. As interpretações de

ambas as interações foram equivalentes para 26 isolados (87%): vinte e três foram

indiferentes e três mostraram efeito sinérgico. Antagonismo não foi observado. A

terapia combinada é uma alternativa à monoterapia, especialmente para pacientes com

infecções invasivas que são difíceis de tratar. Estes resultados precisam ser

correlacionados com relatos clínicos; e ensaios in vivo, usando modelos animais, podem

preencher a lacuna entre avaliações clínicas e avaliações in vitro das drogas.

Palavras-chave: Pythium insidiosum, voriconazol, itraconazol, terbinafina, teste de

suscetibilidade.

ABSTRACT

Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenopila, class Oomycetes.

It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. In order to

evaluate new approaches to treat infections caused by Pythium insidiosum using

chemotherapy, the in vitro activities of voriconazole, itraconazole and terbinafine,

alone or in combination, against 30 clinical isolates were studied employing a

macrodilution methodology based on the M 38-A technique (CLSI, 2002). The

combinations (terbinafine plus voriconazole and terbinafine plus itraconazole) had

their interactions evaluated using the checkerboard technique following the broth

macrodilution design. Terbinafine was active when used as a single drug, showing

minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal fungicidal concentration ≤ 8,0

mg/L for all the isolates. Voriconazole and itraconazole were inactive against the

isolates tested when used alone. The combination of voriconazole with terbinafine was

synergic against 17% of the strains and indifferent on 25 (83%) strains. The

concomitant use of terbinafine and itraconazole was synergic against 17% and

indifferent against 83% of the strains. The interpretations of both interactions were

equivalent for 26 isolates (87%): twenty three were indifferent and three showed

synergistic effect. Antagonism was not observed. Combination therapy provides an

alternative to monotherapy, especially for patients with invasive infections that are

difficult to treat. These results need to be correlated with clinical outcomes, and in vivo

assays using experimental animal models could bridge the gap between in vitro and

clinical evaluation of drugs.

Keywords: Pythium insidiosum, voriconazole, itraconazole, terbinafine, susceptibility

test.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rota de biossíntese do ergosterol. Etapas onde vários agentes antifúngicos

exercem suas atividades inibitórias estão mostradas. TERB, terbinafina; FLU,

fluconazol; ITRA, itraconazol; VOR, voriconazol. (GHANNOUM & RICE,

1999) ................................................................................................................27

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Identificação e origem dos isolados de Pythium insidiosum estudados..........37

Tabela 2: Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) e Concentrações Fungicidas

Mínimas (CFMs) de Pythium insidiosum (n = 30) a terbinafina. ................38

Tabela 3: Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) de Pythium insidiosum (n = 30) ao

itraconazol e voriconazol. .............................................................................38

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................10

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...............................................................................13

2.1 Pythium insidiosum e Pitiose ..........................................................................13

2.2 Zoosporogênese...............................................................................................22

2.3 Antifúngicos: itraconazol, voriconazol e terbinafina......................................24

2.4 Combinações antifúngicas e testes de suscetibilidade in vitro .......................27

3 ARTIGO CIENTÍFICO ..........................................................................................33

4 DISCUSSÃO ..........................................................................................................39

5 CONCLUSÕES ......................................................................................................44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................45

1 INTRODUÇÃO

Pythium insidiosum é um organismo aquático cosmopolita classificado no Reino

Stramenopila, Classe Oomycetes (DE COCK et al., 1987). É o agente etiológico da

pitiose em mamíferos, o qual está intimamente relacionado ao contato de animais e

humanos com águas contaminadas onde o agente produz sua forma infectante, o

zoósporo móvel (SANTURIO et al., 2006a).

A pitiose é mais frequentemente diagnosticada em eqüinos, provocando quadro

infeccioso na pele e região subcutânea; em caninos com apresentação gastrintestinal e

cutânea; e em humanos nas formas subcutânea, vascular e ocular (SANTURIO et al.,

2003b). Acomete ainda bovinos (MILLER et al., 1985; SANTURIO et al., 1998;

PÉREZ et al., 2005), felinos (BISSONETE et al., 1991; RAKISH et al., 2005), ovinos

(TABOSA et al., 2004; SANTURIO et al., 2008) e, recentemente, foi descrito em um

camelo (WELLEHAN et al., 2004), um jaguar da América Central (CAMUS et al.,

2004) e um tigre (BUERGELT et al., 2006).

O tratamento da pitiose em animais e humanos é complicado pelas

características do agente, sobretudo sua composição de parede celular (LEAL et al.,

2001b). A maioria das drogas disponíveis atua primariamente inibindo a síntese do

ergosterol, o qual não é o principal esterol na membrana do Pythium insidiosum

(DYKSTRA et al., 1999), o que restringe o número de drogas que podem ser utilizadas

para o tratamento dessa enfermidade. Vários tratamentos têm sido utilizados,

principalmente em eqüinos, incluindo tratamento químico, cirúrgico e imunoterápico,

encontrando sucesso variável (SANTURIO et al., 2003b). A antifungicoterapia tem

utilizado anfotericina B, cetoconazol, miconazol, fluconazol e itraconazol, além dos

compostos iodínicos como iodeto de potássio e sódio (SANTURIO et al., 2003b). No

entanto, os resultados obtidos com as drogas antifúngicas são controvertidos, tanto no

tratamento clínico como nos testes de suscetibilidade in vitro.

Dentro dos métodos de referência para testes de suscetibilidade, destaca-se o

documento M 38-A recomendado e padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards

Institute (NCCLS, 2002). Este método padrão descreve técnicas de macro e

microdiluição para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de antifúngicos

frente a fungos filamentosos.

Até o presente, nenhuma das terapias antifúngicas propostas para a pitiose

apresentaram resultados satisfatórios. Por outro lado, Shenep et al. (1998)

demonstraram efeito sinérgico da terbinafina associada ao itraconazol no tratamento

clínico da pitiose humana e em ensaios laboratoriais. No entanto, estudos com

voriconazol ainda não foram realizados para Pythium insidiosum. Embora estes

antifúngicos atuem na síntese do ergosterol, o uso dos mesmos nessa pesquisa justifica-

se pelos relatos de cura obtidos com a associação de itraconazol e terbinafina, quando

utilizados no tratamento de pitiose humana e canina.

As associações antifúngicas têm sido pouco estudadas em micologia médica, e

suas atividades contra Pythium insidiosum são quase desconhecidas (SHENEP et al.,

1998). As combinações de drogas de diferentes grupos pode ser uma estratégia de

tratamento útil quando a monoterapia não encontra resultados satisfatórios.

Com base nesta problemática, os objetivos do presente estudo foram:

• Verificar a atividade in vitro de voriconazol, itraconazol e terbinafina

contra 30 isolados de Pythium insidiosum de animais, empregando uma

metodologia de macrodiluição baseada na técnica M 38-A (NCCLS,

2002) adaptada.

• Avaliar as interações in vitro da terbinafina combinada com voriconazol,

e da terbinafina combinada com itraconazol usando a técnica de

checkerboard seguindo o modelo de macrodiluição (NCCLS, 2002).

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pythium insidiosum e Pitiose

Pythium insidiosum, agente etiológico da pitiose em mamíferos (PEREIRA et

al., 2007), pertence ao Reino Stramenopila, Classe Oomycetes, Ordem Pythiales,

Família Pythiaceae, Gênero Pythium e espécie P. insidiosum (DE COCK et al., 1987).

Esta classificação foi fundamentada em estudos detalhados sobre a classificação dos

fungos, baseados em sistemática filogenética e análises moleculares, entre outros, que

dividiram os organismos anteriormente classificados como fungos em três reinos:

Fungi, Stramenopila e Protista (ALEXOPOULUS et al., 1996). No entanto, Schurko et

al. (2003) compararam espécies de Pythium insidiosum originárias das Américas, Ásia e

Austrália, através de técnica molecular, evidenciando diferenças entre os isolados de

Pythium insidiosum das três regiões estudadas, o que possibilita uma reclassificação

como sub-espécies ou, talvez, novas espécies.

O gênero Pythium caracteriza-se por: produção de zoósporos biflagelados

durante a reprodução assexuada; reprodução sexuada oogâmica; parede celular

composta de β-glucanas, celulose e hidroxiprolina; talo diplóide; mitocôndria com crista

tubular; características moleculares e bioquímicas peculiares, como uma rota alternativa

para síntese do aminoácido lisina (MOORE-LANDECKER, 1996). Os oomicetos

também diferem dos fungos quanto ao papel do ergosterol na membrana celular, ou

seja, nos primeiros ele não é o principal esteróide (SANTURIO et al., 2006a). De

acordo com Hendrix (1970), espécies do gênero Pythium incorporam esteróides a partir

do meio ao invés de produzi-los. Os esteróides são importantes para produção de

estruturas sexuadas in vitro, mas não são necessários para o crescimento da hifa

vegetativa (GROOTERS, 2003).

A pitiose é uma enfermidade piogranulomatosa que atinge eqüinos, provocando

quadro infeccioso na pele e tecido subcutâneo; caninos e felinos com apresentação

gastrintestinal e cutânea; bovinos com doença cutânea; e humanos apresentando quadro

clinico de arterite, queratite e celulite periorbital (SANTURIO et al., 2006a).

Epidemiologicamente a pitiose está intimamente relacionada com o contato dos animais

e humanos com águas contaminadas pelo agente, onde o mesmo produz zoósporos

móveis que se constituem na forma infectante do Pythium insidiosum (MENDOZA et

al., 1996). Em 1983, Miller propôs um ciclo biológico para esse organismo, que se

baseia na colonização de plantas aquáticas, que servem de substrato para o

desenvolvimento e reprodução do organismo, formando os zoosporângios. Os

zoósporos livres na água, movimentam-se até encontrar outra planta ou animal, onde se

encistam e emitem tubo germinativo, dando origem a um novo micélio e completando

seu ciclo. Essas observações sustentaram a teoria de infecção, sugerindo que os cavalos

em contato com águas contaminadas poderiam atrair os zoósporos, os quais

germinariam a partir de uma pequena lesão cutânea (MENDOZA et al., 1993).

A pitiose ocorre em regiões de clima tropical, subtropical e temperado

(MEIRELES et al., 1993; SANTURIO et al., 1998; GROOTERS, 2003), e tem sido

relatada nas Américas, alguns países europeus, sudeste asiático, Oceania e África

(CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996; MENDOZA et al., 1996; RIVIERRE et al., 2005).

As condições ambientais são determinantes para o desenvolvimento do organismo em

seu ecossistema. Segundo Miller & Campbell (1982), para a produção de zoósporos são

necessárias temperaturas entre 30 e 40ºC e o acúmulo de água em banhados e lagoas. A

pitiose eqüina é uma doença que ocorre em todas as regiões do Brasil, principalmente

no Pantanal, onde há relação direta com o período das chuvas (outubro-março) e

acarreta prejuízos significativos, direta ou indiretamente (LEAL et al., 2001a). Não há

predisposição por sexo, idade ou raça e a fonte de infecção são os zoósporos ambientais,

não havendo relatos de transmissão direta entre animais e entre animais e o homem

(MENDOZA et al., 1996). A doença é progressiva, levando o animal ao emagrecimento

e morte na maioria dos casos.

No Brasil, a pitiose foi descrita em eqüinos, bovinos, ovinos, caninos e

humanos, porém a maioria dos casos relatados corresponde a lesões cutâneas em

eqüinos. Pitiose nos eqüinos caracteriza-se pela formação de granulomas eosinofílicos,

com a presença de massas necróticas denominadas de “kunkers” (MENDOZA &

ALFARO, 1986; MEIRELES et al., 1993; SANTURIO et al., 2003a). A doença nos

eqüinos é conhecida por outros nomes como hifomicose, zigomicose, dermatite

granular, “bursattee”, “Florida leeches”, granuloma ficomicótico, “swamp cancer”

(CHAFFIN et al., 1995; FOIL, 1996) e “ferida da moda” (LEAL et al., 2001a). As

lesões cutâneas são as mais freqüentes e atingem principalmente as extremidades distais

dos membros e porção ventral da parede toraco-abdominal, provavelmente devido ao

maior tempo de contato com águas contaminadas com zoósporos (MILLER &

CAMPBELL, 1982; CHAFFIN et al., 1995). Os sinais clínicos caracterizam-se por

lesões ulcerativas granulomatosas, formando grandes massas teciduais (5 a 500 mm),

com bordas irregulares, de aparência tumoral e com hifas recobertas por células

necróticas, que formam massas branco-amareladas semelhantes a corais, chamadas

internacionalmente de “kunkers” (SANTURIO et al., 2006a). Conforme estes autores,

os “kunkers” variam de 2 a 10 mm de diâmetro, tem forma irregular, ramificada, com

aspecto arenoso e penetram no tecido granular, dentro de sinus formados ao longo do

seu trajeto. Os animais apresentam intenso prurido e normalmente mutilam a lesão na

tentativa de aliviar o desconforto (LEAL, 1999).

A segunda forma mais freqüente de infecção em eqüinos é a intestinal,

caracterizando-se por massas teciduais localizadas na parede do intestino, levando a

diminuição e obstrução do lúmen (SANTURIO et al., 2003a). A maioria dos casos

descritos relata apenas uma lesão em cada animal, porém podem existir lesões cutâneas

multifocais (MENDOZA & ALFARO, 1986; CHAFFIN et al., 1992). Além disso, pode

ocorrer disseminação para órgãos internos a partir de infecções subcutâneas (REIS et

al., 2003), como nos casos descritos de lesões ósseas (MENDOZA et al., 1988;

ALFARO & MENDOZA, 1990; EATON, 1993). Estes estudos referem-se a eqüinos

com lesões cutâneas crônicas, localizadas nos membros e com grande proliferação do

tecido granulomatoso, onde as lesões ósseas ficaram limitadas aos ossos adjacentes às

lesões cutâneas.

Os caninos são a segunda espécie mais atingida pela pitiose, também nas formas

cutânea e gastrintestinal (SANTURIO et al., 2006a). A forma gastrintestinal é a mais

comum e manifesta-se com distúrbios digestivos como vômito, anorexia crônica, perda

de peso, diarréia (às vezes sanguinolenta) e presença de massas nodulares, quando

submetidos à palpação abdominal (FISCHER et al., 1994; DYKSTRA et al., 1999;

GROOTERS, 2003). Os cães afetados são normalmente oriundos de regiões rurais ou

estiveram, esporadicamente, em locais alagados como açudes e banhados (FOIL et al.,

1984; FISCHER et al., 1994; DYKSTRA et al., 1999). As lesões cutâneas apresentam-

se como dermatites piogranulomatosas ulcerativas, contendo áreas de necrose infiltradas

por neutrófilos e macrófagos e granulomas eosinofílicos (ENGLISH & FROST, 1984;

FOIL et al., 1984; DYKSTRA et al., 1999).

Pitiose em felinos é rara, havendo poucos relatos na literatura. Um deles refere-

se a uma infecção nasal e retrobulbar, sem envolvimento de órgãos internos, cujo

diagnóstico baseou-se em imunohistoquímica, sorologia através de imunodifusão e

isolamento do agente (BISSONNETTE et al., 1991). No outro relato foram dois casos

de pitiose gastrintestinal em gatos nos EUA (RAKICH et al., 2005). Recentemente,

foram descritos os primeiros casos de pitiose em mamíferos não domésticos: pitiose

cutânea e gastrintestinal em ursos (GROOTERS, 2003), pitiose pulmonar em um jaguar

da América Central (CAMUS et al., 2004) e um tigre com lesão intestinal por Pythium

insidiosum (BUERGELT et al., 2006).

A pitiose bovina também é pouco freqüente, havendo apenas três relatos na

literatura, onde os autores descreveram lesões cutâneas, geralmente nos membros e

caracterizadas por ulcerações, espessamento da derme e edema na região afetada. O

primeiro na região de Louisiana, EUA (MILLER et al., 1985), o segundo na região do

Pantanal, Brasil (SANTURIO et al., 1998) e o terceiro, recentemente, na Venezuela

(PÉREZ et al., 2005). Os casos observados no Brasil apresentaram cura espontânea das

lesões (SANTURIO et al., 1998). Já em ovinos essa doença é rara, tendo seu primeiro

surto descrito no Brasil (TABOSA et al., 2004), onde os animais afetados apresentaram

feridas com lesões ulcerativas nas patas e também nas regiões pré-escapular e

abdominal. O segundo relato de pitiose em ovinos também foi reportado no Brasil, e foi

o primeiro caso de rinite granulomatosa por Pythium insidiosum descrito nesta espécie

(SANTURIO et al., 2008). A enfermidade ocorreu em quatro ovinos da raça Santa Inês

e foi caracterizada por nodulações e necrose nasal, dificuldade respiratória e epistaxe

intermitente (SANTURIO et al., 2008).

Pitiose humana foi documentada pela primeira vez em 1985 (DE COCK et al.,

1987). Desde então, muitos casos têm sido relatados, com altas taxas de morbidade e

mortalidade (PUPAIBOOL et al., 2006). É comum no sudeste da Ásia, principalmente

na Tailândia, e dois fatores contribuem para a importância da pitiose nesse país: a

prevalência de β-talassemia e presença de grandes áreas alagadas usadas para

agricultura (TRISCOTT et al., 1993). As infecções por Pythium insidiosum em

humanos podem apresentar-se de três formas: lesões granulomatosas no tecido

subcutâneo de pacientes talassêmicos; forma sistêmica, caracterizada por

desenvolvimento de arterite crônica, trombose arterial e gangrena, atingindo geralmente

a extremidade dos membros inferiores de pacientes talassêmicos; e queratite, podendo

ou não estar associada à talassemia (IMWIDTHAYA, 1994). No Brasil a pitiose teve

seu primeiro relato em humanos no ano de 2005, na forma cutânea (BOSCO et al.,

2005).

O diagnóstico da pitiose, tradicionalmente, é feito pelos aspectos clínicos,

histopatológicos e pelo isolamento e identificação do agente através de suas

características culturais, morfológicas e reprodutivas. O exame histopatológico é

auxiliar no diagnóstico e necessita de outras provas para confirmação (SANTURIO et

al., 2006b). A identificação precoce da doença, no entanto, torna-se difícil através

desses métodos (SANTURIO et al., 2006a). Atualmente, métodos como

imunohistoquímica e técnicas sorológicas auxiliam e suportam um diagnóstico precoce

e correto (MENDOZA et al., 1996). O sucesso no isolamento de P. insidiosum é alto

quando amostras de biópsias forem armazenadas ou transportadas à temperatura

ambiente, com o acréscimo de antibióticos, entre um e três dias antes de seu

processamento no laboratório (SANTURIO et al., 2006a). O diagnóstico imunológico,

pela técnica de ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), possibilita a detecção de

infecções precoces ou ainda subclínicas (MENDOZA et al., 1997). Além de constituir-

se numa poderosa ferramenta para o diagnóstico específico, também pode ser útil no

monitoramento da resposta à terapia (GROOTERS, 2003). Testes de ELISA para

detecção de pitiose em eqüinos, caninos, felinos, humanos e bovinos já foram

desenvolvidos para diagnóstico precoce (GROOTERS et al., 2002a; PÉREZ et al.,

2005; SANTURIO et al., 2006b). Existem ainda as técnicas moleculares constituindo

importante ferramenta para o diagnóstico e identificação de Pythium insidiosum,

principalmente através de PCR (reação de polimerase em cadeia) (JAEGER et al., 2002;

GROOTERS & GEE, 2002b; REIS et al., 2003; RIVIERRE et al., 2005; BOSCO et al.,

2005; MENDONZA & NEWTON, 2005).

O tratamento da pitiose é influenciado principalmente pelo tamanho e evolução

clínica da lesão, idade e estado nutricional do animal (MONTEIRO, 1999), tornando

variável o sucesso das diferentes formas de tratamento. De acordo com Miller (1981) e

Rochette et al. (2003), o tradicional tratamento da pitiose eqüina é cirúrgico, sendo o

procedimento mais utilizado. A intervenção cirúrgica é complicada devido às estruturas

anatômicas envolvidas, pois a partir da permanência de fragmentos do agente podem

ocorrer recidivas (MILLER, 1981; CHAFFIN et al., 1995). O tratamento cirúrgico

apresenta bons resultados apenas em lesões pequenas e superficiais, onde seja possível a

retirada de toda área afetada (SANTURIO et al., 2006a).

No tratamento da pitiose eqüina as drogas mais utilizadas até o momento foram

a anfotericina B e os compostos iodínicos, como iodeto de potássio e sódio

(McMULLAN et al., 1977; GONZALES et al., 1979; MEIRELES et al., 1993).

McMullan et al. (1977) obtiveram 50% de eficiência associando remoção cirúrgica e

anfotericina B; 30% apenas com anfotericina B e 20% não responderam aos

tratamentos. Segundo Gonzales et al. (1979), os animais respondem ao iodeto de

potássio associado à cirurgia ou isolado, porém o iodeto de potássio é mais eficiente

quando usado após a extirpação cirúrgica do granuloma. Little & Kabay (1984) e

Chaffin et al. (1992) também relataram o sucesso do tratamento cirúrgico seguido de

iodeto de sódio em potros com pitiose cutânea. Entretanto, Meireles et al. (1993) não

obtiveram sucesso em dois eqüinos tratados com iodeto de potássio endovenoso, até

mesmo quando associado à cirurgia. Utilizando outras tentativas de tratamento, Sedrish

et al. (1997), obtiveram sucesso no uso de raio laser vermelho de alumínio, neodímio e

ítrio como terapia suplementar após a remoção cirúrgica de lesões de pitiose eqüina.

Porém, alguns autores afirmam que a ressecção cirúrgica total do granuloma combinada

com imunoterapia especifica para Pythium insidiosum é o tratamento mais indicado para

cura de pitiose clínica em eqüinos (HUBERT & GROOTERS, 2002).

O tratamento da pitiose através da imunoterapia foi inicialmente proposto por

MILLER (1981), que desenvolveu um imunobiológico a partir de culturas do próprio

agente. Neste estudo o índice de eficiência foi de 53%; e 75% quando associado à

cirurgia (MILLER & CAMPBELL, 1982). No decorrer das décadas de oitenta e

noventa vários autores utilizaram a imunoterapia, principalmente em eqüinos, cujos

índices de cura não foram maiores que 70% (MENDOZA et al., 1992) e 83,3%

(MONTEIRO, 1999). Thitithanyanont et al. (1998) descreveram a utilização com

sucesso de um imunoterápico no tratamento de pitiose em um menino talassêmico.

Dykdtra et al. (1999) relataram o fracasso de uma vacina autógena utilizada em um cão

com pitiose cutânea. Recentemente, Mendoza et al. (2003) testaram uma nova

formulação de vacina para Pythium insidiosum em eqüinos e caninos e obteve cura em,

respectivamente, 72% e 33% dos animais. Em contraste aos resultados obtidos em

eqüinos e bovinos, a imunoterapia em felinos e caninos tem sido desapontadora

(MENDOZA & NEWTON, 2005).

Até o presente momento, nenhuma das terapias antifúngicas propostas para a

pitiose canina apresentaram resultados satisfatórios. Entre as drogas testadas destacam-

se a anfotericina, fluconazol, cetoconazol e itraconazol (FOIL et al., 1984; ENGLISH &

FROST, 1984; DYKSTRA et al., 1999; JAEGER et al., 2002; RIVIERRE et al., 2005).

Segundo alguns autores, a cirurgia continua como opção mais segura para o tratamento

da pitiose canina (HNILICA, 1998, THOMAS & LEWIS, 1998; GROOTERS, 2003),

embora as recidivas pós-operatórias sejam freqüentes (GROOTERS, 2003). Por esta

razão, Grooters (2003) indica a terapia com itraconazol (10mg/Kg/24 horas) associado a

terbinafina (5-10 mg/Kg/ 24 horas) por dois a três meses após cirurgia. Este mesmo

autor relata que aproximadamente 15% dos cães com pitiose gastrintestinal

responderam ao tratamento com itraconazol ou anfotericina B lipídica. Entretanto,

Dykstra et al. (1999) utilizaram itraconazol (5 mg/kg/60 dias) em um cão não obtendo

melhora. Grooters (2003) também observou melhora ou cura clínica e sorológica em

alguns casos de pitiose cutânea canina e felina, quando os animais administraram

terbinafina associada ao itraconazol. E afirma que, embora o número de animais que

responderam a este protocolo de tratamento tenha sido baixo, a combinação antifúngica

pareceu superior à terapia isolada.

O tratamento da pitiose felina também apresenta resultados variados.

Bissonnette et al. (1991) ao realizarem o tratamento de um felino com pitiose nasal e

retrobulbar com cetoconazol, observaram que houve melhora clínica, porém a lesão

recidivou após o término do tratamento. Já Rakich et al. (2005) encontraram resultados

diferentes ao tratar dois felinos com pitiose gastrintestinal. O animal tratado com a

associação terbinafina/itraconazol, durante dois meses depois da retirada cirúrgica da

lesão, apresentou cura clínica sem recidivas. Porém, morreu subitamente quatro meses

após a cirurgia. O outro felino, que recebeu terapia com itraconazol, também por dois

meses depois da retirada cirúrgica da lesão, demonstrou sorologia negativa, detectada

por meio de um teste de ELISA, realizado cinco meses após tratamento. Este animal

permaneceu em observação por nove meses, não apresentando recidiva da lesão durante

esse período.

De forma similar aos resultados clínicos, os testes de suscetibilidade in vitro

com drogas antifúngicas, realizados com Pythium insidiosum, também tem demonstrado

resultados contraditórios. Em um estudo de Sekhon et al. (1992) os poliênicos

anfotericina B, hamycin e seus análogos não apresentaram atividade satisfatória,

enquanto os azólicos fluconazol, cetoconazol e miconazol inibiram os isolados de

Pythium insidiosum testados in vitro, com o miconazol apresentando os melhores

resultados, seguido do cetoconazol. Entretanto, Triscott et al. (1993), relatando pitiose

subcutânea na região periorbital de dois jovens, constataram a boa resposta ao

tratamento com anfotericina B, contrariando os resultados obtidos nos testes de

sensibilidade. Em outro estudo, as drogas anfotericina B, flucitosina, miconazol e

griseofulvina não inibiram o crescimento deste oomiceto, enquanto o itraconazol

apresentou atividade moderada e a terbinafina foi ativa contra o Pythium insidiosum

testado (SHENEP et al., 1998). De acordo com Shenep et al. (1998), a associação de

terbinafina e itraconazol apresentou efeito sinérgico e foi utilizada, com sucesso, no

tratamento de um menino com infecção facial.

A tendência ao tratamento da pitiose atualmente está voltada para os chamados

inibidores de síntese de glucanas, como a caspofungina (KRAJAEJUN et al, 2006).

Acredita-se que esta droga seja eficiente contra este agente devido a grande quantidade

de β-glucana presente na parede celular deste oomiceto (GROOTERS, 2003).

Recentemente, Pereira et al. (2007) avaliaram a suscetibilidade in vitro de 27 isolados

de P. insidiosum frente à caspofungina e ainda relacionaram estes achados com a

resposta da terapia in vivo em coelhos com pitiose experimental. Entretanto, este estudo

sugeriu que Pythium insidiosum é pouco suscetível à caspofungina in vitro e in vivo.

2.2 Zoosporogênese

A zoosporogênese in vitro é uma ferramenta fundamental, tanto para a

identificação do Pythium insidiosum, como para a obtenção de zoósporos, em

quantidades suficientes, para desenvolvimento de testes de suscetibilidade in vitro e

para inoculação em animais experimentais (PEREIRA et al., 2008). Para obtenção de

inóculo para testes de suscetibilidade in vitro com Pythium insidiosum e para

reprodução experimental da pitiose em coelhos estima-se que o número ideal de

zoósporos seja em torno de 20.000 zoósporos/mL (SANTURIO et al., 2003; PEREIRA

et al., 2007).

A produção de zoósporos inicia com a formação de zoosporângios, os quais se

desenvolvem a partir de hifas que colonizaram certos tipos de plantas (GROOTERS,

2003). A obtenção de zoosporângios in vitro é realizada através da indução da

zoosporogênese em meio líquido (SHIPTON, 1985; CHAIPRASERT et al., 1990).

Neste contexto foram desenvolvidos protocolos para indução da zoosporogênese em

laboratório (MENDOZA & PRENDAS, 1988), os quais vêm sendo aprimorados e

adaptados (PEREIRA et al., 2008).

O protocolo para indução da zoosporogênese, recentemente notificado, baseia-se

no parasitismo de fragmentos de grama por hifas de Pythium insidiosum em um meio

pobre em nutrientes e, a seguir, na incubação dessas gramas parasitadas em Meio de

Indução rico em sais, e com temperatura e pH adequados (PEREIRA et al., 2008). Este

protocolo mostra que os zoósporos podem ser produzidos a partir do cultivo de P.

insidiosum em fragmentos de grama (Paspalum notatum) sobre Corn Meal Agar

(CMA), após 5 dias de incubação a temperatura de 37

C. E, após esse período de

cultivo, os fragmentos de grama parasitados pelo Pythium insidiosum são transferidos

para uma placa de Petri contendo Meio de Indução, composto pela solução A [K

HPO

, (NH

)

HPO

] e solução B [MgCl

O, CaCl

]. O Meio de Indução é obtido

pela mistura de 0,5 ml da solução A e 0,1 ml da solução B em 1000 ml de água

destilada estéril. As placas de Petri contendo o Meio de Indução juntamente com a

grama infectada são incubadas a 37

C por 24 horas (PEREIRA et al., 2008). Pereira et

al. (2008) concluíram que após este período de indução, o número máximo de

zoósporos obtidos foram entre 6 e 8 horas de incubação, onde aproximadamente 87%

dos isolados produziram mais de 20.000 zoósporos/mL.

2.3 Antifúngicos: itraconazol, voriconazol e terbinafina

Os derivados triazólicos mais recentes, como itraconazol e voriconazol, devem

suas atividades antifúngicas, pelo menos em parte, à inibição da 14α-esterol desmetilase

dependente do citocromo P-450, responsável pela conversão do lanosterol em ergosterol

(figura 1) (GHANNOUM & RICE, 1999). Por isso, comprometem a biossíntese do

ergosterol na membrana citoplasmática e levam ao acúmulo de esteróis, os quais podem

desagregar o arranjo compacto das cadeias acíclicas dos fosfolipídios, comprometendo

as funções de determinados sistemas enzimáticos ligados a membrana, como ATPase e

as enzimas de transporte de elétrons (GEORGOPAPADAKOU & WALSH, 1996),

inibindo assim, o crescimento dos fungos.

O ergosterol é um componente essencial da membrana plasmática fúngica, onde

regula a permeabilidade da membrana e tem um papel importante na respiração

mitocondrial e fosforilação oxidativa (BOSSCHE et al., 2003). A inibição da síntese de

ergosterol afeta o citocromo c oxidase nas mitocôndrias; e aumenta a síntese de quitina,

resultando em uma distribuição irregular da mesma (BOSSCHE, 1985). Portanto, é

esperado que mudanças nos níveis de ergosterol e nas estruturas de esteróis influenciem

a atividade de várias rotas metabólicas.

O itraconazol é um triazólico que apresenta atividade antifúngica contra espécies

de Candida sp., Malassezia sp., Cryptococcus neoformans, Blastomyces dermatitidis,

Histoplasma capsulatum, Coccidiodis immitis e dermatófitos (BOSSCHE et al., 2003).

O itraconazol é administrado por via oral e, após absorção, sofre extenso metabolismo

hepático. Sobre a farmacocinética, estudos mostraram que níveis terapêuticos ativos de

itraconazol em humanos são mantidos por muito mais tempo em alguns tecidos

infectados do que no plasma (BOSSCHE et al., 2003). É altamente lipossolúvel, com

meia vida de 36 horas, sendo excretado na urina (BENNET, 2003).

O voriconazol é o primeiro antifúngico da segunda geração dos triazólicos, de

amplo espectro (RADFORD et al., 1997), e sua atividade inclui a maioria das leveduras

e dos fungos filamentosos (GEORGOPAPADAKOU & WALSH, 1996). É ativo em

ambas as formulações, oral e parenteral, e tem sido usado para avaliar ensaios clínicos

para grande variedade de patógenos fúngicos. Voriconazol tem excelente atividade in

vitro contra Aspergillus spp., e variável atividade contra outros fungos filamentosos

(DIEKEMA et al., 2003; SCHWARTZ et al., 1997). Estudos realizados com patógenos

fúngicos emergentes, como Scedosporium (RADFORD et al., 1997; CUENCA-

ESTRELLA et al., 1999; GOSBELL et al., 2003) e Fusarium (RADFORD et al., 1997;

DIEKEMA et al., 2003), demonstraram a eficácia do voriconazol in vitro e in vivo.

A terbinafina é um antifúngico oral ou tópico usado para tratar dermatófitos e

onicomicose, e tem sido avaliado também em combinações com outros agentes

(VAZQUEZ, 2003). Terbinafina é um composto fungicida ceratinofílico, altamente

lipofílico, pertencente ao grupo das alilaminas (COSTA & GÓRNIAK, 2002). É

altamente efetiva contra dermatófitos in vitro e in vivo (GHANNOUM & RICE, 1999;

DAVIS & BALFOUR, 1995), bem como contra fungos filamentosos, dimórficos e

dematiáceos, e algumas espécies de leveduras (BALFOUR & FAULDS, 1992). Atua

especificamente numa etapa precoce da biossíntese do ergosterol (GHANNOUM et al.,

1999), inibindo a enzima esqualeno-epoxidase (figura 1), resultando em deficiência de

esterol na membrana celular fúngica e acúmulo intracelular tóxico de esqualeno

(N’DIAYE et al., 2006), resultando em morte celular. Também é metabolizada no

fígado pelo sistema citocromo P-450 e os metabólitos são excretados na urina

(BENNET, 2003). Esta droga tem sido há muito tempo usado contra dermatófitos, mas

estudos recentes indicaram uma atividade elevada de terbinafina in vitro contra uma

grande variedade de fungos invasivos, tais como espécies de Candida, espécies de

Aspergillus ou Penicillium marneffei (MOORE et al., 2001; RYDER et al., 1998).

Figura 1. Rota de biossíntese do ergosterol. Etapas onde vários agentes antifúngicos

exercem suas atividades inibitórias estão mostradas. TERB, terbinafina; FLU,

fluconazol; ITRA, itraconazol; VOR, voriconazol. (GHANNOUM & RICE, 1999)

2.4 Combinações antifúngicas e testes de suscetibilidade in vitro

Voriconazol, itraconazol e outros azólicos, atuam reduzindo a síntese de

ergosterol via inibição do citocromo P450 (GOSBELL et al., 2003). Terbinafina

pertence ao grupo das alilaminas e atua especificamente em um estágio precursor de

biossíntese do ergosterol, inibindo a enzima esqualeno-epoxidase (GOSBELL et al.,

2003). Ambas as enzimas estão envolvidas na rota de biossíntese do ergosterol na

membrana celular fúngica (figura 1), então, teoricamente a combinação de terbinafina e

azólicos poderia proporcionar sinergismo contra patógenos fúngicos pelo bloqueio

seqüencial desta rota (KOWALSKY & DIXON, 1991, MELETIADIS et al., 2003).

No estudo de Gosbell et al. (2003), a associação de voriconazol à terbinafina

demonstrou sinergismo in vitro e foi utilizada para tratar uma infecção ortopédica

causada por Scedosporium prolificans. O teste de suscetibilidade revelou CIMs

individuais de 8 mg/L para terbinafina e 1 mg/L para voriconazol. As CIMs de

voriconazol foram reduzidas a 0.03-0.25 mg/L quando terbinafina foi adicionada, e a

adição de voriconazol reduziu a CIM de terbinafina a 2 mg/L (GOSBELL et al., 2003).

Terbinafina associada com azólicos mostrou efeito sinérgico contra espécies de

Candida, espécies de Aspergillus, Pseudallescheria boydii, Scedosporium prolificans e

Scopulariopsis brevicaulis, algumas das quais não responderam a qualquer

medicamento utilizado isoladamente (RYDER, 1999). Outros estudos ainda relatam que

combinações de terbinafina com miconazol, voriconazol ou itraconazol mostraram

sinergismo in vitro contra espécies de Scedosporium prolificans resistentes a diversas

drogas (MELETIADIS et al., 2000; MELETIADIS et al., 2003). Entretanto, a

significância in vivo dessas combinações não foi avaliada em animais. A única

informação disponível provém dos relatos de caso que documentam o sucesso do uso de

itraconazol ou voriconazol combinado com terbinafina em pacientes com infecções

invasivas causadas por Scedosporium prolificans, Pythium insidiosum ou

cromoblastomicose causada por Fonsecaea pedrosoi (HOWDEN et al., 2003; GUPTA

et al., 2002; SHENEP et al., 1998).

Tendo em vista a quantidade de agentes antifúngicos sistêmicos disponíveis,

uma opção para o tratamento é a terapêutica combinada. A combinação ideal de drogas

é aquela em que a interação entre elas é sinérgica. No entanto, mesmo na ausência de

sinergismo, pode haver outros possíveis benefícios de combinações terapêuticas. Por

exemplo, a combinação de duas drogas pode aumentar a taxa de homicídio microbiano e

encurtar a duração do tratamento (ZHU et al., 2004). Como também, a combinação de

dois medicamentos diferentes, que exercem seus efeitos através de dois mecanismos

diferentes, poderia evitar o aparecimento de resistência medicamentosa e ampliar o

espectro da atividade da associação. Além disso, com as combinações antifúngicas, que

permitem o uso de doses mais baixas de cada composto, o risco de efeitos tóxicos das

drogas pode ser reduzido (ZHU et al., 2004).

Segundo Johnson (2004), as vantagens dos testes de associações antifúngicas in

vitro são: a facilidade de se avaliar grande número de concentrações; facilidade de

aplicar testes estatísticos; facilidade para variar fatores técnicos; facilidade para testar

múltiplos isolados; facilidade para testar cepas com tipo de resistência definido. E entre

as desvantagens o autor cita que a relevância dos métodos nem sempre é clara, e que

fatores do hospedeiro e a farmacocinética são ignorados (JOHNSON, 2004).

Uma das formas mais conhecidas e mais simples para avaliar efeitos de

combinações in vitro é através da técnica de checkerboard. O termo checkerboard se

refere a um modelo, utilizando tubos ou placas de microtitulação, formado para testar

dois agentes antifúngicos em concentrações várias diluições acima e abaixo da CIM

para o fungo a ser testado (CUENCA-ESTRELLA, 2004). O Índice de Concentração

Inibitória Fracionária (ICIF) é a forma mais comum em micologia médica para relatar

resultados de estudos com o método checkerboard, e é a concentração mais baixa de

cada droga capaz de inibir o crescimento do microrganismo (CUENCA-ESTRELLA,

2004). O método checkerboard utiliza o ICIF para demonstrar quantitativamente que

combinações de dois agentes podem apresentar efeitos inibitórios que são maiores

(sinergismo) ou menores (antagonismo) que a soma dos seus efeitos individuais

(ODDS, 2003). As interações são interpretadas como sinérgicas (ICIF ≤ 0,5),

indiferentes (0,5 < ICIF ≤ 4) ou antagônicas (ICIF > 4) e calculadas de acordo com a

fórmula: ICIF = (CIM A em combinação/CIM A) + (CIM B em combinação/CIM B)

(JOHNSON, 2004).

Conforme Cuenca-Estrella (2004), indiferença sugere que o efeito combinado é

simplesmente o efeito da droga mais ativa quando testada separadamente. Sinergismo é

uma interação positiva entre dois compostos, possuindo como principais mecanismos:

1) inibição de diferentes estágios da mesma via bioquímica; 2) melhor penetração de um

antifúngico como resultado da ação de outro antifúngico na parede celular ou membrana

citoplasmática; 3) interação de transporte; 4) inibição simultânea de diferentes alvos na

célula fúngica; 5) atividade fungicida rápida (JOHNSON, 2004). E o antagonismo, por

outro lado, é uma interação negativa, onde os mecanismos de antagonismo são: 1) ações

de dois antifúngicos no mesmo sítio de ação podem resultar em baixa da habilidade do

outro agente exercer sua atividade no mesmo local, ou num sitio alterado; 2) a adsorção

de um agente na superfície do fungo inibe a ligação de outro agente antifúngico no sítio

de ação; 3) modificação de um alvo após a prévia exposição a outro agente (JOHNSON,

2004).

As indicações para uso dos diferentes antifúngicos devem ser baseadas nos

resultados obtidos com os estudos de suscetibilidade disponíveis, os quais podem

oferecer informações para escolha do tratamento mais adequado (CUENCA-

ESTRELLA & RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002). Os padrões do CLSI constituem os

métodos de referência mais difundidos e os que mais se tem utilizado para realizar

estudos de correlação com a clínica (CUENCA-ESTRELLA & RODRÍGUEZ-

TUDELA, 2002). O documento M 38-A é um dos métodos de referência do CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute, formalmente National Committee for

Clinical Laboratory Standards-NCCLS). M 38-A é uma norma global desenvolvida,

mediante processo consensual do CLSI, para testes de diluição em caldo com a

finalidade de determinar a suscetibilidade in vitro de fungos filamentosos à terapia

antifúngica (NCCLS, 2002). Este documento apresenta a seleção de agentes

antifúngicos; preparação de soluções antifúngicas padrão e diluições para a realização

de testes; e os requisitos de controle de qualidade para testes de sensibilidade de fungos

filamentosos que causam infecções fúngicas invasivas (NCCLS, 2002).

Este padrão descreve técnicas de macro e microdiluição, entre cujas principais

características se incluem um método espectrofotométrico para a preparação do inóculo,

RPMI a pH 7,0 como meio de cultivo, utilização de antifúngicos em forma de pó,

leitura visual dos tubos ou placas, cálculo das CIMs por porcentagens de inibição e

recomendações para controlar a qualidade dos resultados (CUENCA-ESTRELLA &

RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002). O documento focaliza ainda as condições de teste,

incluindo a preparação e o tamanho do inóculo, o tempo e a temperatura de incubação, a

formulação do meio e os critérios para a determinação da CIM.

Uma das limitações das técnicas recomendadas neste protocolo, M 38-A, é que

as mesmas foram estabelecidas utilizando um número limitado de espécies fúngicas,

portanto se têm dúvidas sobre sua aplicabilidade para outros fungos (GUARRO et al.,

1997). Do mesmo modo, se tem dúvidas sobre a confiabilidade e adequação de se

empregar um método espectrofotométrico para preparação do inóculo (ESPINEL-

INGROFF et al., 1997). Por essa razão, tem sido proposto o emprego de técnicas de

contagem microscópica de conídios, que permitam preparar um inóculo reproduzível

(PETRIKKOU et al., 2001; PUJOL et al., 2001). Contudo, recomenda-se sempre para

realização de estudos de suscetibilidade seguir uma metodologia padronizada (NCCLS,

2002), em instituições sanitárias que os façam rotineiramente, utilizando um controle de

qualidade estrito (CUENCA-ESTRELLA & RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002).

3 ARTIGO CIENTÍFICO

TABELAS SUPLEMENTARES DO ARTIGO (NÃO PUBLICADAS)

Tabela 1: Identificação e origem dos isolados de Pythium insidiosum estudados.

Identificação do Isolado

Espécie Origem

ATCC 58637 Eqüino Costa Rica

CBS 101555 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 123 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 124 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 125 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 126 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 127 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 128 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 129 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 134 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 135 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 136 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 137 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 138 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 141 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 142 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 143 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 144 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 145 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 147 Eqüino São Paulo Brasil

LAPEMI 148 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 152 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 156 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 167 Canino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 175 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 177 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 178 Eqüino Mato Grosso do Sul Brasil

LAPEMI 179 Ovino Mato Grosso Brasil

LAPEMI 187 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

LAPEMI 198 Eqüino Rio Grande do Sul Brasil

ATCC, American Type Culture Collection; CBS, Centraalbureau voor

Schimmelcultures; LAPEMI, Laboratório de Pesquisas Micológicas.

Tabela 2: Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) e Concentrações Fungicidas

Mínimas (CFMs) de Pythium insidiosum (n = 30) a terbinafina.

Número (%) de isolados de Pythium insidiosum sensíveis a

terbinafina na concentração (μg/mL) de:

Parâmetros de

suscetibilidade

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

CIM-0

(3,3%)

0 11

(36,7%)

(53,3%)

(6,7%)

0 0 0

CIM-1

0 1

(3,3%)

(30%)

(6,7%)

0 0 0 0

CFM

(3,3%)

0 7

(23,3%)

(56,7%)

(16,7%)

0 0 0

Concentração mais baixa da droga para inibição completa do crescimento.

Concentração mais baixa da droga para inibição parcial do crescimento (25%).

Tabela 3: Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) de Pythium insidiosum (n = 30) ao

itraconazol e voriconazol.

Número (%) de isolados de Pythium insidiosum sensíveis ao

itraconazol e voriconazol na concentração (μg/mL) ≥ a:

Antifúngicos

0,125

0,25

0,5

1,0

2,0

4,0

8,0

Itraconazol

0 0 0 0 0 0 0 21 (70%) 9 (30%)

Voriconazol

0 0 0 0 0 0 0 21 (70%) 9 (30%)

4 DISCUSSÃO

Pythium insidiosum difere dos fungos verdadeiros principalmente na

composição da parede celular e da membrana plasmática. A membrana plasmática não

contém esteróides, como o ergosterol, que é o componente-alvo de ação da maioria dos

antifúngicos (FOIL, 1996). Devido a essas características nenhum antifúngico

demonstrou eficácia clínica contra este oomiceto (FOIL, 1996), e os estudos in vitro

foram pouco esclarecedores.

Estudos de suscetibilidade in vitro com Pythium insidiosum foram previamente

desenvolvidos por Sekhon et al. (1992) e Shenep et al. (1998), porém estes autores não

descreveram os procedimentos empregados para preparação do inóculo, o tempo e

temperatura de incubação, nem os critérios de leitura. Este trabalho descreve o primeiro

estudo sobre suscetibilidade de isolados brasileiros de Pythium insidiosum a

combinações de agentes antifúngicos, seguindo parâmetros recomendados pelo

protocolo M 38-A (NCCLS, 2002). Esse documento foi padronizado para fungos

filamentosos; no entanto, Pythium insidiosum é um oomiceto. Desta forma, para

realização dos testes, foi necessário padronizar um inóculo, o qual foi obtido por

contagem de zoósporos de Pythium insidiosum. Segundo Pereira et al. (2007), este

procedimento constitui-se na metodologia mais confiável para testes de suscetibilidade

com este oomiceto; uma vez que zoósporos de Pythium insidiosum não produzem

turbidez no meio e, portanto o inóculo não pode ser ajustado por espectrofotometria.

Sekhon et al. (1992) utilizaram suspensões de hifas de P. insidiosum ajustadas

em espectrofotômetro como inóculo. Entretanto, Espinel-Ingroff et al. (1997) citam que,

quando se usa suspensões de hifas como inóculo, há uma discrepância entre as

Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) em valores de até três vezes maiores quando

as mesmas são comparadas com suspensões de conídios. Contudo, as desvantagens do

inóculo usado no presente estudo incluem a dificuldade em obter a quantidade requerida

de zoósporos (PEREIRA et al., 2008), e o fato que zoósporos não são a forma

patológica. No entanto, zoósporos e hifas têm as mesmas organelas e composição de

membrana celular (MOORE-LANDECKER, 1996). Enfatizamos ainda que a utilização

do inóculo na concentração de 2-3x10

proporcionou excelente crescimento do Pythium

insidiosum em caldo RPMI. Resultados similares foram obtidos por Pereira et al.

(2007).

Método de análise por microdiluição em caldo está padronizado para bactérias, e

a relação entre CIMs de antibióticos e resposta ao tratamento (interpretação dos pontos

de corte) está bem definida contra estes microrganismos. Entretanto, este não é o caso

para as CIMs de antifúngicos. Pontos de corte interpretados contra fungos têm sido

definidos somente para alguns antifúngicos atuando contra poucas espécies fúngicas. A

padronização desse método e a definição de pontos de corte estão sujeitas a um número

de dificuldades, tais como a pobre reprodutibilidade inter e intra-laboratório e a

dependência dos resultados sobre pH, tipo de inóculo, condições de crescimento ou

meio e tempo de incubação (GIL-LAMAIGNERE & MILLER, 2004).

Neste estudo, o ponto de corte para itraconazol e voriconazol foi estabelecido de

acordo com NCCLS (2002), entretanto para terbinafina foram empregados dois critérios

de avaliação (inibição de 100% e de 75%). Gómez-López et al. (2003) adotaram o

critério de inibição total do crescimento ao testar terbinafina contra espécies de

zigomicetos, assim como Gil-Lamaignere & Miller (2004) utilizaram o mesmo critério

de leitura ao testar a mesma droga frente Candida albicans, C. dubliniensis e C. kefyr.

Entretanto, Garg et al. (2006) definiram o ponto final em 80% de inibição para

terbinafina frente a espécies de Candida. A ausência de dados de padronização para

testes in vitro com oomicetos e a inexistência de CIMs definidas para esta droga

justificam os diferentes critérios de leitura para terbinafina adotados neste estudo.

O primeiro estudo de suscetibilidade in vitro com Pythium insidiosum foi

descrito por Sekhon et al. (1992), que testaram alguns antifúngicos individualmente e

mostraram que os oito isolados de P. insidiosum testados foram mais suscetíveis ao

miconazol, cetoconazol e fluconazol do que ao itraconazol, anfotericina B e 5-

fluorocitosina. Shenep et al. (1998) utilizaram a técnica de macrodiluição em caldo

RPMI para testar a suscetibilidade de um isolado humano de P. insidiosum frente a

agentes antifúngicos in vitro, e mostraram a cura farmacológica de um paciente usando

terbinafina associada ao itraconazol.

Sekhon et al. (1992) testaram itraconazol e encontraram a CIM entre 25 e 50

mg/L, enquanto Shenep et al. (1998) obtiveram uma CIM de 0,125 mg/L para o mesmo

antifúngico. Entretanto, neste estudo, as CIMs variaram de 16 a >32 mg/L para

itraconazol e voriconazol. Provavelmente estas variações de CIMs devem-se às

diferentes metodologias usadas por esses autores. No sinergismo das combinações das

drogas utilizadas neste estudo observou-se que a adição de terbinafina reduziu as CIMs

de voriconazol a 0,25 mg/L e as de itraconazol a 0,5 mg/L, na maior parte dos ensaios.

Da mesma forma, a adição dos triazóis reduziu a CIM de terbinafina de 4,0 mg/L para

1,0 ou 2,0 mg/L, na maioria dos isolados avaliados. Quando Shenep et al. (1998)

associaram terbinafina a itraconazol a CIM de itraconazol foi reduzida para 0,015 mg/L;

e demonstraram que a terbinafina na forma individual foi ativa com a CIM igual a 0,5

mg/L, e quando foi associada ao itraconazol a CIM da mesma foi de 0,008 mg/L.

Os dados sobre tratamentos clínicos para pitiose com drogas antifúngicas bem

como os obtidos com testes de suscetibilidade in vitro são controversos. No presente

estudo foram testados trinta isolados de P. insidiosum, obtidos de casos clínicos de

animais, utilizando a técnica de checkerboard (CUENCA-ESTRELLA, 2004).

Observou-se que as associações itraconazol e terbinafina e voriconazol e terbinafina

atuaram sinergicamente contra cinco isolados, evidenciando que ambas as combinações

testadas exibiram um efeito sinérgico em 17% dos trinta isolados estudados. Já em 83%

não houve interação. Enfatiza-se que três dos isolados indicaram sinergismo em ambas

as combinações testadas, o que pode estar relacionado à variabilidade ou inconstância

bioquímica entre amostras de Pythium (KRAJAEJUN et al., 2006; McMEEKIN &

MENDOZA, 2000). Embora, contrariamente, Schurko et al. (2003) não tenham

demonstrado variabilidade genotípica entre isolados americanos de Pythium insidiosum.

Triazólicos e terbinafina bloqueiam diferentes etapas da mesma rota de

biossíntese de ergosterol nas células fúngicas (MELETIADIS et al., 2000). Desta forma,

quando combinados, um dos antifúngicos deve aumentar a permeabilidade celular para

o outro, o que suporta uma ação sinérgica. Como estes antifúngicos atuam

primariamente inibindo a síntese de ergosterol (KOWALSKY & DIXON, 1991),

ausente na membrana citoplasmática do Pythium insidiosum (FOIL, 1996),

possivelmente outros mecanismos estão envolvidos na inibição ou morte do Pythium

insidiosum. Isto poderia explicar os relatos de cura e suscetibilidade in vitro de alguns

isolados. De acordo com Dykstra et al. (1999), Pythium não é um fungo verdadeiro e

não utiliza ergosterol como o principal esterol nas membranas celulares. Não é surpresa

que agentes antifúngicos que interferem na síntese de ergosterol não sejam efetivos

contra oomicetos. Krajaejun et al. (2006) ao estudarem 102 casos de pitiose em

humanos registrados na Tailândia relataram o sucesso no tratamento de um menino com

pitiose cutânea utilizando iodeto de potássio combinado com itraconazol e terbinafina

após debridamento cirúrgico. Estes autores ainda mencionam a caspofungina, entre

outras drogas que inibem a síntese de glucanas, como uma alternativa para o tratamento

de pitiose. No entanto, recentemente, caspofungina foi testada contra isolados

brasileiros de Pythium insidiosum, evidenciando baixa suscetibilidade in vitro e in vivo

(PEREIRA et al., 2007).

Os valores das CIMs das combinações das drogas testadas neste estudo estão

dentro dos limites séricos. Segundo Kovarik et al. (1995), a concentração máxima

encontrada de terbinafina foi de aproximadamente 1,7 mg/L, após administração oral de

500 mg. Similarmente, Bossche et al. (2003) encontraram concentrações séricas entre

1,7 e 2,0 mg/L após uso da mesma dosagem. Embora, Shenep et al. (1998) tenham

encontrado concentrações de 1,0 a 2,1 mg/L de itraconazol no soro de um paciente após

uso de 8 mg/kg/dia; níveis séricos acima de 3 mg/L já foram encontrados com esta

droga (PATTERSON et al., 1996). Martinez (2006) obteve a concentração sérica de 4,0

a 6,0 mg/L de voriconazol em um paciente humano após administração de 400 mg/dia

da droga. Portanto, as CIMs obtidas nas combinações sinérgicas (variação de 0,25 a 4

mg/L) podem ser consideradas terapêuticas, uma vez que estas concentrações já foram

encontradas em soro humano. Estes achados também podem justificar a atividade da

terbinafina, onde 90% dos isolados testados mostraram CIM igual a 4 mg/L, o que é

muito próximo as concentrações séricas encontradas por Bossche et al. (2003).

O sinergismo in vitro da terbinafina e voriconazol ou itraconazol pode ser

considerado efetivo para o tratamento desta enfermidade. Entretanto é preciso seguir

este estudo in vivo, e se possível comparar com novos relatos de uso clínico destas

interações medicamentosas, em animais e/ou humanos atingidos pela pitiose, para

elucidar o potencial destas drogas combinadas. Este estudo foi o primeiro passo a frente

nas combinações de diferentes drogas antifúngicas, e deverá servir para investigações

futuras deste oomiceto com outras drogas, combinadas ou não, seguindo este protocolo.

5 CONCLUSÕES

1- Zoósporos de Pythium insidiosum devem ser utilizados para confecção de um

inóculo padrão, permitindo que todos os ensaios tenham um inóculo contendo a

mesma quantidade de zoósporos.

2- Testes in vitro com Pythium insidiosum devem seguir o protocolo M 38-A

(NCCLS, 2002) desde que se utilize um inóculo padronizado.

3- Terbinafina foi a droga mais efetiva, com CIM-0 e CFM variando de 0,5 a 8

mg/L; e com 90% dos isolados apresentando CIM-0 = 4 mg/L.

4- Voriconazol e itraconazol não mostraram eficácia e as atividades fungicidas

destas drogas foram > 16 mg/L.

5- Ambas as combinações, terbinafina + voriconazol e terbinafina + itraconazol,

apresentaram efeito sinérgico em 17% e indiferença em 83% dos isolados.

6- As interpretações de ambas as interações foram equivalentes para 87% dos

isolados.

7- Antagonismo nas interações nunca foi observado.

8- CIMs obtidas nas combinações sinérgicas (0,25 a 4 mg/L) podem ser

consideradas terapêuticas.

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