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Universidade de São Paulo
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto
Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e
Periodontia
Exposição a Fatores de Crescimento e Proteínas Típicos
de Plasma Rico em Plaquetas Inibe a Formação de
Nódulos de Mineralização de Culturas de Células
Osteogênicas Crescidas Sobre Titânio
Marcos Andrade de Oliva
Ribeirão Preto-SP
2008
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto
Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e
Periodontia
Exposição a Fatores de Crescimento e Proteínas Típicos
de Plasma Rico em Plaquetas Inibe a Formação de
Nódulos de Mineralização de Culturas de Células
Osteogênicas Crescidas Sobre Titânio
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Cirurgia e Traumatologia
Buco-Maxilo-Facial.
Orientador: Paulo Tambasco de Oliveira
Ribeirão Preto-SP
2008
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OLIVA, Marcos Andrade de
Exposição a Fatores de Crescimento e Proteínas
Típicos de Plasma Rico em Plaquetas Inibe a Formação de
Nódulos de Mineralização de Culturas de Células
Osteogênicas Crescidas Sobre Titânio. Ribeirão Preto,
2008.
69 p. : il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto/USP – Área de
concentração: Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-
Facial – CTBMF
Orientador: De Oliveira, Paulo Tambasco
1. Titânio. 2. Fatores de crescimento. 3. Osteoblastos.
4. Cultura de células. 5. Proliferação celular. 6.
Mineralização.
Dedicatória
À minha família
e à minha noiva,
Leandra Monteiro de Paiva
Agradecimento Especial
Ao meu orientador
Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira
Agradecimentos
Aos Professores e amigos. Muito Obrigado.
Às instituições: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (FORP-USP), Universidade de São Paulo (USP), Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Université de Montréal (UdeM,
Montreal, QC, Canadá);
SUMÁRIO
1. Justificativa.........................................................................................................................1
2. Resumo..............................................................................................................................14
3. Introdução.........................................................................................................................15
4. Material e Métodos.........................................................................................................16
5. Resultados.........................................................................................................................23
6. Discussão ..........................................................................................................................35
7. Referências .......................................................................................................................38
8. Artigo em Inglês..............................................................................................................43
1
JUSTIFICATIVA
Um dos objetivos principais das pesquisas com biomateriais tem sido o desenvolvimento
de materiais para implantação que favoreçam o reparo rápido, controlado e previsível dos tecidos
biológicos interfaciais. Para isso, não só se desenvolvem novos materiais, como também se
modificam aqueles tradicionalmente utilizados em diferentes aplicações clínicas. Com efeito,
vários aspectos físicos, químicos e topográficos da superfície dos materiais têm sido modificados
visando ao desenvolvimento de interface implante-tecido com características adequadas a uma
determinada aplicação (Brunski et al., 2000). Essa estratégia baseia-se no fato de a superfície do
material estar em íntimo contato com o(s) tecido(s) biológico(s) no sítio de implantação, o que é
crítico para a determinação de sua biocompatibilidade (Nanci et al., 1998).
Métodos bioquímicos para tratamento de superfícies constituem-se em uma alternativa às
modificações mencionadas acima, ou até mesmo se somam a elas. O objetivo da modificação
bioquímica é o de imobilizar proteínas, enzimas ou peptídios bioativos em superfícies de
biomateriais com o intuito de induzir respostas celulares e teciduais específicas, por meio da
liberação dessas moléculas diretamente para a região interfacial (Puleo & Nanci, 1999).
Na área de desenvolvimento de novas superfícies metálicas para implantação no tecido
ósseo, observa-se crescente interesse na utilização de moléculas bioativas que possuem efeitos
conhecidos na formação óssea (Puleo & Nanci, 1999). Como o desenvolvimento da interface
osso-implante apresenta diversas semelhanças com processos que ocorrem nas interfaces ósseas
naturais e em sítios de reparo de tecidos mineralizados, moléculas envolvidas nesses processos
seriam também potencialmente capazes de influenciar a integração de biomateriais (Nanci et al.,
1998). Entre os diferentes fatores de crescimento (GFs, da sigla em Inglês) e proteínas que
constituem a matriz extracelular do tecido ósseo (Robey, 1996; Young, 2003; Linkhart et al.,
1996; Schliephake, 2002), aqueles presentes na interface osso-implante poderiam, assim,
2
representar estratégias adequadas para o revestimento da superfície de biomateriais com a
finalidade de se controlar e promover a osteogênese (Puleo & Nanci, 1999).
Por meio de técnicas de biologia molecular, diversos GFs têm sido clonados e expressos
por recombinação, facilitando assim a avaliação de seus efeitos em diferentes sistemas
biológicos. Isso tem resultado na publicação de numerosos estudos sobre os efeitos individuais
de diferentes GFs na biologia do tecido ósseo (revisado por Linkhart et al., 1996; Schliephake,
2002). Seus efeitos estimuladores no processo de osteogênese podem ser: 1) quimiotático
(atribuído, p.e., aos fatores de crescimento derivado de plaqueta-BB, PDGF-BB, e
transformante-β1, TGF-β1, que estimulam a migração de células osteogênicas); 2) mitogênico
(p.e., fatores de crescimento insulina-símile-1, IGF-1, de fibroblasto-2, FGF-2, de tecido
conjuntivo, CTGF, PDGF-BB e TGF-β1); 3) de aumento de atividade de síntese celular (p.e.,
TGF-β1, que acentua a síntese de colágeno, e IGF-1, que estimula a síntese de proteínas da
matriz óssea in vitro), e 4) de indução para a diferenciação osteoblástica (p.e., proteínas
morfogenéticas ósseas, BMPs, fatores de crescimento e diferenciação, como o GDF-5, e CTGF)
(Canalis, 1981; Mohan & Baylink, 1991; Kawai et al., 1993; Ripamonti et al., 1993; Lind, 1996;
Linkhart et al., 1996; Martin et al., 1997; Lind, 1998; Brunski et al., 2000; Conover, 2000;
Gurlek & Kumar, 2001; Fiedler et al., 2002; Schliephake, 2002; Fischer et al., 2003; Lucarelli et
al., 2003; Ortiz et al., 2003; Safadi et al., 2003; Shimaoka et al., 2004; Luo et al., 2004;
Arosarena & Puleo 2007; Elsalanty et al., 2008.
Observa-se, também, que os efeitos biológicos causados pelos GFs dependem de diversos
parâmetros, os quais incluem: (1) concentração de GFs na matriz extracelular, (2) tempo e
duração da exposição, (3) tipo de célula alvo e seu estágio de diferenciação, (4) a expressão de
receptores celulares específicos, e (5) a presença de outros GFs, os quais podem promover
efeitos sinérgicos ou antagônicos (Giannobile et al., 1997; Strayhorn et al., 1999; Schmidmaier et
al., 2003; Chaudhary et al., 2004; Huang et al., 2005; discutido em Ranly et al., 2007). Por
3
exemplo, em relação ao TGF-β, seu efeito mitogênico ocorre apenas em algumas espécies
animais, como o rato e o homem, enquanto que no camundongo sua ação resulta em inibição da
proliferação celular (revisado por Lind, 1996). Há também controvérsias quanto à influência que
o TGF-β exerce no processo de diferenciação osteoblástica em diferentes modelos
experimentais. Apesar de estimular a síntese de matriz colágena, parece ser de consenso que o
TGF-β tem ação inibidora na síntese de proteínas características do fenótipo osteoblástico, como
a fosfatase alcalina e a osteocalcina (revisado por Lind, 1996; Gurlek & Kumar, 2001). Por fim,
uma das importantes limitações de estudos sobre os efeitos isolados de GFs é a impossibilidade
de avaliar fenômenos biológicos mais complexos, como o processo de reparação tecidual. Com
efeito, a ação de cada fator individualmente ocasiona deficiências na regeneração tecidual
(revisado por Anitua et al., 2007).
Os processos de formação e reparo ósseos resultam de uma complexa seqüência de
eventos celulares e teciduais, envolvendo numerosos GFs, citocinas e proteínas da matriz
extracelular. Evidências para a ocorrência de complexas interações entre GFs na osteogênese
fundamentam-se no fato de: 1) diferentes GFs estarem incorporados à matriz óssea em altas
concentrações; 2) células da linhagem osteoblástica secretarem diversos GFs, e 3) genes que
codificam GFs e seus produtos serem expressos durante o reparo ósseo (revisado por Giannobile
et al., 1997; Cho et al., 2002; Lucarelli et al., 2003; Raiche & Puleo, 2004; Li et al., 2005). Essas
complexas interações podem resultar em: 1) sinergismo, quando o efeito resultante é maior que a
soma dos efeitos individuais de cada fator (p.e., associação de células da medula óssea humana,
BMP-4 e fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, resulta em aumento significativo na
quantidade de osso formado no sítio de implantação quando comparada à ação unitária ou a
combinações de dois desses fatores; Huang et al., 2005); 2) soma dos efeitos individuais de cada
fator (Giannobile et al., 1997), e 3) antagonismo, quando o efeito final é oposto àquele
proporcionado pelos GFs individualmente (p.e., IGF-1 e TGF-β são mitogênicos em diversos
4
modelos experimentais, mas quando associados, podem promover a redução da proliferação
osteoblástica in vitro; Schmidmaier et al., 2003; associação de FGF-2 e BMP-7 resulta em
significativa redução da diferenciação osteoblástica induzida por BMP-7; Chaudhary et al.,
2004).
Com base em evidências como as descritas acima, estratégias para o desenvolvimento de
terapia gênica e de terapia com proteínas incluem a expressão ou disponibilização simultânea
e/ou seqüencial de diversos GFs e proteínas, na tentativa de simular eventos de expressão gênica
e de RNAm, de síntese e secreção de proteínas que ocorrem complexa e seqüencialmente durante
o processo de reparo ósseo (Franceschi et al., 2004; Kofron et al., 2004).
Uma das terapias mais conhecidas para a disponibilização de GFs em defeitos ósseos é a
aplicação de plasma rico em plaquetas (PRP), definido como preparações de concentrados de
plaquetas no plasma (Marx et al., 1998; Dugrillon et al., 2002; Marx, 2004; Anitua et al., 2007;
Nikolidakis et al., 2008). Essa terapia se baseia no fato de as plaquetas estarem entre os
primeiros elementos a atuar em sítios de reparo tecidual (Marx et al., 1998) e, associadas ao
plasma, interagir com superfícies de biomateriais no período pós-implantação (Nygren et al.,
1997; Park & Davies, 2000; Park et al., 2001; Soffer et al., 2003). Esses corpúsculos contêm
quantidade expressiva de GFs que são ativamente secretados, entre os quais se destacam PDGF,
TGF-β e VEGF, em um ambiente com proteínas do plasma e numerosas moléculas da matriz
extracelular (Gruber et al., 2003; Lucarelli et al., 2003; Kawase et al., 2005; Graziani et al.,
2006; van den Dolder et al., 2006). As múltiplas e complexas associações entre GFs secretados
por plaquetas e proteínas plasmáticas afetam as interações célula-matriz extracelular-superfície
do material, as quais, por sua vez, definem os eventos subseqüentes do processo de formação
tecidual. Assim, tem-se observado nos últimos anos um crescente interesse no desenvolvimento
de métodos para obtenção de PRP, com o objetivo de favorecer o reparo tecidual em diferentes
aplicações clínicas (Marx et al., 1998; Landesberg et al., 2000; Dugrillon et al., 2002).
5
Os resultados de estudos realizados para investigar o efeito do PRP na regeneração óssea
são controversos. Alguns autores reportaram efeito positivo na osteogênese (Merkx et al., 2004;
Ferreira et al., 2005; Hibi et al., 2006; Graziani et al., 2006; Gerard et al., 2006; Nikolidakis et
al., 2008), enquanto outros não observaram qualquer efeito em sua utilização (Sarkar et al., 2006;
Mooren et al., 2007; Roussy et al., 2007). Por outro lado, inibição da indução para formação
óssea tem sido observado na associação do PRP com GFs osteogênicos (Gruber et al., 2006;
Thorwarth et al., 2006; Ranly et al., 2007). Esses resultados controversos têm sido atribuídos a
diferentes aspectos do PRP, entre os quais: 1) variações intra e inter-espécies na proporção
relativa dos componentes (Lacoste et al., 2003; van den Dolder et al., 2006; Ranly et al., 2007;
Roussy et al., 2007); 2) diferenças no protocolo de preparação (Anitua et al., 2007), e 3)
variações na densidade/concentração de plaquetas (Weibrich et al., 2004; Choi et al., 2005;
Graziani et al., 2006; Ranly et al., 2007; Tomoyasu et al., 2007; discutido por Mooren et al.,
2007). É importante ressaltar o crescente número de publicações que mostram que a associação
do PRP a enxertos autógenos, alógenos ou aloplásticos não estimula a formação óssea (Mooren
et al., 2007) ou até mesmo inibe os fenômenos osseoindutivos, como no caso da associação com
matriz óssea desmineralizado (Ranly et al., 2007; Ranly et al., 2005)
Sendo assim, justifica-se o desenvolvimento de modelos experimentais visando a evitar
as variações inerentes ao PRP, elaborando formulações contendo seus principais componentes
protéicos, em ambientes controlados, com o objetivo principal de avaliar seus efeitos no processo
de osteogênese in vitro principalmente sobre superfícies de titânio, reconhecidamente um
material biocompatível e que permite o crescimento ósseo.
6
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Artigo em Português *
*Este artigo foi escrito de acordo com as normas do Journal of Biomedical
Materials Research Part A.
13
Exposição a Fatores de Crescimento e Proteínas Típicos de Plasma Rico
em Plaquetas Inibe a Formação de Nódulos de Mineralização de Culturas
de Células Osteogênicas Crescidas Sobre Titânio
Marcos Andrade de Oliva
1
, William Marcatti Amarú Maximiano
1
, Larissa Moreira
Spínola de Castro
1
, Paulo Eliandro da Silva Junior
1
, Roger Rodrigo Fernandes
1
, Pietro
Ciancaglini
2
, Márcio Mateus Beloti
1
, Antonio Nanci
3
, Adalberto Luiz Rosa
1
, Paulo
Tambasco de Oliveira
1
1
Laboratório de Cultura de Células da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Av. do Café, s/n, CEP 14040-904, Ribeirão Preto, SP, Brasil
2
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
3
Laboratory for the Study of Calcified Tissues and Biomaterials, Faculté de Médecine Dentaire,
Université de Montréal, P.O. Box 6128, Station Centre-Ville, Montréal, QC H3C 3J7, Canada
*Endereço para correspondência: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira, Departamento de
Morfologia, Estomatologia e Fisiologia, Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Av. do Café, s/n – 14040-940 – Ribeirão Preto, SP, Brasil. Tel. + 55
16 3602-3978 Fax: + 55 16 3633-0999. E-mail: [email protected]
14
RESUMO
Apesar da ampla aplicação clínica de plasma rico em plaquetas (PRP), a sua eficácia no reparo
de defeitos ósseos e na osseointegração de implantes metálicos continua sendo questionada. Em
vista disso, objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de um coquetel contendo os
principais fatores de crescimento (GFs) e proteínas de PRP no desenvolvimento do fenótipo
osteogênico in vitro sobre titânio (Ti). O coquetel referido continha PDGF-BB, TGF-β1, TGF-
β2, albumina, fibronectina e trombospondina. Células da linhagem osteoblástica foram obtidas
por digestão enzimática de osso alveolar humano e cultivadas sob condições osteogênicas
convencionais até a subconfluência, sendo, em seguida, subcultivadas sobre superfície de Ti. As
subculturas foram expostas durante os 7 primeiros dias a meio osteogênico, suplementado com
GFs e proteínas, e apenas ao meio osteogênico nos 7 dias subseqüentes. Os grupos controles
foram expostos apenas ao meio osteogênico. Nos experimentos dose-resposta foram utilizadas
culturas primárias de calvária de ratos, as quais foram expostas ao coquetel de GFs e proteínas e
às suas diluições de 1:10 e 1:100. Culturas derivadas de osso alveolar humano expostas ao
coquetel de GFs e proteínas apresentaram: aumento significativo do número de células a partir
do dia 4 e da proliferação celular em 1 e 4 dias; redução significativa nos níveis de atividade de
fosfatase alcalina (ALP) em 4, 7 e 10 dias e ausência de marcação com vermelho de Alizarina
em 14 dias. Apesar de as diluições 1:10 e 1:100 restaurarem a atividade proliferativa das culturas
aos níveis controles, formações de matriz calcificada foram observadas apenas na diluição 1:100.
Os resultados do presente trabalho mostram que o coquetel de GFs e proteínas inibe o
desenvolvimento do fenótipo osteogênico de culturas de células osteoblásticas humanas e de
ratos crescidas sobre Ti.
Palavras-Chaves: Titânio, Fatores de crescimento, Osteoblastos, Cultura de células,
Proliferação celular, Mineralização.
15
INTRODUÇÃO
A capacidade de induzir formação óssea na superfície de implantes é de grande
importância para melhorar o reparo tecidual, aumentar a estabilidade e, dessa forma, antecipar a
aplicação de carga funcional. Com esse intuito, diversas terapias regenerativas com fatores de
crescimento (GFs) têm sido aplicadas para promover e, em alguns casos até mesmo induzir, à
neoformação óssea em sítios de fraturas e superfícies de implantes metálicos.
1-4
Na área da
implantologia, estudos têm mostrado a melhora em parâmetros da osseointegração através da
utilização de proteínas morfogenéticas ósseas recombinantes humanas (rhBMPs) ou fator de
crescimento transformante β recombinante humano (rhTGF- β).
1,5-9
Durante o processo de reparo ósseo, as células estão expostas simultaneamente a diversos
GFs, especialmente na fase inicial, quando plaquetas do coágulo sanguíneo liberam seus
constituintes.
10
Com esse objetivo, concentrados de plaquetas no plasma têm sido utilizados para
favorecer o reparo em defeitos ósseos.
11-13
Essas preparações, também conhecidas como plasma
rico em plaquetas (PRP), apresentam grande quantidade de fator de crescimento derivado de
plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformante β (TGF- β) e diversas proteínas
plasmáticas.
14-20
Embora trabalhos clínicos tenham apresentado efeito positivo, estudos
demonstram que o uso do PRP não promove a neoformação óssea.
13,18,21-28
Essa divergência de
resultados tem sido atribuída a variações intra e inter-espécies na proporção relativa dos
componentes do PRP.
19,29
Dessa forma, a eficácia da aplicação do PRP concomitantemente à
colocação de implante de titânio (Ti) para favorecer a osseointegração, assim como sua
associação com enxertos ósseos, ainda é objeto de discussão.
30-32
O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos de coquetel de GFs e proteínas
típicos de PRP (referido como GFs+proteínas) em culturas de células humanas e de ratos no
desenvolvimento do fenótipo osteogênico sobre superfícies de Ti in vitro. Para evitar as
variações inerentes ao PRP, optou-se por avaliar uma única formulação contendo seus principais
componentes protéicos.
16
MATERIAL E MÉTODOS
Cultura de células da linhagem osteoblástica derivadas de fragmentos ósseos de processos
alveolares humanos
Células da linhagem osteoblástica foram obtidas de fragmentos de osso do processo
alveolar (explantes), desprezados durante procedimentos cirúrgicos em doadores saudáveis, sob
aprovação do Comitê de Ética em pesquisa com espécimes de tecidos humanos. As células foram
isoladas por digestão enzimática utilizando solução de colagenase tipo II (Gibco – Life
Technologies, Grand Island, NY), como descrito anteriormente.
33
As células isoladas e os
explantes remanescentes foram misturados e cultivados em meio osteogênico, composto por
MEM, modificação alfa (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 10% de soro fetal bovino
(Gibco), 50 µg/mL de gentamicina (Gibco), 0,3 µg/mL de fungizona (Gibco), 5 µg/mL de ácido
ascórbico (Gibco), 7 mM de beta-glicerofosfato (Sigma, St. Louis, MO) e dexametasona a 10
-7
M
(Sigma) em frascos de cultura de 75 cm
2
(Corning Incorporated, Costar, Corning, NY). Na
subconfluência da cultura primária, foi removido o meio de cultura adicionada solução de
tripsina a 0,25% (Gibco) e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 1 mM (Gibco) para
obtenção de suspensão de células. Em seguida, foram plaqueadas 2x10
4
células/poço (n=5) sobre
discos de Ti usinados e polidos (preparados como previamente descrito)
34
em placas de
poliestireno de 24 poços (Corning Incorporated). As subculturas foram mantidas a 37 °C e
atmosfera umidificada contendo 5% de CO
2
e 95% de ar atmosférico. O meio de cultura foi
trocado a cada 3 dias.
Composição do coquetel de fatores de crescimento e proteínas e o protocolo de tratamento
Os GFs e proteínas do coquetel foram selecionados a partir dos principais componentes
de preparações (referidas como extratos ou concentrados) de plaqueta suína
14
e humana.
29,35
O
17
coquetel de GFs e proteínas foi diluído em meio osteogênico nas seguintes quantidades: 27
ng/mL PDGF-BB recombinante humano (rh), 22 ng/mL rhTGF-β1, 15 ng/mL rhTGF-β2, 3,7
µg/mL albumina humana derivada do soro, 2 µg/mL fibronectina humana derivada do plasma e
0.5 µg/mL trombospondina derivada das plaquetas (Sigma). As subculturas foram expostas ao
coquetel de GFs e proteínas durante os 7 primeiros dias, adicionado nos tempos de 0 e 3 dias, e
apenas ao meio osteogênico no período subsequente (7
o
ao 14
o
dia). Esse protocolo de exposição
baseou-se no fato de a atividade funcional de plaquetas e os efeitos biológicos dos GFs por elas
secretados durarem não mais do que 5 dias em sítios de reparo.
11
Para os grupos controles não
foram acrescidos coquetel de GFs ao meio osteogênico.
Morfologia celular por fluorescência direta e localização de proteínas da matriz
extracelular não-colágena por imunofluorescência indireta
Nos tempos experimentais de 1, 4, 7, 10 e 14 dias, as células foram fixadas por 10
minutos à temperatura ambiente em solução de formaldeído (paraformaldeído a 96%, Acros
Organics, Geel, Bélgica) a 4% em tampão fosfato a 0,1 M, pH 7,2 (PB). Para a dupla marcação
vermelho de Alizarina e sialoproteína óssea (BSP), as células foram fixadas em solução de etanol
a 70% por 60 minutos à temperatura de 4 °C. Após lavagem em PB, as culturas foram
submetidas a protocolo para imunomarcação pelo método de imunofluorescência indireta.
34
As
células foram permeabilizadas com solução de Triton X-100 (Acros Organics) a 0,5 % em PB
por 10 minutos, seguida de bloqueio com leite desnatado a 5% em PB por 30 minutos. Foram
incubados anticorpos primários para a detecção de fosfatase alcalina (ALP) humana (monoclonal
B4-78, 1:100; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA), Ki-67 humano
(policlonal, 1:70; Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA), BSP humana (polyclonal LF-100,
36
1:1000, gentilmente fornecido por Dr. Larry W. Fisher, NIH, Bethesda, MD), BSP de rato
18
(monoclonal WVID1-9C5, 1:200, DSHB) e vinculina humana (monoclonal 1:400, hVIN-1,
Sigma), seguidos de incubação com anticorpo secundário anti-camundongo ou anti-coelho
conjugado com fluoróforo Alexa Fluor 488 (1:200, Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR;
fluorescência verde) ou 594 (1:200, Molecular Probes; fluorescência vermelha). Faloidina
conjugada com Alexa Fluor 488 (1:200, Molecular Probes; fluorescência verde) foi utilizada
para visualização das células e de seus limites, pela detecção do citoesqueleto de actina. As
incubações dos anticorpos primários e secundários foram realizadas em atmosfera úmida à
temperatura ambiente por 60 minutos. A substituição dos anticorpos primários por PB foi usada
como controle. Entre cada incubação, as amostras eram lavadas três vezes em PB, 5 minutos
cada. Antes da montagem para observação microscópica, os núcleos celulares foram marcados
com dihidrocloreto 4',6'-diamidino-2-fenilindole (DAPI, Molecular Probes), 1:300 em água
bidestilada, por 5 minutos. Os discos eram montados diretamente em lâminas de vidro e, em
seguida, sobre a superfície contendo células, montava-se lamínula de vidro circular de 12 mm de
diâmetro (Fisher Scientific, Suwanee, GA) com meio de montagem anti-fade (Vectashield,
Vector Laboratories, Burlingame, CA). As amostras foram examinadas em epiluminação
utilizando microscópio de fluorescência Leica modelo DMLB (Leica, Bensheim, Alemanha),
com objetivas N Plan, de 10X/0,25 e 20X/0,40, e HCX PL Fluotar, de 40X/0,75, acoplado a uma
câmera digital Leica DC 300F, 1.3 megapixel CCD (Leica). As imagens adquiridas foram
processadas com o programa Adobe Photoshop.
Morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Nos tempos experimentais de 1 e 4 dias, as células foram fixadas por 60 minutos à
temperatura ambiente em solução de formaldeído (paraformaldeído a 96%, Acros Organics,
Geel, Bélgica) a 4% em PB. Após lavagem em PB e em água bidestilada, as amostras foram
19
examinadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL JSM-6460LV), operado a 7 kV e 50-
70 Pa. As imagens adquiridas foram processadas com o programa Adobe Photoshop.
Proliferação e viabilidade celulares
Nos períodos de 1, 4 e 7 dias, as culturas foram tratadas com solução de tripsina a 0,25
%, colagenase tipo II a 0,1% e EDTA a 1 mM (Gibco, Invitrogen) para a liberação das células
aderidas ao substrato. O número total de células por poço e a porcentagem de células viáveis e
não-viáveis foram determinadas após marcação com azul de Trypan 1% (Sigma) utilizando um
hemocitômetro.
Proporção de células no ciclo celular
A proporção de células imunomarcadas para Ki-67, nos tempos de 1 e 4 dias, foi
determinada por dupla marcação Ki-67/DAPI. O número total de núcleos (DAPI) e de células no
ciclo celular (Ki-67 positivas)
37
nas culturas foi calculado por contagem através de microscópio
de fluorescência, com objetiva de 40X (n=3 para cada tratamento e período). Avaliou-se um
número não inferior a 200 células nos três discos em cada tempo experimental.
Conteúdo de proteína total
A dosagem de proteína total foi realizada, aos 4, 7 e 10 dias, seguindo o método de
Lowry e cols.
38
O meio de cultura dos poços foi removido, os poços lavados três vezes com
solução salina tamponada de fosfato (PBS) aquecida a 37 °C e preenchidos com 2 mL de água
deionizada. As amostras foram submetidas a 5 ciclos de choque térmico, cada um consistindo em
20 minutos a -20 °C e 15 minutos a 37 °C. Ao final dos ciclos, 1 mL do lisado de células de cada
20
poço foi transferido para tubos de ensaio, misturado com 1 mL de solução de Lowry (Sigma) e
deixados em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos. Após esse período, foi adicionado
a cada tubo o volume de 0,5 mL da solução de reagente de fenol de Folin e Ciocalteau (Sigma) e
novamente deixados em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a
absorbância de cada tubo foi medida em um espectrofotômetro (CE3021, Cecil, Inglaterra)
utilizando o comprimento de onda de 680 nm. A concentração de proteína total em cada poço foi
calculada a partir de uma curva padrão feita com albumina bovina (Sigma) e expressa em
µg/mL.
Atividade de ALP
A atividade de ALP foi avaliada em alíquota de mesma solução usada na determinação
do conteúdo de proteína total, pela liberação de timolftaleína por hidrólise do substrato de
timolftaleína monofosfato, utilizando kit comercial de acordo com as instruções do fabricante
(Labtest Diagnóstica, Belo Horizonte, MG, Brasil). Inicialmente, 50 µL de timolftaleína
monofosfato foram misturados com 0,5 mL de tampão dietanolamina a 0,3 M, pH 10,1, por 2
minutos a 37 °C. À solução foi então acrescentada alíquota de 50 µL de lisados obtidos de cada
poço, permanecendo por 10 minutos a 37 °C. Para o desenvolvimento de cor, foram adicionados
2 mL de Na
2
CO
3
a 0,09 M e NaOH a 0,25 M. Após 30 minutos, a absorbância foi medida em
espectrofotômetro utilizando comprimento de onda de 590 nm e a ALP, calculada a partir de
curva padrão usando a timolftaleína em uma escala de 0,012 a 0,4 µmol de timolftaleína/h/mL.
Os dados foram expressos como atividade de ALP normalizada pelo conteúdo de proteína total
(µmol de timolftaleína/h/mg de proteína).
21
Detecção histoquímica de formações nodulares de matriz mineralizada
As culturas, 14 dias pós-plaqueamento, foram lavadas em solução de Hanks (Sigma),
fixadas em álcool etílico a 70% a 4 °C por 60 minutos e lavadas em PBS e água destilada. Em
seguida, foram coradas com vermelho de Alizarina a 2%, pH 4,2, à T.A. por 15 minutos. Após
lavagem em água destilada, as culturas foram processadas para tripla marcação com anticorpo
anti-BSP (WVID1-9C5 ou LF-100) e DAPI. As observações foram feitas por epifluorescência.
Experimento de dose-resposta com células de calvária de ratos
Com o objetivo de avaliar os efeitos de diluições do coquetel de GFs e proteínas no
desenvolvimento do fenótipo osteogênico foram utilizadas culturas primárias da calvária de ratos
recém-nascidos obtidos por digestão enzimática e cultivados sob as mesmas condições
osteogênicas.
34,39-41
A opção em utilizar tais culturas deve-se ao alto potencial osteogênico destas
células, especialmente quando induzidas pela dexametasona.
42,43
As culturas foram, então,
expostas, durante os 7 primeiros dias, a três diferentes diluições do coquetel de GFs e proteínas:
1:1, 1:10 e 1:100 (também referido como GFs+proteínas, GFs+proteínas/10 e
GFs+proteínas/100, respectivamente). Baseado em evidências experimentais de que os efeitos do
PRP não refletem apenas a combinação dos principais GFs presentes em sua composição,
44
as
células foram também expostas às proteínas presentes no coquetel, sem a presença dos GFs. Os
parâmetros avaliados para as culturas da calvária foram: 1) nos dias 7 e 14, imunomarcação para
BSP (como descrito acima); 2) no dia 7, viabilidade/proliferação celular pelo método de redução
do tetrazólio (MTT); 3) nos dias 7 e 10, conteúdo de proteína total e atividade de ALP e no dia
14, detecção histoquímica de formações nodulares de matriz calcificada (como descritos acima).
O método MTT, para avaliar viabilidade/proliferação celular, está baseado na conversão
do sal de tetrazólio amarelo em formazan púrpura após clivagem do anel de tetrazólio por
22
enzimas desidrogenases de mitocôndrias intactas, ou seja, a conversão só ocorre em células
viáveis. No tempo de 7 dias, as células foram incubadas em meio de cultura contendo 100 µL de
brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT, 5 mg/mL) em PBS a 37 °C por
4 horas. O meio foi removido e acrescentado 1 mL de isopropanol ácido (0,04 N HCl em
isopropanol). A placa de cultura foi mantida em um agitador de placas por 5 minutos. Alíquotas
de 100 µL dessa solução de cada poço foram transferidas para placas de 96 poços (Fisher
Scientific, Pittsburgh, PA) para posterior quantificação. A densidade óptica foi lida em 570–650
nm em espectrofotômetro (µQuant, Biotek, Winooski, VT) e os dados foram expressos como
absorbância.
45
As culturas coradas com vermelho de Alizarina foram fotografadas com câmera digital de
alta resolução (Canon EOS Digital Rebel, 6.3 megapixels, com lente macro EF100 f/2.8) e em
microscópio de fluorescência. A proporção de áreas coradas com vermelho de Alizarina foi
determinada a partir de imagens macroscópicas das culturas, usando o programa Image Tool
(University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX).
Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média e desvio padrão. O teste de Qui-quadrado
foi usado para determinar a normalidade dos dados. Os dados numéricos foram, então,
comparados utilizando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney, para duas amostras
independentes, ou o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, para dados independentes e mais
de duas amostras. Quando o resultado do teste era considerado “significante” (p<0,05),
realizava-se em seguida o teste de comparações múltiplas de Fischer, baseado em postos. Os
resultados descritos abaixo são representativos de pelo menos duas culturas distintas, tanto para
células humanas como de ratos.
23
RESULTADOS
Células derivadas do osso alveolar humano
A análise morfológica por epifluorescência e MEV (Figuras 1 e 2, respectivamente)
demonstrou haver diferenças relevantes entre os grupos avaliados. No 1
o
dia, apesar de ambas as
culturas apresentarem células com morfologia estrelária, extensões citoplasmáticas mais longas e
delgadas estavam presentes em maior proporção nas células expostas a coquetel de GFs e
proteínas (Figuras 1A, E; 2A, C). Não houve diferenças importantes nos padrões de marcação
para a proteína citoesquelética vinculina, a qual ocorria tipicamente em adesões focais e também
difusamente na região perinuclear (Figura 1A, E, detalhes). Nos tempos de 4 e 7 dias pós-
plaqueamento, as culturas expostas a coquetel de GFs e proteínas exibiam maior densidade
celular associada a um maior número de células em divisão mitótica (Figuras 1F, G e 2, compare
D com B), sendo que as células, em sua maioria, apresentavam núcleos de dimensões reduzidas
(compare na Figura 1, F com B e G com C). No 14
o
dia, áreas de matriz calcificada, coradas com
vermelho de Alizarina e marcadas para BSP (Figura 1D, detalhe esquerdo), foram observadas
apenas em culturas controles (compare na Figura 1, D com H). Era nítida, nessas culturas, a
presença de um maior número de células com aspecto morfológico de apoptose (Figura 1D,
detalhe direito). Entretanto, culturas expostas a GFs+proteínas exibiam células com seu longo
eixo em uma mesma direção (Figura 1H), ausência de marcação para BSP e reduzida quantidade
de células apoptóticas (Figura 1H, detalhes esquerdo e direito, respectivamente).
O número total de células foi estatisticamente maior nas subculturas expostas ao coquetel
de GFs e proteínas nos tempos de 4 e 7 dias (Figura 3; Tabela 1), embora apenas no dia 4 tenha
se observado aumento significativo no número de células viáveis (Tabela 1). A proliferação
celular foi significantemente maior para o grupo GFs+proteínas, quando comparada ao controle
(Figuras 4 e 5, Tabela 1).
24
Para as culturas expostas ao coquetel de GFs e proteínas, o conteúdo de proteína total
apresentou aumento significativo em todos os tempos avaliados (Tabela 1), enquanto que
redução relevante de ALP foi observada tanto qualitativa como quantitativamente (Figuras 6 e 7,
Tabela 1). Foi interessante notar que os níveis de atividade de ALP foram reduzidos em mais de
90% nos dias 7 e 10 (15 e 12 vezes menor, respectivamente). Enquanto que a atividade de ALP
em função do tempo revelou maior intensidade em 7 dias para o grupo controle, as culturas
expostas ao coquetel de GFs e proteínas exibiram um declínio significativo do dia 4 para os dias
7 e 10, apesar do aumento significativo do conteúdo de proteína total quando comparado ao
controle (2, 2,9 e 1,7 vezes maior, respectivamente)
25
Figura 1. Epifluorescência de culturas de células osteogênicas derivadas de osso alveolar humano crescidas sobre
titânio, dos grupos controle (A-D) e GFs+proteínas (E-H), em 1 (A, E), 4 (B, F), 7 (C, G) e 14 (D, H) dias. No 1
o
dia, ambos os grupos apresentavam células com morfologia estrelária, apesar de o grupo GFs+proteínas exibir
células com extensões citoplasmáticas mais longas e delgadas (compare E com A). Não houve diferenças
importantes entre os grupos nos padrões de marcação para vinculina, difusa por toda a região perinuclear e em
adesões focais (A, E, detalhes; fluorescência vermelha). Nos dias 4, 7 e 14, as culturas expostas ao coquetel de
GFs+proteínas exibiam maior número de células se comparado ao controle (compare F-H com B-D). No 14
o
dia, o
grupo controle apresentava áreas focais de matriz calcificada (D, fluorescência vermelha) e núcleos celulares com
aspecto morfológico de apoptose (D, detalhe direito), enquanto que esses aspectos estavam ausentes no grupo
GFs+proteínas (H e H, detalhe direito). Apenas as culturas controles apresentavam marcação para sialoproteína
óssea (BSP) no 14º dia (fluorescência verde; compare detalhe esquerdo em D com detalhe esquerdo em H), que em
algumas áreas eram circunjacentes às formações nodulares marcadas com vermelho de Alizarina (AR, fluorescência
vermelha) (D, detalhe esquerdo). Fluorescência verde indica o citoesqueleto de actina para A-H (branca, nos
detalhes de A e E) e a azul, núcleos celulares. Barra para A-H = 100 µm; A, E detalhes = 50 µm; D, H detalhes
esquerdos = 200 µm; D, H detalhes direitos = 25 µm.
26
Figura 2. Microscopia eletrônica de varredura de culturas de células osteogênicas derivadas de osso alveolar
humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle (A, B) e GFs+proteínas (C, D), em 1 (A, C) e 4 (B, D) dias. No
1
o
dia, o grupo GFs+proteínas exibia células com extensões citoplasmáticas mais delgadas (C e C detalhe) se
comparadas às do controle (A). Em 14 dias, as culturas expostas ao coquetel de GFs e proteínas apresentavam
claramente maior número de células (compare D com B). Barra para A, C = 20 µm; C, detalhe = 25 µm; B, D = 100
µm.
Figura 3. Número total de células de culturas de células osteogênicas derivadas de osso alveolar humano crescidas
sobre titânio, dos grupos controle e GFs+proteínas, em 1, 4 e 7 dias. Nos dias 4 e 7, o número total de células foi
significativamente maior (p < 0,01) para o grupo GFs+proteínas. Os dados são apresentados como média ± desvio
padrão (n=5).
27
Figura 4. Dupla marcação Ki-67/DAPI (fluorescências vermelha e azul, respectivamente), utilizada para
determinar a proporção de células no ciclo celular (Ki-67 positivas) de culturas de células osteogênicas derivadas de
osso alveolar humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle (A, B) e GFs+proteínas (C, D), em 1 (A, C) e 4
(B, D) dias. Barra para A-D = 50 µm.
Figura 5. Proporção de células Ki-67 positivas de culturas de células osteogênicas derivadas de osso alveolar
humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle e GFs+proteínas, em 1 e 4 dias. Aumento significativo (p =
0,05) foi observado na proporção do número de células no ciclo celular nas culturas exposta ao coquetel de GFs e
proteínas. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n=3).
28
Figura 6. Dupla marcação fosfatase alcalina/DAPI (fluorescências vermelha e azul, respectivamente) de culturas de
células osteogênicas derivadas de osso alveolar humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle (A-C) e
GFs+proteínas (D-F), em 4 (A, D), 7 (B, E), e 10 (C, F) dias. Nas culturas expostas ao coquetel de GFs e proteínas,
observa-se marcação para fosfatase alcalina de menor intensidade. Barra para A-F = 200 µm.
Figura 7. Atividade de fosfatase alcalina (µmol de timolftaleína/h/mg de proteína) de culturas de células
osteogênicas derivadas de osso alveolar humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle e GFs+proteínas, em 4,
7 e 10 dias. O grupo GFs+proteínas mostrou redução significativa (p < 0,01) nos níveis de atividade dessa enzima.
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n=5).
29
TABELA I. Análise quantitativa (média ± desvio padrão, n) do número total de células,
viabilidade celular, proporção de células no ciclo celular (Ki-67 positivas), conteúdo de proteína
total e atividade de fosfatase alcalina (ALP) de culturas de células osteogênicas derivadas de osso
alveolar humano crescidas sobre titânio, dos grupos controle e GFs+proteínas
Parâmetros
Tempo
(dias)
Controle GFs+proteínas
Teste de
Mann-
Whitney
1 1,6 ± 0,4 (5) 1,5 ± 0,5 (5) NS
a
4 6,9 ± 0,4 (5) 11,1 ± 0,5 (5) S
b
Número total de
células (x10
4
)
7 14,3 ± 2,6 (5) 37,4 ± 6,7 (5) S
b
4 95,2 ± 1,6 (5) 97 ± 1,6 (5) S
c
Viabilidade celular
(%)
7 95,3 ± 2 (5) 97,3 ± 0,8 (5) NS
a
1 71,9 ± 1,7 (3) 83,8 ± 8,6 (3) S
d
Células Ki-67
positivas (%)
4 66,2 ± 10,9 (3) 81,7 ± 1,6 (3) S
d
4 16,8 ± 4,5 (5) 33,9 ± 9,3 (5) S
b
7 34,6 ± 5,6 (5) 101,5 ± 15,2 (5) S
b
Conteúdo de proteína
total (µg/mL)
10 90 ± 6,4 (5) 150,4 ± 24,5 (3) S
c
4 29,8 ± 10,1 (5) 9,6 ± 2,1 (5) S
b
7 43,6 ± 9,1 (5) 2,8 ± 0,2 (5) S
b
Atividade de ALP
(µmol de
timolftaleína/h/mg)
10 31,4 ± 2,4 (5) 2,6 ± 0,3(5) S
b
a
Não significante (p > 0,05).
b
Significante (p < 0,01).
c
Significante (p < 0,05).
d
Significante (p = 0,05).
30
Células de calvária de ratos - Experimentos dose-resposta
Os experimentos dose-resposta demonstraram que apenas o grupo GFs+proteínas/100
desenvolveu o fenótipo osteogênico, apesar dos níveis significativamente reduzidos quando
comparados aos dos grupos controle e proteínas (Figuras 8-13). No 7
o
dia, as culturas controles
exibiam extensas áreas com células imunomarcadas para BSP, principalmente em formações
iniciais de multicamadas celulares (Figura 8A), enquanto que os demais grupos apresentavam
apenas discreta marcação e em áreas focais (Figura 8B-E). Valores de viabilidade/proliferação
celular para os grupos GFs+proteínas/10, GFs+proteínas/100 e proteínas foram semelhantes aos
observados para o grupo controle, sendo, no entanto, significativamente maiores para
GFs+proteínas (Figura 9; Tabelas 2 e 3). No 7
o
dia, os grupos expostos ao coquetel de GFs e
proteínas apresentaram redução significativa na atividade de ALP quando comparado ao
controle. No 10
o
dia, a atividade de ALP aumentou em todos os grupos experimentais, com
exceção para o grupo GFs+proteínas, a qual não se alterou, apesar de não haver relação dose-
resposta. A maior atividade de ALP foi observada para o grupo controle, seguida pelo grupo
proteínas (Figura 10; Tabelas 2 e 3). O perfil do gráfico referente aos resultados de conteúdo de
proteína total nos dias 7 e 10 assemelhava-se ao obtido para o ensaio de MTT no dia 7 (compare
Figura 11 com 9), mostrando valores significativamente maiores para GFs+proteínas (Tabelas 2
e 3). No 14
o
dia, análises qualitativa e quantitativa revelaram que os grupos controle, proteínas e
GFs+proteínas/100 desenvolveram formações nodulares de matriz mineralizada (Figuras 12 e
13); coradas com vermelho de Alizarina e imunorreativas para BSP (Figura 12A, B, E). As
proporções de área total mineralizada para os diferentes grupos seguiram a ordem: controle =
proteínas > GFs+proteínas/100 > GFs+proteínas/10 = GFs+proteínas (Figura 13; Tabelas 2 e 3).
Observou-se ausência completa de formações nodulares de matriz mineralizada nos grupos
GFs+proteínas e GFs+proteínas/10 (Figuras 12C, D e 13).
31
32
Figura 8. Dupla marcação sialoproteína óssea (BSP, fluorescência vermelha)/DAPI (fluorescência azul) de culturas
primárias de células osteogênicas derivadas de calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle (A),
proteínas (B), GFs+proteínas (C), GFs+proteínas/10 (D) e GFs+proteínas/100 (E), em 7 dias. Apenas as culturas
controles mostravam áreas mais extensas marcadas para BSP, em sua maioria associadas a formações iniciais de
multicamadas celulares (A). Os demais grupos apresentavam marcações para BSP de menor intensidade, em áreas
menos extensas (B-E) e apenas focais. Note-se maior densidade de células para o grupo GFs+proteínas (C). Barra
para A-E = 200 µm.
Figura 9. Análise da viabilidade/proliferação celular (Método MTT) de culturas primárias de células osteogênicas
derivadas de calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle, GFs+proteínas, GFs+proteínas/10,
GFs+proteínas/100 e proteínas, em 7 dias. O grupo GFs+proteínas apresentou valores de MTT significativamente
maiores. A densidade óptica foi lida em 570-650 nm e os dados estão expressos como absorbância.
Figura 10. Atividade de fosfatase alcalina (ALP; µmol de timolftaleína/h/mg) de culturas primárias de células
osteogênicas derivadas de calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle, GFs+proteínas,
GFs+proteínas/10, GFs+proteínas/100 e proteínas, em 7 e 10 dias. Não se observa relação dose-resposta para este
parâmetro em 10 dias. Os níveis mais baixos de atividade de ALP foram observados para o grupo GFs+proteínas,
enquanto que não houve diferença entre as diluições 1:10 e 1:100.
Figura 11. Conteúdo de proteína total (µg/mL) de culturas primárias de células osteogênicas derivadas de calvária
de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle, GFs+proteínas, GFs+proteínas/10, GFs+proteínas/100 e
proteínas, em 7 e 10 dias. O gráfico deste parâmetro exibe perfil semelhante ao do ensaio de MTT em 7 dias
(compare com Figura 9).
Figura 12. Tripla marcação sialoproteína óssea (BSP, fluorescência verde)/DAPI (fluorescência azul)/vermelho de
Alizarina (fluorescência vermelha) de culturas primárias de células osteogênicas derivadas de calvária de ratos
crescidas sobre titânio, dos grupos controle (A), proteínas (B), GFs+proteínas (C), GFs+proteínas/10 (D) e
GFs+proteínas/100 (E), em 14 dias. Nódulos de matriz calcificada foram apenas observados nos grupos controle,
proteínas e GFs+proteínas (A, B, E, corados com vermelho de Alizarina), os quais também apresentavam marcação
para BSP (fluorescência verde). Os grupos GFs+proteínas e GFs+proteínas/10 (C e D, respectivamente) não exibiam
áreas coradas com vermelho de Alizarina e imunomarcadas para BSP. Barra para A, B, E = 100 µm; C, D = 200 µm.
Figura 13. Imagens macroscópicas e análise quantitativa de áreas coradas com vermelho de Alizarina de culturas
primárias de células osteogênicas derivadas de calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle,
GFs+proteínas, GFs+proteínas/10, GFs+proteínas/100 e proteínas, em 14 dias. A proporção da área total corada com
vermelho de Alizarina foi significativamente maior para os grupos controle e proteínas. O desenvolvimento de
nódulos de matriz calcificada também ocorreu no grupo GFs+proteínas/100, mas em quantidade significativamente
menor. Ausência de mineralização das culturas ocorreu nos grupos GFs+proteínas e GFs+proteínas/10. Diâmetro do
disco de titânio = 12 mm.
33
TABELA II. Análise quantitativa (media ± desvio padrão, n) da viabilidade/proliferação celular
(método MTT; densidade óptica, 570-650 nm), atividade de fosfatase alcalina (ALP; µmol de
timolftaleína/h/mg), conteúdo de proteína total (µg/mL), e proporção de áreas coradas com
vermelho de Alizarina (AR; %) de culturas primárias de células osteogênicas derivadas de
calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle, GFs+proteínas, GFs+proteínas/10,
GFs+proteínas/100 e proteínas
a
Significante (p < 0,01).
Método
MTT
Atividade de ALP Conteúdo de proteína total
Áreas
coradas
com AR
Grupos
Dia 7 Dia 7 Dia 10 Dia 7 Dia 10 Dia 14
Controle
0,12 ± 0,01
(4)
6,2 ± 2,6
(5)
24,9 ± 5,4
(5)
58 ± 3,2
(5)
92,6 ± 3,4
(5)
56,6 ± 10,1
(4)
GFs+proteínas
0,20 ± 0,02
(4)
2,2 ± 1,4
(4)
2 ± 0,6
(5)
81,3 ± 7,4
(4)
99 ± 10,1
(5)
0,9 ± 0,3
(4)
GFs+proteínas/10
0,13 ± 0,01
(4)
1,0 ± 0,4
(5)
5 ± 1,9
(5)
67,5 ± 4,9
(5)
96 ± 9,1
(5)
0,7 ± 0,7
(4)
GFs+proteínas/100
0,10 ± 0,01
(4)
0,4 ± 0,9
(5)
3,4 ± 2
(5)
46,5 ± 3,1
(5)
73,9 ± 5,8
(5)
26,4 ± 1,4
(4)
Proteínas
0,12 ± 0,02
(4)
1,2 ± 0,9
(4)
8,6 ± 2,1
(4)
53,9 ± 3,5
(4)
87 ± 11,4
(4)
46,8 ± 0,7
(4)
Teste de
Kruskal-Wallis
S
a
S
a
S
a
S
a
S
a
S
a
34
TABELA III. Análise comparativa (Pós-teste de Fischer) da viabilidade/proliferação celular
(método MTT), atividade de fosfatase alcalina (ALP), conteúdo de proteína total e proporção de
áreas coradas com vermelho de Alizarina (AR) de culturas primárias de células osteogênicas
derivadas de calvária de ratos crescidas sobre titânio, dos grupos controle, GFs+proteínas,
GFs+proteínas/10, GFs+proteínas/100 e proteínas
Método
MTT
Atividade de ALP
Conteúdo de
proteína total
Áreas
coradas
com AR
Comparações (pós-teste de Fischer)
Dia 7 Dia 7 Dia 10 Dia 7 Dia 10 Dia 14
Controle x GFs+proteínas 1% 5% 0,1% 0,1% NS
a
0,1%
Controle x GFs+proteínas/10 NS
a
0,1% 0,1% 0,1% NS
a
0,1%
Controle x GFs+proteínas/100 NS
a
0,1% 0,1% 0,1% 1% 0,1%
Controle x Proteínas NS
a
1% 5% 5% NS
a
NS
a
GFs+proteínas x GFs+proteínas/10 5% NS
a
0,1% 1% NS
a
NS
a
GFs+proteínas x GFs+proteínas/100 0,1% 1% 5% 0,1% 0,1% 1%
GFs+proteínas x Proteínas 1% NS
a
0,1% 0,1% 5% 0,1%
GFs+proteínas/10 x GFs+proteínas/100 1% NS
a
NS
a
0,1% 0,1% 0,1%
GFs+proteínas/10 x Proteínas NS
a
NS
a
5% 0,1% NS
a
0,1%
GFs+proteínas/100 x Proteínas 5% NS
a
0,1% 1% NS
a
1%
a
Non significant (p > 0.05).
35
DISCUSSÃO
A aplicação do PRP para acelerar o reparo ósseo baseia-se no fato de GFs liberados por
plaquetas e proteínas plasmáticas intensificarem os eventos celulares que, normalmente,
ocorreriam no sítio de reparo.
13
Os resultados do presente trabalho mostram que o coquetel de
GFs e proteínas inibe o desenvolvimento do fenótipo osteogênico de culturas de células
osteoblásticas humanas e de ratos crescidas sobre Ti. Apesar da variação entre espécies, a
ausência de nódulos de matriz mineralizada foi observada em ambas as culturas analisadas.
Além disso, o experimento dose-resposta com células de calvária de ratos demonstrou que a
diluição do coquetel pode, eventualmente, restaurar a formação de nódulos de matriz
mineralizada. Esses resultados corroboram os estudos in vitro e in vivo que têm mostrado a
ineficácia do uso de PRP na promoção de efeitos consistentes nos eventos osteogênicos.
13,18,19,21-
29
O mesmo ocorre, inclusive, na osseointegração de implantes metálicos.
30-32
No contexto da biologia óssea, relação inversa entre proliferação e diferenciação celular
tem sido amplamente descrita, inclusive para células cultivadas sobre o Ti.
46
De fato, a fase final
de diferenciação osteoblástica está necessariamente associada com a fase G0, fora do ciclo
celular.
47,48
Por essa razão, estratégias de diluir o PRP na tentativa de equilibrar a relação
proliferação/diferenciação têm sido utilizadas com o objetivo de melhorar o prognóstico da
reparação óssea.
18,21,31,49-52
É importante ressaltar que o coquetel utilizado apresenta
concentração inferior às preparações típicas de PRP e, apesar da diluição 1:10 reduzir
significativamente a viabilidade/proliferação ao nível do grupo controle, isso não refletiu em
aumento da diferenciação osteoblástica. A diluição 1:100 foi necessária para restaurar a
formação de matriz mineralizada. Novos estudos, com o objetivo de alcançar um equilíbrio
funcional entre o efeito mitogênico e o processo de diferenciação celular, são necessários para
avaliar as diferentes proporções relativas do PRP, alterando os parâmetros de concentração,
duração e tempo de exposição.
36
A redução dos níveis de atividade de ALP para as culturas expostas ao coquetel de GFs e
proteínas é consistente com o efeito sobre a diferenciação osteogênica. Em estudo anterior foi
demonstrado que BMP-7 e GDF-5 poderiam, em parte, estimular a diferenciação osteogênica nas
culturas expostas ao coquetel de GFs e proteínas através do aumento da expressão de RNAm
para ALP.
53
Contudo, a atividade de ALP e a formação de matriz mineralizada não foram
significantemente afetadas, indicando que as células osteoblásticas não atingiam os estágios
finais de diferenciação. No presente estudo, os experimentos dose-resposta demonstraram que a
atividade de ALP aumentou com a diluição do coquetel e que, apesar de não haver diferença
significativa entre as diluições de 1:10 e 1:100, apenas esta desenvolveu o fenótipo osteogênico.
Isso sugere que, além da atividade de ALP, outros parâmetros devem ser considerados. De fato,
ambos os grupos GFs+proteínas e GFs+proteínas/10 não apresentaram marcação para BSP em
14 dias. Essa proteína matricelular é considerada um marcador inicial da diferenciação
osteoblástica, com papel fundamental no processo de nucleação de apatitas na matriz
colágena.
54,55
Contudo, não se pode descartar que a diferença na mineralização entre as diluições
1:10 e 1:100 esteja relacionada à atividade de ALP. Ressalte-se que mesmo uma redução
moderada na expressão dessa enzima e em sua atividade pode ser suficiente para limitar o
processo de mineralização.
56
O procedimento utilizado para avaliar a atividade de ALP não
permite detectar pequenas diferenças que possam existir entre estas duas diluições. Além disso,
dificuldades na extração de proteínas/enzimas da matriz calcificada poderiam resultar, em alguns
casos, em valores de atividade de ALP que não se correlacionam com o conteúdo de proteína
total e o número de células.
57
No tecido ósseo, a ALP está confinada à superfície de osteoblastos,
incluindo as membranas das vesículas de matriz que eles secretam, nas quais a ALP é
particularmente mais concentrada. Tem sido proposto que o principal papel da ALP é fornecer
fosfato necessário para formação de hidroxiapatita. Contudo, tem sido sugerido, também, que a
ALP pode hidrolisar o inibidor de mineralização pirofosfato, facilitando a precipitação mineral e
37
a formação do tecido ósseo.
58
Assim, o coquetel de GFs e proteínas poderia também alterar o
equilíbrio fosfato/pirofosfato, o qual é considerado crucial para a mineralização da matriz
extracelular.
O presente trabalho mostrou que o coquetel de GFs e proteínas, contendo os principais
componentes do PRP, limita a progressão de células osteogênicas humanas e de ratos crescidas
sobre o Ti. Os experimentos dose-resposta revelaram que a redução da proliferação celular,
associada ao aumento dos níveis de ALP, não resulta necessariamente na formação de nódulos
de matriz calcificada. Os resultados corroboram estudos prévios indicando que o PRP não
promove a reparação óssea em determinadas condições experimentais e clínicas. Além disso,
reforçam a necessidade de se questionar o uso de terapias moleculares baseadas em PRP visando
a favorecer a osseointegração de implantes.
38
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Artigo em Inglês *
*Este artigo foi escrito de acordo com as normas do Journal of Biomedical
Materials Research Part A.
44
Treatment with a Growth Factor-Protein Mixture Inhibits Formation of
Mineralized Nodules in Osteogenic Cell Cultures Grown on Titanium
Marcos Andrade de Oliva
1
, William Marcatti Amarú Maximiano
1
, Larissa Moreira
Spínola de Castro
1
, Paulo Eliandro da Silva Junior
1
, Roger Rodrigo Fernandes
1
, Pietro
Ciancaglini
2
, Márcio Mateus Beloti
1
, Antonio Nanci
3
, Adalberto Luiz Rosa
1
, Paulo
Tambasco de Oliveira
1
1
Cell Culture Laboratory, Faculty of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av.
do Café, s/n, CEP 14040-904, Ribeirão Preto, SP, Brazil
2
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil
3
Laboratory for the Study of Calcified Tissues and Biomaterials, Faculté de Médecine Dentaire,
Université de Montréal, P.O. Box 6128, Station Centre-Ville, Montréal, QC H3C 3J7, Canada
Correspondence to: Prof. Dr. Paulo Tambasco de Oliveira, Division of Oral Histology, School of
Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av. do Café, s/n, 14040-904, Ribeirão
Preto, SP, Brazil. Tel. + 55 16 3602-3978 Fax: + 55 16 3633-0999. E-mail address:
Short title: PRP-like mixture inhibits the osteogenic phenotype on Ti
45
ABSTRACT
Background: Despite wide clinical application, the efficacy of platelet-rich plasma (PRP) for
repairing bone defects and enhancing osseointegration of metal implants is still subject of debate.
The objective of the present study was to evaluate the effects of a well-defined mixture of
growth factors (GFs) and proteins (GFs+proteins) on the development of the osteogenic
phenotype on titanium (Ti) in vitro. The composition of the mixture was based on the major
components found in PRP preparations. Methods: The PRP-like mixture contained PDGF-BB,
TGF-β1, TGF-β2, albumin, fibronectin, and thrombospondin. Osteoblastic cells were obtained
by enzymatic digestion of human alveolar bone and cultured under standard osteogenic condition
until subconfluence. They were then subcultured on Ti discs up to 14 days. Treated cultures were
exposed during the first 7 days to osteogenic medium supplemented with GFs+proteins and to
osteogenic medium alone thereafter. Control cultures were exposed to only osteogenic medium
throughout the culture interval. Dose-response experiments were carried out using rat primary
calvarial cells exposed to GFs+proteins and 1:10 or 1:100 dilutions of the mixture. Results:
Treated human-derived cell cultures exhibited a significantly higher number of cells from day 4
on and of cycling cells at days 1 and 4, significantly reduced levels for alkaline phosphatase
(ALP) activity, and no Alizarin red stained areas at day 14. Although the 1:10 and 1:100
dilutions restored the proliferative activity of rat calvaria-derived osteogenic cells to control
levels, mineralized bone-like nodule formation was only observed with the 1:100 dilution.
Conclusions: The present results demonstrated that a PRP-like protein mixture inhibits
development of the osteogenic phenotype in both human and rat osteoblastic cell cultures grown
on Ti.
Key Words: Titanium, Growth factors, Osteoblasts, Cell culture, Cell differentiation, Cell
proliferation, Mineralization.
46
INTRODUCTION
The ability to induce new bone formation around endosseous implants is of critical
importance for improving healing, increasing stability, and accelerating functional loading.
Various regenerative therapies with growth factors (GFs) have been applied to promote and, in
some cases, to induce new bone formation in bone defects, at sites of fracture healing, and
around metal implant devices.
1-4
Recombinant human bone morphogenetic proteins (rhBMPs)
and transforming growth factor β (rhTGF-β) have been demonstrated in various experimental
models to improve key parameters associated with successful osseointegration.
1,5-9
During bone tissue healing, cells are exposed to various GFs simultaneously, particularly
at early response intervals when platelets from the blood clot liberate multiple constituents.
10
In
this context, concentrates of plasma platelets have been exploited for repair of bone defects.
11-13
These so-called Platelet-Rich Plasma (PRP) preparations are rich in platelet-derived growth
factor (PDGF) and TGF-β, and also contain various plasma proteins.
14-20
Although beneficial
clinical results have been reported, some studies have shown that PRP does not promote bone
formation.
13,18,21-28
These divergent outcomes have been attributed to intra and interspecies
variations in the relative proportions of PRP components.
19,29
Thus, the effectiveness of PRP in
enhancing osseointegration of metal implants as well as of bone grafts is still a subject of
debate.
30-32
The objective of our study was to investigate the effects of a mixture of GFs and proteins
(hereafter referred to as GFs+proteins) on the development of the osteogenic phenotype on
titanium (Ti), using both human and rat cell cultures. To avoid the inherent variations in PRP
preparations, we have opted to experiment with a well-defined PRP-like mixture formulated to
contain the major components found in PRP extracts.
47
MATERIAL AND METHODS
Culture of osteogenic cells derived from human alveolar bone
Human alveolar bone fragments were obtained from adult healthy donors, using the
research protocols approved by the Committee of Ethics in Research of the School of Dentistry
of Ribeirão Preto of the University of São Paulo. Osteogenic cells were isolated by enzymatic
digestion of the explants using type II collagenase (Gibco – Life Technologies, Grand Island,
NY) as previously described.
33
They were then cultured in an osteogenic medium consisting of
Gibco α-Minimum Essential Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 10% fetal
bovine serum (Gibco), 50 µg/mL gentamicin (Gibco), 0.3 µg/mL fungisone (Gibco), 10
-7
M
dexamethasone (Sigma, St. Louis, MO), 5 µg/mL ascorbic acid (Gibco), and 7 mM β-
glycerophosphate (Sigma). Subconfluent cells in primary cultures were harvested after treatment
with 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Gibco) and 0.25% trypsin (Gibco) and
subcultured on polished, machined Ti discs (prepared as described previously).
34
The discs were
placed in 24-well polystyrene plates (Falcon, Franklin Lakes, NJ) and cells were seeded at a
density of 2×10
4
cells/well. Cultures were grown at 37ºC in a humidified atmosphere of 5% CO
2
and 95% air and the medium was changed every 3 days.
Composition of the GF and protein mixture, and treatment protocol
The GFs and proteins of the mixture were selected from major components found in
porcine
14
and human
29,35
platelet preparations (referred to as extracts or concentrates). The GFs
and proteins were diluted in osteogenic medium in the following amounts: 27 ng/mL
recombinant human (rh) PDGF-BB, 22 ng/mL rhTGF-β1, 15 ng/mL rhTGF-β2, 3.7 µg/mL
serum-derived human albumin, 2 µg/mL plasma-derived human fibronectin, and 0.5 µg/mL
platelet-derived thrombospondin, all purchased from Sigma. Treated cultures were exposed
during the first 7 days to the GFs+proteins mixture, which was added at time 0 and at day 3, and
48
to osteogenic medium alone thereafter. The timing of exposure to the GFs+proteins mixture was
defined based on the life span of platelets in wounds and the period of the direct influence of its
GFs, which is less than 5 days.
11
Control cultures were exposed to only osteogenic medium
throughout the culture period.
Fluorescence labeling
On days 1, 4, 7, 10, and 14, cells were fixed for 10 min at room temperature (RT) using
4% paraformaldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer (PB), pH 7.2. For dual staining with
Alizarin red (Sigma) and immunolabeling with bone sialoprotein (BSP), cells were fixed in 70%
ethanol for 60 min at 4°C (see below). After washing in PB, cultures were processed for
immunofluorescence labeling as described previously.
34
Briefly, they were permeabilized with
0.5% Triton X-100 in PB for 10 min, followed by blocking with 5% skimmed milk in PB for 30
min. Primary antibodies to human bone alkaline phosphatase (ALP) (monoclonal B4-78, 1:100;
Developmental Studies Hybridoma Bank-DSHB, Iowa City, IA), human Ki-67 (polyclonal,
1:70; Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA), human BSP (polyclonal LF-100,
36
1:1000, kindly
provided by Dr. Larry W. Fisher, NIH, Bethesda, MD), rat BSP (monoclonal WVID1-9C5,
1:200, DSHB), and human vinculin (monoclonal hVIN-1, 1:400, Sigma) were used, followed by
Alexa Fluor 488 (green fluorescence) or 594 (red fluorescence)-conjugated goat anti-mouse or
anti-rabbit secondary antibody (1:200, Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR). Alexa Fluor
488 (green fluorescence)-conjugated phalloidin (1:200, Molecular Probes) was used to label
actin cytoskeleton. Replacement of the primary antibodies with PB was used as control. All
antibody incubations were performed in a humidified environment for 60 min at RT. Between
each incubation step, the samples were washed three times (5 min each) in PB. Before mounting
for microscope observation, cell nuclei were stained with 300 nM 4',6-diamidino-2-
phenylindole, dihydrochloride (DAPI, Molecular Probes) for 5 min and samples were briefly
49
washed with dH
2
O. Titanium discs were placed face up on glass slides and mounted with a
Fisherbrand 12 mm-round glass coverslip (Fisher Scientific, Suwanee, GA) using an antifade
mounting medium (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA). The samples were then
examined under epifluorescence using a Leica DMLB light microscope (Leica, Bensheim,
Germany), with N Plan (×10/0.25, ×20/0.40) and HCX PL Fluotar (×40/0.75) objectives,
outfitted with a Leica DC 300F digital camera. The acquired digital images were processed with
Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA).
Scanning electron microscope (SEM) imaging
At days 1 and 4, cells were fixed for 60 min at RT using 4% paraformaldehyde in PB, pH
7.2, washed in PB, followed by dH2O. Samples were examined wet in a JEOL JSM-6460LV
variable pressure scanning electron microscope operated at 7 kV and 50-70 Pa. Digital images
were processed with Adobe Photoshop.
Growth curve and cell viability
Cells grown for periods of 1, 4, and 7 days were enzymatically detached from Ti discs
using 1 mM EDTA, 1.3 mg/mL collagenase, and 0.25% trypsin solution (Gibco, Invitrogen).
Total number of cells/well, and percentage of viable and nonviable cells were determined after
Trypan blue (Sigma) staining using a hemacytometer.
Proportion of cycling cells
The proportion of cycling cells at days 1 and 4 was determined by means of double Ki-
67/DAPI labeling. The total number of nuclei (DAPI stained) and of cycling cells (Ki-67
positive)
37
on control and treated cultures was calculated by light microscope counting under
epifluorescence at ×40 objective. A minimum total of 200 cells were counted on three Ti discs at
each time point.
50
Total protein content
Total protein content was calculated at days 4, 7, and 10, according to the method
described by Lowry et al.
38
The wells were filled with 2 mL of deionized water. After 5 cycles of
thermal-shock (alternating temperature between 15 min at 37ºC and 20 min at -20ºC) 1 mL of
the sample from each well was mixed with 1 mL of Lowry solution (Sigma) and left for 20 min
at RT. Subsequently, 0.5 mL of phenol reagent of Folin and Ciocalteau (Sigma) was added. This
was then left for 30 min at RT, after which absorbance was measured using a spectrophotometer
(CE3021; Cecil, Cambridge, UK) at 680 nm. Total protein content was calculated from a
standard curve using bovine serum albumin (Sigma), giving a range of 25 to 400 µg protein/mL
and data were expressed as µg protein/mL.
ALP activity
ALP activity was assayed in the same lysates used for determining total protein content
as the release of thymolphthalein from thymolphthalein monophosphate using a commercial kit
(Labtest Diagnóstica, MG, Brazil). Briefly, 50 µL of thymolphthalein monophosphate was
mixed with 0.5 mL of 0.3M diethanolamine buffer, pH 10.1, and left for 2 min at 37°C. The
solution was then added to 50 µL of the lysates obtained from each well for 10 min at 37°C. For
color development, 2 mL of 0.09M Na
2
CO
3
and 0.25M NaOH were added. After 30 min,
absorbance was measured at 590 nm and ALP activity was calculated from a standard curve
using thymolphthalein to give a range of 0.012-0.4 µmol thymolphthalein/h/mL. Data were
expressed as µmol thymolphthalein per hour per mg protein.
Mineralized bone-like nodule formation
For the histochemical detection of mineralized bone-like nodule formation, cultures at
day 14 were washed in Hanks’ balanced salt solution (Sigma) and fixed in 70% ethanol for 60
51
min at 4
o
C. The samples were washed in phosphate buffered saline (PBS) and dH2O and then
stained with 2% Alizarin red, pH 4.2, for 15 min at RT. After being profusely washed in dH2O,
cultures were also processed for triple labeling with anti-BSP antibody (WVID1-9C5 or LF-100)
and DAPI, and then observed under epifluorescence.
Dose-response experiments with calvarial cell cultures
To test the effects of serial dilutions of the GFs+proteins mixture on the development of
the osteogenic phenotype, we have used rat osteogenic cells obtained by enzymatic digestion of
newborn calvaria and cultured under the same conditions as for human cells.
34,39-41
This cell
model was selected because of its high and-well-defined osteogenic activity, especially in
presence of dexamethasone.
42,43
During the first 7 days of culture, calvarial cells were exposed to
three different dilutions of GFs+proteins mixture (1:1, 1:10 and 1:100, also referred to as
GFs+proteins, GFs+proteins/10, and GFs+proteins/100, respectively). Because many of the PRP
effects on cells do not reflect simple combination of its major GFs,
44
cells were also exposed to
the mixture containing only the protein constituents. The parameters evaluated for calvarial cell
cultures were: 1) at days 7 and 14, BSP labeling (as described above); 2) at day 7, mitochondrial
tetrazolium test (MTT); 3) at days 7 and 10, ALP activity and total protein content, and at day
14, mineralized bone-like nodule formation (as described above).
The MTT assay for cell viability/proliferation is based on the reductive cleavage of
yellow tetrazolium salt to a purple formazan compound by the dehydrogenase activity of intact
mitochondria. Therefore, this conversion only occurs in living cells. At day 7, cells were
incubated with 100 µL of 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (5
mg/mL) in PBS at 37°C for 4 h. The medium was then aspirated from the well and 1 mL of acid
isopropanol (0.04 N HCl in isopropanol) was added to each well. The plates were then agitated
on a plate shaker for 5 min, and 100 µL of this solution were transferred to a 96-well format
52
using opaque-walled transparent-bottomed plates (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). The optical
density was read at 570–650 nm on the plate reader (µQuant, Biotek, Winooski, VT) and data
were expressed as absorbance.
45
Alizarin red-stained cultures were photographed with a high-resolution digital camera
(Canon EOS Digital Rebel Camera, 6.3 Megapixel CMOS sensor, with a Canon EF 100 mm
f/2.8 macro lens, Canon, Lake Success, NY) and were also imaged by epifluorescence. The
percentage of the substrate area occupied by Alizarin red-stained nodules was determined by
analyzing the macroscopic images using Image Tool software (University of Texas Health
Science Center, San Antonio, TX).
Statistical analysis
Data are presented as mean ± standard deviation (SD). The chi-square test was used to
determine normality of data sets. Comparisons were then carried out using the non-parametrical
Mann-Whitney test, for two independent samples or Kruskal-Wallis test, for multiple
comparisons, followed by the Fischer test based on rank, where appropriate. The level of
significance was set at 5%. The results described below are representative of a minimum of 2
sets of human and rat osteogenic cell cultures.
53
RESULTS
Human alveolar bone-derived cells
Important differences were clearly noticed in terms of cell morphology and tissue
architecture from day 1 on between control and GFs+proteins treated cultures as revealed by
epifluorescence and SEM imaging (Figures 1 and 2, respectively). At day 1, although both
control and treated cells were polygonal in shape, the latter exhibited higher proportion of thin
cytoplasmic extensions (Figures 1A,E and 2A,C). For both groups, vinculin labeling was
localized perinuclearly and in focal adhesions sites (Figure 1A,E, insets). At days 4 and 7, treated
cultures exhibited a higher cell density and abundant mitoses (Figures 1F,G and 2, compare D
with B), with the majority of cells showing smaller nuclear dimensions compared to control cells
(compare in Figure 1, F with B and G with C). Noticeably, areas of calcified matrix were only
detected in control cultures at day 14 (compare in Figure 1, D with H), and these exhibited a
higher proportion of cells showing morphologic aspects of apoptosis (Figure 1D, right inset).
Calcified nodular areas stained with Alizarin red and labeled for BSP (Figure 1D, left inset). At
this culture interval, treated cultures showed cell alignment (Figure 1H), no BSP labeling and
reduced amounts of apoptotic cells (Figure 1H, left and right insets, respectively).
Cell proliferation/viability analyses revealed that treated cultures supported the growth of
significantly more cells at days 4 and 7 (Figure 3, Table 1) and higher number of viable cells at
day 4 (Table 1). The proportion of cycling cells was significantly higher for treated cultures both
at days 1 and 4 (Figures 4 and 5, Table 1) compared to the control.
Total protein content was significantly higher in treated cultures at all time points and the
amount of ALP, as determined by activity measurements and immunolabeling of the protein, was
reduced (Figures 6 and 7, Table 1). Notably, at days 7 and 10 ALP specific activity levels were
reduced more than 90% compared to control (15- and 12-fold, respectively). While the profile of
ALP activity over time revealed peak levels at day 7 for control cultures, the GFs+proteins group
54
exhibited a significant decrease from day 4 to days 7 and 10, despite the significant increase in
the total of protein content compared to control (2, 2.9, and 1.7-fold, respectively).
Rat calvarial cells – Dose-response experiments
Dose-response experiments showed that only GFs+proteins/100 group supported the
development of the osteogenic phenotype, although in reduced levels compared to control and
proteins groups (Figures 8-13). At day 7, control cultures exhibited large areas of BSP positive
cells, mostly in sites of initial cell multilayering (Figure 8A), whereas treated cultures showed
only focal sites of weak BSP labeling (Figure 8B-E). Cell viability/proliferation assay revealed
that mitochondrial activity was significantly higher for GFs+proteins cultures, reducing to
control levels for GFs+proteins/10 and GFs+proteins/100 groups (Figure 9, Tables 2 and 3). At
day 7, there was a significant difference in ALP activity between the control and the
GFs+proteins treated groups, which exhibited low levels. At day 10, ALP specific activity
increased in all experimental groups, except for GFs+proteins, which remained unaltered, but
there was no significant GFs+proteins dose-response relationship. The highest ALP activity was
observed with the control, followed by the proteins only group (Figure 10, Tables 2 and 3). Total
protein content profiles at days 7 and 10 correlated with the MTT results at day 7 (compare
Figure 11 with Figure 9), with significantly higher values for GFs+proteins cultures (Tables 2
and 3). At day 14, qualitative and quantitative analyses revealed that control, proteins and
GFs+proteins/100 groups supported the development of mineralized bone-like nodule formation
(Figures 12 and 13); nodules stained with Alizarin red and were BSP immunoreactive (Figure
12A,B,E). Proportions of Alizarin red stained areas ranked as follows: Control = Proteins >
GFs+proteins/100 > GFs+proteins/10 = GFs+proteins (Figure 13, Tables 2 and 3). Strikingly, a
complete lack of bone-like nodule formation was noticed for GFs+proteins and GFs+proteins/10
treated cultures (Figures 12C,D and 13).
55
DISCUSSION
The use of PRP to enhance tissue repair relies on the concentrated release of platelet GFs
for enhancing cellular events that normally take place at wound healing sites.
13
The results of the
present study show that a mixture of major GFs and proteins found in platelet extracts
dramatically inhibits development of the osteogenic phenotype in both human alveolar bone and
rat calvarial cell cultures grown on Ti. Remarkably, despite interspecies variations, complete
lack of bone-like nodule formation took place in both cultures. In addition, dose-response
experiments with calvarial cells revealed that dilution of the mixture can eventually partially
restore bone-like nodule formation. These data are in accordance with various in vitro and in
vivo studies showing that PRP has no consistent effects on osteogenic events,
13,18,19,21-29
including osseointegration of metal implants.
30-32
It has been well-established that there is an inverse relationship between proliferation and
differentiation of osteoblastic cells, including for cells cultured on Ti.
46
Indeed, full expression of
the osteoblast phenotype leads to terminal cell cycle exit.
47,48
To make bone repair more
predictable, there have been attempts to balance proliferation/differentiation by using serial
dilutions of PRP preparations.
18,21,31,49-52
Our GFs+proteins mixture is less concentrated than
typical PRP preparations and, although a 1:10 dilution significantly reduced cell proliferation, it
did not enhance osteoblastic differentiation. A dilution of 1:100 was necessary to restore bone-
like nodule formation. Clearly, further studies are needed to optimize the relative proportions of
PRP components, and duration and timing of exposure to achieve a functional balance between
mitogenic activity and osteoblast differentiation effects of PRP-related GF and protein mixtures.
The inhibition of ALP activity in both human and rat osteogenic cultures treated with
GFs+proteins is consistent with an effect on osteogenic differentiation. In a previous study by
our group, it was shown that BMP-7 and GDF-5 could, in part, influence osteogenic
differentiation in GFs+proteins treated cultures by upregulating ALP mRNA expression.
53
ALP
56
activity and mineralized nodule formation were, however, not significantly affected, a finding
interpreted as reflecting an early differentiation status of the cells. In the present study, the dose-
response experiments showed that ALP activity increases with dilution of the mixture, and while
there is no significant difference in activity between the 1:10 or 1:100 dilutions, only the latter
supported mineral deposition. This suggests that, in addition to ALP activity, other parameters
must be taken in consideration for initiating and sustaining the mineralization process. Indeed,
both GFs+proteins and GFs+proteins/10 showed no BSP labeling at day 14. This matricellular
protein is considered an early marker of differentiating osteoblasts and is crucial for promoting
hydroxyapatite nucleation on collagen.
54,55
However, it cannot be ruled out that the difference in
mineralization observed between the 1:10 and 1:100 dilutions relates to ALP activity. It has been
demonstrated that even a moderate reduction in ALP expression levels and enzyme activity
could be sufficient to impair the mineralization process.
56
The procedure used herein to assay
ALP activity does not allow determining small differences that may exist between the two
dosages. In addition, difficulties in extraction of proteins/enzymes from calcified matrices could
in some cases result in ALP specific activity values that do not accurately correlate with total
protein content and cell number.
57
In bone, ALP is confined to the cell surface of osteoblasts,
including the membranes of the matrix vesicle they shed, where the enzyme is particularly
enriched compared with the plasma membrane of the cell. It has been proposed that the main role
of ALP is to generate the phosphate needed for hydroxyapatite formation. However, ALP has
also been hypothesized to hydrolyze pyrophosphate, a mineralization inhibitor, in order to
facilitate mineral precipitation and growth.
58
Therefore, treatment with GFs+proteins may also
affect the phosphate/pyrophosphate equilibrium, which per se is crucial for the regulation of
matrix mineralization.
In conclusion, the present study demonstrates that a GFs+proteins mixture, which
contains the major components of PRP preparations, impairs the progression of both human and
57
rat osteogenic cells grown on Ti. Dose-response experiments showed that the reduction in cell
proliferation associated with higher ALP activity levels does not necessarily correlate with
production of mineralized matrix. Thus, our data lend support to previous studies showing that
PRP preparations do not promote bone repair under various experimental and clinical conditions.
They also raise the question of whether PRP-based multiple component molecular therapy can
benefit osseointegration of implants.
Funded by:
State of São Paulo Research Foundation (FAPESP, Brazil)
National Council of Scientific and Technological Development (CNPq, Brazil)
Canadian Institutes of Health Research (CIHR)
Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC)
Acknowledgements
The authors thank Sylvia Francis Zalzal (Université de Montréal, Montréal, QC, Canada) for
SEM analysis and imaging, and Dr. Larry W. Fisher (NIH, Bethesda, MD) for providing the
anti-human BSP (LF-100) antibody. Marcos Andrade de Oliva and Larissa Moreira Spínola de
Castro are recipients of Masters Scholarships from FAPESP. William Marcatti Amarú
Maximiano and Paulo Eliandro da Silva Junior were recipients of Internships Scholarships from
FAPESP and CNPq, respectively. The mouse monoclonal antibodies anti-human bone ALP (B4-
78), developed by Jerry A. Katzmann, and anti-rat BSP (WVID1-9C5), developed by Michael
Solursh and Ahnders Franzen, were obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank
developed under the auspices of the NICHD and maintained by the Department of Biological
Sciences of the University of Iowa (Iowa City, IA 52242).
58
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63
TABLE I. Quantitative analysis (mean ± SD, n) of total cell number (x10
4
), cell viability
(%), cycling cells (% Ki-67 positive cells), total protein content (µg/mL), and alkaline
phosphatase (ALP) activity (µmol thymolphthalein/h/mg protein) of control and
GFs+proteins treated human alveolar bone-derived osteogenic cell cultures grown on
titanium discs
Parameters
Time
points
(days)
Control GFs+proteins
Mann-
Whitney test
1 1.6 ± 0.4 (5) 1.5 ± 0.5 (5) NS
a
4 6.9 ± 0.4 (5) 11.1 ± 0.5 (5) S
b
Total cell number
7 14.3 ± 2.6 (5) 37.4 ± 6.7 (5) S
b
4 95.2 ± 1.6 (5) 97.0 ± 1.6 (5) S
c
Cell viability
7 95.3 ± 2.0 (5) 97.3 ± 0.8 (5) NS
a
1 71.9 ± 1.7 (3) 83.8 ± 8.6 (3) S
d
Cycling cells
4 66.2 ± 10.9 (3) 81.7 ± 1.6 (3) S
d
4 16.8 ± 4.5 (5) 33.9 ± 9.3 (5) S
b
7 34.6 ± 5.6 (5) 101.5 ± 15.2 (5) S
b
Total protein content
10 90.0 ± 6.4 (5) 150.4 ± 24.5 (3) S
c
4 29.8 ± 10.1 (5) 9.6 ± 2.1 (5) S
b
7 43.6 ± 9.1 (5) 2.8 ± 0.2 (5) S
b
ALP activity
10 31.4 ± 2.4 (5) 2.6 ± 0.3 (5) S
b
a
Non significant (p > 0.05).
b
Significant (p < 0.01).
c
Significant (p < 0.05).
d
Significant (p = 0.05).
64
TABLE II. Quantitative analysis (mean ± SD, n) of MTT assay (optical density, 570-650 nm),
alkaline phosphatase (ALP) activity (µmol thymolphthalein/h/mg protein), total protein content
(µg/mL), and proportion of bone-like nodule formation (%) of control, GFs+proteins,
GFs+proteins/10, GFs+proteins/100, and proteins treated rat calvarial osteogenic cell cultures
grown on titanium discs
a
Significant (p < 0.01).
MTT
assay
ALP activity Total protein content
Bone-like
nodule
formation
Groups
Day 7 Day 7 Day 10 Day 7 Day 10 Day 14
Control
0.12 ± 0.01
(4)
6.2 ± 2.6
(5)
24.9 ± 5.4
(5)
58.0 ± 3.2
(5)
92.6 ± 3.4
(5)
56.6 ± 10.1
(4)
GFs+proteins
0.20 ± 0.02
(4)
2.2 ± 1.4
(4)
2.0 ± 0.6
(5)
81.3 ± 7.4
(4)
99.0 ± 10.1
(5)
0.9 ± 0.3
(4)
GFs+proteins/10
0.13 ± 0.01
(4)
1.0 ± 0.4
(5)
5.0 ± 1.9
(5)
67.5 ± 4.9
(5)
96.0 ± 9.1
(5)
0.7 ± 0.7
(4)
GFs+proteins/100
0.10 ± 0.01
(4)
0.4 ± 0.9
(5)
3.4 ± 2.0
(5)
46.5 ± 3.1
(5)
73.9 ± 5.8
(5)
26.4 ± 1.4
(4)
Proteins
0.12 ± 0.02
(4)
1.2 ± 0.9
(4)
8.6 ± 2.1
(4)
53.9 ± 3.5
(4)
87.0 ± 11.4
(4)
46.8 ± 0.7
(4)
Kruskal-Wallis
test
S
a
S
a
S
a
S
a
S
a
S
a
65
TABLE III. Comparative analysis (Fischer post-test) for MTT, alkaline phosphatase (ALP)
activity, total protein content, and bone-like nodule formation of control, GFs+proteins,
GFs+proteins/10, GFs+proteins/100, and proteins treated rat calvarial osteogenic cell cultures
grown on titanium discs
MTT
assay
ALP activity Total protein content
Bone-like
nodule
formation
Comparisons (Fischer post-test)
Day 7 Day 7 Day 10 Day 7 Day 10 Day 14
Control x GFs+proteins 1% 5% 0.1% 0.1% NS
a
0.1%
Control x GFs+proteins/10 NS
a
0.1% 0.1% 0.1% NS
a
0.1%
Control x GFs+proteins/100 NS
a
0.1% 0.1% 0.1% 1% 0.1%
Control x Proteins NS
a
1% 5% 5% NS
a
NS
a
GFs+proteins x GFs+proteins/10 5% NS
a
0.1% 1% NS
a
NS
a
GFs+proteins x GFs+proteins/100 0.1% 1% 5% 0.1% 0.1% 1%
GFs+proteins x Proteins 1% NS
a
0.1% 0.1% 5% 0.1%
GFs+proteins/10 x GFs+proteins/100 1% NS
a
NS
a
0.1% 0.1% 0.1%
GFs+proteins/10 x Proteins NS
a
NS
a
5% 0.1% NS
a
0.1%
GFs+proteins/100 x Proteins 5% NS
a
0.1% 1% NS
a
1%
a
Non significant (p > 0.05).
66
CAPTIONS OF THE FIGURES
Figure 1. Epifluorescence of control (A-D) and GFs+proteins treated (E-H) human alveolar
bone-derived osteoblastic cell cultures grown on titanium discs at days 1 (A,E), 4 (B,F), 7 (C,G),
and 14 (D,H). At day 1, control and treated cells were polygonal in shape, with treated cells
showing thinner cytoplasmic extensions (compare E with A). No differences were detected
between control and treated cells in terms of vinculin labeling, which was mostly perinuclear and
associated with focal adhesions sites (A,E, insets; red fluorescence). At days 4, 7, and 14,
GFs+proteins treated cultures exhibited a higher number of cells compared to control (compare
F-H with B-D). At day 14, control cultures showed focal areas of calcified matrix (D, red
autofluorescence) and cell nuclei with typical morphological aspects of apoptosis (D, right inset),
whereas treated cultures exhibited no signs of osteogenic phenotype (H) and only occasional
apoptotic cells (H, right inset). Only control cultures exhibited bone sialoprotein (BSP) labeling
at day 14 (green fluorescence; compare D, left inset with H, left inset), which in some areas
circumscribed Alizarin red (AR, red fluorescence)-stained nodule formation (D, left inset).
Green fluorescence represents actin cytoskeleton labeling for A-H (whitish for A,E insets),
whereas blue fluorescence indicates cell nuclei. Scale bar: A-H = 100 µm; A,E insets = 50 µm;
D,H left insets = 200 µm; D,H right insets = 25 µm.
Figure 2. Scanning electron micrographs of control (A,B) and GFs+proteins treated (C,D)
human alveolar bone-derived osteoblastic cell cultures grown on titanium discs, at days 1 (A,C)
and 4 (B,D). At day 1, GFs+proteins treated cultures exhibited cells with thinner cytoplasmic
extensions (C and C inset) compared to control cells (A). At day 4, a higher number of cells was
clearly noticed for treated cultures (compare D with B). Scale bars: A,C = 20 µm; C, inset = 25
µm; B,D = 100 µm.
67
Figure 3. Total cell number of control and GFs+proteins treated human alveolar bone-derived
osteoblastic cell cultures grown on titanium discs. At days 4 and 7, total cell number was
significantly higher (p < 0.01) for the treated group. Data are reported as mean ± standard
deviation (n=5).
Figure 4. Double labeling Ki-67/DAPI (red and blue fluorescence, respectively) to determine
the proportions of cycling cells of control (A,B) and GFs+proteins treated (C,D) human alveolar
bone-derived osteoblastic cell cultures grown on titanium discs, at days 1 (A,C) and 4 (B,D).
Scale bar: A-D = 50 µm.
Figure 5. Proportions of cycling cells of control and GFs+proteins treated human alveolar bone-
derived osteoblastic cell cultures grown on titanium discs. A significant enhancement (p = 0.05)
in the proportion of cycling cells was observed for GFs+proteins treated cultures. Data are
reported as mean ± standard deviation (n=3).
Figure 6. Double labeling alkaline phosphatase/DAPI (red and blue fluorescence, respectively)
of control (A-C) and GFs+proteins treated (D-F) human alveolar bone-derived osteoblastic cell
cultures grown on titanium discs, at days 4 (A,D), 7 (B,E), and 10 (C,F). A weak ALP labeling
was clearly observed for treated cultures. Scale bar: A-F = 200 µm.
Figure 7. Alkaline phosphatase (ALP) activity (µmol thymolphthalein/h/mg protein) of control
and GFs+proteins treated human alveolar bone-derived osteoblastic cell cultures grown on
titanium discs, at days 4, 7, and 10. Cultures exposed to GFs+proteins exhibited significantly
(p<0.01) reduced ALP activity levels. Data are reported as mean ± standard deviation (n=5).
68
Figure 8. Dual-labeled bone sialoprotein (BSP, red fluorescence)/DAPI (blue fluorescence) of
control (A), proteins (B), GFs+proteins (C), GFs+proteins/10 (D), and GFs+proteins/100 (E)
treated calvaria-derived osteogenic cultures grown on titanium discs for 7 days. While control
cultures showed larger areas of BSP labeling mostly associated with initial cell multilayering
(A), treated cultures exhibited fewer areas of BSP labeling and of weaker intensity (B-E). Note a
higher cell density for GFs+proteins treated cultures (C). Scale bar: A-E = 200 µm.
Figure 9. Viability/proliferation analysis (MTT assay) of control, GFs+proteins,
GFs+proteins/10, GFs+proteins/100, and proteins treated calvaria-derived osteogenic cultures
grown on titanium discs, at day 7. Cultures exposed to GFs+proteins exhibited a higher number
of viable cells. The optical density was read at 570–650 nm and data were expressed as
absorbance.
Figure 10. Alkaline phosphatase (ALP) activity (µmol thymolphthalein/h/mg protein) of
control, GFs+proteins, GFs+proteins/10, GFs+proteins/100, and proteins treated calvaria-derived
osteogenic cultures grown on titanium discs, at days 7 and 10. Note that there was no dose-
response relationship for ALP activity at day 10. The lowest levels were observed for the
GFs+proteins treated cultures, whereas no differences were detected between the 1:10 and 1:100
dilutions.
Figure 11. Total protein content (µg/mL) of control, GFs+proteins, GFs+proteins/10,
GFs+proteins/100, and proteins treated calvaria-derived osteogenic cultures grown on titanium
discs, at days 7 and 10. The graph pattern/profile matches the one for MTT assay at day 7
(compare with Figure 9).
69
Figure 12. Triple-labeling bone sialoprotein (BSP, green fluorescence)/DAPI (blue
fluorescence)/Alizarin red (red fluorescence) of control (A), proteins (B), GFs+proteins (C),
GFs+proteins/10 (D), and GFs+proteins/100 (E) treated calvaria-derived osteogenic cultures
grown on titanium discs, at day 14. Calcified bone-like nodules (A,B,E; Alizarin red stained)
were only observed for control, proteins and GFs+proteins/100 groups, which also exhibited
BSP labeling (green fluorescence). No Alizarin red staining and BSP labeling was detected for
GFs+proteins and GFs+proteins/10 groups (C and D, respectively). Scale bar: A,B,E = 100 µm;
C,D = 200 µm.
Figure 13. Macroscopic imaging and quantitative analysis of Alizarin red stained areas for
control, GFs+proteins, GFs+proteins/10, GFs+proteins/100, and proteins treated calvaria-derived
osteogenic cultures grown on titanium discs, at day 14. The percentage of total area occupied by
stained regions was significantly higher for control and proteins group. While a complete lack of
bone-like nodule formation was clearly noticed for the GFs+proteins and GFs+proteins/10
groups, GFs+proteins/100 supported the development of the osteogenic phenotype. Titanium
disc diameter = 12 mm.
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Thank you for submitting your manuscript to Journal of Biomedical Materials Research: Part A.
Manuscript ID: JBMR-A-08-0379
Title:
Treatment with a Growth Factor-
Protein Mixture Inhibits Formation of Mineralized Nodules in
Osteogenic Cell Cultures Grown on Titanium
Authors:
de Oliva, Marcos
Maximiano, William
de Castro, Larissa
da Silva Junior, Paulo
Fernandes, Roger
Ciancaglini, Pietro
Beloti, Márcio
Nanci, Antonio
Rosa, Adalberto L.
Tambasco de Oliveira, Paulo
Date Submitted: 02-May-2008
Manuscript Central
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v4.10 (patent #7,257,767 and #7,263,655). © ScholarOne, Inc., 2007. All Rights Reserved.
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