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UNIVERSIDADE
FEDERAL
DE
SANTA
MARIA
CENTRO
DE
CIÊNCIAS
RURAIS
PROGRAMA
DE
PÓS-GRADUAÇÃO
EM
MEDICINA
VETERINÁRIA
CÉLULAS
–TRONCO
MONONUCLEARES
AUTÓLOGAS
NA
CICATRIZAÇÃO
DE
DEFEITOS
TIBIAIS
AGUDOS
EXPERIMENTAIS
DE
CÃO.
DISSERTAÇÃO
DE
MESTRADO
GRAZIELA
KOPINITS
DE
OLIVEIRA
S
ANTA
M
ARIA
,
RS,
B
RASIL
2008
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2
CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA
CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS
EXPERIMENTAIS DE CÃO
por
Graziela Kopinits de Oliveira
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Cirurgia Veterinária, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
Orientador: Prof. Alceu Gaspar Raiser
Santa Maria, RS, Brasil
2008
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3
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA
CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS EXPERIMENTAIS
DE CÃO
elaborada por
Graziela Kopinits de Oliveira
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISÃO EXAMINADORA:
Alceu Gaspar Raiser, Dr.
(Presidente/Orientador)
Ney Luis Pippi, Dr. (UFSM)
Emerson Antonio Contesini, Dr. (UFRGS)
Santa Maria, 07 de maio de 2008.
4
Dedico esta dissertação a meus pais e irmãos que sempre foram o verdadeiro significado de
amor incondicional na minha vida.
5
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, que sempre iluminou meu caminho e me deu
forças mesmo nos momentos de maior dificuldade, não me deixando desistir nunca de meus
sonhos.
Agradeço a meus pais, sempre maravilhosos, e sempre do meu lado, e que mesmo
distante faziam de tudo para ficarem mais perto, e agradeço por todo orgulho que eles têm de
mim. Por tornarem a minha vida mais fácil e feliz, e por serem meus pais. Amo vocês.
A meus irmãos More e Cá, que são a melhor parte de mim, meus melhores amigos,
meus scaffolds, meus lindos que eu tanto amo, e que me fizeram tanta falta nesse tempo que
passei longe, mas que apesar da distância sempre estiveram bem juntinho de mim.
A Rapha, mais que namorado, meu melhor amigo, que apesar dos problemas sempre
esteve do meu lado, sempre me deu forças, e me fez companhia, mesmo que pela internet,
nesse tempo longe. Um menino lindo e chatinho que é uma parte boa de minha vida. Te adoro
muito.
Ao meu padrinho Gildo, e primos Gabi, Markus, Carol e Camilinha, pessoas que amo
muito.
Ao meu gato Zé, que me ensinou a amar aos gatos tanto quanto aos cães.
Ao meu orientador professor Alceu Gaspar Raiser, mais que orientador, uma pessoa
maravilhosa, que me ajudou muito durante o mestrado, e que me fez querer ser igual a ele
quando eu crescer.
Ao professor Ney Luis Pipi, um verdadeiro paizão entre os professores do LACE,
sempre disposto a proteger, mesmo os não orientados dele, que terminavam se tornando
orientados por tabela.
Ao prof. Adriano Carregaro, um orientador com cara de pós graduando, que ensinou a
cada um de nós a gostar de anestesia, como se fosse cirurgia, se é que isso é possível.
Ao professor Alexandre Mazzante, um professor excelente, que me ensinou a entender
um pouco de neurologia, e que nos proporcionou momentos bem divertidos estudando em
grupo para as provas de neuro.
Ao professor João Eduardo, um grande professor, e que apesar de não termos muita
aproximação me ajudou muito, principalmente nos deixando fazer os plantões do bloco 2,
uma forma de crescer o estudante de pós-graduação.
6
À profa. Sônia Lopes e a todos os professores da pós-graduação em Medicina
Veterinária, que tornaram o meu aprendizado mais fácil, e me tornaram uma profissional
muito melhor.
À toda a minha equipe (Débora, Fabiano, Danieli, Guilherme, Josaine, Laetícia,
Eduardo, Francieli, Priscila, Tiagão, Lorenço, João Paulo e Arícia), grandes amigos que
tornaram os dias cansativos de experimento muito mais divertidos, e com a qual eu pude
contar sempre.
Ao amigo Fabiano, uma pessoa pura e divertida, com qual podemos contar sempre.
Um menino maravilhoso que gosto muito.
À amiga Débora Olsson, sempre preocupada em cuidar da gente e em nos fazer
crescer. Uma pessoa maravilhosa e explosiva, que aprendi a gostar de verdade.
À amiga Josaine, que me acompanhou desde o começo do mestrado, e que se tornou
uma grande amiga que tenho certeza que sempre vai estar do meu lado e sempre torcendo por
mim. Uma amiga que mora no meu coração.
À amiga Laetícia, que passou a fazer parte de minha vida no dia da prova de mestrado,
uma pessoa muito divertida, sempre alegre e que aturou muito maus momentos de mau
humor. Obrigada pelas conversas que sempre me animaram.
Ao amigo Guilherme, ou simplesmente Gui, outro que entrou na minha vida no dia da
prova do mestrado, e que espero que não saia mais. Agradeço por todos os momentos
divertidos com ele e Mari, pessoas mais do que especiais. Amigos que estão sempre do seu
lado.
À amiga Danieli, uma pessoa muito especial, sempre pronta para ajudar aos amigos, e
com quem eu adoro conversar.
À amiga Lisiane, que de tão maravilhosa se tornou uma irmã mais velha para mim. E a
toda família da Lisi (Pipo, Nanda e Nati), que me acolheram tão carinhosamente quando fui
visitá-los.
Aos amigos da pós-graduação Kleber, Fabrício, Eduardo, Rafael, Daniel, Charles,
Renata (virologia), Paula, Fernando, Gabrieli, Bia, Érica, Rogerião e Diego por serem
especiais e tornarem os dias longe de minha família mais fáceis.
Aos estagiários Francieli, Priscila, Tiagão, Lorenço, João Paulo, Arícia, pelo amor que
tiveram pelos meus cães, pelo carinho que me dedicaram, e por terem conquistado minha
amizade.
A todos os estagiários que passaram pelo LACE e pelo bloco 2.
Às companheiras de apartamento Deisi, Micheli e Tati, amigas muito especiais.
7
À tia Menô, minha mãezona gaúcha.
A todos os funcionários do Hospital Veterinário e do LACE, pelas conversas no
banheiro e no corredor, pelo carinho e dedicação.
A meus cães, os melhores de todos, meus amiguinhos lindos, em especial ao Lost e à
Juli, que perderam a vida durante o experimento. Sem vocês nada disso seria possível.
Às empresas pedigree, JP Indústria Farmacêutica S.A , Pharmacia Brasil, Ouro fino e
technewindustria por terem contribuído com a execução de meu experimento.
À Capes pela bolsa e ao Cnpq pelo auxílio financeiro ao meu experimento.
À UFSM, que me proporcionou estrutura física para o desenvolvimento de minha
pesquisa e professores maravilhosos.
Ao LACE, laboratório de análises clínicas, e laboratório de virologia, pela estrutura
para o desenvolvimento de meu experimento.
8
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
CÉLULAS –TRONCO MONONUCLEARES AUTÓLOGAS NA
CICATRIZAÇÃO DE DEFEITOS TIBIAIS AGUDOS EXPERIMENTAIS
DE CÃO.
A
UTORA
:
GRAZIELA
KOPINITS
DE
OLIVEIRA
O
RIENTADOR
:
ALCEU
GASPAR
RAISER
Santa Maria, 03 de março de 2008
Nesta pesquisa foi abordada a utilização de células-tronco mononucleares (CTM) na
cicatrização de defeito ósseo experimental, como alternativa aos métodos convencionais,
analisando-se a velocidade da cicatrização, além da presença dessas células no tecido
neoformado. Foram utilizados 18 cães, separados em três grupos de seis, e de cada animal
foram colhidas células da medula óssea (MO), contadas e analisadas para morfometria,
através da contagem manual e mielograma. Um defeito ósseo tibial foi então criado
cirurgicamente, e a lesão tratada com esponja de gelatina embebida em solução fisiológica
(G1), esponja de gelatina embebida com aspirado de medula óssea processado (G2) e esponja
de gelatina embebida com aspirado de MO processado e proteína óssea morfogenética (G3).
A cicatrização foi então avaliada por estudos radiográficos e a presença de CTM foi
identificada através de marcadores nanocristais Qtracker em microscopia com luz
fluorescente uma semana após a intervenção cirúrgica. Entre as células identificadas pelo
marcador, foram encontradas células da linhagem óssea. As avaliações radiográficas
demonstram crescimento ósseo acelerado nos grupos G2 e G3, e estatisticamente houve
diferenças significativas entre o G1 e G3 em todos os tempos estudados e entre G1 e G2 nos
tempos de 30 e 45 dias. A utilização de células-tronco mononucleares adultas suplementadas
ou não com rhBMP-2 são alternativas favoráveis ao crescimento ósseo em defeitos
experimentais agudos de tíbia de cães.
Palavras-chave: Células-tronco, proteína óssea morfogenética, osso, tíbia, cães.
9
ABSTRACT
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária
Universidade Federal de Santa Maria
AUTOLOGOUS MONONUCLEAR STEM CELLS IN DOGS:
EXPERIMENTAL ACUTE TIBIAL DEFECT HEALING.
A
UTORA
:
GRAZIELA
KOPINITS
DE
OLIVEIRA
O
RIENTADOR
:
ALCEU
GASPAR
RAISER
Santa Maria, 03 de março de 2008.
This research was aimed at evaluating the mononuclear stem cells (MSC) use in
experimental bone defect healing, as an alternative to the conventional methods, analyzing the
healing speed, and the presence of these cells in the new-born tissue. The bone marrow (BM)
was collected from 18 dogs, counted and morphometrically analyzed, through manual count
and myelogram. The dogs were separated in three groups (G1, G2, G3) of six animals. A
surgical tibial bone defect was made then, in each dog and the wound was treated with gelatin
sponge and physiologic solution (G1), gelatin sponge and processed bone marrow (G2) and
gelatin sponge, processed BM and morphogenetic bone protein (G3). The healing was then
evaluated through radiographic study and the presence of MSC was identified through
Qtracker nanocrystal labeler and fluorescent light microscopy one week after the surgery.
Cells from the bone lineage were found among the labeled cells. The radiographic evaluations
demonstrate speeding in bone growth in the groups G2 and G3, and were significant
statistically differences between the G1 and G3 in all studied periods and between G1 and G2
at the 30 and 45 days period. The supplemented or not-supplemented with rhBMP-2 adult
mononuclear stem cells use are favorable alternatives to the speed the healing process of acute
dog tibial experimental defects.
Key words: stem cells,
Bone Morfogenetic Protein, bone, tibia, dogs
10
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Níveis de hemoglobina medidos antes do início da colheita de medula óssea,
imediatamente antes do início e após o término da autotransfusão
sanguínea...................................................................................................................................36
TABELA 2 – Número de células e viabilidade celular obtida no botão celular dos cães dos
grupos G2 e G3.........................................................................................................................37
TABELA 3 – Resultados da Imunofluorescência e da biopsia óssea para identificação das
células marcadas com nanocristais Q-tracker...........................................................................38
TABELA 4 – Taxa de crescimento ósseo, observada através de radiografias. Comparação de
cada tempo com o exame radiográfico pós-operatório imediato..............................................40
TABELA 5: resultados do teste t de studente na comparação entre o crescimento ósseo entre
os grupos aos 15, 30 e 45 dias...................................................................................................42
11
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - Condições de alojamento dos animais em boxes individuais de aço inoxidável
no Biotério de Experimentação Animal da Universidade Federal de Santa
Maria.........................................................................................................................................24
FIGURA 2 - A. Animal posicionado em decúbito lateral, com panos de campo já
posicionados, para ser submetido à colheita de medula óssea. B. Posicionamento da agulha de
Steis na fossa trocantérica do fêmur para coleta de medula......................................................26
FIGURA 3 - Colheita de medula óssea no acesso pela fossa trocantérica (A) e pela asa do íleo
(B) através de pressão negativa em seringa previamente heparinizada em um cão..................27
FIGURA 4 - Apresentação da medula óssea sendo colhida para a bolsa coletora (A) e
filtragem da mesma através de filtros de 200µ contidos no kit bone marrow
(B).............................................................................................................................................27
FIGURA 5 - Colheita de uma alíquota de 3ml de medula óssea da bolsa de infusão, usada
para contagem da porcentagem de células nucleadas e teste de viabilidade
celular........................................................................................................................................28
FIGURA 6 - (A) Colocação de Histopaque (B) em tubos falcon de 50ml, para posterior
adição de sangue de medula óssea............................................................................................29
FIGURA 7 - A. Nuvem de células mononucleares (seta), isolada em gradiente de densidade,
após centrifugação do sangue de medula óssea. B. Botão celular, contendo células
mononucleares, obtido após centrifugação para marcação com nanocristais...........................30
FIGURA 8 - A. Nanocristais Q-tracker. B. Células mononucleares marcadas com de
nanocristais Q-tracker, vista através de microscopia fluorescente (ampliação da objetiva:
40X)..........................................................................................................................................30
FIGURA 9 - A e B. Defeito monocortical sendo confeccionado com uma broca de desgaste
sobre a região medial proximal da tíbia. C Defeito ósseo monocortical sobre a região medial
12
da tíbia. D. Aprofundamento do defeito ósseo monocortical sobre a região proximal da
tíbia............................................................................................................................................31
FIGURA 10 - A. Apresentação comercial da esponja de colágeno. B. Esponja de colágeno
medindo 2,5 x 2,0cm, para utilização como carreador de células-tronco mononucleares........32
FIGURA 11 - A. Esponja de colágeno sendo embebida em solução salina. B. Esponja de
colágeno sendo embebida com o botão celular de células-tronco mononucleares...................33
FIGURA 12 - A. Esponja de gelatina embebida com células-tronco mononucleares. B.
Esponja de colágeno sendo colocada no defeito ósseo tibial de cão........................................33
FIGURA 13 - Raspagem óssea com bisturi, lâmina n. 10, nas adjacências do defeito tibial
para confecção de lâminas de leitura para identificação de células-tronco
marcadas....................................................................................................................................34
FIGURA 14 - Tecido ósseo colhido através de biopsia, positivo (verdes) à leitura de
microscópio fluorescente. (ampliação da objetiva: 40X)..........................................................39
FIGURA 15 - Tecido ósseo colhido através de biopsia à leitura do microscópio óptico A.
Osteoclastos. B. Osteócito. (ampliação da objetiva 100x)........................................................39
FIGURA 16 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos
avaliados em um cão do grupo 1. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -
45 dias de pós-operatório (Animal 5).......................................................................................41
FIGURA 17 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes tempos
avaliados em um cão do grupo 2. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -
45 dias de pós-operatório. (Animal 10)....................................................................................41
FIGURA 18 - Radiografia mostrando ao aumento da densidade óssea nos diferentes tempos
avaliados em um cão do grupo 3. A - pós-operatório imediato; B - 15 dias, C - 30 dias e D -
45 dias de pós-operatório. (Animal 17)....................................................................................42
13
LISTA
DE
ABREVIATURAS
CTM – Células-tronco mononucleares
BMP – Proteína óssea morfogenética
rhBMP-2 - Proteína óssea morfogenética recombinante humana
CT – Células-tronco
CTA – Células-tronco adultas
CP – Células progenitoras
QDs – Pontos quânticos
COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
UFSM – Universidade Federal de Santa Maria
MO – Medula óssea
MPA – Medicação pré-anestésica
LACE – Laboratório de cirurgia experimental
FTCM – Fração total de células mononucleares
DMEM – Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................15
2 DESENVOLVIMENTO........................................................................................................17
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................17
2.1.1 Osso e cicatrização óssea.................................................................................................17
2.1.2 Proteína óssea morfogenética (BMP)..............................................................................18
2.1.3 Células-tronco..................................................................................................................19
2.1.4 Carreadores (Scaffold)......................................................................................................22
2.2 METODOLOGIA...............................................................................................................23
2.2.1 Comitê de ética em pesquisas com animais.....................................................................23
2.2.2 Animais............................................................................................................................23
2.2.3 Separação dos animais.....................................................................................................24
2.2.4 Colheita de material para transfusão autóloga.................................................................25
2.2.5 Pré-operatório e protocolo anestésico..............................................................................25
2.2.6 Colheita das Células.........................................................................................................25
2.2.7 Processamento do sangue da medula óssea para obtenção de CTMs..............................28
2.2.8 Procedimento cirúrgico....................................................................................................31
2.2.9 Cuidados Pós-operatórios................................................................................................33
2.2.10 Avaliação radiográfica...................................................................................................34
2.2.11 Avaliação das amostras através da fluoroscopia............................................................34
2.2.12 Análise estatística...........................................................................................................34
2.2.13 Doação de animais.........................................................................................................35
2.3 RESULTADOS...................................................................................................................35
2.4 DISCUSSÃO......................................................................................................................42
3 CONCLUSÃO.......................................................................................................................46
4 REFERÊNCIAS.....................................................................................................................47
15
1 INTRODUÇÃO
A atual condição socioeconômica tem favorecido a prevalência dos traumatismos em
pequenos animais devido ao aumento da convivência destes com os seres humanos, seja
perambulando pelas ruas, ou mesmo como animais de estimação. Eles estão sujeitos aos mais
diversos tipos de agressões, como atropelamentos, quedas de grandes alturas, chutes, coices e
ferimentos por armas de fogo. Na maioria das vezes, esses traumatismos vêm acompanhados
de fraturas.
Além disso, a melhora da qualidade de vida dos animais domésticos acarreta em um
aumento da idade média, trazendo uma maior incidência de doenças sistêmicas que atrasam a
cicatrização dos tecidos, incluindo o tecido ósseo. Por isso, novas alternativas têm sido
estudadas para diminuir o tempo de cicatrização dos tecidos e para aumentar a qualidade
dessa cicatrização.
Nos últimos anos, uma nova área da medicina vem sendo desenvolvida, que abre
perspectivas inovadoras para o tratamento de doenças crônico-degenerativas. É a chamada
medicina regenerativa que consiste na utilização de células, fatores de proliferação e
diferenciação celulares e biomateriais que permitem ao próprio organismo reparar tecidos e
órgãos lesados. Alguns dos alvos terapêuticos são órgãos considerados por muito tempo como
incapazes de desenvolver quaisquer processos de regeneração, como o cérebro e o coração.
O princípio da terapia celular consiste em restaurar a função de um órgão ou tecido com a
substituição das células perdidas por uma doença ou substituir células que não funcionam
adequadamente devido a um defeito genético, vascular ou iatrogênico.
As células tronco mesenquimais (CTMs) estão sendo estudadas amplamente, para tentar
melhorar o tempo e a qualidade cicatricial de diversos tecidos, tanto em animais, quanto em
humanos. As células-tronco da medula óssea são pluripotentes, ou seja, têm capacidade de se
diferenciar em diversos tipos de tecido, dependendo do ambiente no qual se encontram. Este
tipo celular tem sido bastante estudado, com pesquisas sendo desenvolvidas nas áreas de
cardiologia, oftalmologia, ortopedia, neurologia, entre outras, e obtendo resultados positivos.
Em vista disso, pretende-se nesta pesquisa:
- Verificar a atuação das CTMs no mecanismo cicatricial de falhas experimentais em osso
tibial de cães e eventuais complicações do procedimento.
Mais especificamente, objetiva-se:
- Avaliar a atuação das CTMs suplementadas ou não com rhBMP-2, no tempo de
cicatrização de defeito de tíbia de cães;
16
- Verificar a eficiência de nanocristais Q-tracker na marcação e confirmação de CTMs
uma semana após serem implantadas nos defeitos ósseos e o tipo celular encontrado entre as
células marcadas;
- Comparar a osteogênese entre os grupos controle, suplementados com CTMs e dos que
receberam CTMs com rhBMP-2 através de ensaios radiográficos.
17
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.1.1 Osso e cicatrização óssea:
O osso é o elemento estrutural primário do corpo. Ele serve para proteger órgãos
internos vitais e dar suporte aos músculos que permitem o movimento do esqueleto (LIRANI,
2004). Pode ser considerado tecido ou órgão. Como tecido, caracteriza-se por um tipo
especializado de conjuntivo, cuja principal característica é a rigidez, devido ao elevado
conteúdo de minerais. Como órgão é uma estrutura composta por vasos, cartilagem, tecido
conjuntivo fibroso, tecido adiposo e tecido hematopoético (WASSERMAN et al., 1993).
O osso é um dos tecidos mais rígidos e resistentes do corpo, contudo, é
freqüentemente lesionado, ocorrendo fraturas completas ou incompletas (DOUAT, 2004).
Fratura do sistema esquelético constitui lesão consumada do osso, consistindo de todos os
aspectos de lesão física e circulatória do conteúdo celular viável e da integridade estrutural
óssea (LIRANI, 2004).
A cicatrização óssea corresponde ao processo biológico que ocorre após uma
destruição cartilaginosa e óssea, que restaura a continuidade tecidual necessária para a função
(FOSSUM, 2005). É processo fisiológico complexo. Para que ocorra a consolidação ótima,
haverá necessidade de boa irrigação sanguínea, redução adequada dos fragmentos da fratura,
estabilização e fixação apropriadas da fratura e animal sadio. O comprometimento de
qualquer destes fatores poderá resultar em consolidação retardada da fratura e, potencialmente
numa não-união (MILLIS; PROBST, 1996). Segundo Piermattei; Flo (1999) o tempo
necessário para união clínica em caso de fraturas típicas, não complicadas, é em torno de sete
semanas em animais adultos, mas há variações dependendo do método de fixação utilizado.
O mecanismo de formação embriológica do osso requer uma orquestração de fatores
celular, humoral e mecânicos, resultando na formação do esqueleto ósseo e fatores mecânicos
resultam na formação de tecidos esqueletais ósseos capazes de crescimento controlado,
resposta estrutural ao estresse, e reparo da ferida, unicamente sem cicatriz. O reparo ósseo se
compara à formação embriológica, pois envolve a integração celular, humoral e mecânica. A
base do osso em formação e em reparo são as células-tronco mesenquimais, as quais
respondem e produzem citocinas regenerativas, replicam e se diferenciam, formam a matriz
estrutural e respondem à demanda mecânica para restaurar as funções do esqueleto (KRAUS;
KIRKER-HEAD, 2006).
18
A cicatrização óssea é influenciada pelos fatores de crescimento ósseo, peptídeo ou
glicoproteínas, que organizam e coordenam a mitose celular, quimiotaxia, diferenciação e
crescimento das células produtoras de matriz óssea. (HERNDON et al., 1992).
Os fatores de crescimento são secretados pelos osteoblastos e estão presentes em
quantidades muito pequenas. Os três principais componentes ósseos são o mineral, a matriz
orgânica e células osteogênicas: mineral, sendo responsável por dois terços do volume ósseo e
composto por cristais de fosfato de cálcio depositado como hidroxiapatita; matriz orgânica,
correspondendo a um terço da massa óssea e composta por colágeno, proteínas não colágenas
e água. Incluídas dentro das proteínas não colágenas estão as proteínas ósseas morfogenéticas,
as quais são responsáveis pela morfogênese óssea e regulação da atividade celular osteogênica
(MASTROCINQUE. et al., 2004).
Modelamento e remodelamento ósseo podem ser incitados por microlesões, estímulos
mecânicos, estímulos combinados ou por mecanismos desconhecidos. No entanto, em alguns
casos clínicos, regeneração óssea ou aumento de massa óssea não ocorre da forma esperada, o
que torna necessário o implemento de métodos coadjuvantes para a obtenção dos resultados
esperados (CARVALHO et al., 2004).
Apesar dos crescentes avanços em algumas áreas sobre os procedimentos nas fraturas, o
ortopedista pouco pode fazer para aumentar a velocidade de consolidação da mesma. Assim,
terapias alternativas, que possam auxiliar na recuperação de fraturas são muito importantes,
pois podem minimizar o tempo de tratamento e os custos, garantindo o retorno mais rápido às
atividades normais (DOUAT, 2004).
2.1.2 Proteína óssea morfogenética
As pesquisas biomoleculares sobre o desenvolvimento e a reparação óssea permitiram a
descoberta de uma nova família de proteínas reguladoras da formação óssea e cartilaginosa in
vivo. Capazes de iniciar a neoformação óssea quando implantadas em sítios extra-ósseos,
estas proteínas são denominadas de proteínas ósseas morfogenéticas ou BMPs. A purificação
e a caracterização das BMPs contribuíram para a fundamentação do conhecimento molecular
e celular do processo de reparo ósseo. A resposta tecidual ao implante de BMPs ocorre de
modo similar ao desenvolvimento ósseo embriológico, possibilitando a formação e o
desenvolvimento da reparação na osteogênese pós-natal (GONÇALVES et al., 1998).
A história da identificação e purificação da BMP iniciou-se em 1965, quando Urist
induziu a neoformação óssea em sítios ectópicos (tecido subcutâneo e intramuscular),
implantados com fragmentos de osso desmineralizado, no período de duas semanas. Embora
19
não fosse possível determinar se o componente ativo no extrato ósseo era composto por uma
ou mais moléculas, este foi identificado como sendo de origem protéica e denominado por
Urist (1965) de proteína morfogenética óssea (GONÇALVES et al., 1998.).
BMPs de 2 a 9 (BMP-2 a BMP-9) constituem membros da família de fator de crescimento
transformador beta (TGF- β) (SANTOS et al., 2005), e estão envolvidas em uma grande
variedade de processos biológicos, incluindo diferenciação osteoblástica e cicatrização óssea
(SINGHATANADGIT et al., 2006). São consideradas osteoindutores, ou seja, têm a
capacidade de induzir formação óssea quando colocados em um local onde nenhuma
formação óssea iria ocorrer (KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006).
As BMPs 2, 4, 5, 6 e 7 possuem importância fundamental na regulação da formação de
tecido esquelético e reparação, sendo que estas proteínas têm diferentes potenciais
osteoindutores. As proteínas morfogenéticas ósseas 4 ou 5, por exemplo, precisam estar
presentes em grandes quantidades para induzir a mesma quantidade de tecido ósseo que seria
induzido pela BMP 2 (WOZNEY; ROSEN, 1998).
Em termos de fator de crescimento osteoindutivo, a maior parte se focou no uso da
BMP-2, uma proteína de matriz óssea que estimula a quimiotaxia e a ploriferação da célula
mesequimal, e promove a diferenciação dessas células em condrócitos e osteoblastos (CHU et
al., 2007).
Ferrigno et al. (2007) relataram o uso de BMP em cães com fraturas distais de rádio e
ulna. Neste trabalho foram utilizados 33 cães com peso abaixo de 6kg, sendo 17 animais
alocados no grupo controle (osteossíntese com placa e parafuso) e 16 no grupo tratado
(osteossíntese com placa e parafuso com adição de BMP). Esses autores compararam o tempo
de cicatrização entre os grupos e observaram que o grupo tratado com BMP teve uma redução
significativa no tempo da mesma. Em relação ao tempo de união óssea, o grupo controle
apresentou 12% de animais cujo tempo de união óssea foi de 90 dias, 47% de união óssea aos
120 dias, 6% em 180 dias, 6% em 210 dias e 29% dos animais não apresentaram união óssea
até o final do experimento. No grupo BMP os resultados quanto ao tempo de união óssea
foram: 81% dos animais apresentaram consolidação óssea com 30 dias de pós-operatório e em
6% dos animais o tempo de união óssea encontrado foi de 60 dias e 13% não apresentaram
união óssea.
2.1.3 Células-tronco:
Sabe-se que vários tipos celulares estão em investigação em experimentos animais, porém,
o maior potencial terapêutico está nas células tronco. A CT é um tipo especial de célula, que
20
possui as seguintes características: capacidade de proliferação indefinida, auto-renovação,
produção de diferentes linhagens celulares e regeneração de tecidos. Estão presentes
principalmente em embriões (CT embrionárias), no cordão umbilical
e na medula óssea, que
são chamadas de CT adultas (SILVEIRA et al., 2006).
Segundo Mota et al., (2005), por não envolver as mesmas questões filosóficas, éticas e
religiosas observadas com a utilização de células-tronco embrionárias, a utilização de células
de medula óssea de indivíduos adultos abriu um novo horizonte na medicina reparadora, ou
regenerativa, onde não há possibilidade de rejeição imunológica (já que as células são
autólogas) nem a necessidade de estoque de células em bancos de tecidos (já que o estoque
aparentemente é inesgotável).
As células da medula óssea são pluripotentes e com capacidade de se diferenciarem
dependendo do meio no qual se encontram. As células da medula óssea podem sofrer dois
processos de diferenciação: as células mononucleares (indiferenciadas) e as multinucleares.
Dentre as células mononucleares, existe a hematopoiética, que originará células do sangue
(linfócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, células vermelhas e plaquetas) e a
mesenquimal, que poderá originar células musculares, hepatócitos, osteócito, tecido adiposo,
condrócitos e estroma (SOUZA et al., 2005).
A vantagem mais óbvia no uso de células-tronco não expandidas é a simplicidade do
procedimento em que células extraídas da medula óssea podem ser imediatamente
introduzidas no sítio do defeito ósseo. Este procedimento é o mais usado, não somente porque
é barato e não requer a instrumentação extra, mas também porque pode ser considerado como
um procedimento invasivo mínimo e não requer que o paciente seja imunossuprimido
(LUCARELLI et al., 2004).
A terapia celular e gênica tem-se mostrado muito promissora como opção de tratamento.
Reside aqui, provavelmente, a maior perspectiva de uso clínico desta moderna tecnologia,
surgindo como alternativa de solução para o paciente de enfermidade sem solução.
Obviamente, ainda está em fase inicial de investigação e pesquisa, e os resultados obtidos no
mundo ainda são preliminares (LEITE; DOHMANN, 2004).
Em diversos estudos, a proporção de CT transplantadas, que foram incorporadas pelo
tecido lesado e que se diferenciaram, não explica a melhora funcional observada. Assim, uma
explicação relevante para a regeneração tecidual após aplicação de CT é a liberação de
citocinas e fatores tróficos no local da lesão. Como a maioria das CT é capaz de identificar e
migrar até o local lesionado, é clara sua capacidade de responder a fatores quimiotáticos
21
(liberados pelo tecido lesionado). Há ainda evidências de que estas células, por sua vez,
podem ser capazes de liberar outras moléculas em resposta aos estímulos quimiotáticos
recebidos. Há várias hipóteses quanto às supostas funções de tais fatores na lesão, dentre elas:
liberação de moléculas que previnem a morte celular, recrutamento de CT adjacentes do
próprio tecido (com subseqüente diferenciação), interferência na inflamação provocada pelo
dano tecidual (modulando a resposta do sistema imune), suporte de moléculas ou enzimas que
suprem defeitos metabólicos (SCHWINDT et al., 2005).
Supõe-se que as CTA permaneçam quiescentes (sem se dividirem) nos tecidos que
constituem seu habitat, até que sejam ativadas por doenças, inclusive tumores ou traumatismo,
e também para fazer a reposição de células “gastas” no organismo ao longo da vida, através
da liberação, no sangue circulante, de células progenitoras (CP), que seriam mobilizadas para
os locais onde se fizessem necessárias. Essa mobilização seria feita por substâncias liberadas
no local da lesão (ASAHSRA et al., 1999).
Kitoh et al. (2004), utilizaram CTMs, expandidas em cultura, associadas à plasma rico em
plaquetas e fixador externo, para alongamento ósseo em humanos, e obtiveram uma
diminuição no tempo de osteogênese, diminuindo com isso as complicações decorrentes do
prolongado tempo de manutenção de implantes no osso.
Modelos experimentais de defeitos ósseos tratados com CTMs têm demonstrado que
ambientes biológicos e mecânicos favoráveis resultam em proliferação e diferenciação de
CTM em osteoblastos e condrócitos, e que a presença de células-tronco em defeitos ósseos
experimentais diminui o tempo de cicatrização do defeito (KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006)
Foram desenvolvidos modelos animais para testar o reparo ósseo através da engenharia de
tecidos. Os estudos diferem com relação aos animais (ovelhas, cães, cabras), osso tratado
(fêmur, tíbia, mandíbula) e quanto á estrutura e química dos carreadores (ZHU et al., 2006).
Kon et al. (2000) Avaliaram o potencial de reparo de CTMs em defeitos ósseos in vivo em
ovelhas. Eles criaram um defeito crítico na tíbia de ovelhas e reconstruíram o segmento
perdido com a implantação de um adequado andaime poroso projetado (100% hidroxiapatita).
A cerâmina foi semeada com CTM ou utilizada vazia. Os animais foram sacrificados dois
meses após a cirurgia. Embora formação óssea tenha sido histologicamente verificada nos
dois grupos, nos cilindros semeados, a formação óssea ocorreu dentro dos microporos da
cerâmica, enquanto nos não semeados, a formação se restringiu ao espaço externo ao cilindro.
Kraus; Kirker-Head (2006) utilizaram cães como modelo animal para avaliar a
cicatrização de defeitos segmentários em fêmur; estes autores criaram um defeito com 21mm
e fixaram o mesmo com placas de alongamento, com intuito de criar uma não-união atrófica.
22
Após 16 dias da criação do defeito, CTMs foram então colhidas desses cães, isoladas e
cultivadas. Após cultura, estas células eram colocadas em cilindros de hidroxipatita e
implantadas no fêmur dos cães dos quais elas haviam sido colhidas. A adição de CTMs
resultou em estímulo para neoformação óssea em áreas adjacentes ao implante, sugerindo que
estas estavam se infiltrando no osso hospedeiro, ou estimulando o mesmo a formar novo osso.
Células-tronco são identificadas principalmente através de marcadores de superfície
(KIRSCHSTEIN, 2001). Ferramentas novas de diagnóstico celular incluem pontos quânticos
(QDs) que são nanocristais semicondutores caracterizados por alta fotoestabilidade e
excitação de um único comprimento de onda (HASSAN et al., 2006).
Fundamentalmente nanocristais são substâncias fluoróforas que absorvem fótons de luz e
reemitem com um comprimento de onda diferente. Essas partículas provêem luminosidade e
fluorescência fotoestável que podem ser observadas por horas e tecidos marcados com
nanocristais podem ser arquivados permanentemente. Os nanocristais são capazes de marcar
quase todos os tipos de material de interesse (INVITROGEN, 2007). Segundo Garon et al.
(2007) nanocristais fluorescentes podem ser localizados por pelo menos quatro gerações
celulares, e algumas células permanecem marcadas por até duas semanas.
2.1.4 Carreadores (Scaffold)
A presença de um material de suporte é indispensável quando se necessita reconstituir um
tecido ósseo adulto. Macroscopicamente ele vai permitir a manutenção de volume ósseo
perdido e prevenir a invaginação de massa muscular circunvizinha no defeito ósseo. Do ponto
de vista tecidual, este material vai fazer o papel de vigamento, no qual novo tecido será
formado. Em nível celular obtém-se uma superfície na qual as células-tronco poderão se
aderir, proliferar e diferenciar (POTIER; PETITE, 2005).
Engenharia de tecido para o osso envolve tipicamente células osteogênicas e/ou fator de
crescimento osteoindutivo com scaffolds osteocondutivos. Em termos de fator de crescimento,
a maior parte se focou no uso de proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) e, em particular,
BMP-2. BMP-2 é uma proteína de matriz óssea que estimula a quimiotaxia e a ploriferação da
célula mesequimal, e promove a diferenciação dessas células em condrócitos e osteoblastos
(
CHU et al., 2007)
.
Segundo Potier; Petite (2005) As especificações destes materiais de apoio ideais, para
formação de tecido ósseo, são contraditórias. Porém, geralmente considera-se que este
material deva ser: biocompatível, pois uma reação inflamatória intensa poderia resultar na
modificação do potencial osteogênico, ou mesmo na destruição celular; osteocondutor, para
23
permitir a deposição de tecido ósseo em contato direto com o material, sem interposição
fibrosa; resistente, para sustentar cargas de apoio; reabsorvível, para permitir sua substituição
progressiva por tecido ósseo neoformado; porosos, com porosidade interconectada
compreendida entre 100 e 500 micrômetros, para dar espaço para as células e vasos
sanguíneos; radiotransparente, para permitir ao cirurgião o acompanhamento do crescimento
ósseo ao longo do tempo; maleável, para ser moldado e adaptado ao defeito no qual ele se faz
necessário.
Atualmente muitos materiais têm sido testados em terapia celular, porém nenhum deles
demonstrou possuir todas as características almejadas para esta função.
Segundo a bula do fabricante da esponja de colágeno Gelfoam®, este material é uma
esponja cirúrgica, dobrável e esterilizada, que quando implantada em tecidos é completamente
absorvida dentro de quatro a seis semanas, sem acarretar formação excessiva de tecido
cicatricial ou reação celular. Além disso, é uma matriz dobrável, porosa, moldável e cortável.
Este produto é indicado como hemostático em cirurgias ósseas, pois não interfere no processo
cicatricial.
2.2 Metodologia
2.2.1 Comitê de ética em pesquisas com animais
Este estudo foi submetido à aprovação do Comitê em Ética em Pesquisa com animais
da Universidade Federal de Santa Maria, sob o n
o
23081.017095/2006-47 e seguiu os
princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). Somou-se a
preocupação de bem estar dos animais de acordo com a Lei n
o
. 5.517 de 23 de outubro de
1968, artigo 5
o
; Lei n
o
. 6.638 de 08 de maio de 1979; à resolução n
o
. 592 de 26 de junho de
1992 e Projeto de Lei n
o
. 9.605/1998 e n
o
. 1. 691/2003.
O Comitê de Ética em Experimentação em Pesquisas com Animais da Universidade
Federal de Santa Maria - UFSM segue as propostas legais do COBEA, que é uma Sociedade
Civil, de caráter científico-cultural, sem fins lucrativos, de duração indeterminada, com sede e
foro na cidade de São Paulo, constituída por pesquisadores e técnicos interessados em
experimentação animal.
2.2.2 Animais
Foram utilizados 18 cães adultos, hígidos, machos ou fêmeas, com peso em torno de
8,5kg (5 a 12kg), obtidos no Biotério Central da UFSM. Os animais passaram por um período
24
de adaptação de 20 dias durante os quais receberam tratamento anti-helmíntico à base de
prazinquantel e pamoato de pirantel. Foi realizada uma avaliação clínica e laboratorial
(urinálise, hemograma e perfil bioquímico) em todos os animais.
Durante todo o experimento, os animais foram mantidos em boxes individuais
medindo 70cm de largura, 100cm de profundidade e 80cm de altura (Figura 1), recebendo
ração Pedigree High Performance e água ad libitum.
Para a realização do procedimento cirúrgico os animais receberam banho 24 horas
antes da intervenção e jejum alimentar de 12h e hídrico de 2h. Os animais eram pesados e
realizou-se tricotomia ampla nos membros posteriores e na região pélvica.
2.2.3 Separação dos animais
Todos os cães foram submetidos a colheita de sangue da medula óssea e intervenção
cirúrgica criando-se um defeito de forma elíptica medindo 1,5x1,0cm na tíbia proximal que
recebeu esponja de colágeno
1
. Eles foram separados em três grupos:
1
Gelfoam, Pharmacia brasil ltda, São paulo, SP.
Figura 1 - Condições de alojamento dos animais em boxes
individuais de aço inoxidável no Biotério de
Experimentação Animal da Universidade Federal
de Santa Maria
.
25
grupo 1 (G1) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de
colágeno e solução fisiológica;
grupo 2 (G2) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de
colágeno e medula óssea (MO) processada;
grupo 3 (G3) com 6 animais nos quais o defeito tibial foi preenchido com esponja de
colágeno, MO processada e rhBMP-2.
2.2.4 Colheita de material para transfusão autóloga
Três dias antes do procedimento cirúrgico foi colhida, em bolsa de transfusão
2
, uma
quantidade de 10ml kg
-1
de sangue autólogo, da veia jugular de cada cão, com o intuito de
transfundir o mesmo durante a colheita de medula óssea. Este foi então armazenado sob uma
temperatura ao redor de 4°C.
2.2.5 Pré-operatório e protocolo anestésico
Imediatamente antes da aplicação da medicação pré-anestésica (MPA), foi colhida
uma alíquota de 3mlL de sangue da veia jugular de todos os cães para exame hematológico.
A medicação pré-anestésica (MPA) foi realizada com maleato de acepromazina, na
dose de 0,05mg kg
-1
, e cloridrato de fentanila na dose 0,002mg kg
-1
, por via intramuscular.
Além disto, realizou-se uma anestesia local epidural, em que se associou lidocaína 2%
(0,125mL kg
-1
), bupivacaína (mesma dose) e morfina (0,1mg kg
-1
).
Os animais eram então encaminhados para o centro cirúrgico do Laboratório de
Cirurgia Experimental (LACE) da Universidade Federal de Santa Maria, onde dentro da sala
cirúrgica foi feita a indução anestésica com propofol na dose de 6mg kg
-1
, intubação
orotraqueal e manutenção anestésica com Halotano.
A fluidoterapia intravenosa foi realizada com solução de Ringer com lactato, durante
todo o procedimento. Como antibioticoprofilaxia, administrou-se cefalotina, na dose de 30mg
kg
-1
, por
via intravenosa, 10 minutos antes do procedimento cirúrgico.
2.2.6 Colheita das Células
Após anti-sepsia ampla e colocação de panos de campo (Figura 2A), os animais
anestesiados foram colocados em decúbito lateral direito e submetidos à colheita de sangue da
2
JP Indústria Farmacêutica S.A
26
MO. As amostras foram obtidas por punção rotacional e aspiração com o auxílio de agulha do
tipo Steis
3
(Figura 2B). Os locais de punção foram a crista ilíaca e a fossa trocantérica
femoral. A colheita foi realizada com seringas de 20mL previamente heparinizadas com
liquemine
4
.
Para penetrar no espaço medular dos ossos foi aplicada uma pressão manual, moderada
à agulha, girado-a e alternando os movimentos para direita e esquerda. Por meio de uma
pressão negativa na seringa foi colhida a MO dos ossos (Figura 3 A e B), na quantidade total
necessária de 10ml kg
-1
.
À medida que a medula estava sendo colhida foi transferida para a bolsa de colheita de
MO, Kit Bone Marrow (Figura 4A), contendo 0,1ml de heparina para cada 100ml MO e 10ml
de solução salina 0,9% para cada 100ml de MO. O total de sangue intramedular colhido foi
filtrado pelo Kit Bone Marrow pré-filtro de 500µ e filtro de 200µ em linha, para filtragem das
espículas ósseas que foi acoplado na bolsa (Figura 4B). O total de amostra foi transferido para
uma bolsa de transporte de MO acoplada no mesmo Kit.
3
Agullha Steis - Tucumedy – Marthan- Med Tec –Popper – PBN- M.D. Tech- Porto Alegra- RS.
4
Liquemine, Roche, Rio de Janeiro, RJ
Figura 2 - A. Animal posicionado em decúbito lateral, com panos de campo já
posicionados, para ser submetido à colheita de medula óssea. B.
Posicionamento da agulha de Steis na fossa trocantérica do fêmur
para coleta de medula.
27
No momento da colheita, uma alíquota de 3mL de MO foi obtida da bolsa de infusão
(Figura 5) e usada para contagem manual da porcentagem de células nucleadas e teste de
viabilidade celular com Azul de Trypan
5
em lâmina de microscopia, sendo considerada
aceitável uma viabilidade acima de 70%. Uma outra fração de 0,5ml foi usada para
5
Trypna blue - Comercial Química Americana Ltda – Paulínia- SP.
Figura 3 - Colheita de medula óssea no acesso pela fossa trocantérica (A) e pela
asa do íleo (B) através de pressão negativa em seringa previamente
heparinizada em um cão.
Figura 4 – Apresentação da medula óssea sendo colhida para a bolsa
coletora (A) e filtragem da mesma através de filtros de 200µ
contidos no kit bone marrow (B).
28
confeccionar esfregaços em lâminas microscópicas para mielograma (osteomielograma) e
análise morfológica das células progenitoras da MO.
Após a colheita da metade do volume previsto de medula óssea, em cada paciente, foi
realizada a colheita de sangue periférico da veia jugular para exame hematológico e a
transfusão do sangue autólogo, colhido três dias antes do procedimento cirúrgico. Ao término
da transfusão sanguínea, era novamente colhida uma alíquota de sangue periférico para exame
hematológico.
2.2.7 Processamento do sangue da medula óssea para obtenção de CTMs
A MO colhida (10mL kg
-1
) foi centrifugada a 1800 rotações por minuto (força
centrípeta de 1,63 X g = 1,63 x 9,80665m s
-2
ou 980cm s
-2
= 16g) em tubos Falcon de 50ml
(Figura 6A) e isolada em gradiente de densidade Histopaque®
6
1.077 (Figura 6B), de acordo
com a técnica de Boyum (BOYUM, 1968).
A nuvem de células mononucleares (Figura 7A) foi colhida por pipeta automática,
colocada em tubo Falcon de 50ml para ser lavada em solução salina 0,9% e DMEM com
glicose a 2%, estéril através de centrifugação com o intuito de remover os agregados
celulares. Após a primeira lavagem as células mononucleares depositadas no fundo do tubo
6
Histopaque- Sigma – São Paulo, SP
Figura 5 - Colheita de uma alíquota de 3mL de medula
óssea da bolsa de infusão, usada para contagem
da porcentagem de células nucleadas e teste de
viabilidade celular.
29
foram colhidas e passadas por uma segunda lavagem, obtendo como produto final o botão
celular padronizado em 500µl (Figura 7B). Uma pequena fração (20µl) de FTCM suspensa foi
colhida com pipeta automática para contagem da porcentagem (quantificação) de células
mononucleares em câmara de Neubauer e teste de viabilidade celular com azul de Trypan 1%,
sendo considerada aceitável uma viabilidade acima de 70%.
Também uma fração (10µl) de FTCM do botão celular foi resgatada para esfregaço e
posterior quantificação de células mononucleares ideais para serem injetadas. O restante do
botão (470µL) com FTCM foi diluído em 3mL de solução salina para transplante. As células
a serem transplantadas (botão celular) foram marcadas através de nanocristais fluorescentes
(Figura 8A). Sete dias depois, foi feita biopsia na área de implantação e exame através de
microscopia com luz fluorescente para verificar a presença das células transplantadas. Uma
alíquota do botão celular marcado foi enviada ao Laboratório de Virologia para observação
das células marcadas através de microscópio fluorescente (Figura 8B).
No grupo G3, após formar o botão celular, uma alíquota de 50ng.mL
-1
de rhBMP-2 foi
incubada junto com o marcador.
Figura 6 – (A) Colocação de Histopaque (B) em tubos falcon de 50ml,
para posterior adição de sangue de medula óssea.
30
Figura 8 - A. Nanocristais Q-tracker. B. Células mononucleares marcadas com
nanocristais Q-tracker, vista através de microscopia fluorescente
(ampliação da objetiva: 40X).
Figura 7 – A. nuvem de células mononucleares (seta), isolada em gradiente de
densidade, após centrifugação do sangue de medula óssea. B. Botão
celular, contendo células mononucleares, obtido por centrifugação para
marcação com nanocristais Q-tracker.
31
2.2.8 Procedimento cirúrgico
Cada animal já anestesiado conforme protocolo (item 2.2.5) após o processamento das
CTMs, no mesmo dia da coleta, foi posicionado em decúbito dorsal, em uma calha na mesa
cirúrgica, submetido anti-sepsia do membro posterior direito e delimitação com panos de
campo para acesso medial proximal. Após a abordagem da tíbia, foi criado um defeito
monocortical de 1,5x1,0cm com auxílio de uma broca de desgaste sobre a região medial
proximal da mesma e sob constante irrigação (Figura 9A, B, C e D).
Figura 9 - A e B. Defeito monocortical sendo confeccionado com
uma broca de desgaste sobre a região medial
proximal da tíbia. C Defeito ósseo monocortical sobre
a região medial da tíbia. D. Aprofundamento do
defeito ósseo monocortical sobre a região proximal da
tíbia.
32
O defeito, uma vez preparado foi preenchido com esponjas de colágeno
7
(Figura 10A e
B) embebidas em soro fisiológico (grupo 1 - Figura 11A e Figura 12 A e B) ou com o botão
celular de células-tronco mononucleares (grupo 2 - Figura 11B) ou células-tronco
mononucleares e rhBMP-2 (grupo 3).
A reparação da abordagem foi feita com síntese da fáscia crural com fio mononáilon n.
3-0 em padrão de sutura contínuo simples, a tela subcutânea com o mesmo fio e sutura em
padrão zigue-zague modificado, e o fechamento de pele com mononáilon 4-0 em pontos
isolados simples.
7
Gelfoam, Pharmacia brasil ltda, São paulo, SP.
Figura 10 - A. Apresentação comercial da esponja de colágeno. B. Esponja de
colágeno medindo 2,5 x 2,0cm, para utilização como carreador
de células-tronco mononucleares.
33
2.2.9 Cuidados Pós-operatórios
No pós-operatório administrou-se meloxican como antiinflamatório, via intramuscular,
na dose de 0,2mg kg
-1
, uma vez ao dia, durante sete dias.
O membro no qual foi realizado o defeito foi mantido com bandagem de Robert-Jones
durante sete dias e cada cão foi mantido em um box. Além disso, foram realizadas duas
caminhadas diárias, e o cão retornava a suas atividades restritas ao box. Após sete dias os
pontos foram removidos.
Figura 11 - A. Esponja de colágeno sendo embebida em solução salina. B.
Esponja de colágeno sendo embebida com o botão celular de
células-tronco mononucleares.
Figura 12 - A. Esponja de gelatina embebida com células-tronco mononucleares.
B. Esponja de colágeno sendo colocada no defeito ósseo tibial de cão.
34
2.2.10 Avaliação radiográfica
Exames radiográficos foram realizados imediatamente após a cirurgia e aos 15, 30 e
45 de pós-cirúrgico. Em cada exame foram realizadas sempre duas incidências ortogonais do
membro operado para uma melhor visualização da evolução do calo ósseo. Foram atribuídas
porcentagens de acordo com o aumento da densidade óssea no local do defeito.
2.2.11 Avaliação das amostras através da fluoroscopia
Na tentativa de identificar as células previamente marcadas, uma semana após a
infusão do botão celular, foi realizada biopsia, em três animais de cada grupo, que consistiu
em raspagem do osso, com lâmina de bisturi numero 10 nas adjacências do defeito (Figura
13), e confecção de lâminas para leitura em microscópio fluorescente e em microscópio
óptico. Para cada animal foram confeccionadas três lâminas para cada avaliação.
2.2.12 Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados pelo teste t (Student) através do programa
Statistical Package for the Social Sciences.
Figura 13 - Raspagem óssea com bisturi, lâmina n.
10, nas adjacências do defeito tibial
para confecção de lâminas de leitura
para identificação de células-tronco
marcadas.
35
2.2.13 Doação de animais
Após o término deste experimento todos os animais foram doados
.
2.3 Resultados
O apoio dos membros pélvicos ocorreu nas primeiras 24 horas de pós-operatório e,
posteriormente, não foi observada qualquer complicação referente à locomoção. As feridas
cirúrgicas cicatrizaram sem complicações.
Três animais pré-experimentais sofreram fratura, um após cinco dias e os outros dois após
sete dias do procedimento cirúrgico, o animal que fraturou com cinco dias de pós-operatório
recebeu fixação externa com pinos transfixados, e foi tratado durante a realização deste
experimento. Os outros dois animais receberam imobilização externa com bandagem de
Robert-Jones e foram encaminhados a outros projetos do mesmo grupo de pesquisa. A fratura
destes animais não interferiu nos resultados deste experimento.
Devido à ocorrência destas fraturas, houve uma mudança no manejo dos cães deste
experimento, na tentativa de prevenir que novos animais sofressem este dano. Ao invés dos
animais serem soltos no solário, após a cirurgia, optou-se pela realização de caminhadas com
guia, para evitar pulos, corridas e quedas. E foi instituído o uso de bandagem de Robert-Jones
em todos os animais.
O tempo de colheita de medula óssea variou de 10 minutos à uma hora e meia, sendo que
em dias mais frios houve maior dificuldade de colheita, devido à viscosidade aumentada do
sangue, muitas vezes ocorrendo coagulação do mesmo apesar do uso da heparina.
A tabela 1 mostra a queda dos níveis de hemoglobina em g.dL
-1
durante o procedimento
de colheita de medula óssea seguida de autotransfusão sanguínea.
36
Tabela 1: Níveis de hemoglobina medidos antes da MPA realizada para colheita de
medula óssea, imediatamente antes do início e após o término da
autotransfusão sanguínea.
Animal
Níveis de
hemoglobina (hb)
em g.dL
-1
antes da
MPA
Níveis de hb (g.dL
-
1
) medidos
imediatamente
antes do início da
transfusão, na
metade da colheita
de medula óssea
Níveis de hb (g.dL
-1
)
medidos após término da
transfusão realizada
durante a colheita de
medula óssea
1
12,0 10,2 10,0
2
10,0 10,1 9,5
3
11,4 9,0 8,9
4
12,3 9,1 9,3
5
13,0 8,8 9,1
6
12,2 10,2 10,2
7
10,4 8,2 8,6
8
10,5 8,6 8,2
9
9,6 9,0 8,6
10
11,2 8,9 9,6
11
12,8 9,5 10,2
12
12,8 9,2 8,9
13
11,2 8,5 8,3
14
14,7 12,4 12,0
15
9,6 7,4 7,8
16
12,7 9,4 10,1
17
14,6 10,6 11,0
18
13,4 9,8 11,2
Na tabela 2 observa-se o número de células por mililitro e viabilidade celular que cada
cão, dos grupos G2 e G3, apresentou após colheita e processamento das mesmas.
37
Tabela 2 - Número de células e viabilidade celular obtida no botão celular dos cães dos
grupos G2 e G3.
Animal Grupo Número de células-
tronco
mononucleares
totais por mililitros
Viabilidade (%)
7 G2 7,5 x10
8
96%*
8 G2 3,2 x10
8
90%
9 G2 1,7x10
8
99%
10 G2 5,2 x10
8
97%
11 G2 5,9 x10
8
95%
12 G2 4,3 x10
8
98%
13 G3 4,1 x10
8
90%
14 G3 2,2 x10
8
94%
15 G3 6,7 x10
8
99%
16 G3 5,7 x10
8
96%*
17 G3 6,7 x10
8
92%
18 G3 5,2x10
8
97%
*presença de aglomerados de células mortas
Na tabela 3 observa-se a marcação celular através de nanocristais e o resultado da biopsia
óssea para identificação de células marcadas dos animais dos G2 e G3.
38
Tabela 3 - Resultados da avaliação por imunofluorescência e da biopsia óssea para
identificação das células marcadas com nanocristais Q-tracker
Amostra Animal
Botão de células Fragmentos de osso
7 ++ ++
8 -
*
N
9 - N
10 + ++
11 + +
12 ++ N
13 +++
**
N
14 + N
15 ++ -
16 + -
17 + +
18 ++ N
* -: não foram encontradas células fluorescentes.
** +: poucas células positivas (raras células positivas, inferior a 5% do total); ++ número
médio de células positivas para IFA (aprox. 10-20%); +++: grande número de células
fluorescentes (aprox. 30-50%).
***N: não foi realizada biopsia óssea com uma semana para identificação de células marcadas
com nanocristais Q-tracker.
As amostras analisadas para identificação de células-tronco através de nanocristais Q-
tracker do grupo controle não apresentaram fluorescência quando examinadas através do
microscópio fluorescente, já no G2, das nove lâminas confeccionadas, todas apresentaram
fluorescência e no G3, das nove lâminas lidas, três apresentaram-se positivas (Figura 14). Já
no microscópio óptico as principais células identificadas foram osteoblastos, osteoclastos,
osteócitos e hemácias (Figura 15).
39
Em relação à avaliação radiológica a tabela 4 demonstra a taxa de crescimento ósseo
comparado ao exame radiográfico pós-operatório imediato, em cada grupo distinto (Figura 16,
Figura 17, Figura 18).
Figura 14 - Tecido ósseo colhido através de
biopsia, positivo (verdes) à
leitura de microscópio
fluorescente. (ampliação da
objetiva: 40X).
Figura 15 -
Tecido ósseo colhido através de biopsia à leitura do
microscópio óptico A. Osteoclastos. B. Osteócito.
(ampliação da objetiva 100x)
40
Tabela 4 - Taxa de crescimento ósseo, observada através de radiografias. Comparação
de cada tempo com o exame radiográfico pós-operatório imediato.
Animal Grupo 15 dias 30 dias 45 dias
1 G1 10% 40% 60%
2 G1 60% 90% 100%
3 G1 10% 60% 80%
4 G1 20% 60% 80%
5 G1 10% 40% 70%
6 G1 10% 60% 80%
7 G2 30% 90% 100%
8 G2 30% 60% 90%
9 G2 20% 60% 90%
10 G2 40% 90% 100%*
11 G2 30% 80% 97%
12 G2 20% 80% 97%
13 G3 50% 85% 97%
14 G3 10% 60% 80%
15 G3 80% 100%* 100%
16 G3 60% 85% 100%
17 G3 70% 80% 100%
18 G3 40% 80% 90%
* calo ósseo proeminente
O crescimento ósseo nos grupos suplementados com rhBMP-2 na dose de 50ng ml
-1
mostrou evolução mais rápida aos 15 e aos 30 dias e 50% dos cães já apresentavam
cicatrização completa do defeito aos 45 dias.
41
Figura 16 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes
tempos avaliados em um cão do grupo 1. A - pós-operatório imediato; B
- 15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 5)
Figura 17 - Radiografia mostrando o aumento da densidade óssea nos diferentes
tempos avaliados em um cão do grupo 2. A - pós-operatório imediato; B -
15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 10)
42
A análise estatística foi realizada comparando-se a média de crescimento ósseo nos grupos
aos 15, 30 e 45 dias (Tabela 5), utilizando-se um nível de significância (P) de 0,95, no qual t
deveria ser maior que 1,812 para ser significativo estatisticamente. Aos quinze dias, o
resultado foi significativo entre os grupos G1 e G3 e G2 e G3. Aos 30 e aos 45 dias
observou-se um grau de significância entre os grupos G1 e G2 e G1 e G3, não havendo
diferença significativa quando se comparou G2 e G3.
TABELA 5 - resultados do teste t de student na comparação entre o crescimento
ósseo entre os grupos aos 15, 30 e 45 dias.
Grupos 15 dias 30 dias 45 dias
G1 e G2 0,955 1,963 3,019
G1 e G3 2,433 2,548 2,545
G2 e G3 2,203 0,652 0,307
2.4 Discussão
O modelo experimental utilizado demonstrou ser satisfatório para avaliar a cicatrização
óssea sob influência de adjuvantes, uma vez que a ausência de fixadores e materiais metálicos
não influenciaram sobre a mesma. Segundo Prado et al. (2006) o reparo de defeitos
preparados sem necessidade de osteossíntese é um bom modelo para o estudo da regeneração
do osso e possui grande semelhança com o reparo primário ou direto de fraturas. Ao contrário
Figura 18 - Radiografia mostrando ao aumento da densidade óssea nos diferentes
tempos avaliados em um cão do grupo 3. A - pós-operatório imediato;
B - 15 dias, C - 30 dias e D - 45 dias de pós-operatório. (Animal 17)
43
destas últimas, os defeitos são menos sujeitos a fatores mecânicos e a obstruções do aporte
sangüíneo. Este modelo tem sido utilizado em muitos experimentos clássicos que analisam a
influência de medidas cirúrgicas e farmacológicas para melhorar a regeneração óssea.
Defeitos tibiais monocorticais estão bem fundamentados na literatura, (ARISAWA et al.,
2000; BORGES et al., 2000; PRADO et al., 2006) e apesar da ocorrência de fratura em alguns
animais deste presente experimento, acredita-se que este fato se deveu ao manejo destes
animais, uma vez que o passeio livre pelo solário foi substituído por passeio com coleira, o
que impediu que eles ficassem pulando e preveniu a incidência desse tipo de complicação.
Fatores de crescimento influenciam quimiotaxia, diferenciação, proliferação e atividade
sintética de células ósseas, desta forma regulam fisiologicamente o remodelamento e a
cicatrização da fratura. Numerosos fatores de crescimento, como proteína morfogenética
óssea, fator de crescimento derivado de plaqueta, fator de crescimento transformador beta, e
fator de crescimento tipo insulina têm um efeito estimulante sobre a cicatrização de um
defeito ósseo, induzindo quimiotaxia, proliferação e diferenciação de osteoblastos e seus
precursores (SARKARA et al., 2006). Neste estudo, o fator de crescimento escolhido como
adjuvante na diferenciação das células tronco mononucleares em osteoblastos, foi a proteína
óssea morfogenética, uma vez que esta já é comprovadamente uma substância osteoindutora
segundo publicações de Gonçalves et al. (1998), Kraus; Kirker-Head (2006), Roostaeian et al.
(2006), Singhatanadgit et al. (2006), Chu et al. (2007) e Ferrigno et al. (2007).
A dose utilizada da rhBMP-2 foi escolhida baseando-se no trabalho de Roostaeian et al.
(2006), os quais verificaram que a máxima resposta de atividade de fosfatase alcalina em
células tronco estromais cultivadas em presença de rhBMP-2 foi obtida quando utilizaram
uma dose de 50ng ml
-1
. Uma vez que a fosfatase alcalina é um marcador de diferenciação
osteoblástica. Estes autores, porém, utilizaram esta dose em cultura destas células, o uso desta
mesma dose em células-tronco mononucleares não-expandidas, mostrou-se adequada neste
presente trabalho.
Neste experimento pôde ser observado pela análise radiográfica que os cães do grupo que
recebeu células-tronco e rhBMP-2 apresentaram um melhor percentual de cicatrização em
todos os tempos avaliados, concordando com os resultados de Ferrigno et al. (2007). Ao
contrário de Lima et al. (2004) que utilizaram rhBMP-2 em fraturas diafisárias instáveis do
rádio de coelhos e observaram durante 90 dias, concluindo que em relação ao grupo controle,
pela densitometria óptica radiográfica não há diferença entre os membros tratados ou não com
esse biomaterial, esta diferença ocorre somente pelo exame radiográfico aos 30 dias de pós-
operatório com maior porcentagem de restabelecimento cortical. Porém a espécie e o tipo de
44
defeito utilizados por estes autores eram diferentes dos deste experimento, o que pode ter
interferido nas diferenças obtidas nos resultados.
A coleta de medula óssea segundo Lucarelli et al. (2004) é um procedimento simples, o
que pode ser constatado durante a realização da mesma nos cães deste experimento, pois o
tempo de coleta não passou de uma hora e trinta minutos, e em três animais pode ser
coletados no mesmo turno. Porém, foi observado que quando a mesma é realizada em dias
frios, a dificuldade aumenta, isso provavelmente se deve ao fato de que o frio torna o sangue
mais viscoso. Algumas amostras de medula coagularam, mesmo com a utilização de heparina,
segundos após a colheita em dias extremamente frios.
A quantidade de medula óssea colhida que foi de 10ml kg
-1
por animal foi estabelecida
com base na pesquisa de Pizzo; Poplack (2005), em humanos, que relatam que esta é a
quantidade de medula ideal a ser colhida para que um número adequado de CTM seja
alcançado.
A doação de sangue autólogo pré-operatório, em humanos, tornou-se comum na década de
80 com a preocupação da transmissão de doenças infecto-contagiosas (MCCULLOUGH,
1993). O sangue é coletado dos doadores de MO previamente à doação e é armazenado para
ser devolvido ao doador no trans-operatório, visando diminuir a queda da concentração dos
níveis de hemoglobina (PARKKALI et al., 2005). Na presente pesquisa realizou-se a
transfusão sanguínea autóloga durante o procedimento de coleta de medula óssea, para manter
os níveis de hemoglobina destes animais e observou-se que após a realização da mesma, a
concentração de hemoglobina aumentou em alguns animais e em outros teve uma diminuição
discreta quando comparada aos valores obtidos antes da realização da transfusão, uma vez que
o sangue transfundido contém hemoglobina.
Embora os resultados não demonstrem uma queda brusca da hemoglobina, todos os
animais seriam submetidos a um novo procedimento cirúrgico no período da tarde, desta
forma, qualquer alteração desses valores seria significativa nesses casos.
Kadiyala et al. (1997) afirmam que muitos trabalhos confirmam a superioridade da terapia
com CTM expandidas em cultura em relação à utilização de aspirados de medula óssea. Essa
afirmação não se refere à utilização de medula óssea processada, como foi procedido no atual
experimento, uma vez que o número de células presente no botão celular é que vai determinar
o sucesso da terapia. A vantagem em se utilizar células não expandidas, segundo Lucarelli et
al. (2004) é que este tipo de procedimento além de ter um menor custo, é mais facilmente
realizável, requer menor tempo de espera, menos instrumentação, não requer
imunossupressão, uma vez que o doador é o receptor e sofre mínima invasão.
45
Os resultados demonstraram uma diferença estatística significativa entre G1 e G3 em
todos os tempos estudados e entre G1 e G2 aos 30 e 45 dias. Estes resultados são favoráveis à
utilização de CTM ou de CTM associadas a BMP-2, em relação ao grupo controle. Já entre os
grupos G2 e G3, só aos 15 dias que se observaram diferenças significativas, o que demonstra
que os dois tratamentos trazem bons resultados em defeitos ósseos experimentais de tíbia de
cães.
Das 18 lâminas lidas em microscópio fluorescente, 12 apresentaram fluorescência, já no
microscópio óptico as principais células identificadas foram osteoblastos, osteoclastos,
osteócitos e hemácias. Esses dados levam a supor que as células marcadas se transformaram
em um dos tipos celulares encontrado na lâmina lida no microscópio óptico e que nanocristais
fluorescentes Q-tracker, são marcadores úteis na identificação de células-tronco
mononucleares em tecido ósseo.
O tempo de uma semana definido para obter a amostra para identificação de células
marcadas com nanocristais foi determinado com base no comportamento dos nanocristais que
perdem sua fluorescência ao longo do tempo. Este tempo se mostrou satisfatório, pois as
células ainda estavam fluorescentes e, além disso, foram encontradas células marcadas que
eram da linhagem óssea.
Nem todos os animais que receberam células-tronco marcadas foram submetidos à biopsia
aos sete dias pós-operatório para confecção de laminas, pois havia necessidade de verificar a
cicatrização óssea em alguns animais de cada grupo sem interferência durante este período.
Desta forma, apenas três animais de cada grupo, incluindo o G1, foram submetidos a este
procedimento.
O carreador escolhido foi a esponja de colágeno (gelfoam), apesar de não possuir todas as
características de um scaffold ideal (POTIER; PETITE, 2005), mostrou-se maleável,
biocompativel, poroso, radiotransparente e reabsorvível. Além disso, além de acomodar com
facilidade nos defeitos ósseos, quando colocado no botão celular, este carreador por ser uma
esponja, embebe-se com o mesmo, mantendo-o no local desejado por mais tempo, uma vez
que o tempo de absorção deste material é em torno de 14 dias. Pode-se então considerar, que
este carreador se mostrou apropriado para o objetivo esperado neste trabalho.
46
3 CONCLUSÃO
Por meio deste estudo observou-se que:
- tanto células-tronco-mesenquimais aplicadas isoladamente como em associação com
rhBMP-2 induzem taxa de consolidação mais rápida em defeitos tibiais experimentais de cães,
pela análise radiográfica;
- nanocristais Q-tracker são eficientes como marcadores para identificação de células-
tronco mononucleares adultas quando aplicadas em defeito ósseo no cão;
- baixas temperaturas interferem na incoagulabilidade de medula óssea devido ao
aumento na viscosidade sangüínea;
- a esponja de gelatina comporta-se como um carreador apropriado para inoculação de
células-tronco mesenquimais em defeitos ósseos de cães.
47
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