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URI - CAMPUS ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE LIPASES
EM PROPANO PRESSURIZADO
LUIZ PAULO GOMES FRANKEN
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa
de Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-
Campus de Erechim, como requisito parcial à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, Área de Concentração: Engenharia de
Alimentos, da Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões - URI, Campus de
Erechim.
ERECHIM, RS – BRASIL
MARÇO DE 2007
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ii
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE LIPASES EM
PROPANO PRESSURIZADO
LUIZ PAULO GOMES FRANKEN
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de
Mestrado em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários
à obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de
Concentração: Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Débora de Oliveira, D. Sc.
Orientadora
____________________________________
José Vladimir de Oliveira, D. Sc.
Orientador
____________________________________
Cláudio Dariva, D. Sc.
Orientador
____________________________________
Jorge Luiz Ninow, D. Sc.
____________________________________
Marco Di Luccio, D. Sc.
Erechim, março de 2007.
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iii
NESTA PÁGINA DEVERÁ SER INCLUÍDA A FICHA CATALOGRÁFICA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. ESTA FICHA SERÁ ELABORADA DE
ACORDO COM OS PADRÕES DEFINIDOS PELO SETOR DE PROCESSOS
TÉCNICOS DA BIBLIOTECA DA URI - CAMPUS DE ERECHIM.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter me dado a oportunidade de estar aqui.
À Orientadora Débora pelo carinho e empenho dispensado e,
principalmente, à motivação para que este trabalho fosse realizado.
Ao Orientador Vladimir pela motivação e troca de conhecimentos quando
necessários.
Ao Orientador Dariva pelas informações compartilhadas.
À Colega Naiane que não mediu esforços na realização deste trabalho.
À Professora Helen que colaborou efetivamente na análise dos
resultados obtidos.
Aos professores do Programa de Mestrado em Engenharia de Alimentos,
pelas palavras de apoio e preocupação demonstradas.
Ao colega Joncimar pelo companheirismo nestes dois anos de estudos.
Aos colegas de curso pela participação e apoio nas horas difíceis.
A todos outros de uma forma em geral que me auxiliaram nas horas de
estudo.
v
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em
Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos.
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIDROLÍTICA DE LIPASES
EM PROPANO PRESSURIZADO
Luiz Paulo Gomes Franken
Março/2007
Orientadores: Débora de Oliveira
José Vladimir de Oliveira
Cláudio Dariva
Lipases microbianas (E.C. 3.1.1.3) têm sido largamente empregadas em uma
série de aplicações. A utilização destas enzimas na forma imobilizada confere a
estas vantagens em termos de controle do processo, aumento da estabilidade,
produtos isentos de catalisador, etc. Além disso, as vantagens na utilização de
fluidos comprimidos em substituição aos solventes orgânicos convencionais
tem sido objeto de intensas pesquisas devido às propriedades favoráveis de
transporte, facilidade na recuperação de produtos e redução de reações
secundárias. Visando a condução de reações enzimáticas a altas pressões, a
avaliação do comportamento da atividade enzimática é de fundamental
importância uma vez que a perda de atividade pode conduzir a baixas taxas de
reação. Entre algumas substâncias viáveis, o propano parece ser promissor
como meio alternativo. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo
investigar a influência da temperatura (35-55
o
C), pressão (30-200bar), taxa de
descompressão (2-50 bar.min
-1
) e tempo de exposição (0.5 a 3h) na atividade
hidrolítica de três lipases (Amano PS, Amano AY30 e lipase de Yarrowia
lipolytica) nas formas livre, ressuspendida e imobilizada. Visando verificar o
efeito das variáveis na atividade enzimática, um planejamento experimental
com 2 níveis foi empregado. O equipamento utilizado em todos os
experimentos consiste basicamente de uma célula com três janelas de safira
de 28mL, um transdutor de pressão e uma bomba de seringa. A lipase foi
alimentada ao reator e a temperatura estabelecida no planejamento de
experimentos foi monitorada. Em seguida, o sistema foi pressurizado e a
pressão e temperatura foram mantidas constantes pelo tempo pré-
determinado. A seguir, na taxa de descompressão pré-definida, o sistema foi
despressurizado e a atividade hidrolítica foi medida. De uma forma geral, para
as lipases livres e imobilizadas, foi observado um aumento na atividade
residual. No caso das lipases ressuspendidas, foi demonstrado que a cinética
enzimática é sensível ao tratamento com propano pressurizado, conduzindo
em alguns casos a ganhos inexpressivos e em outros a perdas significativas da
atividade enzimática.
vi
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial
fulfillment of the requirements for the Master in Food Engineering.
EVALUATION OF HYDROLYTIC ACTIVITY OF LIPASES
IN PRESSURIZED PROPANE
Luiz Paulo Gomes Franken
Março/2007
Orientadores: Débora de Oliveira
José Vladimir de Oliveira
Cláudio Dariva
Microbial lipases (E.C. 3.1.1.3) have been increasingly employed in a broad
range of applications. Its immobilization offers unique advantages in terms of
better process control, enhanced stability, enzyme-free products, etc. In
addition, the advantages of using compressed or near critical fluids over liquid
organic solvents have been a matter of intense research due to their favorable
transport properties, recovery of products or reactants and reduction in side
reactions. To conduct such reactions at high pressures, the evaluation of
enzyme behavior is of primary importance as the loss of enzyme activity may
lead to undesirable poor reaction rates. Among some interesting substances,
propane appears to be promising as alternative medium. In this sense, this work
investigates the influence of temperature (35-55
o
C), pressure (30 to 200bar),
decompression rates (2-50 bar.min
-1
) and exposure times (0.5 to 3h) on the
hydrolytic activity of three lipases (Amano PS, Amano AY30 and a lipase from
Yarrowia lipolytica) free, re-suspended and immobilized. In order to verify the
effect of process variables on the lipase activity, a semi-factorial experimental
design with two levels was employed. The equipment used in all experiments
consists basically of a 28mL view cell with three sapphire windows for visual
observations, an absolute pressure transducer and a syringe pump. The lipase
(approximately 1.0g) was fed into the cell and the temperature established in
the experimental design was reached. Afterwards, the system was pressurized
and maintained at constant temperature and pressure for a pre-established
exposure time. Then, at the decompression rates defined, the system was
depressurized and the lipase activity was measured. The residual activity was
defined as the ratio of activity at the beginning and at the end of the treatment
process. Generally, for free and immobilized lipases, it was observed an
enhancement in residual lipase activity with values as high as ~300%. In the
case of re-suspended enzyme, it is shown that enzyme kinetics is very sensitive
to treatment variables with compressed propane leading in some cases to
expressive gains and important activity losses.
vii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................iv
RESUMO ............................................................................................................v
ABSTRACT .......................................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS .........................................................................................ix
LISTA DE TABELAS .......................................................................................xii
1 INTRODUÇAO ...............................................................................................01
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .........................................................................04
2.1 Introdução .................................................................................................04
2.2 Lipases .......................................................................................................04
2.2.1. Atividade enzimática ...............................................................................05
2.2.2. Enzimas imobilizadas .............................................................................06
2.3 Enzimas em fluidos pressurizados .........................................................07
2.4 Considerações Finais ...............................................................................13
3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................14
3.1 Material.......................................................................................................14
3.2 Métodos .....................................................................................................15
3.2.1 Preparo das soluções enzimáticas para avaliação da atividade de
hidrólise em propano pressurizado ...................................................................15
3.2.2 Método para determinação da atividade de hidrólise das lipases ...........17
3.3 Processamento das lipases com propano pressurizado.......................18
3.3.1 Lipases liofilizadas e imobilizadas ...........................................................19
3.3.2 Lipases em solução (ressuspendidas) .....................................................21
3.4 Planejamento de Experimentos e Análise Estatística ...........................22
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................26
4.1 Atividade hidrolítica da lipase PS Amano em propano pressurizado .26
4.2 Atividade hidrolítica da lipase AY30 Amano em propano
pressurizado.....................................................................................................37
viii
4.3 Atividade hidrolítica da lipase de Yarrowia lipolytica em propano
pressurizado ....................................................................................................44
4.4 Considerações Finais ...............................................................................52
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES ...................................................................57
5.1. Conclusões ...............................................................................................57
5.2. Sugestões .................................................................................................58
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................59
7 ANEXOS ........................................................................................................65
Anexo I Atividade residual das lipases PS e AY30 (Amano Inc.) e de Yarrowia
lipolytica ressuspendidas em propano pressurizado em função da pressão e da
temperatura .......................................................................................................65
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 – Amostra das lipases utilizadas. (1) Lipases livres; (2) Lipases
imobilizadas; (a) Amano AY30; (b) Amano PS e (c) lipase de Yarrowia lipolytica........17
Figura 3.2 – Diagrama esquemático do aparato experimental para o tratamento das
lipases sólidas em propano pressurizado. A - reservatório de solvente; B - banho
termostático; C – bomba seringa; D – reator de aço inoxidável; E – transdutor de
pressão; F – indicador de pressão; G – válvula micrométrica.......................................19
Figura 3.3 – Fotos da unidade experimental utilizada para avaliação da atividade de
hidrólise de lipases liofilizadas e imobilizadas em propano pressurizado.....................20
Figura 3.4 – Diagrama esquemático do aparato para o tratamento de lipases
ressuspendidas em propano pressurizado. A – reservatório de solvente; B – banho
termostático; C – bomba seringa; D – transdutor e indicador de pressão; E – célula
com janela de safira de volume variável; F – janelas de safira; G – válvula para
amostragem; H – válvula micrométrica para despressurização, I - pistão...................22
Figura 3.5 – Fotos da unidade experimental utilizada para avaliação da atividade de
hidrólise de lipases ressuspendidas em propano pressurizado....................................23
Figura 4.1. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS liofilizada após
tratamento em propano pressurizado............................................................................27
Figura 4.2. Atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida em função do tempo
de exposição ao propano pressurizado.........................................................................30
Figura 4.3. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida
após tratamento por 30 minutos em propano pressurizado..........................................31
Figura 4.4. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida
após tratamento por 180 minutos em propano pressurizado........................................32
x
Figura 4.5. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS imobilizada
após tratamento em propano pressurizado...................................................................35
Figura 4.6. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano AY30 liofilizada
após tratamento em propano pressurizado...................................................................39
Figura 4.7. Atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida em função do
tempo de exposição ao propano pressurizado..............................................................40
Figura 4.8. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano AY30
ressuspendida após tratamento por 30 minutos em propano pressurizado..................41
Figura 4.9. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase
Amano AY30 ressuspendida após tratamento por 180 minutos em propano
pressurizado..................................................................................................................43
Figura 4.10. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica
liofilizada após tratamento em propano pressurizado...................................................46
Figura 4.11. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida em
função do tempo de exposição ao propano pressurizado.............................................48
Figura 4.12. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase
de Yarrowia lipolytica ressuspendida após tratamento por 30 minutos em propano....50
Figura 4.13. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase
de Yarrowia lipolytica ressuspendida após tratamento por 180 minutos em propano
pressurizado..................................................................................................................51
Figura 4.14. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
liofilizada utilizada após processamento em propano pressurizado.............................53
Figura 4.15. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
ressuspendida. Condição experimental de 35
o
C e 200bar...........................................53
xi
Figura 4.16. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
ressuspendida. Condição experimental de 55
o
C e 200bar...........................................54
Figura 4.17. Compilação dos resultados de atividade enzimática em função da lipase
ressuspendida para cada condição experimental. (a) após 30 minutos de exposição,
(b) após 180 minutos de exposição...............................................................................55
Figura 4.18. Compilação dos resultados de atividade enzimática em função da forma
de apresentação (imobilizada e liofilizada) da lipase Amano
PS..................................................................................................................................56
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 – Preparo das soluções enzimáticas para avaliação da atividade de
hidrólise em propano pressurizado...............................................................................17
Tabela 3.2 – Intervalo de estudo das variáveis para os sistemas contendo lipases
liofilizadas e imobilizadas e propano pressurizado.......................................................24
Tabela 3.3 – Intervalo de estudo das variáveis para os sistemas contendo lipases
ressuspendidas e propano pressurizado.......................................................................24
Tabela 3.4 – Matriz experimental (planejamento fatorial saturado) empregada no
estudo da atividade das lipases liofilizadas e imobilizadas em propano pressurizado.24
Tabela 3.5 – Matriz experimental (planejamento fatorial completo) empregada no
estudo da atividade das lipases ressuspendidas em propano pressurizado................25
Tabela 4.1. Atividade residual da lipase Amano PS liofilizada após tratamento com
propano pressurizado....................................................................................................27
Tabela 4.2. Atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida após tratamento
com propano pressurizado em função do tempo de processamento............................30
Tabela 4.3. Atividade residual da lipase Amano PS imobilizada após tratamento com
propano pressurizado....................................................................................................34
Tabela 4.4. Atividade residual da lipase Amano AY30 liofilizada após tratamento com
propano pressurizado....................................................................................................38
Tabela 4.5. Atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida após tratamento
com propano pressurizado em função do tempo de processamento............................40
Tabela 4.6. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura e
da pressão para a lipase Amano AY30 após 180 minutos de processamento em
propano pressurizado....................................................................................................42
xiii
Tabela 4.7. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica liofilizada após
tratamento com propano pressurizado..........................................................................45
Tabela 4.8. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida após
tratamento com propano pressurizado em função do tempo de processamento.........47
Tabela 4.9. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura e
da pressão para a lipase de Yarrowia lipolytica após 30 minutos de processamento em
propano pressurizado....................................................................................................49
Tabela 4.10. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura
e da pressão para a lipase de Yarrowia lipolytica após 180 minutos de processamento
em propano pressurizado..............................................................................................49
Capítulo 1 - Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
A descoberta das enzimas data do século XVIII, quando se iniciaram os
estudos sobre a digestão dos alimentos. Estas têm como uma das
características principais a alta seletividade, o que permite seu uso em diversas
áreas, como na medicina, na tecnologia de alimentos, na produção de
fármacos, emulsificantes e biodiesel (LEHNINGER, 1995). Considerando as
propriedades particulares das enzimas, o uso destas em síntese orgânica tem
recebido muita atenção nos últimos anos (BEVILAQUA et al., 2004; TORRE et
al., 2006; CHUA e SARMIDI, 2006; MARIA et al., 2006).
Dentre os processos enzimáticos empregados atualmente, cerca de 95%
dos mesmos utilizam hidrolases (proteases, carbohidrolases e lipases), sendo
que 5-10% cabem às lipases (GANDHI, 1997). Lipases (triacylglycerol
acylhydrolases, EC 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de
triglicerídeos e a síntese de ésteres formados a partir de glicerol e ácidos
graxos de cadeia longa. As lipases são amplamente encontradas na natureza
em animais, vegetais e microrganismos. Estas enzimas apresentam grande
versatilidade de propriedades, tais como resistência ao pH, termoestabilidade,
resistência a solventes orgânicos, especificidade, regioseletividade e
estereosseletividade (SHARMA et al., 2001).
Em geral, a utilização de lipases como biocatalisadores é acompanhada
do emprego de solventes orgânicos líquidos para melhorar a estabilidade da
mesma e permitir o adequado contato entre os substratos e o(s) centro(s)
ativo(s) da enzima. Neste sentido, esforços consideráveis têm sido
apresentados na literatura no sentido da realização de reações utilizando
tecnologias limpas conduzidas em fluidos sub e supercríticos (KNEZ e
HABULIN, 1998; KUMAR et al., 2004; OLIVEIRA e OLIVEIRA, 2000). O uso de
fluidos comprimidos como solventes para reações químicas pode ser uma rota
promissora no sentido de eliminar traços de solvente dos produtos reacionais.
Adicionalmente, processos industriais em condições próximas ao ponto crítico
podem ser vantajosos em termos do consumo de energia, facilidade de
recuperação do produto e minimização da formação de produtos secundários.
O dióxido de carbono supercrítico possui características especiais tais como
Capítulo 1 - Introdução
2
baixa toxicidade, temperaturas de trabalho compatíveis com o uso de enzimas
e propriedades de transporte que podem acelerar taxas de reação limitadas
difusionalmente (KNEZ e HABULIN, 1998).
Comparado a outros gases, o dióxido de carbono tem sido largamente
estudado como meio solvente para reações enzimáticas. Contudo, várias
desvantagens na utilização deste fluido podem estar relacionadas à não
polaridade deste, o que implica em problemas de dissolução de compostos
hidrofóbicos e hidrofílicos. Além disso, as características hidrofílicas do dióxido
de carbono podem afetar negativamente a atividade de enzimas (NAKAYA et
al., 2001).
No entanto, o dióxido de carbono não é o único gás cujas propriedades
possam ser adequadas à biocatálise. Por exemplo, a comparável constante
dielétrica entre o propano e o dióxido de carbono (HABULIN e KNEZ, 2001) e o
fato de que pressões de transição muito mais elevadas são geralmente
encontradas em sistemas formados por compostos de alta massa molar
(triglicerídeos, por exemplo) quando comparados ao uso do propano (LANZA et
al., 2005; NDIAYE et al., 2006) suportam um firme propósito de que o propano
possa ser também compatível como meio para reações catalisadas por
enzimas.
Visando a realização de reações enzimáticas a altas pressões, de
fundamental importância é a avaliação do comportamento das enzimas nestes
fluidos, uma vez que a perda de atividade pode levar a baixas taxas de reação
e formação de produtos secundários (KASCHE et al., 1988). De fato, a
estabilidade e atividade enzimáticas podem depender da enzima, das
características do solvente, do conteúdo de água da enzima/suporte/meio
reacional e das variáveis de processo envolvidas, significando que diferentes
efeitos podem ser obtidos dependendo das características do sistema sob
investigação.
Com base em alguns resultados da literatura (TANIGUCHI et al., 1987;
TEDJO et al., 2000; CHEN et al., 1992; ISHIKAWA et al., 1996; OLIVEIRA et
al., 2006a e 2006b; GIEAUF e GAMSE, 2000; FRICKS et al., 2006), que
revelam que algumas enzimas aumentam suas atividades e outras
diminuem/perdem suas atividades após tratamento com fluidos comprimidos, o
uso destes solventes pode ser uma alternativa interessante não somente para
Capítulo 1 - Introdução
3
conduzir reações enzimáticas, mas também aumentar a atividade dos sistemas
enzimáticos ou inativar/reduzir sua atividade. Uma breve investigação da
literatura revela que, enquanto existe uma quantidade de dados relativamente
grande relacionada à atividade e estabilidade de enzimas em dióxido de
carbono, existe uma lacuna correspondente à informação experimental para
outros solventes comprimidos, tais como propano.
Neste contexto, com base na literatura relacionada ao potencial de
aplicação de lipases em reações de interesse, nas propriedades indesejáveis
dos solventes orgânicos, nas pressões de transição relativamente elevadas
quando da utilização de dióxido de carbono supercrítico como solvente, surgiu
o interesse em investigar o comportamento da atividade de hidrólise de lipases
em propano pressurizado. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo
geral avaliar o efeito do processamento a alta pressão (propano pressurizado)
sobre a atividade de lipases (livres - liofilizadas e ressuspendidas - e
imobilizadas) comerciais e não comerciais. Como objetivos específicos avaliou-
se a influência das variáveis temperatura, tempo de exposição, taxa de
despressurização e pressão na atividade de hidrólise de duas lipases
comerciais (Amano AY30 e Amano PS) e uma não comercial obtida por
fermentação submersa de Yarrowia lipolytica, submetidas ao tratamento com
propano pressurizado. Os resultados desta avaliação poderão se constituir em
importante contribuição à utilização destes biocatalisadores na realização de
reações de interesse na área de fármacos e alimentos, principalmente.
O presente trabalho encontra-se organizado da seguinte forma: o
Capítulo 2 aborda uma revisão sucinta a respeito do tema investigado neste
projeto de pesquisa. No Capítulo 3 são apresentados os materiais e os
métodos empregados na presente investigação, bem como a metodologia
adotada para obtenção das informações experimentais pertinentes. O Capítulo
4 apresenta os resultados obtidos e discussão dos mesmos à luz do cenário
disponível na literatura. Por fim, o Capítulo 5 explicita as conclusões referentes
à execução de todo o projeto bem como sugere certos aspectos passíveis de
investigação mais acurada e novas frentes no campo em questão.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
No capítulo a seguir será apresentada uma breve revisão sobre o estado
da arte no qual este trabalho está inserido, procurando evidenciar a relevância
do tema sob investigação para a literatura científica. No transcorrer deste, será
realizada primeiramente uma explanação sobre enzimas e suas características.
A seguir, especial atenção será dada ao comportamento e variáveis que
influem na atividade de enzimas em fluidos pressurizados, foco deste estudo.
2.1. Introdução
Um crescente interesse na modificação de óleos e gorduras tem sido
verificado nos últimos anos. Esta tendência pode ser principalmente atribuída
ao fato de que os oleoquímicos (substâncias derivadas das gorduras e dos
óleos naturais) são obtidos de fontes renováveis, podendo, portanto, ser
produzidos em muitos países e ser alternativa para geração de renda e
desenvolvimento sustentável. Além disso, a crescente disponibilidade de óleos
e gorduras nos países desenvolvidos tem estimulado tanto a pesquisa
fundamental quanto a aplicada, na direção da produção de produtos
alternativos de alto valor agregado derivados de lipídios (MALCATA et al.,
1990). Entre os processos mais promissores para modificação de lipídios
podem ser citadas as reações de hidrólise e a síntese de ésteres na presença
de catalisadores químicos (ácidos e bases) ou enzimáticos (KAUFMAN e
RUEBUSCH, 1990).
2.2. Lipases
As lipases são comumente encontradas na natureza, podendo ser
obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Antigamente, elas
eram predominantemente obtidas a partir do pâncreas de animais e usadas
como auxiliar digestivo para consumo humano (FROST e MOSS, 1987).
Atualmente, as lipases são produzidas, preferencialmente, a partir de
microrganismos devido às facilidades de controle e de aumento da capacidade
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
5
produtiva dos processos fermentativos, além da redução do seu custo de
obtenção. As lipases provenientes de microrganismos são as mais utilizadas
industrialmente uma vez que além das vantagens supracitadas, são,
geralmente mais estáveis e com propriedades bem mais diversificadas que as
lipases de outras fontes (CARVALHO et al., 2003). Em geral, os
microrganismos mais utilizados para produção de lipases são fungos dos
gêneros Rhizopus, Aspergillus, Geotrichum e Mucor.
Lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster
hidrolases E.C.3.1.1.3) e atuam sobre a ligação éster de vários compostos,
sendo os acilgliceróis seus melhores substratos (MACRAE e HAMMOND,
1985). Apresentam peso molecular entre 20.000-60.000 daltons. São
glicoproteínas, na qual a parte glicosilada hidrofóbica circunda o sítio ativo.
Estas enzimas são usualmente estáveis em soluções aquosas neutras à
temperatura ambiente. A maioria das lipases apresenta sua atividade ótima na
faixa de temperatura de 30 a 40
o
C. Sua termoestabilidade varia
consideravelmente em função da origem, sendo as lipases microbianas as que
possuem maior estabilidade térmica (MACRAE e HAMMOND, 1985).
2.2.1. Atividade enzimática
Segundo SCRIBAN (1985), a atividade das enzimas é função direta da
sua estrutura terciária ou quaternária. Nessas condições, todo tratamento que
modifique a conformação da enzima (aquecimento, modificação do pH,
pressão), dificultando ou impedindo a fixação do substrato na enzima ou ainda
modificando a estrutura do sítio ativo, alterará as propriedades catalíticas da
enzima e, portanto, o seu funcionamento. Existe uma zona de temperatura, às
vezes estreita, para a qual atividade enzimática é máxima. Essa variação da
atividade enzimática em função da temperatura é determinada em condições
de operação bem definidas. De fato, a variação da atividade enzimática resulta
de dois efeitos antagônicos: de um lado, o aumento da agitação das moléculas
com a elevação da temperatura, que aumenta a freqüência das colisões entre o
substrato e a enzima; de outro, a desnaturação da proteína enzimática. Esta
desnaturação vai modificar a estrutura terciária e a quaternária da proteína
globular e fazer, portanto, a enzima passar de uma conformação ativa a uma
conformação desprovida de atividade.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
6
Cabe neste ponto salientar a especificidade que as lipases podem
apresentar pelo substrato, podendo catalisar reações em meio aquoso
(atividade de hidrólise) e em meio não aquoso (atividade de esterificação). A
reação de hidrólise envolve ataque na ligação éster do triglicerídeo na
presença de moléculas de água para produzir glicerol e ácidos graxos. A alta
especificidade das lipases pelo triglicerídeo com relação ao tipo e a posição
estereoespecífica do resíduo de ácido graxo propicia um grande número de
aplicações dentro da área de alimentos. Aromatizantes para uso em alimentos
destinados ao consumo humano e animal têm sido obtidos através da hidrólise
parcial de triglicerídeos (MALCATA et al., 1990).
2.2.2. Enzimas imobilizadas
Uma das grandes vantagens da catálise em meio não aquoso é que as
enzimas são insolúveis em praticamente todos os solventes orgânicos e/ou
fluidos pressurizados. Contudo, quando enzimas livres estão suspensas em
solventes não aquosos, elas tendem a agregar-se e prendem-se às paredes do
reator, principalmente quando água é adicionada a este sistema como
substrato ou para aumentar a atividade enzimática. Este problema pode ser
minimizado através da imobilização de enzimas em suportes sólidos. A
imobilização da enzima pode também minimizar o efeito desnaturante de
muitos destes solventes sobre a estrutura da proteína (ILLANES, 1994).
A imobilização geralmente aumenta a estabilidade térmica e química da
lipase, podendo aumentar a resistência aos efeitos desnaturantes de vários
solventes, permitindo um melhor controle do processo e da qualidade do
produto (MALCATA et al., 1990). Estas vantagens, além da possibilidade de
reutilização do biocatalisador ao final do processo, têm determinado estudos
envolvendo lipases imobilizadas.
No entanto, aliado ao custo da etapa de imobilização destas enzimas, tal
processo também adiciona uma limitação adicional de transferência de massa,
fazendo com que o contato dos substratos com os sítios ativos das enzimas
sejam mais limitados do que quando a enzima se encontra na sua forma livre
em suspensão. Neste sentido, alguns trabalhos na literatura apontam para o
emprego de solventes alternativos, como os fluidos pressurizados em
condições próximas ao ponto crítico, com vistas ao aumento das taxas de
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
7
transferência de massa da reação e considerando também as propriedades
peculiares de tais fluidos no que tange à facilidade da separação de
produtos/substratos, faixas operacionais e vantagens ambientais do emprego
de tais fluidos. A próxima seção apresenta uma breve discussão sobre o
emprego de enzimas em sistemas com fluidos pressurizados.
2.3. Enzimas em Fluidos pressurizados
A concepção de fluido supercrítico faz referência a um estado da matéria
em que o composto se comporta como fluido, pois apresenta propriedades
intermediárias entre a de um gás e de um líquido e também se refere ao fato de
uma substância se encontrar em uma condição de temperatura e pressão
acima dos valores críticos. No ponto crítico, as fases gasosa e líquida tornam-
se idênticas, isto é, só uma fase existe (ALMEIDA FILHO, 2003).
A combinação das propriedades das fases líquida e vapor, característica
do estado supercrítico, ocorre de uma forma extremamente vantajosa para a
utilização dos fluidos supercríticos (FSC) como solventes. Os FSC possuem
densidades próximas a dos líquidos, o que fortalece as suas propriedades de
solvente. Por outro lado, a viscosidade, a difusividade e a tensão superficial
apresentam valores próximos aos do estado gasoso, o que torna as
propriedades de transporte bastante favoráveis ao processo. Todas estas
propriedades singulares fazem dos FSC meios bastante interessantes para
reações químicas (OLIVEIRA, 1999).
A catálise enzimática em fluidos pressurizados apresenta interesse
particular para as indústrias farmacêuticas e de alimentos, principalmente
devido à facilidade de recuperação dos produtos, livres de solventes, ao final
do processo. É importante salientar que em geral o solvente pode afetar
fortemente a atividade da enzima através de sua interação com o suporte, no
caso de enzimas imobilizadas, ou mesmo com radicais da própria enzima.
Neste contexto, como etapa anterior à utilização de enzimas como
catalisadores de reações em fluidos supercríticos, de fundamental importância
é a avaliação de seu comportamento nestes solventes alternativos aos
orgânicos convencionais (FEIHRMANN, 2005; PRIMO, 2006).
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
8
Como trabalhos pioneiros nesta área, podem ser citados os estudos de
RANDOLPH et al. (1988); HAMMOND et al. (1985) e NAKAMURA et al. (1985),
que a partir de 1985 começaram a estudar a atividade e estabilidade de
enzimas em meio supercrítico. O que motivou a realização destes trabalhos foi
o fato de que as enzimas podem reter sua atividade e estabilidade em meios
não aquosos. Conseqüentemente, elas podem ser usadas para catalisar
reações em solventes orgânicos e outros meios não convencionais.
Os fluidos supercríticos começaram então a ser examinados como meio
potencial para a catálise enzimática. O uso de solventes não aquosos para
reações enzimáticas é atrativo por várias razões. Uma enzima em um solvente
não aquoso pode possuir interações solvente/enzima similares àquelas de seu
meio nativo e, então, mostrar atividade maior quando comparada à água pura.
Os substratos podem, também, ser mais solúveis em um solvente não aquoso,
fazendo com que as taxas de reação sejam maiores neste tipo de solvente.
Com base nestes aspectos, os fluidos supercríticos começaram a ser
considerados como meio potencial para catálise enzimática (OLIVEIRA, 1999).
Visando a realização de reações enzimáticas a altas pressões,
primeiramente, é necessário conhecer as variáveis que podem afetar a catálise
enzimática em fluidos pressurizados.
Pressão:
Uma pequena mudança na pressão é observada por uma mudança
drástica na densidade nas proximidades do ponto crítico de uma substância,
desta forma alterando as propriedades físico-químicas de um fluido supercrítico
(Mc HUGH e KRUKONIS, 1998). Desde que as propriedades do solvente
podem modular as propriedades da enzima suspensa neste, o efeito da
pressão em reações de catálise enzimática em fluidos supercríticos é uma área
potencial para o desenvolvimento de pesquisas.
Água:
Solventes mais hidrofílicos apresentam uma tendência maior em retirar a
água essencial para molécula da enzima. Este princípio pode também ser
aplicado a sistemas envolvendo fluidos supercríticos. Geralmente, a atividade
enzimática aumenta com o aumento do conteúdo de água adicionado ao fluido
supercrítico, até que a mesma atinja um máximo. Além disso, acima do
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
9
conteúdo ótimo de água, as suspensões das enzimas formam agregados,
resultando em uma redução do contato enzima-substrato, reduzindo assim, a
eficiência da enzima. Pode-se, com base nas informações da literatura, concluir
que o tipo de reação e o meio reacional são também importantes na
determinação da dependência da atividade enzimática com o conteúdo de
água (OLIVEIRA e OLIVEIRA, 2000 e 2001).
Enzimas são inativas na completa ausência de água, mas a quantidade
de água necessária para uma enzima ser cataliticamente ativa é
surpreendentemente baixa (ZAKS e KLIBANOV, 1985). Em sistemas não
aquosos, o teor de água necessário para manter uma enzima na forma
cataliticamente ativa é geralmente equivalente a uma monocamada por
molécula de enzima. Estas moléculas essenciais de água são ligadas por
interações não-covalentes que mantêm a estrutura nativa da proteína. Se as
moléculas de água em volta da enzima são perturbadas, a enzima geralmente
perde sua atividade.
Geralmente, a atividade enzimática aumenta com o aumento do
conteúdo de água adicionado ao fluido supercrítico até um determinado limite.
Quando o conteúdo de água excede o nível ótimo em reações de
transesterificação, as reações de hidrólise tornam-se predominantes e a taxa
da reação desejada cai. Neste sentido, existem duas maneiras de manter a
hidratação da enzima em meio não aquoso. Água pode ser adicionada
diretamente ao sistema reacional ou, alternativamente, sais hidratados podem
ser adicionados como uma fonte indireta. De acordo com HALLING (1990), em
meio não aquoso, a concentração de água é o parâmetro chave a ser
considerado.
A adição de água a preparações enzimáticas sólidas pode aumentar a
atividade enzimática através do aumento da polaridade e da flexibilidade do
sítio ativo da enzima. No entanto, excesso de água facilita a agregação da
enzima e pode provocar um decréscimo de sua atividade (YANG e RUSSEL,
1996).
As propriedades físico-químicas exibidas por uma enzima estão
relacionadas direta ou indiretamente ao papel da água nas interações não
covalentes (eletrostáticas, pontes de hidrogênio, van der Waals e hidrofóbicas),
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
10
as quais ajudam a manter a conformação cataliticamente ativa da enzima
(ILLANES, 1994).
A hidratação dos grupos carregados e polares das moléculas da enzima
parece ser um pré-requisito para a catálise enzimática. É possível que, na
ausência de água, esses grupos interajam produzindo uma conformação
estrutural inativa. A função da água na manutenção da atividade enzimática em
meio não aquoso parece estar relacionada com a sua capacidade de formar
ligações de hidrogênio com esses grupos funcionais protegendo, portanto,
dieletricamente as interações eletrostáticas entre os grupos ionizados e
neutralizando as interações dipolo-dipolo entre unidades peptídicas e grupos
vizinhos polares da proteína (LANGONE, 1998).
A remoção de água ligada à proteína aumenta a força das ligações de
hidrogênio intramoleculares e das pontes salinas, que estabilizam as proteínas
nas suas conformações originais, conferindo-lhes rigidez estrutural. A
desnaturação das enzimas através do calor requer ampla mobilidade
conformacional, o que envolve água livre. Além disso, a eliminação da água do
sistema dificulta a ocorrência de um número de reações químicas indesejáveis,
as quais são promovidas através do aumento da temperatura, tais como,
reações de hidrólise, de oxidação, de isomerização, entre outras, que
promovem a inativação da proteína em soluções aquosas (YANG e RUSSEL,
1996).
Solvente:
A atividade enzimática depende do tipo de fluido utilizado provavelmente
como resultado de diferentes interações proteína-solvente. As interações
proteína-meio pressurizado que podem afetar a atividade enzimática incluem a
partição do substrato, produto e água entre a enzima e o solvente, e interações
diretas entre o fluido e a enzima, as quais podem inibir ou inativar a enzima por
quebra das ligações hidrogênio, iônica e hidrofóbica. A partição do substrato
entre o sítio ativo e o solvente depende da hidrofobicidade do solvente e da
enzima. Os solventes menos nocivos às enzimas são aqueles mais
hidrofóbicos, pois interagem menos com a água necessária para o
funcionamento da enzima. Solventes hidrofílicos, ou seja, solventes que
contêm maior quantidade de grupos polares ou centros capazes de formar
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
11
pontes de hidrogênio, tendem a retirar a água essencial das proximidades da
enzima, acarretando a perda da atividade enzimática (KNEZ e HABULIN,
2001).
Os critérios para determinação da hidrofobicidade de um solvente estão
sujeitos a controvérsias. Um dos mais importantes indicadores de
hidrofobicidade é a constante dielétrica (ILLANES, 1994). A constante dielétrica
do solvente é responsável pelas interações específicas entre a enzima e o
solvente. Admite-se que a diminuição da constante dielétrica do solvente
permite o aumento das interações eletrostáticas entre os resíduos ionizáveis da
molécula de enzima, o que pode causar uma redução da flexibilidade interna
da proteína. Considerando que a mobilidade molecular é essencial para a
atividade catalítica da enzima, uma redução na sua flexibilidade é normalmente
acompanhada por uma diminuição da atividade enzimática. A modificação do
valor da constante dielétrica também altera o valor de pKa dos resíduos
ionizáveis da superfície da proteína. Se essa modificação ocorrer no sítio ativo
ou próximo a ele, pode haver a alteração da ligação e/ou da conversão dos
substratos e, quando a mudança na constante dielétrica é drástica, a estrutura
tridimensional da enzima pode ser afetada (MONOT, 1994).
Temperatura:
A maioria das enzimas possui atividade bastante específica, capaz de
catalisar só uma determinada reação e de fazê-la só em um tipo de meio ou
substrato. Algumas enzimas são mais versáteis. Entretanto, todas as enzimas
operam dentro de um limite estreito de temperatura e pH (COX, 1987). Grande
parte das enzimas apresenta sua atividade ótima em uma faixa de 30 a 40
o
C,
sendo que acima de 45
o
C pode ocorrer início da desnaturação (FENNEMA,
1993). Enquanto algumas enzimas perdem sua atividade catalítica a baixas
temperaturas, outras suportam, ao menos durante um curto período de tempo,
um intenso tratamento térmico (BELITZ e GROSCH, 1997).
Com base no conhecimento destes fatores, de fundamental importância
é a avaliação do comportamento da atividade enzimática do catalisador de
interesse no fluido pressurizado a ser empregado. Tal aspecto encerra
prioridade como etapa anterior à consecução de reações neste meio
alternativo, uma vez que resultados antagônicos podem ser encontrados na
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
12
literatura, principalmente em função do biocatalisador. De fato, a estabilidade e
atividade enzimáticas podem depender da enzima, das características do fluido
comprimido, do conteúdo de água da enzima/suporte/meio reacional e das
variáveis de processo envolvidas, significando que diferentes efeitos podem ser
obtidos dependendo das características do sistema sob investigação.
Por exemplo, com relação ao tratamento de enzimas em CO
2
comprimido, alguns trabalhos apresentados na literatura indicam que a
atividade de α-amilase, glicose oxidase, lipase e catalase tratadas com CO
2
supercrítico (SCCO
2
) mantêm acima de 90% de sua atividade inicial
(TANIGUCHI et al., 1987). Por outro lado, total inativação da lipoxigenase e
peroxidase foi obtida no tratamento com SCCO
2
de soluções não tamponadas
(TEDJO et al., 2000). A atividade de polifenol oxidases (PPOs) foi reduzida
significativamente após processamento com SCCO
2
(CHEN et al., 1992).
ISHIKAWA et al. (1996) reportaram que várias enzimas, tais como lipases,
proteases alcalinas e glicoamilases, foram inativadas e suas estruturas de α-
hélice foram decompostas após tratamento com SCCO
2
. OLIVEIRA et al.
(2006a e 2006b) reportaram que lipases imobilizadas apresentaram pequenas
perdas de atividade no processamento com dióxido de carbono comprimido.
Por outro lado, GIEAUF e GAMSE
(2000) reportaram um aumento na
atividade lipásica acima de 860% após tratamento com SCCO
2
comparado às
enzimas não processadas. FRICKS et al. (2006) encontraram que a atividade
residual de peroxidase de rabanete pode ser aumentada ou reduzida
dependendo da condição de processamento em CO
2
.
Especificamente, para o presente trabalho é de particular interesse os
estudos realizados por OLIVEIRA e colaboradores (2006a,b), os quais
avaliaram a atividade de esterificação de lipases imobilizadas (Lipozyme IM,
Novozym 435 e lipase de Yarrowia lipolytica) em fluidos pressurizados: dióxido
de carbono (70 a 275 bar), propano (30-250 bar) e n-butano (10-250 bar). No
processamento com CO
2,
as três lipases perderam atividade em todas as
condições experimentais avaliadas. Para o processamento com propano, as
lipases Lipozyme IM e Yarrowia lipolytica apresentaram perda na atividade,
enquanto que a Novozym 435 apresentou um aumento na atividade em todas
as condições experimentais estudadas. O processamento em n-butano
apresentou os mesmos resultados apontados no processamento com propano.
Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica
13
Em estudos de processamento hidrostático, um dos poucos trabalhos
apresentados na literatura referente à avaliação da atividade de enzimas
ressuspendidas, realizado por SEYDERHELM et al. (1996), avaliou o efeito da
alta pressão sobre algumas enzimas em tampão fosfato, sendo que a
sensibilidade à pressão em ordem ascendente foi: lipoxigenase,
lactoperoxidase, pectinesterase, lipase, fosfatase, catalase, polifenoloxidase e
peroxidase. Os autores observaram também que o aumento da temperatura
induziu a uma maior inativação dessas enzimas.
2.4. Considerações Finais
Tendo como base os aspectos apresentados no decorrer deste capítulo
no que se refere ao potencial de aplicação de lipases em fluidos pressurizados
para reações de interesse industrial, pôde-se verificar que, para este
biocatalisador em específico, poucos trabalhos concernentes ao
comportamento desta enzima em fluidos pressurizados (mais especificamente,
propano) estão disponíveis na literatura. Levando em consideração este fato e
o grande interesse na realização de reações de hidrólise enzimática para
produção de compostos de alto valor agregado (fármacos obtidos por
resolução enzimática de misturas racêmicas, por exemplo), configurou-se a
proposta deste trabalho, que tem como principal objetivo avaliar o
comportamento da atividade hidrolítica de três lipases, duas comerciais
(Amano PS e Amano AY30) e uma não comercial (obtida por fermentação
submersa de Yarrowia lipolytica) em propano pressurizado, visando
estabelecer faixas de operação – temperatura, pressão, taxa de
despressurização e tempo de exposição - para utilização destas como
catalisadores em reações de hidrólise de interesse. Outro aspecto importante
que o presente trabalho vem a contribuir é na avaliação da atividade das
lipases nas formas livre (liofilizada e ressuspendida em solução tampão) e
imobilizada, aspecto este ainda não explorado na literatura relacionada a
lipases.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
No presente capítulo serão listados os materiais e métodos utilizados
para avaliar o efeito do processamento com propano pressurizado na atividade
de lipases (livres – liofilizadas e ressuspendidas - e imobilizadas) comerciais e
não comerciais.
3.1 Material
Foram utilizados os seguintes reagentes na etapa de determinação da
atividade de hidrólise das lipases: goma arábica (Synth), tampão fosfato de
sódio (Synth), acetona (99,5% de pureza - Quimex), álcool etílico comercial
(95% de pureza - Quimex), hidróxido de sódio (Quimex) e óleo de oliva
(Arisco).
O solvente utilizado foi o propano (99,5% de pureza em fase líquida)
procedente da AGA. As propriedades críticas do solvente (massa molar
44,09g/gmol) são: pressão crítica 72,5bar; temperatura crítica 96,7
o
C e
densidade crítica 0,22g/cm
3
(REID et al., 1987).
Duas lipases comerciais (Amano Inc.) e uma não comercial (gentilmente
cedida pelo Laboratório de Biotecnologia Microbiana do Instituto de Química da
UFRJ/RJ) na forma granulada livre (lipases liofilizadas) foram utilizadas na
realização deste trabalho. As características específicas das três lipases
liofilizadas são apresentadas a seguir:
a) Amano AY30: Lipase obtida por fermentação submersa de Candida rugosa,
não possui atuação específica em nenhuma posição do triglicerídeo e
apresenta temperatura ótima de operação em torno de 60
o
C.
b) Amano PS: Lipase obtida por fermentação submersa de Burkholderia
cepacia, não atua especificamente em nenhuma posição do triglicerídeo e
apresenta faixa ótima de temperatura entre 50 e 60
o
C.
c) Yarrowia lipolytica: Obtida por fermentação submersa de Yarrowia lipolytica
em meio constituído (m/v) de 1% de glicose, 3% de extrato de soro de leite,
0,8% de sulfato de sódio, 1% de xarope de milho e 0,5% de óleo de oliva. Após
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
15
30 horas de fermentação, o meio de cultura foi centrifugado e o sobrenadante
seco por liofilização. Esta lipase apresenta temperatura ótima em torno de 40
o
C
e estudos acerca da especificidade em relação à posição do triglicerídio ainda
não foram realizados.
3.2 Métodos
3.2.1 Preparo das soluções enzimáticas para avaliação da atividade de
hidrólise em propano pressurizado
Esta seção tem por objetivo descrever o preparo das soluções
enzimáticas (lipase livre liofilizada, lipase livre ressuspendida e lipase
imobilizada) para posterior avaliação da atividade em propano pressurizado.
a. Lipases liofilizadas: Para a realização do tratamento com propano
pressurizado utilizando as lipases livres liofilizadas, 0,5g da amostra foram
submetidas às condições definidas no planejamento experimental. Para a
avaliação da atividade hidrolítica antes e após o processamento, 0,1g desta
amostra foi solubilizada em 10mL de tampão fosfato pH 7,0. Desta solução,
1mL foi retirado para determinação da atividade enzimática, cujo procedimento
será descrito posteriormente.
b. Lipases ressuspendidas: Na avaliação da atividade de hidrólise para as
lipases livres na forma ressuspendida, foram preparadas soluções em
diferentes concentrações, das quais era retirado 1mL para determinação da
atividade enzimática. As concentrações utilizadas para cada enzima, definidas
em função da atividade hidrolítica inicial, foram: Amano PS e Amano AY30 –
0,083% (m/v) e lipase de Yarrowia lipolytica – 2% (m/v). Aproximadamente 5mL
destas soluções foram submetidas ao tratamento com propano pressurizado
nas condições definidas no planejamento de experimentos.
c. Lipases imobilizadas: As três lipases utilizadas no desenvolvimento deste
trabalho foram imobilizadas por adsorção no suporte polimérico comercial
Accurel EP100. A metodologia empregada, detalhada no trabalho de OLIVEIRA
et al. (2006), consiste basicamente em embeber o suporte (1,0g) em etanol
(10mL) por 30 minutos, posteriormente em 10mL de uma solução etanol-água
(1:1) e após 10 minutos esta solução é substituída por água destilada, que é
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
16
removida em seguida após a sedimentação do material. O objetivo deste
procedimento foi o deslocamento do ar existente nos interstícios do suporte
para permitir o acesso de soluções contendo a enzima. Aos suportes
previamente preparados adicionou-se 50mL de uma solução enzimática
contendo 3g de enzima, a qual foi mantida sob agitação magnética em
temperatura de 5ºC (banho de gelo) por 2 horas. Depois de decorrido este
tempo, procedeu-se a filtração e lavagem dos sólidos com água destilada para
remoção da enzima não-aderida. Em seguida, o biocatalisador foi seco em
dessecador sob vácuo, por dois dias. As lipases imobilizadas por este
procedimento foram armazenadas em geladeira até o momento da medida da
atividade de hidrólise, para a qual foram utilizadas 0,1g de enzima imobilizada
em cada análise.
A Tabela 3.1 apresenta uma compilação acerca das informações para o
preparo de cada solução enzimática.
Tabela 3.1 – Preparo das soluções enzimáticas para avaliação da atividade de
hidrólise em propano pressurizado.
Lipase/Forma Livre Ressuspendida Imobilizada
Amano PS Solução 0,083%
(m/v) em tampão
1mL de amostra
Amano AY30 Solução 0,083%
(m/v) em tampão
1mL de amostra
Yarrowia lipolytica
0,1g em 10mL de
tampão
1mL da amostra
Solução 2% (m/v)
em tampão
2mL de amostra
0,1g de enzima
A Figura 3.1 apresenta as três lipases utilizadas nas formas livre e
imobilizada.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
17
(a) (b) (c)
(a) (b) (c)
Figura 3.1 – Amostra das lipases utilizadas. (1) Lipases livres; (2) Lipases
imobilizadas; (a) Amano AY30; (b) Amano PS e (c) lipase de Yarrowia lipolytica.
3.2.2 Método para determinação da atividade de hidrólise das lipases
Utilizou-se como substrato para dosagens da atividade lipásica, óleo de
oliva (5%m/v) emulsificado por três minutos com goma arábica (10%m/v) em
tampão fosfato de sódio 100mM pH 7,0. A 19mL desta emulsão contidos em
erlenmeyers de 125mL, foram adicionados 1mL (enzimas livres liofilizadas ou
ressuspendida) ou 0,1g (lipase imobilizada) dos preparados enzimáticos. Após
incubação por 15 minutos à 37ºC e 150rpm, a reação foi interrompida e os
ácidos graxos extraídos pela adição de 20mL de uma solução de
acetona/etanol (1:1v/v). Os ácidos graxos foram, então, titulados com uma
solução de NaOH (0,05N) até pH 11.
Os brancos reacionais, sem adição da enzima, foram preparados
procedendo-se à incubação em agitador orbital e adicionando-se
imediatamente acetona/etanol, fazendo-se após, a titulação. As dosagens de
atividade foram feitas em duplicata e a média aritmética dos valores
encontrados foi utilizada para o cálculo da atividade lipásica.
(1)
(2)
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
18
Uma unidade de atividade lipásica foi definida como a quantidade de
enzima que libera 1mmol de ácido graxo por minuto nas condições descritas
acima que pode ser determinada através das Equações 3.1 (para lipases
imobilizadas) e 3.2 (para lipases liofilizadas e ressuspendidas) (LEAL, 2000).
m
t
NVbVa
gUA
.
10.).(
)/(
3
−
=
(3.1)
Vc
t
NVbVa
mLUA
.
10.).(
)/(
3
−
=
(3.2)
Onde:
A = Atividade enzimática;
Va = Volume da amostra titulada (mL);
Vb = Volume do branco titulado (mL);
Vc = Volume da amostra usada na reação (mL);
m = Massa de amostra usada na reação (g);
t = Tempo de reação (minutos);
N = Normalidade da solução de NaOH.
Após o processamento em propano pressurizado, nas condições pré-
estabelecidas no planejamento experimental, foi calculada a atividade residual,
de acordo com a Equação 3.3.
100.(%)
ãopresurizaçdaantesAtividade
çãopressurizaapósAtividade
residualAtividade =
(3.3)
3.3 Processamento das Lipases com Propano Pressurizado
O procedimento experimental utilizado para avaliação do comportamento
da atividade hidrolítica de lipases em propano pressurizado será relatado
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
19
conforme a forma de apresentação das enzimas: sólida (lipases liofilizadas e
imobilizadas) e em solução (lipases ressuspendidas).
3.3.1 Lipases liofilizadas e imobilizadas
Os experimentos envolvendo os extratos enzimáticos liofilizados ou
imobilizados foram realizados em uma unidade laboratorial similar à
empregada por FRICKS et al. (2006), a qual consiste basicamente de um
reservatório de solvente (propano), dois banhos termostáticos, uma bomba de
seringa (ISCO 260D), um reator de aço inoxidável com volume interno de 3mL,
um transdutor de pressão absoluto (Smar, LD301) equipado com programador
portátil (Smar, HT201) com precisão de + 0,37bar, como esquematicamente
apresentado na Figura 3.2. A Figura 3.3 apresenta uma fotografia da unidade
experimental utilizada para avaliação da atividade hidrolítica de lipases
liofilizadas ou imobilizadas.
TP
IP
A
B
C
D
B
E
F
G
Figura 3.2 – Diagrama esquemático do aparato experimental para o tratamento das
lipases sólidas em propano pressurizado. A - reservatório de solvente; B - banho
termostático; C – bomba seringa; D – reator de aço inoxidável; E – transdutor de
pressão; F – indicador de pressão; G – válvula micrométrica.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
20
Figura 3.3 – Fotos da unidade experimental utilizada para avaliação da atividade de
hidrólise de lipases liofilizadas e imobilizadas em propano pressurizado.
Inicialmente o banho termostático era ajustado para operar na
temperatura estabelecida pelo planejamento de experimentos. Quando a
temperatura estava estabilizada, as preparações enzimáticas liofilizadas (0,5g)
e imobilizadas (0,1g) eram carregadas ao reator. Após este procedimento, o
sistema era alimentado e pressurizado com propano até a pressão referente à
condição experimental, mantendo uma taxa de pressurização constante de
10bar/min. O sistema era mantido nestas condições durante o tempo
estabelecido no planejamento experimental. Então, o sistema era
despressurizado a uma taxa pré-definida pela abertura da válvula micrométrica.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
21
A atividade hidrolítica de cada lipase (Amano PS, Amano AY30 e Yarrowia
lipolytica) em cada forma (liofilizada e imobilizada) era determinada antes
(atividade inicial) e após (atividade final) o tratamento em propano
pressurizado. A atividade residual foi determinada de acordo com o exposto na
Equação 3.3.
3.3.2 Lipases em solução (ressuspendidas)
O principal objetivo desta etapa foi investigar o efeito do processamento
a alta pressão com solvente comprimido na atividade de lipases dissolvidas em
solução, uma vez que várias reações enzimáticas são conduzidas com o
biocatalisador nesta forma. Uma modificação no aparato experimental
apresentado na Figura 3.2 foi realizada para permitir amostragem da solução
enzimática do sistema reacional. A principal modificação residiu na inserção de
uma célula de volume variável dotada de janela de safira, a qual contém um
pistão móvel que permite o controle da pressão dentro do reator. Desta forma,
amostras da solução enzimática podem ser retiradas sem perturbar a pressão
do sistema, tornando possível avaliar o comportamento da atividade lipásica
em função do tempo de processamento, mantendo constantes a pressão e a
temperatura do sistema.
Basicamente, o aparato consiste de um reservatório de solvente, uma
célula com duas janelas de safira para observação visual de 28mL (volume
máximo), um transdutor absoluto de pressão (Smar LD 301), com precisão de +
0,37bar, um programador portátil (Smar, HT 201) para a aquisição de dados de
pressão e uma bomba de seringa. O aparato experimental é
esquematicamente apresentado na Figura 3.4. A Figura 3.5 apresenta uma
vista da unidade experimental utilizada para avaliação da atividade hidrolítica
de lipases ressuspendidas.
A preparação enzimática liofilizada era solubilizada em tampão fostato
de sódio pH 7,0, conforme descrito anteriormente. Tipicamente, cerca de 5mL
da solução era carregada à célula que, em seguida era alimentada com
propano com o auxílio da bomba de seringa até atingir uma razão mássica
solvente:solução enzimática em torno de 2:1. A temperatura, controlada por um
banho ultra-termostático (0,1
o
C), era então estabilizada e o sistema
pressurizado na condição estabelecida pelo planejamento experimental, a uma
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
22
taxa constante de 10bar/min, através do movimento do pistão interno da célula.
Alíquotas da solução enzimática eram amostradas periodicamente durante 3
horas através de um peek-tubing introduzido no interior da célula.
Figura 3.4 – Diagrama esquemático do aparato para o tratamento de lipases
ressuspendidas em propano pressurizado. A – reservatório de solvente; B – banho
termostático; C – bomba seringa; D – transdutor e indicador de pressão; E – célula
com janela de safira de volume variável; F – janelas de safira; G – válvula para
amostragem; H – válvula micrométrica para despressurização, I - pistão.
Após a amostragem, a célula era despressurizada a uma taxa fixa de
descompressão (5bar/min). A atividade hidrolítica de cada lipase (Amano PS,
Amano AY30 e Yarrowia lipolytica) ressuspendida era determinada antes
(atividade inicial) e após (atividade final) o tratamento em propano
pressurizado. A atividade residual em cada condição experimental era
determinada de acordo com a Equação 3.3.
3.4 Planejamento de Experimentos e Análise Estatística
Objetivando avaliar os efeitos das variáveis do processo (temperatura,
pressão, taxa de despressurização e tempo de exposição) sobre a atividade
das lipases liofilizadas e imobilizadas após o tratamento em propano
pressurizado, foi adotado um planejamento experimental fatorial fracionário
com 2 níveis para as 4 variáveis. Para as enzimas ressuspendidas, empregou-
TP
IP
A
B
C
G
D
E
F
H
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
23
se um planejamento fatorial completo com 2 níveis e 2 variáveis (temperatura e
pressão). Neste caso específico, dados cinéticos foram obtidos em cada
condição experimental para cada lipase.
Figura 3.5 – Fotos da unidade experimental utilizada para avaliação da atividade de
hidrólise de lipases ressuspendidas em propano pressurizado.
As Tabelas 3.2 e 3.3 apresentam o intervalo de estudo das variáveis
para as lipases na forma sólida (liofilizadas e imobilizadas) e em solução
(ressuspendidas), respectivamente. Estes intervalos foram selecionados de
modo a abranger a escala normalmente utilizada para sistemas reacionais
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
24
contendo lipases, a faixa de atuação ótima para cada lipase e as limitações dos
equipamentos disponíveis.
Tabela 3.2 – Intervalo de estudo das variáveis para o estudo do processamento de
lipases liofilizadas e imobilizadas em propano pressurizado.
Variável Intervalo de estudo
Temperatura (T) [
o
C] 35-55
Tempo de exposição (t) [horas] 0,5-3,0
Taxa de despressurização (R) [bar/min] 2-50
Pressão (P) [bar] 30-200
Tabela 3.3 – Intervalo de estudo das variáveis para o estudo do processamento de
lipases ressuspendidas em propano pressurizado.
Variável Intervalo de estudo
Temperatura (T) [
o
C] 35-55
Pressão (P) [bar] 30-200
Considerando os intervalos de estudo supracitados e os planos
experimentais adotados, as Tabelas 3.4 e 3.5 apresentam as matrizes para as
lipases liofilizadas e imobilizadas e ressuspendidas, respectivamente.
Tabela 3.4 – Matriz experimental (planejamento fatorial saturado) empregada no
estudo da atividade de lipases liofilizadas e imobilizadas em propano pressurizado.
Experimento T [
o
C] t [horas] R [bar/min] P [bar]
1 35 (-1) 0,5 (-1) 2 (-1) 30 (-1)
2 35 (-1) 0,5(-1) 50 (+1) 200 (+1)
3 35 (-1) 3 (+1) 2 (-1) 200 (+1)
4 35 (-1) 3 (+1) 50 (+1) 30 (-1)
5 55 (+1) 0,5 (-1) 2 (-1) 200 (+1)
6 55 (+1) 0,5 (-1) 50 (+1) 30 (-1)
7 55 (+1) 3 (+1) 2 (-1) 30 (-1)
8 55 (+1) 3 (+1) 50 (+1) 200 (+1)
9 45 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
25
Tabela 3.5 – Matriz experimental (planejamento fatorial completo) empregada no
estudo da atividade de lipases ressuspendidas em propano pressurizado.
Experimento T [
o
C] P [bar]
1 35 30
2 35 200
3 55 30
4 55 200
5 45 115
Os experimentos foram realizados aleatoriamente e com réplica do
ponto central para cada sistema avaliado. O erro experimental para cada
condição foi obtido através da média e do desvio padrão. Ao final dos
experimentos, os resultados obtidos foram analisados no programa Statistica
6.1
®
.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente capítulo tem por objetivo apresentar os resultados obtidos no
decorrer deste trabalho, relacionados à avaliação da atividade hidrolítica de
lipases comerciais e não comerciais após processamento com propano
pressurizado. Para efeitos de melhor compilação e avaliação dos dados obtidos, a
apresentação será abordada de acordo com a lipase utilizada.
4.1 Atividade hidrolítica da lipase PS Amano em propano pressurizado
Nesta etapa são apresentados e discutidos os resultados obtidos na
avaliação da atividade hidrolítica da lipase Amano PS nas formas livre (liofilizada e
ressuspendida) e imobilizada após tratamento em propano pressurizado. Os
experimentos foram realizados aleatoriamente, com réplica do ponto central.
Lipase Amano PS liofilizada
Os resultados obtidos para a lipase Amano PS na forma livre (liofilizada)
após processamento em propano pressurizado são apresentados na Tabela 4.1.
Pela análise desta tabela pode-se verificar que houve um aumento da
atividade hidrolítica após tratamento com propano pressurizado na maioria das
condições experimentais avaliadas. Cabe mencionar a boa reprodutibilidade dos
dados obtidos, que pode ser evidenciada pelos valores de atividade residual
referentes aos experimentos 9 e 10 (réplicas do ponto central). O maior
incremento em relação à atividade inicial ocorreu no experimento 2 (347,33%) nas
condições de menor temperatura (35
o
C), menor tempo de exposição (0,5 horas),
taxa de despressurização rápida (50bar/min) e maior pressão (200bar). Perda
expressiva de atividade ocorreu no experimento 5 (84%), cabendo mencionar que
a temperatura (65
o
C) e taxa de despressurização lenta (2bar/min) empregadas
nesta condição experimental, as quais diferem do experimento 2, parecem afetar
negativamente a atividade enzimática.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
27
Tabela 4.1. Atividade residual da lipase Amano PS liofilizada após tratamento com
propano pressurizado.
Experimento
T
[
o
C]
t
[horas]
R
[bar/min]
P
[bar]
Atividade Residual
*
(%)
1 35 (-1) 0,5 (-1) 2 (-1) 30 (-1) 71,96
2 35 (-1) 0,5(-1) 50 (+1) 200 (+1) 347,33
3 35 (-1) 3 (+1) 2 (-1) 200 (+1) 222,22
4 35 (-1) 3 (+1) 50 (+1) 30 (-1) 98,25
5 65 (+1) 0,5 (-1) 2 (-1) 200 (+1) 16,00
6 65 (+1) 0,5 (-1) 50 (+1) 30 (-1) 189,01
7 65 (+1) 3 (+1) 2 (-1) 30 (-1) 170,37
8 65 (+1) 3 (+1) 50 (+1) 200 (+1) 127,75
9 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0) 156,35
10 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0) 154,74
* Atividade inicial de hidrólise=88,4U/mL.
T=temperatura, t=tempo de exposição, R=taxa de despressurização e P=pressão.
Uma vez determinada a atividade residual para cada condição experimental
definida no planejamento de experimentos, os dados foram tratados
estatisticamente e obteve-se o Gráfico de Pareto apresentado na Figura 4.1.
Figura 4.1. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS liofilizada após
tratamento em propano pressurizado.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
28
Observa-se que a taxa de despressurização apresentou o efeito mais
significativo (p<0,05), demonstrando que maiores atividades residuais são obtidas
quando da despressurização rápida do sistema. Alguns trabalhos apresentados na
literatura (KNEZ e HABULIN, 2002) sugerem que a etapa de despressurização
influencia a atividade da enzima após processamento em fluidos pressurizados.
Cabe novamente mencionar que cada sistema precisa ser investigado, uma vez
que os resultados são função, principalmente, das características da enzima e do
solvente e das possíveis interações entre os mesmos. Por outro lado, dentro da
faixa estudada, a temperatura apresentou efeito significativo negativo sugerindo
que um aumento da temperatura diminua a atividade residual do sistema. A
literatura, no entanto, aponta como ótima para a atividade da lipase PS Amano
temperaturas na faixa de 50-60
o
C. Possíveis aumentos na estabilidade térmica da
enzima podem ser alcançados na etapa de imobilização, resultados que serão
apresentados a seguir. Dentro da faixa avaliada, pôde-se observar também que a
pressão afetou positivamente a atividade de hidrólise da lipase PS Amano. Neste
sistema, dentro dos limites investigados, conclui-se que a temperatura afetou
negativamente a atividade da enzima, efeito contraditório ao apresentado em
relação à pressão e à taxa de despressurização, variáveis comumente citadas
como nocivas à atividade enzimática.
Fazendo referência aos trabalhos apontados na literatura com relação ao
comportamento da atividade enzimática em fluidos pressurizados cumpre
mencionar que grande parte destes refere-se à aplicação de dióxido de carbono
como solvente. Os resultados obtidos na maioria destes casos remetem a perdas
na atividade das enzimas, devido principalmente ao caráter hidrofílico do CO
2
, o
qual poderia, durante o processamento a altas pressões, remover a água
essencial à manutenção da atividade enzimática. Trabalhos que corroboram tal
afirmação podem ser citados: PRIMO et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2006a,b. Cabe
mencionar que em alguns trabalhos ocorreu um incremento na atividade
enzimática após processamento em CO
2
pressurizado (FRICKS et al., 2006).
Neste cenário, os efeitos do tratamento com CO
2
pressurizado na atividade de
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
29
enzimas obtidas a partir de diferentes fontes são variáveis, dependendo da
magnitude da pressão, temperatura e tempo de exposição, entre outros fatores.
Por outro lado, alguns trabalhos apresentados na literatura relatam que o
uso de solventes com baixa constante dielétrica, tais como o propano, poderiam
manter ou aumentar a atividade e estabilidade enzimáticas (KNEZ e HABULIN,
2001; OLIVEIRA et al., 2006a,b; FRICKS et al., 2006). Cabe salientar que a
maioria destes trabalhos refere-se à verificação da atividade de enzimas
imobilizadas, justificando a consecução da presente etapa deste trabalho,
relacionada à análise do comportamento de enzimas livres em propano. Neste
sentido, num dos poucos trabalhos apresentados na literatura referente à atividade
de extratos enzimáticos livres em propano, ANDRADE et al. (2007) verificaram
que, no caso específico da enzima D-hidantoinase, os resultados obtidos quando
do processamento em CO
2
e propano não apresentaram diferença significativa na
atividade do extrato enzimático sólido. Uma vez que as propriedades do solvente
afetam diretamente a interação específica com as enzimas, diferentes efeitos são
obtidos dependendo da enzima estudada (KASCHE et al., 1988; FRICKS et al.,
2006). Como mencionado anteriormente, no caso específico dos resultados
apresentados neste trabalho pôde-se verificar que o emprego de propano
pressurizado como solvente, na maioria das condições avaliadas, conduziu a um
aumento da atividade residual da lipase Amano PS liofilizada.
Lipase Amano PS ressuspendida
Os resultados obtidos para a lipase Amano PS na forma livre
(ressuspendida) após processamento em propano pressurizado são apresentados
na Tabela 4.2.
Cabe salientar que nesta etapa foi avaliada a atividade hidrolítica em
função do tempo de processamento. No entanto, visando uma comparação mais
direta com os dados obtidos anteriormente para a lipase liofilizada, a análise
estatística foi realizada apenas para os tempos de 0,5 e 3 horas de
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
30
processamento no propano pressurizado. A curva cinética obtida para cada
condição experimental apresentada na Tabela 4.2 é demonstrada na Figura 4.2.
Tabela 4.2. Atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida após tratamento com
propano pressurizado em função do tempo de processamento.
Tempo (minutos)
15 30 60 120 180
Condição
Experimental
(P-T)
Atividade Residual
*
(%)
35°C-30Bar 88,55 109,57 39,33 83,25 100,36
35°C-200Bar 94,96 92,94 126,59 75,42 63,21
55°C-30Bar 95,78 111,46 119,30 94,18 78,40
55°C-200Bar 85,18 87,03 90,09 53,06 53,70
45°C-115Bar 93,25 80,90 93,25 82,04 28,07
45°C-115Bar 86,35 80,90 85,46 72,71 34,52
45°C-115Bar 108,39 113,15 93,47 100,96 59,27
*
Atividade inicial de hidrólise=88,4U/mL.
Amano PS ressuspendida em propano
T em p o (min )
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
Atividade enzimática
35°C 30 bar
35°C 200 bar
55°C 30 bar
55°C 200 bar
45°C 115 bar
Figura 4.2. Atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida em função do tempo de
exposição ao propano pressurizado.
Uma análise prévia da tabela e da figura apresentadas anteriormente
permite verificar que, após 30 minutos de processamento em propano
pressurizado, a lipase PS teve praticamente inalterada sua atividade inicial em
todas as condições experimentais avaliadas. Ao longo do tempo de exposição, o
comportamento da atividade enzimática variou em função da condição
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
31
experimental, sendo que, após 180 minutos de exposição, todas as condições de
temperatura e pressão conduziram a uma queda gradativa da atividade
enzimática, parecendo haver um efeito combinado de temperatura e pressão,
afetando a atividade final. Quedas mais acentuadas de atividade foram verificadas
na condição de temperatura e pressão intermediárias. Cabe salientar que na
condição de menor temperatura e pressão, após 180 minutos, a enzima manteve
inalterada sua atividade comparada à atividade inicial.
Após esta análise prévia em relação à atividade residual como função do
tempo de exposição da lipase ressuspendida em propano pressurizado, os dados
apresentados na tabela anterior foram tratados estatisticamente nos tempos de 30
e 180 minutos, visando avaliar o efeito das variáveis pressão e temperatura na
atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida. Foram, desta forma,
obtidos os Gráficos de Pareto apresentados nas Figuras 4.3 e 4.4 para os tempos
de 30 e 180 minutos, respectivamente.
Figura 4.3. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida
após tratamento por 30 minutos em propano pressurizado.
Observa-se que, com 95% de confiança, a pressão e a temperatura
afetaram negativamente a atividade enzimática, demonstrando que um aumento
nestas variáveis, dentro da faixa estudada, acarreta numa diminuição da atividade
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
32
residual da referida lipase. Cumpre salientar o efeito também significativo de
interação entre as referidas variáveis.
Figura 4.4. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS ressuspendida
após tratamento por 180 minutos em propano pressurizado.
Observa-se na análise dos resultados que, após 180 minutos de exposição
ao propano pressurizado, com 90% de confiança, a pressão e a temperatura
afetaram negativamente a atividade enzimática.
Numa tentativa de correlacionar os dados obtidos nesta etapa com os
observados quando da utilização da lipase liofilizada pode-se verificar que a forma
de apresentação da enzima (sólida ou em suspensão) parece afetar o
comportamento desta durante tratamento com propano pressurizado. Enquanto
neste caso a pressão e a temperatura afetaram negativamente a atividade
enzimática, quando da utilização da enzima liofilizada apenas a temperatura
apresentou este efeito negativo, sendo que a pressão apresentou efeito contrário.
Com relação aos resultados reportados na literatura, cumpre mencionar a
escassez dos mesmos relacionados ao comportamento da atividade de enzimas
em solução em fluidos pressurizados, muito embora estes resultados possam ser
significativos no sentido de que a maioria dos sistemas reacionais empregando
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
33
enzimas livres como catalisadores necessita que as mesmas sejam utilizadas na
forma ressuspendida em tampão apropriado.
ANDRADE et al. (2007), investigando o efeito do processamento com CO
2
e propano pressurizados na atividade de uma solução (2mg de sólido/mL) da
enzima D-hidantoinase, verificaram um contínuo decréscimo da atividade
enzimática em todas as condições experimentais avaliadas em CO
2
pressurizado.
A determinação da atividade enzimática na solução mostrou atividades residuais
de cerca de 60%, indicando que a enzima foi desnaturada durante o
processamento com dióxido de carbono comprimido. Desnaturação de proteínas
induzida pela pressão tem sido tópico de intensas pesquisas nos últimos anos, e a
partir de vários exemplos, a desnaturação pela pressão parece ser um processo
reversível, diferentemente da desnaturação provocada pela temperatura
(HEREMANS et al., 1996). Os mesmos autores apresentam resultados
relacionados ao processamento da mesma enzima em solução em propano
pressurizado, onde pôde-se verificar que, após 2 horas de tratamento, uma
pequena alteração na atividade residual foi observada. Comparando os resultados
do tratamento da D-hidantoinase em solução com dióxido de carbono e propano,
os autores verificaram que as proteínas parecem ser mais estáveis em propano
que em CO
2
. Este fato pode ser explicado em termos da maior solubilidade do
dióxido de carbono em soluções aquosas comparado ao propano. Quando as
macromoléculas estão em solução, é esperado que as cadeias pareçam aumentar
de volume, aumentando a mobilidade molecular. Desta forma, moléculas com
menores comprimentos de cadeia poderiam interagir mais facilmente em solução.
Como o CO
2
apresenta maior solubilidade em soluções aquosas que o propano,
interações mais efetivas poderiam estar disponíveis entre os grupamentos. Várias
especulações são apresentadas na literatura acerca do efeito do processamento
com CO
2
pressurizado sobre a atividade de diversas enzimas, no entanto, devido
ao caráter ainda recente da aplicação de propano como solvente pressurizado,
pouco tem sido relatado na literatura acerca do seu efeito direto na atividade de
enzimas.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
34
Lipase Amano PS imobilizada
Os resultados obtidos para a lipase Amano PS imobilizada em Accurel
EP100 após processamento em propano pressurizado são apresentados na
Tabela 4.3.
Tabela 4.3. Atividade residual da lipase Amano PS imobilizada após tratamento com
propano pressurizado.
Experimento
T
[
o
C]
t
[horas]
R
[bar/min]
P
[bar]
Atividade Residual
*
(%)
1 35 (-1) 0,5 (-1) 2 (-1) 30 (-1)
321,97
2 35 (-1) 0,5(-1) 50 (+1) 200 (+1)
72,37
3 35 (-1) 3 (+1) 2 (-1) 200 (+1)
105,01
4 35 (-1) 3 (+1) 50 (+1) 30 (-1)
60,08
5 65 (+1) 0,5 (-1) 2 (-1) 200 (+1)
74,88
6 65 (+1) 0,5 (-1) 50 (+1) 30 (-1)
38,88
7 65 (+1) 3 (+1) 2 (-1) 30 (-1)
54,55
8 65 (+1) 3 (+1) 50 (+1) 200 (+1)
86,96
9 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
109,47
10 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
107,36
11 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
88,19
* Atividade inicial de hidrólise=312,8U/g.
T=temperatura, t=tempo de exposição, R=taxa de despressurização e P=pressão.
Confrontando diretamente os resultados apresentados nesta tabela com os
obtidos quando da utilização da lipase PS na forma liofilizada (Tabela 4.1) pode-se
verificar que diferentes comportamentos são observados em função da forma de
apresentação da enzima. Para a enzima imobilizada, a condição experimental 1,
equivalente aos menores níveis de temperatura, tempo de exposição, taxa de
despressurização e pressão, conduziu a um maior incremento da atividade de
hidrólise da referida enzima (321%). Comparando novamente com a Tabela 4.1
parece haver, no caso da enzima imobilizada, um efeito deletério da taxa de
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
35
despressurização e da pressão na atividade residual, fatos que podem também
ser observados nos experimentos 2, 4, 5 e 6.
Uma vez determinada a atividade residual para cada condição experimental
definida no planejamento de experimentos, os dados foram tratados
estatisticamente e obteve-se o Gráfico de Pareto apresentado na Figura 4.5.
Figura 4.5. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano PS imobilizada após
tratamento em propano pressurizado.
Observa-se que a temperatura, a taxa de despressurização e o tempo de
exposição apresentaram efeito negativo significativo (p<0,05), demonstrando que
maiores atividades residuais são obtidas quando da despressurização lenta do
sistema, em faixas de menores temperaturas e menores tempos de exposição.
Alguns trabalhos apresentados na literatura sugerem que a etapa de
despressurização determina a atividade da enzima após o processamento em
fluidos pressurizados. Neste sistema, parece haver concordância com esta
afirmação apresentada por alguns autores. Por outro lado, dentro da faixa
estudada, a temperatura apresentou efeito significativo negativo sugerindo que um
aumento da temperatura diminua a atividade residual do sistema. A literatura, no
entanto, aponta como ótima para a atividade da lipase PS Amano temperaturas na
faixa de 50-60
o
C. A etapa de imobilização parece não ter aumentado a
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
36
estabilidade térmica da enzima frente ao sistema avaliado. Cabe novamente
mencionar, com base nos dados apresentados até o momento, que cada sistema
precisa ser investigado separadamente, pois os resultados são função,
principalmente, das características da enzima, da forma de apresentação da
mesma, do solvente e das possíveis interações entre os mesmos.
Novamente, conforme mencionado anteriormente no item relacionado ao
comportamento da lipase PS Amano na forma livre após tratamento em propano
pressurizado, pode-se relatar que o uso de solventes com baixa constante
dielétrica poderia manter ou aumentar a atividade e estabilidade enzimáticas
(KNEZ e HABULIN, 2001; OLIVEIRA et al., 2006a,b; FRICKS et al., 2006).
Neste sentido, o trabalho apresentado por OLIVEIRA et al. (2006),
relacionado ao comportamento de duas lipases imobilizadas comerciais (Novozym
435 e Lipozyme IM) após tratamento em CO
2
e propano pressurizado, verificou
que, para a enzima Lipozyme IM, o tratamento com dióxido de carbono conduziu
às maiores perdas de atividade de esterificação (cerca de 14%) e em propano
menores perdas de atividade foram observadas (máximo de 8,9%). Para a enzima
Novozym 435, o processamento com dióxido de carbono também apresentou
efeito deletério na atividade da enzima, embora num nível inferior quando
comparado a Lipozyme IM. Por outro lado, os resultados mostraram que o
tratamento da lipase Novozym 435 em propano comprimido conduziu a um
aumento na atividade enzimática em todas as condições experimentais avaliadas,
com ganhos médios de atividade de cerca de 14%.
O trabalho apresentado por HABULIN e KNEZ (2001), os quais estudaram
a atividade de algumas lipases na reação de esterificação de ácido butírico e
etanol em CO
2
supercrítico e propano a 40
o
C e 100 bar, mostra que maiores
perdas de atividade foram verificadas em CO
2
. É interessante reportar que estes
autores também verificaram um aumento da atividade de esterificação das lipases
testadas em propano.
Os resultados reportados na literatura e os apresentados neste trabalho
permitem concluir que solventes com baixa constante dielétrica favorecem a
ativação interfacial, permitindo maior acesso ao sítio ativo da enzima (KNEZ e
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
37
HABULIN, 2001). Como mencionado anteriormente, no caso específico dos
resultados apresentados neste trabalho pôde-se verificar que o emprego de
propano pressurizado como solvente, em várias condições avaliadas, conduziu a
um aumento da atividade residual da lipase Amano PS imobilizada. Tal fato pode
ter se dado devido às características hidrofóbicas do propano e o fato de que o
mesmo se comporta como um solvente líquido convencional no presente estudo, e
possivelmente devido à afinidade da lipase PS Amano por este solvente.
4.2 Atividade hidrolítica da lipase AY30 Amano em propano pressurizado
Nesta etapa são apresentados os resultados obtidos na avaliação da
atividade hidrolítica da lipase Amano AY30 nas formas livre (liofilizada e
ressuspendida). Cumpre salientar que a etapa de avaliação da atividade residual
utilizando a referida lipase imobilizada não foi efetuada uma vez que, durante o
processo de imobilização, houve expressiva redução da atividade de hidrólise,
tornando inacessível a avaliação da atividade após processamento em propano
pressurizado.
Lipase Amano AY30 liofilizada
Os resultados obtidos para a lipase Amano AY30 na forma livre (liofilizada)
após processamento em propano pressurizado são apresentados na Tabela 4.4.
Pela análise desta tabela pode-se verificar que houve um aumento da
atividade hidrolítica após tratamento com propano pressurizado em algumas das
condições experimentais avaliadas. O maior incremento em relação à atividade
inicial ocorreu nos experimentos de maiores temperaturas e menores pressões. O
experimento 4 foi o que apresentou uma menor atividade residual comparado aos
demais.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
38
Tabela 4.4. Atividade residual da lipase Amano AY30 liofilizada após tratamento com
propano pressurizado.
Experimento
T
[
o
C]
t
[horas]
R
[bar/min]
P
[bar]
Atividade Residual
*
(%)
1 35 (-1) 0,5 (-1) 2 (-1) 30 (-1)
131,82
2 35 (-1) 0,5(-1) 50 (+1) 200 (+1)
108,7
3 35 (-1) 3 (+1) 2 (-1) 200 (+1)
90,72
4 35 (-1) 3 (+1) 50 (+1) 30 (-1)
31,37
5 65 (+1) 0,5 (-1) 2 (-1) 200 (+1)
80,59
6 65 (+1) 0,5 (-1) 50 (+1) 30 (-1)
145,45
7 65 (+1) 3 (+1) 2 (-1) 30 (-1)
134,82
8 65 (+1) 3 (+1) 50 (+1) 200 (+1)
82,62
9 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
167,36
10 50 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
147,39
* Atividade inicial de hidrólise=22,5U/mL.
T=temperatura, t=tempo de exposição, R=taxa de despressurização e P=pressão.
Uma vez determinada a atividade residual para cada condição experimental
definida no planejamento de experimentos, os dados foram tratados
estatisticamente e obteve-se o Gráfico de Pareto apresentado na Figura 4.6. A
análise desta figura permite concluir que dentro do intervalo de estudo investigado,
nenhuma variável apresentou efeito significativo (p<0,05) na atividade de hidrólise
da lipase Amano AY30. Fazendo referência aos resultados obtidos para a lipase
Amano PS pode-se novamente verificar que diferentes enzimas possuem
diferentes comportamentos em propano pressurizado.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
39
Figura 4.6. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano AY30 liofilizada após
tratamento em propano pressurizado.
Lipase Amano AY30 ressuspendida
Os resultados obtidos para a lipase Amano AY30 na forma livre
(ressuspendida) após processamento em propano pressurizado são apresentados
na Tabela 4.5.
Cabe salientar que nesta etapa foi avaliada a atividade hidrolítica em função
do tempo de processamento. No entanto, visando uma comparação mais direta
com os dados obtidos anteriormente para a lipase liofilizada, a análise estatística
foi realizada apenas para os tempos de 0,5 e 3 horas de processamento no
propano pressurizado.
A análise da Figura 4.7 permite verificar que, em todas as condições
experimentais houve um decréscimo contínuo da atividade residual da lipase em
função de tempo de tratamento em propano pressurizado. Tal efeito foi mais
pronunciado nas condições de maiores temperaturas (65
o
C), parecendo esta
variável afetar negativamente a atividade da enzima ao longo do processamento.
Cabe mencionar a completa inativação da enzima, após 30 minutos de
processamento quando pressão de 200bar foi empregada e após 180 minutos de
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
40
processamento quando da pressão de 30bar. Tais efeitos deletérios não foram
verificados para a lipase Amano PS ressuspendida, conforme apresentado
anteriormente.
Tabela 4.5. Atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida após tratamento com
propano pressurizado em função do tempo de processamento.
Tempo (minutos)
15 30 60 120 180
Condição
Experimental
(T-P)
Atividade Residual (%)
35°C-30Bar 79,59 88,04 87,01 38,88 30,33
35°C-200Bar
70,31 68,17 57,53 51,14 47,95
55°C-30Bar 51,86 55,66 27,82 11,39 25,27
55°C-200Bar
82,62 35,02 19,57 23,90 15,18
45°C-115Bar
95,57 103,33 67,75 55,51 33,33
45°C-115Bar
61,29 66,96 53,78 39,80 41,51
45°C-115Bar
92,55 93,47 39,43 42,07 34,57
A curva cinética obtida para cada condição experimental apresentada na
Tabela 4.5 é demonstrada na Figura 4.7.
Yarrowia lipolytica ressuspendida em propano
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Atividade enzimática
35°C 30 bar
35°C 200 bar
55°C 30 bar
55°C 200 bar
45°C 115 bar
Figura 4.7. Atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida em função do tempo
de exposição ao propano pressurizado.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
41
Após esta análise prévia em relação à atividade residual como função do
tempo de exposição da lipase ressuspendida em propano pressurizado, os dados
apresentados na tabela anterior foram tratados estatisticamente nos tempos de 30
e 180 minutos, visando avaliar o efeito das variáveis pressão e temperatura na
atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida. Foi obtido o Gráfico de
Pareto (Figura 4.8) para o tempo de 30 minutos de exposição da enzima Amano
AY30 ao propano pressurizado.
Figura 4.8. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase Amano AY30 ressuspendida
após tratamento por 30 minutos em propano pressurizado.
Após 30 minutos de processamento em propano pressurizado, observa-se
que a pressão e a temperatura não afetaram significativamente (p<0,10) a
atividade da lipase Amano AY30 ressuspendida. Cumpre salientar o efeito não
significativo de interação entre as referidas variáveis.
Os resultados apresentados na Tabela 4.7 foram também tratados
estatisticamente após 180 minutos de exposição da enzima ao propano
pressurizado e um modelo empírico foi obtido (Equação 4.1). O modelo codificado
para a atividade residual em função da temperatura e da pressão foi validado pela
análise de variância apresentada na Tabela 4.6. Verifica-se que o coeficiente de
correlação obtido (0,90) e o valor de F (F calculado maior que o F tabelado)
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
42
validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construção da
superfície de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.9.
T
.
P
.
93
,
6
T
.
46
,
9
59
,
32
(%)
residual
Atividade
−
−
=
(4.1)
Tabela 4.6. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura e da
pressão para a lipase Amano AY30 após 180 minutos de processamento em propano
pressurizado.
Fonte de
Variação
Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média
Quadrática
F calculado
Regressão 549,58 2 274,79 8,32
Resíduo 132,11 4 33,03
Falta de ajuste 93,24 2
Erro puro 38,87 2
Total 681,69 6
Coeficiente de correlação: R=0,90, F
0,90;4;6
=3,18
Na Figura 4.9 pode-se verificar que em níveis mais elevados de pressão e
níveis inferiores de temperatura são obtidos os maiores valores de atividade
residual. Neste aspecto, pode-se evidenciar que existe uma tendência de aumento
da atividade residual com o aumento da pressão, efeito ainda não totalmente
desvendado na literatura, embora existam dados experimentais que corroborem o
comportamento no sistema aqui enfocado.
Numa tentativa de correlacionar os dados obtidos nesta etapa com os
observados quando da utilização da lipase liofilizada pode-se verificar que a forma
de apresentação da enzima (sólida ou em suspensão) parece novamente afetar o
comportamento desta durante tratamento com propano pressurizado.
Correlacionando estes dados com os obtidos para a lipase Amano PS
ressuspendida em propano pressurizado pode-se novamente verificar diferentes
comportamentos de atividade residual em função da enzima utilizada.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
43
Figura 4.9. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase
Amano AY30 ressuspendida após tratamento por 180 minutos em propano pressurizado.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
44
4.3 Atividade hidrolítica da lipase de Yarrowia lipolytica em propano
pressurizado
Nesta etapa são apresentados os resultados obtidos na avaliação da
atividade hidrolítica da lipase de Yarrowia lipolytica nas formas livre (liofilizada e
ressuspendida). Cumpre salientar que a etapa de avaliação da atividade residual
utilizando a referida lipase imobilizada foi investigada em apenas três condições
experimentais, devido à falta de amostra de enzima suficiente para complementar
esta última etapa.
Lipase de Yarrowia lipolytica liofilizada
Os resultados obtidos para a lipase de Yarrowia lipolytica na forma livre
(liofilizada) após processamento em propano pressurizado são apresentados na
Tabela 4.7.
Pela análise desta tabela pode-se verificar que houve uma variação pouco
pronunciada na atividade residual após o tratamento com propano, já que
incrementos ou perdas pouco significativos em relação à atividade inicial foram
verificados para a maioria das condições experimentais. Cabe mencionar a boa
reprodutibilidade dos dados obtidos, o que pode ser evidenciado pelos valores de
atividade residual referentes aos experimentos 9 e 10 (réplicas do ponto central).
No entanto, cabe aqui mencionar que, em praticamente todas as condições
experimentais, a lipase de Yarrowia lipolytica na forma livre (liofilizada), uma
enzima não comercial, apresentou boa estabilidade após processamento em
propano pressurizado, podendo a mesma ser uma boa alternativa a ser
empregada como catalisador em processos bioquímicos em meios alternativos,
neste caso, propano pressurizado, viabilizando economicamente tais processos
em comparação aos catalisados por lipases comerciais de alto custo.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
45
Tabela 4.7. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica liofilizada após tratamento
com propano pressurizado.
Experimento
T
[
o
C]
t
[horas]
R
[bar/min]
P
[bar]
Atividade Residual
*
(%)
1 35 (-1) 0,5 (-1) 2 (-1) 30 (-1)
121,41
2 35 (-1) 0,5(-1) 50 (+1) 200 (+1)
102,6
3 35 (-1) 3 (+1) 2 (-1) 200 (+1)
126,94
4 35 (-1) 3 (+1) 50 (+1) 30 (-1)
102,83
5 55 (+1) 0,5 (-1) 2 (-1) 200 (+1)
99,47
6 55 (+1) 0,5 (-1) 50 (+1) 30 (-1)
73,11
7 55 (+1) 3 (+1) 2 (-1) 30 (-1)
95,63
8 55 (+1) 3 (+1) 50 (+1) 200 (+1)
113,67
9 45 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
102,79
10 45 (0) 1,45 (0) 26 (0) 115 (0)
97,51
* Atividade inicial de hidrólise=56,4U/mL.
T=temperatura, t=tempo de exposição, R=taxa de despressurização e P=pressão.
Numa tentativa de correlacionar diretamente os resultados apresentados na
tabela anterior com os da Tabela 4.1 e 4.4 (referente à atividade residual da lipase
Amano PS e Amano AY30, respectivamente, após tratamento com propano
pressurizado, nas mesmas condições experimentais) pode-se novamente
mencionar que, diferentes enzimas possuem diferentes comportamentos,
considerando o mesmo solvente e as mesmas condições experimentais, fazendo
crer que a interação entre a enzima e o solvente apresenta papel fundamental no
comportamento da atividade enzimática.
Uma vez determinada a atividade residual para cada condição experimental
definida no planejamento de experimentos, os dados foram tratados
estatisticamente e obteve-se o Gráfico de Pareto apresentado na Figura 4.10.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
46
Figura 4.10. Gráfico de Pareto da atividade residual da lipase de Yarrowia
lipolytica liofilizada após tratamento em propano pressurizado.
A análise desta figura permite concluir que, dentro do intervalo de estudo
investigado, somente a temperatura apresentou efeito significativo (p<0,10)
negativo na atividade de hidrólise da lipase de Yarrowia lipolytica. Fazendo
referência aos resultados obtidos para as lipases Amano PS e Amano AY30 pode-
se novamente verificar que diferentes enzimas possuem diferentes
comportamentos em propano pressurizado.
Lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida
Os resultados obtidos para a lipase de Yarrowia lipolytica na forma livre
(ressuspendida) após processamento em propano pressurizado são apresentados
na Tabela 4.8. Cabe salientar que nesta etapa foi avaliada a atividade hidrolítica
em função do tempo de processamento. No entanto, visando uma comparação
mais direta com os dados obtidos anteriormente para a lipase liofilizada, a análise
estatística foi realizada apenas para os tempos de 0,5 e 3 horas de
processamento no propano pressurizado. A curva cinética obtida para cada
condição experimental apresentada na Tabela 4.8 é demonstrada na Figura 4.11.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
47
Tabela 4.8. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida após
tratamento com propano pressurizado em função do tempo de processamento.
Tempo (minutos)
15 30 60 120 180
Condição
Experimental
(T-P)
Atividade Residual (%)
35°C-30Bar 102,92 88,77 89,17 89,39 74,12
35°C-200Bar 89,50 73,27 74,45 68,11 79,61
55°C-30Bar 17,89 18,73 17,68 3,12 0,21
55°C-200Bar 5,58 0,00 0 0 0,00
45°C-115Bar 87,58 69,26 55,43 36,45 33,66
45°C-115Bar 66,10 63,25 52,67 61,41 22,78
45°C-115Bar 68,55 73,83 59,76 43,55 27,14
A análise da Tabela 4.8 e da Figura 4.11 permite verificar que, em todas as
condições experimentais houve um decréscimo contínuo da atividade residual da
lipase em função de tempo de tratamento em propano pressurizado. Tal efeito foi
mais pronunciado nas condições de maiores temperaturas (55
o
C), parecendo esta
variável afetar negativamente a atividade da enzima ao longo do processamento.
Após esta análise prévia em relação à atividade residual como função do
tempo de exposição da lipase ressuspendida em propano pressurizado, os dados
apresentados na tabela anterior foram tratados estatisticamente nos tempos de 30
e 180 minutos, visando avaliar o efeito das variáveis pressão e temperatura na
atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida.
Os resultados apresentados na Tabela 4.8, após 30 minutos de
exposição da enzima ao propano pressurizado, foram tratados estatisticamente e
um modelo empírico foi obtido (Equação 4.2). O modelo codificado para a
atividade residual em função da temperatura e da pressão foi validado pela análise
de variância apresentada na Tabela 4.9. Verifica-se que o coeficiente de
correlação obtido (0,90) e o valor de F (F calculado maior que o F tabelado)
validaram estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construção da
superfície de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.12.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
48
Amano AY30 ressuspendida em propano
Tempo (min)
Atividade residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
-2
8
18
28
38
48
58
68
78
88
98
108
118
Atividade enzimática
35°C 30 bar
35°C 200 bar
55°C 30 bar
55°C 200 bar
45°C 115 bar
Figura 4.11. Atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida em função
do tempo de exposição ao propano pressurizado.
T.82,35P.55,830,55(%)residualAtividade −−=
(4.2)
Na Figura 4.12 pode-se verificar que em níveis inferiores de pressão e de
temperatura são obtidos os maiores valores de atividade residual. Neste aspecto,
pode-se evidenciar que existe uma tendência de aumento da atividade residual
com a diminuição da pressão e da temperatura, mostrando que para esta enzima,
a pressão afeta negativamente a atividade hidrolítica, bem como a temperatura.
Os resultados apresentados na Tabela 4.8, após 180 minutos de exposição
da enzima ao propano pressurizado, foram tratados estatisticamente e um modelo
empírico foi obtido (Equação 4.3). O modelo codificado para a atividade residual
em função da temperatura e da pressão foi validado pela análise de variância
apresentada na Tabela 4.10. Verifica-se que o coeficiente de correlação obtido
(0,92) e o valor de F (F calculado maior que o F tabelado) validaram
estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiram a construção da superfície de
resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 4.13.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
49
Tabela 4.9. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura e da
pressão para a lipase de Yarrowia lipolytica após 30 minutos de processamento em
propano pressurizado.
Fonte de
Variação
Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média
Quadrática
F calculado
Regressão 5426,78 2 2713,38
10,71
Resíduo 1012,66 4 253,16
Falta de ajuste 956,36 2
Erro puro 56,30 2
Total 6439,44 6
Coeficiente de correlação: R=0,92, F
0,90;4;6
=4,32
T.38,3893,33(%)residualAtividade
−
=
(4.3)
Tabela 4.10. Análise de variância para a atividade residual em função da temperatura e
da pressão para a lipase de Yarrowia lipolytica após 180 minutos de processamento em
propano pressurizado.
Fonte de
Variação
Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média
Quadrática
F calculado
Regressão 5892,15 1 5892,15
109,71
Resíduo 268,52 5 53,70
Falta de ajuste 208,57 3
Erro puro 59,95 2
Total 6160,68 6
Coeficiente de correlação: R=0,98, F
0,95;4;6
=6,60
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
50
Figura 4.12. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase de
Yarrowia lipolytica ressuspendida após tratamento por 30 minutos em propano
pressurizado.
Na Figura 4.13 pode-se verificar que somente a temperatura apresentou
efeito significativo negativo na atividade residual da lipase de Yarrowia lipolytica
após processamento por 180 minutos em propano pressurizado. Cabe mencionar
que a atividade ótima desta enzima encontra-se em torno de 40
o
C, sugerindo
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
51
inconsistência na tentativa de deslocar os níveis desta variável no sentido de
aumentar ainda mais a atividade residual.
Figura 4.13. Superfície de resposta e curva de contorno da atividade residual da lipase de
Yarrowia lipolytica ressuspendida após tratamento por 180 minutos em propano
pressurizado.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
52
4.4 Considerações Finais
A partir dos resultados apresentados no decorrer deste capítulo,
relacionados ao comportamento de três lipases, duas comerciais (Amano PS e
Amano AY30) e uma não comercial (obtida por fermentação submersa de
Yarrowia lipolytica), nas formas livre (liofilizada e ressuspendida) e imobilizada,
após processamento em propano pressurizado e, devido ao grande volume de
informações, buscar-se-á compilar os dados, como forma de melhor visualização
global dos resultados obtidos.
Primeiramente, será apresentada a compilação referente ao
comportamento das três lipases avaliadas na forma livre (liofilizada). A Figura 4.14
apresenta a compilação de dais dados. Os números apresentados na abscissa
são relacionados às condições experimentais estudadas no planejamento
experimental (Tabelas 4.1, 4.4 e 4.7).
Com base nesta figura, pode-se verificar que, de forma geral, as três
lipases apresentaram um bom comportamento em propano pressurizado, salvo
em algumas condições experimentais; comprovando que, dentro das faixas de
temperatura, pressão, tempo de exposição e taxa de despressurização
investigadas, o propano mostrou-se um solvente adequado para a catálise de
reações bioquímicas utilizando as enzimas na forma liofilizada aqui enfocadas.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
53
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Experimento
Perda ou Ganho de Atividade (%)
AY 30
PS Amano
YL
Figura 4.14. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
liofilizada utilizada após processamento em propano pressurizado.
As Figuras 4.15 e 4.16 apresentam gráficos relacionados a diferentes
condições experimentais em função da lipase na forma ressuspendida
investigada. Os gráficos referentes às demais condições experimentais
encontram-se no Anexo I.
Atividade enzimática - 35°C/200bar
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
Atividade enzimática
Yarrowia lipolytica
Amano PS
Amano AY30
Figura 4.15. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
ressuspendida. Condição experimental de 35
o
C e 200bar.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
54
Atividade enzimática - 55°C/200bar
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
-2
8
18
28
38
48
58
68
78
88
98
108
118
Atividade enzimática
Yarrowia lipolytica
Amano PS
Amano AY30
Figura 4.16. Compilação dos resultados de atividade residual em função da lipase
ressuspendida. Condição experimental de 55
o
C e 200bar.
A análise destas figuras permite verificar um efeito pronunciado da
temperatura em relação à pressão na atividade residual das lipases. Uma
tendência geral demonstra maior estabilidade da lipase Amano PS frente às
condições experimentais apresentadas.
A Figura 4.17 apresenta a compilação completa dos dados obtidos para as
lipases ressuspendidas em função do tempo de exposição ao propano
pressurizado. Os números apresentados na abscissa são relacionados às
condições experimentais estudadas no planejamento experimental (Tabelas 4.2,
4.5 e 4.8).
De uma forma geral, com base na figura apresentada, pode-se verificar
que, para as três enzimas, após exposição de 180 minutos ao propano
pressurizado, ocorreu uma queda expressiva da atividade enzimática. Apenas a
condição experimental 1 (menor temperatura – 35
o
C e menor pressão – 30bar)
para a lipase Amano PS apresentou, após 180 minutos de processamento, um
incremento em relação à atividade inicial.
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
55
Figura 4.17. Compilação dos resultados de atividade enzimática em função da lipase
ressuspendida para cada condição experimental. (a) após 30 minutos de exposição, (b)
após 180 minutos de exposição.
Para fins de comparação em relação à forma de apresentação da enzima
(liofilizada e imobilizada), a Figura 4.18 apresenta os dados obtidos em relação à
lipase Amano PS. Através da análise desta figura pode-se verificar que, para esta
enzima, após processamento com propano pressurizado, a forma livre da enzima
pareceu apresentar maior estabilidade que a forma imobilizada.
Com base em todos os resultados apresentados anteriormente, de uma
forma geral, pode-se concluir que a atividade enzimática varia de forma
significativa dependendo da enzima, da forma de apresentação da mesma, do
fluido pressurizado e da condição experimental investigada. Os resultados aqui
apontados permitem definir para cada enzima e em cada forma de apresentação,
(a)
(b)
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
56
faixas de operação em termos de atividade residual para aplicação das mesmas
como catalisadores de reações de hidrólise de interesse, tornando possível, com
base nos dados aqui apresentados e nos resultados apontados na literatura,
verificar que o propano apresenta-se como um solvente adequado à consecução
de tais reações.
Figura 4.18. Compilação dos resultados de atividade enzimática em função da forma de
apresentação (imobilizada e liofilizada) da lipase Amano PS.
Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões
57
5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES
5.1 Conclusões
A realização do presente trabalho permite, de maneira geral, concluir que:
- As lipases apresentam diferentes comportamentos dependendo da forma
de apresentação e das condições experimentais, podendo-se concluir que os
efeitos de interação enzima-solvente apresentam papel fundamental no
comportamento da enzima em fluido pressurizado.
- O propano mostrou-se um solvente adequado à execução de reações
enzimáticas neste meio pois, na maioria dos sistemas avaliados, conduziu a um
aumento da atividade hidrolítica após processamento.
Como conclusões específicas, relativas à cada sistema estudado, pode-se
mencionar:
- O maior incremento da atividade obtido para a lipase Amano PS liofilizada
(aproximadamente 340%) ocorreu na condição de 35
o
C, 30 minutos de exposição
ao propano, taxa de despressurização rápida (50bar/min) e pressão de 200bar;
- Após 30 minutos de processamento em propano pressurizado, a lipase
Amano PS ressuspendida manteve praticamente inalterada sua atividade inicial;
- O processamento da lipase Amano PS ressuspendida em propano a 35
o
C
e pressão de 30bar conduziu, após 180 minutos de exposição, à manutenção da
atividade inicial;
- Incrementos da ordem de 300% foram obtidos após tratamento da lipase
Amano PS imobilizada à 35
o
C, 30 minutos de exposição, taxa de
despressurização lenta (2bar/min) e 30bar de pressão;
- O processamento da lipase Amano AY30 liofilizada conduziu, em
praticamente todas as condições experimentais, à manutenção da atividade inicial;
- Maiores temperaturas (55
o
C) e pressões (200bar) conduziram à inativação
completa da lipase Amano AY30 ressuspendida após exposição de 30 minutos em
propano pressurizado;
Capítulo 5 – Conclusões e Sugestões
58
- O processo de imobilização em Accurel EP100 reduziu significativamente
a atividade hidrolítica da lipase Amano AY30;
- A lipase de Yarrowia lipolytica liofilizada apresentou excelente estabilidade
em termos de atividade de hidrólise após tratamento com propano pressurizado,
em todas as condições experimentais avaliadas;
- A lipase de Yarrowia lipolytica ressuspendida apresentou queda gradativa
de atividade em função do tempo de processamento em propano, tendo sido esta
mais acentuada nas condições de maior temperatura e pressão.
5.2 Sugestões
Tomando como base os resultados obtidos e dadas às observações
constatadas durante o desenvolvimento deste trabalho, pode-se apontar algumas
sugestões para trabalhos futuros:
- Análise da mudança conformacional ocorrida nas enzimas após serem
submetidas a altas pressões através de técnicas como MEV (microscopia
eletrônica de varredura) e análise de infra-vermelho;
- Avaliação do comportamento da atividade das lipases frente ao
processamento em outros fluidos pressurizados (CO
2
, por exemplo);
- Avaliação do comportamento da atividade de outras lipases não
comerciais em fluidos pressurizados;
- Utilização dos resultados obtidos neste trabalho para definir regiões de
operação para reações de hidrólise em meio pressurizado usando lipases como
catalisadores.
Capítulo 6 – Referências Bibliográficas
59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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o
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Capítulo 7 – Anexos
65
7. ANEXOS
Anexo I
Atividade residual das lipases PS e AY30 (Amano Inc.) e de
Yarrowia lipolytica ressuspendidas
em propano pressurizado em função da pressão e da temperatura
Capítulo 7 – Anexos
66
Ativ idade enzimática - 35°C/30bar
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
-2
8
18
28
38
48
58
68
78
88
98
108
118
128
Atividade enzimática
Y arrow ia l ipo lyt ic a
A ma no PS
A ma no AY 30
Atividade enzimática - 45°C/115bar
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Atividade enzimática
Yarrowia lipolytica
Amano PS
Amano AY30
Capítulo 7 – Anexos
67
Ativ idade enzimática - 55°C/30bar
Tempo (min)
Atividade Residual %
-5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 195 215
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
Atividade enzimática
Yarrowia lipolytica
Amano PS
Amano AY30
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