ads:
TATIANA BOTELHO MESCIA
Alterações Bioquímicas e Ultra-estruturais nas
Paredes Celulares de Sementes de Caesalpinia
echinata LAM. (Pau-Brasil) Durante a
Maturação e o Armazenamento
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na Área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
SÃO PAULO
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
TATIANA BOTELHO MESCIA
Alterações Bioquímicas e Ultra-estruturais nas
Paredes Celulares de Sementes de Caesalpinia
echinata LAM. (Pau-Brasil) Durante a
Maturação e o Armazenamento
Dissertação apresentada ao Instituto de Botânica
da Secretaria do Meio Ambiente, como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE VEGETAL
E MEIO AMBIENTE, na Área de Concentração
de Plantas Vasculares em Análises Ambientais.
ORIENTADORA: DRA. MÁRCIA REGINA BRAGA
ads:
Mescia, Tatiana Botelho
M578a Alterações bioquímicas e ultra-estruturais nas paredes celulares de sementes de
Caesalpinia echinata LAM. (Pau-Brasil) durante a maturação e o armazenamento /
Tatiana Botelho Mescia -- São Paulo, 2008.
73 p. il.
Dissertação (Mestrado) -- Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, 2008
Bibliografia.
1. Leguminosae/Caesalpinioideae. 2. Sementes. 3. Parede celular. I. Título
CDU : 582.736
III
“Todos os problemas se tornam infantis depois de explicados”
Sherlock Holmes – Os dançarinos
(Edgar Alan Poe)
Dedico
Á Mara, Cintia, Katia, Tiago e
Zizi. Em especial a meu Pai (In
memorian) pela grande herança
deixada (minha família e o gosto
pelo saber).
IV
AGRADECIMENTOS
Agradeço,
Aos representantes do curso de Pós-Graduação do Instituto de Botânica de São Paulo, Dra.
Sonia Dietrich e Dra. Solange Mazzoni-Viveiros, por propiciarem o início de um longo
caminho.
À minha orientadora, Profa. Dra. Márcia R. Braga primeiro, por confiar, e ao longo do
caminho pelos ensinamentos, e pela grande paciência demonstrada na minha formação e nos
momentos em que as minhas deficiências afloravam.
Á Profa. Dra. Rita de Cássia L. Figueiredo-Ribeiro (IBot) pela oportunidade de trabalhar com
as sementes de pau-brasil, pela valorosa revisão deste trabalho e por todos os valiosos
ensinamentos ao longo desse caminho.
Ao Dr. Prof. Ricardo P. Louro (UFRJ) por dispor de seu tempo, pela enorme boa vontade e
inestimável ajuda na fixação do material e obtenção de cortes para as análises ultra-
estruturais, fundamentais para esse trabalho.
Aos funcionários da Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji-Guaçu, ao Dr.
Marcos Mecca e em especial ao funcionário “Seu” Samuel, pela grande ajuda nas coletas.
À FAPESP pelo apoio financeiro através da bolsa de Mestrado e auxílios aos projetos
temáticos (2000/06422-4 e 2005/04139-7) .
Á minha família, que mesmo não entendendo o meu “Trabalho” e o objetivo dele, sempre me
apoiaram e incentivaram.
Aos queridos amigos e funcionários da Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas,
adquiridos nesses anos de Botânico.
Á Juliana I.O. Mello grande AMIGA, que sempre esteve ao meu lado, ajudando ou
atrapalhando mesmo. Os verdadeiros amigos nos são revelados nos momentos mais
improváveis.
Ao Professor e amigo, Claudio Barbedo, pelos cafés, momentos nos quais aprendi valiosas
lições profissionais e de vida. Obrigado por abrir as portas de sua casa e me apresentar a uma
linda família, Adeliana, Laís e Artur, Vó Anita e Vô Alceu.
Á Kelly Simões pela valiosa ajuda e amizade, durante a realização desse trabalho e por nunca
ter perdido a paciência comigo, mesmo quando eu a importunava com minhas intermináveis
dúvidas.
Á grande amiga, guerreira, e agora mamãe Ludmila Raggi. Pelo apoio, incentivo e confiança
e claro a sua amizade.
As eternas meninas da Fisiologia, Amanda´s Souza, Cinthya Murakamy, Claudia Alves,
Fernanda M, Marina Martins, Roberta Moretto, Simone Leduc, Vanessa Oliveira, Vanessa
V
Costa, Vanessa Rebouças e Lourdes Amaral (minha primeira orientadora), que me apresentou
as paredes celulares. Aos meninos: Dr Marco A. Tiné, por esclarecer as minhas numerosas
dúvidas, Fabio Dalle Molle, Clóvis (C1), Rodrigo Caccere (companheiro de bancada e de
dúvidas), João Paulo Naldi (obrigado pelos Cafés, pelo carinho e amizade). Obrigados a todos
pela paciência, apoio e amizade, nesses mais de três anos de convivência.
À Amanda Asega, Vanessa Oliveira, Fernanda K e Paola Mitie (pazinha) pela valiosa ajuda,
principalmente na execução dos cálculos matemáticos, e claro, pela amizade.
Aos queridos amigos do “Index”, Igor Borges, pela coleta dos frutos de pau-brasil, sem os
quais esse trabalho não teria se iniciado, Moacir, pela ajuda nas coletas, Márcio, Lamarca e
Carol pela amizade e ajuda no dia a dia do laboratório.
Aos amigos de longa (e de pequena) data que sempre estiveram ao meu lado. Daniela
Nogueira, Alessandra Britto, Gilberto, Rossini, aos eternos amigos da faculdade (não irei
detalhar nomes para não correr o risco de esquecer alguém) e a tantos outros que nunca
deixaram de me apoiar e incentivar.
Aos meus queridos e eternos Professores, Nair Itaya, Érika Neiro, Michelangelo Juvenale,
Flavio Molina e Alexandre. Pela minha formação como Bióloga, por acreditarem em mim e
por sempre me incentivarem.
Aos meus gatos, Petit, Kitty, Morceginha, Irmão urso, Fofucho, Gordo, Vick (pipoca) e
Francisco. Por sempre me recepcionarem em casa com carinho e me passarem uma energia
enorme nos momentos mais difíceis durante a elaboração desse trabalho.
Sei que muitos serão esquecidos, não por que não foram importantes em algum momento e
sim porque a minha memória nunca foi tão boa assim. Sintam-se parte disso, como todos os
outros mencionados.
VI
SUMÁRIO
Resumo ...................................................................................................................................VII
Abstract .................................................................................................................................VIII
1. Introdução.......................................................................................................................1
Mata Atlântica e conservação ........................................................................................1
Semente – alterações durante a maturação e o armazenamento ....................................2
Parede celular – estrutura e funções ..............................................................................7
Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil) ........................................................................9
Objetivo ....................................................................................................................................11
2. Material e Métodos ......................................................................................................12
Material vegetal ...........................................................................................................12
Maturação ....................................................................................................................12
Armazenamento ...........................................................................................................13
Análises fisiológicas e bioquímicas .............................................................................13
Análises ultra-estruturais .............................................................................................16
Delineamento experimental e Análise estatística ......................................................17
3. Resultados ....................................................................................................................18
Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante a maturação das sementes .18
Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante o armazenamento das sementes .31
4. Discussão .....................................................................................................................51
Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante a maturação das sementes ..51
Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante o armazenamento das sementes .56
5. Conclusão .....................................................................................................................61
6. Referências bibliográficas ............................................................................................62
7. Anexos ……………………………………………………………………………….70
Análises Ultra-estruturais das sementes de paubrasil durante a maturação.................70
Análises Ultra-estruturais das sementes de pau-brasil durante o armazenamento.......72
VII
RESUMO
Sementes de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil) são tolerantes à dessecação, mantendo
sua viabilidade até 0.08 g H
2
O g
-1
de matéria seca, principalmente quando armazenadas em
baixas temperaturas. Amido é a principal reserva dessas sementes e os carboidratos solúveis
representam cerca de 15%, tendo papel na tolerância à dessecação. Em algumas espécies, a
habilidade de sobreviver à dessecação parece depender também da composição da parede
celular. Neste trabalho, foram analisadas as alterações na composição e ultra-estrutura da
parede celular de sementes de pau-brasil durante a maturação e o armazenamento a diferentes
temperaturas por diferentes períodos. Flores individuais foram marcadas no dia da antese e os
frutos coletados de 45 a 65 dias após a antese (DAA). A análise das paredes celulares revelou
mudanças na composição durante o desenvolvimento das sementes, com redução nos teores
de pectinas ácidas (homogalacturonanos) e considerável aumento nos teores de arabinose nas
frações extraídas em oxalato de amônio (pectinas) e NaOH 1N (hemiceluloses fracamente
ligadas à celulose). Por microscopia eletrônica de transmissão, foi observado um padrão
característico de dobramento da parede celular que é descrito, em outras espécies vegetais,
como essencial para prevenir danos mecânicos aos tecidos durante a dessecação. Sementes
maduras (65 DAA) secas a cerca de 7% foram armazenadas em três temperaturas (7, 25 e -18
ºC) e após 30, 60 e 180 dias essas sementes tiveram o rendimento e a composição da parede
celular avaliados. Sementes armazenadas nas mesmas condições por 338 dias foram utilizadas
para análises ultra-estruturais. Com exceção da temperatura de congelamento, que reduziu o
rendimento em parede celular, não foi observada alteração em relação à massa seca das
sementes durante o armazenamento. Entretanto, a proporção relativa das frações de parede
celular sofreu modificações ao longo do armazenamento, independentemente da temperatura.
Foram observadas flutuações nas proporções relativas dos monossacarídeos componentes de
cada fração, principalmente de arabinose e galactose, porém essas variações parecem não
estar diretamente relacionadas à manutenção ou perda da capacidade germinativa das
sementes durante o armazenamento. Considerando que polímeros ricos em arabinose têm sido
encontrados em plantas que sobrevivem a períodos repetidos de dessecação e re-hidratação e
que sua presença implica em aumento na flexibilidade da parede celular nessas plantas,
nossos resultados sugerem as alterações que ocorrem na parede celular durante o
desenvolvimento das sementes de pau-brasil podem contribuir para a manutenção da
viabilidade durante o processo de dessecação que ocorre no final da maturação.
VIII
ABSTRACT
Seeds of Caesalpinia echinata Lam. (brazilwood) are tolerant to desiccation, keeping their
viability up to 0.08 g H
2
O g
-1
DM, mainly when stored under low temperatures. Starch is the
main reserve in these seeds and soluble carbohydrates make up for about 15%, playing a role
in desiccation tolerance. In some species, the ability to survive desiccation seems also to be
related with the cell wall composition. In the present work we report changes in cell wall
structure and composition in brazilwood seeds during development and storage under
different temperatures, aiming at a better understanding of the involvement of structural
polysaccharides in the maturation and storability of these seeds. Individual flowers were
tagged in the day of anthesis and pods were collected from 45 to 65 days after anthesis
(DAA). Cell wall analysis revealed significant changes in composition during development,
with a considerable decrease in acidic pectic polysaccharides (homogalacturonans) and
increase in arabinose content in the ammonium oxalate-soluble (pectins) and weak (NaOH
1N) alkali fractions (hemicelluloses). By transmission electron microscopy, a
characteristic
pattern of
c
ell wall folding
was observed
in brazilwood dry seeds that is ascribed as essential to
prevent mechanical damage to the tissues during desiccation in other species.
Mature seeds (65
DAA) dry up to 7% of water were maintained at 7, 25, and -18 ºC and for 30, 60 e 180 days
before analyzing cell wall yield and composition. Seeds stored at the same conditions for 338
days were used for ultrastructural analysis. Excepting for freezing temperature, which led to a
decrease in cell wall content, no alterations on dry mass basis were observed in cell wall yield
during storage. However, the relative proportion of cell wall fractions changed during storage,
independently of the temperature. Changes in the relative monosaccharide proportion of each
fraction were observed, mainly in the arabinose and galactose contents. However, these
changes seem not to be related with the maintenance or loss of the seed germinability during
storage. Considering that arabinose-rich polymers have been found in plants that survive to
repeated periods of desiccation and rehydration and their presence is implicated in the
increase of cell wall flexibility in these plants, our results might suggest a role for arabinans in
allowing highly fold walls in the brazilwood seeds, therefore contributing to the maintenance
of viability during the dehydration process that occurs during seed maturation.
1
1. Introdução
1.1 Mata Atlântica e Conservação
O Brasil é considerado uma das nações mais ricas em biodiversidade (Mittermeier et
al. 2005), sendo as florestas tropicais as maiores responsáveis por essa riqueza (Lino 1992).
No Brasil, a Mata Atlântica é a segunda maior floresta tropical em extensão, sendo
cerca de quatro vezes menor do que a Floresta Amazônica, entretanto, é proporcionalmente a
que apresenta a maior diversidade biológica (Lino 1992, Mittermeier et al. 2005, INPE &
Fundação SOS Mata Atlântica 2006). Abriga mais de 20.000 espécies de plantas arbóreas,
sendo destas 8.000 endêmicas (Schaffer & Prochnow 2002, Siqueira Filho & Leme 2006,
Fundação SOS Mata Atlântica 2007, Conservation International 2007). O bioma Mata
Atlântica abrange diversas formações florestais como as florestas ombrófilas densas e mistas
e ecossistemas associados que incluem restingas, mangues, dentre outros, formando com isso
um grande mosaico de vegetação. No Brasil, estende-se do Rio Grande do Norte ao Rio
Grande do Sul (Schaffer & Prochnow 2002, Tabarelli et al. 2005, Siqueira Filho & Leme
2006, INPE & Fundação SOS Mata Atlântica 2006).
O papel da Floresta Atlântica vai além de abrigar uma das maiores diversidades
biológicas do mundo. Ela regula o fluxo de mananciais hídricos, o clima, a temperatura e a
umidade do ar, além de ajudar na manutenção da fertilidade do solo, protegendo as encostas e
escarpas de erosão (Schaffer & Prochnow 2002, Lino 1992).
A alta diversidade e o alto endemismo desse ecossistema o tornam extremamente
frágil (Lino 1992). Na época do descobrimento, a Mata Atlântica cobria cerca de 15% do
território nacional, aproximadamente 1.000.000 Km
2
e, foi a partir deste, com a exploração
desordenada, principalmente da madeira de pau-brasil – Caesalpinia echinata Lam., que a
devastação da Mata Atlântica teve início (Schaffer & Prochnow 2002, Tabarelli et al. 2005,
Fundação SOS Mata Atlântica 2007, Conservation International 2007).
Algumas medidas para frear a exploração irracional dos recursos naturais da Mata
Atlântica foram tomadas tais como o seu reconhecimento como reserva da biosfera pela
UNESCO, em 1991, e pela definição quanto à exploração de seus recursos naturais,
estabelecidos através do projeto de Lei Federal nº 750 de 1993. Entretanto, essas poucas ações
foram insuficientes e hoje sua área está extremamente reduzida e fragmentada, restando
apenas 7% do seu território original (Schaffer & Prochnow 2002, Conservation International
2
2007, INPE & SOS Mata Atlântica 2006). Por ter tido grande parte de seu território devastado
e por apresentar uma grande diversidade biológica com alto endemismo, o bioma Mata
Atlântica é classificado como um hotspot de grande importância para conservação da
biodiversidade no mundo (Myers et al. 2000).
Dentre as estratégias de preservação dos recursos florestais estão incluídas a
conservação in situ e a ex situ. A conservação in situ prevê a manutenção das espécies em seu
habitat natural, na forma de reservas biológicas e ecológicas e parques. A conservação ex situ
é realizada fora do ambiente natural da espécie, podendo ser feita na forma de coleções de
plantas no campo, de bancos de sementes ou na forma de coleções de plântulas in vitro
(Botanic Gardens Conservation International 2001 apud Rocha 2004). Apesar da conservação
in situ ser a mais eficiente e recomendada para a preservação da variedade genética das
espécies e ter baixo custo de implantação, esta se torna menos viável por necessitar de
medidas políticas específicas para sua implantação (Siqueira et al.1993).
Apesar da conservação ex situ ser considerada uma medida complementar à
conservação in situ (Botanic Gardens Conservation International 2001 apud Rocha 2004),
hoje em dia ela é a mais utilizada, principalmente na forma de banco de sementes, já que esta
é a principal unidade de propagação da maioria das plantas superiores (Santos 2000). Segundo
Hong & Ellis (1996), para que a conservação das sementes seja realizada com sucesso há a
necessidade que se conheça o seu comportamento fisiológico em relação à secagem e ao
armazenamento.
1.2 Semente - alterações durante a maturação e o armazenamento
As sementes desenvolvem-se a partir de um óvulo fertilizado (Bewley & Black 1994)
e são basicamente constituídas por três estruturas: o embrião, o endosperma e o tegumento ou
testa (Bewley & Black 1994, Cardoso 2004a). Durante o desenvolvimento do embrião e até
que este atinja sua maturidade fisiológica são definidas três fases principais. A
histodiferenciação ou embriogênese, que é a fase inicial e consiste de intensas divisões
celulares e diferenciação, na qual serão formados os tecidos do embrião e do endosperma. É
nessa fase que ocorre um rápido aumento da massa fresca da semente e do conteúdo de água.
A etapa seguinte, denominada fase de maturação, é caracterizada pela expansão celular e pela
deposição de reservas, normalmente proteínas, lipídios ou carboidratos, nos tecidos de
armazenamento (endosperma, cotilédones ou no megagametófito), aumentando com isso a
massa seca da semente. Em algumas sementes, ao final do período de maturação, ocorre uma
3
redução do conteúdo de água e diminuição da massa fresca total da semente. Essa fase é
iniciada com a interrupção das conexões vasculares entre a semente e a planta mãe (Bewley &
Black 1994, Cardoso 2004a).
As sementes podem ser classificadas quanto ao seu comportamento em relação ao
armazenamento e à sensibilidade à dessecação, em ortodoxas (tolerantes a dessecação e ao
armazenamento em baixas temperaturas) e recalcitrantes (sensíveis à dessecação e ao
armazenamento em baixas temperaturas) (Roberts 1973). Entretanto, hoje se sabe que existe
um gradiente de tolerância à dessecação e sensibilidade ao armazenamento, sendo muitas
sementes consideradas intermediárias em relação a esse comportamento (Hong & Ellis 1996).
A aquisição da tolerância à dessecação pelo embrião, nas sementes ortodoxas, é
normalmente um processo gradual, que ocorre ao longo do seu desenvolvimento, sendo
perdido na fase de germinação (Bewley & Black 1994). Essas sementes possuem mecanismos
para prevenir os possíveis danos causados pela dessecação. Dentre esses mecanismos estão o
acúmulo de oligossacarídeos, açúcares e proteínas específicas (Blackman et al. 1991).
Durante o desenvolvimento e o armazenamento de sementes, geralmente ocorrem
variações nos carboidratos solúveis como a sacarose, frutose, glucose e oligossacarídeos da
série rafinósica e também no teor de amido (Garcia et al. 2006). Os carboidratos solúveis
estão envolvidos não só com a reserva de carbono nas plantas, mas possuem funções
adicionais. Este é o caso da sacarose, que além de servir como substrato para a síntese dos
oligossacarídeos da série rafinósica, também estaria envolvida no processo de aquisição de
tolerância à dessecação em sementes ortodoxas, que juntamente com os oligossacarídeos da
série da rafinose, estabilizariam as membranas durante o processo de secagem, ao final da
fase de maturação (Nkang 2002, Buckeridge et al. 2004).
Sementes maduras de diversas espécies como Sinapis alba, Glycine max e Brassica
campestris têm a concentração de açúcares solúveis aumentada com o início da tolerância à
dessecação (Bewley & Black 1994). A aquisição da tolerância à dessecação em sementes de
soja e milho foi associada, principalmente, ao aumento nos níveis de sacarose, de
oligossacarídeos da série da rafinose e aos ciclitóis (Bernal-Lugo & Leopold 1992, Sun et al.
1994, Obendorf 1997).
Um dos mecanismos que podem contribuir para a tolerância à dessecação em sementes
é a formação de um estado vítreo nas células, que é caracterizado pela alta viscosidade e por
retardar as reações metabólicas, contribuindo para a longevidade das sementes após a
4
secagem (Buitink et al. 2000, Hoekstra et al. 2001). A sacarose teria papel fundamental na
formação do estado vítreo, preservando a estrutura dos fosfolipídios e, assim, exercendo sua
função protetora durante a secagem.
Para Koster (1991), a formação do estado vítreo nas células é dependente da proporção
entre sacarose e oligossacarídeos existentes nos tecidos, sendo que grande quantidade de
sacarose, na presença de pequena quantidade de oligossacarídeos, pode causar danos às
membranas celulares, quando as sementes são secas (Lin & Huang 1994). Esses
oligossacarídeos não estariam envolvidos diretamente na formação do estado vítreo e sim na
manutenção deste (Buitink et al. 2000), uma vez que estes preveniriam a cristalização da
sacarose durante a secagem (Caffrey et al. 1988 apud Koster 1991, Lin & Huang 1994).
Além de atuarem na aquisição e manutenção da tolerância à dessecação em sementes,
os oligossacarídeos da série da rafinose podem ser considerados, em alguns casos, como
indicadores do comportamento das sementes quanto ao armazenamento, uma vez que maiores
teores foram encontrados em sementes ortodoxas quando comparados aos das recalcitrantes
(Steadman et al. 2000). Além disso, durante o armazenamento os altos teores de sacarose e de
oligossacarídeos foram correlacionados positivamente com a longevidade de sementes
ortodoxas (Horbowicz & Obendorf 1994, Lin & Huang 1994).
Apesar dos teores de sacarose e de oligossacarídeos da série da rafinose terem sido
associados à tolerância à dessecação e com a categoria de armazenamento em algumas
sementes ortodoxas, esse comportamento não é uma regra. Black et al. (1999) não
encontraram correlação entre a tolerância à dessecação e a presença de oligossacarídeos da
série da rafinose em embriões imaturos de trigo, indicando que outros mecanismos seriam os
responsáveis pela tolerância a dessecação nessas sementes. Além disso, em sementes de
Caesalpinia echinata (pau-brasil), considerada ortodoxa e tolerante ao armazenamento em
baixa temperatura, foram encontrados teores mínimos de oligossacarídeos da série da rafinose
(Garcia et al. 2006, Hellmann 2006, Leduc 2007), indicando que para essa espécie esse açúcar
não é o principal fator na aquisição da tolerância a dessecação e ao armazenamento.
As proteínas também podem estar associadas a esse mecanismo, especialmente as
chamadas "Late Embryogenesis Abundant” (LEA), que atuariam como agentes de solvatação
de outras proteínas de membrana, protegendo-as contra possíveis danos decorrentes da
desidratação (Blackman et al. 1995, Bewley 1997, Cardoso 2004b). Blackman et al. (1995)
observaram que durante a maturação de sementes de soja (Glycine max) o nível de expressão
5
das chamadas “proteínas de maturação”, ou proteínas LEA, aumentava a medida que estas
adquiriam a tolerância à dessecação e esses níveis declinavam com o início do processo de
germinação, período no qual as sementes podem tornar-se sensíveis à dessecação.
Em sementes que não apresentam mecanismos para prevenir os danos pela secagem, a
desidratação pode acarretar mudanças na composição dos fosfolipídios de membrana,
afetando a sua integridade. As conseqüências desses danos usualmente são observadas
durante o processo de re-hidratação, com a exsudação dos constituintes celulares durante o
processo de re-hidratação (Priestley & Willians 1985).
Embora a deterioração das sementes possa estar associada ao armazenamento, o
processo inicia-se logo após as sementes atingirem a maturidade fisiológica. Apesar de ser um
processo irreversível e de não poder ser evitado, a deterioração pode ser retardada. A
deterioração das sementes é um evento que envolve alterações fisiológicas, bioquímicas,
físicas e citológicas (Toledo & Marcos Filho 1977, Villela & Peres 2004, Marcos Filho 2005).
Apesar de vários fatores influenciarem a manutenção da viabilidade das sementes
durante o armazenamento, a temperatura e a água seriam aqueles que mais atuam nesse
processo (Marcos Filho 2005). Teores elevados de água podem diminuir a longevidade das
sementes, alterando o seu metabolismo e permitindo a proliferação de patógenos que são
prejudiciais à manutenção de sua capacidade germinativa. Em contrapartida, a secagem e a
manutenção das sementes em baixas temperaturas podem manter sua viabilidade (Toledo &
Marcos Filho 1977, Vertucci & Ross 1990, Barbedo & Marcos Filho 1998, Villela & Peres
2004). Além do conhecimento do teor de água e da temperatura, é necessário investigar as
alterações bioquímicas que ocorrem nas sementes durante o armazenamento (Kermode 1990).
A diminuição da temperatura durante o armazenamento estabilizaria a atividade enzimática, o
que favoreceria o metabolismo de carboidratos envolvidos na manutenção da integridade das
membranas celulares, como a sacarose, os oligossacarídeos da série da rafinose e os ciclitóis
(Peterbauer & Richter 2001).
Estudos com sementes de trigo, arroz, milho, feijão e outras leguminosas mostraram
que exposições a elevadas temperaturas e alta umidade relativa provocaram desestruturação e
perda da integridade do sistema de membranas. Tal alteração ocasionou uma série de reações
tais como desnaturação de proteínas, diminuição nos teores de carboidratos, aumento no teor
de ácidos graxos, entre outros, diminuindo a viabilidade das sementes durante o
armazenamento (Marcos Filho 2005 e referências nele contidas).
6
A perda da germinabilidade de sementes de milho submetidas ao envelhecimento
acelerado foi associada a uma drástica diminuição nos teores de carboidratos (Bernal-Lugo &
Leopold 1992). Comportamento semelhante foi observado durante o armazenamento de
sementes de azevém (Lolium multiflorum Lam.), que apresentaram correlação positiva entre
os teores de açúcares solúveis e a manutenção da germinabilidade. Além disso, foi observado
que durante o armazenamento houve aumento da solubilidade do amido, entretanto, não
houve correlação entre os teores desse polissacarídeo e a qualidade fisiológica das sementes.
Outro fator que agiu de forma negativa na manutenção da germinabilidade das sementes de
azevém durante o armazenamento foi o aumento nos teores de aminoácidos livres,
provenientes provavelmente da desestruturação de proteínas (Eichelberger et al. 2002).
Estudos de armazenamento de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris) em temperatura
ambiente e com elevado teor de água mostraram aumento significativo no número e
diminuição no tamanho dos grãos de amido. Simultaneamente, foi observada ruptura das
paredes celulares e das membranas de organelas, incluindo dos corpos protéicos (Begnami &
Cortelazzo 1996, Cortelazzo et al. 2005). Análises ultra-estruturais de sementes de Dyckia
pseudococcinea criopreservadas por 12 e 24 meses (Borges 2005) mostraram que as
principais diferenças entre sementes recém coletadas e armazenadas foram o número, as
dimensões e a integridade dos grãos de aleurona, o tamanho dos amiloplastos e o tamanho e
arranjo dos corpos protéicos do endosperma.
Alguns estudos mostraram que nem o acúmulo dos açúcares e nem a presença das
proteínas LEA são, sozinhos, suficientes para conferir tolerância à dessecação em sementes
ou para manter a viabilidade destas durante o armazenamento. Outros carboidratos, como
aqueles encontrados em paredes celulares, substâncias antioxidantes e outros mecanismos
reparatórios também podem participar desse processo (Blackman et al. 1995, Peterbauer &
Richter 2001).
A qualidade nutricional e a viabilidade das sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.),
segundo Shiga et al. (2004), são diretamente influenciadas por alterações na estrutura dos
polissacarídeos de parede celular durante o armazenamento. Esses autores observaram que as
sementes armazenadas em temperatura ambiente (±19 ºC) apresentavam diminuição na
solubilização dos polissacarídeos de parede celular, o que acarretou endurecimento dos
tecidos. Esse fator diminuiu a porcentagem de germinação e elevou o tempo de cozimento
dessas sementes, fenômeno conhecido como “Hard to Cook”. Por outro lado, o
armazenamento em baixa temperatura (±4 ٥C) não alterou a composição das paredes
7
celulares, mantendo a viabilidade dessas sementes. Sasaki (1983), estudando a maturação de
sementes de soja, relatou que ao mesmo tempo em que ocorriam alterações nos açúcares
solúveis era observada substituição dos polissacarídeos da parede celular ricos em arabinose
por galactanos, nos estágios tardios da maturação.
1.3 Parede Celular – estrutura e funções
Juntamente com o amido e os carboidratos solúveis, os polissacarídeos acumulados
nas paredes celulares das sementes também atuam como reserva energética (Buckeridge et al.
2004). Esses polissacarídeos representam os principais constituintes químicos da parede
celular, juntamente com as proteínas estruturais e compostos fenólicos (Carpita & McCann
2000).
A parede celular é uma estrutura de grande importância para as células vegetais, pois a
sua forma é ditada em grande parte por ela. A parede celular direciona o crescimento da
célula, exercendo profunda influência no desenvolvimento e na morfologia das plantas. Suas
características determinam também as funções das células nos tecidos vegetais, além de
conferir resistência mecânica aos mesmos, entre outras características (Carpita & McCann
2000).
A parede celular vegetal, denominada de primária, é normalmente encontrada em
tecidos em crescimento, e secundária em tecidos maduros que completaram o crescimento
(Silveira & Amaral 2000, Carpita & McCann 2000). A parede primária é composta
principalmente por celulose, hemiceluloses, substâncias pécticas e proteínas. Na parede
secundária, as proteínas e as substâncias pécticas são constituintes minoritários, enquanto as
hemiceluloses e a celulose são encontradas em maior porcentagem. Entre as paredes primárias
de células vizinhas existe uma estrutura denominada de lamela média que tem função de unir
as células, e é formada basicamente por substâncias pécticas (Silveira & Amaral 2000, Carpita
& McCann 2000).
A celulose é o polissacarídeo da parede celular mais conhecido, contabilizando de
20% a 30% da massa seca da parede primária da maioria das células, sendo particularmente
abundante na parede celular secundária. Ela é encontrada na forma de microfibrilas (McNeil
et al. 1984), formadas por cadeias simples de moléculas de glucose unidas por ligações
glicosídicas β−(1→4) (McNeil et al. 1984, Carpita & McCann 2000, Silveira & Amaral
2000). Segundo McNeil et al. (1984), a disposição das microfibrilas recém depositadas
determina a morfologia da célula em crescimento.
8
As hemiceluloses ligam-se às microfibrilas de celulose através de pontes de
hidrogênio, formando uma rede complexa. As principais hemiceluloses das plantas superiores
são o xiloglucano, o glucuronoarabinoxilano e o β-glucano. O xiloglucano ocorre nas
dicotiledôneas e nas monocotiledôneas conhecidas como comelinóides. Ele é formado por
unidades de glucose unidas por ligações β-(1→4), as quais são ramificadas com ligações
α−(1→6) por unidades de D-xilopiranose, na proporção de 4:3, e um número variável de
unidades de galactose (Buckeridge et al. 2000a, Carpita & McCann 2000). Nas sementes,
além do xiloglucano estrutural, existe o xiloglucano de reserva, que difere do estrutural pela
ausência de unidades de fucose. O glucuronoarabinoxilano é a principal hemicelulose das
monocotiledôneas, e o β-glucano a principal hemicelulose da Ordem Poales, que inclui os
cereais e as gramíneas forrageiras (Buckeridge et al. 2000a, Carpita & McCann 2000).
As pectinas são polissacarídeos ramificados, altamente hidratados e heterogêneos,
constituídos por ácido galacturônico. As pectinas têm papel fundamental no transporte de
íons, além de determinar a porosidade da parede e regular a adesão célula-célula por meio da
lamela média, participando, ainda, da defesa celular, entre outras funções (Carpita & McCann
2000). Existem três tipos de pectinas: o homogalacturonano (HGA), o ramnogalacturonano I
(RGI) e o ramnogalacturonano II (RGII). O HGA é um polímero constituído por ácido
galacturônico com ligações α (1→4), podendo apresentar diferentes graus de
metilesterificação. O RG I é um heteropolímero formado por unidades repetitivas de um
dissacarídeo (ramnose ligada α−(1→2) – Gal α−(1→4)). O RG I pode ter ramificações de três
polissacarídeos neutros, arabinano, galactano e arabinogalactano, ligados na posição O-4 das
unidades de ramnose. O RG II possui uma cadeia principal formada de ácido galacturônico
ligado α-(1→4) com ramificações de açúcares raros e pouco freqüentes em paredes celulares.
É a mais complexa das pectinas e a menos abundante e está presente em todas as plantas
superiores, sugerindo uma importante função ainda não esclarecida (Buckeridge et al. 2000b,
Carpita & McCann 2000, Silveira & Amaral 2000, Buckeridge et al. 2004).
A parede celular tal como foi descrita quimicamente não é uma estrutura estática, que
uma vez formada teria unicamente função mecânica. Ela é uma estrutura dinâmica, que
durante o desenvolvimento da planta tem sua composição e estrutura continuamente alteradas.
O desenvolvimento da planta envolve uma série coordenada de processos bioquímicos,
incluindo a biossíntese e degradação de componentes das paredes celulares (Stolle-Smits et
al.1999).
9
Existem poucos trabalhos relacionando as alterações dos polissacarídeos de parede
celular com a maturação e o armazenamento de sementes. Koch et al. (1999) e Markovic &
Obendorf (1999) avaliaram a influência do metanol, proveniente da ação da enzima pectina
metilesterase (PME), sobre a maturação e posterior deterioração de sementes de soja na fase
de pré-colheita. A pectina metilesterase é uma importante enzima de parede celular, envolvida
em diferentes processos incluindo a adesão celular e o crescimento caulinar. Essa enzima
catalisa a desmetilesterificação das moléculas de pectina (HGI), liberando, principalmente
metanol (Micheli 2001). A atividade da pectina metilesterase também está envolvida na
quebra da dormência de sementes de cedro amarelo (Ren & Kermode 2000).
McCartney et al. (2000), utilizando anticorpos monoclonais específicos para
polissacarídeos pécticos da parede celular, estudaram as alterações e a complexidade desses
polímeros durante a maturação de sementes de ervilha. Esses autores constataram que existem
alterações espaço-temporais na deposição das pectinas e que essas modificações estariam
relacionadas com as propriedades mecânicas dessas paredes, o que seria uma preparação para
a dessecação, já que ocorrem ao final da fase de maturação.
Estudos com as chamadas “plantas que ressuscitam” mostraram que, ao serem
desidratadas, apresentavam um dobramento de suas paredes celulares resultando em uma
compactação da célula. Esse dobramento da parede celular acompanhou a desidratação do
protoplasto, evitando o deslocamento da membrana plasmática e mantendo a organização
celular (Farrant 2000, Moore et al. 2006). Análises da composição da parede celular dessas
plantas revelaram alto teor de arabinanos (Moore et al. 2006), como aqueles relatados em
sementes ortodoxas como o feijão (Shiga et al. 2004).
1.4 Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil)
O pau-brasil é uma leguminosa (Figura 1A) endêmica da Mata Atlântica, de extrema
importância histórica para o Brasil, não só por ter sido o primeiro produto de comércio, mas
principalmente por ter dado nome ao país (Rocha 2004). A exploração do pau-brasil desde a
época da colonização, servindo como matéria prima para a produção de corantes e confecção
de barcos, levou à drástica redução das populações naturais da espécie. Devido a esse fato,
desde 1994, o pau-brasil encontra-se na lista do IBAMA de espécies em risco de extinção.
Sua distribuição geográfica atual restringe-se à Mata Atlântica na costa do Brasil, do Rio
Grande do Norte ao Rio de Janeiro (Rocha 2004), concentrando-se em três regiões com
florestas mais secas (Carvalho et al. 2005).
10
As sementes de pau-brasil (Figura 1B) apresentam comportamento ortodoxo,
tolerando a secagem até cerca de 7% do teor de água, contudo, apresentam um curto período
de viabilidade quando armazenadas à temperatura ambiente. Além disso, a sua sensibilidade à
secagem é influenciada pela qualidade inicial das sementes (Barbedo et al. 2002). O vigor e a
germinação das sementes de pau-brasil também dependem do ponto de maturidade fisiológica
no qual as sementes são colhidas (Borges et al. 2005). Teixeira et al. (2004) notaram a
presença de estômatos no tegumento das sementes de pau-brasil e a ausência de camadas de
osteosclereídeos, características estas que poderiam contribuir para a baixa longevidade
dessas sementes em condições naturais (Borges et al. 2005). Segundo Garcia et al. (2006) a
capacidade germinativa das sementes de pau-brasil, durante o armazenamento,
aparentemente, está relacionada com as variações nos carboidratos solúveis. Esses autores
observaram uma alteração na proporção de glucose e frutose, em relação à de sacarose. Sendo
as sementes de pau-brasil preservadas por até 18 meses quando armazenadas sob temperaturas
baixas. Entretanto ao longo da maturação das sementes de pau-brasil, Borges et al. (2006)
notaram que os teores de ciclitóis aumentavam à medida que essas sementes adquiriam a
maturidade e que o acúmulo de alguns desses açúcares álcoois coincidia com a porcentagem
máxima de germinação.
Figura 1. Aspectos gerais de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil). A – Exemplar
adulto, B – sementes maduras, C – frutos imaturos, D – inflorescência, E – tronco com
acúleos. Barras = 30 cm (figura A), 1 cm (figuras B, C e D) e 5 cm (figura E). (Prancha
gentilmente cedida por J.I.O. Mello).
11
Contudo Hellmann (2006) observou que apesar de ocorrerem flutuações nos teores de
carboidratos de reserva das sementes de pau-brasil armazenadas em baixas temperaturas,
essas flutuações parecem não ter influência direta sobre a viabilidade dessas sementes.
Resultado semelhante foi encontrado por Mello (2008) em sementes de pau-brasil congeladas
por 30 dias, com diferentes teores de água. Foi observado que durante o período de
armazenamento a – 18 °C ocorreu pequena diminuição no teor de amido, ao passo que o teor
de carboidratos solúveis aumentou. Entretanto, a porcentagem de germinação não foi alterada,
mantendo valor próximo de 90% durante todo o período de armazenamento.
Apesar de vários fatores terem sido analisados em relação à tolerância à dessecação
nas sementes de pau-brasil, ainda existem várias lacunas a serem preenchidas, uma vez que, o
processo de redução da germinação e deterioração ocorre como conseqüência de uma série de
eventos como a desorganização de membrana plasmática, redução e mudanças estruturais nas
fontes energéticas, a exemplo das proteínas e carboidratos. Dessa forma, a análise estrutural
durante o armazenamento de sementes pode ser uma ferramenta importante para
monitoramento de alterações subcelulares e avaliar os efeitos causados durante o processo.
Além disso, a relação dessas variações com outras que possivelmente ocorrem nos
polissacarídeos das paredes celulares ainda é desconhecida. Assim, o conhecimento da
dinâmica dos polissacarídeos das paredes celulares durante a maturação e o armazenamento
poderá auxiliar no entendimento da baixa longevidade apresentada pelas sementes de pau-
brasil quando armazenadas em temperatura ambiente.
Objetivo
Analisar a composição e a estrutura das paredes celulares de sementes de pau-brasil
durante a maturação e o armazenamento em diferentes temperaturas, objetivando avaliar se
alterações nessa organela podem estar relacionadas à aquisição da tolerância a dessecação
durante a maturação e à deterioração durante o armazenamento.
12
2. Material e Métodos
2.1 Material vegetal
As sementes de Caesalpinia echinata Lam. - Leguminosae (pau-brasil) - utilizadas
neste trabalho, nos estudos de maturação e de armazenamento, foram coletadas de plantas
cultivadas em arboreto experimental homogêneo, com cerca de 250 árvores, existente na
Reserva Biológica e Estação Experimental de Moji-Guaçu (RBEEMG), município de Mogi-
Guaçu, SP, (22°15-16' S e 47°8-12' W). Em alguns experimentos também foram utilizadas
sementes procedentes de árvores adultas mantidas na área do Instituto de Botânica de São
Paulo.
Inflorescências que apresentavam mais da metade das flores em antese foram
marcadas no período de máximo florescimento da espécie, que ocorreu no mês de novembro
de 2006 e 2007 nas áreas de coleta.
2.2 Maturação das sementes de pau-brasil
Os frutos foram coletados diretamente das árvores aos 45, 55 e 65 dias após a antese
(DAA), caracterizando diferentes fases de maturação das sementes (Figura 2), conforme
descrito por Borges et al. (2005). O material vegetal foi trazido para o Laboratório de
Sementes e Melhoramento Vegetal do Instituto de Botânica de São Paulo. Os frutos foram
abertos manualmente, as sementes foram selecionadas, sendo descartadas aquelas que
apresentaram danos por insetos e má formação.
Figura 2. Aspecto geral de sementes de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil) em
três estádios de maturação. A: sementes com 45 DAA; B: sementes com 55 DAA; C:
sementes com 65 DAA. Barra = 1cm.
13
2.3 Armazenamento das sementes de pau-brasil
Os frutos contendo sementes maduras (65 DAA) de pau-brasil foram trazidos para o
Laboratório de Sementes e Melhoramento vegetal, do Instituto de Botânica de São Paulo e
mantidos em temperatura ambiente até sua deiscência, sendo denominados T0 fresco.
Adicionalmente, sementes recém dispersas (menos de 24h da dispersão) foram colhidas e
secas ao sol (denominadas T0 seco).
As sementes maduras e recém dispersas, (T0 seco) foram armazenadas por 30, 60, 180
e 338 dias em câmara fria (7 ± 2 ºC), em temperatura ambiente do laboratório (25 ± 5 ºC) e
somente por 180 dias em congelador (-18 ºC). As temperaturas e períodos de armazenamento
foram selecionados com base em estudos anteriores realizados por Barbedo et al. (2002) e
Hellmann et al. (2006).
2.4 Análises fisiológicas e bioquímicas
As sementes utilizadas no estudo de maturação, logo após a coleta, e as sementes
utilizadas no estudo de armazenamento, após a coleta e após cada período de armazenamento,
foram analisadas pelos métodos descritos a seguir. Para as análises bioquímicas foram
descartados os tegumentos das sementes e todas as análises foram realizadas em triplicatas.
2.4.1 Determinação do teor de água e matéria seca
O teor de água (expresso em porcentagem, com base na massa úmida, %
bu
) e o
conteúdo de matéria seca (g.semente
-1
) foram determinados através do método de estufa a 103
ºC por 17 horas (ISTA 1985), em quatro repetições de cinco sementes cada. Para os diferentes
estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA), devido ao menor número disponível, foram
utilizadas três sementes por repetição para a determinação desses parâmetros.
2.4.2 Testes de germinação
Para os testes de germinação foram utilizadas quatro repetições de 12 sementes, em
rolos de papel para germinação (Germitest), previamente umedecidos com água até sua
saturação e escorrendo-se o excesso. Os rolos foram colocados em germinadores Marconi tipo
MA400 com circulação interna de água, a 25±1 ºC, com fotoperíodo de 12 horas e elevada
umidade relativa do ar (Mello & Barbedo 2007). As leituras para este teste foram iniciadas a
14
partir do segundo dia, em dias alternados, registrando-se as sementes germinadas (protrusão
da raiz primária de no mínimo 5 mm) e com desenvolvimento normal (presença de sistema
radicular e parte aérea sem aparentes defeitos) (Barbedo et al. 2002, Borges et al. 2005).
Foram calculados os índices de Índice de velocidade de germinação (IVG), Tempo médio de
germinação (Tm) e variância do tempo médio de germinação (S
2
Tm) (Santana & Ranal
2004).
2.4.3 Extração e quantificação de açúcares solúveis
As sementes foram pesadas, descascadas, homogeneizadas manualmente e fervidas em
etanol 80% (10mL/g peso fresco) por 10 min (por três vezes), para extração dos açúcares
solúveis. Após cada extração, o material foi centrifugado por 5 minutos a 1294 g e os
resíduos lavados com água destilada (10 mL/g) a 60 ºC, congelados e liofilizados.
Os extratos etanólicos foram concentrados em evaporador rotatório até eliminação do
álcool e utilizados para quantificação de carboidratos solúveis totais pelo método do fenol-
sulfúrico (Dubois et al. 1956), utilizando glucose como padrão. Os açúcares redutores foram
avaliados pelo método de Somogyi-Nelson (Somogyi 1945), também tendo glucose como
padrão.
2.4.4. Extração de lipídios
Os resíduos da extração de açúcares solúveis foram lavados (10 mL/g) três vezes em
clorofórmio:metanol (1:1, v/v) por 20 min, duas vezes em acetona pura por 10 min e duas
vezes em éter etílico também por 10 min. Sempre após cada lavagem, o material foi
centrifugado por 10 min a 1294 g. Os sobrenadantes de cada extração foram reunidos e
deixados em capela até completa evaporação do solvente, sendo pesados e os pesos
considerados como uma estimativa do rendimento em lipídios.
Os resíduos deslipidizados foram mantidos em capela até completa evaporação do
solvente, sendo pesados e utilizados para extração de amido.
2.4.5. Extração e quantificação de amido
Para extração de amido, ao resíduo da extração lipídica foi adicionado DMSO a 90%
(10 mL/g) (adaptado de Gorshkova et al. 1996), que permaneceu sob agitação por 16 h. O
material foi centrifugado por 15 min a 1294 g, sendo o sobrenadante coletado. Mais quatro
15
extrações com DMSO 90% (10mL/g) foram realizadas, sendo duas delas por 4 h cada, e as
outras duas por uma noite em câmara fria, a 5 ºC. Após cada extração, o material foi
centrifugado por 15 min a 1294 g e o sobrenadante coletado. O precipitado foi lavado
exaustivamente em água destilada, para remoção completa do DMSO e o sobrenadante foi
reunido à fração de DMSO.
Após a remoção do amido por DMSO, o resíduo foi tratado por 24 h a 30 ºC com
Amiloglucosidase (AMG) para a retirada do amido resistente. Foram utilizadas 50 U da
enzima e um volume de 500 µl para cada 500 mg de material. Após centrifugação a 1294 g,
por 5 min, o material foi lavado duas vezes com água destilada, com o mesmo volume
utilizado para a AMG. As duas frações foram reunidas e os carboidratos totais e os ácidos
urônicos foram quantificados através dos métodos de fenol-sulfúrico (Dubois et al. 1956) e
m-hidroxibifenil (Filisetti-Cozzi & Carpita 1991), respectivamente. O material foi lavado com
acetona e éter etílico, duas vezes o volume utilizado para a AMG, liofilizado e o resíduo
considerado como o rendimento em parede celular.
Para a estimativa do teor de amido, a fração de DMSO foi dialisada exaustivamente
em água destilada a 5
o
C, liofilizada e ressuspensa em água deionizada. O amido foi
quantificado indiretamente pelo teor de açúcares totais pelo método de fenol-sulfúrico
(Dubois et al. 1956).
2.4.6. Fracionamento da parede celular
O resíduo, após a remoção dos açúcares solúveis, lipídios e amido foi considerado
como o rendimento em parede celular (porcentagem em relação à massa seca total da
semente). Esse resíduo foi utilizado para o fracionamento da parede celular.
Para a obtenção de pectinas, as paredes celulares foram extraídas (3 vezes) com
oxalato de amônio 0,5% (10 mL/g), pH 7,0, a 100ºC, durante 1 h. O sobrenadante foi coletado
após centrifugação a 1294 g para cada extração. Os sobrenadantes foram reunidos e dialisados
em água destilada por 48 h. Para extrair o restante das pectinas metilesterificadas e as
hemiceluloses fracamente ligadas à celulose, ao resíduo foi adicionado NaOH 1N, contendo 3
mg/mL de NaBH
4
, durante 24 h a temperatura ambiente. Após centrifugação a 1294 g, os
sobrenadantes foram reunidos, neutralizados com acido acético glacial e dialisados
exaustivamente em água destilada por 48 h. O mesmo procedimento foi realizado com NaOH
6 N (Koch et al. 1999). Ao final do processo, todas as frações dialisadas foram congeladas e
liofilizadas para obtenção dos respectivos rendimentos. O teor de celulose foi quantificado
após digestão dos resíduos de fracionamento da parede celular com ácido nítrico: ácido
16
acético glacial: água destilada. O resíduo foi lavado em água deionizada, liofilizado e pesado,
correspondendo à porcentagem de celulose (Gorshkova et al. 1996).
Uma alíquota de cada material dialisado foi submetida à hidrólise ácida com ácido
trifluoracético (TFA) 2N em ampolas seladas por 1 h a 121º C em autoclave. Após
evaporação do ácido, as amostras foram dissolvidas em água deionizada, filtradas em filtros
Millipore 45 µm, quantificadas quanto aos teores de carboidratos totais (Dubois et al.1956) e
de ácidos urônicos (Filisetti-Cozzi & Carpita 1991) e analisadas por cromatografia líquida de
troca aniônica de alta resolução com detector de pulso amperométrico (HPAEC/PAD) em
coluna Carbo-Pac PA1 em sistema Dionex ICS 3000. Os monossacarídeos neutros foram
eluídos isocraticamente com NaOH 20 mM e identificados por comparação dos tempos de
eluição com padrões comerciais de monossacarídeos.
2.5. Análises ultra-estruturais
As análises estruturais foram realizadas em sementes recém coletadas nos diferentes
estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA), em sementes maduras após a secagem e após o
armazenamento por 388 dias a 7, 25 e -18 °C, de acordo com procedimento descrito no item
2.2. Eixos embrionários na região próxima à inserção dos cotilédones, e cotilédones foram
fixados separadamente em paraformaldeído 4% e glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato
de sódio 50 mM, pH 7,2 e CaCl
2
5 mM. A pós- fixação foi efetuada com tetróxido de ósmio
1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2 por 1 h no escuro, a temperatura ambiente.
Após lavagem com tampão cacodilato de sódio, as amostras foram desidratadas em série
cetônica ascendente, infiltradas e incluídas em resina Spurr (Louro et al. 2003). A
polimerização foi realizada por 16 h em estufa a 70
o
C. Secções transversais e longitudinais
das sementes (0,5-1,0 mm) foram obtidas em micrótomo Sorvall, aderidas em lâmina, coradas
com azul de toluidina a 1% por 1-2 min e montadas em Permout. As amostras foram
observadas em microscópio Axioplan 2.
Os cortes ultrafinos foram realizados com cerca de 700 nm, colhidos em grades de
cobre de 400 mesh e posteriormente contrastados com acetato de uranila 1% em etanol
absoluto e citrato de chumbo. As observações e eletromicrografias foram efetuadas através do
MET JEOL 120.
17
2.6 Delineamento experimental e Análise Estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, sendo utilizadas quatro
repetições para os testes de germinação, índice de velocidade de germinação, tempo médio,
variância do tempo médio,
teor de água e massa seca e três repetições para as análises
bioquímicas. No experimento de maturação os tratamentos foram constituídos pelas idades,
ou seja, 45, 55 e 65 DAA. No experimento de armazenamento utilizou-se esquema fatorial
2X4, sendo duas temperaturas (7 ºC e 25 ºC) e quatro períodos (0, 30, 60 e 180). Sempre que
possível, os resultados foram submetidos à análise de variância (Teste F, ao nível de 5% de
probabilidade), empregando-se o teste Tukey para a comparação das médias, também a 5%.
Quando necessário, para ajuste da normalidade, os valores foram transformados em arc sen
(%)
0,5
.
18
3. Resultados
3.1 Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante a maturação das sementes
Caracterização fisiológica
As análises efetuadas com sementes de pau-brasil provenientes de Moji-Guaçu em três
estádios distintos de maturação (45, 55 e 65 DAA) revelaram que a massa fresca (MF)
máxima foi atingida aos 55 DAA (tabela 1). O maior valor de massa seca (MS) foi encontrado
aos 65 DAA, embora incremento mais acentuado tenha sido observado entre 45 e 55 DAA.
Ao longo do período de maturação, o teor de água dessas sementes diminuiu, atingindo cerca
de 12% ao final da maturação (65 DAA), sendo 84% menor em relação ao primeiro estádio
estudado (45 DAA). Foi evidenciado, também, aumento na porcentagem de germinação com
a maturação das sementes, atingindo os 100% aos 55 DAA (tabela 1).
Tabela 1. Massa fresca (PF) inicial, massa seca (MS), teor de água e porcentagem de
germinação (G) em três diferentes estádios de maturação (dias após a antese = DAA) das
sementes de pau-brasil. Os valores representam a média +
desvio padrão (n = 4 para
germinação e n = 3 para os demais parâmetros).
Estádio
(DAA)
MF
(mg)
Teor de água
(%)
MS
(mg)
G
(%)
45
363 ±
0,07
77,35
113 ±
0,03
88
55
543
± 0,07
69,70
217±
0,04
100
65
344
± 0,06
12,74
223 ±
0,01
100
Dados fornecidos por S. Leduc (2007)
Carboidratos não estruturais
A análise do extrato etanólico das sementes de C. echinata mostrou que, apesar de ter
sido observado aumento no peso seco das sementes a partir dos 45 DAA, houve redução de
63% no teor de açúcares totais nesse período (figura 3). A proporção dos açúcares redutores
em relação aos açúcares totais também diminuiu passando de 43,7% para 29,7%. Entretanto,
o teor de amido, quantificado inespecificamente pela dosagem de açúcar total, aumentou
cerca de 64% nesse mesmo período, ou seja, de 45 para 55 DAA (figura 3).
19
Figura 3. Teores de açúcares totais, açúcares redutores e amido (mg g
-1
MS) extraídos
de sementes de C. echinata em três estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA). As
barras representam o erro padrão da média (n = 3).
Para as sementes de pau-brasil foi observado aumento no teor de lipídios (extraídos
pelas lavagens com solventes orgânicos) ao longo da maturação, passando de 31 mg.g
-1
no
início da maturação (45 DAA) para 72 mg.g
-1
na fase final (65 DAA), correspondendo a cerca
de 3% do peso seco da semente nessa fase.
Caracterização da parede celular durante a maturação
Coincidindo com o período no qual houve diminuição nos teores de açúcares totais
(figura 3), o maior rendimento em parede celular (porcentagem em relação à massa seca da
semente) foi observado aos 55 DAA, sendo a proporção de parede celular duas vezes maior
do que no estádio anterior (figura 4). Após esse período, houve redução de cerca de 60% na
proporção da parede celular em relação à massa seca total da semente.
Pelo cálculo da porcentagem de cada fração da parede celular em relação à massa seca
total da parede nota-se que houve alteração na proporção das diferentes frações de 45 para 55
DAA (figura 5), com uma maior solubilização dos polissacarídeos na fração NaOH 1N,
composta principalmente de hemiceluloses fracamente ligadas à celulose. Esses dados
mostram que o incremento observado no rendimento total da parede de 45 para 55 DAA
(figura 4) refere-se basicamente a alterações nessa fração.
20
Figura 4. Rendimento de parede celular (%) das sementes de C. echinata (pau-brasil)
em três estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA). Os valores representam a média de
três determinações.
A proporção relativa da fração oxalato de amônio e da fração de NaOH 6N diminuiu
45% e 23% após os 45 DAA, respectivamente. Em contraste, a proporção relativa das frações
de NaOH 1N e de celulose aumentou 1,5 e 3,2 vezes, respectivamente, sendo essas alterações
mantidas até o final da maturação (figura 5).
A composição dos polissacarídeos das diferentes frações da parede celular encontra-se
na figura 6. Os monossacarídeos predominantes nas frações de pectinas (oxalato de amônio) e
NaOH 1N foram arabinose e glucose, sendo observado aumento do primeiro e redução da
proporção relativa do segundo, com a maturidade das sementes. Na fração de hemiceluloses
fortemente ligadas a celulose (NaOH 6N), os açúcares predominantes foram
glucose,
arabinose e xilose, respectivamente, no início da maturação. Com a maturação houve
incremento na proporção de glucose e, consequentemente, diminuição na proporção dos
demais açúcares. Ramnose foi detectada apenas na fração NaOH 1N aos 45 DAA.
A quantificação de ácidos urônicos nas frações revelou predomínio desses açúcares na
fração de pectinas, nos três estádios de maturação das sementes, conforme esperado, uma vez
que a maior parte dos polissacarídeos ácidos encontra-se nessa fração (figura 7A). Com a
maturação, o teor de ácidos urônicos diminuiu, contudo aos 65 DAA a proporção em relação
à fração de açúcar total ainda era cerca de 4 vezes maior.
21
Figura 5. Rendimento das frações de parede celular (%) em sementes de C. echinata (pau-
brasil) em três estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA). Frações: oxalato = pectinas,
NaOH 1N = hemiceluloses fracamente ligadas à celulose, NaOH 6N = hemiceluloses
fortemente ligadas à celulose e celulose. Os valores representam a média de três
determinações.
Figura 6. Composição em monossacarídeos (% relativa) em relação à massa seca da parede
celular de sementes de C. echinata (pau-brasil) em diferentes estádios de maturação (54, 55 e
65 DAA). Os valores representam a média de três determinações.
0
20
40
60
80
100
45 55 65
Dias após a antes e (DAA )
R endimento
(% )
Oxalato Na OH 1N Na OH 6N celulos e
45 DAA
55 DAA
65 DAA
Oxalato
(Pectinas)
NaOH 1N
(Hemiceluloses fracamente
ligadas à celulose)
NaOH 6N
(Hemiceluloses fortemente
ligadas à celulose)
22
Figura 7. Teor de açúcares totais e ácidos urônicos (mg g
-1
MS) nas frações da parede
celular de sementes de pau-brasil em três estádios de maturação (45, 55 e 65 DAA). A:
Fração de pectinas. B: Fração de hemiceluloses fracamente ligadas à celulose. C:
fração de hemiceluloses fortemente ligadas à celulose. Os valores representam a média
de três determinações e as barras os erros padrão.
Análises ultra-estruturais durante a maturação
As análises ultra-estruturais foram realizadas nos três estádios de maturação, em eixos
embrionários, na região próxima à inserção dos cotilédones, e nos cotilédones. As descrições
foram agrupadas por estádio de maturação.
A
B
C
23
Eixo embrionário
45 DAA – Cortes transversais mostram células túrgidas com citoplasma aderido a
paredes celulares finas, com pequenas ondulações (figura 8 A) e, em alguns casos, com
dobras bem acentuadas (figura 8 B). Adjacente à zona de interseção das células, as
paredes tornam-se mais espessadas, sendo cerca de 3 a 5 vezes maiores
do que nas demais regiões da célula (figura 8 C). O citoplasma apresenta-se
denso e nele imersos observam-se amiloplastos contendo um ou mais grãos de amido
e numerosos corpos protéicos distribuídos aleatoriamente ao longo da célula.
O núcleo e as mitocôndrias apresentam estruturas preservadas, assim como o Golgi e o
retículo endoplasmático, geralmente próximos à parede celular (figuras 8 A-C).
55 DAA – Cortes transversais evidenciam células túrgidas, com a parede ligeiramente
espessada, com pequenas dobras (figura 9). O citoplasma é denso sendo observados
numerosos plastídeos bem desenvolvidos com um ou mais grãos de amido e plastoglóbulos
(figura 9 B). Imersos no citoplasma encontram-se, ainda, numerosos corpos protéicos, com
conteúdo eletrondenso de aspecto granuloso, ocupando grande parte da
célula (figura 9 A). Na região de junção entre as células adjacentes a parede celular
apresenta-se mais espessada do que no restante da célula (figura 9 C). Os plastos apresentam
numerosos grãos de amido e plastoglóbulos e o núcleo é bem delimitado, apresentando
características preservadas ocupando grandes porções do citoplasma. Adjacentes às paredes
celulares, vesículas ricas em lipídios podem ser observadas. Em ambas as células, evidenciam
mitocôndrias com características preservadas, Golgi e retículo endoplasmático são
visualizados adjacentes à parede celular e dispersos ao acaso, respectivamente (figura 9 A-C).
65 DAA – Cortes transversais evidenciam paredes espessas e levemente onduladas,
campos primários de pontoação regularmente espaçados (figura 10 A). O citoplasma é denso
com a presença de numerosos grãos de amido, corpos protéicos de conteúdo eletrondenso
finamente granular de grandes dimensões e outros com matriz pouco granulosa e pouco
preenchida (figura 10 A, B). Observa-se, ainda, a presença de grande número de vesículas
lipídicas distribuídas, principalmente, ao longo da plasmalema (figura 10 B, C). As
mitocôndrias não apresentam suas características preservadas, assim como, o retículo
endoplasmático.
24
Figura 8. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) aos 45 DAA. A – Células com
dobras e ondulações nas parede celular (Pc). B – Detalhe das dobras da parede celular.
C- Detalhe da zona de junção das células (Zj). As setas indicam dobras na parede
celular. Am: Grão de amido; Cp: Corpo proteico; G: Complexo de Golgi; Nu: Núcleo;
Mi: Mitocôndria; Pt: plastídeo, Re: Retículo endoplasmático.
2µm
2µm
A
B
C
2µm
Nu
Cp
Pt
Am
Cp
Am
Mi
Pc
Pc
Pc
Zj
G
Re
Figura 8. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) aos 45 DAA. A – Células com
dobras e ondulações nas parede celular (Pc). B – Detalhe das dobras da parede celular.
C- Detalhe da zona de junção das células (Zj). As setas indicam dobras na parede
celular. Am: Grão de amido; Cp: Corpo proteico; G: Complexo de Golgi; Nu: Núcleo;
Mi: Mitocôndria; Pt: plastídeo, Re: Retículo endoplasmático.
2µm
2µm
A
B
C
2µm
Nu
Cp
Pt
Am
Cp
Am
Mi
Pc
Pc
Pc
Zj
G
Re
2µm
2µm
A
B
C
2µm
Nu
Cp
Pt
Am
Cp
Am
Mi
2µm
2µm
A
B
C
2µm
2µm
2µm
A
B
C
2µm2µm
Nu
Cp
Pt
Am
Cp
Am
Mi
Pc
Pc
Pc
Zj
G
Re
25
Figura 9. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 55 DAA. A- Parede celular espessada (Pc) com ondulações
(seta). B – Detalhe da parede celular. C – Detalhe da zona de junção das células com
lamela média (Lm) bem definida. As setas indicam dobras na parede celular. Pt:
plastídeo Am:grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: vesículas de lipídeo; Nu: Núcleo;
Mi: Mitocondria; Re: Retículo endoplasmático; Zj: zona de junção das células.
2µm
B
A
C
2µm
Pt
Cp
2µm
Nu
Mi
Lp
Pc
Pc
Lm
Pg
Am
Zj
Re
Figura 9. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 55 DAA. A- Parede celular espessada (Pc) com ondulações
(seta). B – Detalhe da parede celular. C – Detalhe da zona de junção das células com
lamela média (Lm) bem definida. As setas indicam dobras na parede celular. Pt:
plastídeo Am:grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: vesículas de lipídeo; Nu: Núcleo;
Mi: Mitocondria; Re: Retículo endoplasmático; Zj: zona de junção das células.
2µm
B
A
C
2µm
Pt
Cp
2µm
Nu
Mi
Lp
Pc
Pc
Lm
Pg
Am
Zj
Re
2µm2µm
B
A
C
2µm2µm
Pt
Cp
2µm2µm
Nu
Mi
Lp
Pc
Pc
Lm
Pg
Am
Zj
Re
26
Figura 10. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 65 DAA. A – Célula com paredes celulares (Pc) levemente
onduladas (seta). B – Detalhe da parede celular com vesículas de lipídeos. C – Detalhe
da zona de junção das células. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de
lipídeo; Lm: Lamela média; Mi: Mitocôndria; Mp: plasmalema; Pt: plastídeo; Re:
Retículo endoplasmático.
1µm
1µm
5µm
A
C
B
Cp
Am
Lp
Cp
Lp
Cp
Pc
Pc
Pc
Lm
Pt
Mp
Mi
P
Re
Figura 10. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 65 DAA. A – Célula com paredes celulares (Pc) levemente
onduladas (seta). B – Detalhe da parede celular com vesículas de lipídeos. C – Detalhe
da zona de junção das células. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de
lipídeo; Lm: Lamela média; Mi: Mitocôndria; Mp: plasmalema; Pt: plastídeo; Re:
Retículo endoplasmático.
1µm
1µm
5µm
A
C
B
Cp
Am
Lp
Cp
Lp
Cp
Pc
Pc
Pc
Lm
Pt
Mp
Mi
P
Re
1µm1µm
1µm1µm
5µm5µm
A
C
B
Cp
Am
Lp
Cp
Lp
Cp
Pc
Pc
Pc
Lm
Pt
Mp
Mi
P
Re
27
Cotilédones
45 DAA – Cortes transversais na região das células parenquimáticas, evidenciaram
paredes celulares de espessura heterogênea, freqüentemente espessadas, porém com regiões
delgadas nos campos primários de pontoações (figura 11 A). Os amiloplastos possuem forma
e dimensões variadas e, geralmente um único grão de amido ocupa toda a região da matriz.
Os corpos protéicos apresentam conteúdo granular, sem uniformidade e as vesículas
lipídicas, presentes em grande quantidade, encontram-se sem organização aparente, dispersas
no citoplasma (figura 11 B). As mitocôndrias apresentam características preservadas, e
juntamente com o retículo endoplasmático e complexo de Golgi aparecem distribuídos
aleatoriamente no citoplasma (figuras 11 A, B).
55 DAA – Nos cortes transversais na região das células parenquimáticas verifica-se
espessamento irregular das paredes celulares, com as regiões dos campos primários de
pontoações, de distribuição regular (figura 12 A, B) e com espessamento menor do que as
demais regiões da parede. Os amiloplastos, nesta etapa, sofrem aumento nas dimensões e
podem ser observados com um ou mais grãos de amidos imersos em sua matriz. Os corpos
protéicos aumentam em número e dimensões, ocupando grande parte do citoplasma e sua
matriz apresenta-se totalmente preenchida por fina granulosidade eletrondensa (figura 12 A).
Adjacente aos amiloplastos e a membrana plasmática, ocorre aumento no número de vesículas
lipídicas (figura 12 B).
65 DAA – Cortes transversais na região das células parenquimáticas, mostram
espessamento irregular das paredes celulares, com as regiões dos campos primários de
pontoações, que possuem distribuição regular e grande número de plasmodesmas (figura 13
A) e com menor espessamento do que as demais regiões da parede. Foi observado aumento
na quantidade e nas dimensões dos grânulos de amido e aumento no número dos grãos
agregados em amiloplastos (figura 13 B). Evidenciam-se numerosas vesículas lipídicas
organizadas ao redor dos amiloplastos e ao longo da membrana plasmática. Por vezes,
observa-se aparente coalescência de algumas delas, tornado-se unidas umas as outras e
maiores em dimensão (figura 13 A, B).
28
Figura 11. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 45 DAA. A-. Detalhes dos grãos de amido, parede celular e
vesículas de lipídeo. B – Detalhe da parede celular (Pc) com a seta indicando campo de
pontoação (P), também visível na figura A. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; G:
Complexo de Golgi; Lp: Vesícula de lipídeo; Re: Retículo endoplasmático.
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
P
G
Re
Figura 11. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 45 DAA. A-. Detalhes dos grãos de amido, parede celular e
vesículas de lipídeo. B – Detalhe da parede celular (Pc) com a seta indicando campo de
pontoação (P), também visível na figura A. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; G:
Complexo de Golgi; Lp: Vesícula de lipídeo; Re: Retículo endoplasmático.
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
P
G
Re
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
P
G
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
P
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
2µm
B
Am Mi
Pc
2µm2µm
B
Am Mi
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
2µm
A
Cp
Lp
Am
2µm2µm2µm
A
Cp
Lp
Am
Pc
Lp
P
G
Re
29
Figura 12. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 55 DAA. A- Detalhe da parede celular (Pc) e plastídeos
contendo grãos de amido. B – Detalhe das vesículas de lipídeo que aparecem junto à
membrana plasmática. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo;
Mp: Plasmalema; P: Campo primário de pontoação.
2µm
1µm
A
B
Am
Cp
Lp
Lp
Pc
Mp
Pc
Lp
P
Figura 12. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 55 DAA. A- Detalhe da parede celular (Pc) e plastídeos
contendo grãos de amido. B – Detalhe das vesículas de lipídeo que aparecem junto à
membrana plasmática. Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo;
Mp: Plasmalema; P: Campo primário de pontoação.
2µm
1µm
A
B
Am
Cp
Lp
Lp
Pc
Mp
Pc
Lp
P
2µm
1µm
A
B
2µm
1µm
2µm2µm
1µm1µm
A
B
Am
Cp
Lp
Lp
Pc
Mp
Pc
Lp
P
30
Figura 13. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 65 DAA. A- Detalhe da parede celular (Pc). B- Detalhe do
grãos de amido circundados por vesículas de lipídeo. Am:Grão de amido; Cp: Corpo
proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; P: Campo primário de pontoação; Pd =
Plasmodesmata.
2µm
2µm
A
B
Cp
Am
Lp
Pc
Lp
Am
Cp
Pd
P
Figura 13. Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C.
echinata (pau-brasil) aos 65 DAA. A- Detalhe da parede celular (Pc). B- Detalhe do
grãos de amido circundados por vesículas de lipídeo. Am:Grão de amido; Cp: Corpo
proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; P: Campo primário de pontoação; Pd =
Plasmodesmata.
2µm
2µm
A
B
Cp
Am
Lp
Pc
Lp
Am
Cp
Pd
P
2µm
2µm
A
B
2µm
2µm
2µm2µm
2µm2µm
A
B
Cp
Am
Lp
Pc
Lp
Am
Cp
Pd
P
31
3.2. Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais durante o armazenamento das sementes
Caracterização fisiológica
As sementes de pau-brasil frescas (T0 fresca) apresentavam cerca de 89% de
germinação produzindo 75% de plântulas normais. Para as sementes secas, tanto a
porcentagem de germinação quanto a produção de plântulas normais foi menor, ao redor de
58% do valor inicial. O armazenamento após 30 dias, em baixa temperatura (7 °C), ocasionou
um aumento na porcentagem de geminação, em relação às sementes não armazenadas (T0
seco), porém esse comportamento não se manteve ao longo do armazenamento. Nas sementes
armazenadas a 7 ºC, embora tenha sido observada redução na porcentagem de produção de
plântulas normais, os resultados não diferiram estatisticamente, mostrando que o tempo de
armazenamento não influenciou essa variável. Contudo, nas sementes armazenadas a 25 ºC
foi observada a perda na capacidade de produção de plântulas logo aos 30 dias de
armazenamento, embora a porcentagem de germinação tenha sido reduzida gradativamente.
Excetuaram-se as sementes congeladas (-18 ºC) que, mesmo após 180 dias de
armazenamento, mantiveram a capacidade germinativa e a produção de plântulas normais
relativamente altas (tabela 2). Uma vez armazenadas, as sementes de pau-brasil mostraram
pequenas variações no teor de água (de 6 a 11%) com acréscimo ao final do armazenamento,
nas duas temperaturas, sendo esse ganho mais acentuado nas sementes armazenadas a 25 ºC.
Os valores de matéria seca não apresentaram diferenças significativas durante o
armazenamento, independente da temperatura de armazenamento (tabela 2).
Em relação ao IVG (tabela 2), que se refere ao número de sementes germinadas por
tempo de semeadura, as sementes de pau-brasil armazenadas a 7 ºC apresentam os maiores
valores (3,3 a 0,85) do que as armazenadas a 25 ºC, que apresentam valores de 0,71 a 0.
Durante o armazenamento, os IVGs apresentaram pequenas flutuações, sendo que as sementes
armazenadas a temperatura ambiente apresentaram redução linear destes, apresentando valor
nulo após 180 dias de armazenamento. Os tempos médios (tabela 2) das sementes
armazenadas a 7 ºC variaram de 2,6 a 7,1, enquanto que nas mantidas a 25 ºC estes valores
ficaram entre 5,2 a 0, com tendência a redução com o tempo de armazenamento. Embora para
os valores de IVG e tempo médio tenha sido observada interação entre os fatores tempo e
temperatura de armazenamento, isso não foi verificado para os valores da variância do tempo
médio, que ficaram ao redor de 4,4 nas sementes armazenadas a 7 ºC e de 0,6 para aquelas
armazenadas a 25 ºC, indicando que a germinação nessa última condição foi mais uniforme
do que aquela observada para as sementes armazenadas a 7 ºC. Por outro lado,
32
independentemente da temperatura de armazenamento, a variância do tempo médio de
germinação não foi alterada com o tempo de armazenamento.
Tabela 2. Germinação (%), desenvolvimento de plântulas normais (%), teor de água (%), massa seca
(mg g
-1
MF), índice de velocidade de germinação (IVG), tempo médio (Tm) e variância do tempo
médio (S
2
Tm) das sementes de C. echinata (pau-brasil) recém coletadas (T0), após a secagem (T0
seca) e durante o armazenamento em diferentes temperaturas (n = 4).
Tempo de armazenamento
Germinação Inicial 30 dias 60 dias 180 dias médias
7 ºC 52aB 67aA 33aC 35aC -
25 ºC 52aA 19bB 6bC 0bC -
-18 ºC 52 - - 79 -
C.V (%) 17,63
IVG
7 ºC 1,6aB 3,3aA 0,8a 1,2aC -
25 ºC 1,6aA 0,7bB 0,7aB 0bC -
-18 ºC - - - -
C.V (%) 25,55
Tempo médio
7 ºC 6,4aA 2,6aB 7,1aA 4,3aAB -
25 ºC 6,4aA 3,1aBC 5,2aAB 0bC -
-18 ºC - - - - -
C.V (%) 36,47
Variancia do tempo médio
7 ºC 1,4 1,6 8,1 6,6 4,4a
25 ºC 1,4 0,8 0 0 0,6b
-18 ºC - - - - -
Médias 1,4A 1,2A 4,1A 3,3A
C.V (%) 65,56
Plântulas normais
7 ºC 31,2aA 18,7aA 16,7aA 14,6aA -
25 ºC 31,2aA 0bB 2,1bB 0bB -
-18 ºC 31,2 - - 64,5 -
C.V (%) 46,76
Teor de água
7 ºC 6,1aB 6,7bAB 6,3bB 7,2bA -
25 ºC 6,1aC 8,8aB 8,6aB 10,6aA -
-18 ºC 6,1 - - 8,6 -
C.V (%) 3,99
Massa seca
7 ºC 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3a
25 ºC 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3a
-18 ºC 0,3 - - 0,3 -
Médias 0,3A 0,3A 0,3A 0,3A
C.V (%) 10,46
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%. Letras
minúsculas comparam colunas, letras maiúsculas comparam linhas.
33
Carboidratos não estruturais
A análise do extrato etanólico das sementes de C. echinata mostrou que após a
secagem houve tendência à redução nos teores de açúcares totais. Contudo, após 30 dias de
armazenamento, indiferentemente da temperatura, o teor de açúcar total aumentou cerca de
40%, mantendo essa média até o final do armazenamento. Os teores de açúcares redutores
representaram pequena proporção dos açúcares totais, mantendo-se durante o armazenamento,
exceto aos 180 dias de armazenamento, quando houve aumento de 4 vezes o valor inicial.
Não foi observada diferença entre as temperaturas de armazenamento (figura 14).
O teor de amido diminuiu durante o armazenamento, sendo o decréscimo ligeiramente
mais acentuado nas sementes mantidas a temperatura ambiente, quando comparadas àquelas
armazenadas a 7 ºC (figura 14 C). Foi observada uma relação direta entre o teor de amido e a
temperatura de armazenamento. Aos 180 dias as sementes armazenadas, a -18 ºC,
apresentaram 68% menos amido do que as sementes não armazenadas (T0 seca).
Apesar de pequenas oscilações, entre os tempos de armazenamento, o teor de lipídios
manteve-se estável durante o armazenamento
, independentemente da temperatura,
correspondendo a cerca de 5% do peso seco da semente.
Caracterização da parede celular durante o armazenamento
Analisando o rendimento (%) em parede celular, ficou evidenciado que o
armazenamento, independentemente da temperatura, não alterou a proporção de parede
celular em relação ao peso seco da semente, exceção feita para o congelamento por 180 dias
(figura 15). Contudo, a porcentagem relativa das frações da parede celular variou ao longo do
armazenamento, indicando que ocorreram alterações na solubilização dos diferentes
polissacarídeos constituintes (figura 16). Aos 30 dias de armazenamento a 7°C, não foram
observadas alterações significativas nas proporções das diferentes frações analisadas, porém a
partir de 60 dias houve aumento de 50% na solubilização das pectinas (oxalato) e expressiva
redução na proporção de hemiceluloses solubilizadas em NaOH 1N (figura 16 B).
Em contraste, para sementes armazenadas em temperatura ambiente, as
principais alterações foram observadas aos 30 dias do armazenamento, com aumento nas
frações de oxalato, NaOH 6N e de celulose, em cerca de 60, 90 e 150%, respectivamente. Ao
longo do armazenamento, essa proporção foi novamente alterada (figura 16 C).
34
Figura 14. Teores de açúcares totais (A), açúcares redutores (B) e amido (C) (mg g
-1
MS) em sementes de C. echinata fresca (T0 fresca), seca (T0 seca) e durante o
armazenamento em diferentes temperaturas. As barras representam o erro padrão da
média de triplicatas.
O perfil das frações da parede celular das sementes congeladas assemelha-se ao
perfil das sementes armazenadas por 30 dias em temperatura ambiente, exceto pela fração
péctica (figura 16 D). Houve aumento na solubilização das frações oxalato, NaOH 6N e
celulose em detrimento das hemiceluloses extraídas em NaOH 1N, cuja fração que sofreu
redução de 54% (figura 16 D).
A composição em monossacarídeos neutros das diferentes frações da parede
celular encontra-se nas figuras 17, 18 e 19. Em todas as frações, a temperatura de
armazenamento parece ter ocasionado alterações nas proporções relativas desses açúcares.
A
B
C
35
Figura 15. Rendimento de parede celular (%) das sementes de C. echinata (pau-brasil)
frescas (T0), após a secagem (T0 seca) e durante o armazenamento em diferentes
temperaturas. As barras representam o erro padrão da média de triplicatas.
Os monossacarídeos predominantes na fração de oxalato de amônio (figura 17)
foram xilose/manose, arabinose e galactose. Para as sementes secas, foi observada diminuição
da proporção relativa de ramnose e xilose/manose. Entretanto, houve aumento da proporção
relativa da fucose, arabinose e galactose. O armazenamento em baixa temperatura (7 ºC) por
30 dias levou à redução no teor de ramnose e de arabinose e aumento na proporção relativa de
galactose a partir desse período. Em relação à condição seca inicial, a manutenção das
sementes à
temperatura ambiente promoveu redução na proporção relativa de glucose e
aumento de galactose e ramnose. Apesar da proporção relativa de arabinose ter diminuído
com o armazenamento a 7 °C, esse decréscimo foi mais acentuado, cerca de 70%, com o
armazenamento à
temperatura ambiente. As sementes congeladas, ao final do armazenamento,
apresentaram diminuição na proporção relativa de fucose e de glucose (17% e 81%,
respectivamente), quando comparadas às sementes não armazenadas, assemelhando-se à
condição de armazenamento por 30 dias à temperatura ambiente.
Os açúcares predominantes da fração de hemiceluloses fracamente ligadas à
celulose (NaOH 1N) foram a arabinose, encontrada em maior proporção, seguida pela
xilose/manose e galactose (figura 18). Nas sementes secas não foram observadas alterações
expressivas nas proporções relativas dos monossacarídeos neutros dessa fração. Ao longo do
armazenamento, independentemente da temperatura, essas proporções mantiveram-se muito
semelhantes àquelas das sementes não armazenadas. A única exceção ocorreu com a
proporção de glucose no armazenamento em baixa temperatura, que aos 60 dias apresentou-se
44% maior do que nas sementes não armazenadas (figura 18).
36
Figura 16. Rendimento das frações de parede celular (%) em sementes de C. echinata (pau-
brasil). T0 fresca e seca (A), e armazenadas por até 180 dias a 7 ºC (B), 25 º C (C) e -18 ºC
(D).
B
A
C
D
37
Figura 17. Composição em monossacarídeos (% relativa) da
fração oxalato de amônio da
parede celular de sementes de C. echinata (pau-brasil) no momento da coleta (T0), após a
secagem (T0 seca) e ao longo do armazenamento em diferentes temperaturas.
Arabinose, xilose/manose e glucose foram os açúcares predominantes da fração
de hemiceluloses fortemente ligadas à celulose (NaOH 6N) (figura 19). As alterações mais
expressivas observadas foram aumento de arabinose e redução de glucose aos 180 dias, em
sementes mantidas a 7 °C e à temperatura ambiente. Com exceção da proporção relativa de
glucose, que aumentou em 50%, o congelamento (-18º C) aparentemente não alterou
expressivamente as demais proporções (figura 19). Foi observado pequeno aumento na
proporção relativa de xilose/manose.
Fucose Ramnose A rabinos e Galactose Glucose Xil/ Man
T0
T0
seca
180 dias
25º C
7
º C
60 dias
30 dias
-
18º C
38
Figura 18. Composição em monossacarídeos (% relativa) da fração NAOH 1N da parede
celular de sementes de C. echinata (pau-brasil) no momento da coleta (T0), após a secagem
(T0 seca) e ao longo do armazenamento em diferentes temperaturas.
Fucose Ramnose Arabinose Galactose Glucose Xil/ Man
T0 T0 seca
7º C
25º C
-18º C
30 dias 60 dias 180 dias
39
Figura 19. Composição em monossacarídeos (% relativa) da fração NAOH 6N da parede
celular de sementes de C. echinata (pau-brasil) no momento da coleta (T0), após a secagem
(T0 seca) e ao longo do armazenamento em diferentes temperaturas.
A quantificação de ácidos urônicos nas frações da parede celular apontou os maiores
teores na fração de oxalato de amônio e, principalmente, nas sementes armazenadas a 7º C.
Contudo, esse teor foi reduzido ao longo da maturação, em todas as temperaturas analisadas.
Em relação ao teor de açúcar total, este foi predominante em todas as frações da parede
celular, sendo reduzido somente aos 180 dias, mais acentuadamente na fração NaOH 1N,
paras as sementes armazenadas a 7º C. Apesar da redução de 30%, ao 30 dias, o teor de
açúcar total se manteve estável ao longo do armazenamento em temperatura ambiente.
Fucose Ramnose Arabinose Galactose Glucose Xil/Man
T0
T0 seca
7ºC
25º C
30 dias 60 dias 180 dias
-18º C
40
Figura 20. Teor de açúcares totais e ácidos urônicos (mg g
-1
MS) nas frações da parede celular de sementes de pau-brasil. A: Sementes armazenadas a
7 ºC; B: sementes armazenadas a 25 ºC; C: sementes armazenadas a -18 ºC. Oxalato= pectinas, NaOH 1N= hemiceluloses fracamente ligadas a
celulose e NaOH 6N= hemiceluloses fortemente ligadas à celulose.
T0
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
mg g -1 (MS)
T0 seca
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
açúcar total ácido urônico
30 dias
0
1
2
3
4
5
mg g -1 (MS)
60 dias
0
1
2
3
4
5
180 dias
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
180 dias
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
mg g -1 (MS)
180 dias
0
1
2
3
4
5
30 dias
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
mg g -1 (MS)
60 dias
0
1
2
3
4
5
Oxalato NaOH 1N NaOH 6N
A
B
C
41
Análises ultra-estruturais durante o armazenamento
As sementes de pau-brasil, T0 seco, foram armazenadas a 7º C, em temperatura
ambiente de laboratório (± 25 ºC) e congeladas (-18 ºC). Problemas técnicos durante o
procedimento de emblocamento das amostras impediram a obtenção de cortes dos materiais
armazenados por 30, 60 e 180 dias nas condições mencionadas. Desse modo, as análises ultra-
estruturais foram realizadas, nos eixos embrionários, na região próxima à inserção dos
cotilédones, e nos cotilédones, com as sementes secas (T0 seca) e após os 338 dias de
armazenamento em cada temperatura, período no qual a viabilidade havia sido perdida na
temperatura ambiente, reduzida no armazenamento a 7 ºC, de cerca de 50% para 10%, e
mantida no congelamento (Barbedo et al. 2002, Hellmann et al. 2006). Para as sementes
recém coletadas e secas (T0 seca) não foi possível a obtenção de cortes dos cotilédones.
Eixo embrionário
T0 seca – Em secções transversais as células apresentam paredes anticlinais
espessadas, com pequenas ondulações. A membrana plasmática e citoplasma encontram-se
aderidos à parede celular, entretanto, em algumas regiões já é possível observar retração do
protoplasto. Imersos, no citoplasma, observam-se plastídeos, contendo grãos de amido,
grande número de corpos protéicos com matriz granulosa eletrondensa e dispersa. Adjacentes
à parede celular encontram-se vesículas lipídicas (figura 20 A). Algumas células apresentam o
citoplasma com numerosos corpos protéicos com grandes dimensões, de conteúdo granuloso,
mais eletrondenso, que ocupa toda região da matriz (figura 20 B). Observa-se grande
quantidade de mitocôndrias com perda da estrutura característica (figura 20 A, B).
Temperatura ambiente – Em secções transversais as células apresentam paredes pouco
onduladas e delgadas. De um modo geral, observa-se retração do protoplasto (figura 21 A),
observando-se grandes espaços entre a parede celular e a membrana plasmática. Os
amiloplastos estão em número reduzido, quando comparados ao embrião T0 seco, e por vezes,
já se observa o rompimento das membranas envoltórias dos plastídeos, resultando na
dispersão dos grãos de amido no citoplasma (figura 21 A, B). Os corpos protéicos, de
conteúdo eletrondenso granuloso, ocupam grande parte do citoplasma (Figura 21 B). Nesta
fase ocorre diminuição no número de vesículas de lipídeo e de mitocôndrias, que apresentam
perda do seu arranjo característico (Figura 21 A, B).
42
Figura 20. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 65 DAA secas. A – Célula com paredes celulares (Pc)
levemente onduladas (seta), com retração do protoplasto (*). B – Detalhe da célula com
vesículas de lipídeos (Lp) e mitocôndrias (Mi). Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico;
Mp: plasmalema.
5µm
A
B
1µm
Mp
Pc
Cp
Am
Cp
Mi
Lp
B
*
Lp
Figura 20. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) aos 65 DAA secas. A – Célula com paredes celulares (Pc)
levemente onduladas (seta), com retração do protoplasto (*). B – Detalhe da célula com
vesículas de lipídeos (Lp) e mitocôndrias (Mi). Am:Grão de amido; Cp: Corpo proteico;
Mp: plasmalema.
5µm
A
B
1µm
Mp
Pc
Cp
Am
Cp
Mi
Lp
B
*
Lp
5µm
A
B
1µm
Mp
Pc
Cp
Am
Cp
Mi
Lp
B
*
Lp
43
Temperatura baixa (7 ºC) – Em secções transversais do eixo embrionário foi observado um
grande afastamento do protoplasto em relação à parede celular, que se apresenta bastante
ondulada (figura 22 A). Os amiloplastos, em pequeno número, encontram-se em geral
dissociados e os grãos de amido ocorrem dispersos, o mesmo ocorrendo com os corpos
protéicos. Os corpos protéicos de conteúdo eletrondenso e granuloso ocupam grande porção
do citoplasma. Nota-se pouca quantidade de vesículas lipídicas associadas à membrana
plasmática e uma grande quantidade dispersa no citoplasma, sem organização aparente
(Figura 22 A, B).
Congelamento (-18 ºC) – Em secções transversais do eixo embrionário, as células
parenquimáticas apresentam paredes com dobras (Figura 23A), pouco espessas, sendo
maiores na região de interseção de duas ou mais células (figura 23 B), com organização
celular semelhante à das sementes secas não armazenadas (T0 seca). É visível grande número
de grãos de amido dispersos no citoplasma, com grandes dimensões, numerosos corpos
protéicos, de conteúdo granular (figura 23 B). Numerosas vesículas de lipídeos aparecem ao
longo da membrana plasmática (figura 23 A) e distribuídas no citoplasma, sem organização
aparente (figura 23 B).
Cotilédones
Temperatura ambiente (25 ºC) – Cortes transversais na região das células
parenquimáticas evidenciaram que a parede celular apresenta-se levemente ondulada, sendo
mais espessa que nos eixos embrionários (figura 24 A). Grande quantidade de grãos de amido
de tamanhos variados é visualizada. Nota-se desorganização dos corpos protéicos, que
preenchem grande parte do citoplasma. Muitas vesículas de lipídio aparecem dispostas
aleatoriamente no citoplasma, sugerindo coalescência em alguns pontos, junto à membrana
plasmática. (figura 24 A, B).
Temperatura baixa (7 ºC) – Em secções transversais de células cotiledonares nota-se a
presença de grande quantidade de amiloplastos de grandes dimensões, com um ou mais grãos
de amidos dissociados (figura 25 A, C). A parede celular apresenta-se espessada, pouco
ondulada, com campos primários de pontoação e plasmodesmatas visíveis (figura 25 B).
Numerosos corpos protéicos de grande tamanho com conteúdo granuloso são visualizados.
Observa-se grande quantidade de vesículas de lipídios dispersas no citoplasma,
desorganizadas e com aparente coalescência (figura 25 A, C).
44
Figura 21. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura ambiente (25 ºC). A
– Células com retração do protoplasto (*) em relação à parede celular (Pc, seta). B –
Detalhe da distribuição e características dos corpos proteicos e dos grãos de amido. Am:
Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mi: Mitocôndria;
Mp:Plasmalema; Zj: Zona de junção das células.
A
B
Zj
Cp
Mi
Am
Cp
Pc
Pc
Lp
Mp
Pc
*
*
*
Lp
2µm
5µm
Figura 21. Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de
C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura ambiente (25 ºC). A
– Células com retração do protoplasto (*) em relação à parede celular (Pc, seta). B –
Detalhe da distribuição e características dos corpos proteicos e dos grãos de amido. Am:
Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mi: Mitocôndria;
Mp:Plasmalema; Zj: Zona de junção das células.
A
B
Zj
Cp
Mi
Am
Cp
Pc
Pc
Lp
Mp
Pc
*
*
*
Lp
2µm
5µm
A
B
Zj
Cp
Mi
Am
Cp
Pc
Pc
Lp
Mp
Pc
*
*
*
Lp
2µm2µm
5µm5µm
45
Figura 22. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em
temperatura baixa (7 ºC). A – Células com retração do protoplasto (*) em relação à
parede celular (Pc). B – Detalhe da distribuição e características dos corpos proteicos
(Cp) e dos grãos de amido (Am). Lp: Vesícula de lipídeo; Mp: Plasmalema..
A
B
2 µm
2 µm
Cp
Pc
Mp
Am
Lp
Pc
Mp
*
*
*
Cp
Figura 22. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em
temperatura baixa (7 ºC). A – Células com retração do protoplasto (*) em relação à
parede celular (Pc). B – Detalhe da distribuição e características dos corpos proteicos
(Cp) e dos grãos de amido (Am). Lp: Vesícula de lipídeo; Mp: Plasmalema..
A
B
2 µm
2 µm
Cp
Pc
Mp
Am
Lp
Pc
Mp
*
*
*
Cp
A
B
2 µm
2 µm
Cp
Pc
Mp
Am
Lp
Pc
Mp
*
*
*
Cp
A
B
2 µm2 µm
2 µm2 µm
Cp
Pc
Mp
Am
Lp
Pc
Mp
*
*
*
Cp
46
Figura 23. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em
temperatura de congelamento (-18 ºC). A – Células com parede celular (Pc) com
ondulações (seta). B – Detalhe da zona de junção das células (Zj). Am: Grão de amido;
Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mi: mitocôndria.
2µm
5µm
A
B
Am
Cp
Pc
Lp
Cp
Mi
Zj
Pc
Figura 23. Eletromicrografias de cortes transversais da região do parênquima de eixo
embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em
temperatura de congelamento (-18 ºC). A – Células com parede celular (Pc) com
ondulações (seta). B – Detalhe da zona de junção das células (Zj). Am: Grão de amido;
Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mi: mitocôndria.
2µm
5µm
A
B
Am
Cp
Pc
Lp
Cp
Mi
Zj
Pc
2µm
5µm
A
B
Am
Cp
Pc
Lp
Cp
Mi
Zj
Pc
47
Figura 24. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura ambiente
(25 ºC). A – Células com parede celular (Pc) com pequena ondulação e coslescência de
vesículas de lipídio (Lp) junto à plasmalema (Mp). Nota-se pequena retração do
protoplasto (*) junto à zona de junção (Zj) das células. B – Detalhe da parede celular
(Pc). Am: Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo.
2 µm
5 µm
A
B
Cp
Am
Mp
Pc
Zj
Pc
Lp
Mi
Cp
Cp
Lp
*
Lp
Am
Figura 24. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura ambiente
(25 ºC). A – Células com parede celular (Pc) com pequena ondulação e coslescência de
vesículas de lipídio (Lp) junto à plasmalema (Mp). Nota-se pequena retração do
protoplasto (*) junto à zona de junção (Zj) das células. B – Detalhe da parede celular
(Pc). Am: Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo.
2 µm
5 µm
A
B
Cp
Am
Mp
Pc
Zj
Pc
Lp
Mi
Cp
Cp
Lp
*
Lp
Am
2 µm2 µm
5 µm
A
B
Cp
Am
Mp
Pc
Zj
Pc
Lp
Mi
Cp
Cp
Lp
*
Lp
5 µm5 µm
A
B
Cp
Am
Mp
Pc
Zj
Pc
Lp
Mi
Cp
Cp
Lp
*
Lp
Am
48
Figura 25. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura baixa (7
ºC). A – Aspecto geral da célula evidenciado a dissociação dos grãos de amido (Am).
B – Detalhe da parede celular espessada (Pc) com com coalescência de vesículas de
lipídio. C – Detalhe da dissociação do grãos de amido. Am: Grão de amido; Cp: Corpo
proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mp:Plasmalema; P: Campo primário de pontoação;
Pd: Plasmodesmata.
A
B
C
2 µm
5 µm
2 µm
Am
Cp
Pc
Cp
Am
Cp
Lp
Pc
Lp
Mp
Cp
Pc
Lp
Lp
P
Pd
Figura 25. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura baixa (7
ºC). A – Aspecto geral da célula evidenciado a dissociação dos grãos de amido (Am).
B – Detalhe da parede celular espessada (Pc) com com coalescência de vesículas de
lipídio. C – Detalhe da dissociação do grãos de amido. Am: Grão de amido; Cp: Corpo
proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mp:Plasmalema; P: Campo primário de pontoação;
Pd: Plasmodesmata.
A
B
C
2 µm
5 µm
2 µm
Am
Cp
Pc
Cp
Am
Cp
Lp
Pc
Lp
Mp
Cp
Pc
Lp
Lp
P
Pd
A
B
C
2 µm
5 µm
2 µm
Am
Cp
Pc
Cp
Am
Cp
Lp
Pc
Lp
Mp
Cp
Pc
Lp
Lp
P
Pd
49
Congelamento (18º C) – Em cortes transversais de células cotiledonares observa-se parede
celular intacta, sem dobramentos (figura 26 A). Os amiloplastos são numerosos, de grandes
dimensões e com um ou mais grãos de amidos associados. Nota-se pequena quantidade de
grãos de amido isolados e numerosos corpos protéicos de tamanhos variados no citoplasma.
Há grande quantidade de vesículas lipídicas, algumas coalescidas e outras associadas
principalmente aos amiloplastos e grãos de amido (figura 26 A, B).
50
Figura 26. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura de
congelamento (-18 ºC). A – Aspecto geral da célula evidenciado a parede celular (Pc),
plasmalema (Mp) e lamela média (Lm). B – Detalhe dos amiloplastos. Am: Grão de
amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo.
A
B
5 µm
2 µm
Pc
Cp
Zj
Lm
Am
Cp
Lp
Mp
Lp
Am
Lp
Figura 26. Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de
sementes de C. echinata (pau-brasil) armazenadas por 338 dias em temperatura de
congelamento (-18 ºC). A – Aspecto geral da célula evidenciado a parede celular (Pc),
plasmalema (Mp) e lamela média (Lm). B – Detalhe dos amiloplastos. Am: Grão de
amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo.
A
B
5 µm
2 µm
Pc
Cp
Zj
Lm
Am
Cp
Lp
Mp
Lp
Am
Lp
A
B
5 µm5 µm
2 µm2 µm
Pc
Cp
Zj
Lm
Am
Cp
Lp
Mp
Lp
Am
Lp
51
4. Discussão
4.1 Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais das sementes durante a maturação
Sementes de pau-brasil, a partir de 45 DAA, mostraram aumento do conteúdo de
matéria seca e, apesar do maior valor ter sido encontrado aos 65 DAA, o maior incremento
ocorreu entre 45-55 DAA. O aumento de peso fresco observado nesse período deve-se ao
acúmulo de matéria seca, uma vez que houve redução do teor de água das sementes durante
esse intervalo, de 77% para 69%. Para as sementes de pau-brasil, a fase denominada de
maturação, na qual ocorre a deposição de reservas, tem início por volta do 32º dia após a
antese (DAA) (Borges et al. 2005), entretanto, neste trabalho, foi observado que a fase de
maior acúmulo de matéria seca ocorreu entre 45-55 DAA. Segundo alguns autores, o maior
valor de massa seca das sementes de várias espécies corresponde ao ponto máximo de
maturidade fisiológica das mesmas (Carvalho & Nakagawa 1983, Koch et al. 1999). Isso
também foi sugerido por Borges et al. (2005) para sementes de pau-brasil, motivo pelo qual o
ponto de 65 DAA foi escolhido para as análises realizadas no presente trabalho.
As sementes de pau-brasil, desde o início da maturação, já apresentavam alta
porcentagem de geminação (tabela 1), o que só aumentou à medida que estas adquiriam a
maturidade fisiológica. Contudo, Borges et al. (2006) e Leduc (2007) observaram que as
sementes de pau-brasil somente obtiveram a máxima capacidade de produzir plântulas
normais ao final da maturação. Segundo Marcos-Filho (2005), a capacidade germinativa é
adquirida, em muitas espécies, precocemente durante o processo de maturação. Entretanto,
como essas sementes não completaram o processo de maturação não há a formação de
plântulas normais. Para as sementes utilizadas nesse estudo foi observado aumento da
capacidade de produção de plântulas normais, à medida que essas sementes amadureciam,
sendo que o aumento mais significativo foi observado entre os períodos de 45 para 55 DAA
com aumento de cerca de 70%, nessa capacidade, alcançado os maiores valores somente ao
final da maturação (65 DAA) (dados não mostrados).
Foram observados diminuição nos teores de açúcares totais e redutores e aumento no
teor de amido com a maturação das sementes de pau-brasil (figura 3), sugerindo que parte dos
açúcares está sendo direcionada para a síntese desse polissacarídeo de reserva (amido), que
corresponde a cerca de 30-40% do peso seco dessas sementes (Garcia et al. 2006). A
diferença entre açúcares totais e redutores deve-se supostamente à presença de sacarose que,
conforme reportado anteriormente, se mantém em níveis altos e estáveis durante a maturação
das sementes dessa espécie (Borges et al. 2006, Leduc 2007). A presença da sacarose, assim
52
como a de oligossacarídeos da série da rafinose, seria fundamental para a aquisição da
tolerância à dessecação uma vez que auxiliaria na formação do estado vítreo na célula,
preservando a estrutura dos fosfolipídios de membrana, mantendo sua estrutura e integridade
durante a secagem. (Obendorf 1997, Hoekstra et al. 2001, Nkang 2002).
As sementes de várias espécies de Leguminosae acumulam amido, proteínas e lipídios
em diferentes proporções, e em maior quantidade nos cotilédones, através do importe de
sacarose, nos estádios tardios da maturação (Weber et al. 1996, Weber et al. 1997). O amido é
um dos compostos de reserva mais importantes e de mais ampla ocorrência nas plantas
(Buckeridge et al. 2004). Em Lupinus sp. o maior acúmulo de amido coincidiu com o maior
acúmulo de água, declinando nos estádios finais da maturação (Górecki et al.1997). Para as
sementes de pau-brasil, a quantificação inespecífica do teor de amido, revelou uma tendência
ao acúmulo ao longo da fase de maturação, sendo que o maior valor coincidiu com o período
de maior acúmulo de massa fresca das sementes (55 DAA) (figura 3).
Nas sementes, os lipídios assim como os carboidratos, são acumulados na fase de
maturação, apresentando variações na composição e no teor e constituindo importante fonte
de energia e carbono, que será utilizada para o processo de germinação e estabelecimento da
plântula (Voelker & Kinney 2001, Buckeridge et al. 2004, Marcos Filhos 2005). Para as
sementes de pau-brasil analisadas nesse trabalho, em diferentes estádios de desenvolvimento,
foi observado um aumento no teor de lipídios ao longo da maturação, correspondendo a cerca
de 3% do peso seco da semente. Mello (2008), utilizando metodologia específica para a
quantificação de lipídios, verificou que sementes maduras e recém dispersas de pau-brasil
apresentavam ao redor de 17% de lipídios na sua composição. A grande diferença encontrada
nesses valores deve-se principalmente à metodologia de extração dos lipídios utilizada no
nosso trabalho que visava apenas a remoção e não a quantificação do lipídio.
O fato da diminuição nos teores de açúcares solúveis (figura 3) e o aumento no
rendimento em parede celular (figura 4) terem ocorrido no mesmo período, 55 DAA, pode
indicar que parte desses açúcares pode ter sido direcionada, além do amido, para a síntese dos
polissacarídeos que compõem a parede celular. Para as sementes de soja, o máximo peso
fresco correspondeu com a parada na deposição de parede celular (Koch et al. 1999). O maior
acúmulo em massa fresca, para as sementes de pau-brasil, ocorreu aos 55 DAA, coincidindo
com o período de maior acúmulo em parede celular. A redução na proporção da parede
celular, em relação à massa seca total da semente, após os 55 DAA, deve-se provavelmente
pelo acúmulo de outras reservas, como proteínas. Segundo Marcos-Filho (2005), as
leguminosas exibem variações nos teores de lipídios e de carboidratos, mas, geralmente,
apresentam altos teores de proteínas.
53
Analisando-se o rendimento de cada fração da parede celular, ao longo do
desenvolvimento da semente, nota-se que o incremento em parede celular ocorrido após os 45
DAA (figura 4) parece ser devido, principalmente, a um aumento na fração de hemiceluloses
fracamente ligadas à celulose, ou seja, aquelas extraídas com NaOH 1N (figura 5). Nota-se,
ainda, que houve decréscimo na proporção de pectinas com a maturação (figura 5). O fato de
ramnose ter sido detectada apenas na fração NaOH 1N em sementes com 45 DAA (figura 6),
em conjunto com a grande quantidade de ácidos urônicos presente na fração extraída com
oxalato de amônio (figura 7) sugere que os açúcares ácidos encontram-se,
predominantemente, na forma de homogalacturonanos nas paredes celulares de sementes de
pau-brasil. A drástica redução observada nos teores de ácidos urônicos com a maturação
(figura 7) indica fortemente que a redução na proporção relativa de pectinas a partir de 45
DAA deve-se à redução no teor de homogalacturonanos, seu polissacarídeo ácido majoritário.
O aumento na proporção relativa de arabinose, observado principalmente nas frações
extraídas com oxalato de amônio e álcali fraco durante a maturação (figura 6), sugere maior
deposição de arabinanos, polissacarídeos usualmente presentes como ramificações de
polissacarídeos ácidos como os ramnogalacturonano I (Carpita & McCann 2000). Diversos
trabalhos relatam a ocorrência de arabinanos como polissacarídeos predominantes em
sementes de leguminosas tais como soja, feijão, ervilha e Vicia faba, e de não leguminosas
como espécies pertencentes ao gênero Brassica (Brillouet & Carré 1983, Huisman et al. 1998,
Koch et al. 1999, Ghosh et al. 2004, Shiga & Lajolo 2005).
Estudos com as chamadas “plantas que ressuscitam” mostraram que as folhas ao serem
desidratadas, apresentavam um dobramento de suas paredes celulares resultando em uma
compactação da célula. Esse dobramento da parede celular acompanhava a desidratação do
protoplasto, evitando o deslocamento da membrana plasmática e mantendo a organização
celular (Farrant 2000, Moore et al. 2006). Análises da composição da parede celular dessas
plantas revelaram alto teor de arabinanos, sugerindo que a presença desses polímeros,
conhecidos por conferirem maior flexibilidade à parede celular (Jones et al. 2003, McCartney
et al. 2000), poderiam contribuir para a manutenção da viabilidade celular durante a re-
hidratação (Moore et al. 2006). Desse modo, o aumento na deposição de polímeros ricos em
arabinose em sementes de pau-brasil poderia de algum modo contribuir para sua tolerância à
dessecação, adquirida durante a maturação.
Galactose e glucose, por sua vez, são monossacarídeos componentes da parede que
foram encontrados em proporções menores em sementes de pau-brasil com 65 DAA.
Alterações nas proporções de arabinose e galactose foram relatadas durante o
desenvolvimento de sementes de soja (Sasaki 1983, Koch et al. 1999). Entretanto, nesses dois
54
estudos as variações desses dois monossacarídeos, arabinose e galactose, foram distintas das
observadas para sementes de pau-brasil (figura 6). Sasaki (1983) observou um aumento na
proporção de galactose e diminuição da proporção de arabinose. Koch et al. (1999), por sua
vez, verificaram manutenção da proporção de galactose e aumento da proporção de arabinose.
Essa proporção, segundo Stombaught et al. (2000), poderia ser um parâmetro melhor de
avaliação da condição de maturidade de sementes do que a quantidade individual desses
açúcares. McCartney et al. (2000) observaram que a deposição de galactanos ocorreu na fase
mais tardia do desenvolvimento, em regiões específicas do cotilédone, em sementes de
ervilha, coincidindo com o período de secagem. Esses autores relacionaram esses fatos com as
propriedades mecânicas da parede celular, o que seria uma preparação para a dessecação. O
aumento de galactose na fase final do desenvolvimento, das sementes de soja, também foi
correlacionado como sendo um possível fator na preparação para a secagem ocorrida no final
da maturação (Koch et al. 1999).
A grande proporção de glucose, galactose e xilose presente na fração de NaOH 6 N
indica a presença de um xiloglucano. O xiloglucano foi relatado como sendo a principal
hemicelulose em sementes de leguminosas, como soja (Huisman et al. 1998), trigo (Obel et
al. 2002) e feijão (Shiga & Lajolo 2006) e não leguminosas como as sementes de Brassica sp.
(Ghosh et al. 2004). Pelo fato da molécula de xiloglucano ser hidrofílica esse polissacarídeo
teria um papel importante nas relações hídricas das sementes, além de sua função estrutural
(Brett & Waldron 1990).
As análises ultra-estruturais das sementes de pau-brasil reforçam os dados bioquímicos
em relação à presença e tipo de compostos de reserva e à parede celular. Ao longo do
desenvolvimento foi possível observar aumento nos compostos de reserva, como o amido e
lipídios (figuras 3, 8-13). Houve nítido aumento na quantidade de amiloplastos ou grãos de
amido isolados com a maturação, mas a quantidade sempre foi superior nos cotilédones. Esses
resultados estão de acordo com relatos prévios de que as sementes de pau-brasil apresentam
cerca de 30% de amido na sua constituição, entretanto, o teor no eixo embrionário é cerca de
60% menor do que nos cotilédones (Hellmann 2006, Leduc 2007).
Em sementes de soja, o teor de lipídios aumenta com a maturidade das sementes
(Marcos Filho 2005). Mesmo não tendo sido utilizada a metodologia adequada para a
extração de lipídios em sementes de pau-brasil foi possível observar que o teor tendeu a
aumentar com a maturação das sementes. Essa observação foi confirmada pelas análises ultra-
estruturais, sendo observado maior número de vesículas lipídicas aos 65 DAA e maior
quantidade nos cotilédones (figuras 10-13), o que corrobora outros trabalhos nos quais foi
mostrado que o teor de lipídios nos cotilédones era cerca de 20
vezes maior do que nos eixos
55
embrionários (Mello 2008). Aos 65 DAA, as vesículas lipídicas estavam distribuídas
principalmente ao longo da membrana plasmática nos eixos embrionários e por todo o
citoplasma e ao redor dos amiloplastos e da plasmalema nos cotilédones.
Diferentemente dos outros compostos de reserva, os corpos protéicos foram
abundantes desde o início da maturação, tanto no eixo quanto nos cotilédones das sementes de
pau-brasil, indicando que estas teriam importante papel no processo de maturação, conforme
relatado para sementes de outras espécies, como em Prunus dulcis (Smith et al. 1995).
O espessamento da parede celular observado tanto nos cotilédones quanto nos eixos
embrionários, durante o desenvolvimento das sementes, deve-se principalmente ao acúmulo
de polissacarídeos. O aumento na espessura da parede celular foi notado de 45 para 55 DAA
(figuras 8 e 9), o que está de acordo com os resultados apresentados na figura 4. Os
polissacarídeos de parede celular são acumulados durante a fase de maturação das sementes e,
além de sua função estrutural, podem servir como material de reserva durante o
estabelecimento inicial da plântula (Buckeridge et al. 2004).
A capacidade de dobramento da parede celular durante a desidratação pode ser uma
característica importante para a manutenção da viabilidade celular, evitando a ruptura do
contínuo parede-protoplasto. Conforme já mencionado, em plantas “que ressuscitam” foi
observado grande teor de arabinose nas folhas, possivelmente na forma de arabinanos,
aumentando a flexibilidade das paredes, fazendo com que estas se dobrassem durante a
secagem sem que houvesse rupturas (Vicré et al. 2004, Moore et al. 2006). O aumento no teor
de arabinose durante a maturação das sementes de pau-brasil coincidiu com o período no qual
se inicia o processo de perda de água (a partir de 55 DAA) (tabela 1, figura 6). Desse modo,
talvez a grande flexibilidade da parede celular dessas sementes, evidenciada pelo pela
presença de dobras, possa estar relacionada à presença arabinanos, os quais parecem aumentar
durante a maturação (figura 6).
Desde o início da maturação (45 DAA) foi evidenciado grande número de dobras nas
paredes celulares das sementes de pau-brasil (figura 8), indicando grande flexibilidade das
mesmas, o que pode ser uma característica conferida pela grande quantidade de arabinose
encontrada em sua composição (figura 6). Considerando-se que nessa fase as células
encontravam-se extremamente hidratadas, com 77% de água, não se pode atribuir esse
dobramento à perda de água. A partir dessa fase ocorre o acúmulo das reservas, com aumento
de massa seca e expansão celular (tabela 1), o que faz com que essas paredes tenham menos
dobras nas fases posteriores de maturação das sementes (figuras 9 e 10).
56
4.2 Variações fisiológicas, bioquímicas e estruturais das sementes durante o
armazenamento
A capacidade germinativa e de produção de plântulas das sementes frescas recém
colhidas era elevada, 89% e 75% respectivamente, já as sementes secas apresentaram a
porcentagem de produção de plântulas cerca de 42 % menor. Apesar do armazenamento em
baixa temperatura ter apresentado melhores resultados quando comparado à temperatura
ambiente, este foi bem inferior ao que foi previamente encontrado para a espécie (Barbedo et
al. 2002, Hellmann 2006). Embora o processo de deterioração seja inevitável e irreversível
(Delouche 2002), o armazenamento a 7 ºC parece ter favorecido a manutenção da
germinabilidade dessas sementes, porém isso não foi mantido ao longo do armazenamento
nessas condições, chegando a ser 32% menor aos 180 dias. Além disso, essa condição de
armazenamento não foi suficiente para manter a capacidade de produção de plântulas
normais, que diminuiu em 53% e continuou em declínio ao longo do armazenamento (tabela
2). Provavelmente, isso se deve ao fato de que a perda do potencial germinativo é a última
manifestação fisiológica dentre os processos que levam à deterioração das sementes, sendo o
desenvolvimento de plântulas mais sensível e, por conseqüência, antecipadamente afetado
(Marcos Filho 2005).
A deterioração das sementes é caracterizada por um conjunto de fatores físicos,
fisiológicos, bioquímicos e citológicos e, apesar de ser melhor visualizada e detectada durante
o armazenamento, pode ter início durante o processo de maturação da semente.
Independentemente do potencial fisiológico das sementes, as condições de manejo e do
ambiente no qual elas são expostas são fundamentais para preservar a qualidade fisiológica ou
decrescê-la rapidamente (Marcos Filho 2005). Para as sementes utilizadas neste trabalho nem
as condições favoráveis de baixa temperatura e o reduzido teor de água foram suficientes para
manter a viabilidade, que pode ter sido perdida devido à má qualidade inicial do lote, o que só
ficou evidenciado após o armazenamento. Segundo Barbedo et al. (2002), a qualidade inicial
do lote é fundamental para a conservação dessa espécie durante o armazenamento. Por outro
lado, foi observado alto coeficiente de variação (tabela 2) para os dados de germinação
(17,63) e, principalmente, de produção de plântulas normais (46,76), o que poderia ser
explicado pela falta de homogeneidade entre as repetições.
Por outro lado, as sementes congeladas (-18 ºC) por 180 dias apresentaram cerca de
50% mais germinação do que as não armazenadas e o dobro do valor inicial para a produção
de plântulas normais. Embora Santos et al. (2002) comentem que durante o armazenamento a
qualidade das sementes não pode ser melhorada, apenas mantida se as condições forem
favoráveis, os resultados da tabela 2 sugerem que alguma alteração fisiológica ocorrida
57
durante o processo de congelamento pode ter contribuído para que as sementes de pau-brasil
apresentassem qualidade fisiológica melhor após 180 dias. O efeito do congelamento sobre
possíveis microrganismos presentes nessas sementes também não pode ser descartado.
Hellmann (2006) observou manutenção da capacidade germinativa e de produção de plântulas
normais após 90 dias de congelamento a -18 ºC de sementes de pau-brasil com 12% de água.
Portanto, a manutenção da condição fisiológica inicial era esperada no presente estudo. Pela
tabela 2, nota-se que o congelamento por 180 dias levou a um pequeno aumento no teor de
água das sementes,
devido a uma tendência de equilíbrio higroscópico, contudo essa elevação
parece não ter modificado a capacidade germinativa dessas sementes. Entretanto, hidratação
semelhante foi observada para sementes mantidas à temperatura ambiente por 60 dias e, nesse
caso, houve drástica redução na qualidade fisiológica das sementes. Isso sugere que outros
fatores e não as diferenças entre os teores de água entre sementes secas e congeladas devem
ter sido determinantes para incremento da germinabilidade observada a -18 °C. Soma-se a
isso, o fato de que os teores de água encontrados nas sementes antes e após o armazenamento
encontravam-se dentro da faixa limite de tolerância à dessecação para essa espécie (Barbedo
et al. 2002).
Ao longo do armazenamento não foram observadas diferenças entre os teores de
açúcares totais e redutores em relação à temperatura de armazenamento (figura 14A).
Entretanto, houve aumento no teor de açúcar total durante o armazenamento em relação ao
conteúdo inicial, o que pode ter relação com a solubilização de reservas (Nkang 2002). Essa
sugestão encontra respaldo no fato de que durante o mesmo período houve redução de até
68% no teor de amido (figura 14C). Segundo Krause et al. (1998), uma das explicações para a
redução do teor de amido sob baixa temperatura seria que esta aumentaria a atividade de uma
ou mais enzimas hidrolíticas desse polissacarídeo, o que é coerente com o aumento
substancial nos conteúdos de açúcares redutores aos 180 dias (figura 14 B), em todas as
temperaturas de armazenamento. Hellmann et al. (2006) observaram que, após 90 dias de
armazenamento a -18 ºC, as sementes de pau-brasil não dispersas e secas tiveram o teor de
amido diminuído.
Por outro lado, resultados divergentes desses foram relatados por Garcia et al. (2006).
Esses autores observaram que as sementes de pau-brasil armazenadas por 12 meses em
temperatura ambiente e em câmara fria apresentavam os teores de açúcares solúveis estáveis,
independentemente da temperatura. Mello (2008) trabalhando com sementes frescas dessa
mesma espécie e secas a cerca de 10% de água observou que após 30 dias de armazenamento
em temperatura de congelamento, o teor de amido aumentava, tanto nos eixos quanto nos
cotilédones. É possível que tais discrepâncias estejam relacionadas à variabilidade natural
58
e/ou à condição inicial das reservas de carboidratos das sementes nos diferentes lotes
utilizados nesses estudos.
Os teores de lipídios mantiveram-se estáveis ao longo do armazenamento,
indiferentemente da temperatura (resultados não mostrados). Dados semelhantes foram
obtidos para a mesma espécie durante o armazenamento por 30 dias em temperatura
ambiente, entretanto, a porcentagem correspondente à massa seca encontrada foi bastante
superior, 70% maior (Mello 2008), fato explicado pelas diferenças na metodologia de
extração utilizada, conforme já discutido acima.
Exceto para sementes armazenadas em congelador por 180 dias, os diferentes tempos
e condições de armazenamento não alteraram o rendimento em parede celular (figura 5). A
degradação de parede celular na condição de congelamento, gerando principalmente
monossacarídeos, poderia ser um dos fatores que levou ao maior aumento no teor de açúcares
solúveis observado na figura 14 C. Somente a análise da composição em monossacarídeos dos
extratos de carboidratos solúveis, realizada por cromatografia líquida de alto desempenho,
poderia confirmar essa sugestão.
De acordo com os dados mostrados na figura 16, a fração predominante nas sementes
de pau-brasil, que corresponde às hemiceluloses fracamente ligadas à parede celular
(extraídas em NaOH 1N), e a fração de pectinas foram alteradas pelas condições e tempos de
armazenamento. Comportamento inverso foi observado para as diferentes temperaturas de
armazenamento em relação à solubilização da fração extraída em NaOH 1N. O
armazenamento a 7 ºC manteve as proporções iniciais até os 30 dias, com diminuição na
solubilização da fração de NaOH 1N e, conseqüentemente, aumento na proporção das demais
frações, aos 60 dias. O armazenamento a 25 ºC, por sua vez, levou a um aumento gradativo
nessa fração com o tempo de armazenamento. Nota-se que aos 180 dias, embora a condição
fisiológica das sementes mantidas a 7 °C e a temperatura ambiente fosse bastante diversa
daquela das sementes secas antes do armazenamento (tabela 2), as frações que compõem a
parede celular mostraram perfil bastante similar. Assim, aparentemente as proporções de
componentes pécticos, hemicelulósicos e celulósicos da parede celular não estão relacionadas
com a perda ou manutenção da capacidade germinativa das sementes de pau-brasil. Por outro
lado, o aumento na capacidade germinativa das sementes congeladas por 180 dias foi
acompanhado por alterações substanciais na proporção de pectinas da parede celular (figura
16 D), que aumentaram em detrimento das hemiceluloses fracamente ligadas à celulose.
Assim, pelos resultados mostrados nas figuras 15 e 16 não há dúvidas que a condição de
congelamento promoveu grandes alterações na parede celular e na qualidade fisiológica das
sementes em relação à germinação.
59
A análise da composição em monossacarídeos da fração péctica da parede celular
indicou alteração na proporção de alguns de seus açúcares, porém perfis similares foram
encontrados tanto em sementes altamente viáveis como naquelas incapazes de germinar
(figura 17, tabela 2). Assim como ocorreu durante a maturação, a principal alteração
observada durante o armazenamento foi na proporção entre arabinose e galactose. A perda da
capacidade germinativa parece estar associada à inversão na proporção entre a galactose e a
arabinose, com redução deste último monossacarídeo nas sementes que perdem
gradativamente a germinabilidade. Para sementes de feijão, o armazenamento em temperatura
ambiente também ocasionou um decréscimo no conteúdo de arabinose, devido possivelmente
a novas interações entre polissacarídeos ricos nesse açúcar, o que produziria moléculas de
grande peso molecular e baixa solubilidade. Contudo, em feijão durante o armazenamento em
baixa temperatura não foram observadas alterações nas proporções dos açúcares componentes
da parede celular (Shiga et al. 2003). O aumento na proporção de galactose na fração péctica
da parede celular de sementes de pau-brasil (figura 17) parece ser um evento comum a todas
as condições de armazenamento utilizadas.
Ao final do armazenamento foi observado um expressivo decréscimo no conteúdo de
ácidos urônicos nas sementes (figura 18). Para as sementes armazenadas a 7 ºC, esse
decréscimo foi de 85%, em relação às sementes não armazenadas. Na condição de
congelamento, também houve decréscimo nos ácidos urônicos, o que indica que o aumento na
proporção da fração péctica mostrado na figura 16 D deve-se possivelmente à redução nas
outras frações da parede ou a um aumento na deposição de pectinas neutras, como galactanos
e arabinanos. Como as proporções de arabinose e galactose não aumentaram (figura 17), a
primeira sugestão parece ser a mais plausível.
A exemplo do que ocorreu com as pectinas, a análise da composição em
monossacarídeos nas frações extraídas em NaOH 1 N e 6 N revelou perfis muito similares em
sementes que mostraram qualidade fisiológica bastante distinta (figuras 18 e 19), o que
sugere que outras variáveis, que não a composição dessas frações devem ser as responsáveis
pela perda de germinabilidade das sementes de pau-brasil, em algumas condições de
armazenamento. Em relação aos teores de açúcar total e ácido urônico (figura 20) o
congelamento parece ter preservado melhor esses teores em relação às sementes armazenadas
pelo mesmo período em temperaturas diferentes.
Mesmo apresentando diferenças nos níveis de deterioração, foi observada alteração na
forma, quantidade e nas características das estruturas celulares, em todas as sementes,
independente da temperatura de armazenamento. O grau de descolamento da parede celular
60
do protoplasto teve relação direta com a temperatura de armazenamento, quanto maior a
temperatura maior foi o descolamento observado (figura 21). Com exceção das sementes
armazenadas em temperatura ambiente (figura 21), nas quais o teor de água possivelmente era
mais alto, as dobras nas paredes celulares, nos eixos, foram menos evidentes do que nas
sementes armazenadas em baixas temperaturas (figura 22 e 23). Nas células cotiledonares
foram evidenciadas apenas pequenas ondulações nas sementes armazenadas em temperatura
ambiente e a 7 ºC. O armazenamento não alterou o espessamento da parede celular, entretanto
as células cotiledonares apresentavam, aparentemente, maior espessamento que as células dos
eixos.
A temperatura de armazenamento também alterou as proporções e as características
dos compostos de reserva. Uma diminuição das vesículas de lipídios foi observada nas
sementes armazenadas a 7 e 25 ºC (figura 21, 22, 24 e 25), quando comparadas às sementes
armazenadas em congelador (figuras 23 e 26) e com aquelas não armazenadas (T0 seca)
(figura 20). Essas alterações foram melhor visualizadas nos cotilédones, uma vez que o teor
de lipídios nesses órgãos chega a ser 18 vezes maior do que nos eixos embrionários.
As maiores alterações nos grãos de amido foram observadas nos cotilédones, uma vez
que a diferença numérica nesses grãos nos eixos se deve ao fato de que o teor de amido nos
cotilédones pode variar de 10-20 vezes mais (Hellmann 2006). Nas células cotiledonares foi
observada desestruturação dos amiloplastos e desagregação dos grãos de amido. Em sementes
de Phaseolus vulgaris submetidas a envelhecimento acelerado foi observado aumento no
número e decréscimo no tamanho dos grãos de amido (Cortelazzo et al. 2005). Para que o
amido seja degradado é necessário que os grânulos sejam desmembrados em estruturas
menores (Buckeridge et al. 2004). A forma esférica do grão de amido está associada ao
elevado teor de amilose. A alteração do formato representa sintoma característico do processo
de deterioração (Marcos Filho 2005). Essa desestruturação dos grãos de amido está de acordo
com os dados bioquímicos, que indicaram redução nos teores de amido, principalmente nas
sementes congeladas, que apresentaram cerca de 70% menos amido do que as sementes não
armazenadas (figura 14 C).
Garcia et al. (2005) reportaram que as proteínas correspondem a cerca de 10% do peso
seco das sementes de pau-brasil. As fotomicrografias das células de sementes dessa espécie
evidenciaram que grande parte do citoplasma dessas células era preenchida por corpos
protéicos (figura 20). Com o armazenamento, independente da temperatura, essa proporção
não se alterou, entretanto, foi evidenciada modificação nas características desses corpos
protéicos, com diminuição na eletrondensidade e aumento no aspecto granuloso. Com o
61
aumento da temperatura de armazenamento foi observada também uma coalescência dessas
estruturas.
Com o envelhecimento acelerado de sementes de feijão foi evidenciada alteração na
agregação e na distribuição de corpos protéicos no citoplasma. Além disso, análises
bioquímicas constataram diminuição nos teores de proteína com o envelhecimento acelerado
(Begnami & Cortelazzo 1996).
Segundo Yamada et al. (2002) a resistência de plantas tolerantes ao resfriamento
estaria associada às propriedades da parede celular. Segundo esses autores, a parede celular
serviria como uma barreira para a propagação de gelo extracelular. Esse fato, associado com a
redução do metabolismo poderia explicar a manutenção na integridade das células após 338
dias de armazenamento em temperatura de congelamento.
5. Conclusão
Durante o desenvolvimento das sementes de pau-brasil ocorrem alterações na
deposição e composição das paredes celulares, as quais antecedem a etapa final da maturação.
O armazenamento das sementes em diferentes temperaturas e por diferentes períodos provoca
algumas modificações na composição das paredes celulares, porém essas alterações não
parecem estar diretamente relacionadas à manutenção ou perda da capacidade germinativa.
Desse modo, conclui-se que as alterações que ocorrem na parede celular durante a maturação
de sementes de pau-brasil parecem ser fundamentais para que estas tolerem a dessecação ao
final da maturação, podendo contribuir para a manutenção de sua capacidade germinativa,
desde que as sementes sejam armazenadas em temperaturas que preservem a integridade de
outros componentes celulares.
62
6. Referências Bibliograficas
Barbedo, C.J. & Marcos Filho, J. 1998. Tolerância à dessecação em sementes. Acta
Botânica Brasílica 12: 145-164.
Barbedo,C.J., Bilia, D.A. & Figueiredo-Ribeiro, R.C.L. 2002. Tolerância à dessecação e
armazenamento de sementes de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil), espécie da Mata
Atlântica. Revista brasileira de Botânica 25: 431-439.
Begnami, C.N., Cortelazzo, A.L. 1996. Celular alterations during accelerated aging of funch
bean seeds. Seed Science Technology 24: 295-303.
Bernal-Lugol, I. & Leopold, A.C. 1992. Changs in soluble during seed storage. Plant
Physiology 98: 1207-1210.
Bewley, J.D. & Black, M. 1994. Seeds: Physiology of development and germination. Ed.
Plenum Press, New York. 2º ed. 445p.
Bewley, J.D. 1997. Seed germination and dormancy. Plant Cell 9: 1055-1066.
Black, M., Corbineau, F., Gee, H. & Côme, D. 1999. Water content, raffinose, and
dehydrins in the induction of desiccation tolerance in immature wheat embryos. Plant
Physiology 120: 463-471.
Blackman, S.A., Obendorf, R.L. & Leopold, A.C. 1995. Desiccation tolerance in
development soybean seeds: The role of stress proteins. Physiologia Plantarum 93: 630-
638.
Blackman, S.A., Wettlaufer, S.H., Obendorf, R.L. & Leopold, A.C. 1991. Maturation
proteins associated with desiccation tolerance in soybean. Plant Physiology 96: 868-874.
Borges, E.S.T. 2005. Conservação ex situ de espécies endêmicas e ameaçadas de Dyckia e
Encholirium (Bromeliaceae). Tese de Doutorado. Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, RJ, 118 p.
Borges, I.F., Barbedo, C.J., Richter, A.A. & Figueiredo-Ribeiro, R.C.L. 2006. Variations
in sugars and cyclitols during development and maturation of seeds of brazilwood
(Caesalpinia echinata Lam., Leguminosae). Brazilian Journal of Plant Physiology 18:
475-482.
Borges, I.F., Giudice, J., Bilia, D.A.C., Figueiredo-Ribeiro, R.C.L. & Barbedo, C.J. 2005.
Maturation of seeds of Caesalpinia echinata Lam. (Brazilwood), an endangered
Leguminous tree from the Braziliam Atlantic Forest. Brazilian Archives of Biology and
Technology 48: 851-861.
Brett, C. & Waldron, K. 1990. Physiology and biochemistry of plant cell walls. Unwin
Hyman Ltd.
63
Brillouet, J.-M. & Carré, B. 1983. Composition of cell walls from cotyledons of Pisum
sativum, Vicia faba and Glycine max. Phytochemistry 22: 841-847.
Buckeridge, M.S., Aidar, M.P.M., Santos, F.P. & Tiné, M.A.S. 2004. Acúmulo de
reservas. In Germinação: do básico ao aplicado. Ferreira, A.G. & Borghetti, F. (Orgs.).
Artmed Editora S.A., Porto Alegre, p. 31-50.
Buckeridge, M.S., Santos, H.P. & Tiné, M.A.S. 2000b. Mobilisation of storage cell wall
polysaccharides in seeds. Plant Physiology and Biochemistry 38: 141-156.
Buckeridge, M.S., Tiné, M.A.S., Santos, H.P. & Lima, D.U. 2000a. Polissacarídeos de
reserva de parede celular em sementes. Estrutura, metabolismo, funções e aspectos
ecológicos. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 12: 137-162.
Buitink, J., Hemminga, M.A. & Hoekstra, F.A. 2000. Is there a role for oligosaccharides in
seed longevity? An assessment of intracellular glass stability. Plant Physiology 122:
1217-1224.
Cardoso, V.J.M. 2004b. Germinação. In Fisiologia vegetal. Kerbauy, G.B. Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro, p. 386-408.
Cardoso, V.J.M.. 2004a. Dormência: Estabelecimento do processo. In Germinação: do
básico ao aplicado. Ferreira, A.G. & Borghetti, F. (Orgs.). Artmed Editora S.A., Porto
Alegre, p. 95-108.
Carpita, N. & McCann, M. 2000. The Cell Wall. In Biochemistry & Molecular Biology of
Plants. Buchanan, B.B., Gruissem, W., Jones, R.L. (Eds). Ed. American Society of
Plant Physiologists, Rockville, p. 53-107.
Carvalho, N.M. & Nakagawa, J. 1983. Sementes: ciência, tecnologia e produção. 2ª ed. rev.,
Fundação Cargill, Campinas.
Carvalho, S.R.S., Provan, J., Lira, C.F., Pereira, L.O.R., Ferreira, P.C.G. & Cardoso
L.A. 2005. High levels of genetic structuring as a result of population fragmentation in
the tropical tree species Caesalpinia echinata Lam. Biodivesity and. Conservation 14:
1047-1057.
Conservation International. 2007. Biodiversity HOTSPOTS. Disponível
<http://www.bioodiversityhotspots.org > Acesso em dezembro de 2007.
Cortelazzo, A.L., Coutinho, J. & Granjeiro, P.A. 2005. Storage and ageing of french beans
(Phaseolus vulgaris L.): Effect on seed viability and vigor. Brazilian Journal
Morphology of Science 22: 121-128.
Delouche, J. 2002. Germinação, deterioração e vigor da semente. Seed News 6: 24-31.
64
Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. & Smith, F. 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry 28:
350-356.
Eichelberger, L., Maia, M.S., Peske, S.T. & Moraes, D.M. 2002. Composição química de
sementes de azevém em resposta ao retardamento da secagem e ao armazenamento.
Pesquisa Agropecuária Brasileira 37: 693-701.
Farrant, J.M. 2000. A comparison of mechanisms of desiccation tolerance among three
angiosperm resurrection plant species. Plant Ecology 151: 29-39.
Filisetti-Cozzi, T.M.CC & Carpita, N.C. 1991. Measurement of uronic acids without
interference from neutral sugars. Anaytical. Biochememistry 197: 157-162.
Fundação SOS Mata Atlântica. 2007. Disponível em <http://www.sosma.org.br > Acesso
em Dezembro de 2007.
Garcia, I.S., Souza, A., Barbedo, C. J., Dietrich, S.M.C. & Figueiredo-Ribeiro, R.C.L.
2006. Changes in soluble carbohydrates during storage of seeds of Caesalpinia echinata
Lam. (Brazilwood), an endangered leguminous tree from the Brazilian Atlantic forest.
Brazilian Journal of Biology 66: 29-41.
Ghosh, P., Ghosal, P., Thakur, S., Lerouge, P., Loutelier-Bourhis, C., Driouich, A. &
Ray, B. 2004. Cell wall polysaccharides of Brassica campestris seed cake: isolation and
structural features. Carbohydrate Polymers 57: 7-13.
Górecki, R.J., Piotrowicz-Cieslak, A. & Obendorf, R.L. 1997. Soluble sugars and
flatulence-producing oligosaccharides in maturing yellow lupin (Lupinus luteus L.)
seeds. Seed Science Research 7: 185-193.
Gorshkova, T.A., Wyatt, S.E., Salnikov, V.V., Gibeaut, D.M., Ibragimov, M.R.,
Lozovaya, V.V. & Carpita, N.C. 1996. Cell-wall polysaccharides of development of
flax plants. Plant Physiology 110: 721-729.
Hellmann, M.E. 2006. Tolerância ao congelamento de sementes de Caesalpinia echinata
Lam. (pau-brasil). Dissertação de Mestrado, Instituto de Botânica, São Paulo.
Hellmann, M.E., Mello, J.I.O., Figueiredo-Ribeiro, R.C.L. & Barbedo, C. J. 2006.
Tolerância ao congelamento de sementes de pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam.)
influenciada pelo teor de água. Revista Brasileira de Botânica 29: 21-31.
Hoekstra, F.A., Golovina, E.A. & Buitink, J. 2001. Mechanisms of plant desiccation
tolerance. Trends in Plant Science 6: 431-438.
Hong, T.D. & Ellis, R.H. 1996. A protocol to determine seed storage behaviour. Rome:
IRPGRI, 55p. (Technical Bulletin, 1).
65
Horbowicz, M. & Obendorf, R.L. 1994. Seed desiccation tolerance and storability:
dependence on flatulence-producing oligosaccharides and cyclitols – review and survey.
Seed Science Research 4: 385-405.
Huisman, M.M.H., Schols, H.A. & Voragen, A.G.J. 1998. Cell wall polysaccharides from
soybean (Glycine max) meal. Isolation and characterisation. Carbohydrate Polymers 37:
87-95.
INPE & Fundação Sos Mata Atlântica. 2006. Atlas dos Remanescentes Florestais do
Domínio Mata Atlântica 2000-2005. São Paulo: Instituto Nacional de Pesquisas
Espaciais (INPE), São José dos Campos, e Fundação SOS Mata Atlântica.
ISTA. 1985. International rules for seed testing. Seed Science and Technology 13: 356-513.
Jones, L., Milne, J.L., Ashford, M.D. & McQueen-Mason, S.J. 2003. Cell wall arabian is
essencial for guard cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences 100:
11783-11788.
Kermode, A.R. 1990. Regulatory mechanisms involved in the transition from seed
development to germination. Critical Reviews in Plant Sciences 9: 155-195.
Koch, J.L., Horbowicz, M. & Obendorf, R.L. 1999. Methanol, pectin and pectinesterase
changes during soybean seed maturation. Seed Science Research 9: 311-320.
Koster, K.L. 1991. Glass formation and desiccation tolerance in seeds. Plant Physiology 96:
302-304.
Krause, K.-P., Hill, L., Reimholz, R., Nielsen, T.H., Sonnewald, U. & Stitt, M. 1998.
Sucrose metabolism in cold-stored potato tubers with decreased expression od sucrose
phosphate synthase. Plant Cell Environ 21: 285-299.
Leduc, S.N.M. 2007. Indução de tolerância à dessecação e variação de carboidratos solúveis
em sementes de Caesalpinia echinata Lam. (pau-brasil) durante a maturação.
Dissertação de Mestrado, Instituto de Botânica, São Paulo.
Leme, E.M.C. & Siqueira Filho, J.A. 2006. A Mata Atlântica – aspectos gerais. In: Siqueira
Filho, J.A., Leme, E.M.C. (eds.). Fragmentos de Mata Atlântica do Nordeste.
Biodiversidade, Conservação e suas Bromélias. Andréa Jakobsson, Rio de janeiro.
Lin, T.-P. & Huang, N.-H. 1994. The relationship between carbohydrate composition of
some tree seeds and their longevity. Journal of Experimental Botany 45: 1289-1294.
Lino, C.F., 1992. Reserva da Biosfera da Mata Atlântica. Volume 1. ed. Consórcio Mata
Atlântica-Universidade Estadual de Campinas. São Paulo.
Louro, R.P., Santiago, L.J.M., Dos Santos, A. V. & Machado, R. D. 2003. Ultrastructure of
Eucalyptus grandis X Eucalyptus urophylla plants cultivated ex vitro in greenhouse and
field conditions. Tree Structure and Function 17: 11-22.
66
Marcos Filho, M. 2005. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas, Fealq, Piracicaba.
Markovic, O. & Obendorf, R.L. 1999. Soybean seed pectinesterase. Seed Science Research
8: 455-461.
McCartney, L., Ormerod, A.P., Gidley, M.J. & Knox, J.P. 2000. Temporal and spatial
regulation of pectic (1
→
4)-
β
-D-galactan in cell walls of developing pea cotyledons:
implications for mechanical properties. Plant Journal 22: 105-113.
McNeil, M., Darvill. A.G., Fry, S.C. & Albersheim, P. 1984. Structure and function of the
primary cell walls of plants. Annalls of Review Biochemistry 53: 625-663.
Mello, J.I.O. & Barbedo, C.J. 2007. Temperatura, luz e substrato para a germinação de
sementes de pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam., Leguminosae – Caesalpinioideae).
Revista Árvore 31: 645-655.
Mello, J.I.O. 2008. Compostos de reserva de sementes e suas relações com diferentes níveis
de sensibilidade à dessecação e ao congelamento. Dissertação de Mestrado, Instituto de
Botânica, São Paulo.
Micheli, F. 2001. Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important roles in plant
physiology. TRENDS in Plant Science 6: 414-419.
Mittermeier, R.A., Da Fonseca, G.A.B., Rylands, A.B. & Brandon,K. 2005. A brief
history of biodiversity conservation in Brazil. Conservation Biology 19: 601-607.
Moore, J.P., Nguema-Ona, E., Chevalier, L., Lindsey, G.C., Brandt, W.F., Lerouge, P,
Farrant, J.M. & Driouich, A. 2006. Response of the leaf cell wall to desiccation in the
resurrection plant Myrothamnus flabellifolius. Plant Physiology 141: 651-662.
Myers, N., Mittermeier, R.A., Mittermeier, C.G., Fonseca, G.A.B. & Kent, J. 2000.
Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature 403: 853-858.
Nkang, A. 2002. Carbohydrate composition during seed development and germination in two
sub-tropical rainforest tree species (Erythrina caffra and Guilfoylia monostylis). Journal
of Plant Physiology 159: 473-483.
Obel, N., Porchia, A.C. & Scheller, H.V. 2002. Dynamic changes in cell wall
polysaccharides during whheat seedling development. Phytochemistry 60: 603-610.
Obendorf, R.L. 1997. Oligosaccharides and galactosyl cyclitols in seed desiccation tolerance.
Seed Science Research 7: 63-74.
Peterbauer, T. & Richter, A. 2001. Biochemistry and physiology of raffinose family
oligosaccharides and galactosyl cyclitols in seeds. Seed Science Research 11: 185-197.
Priestley, D.A. & Williams, S.E. 1985. Changes in cotiledonary lipids during drying of
cocoa (Theobroma cacao L.) seeds. Tropical Agriculture 63: 65-67.
67
Ren, C. & Kermode, A.R. 2000. An increase in pectin methyl esterase activity accompanies
dormancy breakage and germination of yellow cedar seeds. Plant Physiology 124: 231-
242.
Roberts, E.H. 1973. Predicting the storage life of seeds. Seed Science and Technology 1:
499-514.
Rocha, Y. T. 2004. Ibirapitinga: história, distribuição e conservação do pau-brasil
(Caesalpinia echinata Lam., Leguminosae) do descobrimento à atualidade. Tese de
Doutorado, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
Santana, D.G. & Ranal, M.A. 2004. Análise Estatística. In Germinação: do básico ao
aplicado. Ferreira, A.G. & Borghetti, F. (Orgs.) Artmed Editora S.A., Porto Alegre, p.
197-208
Santos, I.R.I. 2000. Criopreservação: potencial e perspectivas para a conservação de
germoplasma vegetal. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 12 (Edição especial): 70-
84.
Santos, P.M., Gondim, T.C.O., Araújo, E.F. & Dias, D.C.F.S. 2002. Avaliação da
qualidade fisiológica de sementes de milho-doce pelo teste de envelhecimento
acelerado. Revista Brasileira de Sementes 24: 91- 96.
Sasaki, K. 1983. Changes in Neutral Sugar Compositions of Cell Wall Polysaccharides
during Redifferentiation of Cultured Carrot Cells and during Maturation of Soybean
Seeds. Plant and Cell Physiology 24: 811-821.
Schaffer, W.B. & Prochnow, M. 2002. A Mata Atlântica e você. Como preservar, recuperar
e se beneficiar da mais ameaçada floresta brasileira. Ipisis, Brasília.
Shiga, T.M. & Lajolo, F.M. 2006. Cell wall polysaccharides of common beans (Phaseolus
vulgaris L.) – composition and structure. Carbohydrate Polymers 63: 1-12.
Shiga, T.M., Lajolo, F.M. & Filisetti, T.M.C.C. 2004. Changes in the cell wall
polysaccharides during storage and hardening of beans. Food Chemistry. 84: 53-64.
Silveira, C.E.S. & Amaral, L.I.V. 2000. Parede celular vegetal. Revista da Universidade
Católica de Brasilia 8: 65-100.
Siqueira, A.C.M.F., Nogueira, J.C.B., & Kageyama, P.Y. 1993. Conservação de recursos
genéticos ex situ do cumbaru (Dipteryx alata Vog.) – Leguminosae. Revista do Instituto
Florestal. 5: 231-243.
Somogyi, M. 1945. A new reagent for the determination of sugars. Journal of Biology and
Chemistry 160: 61-68.
Steadman, K.S., Burgoon, M.S., Schuster, R.L., Lewis, B.A., Edwardson, S.E. &
Obendorf, R.L. 2000. Fagopyritols, D-chiroinositol and other soluble carbohydrates in
68
buckwheat seed milling fractions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 2843-
2847.
Stolle-Smits, T., Beekhuizen, J.G., Kok, M.T.C., Pijnenburg, M., Recourt, K. Derksen, J.
& Voragen, A.G.J. 1999. Changes in cell wall polysaccharides of green bean pods
during development. Plant Physiology 121: 363-372.
Stombaugh, S.K., Jung, H.G., Orf, J.H. & Somers, D.A. 2000. Crop physiology &
metabolism. Crop Science 40: 408-412.
Sun, W.Q., Irving, T.C. & Leopold, A.C. 1994. The role os sugar, vitrification and
membrane phase transition in seed desiccation tolerance. Physiologia Plantarum 90:
621-628.
Tabarelli, M., Pinto, L.P., Silva, J.M.C., Hirota, M. & Bedê, L. 2005. Challenges and
opportunities for biodiversity conservation in the Brazilian Atlantic Forest.
Conservation Biology 19: 695-700.
Teixeira, S.P., Carmello-Guerreiro, S.M. & Machado, S.R. 2004. Fruit and seed ontogeny
related to the sees behaviour of two tropical species of Caesalpinia (Leguminosae).
Botanical Journal of the Linnean Society 146: 57-70.
Toledo, F.F. & Marcos Filho, J. 1977. Manual das sementes - tecnologia da produção. São
Paulo: Ceres.
Vertucci, C.W. & Roos, E.E. 1990. Theorical basis of protocols for seed storage. Plant
Physiology 94: 1019-1023.
Vicré, M., Lerouxel, O., Farrant, J., Lerouge, P. & Driouich, A. 2004. Composition and
desiccation-induced alterations of the cell wall in the resurrection plant craterostigma
wilmsii. Physiologia Plantarum 120: 229-239.
Villela, F.A. & Peres, W.B. 2004. Coleta, beneficiamento e armazenamento. In Germinação:
do básico ao aplicado. Ferreira, A.G. & Borghetti, F. (Orgs.). Artmed Editora S.A.,
Porto Alegre, p. 265-281.
Voelker, T. & Kinney, A.J. 2001. Variations in the biosynthesis of seed-storage lipids. Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 335-361.
Weber, H., Borisjuk, L. & Wobus, U. 1996. Controlling seed development and seed size in
Vicia faba: a role for seed coat-associated invertases and carbohydrate state. The Plant
Journal 10: 823-834.
Weber, H., Borisjul, L. & Wobus, U. 1997. Sugar import and metabolism during seed
development. Trends in plant science 2: 169-174.
69
Wesley-Smith, J., Berjak, P., Pammenter, N.W. & Vertucci, C.W. 1995. Ultrastructural
evidence for the effects of freezing in embryonic axes of Pisum sativum L. at various
water contents. Annals of Botany 76: 59-64.
Yamada, T., Kieroda, K., Jitsuyama, Y., Takezama, K., Arakawa, K. & Fujikawa, S.
2002. Roles os the plasma membrane and cell wall in the responses of plant cells to
freezing. Planta 215: 770-778.
70
7. Anexos
7.1.Análises Ultra-estruturais das sementes de paubrasil (eixo e cotilédones) durante
a maturação
45 DAA 55 DAA 65 DAA
Eixo embrionário
Eletromicrografias de cortes transversais do eixo embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil)
nos três estádios de maturação. As setas indicam dobras na parede celular. Am: Grão de amido; Cp:
Corpo proteico; G: Complexo de Golgi; Nu: Núcleo; Mi: Mitocôndria; Pt: plastídeo, Re: Retículo
endoplasmático; Lm: Lamela média; Zj: Zona de junção das células; Lp: Vesícula de lipídio.
71
45 DAA 55 DAA
65 DAA
Cotilédones
Eletromicrografias de cortes transversais de cotilédones de sementes de C. echinata (pau-brasil) nos
três estádios de maturação. (Pc) com a seta indicando campo de pontoação (P). Am:Grão de amido;
Cp: Corpo proteico; G: Complexo de Golgi; Lp: Vesícula de lipídeo; Re: Retículo endoplasmático;
Mp: Plasmalema; Pd: Plasmodesmata.
72
7.2.Análises Ultra-estruturais das sementes de paubrasil (eixo e cotilédones) durante
o armazenamento
Eixo embrionário
25 C 7 ºC -18ºC
Eletromicrografias de cortes transversais de eixo embrionário de sementes de C. echinata (pau-brasil)
armazenadas por 338 dias em diferentes temperaturas. (Pc) Parede celular seta. Zj: Zona de junção das
células; (*) Retração do protoplasto Am: Grão de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo;
Mi: mitocôndria; Mp: Plasmalema;
73
Cotilédones
25 C 7 ºC -18ºC
Eletromicrografias de cortes transversais de células dos cotilédones de sementes de C. echinata (pau-
brasil) armazenadas por 338 dias em diferentes temperatura. (Pc) Parede celular; (Lp) Vesículas de
lipídio; (Mp) Plasmalema; (*) Retração do protoplasto junto à zona de junção (Zj) das células; Grão
de amido; Cp: Corpo proteico; Lp: Vesícula de lipídeo; Mp:Plasmalema; P: Campo primário de
pontoação; Pd: Plasmodesmata.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
