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LÍVIA SANTOS CAPEL
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE PORTA-ENXERTOS DE VIDEIRA
EMPREGANDO MARCADOR MOLECULAR RAPD
MARINGÁ
PARANÁ – BRASIL
FEVEREIRO - 2008
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LÍVIA SANTOS CAPEL
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE PORTA-ENXERTOS DE VIDEIRA
EMPREGANDO MARCADOR MOLECULAR RAPD
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual de Maringá, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Genética e Melhoramento, para obtenção
do título de Mestre.
MARINGÁ
PARANÁ – BRASIL
FEVEREIRO – 2008
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Capel, Lívia Santos
C238c Caracterização genética de porta-enxertos de
videira empregando marcador molecular RAPD / Lívia
Santos Capel. -- Maringá : [s.n.], 2008.
49 f. : il.
Orientadora : Prof. Dr. Claudete Aparecida
Mangolin.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento, 2008.
1. Uva - Porta-enxertos - Identificação. 2. Uva -
Porta-enxertos - Variedades. 3. Uva - Porta-enxertos
- Norte e Noroeste do Paraná. 4. Uva - Porta-
enxertos - RAPD. I. Universidade Estadual de
Maringá, Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento. II. Título.
CDD 21.ed.634.8
ii
Dedico todo o meu trabalho àqueles que considero um presente de Deus, que
sempre me apoiaram e me encorajaram em mais uma jornada de minha vida:
Meus pais, José Luiz e Maria Iraci, meus irmãos: Laís, Luiz A. e Júnior;
e meu Esposo: André...
À vocês minha gratidão e todo o meu amor...
iii
AGRADECIMENTO
A Deus, por iluminar sempre minha caminhada e oportunizar meu
crescimento.
À Universidade Estadual de Maringá, à Coordenação e aos funcionários do
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, pela oportunidade de
realizar este curso.
Ao CNPq, pela apoio financeiro, através de bolsa de estudo.
À professora, orientadora e amiga, doutora Claudete Aparecida Mangolin,
pelo seu exemplo de ética profissional, pelo aprendizado, crescimento e carinho
proporcionado.
À COROL - Cooperativa de Rolândia, pelo material biológico de
variedades de uva analisado neste estudo.
À Embrapa - Centro Nacional de Pesquisa em Uva e Vinho (Bento
Gonçalves-RS), pelo fornecimento das estacas da variedade Kober 5BB.
À professora doutora Sandra e às queridas amigas, Adriana e Márcia, que
me forneceram os primeiros ensinamentos sobre as técnicas de trabalho em
laboratório e manuseio de equipamentos, auxiliando no desenvolvimento das
pesquisas.
Às professoras doutora Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki e doutora
Ana Silvia Helena Zequim Maia, e aos Professores doutor José Ricardo e doutor
Erasmo Renesto, pelos maravilhosos momentos de convivência e aprendizado.
Aos técnicos de laboratório, Sérgio e Leila, pelo auxílio durante o
desenvolvimento deste trabalho e, principalmente, pela amizade que construímos.
A todos os amigos dos laboratórios “17” e “21”, pelo carinho e incentivo.
Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram com mais esta vitória.
iv
BIOGRAFIA
Lívia Santos Capel é natural de Paranavaí, Estado do Paraná. Nasceu em 17
de maio de 1982. Filha de José Luiz Barbosa Capel e Maria Iraci dos Santos Capel.
Casada com André Ivan Bernardin Mânica.
Realizou o ensino fundamental na Escola Estadual Newtom Guimarães na
cidade de Paranavaí - PR, sendo este completado no ano de 1992. Posteriormente,
na mesma cidade, realizou inicialmente o curso de ensino médio no Colégio
Estadual Bento Munhoz da Rocha Neto, sendo concluído no Colégio Paroquial, no
ano de 1996. Os estudos de segundo grau foram realizados no período de 1997 a
1999 no Colégio Nobel de Paranavaí.
Graduada em Ciências Biológicas com ênfase em Biotecnologia, em
dezembro de 2004, obteve habilitação em licenciatura plena e bacharelado, pela
Universidade Paranaense – UNIPAR campus Paranavaí - PR.
Como Professora Substituta da Secretaria do Estado do Paraná, ministrou
aulas de biologia e ciências no último bimestre de 2006 no Colégio Estadual
Rodrigues Alves.
Ingressou, em março de 2006, no Programa de Pós-graduação de Genética e
Melhoramento da Universidade Estadual de Maringá – UEM.
v
ÍNDICE
RESUMO ................................................................................................................... vii
ABSTRACT .............................................................................................................. viii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................ 4
2.1. Origem da videira .......................................................................................................... 4
2.2. Classificação botânica ................................................................................................... 5
2.3. A uva no Brasil e no Município de Marialva ................................................................ 6
2.4. Propagação da videira ................................................................................................... 7
2.5. Porta-enxertos de uva .................................................................................................... 8
2.6. Porta-enxertos estudados ............................................................................................. 10
2.6.1. Kober 5BB e 420-A ................................................................................................. 10
2.6.2. Schwarzmann ........................................................................................................... 11
2.6.3. IAC-766 - Campinas ................................................................................................ 12
2.6.4. Traviú ....................................................................................................................... 13
2.6.5. IAC-572 - Jales ........................................................................................................ 14
2.7. Identificação dos porta-enxertos ................................................................................. 15
2.7.1. Ampelografia ............................................................................................................ 16
2.7.2. Marcadores bioquímicos .......................................................................................... 17
2.7.3. Marcadores moleculares ........................................................................................... 18
2.8. Marcadores Moleculares em Vitis ............................................................................... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 22
3.1. Variedades de porta-enxerto de uva ............................................................................ 22
3.2. Extração do DNA de folhas das variedades de porta-enxerto de uva ......................... 23
3.3. Avaliação e quantificação dos DNAs extraídos .......................................................... 24
3.4. Amplificação do DNA e seleção de primers ............................................................... 25
3.5. Análise dos resultados ................................................................................................. 26
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................................................... 27
5. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 37
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 38
vi
RESUMO
CAPEL, Lívia Santos. M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, fevereiro de 2008.
Caracterização Genética de Porta-enxertos de Videira Empregando Marcador
RAPD. Professora Orientadora: Dra. Claudete Aparecida Mangolin. Professores
Conselheiros: Dra. Maria de Fátima Pires da Silva Machado e Dra. Maria Cláudia
Colla Ruvolo Takasusuki.
A identificação das variedades de porta-enxertos de uva através de caracteres
fenológicos não é segura e tem gerado problemas para os viticultores. Assim, a
proposta deste estudo foi caracterizar, através de RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA), as variedades de porta-enxertos de uva plantadas nas regiões
Norte e Noroeste do Paraná. Os resultados poderão ser úteis para esclarecer dúvidas
quanto à identificação destas variedades. O DNA das variedades dos porta-enxertos
420-A, Schwarzmann, IAC-766 – Campinas, Traviú, Kober 5BB, e IAC-572 – Jales
foi extraído e amplificado, utilizando-se 17 primers para RAPD que resultou em
247 fragmentos, conferindo um polimorfismo total para estas variedades de
87,04%. A freqüência diferencial para os fragmentos amplificados determinou uma
divergência genética entre os porta-enxertos de 0,7094. A maior identidade genética
foi entre as variedades IAC-766 - Campinas e Schwarzmann (83,22%) e a menor foi
encontrada entre as variedades Kober 5BB e 420–A (61,96%). No dendrograma
obtido, foi possível a identificação de um grupo formado pelas variedades 420–A,
Schwarzmann e IAC–766 – Campinas. Os porta-enxertos, Traviú, IAC–572 - Jales
e Kober 5BB não formaram grupos, refletindo, assim, a grande divergência
encontrada entre eles. A amplificação do DNA com os primers OPB-4, OPB-5 e
OPP-17 produziram fragmentos específicos para os porta-enxertos 420-A e IAC-
512 – Jales; os primers OPB-1, OPB-3, OPB-4 e OPB-11 produziram fragmentos
específicos para a variedade Kober 5BB. Estes fragmentos específicos poderão ser
utilizados como marcadores dos genótipos IAC-522 – Jales, 420-A e Kober 5BB.
Desta forma as variedades Kobber 5BB e 420-A freqüentemente confundidas,
poderão ser molecularmente distinguidas.
Palavras-chave: Vitis, Porta-enxerto, RAPD.
vii
ABSTRACT
CAPEL, Lívia Santos. M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, february 2008.
Genetic Characterization of Vine Rootstock by RAPD marker. Adviser
Professor: Dra. Claudete Aparecida Mangolin. Committee Members: Dra. Maria de
Fátima Pires da Silva Machado and Dra. Maria Cláudia Colla Ruvolo Takasusuki.
Identification of several vine rootstocks by phenomenological traits lacks security
and has brought about certain problems for vine cultivators. In current analysis
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) characterizes several rootstocks of
vine planted in the northern and northwestern regions of the state of Paraná. Results
may be useful to explain identification of these varieties. DNA of rootstock
varieties 420-A, Schwarzmann, IAC-766 – Campinas, Traviú, Kober 5BB, and
IAC-572 – Jales has been extracted and amplified by 17 primers. The 247 fragments
assured total polymorphism (87.04%) for these varieties. Differential frequency for
amplified fragments determined a 0.7094 genetic divergence between the
rootstocks. Highest genetic identity (83.22%) has been detected between IAC-766 -
Campinas and Schwarzmann (83.22%) and the lowest (61.96%) between Kober
5BB and 420–A. Dendrogram also identified a group made up of varieties 420–A,
Schwarzmann and IAC–766 – Campinas. Rottstocks Traviú, IAC–572 - Jales and
Kober 5BB did not make up groups and thus showed high divergence among them.
DNA amplification by primers OPB-4, OPB-5 and OPP-17 produced fragments
which were specific to rootstocks 420-A and IAC-512 – Jales; primers OPB-1,
OPB-3, OPB-4 and OPB-11 produced fragments specific to Kober 5 BB. Specific
fragments may be used as markers for genotype IAC-522 – Jales, 420-A and Kober
5BB. The frequently mixed up varieties Kobber 5BB and 420-A may actually be
distinguished on a molecular basis.
Key words: Vitis, rootstock, RAPD.
1
1. INTRODUÇÃO
A videira é uma das plantas frutíferas mais conhecidas desde a antiguidade,
podendo ser encontrada em fósseis de épocas geológicas anteriores ao aparecimento
do homem na Terra (Pio Corrêa, 1926). Sousa (1996) também relata que a videira
surgiu no período terciário, milhões de anos antes do aparecimento do homem,
provavelmente na atual Groenlândia, conforme comprovam os achados
arqueológicos.
De acordo com Sousa (1996), o homem, que se alimentava do fruto, através
da evolução de seus conhecimentos, aprendeu a fabricar produtos a partir da uva,
como o vinho, a passa e o suco, e também entendeu que, para melhor tirar proveito
da videira, é preciso conhecer de modo mais profundo esta planta, desde sua origem,
suas espécies e variedades, bem como suas características inerentes. Tais
conhecimentos são importantes para superar os obstáculos advindos da evolução das
doenças e adaptar a cultura aos mais variados climas e solos, a fim de obter
produções em maior quantidade e com melhor qualidade.
A videira pode ser propagada de forma sexuada (por semente) ou assexuada
(por via vegetativa). As sementes são úteis para o melhoramento genético, para a
obtenção de novas variedades (Hidalgo, 1993). Entretanto, na Europa, em meados do
século XIX, a propagação por via vegetativa, através da técnica de enxertia, passou a
ser uma prática obrigatória após a invasão da filoxera (Daktulosphaira vitifoliae)
(Fitch, 1855), um pulgão sugador das raízes. O sistema radicular da espécie Vitis
vinifera é extremamente sensível à ação deste inseto, que pode ocasionar a morte da
planta. Assim, o uso de porta-enxertos resistentes tornou-se a única forma de controle
deste parasita e, conforme salienta Ribas (1957), o uso de porta-enxertos não só
proporcionou à videira resistência à filoxera, como também permitiu o
aproveitamento de muitos tipos de solos, antes tidos como inadequados para a
viticultura. Desta forma, a maioria dos vinhedos brasileiros é formado através do
plantio dos porta-enxertos no local do futuro vinhedo, para posterior enxertia no
campo das cultivares produtoras.
2
No noroeste do estado do Paraná, o município de Marialva destaca-se como
o maior produtor de uvas finas deste estado, contando com mais de 1.000 hectares de
parreiras em produção, todas elas formadas com plantas enxertadas. Nesta região, os
porta-enxertos mais usados são: o IAC-766 - Campinas, o IAC-572 – Jales, o 420-A,
o IAC 313-Tropical, Kober 5BB, o Schwarzmann e o Traviú e (Kishino et al., 2007).
O porta-enxerto Kober 5BB é um cruzamento entre Vitis berlandieri x V.
riparia e é bastante utilizado na região de Marialva; apresenta vigor médio e boa
adaptação a diferentes tipos de solo e boa resistência à seca e às doenças fúngicas
(Pommer et al., 1997). Em muitos casos, esse porta-enxerto era confundido com o
420-A, que é menos vigoroso, menos produtivo e usado em pequena escala somente
no Rio Grande do Sul. Essa informação, segundo Camargo (1998), é importante, uma
vez que o produtor pode adquirir o verdadeiro 420-A e obter resultados aquém do
esperado.
O 420-A, segundo Camargo (1998), conforme mencionado acima, é um
porta-enxerto pouco vigoroso e de difusão restrita; apresenta certa dificuldade de
enraizamento, mas tem mostrado bons resultados práticos no cultivo de Cabernet
Sauvignon. Pode ser uma boa opção para o cultivo de uvas para a elaboração de
vinhos finos.
Pertencente ao grupo de híbridos entre V. riparia x V. rupestris, o porta-
enxerto Schwarzmann é dotado de aptidão edáfica semelhante ao 101 – 14. Em
terrenos pobres, pode apresentar um desenvolvimento deficiente, preferindo, assim,
terrenos profundos, férteis, frescos e pouco calcários, como informa Pastena (1981).
No grupo de híbridos complexos estão incluídos o IAC-766 - Campinas e o
Traviú. O IAC-766 - Campinas foi obtido a partir do cruzamento 106-8 Mgt [V.
riparia x (V. rupestris x V. cordifolia)] x V. tiliifolia, realizado por Santos Neto em
1958. Este híbrido apresenta alto vigor e boa adaptação às condições edafo-climáticas
paulistas; suas folhas são bastante resistentes às doenças (Pommer et al., 1997). O
IAC-766 – Campinas também é um porta-enxerto bastante usado na região Norte do
Paraná para a cultivar Itália e suas mutações Rubi e Benitaka (Camargo, 1998;
Kishino et al., 2007). Em contrapartida, o Traviú foi produzido a partir do
cruzamento entre V. riparia x (V. cordifolia x V. rupestris 106 – 8) e apresenta uma
3
adaptação similar à do 104 – 14 preferindo, porém, solos mais frescos, como informa
Sousa (1969). Por outro lado, parece possuir também boa resistência à secura e
simultaneamente boa adaptação a terrenos argilosos e úmidos.
O IAC-572 – Jales é oriundo do cruzamento entre V. tiliifolia x 101 – 14
Mgt, realizado, em 1954, no IAC (Camargo, 1998). A partir do início da década de
90, este porta-enxerto tem sido bastante difundido em todas as regiões vitícolas
tropicais do país, sob a etiqueta “Tropical sem vírus”. Apresenta alto vigor, é
adaptado tanto a solos argilosos como arenosos, folhas resistentes às principais
doenças, ótimo enraizamento e pegamento (Pommer et al., 1997).
Entretanto, a identificação destas variedades através de caracteres
fenológicos não é totalmente segura e tem gerado eventualmente problemas para os
viticultores. Análises de polimorfismos de fragmentos de DNA aleatoriamente
amplificados ainda não foram realizadas para estas variedades, portanto a proposta
deste estudo foi caracterizar, através de RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA), as variedades de porta-enxertos de uva plantadas nas regiões Norte e Noroeste
do Paraná com a finalidade de obter resultados que possam ser úteis para esclarecer
dúvidas quanto à identificação de variedades de porta-enxerto de uva.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Origem da videira
A videira é uma das plantas frutíferas mais conhecidas desde a antiguidade,
podendo ser encontrada entre fósseis de épocas geológicas anteriores mesmo ao
aparecimento do homem na Terra; é originária do árido Cáucaso, na Ásia, sendo a
uva uma das frutas mais antiga utilizada na alimentação humana e sendo a sua
produção espalhada por todo o mundo. Sua origem data de 6.000 aC; Sousa (1996),
relata que no período quaternário iniciou-se a era glacial, que cobriu a Terra com um
enorme manto de gelo, obrigando a videira a refugiar-se para regiões menos atingidas
pelo rigoroso inverno: o continente americano, europeu e asiático-ocidental.
Janick e Moore (1975), Huglin (1986) e Sousa (1996) consideram que, como
resultado da separação da videira em diversos centros de refúgios, durante o período
glacial, as videiras sofreram adaptações climáticas, que, posteriormente, com o
cultivo pelo homem durante milhares de anos, determinaram o surgimento de
variações. Desse modo, existem diversas espécies e milhares de variedades
espalhadas por todo o mundo. Por outro lado, a origem de muitas variedades
importantes para a produção de vinho cultivadas atualmente deve ter sido perdida
num passado distante (Janick e Moore, 1975; Sousa, 1996). A cultura da uva, que é
permanente e de longa duração (alguns vinhedos chegam a durar até 150 anos), só se
tornou possível no meio das comunidades que abandonaram o nomadismo. Fixo à
terra, pouco a pouco, de geração em geração, o homem foi aprimorando as técnicas
de cultivo e de processamento da fruta.
Segundo os registros de Pio Corrêa (1926), foi por volta do ano 600 antes de
Cristo que o homem aprendeu a podar a videira para obter uma abundante e saborosa
carga de frutos, um salto definitivo na melhoria das técnicas de produção da fruta.
Foram os romanos, por sua vez, que transformaram a viticultura em um comércio
lucrativo, enchendo as paisagens mediterrâneas de videiras. As uvas desta época,
ainda por vários séculos depois disso, destinavam-se, basicamente, à produção de
5
vinho. Somente por volta de 1950, surgiram os primeiros empreendimentos de
proporções e finalidades comerciais.
O gênero Vitis L. é bastante diverso, compreende 40 a 60 espécies na Ásia,
cerca de 25 na América do Norte e uma só espécie européia a Vitis vinifera L. Esta é
a principal espécie cultivada hoje, enquanto as outras espécies são utilizadas
principalmente para programas de melhoramento de porta-enxerto e cultivares
resistentes aos fungos. Estima-se que existe 6.000 cultivares de V. vinifera L.
(Alleweldt e Dettweiler, 1994) e destas menos de 400 são comercialmente
importantes (Galet, 2000). As diferentes cultivares ou variedades são adaptadas a
vários tipos de solo e de clima, o que possibilita o seu cultivo em quase todas as
regiões do mundo.
Sendo frutas bastante sensíveis às condições do solo e do clima em que se
desenvolvem, as uvas variam muito de acordo com essas condições, apresentando
características que as distinguem segundo o sabor, a acidez, a doçura, o formato, a
coloração e a resistência da casca, o tamanho, a quantidade de sementes, a forma e o
formato dos cachos. As que não são cultivadas servem como fonte de material
genético e hoje a maioria das fontes genéticas de V. vinifera L. são mantidas em
coleções de germoplasma.
2.2. Classificação botânica
A videira está classificada no Grupo Cormófitas, da Divisão Spermatophyta,
da Subdivisão Angiospermae, da Classe Dicotiledoneae, da Ordem Rhamnales, da
Família Vitaceae, do Gênero Vitis. Na família Vitaceae, o gênero Vitis é o único de
importância econômica, social e histórica, e a ele pertencem todas as videiras
terrestres selvagens ou cultivadas (Sousa, 1996). Dentro do gênero Vitis, distinguem-
se dois subgêneros: o Muscadinea que possui as espécies Vitis rotundifolia, V.
munsoniana e V. popenoi, e o Euvitis que compreende mais que 50 espécies (Sousa,
1996). As espécies também podem ser agrupadas geograficamente em Euvitis
Americanas, Euvitis da Ásia Oriental, e Euvitis Européias (Ásia Ocidental). De
6
acordo com Toda (1991), as espécies americanas constituem a base de obtenção de
porta-enxertos utilizados na viticultura. Estas apresentam uma maior ou menor
resistência à filoxera. A espécie Vitis vinifera apresenta sensibilidade total à filoxera
e a espécie V. rotundifolia apresenta imunidade total.
2.3. A uva no Brasil e no Município de Marialva
De acordo com Sousa (1996), no Brasil, a videira foi introduzida em São
Paulo, pela expedição colonizadora de Martin Afonso de Souza, em 1532. Em
Pernambuco, a primeira expedição capacitada a introduzir a videira foi a de Duarte
Coelho em 1535. Mas, comprovadamente, foi em 1542 que João Gonçalves
fomentou o cultivo da vinha da ilha de Itamaracá (Albuquerque, 1987).
Por muito tempo, segundo Pio Corrêa (1926), predominou por aqui a idéia de
que as condições ambientais não permitiriam jamais a cultura da videira, planta que
era considerada delicadíssima, e que só poderia produzir em alguns paises da “Velha
Europa”. Hoje, no entanto, a viticultura constitui-se em uma grande fonte de riquezas
para o País.
O Estado do Paraná é o maior fornecedor nacional de uva de mesa, durante o
período de novembro a janeiro e de março a final de junho, determinando, assim,
uma abertura de mercado onde entram poucos fornecedores. No noroeste do estado
do Paraná, o município de Marialva, localizado a uma latitude 23º29'06" sul e a uma
longitude 51º47'30" oeste, se localiza a leste de Maringá, sendo denominado como a
capital da uva fina de mesa, destacando-se pelo seu povo trabalhador e sua grande
produção de uvas finas, contando com 1.400 hectares de parreiras em produção,
todas formadas com plantas enxertadas e que ocupam em torno de 5.600 pessoas na
atividade. São 675 viticultores que colhem entre 10 e 12 mil toneladas de uvas finas,
obtendo uma produtividade média de 27 t/ha/ano (safrão + safrinha). A cultura da
uva tem sido o principal fator de desenvolvimento de Marialva-PR e de seus
produtores, gerando cerca de quatro empregos por hectare (www.seab.pr.gov.br).
7
Na região de Marialva, as cultivares predominantes são as cultivares com
sementes, destacando-se a Itália e suas mutações Niágara, Rubi, Benitaka e Brasil. As
variedades sem sementes representam uma área bem menor, destacando-se as
cultivares lançadas pela Embrapa Uva e Vinho - BRS Morena, BRS Clara e BRS
Linda, cujo interesse pelo cultivo tem aumentado muito nessa região, e também as
cultivares tradicionais como a Vênus e a Centennial Seedless (www.embrapa.br).
2.4. Propagação da videira
Por ser uma espécie cultivada há milhares de anos, a videira tem evoluído de
modo a adaptar-se às mais diversas situações de propagação e cultivo. A videira pode
ser propagada de forma sexuada (por semente) ou assexuada (por via vegetativa). As
sementes são úteis para o melhoramento genético, para a obtenção de novas
variedades (Hidalgo, 1993), pois a elevada segregação genética pode dar origem a
indivíduos com características diferentes dos parentais, o que é desejado pelos
melhoristas. Entretanto, a propagação de videiras através de sementes tem sido
desaconselhável, pois as novas plantas apresentam vigor, produtividade e qualidade
dos frutos inferiores aos da planta-mãe, além de prolongar o tempo para a formação
do vinhedo.
A propagação vegetativa baseia-se na facilidade que os ramos têm de emitir
brotos e raízes. Nesse tipo de propagação vegetativa, as plantas obtidas têm as
mesmas características da planta-mãe, a não ser que ocorra alguma mutação
(Hidalgo, 1993). Para os métodos de propagação vegetativa, usam-se os ramos do
ano e as técnicas mais empregadas são a estaquia e a enxertia (Fachinello et al., 1995;
Peruzzo, 1995).
De acordo com Sousa (1996), a partir do século XVIII, com o aumento do
intercâmbio mundial de material vegetativo, uma praga de raízes, a filoxera
(Daktulosphaira vitifoliae) (Fitch, 1855), foi introduzida na Europa. Esse inseto
provocou enormes danos nas videiras da Europa e de todo o mundo. A partir daí, as
videiras passaram a ser enxertadas sobre porta-enxertos resistentes e, atualmente, a
8
maioria dos vinhedos brasileiros é formado por meio do plantio dos porta-enxertos no
local do futuro vinhedo, para posterior enxertia no campo das cultivares produtoras
(Hidalgo, 1993; Fachinello et al., 1995; Peruzzo, 1995; Sousa, 1996).
2.5. Porta-enxertos de uva
No caso da viticultura, a única maneira de controlar a filoxera, é através do
uso de porta-enxertos resistentes (Boliani, 2002). Para Hartmann e Kester (1990) e
Fachinello et al. (1995), a propagação de porta-enxertos de videiras e de outras
plantas frutíferas por estaquia baseia-se no princípio de que é possível regenerar uma
planta a partir da planta-mãe. Para este processo, as estacas utilizadas podem ser
herbáceas, quando não possuem tecidos lignificados; lenhosas, com tecidos
lignificados; e semilenhosas ou semi-herbáceas, quando coletadas no início da
lignificação.
O domínio das técnicas de propagação é um importante passo no sucesso da
implantação de um parreiral. De acordo com Santos Jesus (1994), o método
tradicionalmente utilizado no sul do país é a enxertia praticada diretamente no campo
durante os meses de inverno; esta é realizada sobre porta-enxertos plantados no ano
anterior e em local definitivo ou enraizados em viveiro ou telado. Fachinello et al.
(1995) descrevem que a utilização de estacas lenhosas é bastante difundida e isso se
deve ao fato de essas apresentarem alta taxa de pegamento.
Os porta-enxertos de uva formam um complexo grupo de plantas. A maioria
deles são híbridos derivados de espécies nativas de Vitis norte americanas e estas são
usadas para conferir resistência à filoxera e também a problemas associados ao solo
(De Andres, 2007). Monteiro (1999) descreve que o material biológico inclui duas
partes distintas, o garfo e o porta-enxerto. A espécie Vitis vinifera, onde se incluem
as videiras produtoras dos vinhos atuais, é susceptível à filoxera. Tendo sido
constatado que outras Vitis eram resistentes a essa praga, estas foram introduzidas em
9
larga escala e hoje é uma prática normal o enxerto do tipo de V. vinifera desejado em
um porta-enxerto resistente.
Além de apresentar resistência à praga, o porta-enxerto influencia o
crescimento vegetativo, a produção e a qualidade do cacho da videira; ele sofre
grande interferência edafoclimática e responde diferentemente de acordo com a copa
sobre ele enxertada (Hartmann e Kester, 1990; Monteiro, 1999). Atualmente, um
número relativamente grande de porta-enxertos encontra-se disponível aos
produtores; porém, cada um deles apresenta suas vantagens e deficiências. Apenas
com a experimentação agrícola pode-se determinar com regular precisão qual é o
mais adequado para uma determinada cultivar e região (Pommer et al., 1997).
As condições fundamentais exigidas para um bom porta-enxerto na
viticultura incluem resistência à filoxera e ao nematóide, adaptação ao meio
ambiente, facilidade de propagação, afinidade satisfatória com as cultivares copa,
sanidade e desenvolvimento de acordo com o destino da produção (Ojima, et al,
1978; Hidalgo, 1993). O uso de porta-enxertos não só proporcionou à videira
resistência à filoxera, como também permitiu o aproveitamento de muitos tipos de
solos, antes tidos como inadequados para a viticultura, conforme salientado por Ribas
(1957).
Para os vitivinicultores, é importante saber a variedade exata que plantam
porque: variedades diferentes têm custos diferenciais; o tipo de viticultura desejada
requer variedades específicas; uvas e vinhos produzidos por variedades diferentes
têm características qualitativas, quantitativas e preços muito diversos; o viticultor é
legalmente responsável por assegurar que as castas declaradas são as que estão
plantadas (Ribas, 1957; Monteiro, 1999; Leão, 2003).
Para Alvarenga et al. (2002), na busca da combinação ideal entre porta-
enxertos e variedades copa, inúmeros trabalhos têm sido e deverão continuar sendo
realizados, isto porque são inúmeras as variáveis que atuam sobre essa combinação e
para cada uma das combinações pode haver um par ideal. Soma-se a essa condição o
avanço dos programas de melhoramento. Estes programas colocam no mercado
novas cultivares, tanto de copa quanto de porta-enxertos, obrigando os pesquisadores,
10
mais uma vez, a lançar mão de experimentações para encontrar o melhor porta-
enxerto para cada local.
2.6. Porta-enxertos estudados
2.6.1. Kober 5BB e 420-A
Kober 5BB é um porta-enxerto resultante de um cruzamento entre V.
berlandieri x V. riparia. Este cruzamento foi realizado por Sigmund Teleki, no final
do século XIX, e selecionado por Kober, na Áustria. Este porta-enxerto é bastante
utilizado no Norte do Paraná e tem sido muitas vezes confundido com o porta-
enxerto 420-A. Este último, com elevada resistência à filoxera e certa resistência aos
nematóides, é proveniente de outro cruzamento entre V. berlandieri x V. riparia,
obtido na França, no ano de 1887, por Millardet e De Grasset. Em São Paulo, é
recomendado como bom porta-enxerto para as variedades de uvas finas de mesa,
enquanto que no Rio Grande do Sul é pouco difundido (Camargo, 1998; Sousa e
Martins, 2002). Esta informação é extremamente importante, uma vez que, na busca
de material isento de vírus, o agricultor pode plantar o verdadeiro 420-A, oriundo de
instituições de pesquisa, e obter resultados aquém do esperado. Isso porque o 420-A
imprime pouco vigor à copa e, em conseqüência, produtividades menores que
aquelas obtidas com o Kober 5BB. Este problema foi observado em 1989 em
parreirais de Maringá-PR; mais tarde em Ivoti-RS e também na região de Jales-SP.
O porta-enxerto Kober 5BB difundiu-se com a cultura da variedade Itália,
difusão esta que se deve ao bom comportamento da cultivar Itália nele enxertada. O
Kober 5 BB é um porta-enxerto que apresenta um bom enraizamento e boa “pega” de
enxertia, imprimindo bom vigor e produtividade à copa. Adapta-se melhor a terrenos
fundos, aluviais, frescos e férteis, tolerando bem os solos argilosos e pobres,
enquanto manifesta boa resistência a nematóides e fungos. Há controvérsias quanto a
sua resistência à seca. Quanto à morfologia, as plantas da variedade Kober 5BB
possui ramos de coloração vermelha, pubescentes entre os nós e com extremidade
lanosa e esbranquiçada. As folhas jovens são aranhosas e cobreadas; as folhas adultas
11
grandes, quase inteiras, são cuneiformes, finas, com seio peciolar em U, sendo a face
superior glabra e a inferior mais clara e com tênue pubescencia. A planta da Kober
5BB produz flores femininas e os cachos formados são pequenos, com bagas
pequenas, esféricas e pretas (Sousa e Martins, 2002).
Morfologicamente, as plantas da variedade 420-A possuem ramos com
superfície um pouco estriada, glabros de coloração verde escura com nós violáceos
até a extremidade, contrastando com os entrenós. As folhas jovens são brilhantes e
verde-bronzeadas. As folhas adultas são inteiras, as basais são nitidamente trilobadas,
cuneiformes, espessas, brilhantes, verde escuras na face superior e pouco mais claras
na face inferior, com seio peciolar em U. Esta variedade produz flores masculinas
estéreis (Sousa e Martins, 2002).
Cosmo (1979) descreve o 420-A como um porta-enxerto que pode se adaptar
à seca e a solos leves. Porém, não tolera terrenos muito argilosos e compactos.
2.6.2. Schwarzmann
Pommer et al. (1997) classifica o porta-exento Schwarzmann como sendo um
híbrido natural entre Vitis riparia e V. rupestris, selecionado por Bizenz, na Moravia,
Região da ex-Tchecoslovaquia, no início do século XX. Este porta-enxerto apresenta
vigor médio e enraizamento satisfatório, é adaptado a terrenos secos, áridos, ácidos e
arenosos (Sousa, 1996). Segundo Stirling e Cirami, (1984); Pommer et al., (1997), o
Schwarzmann revela boa resistência a nematóides e, embora seja pouco difundido,
ele é apropriado para as condições paulistas, podendo ser uma opção para a cultivar
Niágara.
Seus ramos são glabros, com nós e entrenós violáceos no lado exposto ao sol.
As folhas novas são verde-amareladas e brilhantes e as adultas são de coloração
verde-clara, tamanho médio tendendo a reniformes, inteiras ou levemente trilobadas,
com seio peciolar em lira aberta e profunda, as folhas são onduladas, apresentando na
face inferior, pubescencia sobre as nervuras. Produz flores masculinas e não produz
frutos (Sousa e Martins, 2002).
12
Pastena (1981) descreveu o porta-enxerto Schwarzmann como sendo dotado
de aptidão edáfica semelhante ao 101-14 e não ter apresentado, em algumas regiões
vitícolas, boa afinidade com certas cultivares locais. Em terrenos pobres, pode
apresentar um desenvolvimento deficiente, preferindo terrenos profundos, férteis,
frescos e pouco calcários. Mostra ainda boa afinidade com cultivares viníferas,
favorecendo a qualidade dos vinhos, embora não pareça revelar a capacidade de
frutificação induzida por alguns outros porta-enxertos. Como o 101-14, o
Schwarzmann também revelou boa afinidade, mas, na Fazenda Experimental de
Caldas, da EPAMIG, em um experimento de competição de porta-enxertos
combinados com híbridos franceses, o 101-14 mostrou-se, sistematicamente, mais
produtivo do que o Schwarzmann (Alvarenga et al., 1982).
2.6.3. IAC-766 - Campinas
No grupo de híbridos complexos estão incluídos os porta-enxertos IAC-766 -
Campinas e Traviú. O IAC-766 - Campinas foi obtido a partir do cruzamento 106-8
Mgt [V. riparia x (V. rupestris x V. cordifolia)] x V. tiliifolia, realizado por Santos
Neto (1957), citado por Pommer et al. (1997) e Camargo, (1998). O IAC-766 -
Campinas é um porta-enxerto menos vigoroso que o IAC-572 - Jales. Isso, em alguns
casos, dificulta a obtenção de plantas com desenvolvimento adequado para a
realização da enxertia de inverno, realizada no local definitivo quando o transplante é
feito tardiamente (após o mês de dezembro). Em regiões com ocorrência de
temperaturas mais baixas, este porta-enxerto tende a entrar em dormência durante o
inverno, apresentando intensa queda de folhas. Santos Neto (1973) afirmou que o
porta-enxerto IAC-766 - Campinas é um dos mais indicados para uvas finas de mesa.
Trata-se de um porta-enxerto vigoroso, o enraizamento das suas estacas é satisfatório
e apresenta boa resistência às doenças (Pereira e Leitão Filho, 1973).
O IAC-766 – Campinas é recomendado para cultivares como Itália, Rubi,
Benitaka, Brasil, Red Globe, Centennial Seedless, BRS Clara, BRS Morena e BRS
Linda. Embora haja necessidade de estudos mais completos, acredita-se que esse
13
porta-enxerto seja uma boa alternativa para cultivares de uvas sem sementes e uvas
para suco, devido ao fato de proporcionar menor vigor à copa, o que favorece a
diferenciação de gemas nas uvas sem sementes e facilita o manejo da copa nas uvas
para suco em espaçamentos adensados (Sousa, 1996; Pommer et al., 1997).
As plantas desse porta-enxerto possuem folhas com a face superior verde-
escura e a inferior um pouco mais clara; apresentam nervuras primárias com leve
pigmentação de antocianina; pêlos simples hialinos e bem curtos, além de esparsos
pêlos lanuginosos em ambas as faces; lobos foliares pouco nítidos e base foliar bem
fechada, com os bordos quase se sobrepondo; brotos terminais bronzeados ou verde-
bronzeados, com abundante indumentário tanto simples como lanuginoso, ambos
brancacentos; caules adulto verde-amarelados e esporadicamente com estrias
bronzeadas, cilíndricos, glabros e com pigmentação antociânica nos nós (Sousa e
Martins, 2002).
2.6.4. Traviú
O porta-enxerto Traviú foi produzido a partir do cruzamento entre V. riparia
x (V. rupestris x V. cordifolia), também conhecido como Riparia do Traviú ou 106-8
Mgt, obtido por Millardet e de Grasset, na França, em 1882. Segundo Sousa (1969),
este porta-enxerto apresenta uma adaptação similar à do 104-14, preferindo, porém
solos mais frescos. Por outro lado, parece possuir boa resistência à secura e
simultaneamente boa adaptação a terrenos argilosos e úmidos. Pereira e Leitão Filho
(1973) apresentaram o Traviú como possuindo afinidade para a maioria das
cultivares. Este porta-enxerto é utilizado principalmente com as cultivares de Niágara
e induz bons rendimentos quando utilizado com as cultivares Patrícia, Soraya,
Rainha, Seibel 2 e IAC 138-22. Para a cultivar Itália, o Traviú proporciona menores
produções do que quando esta é combinada com o porta-enxerto Kober 5BB. Mas,
por outro lado, quando a Itália está associada com Traviú, ocorre antecipação da
maturação em alguns dias e formação de cachos mais soltos. De acordo com as
colocações de Pommer et al. (1997) e Simão (1998), desde que sejam respeitadas as
14
exigências naturais e específicas, ou adaptações dos porta-enxertos, é possível que as
cultivares de Niágara tenham boas possibilidades de responder bem a enxertias
realizadas sobre o du Lot, o Traviú, ou mesmo o Golia, o que já não acontecerá com
o 5BB.
As plantas do porta-enxerto Traviú apresentam folhas cuneiformes, de
coloração verde-escura na face superior e levemente mais clara e opaca na inferior,
apresentam nervuras primárias pigmentadas de antocianinas em seu terço basal;
pilosidade esparsa em ambas as faces, constituída por pêlos simples, curtos e
brancos; lobos longo-acuminados e bem salientes; seio peciolar em U; pecíolo de
coloração vermelho escura e dotado de pêlos lanuginosos brancacentos; os brotos
terminais são levemente bronzeados e as folhas jovens brilhantes, com pecíolo e
lâmina sericio-pilosos. Os caules adultos são avermelhados, glabros e levemente
reluzentes. A planta do Traviú produz flores femininas, que dão origem a poucos
frutos (Sousa e Martins, 2002).
2.6.5. IAC-572 - Jales
Dos porta-enxertos criados pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC),
destaca-se principalmente o IAC-572-Jales, pela adaptação e afinidade com as
principais cultivares em uso nas regiões tropicais. O IAC-572-Jales é oriundo do
cruzamento entre V. tiliifolia x 101-14 Mgt, realizado, em 1954, no IAC (Camargo,
1998). A partir do início da década de 90, este porta-enxerto vem sendo bastante
difundido em todas as regiões vitícolas tropicais do país, sob a etiqueta “Tropical sem
vírus”. A difusão ocorreu a partir de material sadio, obtido por termoterapia no IAC,
propagado, em Tupi Paulista - SP, pelo viticultor Nelson Fujino e levado para Jales,
para o Vale do São Francisco e para as novas regiões vitícolas em desenvolvimento
no Mato Grosso do Sul e no Mato Grosso. Em 1993, o IAC-572 – Jales foi
identificado em matrizeiro formado pela Agropecuária Labrunier Ltda. sediada no
Vale do São Francisco, a partir de material proveniente de Tupi Paulista.
15
Atualmente, este é o porta-enxerto mais propagado, substituindo o IAC-313-
Tropical em praticamente todos os novos plantios a partir dos anos 1994/1995, tanto
no Vale do São Francisco como no Noroeste de São Paulo e outras regiões. O IAC-
572 - Jales é um pouco menos vigoroso que o porta-enxerto Tropical, sendo de fácil
enraizamento, apresentando bom índice de sobrevivência quando transplantado para
o campo e boa afinidade geral com as principais cultivares de uvas finas, como a
Itália, Rubi, Benitaka, Brasil, Red Globe, Christmas Rose, Perlette e Centennial.
Também tem sido usado com sucesso para a cultivar Niagara Rosada na região de
Jales e nos estados de Mato Grosso do Sul e Mato Grosso (Camargo, 1998).
As plantas do porta-enxerto IAC-572 - Jales possuem folhas de coloração
verde-escura na face superior e verde-clara e opaca na face anterior, com nervuras
primárias, secundárias e seio peciolar pigmentados com antocianina; pilosidade nas
duas faces, formada por pêlos brancos e curtos, concentrados ao longo das nervuras;
lobos desenvolvidos correspondentes às três nervuras primárias, razão pela qual a
folha se apresenta trilobada; seio peciolar em V; pecíolo vermelho escuro ou
bronzeado, opaco. Os brotos terminais são verde-claros ou levemente bronzeados. As
folhas e os ramos novos são densamente revestidos de pilosidade lanuginosa; os
caules adultos são verde-bronzeados ou levemente amarelados, lisos e opacos, com
esparsos pelos lanuginosos brancos (Sousa e Martins, 2002).
2.7. Identificação dos porta-enxertos
A identificação de espécies, variedades, cultivares e híbridos de uvas,
tradicionalmente é dependente das características das folhas e frutos (Lin e Walker,
1997). A utilização destas características para a identificação é uma habilidade de
praticidade e é realizada com certa dificuldade devido às variações condicionadas
pelos ambientes e o estágio de desenvolvimento da planta. Porta-enxertos com
mesmo parentesco ou similar podem ter muitas características viticulturais diferentes,
e a escolha apropriada do porta-enxerto pode ser essencial para um ótimo
16
crescimento e qualidade do fruto. Por isso, é importante a correta identificação dos
porta-enxertos.
Para a indústria, por exemplo, a identificação de videiras é uma necessidade
essencial e esta tem sido realizada através de ampelografia de campo; por este
método, os cultivares são distinguidos com base em características morfológicas. A
propagação vegetativa e a disseminação global dos cortes propagados
vegetativamente por centenas de anos têm causado problemas para o sistema de
identificação baseado em genótipos (Thomas et al., 1994). O problema é que, embora
haja variedades que sejam perfeitamente distinguível a olho nu, sendo o exemplo
extremo a distinção entre variedades brancas e tintas quando o fruto está maduro, há
muitas variedades com características de matéria-prima enológica muito diferentes,
mas com aparências muito similares. Quando a isso é acrescida a influência
ambiental, o resultado é um elevado grau de variabilidade ao fenótipo, (em
linguagem comum, o resultado visível da interação entre a herança genética e o
ambiente), levando a uma impossibilidade de identificação correta de certas
variedades ou cultivares.
De acordo com Monteiro (1999), existem três grandes grupos para a detecção
de polimorfismos: a ampelografia, os marcadores celulares e os marcadores
moleculares
2.7.1. Ampelografia
A ampelografia é o método usual e de utilização generalizada na
identificação de variedades, mas, apesar da sua grande e evidente contribuição para a
viticultura nacional, esse método apresenta desvantagens inerentes ao fato de utilizar
as características fenotípicas da videira no processo de classificação. Sendo o
fenótipo a expressão do genótipo e levando em consideração que, durante o
crescimento da videira (fase em que o genótipo se exprime em fenótipo), esta
expressão é influenciada pelo ambiente e a ampelografia introduz no processo da
17
classificação, variáveis não controladas e dependentes do ambiente (Wolfe, 1976;
Dias, 1994).
Em busca de uma modo que fosse o mais objetivo possível e que permitisse
diferenciar todas as castas, foi necessário desenvolver um método que utilizasse
parâmetros que se mantivessem inalterados em todas as circunstâncias. Atualmente, o
genótipo satisfaz a esses requisitos e, desse modo, permite uma análise constante,
objetiva e independente das variações ambientais (Monteiro, 1999).
2.7.2. Marcadores bioquímicos
Os métodos bioquímicos, como a análise de isoenzimas, têm sido
desenvolvidos para complementar e assistir a identificação ampelográfica,
determinando o genótipo de cultivares. Muitos autores têm utilizado as isoenzimas
como marcadores bioquímicos para identificar videiras (Wolfe, 1976; Weeden et al.,
1988; Bachmann 1989; Calò et al., 1989; Parfitt e Arulsekar, 1989; Walters et al.,
1989; Boursiquot e Parra, 1992; Walker e Liu, 1995). Entretanto, o uso destes
marcadores é limitado em Vitis, pois poucos sistemas enzimáticos estão padronizados
e disponíveis. Além desta limitação, o uso de isoenzimas não indica diretamente o
genótipo, uma vez que fatores fisiológicos, ambientais, relacionados com
desenvolvimento e expressão tecido-específica interferem nos resultados obtidos. Os
resultados obtidos expressam o fenótipo para os loci analisados (Botta et al., 1995;
Walker e Liu, 1995; Oliveira-Collet et al., 2005).
Análises com isoenzimas também tem sido utilizadas para distinguir os
porta-enxertos e cultivares frutíferas (Wolf, 1976; Walker e Liu, 1995; Weeden et al.,
1998;), mas esta técnica é freqüentemente restrita, devido ao limitado número de loci
detectáveis, ao polimorfismo também limitado e à expressão de certos produtos
gênicos. Assim, o uso de marcadores moleculares baseados em DNA para a
identificação dos genótipos foi proposto para superar estas limitações das análises
bioquímicas.
18
2.7.3. Marcadores moleculares
Os recentes avanços na biologia molecular têm permitido detectar facilmente
seqüências polimórficas de DNA, e têm sido aplicadas para a identificação de
cultivares e estudos filogenéticos para diversas plantas. As seqüências polimórficas
de DNA não são influenciadas pelas condições ambientais ou culturais e o uso delas
é proposto como uma grande vantagem sobre as características morfológicas ou
fisiológicas (Goto - Yamamoto et al., 1998). Vários marcadores têm sido utilizados,
incluindo o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Bourquin et al.,
1993) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Wu e Lin, 1994) e
microssatélites ou SSR (Simple Sequences Repeat) (Thomas e Scott, 1993; Bowers et
al., 1996; Rongwen et al., 1995).
De acordo com Ferreira e Grattapaglia (1996), um marcador molecular pode
ser definido como todo e qualquer fenótipo decorrente da expressão de um gene,
como no caso de proteínas, caracteres morfológicos, ou de um segmento específico
de DNA, neste caso correspondendo a regiões expressas ou não do genoma, cuja
seqüência e função podem ou não ser conhecidas. Os marcadores moleculares podem
complementar o melhoramento de forma distinta, fornecendo uma medida confiável
da diversidade genética, que pode ser utilizada para a determinação do grau de
parentesco entre linhagens e variedades, para proteção dos direitos da propriedade
intelectual. Pode, ainda, contribuir, por meio de seu ligamento com alelos de
interesse, no primeiro passo, para o entendimento da biologia e da estrutura de muitas
características, especialmente quantitativas (Borém e Miranda, 2005).
A proposta de Thomas e Scott (1993) é de que a identificação de cultivares
usando marcadores de DNA deva ser mais eficiente, pois estes avaliam diretamente o
genótipo independente do fenótipo. Esta identificação é importante para os
programas de melhoramento, para mapear características de interesse econômico e
isolar genes específicos.
O grande avanço na área de marcadores moleculares baseados em PCR
ocorreu, em 1990, com a idéia de utilizar primers mais curtos e de seqüências
arbitrárias para dirigir a reação de amplificação, eliminando, assim, a necessidade do
19
conhecimento prévio da seqüência. Esta técnica foi desenvolvida independentemente
por dois grupos nos Estados Unidos. Williams et al. (1990) patentearam a tecnologia
com o nome mais comumente utilizado - RAPD (Randon Amplified Polymorphic
DNA; DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso).
RAPD é basicamente uma variação de protocolo de PCR, com duas
características distintas: utiliza um só primer ao invés de um par de primers; este
primer tem seqüência arbitrária e, portanto, sua seqüência alvo é desconhecida. Uma
característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato deles se comportarem
como marcadores genéticos dominantes. Portanto, o polimorfismo genético detectado
pelos marcadores RAPD possui natureza binária, isto é, o segmento amplificado
(banda no gel) está presente ou ausente. Enquanto o genótipo homozigoto recessivo
(aa) é identificado pela ausência da banda no gel, os genótipos homozigoto
dominante (AA) e heterozigoto (Aa) são colocados juntos na mesma classe
fenotípica, ou seja, como a presença da banda no gel (Ferreira e Grattapaglia, 1996).
2.8. Marcadores Moleculares em Vitis
Nas últimas décadas, diferentes tipos de marcadores de DNA têm sido
desenvolvidos e utilizados para investigar e identificar videiras. Entre estes estão o
RFLP (Blaich, 1989; Striem et al., 1990; Bourquin et al., 1992; Bowers et al., 1993;
Thomas e Scott, 1993); RAPD (Jean-Jaques et al., 1993; Gorgocena et al., 1993;
Büscher et al., 1993; Büscher et al., 1994; Lodhi et al., 1997); SSR ou microssatélites
(Thomas e Scott, 1993; Thomas et al., 1994; Bowers et al., 1996; Sefc et al., 1999; Di
Gaspero et al., 2000; Arnold et al., 2002) e AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) (Cervera et al., 2000).
O emprego de marcadores moleculares utilizando análises de seqüências de
DNA aleatoriamente amplificadas, referida como RAPD (Williams et al., 1990) ou
AP-PCR (Welsh e Mccletlland, 1991), tem sido importante e pode resolver vários
aspectos no estudo das videiras. RAPD é uma técnica simples, mas poderosa. É um
método baseado em PCR, permitindo a amplificação casual de segmentos
20
inespecíficos do DNA genômico criando um firgerprint de marcadores polimórficos.
Variações nos firgerprints produzidas pelas análises com RAPD tem a sua origem a
partir de mudanças nas seqüências onde os primers se anelam nos diferentes genomas.
O polimorfismo é criado a partir do momento que a seqüência é amplificada em um
indivíduo, mas não em outro (Benter et al., 1995).
O polimorfismo resultante quando RAPD é utilizado é importante, pois pode
gerar alta quantidade de marcadores de DNA, oferecendo uma boa possibilidade para
os estudos de relação genética em Vitis, uma vez que apresenta uma grande
diversidade intraespecífica (Grando et al., 1996).
De acordo com Vidal et al. (1996), o uso de RAPD permitiu a separação de 32
variedades de uva branca (Vitis vinifera L.), crescidas em diferentes regiões da França
e Espanha. As variedades foram separadas em três grupos com influências do
Atlântico e do Mediterrâneo. Assim, este marcador pôde ser empregado para separar
espécies de acordo com sua origem geográfica. Este marcador também foi importante
para analisar as relações entre uvas selvagens e as cultivadas do Japão, Coréia e China.
Os resultados obtidos evidenciam uma clara separação entre uvas cultivadas e
selvagens (Goto-Yamamoto et al., 1998).
As variedades cultivadas, os porta-enxertos e as espécies selvagens de
genótipos indianos foram avaliados e os resultados possibilitaram a separação das
espécies selvagens e porta-enxertos dos genótipos cultivados (Tamhantar et al., 2001).
As espécies cultivadas foram separadas em dois grupos, constituídos principalmente
de V. labrusca e V. vinifera. As uvas para a produção de vinho ainda puderam ser
separadas em diferentes subgrupos. As origens e autenticidade de muitos cultivares de
uva (V. vinifera) usadas para a produção de vinho não são claras e estão sujeitas a
algumas controvérsias (Herrera et al., 2002). Utilizando RAPD, verificou-se que foi
possível a comparação das quatro cultivares no Chile e os resultados deste trabalho
mostram que a Merlot cultivada no Chile e na França são altamente divergentes,
representando diferentes genótipos.
Cuisset (1998) registrou que uma associação dos marcadores RAPD,
microssatélites e caracteres morfológicos possibilitaram a discriminação de uvas de
vinho, de mesa e de porta-enxertos. As uvas de vinho puderam ser agrupadas de
21
acordo com sua origem geográfica. Através destes estudos foi possível supor que a
evolução das uvas de vinho não se deve somente à propagação vegetativa e a
procedimentos de seleção, mas também foi promovida por atividades de
cruzamentos.
O uso de PCR-multiplex tem sido importante para auxiliar os programas de
melhoramento desta cultura. É um método que permite uma rápida identificação
genética de porta-enxertos, sendo útil em todos os casos onde a identificação baseada
em caracteres morfológicos não apresenta consistência (Frei et al., 2004).
Um considerável investimento também tem sido feito para investigar
caracteres quantitativos, para subsidiar os programas de melhoramento e em estudos
genéticos para a uva. Um aumento no número de loci de microssatélites em uva
disponibilizados por vários autores (Thomas e Scott, 1993; Thomas et al., 1994;
Cipriani et al., 1994; Bowers et al., 1996; Regner et al., 2000; Sefc et al., 1999; Scott
et al., 2000; Di Gaspero et al., 2000; Arnold et al., 2002), aliado com a facilidade de
emprego deste marcador, tem mostrado que os loci SSR podem ser utilizados para a
construção de mapas genéticos, sendo assim possível o estudo de caracteres que
apresentam herança quantitativa em uva (Bellin et al., 1999; Dalbó et al., 2000).
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Variedades de porta-enxerto de uva
Para a extração de DNA, foram utilizadas folhas jovens e completamente
expandidas de 15 a 20 plantas das seguintes variedades de porta-enxerto de uva: 420-
A, Schwarzmann, IAC-766 – Campinas, Traviú, Kober 5BB e IAC-572 – Jales
(Quadro 1). As folhas foram coletadas em uma área experimental da Cooperativa de
Rolândia (COROL), no município de Rolândia-PR. Também foram necessárias de 15
a 20 estacas da variedade Kober 5BB, oriundas da EMBRAPA Centro Nacional de
Pesquisa em Uva e Vinho - Bento Gonçalves-RS.
Quadro 1. Cruzamentos entre espécies de uvas que deram origem aos porta-enxertos
analisados
Variedades de
Porta-enxertos
Origem
420-A Vitis berlandieri x V. riparia
Traviú V. riparia x (V. rupestris – V. cordifolia)
IAC-572 - Jales V. tiliifolia x 101-14 Mgt
IAC-766 - Campinas Traviú x V. tiliifolia
Schwarzmann V. riparia x V. rupestris
Kober 5BB V. berlandieri x V. riparia
Fonte: Camargo, 1998; Pommer et al., 1997; Sousa e Martins, 2002.
As folhas coletadas das cinco primeiras variedades foram identificadas,
armazenadas em sacos de sombrite e mantidas em gelo desde a coleta até o
laboratório, onde foram rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e estocadas
em freezer -80
0
C até o momento de extração de DNA. As estacas da variedade
Kober 5BB, fornecidas pela Embrapa de Bento Gonçalves – RS, foram plantadas no
Jardim Didático da Universidade Estadual de Maringá e, após a brotação as folhas
jovens completamente expandidas, foram coletadas para o processo de extração de
DNA.
23
3.2. Extração do DNA de folhas das variedades de porta-enxerto de uva
Para a extração do DNA genômico das folhas dos porta-enxertos de uva, foi
utilizado a metodologia descrita por Thomas e Scott (1993) com algumas
modificações. Foi extraído o DNA de 15 amostras de cada uma das seis variedades e,
para facilitar o processo de extração, o protocolo foi dividido em três etapas:
Primeira etapa - 100 mg de folhas de cada amostra foi pulverizada com
nitrogênio líquido e o pó obtido foi distribuído em 4 microtubos de 2 mL e
homogeneizado com 1250 µL de tampão de extração ‘A’, descrito no Quadro 2.
Após a homogeneização, foi realizada a centrifugação a 4 ºC, durante 10 minutos, a
4.000 x g. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e em cada tubo foi
adicionado 700 µL do tampão ‘B’, descrito no Quadro 2. Após a homogeneização, os
tubos foram incubados em banho-maria a 37 ºC, durante 30 minutos, sendo agitados
a cada 5 minutos. Após este período, os tubos foram retirados do banho-maria e
mantidos na bancada até atingirem a temperatura ambiente. Em seguida, foi
adicionado 700 µL de clorofórmio: álcool isoamílico (preparado na proporção de
24:1) e os tubos foram agitados durante 3 minutos. Em seguida foram centrifugados
em temperatura ambiente por 12 minutos a 16.000 x g. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi recuperado e a este foi adicionado 0,54 vezes o volume de
isopropanol. Após algumas inversões, os tubos foram novamente centrifugados como
anteriormente, obtendo-se o pellet no fundo do tubo. O sobrenadante foi descartado,
o pellet foi seco em temperatura ambiente e a este foi adicionado 200 µL de TE
(Tris/HCl 10 mM e EDTA 1 mM pH 8,0). O DNA foi ressuspendido e armazenado
em geladeira a 4ºC.
Segunda etapa – Em cada tubo, foi adicionado 2 µL de RNAse (20 ng/µL),
e estes foram mantidos por 30 minutos em temperatura ambiente. Após este período,
foi acrescentado 100 µL de acetato de amônio a 7,5 M e, após algumas inversões, os
tubos foram centrifugados em temperatura ambiente por 12 minutos a 16.000 x g. Os
sobrenadantes obtidos foram transferidos para tubos novos e a eles adicionados 0,54
vezes o volume de isopropanol. Os tubos foram armazenados over night em freezer a
20ºC.
24
Terceira etapa – Em seguida, foi realizada centrifugação em temperatura
ambiente por 12 minutos a 16.000 x g obtendo-se o pellet. O sobrenadante foi
descartado e o pellet foi lavado com 300 µL de etanol 70 % gelado. Após a lavagem,
realizou-se uma centrifugação a 4 ºC, por 12 minutos, com 16.000 x g. O
sobrenadante foi vertido delicadamente e os tubos colocados na estufa a 37 ºC até
que todo o etanol fosse evaporado. O pellet foi ressuspendido em 50 µL de TE e os
tubos vedados com parafilm, e armazenados em geladeira com 4ºC.
Quadro 2. Composição dos Tampões ‘A’ e ‘B’ utilizados para extração de DNA de
folhas de porta-enxertos de uva
Reagentes
Tampão de
extração ‘A’
Tampão de
extração ‘B’
PVP-40
NaCl
Tris HCl pH 7,0
Tris HCl pH 8,0
EDTA
ß-mercaptoetanol
Sarcosil
Etanol
H
2
O MiliQ
2,5% 2,5%
0,25 M 0,5 M
- 0,2 M
0,25 M -
50 mM 50 mM
0,1% 1%
- 3%
- 20%
q.s.p. q.s.p.
3.3. Avaliação e quantificação dos DNAs extraídos
As etapas de avaliação, quantificação do DNA, coloração do gel e estocagem
do DNA foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos por Zequim-
Maia (2003), para folhas jovens de Vitis vinifera L.
Para quantificar o DNA extraído e avaliar a sua integridade, os DNAs das
amostras de folhas de porta-enxerto de uva e soluções de DNA de fago λ de
concentrações conhecida (50, 100, 150, 200 e 250 ng) foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose a 0,8 %, preparado com tampão TAE e concentração
1X pH 8,0 (0,04 M Tris-acetato e 0,001 M EDTA) (Hoisington et al., 1994), sob
voltagem de 80 V. Para a visualização, o gel foi corado em banho de Brometo de
Etídio preparado com 0,5 µg/mL. Em seguida, o gel foi fotografado sob luz UV,
25
utilizando o programa KODAK 1D 3.5. As quantificações foram confirmadas através
do uso do espectrofotômetro.
3.4. Amplificação do DNA e seleção de primers
As reações de amplificação foram realizadas com DNA extraído de folhas
jovens dos diferentes porta-enxerto de uva. Para tanto, foram selecionadas em média
11 amostras de cada variedades, totalizando 65 amostras. As demais amostras de
DNA extraídas foram guardadas como amostras reserva.
Como base para a amplificação, foi utilizado o protocolo original descrito
por Williams et al. (1990) com padronizações para as concentrações de alguns dos
componentes. Para a padronização da reação, foram testadas as concentrações de
DNA (20, 25 e 30 ng; esta última não apresentada no gel), e de MgCl
2
(2,0, 2,5 e 3,0
mM). Para os testes de padronização de amplificação, foram utilizados os primers
OPB-03 e OPB-11 e amplificados os DNAs de quatro amostras escolhidas ao acaso.
As reações de amplificação para os ensaios de RAPD, foram realizadas em
um termociclador Techne TC-512 e preparadas em microtubos de 0,2 mL para um
volume final de reação de 20 µL. Para a padronização da reação, foram testados 20,
25 e 30 ng de DNA genômico e 2,0; 2,5 e 3,0 mM de MgCl
2
, com 0,2 µM de primer,
1 U de Taq-DNA polimerase (Invitrogen), tampão de reação (Invitrogen) 1X, 0,1 mM
de cada dNTP e água mili-Q autoclavada qsp.
A desnaturação do DNA foi feita em 96 ºC por cinco minutos, seguida por 45
ciclos de amplificação (94 ºC por 45 s, 35 ºC por 60 s, 72 ºC por 90 s). Após os 45
ciclos, foi realizada uma extensão final de 7 min em 72 ºC.
Os produtos das amplificações foram separados em gel de agarose 2%,
usando tampão TBE 0,5X pH 8,0 (0,045 M Tris-borato, 0,001 M EDTA). A
eletroforese foi realizada por aproximadamente 5 horas, com 60 Volts. Os géis foram
corados com banho de brometo de etídio e a imagem capturada com Ultraviolet
Transilluminador High Performance-Edas 290, utilizando o programa Kodak 1D 3.5.
26
Para definir o tamanho dos fragmentos amplificados, foi utilizado o marcador de
peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen).
Para a seleção dos marcadores, foram avaliados 83 primers para RAPD
pertencentes a diferentes Kits: A (1-20), B (1-20), C (1-20), F (5, 9, 13), I (5), L (11),
M (1-10) e P (2, 4, 7-11 e 17), desenvolvidos pela Operon Technologies Inc. Dentre
eles, foram selecionados aqueles que apresentaram bandas bem fracionadas e nítidas
no gel de agarose após as amplificações realizadas com uma amostra de cada
variedade.
3.5. Análise dos resultados
A análise dos produtos das amplificações foi realizada em termos da
presença ou ausência de cada fragmento de DNA amplificado. Oresultado da leitura
dos géis foi utilizado para a construção de uma matriz binária. Para a obtenção dos
resultados, foi utilizado o aplicativo Popgene 1.32 (YEH et al., 1999) e o
agrupamento foi realizado pelo método de UPGMA (Unweighted Pair_Group
Method Using Arithmetic Avarage). Usando este aplicativo, foram estimadas a
identidade genética de Nei e a distância genética entre as variedades dos porta-
enxertos de uva agrupadas em um dendrograma, também construído pelo mesmo
aplicativo. Também foi calculado o G
st
que é definido como uma medida de
diferenciação genética entre as subpopulações (Nei, 1977). Na estatística F, de
Wright, a medida de diferenciação genética G
st
pode ser aplicada a níveis de
subdivisão hierárquica adicionais, tais como populações dentro de uma região
geográfica, subpopulações dentro de populações, colônias dentro de subpopulações e
indivíduos dentro de colônias, utilizando-se, em cada caso, as freqüências alélicas
correspondentes ao nível em questão (Alfenas, 2006). Nei (1972, 1973) propôs
também as medidas de similaridade genética (I) e de distância genética (D), que
comparam as freqüências alélicas entre as populações. Estas medidas podem ser
utilizadas para a construção de dendrogramas (na análise de grupamentos).
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Através da análise em gel de agarose a 0,8% foi possível verificar a
integridade das amostras de DNA e determinar a concentração de DNA de todas as
amostras das seis variedades de porta-enxerto de uva estudadas. A quantificação foi
realizada através de comparação das bandas das amostras das diferentes variedades
com as de DNA do fago λ de concentrações conhecidas (50, 100, 150, 200 e 250 ng).
Em função desta comparação, foi possível determinar que a quantidade dos 65 DNAs
extraídos e selecionados variou de 67 a 530 ng/µL (Figura 1). Apesar de Lin e
Walker (1997) descreverem que a extração de DNA de tecido de câmbio em Vitis
seja um método efetivo tanto para a qualidade como para a quantidade de DNA
extraído, a metodologia descrita por Thomas e Scott (1993), empregando folhas
como material biológico, utilizada no presente trabalho, foi eficiente para a
amplificação do DNA, utilizando primes arbitrários e os resultados foram
reproduzíveis.
Figura 1. Gel de agarose a 0,8% utilizado para avaliar e quantificar as amostras de
DNA. 1, 2 e 3 são amostras de DNA fago λ com as concentrações de 50, 100 e 150
ng respectivamente. As amostras de 4 a 24 são DNAs extraídos das variedades de
porta-enxerto de uva.
Para garantir que os resultados fossem reproduzíveis, concentrações de DNA
e de MgCl
2
foram testadas. Foi possível verificar que a melhor concentração de DNA
foi a de 30 ng, uma vez que, quando esta concentração foi utilizada, um maior
número de fragmentos amplificados foi obtido (Figura 2). Para o MgCl
2
, as bandas
de DNA nítidas e bem fracionadas foram obtidas quando a concentração de 3,0 mM
foi utilizada para a reação (Figura 3). Estas condições de amplificação foram
adotadas para todas as amostras estudadas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
23 24
28
Figura 2. Gel de agarose a 2% utilizado para separar os fragmentos de DNA
amplificados durante a padronização da concentração de DNA. Para as amostras de 1
a 8 foi utilizada a concentração de 20 ng e para as amostras de 9 a 16 foram utilizadas
as mesmas amostras de DNA na concentração de 25 ng. Para amplificar as amostras
de 1 a 4 e de 9 a 12 foi utilizado o primer OPB-03 e para as amostras de 5 a 8 e de 13
a 16 o primer OPB-11.
Figura 3. Gel de agarose a 2% utilizado para separar os fragmentos de DNA
amplificados durante a padronização para a concentração de MgCl
2
. Para as amostras
de 1 a 12 a reação foi realizada com o primer OPB-03 e de 13 a 24 com o primer
OPB-11. De 1 a 4 e 13 a 16 a concentração do MgCl
2
utilizado foi de 2,0 mM; de 5 a
8 e de 17 a 20 foi de 2,5 mM; de 9 a 12 e 21 a 24 foi utilizado 3,0 mM. As amostras
1, 5, 9, 13 17 e 21 são da variedade 420-A; as amostras 2, 6, 10, 14, 18 e 22 da
variedade Schwarzmann; 3, 7, 11, 15, 19 e 23 da variedade Traviú e 4, 8, 12, 16, 20 e
24 da variedade IAC-766 - Campinas.
Para avaliar a diversidade genética dentro e entre as variedades de porta-
enxerto de uva, foram testados um total de 83 primers para RAPD; destes, 17 foram
selecionados conferindo um aproveitamento de 20,48% para os primers avaliados.
This et al. (1997) testaram 21 primers para RAPD para selecionar marcadores
moleculares para a identificação de porta-enxertos de uva; desses primers testados,
123456789101112131415161718192021222324
12345678910111213141516
29
somente seis foram utilizados para a análise. Quando combinações de 64 primers
para AFLP foram testadas por Upadhyay et al. (2007) para analisar três porta-
enxertos de uvas da Índia, somente 10 deles amplificaram todos os porta-enxertos,
conferindo um aproveitamento de 15,6%. Assim, a efetividade dos primers para
diferentes marcadores testados e selecionados para Vitis parece ser baixa.
Os primers selecionados no presente trabalho foram aqueles que
apresentaram maior número de bandas com maior polimorfismo (Figura 4); outra
qualidade para a escolha dos primers foi a reprodutibilidade dos fragmentos
amplificados. Para estudar a diversidade genética dos 65 indivíduos selecionados das
seis variedades de porta-enxerto de uva, foram selecionados e utilizados os primers
OPB–01, OPB–03, OPB–04, OPB–05, OPB–07, OPB–08, OPB–10, OPB–11, OPB–
15, OPB–17, OPB–18, OPC–02, OPC–04, OPC–07, OPP–08, OPP–11 e OPP–17.
As reações de amplificações resultaram em 247 fragmentos amplificados,
com uma média de 14,5 fragmentos amplificados por primer. Dos fragmentos
obtidos, 32 foram monomórficos e 215 polimórficos, conferindo, assim, um
polimorfismo total para as variedades estudadas de 87,04%. Os primers OPB–03,
OPB–04, OPB–08, OPC–07 e OPP–08 apresentaram 100,00% de polimorfismo,
produzindo cada um 15, 17, 14, 17 e 14 fragmentos, respectivamente. O primer
OPB–15 foi o que apresentou menor polimorfismo (36,36%), gerando 11 fragmentos
dos quais somente 4 foram polimórficos (Quadro 3).
O polimorfismo obtido para as seis variedades de porta-enxerto no presente estudo
foi mais alto (87,04%) do que o verificado para quatro variedades de Vitis vinifera,
utilizando também o marcador RAPD (Zequim-Maia, 2003). O polimorfismo de
65% encontrado para as quatro cultivares também foi considerado alto. Orasmo et al.
(2007) trabalhando com as mesmas cultivares de Vitis vinifera L. observaram um
polimorfismo de 61,7% para alelos nulos para a carboxilesterase EST-3. A
ocorrência de crossing-over somático, induzido por elementos genéticos
transponíveis que promovem rearranjos cromossomais, tem sido descrita por
Oliveira-Collet et al. (2005) como o mecanismo responsável pelo alto polimorfismo
em variedades de uvas de cor (Vitis vinifera L.). Esses rearranjos somáticos descritos
para Vitis vinifera podem também explicar o alto nível de polimorfismo observado
30
para as seis variedades de porta-enxerto. O mais alto polimorfismo obtido com uso
de RAPD para os porta-enxertos pode estar relacionado com a forma de avaliação do
marcador. Com o emprego de isozimas é avaliada a expressão de genes e, quando
seqüências de nucleotídeos são avaliadas de forma arbitrária, uma maior extensão do
genoma é estudada. Nesta forma de análise, são avaliadas seqüências que podem
estar associadas a um papel funcional e seqüências que apresentam somente papel
estrutural (Dziechciarkova, et al., 2004; Koch e Kiefer, 2006).
Quadro 3. Número e freqüência dos fragmentos monomórficos e polimórficos
obtidos para cada primer utilizados para a amplificação das diferentes variedades de
porta-enxerto de uva
Primers
Total de
Fragmentos
Fragmentos
Monomórficos
%
Fragmentos
Polimórficos
%
OPB-01 12 2 16,67 10 83,33
OPB-03 15 0 0 15 100,00
OPB-04 17 0 0 17 100,00
OPB-05 12 2 16,67 10 83,33
OPB-07 16 3 18,75 13 81,25
OPB-08 14 0 0 14 100,00
OPB-10 12 5 41,67 7 58,33
OPB-11 18 1 5,56 17 94,44
OPB-15 11 7 63,64 4 36,36
OPB-17 16 1 6,25 15 93,75
OPB-18 12 3 25,00 9 75,00
OPC-02 15 2 13,34 13 86,66
OPC-04 16 3 18,75 13 81,25
OPC-07 17 0 0 17 100,00
OPP-08 14 0 0 14 100,00
OPP-11 13 1 7,70 12 92,30
OPP-17 17 2 11,77 15 88,23
TOTAL 247 32 12,96 215 87,04
A freqüência diferencial para os fragmentos observados para as seis
variedades de porta-enxertos determinou uma divergência genética entre elas de
0,7094. De acordo com Wright (1978), valores de G
st
entre 0,15 e 0,25 indicam alto
nível de divergência interpopulacional ou alto nível de diferenciação genética entre as
populações. No Quadro 4, é possível observar a diferença de polimorfismo entre as
variedades, sendo o menor polimorfismo o encontrado na variedade IAC-572 - Jales
31
(21,91%). A variedade que apresentou o maior polimorfismo foi a 420-A, com
49,24% de fragmentos polimórficos. Uma grande variação genética entre cultivares
Vitis tem sido observada por Koesis et al. (2005), sendo que estes autores estimaram a
diversidade genética para 12 cultivares de V. vinifera, empregando o marcador
molecular RAPD, e encontraram que a variação genética entre as cultivares foi entre
0,419 e 0,642.
Figura 4. Gel de agarose 2%, utilizado para separação dos fragmentos de DNA de
diferentes variedades de porta-enxerto de uva amplificados com o primer OPP-17. As
amostras de 1 a 11 são da variedade 420-A; 12 a 22 são da variedade Schwarzmann;
23 a 33 são da variedade Traviú; 34 a 44 são da variedade IAC-766 - Campinas; 45 a
55 são da variedade IAC-572 - Jales; 56 a 66 são da variedade Kober 5BB e M
corresponde ao marcador 1Kb DNA ladder (Invitrogen).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
M 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
M 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66
300
1.000
12.000
5.000
2.000
1.650
850
650
500
400
200
Pb
32
A diversidade genética calculada pelos coeficientes de Identidade ou de
Distância Genética de Nei (1978) mostrou maior identidade genética entre as
variedades IAC-766 - Campinas e Schwarzmann, com 83,22% de similaridade e a
menor similaridade genética foi encontrada entre as variedades Kober 5BB e 420-A
(61,96%). Esses resultados estão apresentados na matriz de similaridade (Quadro 5).
A diferença genética entre os porta-enxertos pode ser justificada pela composição
genética inicial de cada um deles (os cruzamentos dos quais eles foram originados).
No Quadro 1, é possível verificar que cruzamentos de espécies diferentes foram
utilizados para a produção dos porta-enxertos diferentes. Assim, as diferenças na
composição genética oriunda dos parentais destes cruzamentos devem estar refletidas
no valor de G
st
= 0,7094.
Por outro lado, as variedades 420–A e Kober 5BB, que possuem a mesma
origem, ou seja, são resultantes do cruzamento entre V. berlandieri x V. riparia e que
são freqüentemente confundidas por serem morfologicamente não distinguíveis, foram
as variedades que apresentaram a maior distância genética (0,4786). A partir dos
dados obtidos utilizando os 17 primers para RAPD foi construído um dendrograma
(Figura 5), onde é possível a identificação de um grupo formado pelas variedades 420-
A, Schwarzmann e IAC – 766 – Campinas. Os porta-enxertos, Traviú, IAC – 572 -
Jales e Kober 5BB não formaram grupos, refletindo assim a grande divergência
encontrada entre eles. As variedades 420-A, Schwarzmann e IAC 766 - Campinas
formaram um grupo no dendrograma, apesar de terem origens diferentes.
O fato de variedades originadas a partir do mesmo cruzamento parental
apresentarem diferenças genéticas em nível molecular é mais uma evidência de que a
divergência de marcadores moleculares não necessariamente determina ou é
acompanhada por divergência morfológica. A despeito da similaridade morfológica
entre as duas variedades que apresentaram a mesma origem genética, as performances
destas também são diferentes. Quando comparados quanto à performance, o 420–A
apresenta pouco vigor, difusão restrita e dificuldade de enraizamento (Camargo,
1998). Quando o produtor, em vez de utilizar o cultivar Kober 5BB, utiliza o 420-A,
os resultados obtidos quanto à produtividade são muito inferiores ao esperado.
33
Quadro 4. Número total de fragmentos amplificados e o número de fragmentos
monomórficos e polimórficos obtidos com os 17 primers para RAPD para cada
variedade de porta-enxerto de uva
Variedades
Total de
Fragmentos
Fragmentos
Monomórficos
Fragmentos
Polimórficos
Polimorfismo
(%)
420-A 197 100 97 49,24 %
Schwarzmann 176 117 59 33,52 %
Traviú 185 118 67 36,22 %
IAC-766 - Campinas 187 112 75 40,11 %
IAC-572 - Jales 178 139 39 21,91 %
Kober 5BB 180 138 42 23,33 %
Quadro 5. Matriz de similaridade construída a partir dos coeficientes de identidade
ou distância genética de Nei (1978) para as 6 variedades de porta-enxertos obtida
com os dados obtidos por RAPD
Variedades
420-A Schwarzmann Traviú IAC-766 IAC-572
Kober
5BB
420-A **** 0,8076 0,7425 0,7754 0,6697 0,6196
Schwarzmann 0,2137 **** 0,7412 0,8322 0,6788 0,6358
Traviú 0,2978 0,2994 **** 0,7416 0,6625 0,6685
IAC-766 0,2544 0,1836 0,2989 **** 0,7557 0,6873
IAC-572 0,4009 0,3874 0,4117 0,2801 **** 0,6687
Kober 5BB 0,4786 0,4529 0,4028 0,3749 0,4025 ****
Obs: Identidade Genética de Nei (acima da diagonal) e Distância Genética (abaixo
da diagonal)
Figura 5. Agrupamento obtido para os seis porta-enxertos de uva realizado através
do método UPGMA e obtido a partir da análise de 247 fragmentos amplificados com
primers para RAPD.
420-A
Schwarzmann
IAC-766
Traviú
IAC-572
Kober 5BB
34
A amplificação do DNA de porta-enxerto com os primers OPB-1, OPB-3,
OPB-4, OPB-5, OPB-11, e OPP-17 produziram fragmentos que podem ser utilizados
para diferenciar as variedades 420-A, Kober 5BB, e IAC-572 – Jales (Quadro 6). O
primer OPB-4, por exemplo, determina a amplificação do fragmento 4 específico na
variedade 420-A e dos fragmentos 10 e 13 específicos na variedade Kober 5BB. Os
primers OPB-1, OPB-3, e OPB-11 também determinam a amplificação de
fragmentos específicos (fragmentos 2, 13, e 6) na variedade Kober 5BB; o primer
OPP-17 amplifica especificamente o fragmento 1 na variedade IAC-572 – Jales e o
fragmento 2 na variedade 420-A (Quadro 6). Esse é um aspecto positivo e promissor
para a análise dos fragmentos aleatórios de DNA amplificados no presente estudo. Os
fragmentos especificados pelos respectivos primers poderão ser utilizados como
marcadores dos genótipos IAC-522 – Jales, 420-A e Kober 5BB. Dessa forma, as
variedades Kober 5BB e 420-A, freqüentemente confundidas, poderão ser
molecularmente distinguidas.
A divergência genética produzida a partir dos fragmentos de DNA analisados
entre as variedades 420-A e Kober 5BB, que são de origem comum, pode ser
justificada pela forma de manejo e seleção empregados no desenvolvimento das
variedades. A seleção de exemplares (clones) com as características de interesse
também pode gerar divergência genética molecular, na medida em que seleciona
genótipos distintos que apresentam a característica de interesse. Evidências de que a
domesticação e seleção artificial para caracteres quantitativos apresentam um
pequeno efeito na seleção da diversidade genética também têm sido descrita para loci
SSR (Vigouroux et al., 2005).
A ocorrência de crossing-over somático em cultivares de V. vinifera,
proposta por Oliveira-Collet et al. (2005), pode determinar alterações nas seqüências
de DNA que dão origem a seqüências complementares aos primers variáveis. Essas
alterações podem ocorrer numa mesma variedade ou cultivar, estabelecendo, assim, a
variabilidade genética dentro da cultivar ou variedade, podendo, ainda, dar origem a
alterações morfológicas ou fisiológicas marcantes. Esta proposta para explicar uma
variabilidade genética em nível de seqüências de DNA, a despeito da origem parental
e da similaridade morfológica entre as variedades, pode, também, explicar as
35
observações de Crespan (2004). Este autor descreveu que quanto mais velha é a
variedade de uva, maior é a probabilidade de observar plantas diferentes em função
do acúmulo de mutações.
Quadro 6. Fragmentos específicos amplificados com diferentes primers para RAPD
em diferentes variedades de porta-enxertos de uva
VARIEDADES PRIMERS
FRAGMENTOS
ESPECÍFICOS
420-A OPB-4
OPB-5
OPP-17
4
2
2
IAC-572 -Jales OPB-4
OPB-5
OPP-17
4
2
1
Kober 5BB OPB-1
OPB-3
OPB-4
OPB-11
2
13
10, 13
6
O uso de RAPD no presente estudo mostrou ser uma técnica eficiente e
permitiu a separação das seis variedades de porta-enxerto (Figura 5). Outros acessos
de uva têm sido diferenciados quando o RAPD é utilizado (Grando et al. 1995;
Loureiro et al, 1998; Ye e Soylemezoglu 1998; Tessier et al., 1999). Esse marcador
pode, portanto, ser recomendado para a resolução de problemas relacionados com a
identificação de uva. A qualidade de um marcador é dependente de sua
reprodutibilidade e também de sua facilidade de uso. Lin e Walker (1998) avaliaram
estes critérios para os marcadores SSR e RAPD em uva e concluíram que um grande
número de marcadores polimórficos é produzido quando o RAPD é utilizado e que,
através desta técnica, marcadores consistentes podem ser obtidos, desde que as
condições da PCR sejam cuidadosamente controladas.
O desenvolvimento e o uso de marcadores para uva são bastante importantes,
uma vez que a identificação de cultivares tem sido baseada em caracteres
ampelográficos (Galet 1991; Boursiquot e This, 1996; Aradhya et al., 2003). A
expressão de caracteres morfológicos é influenciada por fatores ambientais, biologia
individual de cada planta e história de vida da planta (This et al., 2004). Assim, os
36
marcadores moleculares têm sido importantes no estudo de Vitis, uma vez que eles
são eficientes no processo de identificação de cultivares muito similares e difíceis de
serem diferenciadas através de comparação visual.
Os marcadores moleculares também são eficientes para discriminar clones
intervarietais, que podem diferir consideravelmente, mesmo possuindo o mesmo
conteúdo de DNA (Franks et al, 2002; Riaz et al, 2002). Assim, para resolver estes
problemas, tais como a diferenciação entre os porta-enxertos Kober 5BB e 420-A, é
importante desenvolver e estabelecer as metodologias adequadas para as análises dos
diferentes marcadores moleculares, que possibilitem a caracterização e diferenciação
entre as variedades e/ou cultivares de uvas. Esta diferenciação é extremamente
importante, pois o agricultor, ao plantar a variedade Kober 5BB, obterá maior
produtividade que ao plantar a 420-A, variedade esta que imprime pouco vigor à
copa, resultando em produtividades menores.
37
5. CONCLUSÕES
1- O primer OPB-4 pode ser utilizado para discriminar as variedades de porta-
enxerto 420-A e Kober 5BB; o fragmento 4 é específico da variedade 420-A e os
fragmentos 10 e 13 da Kober 5 BB.
2- O primer OPP-17 produziu os fragmentos 2 e 4 que são específicos,
respectivamente, para as variedades 420-A e IAC-572 – Jales. Assim, este primer
poderá ser utilizado para discriminar estas variedades.
3- O uso de RAPD mostrou ser uma técnica eficiente, permitindo a separação das
seis variedades de porta-enxerto de uva. Portanto, este marcador pode ser
recomendado para a resolução de problemas relacionados com a identificação de uva.
38
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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