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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Centro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Estudos para Identificação de Tecidos Alvos das Ureases de
Canavalia ensiformis em Dysdercus peruvianus.
Melissa Postal
Dissertação apresentada como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em Biologia
Celular e Molecular.
Orientadora: Dra. Célia R. Carlini
Porto Alegre, fevereiro de 2008.
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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Proteínas Tóxicas, Departamento
de Biofísica do Centro de Biotecnologia da UFRGS, e na FK Biotecnologia, com suporte
financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq,
Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior – CAPES, Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul – FAPERGS e Financiadora de
Estudos e Projetos – FINEP.
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COMPOSIÇÃO DA BANCA DE MESTRADO
----------------------------------------------------------------------
Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos
(Depto. Bioquímica e Biologia Molecular – UFC)
-----------------------------------------------------------------------
Profa. Dra. Maria Fátima Grossi-de-Sá
(EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia; UCB)
----------------------------------------------------------------------
Prof. Dr. Carlos Termignoni
(PPG em Biologia Celular e Molecular – UFRGS)
-------------------------------------------------------------------------
Dra. Fernanda Stanisçuaski
(Revisor e suplente da banca, Departamento de Biofísica - UFRGS)
4
AGRADECIMENTOS
Tão difícil agradecer tanta pessoas, tantos dias, tantas coisas...
Agradecer pelos dias em que quis fugir, e me seguraram.
Agradecer pelos dias em que quis desistir, e me encorajaram.
Agradecer pelas coisas que esqueci, e me lembraram.
Agradecer pelas coisas que não sabia, e me ensinaram.
Tão difícil...
Agradeço a DEUS por todos os dias, por todas as coisas, por todas as pessoas.
Agradeço à minha família: Jorge e Alzemir, David e Morgana, Itamar e Rita de Cássia e
Vivian e Laura. Obrigada pelo amor incondicional, pela saudade, por estarem sempre ao
meu lado, sempre um abraço, sempre o que foi preciso.
PAI e MÃE, OBRIGADA!
Agradeço aos meus colegas do LAPROTOX: aos que já passaram por aqui e aos que me
acompanham ainda. Obrigada pelo apoio, opiniões, discussões, ensinamentos; mas também
pelas risadas, pelos bons e maus momentos que me ensinaram muito mais do que Ciência,
me fizeram crescer.
5
Agradeço à Fernanda Stanisçuaki, pela ajuda e incentivo, principalmente nos momentos
mais difíceis e também pelas conversas sinceras. Valeu Fê!
OBRIGADA CÉLIA!
Pelas oportunidades que tem me dado desde que cheguei no laboratório. Obrigada por
acreditar que eu podia, mesmo quando eu não acreditei. Obrigada pela mão, além de tudo,
de tudo mesmo, ainda me estendeste a mão.
MUITO OBRIGADA DEUS
POR CADA DIA, POR CADA COISA E POR CADA PESSOA.
QUE ASSIM SEJA!
6
Introdução 11
1. Ureases 11
2. Isoformas de Ureases de Canavalia ensiformis 12
3. Canatoxina 13
4. Atividade Inseticida 14
5. Mecanismo de ação da urease e/ou do peptídeo 16
6. Inseto modelo - Dysdercus peruvianus 17
7. Anticorpos Monoclonais 20
8. Uso de anticorpos monoclonais (mAB) no estudo de mecanismos de ação de
proteínas inseticidas e de ureases
23
Objetivos 27
Metodologia 28
1. Ureases 28
2. Peptídeo Recombinante Jaburetox 2-Ec 29
3. Insetos – D. peruvianus 29
4. Preparação dos Homogeneizados de D. peruvianus 30
5. Eletroforeses 30
6. Anticorpos Policlonais desenvolvidos em coelho 30
7. Histologia e imunolocalização. 31
8. Imunodifusão 31
7
9. Dot Blot 32
10. Western-Blot 33
11. Overlay ou Ligand blot 33
12. Cromatografia de afinidade com urease imobilizada 34
13. ELISA 35
14. Produção dos Anticorpos Monoclonais 35
15. Seleção dos clones 36
Resultados 38
1. Identificação de proteínas presentes nos tecidos do Dysdercus peruvianus que
interagem com as ureases in vitro.
38
2. Produção de Anticorpos Monoclonais anti-Urease de C. ensiformis 45
Discussão 47
Conclusões 51
Referências Bibliográficas 52
Anexo 1 – CURRICULUM VITAE 63
Anexo 2 – Artigo 69
8
LISTA DE ABREVIATURAS
ACF: adjuvante completo de Freund
BCIP: 5-bromo-4-cloro-indoil-fosfato
BSA: albumina do soro bovino
CNTX: canatoxina
GHU: urease de Gossipyum hirsutum
GMPc: guanosina monofosfato cíclico
EDTA: ácido etilenodiamino-tetraacético
ELISA: ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas
HAT: hipoxantina-aminopterina-timidina
HGPRT: hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferase
IMAC: cromatografia de afinidade por metal imobilizado
IgG: imunoglobulina
JBU: urease de Canavalia ensiformis
mAB: anticorpo monoclonais
NaPB: fosfato de sódio
NBT: nitroblue tetrazolium
PEG: polietileno glicol
PVDF: difluoreto de polivinilideno
SDS PAGE: gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
TBS: solução TRIS HCL salina: 10mM TRIS + 137 mM NaCl Ph 7,4
TM: Túbulos de Malpighi
TMB: 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina
9
RESUMO
As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse
bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são
enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato
encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a
partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A
CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à
produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos
insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são
suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua
hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases
de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante
investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos
insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a
imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo
Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando
diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease
com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização.
Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco
caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes
vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da
10
urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras
tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a
urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes
não apresentaram resultados conclusivos.
A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de
C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira
tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C.
ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de
anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22
clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes);
dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de
reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior
especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que
é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C.
ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.
11
INTRODUÇÃO
1. Ureases
As ureases (E.C. 3.5.1.5) são enzimas níquel-dependentes (Dixon et al., 1975;
King et al., 1995) que catalisam a reação de hidrólise da uréia à amônia e carbamato, o qual
se decompõe espontaneamente para formar dióxido de carbono e uma segunda molécula de
amônia (Wang & Tarr, 1955). Esta enzima também age sobre outros substratos, como
hidroxiuréia e dihidroxiuréia (Fishbein, W.N., 1969) e algumas uréias substituídas e ésteres
de ácido carbâmico, como a tiouréia e p-nitrofenilcarbamato (Bennett, J. & Wren,E.A.
1977).
Essas enzimas estão presentes em fungos, bactérias e em plantas. Algumas
bactérias produtoras de urease, como Klebsiella aerogenes, utilizam a uréia como fonte de
nitrogênio (Mulrooney et al., 1989). As ureases de algumas bactérias patogênicas estão
envolvidas em vários processos patológicos, como a formação de cálculos urinários,
incrustação de catéter, pielonefrites, coma hepático, decorrentes de infecções com Proteus
mirabilis, bem como gastrites e alguns casos de câncer gástrico, causados por Helicobacter
pylori. Acredita-se que a hidrólise da uréia e conseqüente formação de amônia protegem os
microorganismos da morte em ambientes ácidos (Mobley et al.,1995).
Embora a ocorrência dessa enzima seja bastante comum em tecidos vegetais,
particularmente em leguminosas (Polacco & Holland, 1993), o seu papel na planta ainda
não está claro. Atribui-se como função fisiológica das ureases um papel na reciclagem de N
a partir de uréia (Sirko & Brodzik, 2000), apesar dessa não ser um metabólito abundante
12
em plantas. Durante a germinação, a uréia endógena é, na sua maioria, produto da
degradação de arginina. A urease catalisa a conversão de uréia à amônia, permitindo sua
assimilação na via de síntese de glutamina (Goldraij & Polacco, 1999).
Polacco & Holland (1993) descreveram a ocorrência de duas isoenzimas de
ureases na soja (Glycine max): uma urease ubíqua que está presente em todos os tecidos da
planta, e uma urease embrião-específica, sintetizada no embrião em desenvolvimento e
acumulada na semente madura. Essa última apresenta, na semente, uma atividade ureásica
1000 vezes maior do que a urease ubíqua (Polacco & Winkler, 1984). Esses estudos
ampliaram a discussão sobre a função de ureases em vegetais. Em plantas mutantes, nas
quais a urease ubíqua está ausente, observa-se necrose nas extremidades das folhas e raízes,
acúmulo da uréia e retardo da germinação (Polacco & Holland, 1993). No entanto, a perda
da urease embrião-específica não acarreta alteração fenotípica alguma na planta. Em
virtude desses fatos, Polacco & Holland (1993) propuseram que essa proteína teria outra
função na planta, talvez, em mecanismos de defesa.
Essa função de defesa das ureases nas plantas condiz com a atividade inseticida
e fungicida descrita para canatoxina, uma isoforma de urease encontrada em sementes de
Canavalia ensiformis (Carlini et al., 1997; Oliveira et al., 1999; Ferreira DaSilva et al.,
2000; Follmer et al., 2001; Becker-Ritt et al., 2007).
2. Isoformas de Ureases de Canavalia ensiformis
As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse
bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) (Sumner, 1926), a lectina concanavalina
13
A (Sumner & Howell, 1936), inibidores de tripsina (Ubatuba, 1955) e a canatoxina
(CNTX), (Carlini & Guimarães, 1981).
A urease (JBU) de C. ensiformis foi a primeira enzima a ser cristalizada
(Sumner, 1926). Possui uma cadeia polipeptídica única com 840 resíduos de aminoácidos e
uma massa molecular de 90,770 kDa. A forma mínima da proteína expressando atividade
enzimática é a de um trímero de 270 kDa, sendo que a forma nativa é um hexâmero de 540
kDa (Zerner, 1991). Fragmentos de baixo peso molecular (30-45 kDa) formam-se em
soluções de urease, provavelmente decorrentes de quebras “espontâneas” da cadeia
peptídica em ligações Asp-Pro (Dixon et al., 1980).
Em 1981, Carlini & Guimarães isolaram uma proteína neurotóxica das
sementes de Canavalia ensiformis: a canatoxina. Posteriormente, essa proteína foi
caracterizada como sendo uma isoforma minoritária da urease da mesma semente (Follmer
et al., 2001), sendo que ambas isoformas apresentam atividade inseticida (Carlini et al.,
1997; Follmer et al., 2004).
3. A Canatoxina
A canatoxina corresponde a 0,5% do peso seco da semente de C. ensiformis
(Carlini & Guimarães, 1981). Quando injetada intraperitonealmente, a toxina induz
bradicardia, hipertensão e hipotermia, que precede convulsões e a morte em ratos e
camundongos, com uma DL
50 de 2 mg/Kg (Carlini et al., 1984). Nenhum efeito é
observado nesses animais quando a CNTX é administrada por via oral. Em concentrações
nanomolares a CNTX induz in vitro exocitose em plaquetas, mastócitos, sinaptosomas,
14
ilhotas pancreáticas, neutrófilos e macrófagos, sem alterar a integridade das membranas
celulares (Carlini et al., 1985; Barja-Fidalgo et al., 1991
a, 1991b; Ghazaleh et al., 1997). A
canatoxina e a JBU interagem com a superfície celular via ligação com gangliosídeos e
sialoproteínas (Carlini & Guimarães, 1991; Follmer et al., 2001; Real-Guerra, 2007). A
maioria dos efeitos, in vivo e in vitro, da CNTX envolvem a ativação do metabolismo do
ácido araquidônico, principalmente pela rota das lipoxigenases (Carlini et al., 1985; Barja-
Fidalgo et al., 1991
a, 1991b; Oliveira-Severo et al., 2006).
Em sua forma nativa, a canatoxina apresenta-se como um dímero de cadeias
polipeptídicas de 95 kDa ligadas não covalentemente. Esta proteína contém zinco e níquel,
elevada homologia (~85%) com a seqüência primária da urease majoritária, e 40-50% da
atividade ureásica desta. Em contraste, a JBU é um hexâmero de uma subunidade de 90,7
kDa, contendo 2 átomos de Ni cada, e nenhum Zn (Follmer et al., 2001, 2002). Anticorpos
policlonais desenvolvidos contra a canatoxina nativa ou desnaturada, bem como anticorpos
monoclonais de fonte comercial (Sigma Chem. Co) contra a JBU são incapazes de
diferenciar as isoformas, confirmando o seu alto grau de homologia (Follmer et al., 2001).
As duas isoformas podem ser separadas através de cromatografia de afinidade
por metal imobilizado, em função da diferença de afinidade por zinco ou cobalto,
apresentada pelas duas proteínas (Follmer et al., 2001, Follmer et al., 2004).
4. Atividade Inseticida
A atividade inseticida das ureases vegetais foi primeiramente descrita para a
canatoxina, em 1997. A canatoxina foi testada em diferentes insetos apresentando-se tóxica
para insetos com digestão baseada em catepsinas, como Callosobruchus maculatus
(Coleoptera:Bruchidae) e Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae). Essa atividade
inseticida não é observada em insetos com digestão baseada em enzimas do tipo tripsina
(Carlini et al., 1997). Abaixo estão relacionados os insetos testados para o efeito inseticida
da CNTX ou urease de C. ensiformis até o presente momento:
Insetos Não Susceptíveis
Schistocerca americana (Orthoptera, Acrididae)
Drosophila melanogaster (Diptera, Drosophilidae)
Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)
Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae)
Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae)
Enzimas Digestivas Básicas
Insetos Susceptíveis
Callosobruchus maculatus (Coleoptera, Bruchidae)
Rhodnius prolixus (Hemiptera, Reduviidae)
15
Nezara viridula (Hemiptera, Pentatomidae)
Dysdercus peruvianus (Hemíptera, Pyrrhocoridae)
Enzimas Digestivas Acídicas
Oncopeltus fasciatus (Hemíptera, Lygaeidae)
A inibição das catepsinas digestivas resulta em proteção para o inseto R.
prolixus contra o efeito letal da CNTX, sugerindo que a hidrólise proteolítica da toxina é
16
essencial para a atividade tóxica (Carlini et al., 1997; Ferreira-DaSilva et al., 2000). Essa
hipótese foi confirmada por estudos de digestão in vitro da proteína com enzimas de C.
maculatus, resultando em peptídeos que apresentaram efeito tóxico sobre R. prolixus. O
peptídeo mais ativo, apresentando cerca de 10 kDa, foi isolado e chamado de pepcanatox.
Quando o pepcanatox é administrado aos insetos juntamente com inibidores de catepsina, o
efeito protetor não é mais observado (Ferreira-DaSilva et al., 2000), confirmando assim que
a CNTX é uma protoxina, e que fragmento(s) dela, gerado(s) pelas enzimas digestivas do
próprio inseto, é(são) o(s) responsável(eis) pelo efeito inseticida. A partir da seqüência do
pepcanatox (Gombarovits 1999), foram desenhados primers para obtenção de um cDNA
codificando um peptídeo recombinante de 12,8 kDa, designado jaburetox-2Ec, expresso em
E. coli (Mulinari et al., 2007). O peptídeo jaburetox-2Ec, apresentou potente efeito
entomotóxico no inseto modelo D. peruvianus, uma peste da cultura de algodão, e também
na lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda, destacando o potencial uso dessa
proteína como ferramenta biotecnológica no controle de pragas (Stanisçuaski, et al, 2005;
Mulinari et al., 2007).
5. Mecanismo de ação da urease e/ou do peptídeo
O mecanismo de ação inseticida da urease e do peptídeo tóxico tem sido
estudado em nosso laboratório. Ensaios de western blot mostraram que não há mais CNTX
no intestino de R. prolixus 48 h após uma refeição da toxina, período bem anterior ao início
da morte dos insetos, que acontece a partir do 3º-4º dia. Com 48 h, na hemolinfa vêem-se
muitos fragmentos e também agregados moleculares imunoreativos, maiores que a própria
17
toxina (Carlini et al., 1997; Ferreira-DaSilva et al., 2000). Estes sugerem que tanto a urease
como seus fragmentos não ficam restritos ao intestino do inseto e podem ter efeitos
sistêmicos. Stanisçuaski et al (2007) mostrou que tanto as ureases quanto o Jaburetox 2-Ec
atuam sobre os Túbulos de Malpighi (TM) do inseto R. prolixus diminuindo a secreção de
fluidos, porém por rotas diferentes. A secreção estimulada por serotonina pelos TM é
ocorre através de rotas diferentes. Eicosanóides e Ca
2+
estão envolvidos na inibição da
secreção provocada por JBU, mas não pelo peptídeo jaburetox 2Ec, para o qual o GMPc
parece ser o 2º mensageiro do efeito antidiurético.
A JBU também tem ação direta sobre o sistema digestório, diminuindo o
transporte de fluídos através do epitélio do estômago. Além disso, promove alteração na
freqüência e amplitude das contrações do intestino posterior além de alterar o tônus basal
do músculo. Tanto a JBU, como o Jaburetox 2-Ec, interferem na freqüência de contrações
do estômago (Stanisçuaski, 2007).
6. Inseto modelo - Dysdercus peruvianus
Dysdercus peruvianus Guérin-Menéville (Hemíptera: Pyrrhocoridae),
conhecido vulgarmente como percevejo manchador do algodoeiro, é uma praga da cultura
de algodão. Os danos causados por esse inseto são a queda ou mau desenvolvimento das
maçãs, manchas das fibras, introdução de fungos e bactérias, que podem levar a perdas
totais da cultura do algodão (Gallo et al., 1988). O ciclo de vida do D. peruvianus pode
variar de 30 a 35 dias, dos ovos até a fase adulta.
18
Dysdercus peruvianus pertence à ordem Hemiptera, subordem Heteroptera,
família Pyrrhocoridae. Esses insetos são adaptados a diferentes dietas (Gooldchild, 1966).
O inseto escolhido como modelo pertence a infraordem Pentatomomorfa. A maioria dos
pentatomomorfos se alimenta de sementes, nas quais injetam sua saliva contendo enzimas
digestivas (Miles, 1972; Feir, 1974; Hori, 1975; Laurema et al., 1985). A completa digestão
do alimento deve ocorrer no intestino médio, (Takanona & Hori, 1974; Khan & Ford, 1967)
que se caracteriza, quanto a morfologia digestória, por ter um intestino médio dividido em 4
regiões distintas (V1 - V4), nem sempre apresentando cecos gástricos. Os processos de
digestão desse grupo de insetos ocorrem ao longo do intestino médio: V1 é um local de
armazenamento, em V2 e V3 ocorre a digestão das proteínas, carboidratos e a absorção de
monossacarídeos (Saxena, 1958; Feir, 1974). Depois de um longo período em V3, o
alimento passa rapidamente através de V4 para a porção final do intestino. Existem
bactérias associadas ao epitélio de V3 e V4, que parecem não possuir papel na digestão, já
que a sua ocorrência se dá num local onde não há mais processos digestivos (Silva & Terra,
1994). Postula-se que a importância desses microrganismos estaria relacionada ao
movimento do bolo alimentar, devido à produção de substâncias que estimulariam o
movimento peristáltico (Silva et al., 1995).
Silva & Terra (1994) descreveram os sítios de absorção do intestino médio de
D. peruvianus. V1 é o principal local de absorção de água e glicose, sendo que a água
absorvida em V1 passa através dos tubos de Malpighi para a porção final do intestino. V2 e
V3 são os locais de absorção de aminoácidos. Esse inseto, ao contrário do que é relatado
para outras espécies da infraordem a qual pertencem, não possui enzimas digestivas na
saliva, que serve apenas para suspender o material ingerido (Silva & Terra, 1994).
Uma metodologia de bioensaios de toxicidade para D. peruvianus desenvolvida
em nosso grupo permitiu a introdução de substância-teste em sua dieta, sem manipulação
excessiva do animal (Stanisçuaski et al, 2005). Observa-se assim que o efeito da CNTX
sobre esse inseto é estágio dependente, sendo que ninfas são susceptíveis enquanto adultos
não o são (Figura 1).
02468101214
0
20
40
60
80
100
Ninfas - Controle
Adultos - C ontrole
Ninfas - CNTX 0.01%
Adultos - CNTX 0.04%
Ninfas - Azida 0.01%
Adultos - Azida 0.01%
Sobrevivência (%)
Tempo (dias)
FIGURA 1 - Curva de Sobrevivência. Insetos de terceiro estágio ou machos
adultos foram alimentados com a semente artificial confeccionada com farinha de
cotilédones de algodão, contendo CNTX ou azida sódica. O número de insetos
sobreviventes foi acompanhado diariamente. Os dados são médias e desvio padrão
de pontos experimentais em triplicatas. (Retirado de Stanisçuaski et al, 2005).
19
20
A diferença de susceptibilidade entre adultos e ninfas pode estar relacionada
com as enzimas digestivas presentes ou alterações de permeabilidade do trato digestório em
cada fase. Estudos de hidrólise in vitro mostraram que embora ninfas e adultos sejam
capazes de digerir a urease, nos adultos não se observa a formação de um fragmento
equivalente ao peptídeo entomotóxico, como se observa em ninfas (Piovesan et al, 2007).
Nesse mesmo trabalho, foi sugerido que as enzimas responsáveis pela hidrólise da urease
em adultos são do tipo serino e cisteíno proteases, enquanto em ninfas, as enzimas
responsáveis são do tipo aspártico proteases.
7. Anticorpos Monoclonais
Anticorpos são uma família de proteínas produzidas como parte do sistema
imune de vertebrados, sendo moléculas capazes de identificar uma substância única em
uma mistura complexa de outras substâncias. Tradicionalmente, os anticorpos são
purificados a partir do soro imune de animais. Essa prática consiste em introduzir o
imunógeno no animal escolhido, e controlar os níveis de anticorpos no soro até alcançar
uma resposta adequada. Atingido o nível desejado de anticorpos, é realizada a sangria do
animal e purificação das imunoglobulinas, resultando em uma fração de anticorpos
purificados. No entanto, esses anticorpos são heterogêneos do ponto de vista dos
determinantes antigênicos que eles reconhecem, principalmente quando o antígeno tem
natureza complexa.
Em 1975, Kohler & Milstein descreveram uma forma para a obtenção de
anticorpos que veio a proporcionar grandes avanços nas áreas da biologia celular e dos
diagnósticos clínicos. A técnica consiste em produzir populações de anticorpos
monoclonais através da hibridização de células de mielomas, que podem crescer
indefinidamente, com linfócitos B portadores do gene para um anticorpo específico.
Figura 2 — Esquema ilustrativo para a obtenção de Anticorpos monoclonais em
camundongos. (Extraído de: Boletim Epidemiológico Paulista – BEP - ISSN 1806-4272)
.
A fusão é facilitada por polietileno glicol, que promove a aderência das células
e fusão dos núcleos. Depois de fusionadas, as células são transferidas para um meio com
hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), no qual apenas células híbridas são capazes de
sobreviver. Os mielomas morrem pela falta de nutriente e as células esplênicas têm limitado
21
22
período de vida. A morte dos mielomas ocorre devido ao fato dessas células não serem
capazes de sintetizar purinas, usando hipoxantina de fonte externa como precursor, pois a
enzima (hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferase – HGPRT) está ausente nesse tipo
celular. Outras rotas para a síntese de purinas são utilizadas como alternativa à HGPRT,
sendo essas inibidas na presença de aminopterina. Células positivas são isoladas e
subcultivadas. Cada célula representa um clone, que produz um anticorpo monoclonal
dirigido contra um único antígeno, ou determinante antigênico, no caso de antígenos
complexos. Os hibridomas podem ser estocados em nitrogênio líquido por muitos anos
(Leenaars & Hendriksen, 2005; CCAC Guidelines on: antibody production, 2002).
Depois de selecionados, os hibridomas são injetados na cavidade peritoneal do
animal que deu origem às células esplênicas e aos mielomas. Ali, secretam os anticorpos
monoclonais formando o fluido ascítico. Este é retirado do animal e purificado por
cromatografia de afinidade com proteína A/G, ou por cromatografia líquida. Os anticorpos
também podem ser obtidos por cultura de células, no entanto, essa alternativa produz
concentrações bem menores de imunoglobulinas.
Outro método de imortalização de linfócitos B é a infeccção pelo vírus Epstein-
Barr (EBV), porém as células assim transformadas são difíceis de clonar e produzem baixos
níveis de imunoglobulinas (Little et al., 2000). A produção de anticorpos monoclonais
também pode ser obtida utilizando-se tecnologia de DNA recombinante, com o isolamento
e a amplificação por PCR dos genes presentes codificantes para anticorpos circulantes e a
clonagem em Escherichia coli. Outra alternativa para obtenção de anticorpos monoclonais
são técnicas de transformação de células embrionárias de camundongos, com inserção de
cromossomos codificantes para as imunoglobulinas desejadas (Reiche et al, 2002).
23
8. Uso de anticorpos monoclonais (mAB) no estudo de mecanismos de ação
de proteínas inseticidas e de ureases
Anticorpos monoclonais são ferramentas convenientes para o estudo da
interação de proteínas tóxicas e receptores moleculares, pois permite que estudos sejam
realizados in vivo, diretamente sobre células e tecidos possibilitando a visualização do
evento estudado.
Estudos com as proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis, por exemplo,
utilizaram imunolocalização para a elucidação do mecanismo de ação e localização das
endotoxinas (proteínas Cry) nos tecidos dos insetos. As proteínas Cry se ligam a receptores
específicos na superfície epitelial das células do trato digestório dos insetos, disparando o
seu mecanismo de ação. O reconhecimento desses receptores pelas toxinas é fundamental
para a atividade tóxica e é especifico para determinado grupos de insetos (Piggot et al.
2007). Anticorpos monoclonais contra distintos sítios funcionais dessas endotoxinas foram
produzidos e caracterizados (Huber-Lukac et al., 1982, 1983, 1986). Esses mABs reagiram
diferencialmente com proteínas Cry de diferentes subespécies de B. thuringiensis,
permitindo a identificação dessas proteínas (Huber-Lukac et al., 1986).
Estudos de imunolocalização permitem também estudar a distribuição e
localização de proteínas em tecidos específicos. A imunolocalização de arcelinas, uma
família de proteínas tóxicas presente em Phaseolus vulgaris, sobre os insetos Zabrotes
subfasciatus e Acanthoscelides obtectus permitiu avaliar a distribuição dessas toxinas em
células e tecidos dos insetos, contribuindo para o esclarecimento do mecanismo de ação
dessas proteínas (Paes et al., 2000).
24
Anticorpos monoclonais contra ureases já foram descritos, em especial contra a
enzima de Helicobacter pylori, devido a sua aplicação em diagnóstico de doenças gástricas.
Anticorpos monoclonais contra a urease nativa de H. pylori são capazes de inibir a
atividade ureásica, enquanto anticorpos policlonais não inibem e podem abolir a ação
inibitória desses mAbs (Nagata et al., 1992). Um desses anticorpos, chamado L2,
apresentou reação cruzada com ureases purificadas de outras espécies de Helicobacter (H.
felis, H. nemestrinae), mas não foi capaz de reconhecer urease de Proteus mirabilis ou de
C. ensiformis (Hirota et al. 2001).
Em 1993, Karmali et al. descreveu a produção de mABs contra ureases de
Canavalia ensiformis. Nesse estudo, foram obtidas três linhagens de células secretando
mABs da classe IgM que reconheciam formas monoméricas e triméricas de urease e não
apresentavam reação cruzada contra ureases bacterianas. Os autores não citam dados de
reação cruzada com ureases de outras fontes vegetais e nem entre as isoformas de urease
presentes na mesma planta.
Monoclonais contra ureases de plantas foram desenvolvidos por Hirayama et
al., 2000, para estudar a distribuição dessas proteínas no bicho-da-seda Bombyx mori, cuja
lagarta se alimenta de folhas e raízes de amoreira (Morus alba). A presença de urease no
epitélio digestório e na hemolinfa do B. mori foi realizada por imunohistoquímica usando
mAbs anti-urease. Os estudos mostraram que a urease encontrada na hemolinfa da lagarta
era originária da planta da qual o inseto se alimenta. Os autores demonstraram ainda que a
urease ingerida pelo inseto passa intacta para a hemolinfa, provavelmente, através de
ligação a uma proteína localizada nas membranas do epitélio digestório, que serve como
receptor seletivo, já que esse transporte é mais eficiente para a urease de Morus alba do que
25
ureases de outras fontes, como C. ensiformis (jack bean) e Bacillus pasteurii (Kurahashi et
al, 2005).
Em nosso laboratório, anticorpos policlonais produzidos em coelho contra a
CNTX nativa ou desnaturada, não se mostraram capazes de distinguir a JBU da CNTX,
apresentando igual título por ELISA. Adicionalmente, testamos um anticorpo monoclonal
contra urease de C. ensiformis, disponível comercialmente (Sigma Chem. Co, U-4879, Lot
79F4819) e esse também não se mostrou capaz de distinguir a CNTX da urease majoritária
de semente (Follmer et al., 2001).
Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e seus
peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os
mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Alguns
insetos respondem aos efeitos tóxicos da ureases de C. ensiformis ou da soja (Glycine max),
apesar da presença de urease endógena nas sementes que lhes servem como alimento. Esse
é o caso do percevejo D. peruvianus, sendo que extratos da semente de algodão apresentam
atividade ureásica e reagem contra anticorpos anti-urease ou anti-CNTX. Uma urease com
subunidades de ~98.3 kDa foi preliminarmente caracterizada pelo nosso grupo, sendo esta a
primeira descrição de urease em uma Malvácea (Barcelos et al, 2004; Menegassi et al,
dados não publicados). Ureases são abundantes também na semente de soja, fonte de
alimento do percevejo verde Nezara viridula, ou no feijão-de-corda Vigna unguiculata,
atacada pelo caruncho C. maculatus, sendo que ambas essas pragas são susceptíveis ao
efeito tóxico de ureases de C. ensiformis. Devido ao alto grau de homologia entre ureases
de diferentes fontes vegetais (Follmer, 2007), a imunolocalização da toxina nos tecidos
26
alvos desses insetos pode resultar em um falso positivo, devido a uma reação cruzada com
as proteínas endógenas e seus fragmentos, provenientes do alimento consumido.
Assim, o desenvolvimento de anticorpos capazes de distinguir as isoformas de
urease de C. ensiformis e o peptídeo tóxico jaburetox 2-Ec, sem apresentar reação cruzada
com ureases de outras espécies, é uma ferramenta importante nos estudos sobre seu
mecanismo de ação em organismos suscetíveis.
27
OJETIVOS
Objetivos Gerais:
Os objetivos desse trabalho foram realizar a imunolocalização das ureases de
Canavalia ensiformis e/ou de seus fragmentos nos tecidos em ninfas do inseto Dysdercus
peruvianus e desenvolver anticorpos monoclonais capazes de diferenciar as isoformas de
ureases dessa semente, bem como o peptídeo inseticida recombinante, derivado de urease.
Os objetivos específicos desse trabalho foram:
• Identificar tecidos alvos de ureases e ou peptídeos em Dysdercus
peruvianus e otimizar uma metodologia para visualizar a interação da
urease com as proteínas ligantes nos diferentes tecidos;
• Analisar o grau de imunoreatividade cruzada entre as isoformas de
ureases de Canavalia ensiformis e do algodão Gossypium hirsutum;
• Desenvolver anticorpos monoclonais para o peptídeo inseticida
recombinante jaburetox-2Ec que não reconheçam as holoproteínas;
28
Metodologia
1. Ureases
A CNTX e a JBU foram purificadas por cromatografia de afinidade por metal
imobilizado (IMAC) a partir de sementes de feijão-de-porco de acordo com Follmer et al.,
2004. A concentração protéica foi estimada pela absorbância a 280 nm (A280) ou pelo
método de Bradford (1976).
A urease de sementes de algodão foi purificada conforme Menegassi et al.,
2007. Resumidamente, o protocolo de purificação consta de precipitação com sulfato de
amônio, duas etapas de cromatografia de troca iônica e gel-filtração, resultando em uma
preparação homogênea da proteína. A enzima apresenta-se como um hexâmero de
subunidades de 98.3 kDa, ligadas não covalentemente.
A atividade ureásica das amostras em tampão 20 mM de fosfato de sódio, 1 mM de
ácido etilenodiamino-tetraacético (EDTA), 5 mM de β-mercaptoetanol pH 7,5 foi ensaiada
sobre uréia (10 mM, concentração final), por 30 min a 37 °C. A amônia formada foi
determinada colorimetricamente (Weatherburn, 1967). Uma unidade de urease foi definida
como sendo a quantidade de enzima capaz de hidrolisar 1 micromol de uréia por min nas
condições descritas.
29
2. Peptídeo Recombinante Jaburetox 2-Ec:
O peptídeo Jaburetox 2Ec é obtido através da expressão heteróloga em E. coli,
segundo Mulinari et al, 2007. O peptídeo possui uma cauda de His que interage com Ni,
viabilizando a purificação por cromatografia de afinidade em Ni-NTA (QIAGEN). O
peptídeo é retido na coluna e depois eluído com 200 mM de imidazol. A amostra foi
dializada exaustivamente para a retirada do imidazol.
3. Insetos
Dysdercus peruvianus
A colônia de D. peruvianus é mantida em sala climatizada, com temperatura
entre 22-25 C (Milano et al., 1999), umidade relativa de 75%, e com fotoperíodo de 16:8 h
(Claro: Escuro). Os insetos são mantidos em frascos de tereflato de polietileno (PET),
fechados com tela de tecido serigráfico e com uma camada de areia no fundo. Os insetos
têm livre acesso a água, mantida em bebedouros de plástico, e são alimentados com
sementes lintadas de algodão (Gossypium hirsutum). Estas sementes são mantidas dentro
dos frascos durante o período de reprodução e postura, até o primeiro estágio de ninfa.
Depois, as sementes são colocadas sob o tecido que fecha os frascos, para evitar contato
com as fezes dos insetos. O ciclo de vida do D. peruvianus, dos ovos até a fase adulta.
pode levar de 30 a 35 dias, incluindo 5 fases larvais.
30
4. Preparação dos Homogeneizados de D. peruvianus
Ninfas de 4º ínstar foram mantidas em jejum de 2 a 4 dias, mas com livre
acesso a água. Para o preparo dos homogeneizados, os insetos foram anestesiados por
hipotermia por 10-15 minutos e em seguida dissecados sob microscópio estereocóspico: as
patas e antenas são removidas, a cabeça e o intestino são separados, e o resto do corpo é
reunido em uma única fração. Cada fração foi homogeneizada com Potter manual de vidro
em tampão PBS 1X, numa proporção de 50 insetos (ou suas partes) por mL, e centrifugada
2 vezes a 14.000 rpm por 30 min à 6º C. O sobrenadante foi separado, filtrado em
membrana de 0,45 um e a concentração de proteína nos homogeneizados foi estimada por
Bradford (1976).
5. Eletroforeses
As eletroforeses em gel de poliacrilamida (8%, 10%, 12% ou gradiente de 8-
20%) foram realizadas utilizando o método de Laemmli (1970). Realizou-se também o
SDS-PAGE, utilizando-se amostras não fervidas contendo SDS. As amostras dos géis
nativos, feitos sem a adição de SDS, também não foram fervidas. Após as corridas, os géis
foram corados com Coomassie Blue ou nitrato de prata (Blum et al., 1987).
6. Anticorpos Policlonais desenvolvidos em coelho
Adaptado de Follmer et al., 2001. As amostras (CNTX) foram separadas por
SDS-PAGE e coradas com Coomassie Blue. Bandas referentes a CNTX (totalizando cerca
31
de 100 µg de proteína) foram cortadas, submetidas a eletroeluição ou não, e emulsionadas
com os adjuvantes para o preparo das injeções. Aplicou-se três injeções subcutâneas no
dorso do de coelhos, acompanhando-se o título por dot blot. Após a sangria dos coelhos, o
sangue foi centrifugado, deixado coagular e depois o soro foi recuperado. O soro contendo
as imunoglobulinas foi adsorvido com membranas de nitrocelulose impregnadas com
canavalina (0,5 mg/mL em NaPB 50mM) e concanavalina-A (0,5 mg/mL em Tris HCL 50
mM) para retirada de anticorpos inespecíficos. Adicionalmente, uma aliquota do anticorpo
foi adsorvido em membranas impregnadas de extrato bruto de sementes de algodão.
7. Histologia e imunolocalização.
Para avaliação ao microscópio óptico, os tecidos dos insetos tratados e controles
foram preparados segundo Veiga et al., 2001. Os insetos de terceiro e quarto instares foram
fixados em formaldeído 4% tamponado (pequenos cortes foram feitos ao longo do inseto
para melhorar a entrada do fixador), desidratados em série alcoólica, e embebidos em
historesina (Leica). Realizou-se cortes seriados transversais e longitudinais do inseto
(micrótomo Leica 2145) com espessura de 3 a 7 µm. A coloração empregada foi azul de
metileno/fucsina básica. Os cortes foram montados entre lâminas e lamínulas e com
Entelan para observação em microscópio óptico.
8. Imunodifusão
A imunodifusão foi realizada segundo Outchterlony (1958) usando géis de
agarose a 1%, em 20 mM de fosfato de sódio, 150 mM NaCl, pH 7,0, com 0,02% NaN3.
32
Depois da difusão por 48 horas à temperatura ambiente, os géis foram lavados em salina e
água destilada, secos e corados com coomassie blue.
9. Dot blot
As amostras (0,5 a 1,0 ng de proteína por spot,) de homogeneizados da cabeça,
intestino e o restante do corpo (insetos controle) foram aplicadas diretamente em pedaços
(1 cm
2
)
de membrana de nitrocelulose (GE-Lifesciences), acomodadas em placas de 16
poços. As membranas foram bloqueadas com TBS 1X, 5% de leite desnatado, 0,05% de
Tween por 1h 30min à temperatura ambiente sob agitação. Depois de lavar 3 x com tampão
de lavagem (TBS 1X, 0,05% de Tween) as membranas foram incubadas overnight sob
agitação com uma solução de urease (2 µg em 1 mL, em cada poço) em diferentes soluções:
1) NaPB 20mM, EDTA 1mM, 2-mercaptoetanol 5mM pH 7,5; 2) formiato de amônio pH
5,6; 3) TBS 1x, pH 7,5. As membranas foram lavadas com o tampão de lavagem 3x e
incubadas com o anticorpo anti-urease (diluição 1:10.000) por 2 h, à temperatura ambiente.
Após nova lavagem, as membranas foram então incubadas com o anticorpo secundário
contra IgG de coelho marcado com fosfatase alcalina (diluição 1:20.000) por 2 h, à
temperatura ambiente. Depois de lavada 3x com o tampão de lavagem, as membranas
foram colocadas na solução de revelação (Tris H-Cl 0,2M pH 9,0; NaCl 0,1M; MgCl
2,5mM; 0,75 µM de nitroblue tetrazolium (NBT) e 30 nM de 5-bromo-4-cloro-indoil-
fosfato (BCIP).
33
10. Western-Blot
As amostras de homogeneizados de tecidos (fervidas e não fervidas) foram
separadas por SDS-PAGE 8% ou 10% ou em gel nativo (gradiente de poliacrilamida 4 a
15%) e transferidas para membrana de PVDF (0,2 um) previamente ativada com metanol
100% (adaptado de Fitches et al., 2001). A membrana foi bloqueada com 5 % de leite
desnatado por 2 h, em seguida incubada com anticorpo anti-urease desenvolvido em coelho,
com diluição de 1:20.000 em TTBS ( 0,15 M NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7,4 com 0,05% de
Tween 20 e 1,5% de Leite Desnatado) por 2 horas. Após lavagem com TBS (3x), a
membrana foi incubada com anti-IgG de coelho, conjugado com fosfatase alcalina por 2 h
(diluições 1:25.000; 1:20.000; 1:10.000). Depois de nova lavagem (3x), as membranas
foram reveladas para atividade fosfatásica em uma solução de NBT e BCIP, diluídos em
tampão Tris H-Cl 0,2M pH 9,0; NaCl 0,1M; MgCl 2,5mM.
Alternativamente, os homogeneizados foram incubados in vitro com soluções
de urease numa relação de 1:1 (massa de proteína) overnight em NaPB 20mM, EDTA
1mM, 2-mercaptoentanol 5mM pH 7,5 a 4 C. Depois, as amostras foram submetidas à
separação eletroforética em gel nativo (gradiente de poliacrilamida, de 8 – 15%), seguido
de Western Blot, conforme descrito acima.
11. Overlay ou ligand blot
Os homogeneizados de tecidos de D. peruvianus (fervidos ou não fervidos)
foram separados por SDS-PAGE 8 % ou 10% ou gel nativo (gradiente de poliacrilamida 8 a
34
15%) e as proteínas transferidas para membrana de PVDF previamente ativada com
metanol 100% (adaptado de Fitches et al., 2001). A membrana foi bloqueada com 5% de
caseína e todas as etapas posteriores foram realizadas em tampão TBS 1X. A membrana foi
incubada com uma solução de urease (1,0 A
280) por 2 h a temperatura ambiente ou
overnight à 4
o
C, seguida de incubação com anticorpo policlonal desenvolvido em coelho
contra urease (diluição 1:10.000) por 2 h à temperatura ambiente, e incubação com
anticorpo secundários anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma Chem.
Co.) (diluição 1:25000) por 2 h a temperatura ambiente. Depois de lavagem 3x, as
membranas foram colocadas numa solução de revelação (Tris H-Cl 0,2M pH 9,0; NaCl
0,1M; MgCl 2,5mM; NBT +BCIP).
12. Cromatografia de afinidade com urease imobilizada
Alíquotas de 500 µl da resina Chelating Sepharose Fast Flow (GE-Healthcare)
foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL e lavadas por centrifugação (vortex por 1
min) com água destilada. Em seguida, adicionou-se a cada eppendorf 500 µL de solução de
NiCl
2 1M em água destilada. O excesso de NiCl2 foi retirado lavando-se a resina com água.
A resina foi equilibrada com tampão NaPB 20mM, 150mM ou 500mM NaCl, pH 7.0 (5
mL cada etapa, 500 µL cada vez no vortex) e em seguida, adicionou-se volume de solução
de urease contendo 300 µg ou 1,0 A280, no mesmo tampão. Após 2 h a 4 C, a resina foi
lavada para remoção da urease não ligada com tampão NaPB 20mM, pH 7.0, contendo 150
mM ou 500 mM NaCl. Em seguida, foram adicionados os homogeneizados (cabeça,
intestino, corpo: 100 µl contendo ~50 µg de proteínas), e incubados com a resina overnight.
35
A resina foi então eluída com tampão NaPB 20mM, pH 7.0, contendo 150mM ou 500 mM
NaCl, e em seguida, eluída com 250 mM de Imidazol. Os materiais eluídos com tampão e
com imidazol foram aplicados em gel SDS-PAGE 8% ou 10% para análise.
13. ELISA
Os antígenos foram adsorvidos em placas de ELISA em concentrações variadas
(ureases de C. ensiformis: 0,007 a 1,0 µg de proteína; urease de G. hirsutum: 0,2 a 7,8 µg
de proteína/ por poço) em 50 µl de solução NaPB 20mM, EDTA 1mM, 2-mercaptoetanol
5mM pH 7,5. A seguir, as placas foram incubadas na solução de bloqueio TBS 1X
contendo 1% p/v leite desnatado. As placas sensibilizadas foram expostas a um anticorpo
policlonal anti-urease desenvolvido em coelhos (diluições 1:5.000) por 2 h, e após lavagem,
incubada por mais 1 h com anticorpo secundário anti-IgG de coelho (1:10.000), marcado
com fosfatase alcalina (Sigma Chem. Co). Para a revelação, adicionou-se a cada poço 50 µl
da solução de revelação 1 mM p-nitrofenil fosfato, 10 mM borato de sódio, 0,25 mM
MgCl
2
pH 9,8, incubando-se por 30 minutos a temperatura ambiente. A hidrólise do
substrato foi avaliada por leitura da absorbância de 450 nm em um leitor de microplacas
SpectraMax® (Molecular Devices), e analisada com o software SoftMaxPro, para a
construção de curvas padrões em função da concentração de urease.
14. Produção dos Anticorpos Monoclonais
A produção de anticorpos monoclonais foi realizada com a colaboração de
Aline Baldi, sob orientação do Dr. Fernando Kreutz, na FK-Biotecnologia.
36
Resumidamente, dois grupos de três camundongos BALB/c foram imunizados
com uma mistura das isoformas CNTX e JBU (1:6 p/p). Cada animal recebeu quatro
imunizações com 50 µg de proteína cada. As três primeiras injeções foram intraperitoneais
com intervalos de 2 semanas. Na primeira, a proteína foi emulsionada em adjuvante
completo de Freund (ACF), na segunda, a emulsão foi feita com o adjuvante incompleto de
Freund e na terceira imunização, as proteínas foram diluídas em tampão fosfato de sódio-
salina (PBS) 1x. Três dias antes da fusão, uma quarta dose foi administrada por injeção
intra-esplênica em cada camundongo. Células SP2/0 (mielócitos de camundongo) e os
esplenócitos foram fusionados com polietileno glicol (PEG), ressuspendidas em meio
aminopterina-hipoxantina-timidina (HAT) para seleção das células híbridas e plaqueadas na
presença de macrófagos. Os hibridomas resultantes dessa fusão foram pré-selecionados
contra a mistura das isoformas. Aqueles que reagiram positivamente foram isolados e nova
seleção foi feita utilizando-se as proteínas purificadas (CNTX, JBU) e o peptídeo
jaburetox-2 Ec. A seleção foi feita por ELISA, como descrito acima.
15. Seleção dos clones
As placas de ELISA foram sensibilizadas com 50 µl por poço de uma solução
10 µg/mL do antígeno (CNTX, JBU ou jaburetox-2Ec) por 18 horas a 4
o
C. As placas
foram lavadas 3 X com PBS 1X, e bloqueadas com BSA 3% por 1 hora. Alíquotas de 100
ul dos sobrenadantes das culturas de hibridomas foram adicionados em cada poço e
incubados por 1 hora. O anticorpo secundário anti IgG de camundongo conjugado com
peroxidase foi adicionado, incubado por 1 hora, e depois retirado o excesso por lavagens.
37
Todas as incubações ocorreram à temperatura ambiente sob agitação. A atividade da
peroxidase foi medida com os substratos 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB) e peróxido de
hidrogênio, parando-se a reação após 10 min com ácido sulfúrico. As placas foram lidas
para absorbânica a 450 nm no leitor de placas SpectraMax, e as leituras foram analisadas
com o software SoftMaxPro.
38
RESULTADOS
1. Identificação de proteínas presentes nos tecidos do Dysdercus
peruvianus que interagem com as ureases in vitro.
Como abordagem inicial, a técnica de dot blot foi utilizada para caracterizar a
interação entre as ureases e os homogeneizados dos insetos. Observamos (resultados não
mostrados) que os controles dos homogeneizados (0,5 µg de proteína no spot), não
incubados com JBU, davam reação positiva nos dot blots com diluições de até 1:10000 do
anticorpo primário (policlonal anti-urease). Diferentes condições foram testadas visando
otimizar o processo de interação in vitro entre ligantes, de tal modo a permitir a
caracterização dessa interação. Para tal, fizemos Dot Blots utilizando três tampões de uso
comum no laboratório: NaPB 20 mM, EDTA 1mM, 2-mercaptoetanol 5 mM pH 7,5, que é
o tampão normalmente utilizado para armazenar a urease em sua forma estável e ativa;
formiato de amônio pH 5,6, com o mesmo pH encontrado no intestino desses insetos; e
TBS 1x pH 7,5, por ser o tampão utilizado nas outras etapas dos ensaios de blot. Não houve
diferenças nos resultados dos Dot blots, indicando que a ligação do anticorpo anti-urease
diretamente aos homogeneizados (cabeça, intestino e o resto do corpo) ocorre igualmente
nos três tampões.
O Dot Blot demonstrou que o anticorpo policlonal anti-urease reconhece
epítopo(s) nos homogeneizados de D. peruvianus, mesmo quando os insetos controle estão
em prolongado jejum. No entanto, esse reconhecimento não foi visto nos Western blots,
39
quando os homogeneizados de tecidos são previamente separados por SDS-PAGE. Após a
desnaturação preparatória com o SDS, com ou sem fervura das amostras, apenas a urease
de C. ensiformis foi reconhecida pelo anticorpo, não sendo detectada qualquer banda
imunorreativa nos homogeneizados de tecidos dos insetos controles. A incubação in vitro
dos homogeneizados de tecidos do inseto com a urease por 16 horas nas condições testadas,
seguida de Western blot, não produziu resultado diferente, mesmo quando os
homogeneizados foram submetidos à separação em gel nativo (sem detergente e sem
fervura). Esses resultados negativos sugerem que os anticorpos policlonais anti-urease
utilizados reconhecem epítopos conformacionais de urease/fragmentos presente(s) nos
tecidos dos insetos (figuras 3A e 3B).
Não foi possível detectar, em nenhuma das condições testadas nos ensaios de
“overlay”, a ligação da urease com proteínas dos homogeneizados de tecidos dos insetos,
após separação destes por eletroforese e transferência para membranas de nitrocelulose.
Utilizamos a cromatografia de afinidade com urease imobilizada como
alternativa aos ensaios utilizando o anticorpo policlonal anti-urease. Nessa técnica, a urease
nativa foi imobilizada na resina cromatográfica através da sua afinidade por níquel. Os
homogeneizados de tecidos dos insetos foram aplicados na coluna e, após retirada das
proteínas não retidas, procedeu-se a duas etapas de eluição, a primeira através de um
aumento da força iônica com NaCl, e a segunda com imidazol, nesse caso “desligando-se”
também a urease da resina. A análise por SDS-PAGE das proteínas eluídas da resina com
urease imobilizada foi semelhante nos experimentos e no controle (onde não havia a urease
imobilizada na resina) (dados não mostrados). Uma explicação para esse resultado seria
que proteínas presentes nos homogenados dos tecidos possuem também afinidade pelo
metal quelado (Ni), mascarando qualquer interação com a urease imobilizada.
A
B
Figura 3: (A) SDS-PAGE e (B) Western Blot dos homogeneizados de D. peruvianus: (PM)
padrão de peso molecular; (URE) urease de C. ensiformis 5 µg; (CO) homogeneizado do
corpo, 15 µg; (IN) homogeneizado do intestino 15 µg; (CA) homogeneizado da cabeça 15
µg. (À): gel 10 % de poliacrilamida, corado com prata. (B): Western blot, anticorpo anti-
urease (1:5000) de coelho e anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina
(1:10000), revelado com BCIP e NBT. A seta indica a banda do monômero da urease de C.
ensiformis, com ~95 kDa.
40
41
Ensaios preliminares de imunohistoquímica utilizando cortes de tecidos de D.
peruvianus (não alimentados com JBU) e anticorpos policlonais anti-urease mostraram uma
forte marcação inespecífica, que inviabilizou o uso dessa técnica para os objetivos
propostos. Como esse inseto se alimenta de sementes de algodão, que contem uma urease
endógena (GHU), esta poderia estar sendo reconhecida pelo anticorpo policlonal anti-
urease de C.ensiformis, mesmo após a adsorção do anticorpo com extratos de algodão.
Realizamos ensaios de imunodifusão utilizando o anticorpo policlonal anti-
urease para avaliar a imunorreatividade cruzada de extratos brutos de sementes de algodão
e de feijão-de-porco. Nas melhores condições do ensaio, obtivemos linhas de precipitação
para o extrato de algodão após 48 horas, enquanto que para o extrato de C. ensiformis essas
já eram visíveis após 24 horas de corrida (dados não mostrados).
Em seguida avaliamos o reconhecimento de GHU (purificada ou no extrato
bruto da semente) nos testes de ELISA, utilizando-se os anticorpos policlonais anti-urease
C. ensiformis (Figuras 4 e 5). O comportamento da curva dose-resposta para a GHU no
ELISA tende a fugir da linearidade, mesmo para a proteína purificada (Figura 5). Vários
fatores podem contribuir para isso: no extrato bruto pode haver outros compostos que
“sequestram” os anticorpos, como lectinas, por exemplo; por outro lado, essa observação
indica que apenas parte dos determinantes antigênicos da JBU estão presentes na GHU.
Ensaios de atividade ureásica indicaram que a semente de algodão possui cerca
de 116 U da enzima/g de farinha, um conteúdo mais baixo de urease comparado às
sementes de leguminosa (o feijão-de-porco tem 720 U/g farinha). A GHU purificada
segundo Menegassi et al., 2007, apresenta uma atividade específica de 29 U por mg de
proteína.
42
Avaliando a imunorreatividade cruzada entre a urease de algodão e a urease de
C.ensiformis por ELISA, constatamos que os anticorpos policlonais anti-JBU reconhecem
menos eficientemente a GHU, com uma diferença de afinidade de cerca de 100 vezes. Essa
diferença no ELISA foi vista tanto utilizando-se a GHU purificada, como titulando sua
presença no extrato bruto (Figuras 4 e 5). Segundo o resultado do ELISA, o extrato bruto de
algodão teria cerca de 0,1 µg de urease por µl do extrato bruto. Considerando a
concentração protéica de 4,1 mg/mL desse extrato (0,2 g farinha/mL), o ELISA indicou
0,024 mg GHU por mg de proteína do extrato, ou ainda, a partir da atividade específica da
GHU purificada, o extrato bruto de algodão teria cerca de 14 U de GHU por g de semente.
Em resumo, ainda que o reconhecimento da GHU pelos anticorpos policlonais
anti-urease C.ensiformis disponíveis subestimem em 5 a 10 vezes os níveis da enzima, o
alto grau de homologia entre as ureases em geral e a conseqüente imunorreatividade
cruzada obtida com anticorpos policlonais, mostram que a abordagem imunohistoquímica
convencional tem pouca chance de sucesso.
Absorbância 450 nm
Concentração de proteína
Absorbância 450 nm
Concentração de proteína
Figura 4: Curva padrão da urease de C. ensiformis utilizando anticorpos policlonais contra
JBU, por ELISA: (A) Curva padrão de urease de C. ensiformis purificada (B) Apresentação
logarítmica da curva padrão. Resultados são médias de triplicatas ± desvio padrão.
43
Absorbância 450 nm
Absorbância 450 nm
Figura 5. Curva padrão e titulação da da urease de algodão por ELISA: (A) Curva padrão
de GHU purificada conforme Menegassi et al., 2007. (B) Titulação da urease de GHU no
extrato bruto de semente de algodão. Resultados são médias de triplicatas ± desvio padrão.
44
45
2
. Produção de Anticorpos Monoclonais anti-Urease de C. ensiformis
A fusão de esplenócitos dos camundongos imunizados com os mielomas
resultou em 500 poços contendo hibridomas. Os sobrenadantes das culturas de hibridomas
foram inicialmente testados por ELISA em placas sensibilizadas com uma mistura das
isoformas, CNTX (15%) e urease (85%). Desses, 96 poços foram selecionados, por
apresentarem maior reatividade na avaliação inicial, sendo transferidos para uma nova
placa para crescimento. Um segundo ciclo de seleção desses clones foi realizado utilizando
três diferentes antígenos purificados: CNTX, JBU e o peptídeo jaburetox 2-Ec (Figura 6).
Os resultados mostram que, mesmo imunizando os camundongos com uma
mistura de CNTX e de JBU, é possível obter hibridomas produtores de anticorpos
monoclonais que reconhecem mais especificamente uma das isoformas, ou o peptídeo
recombinante. Dos 96 poços, verificamos que 22 destes foram mais responsivos às
isoformas, ou ao peptídeo recombinante. Assim, os hibridomas dos poços 72 e 7
produziram anticorpos com maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes em relação
à urease ou o peptídeo). Dois poços, 21 e 57, foram mais específicos para JBU (cerca de 2
vezes). Embora o sobrenadante de todos os poços tenham reconhecido o fragmento tóxico,
o poço 37 reconheceu o peptídeo recombinante com maior especificidade (resposta 1,5
maior para o jaburetox 2-Ec do que CNTX ou urease).
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
4
7
15
19
20
21
26
35
36
37
39
40
53
57
59
61
64
71
72
79
83
85
Poço (número de identificação)
CNTX 10µg/mL
JBU 10 µg/mL
Jaburetox 2Ec 10 µg/mL
Absorbância 450 nm
Figura 6: Sobrenadantes das culturas de hibridomas foram testados contra
CNTX, urease de C. ensiformis e peptídeo tóxico. Os números na vertical correspondem ao
número do poço da cultura de hibridoma. (* clone mais específico para CNTX; **
específico para JBU; *** específico para Jaburetox 2Ec)
46
47
DISCUSSÃO
O reconhecimento de proteínas “endógenas” nos tecidos do inseto pelo
anticorpo policlonal anti-urease disponível impossibilitou os estudos de imunolocalização
da urease. Mesmo utilizando diferentes condições para incubação e altas diluições do
anticorpo, ainda se observa a interação do anticorpo anti-urease com os homogeneizados.
Essa interação pode ser explicada, em parte pela presença de urease nas
sementes de algodão (Menegassi et al., 2007), que serve como alimento do inseto modelo
D. peruvianus. Fragmentos da proteína poderiam estar presentes mesmo nos tecidos dos
insetos mesmo em prolongado jejum.
Outro motivo poderia ser a ocorrência de proteínas do inseto que possuam
homologia com as ureases. Stanisçuaki e colaboradores (dados não publicados) detectaram
uma banda de 90 kDa imunoreativa para anticorpos anti-urease de C. ensiformis em
Western blot de extratos de tecido nervoso de Rhodnius prolixus. Como esse inseto é
hematófago, a origem dessa proteína imunoreativa permanece desconhecida, não sendo
provavelmente proveniente do repasto de sangue do percevejo. Uma consulta aos bancos de
dados revela a existência de uma seqüência de cDNA (Q7PED9) que codificaria uma
proteína homóloga ao N-terminal de ureases de plantas no mosquito Anopheles gambiae.
Outra fonte alternativa dessa urease no R. prolixus ou mesmo no D. peruvianus poderiam
ser microrganismos simbiontes (bactérias, fungos ou protozoários) que estão presentes em
vários insetos.
48
Uma alternativa para esses estudos seria a obtenção de anticorpos monoclonais
capazes de diferenciar as isoformas de urease das diferentes sementes, o que
potencialmente permitiria realizar a imunolocalização da urease de C. ensiformis nos
tecidos do inseto Dysdercus peruvianus, apesar da presença da urease/fragmentos de
algodão provenientes da fonte alimentar.
Nossos resultados mostram que é possível obter-se anticorpos monoclonais que
diferenciam a isoforma minoritária CNTX da urease majoritária da C.ensiformis, ainda que
exista entre elas uma homologia estimada em mais de 85%. A imunização dos
camundongos com uma mistura das isoformas de urease de C. ensiformis resultou em 22
poços com imunoreatividade positiva. Desses, quatro foram capazes de diferenciar as
isoformas: dois foram mais específicos para a CNTX, (72 e 7), e dois, para a urease, (21 e
57). Um poço, 37, foi mais específico para o peptídeo inseticida. Considerando que em
cada poço havia uma mistura de clones, já que não chegamos a realizar a diluição limitante,
espera-se que a especificidade para cada isoforma e para o peptídeo seja maior após o
isolamento de cada clone.
A obtenção dos anticorpos monoclonais contra as isoformas de urease é
dificultada pela necessidade de obter cada isoforma pura e em quantidade suficiente para as
imunizações. Nesse trabalho pudemos observar que esse pré-requisito não é fundamental
para a produção de anticorpos monoclonais, pelo menos nas etapas de imunização. Além
disso, a sobrevivência dos camundongos também é fator que exige atenção, pois a CNTX é
uma proteína letal para esses animais quando administrada por via intraperitoneal, sendo
que a quantidade de proteína administrada em cada imunização obviamente não pode
ultrapassar a dose letal da toxina (cerca de 2 mg/kg).
49
Ainda que não tenha sido possível testar a imunoreatividade da urease de
algodão contra esses anticorpos monoclonais, ou utilizá-los para os ensaios de
imunolocalização, muito provavelmente será possível encontrar um monoclonal que
reconheça apenas as ureases de C.ensiformis, sem ter imunoreatividade cruzada com a
urease endógena do algodão.
Outras abordagens para um estudo histoquímico ainda são possíveis, como a
marcação da urease com um fluoróforo, e visualização “direta” da proteína no tecido-alvo.
Resultados preliminares mostraram que a marcação da urease com 2-(4’-isothiocyanate-
2’hydroxyphenyl)benzothiazole (4b) (Rodembusch et al. 2005) é eficiente, no entanto os
homogeneizados de tecidos dos insetos emitem uma fluorescência intrínseca no mesmo
comprimento de onda desse fluoróforo. O uso de outros tipos de sondas fluorescentes seria
uma alternativa para contornar esse problema.
A interação das ureases com membranas de eritrócitos (Follmer et al., 2001),
com proteínas da hemolinfa do bicho da seda (Kurahashi et al., 2005) ou do barbeiro
(Ferreira-daSilva et al., 2000) já foram descritos. Sabe-se que, após ingestão, essa proteína
é absorvida, passando do lúmen intestinal para a hemolinfa do inseto (Kurahashi et al.,
2005). Ainda que o peptídeo derivado da urease após digestão seja provavelmente o
principal agente tóxico para o inseto, a holoproteína também parece exercer efeitos per se.
Assim, Stanisçuaski (2007), descreveu a interação in vitro da urease com vários órgãos de
Rhodnius prolixus, como túbulos de Malpighi e o estômago.
No presente trabalho, não conseguimos observar a interação das ureases com
nenhum dos tecidos avaliados nos ensaios, mesmo utilizando diferentes condições. É
provável que, a interação esteja ocorrendo, mas seja muito lábil, e não esteja sendo
50
detectada pelos métodos aqui utilizados. Novas modificações deverão ser feitas nos
ensaios visando possibilitar a visualização ou medida dessa interação, como por exemplo,
cross-linking entre a urease e as estruturas-alvo, ou estudos por ressonância plasmônica de
superfície.
51
CONCLUSÕES
As metodologias utilizadas para visualizar a interação entre moléculas presentes
nos homogeneizados dos insetos e a urease mostraram-se ineficazes nas condições testadas.
Os anticorpos policlonais contra JBU reconhecem GHU com uma afinidade
cerca de 100 vezes menor. Apesar disso, a imunorreatividade cruzada com a GHU ou
fragmentos provenientes do algodão ingerido, presentes nos tecidos de D.peruvianus,
inviabilizaram o uso de técnicas de imunohistoquímicas para identicação de alvos da urease
no inseto.
Demonstramos ainda que é possível produzir anticorpos monoclonais que
diferenciam as isoformas de urease de C.ensiformis, apesar das proteínas apresentarem no
mínimo 85% de identidade. Assim, a obtenção de anticorpos monoclonais que discriminem
ureases de diferentes fontes pode ser uma alternativa para os estudos imunoquímicos
visando determinar tecidos-alvos em insetos que se alimentem de fontes produtoras de
urease, como o Dysdercus peruvianus.
52
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. BARCELOS, J.; WASSERMANN, G. E.; OLIVERA-SEVERO, D.; CARLINI, C.
R. Purification and Characterization of Urease(s) in Gossypium hirssutum. In:
XXXIII Reunião Anual da SBBq, Caxambú – MG. XXXIII Reunião Anual
Programas e índices, 2004.
2. BARJA-FIDALGO, C.; GUIMARÃES, J. A. & CARLINI, C. R. Canatoxin, a plant
protein, induces insulin release from isolated pancreatic islets. Endocrinology, 128:
675-679, 1991a.
3. BARJA-FIDALGO, C.; GUIMARÃES, J. A. & CARLINI, C. R. Lipoxygenase-
mediated secretory effect of canatoxin, the toxic protein from Canavalia ensiformis
seeds. Toxicon. 29: 453-460, 1991b.
4. BENNETT, J & WREN, E.A. The interaction of p-nitrophenyl carbamate with
urease, Biochim. Biophys. Acta, 482: 421-426, 1977.
5. BECKER-RITT, A. B.; MARTINELLI, A. H. S.; MITIDIERI, S.; FEDER, V.;
WASSERMANN, G. E.; SANTI, L.; VAINSTEIN, M. H.; OLIVEIRA, J. T. A.;
FIUZA, L. M.; PASQUALI, G. & CARLINI, C. R. Antifungal activity of plant and
bacterial ureases, Toxicon, 50(7): 971-983, 2007.
6. BLUM, H., BEIER, H. & GROSS, H. J. Improved silver staining of plant proteins,
RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8:93-99, 1987.
7. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analyt. Biochem., 72: 248-254, 1976.
53
8. CARLINI, C. R. & GUIMARÃES, J. A. Isolation and characterization of a toxic
protein from Canavalia ensiformis (jack bean) seeds, distinct from concanavalin-A.
Toxicon, 19: 667-676, 1981.
9. CARLINI, C.R. & GUIMARÃES, J. A. Plant and microbial toxic proteins as
hemilectins: emphasis on canatoxin. Toxicon, 29: 791-806, 1991.
10. CARLINI, C. R.; GOMES, C. B.; GUIMARÃES, J. A.; MARKUS, R. P.; SATO,
H. & TROLIN, G. Central nervous effects of the convulsant protein canatoxin. Acta
Pharmacol. Tox., 54: 161-166, 1984.
11. CARLINI, C. R.; GUIMARÃES, J. A.; RIBEIRO, J. M. Platelet release reaction
and aggregation induced by canatoxin, a convulsant protein: evidence for the
involvement of the platelet lipoxygenase pathaway. Br. J. Pharmacol., 84: 551-560,
1985.
12. CARLINI, C. R.; OLIVEIRA, A. E.; AZAMBUJA, P.; XAVIER-FILHO, J.;
WELLS, M. A. Biological effects of canatoxin in different insect models: evidence
for a proteolytic activation of the toxin by insect cathepsinlike enzymes. J. Econ.
Entomol., 90: 340-348, 1997.
13. CARLINI, C. R., & UDEDIBIE, A. B. Comparative effects of processing methods
on hemagglutinating and antitryptip activities of Canavalia ensiformis and
Canavalia brazilienses seeds. J. Agric. Food Chem., 45: 4372-4377, 1997.
14. CCAC guidelines on: antibody production. 43 pg. Canadian Council on Animal
Care, 2002.
54
15. DIXON, N. E.; GAZZOLA, C.; BLAKELEY, R. L. AND ZERNER, B. Jack Bean
Urease (EC 3.5.1.5). Letter: A metalloenzyme. A simple biological role for nckel?
Journal of the American Chemical Society, 97: 4131-4133, 1975.
16. DIXON, N. E.; HINDS, J. A.; FIHELLY, A. K.; GAZZOLA, C.; WINZOR, D. J.;
BLAKELEY, R. L. & ZERNER, B. Jack Bean Urease (EC 3.5.1.5). IV. The
molecular size and the mechanism of inhibition by hydroxamic acids.
Spectrophotometric titration of enzyme with reversible inhibitors. Canadian
Journal of Biochemistry, 58: 1321-1334, 1980.
17. FEIR, D. Oncopeltus fasciatus: a research animal. Rev. Ent., 19: 81-96, 1974.
18. FERREIRA-DASILVA, C. T.; GOMBAROVITS, M. E.; MASUDA, H.;
OLIVEIRA, C. M. & CARLINI, C. R. Proteolytic activation of canatoxin, a plant
toxic protein, by insect cathepsin-like enzymes. Arch Insect Biochem Physiol., 44
(4): 162-71, 2000.
19. FISHBEIN, W. N. The structural basis for the catalytic complexity of urease
interacting and interconvertible molecular species (with a note on isozyme classes).
Annals New York Academy of Sciences, 147: 857-881, 1969.
20. FITCHES, E.; WOODHOUSE, S. D.; EDWARDS, J. P.; GATEHOUSE, J. A. In
vitro and in vivo binding of snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin: GNA) and
jackbean (Canavalia ensiformis; Con A) lectins within tomato moth (Lacanobia
oleracea) larvae; mechanisms of insecticidal action. Journal of Insect Physiology,
47: 777-787, 2001.
21. FOLLMER, C.; BARCELLOS, G. B.; ZINGALI, R. B.; MACHADO, O. L.;
ALVES, E. W.; BARJA-FIDALGO, C.; GUIMARÃES, J. A & CARLINI, C. R.
55
Canatoxin, a toxin protein from jack beans (Canavalia ensiformis), is a variant form
of urease (EC 3.5.1.5): biological effects of urease independent of its ureolytic
activity. Biochem J., 15: 217-24, 2001.
22. FOLLMER, C.; YONEMA, M. L.; DIAS, J. F.; CARLINI, C. R. PIXE analysis of
urease isoenzymes isolates from canavalia ensiformis (jack bean) seeds. Nuclear
Instr. Meth. Phys. Res., Part B, 189: 482-486, 2002.
23. FOLLMER, C.; WASSERNANN, G. E.; CARLINI, C. R. Separation of jack bean
(Canavalia ensiformis) urease isoforms by immobilized metal affinity
chromatography and characterization of insecticidal properties unrelated to ureolytic
activity. Plant Science, 167:241-246, 2004.
24. FOLLMER, C. Insights into the role and structure of plant ureases. Phytochemistry,
69(1):18-28, 2008.
25. GALLO, D (Ed.). Manual de Entomologia Agrícola. Segunda Edição. CERES. São
Paulo. 649p. 1988.
26. GHAZALEH, F. A.; FRANCISCHETTI, I. M.; GOMBAROVITS, M. E.;
CARLINI, C. R. Stimulation of calcium influx and platelet activation by canatoxin:
methoxyverapamil inhibition and downregulation by cGMP. Arch. Biochem.
Biophy., 15: 339(2):362-7, 1997.
27. GOLDRAIJ, A. & POLACCO, J. C. Arginase is inoperative in developing soybean
embryos. Plant Physiol., 119(1): 297-304, 1999.
28. GOMBAROVITZ, M. C. Peptídeos Entomotóxicos gerados a partir da Canatoxina:
obtenção, isolamento, propriedades biológicas e caracterização físico-química.
Dissertação de Mestrado, UFRJ, Brasil, 1999.
56
29. GOOLDCHILD, A. J. P. Evolution of the alimentary canal in the Hemiptera. Biol.
Rev., 41: 97-140, 1966.
30. HIRAYAMA, C.; SUGIMURA, M.; SAITO, H.; NAKAMURA, M. Host plant
urease in the hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. Journal of Insect
Physiology, 46:1415-1421. 2000
31. HIROTA, K.; NAGATA, K.; NOROSE, Y.; FUTAGAMI, S.; NAKAGAWA, Y.
SENPUKU, H.; KOBAYASHI, M. & TAKAHASHI, H. Identification of an
antigenic epitope in Helicobacter pylori urease that induces neutralizing antibody
production. Infection and Immunity. 69(11): 6597-6603, 2001.
32. HORI, K. Digestive carbohydrases in the salivary gland and midgut of several
phytophagous bugs. Comp. Biochem. Physiol., 50B: 145-151, 1975.
33. HUBER-LUKAC, M.; JAQUET, F.; LUETHY, P.; HUETTER, R.; BRAUN, D. G.
Characterization Specificities of Monoclonal Antibodies to a Crystal Protein of
Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Infection and Immunity, 54(1):228 –232,
1986.
34. HUBER-LUKAC, M.; HERBST, H.; LUETHY, P. & BRAUN D. G. Monoclonal
Antibodies Against functionally distinct sites on deltaδ-Endotoxin of Bacillus
thuringiensis var. thurigiensis. Experientia, 38: 1103 –1105, 1982.
35. HUBER-LUKAC, M.; LUTHY, P. & BRAUN, D. G. Specificities of Monoclonal
Antibodies Against the Activated δ-Endotoxin of Bacillus thuringiensis var.
thurigiensis. Infection and Immunity, 40 (2): 608–612, 1983.
36. KARMALI, A. & DOMINGOS, A. Monoclonal antibodies against urease from
Canavalia ensiformis. Biochimie, 73 (11): 1001-1006, 1993.
57
37. KHAN, M. R. & FORD, J. B. The distribution and localization of digestive
enzymes in the alimentary canal an salivary glands of the cotton stainer Dysdercus
fasciatus. J. Insect Physiol., 13: 1619-1628, 1967.
38. KING TP. Lectin cytochemistry and intestinal epithelial cell biology. Pusztai A and
Bardocz S, ed. Lectins – Biomedical Perspectives. London UK.: Taylor & Francis,
183-210. 1995.
39. KOHLER, G. & MILSTEIN, C. Continuos cultures of fused cells secreting
antibody of predefined specificity. Nature, 256: 495-497, 1975.
40. KURAHASHI, H.; ATIWETIN, P.; NAGAOKA, S.; MIYATA, S.; KITAJIMA, S.;
SUGIMURA, Y. Absorption of mulberry root urease to the hemolymph of the
silkworm, Bombyx mori. Jounal of Insect Physiology, 51:1055-1061, 2005.
41. LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685. 1970.
42. LAUREMA, S.; VARIS, A L. & MIETTINEN, H. Studies on enzymes in the
salivary glands of Lygus rugulipennis (Hemiptera: Miridae). Insect Biochem., 15:
211-224, 1985.
43. LEENAARS, M. & HENDRIKSEN C. F. M. Critical Steps in the Production of
Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations. ILAR
Journal, 46(3): 269 -279, 2005.
44. LITTLE, M.; KIPRIYANOV, S. M.; LE GALL, F. & MOLDENHAUER, G. Of
mice and men: hybridoma and recombinant antibodies. Immunology Today, Vol.
21(8): 364-370, 2000.
58
45. MENEGASSI, A.; WASSERMANN, G. E.; OLIVERA-SEVERO, D.; BECKER-
RITT, A. B.; MARTINELLI, A. H. S.; FEDER, V.; CARLINI, C. R. Urease from
cotton (Gossypium hirsutum) seeds: isolation, physicochemical characteriztion and
antifungal properties of the protein. ARTIGO SUBMETIDO. 2007.
46. MILANO, P.; CONSOLI, F. L.; ZERIO, N. G. & PARRA, J. R. P. Thermal
requirements of the cotton stainer Dysdercus peruvianus Guerin-Menenville
(Heteroptera: Pyrrhocoridae). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, 28:233-
238, 1999.
47. MILES, P. W. The saliva of Hemiptera. Adv. Insect Physiol., 9: 183-255, 1972.
48. MOBLEY, H. L.; ISLAND, M. D. & HAUSINGER, R. P. Molecular biology of
microbial ureases. Microbiol. Rev., 59:451-480, 1995.
49. MULINARI, F.; STANISÇUASKI, F.; BERTHOLDO-VARGAS, L. R.; POSTAL,
M.; OLIVEIRA-NETO, O. B.; RIGDEN, D. J.; GROSSI-DE-SÁ, M. F.; CARLINI,
C. R. Jaburetox-2Ec: an insecticidal peptide derived from an isoform of urease from
the plant Canavalia ensiformis. Peptides, 28: 2042-2050, 2007.
50. MULROONEY, S. B.; PANKRATZ, H. S. & HAUSINGER, R. P. Regulation of
gene expression and celular localization of clone Klebsiella aerogenes (K.
Pneumoniae) urease. J. Bacteriol., 135: 1769-1776, 1989.
51. NAGATA, K.; MIZUTA, T.; TONOKATU, Y.; FUKUDA, Y.; OKAMURA, H.;
HAYASHI, T.; SHIMOYAMA, T. AND TAMURA, T. Monoclonal antibodies
against the native urease of Helicobacter pylori: synergistic inhibition of urease
activity by monoclonal antibody combinations. Infection and Immunity, 60(11):
4826-4831, 1992.
59
52. OLIVEIRA, A. E. A.; GOMES, V. M.; SALES, M. P.; FERNANDES, K. V. S.;
CARLINI, C. R.; XAVIER-FILHO, J. The toxicity of jack bean Canavalia
ensiformis(L.) DC. Canatoxin to plant pathogenic fungi. Ver. Brasil. Biologia, 59:
59-62, 1999.
53. OLIVEIRA-SEVERO D.; WASSERMANN G. E.; CARLINI C.R. Ureases display
biological effects independent of enzymatic activity. Is there a connection to
diseases caused by urease-producing bacteria? Braz. J. Med. Biol. Res., 39:851-861,
2006.
54. OUCHTERLONY, O. Progr. All. 5:1. 1958.
55. PAES, N. S.; GERHARDT, I. R.; COUTINHO, M. V.; YOKOYAMA, M.;
SANTANA, E.; HARRIS, N.; CHRISPEELS, M. J.; GROSSI DE SÁ, M. F. The
effect of arcelin-1 on the structure of the midgut of bruchid larvae and
immunolocalization of the arcelin protein. Journal of Insect Physiology, 46:393-
402, 2000.
56. PIGGOT, C. R.; ELLAR, D. J. Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal
toxin activity. Microbiol. Molec. Biol. Rev., 71(2):255-281, 2007.
57. PIOVESAN, A. R. Processamento de urease de Canavalia ensiformis por ninfas e
adultos de Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). Trabalho de
Conclusão, Curso de Ciências Biológicas Ênfase Molecular, Celular e Funcional,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS, Porto Alegre, RS, 2007.
58. POLACCO, J. C. & HOLLAND, M. A. Roles of urease in plant-cells. Internacional
Review of Cytology – A Survey of Cell Biology, 145:65-103, 1993.
60
59. POLACCO, J. C. & WINKLER, R. G. Soybean leaf urease – A seed enzyme. Plant
Physiol., 74: 800-803, 1984.
60. REAL-GUERRA, R. Aspectos biológicos e estruturais das ureases de Canvalia
ensiformis. Dissertação de Mestrado. Programa de pós-graduação em Biologia
Celular e Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS,
2007.
61. REICHE, N.; JUNG, A.; BRABLETZ, T.; VATER, T.; KIRCHNER, T.; FALLER,
G. Generation and Characterization of human monoclonal scFv antibodies against
Helicobacter pylori antigens. Infection and Immunity., 4158-4164, 2002.
62. RODEMBUSCH, F. S.; LEUSIN, F. P.; MEDINA, L. F. C.; BRANDELLI, A.;
STEFANI, V. Synthesis and spectroscopic characterization of new ESIPT
fluorescent protein probes. Photochem. Photobiol. Sci., 4:254-259. 2005.
63. SAXENA, K. N. Digestion and absorption of carbohydrates in the alimentary canal
of the red cotton bug, Dysdercus koenigii. Fabr. (Hemiptera: Pyrrhocoridae).
Physiol. Zool., 31: 129-138, 1958.
64. SILVA, C. P. & TERRA, W. R. Digestive and absorptive sites along the midgut of
the cotton seed sucker bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae).
Insect Biochem. Mol. Biol., 24: 493-505, 1994.
65. SILVA, C. P.;RIBEIRO, A. F.;GULBENKIAN, S. & TERRA, W. R. Organization,
origin and function of the outer microvillar (perimicrovillar) membranes of
Dysdercus peruvianus (Hemiptera) midgut cells. J. Insect Physiol., 41: 1093-1103,
1995.
61
66. SIRKO, A. & BRODZIK, R. Plant ureases: roles and regulation. Acta Biochimica
Polonica, 47:1189-1195, 2000.
67. STANISÇUASKI, F. Ureases de Canavalia ensiformis: Processamento e
mecanismo de ação em insetos. Tese de doutorado. Pós-Gradualção em Biologia
Celular e Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS, Porto
Alegre, RS, 2007.
68. STANISÇUASKI, F., FERREIRA-DASILVA, C. T.; MULINARI, F.; PIRES-
ALVES, M.; CARLINI, C. R. Insecticidal efects of canatoxin on the cotton stainer
bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). Toxicon, 45: 753-760,
2005.
69. STANISÇUASKI, F., TE BRUGGE, V., CARLINI, C. R. & ORCHARD, I. Effect
of Canavalia ensiformis urease and the derived peptide Jaburetox 2Ec on Rhodnius
prolixus Malpighian tubules. 46
th
Annual Meeting of the Canadian Society of
Zoologist, Montreal, Cánada, 2007.
70. SUMNER, J. B. & HOWELL, S. F. Identification of the hemagglutinin of jack bean
with Con A. J. Bacteriol., 32: 227, 1936.
71. SUMNER, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. J. Biol.
Chem., 69: 435 – 441, 1926.
72. TAKANONA, T. & HORI, K. Digestive enzimes in the salivary glands and midgut
of the bug Stenotus binotatus. Comp. Biochem. Physiol., 47
A
: 521-528, 1974.
73. WANG, J. H. & TARR, D. A. On the mechanism of urease action J. Am. Chem.
Soc., 77:6205-6206, 1955.
62
74. WEATHERBURN, M. W. Phenol-hypochlorite reaction for determination of
ammonia. Analytical Chemistry, 39: 971-974. 1967.
75. UBATUBA, F. B. Ocurrence of a trypsin inhibiting factor in the seeds of Canavalia
ensiformis. Ver. Bras. Biol., 15: 1 – 8, 1955.
76. VEIGA, A.B.G., BLOCHTEIN, B., GUIMARÃES, J.A, 2001. Structures involved
in production, secretion and injection of the venom produced by the caterpillar
Lonomia obliqua (Lepidoptera, Saturniidae). Toxicon 39, 1343-1351.
77. ZERNER, B. Recent advances in the chemistry of an old enzyme, Urease.
Bioorganic Chemestry, 19: 116 – 131, 1991.
63
ANEXO 1
64
CURRICULUM VITAE
(Postal, M.)
1 - DADOS PESSOAIS
Nome: Melissa Postal
Nascimento: 21/10/1980 - São Jorge/RS - Brasil
Endereço profissional: Laboratório de Proteínas Tóxicas, Departamento de Biofísica, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul. Av. Bento Gonçalves,9500, Prédio 43422, SALA 204, CEP. 9150-
970. Porto Alegre, RS
2 - FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
2005 - Mestrado em Biologia Celular e Molecular.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil
Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
2000 - 2004 Graduação em Ciências Biológicas. Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
UFRGS, Porto Alegre, Brasil
3 – FORMAÇÃO COMPLEMENTAR
2006 – PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS.
Curso do Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia – CBAB. Universidade
Federal de Santa Catarina, Florianópolis,SC.
65
4 - ESTÁGIOS
2001 –2002: FAPERGS – Análise ambiental da Bacia Hidrográfica do Arroio
Itapuã: Moluscos. Laboratório de Malacologia, Departamento de Zoologia,
UFRGS. Orientação: Ingá L. V. Mendes.
2002 – 2003: CNPQ – Microanatomia do trato digestivo de formas jovens de
Dysdercus peruvianus (Hemíptera, Pyrrhocoridae). Laboratório de Proteínas
Tóxicas, UFRGS. Orientação: Célia R. Carlini.
2003 – 2004: PIBIC/CNPQ – Identificação de tecidos alvos de ureases no
percevejo Dysdercus peruvianus. Laboratório de Proteínas Tóxicas, UFRGS.
Orientação: Célia R. Carlini.
5 - CAPÍTULOS DE LIVROS PUBLICADOS
1. MENDES, Inga Ludmila Veitheimer, POSTAL, M.
Os Moluscos In: Análise ambiental da bacia hidrográfica do Arroio Itapuã: Caderno para Educação
Ambiental.1 ed.Porto Alegre : Gráfica daUFRGS, 2002, v.1, p. 1-104.
6 – ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS:
1. MULINARI, F.; STANISÇUASKI, F.; BERTHOLDO-VARGAS, L. R.; POSTAL, M.;
OLIVEIRA-NETO, O. B.; RIGDEN, D. J.; GROSSI-DE-SÁ, M. F.; CARLINI, C. R.
Jaburetox-2Ec: an insecticidal peptide derived from an isoform of urease from the plant
Canavalia ensiformis. Peptides, 28: 2042-2050, 2007.
66
7 – COMUNICAÇÕES E RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE
CONGRESSOS OU PERIÓDICOS (RESUMO)
1. POSTAL, M., STANICUASKI, F., SETEMBRINI, B., KREUTZ, F., CARLINI, C. R.
Produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de Canavalia
esnsiformis e Imunolocalização de tecidos alvos da toxina em insetos suscetíveis In: VIII Reunião
Anual do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de Biotecnologia
da Ufrgs, 2006, Porto Alegre.
Livro de resumos PPGBCM. , 2006. p.01 - 137
2. POSTAL, M., CARLINI, C. R.
Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de urease de
Canavalia ensiformis In: VII reunião anual do programa de pós-graduação em biologia celular e
molecular do centro de biotecnologia da UFRGS, 2005, porto alegre.
PPGBCM: Livro de Resumos. , 2005.
3. STANICUASKI, F., POSTAL, M., CARLINI, C. R.
Proteolysis of Canatoxin: Characterization of Callosobruchus maculatus Digestive Enzymes
Involved in the Process. In: XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e
Biologia Molecular, 2005, Aguas de Lindóia.
Livro de Resumos da XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e
Biologia Molecular. , 2005.
4. POSTAL, M., STANICUASKI, F., BLOCHTEIN, B., CARLINI, C. R.
Identificação de tecidos alvos de ureases no percevejo Dysdercus peruvianus In: XX Congresso
Brasileiro de Entomologia, 2004, Gramado.
XX Congresso Brasileiro de Entomologia. , 2004.
67
5. STANICUASKI, F., POSTAL, M., SALVADORI, J., CARLINI, C. R.
Isolamento e Caracterização das Enzimas Digestivas de C. maculatus Responsáveis pelo
Processamento da CNTX In: XX Congresso Brasileiro de Entomologia, 2004, Gramado.
XX Congresso Brasileiro de Entomologia. , 2004. v.U.
6. POSTAL, M., STANICUASKI, F., CARLINI, C. R., BLOCHTEIN, B.
Histological Analyses of Canatoxin Effects on the Digestive Tract of Dysdercus
peruvianus(Hemiptera; Pirrhocoridae) Nymphs. In: XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq, 2003, Caxambu.
XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq. ,
2003.
7. STANICUASKI, F., POSTAL, M., Ferreira-da-Silva, C, CARLINI, C. R.
Insecticidal Effect of Canatoxin in Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) dependent on
the life cycle stage. Partial Characterization of Digestive Enzymes of nymphs and adults. In: XXXII
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Biologia molecular - SBBq, 2003, Caxambu.
XXXII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Biologia molecular - SBBq. , 2003.
8. STANICUASKI, F., POSTAL, M., SALVADORI, J., CARLINI, C. R.
Isolamento e caracterização das enzimas digestivas de insetos envolvidas pelo processamento da
CNTX In: V Reunião anual do programa de pós-graduação em biologia celular e molecular do
centro de biotecnologia da UFRGS, 2003, Porto Alegre.
Livro de Resumos PPGBCM. , 2003. v.U.
9. POSTAL, M., STANICUASKI, F., CARLINI, C. R., BLOCHTEIN, B.
Microanatomia do trato digestivo de formas jovens de Dysdercus peruvianus (Hemiptera;
Pyrrrhocoridae) In: V Reunião Anual do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
68
Molecular do Centro de Biotecnologia da UFRGS, 2003, Porto Alegre.
Livro de Resumos PPGBCM. , 2003. v.u.
10. STANICUASKI, F., POSTAL, M., Ferreira-da-Silva, C, CARLINI, C. R.
Efeito inseticida da canatoxina em diferentes estágios de Dysdercus peruvianus (Hemiptera:
Pyhrrocoridae). Caracterização das enzimas envolvidas In: XIV Salão de Iniciação Científica da
UFRGS, 2002, Porto Alegre.
XIV Salão de Iniciação Científica da UFRGS. , 2002.
11. POSTAL, M., STANICUASKI, F., Ferreira-da-Silva, C, CARLINI, C. R., BLOCHTEIN, B.
Microanatomia do trato digestivo de formas jovens de Dysdercus peruvianus (Hemiptera;
Pyrrhocoridae) In: XIII Salão de Iniciação Científica da UFRGS, 2002, Porto Alegre.
XIII Salão de Iniciação Científica da UFRGS. , 2002.
12. MENDES, I. L. V., POSTAL, M.
Análise ambiental da bacia hidrográfica do Arroio Itapuã: moluscos In: XXIV CONGRESSO
BRASILEIRO DE ZOOLOGIA, 2001, ITAJAÍ.
8 – ATUAÇÃO PROFISSIONAL
2004/02 – 2005/01: CNPQ – Bolsista de apoio técnico de Nível superior.
Laboratório de Proteínas Tóxicas, Departamento de Biofísica, UFRGS.
2007( junho – outubro): Programa de Combate à Dengue da Prefeitura Municipal
de Porto Alegre: Processo seletivo 1/07 para Admissão Temporária - Função:
Supervisor de Campo.
69
ANEXO 2
70
71
72
73
74
75
76
77
78
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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