( PDF ) Biomarcadores salivares de pacientes periodontais com diabetes mellitus tipo 2

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO

PRISCILA PAGANINI COSTA

Biomarcadores Salivares de Pacientes Periodontais com Diabetes

Mellitus Tipo 2

Ribeirão Preto

2008

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PRISCILA PAGANINI COSTA

Biomarcadores Salivares de Pacientes Periodontais com Diabetes

Mellitus Tipo 2

Dissertação apresentada à Faculdade

de Odontologia de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como

parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Periodontia.

Orientador: Prof. Dr. Mário Taba Júnior

Ribeirão Preto

2008

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer

meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que

citada a fonte.

FICHA CATALOGRÁFICA

Costa, Priscila Paganini

Biomarcadores salivares de pacientes periodontais com diabetes

mellitus tipo 2/ Priscila Paganini Costa; orientador Mário Taba Júnior.

Ribeirão Preto, 2008.

99p.: i.; 30 cm

Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-graduação em

Periodontia. Área de concentração: Periodontia) – Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

1.Periodontite. 2.Diabetes mellitus. 3. Saliva. 4. Biomarcadores.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Priscila Paganini Costa

Biomarcadores salivares de pacientes periodontais com diabetes mellitus tipo 2

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia

de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre.

Área de Concentração: Periodontia

Aprovado em: ____ / ____ / 2008

Banca Examinadora

Prof.Dr. ____________________________________________________________

Instituição: _________________________ Assinatura: _______________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________

Instituição: _________________________ Assinatura: _______________________

Prof.Dr. ____________________________________________________________

Instituição: _________________________ Assinatura: _______________________

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho

Aos meus pais

João e Ana Maria,

Exemplos de perseverança, coragem e disciplina,

Companheiros por toda vida,

Que sempre me guiaram e me apoiaram,

Com amor incondicional, dedicação e confiança.

A vocês, minha eterna gratidão e todo o meu amor.

Às minhas irmãs

Alessandra, Andréa e Cintia,

Pelo estímulo e carinho.

Agradeço ao ombro amigo.

Pela força que vocês me oferecem

me fazendo erguer os olhos em todos os momentos.

Ao meu orientador

Prof. Dr. Mario Taba Jr,

Cuja sabedoria me proporcionou um grande aprendizado,

me oferecendo tranqüilidade para realizar este estudo.

Sempre atencioso, com sua dedicação,

me ajudou a abrir um leque de conhecimentos.

A você, que de forma brilhante se dedica à pesquisa científica,

meus sinceros agradecimentos por despertar em mim a ânsia pelo saber.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo o dom da vida.

À minha família, especialmente aos meus cunhados pelo apoio e carinho, e aos

meus sobrinhos, alegrias do meu viver.

Ao Rodrigo, meu amor, pelo companheirismo, sabedoria e equilíbrio, tornando meus

dias mais alegres e serenos.

À amiga e Prof. Maria Letícia Bucchianeri Pinheiro, pelo incentivo, dedicação e

confiança na minha formação profissional.

A todas as minhas amigas, principalmente à Tetê e à Fernanda, por partilharmos

juntas momentos tão especiais e pela verdadeira amizade.

Aos professores do curso de Periodontia Arthur Belém Novaes Jr, Márcio Fernando

de Moraes Grisi, Sérgio Luís Scombatti de Souza e Daniela Bazan Palioto, pelo

profissionalismo, que conduziram o curso, e pelo apoio.

Aos amigos de mestrado e doutorado por compatilharem comigo os momentos e as

emoções desta trajetória.

A todos os funcionários desta instituição, de forma especial à Tati, Dulce, Fabíola,

Zilda, Sueli e Sandra pelo auxílio e atenção desprendidos.

À Prof. Maria Cristina Foss e às funcionárias Ivanilda e Marivone, pela colaboração e

atenção durante o período em que estive no Hospital das Clínicas e no Centro de

Saúde Escola.

Aos meus pacientes, pela cooperação e esforço, sem os quais este trabalho não

seria possível.

JUSTIFICATIVA

O diagnóstico periodontal tradicional inclui parâmetros clínicos como

profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, nível clínico de inserção,

índice de placa e perda óssea alveolar verificada por método radiográfico. Estas

medidas fornecem informações primárias sobre a severidade da periodontite, mas

não mensuram a atividade da doença

1,2

. O diagnóstico da fase ativa da periodontite

e a identificação de pacientes com risco para a doença representam uma mudança

para as investigações clínicas

. Avanços nas pesquisas em Periodontia estão

direcionando os métodos de diagnóstico para que a atividade da doença possa ser

identificada por mensurações de biomarcadores encontrados em amostras de fluido

crevicular gengival, soro e saliva

4,5

A saliva é um fluido fisiológico, elaborado a partir das secreções de glândulas

salivares e que contém proteínas produzidas localmente, bem como outras

moléculas da circulação sistêmica

. Isso a torna uma potencial candidata para

identificar biomarcadores que reflitam as alterações da periodontite e de outras

doenças bucais e sistêmicas. Além disso, a saliva apresenta vantagens como fácil

manipulação, característica não-invasiva, coleta simples e, geralmente, maiores

quantidades

7,8

. Os testes salivares já têm sido utilizados no diagnóstico e na

identificação do risco ao desenvolvimento de determinadas doenças sistêmicas

como Aids e hepatite, bem como na avaliação da atividade de cárie

A periodontite é uma doença inflamatória que afeta o tecido conjuntivo de

inserção e osso de suporte ao redor do dente

. O desencadeamento da doença

deve-se ao desequilíbrio entre as bactérias e a resposta do hospedeiro, que gera

uma descarga de componentes pró-inflamatórios e de outras moléculas,

promovendo destruição do tecido conjuntivo e ósseo

. Dessa forma, parece ser

plausível a hipótese de que a saliva contém biomarcadores para periodontite como

tem sido observado no fluido crevicular gengival

Os biomarcadores podem ter diversas aplicações na biologia moderna e na

medicina: desde o monitoramento de doenças como câncer (antígeno

carciembriônico), diabetes mellitus (Hemoglobina A1c) e doenças auto-imunes (Fator

reumatóide), como o diagnóstico destas

. A análise da saliva pode ser

especialmente benéfica na determinação do status periodontal atual, por meio da

busca de biomarcadores que possam melhor caracterizar a periodontite

. Estudos

têm indicado que a determinação dos níveis de mediadores inflamatórios em fluidos

biológicos são bons indicadores da atividade inflamatória; além de examinarem se

marcadores bioquímicos e imunológicos na saliva e/ou no fluido crevicular gengival

podem refletir a extensão da destruição periodontal e também se são capazes de

indicar a direção futura da progressão da doença

13,5

Algumas pesquisas demonstraram resultados satisfatórios na utilização da

saliva para monitoramento de biomarcadores em pacientes periodontais

6,10

. O

estudo realizado por Miller et al.

analisou as concentrações de interleucina-1β (IL-

1β), metaloproteinase da matriz-8 (MMP-8) e osteoprotegerina (OPG) em 28

pacientes com periodontite crônica e 29 indivíduos saudáveis, que foram utilizados

como controle, e verificaram que as concentrações de IL-1β e MMP-8 foram

significativamente mais altas nos pacientes periodontais quando comparados ao

grupo controle.

Ng et al.

avaliaram a associação entre a evidência radiográfica de perda

óssea e a concentração de fatores de reabsorção óssea do hospedeiro como

interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e

prostaglandina E

(PGE

) e marcadores de remodelação óssea (piridinolina

interligada ao telopeptídeo carboxiterminal de colágeno tipo I – ICTP, osteocalcina e

osteonectina) em saliva de 110 pacientes periodontais. Dentro dos resultados

obtidos, pode-se verificar que as concentrações de IL-1β, IL-6, PGE

, osteocalcina e

osteonectina estão relacionadas significativamente com perda óssea. A partir disso,

os autores concluíram que a quantificação desses biomarcadores na saliva pode

servir como um importante método para monitorar e prever a susceptibilidade à

periodontite.

Estes estudos

6,10

, no entanto, não consideraram as possíveis associações da

periodontite com outras doenças sistêmicas, como o diabetes mellitus. A literatura

mostra que há uma relação bidirecional entre essas doenças, ou seja, o diabetes

pode ser considerado como um fator de risco para a periodontite e esta, uma

complicação do diabetes

Dentro desse contexto, o presente estudo propõe-se a analisar as

concentrações salivares de IL-6, MMP-8 e OPG em pacientes com periodontite

crônica associada ou não ao diabetes mellitus tipo 2.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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individuals for periodontal diseases. Clinical assessment of the periodontium. J

Clin Periodontol 1988;15:403-410.

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Periodontol 1990;61:543-552.

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Clin Periodontol 2000;27:453-465.

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reactants, C-reactive protein and haptoglobin, in adult periodontitis. Clin Exp

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periodontal diseases. Dent Clin North Am 2005;49(3):551-571.

6. Miller CS, King Jr. CP, Langub C, Kryscio RJ, Thomas MV. Salivary biomarkers of

existing periodontal disease. A cross-sectional study. JADA 2006;137(5):7-16.

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disease: Current concepts. J Periodontol 1992;63:322-331.

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12. LaBaer J. So, you want to look for biomarkers (Introduction to the Special

Biomarkers Issue). J Proteome Res 2005;4:1053-1059.

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14. Papapanou PN. World Workshop in Clinical Periodontics. Periodontal diseases:

epidemiology. Ann Periodontol 1996;1:1-36.

RESUMO

COSTA, P. P. Biomarcadores salivares de pacientes periodontais com diabetes

mellitus tipo 2. 2008. 99 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Odontologia de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

A associação entre o diabetes e a periodontite produz uma descarga de proteínas

inflamatórias que pode ser refletida na saliva. Com base nisso, o objetivo desse

estudo foi mensurar as concentrações salivares de interleucina-6 (IL-6),

metaloproteinase da matriz-8 (MMP-8) e osteoprotegerina (OPG) em pacientes com

periodontite crônica associada ou não ao diabetes mellitus tipo 2. Um total de 90

indivíduos foi dividido em quatro grupos: saudáveis (Controle, n=22), pacientes com

doença periodontal (DP, n=24), apenas com diabetes mellitus (DM, n=20) e com

doença periodontal e diabetes mellitus (DP+DM, n=24). Dados clínicos e

metabólicos foram registrados. Amostras de saliva não-estimulada foram analisadas

pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). Diferenças estatisticamente significantes

foram detectadas entre os grupos para todos marcadores (p<0,05). Em relação à IL-

6, diferenças estatisticamente significantes foram encontradas comparando os

grupos Controle com DP e com DP+DM, e entre os grupos DP+DM com DM

(p<0,005). Para MMP-8, a média das concentrações do grupo Controle foi

significativamente menor que em todos os grupos doentes (p<0,01) e nenhuma

diferença entre os grupos doentes foi detectada. Para OPG, diferenças

estatisticamente significantes foram encontradas entre os grupos Controle com DP e

entre Controle com DM (p<0,05). Todos os parâmetros clínicos foram

estatisticamente significantes entre os grupos (p<0,001), exceto supuração. No

grupo DP, SS (sangramento à sondagem) mostrou uma correlação positiva com as

concentrações de IL-6 (r=0,48; p<0,05), PS≥7 (profundidade de sondagem≥7mm)

correlacionou-se positivamente com as concentrações de MMP-8 (r=0,46; p<0,05), e

os níveis de HbA1c também correlacionaram-se positivamente com as

concentrações de IL-6 (r=0,54; p<0,000). Concluindo, a saliva é um adequado

substrato para identificação de biomarcadores inflamatórios em pacientes

periodontais com ou sem diabetes. A IL-6 é um biomarcador candidato para

periodontite e periodontite associada ao diabetes na saliva. Além disso, conclui-se

que a super-expressão de MMP-8 e OPG pode acionar o aumento do colapso

periodontal observado em indivíduos com diabetes tipo 2.

Palavras-chave: Periodontite; Diabetes mellitus; Saliva; Biomarcadores

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

IL-1β: interleucina-1β

MMP-8: metaloproteinase da matriz-8

OPG: osteoprotegerina

TNF-α: fator de necrose tumoral-α

IL-6: interleucina-6

PGE

: prostaglandina E

ICTP: piridinolina interligada ao telopeptídeo carboxiterminal de colágeno tipo I

DP: pacientes com doença periodontal

DM: pacientes com diabetes mellitus

DP+DM: pacientes com doença periodontal e diabetes mellitus

ELISA: ensaio imunoenzimático

HbA1c: hemglobina glicada A1c

AGEs: produtos finais da glicação avançada

RAGEs: receptores para produtos finais da glicação avançada

MMP: metaloproteinase da matriz

RANK: receptor ativador do fator kappa B nuclear

RANKL: ligante do receptor ativador do fator kappa B nuclear

PS: profundidade de sondagem

PS≤3: profundidade de sondagem ≤ 3mm

PS4-6: profundidade de sondagem entre 4 e 6mm

PS≥7: profundidade de sondagem ≥ 7mm

NIC: nível clínico de inserção relativo

SS: sangramento à sondagem

SUP: supuração

n. dentes: número de dentes

mm: milímetro

C: graus Celsius

BSA: albumina sérica bovina

HPLC: cromatografia líquida de alta pressão

pg/ml: picograma por mililitro

ng/ml: nanograma por mililitro

r: valor da correlação

RT-PCR: reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa

SUMÁRIO

JUSTIFICATIVA

RESUMO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................23

2 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................27

2.1 População do Estudo.....................................................................................27

2.2 Parâmetros clínicos........................................................................................28

2.3 Coleta das Amostras de Saliva ......................................................................28

2.4 Análise das Proteínas Salivares ....................................................................29

2.5 Mensuração da Hemoglobina Glicada (HbA1c) .............................................30

2.6 Análise Estatística..........................................................................................31

3 RESULTADOS .......................................................................................................33

3.1 Características Demográficas e Clínicas .......................................................33

3.2 Concentração das Proteínas Salivares..........................................................34

3.3 Parâmetro Metabólico....................................................................................35

3.4 Correlação entre Parâmetros Clínicos e Proteínas Salivares ........................35

3.5 Correlação entre Parâmetro Metabólico e Parâmetros Clínicos e Proteínas

Salivares ...................................................................................................................36

4 DISCUSSÃO ..........................................................................................................48

5 CONCLUSÕES ......................................................................................................55

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..........................................................................57

ARTIGO EM INGLÊS ................................................................................................64

ANEXOS ...................................................................................................................96

1 INTRODUÇÃO

A periodontite é uma doença inflamatória que resulta de um desequilíbrio na

interação entre a microflora periodontal e a resposta multifacetada do sistema imune

do hospedeiro

. Este desequilíbrio desencadeia uma super-expressão de citocinas

pró-inflamatórias e a subseqüente destruição do tecido conjuntivo de inserção e do

osso alveolar

Evidências demonstram que o diabetes é um fator de risco para a

periodontite

. Diabetes mellitus é uma desordem metabólica, caracterizada pela

hiperglicemia resultante de defeitos na secreção ou ação da insulina

. Tem-se

demonstrado que a hiperglicemia pode promover a glicação não-enzimática de

proteínas do corpo, formando produtos finais da glicação avançada (AGEs). Os

AGEs, no periodonto, estimulam o recrutamento de monócitos para o sítio e

interagem com seus receptores (RAGEs) na superfície destas células. A interação

AGE–RAGE induz uma mudança no fenótipo do monócito, sobre-regulando a célula

e aumentando, significativamente, a produção de citocinas pró-inflamatórias

. Além

disso, o diabetes pode modular a destruição do tecido periodontal pela redução da

função de leucócitos polimorfonucleares, incluindo quimiotaxia, aderência e

fagocitose

Diabetes e periodontite são doenças crônicas comuns em adultos. Ambas as

doenças são altamente prevalentes na população mundial, e estima-se que 1 – 6%

da população sofre de diabetes

. Por outro, a doença periodontal afeta mais de 50%

da população adulta nos Estados Unidos

O diagnóstico periodontal tradicional inclui parâmetros clínicos e radiografias

avaliando o nível do osso alveolar

. Entretanto, avanços em pesquisa de diagnóstico

oral e da doença periodontal estão direcionando os métodos para que o risco e

atividade periodontal possam ser identificados e quantificados por mensurações

objetivas tais como biomarcadores, que são encontrados em amostras de fluido

crevicular gengival, soro e saliva e que podem potencialmente ser usados como

marcador de diagnóstico

Interleucina-6 (IL-6) ordena a transição de inflamação aguda para crônica pela

modificação do infiltrado leucocitário inato (de neutrófilos polimorfonucleares para

monócitos/ macrófagos) e exerce efeito estimulador nas células T e B, favorecendo

a resposta crônica inflamatória

. Além disso, estimula a diferenciação celular de

células progenitoras mesenquimais para a linhagem osteoblástica, é um potente

agente anti-apoptótico nas células osteoblásticas, podendo favorecer a reabsorção

óssea e induz a produção de metaloproteinases

. Dessa forma, IL-6 parece ser um

indicador útil ou um marcador de diagnóstico para periodontite

Metaloproteinase da matriz-8 (MMP-8) é a principal metaloproteinase (MMP)

destrutiva, envolvida na patogênese da periodontite, sendo encontrada em grandes

quantidades em biópsias gengivais e em fluidos orais

. O neutrófilo

polimorfonuclear é uma das células que produzem MMP-8, embora os fibroblastos

também possam expressá-la

. Então, a literatura sugere que a MMP-8 tem um

importante papel no monitoramento da periodontite

A osteoprotegerina (OPG) é um membro da família de receptor do fator de

necrose tumoral (TNF), que é expresso por osteoblastos. A função da OPG é reduzir

a interação entre o ligante do receptor ativador do fator kappa B nuclear (RANKL) e

o receptor ativador do fator kappa B nuclear (RANK) da superfície celular, devido ao

RANKL potencialmente estimular osteoclastos a aumentarem a reabsorção óssea.

Então, quando a OPG liga-se ao RANKL, sua ação é bloqueada, reduzindo a

quantidade de reabsorção óssea

. Uma hipótese razoável é que a destruição óssea

na periodontite está associada com a perturbação do equilíbrio entre RANKL e OPG.

Por exemplo, elevados níveis de RANKL e/ou baixos níveis de OPG nos fluidos e

tecidos resultam em um excesso de quantidade de RANKL livre capaz de estimular

RANK, dessa forma, aumentando a reabsorção óssea por osteoclastos. Algumas

citocinas, tais como Interleucina-1 (IL-1) e IL-6, são conhecidas por modular as

concentrações de RANKL e OPG

A saliva tem o potencial para ser usada como um fluido diagnóstico para

doença oral bem como o fluido crevicular gengival e o soro

19,20

. Além disso, pode ser

facilmente coletado, contém marcadores derivados localmente e sistemicamente,

que consequentemente, podem oferecer base para um teste de diagnóstico

específico para a periodontite

. De acordo com Pellegrini et al.

e Ito et al.

, a

mensuração de biomarcadores na saliva pode servir como hábil instrumento para

monitorar e predizer a susceptibilidade à periodontite, fornecer informação para a

severidade da doença e monitorar a efetividade da terapia periodontal.

Considerando o acúmulo de evidências e a necessidade de investigar ainda

mais os biomarcadores inflamatórios na periodontite associada ao diabetes, o

objetivo deste estudo foi mensurar as concentrações salivares de IL-6, MMP-8 e

OPG em pacientes com periodontite associada ou não ao diabetes mellitus tipo 2.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 População do Estudo

Esse estudo foi conduzido em conjunto com o Departamento de Cirurgia e

Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e Periodontia e o Departamento de Medicina

Interna – Divisão de Doenças Metabólicas e Endocrinológicas da Universidade de

São Paulo. E foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da

Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, n

2007.1.104.58.0 (Anexo A). Todos

os indivíduos foram, individualmente, informados sobre a natureza do estudo

proposto e assinaram o termo de consentimento (Anexo B).

Os indivíduos foram submetidos à anamnese, exame clínico e radiográfico.

Os pacientes diabéticos tiveram os níveis de hemoglobina glicada (HbA1c)

verificados pelo Setor Ambulatorial da Clínica de Endocrinologia – Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

De acordo com a condição periodontal e o padrão geral de saúde, os indivíduos

foram incluídos no estudo.

Os critérios de inclusão foram: (i) presença de pelo menos 15 dentes; (ii) no

mínimo, um sítio com profundidade de sondagem ≥ 5mm e dois dentes com perda

de inserção ≥ 6mm

; (iii) idade acima de 35 anos. Os critérios de exclusão incluíam:

(i) uso de antibióticos ou tratamento periodontal nos últimos 6 meses; (ii) história

positiva de tabagismo no prazo de cinco anos; (iii) grávidas ou lactentes; (iv) terapia

medicamentosa, exceto para condição diabética; (v) presença de condições

inflamatórias; (vi) complicações graves do diabetes.

Um total de 90 indivíduos foi dividido em quatro grupos: 22 indivíduos

saudáveis (Controle), 24 pacientes com doença periodontal (DP), 20 pacientes

apenas com diabetes mellitus (DM), 24 pacientes com doença periodontal e diabetes

mellitus (DP+DM).

2.2 Parâmetros Clínicos

O exame clínico foi realizado por único examinador experiente e registrado

em seis sítios por dente, com auxílio de uma sonda periodontal computadorizada

(Figura 1). Os parâmetros verificados foram: profundidade de sondagem (PS), nível

clínico de inserção relativo (NIC), sangramento à sondagem (SS), supuração (SUP)

e número de dentes (n. dentes).

Figura 1. Sonda periodontal computadorizada

2.3 Coleta das Amostras de Saliva

Saliva total não-estimulada foi coletada (~3ml) de cada indivíduo em tubos

estéreis, de acordo com o método descrito por Navazesh

. Os indivíduos estavam

impedidos de comer, beber e higienizar a boca durante 2 horas antes da coleta de

saliva. As amostras de saliva foram colocadas imediatamente no gelo e aliquotadas

antes do congelamento a -80

C (Figura 2).

Florida Probe®, Florida Probe Corporation, Gainsville, FL

Figura 2. Saliva não-estimulada em tubo estéril e aliquotada

2.4 Análise das Proteínas Salivares

As concentrações salivares de IL-6, MMP-8, OPG e Proteína Total foram

determinadas em duplicatas para cada indivíduo, utilizando ensaio imunoenzimático

(ELISA). Cada kit

para o ensaio da IL-6, MMP-8, OPG e Proteína Total foi realizado

com um anticorpo monoclonal específico para cada molécula em questão e

quantificado em placas para teste ELISA de 96 poços (Figura 3), de acordo com as

instruções do fabricante.

Figura 3. Placa de 96 poços para ELISA

Brevemente, todos os reagentes foram levados para uma temperatura

ambiente, e o diluente foi adicionado em cada poço. Os modelos padrões ou

Human Quantikine IL-6 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

Human MMP-8/OPG DuoSet kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

Bio-Rad Bradford Total Protein Assay Kit, Bio-Rad, California, USA

amostras desconhecidas foram então adicionados aos poços em duplicata. Após um

período de incubação, os poços foram lavados quatro vezes com solução tampão

seguidas da adição de um segundo anticorpo específico de citocina-conjugada. A

placa foi novamente incubada em temperatura ambiente e lavada em seguida. Um

substrato foi adicionado em todos os poços e incubado (Figura 4), seguido de uma

solução de parada. O desenvolvimento e a intensidade da cor foram quantificados

utilizando um leitor

de placas para ELISA (Figura 5). Uma curva padrão foi feita

usando os padrões fornecidos no kit, e as concentrações das proteínas foram

calculadas com base na curva padrão. Para o ensaio da Proteína Total, albumina

sérica bovina (BSA) foi usada como padrão.

Figura 4. Reação do ELISA

Figura 5. Leitor de placas para ELISA

2.5 Mensuração da Hemoglobina Glicada (HbA1c)

Os níveis de HbA1c foram utilizados para a avaliação metabólica nos

pacientes diabéticos. Os dados para HbA1c foram mensurados por cromatografia de

µQuant, Biotek Instruments,Vemont, USA

troca iônica HPLC (cromatografia líquida de alta pressão) e os valores obtidos foram

expressos em porcentagem.

2.6 Análise Estatística

Os dados foram registrados como média ± desvio padrão e a unidade

experimental foi o indivíduo. A análise Kruskal-Wallis One Way e o teste Mann-

Whitney foram aplicados tanto para comparar os parâmetros clínicos entre os grupos

como as concentrações das proteínas salivares dos grupos. As correlações entre as

concentrações das proteínas salivares, os parâmetros clínicos e os níveis de HbA1c

foram calculadas pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman. Os dados

foram testados para normalidade antes de aplicar os testes adequados,

paramétricos ou não-paramétricos. Para todas as análises estatísticas, adotou-se o

nível de significância de 5% (p<0,05).

3 RESULTADOS

3.1 Características Demográficas e Clínicas

Os parâmetros clínicos, a idade, o sexo e as concentrações das proteínas

salivares foram mensurados nas amostras de saliva de 90 indivíduos: 22 saudáveis,

24 pacientes com doença periodontal, 20 pacientes apenas com diabetes mellitus

tipo 2, 24 pacientes com doença periodontal e diabetes mellitus tipo 2. Sessenta

eram mulheres e trinta, homens.

A idade e os parâmetros clínicos dos participantes recrutados para este

estudo estão resumidos na Tabela 1. As médias de idade dos grupos Controle, DP e

DP+DM foram semelhantes, 43,7 ± 1,6; 45,4 ± 1,2 e 47,8 ± 1,4 respectivamente.

Somente a média de idade do grupo DM (53,3 ± 2,0) foi mais alta que nos outros

grupos. A maioria dos indivíduos participantes tinha mais que 20 dentes, com média

de 26,4 para o grupo Controle, 23,7 para o grupo DP, 23,4 para o grupo DM e 21,5

para o grupo DP+DM.

Em relação aos parâmetros clínicos, somente SUP não foi estatisticamente

significante entre os grupos (p=0,078). Dessa forma, os dados mostraram que os

outros parâmetros clínicos avaliados, PS, PS≤3, PS4-6, PS≥7, NIC e SS, foram

estatisticamente significantes (p<0,05). Os grupos sem periodontite, Controle e DM,

apresentaram médias semelhantes para os parâmetros clínicos, enquanto que os

grupos DP e DP+DM não tiveram diferenças estatisticamente significantes entre eles

(p>0,05). Diferenças estatisticamente significantes foram encontradas somente

quando os grupos DP e DP+DM foram comparados ao grupo Controle ou ao grupo

DM.

Os grupos Controle e DM mostraram ausência ou poucos sinais de

inflamação (SS=0,1 ± 0,1 e 1,2 ± 0,4 respectivamente) e ausência de bolsas

periodontais; visto que para os grupos DP e DP+DM, inflamação e bolsas

periodontais sempre estavam presentes. Altas médias de NIC nos grupos DP e

DP+DM podem ser interpretadas como um indicador de periodontite. Embora as

médias de PS não tenham sido altas nos grupos DP e DP+DM (3,06 ± 0,13 e 2,83 ±

0,17 respectivamente), estes grupos mostraram vários sítios com bolsas

periodontais de 4 a 6mm (PS4-6), caracterizando doença periodontal estabelecida

(DP=32,9 ± 4,2; DP+DM=28,5 ± 3,4). Além disso, os grupos DP e DP+DM

apresentaram periodontite crônica moderada, portanto, os pacientes apresentaram

poucas bolsas periodontais ≥ 7 mm (PS≥7), PD=4,7 ± 1,1; DP+DM=5,5 ± 2,2.

3.2 Concentração das Proteínas Salivares

As concentrações de IL-6 e OPG estão apresentadas em picograma por

mililitro (pg/ml) de saliva, e as concentrações de MMP-8 em nanograma por mililitro

(ng/ml) de saliva no Gráfico 1. O limite de detecção foi 3.13 - 300 pg/ml para IL-6,

62.5 - 4000 pg/ml para MMP-8 e OPG.

Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre todos os

grupos para as três proteínas salivares, com IL-6 (p=0,006); MMP-8 (p=0,004) e

OPG (p=0,032). Em relação a IL-6, o grupo Controle mostrou a média da

concentração significativamente menor que as médias dos grupos DP e DP+DM,

enquanto que a média do grupo DM foi significativamente menor só quando

comparada ao grupo DP+DM. Para MMP-8, a concentração do grupo Controle foi

significativamente menor que a dos outros grupos e nenhuma diferença entre os

grupos doentes (DP, DM e DP+DM) foi detectada. A média da concentração de OPG

foi estatisticamente diferente entre os grupos Controle e DM, e DP e DM (Tabela 2).

Somente as amostras que ficaram dentro do limite de detecção para o ensaio foram

consideradas nas análises estatísticas.

As concentrações de Proteína Total estão apresentadas em miligrama por

mililitro (mg/ml) de saliva no Gráfico 2. Somente os grupos Controle e DP+DM

apresentaram diferenças estatisticamente significantes, p=0.003.

3.3 Parâmetro Metabólico

A variação normal para saúde dos níveis de HbA1c é de 4,5 – 6%. No

presente estudo, os níveis de HbA1c foram 7,8% para o grupo DM e 8,5% para o

grupo DP+DM, sem diferença estatisticamente significante entre eles (p=0,052).

Estes dados também mostraram que o grupo DP+DM apresentou inadequado

controle glicêmico.

3.4 Correlação entre Parâmetros Clínicos e Proteínas Salivares

Para o grupo Controle, os dados mostraram uma correlação negativa entre as

concentrações de MMP-8 com PS≤3 (r= -0,62; p=0,054) e com n. dentes (r= -0,64;

p=0,047) (Tabela 3). No grupo DP, os parâmetros clínicos n. dentes e SS foram

correlacionados com as concentrações salivares de IL-6 (r= -0,44; p=0,036 e r=0,48;

p=0,020 respectivamente). No mesmo grupo, PS≥7 correlacionou-se com elevadas

concentrações de MMP-8 (r=0,46; p=0,030) e o parâmetro SUP, com OPG salivar

(r= -0,55; p=0,018) (Tabela 4). Para os grupos DM e DP+DM, nenhuma correlação

estatisticamente significante foi encontrada com os parâmetros clínicos (Tabelas 5 e

6 respectivamente).

3.5 Correlação entre Parâmetro metabólico e Parâmetros Clínicos e Proteínas

Salivares

Os dados mostraram que HbA1c teve correlação estatisticamente significante

com alguns parâmetros clínicos como PS (r=0,31; p=0,049), PS≤3 (r= -0,39;

p=0,013), NIC (r=0,36; p=0,022) e n. dentes (r= -0,40; p=0,011) nos grupos DM e

DP+DM (Tabela 7). Em relação às proteínas salivares, somente a IL-6 foi

correlacionada positivamente com HbA1c (r=0,54; p<0,000) (Tabela 8).

Tabela 1. Parâmetros clínicos e idade (média ± erro padrão) dos grupos

Parâmetros

Clínicos

grupo Controle grupo DP grupo DM grupo DP+DM p

Idade (anos)

43,7 ± 1,6

45,4 ± 1,2

53,3 ± 2,0

a,b,c

47,8 ± 1,4

0,002*

PS (mm)

2,05 ± 0,06

a,b

3,06 ± 0,13

a,c

2,11 ± 0,03

c,d

2,83 ± 0,17

b,d

<0,000*

PS≤3 (sítios)

158,3 ± 4,1

a,b

103,6 ± 5,5

a,c

140,4 ± 5,9

c,d

95,1 ± 6,2

b,d

<0,000*

PS4-6 (sítios)

a,b

32,9 ± 4,2

a,c

c,d

28,5 ± 3,4

b,d

<0,000*

PS≥7 (sítios)

a,b

4,7 ± 1,1

a,c

c,d

5,46 ± 2,2

b,d

<0,000*

NIC (mm)

2,09 ± 0,06

a,b

3,82 ± 0,22

a,c

2,21 ± 0,03

c,d

3,81 ± 0,25

b,d

<0,000*

n. dentes

26,4 ± 0,7

23,7 ± 0,5 23,4 ± 1,0 21,5 ± 0,9

<0,000*

SS (%)

0,1 ± 0,1

a,b

19,0 ± 4,2

a,c

1,2 ± 0,4

15,0 ± 5,4

<0,000*

SUP (%)

0 1 ± 0,0 0 0,3 ± 0,2 NS

*p é estatisticamente significante para análise Kruskal-Wallis One Way.

NS: diferença estatisticamente não significante para análise Kruskal-Wallis One Way.

Para o teste Mann-Whitney, níveis conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (p<0,05).

Gráfico 1. Concentrações das proteínas salivares dos grupos determinadas pelo ELISA

(A)

IL-6

Controle DP DM DP+DM

grupos

concentração (pg/ml)

(B)

MMP-8

100

200

300

400

500

600

Contr ole DP DM DP+DM

grupos

concentração (ng/ml)

(C)

OPG

400

800

1200

1600

Contr ole DP DM DP+DM

grupos

concentração (pg/ml)

(A) Comparação da concentração (pg/ml) de Interleucina-6 (IL-6) na saliva determinada pelo

ELISA; para análise Kruskal-Wallis One Way, p=0,006. (B) Comparação da concentração (ng/ml) de

Metaloproteinase da matriz-8 (MMP-8) na saliva determinada pelo ELISA; análise Kruskal-Wallis One

Way, p=0,004. (C) Comparação da concentração (pg/ml) de Osteoprotegerina (OPG) na saliva

determinada pelo ELISA; análise Kruskal-Wallis One Way, p=0,032.

* Para o teste Mann-Whitney, groups connected are significantly differents (p<0,05).

Tabela 2. Concentrações das proteínas salivares (média ± erro padrão) dos grupos

determinadas pelo ELISA

Proteínas

Salivares

grupo Controle grupo DP grupo DM grupo DP+DM p

IL-6 (pg/ml)

9,81±2,70

a,b

20,22±4,00

10,50±1,91

31,14 ± 7,99

b,c

0,006*

MMP-8 (ng/ml)

104,17±64,30

a,b,c

296,35±43,22

395,88±75,22

406,961±75,79

0,004*

OPG (pg/ml)

740,22±177,09

982,02±274,15

1552,58±254,84

a,b

1284,83±240,14 0,032*

*p é estatisticamente significante para análise Kruskal-Wallis One Way.

Para o teste Mann-Whitney, níveis conectados pela mesma letra são significativamente diferentes (p<0,05).

Gráfico 2. Comparação das concentrações salivares da Proteína Total (mg/ml) entre

os grupos, determinadas por ELISA

Proteína Total

Controle DP DM DP+DM

grupos

concentração (mg/ml)

Para análise Kruskal-Wallis One Way, p=0,042.

* Para o teste Mann-Whitney, níveis conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

(p<0,05).

Tabela 3. Correlações entre parâmetros clínicos e proteínas salivares do grupo

Controle

Proteínas Salivares

IL-6 MMP-8 OPG

Parâmetros

Clínicos

r p r p r p

0,07 NS 0,11 NS 0,18 NS

PS≤3

-0,39 NS -0,62 0,050* 0,01 NS

PS4-6

** ** **

PS≥7

** ** **

NIC

0,04 NS 0,10 NS 0,20 NS

n. dentes

-0,39 NS -0,64 0,047* 0,01 NS

0,22 NS 0,34 NS -0,11 NS

SUP

** ** **

*p é estatisticamente significante para correlação não-paramétrica de Spearman (p<0,05).

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para correlação não-paramétrica de

Spearman.

**Variáveis não testadas devido à ausência dos parâmetros clínicos.

Tabela 4. Correlações entre parâmetros clínicos e proteínas salivares do grupo DP

Proteínas Salivares

IL-6 MMP-8 OPG

Parâmetros

Clínicos

r p r p r p

0,00 NS 0,32 NS -0,05 NS

PS≤3

-0,13 NS -0,38 NS -0,11 NS

PS4-6

-0,06 NS 0,32 NS 0,04 NS

PS≥7

0,11 NS 0,46 0,030* 0,00 NS

NIC

0,11 NS 0,36 NS 0,06 NS

n. dentes

-0,44 0,036* -0,25 NS -0,20 NS

0,48 0,020* -0,17 NS -0,00 NS

SUP

-0,32 NS -0,01 NS -0,55 0,018*

*p é estatisticamente significante para correlação não-paramétrica de Spearman (p<0,05).

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para correlação não-paramétrica de

Spearman.

Tabela 5. Correlações entre parâmetros clínicos e proteínas salivares do grupo DM

Proteínas Salivares

IL-6 MMP-8 OPG

Parâmetros

Clínicos

r p r p r p

0,36 NS 0,15 NS 0,25 NS

PS≤3

-0,18 NS -0,05 NS 0,21 NS

PS4-6

** ** **

PS≥7

** ** **

NIC

0,39 NS 0,15 NS 0,17 NS

n. dentes

-0,18 NS -0,05 NS 0,21 NS

0,06 NS 0,31 NS 0,07 NS

SUP

** ** **

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para correlação não-paramétrica de Spearman.

**Variáveis não testadas devido à ausência dos parâmetros clínicos.

Tabela 6. Correlações entre parâmetros clínicos e proteínas salivares do grupo

DP+DM

Proteínas Salivares

IL-6 MMP-8 OPG

Parâmetros

Clínicos

r p r p r p

0,02 NS -0,22 NS -0,20 NS

PS≤3

0,12 NS -0,06 NS 0,33 NS

PS4-6

0,01 NS -0,06 NS 0,02 NS

PS≥7

0,08 NS -0,06 NS -0,02 NS

NIC

0,07 NS 0,09 NS -0,13 NS

n. dentes

-0,10 NS -0,31 NS 0,21 NS

-0,04 NS -0,17 NS 0,15 NS

SUP

0,21 NS -0,17 NS 0,32 NS

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para correlação não-paramétrica de Spearman.

Tabela 7. Correlações entre níveis de HbA1c e parâmetros clínicos dos grupos DM e

DP+DM

HbA1c

Parâmetros

clínicos

r p

0,31 0,049*

PS≤3

-0,39 0,013*

PPD 4-6

0,24 NS

PPD≥7

0,28 NS

NIC

0,36 0,022*

SUP

0,25 NS

0,10 NS

n. dentes

-0,40 0,011*

*p é estatisticamente significante para correlação não-

paramétrica de Spearman (p<0,05).

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para

correlação não-paramétrica de Spearman.

Tabela 8. Correlações entre níveis de HbA1c e proteínas salivares dos grupos DM e

DP+DM

HbA1c

Proteínas

salivares

r p

IL-6

0,54 <0,000*

MMP-8

0,22 NS

OPG

-0,13 NS

*p é estatisticamente significante para correlação não-

paramétrica de Spearman (p<0,05).

r: valor da correlação.

NS: diferença estatisticamente não significante para

correlação não-paramétrica de Spearman.

4 DISCUSSÃO

Estudos anteriores verificaram a relação entre o diabetes e a periodontite

como sendo bidirecional, sugerindo que o diabetes é um fator de risco à

periodontite

assim como o tratamento periodontal pode ter influência sobre o

controle glicêmico

Os dados desse estudo demonstraram que as concentrações de IL-6 são

mais altas em locais que apresentam inflamação periodontal (pacientes dos grupos

DP e DP+DM) em comparação a locais sem inflamação (grupos Controle e DM).

Além disso, os dados mostraram elevada concentração de MMP-8 e OPG em

amostras de saliva de pacientes diabéticos (grupos DM e DP+DM).

No presente estudo, a análise dos dados sugeriu que altas concentrações de

IL-6 na saliva de pacientes periodontais (grupos DP e DP+DM) podem ser

relevantes para a modulação da periodontite, como indicado pelos parâmetros

clínicos destes grupos. A detecção de elevadas concentrações de IL-6 na saliva de

pacientes com periodontite foi consistente com as concentrações observadas por

Kurtis et al.

e Mengel et al.

. As concentrações de IL-6 foram positivamente

correlacionadas com SS e negativamente com o n. dentes no grupo DP,

concordando com o fato de que esta citocina está associada às respostas

inflamatórias crônicas

e ao aumento da reabsorção óssea, o que pode provocar a

perda dentária

. Em contraste, as concentrações salivares de IL-6 não estavam

associadas aos parâmetros clínicos do grupo Controle.

A formação de AGEs tem sido relatada como tendo um importante papel na

modulação da expressão de citocinas, como IL-6, em pacientes diabéticos

Contudo, nossos resultados apresentaram menores concentrações de IL-6 em

amostras do grupo DM, e nenhuma significância estatística entre os grupos DP e

DP+DM foi encontrada. Uma razoável explicação para esses resultados pode ser em

relação ao tratamento do diabetes tipo 2 com insulina, que reduz os efeitos da IL-1 e

da IL-6

. Outra possível explicação seria que as concentrações reduzidas de IL-6 no

grupo DM podem ser um mecanismo compensatório pelas concentrações de outras

citocinas estarem aumentadas devido à ação dos AGEs. Dessa forma, o

monitoramento de um amplo grupo de citocinas poderia explicar esse fenômeno.

Adicionalmente, segundo O’Connell et al.

, os níveis de HbA1c estão relacionados

com a concentração de alguns biomarcadores. Em acordo com esse estudo, nossos

resultados mostraram uma correlação positiva entre a concentração de IL-6 e os

níveis de HbA1c. Desse modo, nossos achados sugerem que a IL-6 salivar pode ser

testada como um sensível marcador para a inflamação periodontal.

Em relação à MMP-8, esta proteína é um dos principais participantes no

colapso do colágeno durante a destruição periodontal e pode estar presente no

fluido crevicular gengival e na saliva

. Assim como nos estudos de Miller et al.

Christodoulides et al.

, a concentração de MMP-8 foi maior em amostras de saliva

de pacientes com periodontite (DP e DP+DM) quando ao grupo Controle. Também

de acordo com estes autores

19,33

, a média de MMP-8 teve correlação inversa com

PS≤3 e o n. dentes no grupo controle, indicando que quanto mais sítios sadios e

dentes o paciente possuir, menor será a concentração da MMP-8. Por outro lado, a

média da MMP-8 teve uma correlação positiva com PS≥7 no grupo DP. A detecção

de MMP-8 salivar e as correlações entre suas concentrações e alguns parâmetros

clínicos estão de acordo com Chen et al.

, que sugere que a MMP-8 tem um

importante papel no monitoramento da periodontite.

Entretanto, nossos dados também mostraram concentrações elevadas de

MMP-8 nas amostras de saliva de pacientes diabéticos com ou sem periodontite

(grupos DM e DP+DM). De acordo com a literatura

34,35

, o diabetes tem sido

associado ao metabolismo alterado do colágeno. O estudo de Collin et al.

mostrou

que a maioria das MMPs na saliva de pacientes diabéticos do tipo 2 são MMP-8 e

MMP-9. Além disso, Sorsa et al.

relataram que a concentração aumentada de

MMP-8 nos pacientes diabéticos era independente dos fatores bacterianos,

indicando que a concentração de MMP-8 nestes pacientes pode não estar

relacionada somente à periodontite. Dessa forma, embora a literatura relate que a

MMP-8 possa ser um marcador para a periodontite, o diabetes pode superestimar os

valores desta MMP.

Altas concentrações de OPG foram detectadas em amostras de saliva de

pacientes diabéticos (grupos DM e DP+DM). Uma possibilidade é que os níveis

séricos de glicose ou proteínas glicadas afetem o ensaio para a OPG

, mas não

encontramos correlação entre as concentrações de OPG e níveis de HbA1c nos

pacientes diabéticos, sugerindo que esta pode não ser uma explicação razoável.

Outra hipótese é que as concentrações de OPG refletem a presença de doenças

vasculares em curso, o que é uma complicação comum no diabetes

Recentemente, concentrações plasmáticas elevadas de OPG foram relatadas em

pacientes diabéticos tipo 2 e foram associadas a complicações microvasculares e a

doença assintomática das artérias coronais assim como a função endotelial

prejudicada

. Alguns estudos

39,40

sugeriram que concentrações elevadas de OPG

representam um incompleto mecanismo de defesa contra outros fatores que

promovam a calcificação arterial, aterosclerose e outras formas de dano vascular;

atuando como uma importante molécula reguladora na vasculatura. Os resultados

do presente estudo são similares aos dados de pacientes com diabetes tipo 2 como

previamente relatado por Browner et al.

e Xiang et al.

, sugerindo que a OPG

pode afetar os estágios iniciais da aterosclerose em pacientes diabéticos.

Além disso, os resultados não apresentaram diferença estatisticamente

significante entre a concentração de OPG no grupo DP e no grupo Controle,

confirmando os resultados de OPG encontrados por Miller et al.

. Parece que a

concentração de OPG na saliva não está bem definida na saúde ou doença. O papel

da OPG no metabolismo ósseo leva à hipótese de que suas concentrações estariam

aumentadas em circunstâncias que requeiram a inibição da osteoclastogênese. Um

dos possíveis mecanismos biológicos atuantes é que um aumento nos precursores

dos osteoclastos possa levar a uma regulação aumentada da OPG. Por sua vez, a

OPG inibiria um aumento no número dos precursores de osteoclastos. Contudo,

durante a destruição periodontal, pode haver um limiar onde a OPG está operando

em sua capacidade máxima, mas não consegue superar o número excessivo de

precursores de osteoclastos, o que resultaria em remodelação óssea

. Uma vez

que a periodontite tem períodos de remissão, a remodelação óssea talvez não

estivesse em curso durante a amostragem deste estudo. Isto pode explicar a menor

concentração média de OPG no grupo DP quando comparado ao grupo Controle.

Assim sendo, a OPG pode não ser o marcador mais apropriado para avaliar a

reabsorção óssea ativa na periodontite.

O teste da hemoglobina glicada (HbA1c) mede a quantidade de glicose

irreversivelmente ligada à molécula da hemoglobina, sendo também utilizado como

um instrumento de monitoração do controle glicêmico no diabetes

. Os pacientes

DM apresentaram níveis glicêmicos pouco acima do limite do controle adequado do

diabetes, mas no grupo DP+DM, a média da HbA1c indicou um controle glicêmico

inadequado. Os estudos de Novaes et al.

mostraram que o diabetes não-

controlado ou mal controlado está associado com uma maior susceptibilidade a

infecções orais, incluindo a periodontite. Por outro lado, a presença de periodontite

pode agravar o controle glicêmico

. Em um estudo longitudinal

, pacientes com

diabetes tipo 2 e com periodontite severa demonstraram um controle glicêmico

inadequado quando comparados aos pacientes diabéticos com destruição

periodontal mínima. No presente estudo, os dados mostraram correlação positiva

entre os níveis de HbA1c e alguns parâmetros clínicos (PS, NIC) e correlação

inversa com PS≤3 e com o n. dentes nos grupos DM e DP+DM. Contudo, não há

como saber se os níveis altos de HbA1c interferiram na periodontite ou vice-versa.

O teste ELISA para RAGE foi realizado, mas não foi possível detectar a

concentração da RAGE na saliva usando o kit Human Quantikine RAGE ELISA

Yoon et al.

caracterizaram os AGEs na saliva de pacientes diabéticos com

espectroscopia de ressonância magnética nuclear, mas não os RAGEs. Katz et al.

analisaram os AGEs na periodontite usando imunohistoquímica e reação em cadeia

da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) em biópsias gengivais.

A concentração total de proteínas salivares apresenta-se similar nos

pacientes diabéticos

, periodontais

e nos indivíduos controle. No presente estudo,

a concentração total de proteínas salivares foi dosada a fim de checar se havia

discrepâncias entre os grupos que pudessem comprometer os resultados dos

biomarcadores específicos; contudo, esse comprometimento não foi verificado. Foi

possível observar que as maiores concentrações no grupo DP+DM, quando

comparado ao grupo Controle, podem ser explicadas por elevado conteúdo de

Human Quantikine RAGE ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

proteínas que se originam a partir da ativação do mecanismo de defesa do

hospedeiro contra o processo inflamatório

A pequena diferença na concentração total de proteína salivar entre os grupos

pode também estar relacionada ao fluxo salivar que varia entre os pacientes e nos

próprios pacientes. Algumas medicações afetam o fluxo salivar assim como doenças

sistêmicas

. Mudanças no fluxo salivar podem apresentar um impacto significante

na concentração de proteínas na saliva. Ainda, a composição de saliva estimulada e

não-estimulada difere, o que pode afetar as proteínas de interesse

. No presente

estudo, a saliva total foi coletada de forma não-estimulada como realizado em outros

estudos semelhantes

19,23,50

. Dodds et al.

mostraram que o fluxo salivar total

estimulado e não-estimulado não foi afetado pelo estado do diabetes ou pelo

controle do nível glicêmico.

5 CONCLUSÕES

• Dentro dos limites do presente estudo, os dados indicam que a saliva é um

identificador adequado dos biomarcadores inflamatórios da periodontite com

ou sem diabetes.

• Os dados suportam que a IL-6 é um biomarcador candidato da periodontite

associada ou não ao diabetes na saliva.

• A análise dos resultados sugere que OPG e MMP-8 não são marcadores mais

indicados para determinar o colapso periodontal, pois não foi possível

diferenciar, por estes marcadores, os quadros de periodontite e de

periodontite associada ao diabetes.

• Alternativamente, outros biomarcadores inflamatórios devem ser avaliados

para a susceptibilidade individual à periodontite bem como para o diagnóstico

da periodontite associada ou não ao diabetes.

• Baseado nestes achados, sugere-se que o papel do diabetes na modulação

da periodontite pode envolver a super-expressão da MMP-8 e da OPG.

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ARTIGO EM INGLÊS

Salivary Biomarkers of Periodontal Patients with Type 2 Diabetes Mellitus

Priscila P Costa*

Mario Taba Jr.*

Glauce L Trevisan*

Viviane K S Kawata*

Guilherme O Macedo*

Arthur B Novaes Jr.*

Sergio L S Souza*

Marcio F M Grisi*

Daniela B Palioto*

*Department of Oral Surgery and Periodontology, University of São Paulo, Ribeirão

Preto School of Dentistry.

Number of figures and tables: 02 figures and 03 tables

Running title: Salivary Biomarkers in Periodontal Patients

Correspondence: Mario Taba Jr. Department of Oral Surgery and Periodontology,

University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Dentistry, Avenida do Café - s/n,

post code: 14040-904, Ribeirão Preto, SP, Brazil; e-mail: [email protected]; fax

number: 55 16 36024788.

One-Sentence Summary

This study found that saliva is an adequate identifier of biomarkers for periodontitis.

Also, the IL-6 concentration was higher in periodontal patients with or without

diabetes supporting that IL-6 may be a candidate periodontal biomarker in saliva.

The MMP-8 and OPG concentrations were higher in diabetic patients and it is not

possible to distinguish the condition of periodontitis and periodontitis associated to

diabetes by both markers. Therefore, OPG and MMP-8 may be not the most

appropriate markers for periodontitis.

ABSTRACT

Background: Association of diabetes and periodontitis produces an inflammatory

proteins discharge that can be reflected in saliva. The aim of this study was to

measure salivary concentrations of interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinase-8

(MMP-8) and osteoprotegerin (OPG) in patients with chronic periodontitis associated

or not to type 2 diabetes mellitus.

Methods: A total of 90 subjects was divided in four groups: healthy (Control, n=22),

patients with Periodontal Disease (PD, n=24), Diabetes Mellitus only (DM, n=20),

Periodontal Disease and Diabetes Mellitus (PD+DM, n=24). Clinical and metabolic

data were recorded. Non-stimulated saliva samples were analyzed by enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA).

Results: Significant differences were detected between groups for the biomarkers

(p<0.05). Regarding IL-6, significant differences were found comparing Control with

PD and with PD+DM, and comparing PD+DM with DM groups (p<0.005). For MMP-

8, the concentrations mean of the Control group was significantly lower than all the

diseased groups (p<0.01), and no differences between diseased groups were

detected. For OPG, significant differences were found between Control and PD, and

between Control and DM groups (p<0.05). All clinical parameters were significant

between groups (p<0.001), except suppuration. In PD group, BOP (bleeding on

probing) showed positive correlation with IL-6 concentrations (r=0.48; p<0.05),

PPD≥7 (pocket depth≥7mm) correlated positively with MMP-8 concentrations

(r=0.46; p<0.05), also HbA1c levels correlated positively with IL-6 concentrations

(r=0.54; p<0.000).

Conclusion: Saliva is an adequate substrate for inflammatory biomarkers

identification in periodontal patients. IL-6 is a candidate biomarker for periodontitis

and periodontitis associated to diabetes in the saliva.

Key words: Periodontitis, Diabetes mellitus; Saliva; Biomarkers

INTRODUCTION

Periodontitis is an inflammatory disease which results from an imbalance in

the interactions between the periodontal microflora and the multifaceted response of

the host’s immune system

. This imbalance causes the overexpression of

proinflammatory cytokines and the subsequent destruction of connective tissue

attachment and alveolar bone

Evidences demonstrate that diabetes is a risk factor for periodontitis

Diabetes mellitus is a metabolic disorder, characterized by hyperglycemia resulting

from defects in insulin secretion or insulin action

. It has been shown that

hyperglycemia may glycate body proteins, forming advanced glycation end products

(AGEs). The AGEs in the periodontium stimulates monocytes recruitment to the site

and interact with their receptors (RAGEs) on the cell surface of these monocytes.

The AGE–RAGE interaction induces a change in monocyte phenotype, upregulating

the cell and significantly increasing the production of proinflammatory cytokines

. In

addition, diabetes may modulate periodontal tissue destruction by reducing the

polymorphonuclear leukocyte function, including chemotaxis, adherence, and

phagocytosis

Diabetes and periodontitis are common chronic diseases in adults. Both

diseases are high prevalent in world’s population, and it is estimated that 1 – 6% of

the general population suffer from diabetes

. On the other hand, periodontal disease

afflicts over 50% of the adult population in the United States

Traditional periodontal diagnosis includes clinical parameters and radiographs

to assess alveolar bone level

. However, advances in the diagnosis of oral and

periodontal diseases are moving toward methods whereby periodontal activity can be

identified and quantified by objective measures such as biomarkers found in gingival

crevicular fluid, serum and saliva and can potentially be used as diagnostic

markers

Interleukin-6 (IL-6) dictates the transition from acute to chronic inflammation by

changing the nature of leucocyte infiltrate (from polymorphonuclear neutrophils to

monocyte/macrophages), and it exerts stimulatory effects on T- and B-cells, favoring

chronic inflammatory response

. In addition, it stimulates mesenchymal progenitor

cell differentiation toward the osteoblastic lineage, is a potent anti-apoptotic agent on

osteoblastic cells, increasing bone resorption and induces production of matrix

metalloproteinases

. Thus, IL-6 may be a useful indicator or a diagnostic marker for

periodontitis

Matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) is the major destructive metalloproteinase

(MMP), implicated in the pathogenesis of periodontitis and is found in large amounts

in gingival biopsies and oral fluids

. Polymorphonuclear neutrophil is one of the cells

that produce MMP-8, although gingival fibroblasts can also express it

. Thus,

literature suggests that MMP-8 plays an important role in monitoring periodontitis

Osteoprotegerin (OPG) is a member of the tumor necrosis factor (TNF)

receptor family that is expressed by osteoblasts. The function of the OPG, a decoy

receptor, is to reduce interaction between receptor activator of nuclear factor-kappa

B ligand (RANKL) and the receptor activator of nuclear factor-kappa B (RANK) since

RANKL can potentially stimulate osteoclasts to induce bone resorption, and when

blocked by OPG, the amount of bone resorption may be reduced

. A reasonable

hypothesis is that the bone destruction seen in periodontitis is associated to a

disturbance in the balance of RANKL and OPG, for example, elevated RANKL

concentrations and/or lower OPG concentrations in fluids and tissues result in an

excess amount of free RANKL capable of stimulating RANK, thereby increasing bone

resorption by osteoclasts. Some cytokines, such as interleukin (IL)-1 and IL-6, are

known to modulate RANKL and OPG concentration

Saliva has the potential to be used as a diagnostic fluid for oral disease

19,20

. It

can also be easily collected, contains locally-derived and systemically-derived

markers, and hence may offer the basis for a specific diagnostic test for

periodontitis

. According to Pellegrini et al.

and Ito et al.

, quantifying biomarkers

in saliva may serve as a useful tool to predict susceptibility to periodontitis, to provide

information for disease severity and to monitor the effectiveness of periodontal

therapy.

Considering the accumulated evidences and the necessity to further

investigate the inflammatory biomarkers in periodontitis associated to diabetes, the

aim of this study was to measure salivary concentration of IL-6, MMP-8 and OPG in

patients with periodontitis associated or not to type 2 diabetes mellitus.

MATERIALS AND METHODS

Study Population

This study was carried out as a joint collaboration of the Department of Oral

Surgery and Periodontology and the Department of Internal Medicine – Division of

Endocrinology and Metabolism of the University of São Paulo. It was reviewed and

approved by the Institutional Human Research Committee. All subjects were, on an

individual basis, informed about the nature of the proposed study and informed

consent forms were signed.

Subjects underwent anamnesis, clinical and radiographic examination.

Diabetic patients had the glycosylated hemoglobin (HbA1c) levels verified in the

Endocrinology Clinical of University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Medicine.

According to their periodontal condition and general health status, they were invited

to participate in the study. Inclusion criteria were: (i) presence of at least 15 teeth; (ii)

at least one site with probing depth ≥ 5mm and two teeth with attachment loss ≥

6mm

; (iii) to be 35 years or older. Exclusion criteria included: (i) use of antibiotics or

periodontal treatment in the previous 6 months; (ii) smoking within the past 5 years;

(iii) pregnancy or lactancy; (iv) concomitant medical therapy, except for diabetic

condition; (v) presence of other inflammatory conditions; (vi) major diabetic

complications.

A total of 90 subjects were divided in four groups: 22 Healthy subjects

(Control), 24 patients with periodontal disease (PD), 20 patients with diabetes

mellitus only (DM), 24 patients with periodontal disease and diabetes mellitus

(PD+DM).

Clinical Parameters

Clinical examination was performed by a single experienced examiner and

recorded at six sites per tooth with the aid of a computerized periodontal probe

. The

parameters recorded were: probing pocket depth (PPD), relative clinical attachment

level (CAL), bleeding on probing (BOP), suppuration (SUP) and number of teeth (n.

teeth).

Saliva Sample Collection

Non-stimulated whole expectorated saliva was collected (~3ml) from each

subject’s saliva into sterile tubes according to the method described by Navazesh

Subjects refrained from eating, drinking, and oral hygiene for 2 hours prior to saliva

collection. Saliva samples were placed on ice immediately and aliquoted before

freezing at -80

Salivary Proteins Analysis

The salivary concentrations of IL-6, MMP-8, OPG and Total Protein were

determined in duplicate for each subject using enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA). Human IL-6, MMP-8, OPG and Total Protein assay kits

were used

according to each manufacturer’s instructions. A standard curve was constructed by

using standards provided by the kits, and protein concentrations were calculated

from the standard curve. For the Total Protein assay, bovine serum albumin was

used as standard.

Florida Probe®, Florida Probe Corporation, Gainsville, FL, USA

Human Quantikine IL-6 ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

Human MMP-8/OPG DuoSet kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

Bio-Rad Bradford Total Protein Assay Kit, Bio-Rad, California, USA

Glycosylated Hemoglobin (HbA1c) Measurement

The HbA1c levels were analyzed for the metabolic assessment in diabetic

patients (DM and PD+DM groups). The HbA1c data were measured by ion exchange

chromatography HPLC (high-pressure liquid chromatography) and is expressed in

percentage.

Statistical Analysis

Data were recorded as mean ± standard deviation and the experimental unit

was the subject. Kruskal-Wallis One Way Analysis and Mann-Whitney’s test were

applied to compare clinical parameters and concentration of salivary proteins

between groups. Correlations between concentrations of salivary proteins, clinical

parameters and HbA1c levels were measured by Spearman Nonparametric

Correlation. Data were tested for normality before applying the adequate parametric

or non-parametric tests. Statistical significance was considered at significance level

of 5% (p<0.05).

RESULT

Demographics and clinical characteristics

The clinical parameters, age, sex and salivary proteins concentrations were

measured in saliva samples of 90 subjects: 22 Healthy, 24 patients with periodontal

disease, 20 patients with diabetes mellitus only, 24 patients with periodontal disease

and type 2 diabetes mellitus. Sixty were women and thirty were men.

Age and clinical parameters of the participants recruited for this study are

summarized in Table 1. The mean age of the Control, PD and PD+DM groups were

similar, 43.7 ± 1.6, 45.4 ± 1.2 and 47.8 ± 1.4, respectively. Only the mean age of the

DM group was higher than the others groups, 53.3 ± 2.0. Most of the subjects in this

population had more than 20 teeth, with mean of 26.4 teeth for the Control group,

23.7 for the PD group, 23.4 for the DM group and 21.5 for the PD+DM group.

Regarding clinical parameters, only SUP was not different among all groups

(p=0.078). Therefore, data showed that all other evaluated clinical parameters, PPD,

PPD≤3, PPD4-6, PPD≥7, CAL and BOP, were different among groups (p<0.05). The

groups without periodontitis, Control and DM, presented similar mean values for the

clinical parameters while the PD and PD+DM groups had no significant differences

between themselves (p>0.05). Significant differences were found only when PD and

PD+DM groups were compared to the Control group or to the DM group.

The Control and DM group showed no or few signs of inflammation (mean

BOP=0.1 ± 0.1 and 1.2 ± 0.4 respectively) and absence of periodontal pockets,

whereas for both PD and PD+DM groups, inflammation and periodontal pockets were

always present. Elevated means of CAL in the PD and PD+DM groups may be an

indicator of periodontitis. Though the PPD mean value from the PD and PD+DM

groups were not higher, 3.06 ± 0.13 and 2.83 ± 0.17 respectively, these groups

showed several sites with periodontal pockets from 4 to 6mm (PPD4-6),

characterizing established periodontal disease (PD=32.9 ± 4.2; PD+DM=28.5 ± 3.4).

Concentration of salivary proteins

The mean concentrations of IL-6 and OPG are presented in picogram per

milliliter (pg/ml) of saliva, and the mean concentrations of MMP-8 presented in

nanogram per milliliter (ng/ml) of saliva (Figure 1). The detection limit was 3.13 - 300

pg/ml for IL-6 and 62.5 - 4000 pg/ml for MMP-8 and OPG.

Significant differences were found among all groups for the three screened

salivary proteins, with IL-6 (p=0.006), MMP-8 (p=0.004) and OPG (p=0.032).

Regarding IL-6, the Control group showed significantly lower mean concentration

than PD and PD+DM groups, while for the DM group mean concentration was

significantly lower only when compared to the PD+DM group. For MMP-8, the Control

group concentration was significantly lower than the other diseased groups and no

differences between diseased groups (PD, DM e PD+DM) were detected. The mean

concentration of OPG was significantly different between Control and DM groups,

and PD and DM groups. Only samples which stayed within the detection limit for the

assay were considered for statistical analysis.

Mean concentrations of Total Protein are presented in miligram per milliliter

(mg/ml) of saliva in Figure 2. Only Control and PD+DM groups presented statistically

significant differences (p=0.003).

Metabolic parameter

The normal healthy range for the HbA1c levels is 4.5 – 6%. In the present

study, the HbA1c mean values were 7.8% for the DM group and 8.5% for the PD+DM

group, without significant differences between diabetic groups (p=0.052). Also, these

data show that principally PD+DM group presented inadequate glycemic control.

Correlation between clinical parameters and salivary proteins

For the Control group, data showed a negative correlation among MMP-8

concentrations with PPD≤3 (r= -0.62, p=0.054) and with n. teeth (r= -0.64, p=0.047).

In PD group, the n. teeth and BOP clinical parameters were correlated with IL-6

concentrations (r= -0.44, p=0.036 and r=0.48, p=0.020 respectively). In the same

group, PPD≥7 were correlated with elevated MMP-8 concentrations (correlation

value= 0.46; p=0.030) and SUP parameter with OPG concentrations (r= -0.55; p=

0.018). For the DM and PD+DM groups, no significant correlation to clinical

parameters was found.

Correlation between metabolic parameter and clinical parameters and salivary

proteins

Data showed that HbA1c had significant correlation to some clinical

parameters such as PPD (r=0.31, p=0.049), PPD≤3 (r= -0.39, p=0.013), CAL (r=0.36,

p=0.022) and n. teeth (r= -0.40, p=0.011) in DM and PD+DM groups (Table 2).

Regarding salivary proteins, only IL-6 was positively correlated to HbA1c (r=0.54;

p<0.000) (Table 3).

DISCUSSION

Previous studies support a bidirectional relationship between diabetes and

periodontitis, suggesting that diabetes is a risk factor for periodontitis

as well as the

periodontal treatment may influence glycemic control

Data from the current study demonstrated that salivary concentrations of IL-6

are higher in patients with periodontal inflammation (PD and PD+DM groups) in

comparison to Control and DM group and elevated salivary concentrations of MMP-8

and OPG in saliva samples from diabetic patients (DM and PD+DM groups).

In the current study, results suggested that elevated IL-6 concentrations in the

saliva of periodontal patients (PD and DM+PD groups) may be related to the modulation

of periodontitis, indicated by the clinical parameters in these groups. This result was

consistent to IL-6 concentrations reported by Kurtis et al.

and Mengel et al.

. IL-6

concentrations were positively correlated to BOP and negatively to n. of teeth in PD

group, corroborating that this proinflammatory cytokine is associated to chronic

inflammatory responses

and to the increase in bone resorption

. In contrast, IL-6

concentrations were not associated to clinical parameters in the Control group.

The formation of AGEs has been reported to play an important role in modulating

cytokine expression as IL-6 in diabetic patients

. However, results presented lower IL-6

concentrations in samples from the DM group, and no statistically significant differences

between PD and PD+DM groups were found. A reasonable explanation for these results

may be related to type 2 diabetes treatment with insulin which decreases IL-1 and IL-6

effects

Another explanation would be that lower IL-6 concentrations in the DM group

may be a compensatory mechanism to increase others cytokines concentrations due

AGEs action. Therefore, monitoring the large cytokines group may explain this

phenomenon. In addition, O’Connell et al.

study presented that HbA1c levels were

related to some biomarkers concentrations. In accordance to O’Connell et al.

, our

results showed a positive correlation between IL-6 concentration and HbA1c levels.

Thus our findings suggest that salivary IL-6 may potentially be used as a sensitive

marker for periodontal inflammation.

Regarding MMP-8, it is one of the major players in collagen breakdown during

periodontal destruction and may be present in gingival crevicular fluid and in saliva

In line with Miller et al.

and Christodoulides et al.

, MMP-8 concentrations were

higher in patients’ saliva samples with periodontitis (PD and PD+DM) when

compared to the Control group. Also, in accordance to these authors

19,33

, MMP-8

mean had negative correlation with PPD≤3 and n. teeth in the Control group,

indicating that the more teeth and healthy sites the patient has, the lower will be the

MMP-8 concentration. On the other hand, MMP-8 mean had positive correlation to

PPD≥7 in the PD group. Detection of salivary MMP-8 and the correlation between

MMP-8 concentrations and some clinical parameters are in accordance with Chen et

al.

who suggests that MMP-8 has an important role in monitoring periodontitis.

However, data showed the highest concentrations of MMP-8 in saliva samples

from diabetic patients (DM and PD+DM groups). According to literature

34,35

, diabetes

has been associated to altered collagen metabolism. The Collin et al. study

showed

that the major MMPs in type 2 diabetic patients' saliva are MMP-8 and MMP-9.

Besides, Sorsa et al.

reported that increased MMP-8 was independent of bacterial

factors, indicating that its concentration in diabetic patients may be not related only to

periodontitis. Though the literature reported that MMP-8 is a periodontitis marker,

diabetes may overestimate this metalloproteinase values.

Elevated OPG concentrations were detected in saliva samples of diabetic

patients (DM and PD+DM groups). One possibility is that serum

glucose levels or

glycosylated proteins affect the assay for OPG

, but

we found no correlation between

OPG concentrations and HbA1c levels in diabetic patients, suggesting that this may be

an unlikely

explanation. Another hypothesis is that concentrations of OPG reflect

ongoing

vascular disease, which is a common complication in patients with

diabetes

. Recently,

increased OPG concentrations have been reported in type 2 diabetic patients and they

were associated to microvascular complications and to asymptomatic coronary artery

disease as well as with impaired endothelial function

. Some studies

39,40

suggested that

increased OPG concentrations represent an incomplete defense mechanism against

other factors that promote arterial calcification, atherosclerosis and other forms of

vascular damage, acting as an important regulatory molecule in the vasculature. The

results of the present study are similar to data from type 2 diabetic patients, as

previously reported by Browner et al.

and Xiang et al.

, suggesting that OPG might

affect early stage atherosclerosis in diabetic patients.

Besides, the results did not show significant differences between OPG

concentrations in the PD and Control groups corroborating to the results of Miller et

al.

. It seems that OPG concentrations in saliva are not well-defined in health or

disease. OPG’s role in bone metabolism leads one to hypothesize that its

concentration would be increased under circumstances which require inhibition of

osteoclastogenesis. One of the possible biological mechanisms at work is that an

increase in osteoclast precursors might lead to the upregulation of OPG. In turn,

OPG would inhibit an increased number of osteoclast precursors. However, during

periodontal destruction, there may be a threshold whereby OPG is operating at full

capacity and yet cannot overcome the overwhelming number of osteoclast

precursors; this would result in bone turnover

. Since periodontitis is episodic, bone

turnover may not have been occurring in each patient at the time of sampling in this

study; this might explain why the mean concentration of OPG was slightly elevated in

the PD group compared to the Control group. Alternatively, OPG may not be the

most appropriate marker for assessment of active bone resorption in periodontitis.

Glycosylated hemoglobin (HbA1c) test measures the amount of glucose

irreversibly bound to the hemoglobin molecule. It has been used as a monitoring

tool

. The DM patients were slightly above diabetic control’s boundary, but in the

PD+DM group, the HbA1c mean indicated an inadequate metabolic control of

diabetes. Studies by Novaes et al.

42,43

showed that uncontrolled or poorly controlled

diabetes is associated with increased susceptibility to oral infections, including

periodontitis. On the other hand, the presence of periodontitis may aggravate

glycemic control

. In a longitudinal study

, diabetic subjects with severe

periodontitis demonstrated significantly inadequate glycemic control than diabetic

subjects with minimal periodontal destruction. In the current study, data showed

positive correlation between the HbA1c levels and some clinical parameters (PPD,

CAL) and negative correlation to PPD≤3 and n. teeth in DM and PD+DM groups.

The ELISA for RAGE was run, but it was not possible to detect it in the saliva

samples using the Human Quantikine RAGE ELISA kit

. Yoon et al.

characterized

AGEs in saliva from patients with diabetes mellitus with Nuclear magnetic resonance

spectroscopy, but not RAGEs. Katz et al.

analyzed this biomarker in periodontitis

with immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-

PCR) in gingival biopsies.

Total salivary protein concentration has been found to be similar in diabetic

periodontal

and control subjects. In the present study, total salivary protein

concentration was measured to verify if possible differences between groups would

Human Quantikine IL-6/RAGE ELISA kit, R&D Systems, Minneapolis, USA

compromise results of specific biomarkers; however, compromising was not verified.

In this study, the higher total protein concentration in PD+DM when compared to the

Control group may be explained by the elevated protein content produced due to the

activation of the host’s defence mechanism against the inflammatory process

Also, slight differences in total protein concentrations among groups may be

related to the flow rate of saliva that varies within and between subjects. Some

medications affect salivary flow rate as well as systemic diseases

. Changes in flow rate

could have a significant impact on proteins concentration in saliva. Besides, the

composition of stimulated and non-stimulated saliva differs, and this could affect the

proteins of interest

. In the present study, non-stimulated whole saliva was collected

according to other studies

19,23,50

. Dodds et al.

showed that unstimulated whole saliva

flow rates were unaffected by diabetes status, or by the level of glycemic control.

Within the limits of the present study, data indicated that saliva is an adequate

identifier of inflammatory biomarkers for periodontitis with or without diabetes mellitus

diagnosis. These data support that IL-6 is a candidate biomarker of periodontal

disease in saliva, and OPG and MMP-8 are not the most appropriate markers for

assessment of active periodontal breakdown, since it is not possible to distinguish

the condition of periodontitis and periodontitis associated to diabetes by OPG and

MMP-8 markers. Alternatively, other inflammatory biomarkers should be evaluated

for the diagnosis of periodontitis and periodontitis associated to diabetes as well as

the individual susceptibility to this disease. Based on these findings, it can be

speculated that the role of diabetes in modulating periodontitis may involve the

overexpression of MMP-8 and OPG.

ACKNOWLEDGMENTS

We applied the sequence-determines-credit approach for the sequence of authors.

The study had the financial support of the National Council for Scientific and

Technological Development (CNPq) grant 477428/2006-1 ABNJ & MTJ. Authors

thank the kind assistance of Fabíola Singaretti de Oliveira from the Molecular Biology

Laboratory of the University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Dentistry,

Department of Oral Surgery and Periodontology, and of Maria Cristina Foss Freitas

from the Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology and Metabolism

of the University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Medicine and the pos

gradutes Priscila Brasil da Nóbrega, Ingrid Webb Josephson Ribeiro and Karina

Kimiko Yamashina Pereira from Department of Oral Surgery and Periodontology of

the University of São Paulo, Ribeirão Preto School of Dentistry.

REFERENCES