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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação Strictu senso
Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos
LEILA ROSELI DIERINGS
ABORDAGEM MICROBIOLÓGICA DA FERMENTAÇÃO OXIDATIVA, ALCOÓLICA E
MALOLÁTICA NO PROCESSAMENTO DA SIDRA
PONTA GROSSA
2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação Strictu senso
Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos
LEILA ROSELI DIERINGS
ABORDAGEM MICROBIOLÓGICA DA FERMENTAÇÃO OXIDATIVA, ALCOÓLICA E
MALOLÁTICA NO PROCESSAMENTO DA SIDRA
Dissertação apresentada à banca
examinadora como um dos requisitos à
obtenção do grau de Mestre em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, para o
Programa de Pós-Graduação em Ciência
e Tecnologia de Alimentos da
Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Orientador: Prof. Dr. Alessandro Nogueira
PONTA GROSSA
2008
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Ficha Catalográfica Elaborada pelo Setor de Processos Técnicos BICEN/UEPG
Dierings, Leila Roseli
D563a Abordagem microbiológica da fermentação oxidativa,
alcoólica e malolática no processamento da sidra. / Leila Roseli
Dierings. Ponta Grossa, 2008.
115f.
Dissertação ( Mestrado em Ciência e Tecnologia de
Alimentos ), Universidade Estadual de Ponta Grossa.
Orientador: Prof. Dr. Alessandro Nogueira
1.Sidra. 2. Fermentação oxidativa. 3. Fermentação
4. Malolática. 4. Tecnologia. I. Nogueira, Alessandro. II. T.
CDD: 664.24
A minha amada filha, Nathália Camila.
Dedico.
Existe uma coisa que uma longa
existência me ensinou: toda a ciência,
comparada à realidade, é primitiva e
inocente; e, portanto, é o que temos de
mais valioso.
(Albert Einstein)
AGRADECIMENTOS
Á Deus que proporcionou a realização deste trabalho.
Ao departamento de Engenharia de Alimentos que disponibilizou materiais,
reagentes e permitiu que o trabalho fosse realizado em suas dependências e a todos os
professores que contribuíram com informações e dividiram seus espaços.
Ao orientador Professor Doutor Alessandro Nogueira pelo compromisso
assumido e pela dedicação empenhada neste trabalho, pela confiança e amizade, pelos
suportes formais e informais que disponibilizou, pelas sugestões, esclarecimentos e
comentários sempre oportunos e que espero ter sabido aproveitar.
Ao Professor Doutor Gilvan Wosiacki pela disposição em ajudar, amizade e
seriedade com que conduz os trabalhos.
A Professora e amiga Leila Denise Falcão, pelo incentivo e pelos apontamentos
como membro examinador.
Aos colegas do Programa de Pós-Graduação Cristiane Schamne, Maria Isabel,
Paula, Cristiane, Audie, Danianni, Débora, Ana Mery, Marina, Mary, Lúcia, Cleoci e
Simone pelo auxílio, sugestões e críticas, além de momentos de descontração durante
o café que resultaram em amizades que persistirão por toda a vida.
À Denise e a Rita pela dedicação e ajuda durante a realização dos trabalhos
experimentais e por transformarem o laboratório em um ambiente familiar.
Aos colegas que formam o Grupo de Trabalho sobre Maçã, pela colaboração nos
estudos, trabalhos e pelos momentos de descontração que me proporcionaram.
E... Especialmente ao meu marido e amigo Rodrigo Desidério, a minha filha
Nathália, meus pais, minha irmã Letícia e a toda a minha família que sempre
acreditaram, incentivaram e ajudaram na conclusão deste trabalho.
RESUMO
Na Europa o processo de fermentação do suco de maçã para obtenção da sidra
compreende 3 fases distintas, fase oxidativa e fermentativa (síntese de aromas e
produção de etanol) e fase malolática (redução da acidez). No Brasil o processo ocorre
em temperaturas de 25-35ºC, presença de sulfito e com adição de leveduras
fermentativas, caracterizando um processo rápido e com predominância de aroma do
fermento. A fim de aumentar o consumo e retomar a identidade da bebida torna-se
necessário melhorar a qualidade avaliando a tecnologia. Este trabalho teve como
objetivo avaliar o processo fermentativo da sidra, verificando a influência dos diferentes
microrganismos, naturais ou comerciais, na sua qualidade. Os experimentos foram
conduzidos em microfermentadores. Foram utilizadas duas cepas comerciais
Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni. Dentre os microrganismos de interesse
na fermentação, as leveduras apiculadas apresentaram as maiores populações
presentes nos mostos (10
5
ufc.mL
-1
). Na fermentação natural as leveduras apiculadas
apresentaram um rápido crescimento, mas foram suplantadas pelas fermentativas após
3 dias. As leveduras fermentativas inibiram o crescimento das bactérias láticas, porém
com a autólise, após 10 dias, as bactérias retomaram o crescimento. Com o inóculo da
levedura e/ou da bactéria o comportamento dos microrganismos foram semelhantes ao
processo natural. Porém com inóculo de bactérias láticas no mosto as populações
foram superiores (10
7
ufc.mL
-1
), o que pode tornar o processo de fermentação
malolática mais eficiente.
Palavras-chaves: Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni, leveduras apiculadas,
tecnologia.
ABSTRACT
In the Europe the fermentation process of apple juice for cider obtention comprehend 3
phases distinct, oxidative and alcoholic fermentation phase (synthesis of aromas and
ethanol release respectively
) and the malolatic phase (reduction of the acid). In the
Brazil the process occurs in temperatures of 25-35ºC, presence of sulfite and with
addition of yeast, resulting a fast process with predominance of aroma of yeast. In order
to increase its consumption and to retake the identity of the beverage is necessary
improve the quality and evaluate the processing technology. This work has as objective
to evaluate the fermentation process of the cider, verified the interaction between the
different microorganisms that influence in the quality. The experiments were lead with
microfermentors. Were used two commercial strain Saccharomyces cerevisiae and
Oenococcus oeni. The population of apiculate yeast of the apple must were superior
(10
5
ufc.mL
-1
). In the natural fermentation the apiculate yeast had presented a fast
growth, but they were supplanted by Saccharomyces sp in 3 days of fermentation, this
microorganisms inhibited too the growth of the lactic bacteria. After 10 days of
fermentation, the yeast starts a mortality phase that induced the bacterial growth.
Inoculate of the yeast and/or the bacteria the behavior and developments of the
microorganisms were similar at the natural fermentation. However with addition of lactic
bacteria in the apple must, after 10 days of fermentation the populations were highest
(10
7
ufc.mL
-1
)
that can become the malolactic fermentation more efficient.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni, apiculate yeast, technology.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1- Via metabólica de bactérias láticas homofermentativa
(DRILLEAU, 1995).......................................................................... 32
FIGURA 2- Via metabólica de bactérias láticas heterofermentativa
(DRILLEAU, 1995)......................................................................... 33
FIGURA 3- Metabolismo do ácido cítrico pela bactéria Oenococcus oeni
(NIELSEN; RICHELIEU, 1999)....................................................... 42
FIGURA 4- Esquema de um fermentador e da determinação de perda de gás
carbônico para obtenção da cinética da fermentação
(NOGUEIRA et al., 2007)................................................................ 53
FIGURA 5- Fluxograma representativo do experimento da microbiota natural
de mostos de maçãs....................................................................... 54
FIGURA 6- Fluxograma representativo do experimento de monitoramento da
microbiota em fermentações naturais............................................. 55
FIGURA 7- Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais.............. 56
FIGURA 8- Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do inóculo de levedura e redução de biomassa............................. 57
FIGURA 9- Fluxograma representativo do experimento para avaliar o
crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado.... 58
FIGURA 10- Fluxograma representativo do experimento para avaliar a
fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado................ 59
FIGURA 11- Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do sulfito no crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã. 60
FIGURA 12- Fotos do experimento de fermentação no início (A) e após 48
horas (B)......................................................................................... 61
FIGURA 13- Fluxograma representativo das fermentações com inóculo S.
cerevisiae e O. oeni em diferentes condições de inoculação da
bactéria lática.................................................................................. 62
FIGURA 14- Fotos do experimento de fermentação no início (A) e após
redução de biomassa (B)................................................................ 63
FIGURA 15- Amostras de maçãs comerciais e industriais (descarte) contendo
defeitos, injúrias e/ou podridões..................................................... 64
FIGURA 16- Variação de temperatura no interior do fermentador...................... 66
FIGURA 17- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação natural........................................................ 68
FIGURA 18- Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
natural............................................................................................ 70
FIGURA 19- Evolução dos ácidos orgânicos durante a fermentação natural..... 71
FIGURA 20- Cinética da fermentação natural em função da perda de peso dos
fermentadores decorrente da liberação de gás carbônico.............. 71
FIGURA 21- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo da levedura S. cerevisiae...... 73
FIGURA 22- Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo de S. cerevisiae......................................................... 74
FIGURA 23- Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae............ 75
FIGURA 24- Cinética da fermentação com inóculo de leveduras S. cerevisiae.. 76
FIGURA 25- Variação de temperatura durante o experimento........................... 77
FIGURA 26- Efeito da redução de biomassa no crescimento das leveduras
fermentativas................................................................................... 79
FIGURA 27- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo da levedura e com redução
de biomassa.................................................................................... 80
FIGURA 28- Efeito da redução de biomassa no crescimento das bactérias
láticas naturais............................................................................... 81
FIGURA 29- Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo da levedura e com
redução de biomassa...................................................................... 81
FIGURA 30- Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae e sem
redução de biomassa...................................................................... 82
FIGURA 31- Cinética da fermentação com inóculo da levedura e redução de
biomassa........................................................................................ 83
FIGURA 32- Desenvolvimento da bactéria lática O. oeni durante a
fermentação do mosto de maçãs da cultivar Gala e Fuji
pasteurizado.................................................................................. 84
FIGURA 33- Crescimento da bactéria O. Oeni, adicionado ou não de S.
cerevisiae, em suco de maçã pasteurizado, após 5 dias de
fermentação................................................................................... 86
FIGURA 34- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O.
oeni................................................................................................. 88
FIGURA 35- Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O.
oeni................................................................................................. 89
FIGURA 36- Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O.
oeni................................................................................................. 90
FIGURA 37- Cinética da fermentação com inóculo simultâneo de S. cerevisiae
e O. oeni......................................................................................... 90
FIGURA 38- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e
O. oeni............................................................................................. 92
FIGURA 39- Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni....................... 93
FIGURA 40- Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo seqüencial de S.
cerevisiae e O. oeni........................................................................ 94
FIGURA 41- Curva de crescimento de O. Oeni com inóculo simultâneo e
seqüencial......................................................................................
95
FIGURA 42- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação do mosto de maçã pasteurizado e com
inóculo de S. cerevisiae e O. oeni................................................. 96
FIGURA 43- Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação do
mosto de maçã pasteurizado e com inóculo de S. cerevisiae e O.
oeni................................................................................................. 97
FIGURA 44- Cinética da fermentação em função da perda de peso dos
fermentadores decorrente da liberação de gás carbônico durante
a fermentação do mosto de maçã pasteurizado e com inóculo de
S. cerevisiae e O. oeni.................................................................... 98
FIGURA 45- Efeito da redução de biomassa no crescimento das leveduras
fermentativas................................................................................... 100
FIGURA 46- Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni,
com redução de biomassa.............................................................. 101
FIGURA 47- Efeito da redução de biomassa no crescimento das bactérias
láticas............................................................................................. 102
FIGURA 48- Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O.
oeni, com redução de biomassa..................................................... 103
FIGURA 49- Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni... 104
FIGURA 50- Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae, O. oeni e
redução de biomassa...................................................................... 105
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Microrganismos naturais em mostos de maçãs................................ 65
TABELA 2- Composição do mosto de maçãs e monitoramento durante a
fermentação natural.......................................................................... 67
TABELA 3- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
leveduras S. cerevisiae..................................................................... 72
TABELA 4- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação da sidra com
inóculo de S. cerevisiae, com centrigugação do fermentado após
12 horas de fermentação.................................................................. 78
TABELA 5- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae...................................................................................... 78
TABELA 6- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae...................................................................................... 85
TABELA 7- Monitoramento da acidez total e volátil durante a fermentação do
mosto de maçã com inóculo de O. oeni a e sulfito............................ 86
TABELA 8- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae e de O. oeni no mosto................................................. 87
TABELA 9- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo
seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni............................................... 91
TABELA 10- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação do mosto de
maçã pasteurizado com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni............. 96
TABELA 11- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae e O. oeni, com redução de biomassa.......................... 98
TABELA 12- Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae e O. oeni...................................................................... 99
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 14
2. OBJETIVOS ........................................................................................... 16
2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 16
2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 16
3. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................. 18
3.1 A sidra: histórico e definição ................................................................... 18
3.2 A matéria-prima ...................................................................................... 19
3.3 Operações pré-fermentação ................................................................... 21
3.4 Fermentação .......................................................................................... 22
3.4.1 Fermentação oxidativa ........................................................................... 22
3.4.2 Fermentação alcoólica............................................................................ 24
3.4.3 Fermentação malolática ......................................................................... 27
3.4.3.1 As bactérias láticas ................................................................................. 30
3.4.3.2 Fermentação malolática natural ............................................................. 34
3.4.3.3 Fermentação malolática por inóculo ....................................................... 34
3.4.3.4 Condições do meio ................................................................................. 35
3.4.3.5 Efeito na qualidade da sidra ................................................................... 39
3.4.4 Operações pós-fermentação .................................................................. 43
4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 45
4.1 Material ................................................................................................... 45
4.1.1 Microorganismos .................................................................................... 45
4.1.2 Frutas ..................................................................................................... 45
4.2 Métodos .................................................................................................. 46
4.2.1 Processo ................................................................................................. 46
4.2.1.1 Mosto de maçãs ..................................................................................... 46
4.2.1.2 Processamento do fermentado de maçã ................................................ 46
4.2.2 Análises microbiológicas ........................................................................ 47
4.2.2.1 Leveduras totais em placa ...................................................................... 47
4.2.2.2 Leveduras oxidativas .............................................................................. 48
4.2.2.3 Bactérias láticas ..................................................................................... 48
4.2.3 Análises físico-químicas ......................................................................... 49
4.2.3.1 Açúcares ................................................................................................. 49
4.2.3.2 Acidez titulável ........................................................................................ 50
4.2.3.3 Acidez volátil ........................................................................................... 50
4.2.3.4 Ácidos orgânicos .................................................................................... 50
4.2.3.5 pH ........................................................................................................... 51
13
4.2.3.6 Nitrogênio ............................................................................................... 51
4.2.3.7 Dióxido de enxofre total .......................................................................... 51
4.2.3.8 Álcool ...................................................................................................... 51
4.2.4 Cinéticas de fermentação ....................................................................... 52
4.2.5 Experimentos .......................................................................................... 53
4.2.5.1 Microbiota natural de mostos de maçãs ................................................. 53
4.2.5.2 Monitoramento da microbiota em fermentações naturais ....................... 54
4.2.5.3 Efeito do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais ............ 55
4.2.5.4 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e redução de biomassa..................... 56
4.2.5.5 Crescimento da Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado ............ 57
4.2.5.6 Fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado ....................... 58
4.2.5.7 Efeito do sulfito no crescimento de O. oeni em suco de maçã ............... 59
4.2.5.8 Efeito do inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O. oeni ......................... 60
4.2.5.9 Efeito do inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni ......................... 61
4.2.5.10 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni em suco pasteurizado ....... 62
4.2.5.11 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni com redução de biomassa 62
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 64
5.1 Microbiota natural de mostos de maçãs ................................................. 64
5.2 Monitoramento da microbiota em fermentações naturais ....................... 65
5.3 Efeito do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais ............ 72
5.4 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e redução de biomassa..................... 76
5.5 Crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado ............ 83
5.6 Fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado ....................... 83
5.7 Efeito do sulfito no crescimento de O. oeni em suco de maçã ............... 85
5.8 Efeito do inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O. oeni ......................... 87
5.9 Efeito do inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni ......................... 91
5.10 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni em suco pasteurizado ....... 95
5.11 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni com redução de biomassa 98
6. CONCLUSÕES .................................................................................... 106
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 108
14
1. INTRODUÇÃO
A fermentação de suco da maçã para obtenção da sidra é um bioprocesso
tão nobre e antigo quanto o do vinho e da cerveja. A sidra é tradicionalmente
produzida em países europeus que apresentam regiões de clima temperado
definido, como a Inglaterra e a França, a Bélgica e a Espanha, aonde se torna
possível o desenvolvimento pleno de macieiras. A cultura sidrícola é especialmente
dominante em regiões francesas da Bretagne e Normandie, mas pouco desenvolvida
em países de influência alemã, onde são preferidos os vinhos de uva.
No Brasil o processamento iniciou antes da década de 60 no estado de São
Paulo. Os imigrantes europeus cultivavam maçãs para o processamento de geléias
bem como fermentados, auxiliados pelo Instituto Agronômico de Campinas, pois as
maçãs ali produzidas eram de má qualidade. Desde então pouco foi estudado com
relação à tecnologia, microbiologia e qualidade da sidra nas condições de
processamento brasileira.
A elaboração do fermentado de maçã e da sidra, que tem como diferença
apenas o gás carbônico dissolvido, pode compreender duas etapas, [1] a
fermentação alcoólica, que compreende a oxidativa, por leveduras não-
convencionais ou apiculadas, responsáveis por aromas classificados como frutados
e florais, e a fermentativa, pelas leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae,
que transformam o açúcar em etanol; e a [2] fermentação malolática que
descarboxila o ácido L-málico transformando-o em ácido L-lático, atenuando o sabor
ácido e melhorando o corpo da bebida.
Na indústria sidrícola brasileira, em decorrência da temperatura média de
25ºC, é comum à adição de sulfito no início do processo fermentativo seguido do
15
inóculo da levedura, ocasionando a perda de viabilidade das leveduras oxidativas e
das bactérias láticas naturais do mosto, além disso, a elevada temperatura,
proporcionar uma fermentação rápida, muitas vezes com aromas característicos de
fermento. As leveduras oxidativas podem influenciar a qualidade do fermentado
conferindo melhores propriedades aromáticas, mas para que isso ocorra, estes
microrganismos devem ser favorecidos durante o processamento.
A fermentação malolática pode ser tanto positiva quanto negativa, pois as
maçãs brasileiras apresentam baixa acidez o que não justificaria a fermentação
malolática, porém esta transformação pode melhorar o corpo da bebida, quando o
processo for conduzido até uma bebida seca (menos e 20 g.L
-1
de açúcares), além
de o produtor poder adicionar menores quantidades de açúcares no produto final.
No Brasil, face à falta de informações científicas sobre o comportamento de
microrganismos envolvidos na fermentação do suco de maçã e sua participação na
obtenção de um produto de melhor qualidade, é oportuno um estudo comparando os
processos conduzidos com a microbiota natural e com cepas de leveduras e de
bactérias láticas sob condições programadas e controladas. Dessa forma busca-se
desenvolver um produto capaz de atender a exigência do consumidor e ao mesmo
tempo resgatar a identidade da bebida.
Diante da realidade do processamento sidrícola brasileiro e da necessidade
de uma sidra de melhor qualidade, este trabalho teve como objetivo avaliar os
microrganismos de interesse sidrícola, por meio de suas populações durante as
fermentações.
16
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
• Avaliar o comportamento das leveduras oxidativas, fermentativas e
maloláticas, da microbiota natural ou inoculada no processamento da sidra em
condições brasileiras.
2.2 Objetivos específicos
• Analisar as leveduras e as bactérias láticas presentes na microbiota
natural de mostos de maçãs comerciais e industriais no contexto
brasileiro;
• Avaliar o perfil de fermentação da sidra pela microbiota natural;
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo de
Saccharomyces cerevisiae em presença de bactérias láticas naturais;
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo de
Saccharomyces cerevisiae e redução de biomassa em presença de
bactérias láticas naturais;
• Avaliar a capacidade de crescimento da bactéria Oenococcus oeni em
mosto de maçãs;
• Avaliar o crescimento da bactéria Oenococcus oeni em mosto de maçã
clarificado e pasteurizado na presença de sulfito;
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo simultâneo
de Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni;
17
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo seqüencial
de Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni;
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo de
Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni em mosto pasteurizado;
• Avaliar o perfil fermentativo do mosto de maçãs com inóculo de
Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni e redução de biomassa;
• Avaliar o efeito da fermentação malolática na aceitação do fermentado
de maçã.
18
3. REVISÃO DE LITERATURA
Este item apresenta uma descrição do cenário da fabricação da sidra, com
abordagem dos processos fermentativos.
3.1 A sidra: histórico e definição
O processo de fermentação de suco de maçã visando à obtenção de uma
bebida alcoólica já era praticado no Mediterrâneo Oriental há mais de 2000 anos
(JARVIS et al., 1995, citado por LAPLACE et al., 2001). Em documentos antigos,
podem ser encontrados termos como Sikéra (grego) e Sicera (latim), descritos por
Plínio no século I (Histoire Naturelle) e por Hipócrates, patrono da Medicina, no
século V a.C., relacionados a bebidas fermentadas à base de maçãs e pêras
(ROBIN; DE LA TORRE, 1988).
No Brasil a sidra é definida legalmente como bebida com graduação
alcoólica de quatro a oito por cento em volume, a vinte graus Celsius, obtida pela
fermentação alcoólica do mosto da maçã, podendo ser adicionada de suco de pêra,
em proporção máxima de trinta por cento, e sacarose não superior aos açúcares da
fruta (BRASIL, 2000).
A sidra francesa caracteriza-se como um produto suave, adstringente
(tânico), com aroma frutado. Na Alemanha e Suíça as principais características da
sidra é o sabor tipicamente seco e ácido, enquanto que na Espanha apresenta
aroma pungente, predominante de ácido acético. Já no Brasil, esta bebida é
considerada pouco aromática e de baixa acidez, produzida essencialmente de
maçãs de mesa (NOGUEIRA, 2003).
19
A sidra brasileira encontra-se disponível no mercado consumidor o ano todo,
mas é comprada apenas em festas e, particularmente, nas de fim de ano. Toda
produção é voltada para o mercado interno, não existindo processos de exportação
e nem de importação (WOSIACKI; CHERUBIN; SANTOS, 1997).
O desenvolvimento de uma sidra com um perfil definido mediante a
aceitação do consumidor brasileiro pode estender seu consumo durante todo o ano,
e mesmo, almejar a comercialização internacional. A quantidade de matéria-prima
disponibilizada ao setor industrial é significativa, torna-se necessário o
desenvolvimento de pesquisas que favoreçam a melhoria do produto e que a
qualidade atenda à exigência do consumidor (NOGUEIRA et al., 2003).
3.2 A matéria-prima
A maçã (Malus domestica), dentre as frutas de clima temperado, cultivadas
no Brasil, apresentou a maior expansão em área plantada e em volume de
produção, passando de 931 ha em 1972 a 37.413 ha em 1980 (EPAGRI, 2002). Em
2005 o Brasil ocupou o décimo quarto lugar na produção mundial, com 870.000
toneladas ou 1,33% da produção global (ALMEIDA; ALVES, 2006). De acordo com o
IBGE em 2007 a produção nacional foi de 1.093.843 toneladas em uma área
plantada de 37.562 hectares e com um rendimento médio de 29.121 quilogramas
por hectare (IBGE, 2008).
No Brasil, as frutas destinadas à indústria sidrícola são as maçãs sem valor
comercial para o consumo in natura, que apresentam defeitos fisiológicos e
morfológicos, com destaque para tamanho pequeno, má distribuição de cor, formas
inadequadas, marcas de cicatrizes e injúrias mecânicas. As maçãs de descarte
industrial compreendem as infectadas por microorganismos. Ao contrário de outros
20
países, na França utiliza-se como matéria-prima maçãs cultivadas exclusivamente
para a elaboração de Sidra (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
A matéria-prima para produção de sidra constitui-se em uma mistura de
maçãs de cultivares comercial. No Brasil, não existem ainda atitudes concretas no
sentido de procurar maçãs mais adequadas para o processamento, uma vez que a
maioria disponibilizada ao setor industrial é das variedades Gala e Fuji, as quais são
variedades selecionadas para consumo in natura (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
A composição físico-química das frutas de descarte é praticamente a mesma
das maçãs comercializadas e, dessa forma, podem ser utilizadas pelas indústrias
processadoras de suco, possibilitando a oferta de um produto nobre ao longo de
todo o ano. Há possibilidade de valorizar economicamente essa fração da produção
comercial, até então, sem muitas perspectivas (WOSIACKI et al., 1992).
O mosto de maçã industrial brasileiro difere quantitativamente pouco do
mosto de maçã industrial europeu. Os açúcares constituem a maior porção dos
carboidratos e os maiores constituintes dos sólidos solúveis da maçã, sendo os
principais a frutose, a glucose e a sacarose, os quais são distribuídos uniformemente
por todas as partes da fruta (NOGUEIRA; WOSIAKI, 2005). Pode ser encontrado no
mosto teores de açúcares entre 100 a 150 g.L
-1
, a relação entre açúcares e acidez
permite a classificação das variedades de maçã em sabor amarga, doce-amarga,
doce, ácida e azeda (DRILLEAU, 1995).
O principal ácido orgânico presente na fruta é o málico (NOGUEIRA;
WOSIAKI, 2005), em uma concentração que varia de 4 a 6 g.L
-1
. Tipicamente estão
presentes no mosto compostos nitrogenados com baixa concentração de prolina e
compostos fenólicos, no entanto, antocianinas geralmente não são encontradas
(DRILLEAU, 1995).
21
3.3 Operações pré-fermentação
Quando as frutas chegam à indústria são armazenadas em silos ou
pequenas pilhas, as quais são transportadas até o local de processamento por
canais, através de flotação, em um processo de pré-lavagem. Posteriormente são
limpas em água corrente e trituradas em ralador ou moinho, obtendo uma polpa com
textura fina e sólida (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
Após a trituração a massa ralada é acondicionada em telas plásticas, as
quais são superpostas e levadas à prensa. O suco é extraído empregando-se uma
determinada pressão em função do tempo. Para aumentar o rendimento,
coadjuvantes como celulose ou cascas de arroz podem ser misturados a massa
ralada, facilitando o escoamento do suco. (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
Ao sair da prensa o mosto ainda contém substâncias pécticas, hidrocolóides,
que elevam a viscosidade do líquido e adsorvem pigmentos coloridos derivados da
ação enzimática sobre compostos fenólicos. Para reduzir o tamanho das moléculas
e a descaracterização dos polissacarídeos, é feito uma despectinização enzimática
por hidrólise ou beta-eliminação, com o auxílio de enzimas comerciais contendo
pectinases e celulases, após, a clarificação é feita por flotação ou colagem. O
dióxido de enxofre empregado na forma gasosa ou líquida, processo chamado
sulfitagem, tem efeito antiséptico, antioxidante e antioxidásico (NOGUEIRA;
WOSIACKI, 2005).
22
3.4 Fermentação
O processo de fermentação da sidra pode compreender duas etapas: a
fermentação alcoólica e a malolática. A fermentação alcoólica abrange a oxidativa e
a fermentativa e corresponde à formação de aromas e a transformação de açúcares
em álcool, respectivamente. A fermentação malolática, conduzida por bactérias, tem
por finalidade reduzir a acidez do fermentato por conversão do ácido málico em
ácido lático, melhorando o sabor da bebida (DRILLEAU, 1995).
3.4.1 Fermentação oxidativa
A fermentação oxidativa é feita por leveduras de baixa atividade enzimática
(LEQUÉRÉ; DRILLEAU, 1998). Estágios prévios a produção de álcool, em
fermentações naturais, são caracterizados geralmente pela atividade de leveduras
do gênero Kloeckera spp e Hanseniespora valbyensis (MARTINEZ; MILLAN;
ORTEGA, 1989). Estas leveduras, em especial a Metschnikowia pulcherrima e a
Hanseniespora valbyensis, participam do processo de clarificação por flotação
mediante a liberação de gás carbônico (CO
2
) (NOGUEIRA, 2003).
A viabilidade das células pode durar de 5 a 15 dias após a preparação do
mosto, o que corresponde ao consumo de cerca de 10 g.L
-1
de açúcares e 30 a 40
mg.L
-1
de nitrogênio (LEQUÉRÉ; DRILLEAU, 1998).
As leveduras apiculadas ou não Saccharomyces, presente nas frutas e
materiais de processamento, podem alcançar populações ao redor de 10
6
ufc.mL
-1
durante a fermentação do mosto (COTON et al., 2006).
23
Em vinhos tintos a presença de leveduras apiculadas durante a fermentação
pode alterar a composição aromática. Elas produzem concentrações elevadas de
alguns compostos como glicerol, acetato de etila e acetoína (CIANI; FATICHENTI,
1998).
Interações metabólicas entre leveduras não Saccharomyces e S. cerevisiae
durante a fermentação do vinho, podem interferir no crescimento e fermentação dos
microrganismos, especialmente da S. cerevisiae. (CIANI; FATICHENTI, 1998). As
leveduras oxidativas dão lugar a cepas mais tolerantes as condições do meio como
Saccharomyces cerevisiae (MARTINEZ; MILLAN; ORTEGA, 1989).
O progressivo desaparecimento de espécies de leveduras não
Saccharomyces durante a fermentação, geralmente é atribuído à sua ineficiência em
sobreviver em ambientes com altas concentrações de etanol, o qual é produzido
durante a fermentação alcoólica. O acúmulo de etanol no meio representa uma
forma de estresse químico e estudos demonstram que a membrana plasmática é o
primeiro alvo de ação do etanol (PINA et al., 2004).
O tempo de ação das cepas oxidativas varia em função do microrganismo,
sua população inicial e disponibilidade de oxigênio durante a fase de crescimento
(NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005). Temperatura, pH, concentração de sulfito e etanol
também influenciam o crescimento (CIANI; FATICHENTI, 1998). Estes
microrganismos podem ser inibidos pela adição de anidrido sulfuroso (NOGUEIRA;
WOSIACKI, 2005).
24
3.4.2 Fermentação alcoólica
A fermentação alcoólica, na maioria dos casos, acontece sob ação da
microbiota selvagem presente na fruta e material de processamento, no entanto, é
possível seu desenvolvimento pela adição de levedura seca-ativa disponível ao setor
agroindustrial (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
As leveduras naturais do gênero Saccharomyces estão presentes no mosto
em uma população de aproximadamente 6,0x10
4
ufc.mL
-1
, apresentam crescimento
e atingem a população máxima de cerca de 1,0 a 4,0x10
7
ufc.mL
-1
, situação na qual,
a velocidade de fermentação atinge seu valor máximo. A população estabiliza o
crescimento após o consumo de 10 a 15 g.L
-1
de açúcares (LEQUÉRÉ; DRILLEAU,
1998). No entanto, quando células viáveis de Saccharomyces cerevisiae são
inoculadas no mosto em uma população em torno de 10
6
ufc.mL
-1
, atingem a fase
estacionária com uma população ao redor de 10
7
ufc.mL
-1
(HERRERO et al., 1999).
As leveduras utilizam prontamente os açúcares simples, glicose e frutose, os
quais penetram na célula por difusão facilitada. Apresentam atividade invertásica,
hidrolisando sacarose em glicose e frutose, porém não são capazes de metabolizar
açúcares mais complexos (BELIN, 1995). Durante a fermentação alcoólica as
leveduras esgotam os nutrientes do meio como amônio, hexoses, aminoácidos e
vitaminas, pela fácil assimilação (REMIZE et al., 2006).
Esta deficiência do meio, em vitaminas ou aminoácidos, pode torná-lo
menos favorável para o desenvolvimento das bactérias nas primeiras semanas de
fermentação (DRILLEAU, 1995). No entanto, como Oenococcus oeni é autotrófico
apenas para alguns aminoácidos, necessita adquirir outros do meio para poder se
25
desenvolver, podendo desta forma, o crescimento das bactérias ser prejudicado pelo
metabolismo das leveduras (GUILLOUX-BENATIER et al., 2006).
O primeiro mecanismo de inibição das bactérias durante a fermentação
alcoólica estudado foi a produção de sulfito (SO
2
) pelas leveduras (HENICK-KLING;
PARK, 1994). Estudos demonstraram que as leveduras produziam altas
concentrações de sulfito durante a fermentação, sob concentrações elevadas de
nitrogênio. Contudo, a produção de SO
2
por leveduras não foi sempre considerada o
fator de inibição de Oenococcus oeni, sugerindo a presença de outros mecanismos
inibitórios (OSBORNE; EDWARD, 2006).
Pesquisas recentes verificaram que mesmo leveduras que produziam
quantidades similares de sulfito, não inibiam igualmente a bactéria lática
Oenococcus oeni, durante a fermentação alcoólica. A inibição bacteriana diminuía
quando o vinho era tratado com proteases, mas não através da adição de nutrientes.
A fração do vinho responsável pelo efeito inibitório apresentava compostos com
peso molecular abaixo de 3kDa e a habilidade deste peptídio demonstrou ser
dependente da presença de sulfito (OSBORNE; EDWARDS, 2007). O mecanismo
pelo qual o peptídeo inibiu Oenococcus oeni não foi determinado, porém, o tamanho
pequeno deste peptídeo sugere que a ação inibitória pode ser similar à ação das
bacteriocinas, formando poros ou canais nas membranas, permitindo a entrada de
SO
2
mais facilmente (OSBORNE; EDWARDS, 2007). De acordo com Oscaríz e
Pisabarro, (2001) bacteriocinas são substâncias proteinaceas, antibacterianas,
produzidas por bactérias Gram positivas que apresentam um espectro de atividade
contra as espécies relatadas e possuem tamanho normalmente menor que 10 kDa.
Durante o metabolismo as leveduras secretam aminoácidos (ácido
glutâmico, valina) essenciais para o desenvolvimento das bactérias. Portanto, a
26
composição em aminoácidos sofre modificação qualitativa (DRILLEAU, 1995). Os
nutrientes liberados durante a autólise das leveduras são responsáveis pelo efeito
estimulatório no crescimento bacteriano (PATYNOWSKI; JIRANEK; MARKIDES,
2002).
A autólise da levedura durante o envelhecimento de vinhos pode afetar
extremamente as concentrações dos compostos nitrogenados, incluindo
aminoácidos, peptídeos e proteínas. A liberação de nitrogênio é devida à atividade
proteolítica das leveduras. Em condições ácidas e usando inibidores de proteinase,
a atividade da proteinase A da levedura foi responsável por 80% da liberação do
nitrogênio durante a autólise. A liberação de nitrogênio durante a fermentação
alcoólica ou durante a autólise poderia explicar a estimulação do crescimento da
bactéria ácido lática (LURTON; SEGAIN; FEUILLAR, 1989).
A fermentação alcoólica de um meio de composição definida foi estudada
usando Saccharomyces cerevisiae e uma cepa mutante ∆pep4, na qual foi suprido o
gene da proteinase A. A fermentação com a cepa mutante, ∆pep4, resultou em
níveis de aminoácidos livres inferiores a 61% e concentração de peptídeos inferiores
a 62%, no final da fermentação alcoólica, quando comparado ao controle. Diferenças
qualitativas na concentração dos aminoácidos foram observadas. Depois da
fermentação alcoólica cada meio foi inoculado com Oenococcus oeni e a
fermentação malolática com a cepa na qual o gene da proteinase A foi suprido levou
10 dias a mais que o controle para completar a fermentação malolática, o que pode
ser devido à diferença na composição de nitrogênio dos dois meios, além do que, os
aminoácidos livres e os peptídeos foram menos consumidos por Oenococcus oeni.
Portanto, o aspecto qualitativo da composição de nitrogênio, o qual depende em
27
parte do metabolismo da levedura pode ser um determinante para o crescimento
ótimo de Oenococcus oeni em vinhos (GUILLOUX-BENATIER et al., 2006).
3.4.3 Fermentação malolática
Nos anos 70 e 80 pesquisadores britânicos descobriram a presença de
bactérias ácido-tolerantes, bactérias lácticas e acéticas onde comprovaram que nas
frutas existiam espécies do gênero Oenococcus e Lactobacillus (SALIH et al., 1988).
A fermentação malolática usualmente ocorre em vinhos após a fermentação
alcoólica, sendo desejável por três fatores: diminuição da acidez, melhoramento
geral das características sensoriais e da estabilidade microbiológica. Contudo, não é
favorável para todos os tipos de vinhos, pois em áreas quentes as uvas tendem a
ser menos ácidas e isto somado a diminuição da acidez promovida pela fermentação
malolática pode ser prejudicial às propriedades sensoriais e a estabilidade dos
vinhos (VERSARI; PARPINELLO; CATTANEO, 1999).
Fermentação malolática é um processo microbiológico que permite a
desacidificação da sidra por meio da descarboxilação do ácido L-málico (di-
carboxílico) em ácido L-lático (mono-carboxílico) (LIU, 2002). É catalisada pela
enzima malolática (L-malate: NAD+ carboxilase) na presença de NAD
+
e Mn
2+
e
como um próton é consumido na reação de descarboxilação o pH interno diminui
(VERSARI; PARPINELLO; CATTANEO, 1999).
Segundo Lequéré e Drilleau (1998) em condições francesas a fermentação
malolática (ou maturação) tem duração de 3 a 6 meses, apresenta um consumo
limitado de açúcares (não ultrapassando de 2 a 4 g.L
-1
ao mês) em um meio que
28
contém 30 a 50 g.L
-1
(leveduras eliminadas por filtração), teor alcoólico de 2 a 3%
(v/v), pH relativamente elevado (3,8 a 4,2) e presença de uma microbiota complexa.
A população de bactérias láticas aumenta de 1000 a 10000 vezes do seu
valor inicial (SALIH et al., 1988), sendo que, o início da fermentação malolática pode
ser influenciado pela taxa de inóculo em bactérias láticas. Uma taxa superior a 10
5
ufc.mL
-1
diminui o tempo de carência para o início da biotransformação e impede a
formação da (piqûre láctique) na sidra, com uma alta velocidade de degradação do
ácido málico (SALIH et al., 1987). A fermentação malolática inicia quando a
população de bactérias encontra-se em aproximadamente 10
6
ufc.mL
-1
(VERSARI;
PARPINELLO; CATTANEI, 1999), sendo inibida ou retardada se a bactéria não
alcançar esta população crítica (REMIZE et al., 2006).
Altas concentrações de compostos fenólicos apresentam um efeito
desfavorável ao início do processo, podendo apresentar como conseqüência a
inibição do crescimento de bactérias láticas ou de suas funções enzimáticas. No
entanto, a velocidade de conversão de ácido L-málico é pouco afetada (SALIH et al.,
1987).
A fermentação malolática contribui para o aumento de flavours complexos na
sidra. Atributos sensoriais como corpo são melhorados em vinhos submetidos à
fermentação malolática (CABRANES; BLANCOB; MANGASA, 1998).
Leuconostoc oenos, mais recentemente reclassificado como Oenococcus
oeni, é reconhecida como a bactéria mais tolerante para as condições do vinho
(baixo pH, alto nível de SO
2
e presença de álcool) (VERSARI; PARPINELLO;
CATTANEO, 1999). Além de baixa temperatura e interações antagônicas entre as
leveduras do vinho (Saccharomyces cerevisiae) e as bactérias maloláticas
29
(Oenococcus oeni). Este antagonismo é devido a compostos inibitórios produzidos
pelas leveduras do vinho (BELLMAN; KEEN, 1982).
O pH do vinho é baixo, entre 3,0 e 3,8 e o conteúdo alcoólico é 10% para
climas frios e aumenta para 15% em climas quentes. Vinhos podem conter uma
série de outros inibidores para o crescimento bacteriano como ácidos graxos livres
(ácido decanóico e dodecanóico), alguns ácidos fenólicos e taninos (LONVAUD-
FUNEL, 1999).
O etanol induz mudanças na composição de lipídios das membranas das
bactérias ácido láticas, do mesmo modo, as distribuições de ácidos graxos celulares
variam de acordo com a fase de crescimento, o meio fermentativo, a temperatura e o
pH. A composição de ácidos graxos em cepas de Oenococcus oeni envolve os
ácidos mirístico, palmítico, palminoléico e ácido esteárico (GARBAY; ROZES;
LONVAUD-FUNEL, 1995).
A fermentação malolática permanece até hoje como um processo
imperfeitamente controlado. Fatores nutricionais e fatores físicos químicos afetam o
crescimento e metabolismo das bactérias láticas. A cepa de levedura usada
promove a formação de diferentes aminoácidos, peptídeos e vitaminas disponíveis
como fatores de crescimento para as bactérias láticas. A presença de produtos do
metabolismo da levedura, como ácidos graxos e etanol, atuam como inibidores.
Podem ocorrer interações entre leveduras e bactérias láticas (HERRERO et al.,
1999). Contudo, um melhor conhecimento da fermentação malolática é essencial
para o controle (estímulo ou interrupção) deste importante processo (VERSARI;
PARPINELLO; CATTANEO 1999).
30
3.4.3.1 As bactérias láticas
As bactérias láticas caracterizam-se por apresentar produção de ácido lático.
Este grupo compreende os gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Oenococcus e
Pediococcus. Podem incluir os gêneros Eubacterium e Butyribacterium (LARPENT,
1995). Na sidra são encontradas espécies representativas de Pediococcus sp.,
Leuconostoc mesenteroides, Oenoccocus oeni, Lactobacillus brevis e cepas de
Lactobacillus hetero e homofementativos (DRILLEAU, 1995). Oenococcus oeni é um
coco gram-positivo, heterofermentativo, presente em pares ou cadeias,
caracterizando a bactéria lática responsável pela fermentação malolática, após a
fermentação alcoólica na moderna indústria de vinho de frutas (HERRERO et al.,
1999).
Esta bactéria possui necessidade de fatores complexos para seu
crescimento, como a presença de vitamina B, aminoácidos, peptídeos, bases púricas
e pirimídicas. É capaz de tolerar pHs ácidos (5,0 ou menos) (BELIN, 1995).
Metaboliza muitos constituintes do meio no qual se desenvolve e modifica flavours.
Seus principais metabólitos são: ácido lático, ácido acético, etanol, diacetil e
acetaldeído (DRILLEAU, 1995).
Relativas adaptações dos aminoácidos requeridos dependem da presença
de ácidos orgânicos, tais como ácido L-málico e ácido cítrico, estes ácidos
provavelmente fornecem energia adicional e constituem substratos para a síntese de
aminoácidos (SAGUIR; MANCA DE NADRA, 2002).
As bactérias láticas não podem crescer tendo o ácido L-málico como única
fonte de energia, conseqüentemente estes microrganismos necessitam de uma fonte
adicional de energia, açúcar residual da fermentação como a glicose ou frutose, ou
31
aminoácidos como a arginina, permitindo desta forma o crescimento celular (LIU;
DAVIS; BROOKS, 1995).
Os ácidos orgânicos são metabolizados em uma ordem definida. Primeiro é
metabolizado o piruvato. Os lactobacilos heterofermentativos o transformam em
ácido lático e acético, os homofermentativos o transformam em ácido lático, já os
Oenococcus combinam ambos os efeitos. O diacetil é igualmente produzido a partir
do ácido málico ou cítrico e a partir de açúcares. Determinadas cepas láticas
proporcionam a presença de quantidades expressivas de ácido succínico, um
componente prejudicial ao flavour da sidra devido ao sabor que apresenta
(DRILLEAU, 1995). O ácido málico e ácido cítrico podem ser metabolizados com a
formação de ácido acético. O ácido quínico e seus ésteres, os ácidos clorogênico e
paracumárico, são degradados por uma série de reações de óxido-redução, em
condições de anaerobiose (DRILLEAU, 1995).
Saguir e Manca de Nadra (2002) avaliaram o crescimento de culturas de
bactérias (Oenococcus oeni) em meio sintético com condições nutricionais
deficientes e na presença dos ácidos málico e cítrico. A taxa de crescimento de
bactérias foi reduzida ou anulada quando um aminoácido era omitido do meio,
especialmente para membros da família aspartato, exceto lisina. No entanto, os
ácidos orgânicos aumentavam ou restauravam as taxas de crescimento para os
respectivos valores de referência. Em cada meio deficiente de um aminoácido
essencial, a utilização do ácido L-málico foi acompanhada de um aumento da
concentração do ácido L-lático, quase 100% do ácido málico foi consumido. A
produção de etanol e acetato não foi modificada.
Carr et al. (1956) verificaram que durante o crescimento das células o ácido
quínico é totalmente metabolizado e aparece no meio o ácido dihidroxiquínico.
32
A influência da fermentação malolática, nas propriedades químicas e
sensoriais, ainda não foi completamente elucidada (POZO-BAYÓN et al., 2005).
A. Fermentação homofermentativa
No metabolismo homofermentativo o produto final formado é o ácido lático
(Figura 1). Por esta via são liberadas duas moléculas de ATP por mol de glicose
(LARPENT, 1995).
Glicose
Ácido lático
Dihidroxi-acetona-fosfatoGliceraldeído 3-fosfato
Glicose -6-fosfato
Frutose-6-fosfato
Frutose-1,6-difosfato
ATP
ADP
ATP
ADP
Ácido 1,3 difosfoglicérico
Ácido 3 fosfoglicérico
Ácido fosfoenolpirúvico
Ácido pirúvico
2 NADP
2 NAD
+
2ADP
2ATP
2ADP
2ATP
2H
2
O
2 NAD
+
2 NADH
2 P
Glicose
Ácido lático
Dihidroxi-acetona-fosfatoGliceraldeído 3-fosfato
Glicose -6-fosfato
Frutose-6-fosfato
Frutose-1,6-difosfato
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
Ácido 1,3 difosfoglicérico
Ácido 3 fosfoglicérico
Ácido fosfoenolpirúvico
Ácido pirúvico
2 NADP
2 NAD
+
2 NADP
2 NAD
+
2ADP
2ATP
2ADP
2ATP
2ADP
2ATP
2ADP
2ATP
2H
2
O
2 NAD
+
2 NADH
2 P
FIGURA 1. Via metabólica de bactérias láticas homofermentativa
(DRILLEAU, 1995).
33
B. Fermentação heterofermentativa
Na fermentação heterofermentativa, além do ácido lático são formados
etanol, acetatos e gás carbônico (CO
2
) (Figura 2). As bactérias heterofermentativas
não possuem frutose-difosfato-aldolase e degradam a glicose pela via pentose
fosfato e hexose fosfato, promovendo a liberação de uma molécula de ATP por mol
de glicose. As bactérias do gênero Oenococcus são exemplos heterofermentativos
(LARPENT, 1995).
Entre os açúcares, a frutose é fermentada pelas bactérias
heterofementativas produzindo hexitol, manitol, acompanhado da produção de
lactato, acetona e água (DRILLEAU, 1995).
Glicose
Ácido lático
Ribulosa-5-fosfato
Gás carbônico
Glicose -6-fosfato
Ácido-6- fosfoglucônico
ATP
ADP
Ácido 1,3 difosfoglicérico
Ácido 3 fosfoglicérico
Ácido fosfoenolpirúvico
Ácido pirúvico
NADH
NAD
+
ADP
ATP
ADP
ATP
2H
2
O
2 NAD
+
2 NADH
P
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
Acetil fosfato
Acetaldeído
Etanol
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
P
P
Gliceraldeído-3-fosfato
Glicose
Ácido lático
Ribulosa-5-fosfato
Gás carbônico
Glicose -6-fosfato
Ácido-6- fosfoglucônico
ATP
ADP
ATP
ADP
Ácido 1,3 difosfoglicérico
Ácido 3 fosfoglicérico
Ácido fosfoenolpirúvico
Ácido pirúvico
NADH
NAD
+
NADH
NAD
+
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
2H
2
O
2 NAD
+
2 NADH
2 NAD
+
2 NADH
P
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
Acetil fosfato
Acetaldeído
Etanol
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
NAD
+
NADH
P
P
Gliceraldeído-3-fosfato
FIGURA 2. Via metabólica de bactérias láticas heterofermentativa
(DRILLEAU, 1995).
34
3.4.3.2 Fermentação malolática natural
Bactérias láticas como Pediococcus sp., Leuconostoc mesenteroides,
Oenococcus oeni, Lactobacillus brevis, cepas de Lactobacillus homo e
heterofermentativo estão presentes na flora lática da sidra. A população destas
bactérias varia e depende das condições de trabalho. A população natural presente
no mosto em torno de 10
4
ufc.mL
-1
pode chegar a uma população em torno de 10
7
ufc.mL
-1
ao final da fermentação malolática em condições francesas (em torno de
100 dias), sendo que, ao final da fermentação apenas Oenococcus oeni está
presente. A microbiota lática pode ser controlada utilizando anidrido sulfuroso
(DRILLEAU, 1995).
3.4.3.3 Fermentação malolática por inóculo
O uso de culturas iniciais na fermentação da sidra, tanto leveduras quanto
bactérias, permite manter um produto final uniforme. Várias culturas liofilizadas para
bioconversão malolática estão disponíveis no mercado, selecionadas apenas para
fermentação de vinho. Segundo Herrero et al. (1999) estudos demonstraram que
bactérias maloláticas naturais são mais adaptadas ao mosto e resultam em maior
degradação do ácido málico.
As bactérias maloláticas podem ser inoculadas simultaneamente com o
inóculo da levedura ou no término da fermentação alcoólica. No primeiro caso ocorre
vantagem no desenvolvimento bacteriano devido ao baixo nível de etanol e alto nível
de açúcares, mas pode ocorrer uma demora no crescimento bacteriano e
degradação do ácido málico. Já no segundo caso, a presença de nutrientes
35
essenciais resultantes da excreção e autólises de leveduras está disponível para
serem utilizados pelas bactérias (HERRERO et al., 1999).
A indução da fermentação malolática por inoculação de uma cepa comercial
de Oenococcus oeni não é sempre bem sucedida. Induzir a fermentação malolática
em vinhos é difícil porque o vinho apresenta um ambiente muito desfavorável, a
seleção de cepas para a inoculação em vinhos é conduzida por testes clássicos
baseados essencialmente na composição de ácido L-málico (HENICK-KLING;
SANDINE; HEATHERBELL, 1989).
3.4.3.4 Condições do meio
As propriedades físico-químicas como pH, acidez, concentração de etanol,
concentração de sulfito e temperatura, influenciam o crescimento microbiano
(VERSARI; PARPINELLO; CATTANEO 1999).
A. Temperatura
As fermentações, alcoólica e malolática, podem acontecer à temperatura
ambiente ou a frio (DRILLEAU, 1995).
A temperatura influencia a atividade das leveduras e o seu aumento afeta a
velocidade da fermentação. Entre 15 e 35ºC a duração da fase latente é curta e o
consumo de nitrogênio pelas leveduras aumenta (D’AMATO et al., 2006).
Em baixas temperaturas (7 a 15ºC) as fermentações são mais longas. O
metabolismo das leveduras freqüentemente depende de uma absorção de nutrientes
36
conduzido por permeases. Essas enzimas são altamente dependentes de
temperatura e mudanças podem causar alterações conformacionais na sua estrutura
(BELTRAN et al., 2007).
A fermentação malolática apresenta sua atividade máxima entre 20°C e
25°C. Em temperaturas superiores a 30°C e inferiores a 15°C a fermentação pode
parar, mas reinicia quando a temperatura é aumentada. Portanto, a fermentação
malolática deve ser conduzida à temperatura média máxima de 18°C, para evitar
que as bactérias láticas ataquem outros compostos distintos do ácido málico e
aumentem desta forma a acidez volátil (MESAS, ALEGRE, 1999).
Faia (1999) avaliou o efeito da temperatura (18, 25 e 35ºC) no crescimento
e metabolismo dos ácidos, durante a produção de vinho Cabernet Souvignon. Na
menor temperatura de incubação avaliada (18ºC), as taxas específicas de
crescimento e a produção de biomassa foram menores. A velocidade de
descarboxilação do ácido málico foi maior a 25ºC do que a 32ºC e 18ºC; o ácido
málico foi completamente metabolizado ao fim de 96, 192 e 264 horas,
respectivamente. Nesta pesquisa verificou-se que com a maior temperatura de
incubação avaliada (32ºC), maior foi a degradação de frutose e conseqüentemente,
maior a concentração final de manitol, exceto quando se adicionou citrato.
B. pH
O pH tem um efeito importante no crescimento das bactérias ácido láticas. A
acidificação do meio durante o crescimento produz uma queda do pH, a qual
finalmente inibe o seu crescimento (CHAMPAGNE; GARDNER, 2002).
Herrero; Garcia e Díaz (2003) determinaram a alteração do pH em culturas
de bactérias maloláticas usando suco de maçã reconstituído e suco de maçã
37
suplementado com YE comercial (0,5%, Biokar, France) e extrato de células
liofilizadas (0,5 a 1%). Determinaram que o pH aumenta até 48 horas e esta fase
corresponde ao consumo de ácido málico e a produção de ácido lático. A partir de
48 horas os valores de pH do meio diminuem com a extensão do crescimento das
bactérias maloláticas. A velocidade de degradação do ácido málico pela
Oenococcus oeni é máxima em pH menor que 4,5. No entanto, o catabolismo de
glicose e frutose são inibidos nesta faixa de pH, sendo o pH ótimo para catabolismo
dos açúcares e crescimentos bacteriano observado a 5.5.
C. Metabissulfito
Na elaboração da sidra brasileira o dióxido de enxofre é indispensável face
às temperaturas durante o processamento, próximas de 25°C, o que facilita a
proliferação de microrganismos contaminantes (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005). O
metabissulfito de potássio é adicionado no fermentado ao final da maturação como
agente de conservação a uma concentração correspondente de 30 a 50 mg.L
-1
de
dióxido de enxofre livre (WOSIACKI; CHERUBIM; SANTOS, 1997).
As bactérias maloláticas podem ser controladas pelo anidrido sulfuroso e a
resistência destes microrganismos ao anti-séptico depende da concentração do
anidrido sulfuroso livre e varia segundo o pH do mosto (NOGUEIRA; WOSIACKI,
2005).
Liu e Gallander (1983) avaliaram as velocidades da fermentação malolática
em três amostras de vinho com o pH ajustado a 3,3; 3,5 e 3,7. As amostras para
cada pH foram tratadas com 25, 50 e 75 mg.L
-1
de dióxido de enxofre,
respectivamente. Inocularam em seguida Saccharomyces cerevisiae e quando o
38
fermentado apresentou 5° Brix inocularam Oenococcus oeni. Os autores verificaram
que para os níveis de dióxido de enxofre utilizados, as taxas de fermentação
malolática eram quase as mesmas, em valores de pH de 3.5 e 3.7, mas a
fermentação foi muito mais lenta em pH 3.3. Para cada valor de pH, a fermentação
malolática foi mais rápida frente a níveis mais baixos de dióxido de enxofre. Depois
da inoculação a população bacteriana diminuiu e a menor contagem bacteriana foi
observada na presença do menor valor de pH e na presença de alta concentração
de SO
2
.
D. Compostos nitrogenados
O nitrogênio aminado livre no mosto representa aproximadamente 50% do
nitrogênio total da maçã, mesmo após um período de maturação. Entre os
aminoácidos apenas aspargina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico e serina
representam 86 a 95% dos aminoácidos totais do mosto. Estes aminoácidos são os
primeiros a serem utilizados pelas leveduras (DRILLEAU, 1995).
A quantidade de nitrogênio nos mostos de maçãs pode ser muito baixa (<50
mg.L
-1
) ou excessiva (>150 mg.L
-1
), em função principalmente da idade dos pomares
e das adubações, respectivamente, o que torna os compostos nitrogenados ora
limitantes do crescimento das leveduras, causando lentidão e/ou paradas de
fermentação, ora causadores de instabilidades microbiológicas, como explosões de
garrafas no caso da sidra gaseificada naturalmente (NOGUEIRA; WOSIACKI, 2005).
Na fermentação, os compostos nitrogenados são utilizados pela
Saccharomyces sp. durante a fase de crescimento, exercendo importantes funções
na biossíntese de proteínas e nas funções enzimáticas. Estes compostos
influenciam o crescimento e o metabolismo das leveduras, chegando a constituir
39
10% da sua matéria seca. Fatores como composição do mosto e o tipo de cepa de
levedura podem afetar a sua assimilação (JULIEN et al., 2000). O metabolismo das
leveduras pode conduzir a eficiência da fermentação alcoólica e afetar a qualidade
do produto final (SALMON; BARRE, 1998).
O consumo de aminoácidos pelas leveduras deixa o meio menos favorável
para o desenvolvimento de bactérias nas primeiras semanas de fermentação.
Posteriormente as leveduras secretam aminoácidos (ácido glutâmico e valina),
essenciais para o desenvolvimento das bactérias láticas. Portanto a composição dos
aminoácidos no mosto é modificada qualitativamente (DRILLEAU, 1995). Durante a
autólise a concentração de aminoácidos e peptídeos aumentam até valores máximos
de 20 e 40 mg.L
-1
, respectivamente (ALEXANDRE et al., 2001).
Remize et al. (2006) verificaram que Oenococcus Oeni consumiu um nível
significante de nitrogênio somente em meio contendo aminoácidos livres. A
concentração de nitrogênio do meio, ao redor de 5 mg.L
-1
, foi suficiente para
assegurar a formação de biomassa e o crescimento bacteriano foi maior na
presença de nitrogênio de peptídios na forma de aminoácidos livres.
3.4.3.5 Efeito na qualidade da sidra
A produção de vinhos com qualidade depende da qualidade das uvas, dos
microrganismos envolvidos na fermentação e do processamento na fabricação do
vinho. A redução da acidez em mosto de uvas com alto teor de acidez é essencial
para a produção de vinhos bem equilibrados (BEELMAN; GALLANDER, 1979).
Na fabricação da sidra, maçãs ácidas ajudam a evitar contaminações
bacterianas e participam significativamente no corpo da bebida. Porém é necessária
40
a fermentação malolática para melhorar o sabor e a qualidade sensorial da sidra,
além, de estabilizar microbiologicamente o produto pelo consumo de nutrientes
residuais de carbono (LIU, 2002).
A. Acidez
A acidez do mosto e do vinho pode ser avaliada através do pH, o qual
representa a concentração de hidrogênio iônico do vinho. A acidez titulável e a
determinação da concentração dos ácidos orgânicos são outras duas maneiras. O
pH do vinho depende do tipo e da concentração dos ácidos orgânicos e da
concentração de cátions, especialmente do potássio. Os fatores relacionados à
acidez do vinho têm participação importante nas características sensoriais, na
estabilidade físico-química e biológica do vinho. A acidez do vinho está diretamente
relacionada à composição do mosto, especialmente à sua concentração de potássio
e à predominância do ácido tartárico em relação ao málico (RIZZON; MIELE, 2002).
Há vários métodos para diminuir a acidez do vinho, mas a desacidificação
biológica é a mais usada. A desacidificação biológica pode ser feita através da
fermentação malolática ou fermentação maloetanólica, sendo esta última
desenvolvida geralmente pelas espécies de leveduras Schizosaccharomyces pombe
e Saccharomyces que convertem o ácido málico a piruvato por meio de uma enzima
málica intracelular (REDZEPOVIC et al., 2003).
Uma importante via de acidificação biológica é a seleção e utilização de
leveduras produtoras de ácidos orgânicos, durante a fermentação alcoólica, as quais
pertencem ao gênero Saccharomyces. A hipótese mais difundida postula a formação
por fixação de CO
2
sobre o piruvato, produto final da glicólise, para formar
oxaloacetato que é reduzido a ácido málico (YERAMIAN et al., 2005).
41
A fermentação malolática produz na sidra uma diminuição da acidez, pela
conversão do ácido málico (monoácido) em ácido lático (diácido). Esta diminuição da
acidez causa alterações nas propriedades sensoriais do vinho, tanto na cor quanto
no sabor e aroma (MESAS; ALEGRE, 1999).
A fermentação malolática no vinho produz alterações como o aumento da
acidez volátil, a qual se deve basicamente à transformação do ácido cítrico em ácido
acético pelas mesmas bactérias láticas (MESAS; ALEGRE, 1999).
Outros métodos usados pela indústria para reduzir a acidez de vinhos ou
mosto de uvas incluem mistura, adição de carbonato, precipitação, maceração
carbônica e diluição (HUSNIK et al., 2006).
B. Aromas
Inicialmente a sidra resultava de uma fermentação lenta, estabilizada pela
carência de nutrientes (vitaminas e nitrogênio). Era obtida através de uma
clarificação prévia a fermentação, sendo a fermentação lenta responsável pelo
flavour frutado e aromático da sidra (DRILLEAU, 1995).
Como resultado do metabolismo fermentativo das leveduras, compostos
sensoriais são formados. Estes têm um efeito na qualidade do produto, tal como a
concentração de etanol, ésteres e outros voláteis. O aroma da sidra é desenvolvido
não somente por leveduras do gênero Saccharomyces, mas por leveduras
apiculadas. Leveduras selvagens como Hanseniaspora uvarum e Kloechera
apiculata são potentes produtoras de ésteres (CABRANES; BLANCOB; MANGASA,
1998).
Na fermentação malolática a Oenococcus influencia as características
aromáticas no produto final ou modificando os aromas da fruta, ou produzindo novos
42
compostos de aroma. Em específico, a Oenococcus metaboliza ácido L-málico em
ácido cítrico (Figura 3) determinando a formação de acetoína e diacetil (NIELSEN;
RICHELIEU, 1999).
Ácido málico
2,3 butanodiol
Diacetil
Ácido cítrico
Ácido oxalacético
Ácido pirúvico
Ácido α-acetolático
Acetoina
Ácido acético
CO
2
CO
2
CO
2
Ácido málico
2,3 butanodiol
Diacetil
Ácido cítrico
Ácido oxalacético
Ácido pirúvico
Ácido α-acetolático
Acetoina
Ácido acético
CO
2
CO
2
CO
2
FIGURA 3. Metabolismo do ácido cítrico pela bactéria Oenococcus oeni
(NIELSEN; RICHELIEU, 1999).
O ácido acetolático é um composto instável que, além da descarboxilação
enzimática, pode ser originado por descarboxilação espontânea, formando a
acetoína e em condições de oxidação, o diacetil. O diacetil é então reduzido pela
Oenococcus oeni a acetoína e a 2,3-butanodiol, que em concentrações normais (1,3
g.L
-1
) não apresentam influência sobre o aroma na maioria dos vinhos (NIELSEN;
RICHELIEU, 1999).
O acetaldeído no vinho é formado por leveduras, bactérias acéticas e por
auto-oxidação do etanol e compostos fenólicos. Pode-se ligar ao dióxido de enxofre
43
diminuindo assim a atividade antimicrobiana e o efeito antioxidante do mesmo. O
crescimento microbiano pode ser estimulado ou inibido, dependendo da
concentração do acetaldeído, o que tem implicações diretas nas fermentações
alcoólica e malolática. Por outro lado, o catabolismo do acetaldeído pode gerar
compostos de flavours que influenciam as propriedades sensoriais do vinho (LIU;
PILONE, 2000).
Diferentes estudos têm focado a biossíntese de compostos de aroma
durante a fementação malolática e a concomitante conseqüência sensorial. Maicas
et al. (1999) demonstrou que a fermentação malolática favorece a formação de
compostos voláteis que são benéficos ao flavour do vinho. Em contraste, Sauvageot
e Vivier (1997) conduziram análise sensorial em vinhos Chardonnay e Pinot Noir
com e sem fermentação malolática e concluíram que os provadores não perceberam
diferenças sensoriais entre os dois tipos de vinhos. Em outro estudo, conduzido por
Sauvageot e Vivier (1997) a influência da cepa da bactéria ácido lática usada para a
fermentação malolática não apresentou interferência na composição e complexidade
dos aromas do vinho.
3.4.4 Operações pós-fermentação
Os produtores de sidra fazem misturas dos fermentados para obter o
equilíbrio gustativo e o teor de açúcares residuais. A fermentação é interrompida por
vários tipos de filtração: sobre placas, com diatomáceas e em módulos de
membranas para filtração tangencial, ambos têm a finalidade de eliminar as
leveduras e as bactérias. A densidade na qual se efetua a filtração depende da
44
categoria da sidra desejada, que pode ser seca, semi-seca ou doce (NOGUEIRA;
WOSIACKI, 2005).
Existem na literatura muitos estudos sobre o processamento do vinho e os
fatores que afetam a qualidade. Do mesmo modo o processamento da sidra
francesa já foi muito estudado e o comportamento dos microrganismos responsáveis
pela transformação do mosto de maçã em sidra elucidado, no entanto, não está
disponível na literatura dados sobre o comportamento dos microrganismos
responsáveis pela fermentação do mosto de maçã nas condições brasileiras, que
diferem significativamente da européia, o que afeta de maneira direta os
processamentos industriais, resultando em um produto nacional atualmente de baixa
qualidade.
45
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Microorganismos
A levedura fermentativa utilizada foi a Saccharomyces cerevisiae (FERMOL
AROMÊ PLUS, da Pascal Biotech, Paris).
A bactéria lática utilizada foi a Oenococcus oeni (ENOLAT DIR*01, Vêneto
Mercantil), resistente ao sulfito, comercializada. Ambas foram utilizadas na forma
seca ativa e conservadas à 7ºC até utilização nesta pesquisa.
4.1.2 Frutas
Amostras de maçãs (Malus domestica) das cultivares Gala e Fuji,
2006/2007, fornecidas pela Empresa Agropecuária Boutin Ltda, localizada em Porto
Amazonas, Paraná e adquiridas no comércio local, da cidade de Ponta Grossa. A
cultivar Fuji somente foi utilizada no experimento de fermentação do mosto
pasteurizado com inóculo de Oenococcus oeni (item 4.2.5.6). Nos demais
experimentos utilizou-se a cultivar Gala.
46
4.2 Métodos
4.2.1 Processo
4.2.1.1 Mosto de maçãs
As maçãs devidamente classificadas em comerciais e industriais, foram
pesadas em balança analítica (Gehaka) e em seguida fragmentadas em processador
com facas (Processador Metvisa, tipo MPA) sendo, as massas raladas, transferidas
para telas plásticas, superpostas, que foram submetidas a duas prensagens (Prensa
hidráulica Eureka, Hoppe Ind. Ltda, Brasil). Sob pressão de 1,0 kgf.cm
-2
por 2
minutos e seguida de 4,0 kgf.cm
-2
por 5 minutos. O volume do suco bruto foi usado
para o cálculo do rendimento e elaboração dos experimentos. O suco foi
despectinizado com enzima Pectinex-Batch 1201371L à concentração 3,0 mL.hL
-1
,
em temperatura ambiente (23±3ºC) durante 4 horas. Em seguida, o suco foi
trasfegado, filtrado em papel filtro qualitativo e distribuído nos fermentadores.
4.2.1.2 Processamento do fermentado de maçã
As microfermentações foram realizadas em frascos de Erlenmeyer de 2000,
500 e 200 mL, lavados com água destilada e em seguida com etanol (99%). Estes
erlenmeyers foram munidos de batoques e o volume útil utilizado foi de 1800, 450 e
150 mL, respectivamente, que corresponde entre 75 a 90% do volume total. Os
sucos de maçãs clarificados adicionados foram mantidos em anaerobiose. Para
47
simulação de anaerobiose utilizou-se rolha de silicone na qual foi acoplada uma
agulha conectada a uma mangueira de látex, que permitiu a liberação do gás
carbônico (CO
2
). A extremidade da mangueira de látex foi colocada dentro de um
recipiente plástico contendo água destiladas com 200 mg.L
-1
de metabissulfito de
potássio (Labsynth). Os números nos ensaios designados como P
0
, P
3
, P
10
, P
20
, P
30
,
P
35
e P
45
correspondema ao tempo em dias da fermentação.
A maioria dos experimentos foi realizada num total de 45 dias de
fermentação, com exceção, aos experimentos com suco de maçã pasteurizado com
inóculo da Oenococcus Oeni. Neste último, para verificar a capacidade de
crescimento da bactéria utilizou-se um período de 1 a 3 dias, para verificar a
capacidade de fermentação, 20 dias e para verificar a resistência ao sulfito, 5 a 25
dias.
4.2.2 Análises microbiológicas
4.2.2.1 Leveduras totais em placa
A determinação de leveduras fermentativas totais foi feita pela contagem de
colônias em meio seletivo preparado com 39 g de meio BDA (Batata Dextrose Agar,
Difco, 213400) diluído em 1000 mL de água destilada e aquecido em forno
microondas para dissolução. As esterilizações do meio e da vidraria foram feitas em
autoclave vertical (AV 13811, Phoenix) por 15 minutos (121°C a 1,01 Kgf.cm
-2
). Após
a esterilização do meio foi adicionado o ácido tartárico (ACS-189, Ecibra), diluídos
1:10 (v/v), na concentração de 1,8%. Desse meio, 10 mL foram transferidos para
placas de 90mm de diâmetro descartáveis (J. Prolab) e após solidificação, 100µL de
48
amostra foram inoculados na placa com o auxílio de um alça de Drigalski. Após
incubação em estufa a 28ºC durante 48 horas as colônias foram contadas
manualmente e o resultado expresso em ufc.mL
-1
(NOGUEIRA, 2003).
4.2.2.2 Leveduras oxidativas
A determinação de leveduras apiculadas foi feita em meio seletivo
preparado em duas etapas, na primeira, 11,75 g de extrato de levedura (Biobrás,
cód. 155-1) foram diluídos em 500 mL de água destilada, posteriormente esterilizado
em autoclave (AV 13811, Phoenix) por 15 minutos (121°C a 1,01 Kgf.cm
-2
). Na
segunda etapa, o meio foi preparado com 2,3 g de lisina, 20 g de ágar-ágar (Rea-
Tech), diluídos em 500 mL de água destilada, aquecidos até completa dissolução em
forno microondas e esterilizado em autoclave. Após esterilização as duas etapas
foram misturadas e 10 mL introduzidos em placas de 90mm de diâmetro
descartáveis (J. Prolab). Após a solidificação do meio, 100µL de amostra foram
inoculados em placas com o auxilio de um alça de Drigalski. Após incubação em
estufa a 28ºC durante 72 horas as colônias foram contadas manualmente e o
resultado expresso em ufc.mL
-1
(NOGUEIRA, 2003).
4.2.2.3 Bactérias láticas
A determinação de bactérias láticas foi feita em meio seletivo, utilizando 50g
de MRS (Lactobacilli MRS, Broth), diluído em 950 mL de água destilada, o pH foi
ajustado a 4,8 com ácido fosfórico (Biotec) concentrado. Em seguida, foram
adicionados 20 g de agar-agar (Rea-Tech) e o volume foi completado com água
49
bidestilada até 1000 mL. O meio foi aquecido até completa dissolução em forno
microondas. A esterilização foi realizada em autoclave (AV 13811, Phoenix) por 15
minutos (121°C a 1,01 Kgf.cm
-2
). Foi preparada uma solução de antibióticos
utilizando 20 mg de Actidione (Cycloheximide Sigma C1988-5G) e 5,0 mg de oxine
(8-quinolinol Sigma H6878-25G) em 10,0 mL de água bidestilada e esterilizada por
filtração em membrana estéril de 0,45 mícrons. Para a análise, foram introduzidos na
placa 1,0 mL da amostra, 0,5 mL da solução de antibiótico e 10,0 mL do meio de
cultura com a forma de cultivo Pour Plate. As placas foram dispostas em jarras de
anaerobiose (Permution) com pastilhas de consumo de oxigênio por reação de
oxidação do ferro em meio ácido (Anaerobac, da Probac do Brasil Produtos
Bacteriológicos Ltda). Após a incubação por 8 dias a 28°C as colônias foram
contadas manualmente e o resultado expresso em ufc.mL
-1
(NOGUEIRA, 2003).
4.2.3 Análises físico-químicas
4.2.3.1 Açúcares
Açúcares redutores (AR) foram analisados pelo método colorimétrico de
Somogyi-Nelson, assim como os açúcares redutores totais (ART) após a hidrólise
da sacarose com HCl 1N (50ºC/5 min.). A glucose (GLC) foi quantificada pelo
método enzimático da glucose oxidase (Glicose pp, 434E, Analisa), sendo que a
sacarose (SAC) foi determinada pela diferença entre os açúcares redutores totais e
solúveis e a frutose (FRU) pela diferença entre os açúcares redutores solúveis e a
glucose. Todos os carboidratos foram expressos como monossacarídeos em g.L
-1
50
(IAL, 1976) (TANNER; BRUNNER, 1985). Os resultados das análises de glucose e
frutose foram confirmados por Kit enzimático (cód. 0139106, Roche).
4.2.3.2 Acidez titulável
A acidez titulável total foi determinada por neutralização com NaOH 0,1 N
até pH 8,3 com fenolftaleína, sendo expresso em g.L
-1
(IAL, 1976).
4.2.3.3 Acidez volátil
Na determinação da acidez volátil 10,0 mL da amostra foram transferidos
para o aparelho de Casenave-Ferré acoplado a um frasco Erlenmeyer de 500 mL.
Em seguida foram adicionados 200 mL de água destilada. O Erlenmeyer foi
acoplado a um refrigerador de Liebig e aquecido em bico de Bünsen com chama
baixa até destilar o volume de 100 mL, o destilado foi transferido para um
Erlenmeyer de 250 mL, contendo 20 mL de água destilada. Em seguida 2,0 mL de
indicador de Fenolftaleína foram adicionados para a titulação com solução de
hidróxido de sódio (0,1N) até coloração rósea (IAL, 1976).
4.2.3.4 Ácidos orgânicos
Foram determinados os ácidos L-málico, D-lático e L-lático por Kits
enzimáticos (L-Malic acid, cód. 10139068035 e D-Lactic, L-lactic, cód. 11112821035,
Roche) de acordo com Herrero et al,. (1999).
51
4.2.3.5 pH
Foi determinado por imersão direta na amostra utilizando um Phmetro digital
(pH digital microprocessado Tecnal, modelo TEC3-MP) (IAL, 1976).
4.2.3.6 Nitrogênio
O nitrogênio total foi quantificado por neutralização com HCl 0,02N, com
solução de ácido bórico (2% e indicadores), após ter sido destilado em destilador de
nitrogênio com NaOH 50%, sendo expresso em mg.L
-1
(BARON; BOHUON;
DRILLEAU, 1977).
4.2.3.7 Dióxido de enxofre total
Foram transferidos 50 mL da amostra em Erlenmeyer de 250 mL, com
tampa esmirilhada. Adicionou-se 25 mL da solução de hidróxido de potássio 0,02N.
O Erlenmeyer foi fechado, agitado e deixado repousar por 15 minutos. Foi
adicionado 15 mL de ácido sulfúrico a 20% (Biotec) e de solução de amido a 1%.
Titulou-se com iodo e o resultado foi expresso em mg.L
-1
(IAL, 1976).
4.2.3.8 Álcool
A determinação da concentração de etanol (% de etanol em volume, à
20°C) no fermentado foi feita utilizando-se o equipamento ebuliômetro (Ebuliômetro
52
3300, Metalúrgica Leonardo). O ebuliômetro é composto de uma caldeira, onde fica
a amostra a ser analisada, um condensador que é acoplado à caldeira onde são
condensados vapores provenientes do líquido contido na caldeira e uma lamparina
que fornece aquecimento à caldeira do ebuliômetro. Foram transferidos 50 mL da
amostra para a caldeira do ebuliômetro e, logo após, o condensador foi preenchido
com água fria e a lamparina acesa. Com um termômetro acoplado à caldeira, pôde-
se medir a temperatura de ebulição da amostra, aguardando-se que a temperatura
se estabilizasse, por um tempo de aproximadamente 5 minutos. Com o auxílio de
uma régua graduada é feita a conversão da temperatura de ebulição para a
concentração de etanol. O resultado é expresso em % (v/v).
4.2.4 Cinéticas de fermentação
A cinética de fermentação foi avaliada pela perda de peso dos
fermentadores (Figura 4) causada pela liberação de gás carbônico (BELY;
SABLAYROLLES; BARRE, 1990, NOGUEIRA et al., 2007). As pesagens foram
feitas a cada duas horas, no período diurno, em balança analítica (Gehaka) com
sensibilidade de 0,001 g durante 45 dias (tempo de fermentação), em temperatura
ambiente (22 a 30ºC).
53
perda de CO
2
Batoque
Agulha
Fermentador
Head space
Solução de
SO
2
0.001 g
Controle de peso do
fermentador
Balança
Rolha
Açúcar
Etanol
CO
2
FIGURA 4. Esquema de um fermentador e da determinação de perda de
gás carbônico para obtenção da cinética da fermentação (NOGUEIRA et al.,
2007).
Após as pesagens foi feita uma curva de tendência ou regressão de ordem 4
como R
2
e utilizada para corrigir os pontos de perda de peso. Após esta correção, foi
calculada a derivada da perda de peso em função do tempo que consiste na
velocidade de fermentação.
4.2.5 Experimentos
4.2.5.1 Microbiota natural de mostos de maçãs
Os microrganismos naturais de interesse neste trabalho foram os
microrganismos responsáveis pela [1] fermentação alcoólica, os [2] potenciais
produtores de aromas frutados e as [3] bactérias da bioconversão malolática. Para
avaliar a quantidade de microrganismos provenientes das frutas, as maçãs foram
classificadas em função das características morfológicas e fitossanitárias. As frutas
54
foram trituradas e prensadas segundo o método descrito anteriormente no item
4.2.1.1, retirada uma amostra do mosto para análise quantitativa de leveduras
fermentativas totais, leveduras apiculadas totais e bactérias láticas totais (Figura 5).
Maçãs
Suco bruto
• Seleção
•Limpeza
•Trituração
•Prensagem
• contagem de colônias
Maçãs
Suco bruto
• Seleção
•Limpeza
•Trituração
•Prensagem
• contagem de colônias
FIGURA 5. Fluxograma representativo do experimento da microbiota natural
de mostos de maçãs.
4.2.5.2 Monitoramento da microbiota em fermentações naturais
O suco despectinizado foi distribuído em 6 fermentadores: P
0
, P
3
, P
10
, P
20
,
P
30
e P
45
, e estes foram colocados em anaerobiose como descrito no item 4.2.1.2. A
fermentação ocorreu com a microbiota natural (Figura 6). O experimento foi
realizado em duplicata. A microbiota natural foi monitorada pela contagem de
leveduras totais, oxidativas e de bactérias láticas em meios seletivos em placas de
Petri descartáveis (J. Prolab).
55
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
• Seleção
•Limpeza
•Trituração
• Prensagem
• Despectinização
•Trasfega
• Fermentação natural
• Maturação natural (30 dias)
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
• Seleção
•Limpeza
•Trituração
• Prensagem
• Despectinização
•Trasfega
• Fermentação natural
• Maturação natural (30 dias)
FIGURA 6. Fluxograma representativo do experimento de monitoramento da
microbiota em fermentações naturais.
4.2.5.3 Efeito do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais
Para avaliar o crescimento das bactérias láticas em fermentações com
inóculo de Saccharomyces cerevisiae, o suco despectinizado foi distribuído em 6
fermentadores com volume útil de 450 mL: P
0
, P
3
, P
10
, P
20
, P
30
e P
45
. Em cada
fermentador foram introduzidos 135 mg da levedura, que corresponde ao inóculo de
aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-1
(Figura 7). O experimento foi realizado em
duplicata.
56
FIGURA 7. Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais.
4.2.5.4 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e redução de biomassa
Para avaliar a microbiota com a redução de biomassa foi introduzido um
inóculo de 675 mg de Saccharomyces cerevisiae em 2250 mL de suco de maçã
despectinizado, que corresponde ao inóculo de aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-1
. Este foi fermentado por 12 horas, centrifugado por 20 min a 1500 rpm,
com o objetivo de retirar parte da biomassa de S. cerevisiae. O sobrenadante foi
retirado e distribuído em 6 fermentadores: P
0
, P
3
, P
10
, P
20
, P
30
e P
45
(Figura 8). Para
controle, foi realizado o experimento como descrito no item anterior (4.2.2.3).
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Fermentação com S. cerevisiae
•
Maturação natural (30 dias)
57
FIGURA 8. Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do inóculo de levedura e redução de biomassa.
4.2.5.5 Crescimento da Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado
Para avaliar o crescimento da cepa comercial Oenococcus oeni, o suco de
maçã foi processado, acondicionado em garrafas hermeticamente fechadas e
pasteurizado (80ºC/25 minutos). A fim de verificar o seu crescimento, o suco foi
diluído 1:1 (v/v) com água destilada e autoclavado em autoclave vertical (AV 13811,
Phoenix) por 15 min (121ºC a 1,01 Kgf.cm
-2
) e foi distribuído em 4 fermentadores
com volume útil de 450 mL cada: P
1A
, P
1B,
P
2B
e P
3B
(os números correspondem aos
dias de fermentação). Em seguida, ao fermentador “A” foram adicionados 10 mg da
bactéria lática Oenococcus oeni e aos fermentadores “B” (P
1B,
P
2B
e P
3B
) 50 mg, que
corresponde a população de aproximadamente 1,00x10
6
e 5,00x10
6
células.mL
-1
,
respectivamente (Figura 9).
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Fermentação com S. cerevisiae
•
Redução de biomasa
•
Maturação com natural
58
FIGURA 9. Fluxograma representativo do experimento para avaliar o
crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado.
4.2.5.6 Fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado
Ao suco de maçãs das cultivares Fuji e Gala despectinizado e pasteurizado
(80ºC/25 minutos), foi inoculado a população de aproximadamente 1,00x10
6
células.mL
-1
de bactéria lática O. oeni em fermentadores (P
0
, P
3
, P
10
, P
20
, P
30
e P
45
dias
) com 150 mL de volume útil (Figura 10).
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Inóculo de O. oen
i
(1 a 3 dias)
59
FIGURA 10. Fluxograma representativo do experimento para avaliar a
fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado.
4.2.5.7 Efeito do sulfito no crescimento de O. oeni em suco de maçã
O suco de maçã despectinizado foi pasteurizado (80ºC/25 minutos) e em
seguida o suco foi distribuído em 8 fermentadores com volume útil de 150 mL. Em 4
fermentadores Oenococcus oeni foi inoculado à população de 1,00x10
6
células.mL
-1
,
os tratamentos consistiram em: fermentador 1 (F
1
) não foi adicionado sulfito e os
fermentadores 2 (F
2
); 3 (F
3
) e 4 (F
4
) foram adicionados 50,0; 100,0; 150,0 mg.L
-1
de
sulftito (metabissulfito de potássio, Labsynth), respectivamente. Após 5 dias de
fermentação foi feita a contagem das colônias em placas com meio seletivo.
Nos 4 fermentadores restantes foram inoculados 135 mg de Saccharomyces
cerevisiae, que corresponde à população de aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-
1
. Os tratamentos consistiram em: fermentador 5 (F
5
) sem sulfito; fermentadores 6
(F
6
); 7 (F
7
) e 8 (F
8
) 50,0; 100,0 e 150,0 mg.L
-1
de sulfito. Após 20 dias de
fermentação alcoólica foi feito o inóculo de 10 mg de Oenococcus oeni à população
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Pasteurizado
•
Inóculo de O. oeni (20 dias)
60
aproximada de 1,00x10
6
células.mL
-1
(Figura 11) e após 5 dias foi feita a contagem
das bactérias em placas contendo meio de cultura seletivos.
FIGURA 11. Fluxograma representativo do experimento para avaliar o efeito
do sulfito no crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã.
4.2.5.8 Efeito do inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O. oeni
O suco despectinizado foi distribuído em 6 fermentadores: P
0
, P
3
, P
10
, P
20
,
P
30
e P
45
em cada fermentador foi adicionado Saccharomyces cerevisiae na
população de aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-1
e O. oeni ao redor de
1,00x10
6
células.mL
-1
. O experimento foi realizado em duplicata.
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Pasteurização
•
A
dição de sulfito 0, 50 , 100 e 150 mg.L
-1
•
Fermentação com LS
A
•
Inóculo de bactéria
Apenas inóculo de
O. oen
i
Inóculo de S. cerevisiae e após
20 dias inóculo de O. oen
i
61
4.2.5.9 Efeito do inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni
O suco despectinizado foi transferido para um fermentador com volume útil
de 1800 mL. Em seguida foi feito o inóculo de Saccharomyces cerevisiae na
população de aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-1
e após 10 dias de
fermentação em temperatura ambiente (média de 27ºC) o fermentado de maçãs foi
distribuído em 4 fermentadores: P
10
, P
20
, P
30
e P
45 dias
. Nesses fermentadores foram
adicionados 10 mg de Oenococcus. Oeni, que correspondem à população de
aproximadamente 1,00x10
6
células.mL
-1
. As bactérias, bem como a fermentação
malolática foram monitoradas por 35 dias.
(A)
(B)
FIGURA 12. Fotos do experimento de fermentação no início (A) e após 48
horas (B)
Fermentação natural
Com inóculo
da levedura
Com inóculo da levedura
e da bactéria no mosto
Com inóculo da levedura no mosto
e da bactéria no fermentado
62
4.2.5.10 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni em suco pasteurizado
O suco pasteurizado foi distribuído em 6 fermentadores: P
0
, P
3
, P
10
, P
20
, P
30
e P
45
e cada fermentador recebeu o inóculo de Saccharomyces cerevisiae na
população de aproximadamente 6,00x10
6
células.mL
-1
e de Oenococcus oeni ao
redor de 1,00x10
6
células.mL
-1
(Figura 13).
FIGURA 13. Fluxograma representativo das fermentações com inóculo
S. cerevisiae e O. oeni em diferentes condições de inoculação da bactéria
lática.
4.2.5.11 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni com redução de biomassa
No suco despectinizado foi feito o inóculo de 810 mg de Saccharomyces
cerevisiae e 60 mg deOenococcus oeni, que correspondem aproximadamente a
6,00x10
6
e 1,00x10
6
células.mL
-1
, respectivamente. Após 12 horas de fermentação,
Maçãs
Suco clarificado
Fermentado
varietal
•
Seleção
•
Limpeza
•
Trituração
•
Prensagem
•
Despectinização
•
Trasfega
•
Fermentação com
S. cerevisiae
•
Inóculo de O. oen
i
S. cerevisiae e O. oen
i
no mosto
S. cerevisiae no mosto e
O. oeni no fermentado
S. cerevisiae e O. oen
i
no mosto pasteuzido
S. cerevisiae e O. oeni no mosto
e redução de biomassa
63
o fermentado foi centrifugado por 20 minutos à 1500 rpm, o sobrenadante foi
separado e a população de microrganismos foi reduzida para próximo ao valor do
inóculo. Em seguida, o sobrenadande foi distribuído em 5 fermentadores (P
3
, P
10
,
P
20
, P
30
e P
45
) em anaerobiose, para que ocorresse um novo crescimento das
leveduras. Para controle, foi feito o experimento como descrito no item 4.2.2.10.
(A)
(B)
FIGURA 14. Fotos do experimento de fermentação no início (A) e após
redução de biomassa (B).
64
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Microbiota natural de mostos de maçãs
As maçãs comerciais e industriais (descarte) (Figura 15) foram processadas
separadamente. Nestes dois sucos foram avaliadas as populações totais de
leveduras fermentativas e oxidativas, denominadas apiculadas e de bactérias láticas
(Tabela 1). Este processo foi repetido dez (10) vezes, com diferentes lotes de frutas
para as leveduras fermentativas e oxidativas e oito (8) vezes para as bactérias
láticas. Estes microrganismos são os responsáveis pela transformação do mosto em
fermentado de maçã (MICHEL; BIZEAU, 1988).
FIGURA 15. Amostras de maçãs comerciais e industriais (descarte)
contendo defeitos, injúrias e/ou podridões.
As leveduras fermentativas, tipo Saccharomyces sp., variaram de 1,00x10
2
a 2,02x10
4
ufc.mL
-1
nas maçãs comerciais, enquanto que nas maçãs industriais de
7,80x10
1
a 4,27x10
4
ufc.mL
-1
, ou seja, valores semelhantes (Tabela 1). Os valores
médios de 4,3x10
3
e 9,14x10
3
ufc.mL
-1
para os mostos comerciais e industriais,
foram menores do que os valores encontrados por Nogueira et al. (2007) de
3,00x10
4
e 6,50x10
4
ufc.mL
-1
em maçãs comerciais e industriais, respectivamente.
65
As populações de leveduras oxidativas variaram de 2,60x10
3
a 2,40x10
4
ufc.mL
-1
nos mostos de maçãs comerciais, enquanto que nos mostos de maçãs
industriais os valores foram superiores, compreendidos entre 1,03x10
4
a 1,24x10
6
ufc.mL
-1
. Nogueira et al. (2007) encontraram uma população média de leveduras
apiculadas de 5,50 x10
5
ufc.mL
-1
em maçãs industriais da variedade Gala.
As bactérias láticas variaram de 0 a 1,17x10
2
ufc.mL
-1
nos mostos das
maçãs comerciais. Nas maçãs industriais as populações foram semelhantes,
variando de 0 a 1,41x10
2
ufc.mL
-1
.
TABELA 1. Microrganismos naturais em mostos de maçãs.
Microrganismos
Contagem (ufc.mL
-1
)
N Mínimo Média Máximo DP CV(%)
Maçãs comerciais
Leveduras fermentativas
10 1,00x10
2
4,31x10
3
2,02x10
4
6,64x10
3
153,84
Leveduras oxidativas
10 2,60x10
3
1,13x10
4
2,40x10
4
6,71x10
3
59,50
Bactérias láticas
8 Ausente 1,48x10
1
1,17x10
2
4,13x10
1
280,11
Maçãs industriais
Leveduras fermentativas
10 7,80x10
1
9,14x10
3
4,27x10
4
1,38x10
4
150,84
Leveduras oxidativas
10
1,03x10
4
3,20x10
5
1,24x10
6
4,90x10
5
152,91
Bactérias láticas
8 Ausente 2,53x10
1
1,41x10
2
4,96x10
1
196,44
NOTA: (DP) Desvio padrão; (CV) coeficiente de variação.
5.2 Monitoramento da microbiota em fermentações naturais
Para monitorar o processo fermentativo natural, maçãs da cultivar Gala
foram processadas e o mosto foi despectinizado. Em seguida foi transferido para
fermentadores em anaerobiose para que a fermentação ocorresse. Durante o
experimento a temperatura no interior do fermentador variou de 24,9 a 30,7ºC
(Figura 16).
66
20
25
30
35
0 10203040
Tempo de fermentação, d
Temperatura,
O
C
Variação de temperatura
FIGURA 16. Variação de temperatura no interior do fermentador.
A composição inicial do mosto pode ser observada na Tabela 2, no tempo
zero. A concentração de açúcares redutores totais e os redutores foram de 111,83 e
80,75 g.L
-1
, respectivamente, o que atesta o estágio de maturidade das frutas. A
frutose foi o açúcar em maior concentração (64,61g.L
-1
), a sacarose esteve presente
em concentração de aproximadamente 50% do teor de frutose (31,08 g.L
-1
)
enquanto que glicose foi o açúcar fermentescível de menor concentração (15,15
g.L
-1
). Estes dados estão de acordo com os valores encontrados por Paganini et al.
(2004); Wosiacki; Pholman e Nogueira (2004) e Nogueira et al. (2006).
A concentração de nitrogênio total de 150,00 mg.L
-1
corresponde a uma
concentração considerada o limite máximo do valor normal (75-150 mg.L
-1
)
(NOGUEIRA, 2003).
Os valores de pH (4,03), acidez total (2,35 g de ácido málico e/ou lático.L
-1
)
e acidez volátil (0,72 g de ácido acético.L
-1
), são considerados normais para sucos
de maçãs de mesa (OLIVEIRA et al., 2006) (NOGUEIRA et al., 2006).
67
A concentração de ácido málico, principal ácido encontrado em maçãs
(WOSIACKI; NOGUEIRA, 2005), foi de 2,60 g.L
-1
, valor menor do que o encontrado
por Drilleau (1995) de 4,0 a 6,0 g.L
-1
. Uma pequena quantidade de ácido L-lático foi
detectada (0,16 mg.L
-1
) e ausência de ácido D-lático.
TABELA 2. Composição do mosto de maçãs e monitoramento durante a
fermentação natural.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 3 10 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
111,83±0,04 108,82
±
0,21 22,02
±
0,01 4,61± 0,01 2,89
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
80,75±0,20 79,74
±
0,20 10,09
±
0,02 2,82±0,00 2,72
±
0,01
Frutose, g.L
-
1
64,61±0,19 63,89
±
0,21 9,22
±
0,02 2,81±0,01 2,70
±
0,03
Sacarose, g.L
-
1
31,08±0,16 29,08
±
0,22 11,94
±
0,01 1,79±0,00 0,18
±
0,03
Glucose, g.L
-
1
16,15±0,01 15,85
±
0,01 0,87
±
0,00 0,02±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, % (v/v)
0,00 0,20 4,90 5,60 5,60
Nitrogênio, mg.L
-
1
150±0,00 150
±
0,00 50
±
0,00 30±0,00 90
±
0,00
pH
4,03 4,29 3,53 3,48 3,42
Acidez total, g.L
-
1
2,35±0,01 2,05
±
0,00 4,05
±
0,01 5,08±0,01 6,25
±
0,00
Ácido málico, g.L
-
1
2,60 2,17 0,43 0,01 0,005
Acidez volátil, g.L
-
1
0,72±0,00 0,74
±
0,00 0,56
±
0,00 0,82±0,00 1,27
±
0,01
Ácido L-lático, g.L
-
1
0,16 0,20 3,06 4,25 4,97
Ácido D-lático, g.L
-
1
*** -- *** -- ***
Anidrido sulfuroso g.L
-
1
0,00 2,56 5,12 3,84 3,84
Nota: (--) Não analisada; (***) Traços.
Durante o experimento de fermentação natural do mosto de maçã, as
leveduras fermentativas inicialmente presentes em uma população de 4,25x10
4
ufc.mL
-1
apresentaram um rápido crescimento e após 3 dias de fermentação a
populção encontrada foi de 1,94x10
6
ufc.mL
-1
. Esta população permaneceu estável
com 7,10x10
6
e 2,27 x10
6
ufc.mL
-1
após 10 e 20 dias, respectivamente. Na
fermentação alcoólica (20 dias) as leveduras consumiram 120 mg.L
-1
de nitrogênio
para formação de biomassa. Com o término dos açúcares fermentescíveis as
leveduras começaram a perder a viabilidade, passando a populações de 1,95x10
5
e
3,15x10
3
ufc.mL
-1
em 30 e 45 dias de fermentação, respectivamente.
68
A produção de anidrido sulfuroso pelas leveduras variou de 2,56 a 5,12
g.L
-1
, fator que não influenciou a inibição das bactérias láticas (OSBORNE;
EDWARDS, 2006).
As leveduras utilizaram em 3 dias de fermentação 2,69% dos açúcares
redutores totais na produção de 0,20% (v/v) de etanol. Este consumo aumentou
gradativamente e 95,88% dos açúcares redutores totais foram fermentados em 30
dias com produção de 5,60% (v/v) de etanol (Figura 17).
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
0 1020304050
Tempo, d
Açúcar, g.L
-1
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
Etanol % (v/v)
Açúcar total Etanol
FIGURA 17. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação natural.
As leveduras apiculadas presentes no suco em uma população superior às
leveduras fermentativas, apresentaram um rápido crescimento, passando de
2,00x10
5
a 3,78x10
6
ufc.mL
-1
em 3 dias de fermentação. Este mesmo
comportamento foi observado por Nogueira (2003), que constatou neste período
uma população de leveduras apiculadas superior às leveduras fermentativas em
mosto de maçã da cultivar Gala.
69
Durante o crescimento das leveduras fermentativas ocorreu a inibição das
leveduras apiculadas, fato que foi observado por Martinez et al. (1989). Após 10 dias
de fermentação a população de células vivas foi de 7,60x10
2
ufc.mL
-1
. Com a perda
de viabilidade e a autólise das leveduras fermentativas (final da fermentação
alcoólica), as leveduras apiculadas iniciaram um novo crescimento, apresentando
após 30 dias de fermentação 3,65x10
3
ufc.mL
-1
. Este crescimento foi momentâneo e
a população voltou a diminuir, mantendo-se estável até o término do experimento
(Figura 18).
A baixa população de bactérias láticas provenientes das maçãs (1,14x10
2
ufc.mL
-1
), diminuiu ainda mais devido a competição e compostos inibitórios,
conforme descrito por Osborne e Edwards (2007). Estes compostos são secretados
pelas leveduras durante seu crescimento e em 10 dias de fermentação a população
observada foi de 8,50 ufc.mL
-1
. Ao final da fermentação alcoólica com a morte das
leveduras fermentativas e liberação de compostos que estimulam o crescimento
(PATYNOWSKI; JIRANEK; MARKIDES, 2002) a população passou a 4,13x10
4
. Esta
população manteve-se até o término do experimento (Figura 18).
70
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo, d
Contagem de colônias, ufc.mL
-1
Bactérias láticas Leveduras apiculadas Leveduras fermentativas
FIGURA 18. Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
natural.
O pH inicial do mosto de 4,03 passou a 3,42 em 45 dias de fermentação e a
acidez total de 2,35 g.L
-1
aumentou para 6,25 g.L
-1
, devido a transformação de
monossacarídeos em ácidos orgânicos pelas bactérias láticas, com destaque para o
ácido lático (Tabela 2).
Os microrganismos metabolizaram o ácido málico proveniente das maçãs
que de 2,60 g.L
-1
passou para 0,43 e 0,005 g.L
-1
em 10 e 45 dias de fermentação,
respectivamente. A concentração de ácido L-lático passou de 0,16 para 3,06 e 4,97
g.L
-1
em 10 e 45 dias, respectivamente (Figura 19). O ácido D-lático foi encontrado
em uma quantidade muito pequena, demonstrando que o ácido málico foi convertido
pelas bactérias láticas em ácido L-lático (LONVAUD-FUNEL, 1999).
71
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
0 1020304050
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total Acidez volátil Ácido málico Ácido lático
FIGURA 19. Evolução dos ácidos orgânicos durante a fermentação natural.
Durante a fermentação natural foram liberados 23,54 g.L
-1
de gás carbônico.
A velocidade máxima da fermentação foi de 2,57 g.L
-1
.d
-1
em 3 dias de processo.
Após 24 dias, o peso do fermentador permaneceu constante, indicando o término
dos açúcares fermentescíveis (Figura 20).
FIGURA 20. Cinética da fermentação natural em função da perda de peso
dos fermentadores decorrente da liberação de gás carbônico.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
R
2
= 0,9792
y = 8E-05x6 - 0,0021x5 + 0,0181x4 -
0,074x3 + 0,1991x2 - 0,1776x + 0,1965
72
5.3 Efeito do inóculo de S. cerevisiae nas bactérias láticas naturais
O mosto de maçã utilizado na fermentação com inóculo de levedura
Saccharomyces cerevisiae foi o mesmo descrito no primeiro experimento do item 5.2
e os resultados foram demosntrados na da Tabela 3. Durante a fermentação a
temperatura média do interior do fermentador foi de 27,29±3,41 ºC, ideal para o
crescimento das bactérias láticas, o que está de acordo com o que foi descrito por
Britz e Tracey (1990).
TABELA 3 Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
leveduras S. cerevisiae.
Análises, g.L
-1
Período de fermentação (dias)
0 3 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
111,83±0,04 47,53
±
0,06 1,53
±
0,00 0,76
±
0,00 0,39±0,00 0,33
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
80,75±0,20 43,33
±
0,20 1,52
±
0,00 0,60
±
0,00 0,18±0,00 0,11
±
0,00
Frutose, g.L
-
1
64,61±0,19 36,89
±
0,18 1,51
±
0,00 0,59
±
0,00 0,17±0,00 0,10
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
31,08±0,16 4,19
±
0,14 0,00
±
0,00 0,16
±
0,00 0,21±0,00 0,22
±
0,00
Glucose, g.L
-
1
16,15±0,01 6,44
±
0,01 0,01
±
0,00 0,01
±
0,00 0,01±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL
0,00 3,75 6,50 6,20 6,50 6,35
pH
4,03 3,96 4,22 4,14 4,06 3,82
Acidez volátil, g.L
-
1
0,72±0,00 0,64
±
0,00 0,64
±
0,00 0,83
±
0,00 0,97±0,00 0,91
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,35±0,01 2,66
±
0,00 1,99
±
0,00 2,20
±
0,00 2,30±0,00 3,20
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
150±0,00 60
±
0,00 50
±
0,00 110
±
0,00 110±0,00 100
±
0,00
Ácido málico, g.L
-
1
2,60 1,80 0,36 0,05 0,001 0,0005
Ácido L-lático, g.L
-
1
0,16 0,22 0,99 1,37 1,33 2,29
Ácido D-lático, g.L
-
1
*** -- *** -- -- ***
Anidrido sulfuroso, g.L
-
1
0,00 3,84 4,48 6,40 3,84 3,85
Nota: (--)Não analisada; (***) Traços.
As leveduras inoculadas em uma população de 6,02x10
6
ufc.mL
-1
passaram
para 2,43x10
7
ufc.mL
-1
em 3 dias de fermentação. Esta população permaneceu
estável até o décimo dia de fermentação. Nesse período, foram metabolizados 97,66
e 99,94% de glicose e frutose, respectivamente.
A autólise das leveduras afetou extremamente as concentrações dos
compostos nitrogenados que passaram de 50 mg.L
-1
no décimo dia de fermentação
73
para 110 mg.L
-1
no vigésimo dia. Lurton; Segain e Feuillat (1989) verificaram
aumentos na concentração de nitrogênio durante a autólise das leveduras em
vinhos. A partir do vigésimo dia de fermentação as células viáveis diminuíram
gradativamente apresentando em 45 dias 6,40x10
2
ufc.mL
-1
, conforme Figura 22.
A produção de anidrido sulfuroso pelas leveduras variou de 3,84 a 6,30g.L
-1
,
porém não influenciou a inibição das bactérias láticas isoladamente, o que foi
observado no trabalho de Osborne e Edwards (2006).
As leveduras inoculadas fermentaram 57,50% dos açúcares redutores totais
para a produção de 3,75% de etanol (v/v) em 3 dias de fermentação (Figura 21). A
sacarose foi rapidamente hidrolisada (86,51%), resultados que concordam com os
de Herrero et al (1999). As análises realizadas no décimo dia demonstraram que
foram fermentados 98,63% de açúcares redutores totais para a produção de 6,5%
de etanol (v/v) e 100 mg.L
-1
de nitrogênio foram utilizados na produção de biomassa.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1020304050
Tempo, d
Açúcares, g.L
-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol %(V/V)
Açúcares totais Etanol
FIGURA 21. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo da levedura S. cerevisiae.
As leveduras apiculadas provenientes das maçãs (2,00x10
5
ufc.mL
-1
)
aumentaram para 5,60x10
5
ufc.mL
-1
até serem inibidas, o que ocorreu no terceiro dia
74
de fermentação (Figura 22). Comportamento similar foi observado por Martinez;
Millan e Ortega (1989) na fermentação de vinho.
A população de bactérias láticas provenientes das maçãs foi de 1,14x10
2
ufc.mL
-1
, este valor está de acordo com Drilleau (1995).
A população de bactérias láticas manteve-se baixa até a perda de
viabilidade das leveduras fermentativas. A partir do décimo dia de fermentação a
população aumentou gradativamente até atingir 1,14x10
6
ufc.mL
-1
em 20 dias e
4,59x10
6
ufc.mL
-1
em 45 dias (Figura 22).
O consumo de nitrogênio para formação de biomassa e crescimento
microbiano foi em torno de 10 mg.L
-1
, valores similares foram observados por
Remize et al. (2006) em condições vinícolas.
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo, d
Contagem de colônias, ufc.mL
-1
Bactérias láticas Leveduras apiculadas Leveduras fermentativas
FIGURA 22. Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo de S. cerevisiae.
As bactérias láticas metabolizaram o ácido málico proveniente das maçãs, o
qual passou de 2,60 do primeiro dia para 0,36 g.L
-1
e 0,001 g.L
-1
no décimo e
trigésimo dia de fermentação, respectivamente. Concomitantemente, os valores de
75
ácido L-lático aumentaram nesse período, passando de 0,16 para 0,99 e 1,33 g.L
-1
(Figura 23). Ainda neste período o pH diminuiu de 4,03 para 3,82 e a acidez total
apresentou uma pequena varição, sendo observada 2,30 g.L
-1
no trigésimo dia de
fermentação.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total Acidez volátil Ácido málico Ácido lático
FIGURA 23. Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico
e lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae.
Durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae foram liberados 25,89
g.L
-1
de gás carbônico, valor menor que encontrado por Nogueira et al. (2007) de
29,23 g.L
-1
para fermentação de mosto de maçã Gala. A velocidade máxima da
fermentação foi de 6,11 g.L
-1
.d
-1
em 1 dia de processo. Após 9 dias o peso do
fermentador permaneceu constante indicando o fim dos açúcares fermentescíveis
(Figura 24).
76
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
FIGURA 24. Cinética da fermentação com inóculo de leveduras
S. cerevisiae.
5.4 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e redução de biomassa
Para monitorar o efeito do inóculo de leveduras fermentativas S. cerevisiae
e a redução de biomassa na população de bactérias láticas provenientes das maçãs,
o mosto de maçã despectinizado foi transferido a fermentadores em anaerobiose.
Para monitoramento da fermentação, a variação de temperatura dentro do
fermentador foi avaliada e apresentada na Figura 25.
R
2
= 0,9977
y = -6E-07x6 + 7E-05x5 - 0,0038x4 +
0,0993x3 - 1,3746x2 + 9,5984x - 0,4162
77
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo de fermentação, d
Temperatura,
O
C
Variação de temperatura
Figura 25. Variação de temperatura durante o experimento.
A composição inicial do mosto está demonstrada na Tabela 4. Os açúcares
redutores totais e os redutores foram 114,83 e 88,83 g.L
-1
respectivamente, o que
atesta o estágio de maturidade das frutas. A frutose foi o açúcar em maior
concentração (66,25 g.L
-1
), seguida da sacarose (26,00 g.L
-1
) e da glicose (22,58
g.L
-1
), ambas com concentrações próximas. Estes resultados estão de acordo com
os valores encontrados por Paganini et al. (2004); Wosiacki; Pholman e Nogueira
(2004) e Nogueira et al. (2006), que trabalharam sobre produtos derivados da maçã
(suco, sidra, etc.).
78
TABELA 4. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação da sidra com inóculo
de S. cerevisiae, com centrigugação do fermentado após 12 horas de fermentação.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
114,83±0,76 22,45
±
0,02 2,06
±
0,01 1,19± 0,01 1,12
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
88,83±0,08 21,35
±
0,02 1,02
±
0,00 1,09±0,00 0,95
±
0,01
Frutose, g.L
-
1
66,25±0,01 20,63
±
0,00 1,00
±
0,00 1,07±0,00 0,94
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
26±0,69 1,11
±
0,00 1,04
±
0,01 0,03±0,01 0,24
±
0,01
Glucose, g.L
-
1
22,58±0,01 0,72
±
0,00 0,02
±
0,00 0,01±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL 0,00 5,13 6,26 6,31 6,32
pH 3,88 3,79 -- 4,16 4,08
Acidez volátil, g.L
-
1
0,71±0,00 0,52
±
0,00 0,44
±
0,00 0,55±0,00 0,57
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,19±0,00 3,12
±
0,01 1,26
±
0,00 1,81±0,00 2,12
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
200±0,00
--
80
±
0,00 80±0,00 80
±
0,00
Nota: (--) Não analisada.
O nitrogênio total dosado em 200 mg.L
-1
corresponde a uma concentração
considerada acima do valor limite máximo (75-150 mg.L
-1
), significando que a
levedura não utilizará todo o nitrogênio assimilável (NOGUEIRA, 2003).
Foi observado o pH de 3,88, acidez total de 2,19 g.L
-1
e a acidez volátil de
0,71 g.L
-1
(demonstrados na Tabela 5) no suco de maçã, os quais estavam dentro
dos padrões legais vigentes (BRASIL, 2000).
TABELA 5. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 3 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
114,83±0,76 34,11
±
0,06 2,38
±
0,02 1,09
±
0,01 1,24±0,00 0,54
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
88,83±0,08 32,71
±
0,10 2,35
±
0,00 1,05
±
0,00 1,10±0,00 0,46
±
0,00
Frutose, g.L
-
1
66,25±0,08 30,11
±
0,10 2,34
±
0,00 1,03
±
0,00 1,07±0,00 0,45
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
26±0,69 1,4
±
0,10 0,03
±
0,02 0,04
±
0,00 0,13±0,00 0,08
±
0,00
Glucose, g.L
-
1
22,58±0,01 2,60
±
0,00 0,01
±
0,00 0,02
±
0,00 0,04±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL
0,00 4,48 6,25 6,32 6,31 6,35
pH
3,88 3,72 4,10 -- 4,27 4,18
Acidez volátil, g.L
-
1
0,71±0,00 0,77
±
0,01 0,50
±
0,00 0,61
±
0,01 0,38±0,00 0,71
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,14±0,00 3,21
±
0,01 1,66
±
0,00 1,61
±
0,00 1,70±0,00 1,70
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
200±0,00 70
±
0,00
--
90
±
0,00 150±0,00 160
±
0,00
Nota: (--) Não analisada.
79
Durante o experimento de fermentação com redução de biomassa, as
leveduras fermentativas inoculadas em uma população de 6,60x10
6
ufc.mL
-1
diminuíram para 4,58x10
6
ufc.mL
-1
após a centrifugação em 13 horas, demonstrando
desta forma, que o objetivo de reduzir a população para valores próximos ao inóculo
foi alcançado.
Em 10 dias de fermentação a população de leveduras aumentou para
2,66x10
7
ufc.mL
-1
, permanecendo estável até o término do experimento.
Diferentemente na fermentação controle (sem redução de biomassa) a população de
leveduras aumentou de 4,25x10
6
para 5,78x10
4
ufc.mL
-1
, do vigésimo ao
quadragésimo quinto dia de fermentação (Figura 26).
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 10203040
Tempo, d
População de leveduras, ufc.mL
-1
Com redução de biomassa
Sem redução de biomassa
FIGURA 26. Efeito da redução de biomassa no crescimento das leveduras
fermentativas.
Durante a fermentação com redução de biomassa, em 10 dias de
fermentação, as leveduras fermentativas utilizaram 80,45% dos açúcares redutores
totais na produção de 5,13% de etanol (v/v). Em 30 dias utilizaram 98,96% dos
açúcares redutores totais e produziram 6,31% de etanol (v/v). A fermentação dos
80
açúcares foi lenta, quando comparado à fermentação controle sem redução de
biomassa, a qual utilizou 97,93% dos açúcares redutores totais na produção de
6,25% de etanol (v/v) em 10 dias de fermentação (Figura 27).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1020304050
Tempo, d
Açúcares, g.L
-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol, % (V/V)
Açúcares redutores totais
Açúcares redutores totais com redução de biomassa
Etanol
Etanol com redução de biomassa
Figura 27. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo da levedura e com redução de
biomassa.
As bactérias láticas provenientes das maçãs (8,30x10
1
ufc.mL
-
1), durante a
fermentação com redução de biomassa, aumentaram gradativamente sua
população, passando para 4,00x10
6
ufc.mL
-1
em 20 dias e para 1,92x10
7
ufc.mL
-1
em
45 dias (Figura 28). As bactérias láticas durante a fermentação controle (sem
redução de biomassa) passaram de 8,30x10
1
para 3,60x10
2
ufc.mL
-1
em 3 dias e
atingiram 5,36x10
7
ufc.mL
-1
em 20 dias de fermentação. Os resultados denotaram
que a população de bactérias durante a fermentação controle foi maior.
81
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
010203040
Tempo, d
População de bactérias, ufc.mL
-1
Com redução de biomassa
Sem redução de biomassa
FIGURA 28. Efeito da redução de biomassa no crescimento das bactérias
láticas naturais.
Durante a fermentação com redução de biomassa a acidez total aumentou
de 2,19 g.L
-1
no tempo zero para 2,12 g.L
-1
em 45 dias de fermentação. O pH evoluiu
de 3,88 para 4,08 (Figura 29). Valores semelhantes foram observados durante a
fermentação controle.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 10203040
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total
Acidez volátil
Acidez total com redução de biomassa
Acidez voláti com redu
ç
ão de biomassal
FIGURA 29. Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico
e lático durante a fermentação com inóculo da levedura e com redução de
biomassa.
82
Durante a fermentação controle sem redução de biomassa foram liberados
30,45 g.L
-1
de gás carbônico, com velocidade máxima da fermentação de 4,42 g.L
-
1
.d
-1
nas primeiras 24 horas do processo. Após 13 dias o peso do fermentador
permaneceu constante (Figura 30), indicando o término dos açúcares
fermentescíveis.
0
5
10
15
20
25
30
35
010203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
FIGURA 30. Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae e sem
redução de biomassa.
Durante a fermentação com redução de biomassa foram liberados 21,54
g.L
-1
de gás carbônico, sendo que o peso do fermentador permaneceu constante
após 26 dias. A velocidade máxima da fermentação foi de 2,33 g.L
-1
.d
-1
nas
primeiras 48 horas do processo (Figura 31). Indicando que a redução de biomassa
resulta em uma fermentação lenta.
R
2
= 0,9964
y = -7E-07x6 + 9E-05x5 - 0,0045x4 +
0,1141x3 - 1,5467x2 + 10,772x - 1,8536
83
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
FIGURA 31. Cinética da fermentação com inóculo da levedura e redução
de biomassa.
5.5 Crescimento de Oenococcus oeni em suco de maçã clarificado
As bactérias láticas inoculadas no mosto em uma população de 1,00x10
6
ufc.mL
-1
resultaram em uma população de 5,83x10
6
ufc.mL
-1
após 24 horas.
Contudo, quando inoculadas em uma população de 5,00x10
6
ufc.mL
-1
resultaram em
populações de 1,00x10
7
, 1,48x10
7
e 9,10x10
6
ufc.mL
-1
após 24, 48 e 72 horas de
fermentação, respectivamente. Notou-se desta forma, que esta cepa de bactéria tem
a capacidade de crescer no mosto de maçã.
5.6 Fermentação malolática em suco de maçã pasteurizado
As bactérias láticas Oenococcus oeni inoculadas no mosto de maçã
pasteurizado da cultivar Gala em uma população inicial de 1,81x10
6
ufc.mL
-1
,
R
2
= 0,9981
y = -2E-06x4 + 0,0015x3 - 0,1065x2 +
2,6367x - 0,4726
84
aumentaram para 1,15x10
7
e 2,11x10
6
ufc.mL
-1
no terceiro e vigésimo dia de
fermentação, respectivamente.
Quando inoculadas no mosto pasteurizado da cultivar Fuji aumentaram de
3,50x10
6
ufc.mL
-1
para 1,20x10
7
e 8,61x10
7
ufc.mL
-1
do terceiro para o vigésimo dia
de fermentação, respectivamente (Figura 32), população superior à apresentada na
fermentação do mosto da cultivar Gala.
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
0 5 10 15 20 25
Tempo, d
Contagem de bactérias, ufc/m
L
Mosto de maçã Fuji Mosto de maçã Gala
FIGURA 32. Desenvolvimento da bactéria lática O. oeni durante a
fermentação do mosto de maçãs da cultivar Gala e Fuji pasteurizado.
Durante a fermentação do mosto da cultivar Gala a acidez total passou de
2,32 g.L
-1
no início da fermentação para 1,39 g.L
-1
em 20 dias. Para a cultivar Fuji foi
observado um aumento de 0,59 g.L
-1
na acidez total durante os 20 dias de
fermentação (Tabela 6).
85
Tabela 6. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 3 10 20
Cultivar Gala
Acidez total, g.L
-
1
2,32±0,01 1,86
±
0,01 1,37
±
0,00 1,39
±
0,01
Acidez volátil, g.L
-
1
0,34±0,01 0,46
±
0,01 0,48
±
0,01 0,52
±
0,01
Cultivar Fuji
Acidez total, g.L
-
1
1,53±0,01 1,72
±
0,01 1,15
±
0,01 2,12
±
0,00
Acidez volátil, g.L
-
1
0,57±0,01 0,12
±
0,01 0,08
±
0,00 0,16
±
0,01
pH 3,96 4,21 4,52 4,20
5.7 Efeito do sulfito no crescimento de O. oeni em suco de maçã
Nas fermentações com inóculo de Oenococcus oeni, após 5 dias a contagem
das populações de bactérias foram de 3,25x10
7
, 4,02x10
7
, 2,88x10
7
e 3,39x10
7
ufc.mL
-1
para os experimentos com ausência, 50, 100 e 150 mg.L
-1
de sulfito,
respectivamente. Nas fermentações com inóculo de S. cerevisiae e O. Oeni, as
populações de microrganismos encontradas foram de 2,37x10
7
, 3,28x10
7
, 2,27x10
7
e 1,29x10
7
ufc.mL
-1
para os experimentos em ausência de sulfito, adição de 50, 100
e 150 mg.L
-1
de sulfito, respectivamente (Figura 33). A maior população observada
foi para a adição de 50 mg.L
-1
de sulfito na fermentação com inóculo de O. Oeni e na
fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni . A menor população foi
observada para adição de 150 mg.L
-1
de sulfito. Sendo assim, esta bactéria
demonstrou resistência ao sulfito.
86
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
3,00E+07
3,50E+07
4,00E+07
4,50E+07
0 50 100 150
Concentração de sulfito, ppm
Bactérias lática, ufc.mL
-1
Adição de bactéria lática Adição de levedura e bactéria lática
FIGURA 33. Crescimento da bactéria O. Oeni, adicionado ou não de
S. cerevisiae, em suco de maçã pasteurizado, após 5 dias de fermentação.
A acidez total do mosto (1,99±0,00 g.L
-1
) diminuiu ao final do experimento e
o pH aumentou, tanto na fermentação com inóculo de bactéria, quanto na
fermentação com inóculo de levedura e bactéria (Tabela 7).
Tabela 7. Monitoramento da acidez total e volátil durante a fermentação do mosto de
maçã com inóculo de O. oeni e sulfito.
Análises
Mosto
Concentração de sulfito (mg.L
-
1
)
ausência 50 100 150
Oenococcus oeni (5 dias de fermentação)
Acidez total, g.L
-
1
1,99±0,00 1,70
±
0,01 1,61
±
0,01 1,37
±
0,00 1,37±0,00
Acidez volátil, g.L
-
1
0,68±0,00 0,57
±
0,01 0,57
±
0,00 0,63
±
0,00 0,57±0,00
pH 3,76 4,06 4,08 4,07 4,10
Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus oeni. (25 dias de fermentação)
Acidez total, g.L
-
1
1,99±0,00 1,61
±
0,00 1,79
±
0,01 1,68
±
0,00 1,57±0,00
Acidez volátil, g.L
-
1
0,68±0,00 0,44
±
0,01 0,55
±
0,01 0,36
±
0,00 0,30±0,01
pH 3,76 3,90 3,89 3,89 3,92
87
5.8 Efeito do inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O. oeni
A fermentação com inóculo de Saccharomyces cerevisiae e Oenococcus
oeni foi realizada com o mesmo mosto descrito no primeiro experimento do item 5.2.
e apresentado na Tabela 8. Durante a fermentação a temperatura média do interior
do fermentador foi de 27,29±3,41 ºC.
TABELA 8. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae e de O. oeni no mosto.
Análises
Período de fermentação, d
0 3 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
111,83±0,04 46,34
±
0,15 1,47
±
0,00 0,68
±
0,00 0,58±0,00 0,59
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
80,75±0,20 40,70
±
0,27 1,43
±
0,00 0,64
±
0,00 0,35±0,00 0,19
±
0,00
Frutose, g.L
-
1
64,61±0,19 33,47
±
0,15 1,42
±
0,00 0,63
±
0,00 0,34±0,00 0,18
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
31,08±0,16 5,65
±
0,44 0,03
±
0,00 0,04
±
0,01 0,23±0,00 0,40
±
0,00
Glucose, g.L
-
1
16,15±0,01 7,23
±
0,00 0,01
±
0,00 0,01
±
0,00 0,01±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL
0,00 3,90 6,55 6,30 6,20 6,50
pH
4,03 3,89 4,04 4,02 4,10 3,80
Acidez volátil, g.L
-
1
0,72±0,00 0,52
±
0,00 0,66
±
0,00 1,17
±
0,01 1,06±0,00 0,91
±
0,01
Acidez total, g.L
-
1
2,35±0,01 2,54
±
0,01 2,12
±
0,00 2,58
±
0,00 2,36±0,01 2,98
±
0,01
Nitrogênio, mg.L
-
1
150±0,00 80
±
0,00 60
±
0,00 120
±
0,00 130±0,00 120
±
0,00
Ácido málico, g.L
-
1
2,60 2,40 0,02 0,01 0,001 0,0001
Ácido L-lático, g.L
-
1
0,16 0,18 1,44 2,05 2,06 2,07
Ácido D-lático, g.L
-
1
-- *** -- *** *** 0,00
Nota: (--) Não analisada; (***) Traços.
A S. cerevisiae inoculada em uma população correspondente a 6,02x10
6
ufc.mL
-1
cresceu rapidamente e em 3 dias de fermentação a população encontrada
foi de 1,96x10
7
ufc.mL
-1
. Essa população iniciou a fase de perda de viabilidade das
células apresentando em 20 dias a população de 6,20x10
4
ufc.mL
-1
. Herrero et al.
(1999) observaram que as leveduras, no processamento da sidra, iniciavam a fase
de perda de viabilidade em aproximadamente 10 dias, a temperatura de 22ºC. A
população permaneceu estável a partir do vigésimo dia até o término do
experimento.
88
A S. cerevisiae fermentou 58,56 e 98,68% dos açúcares redutores com
produção de 3,90 e 6,55% de etanol (v/v) em 3 dias e 10 dias de fermentação,
respectivamente (Figura 34).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1020304050
Tempo, d
Açúcares, g.L
-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol, % (V/V)
Açúcares totais Etanol
FIGURA 34. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni.
As leveduras apiculadas presentes no suco em uma população de 2,00x10
5
ufc.mL
-1
cresceram ligeiramente apresentando em 3 dias de fermentação a
população de 6,88x10
5
ufc.mL
-1
. Durante o crescimento das leveduras fermentativas
ocorreu a inibição do desenvolvimento das leveduras apiculadas. Em 10 dias de
fermentação a população observada foi de 1,09x10
4
ufc.mL
-1
, permanecendo estável
até o término do experimento (Figura 35).
89
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo, d
Contagem de colônias, ufc.mL
-1
Bactérias láticas Leveduras apiculadas Leveduras fermentativas
FIGURA 35. Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo simultâneo de S. cerevisiae e O. oeni.
A população de bactérias láticas inoculadas no suco (1,00x10
6
ufc.mL
-1
)
diminuiu, permanecendo baixa até o término da fermentação alcoólica. Com a
autólise das leveduras, comprovado pelo aumento do nitrogênio que passou de 60
mg.L
-1
em 10 dias de fermentação para 120 mg.L
-1
em 20 dias, as bactérias
iniciaram o aumento populacional. Em 20 dias de fermentação a população
observada foi de 6,70x10
5
ufc.mL
-1
e ao final do experimento 3,04x10
7
ufc.mL
-1
.
O ácido málico proveniente das maçãs (2,60 g.L
-1
) teve sua concentração
drasticamente diminuída para 0,02 g.L
-1
em 10 dias de fermentação, segundo
Herrero et al (1999) isso ocorre devido à reação de descarboxilação do ácido málico
durante a fermentação alcoólica. A concentração de ácido L-lático dosado passou de
0,16, para 1,44 e 2,07 g.L
-1
no décimo e quadagésimo quinto dia de fermetnação,
respectivamente (Figura 36).
90
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 10203040
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total Acidez volátil Ácido málico Ácido lático
FIGURA 36. Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico
e lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni.
Durante a fermentação foram liberados 26,87 g.L
-1
de gás carbônico e a
velocidade máxima da fermentação foi de 5,61 g.L
-1
.d
-1
nas primeiras 24 horas do
processo. Após 10 dias, o peso do fermentador permaneceu constante, indicando a
capacidade fermentativa da S. cerevisiae inoculada (Figura 37).
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fementação
FIGURA 37. Cinética da fermentação com inóculo simultâneo de
S. cerevisiae e O. oeni.
R
2
= 0,9751
y = -4E-07x6 + 5E-05x5 - 0,0028x4 +
0,0788x3 - 1,1622x2 + 8,5874x + 1,816
91
5.9 Efeito do inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni
A fermentação com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e de O. oeni foi
realizada utilizando o mesmo mosto descrito no primeiro experimento do item 5.2
(Tabela 9). A temperatura do interior do fermentador foi monitorada e a média
observada foi de 27,29±3,41 ºC.
TABELA 9. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo
seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni.
Análises, g.L
-1
Período de fermentação (dias)
0 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
111,83±0,04 1,35
±
0,00 0,77
±
0,00 0,34±0,00 0,32
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
80,75±0,20 1,24
±
0,00 0,74
±
0,00 0,10±0,00 0,08
±
0,00
Frutose, g.L
-
1
64,61±0,19 1,24
±
0,00 0,73
±
0,00 0,09±0,00 0,07
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
31,08±0,16 0,11
±
0,00 0,03
±
0,00 0,24±0,00 0,24
±
0,00
Glucose, g.L
-
1
16,15±0,01 0,01
±
0,00 0,01
±
0,00 0,01±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL 0,00 5,60 5,75 6,10 5,75
pH 4,03 4,20 4,10 4,10 4,00
Acidez volátil, g.L
-
1
0,72±0,00 0,79
±
0,01 1,21
±
0,00 1,07±0,00 1,07
±
0,01
Acidez total, g.L
-
1
2,35±0,01 1,93
±
0,00 2,28
±
0,00 2,66±0,00 2,84
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
130±0,00 150
±
0,00 80
±
0,00 110±0,00 120
±
0,00
Ácido málico, g.L
-
1
2,60 0,066 0,06 0,01 0,0066
Ácido L-lático, g.L
-
1
0,16 1,07 1,74 1,75 1,76
Ácido D-lático, g.L
-
1
*** *** -- -- ***
Nota: (--) Não analisada; (***) Traços.
A Saccharomyces cerevisiae inoculada em uma população correspondente
a 6,02x10
6
ufc.mL
-1
, apresentou após o décimo dia de fermentação a população de
1,16x10
7
ufc.mL
-1
. Com o término dos açúcares fermentescíveis, iniciou a fase de
perda de viabilidade e no vigésimo dia a população observada foi de 1,00x10
4
ufc.mL
-1
, a qual permaneceu estável até o quadragésimo quinto dia de fermentação.
Foram fermentados 98,79% dos açúcares redutores totais para a produção
de 5,6% de etanol (v/v) em 10 dias de fermentação (Figura 38).
92
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 1020304050
Tempo, d
Açúcares, g.L
-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol, %(V/V)
Açúcares totais Etanol
FIGURA 38. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni.
As leveduras apiculadas presentes no suco inicialmente em uma população
de 2,00x10
5
ufc.mL
-1
, passaram para 1,00x10
4
ufc.mL
-1
no décimo dia e 5,50x10
3
ufc.mL
-1
no quadragésimo quinto dia de fermentação (Figura 39).
As bactérias láticas, que estavam presentes inicialmente no suco em uma
população de 1,14x10
2
ufc.mL
-1
, passaram para 7,24x10
2
ufc.mL
-1
após 10 dias de
fermentação. No décimo segundo dia de fermentação foi feito o inóculo de uma
população correspondente a 1,00x10
6
ufc.mL
-1
de Oenococcus oeni. Essa população
diminuiu para 2,52x10
5
ufc.mL
-1
em 20 dias e permaneceu estável até o término do
experimento (45 dias), demonstrado na Figura 39.
93
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo, d
Contagem de colônias, ufc.mL
-1
Bactérias láticas Leveduras apiculadas leveduras fermentativas
FIGURA 39. Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e O. oeni.
A concentração de ácido málico no mosto de maçã Gala diminuiu de 2,60
para 0,006 g.L
-1
, enquanto que a concentração de ácido L-lático passou de 0,16 para
1,75 g.L
-1
durante o tempo do experimento (45 dias). A acidez total aumentou de
1,93 g.L
-1
no décimo dia para 2,84 g.L
-1
no quadragésimo quinto dia de fermentação
(Figura 40).
94
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 10203040
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total Acidez volátil Ácido málico Ácido lático
FIGURA 40. Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico
e lático durante a fermentação com inóculo seqüencial de S. cerevisiae e
O. oeni.
O inóculo de O. oeni no início do processo fermentativo diminuiu
rapidamente, permanecendo apenas algumas células viáveis. Após o término dos
açúcares fermentescíveis e da perda da viabilidade das células leveduriformes, o
crescimento das bactérias foi rápido. Estas bactérias tornaram-se mais adaptadas ao
meio do que as bactérias inoculadas após o 12º dia de fermentação, apresentando
populações maiores (Figura 41). Sendo assim, um inóculo inicial de O. oeni pode
tornar o processo de fermentação malolática mais eficiente.
95
1,00E+01
1,00E+03
1,00E+05
1,00E+07
1,00E+09
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (dias)
Bactérias láticas ufc.mL
-1
Inóculo bactéria início fermentação
Inóculo bactéria após 12 dias fermentação
FIGURA 41. Curva de crescimento de O. Oeni com inóculo simultâneo e
seqüencial.
5.10 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni em suco pasteurizado
A fermentação com inóculo de S. cerevisiae e de O. Oeni foi realizada com
o mosto utilizado no experimento descrito no item 5.2 (Tabela 10). O mosto foi
pasteurizado e distribuído em microfermentadores para que a fermentação
ocorresse. Durante a fermentação, a temperatura média do interior do fermentador
foi de 27,29±3,41 ºC.
96
TABELA 10. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação do mosto de maçã
pasteurizado com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 3 10 20 35
Açúcar redutor total, g.L
-
1
111,83±0,04 48,55
±
0,02 1,27
±
0,00 0,58±0,00 0,57
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
80,75±0,20 26,18
±
0,19 0,61
±
0,00 0,11±0,00 0,43
±
0,00
Frutose, g.L
-
1
64,61±0,19 18,54
±
0,21 0,59
±
0,00 0,09±0,00 0,42
±
0,00
Sacarose, g.L
-
1
31,08±0,16 22,37
±
0,21 0,66
±
0,00 0,47±0,00 0,14
±
0,00
Glucose, g.L
-
1
16,15±0,01 7,65
±
0,02 0,01
±
0,00 0,02±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL 0,00 3,40 5,60 6,10 5,50
pH 4,03 3,89 4,22 4,12 4,13
Acidez volátil, g.L
-
1
0,72±0,00 0,46
±
0,00 0,87
±
0,00 1,05±0,00 1,01
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,35±0,01 2,52
±
0,00 1,69
±
0,00 2,22±0,00 2,16
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
150±0,00 60
±
0,00 60
±
0,00 110±0,00 110
±
0,00
A Saccharomyces cerevisiae inoculada (6,02x10
6
ufc.mL
-1
) cresceu nos 10
primeiros dias de fermentação. Com a diminuição dos açúcares fermentescíveis
iniciaram a fase de perda de viabilidade celular. A população observada em 45 dias
de fermentação foi de 3,00x10
2
ufc.mL
-1
.
A Saccharomyces cerevisiae em 10 dias de fermentação utilizou 98,86%
dos açúcares redutores totais para produção de 5,60% de etanol (v/v) (Figura 42).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 10203040
Tempo, d
Açúcares, g.L
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol, % (V/V)
Açúcares totais Etanol
FIGURA 42. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação do mosto de maçã pasteurizado e com inóculo de
S. cerevisiae e O. oeni.
97
A Oenococcus oeni inoculada no suco em uma população de 1,00x10
6
ufc.mL
-1
diminuiu para 2,80x10
4
ufc.mL
-1
em 10 dias de fermentação, devido à
competição com as leveduras que, nesta etapa, dominam o meio rapidamente. Com
a perda de viabilidade e autólise das células, as bactérias láticas encontraram um
meio favorável para iniciar o crescimento. Neste crescimento, a população máxima
de bactérias láticas foi 4,50x10
6
ufc.mL
-1
em 35 dias de fermentação (Figura 43).
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tempo, d
Contagem de colônias, ufc/m
L
Bactérias láticas Leveduras fermentativas
FIGURA 43. Desenvolvimento dos microrganismos durante a fermentação
do mosto de maçã pasteurizado e com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni.
Durante a fermentação foram liberados 26,60 g.L
-1
de gás carbônico com a
velocidade máxima de fermentação de 5,94 g.L
-1
.d
-1
em 2 dias de processo. Após 24
dias o peso do fermentador permaneceu constante, indicando o término dos
açúcares fermentescíveis (Figura 44).
98
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo,d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
FIGURA 44. Cinética da fermentação em função da perda de peso dos
fermentadores decorrente da liberação de gás carbônico durante a
fermentação do mosto de maçã pasteurizado e com inóculo de S. cerevisiae
e O. oeni.
5.11 Efeito do inóculo de S. cerevisiae e O. oeni com redução de biomassa
A fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni com redução de
biomassa foi realizada com o mesmo mosto descrito no item 5.4 e nas Tabelas 11 e
12 (ponto zero). A temperatura média durante o experimento foi de 24,24±2,3 ºC.
TABELA 11. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de S.
cerevisiae e O. oeni, com redução de biomassa.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
114,83±0,76 19,71
±
0,10 1,73
±
0,01 1,18± 0,01 1,16
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
88,83±0,08 19,33
±
0,02 1,63
±
0,00 1,09±0,00 0,86
±
0,01
Frutose, g.L
-
1
66,25±0,08 18,51
±
0,02 1,61
±
0,00 1,08±0,00 0.85
±
0,01
Sacarose, g.L
-
1
26±0,69 0,39
±
0,12 0,10
±
0,00 0,09±0,00 0,3
±
0,01
Glucose, g.L
-
1
22,58±0,01 0,82
±
0,00 0,02
±
0,00 0,01±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL 0,00 5,28 6,28 6,31 6,32
pH 3,88 4,01 -- 4,06 4,05
Acidez volátil, g.L
-
1
0,71±0,00 0,55
±
0,00 0,57
±
0,00 0,57±0,00 0,61
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,19±0,00 1,92
±
0,01 1,79
±
0,00 2,03±0,00 2,28
±
0,00
Nitrogênio, mg.L
-
1
200±0,00
--
110
±
0,00 80±0,00 80
±
0,00
Nota: (--) Não analisada.
R
2
= 0,9988
y = 1E-07x6 + 2E-05x5 - 0,002x4 +
0,0706x3 - 1,1479x2 + 8,9207x - 0,5447
99
As leveduras fermentativas inoculadas inicialmente em uma população de
5,20x10
6
ufc.mL
-1
diminuíram para 2,07x10
6
ufc.mL
-1
após a centrifugação em 12
horas de fermentação, demonstrando desta forma, que o objetivo de reduzir a
população para valores próximos ao inóculo foi alcançado.
TABELA 12. Parâmetros físico-químicos durante a fermentação com inóculo de
S. cerevisiae e O. oeni.
Análises
Período de fermentação (dias)
0 3 10 20 30 45
Açúcar redutor total, g.L
-
1
114,83±0,76 28,55
±
0,09 2,88
±
0,01 1,19
±
0,01 1,12±0,01 1,03
±
0,00
Açúcar redutor, g.L
-
1
88,83±0,08 28,54
±
0,17 2,70
±
0,04 1,10
±
0,00 1,10±0,00 0,46
±
0,03
Frutose, g.L
-
1
66,25±0,08 25,06
±
0,17 2,69
±
0,04 1,08
±
0,00 1,06±0,00 0,45
±
0,03
Sacarose, g.L
-
1
26±0,69 0,01
±
0,10 0,18
±
0,04 0,09
±
0,01 0,02±0,01 0,57
±
0,04
Glucose, g.L
-
1
22,58±0,01 3,49
±
0,00 0,01
±
0,00 0,02
±
0,00 0,04±0,00 0,01
±
0,00
Etanol, °GL
0,00 4,79 6,22 6,31 6,32 6,32
pH
3,88 3,87 4,09 -- 4,19 4,19
Acidez volátil, g.L
-
1
0,71±0,00 0,55
±
0,00 0,52
±
0,00 0,61
±
0,00 0,59±0,00 0,74
±
0,00
Acidez total, g.L
-
1
2,14±0,00 2,61
±
0,00 1,66
±
0,00 1,77
±
0,00 1,99±0,00 1,72
±
0,00
±
0,
Nitrogênio, mg.L
-
1
200±0,00 130
±
0,00
--
140
±
0,00 150±0,00 80
±
0,00
Nota: (--) Não analisada.
Na fermentação com redução de biomassa a população de leveduras
fermentativas aumentou para 3,14x10
7
ufc.mL
-1
em 10 dias de fermentação e
permaneceu estável até 30 dias devido à presença de açúcares residuais. Durante a
fermentação controle, sem redução de biomassa, as leveduras demonstraram perda
de viabilidade celular depois de 3 dias de fermentação (Figura 45).
100
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 10203040
Tempo, d
População de leveduras, ufc.mL
-1
Com redução de biomassa
Sem redução de biomassa
FIGURA 45. Efeito da redução de biomassa no crescimento das leveduras
fermentativas.
Durante a fermentação com redução de biomassa as leveduras
fermentaram 82,84 e 98,48% dos açúcares redutores totais e redutores para
produção de 5,28 e 6,28% de etanol (v/v) em 10 e 20 dias de fermentação,
respectivamente. As leveduras da fermentação controle utilizaram 97,49% dos
açúcares redutores totais para produção de 6,22% de etanol (v/v) em 10 dias de
fermentação (Figura 46).
101
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo, d
Açúcares, g.L
-1
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Etanol, %(V/V)
Açúcares redutores totais
Açúcares redutores totais com redução de biomassa
Etanol
Etanol com redução de biomassa
FIGURA 46. Consumo dos açúcares redutores totais e produção de etanol
durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni, com redução de
biomassa.
A O. oeni inoculada passou de 6,56x10
6
para 3,36x10
6
ufc.mL
-1
após a
redução de biomassa. No entanto, com o crescimento lento das leveduras
fermentativas e menor liberação de compostos inibitórios, as bactérias aumentaram
sua população para 5,79x10
7
ufc.mL
-1
em 20 dias e 6,62x10
7
ufc.mL
-1
em 45 dias de
fermentação (Figura 47).
Durante a fermentação controle, sem redução de biomassa, a população de
bactérias inoculadas passou de 6,56x10
6
para 4,80x10
6
ufc.mL
-1
em 10 e 2,23x10
7
ufc.mL
-1
em 20 dias de fermentação. No final do experimento a população
observada foi de 6,00x10
6
ufc.mL
-1
.
102
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
0 10203040
Tempo, d
População de bactérias, ufc.mL
-1
Com redução de biomassa
Sem redução de biomassa
FIGURA 47. Efeito da redução de biomassa no crescimento das bactérias
láticas.
A acidez total diminuiu durante o crescimento das leveduras fermentativas
na fermentação com redução de biomassa, posteriormente passou de 1,79 g.L
-1
no
vigésimo dia para 2,28 g.L
-1
no quadragésimo quinto dia de fermentação. Na
fermentação controle, nesse mesmo período, a acidez total passou de 2,14 g.L
-1
para 1,72 g.L
-1
(Figura 48). A evolução da acidez volátil durante as fermentações
com e sem redução de biomassa foi semelhante.
103
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
0 10203040
Tempo, d
Acidez, g.L
-1
Acidez total
Acidez volátil
Acidez total com redução de biomassa
Acidez volátil com redução de biomassa
FIGURA 48. Evolução da acidez total e volátil e dos teores de ácidos málico e
lático durante a fermentação com inóculo de S. cerevisiae e O. oeni, com
redução de biomassa.
Durante a fermentação controle (sem redução de biomassa) foram liberados
29,14 g.L
-1
de gás carbônico e a velocidade máxima da fermentação foi de 6,56
g.L
-1
.d
-1
nas primeiras 24 horas de processo. Após o décimo terceiro dia, o peso do
fermentador permaneceu constante indicando o término dos açúcares
fermentescíveis (Figura 49).
104
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo, d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da femrentação
FIGURA 49. Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae e
O. oeni.
Na fermentação com redução de biomassa foram liberados 22,42 g.L
-1
de
gás carbônico e a velocidade máxima da fermentação foi de 2,94 g.L
-1
.d
-1
nas
primeiras 48 horas do processo. Após o décimo oitvo dia, o peso do fermentador
permaneceu constante (Figura 50). Menor velocidade de fermentação foi observada
em comparação à fermentação controle, o que demonstra que a redução de
biomassa proporciona uma fermentação mais lenta.
R
2
= 0,9596
y = -2E-07x6 + 3E-05x5 - 0,0019x4 +
0,0621x3 - 1,0791x2 + 9,3867x - 2,8799
105
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10203040
Tempo,d
Gás carbônico liberado,g.L
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
Velocidade (∆CO
2
/∆t),g.L
-1
.d
-1
Gás carbônico liberado
Velocidade da fermentação
FIGURA 50. Cinética da fermentação com inóculo de S. cerevisiae, O. oeni
e redução de biomassa.
R
2
= 0,9921
y = -3E-05x4 + 0,0039x3 -
0,1843x2 + 3,4596x - 0,7926
106
6. CONCLUSÕES
Entre os três microrganismos de interesse no processamento de
fermentados de maçã e de sidra, a população natural de leveduras apiculadas
presentes nas maçãs e conseqüentemente nos mostos, foi superior.
As leveduras apiculadas naturais do mosto de maçã cresceram mais
rapidamente no início da fermentação, apresentando crescimento durante a fase de
desenvolvimento das Saccharomyces, sendo supridas após o terceiro dia de
fermentação. Durante o crescimento das leveduras na fermentação alcoólica, as
bactérias láticas tiveram seu crescimento inibido. Posteriormente durante a perda de
viabilidade das leveduras, as bactérias foram estimuladas ao desenvolvimento.
Comportamento semelhante do crescimento das leveduras apiculadas,
fermentativas e bactéria lática durante a fermentação natural foi observado pelos
microrganismos durante a fermentação com inóculo de Saccharomyces cerevisiae.
Nas fermentações com inóculo de levedura e redução de biomassa, a
operação diminuiu a velocidade de fermentação, resultando em populações de
leveduras fermentativas menores no início do experimento e maiores no término,
quando comparado à fermentação controle. As bactérias láticas naturais
apresentaram populações maiores que o controle ao final do experimento.
A Oenococcus oeni apresentou crescimento no suco de maçã,
demonstrando capacidade fermentativa. Quando inoculada em mosto com adição de
sulfito, apresentou crescimento em todas as concentrações de sulfito (50 a 150
g.L
-1
), mostrando-se resistente.
As bactérias inoculadas com as leveduras apresentaram uma rápida
mortalidade, porém voltaram a crescer após o décimo dia de fermentação, momento
em que houve diminuição da população de leveduras e término dos açúcares
107
fermentecíveis. Nesse novo crescimento, a população foi superior à fermentação
inoculada por O. oeni após 10 dias de fermentação, indicando uma melhor condição
para o crescimento das bactérias láticas. O mesmo comportamento foi observado na
fermentação com o inóculo de S. cerevisiae e O. oeni no mosto pasteurizado.
Nas fermentações com inóculo de S. cerevisiae, O. oeni e redução de
biomassa, houve uma diminuição velocidade, resultando em populações menores
durante o experimento, quando comparado à fermentação controle. As bactérias
láticas inoculadas apresentaram populações maiores durante todo o período de
fermentação, quando comparadas ao controle.
108
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