ads:
ARTHUR NASCIMENTO DE MELO
SEXAGEM FETAL EM LÍQUIDO AMNIÓTICO OVINO (Ovis aries L., 1758) POR
PCR
Recife- PE
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
ARTHUR NASCIMENTO DE MELO
SEXAGEM FETAL EM LÍQUIDO AMNIÓTICO OVINO (Ovis aries L., 1758) POR
PCR
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
graduação em Ciência Veterinária da
Universidade Federal Rural de Pernambuco
como parte dos requisitos para obtenção do
Grau de Mestre em Ciência Veterinária
Área de Concentração:
Reprodução Animal
Profa Orientadora:
Áurea Wischral, PhD
Recife-Pe
2008
ads:
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
CDD 636. 308 926
1. Reprodução animal
2. Amniocentese
3. SRY
4. AML – X
5. PCR
6. Fluído aminiótico
7. Ovis aries
I. Wischral, Áurea
II. Título
M528s Melo, Arthur Nascimento de
Sexagem fetal em líquido amniótico ovino (Ovis aries
L., 1758) por PCR / Arthur Nascimento
de Melo. -- 2008.
50 f. : il.
Orientadora : Aurea Wischral
Dissertação (Mestrado em Ciência Veterinária) -- Uni -
versidade Federal Rural de Pernambuco. Departamento de
Medicina Veterinária.
Inclui bibliografia.
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
SEXAGEM FETAL EM LÍQUIDO AMNIÓTICO OVINO (Ovis aries L., 1758) POR
PCR
Dissertação de Mestrado elaborada por
ARTHUR NASCIMENTO DE MELO
Aprovada pela
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Áurea Wischral
Orientadora
_____________________________________________
Profa. Dra. Márcia Bezerra da Silva
______________________________________________
Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto
______________________________________________
Prof. Dr. Manoel Adrião Gomes Filho
Recife-PE
2008
v
DEDICATÓRIAS
A Deus Pai, Filho e Espírito Santo, razão da minha vida, pela convivência
diária e presença viva em mim...
Aos meus amados pais, Clayton e Socorro, por todo o amor e compreensão que
recebo diariamente...
Ao meu irmão Brunno, por todo o apoio, amor e confiança depositados em minha
pessoa...
A Deborah e seu amor por mim, por ter dividido comigo momentos difíceis e
felizes, me incentivando constantemente a ir sempre além...
Aos amigos que estiveram comigo desde o início da caminhada até aqui, por todo
o apoio e amor... Deus os põe em minha vida e o que Ele faz é sempre certo...
vi
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Áurea Wischral, pela acolhida, paciência, atenção, confiança e
ensinamentos, principalmente os exemplos de ser humano, os quais me ajudam a
acreditar cada vez mais no amor e nas pessoas.
Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira, por todos os ensinamentos de
vida e profissionais e por todas as oportunidades e confiança depositados em mim
desde a Graduação até hoje.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco, através do curso de Pós-
graduação em Ciência Veterinária, representado pela Profa. Dra. Áurea
Wischral, Coordenadora deste curso, por permitir desfrutar dos ensinamentos
desta casa.
Ao Prof. Dr. Manoel Adrião, por todo o seu acolhimento e profissionalismo,
atenção e dedicação, sempre pronto a ajudar e ensinar.
Aos meus amigos de república estudantil, Edivaldo Rosas e Filipe Queirós, por
todos os momentos divididos e apoio prestado uns aos outros, constituindo uma
verdadeira família durante estes últimos anos.
Ao meu amigo de Pós-graduação Cristiano Rocha de Aguiar Filho, pela sua
honestidade, dignidade e fidelidade, exemplo de ser humano.
vii
Aos companheiros do Laboratório de Fisiologia Animal Molecular Aplicada,
pelos momentos de trabalho e alegria compartilhados.
A todos os professores e funcionários da Área de Reprodução Animal, por toda a
ajuda fornecida para que este trabalho fosse realizado.
À Escola de Formação e Evangelização Maanaim e às pessoas maravilhosas que
a compõem, por me dar a chance de crescer e aprender a amar.
Ao Matadouro Suimax pela receptividade e abertura para realização desta
pesquisa.
À família Batista, por todo o amor, confiança, respeito, carinho e acolhimento.
Aos meus amigos, Renata, Isabel, Hugo, Diogo, Natália, Fellype, Sílvio, Pedro,
Caio, Marcelo, Mayara, Edlângela, Ellem, Rodrigo, Edízia, André, João,
Tarcyla, Johann, Pedro Henrique, Claritita, Virna, Bruno, Liliane, Nerivaldo,
Cássia Elayne, Heitor, Flávia, Mariana, Robsom, Aline, Bruno Manso, Daniel,
Thiago, Dinno, Erick, Guilherme, Ismael, Noêmio, Danillo, Elyelson, André,
Rômulo e todos os amigos de Natal, da Igreja e da Universidade, por todos os
momentos que vivemos juntos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (
( (
(CAPES), pela
bolsa concedida e confiança depositada.
viii
RESUMO
Com o objetivo de realizar a identificação do sexo fetal em ovinos, foram submetidas à
técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), 45 amostras de DNA extraídas do líquido
amniótico de úteros prenhes, sendo 24 amostras de machos e 21, fêmeas. O fluido amniótico
foi obtido por amniocentese guiada por ultra-sonografia para maior precisão na aspiração,
como também para posterior aplicação in vivo da técnica, com efeito de simulação. A idade
gestacional foi estipulada a partir da medição dos fetos com paquímetro, a qual apresentou
variação de 3,3 a 46,5 cm. As amostras foram divididas em três grupos segundo Kadu e
Kaikini (1987): Grupo 1 (zero a 8,6cm) da concepção ao 60
o
dia de gestação, Grupo 2 (8,7 a
26 cm) entre o 61
o
e o 105
o
dia e Grupo 3 (26,1 cm em diante) 106
o
até o nascimento. O DNA
foi extraído através do método fenol-clorofórmio, obtendo-se uma quantidade inferior a 50 ng
por µl ao ser quantificado por comparação através de ג-lambda e visualizado em gel de
agarose 1%. Na amplificação do material genético, foram utilizados os “primers” referentes
aos genes SRY (116pb), encontrado no cromossomo Y presente apenas em machos, e Aml-X
(300pb), de caráter autossômico, presente em ambos os sexos. Em todas as amostras foi
possível realizar a sexagem fetal e os primers utilizados demonstraram ser bastante eficientes.
O sexo foi confirmado pela análise morfológica dos fetos, com exceção do concepto cujo
tubérculo genital ainda não havia migrado, comprovando a eficácia da ferramenta molecular
PCR para este exame.
ix
ABSTRACT
In order to achieve the identification of sex in fetal sheep, were subjected to the technique of
Polymerase Chain Reaction (PCR), 45 samples of DNA extracted from amniotic fluid of
pregnant uterus, 24 samples of males and 21 females. The amniotic fluid was obtained by
amniocentesis guided by ultrasound for greater accuracy in aspiration and also for subsequent
application of the technique in vivo, as simulation. Gestational age was laid on the
measurement of fetuses with caliper, which showed variation of 3.3 to 46.5 cm. The samples
were divided into three groups based in Kadu and Kaikini (1987): Group 1 (zero to 8.6 cm)
from conception to the 60th day of gestation, group 2 (8.7 to 26 cm) among 61th and 105th
day, and Group 3 (26,1 cm on) 106th day until the birth. The DNA was extracted using the
method phenol-chloroform, obtaining a quantity of less than 50 ng per µL, quantified by
comparing through ג - lambda and visualized in 1% agarose gel. For amplification of genetic
material, were used "primers" to the SRY gene (116pb), found in the Y chromosome present
only in males, and Aml-X (300pb), autosomal, present in both sexes. In all samples was
possible to sex the fetuses and the primers used shown to be quite effective. The sex was
confirmed by morphological analysis of fetuses, aside from the concept who genital tubercle
still had not moved, proving the effectiveness of the PCR molecular tool for this examination.
x
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 - Resultado da amplificação por PCR, apresentando bandas
correspondentes ao AML-X (300pb) e SRY (116pb) em ovinos
machos...................................................................................................
35
Figura 2 - Resultado da amplificação por PCR, apresentando a banda
correspondente ao AML-X (300pb) em ovinos fêmeas.........................
35
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 - Número de fetos (n), Tamanho (cm), a Média (M) e o erro padrão da
média (EPM) do CCC – paquímetro (cm) em relação à sexagem fetal
(M- machos; F – fêmeas).......................................................................
36
xi
SUMÁRIO
Página
DEDICATÓRIAS....................................................................................................... iv
AGRADECIMENTOS................................................................................................ v
RESUMO.................................................................................................................... vii
ABSTRACT................................................................................................................ viii
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................
ix
LISTA DE TABELAS................................................................................................. ix
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1
2 REVIÃO DE LITERATURA................................................................................... 3
2.1 Embriologia do aparelho reprodutivo.................................................................... 4
2.2 Líquido amniótico.................................................................................................. 6
2.2.1 Composição........................................................................................................ 7
2.2.2 Citologia amniótica............................................................................................. 8
2.2.3 Aspectos físico-químicos do LA........................................................................ 9
2.3 Determinação da idade gestacional....................................................................... 9
2.4 Reação em cadeia da polimerase........................................................................... 10
2.5 Sexagem Fetal........................................................................................................ 12
2.6 Ultra-som............................................................................................................... 16
3 REFERÊNCIAS........................................................................................................
18
EXPERIMENTO........................................................................................................ 28
CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................... 40
1
1 INTRODUÇÃO
A moderna produção pecuária deve ser fundamentada na exploração animal em
condições de bem estar, respeito ao ambiente e com alta produtividade, visando o atendimento
das necessidades da espécie humana (CASTRO e MELO, 2001).
A caprino-ovinocultura na Região Nordeste, que outrora somente apresentava baixo
desempenho produtivo decorrente da ausência marcante de tecnologia, tem experimentado na
atualidade significativo progresso na qualidade genética dos rebanhos em função do emprego
de biotécnicas reprodutivas que têm motivado a substituição do tradicional modelo de criação
pelo mais tecnificado que objetiva a produção em escala de agro-negócio (BANDEIRA et al.,
2004).
Considerando que a caprino-ovinocultura deve ser racionalmente explorada em função
do monitoramento reprodutivo assumir um importante papel na escala produtiva, faz-se
necessário implementar a utilização de biotécnicas que maximizem a produtividade do
rebanho. Por isso foi gerada, nos últimos anos, uma série de biotécnicas, como a inseminação
artificial (IA) e a transferência de embriões (TE) na expectativa de tecnificar a produção das
criações mais estruturadas. Na realidade, estas biotécnicas contribuem para aumentar a
fertilidade, a prolificidade e acelerar o melhoramento genético dos rebanhos, bem como
favorecem os proprietários na tomada de decisões sobre a exploração, já que permitem
submeter seus rebanhos a graus maiores ou menores de intensificação (SANTOS, 2003).
A punçäo da cavidade amniótica pode ser feita pela via abdominal ou pela vaginal. A
primeira, mais simples e inofensiva, relegou a segundo plano as que alcançavam o âmnio
através do canal cervical. A amniocentese na espécie humana, cujo emprego se difunde cada
vez mais, é indicada na pesquisa e na clínica, nas seguintes circunstâncias: 1) Obtençäo de
líquido amniótico para estudos bioquímicos e citológicos; 2) Para permitir a determinaçäo da
pressäo amniótica e o estudo da contratilidade uterina; 3) Identificação do grupo sangüíneo
fetal; 4) Obtençäo de líquido como subsídio ao diagnóstico e ao pronóstico da doença
hemolítica perinatal e da gravidez biologicamente prolongada; 5) Na asssitência ao
polidrâmnio agudo, como tratamento sintomático; no polidrâmnio de evoluçäo progressiva
como ensaio de terapêutica fisiopatológica e no trabalho parturiente para melhorar a cinética
uterina; 6) Permitindo a injeçäo de substâncias que provoque a morte fetal ou induza o
trabalho de abortamento ou de parto (indicaçäo hoje obsoleta); 7) Para injetar contrastes
2
radioopacos na amniografia; 8) Para determinar o volume amniótico; 9)Nos estudos sobre a
circulaçäo do líquido amniótico e a passagem transamniótica de sustâncias diversas; 10)
Obtençäo de líquido para o diagnóstico antenatal do sexo (NAHOUM, 1989).
Em pequenos ruminantes, a determinação precoce do sexo fetal pode contribuir, antes
de tudo, para o avanço de diversas áreas da pesquisa fundamental, visando, por exemplo, o
diagnóstico prematuro do sexo de fetos após a inseminação artificial com sêmen sexado
(CRAN et al., 1997; JOHNSON, 2000; GARNER, 2001), após a transferência de embriões
com sexo pré-determinado (GUTIERREZ-ADAN et al., 1997) ou de embriões produzidos in
vitro pela técnica da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (CATT et al., 1996).
A descoberta da técnica da PCR por Saiki et al. (1988) motivou os primeiros estudos
direcionados à identificação do sexo de embriões em bovinos (HERR e REED, 1991) visando
sua exploração comercial (THIBIER e NIBART, 1992). A utilização de ferramentas
moleculares na sexagem fetal permite, ao criador, a negociação precoce do produto,
otimizando assim o programa reprodutivo e conseqüente aumento nos lucros da atividade.
Porém, este recurso altamente específico ainda é pouco utilizado, o que estimulou o presente
estudo a avaliar sua utilização e colaborar para o estreitamento dessa distância na prática.
Com isso, objetivou-se avaliar a aplicabilidade e a eficiência da PCR multiplex para
identificar o sexo de fetos na espécie ovina, utilizando líquido amniótico coletado de úteros
gestantes provenientes de matadouro.
3
REVISÃO DE LITERATURA
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Embriologia do aparelho reprodutivo
Os sistemas reprodutores masculino e feminino apresentam a mesma origem
embrionária (MARTIN e ALFONSO, 1985). As gônadas são primitivamente formadas por
células germinativas (gonócitos) derivadas do interstício gonodal localizado no saco vitelino,
de onde migram para a região mesenquimal, chamada crista gonadal (NASCIMENTO e
SANTOS, 1997).
A formação da crista gonadal resulta da proliferação do epitélio celômico e da
agregação do mesênquima subjacente a esta região (RÜSSE, 1991) e a partir de então ocorre a
diferenciação das gônadas em testículos ou ovários num processo que depende dos
cromossomos sexuais. Nos embriões de ambos os sexos, as cristas gonadais surgem
inicialmente sob a forma de uma pequena proeminência longitudinal na superfície do celoma,
a qual está localizada entre a parede do corpo e os órgãos internos (MARTIN e ALFONSO,
1985; MICHEL, 1986), na região dos mesonéfros. Esta pequena proeminência, também
conhecida como rins temporários, forma os ductos eferentes no sexo masculino, enquanto que
no feminino existem apenas vestígios rudimentares (SCHNORR, 1989).
Entre o 35
o
e o 40
o
dia de gestação, o embrião ovino e caprino é, do ponto de vista
anatômico, sexualmente indefinido e ambivalente (BÜRSTEL, 2002). A determinação do
sexo ocorre no momento da fecundação e influencia o desenvolvimento da gônada
indiferenciada. Acredita-se que o fator de diferenciação testicular (TDF), gene localizado no
cromossomo Y, conhecido como SRY, corresponde à região determinante do sexo do
cromossomo Y. Sendo assim, no caso dos cromossomos sexuais XY, o Y induz a formação
dos testículos, determinando o sexo gonádico masculino (WILKENS, 1982).
Com a diferenciação das gônadas em testículos ocorre a formação dos túbulos
seminíferos e das células de Leydig, responsáveis pela secreção de testosterona. Esta, por sua
vez, estimula tanto a diferenciação do sistema urogenital primitivo em próstata, pênis e bolsa
escrotal quanto o desenvolvimento dos órgãos sexuais externos masculinos (SCHNORR,
1989).
5
No caso das células primordiais possuírem apenas cromossomos sexuais XX, as
gônadas indiferenciadas desenvolvem-se em ovários e estabelecem o sexo gonádico feminino
(WILKENS, 1982).
O desenvolvimento das vias genitais internas masculinas ocorre a partir dos ductos de
Wolf ou ductos mesonéfricos que surgem sob estímulo hormonal da testosterona produzida
pelas células intersticiais de Leydig. Parte desse hormônio é metabolizada em
diidrotestosterona que estimula o seio urogenital a diferenciar-se nos órgãos genitais
masculinos externos. As células indiferenciadas de suporte, presentes na gônada masculina,
secretam o Fator Inibidor de Müller (MIF) que inibe o desenvolvimento dos ductos
paramesonéfricos, também chamado de ductos de Müller. A genitália interna feminina
desenvolve-se na ausência do estímulo da testosterona, não ocorrendo o desenvolvimento dos
ductos mesonéfricos e sim dos ductos paramesonéfricos por não haver produção de MIF,
enquanto o seio urogenital forma os órgãos sexuais externos femininos devido à ausência da
diidrostestosterona (NASCIMENTO e SANTOS, 1997; MOORE e PERSAUD, 2000).
O desenvolvimento embrionário da genitália externa está relacionado com a porção
mais externa do seio urogenital e do mesênquima circundante (MARTIN e ALFONSO,
1985). Ao formarem-se as pregas corporais, o mesoderma lateral progride lateral e
ventralmente até a cloaca para originar o componente mesodérmico da parede ventral do
abdome. Em torno da membrana cloacal este mesoderma forma três estruturas: o tubérculo
genital (extremo cranial da membrana cloacal), as pregas cloacais (lateralmente à membrana
cloacal) e as eminências genitais ou labioescrotais (lateralmente às pregas cloacais) (NODEN
e DE LAHUNTA, 1990).
A fusão do septo uroretal (futura musculatura perineal) com a
membrana cloacal resulta na divisão desta em membrana anal e urogenital, com conseqüente
desenvolvimento das pregas anais e uretrais (RÜSSE e GRUNERT, 1993). Após o
rompimento das membranas anal e urogenital formam-se, respectivamente, os orifícios anal e
urogenital. No embrião fêmea, a uretra e a vagina abrem-se em uma cavidade comum,
chamada de vestíbulo vaginal (NODEN e DE LAHUNTA, 1990).
No embrião macho, sob a influência do hormônio diidrotestosterona produzido pela
gônada fetal, o tubérculo genital sofre um acentuado crescimento e assume a forma cilíndrica
que origina o pênis. No embrião do sexo feminino, devido à ausência de andrógenos
testiculares e a ação provável de esteróides maternos, placentários e ovarianos fetais, o
tubérculo genital desenvolve-se pouco e forma o clitóris (WILKENS, 1982; SCHNORR,
1989).
6
Nas fêmeas, o seio urogenital permanece curto e ao se dilatar origina o vestíbulo
vaginal (MICHEL e SCHWARZE, 1970). As pregas urogenitais permanecem separadas para
originar os lábios vulvares, cobrindo o tubérculo genital situado no vestíbulo. Com o
alongamento do tronco, as eminências genitais situam-se cranialmente ao tubérculo genital
(NODEN e DE LAHUNTA, 1990). Nas fêmeas e nos machos, as duas saliências ao redor das
pregas uretrais, saliências labioescrotais, irão participar na formação da vulva e do escroto,
respectivamente (WILKENS, 1982; SCHNORR, 1989).
2.2 Líquido amniótico
Os animais domésticos possuem os líquidos alantoideano e amniótico, nas respectivas
bolsas, diferenciando-se assim do homem, que apresenta como único líquido fetal o fluido
amniótico (GRUNERT e BIRGEL, 1982).
A cavidade amniótica é formada cerca de 13 a 16 dias após a concepção em ovelhas e
apresenta-se como um saco de camada dupla repleto de líquido e em íntimo contato com o
feto (ROBERTS, 1971). A origem dos fluidos fetais (amniótico e alantoideano) e as secreções
que para ele contribuem são complexas. Existem pelo menos quatro locais em que podem
ocorrer a absorção e a secreção: o sistema respiratório, o urinário, o digestivo e a pele
(TONIOLLO e VICENTE, 1995; HAFEZ e HAFEZ, 2004).
No feto ovino, a urina formada nos mesonéfrons passa para dentro da cavidade
alantiodeana por meio do úraco, até cerca de 90 dias de gestação. Depois disso, a urina passa
em quantidades crescentes para a cavidade amniótica devido à oclusão do úraco e à abertura
da uretra. Deste modo, a urina fetal forma a maior fonte de fluido amniótico na última fase da
gestação em ovinos (HAFEZ e HAFEZ, 2004).
O líquido amniótico (LA) desempenha um papel importante no crescimento e
desenvolvimento fetal. Circunda e protege o feto na cavidade amniótica, proporcionando um
coxim contra os limites constritivos do útero grávido, permitindo-lhe espaço para movimento
e crescimento, protegendo-o de traumatismos externos. Este espaço ao redor do feto é
importante para o desenvolvimento e maturação de seus pulmões, assim como o crescimento
e desenvolvimento normal de seus membros. O líquido permite flexão e extensão periódicas
destes, evitando contraturas articulares, além do que, banhando constantemente o feto,
mantém sua temperatura corporal e participa da homeostasia de líquidos e eletrólitos
(VELHO et al., 2001).
7
Para que se mantenha a homeostase fetal é necessário que a quantidade de água
excretada pelo feto seja proporcional àquela que se encontra em seu organismo. De uma
forma sintética, ao explicar a fisiologia de formação e eliminação do LA, pode-se dizer que no
início da gestação, antes que se estabeleçam a micção e a deglutição, o mecanismo provável
para formação do LA é o transporte ativo de solutos através do âmnio para o espaço
amniótico, o que possibilita a passagem ativa de água em função da diferença de gradiente
químico (KLINGENFUSS et al., 1997).
Para obtenção de fluidos fetais, o método eleito é amniocentese transabdominal, sendo
um procedimento seguro que pode ser realizado no ambulatório. Em ovinos, Mellor e Slater
(1974) indicaram a cateterização para se obter os líquidos fetais; Lovell et al. (1995)
recomendaram a ultra-sonografia, em caprinos, como guia da via aspirativa, entre os dias 59 a
65 de gestação, como técnica ideal. Contudo, é possível obter amostras em matadouros, do
início ao final da gestação (HERVEY e SLATER, 1967; BAETZ et al., 1976; DOMINGUES
et al., 1990; WINTOUR e McFARLANE, 1993).
Através da aspiração de líquido amniótico pela via transvaginal, Makondo et al. (1997)
realizaram com sucesso a identificação do sexo fetal em bovinos das raças Holstein-Freisian e
Hereford x Freisian utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Em se
tratando do líquido amniótico, estes pesquisadores afirmaram ser uma importante ferramenta
para o futuro.
2.2.1 Composição
Os fluidos fetais contêm constituintes metabólicos, eletrólitos, enzimas, hormônios,
células e outras estruturas (HAFEZ e HAFEZ, 2000). Os principais componentes presentes
neste líquido estão em suspensão e em dissolução. Entre os elementos em suspensão
encontram-se células esfoliadas do âmnio, principalmente do feto, assim como lanugem e
gotículas de gordura. Como elementos de dissolução, são encontradas substâncias orgânicas e
inorgânicas. Os eletrólitos representam as substâncias inorgânicas, sendo alguns relacionados
com a idade gestacional. Entre os compostos orgânicos estão as proteínas, os aminoácidos, a
alfa-fetoproteína, as substâncias nitrogenadas não-protéicas, os lipídios, os carboidratos, as
vitaminas, as enzimas, a bilirrubina, os hormônios e as prostaglandinas (REZENDE et al.,
1998).
As proteínas do feto são sintetizadas na placenta ou no próprio organismo a partir de
aminoácidos da mãe. As membranas fetais são ativas na síntese de proteínas. Nos líquidos
8
fetais elas têm origem urinária, pois as proteínas plasmáticas não atravessam a membrana
fetal em ovinos (HERVEY e SLATER, 1967).
A glicose é o principal açúcar sangüíneo do feto, sendo, portanto, a mais importante
fonte de energia. A maior parte da glicose utilizada pelo feto é fornecida pela mãe, sendo
mínima a produção endógena. Porém, o concepto pode sintetizar, pela glicogênese: frutose,
galactose ou pela neoglicogênese: piruvato, lactato e alanina. A concentração de glicogênio
placentário é elevada durante o início da gestação, decrescendo com o seu avanço. À medida
que isto ocorre, o feto começa ter sua própria glicogênese e passa a armazenar o glicogênio na
forma de reserva hepática (REZENDE E MONTENEGRO, 1995).
A creatinina é um dos elementos bioquímicos mais estudados para determinar a
maturidade fetal e suas variações durante a gestação. Sua presença é explicada pela simples
difusão, por diferença de gradiente, pelos corioâmnios (cordão umbilical, mucosa digestiva e
mucosa bronquial) em ambas as direções. Esta é uma substância nitrogenada não proteica
derivada da filtração glomerular, que atravessa totalmente esta membrana, de onde se pode
concluir que a maturidade renal aumenta sua concentração no líquido amniótico (VOTTA,
1975).
A literatura específica para a análise bioquímica dos líquidos fetais, segue as mesmas
técnicas, já padronizadas, para bioquímica sangüínea que também é um fluido corpóreo
(ZOGNO et al., 2004).
2.2.2 Citologia
O LA apresenta-se rico em células escamadas que delimitam a cavidade amniótica e
também células provenientes do feto. A base morfológica da citologia amniótica está
estritamente relacionada ao feto, decorrendo da necessidade de ser conhecido o
desenvolvimento intra-uterino da pele, das mucosas respiratórias e digestivas, das coberturas
geniturinárias e dos demais elementos que tenham contato com este líquido. Torna-se
necessária ainda, a investigação da fisiologia de cada epitélio, seus ritmos de crescimento e
maturação (REZENDE et al., 1998).
Benavides et al. (1983) em estudo para determinar o valor citológico do líquido
amniótico no diagnóstico pré-natal do sexo, demonstraram uma significativa diferença na
citologia de fetos masculinos e femininos, já que nestes últimos encontraram um maior
número de células, com predomínio de células intermediárias basófilas e células naviculares,
em comparação com a menor quantidade de células e predomínio de células escamosas
9
intermediárias e superficiais acidófilas com ausência de células naviculares nos fetos
masculinos.
2.2.3 Aspectos físico-químicos
Alguns parâmetros físico-químicos como volume, pH e osmolaridade, são
freqüentemente analisados por sua importância.
Para o volume não é conhecido limite mínimo normal dos líquidos fetais; sabe-se,
porém, que seu aumento é patológico (polidramnia), não devendo passar de 20 litros para as
grandes espécies animais, 5 litros para pequenos ruminantes e 0,5 litro para carnívoros
(GRUNERT e BIRGEL, 1982). Sabe se que a anormalidade no volume do LA (tanto para
mais, como para menos) está associada a um aumento significativo nas taxas de morbidade e
mortalidade perinatais (ALENCAR JUNIOR, et al., 1995; MERCER, et al., 1984).
Muitas reações intracelulares, inclusive de cadeias metabólicas, são pH dependentes.
Assim sua manutenção é essencial e realizada pelos sistemas de tampões sangüíneos, sistema
respiratório e renal (STRAYER, 1995).
A osmolaridade é uma determinação da quantidade relativa de solutos em solução. A
osmolaridade pode ser um indicativo da capacidade de reabsorção renal, assim como, pode
informar sobre a desidratação do organismo ou anormalidades do hormônio antidiurético
(STRAYER, 1995).
2.3 Determinação da idade gestacional
Para o diagnóstico preciso da idade fetal, são necessárias algumas medidas
morfológicas que mostrem uma taxa rápida de crescimento constante e que seja menos
variável em determinada fase. O comprimento do corpo e o desenvolvimento do esqueleto
foram utilizados durante anos para estimar a idade fetal (MUFTI et al., 2000).
Richardson et al. (1976) estimaram o desenvolvimento de ovinos da raça Clun Forest e
mestiços de Suffolk e observaram, aos 50, 85, 120 e 150 dias, um comprimento céfalo-
coccígeo (CCC) médio de 8, 25, 42 e 55,4 cm respectivamente, contudo, nesse estudo, não foi
levado em consideração o fato dos fetos serem provenientes de gestação simples ou não.
Enquanto Mufti et al. (2000), estudando o desenvolvimento pré-natal em ovinos sem raça
10
definida (SRD), verificaram CCC médio de 6,7; 10,1; 31,5 e 46,0 cm, nos períodos de 30-60;
61-90; 91-120 e de 120 dias a termo, respectivamente.
O CCC é realizado em muitas espécies para determinar a idade gestacional
(BRETZLAFF et al., 1993) e caracteriza-se pelos comprimentos dos embriões e dos fetos,
baseando-se na distância anatômica entre a extremidade superior do crânio até a primeira
vértebra coccígea (BINGHAM et al., 1990; SOUSA et al., 1997).
Baseado na medida do CCC (cm) obtido através de paquímetro, a idade fetal pode ser
estimada e classificada em estágios de 15 dias cada, sendo o estágio 1 (1 a 15 dias), 2 (16 a 30
dias ), 3 (31 a 45 dias), 4 (46 a 60 dias), 5 (61 a 75 dias), 6 (76 a 90 dias), 7 (91 a 105 dias), 8
(106 a 120 dias) e 9 (120 até o nascimento) (KADU e KAIKINI, 1987). Utilizando esta
classificação, Messias (2002) estimou a idade de 89 embriões/fetos caprinos entre o 3
o
e o 7
o
estágio de desenvolvimento, obtendo um intervalo de variação entre 2,6 e 26 cm.
2.4 Reação em cadeia da polimerase
Dentre as novas tecnologias, a análise de DNA tem se intensificado bastante nos
últimos anos, e o desenvolvimento do método de reação em cadeia da polimerase (Polymerase
Chain Reaction - PCR) tem sido largamente empregado nas áreas biológicas, em especial na
Medicina Veterinária. A utilização desta técnica é tão ampla que podem ser editados
compêndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnóstica (OLIVEIRA,
2003).
A PCR é um método utilizado para amplificar uma seqüência selecionada de DNA ou
RNA que permite sintetizar, em poucas horas, milhões de cópias de uma seqüência de
nucleotídeos específica, podendo amplificar a seqüência-alvo em um milhão de vezes da
amostra inicial (CHAMPE E HARVEY, 1997). Como conseqüência do desenvolvimento
desta tecnologia, é atualmente possível realizar diversos tipos de diagnósticos, entre eles a
investigação de paternidade, detecção de doenças genéticas e infecciosas, além da
determinação do sexo de embriões (GARCIA et al., 2003).
Esta reação permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se
basicamente de uma reação enzimática catalisada pela polimerase (enzima termoestável) cuja
atividade depende de íons Mg++, e ocorre em 3 etapas: desnaturação (que consiste na
separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), anelamento ou hibridização (ligação do
11
oligonucleotídeo iniciador ou “primer" ao DNA a ser amplificado) e extensão (polimerização
propriamente dita) (SAIKI et al., 1988).
Na desnaturação é necessário inicialmente que as duas fitas de DNA a ser
amplificadas sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90ºC a 95ºC promove a
separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de
desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de
ligações entre guanina (dGTP) e citosina (dCTP) (GC) do fragmento de DNA alvo ou de
interesse (OLIVEIRA, 2003).
A polimerase, para realizar a função de anexar as bases complementares,
transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado
na região previamente escolhida. Para isto, as extremidades do DNA de interesse nas duas
fitas simples são identificados por ”primers” ou oligonucleotídeos iniciadores, que são
pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, compostos por 20 a 30 bases
nitrogenadas. Os “primers” são sintetizados in vitro baseados na seqüência conhecida do
DNA a ser amplificado, sendo eles complementares a esta seqüência.
Os oligonucleotídeos iniciadores identificam as regiões escolhidas hibridizando-se às
seqüências complementares nas duas fitas simples (no sentido 5’). Nas duas fitas formam-se,
assim, pequenos fragmentos de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers”,
descrito como “anelamento”, deve ser feita a uma temperatura inferior à da desnaturação
(45ºC a 60ºC) (OLIVEIRA, 2003).
Quando os iniciadores encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a enzima
DNA polimerase pode assumir sua função, incorporando, a partir daí, os nucleotídeos
correspondentes um a um, ligando-os entre si, completando assim as fitas simples e
transformando-as em duplas (extensão). A DNA polimerase não reconhece apenas o lócus de
início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3' e 5'), ela
inicia a reação sempre pela extremidade 3' do “primer”, completando a fita simples daí em
diante, portanto, sempre na direção do fragmento procurado. Os fragmentos de DNA recém-
formados constituem-se em mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos
subseqüentes, no entanto, com região já determinada resultando em uma reação em cadeia
(OLIVEIRA, 2003).
As durações dos ciclos correspondentes às três etapas da reação e suas temperaturas
podem ser programadas em aparelhos especiais para PCR chamados termocicladores. Em
cada ciclo, esse material é duplicado conseguindo-se que o número dessas moléculas curtas de
DNA multiplique-se em progressão geométrica. Assim, no trigésimo ciclo existirão mais de
12
260.000.000 moléculas iguais (WATSON et al.,1992). Para observar o resultado da PCR, o
DNA multiplicado é corado com brometo de etídio ou outra substância específica, que será
visualizado em eletroforese em gel de agarose ou diretamente em tubos.
Na reprodução animal, a PCR oferece a possibilidade de identificar o sexo de
embriões (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003), porém para ser comercialmente viável, a técnica
de sexagem deve ser reproduzível, barata e rápida o suficiente para permitir avaliar um grande
número de embriões em pouco tempo (VAN VLIET et al., 1989). Por enquanto, apenas a
técnica da PCR parece obedecer às condições acima assinaladas, sendo a mais indicada na
sexagem de embriões de alto valor genético (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003).
2.5 Sexagem fetal
Dentre as aplicações práticas da sexagem fetal, pode-se destacar sua importância para
a produção animal, por permitir um melhor planejamento tanto para adquirir quanto para
comercializar animais do próprio rebanho (HAIBEL, 1990) podendo, na dependência do
resultado, elevar ou diminuir o valor do animal examinado e facilitar a coordenação de ações
que visem racionalizar produção e lucratividade, oferecendo vantagens de ordem prática e
econômica à indústria de produção animal (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003). Este melhor
planejamento implica numa coordenação de ações mais efetivas, que proporcionem maior
concentração de fêmeas nos rebanhos leiteiros e de machos nos de carne, racionalizando a
produção e a lucratividade (REICHENBACH et al., 2004).
Nos últimos anos foi gerada uma série de biotécnicas, como a inseminação artificial
(IA), a transferência de embriões (TE) e até a fecundação in vitro (FIV), na expectativa de
tecnificar a produção das criações mais estruturadas. Apesar dessas ferramentas contribuírem
para aumentar a fecundidade, a prolificidade e acelerar o melhoramento genético dos
rebanhos é preciso considerar que a utilização destas biotécnicas requer alto investimento
financeiro e necessita de um comércio atraente que assegure rotatividade e retorno do capital
investido, pelo menos em médio prazo (BANDEIRA et al., 2004).
A determinação precoce do sexo fetal nos pequenos ruminantes, ainda é de uso
limitado, apesar do potencial que apresenta em contribuir para o avanço de diversas áreas da
pesquisa fundamental (REICHENBACH et al., 2004).
Para uma série de diagnósticos pré-natais, inclusive com a finalidade de determinar o
sexo fetal, foram desenvolvidas, no decorrer dos últimos anos, diversas técnicas invasivas e
13
não invasivas, sendo as não invasivas as de maior interesse devido à segurança que oferecem
tanto para a fêmea gestante quanto para o feto (REICHENBACH et al., 2004).
O uso da PCR para identificação do sexo de embriões baseia-se na amplificação de
seqüências de bases exclusivas do cromossomo Y (BONDIOLI, 1992). O propósito de
multiplicá-las objetiva torná-las facilmente detectáveis por meio de um corante específico
para DNA (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003).
O gene SRY (região do cromossomo Y determinante do sexo), que é localizado
próximo a região pseudo-autossômica na porção distal do braço curto do cromossomo Y, foi
descoberto como sendo o regulador da formação de estruturas macho-específicas por
Goodfellow et al. (1990). O SRY compreende genes específicos para determinação do sexo
que codificam a enzima P
450
aromatase e a substância inibidora de Müller (MIS). A P
450
aromatase catalisa a conversão de testosterona para estradiol que, no embrião masculino, tem
sua expressão reduzida. Reciprocamente, a MIS é expressa no embrião macho para induzir a
diferenciação testicular e regressão das estruturas femininas (HAQQ et al., 1993).
O gene amelo (AML gene) existente tanto no cromossomo X quanto no Y, também foi
usado para determinar o sexo em bovinos (ENNIS e GALLAGHER, 1994) e em humanos
(SULLIVAN et al., 1993). O polimorfismo observado entre o cromossomo X e Y para ovelha
e o veado europeu evidenciaram resultados homólogos para as seqüências do gene Aml-X de
96% e 97% e para o Aml-Y de 86% e 90%, para ovelha e veado, respectivamente (PFEIFFER
e BRENIG, 2005).
A partir de DNA obtido de amostras sangüíneas de caprinos, Phua et al. (2003)
realizaram a identificação do sexo destes animais utilizando “primers” correspondentes aos
genes SRY e AML-X através da técnica de PCR. A descoberta desta técnica por Saiki et al.
(1988) motivou os primeiros estudos direcionados à identificação do sexo de embriões
bovinos (HERR E REED, 1991) visando sua exploração comercial (THIBIER E NIBART,
1992).
Na eletroforese em gel de agarose (método convencional), o aparecimento de uma
banda correspondente ao peso molecular do fragmento de DNA escolhido para ser
amplificado, significa que o embrião do qual foi feita a biópsia possuía seqüências de
nucleotídeos do cromossomo Y (macho). A ausência da banda pode indicar um embrião
feminino ou então ausência da amostra, enquanto que a reação positiva também poderia ser
devida à eventual presença de DNA “contaminante” (DNA próprio do operador, ou
remanescente de uma amostra anterior). Dessa forma, é indicado correr amostras controles ao
lado das amostras a serem sexadas (MC PHERSON et al., 1991).
14
Como controles, podem ser utilizados DNA obtido de linfócitos ou de outras células
corporais de machos e fêmeas (controle de sexos); DNA obtido de células humanas (controle
de contaminação); controle de especificidade, que leva todos os reagentes, menos o DNA, e o
controle marcador de pesos moleculares conhecidos (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003).
Outra forma de fazer controles para ambos os sexos é realizar simultaneamente duas
reações para cada amostra: uma para o cromossomo Y e outra (usando o outro par de primers)
para o cromossomo X, ou então para algum gene autossômico. Nesse caso, o aparecimento de
uma única banda indica que o embrião é fêmea, e o de duas bandas, macho (ALMEIDA e
ALVAREZ, 2003).
Na técnica de sexagem de embriões direta em tubos, os reagentes, repartidos em duas
soluções, são colocados em dois momentos diferentes. Ao final dos ciclos da PCR, a cor rosa,
corado com brometo de Etídio, é observada apenas nos tubos com DNA do Y. As vantagens
dessa técnica em comparação com a convencional incluem uma maior velocidade na obtenção
dos resultados de sexagem, maior praticidade e menor custo por não ter que realizar
eletroforese, e menores possibilidades de presença de DNA contaminante, decorrente da
menor manipulação das amostras, que permanecem fechadas durante o processo
(BREDBACKA et al., 1995). O principal inconveniente desta técnica é que as eventuais
reações inespecíficas não são diferenciáveis por não poder ser incluídos outros “primers”
(controles) dentro dos tubos das amostras (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003).
Com relação à eficácia da sexagem embrionária por intermédio da PCR, um total de
110 embriões Bos taurus e Bos indicus foi submetido à micromanipulação para amostragem
embrionária, tendo sido alcançado um índice de 89,8% de amplificações. A acuidade da
técnica foi avaliada por meio de exame ultra-sonográfico das 44 prenhezes obtidas, realizado
aos 55 dias pós-transferência, onde foi observada uma confirmação de 100% de sexagem
correta (GARCIA, 1995).
Em ovinos, foram realizadas biópsias de embriões produzidos através de fertilização in
vitro para a realização de sexagem e em seguida a transferência destes embriões. Foi obtida
uma taxa de prenhez de 60% com uma taxa de sobrevivência embrionária de 33%, mas a
sexagem por PCR foi correta em 100% dos carneiros nascidos (KOCHHAR, et al., 2000).
As técnicas não invasivas de diagnóstico podem ser por imagem de ultra-som (NAN et
al., 2001; BÜRSTEL, 2002) ou por métodos laboratoriais baseados em amostras biológicas.
Em humanos, por exemplo, existe a possibilidade da determinação do sexo fetal pela análise
do sangue materno em função da placenta hemocorial permitir a passagem de um pequeno
número de células da circulação fetal para a materna (HONDA et al., 2001; RIJNDERS et al.,
15
2001). Foi descoberta a presença de uma quantidade significativa de DNA fetal presente no
sangue materno
que pode ser facilmente investigado através da reação em cadeia de
polimerase (PCR) por apresentar alta sensibilidade (LO et al., 1997/1998). Todavia, não é
possível separar o DNA fetal do materno, uma vez que este último se encontra em quantidade
bem superior. Deste modo, o exame baseia-se na presença do cromossomo Y nos fetos
masculinos e a ausência do mesmo nas mães. Portanto, a detecção de DNA do cromossomo Y
no sangue da mulher indica que o feto é do sexo masculino e sua ausência que é do feminino
(COSTA et al., 2001; LEVI et al., 2003). É interessante notar que o DNA fetal desaparece da
circulação materna em poucas horas após o parto e sendo assim, gestações anteriores não
interferem no resultado (LEVI et al., 2003).
Bovinos e pequenos ruminantes possuem placenta do tipo epiteliocorial que,
praticamente, não permitem a passagem de células ou anticorpos, o que torna este tipo de
diagnóstico improvável nestas espécies (RÜSSE e GRUNERT, 1993).
Nos métodos denominados invasivos, a colheita de células fetais ou da placenta é
efetuada através de biópsia da vilosidade coriônica ou da obtenção de líquido amniótico por
meio da amniocentese (LEIBO e RALL, 1990; KAMIMURA et al., 1997).
O exame das células amnióticas permite evidenciar a cromatina sexual e, portanto,
estabelecer o diagnóstico do sexo do feto. Esta massa cromatínica, denominada de cromatina
sexual, é proveniente da condensação de um dos cromossomos X das fêmeas que se encontra
próximo à parede nuclear (LYON, 1961). Sua presença está relacionada com a expressão do
sexo feminino (DERIVAUX e ECTORS, 1984). Além disto, a maturidade fetal é evidenciada
pela citologia do fluido amniótico de acordo com a classificação do aspecto morfológico,
tamanho, tipos e propriedades tintoriais das células do líquido amniótico (GORDON e
BROSENS, 1967).
A aspiração de fluido amniótico via amniocentese vaginal permite a obtenção de
células para análise cromossômica. Este método é simples e preciso, fornecendo um
diagnóstico seguro para detecção do sexo pré-natal e defeitos citogenéticos em bovinos
(BONGSO e BASRUR, 1975).
A concentração de testosterona no líquido amniótico, entre 90 e 150 dias de gestação
em bovinos, pode ser utilizada para determinar o sexo fetal. Sendo os valores de 442 ± 20 pg
testosterona/mL para feto masculino e 215 ± 8 pg/mL para fetos femininos (BONGSO et al.,
1976). As células cianofílicas (basofílicas) pequenas e nucleadas no líquido amniótico são as
mais ativas e mitóticas e também podem ser utilizadas para a detecção do sexo e perfil
citogenético do feto bovino (BONGSO e BASRUR, 1975). A porcentagem de células
16
cianofílicas é significativamente maior nas fêmeas do que nos machos. Diferenças
significativas, contudo, não foram encontradas para células eosinofílicas e orangeofílicas.
Dessa forma a contagem de células cianofílicas pode ser um método de determinação do sexo
fetal em bovinos. (MOYA, 2004).
Porém, nenhum dos métodos utilizados para sexagem fetal a partir de amniócitos é tão
eficiente e preciso como a PCR, que possui elevada sensibilidade e especificidade
(OLIVEIRA, 2003).
2.6 Ultra-som
A utilização de imagens ultra-sonográficas é um procedimento rotineiro na
Medicina Veterinária e sua aplicabilidade na reprodução de pequenos ruminantes pode ser
uma ferramenta importante no aperfeiçoamento e difusão de algumas biotécnicas (OLIVEIRA
et al., 2004).
Por muitos anos, as técnicas ultra-sonográficas utilizaram-se do efeito doppler e do
scan modo A, em que as ondas ultra-sônicas refletidas são captadas pelo equipamento e
traduzidas por sinais luminosos ou sonoros. A partir da década de 80, passou-se utilizar
técnicas que traduzem as ondas refletidas por imagens (modo B) e que, por analogia,
permitem a interpretação das estruturas (BICUDO, 2003).
O componente mais importante de um aparelho ultra-sonográfico de tempo real é a
sonda por ser responsável pela emissão das ondas que refletirão nos tecidos e se converterão
nas imagens. Estas sondas podem ser lineares ou setoriais que formarão imagens,
respectivamente, retangulares e cônicas (BUCKRELL, 1988; BICUDO, 2003).
A ultra-sonografia é uma técnica diagnóstica que permite avaliação anatômica da
gestação. O método empregado isoladamente (exame de ultra-som) permite o diagnóstico de
aproximadamente 70 a 80% das malformações estruturais ou anatômicas do feto, dependendo
da acuidade diagnóstica, da experiência do operador, do tempo despendido para a realização
do exame e da qualidade técnica do aparelho empregado (SANSEVERINO et al., 2001).
O uso do ultra-som pode ainda auxiliar na realização de outras técnicas como a
amniocentese transabdominal, orientando a agulha para o local mais adequado de aspiração
do líquido amniótico. Este procedimento é bastante eficiente e já foi anteriormente realizado
17
com sucesso em eqüinos (SMITH et al. 1997), bovinos (KAMIMURA, 1997; MAKONDO,
1997) e humanos (CASTRO, 2001; LOPES, 2007).
18
REFERÊNCIAS
ALENCAR JUNIOR, C.A. et al. Técnicas ultra-sonográficas de avaliação do volume de
líquido amniótico e sua correlação com o resultado gestacional. Femina, Rio de Janeiro, v.23,
p.877-880, 1995.
ALMEIDA, G.P.; ALVAREZ, R.H. Métodos de determinação do sexo de embriões bovinos.
Boletim da Indústria Animal, Nova Odessa, v.60, n.2, p.185-196, 2003.
BANDEIRA, D.A. et al. Aspectos gerais da caprino-ovinocultura no Brasil e seu reflexos
produtivo e reprodutivo. In: SANTOS, M.H.B.; OLIVEIRA, M.A.L.; LIMA, P.F.
Diagnóstico de gestação na cabra e na ovelha. São Paulo: Varela, 2004. p.1-8.
BAETZ, A. L.; HUBERT, W. T.; GRAHAM, C. K. Changes of biochemical constituents in
bovine fetal fluids with gestational age. American Journal of Veterinary Research,
Chicago, v.37, p. 1047 – 1052, 1976.
BICUDO, S. D. O diagnóstico ultra-sonográfico de gestação em ovinos.
http://www.fmvz.unesp.br/Informativos/ovinos/repman3.htm, 2003.
BONGSO, T. A.; BASRUR, P. K. Prenatal diagnosis of Sex in cattle by amniocentesis.
Veterinary Record, London, v. 96, n. 6, p. 124 – 126, 1975.
BONGSO, T. A.; BASRUR, P. K.; YOUNGLAI, E. V. Prediction of fetal Sex in cattle by
testosterone levels in allantoic fluid. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v.
46, n. 2, p. 441 – 442, 1976.
BINGHAM, C.M.; WILSON, P.R.; DAVIES, A.S. Real-time ultrasonography for pregnancy
diagnosis and estimation on fetal age in farmed red deer. Veterinary Record, London, v.3, p.
102-106, feb. 1990.
BONDIOLI, K.R. Embryo sexing: a review of current techniques and their potential for
commercial application in livestock production. Jornal of Animal Science, Champaign, v.70,
n.2, p. 19-29, 1992.
19
BREDBACKA, P.; KANKAANPAA, A.; PEIPPO, J. PCR sexing of bovine embryos: a
simplified protocol. Theriogenology, Stoneham, v.44, n.2, p.167-176, 1995.
BRETZLAFF, K. et al. Ultrasonographic determination of pregnancy in ruminants.
Veterinary Medicine, Lenexa, v.1, p. 12-24, 1993.
BUCKRELL, B.C. Applications of ultrasonography in reproduction in sheep and goats.
Theriogenology, v.29, p.71-84, 1988.
BÜRSTEL, D. Untersuchungen zur intrauterinen Geschlechtsfeststellung bei Feten
kleiner Wiederkäuer mittels Ultrasonographie. 2002. 142 f. Tese (Doctor Medicinae
Veterinariae) - Institut für Reproduktionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover,
Hannover.
CASTRO, R.S.; MELO, L.E.H. CAEV e MAEDI-VISNA: Importância na saúde e na
produtividade de caprinos e ovinos e a necessidade de controle no Nordeste Brasileiro.
Ciência Veterinária nos Trópicos, Recife, v.4/3, p.315-320, 2001.
CATT, S.L. et al. Birth of a male lamb derived from an in vitro matured oocyte fertilised by
intracytoplasmic injection of a single presumptive male sperm. Veterinary Record, London,
v.139, p.494-495, 1996.
CASTRO, F.C. et al. Comparação dos Métodos para Diagnóstico da Toxoplasmose
Congênita. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, Belo Horizonte, v.23, n.5,
2001.
CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A. Bioquímica ilustrada. 2ª ed. Porto Alegre: Artes Médicas,
1997. p. 446.
COSTA, J.M. et al. First-trimester fetal sex determination in maternal serum using real-time
PCR. Prenatal Diagnostic, Paris, v.21, p.1070-1074, 2001.
20
CRAN, D.G. et al. Production of lambs by low dose intrauterine insemination with flow
cytometrically sorted and unsorted semen. Theriogenology, Stoncham, v.42, p.267, 1997.
DERIVAUX, J.; ECTORS, F. Fisiopatologia de la gestación y obstetricia veterinaria.
Zaragoza: Acribia, 1984. p. 39-43.
DOMINGUES, M. M.; LIPTRAP, R. M.; BASRUR, P. K. Foetal fluids steroids and their
relationship to gonadal steroid secretion in single and twin bovine fetuses. Theriogenology,
Stoneham, v. 34, p. 57-73, 1990.
ENNIS, S.; GALLAGHER, T. F. A PCR-based sex determination assay in cattle based on the
bovine amelogenin locus. Animal Genetics, Oxford, v.25, p. 425-427, 1994.
GARCIA, J. F. Micromanipulação, criopreservação e sexagem pela técnica de PCR
(“Polymerase Chain Reaction”) de embriões bovinos. 1995. 76 f. Tese (Doutorado em
Reprodução Animal) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo.
GARCIA, J.F.; AVELAR, G.A.; DIAS, F.E.F. Aplicação de tecnologias de análise genética
no diagnóstico em Medicina Veterinária. In: CONGRESSO PERNAMBUCANO DE
MEDICINA, VETERINÁRIA, 5., 2003, Recife. Anais [S.l.:s.n.] ,2003 p.100-103.
GARNER, D.L. Sex-sorting mammalian sperm: concept to application in animals. Journal of
Andrology, Philadelphia, v.22, p.519-526, 2001.
GORDON, H.; BROSENS, I. Cytology of amniotic fluid: a new test of fetal maturity.
Obstetrics and Gynecology, New York, v. 30, n. 5, p. 652-656, Nov. 1967.
GRUNERT, E.; BIRGEL, E. H. Fisiologia da prenhez. In:______. Obstetricia veterinária.
3. ed. Porto Alegre: Sulina, 1982. p. 27-60.
GUTIERREZ-ADAN, A. et al. Ovine-specific Y-chromosome RAPD-SCAR marker for
embryo sexing. Animal Genetics, Oxford, v.28, p.135-138, 1997.
21
HAFEZ, B.; HAFEZ, E. S. E. Gestation, prenatal physiolgy and parturition. In:______.
Reproduction in farm animals. 7. ed. Philadelphia: Lippincott, 2000. p.148-149.
HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Gestação, fisiologia pré-natal e parto. In: Reprodução Animal.
7.
ed. Barueri: Manole, 2004. p. 141 – 156.
HAIBEL, G.K. Use of ultrasonography in reproductive management of sheep and goat herds.
The Veterunary Clinics of North-America. Food Animal Practice, Philadelphia, v. 6, n. 3,
p.597-613, 1990.
HAQQ, C. M. et al. SRY recognizes conserved DNA sites in sex-specific promoters. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Biochemistry, New York. v. 90, pp. 1097-1101, 1993.
HERR, C.M.; REED, K.C. Micromanipulation of bovine embryos for sex determination.
Theriogenology, Los Altos, v.21, n.1, p.7-17, 1991.
HERVEY, E. J.; SLATER, J. S. The source of sheep foetal fluids in the later stages of
gestation. Journal of Physiology, Stuttgart, v. 22, p. 40-41, 1967.
HONDA, H. et al. Successful diagnosis of fetal gender using conventional PCR analysis of
maternal serum.Clinical Chemistry, Washington, v.47, p.41-46, 2001.
JOHNSON, L.A. Sexing mammalian sperm for production of offspring: the state-of-the-art.
Animal Reproduction Science, Amsterdan, n.60/61, p.93 - 107, 2000.
KADU, M.S.; KAIKINI, A.S. Prenatal development of caprinos foetus. Indian Journal of
Animal Science, New Delhi, v. 57, n. 9, p. 962-969, 1987.
KAMIMURA, S. et al. Determination of bovine fetal sex by PCR using fetal fluid aspirated
by transvaginal ultrasound-guided amniocentesis. Theriogenology, Kagoshima, v.47, p.1563-
1569, 1997.
KLINGENFUSS, P.J. et al.. Valores normais do índice do líquido amniótico na gravidez.
Jornal Brasileiro de Ginecologia, Rio de Janeiro, v.107, p.101-117, 1997.
22
KOCHHAR, H. S. et al. Production of sexed lambs after biopsy of ovine blastocyts produced
in vitro. The Canadian Veterinary Journal, Ottawa, v.41, p. 398-400, 2000.
LEIBO, S.P.; HALL, W.F. Prenatal diagnosis sex in bovine fetuses by amniocentesis.
Theriogenology, San Antonio, v.33 p. 531-552, 1990.
LEVI, J.E.; WENDEL, S.; TAKAOKA, D. T. Prenatal fetal gender determination by analysis
of DNA from maternal plasma. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, Rio de
Janeiro, v.25, n.9, p.687-690, 2003.
LO, Y.M. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet, Oxford, v.350,
p.485-487, 1997.
LO, Y.M. et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum:
implications for non-invasive prenatal diagnosis. The American Journal of Human
Genetics, Oxford, v.62, p.768-775, 1998.
LOPES, A.C.V. et al. Complicações materno-fetais da biópsia de vilo corial: experiência de
um centro especializado do Nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Ginecologia e
Obstetrícia, Rio de Janeiro, v.29, n.7, p.360-367, 2007.
LYON, M. F. Gene action in the X – chromosome of the mouse (Mus musculus). Nature,
London, v. 190, p. 372, 1961.
MAKONDO, K. et al. Use of polymerase chain reaction to sex the bovine fetus using cells
recovered by ultrasound-guied fetal fluid aspiration. Animal Reproduction Science,
Amsterdan, v.49, p. 125-133, 1997.
MARTIN, M.; ALFONSO, G. Bases anatômicas : embriologia del aparato genital. In :_____.
Fisiopatologia de la reproduccion con sus bases sinopticas. Zaragoza: Acribia, 1985. cap.
1, p. 117-136.
23
Mc PHERSON, M.J.; QUIRKE, P.; TAYLO, G.R. PCR: a practical approach. Oxford:
Oxford Univ. Press, 1991. p.253.
MERCER, L.J. et al. A survey of pregnancies complicated by decreased amniotic fluid.
American Journal of Obstetrics and Gynecology, St. Louis, v.149, p.355-361, 1984.
MESSIAS, J. B. Estimativa do peso fetal caprino (Capra hircus L., 1758) através de medidas
obtidas por ultra-sonografia e paquímetro. 2002. 37f. Dissertação (Mestrado em Ciência
Veterinária) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife.
MICHEL, G. Die Entwicklung der Organe, Organogenese: Die Entwicklung des
Geschlechtsapparates. In: _____. Kompendium der Embryologie der Haustiere. Stuttgart:
Gustav Fischer Verlag, 1986. p.223-242.
MICHEL, G.; SCHWARZE, E. Compendio de anatomia veterinária: embriologia.
Zaragoza: Acribia, 1970. 350p.
MOORE, K.L.; PERSAUD, T.V.N. Sistema urogenital. In:_____. Embriologia clínica. 6.ed.
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. p. 290-331.
MOYA, C.F. Aspectos físico-químicos dos fluidos fetais em ruminantes. 2004. 12p.
Monografia (Pós-Graduação em Medicina Veterinária) – Departamento de Medicina
Veterinária, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Botucatu.
MUFTI, A.M. et al. Prenatal development of ovine fetus. Small Ruminant Research,
Amsterdan, v.38, p.87-89, 2000.
NAN, D.; VAN OORD, H.A., TAVERNE, M.A.M. Determination of foetal gender in sheep
by transabdominal ultrasonographic scanning. In: CONFERENCE OF THE EUROPEAN
SOCIETY FOR DOMESTIC ANIMAL REPRODUCTION, 5., 2001, Vienna. Anais...
Viena:ESDAR, 2001. p.70.
24
NASCIMENTO, E.F.; SANTOS, R.L. Embriologia do sistema genital e diferenciação sexual.
In: _____. Patologia da reprodução dos animais domésticos. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1997. p.3-5.
NODEN, D.M.; DE LAHUNTA, A. The embryology of domestic animals. Developmental
mechanisms and malformations. Baltimore: Williams and Wilkins, p. 330-342, 1990.
NAHOUM, J.C. Amniocentese transabdominal: indicaçöes e técnica. Femina, Rio de Janeiro,
v.17, n.8 p.622-629, 1989.
OLIVEIRA, C.J.R. Aplicações teóricas da biologia molecular/engenharia genética em
análises clínicas. São Paulo, 2003. p.17-20. Apostila.
OLIVEIRA, M.A.L. et al. Aplicabilidade do scan B na reprodução de pequenos ruminantes.
In: SANTOS, M.H.B.; OLIVEIRA, M.A.L.; LIMA, P.F. Diagnóstico de gestação na cabra e
na ovelha. São Paulo: Varela, 2004. p.85-96.
PFEIFFER, I.; BRENIG, B. X- and Y-chromosome specific variants of the amelogenin gene
allow sex determination in sheep (Ovis aries) and European red deer (Cervus elaphus) BMC
Genetics, Berlin, v.6, n.16. 2005.
PHUA, A. C. Y.; ABDULLAH, R. B.; MOHAMED, Z. A PCR- Based sex determination
method for possible application in caprine gender selection by simultaneous amplification of
the Sry and Aml-X genes. Journal of Reproduction and Development, Tokyo. v. 49, n. 4,
p. 307-311, 2003.
REICHENBACH, H-D. et al. Sexagem fetal na cabra e na ovelha por ultra-sonografia. In:
SANTOS, M.H.B.; OLIVEIRA, M.A.L.; LIMA, P.F. Diagnóstico de gestação na cabra e na
ovelha. São Paulo: Varela, 2004. p.117-136.
REZENDE, J. et al. Obstetrícia. 8.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. p. 204-209.
25
REZENDE, J.; MONTENEGRO, C. A. Trocas materno-ovulares. In: REZENDE, J.
Obstetrícia 7. ed. São Paulo: Guanabara Koogan, 1995. p. 77-89.
RICHARDSON, C.; HERBERT, C.N.; TERLECKI, S. Estimation of the development age of
ovine fetus and lamb. Veterinary Record, London, v.99, p. 22-26, July. 1976.
RIJNDERS, R.J.P. et al. Fetal sex determination from maternal plasma in pregnancies at risk
for congenital adrenal hyperplasia. Obstetrics and Gynecology, New York, v.98, p.374-378,
2001.
ROBERTS, S. J. Gestational period and embriology. In:_____. Veterinary obstetrics and
genital diseases. 2.
ed. Michigan: Edwards Brothers, 1971. p. 36 – 46.
RÜSSE, I. Harn- und Geschlechtsorgane. In: RÜSSE, I.; SINOWATZ, F. (Ed.). Lehrbuch
der Embryologie der Haustiere. Berlin: Verlag Paul Parey, 1991. p.313-337.
RÜSSE, I.; GRUNERT, E. Die normale Gravidität. In: RICHTER, J. et al.
Tiergeburtshilfe. Berlin: Verlag Paul Parey, 1993. p.29-64
SAIKI, R.K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, Washington, v.239, p.487-491, 1988.
SANTOS, M.H.B. Principais métodos de diagnóstico de gestação em pequenos
ruminantes domésticos. Lavras, 2003. 61f. Monografia (Trabalho de conclusão de curso)
Universidade Federal de Lavras, Lavras.
SANSEVERINO, M.T.V. et al. Diagnóstico pré-natal: avanços e perspectivas. Revista do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, v.3, p.301-316, 2001.
SCHNORR, B. Entwicklung der Organe: Entwicklung der Geschlechtsorgane. In: _____.
Embryologie der Haustiere: Ein Kurzlehrbuch. Stuttgart: Verlag Enke, 1989. p.165-180
26
SMITH, K.C. et al. Use of transabdominal ultrasound-guided amniocentesis for detection of
equid herpesvirus 1-induced fetal infection in utero American Journal of Veterinary
Research, Washington, v.58, p.997-1002, 1997.
SOUSA, D.M.B. Desenvolvimento embrionário e fetal avaliado por ultra-sonografia do 25
o
ao 60
o
dia de gestação e Nelore (Bos taurus indicus). Revista Brasileira de Reprodução
Animal, Belo Horizonte, v.21, n. 2, p. 15-21, 1997.
STRAYER, L. Biochemistry. 4. ed. New York: W.H. Freeman, 1995. p.1064.
SULLIVAN, K. M. et al. A rapid and quantitative DNA sex test: fluorescence-based PCR
analysis of X-Y homologous gene amelogenin. Biotechniques, Natick, v.15, p. 636-641,
1993.
THIBIER, M.; NIBART M. Bovine embryo sexing by a DNA probe on the field.
Reproduction In Domestic Animals, Berlin, v.27, p.29-33, 1992.
TONIOLLO, G. H.; VICENTE, W. R. R. Placentas e placentação. In:_____. Manual de
obstetrícia veterinária. São Paulo: Liv. Varela, 1995. p.31-36.
VAN VLIET, R.A.; GIBBINS, A.M.V.; WALTON, J.S. Livestock embryo sexing: a review
of current methods, with emphasis on Y- specific DNA probes. Theriogenology, Stoneham,
v.32, p.421-438, 1989.
VELHO, M.T.C.; MORAIS, E.N.; ETHUR, A.B.N.; Determinação ultra-sonográfica do
índice do líquido amniótico em grávidas normais, da 12a à 42a semana de gravidez. Revista
Brasileira de Ginecologia e Obstretícia , Rio de Janeiro, v.23 n.4, p. 225-232, 2001.
VOTTA, R. A. Aplicaciones clínicas del estudo de la creatinina del líquido amniótico.
In:______.Investigaciones clínicas al conocimento del estado fetal. México: Panamericana,
1975. p. 59-63.
WATSON, J.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J. Recombinant DNA. 2. ed. New York: W.H.
Freeman & Co.,1992. p.626.
27
WILKENS, H. Embryologie und Anatomie des weiblichen Genitale. In: GRUNERT, E.,
BERCHTOLD, M. Fertilitätsstörungen beim weiblichen Rind. Berlin: Verlag Paul Parey,
1982. p.25-48.
WINTOUR, E. M.; McFARLANE, C. Abnormalities of fetal fluids in sheep: two case
reports. Australian Veterinary Journal, Brunswich, v. 70, n. 10, p. 276 – 378, 1993.
ZOGNO, M.A.; MIGLINO, M.A.; OLIVEIRA, M.R.; Análise bioquímica dos líquidos fetais
e citologia do fluido amniótico da fêmea de Mocó (Kerodon rupestris). Brazilian Journal of
Veterinary Research and Animal Science, São Paulo, v.41, p. 228-235, 2004.
28
EXPERIMENTO
29
SEXAGEM FETAL EM LÍQUIDO AMNIÓTICO OVINO POR PCR*
Arthur Nascimento de MELO
1
, Edivaldo Rosas dos SANTOS JÚNIOR
1
, Glenda Mônica Luna de
HOLANDA
1
, Manoel ADRIÃO
2
, Aurea WISCHRAL
3
1
Programa de Pós-graduação em Ciência Veterinária,UFRPE. [email protected]om
2
Prof. Adjunto, Depto de Morfologia e Fisiologia Animal, Laboratório de Fisiologia Animal
Molecular Aplicada – FAMA/DMFA/UFRPE.
3
Prof. Associado, Depto de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
UFRPE, Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n CEP - 52171-900, Recife, Pernambuco, Brasil
RESUMO
Foi realizada a identificação pré-natal do sexo em 45 amostras de líquido amniótico ovino,
obtidas por amniocentese guiada por ultra-som em úteros prenhes oriundos de animais
abatidos em matadouro, com os objetivos de avaliar a aplicabilidade e a eficiência da técnica
de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para este fim. Foram realizados PCR multiplex
com os “primers” referentes aos genes SRY e Aml-X. As amostras amplificadas foram
plotadas em gel de agarose 2% para eletroforese e posterior visualização em transluminador
de luz ultravioleta. Foram identificadas 24 amostras (53,33 %) como “macho” (116pb e
300pb) e 21 amostras (46,66 %) como “fêmea” (300pb), que foram confirmadas pela
avaliação morfológica dos fetos.
Palavras-chave: identificação do sexo, Aml-X, SRY, amniocentese.
ABSTRACT
Pre-natal sexing was undertaken using 45 samples of ovine amniotic fluid obtained through
amniocentesis ultrasound-guided from pregnant uteruses of animals killed in a
slaughterhouse. The aim was to evaluate the applicability and efficiency of the Polymerase
Chain Reaction technique (PCR) for these purposes. Multiplex PCRs were carried out with
SRY and Aml-X primers. The amplified samples were plotted in 2% electrophoresis agarose
gel and viewed using an ultraviolet transilluminator. 24 samples (53.33 %) were identified as
“male” (116bp and 300bp) and 21 samples (46.66 %) as “female” (300bp); this information
was confirmed by a morphological analysis of all fetuses.
Keywords: sexing, Aml-X, SRY, amniocentesis.
__________________________
• Trabalho formatado segundo normas da Revista Genetics and Molecular Biology
30
INTRODUÇÃO
A PCR é um método utilizado para amplificar uma seqüência selecionada de DNA ou
RNA que permite sintetizar, em poucas horas, milhões de cópias de uma seqüência de
nucleotídeos específica, podendo amplificar a seqüência-alvo em um milhão de vezes da
amostra inicial (CHAMPE E HARVEY, 1997). Como conseqüência do desenvolvimento da
PCR é atualmente possível realizar diversos tipos de diagnósticos, entre eles a investigação de
paternidade, detecção de doenças genéticas e infecciosas, além da determinação do sexo de
embriões, através da análise do DNA (GARCIA et al., 2003).
A possibilidade de selecionar o sexo da descendência oferece vantagens de ordem
prática e econômica à industria de produção animal (ALMEIDA e ALVAREZ, 2003). Os
métodos moleculares mais conhecidos para sexagem envolvem a visualização de
cromossomos sexuais a partir da realização do cariótipo (citogenética), ou a detecção de uma
seqüência de DNA específica do cromossomo Y, após amplificação por PCR (LUZ et al.,
2000).
Os segmentos alvos de amplificação para determinação de fragmentos cromossômicos
específicos incluem o SRY, que está localizado na fração longa do braço do cromossomo Y, e
o Aml-X encontrado no cromossomo X. A possibilidade de uma amplificação simultânea de
seqüências correspondentes de ambos os cromossomos permite a sua utilização como método
eficiente e reproduzível de se determinar o sexo através do uso de PCR (PHUA et al, 2003).
O gene amelo (AMEL gene), existente no cromossomo X, foi usado para identificar o
sexo em bovinos (ENNIS et al., 1994) e em humanos (SULLIVAN et al., 1993).
Para o diagnóstico preciso da idade fetal, são necessárias algumas medidas
morfológicas que mostrem uma taxa rápida de crescimento constante e que seja menos
variável em determinada fase. O comprimento do corpo e o desenvolvimento do esqueleto
foram utilizados durante anos para estimar a idade fetal (MUFTI et al., 2000).
Baseado na medida do CCC (cm) obtido através de paquímetro, a idade fetal pode ser
estimada e classificada em estágios de 15 dias cada, sendo o estágio 1 (1 a 15 dias), 2 (16 a 30
dias ), 3 (31 a 45 dias), 4 (46 a 60 dias), 5 (61 a 75 dias), 6 (76 a 90 dias), 7 (91 a 105 dias), 8
(106 a 120 dias) e 9 (120 até o nascimento) (KADU e KAIKINI, 1987). Utilizando esta
classificação, Messias (2002) estimou a idade de 89 embriões/fetos caprinos entre o 3
o
e o 7
o
estágio de desenvolvimento, obtendo um intervalo de variação entre 2,6 e 26 cm.
31
A ultra-sonografia é uma técnica diagnóstica que permite avaliação anatômica da
gestação. O método empregado isoladamente (exame de ultra-som) permite o diagnóstico de
aproximadamente 70 a 80% das malformações estruturais ou anatômicas do feto, dependendo
da acuidade diagnóstica, da experiência do operador, do tempo despendido para a realização
do exame e da qualidade técnica do aparelho empregado (SANSEVERINO et al., 2001).
O uso do ultra-som pode ainda auxiliar na visualização de outras técnicas como a
amniocentese transabdominal. Este procedimento é bastante eficiente e já foi anteriormente
realizado com sucesso em eqüinos (SMITH et al. 1997), bovinos (KAMIMURA, 1997;
MAKONDO, 1997) e humanos (CASTRO, 2001; LOPES, 2007).
Células do líquido amniótico foram primeiramente utilizadas para sexagem fetal em
humanos por Fuchs e Riis (1956). A partir de então, o procedimento para a amniocentese tem
melhorado bastante e foram introduzidos os métodos para cultivo dessas células in vitro para
análises citogenéticas de anomalias em humanos (STELLE e BREG, 1966). Makondo et al.
(1997) realizaram com sucesso a identificação do sexo fetal em bovinos a partir dos líquidos
amniótico e alantoideano, utilizando a técnica de PCR. Porém não se tem estudos conhecidos
sobre esta técnica em pequenos ruminantes.
Dessa forma, objetivou se avaliar a aplicabilidade e a eficiência da PCR multiplex para
identificar o sexo de fetos na espécie ovina, utilizando líquido amniótico coletado de úteros
gestantes provenientes de matadouro.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de líquido amniótico
Os úteros ovinos foram obtidos de animais sem raça definida (SRD) após o abate em
matadouro privado no município de Igarassu – PE e conservados em baixa temperatura até
serem transportados ao Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE.
Após imersão do útero em recipiente contendo água para facilitar a execução e simular
uma condição natural de exame, a ultra-sonografia foi realizada com transdutor linear 5,0
MHz acoplado ao monitor da marca FF-Sonic UF, modelo 4500.
Foram coletadas 44 amostras de 10 mL e uma, de 6 mL, de líquido amniótico em 39
úteros (sendo 33 gestações simples e 6 gemelares) e armazenadas em tubos de ensaio
32
devidamente esterilizados e identificados. O líquido aspirado foi conservado em geladeira por
três horas para sedimentação dos amniócitos.
Após amniocentese, os fetos foram retirados do útero, medidos com paquímetro e
examinados para análise morfológica do sexo. As amostras foram divididas em três grupos
segundo Kadu e Kaikini (1987): Grupo 1 (zero a 8,6cm) da concepção ao 60
o
dia de gestação,
Grupo 2 (8,7 a 26cm) entre o 61
o
e o 105
o
dia de gestação e Grupo 3 (26,1 cm em diante)
entre o 106
o
dia e o nascimento.
Extração de DNA
O DNA foi extraído segundo a técnica de Maniatis et al. (1989) modificada. Foram
retirados, em cada amostra, 600 µL de líquido amniótico com sedimentação celular e
transferidos para tubos de 1,5 mL e adicionados de 300 µL de TE (Tris, 10 mM - Invitrogen
Life Technologies e EDTA, 1 mM pH 8,0- Sigma Chemical Co.) e 300 µL de fenol (Merck)
equilibrado (pH 8,0). As amostras foram homogeneizadas por 1 minuto em um vortex
(Phoenix) e centrifugada (SIGMA 2K15) a 18.000 g por 5 minutos a 4 °C. Em seguida, o
sobrenadante foi transferido para outro tubo ao qual foi adicionado 200 µL de fenol-
clorofórmio (1:1), a amostra foi homogeneizada por 1 minuto e centrifugada a 18.000 g por 5
minutos.
O sobrenadante foi transferido para outro tubo onde foram adicionados 300 µL de
clorofórmio (Merck), misturados por 1 minuto e centrifugado a 18.000 g por 5 minutos.
Novamente em outro tubo, foram adicionados: 30 µL de acetato de amônio 3M (Cromato
Produtos Químico LTDA), todo o sobrenadante do tubo anterior (onde encontra-se o DNA) e
300 µL de isopropanol (Merck).
A mistura foi homogeneizada por 1 minuto e incubada por 60 minutos no freezer a –
20 °C, em seguida, centrifugada a 18.000 g por 30 minutos. O sobrenadante foi desprezado e
o sedimento lavado com 500 µL de etanol 70% (Merck) por centrifugação a 18.000 g durante
5 minutos a 4ºC. O etanol foi retirado e o sedimento deixado em temperatura ambiente e
ressuspendido em 30 µL de TE. O DNA extraído foi analisado em gel de agarose (Invitrogen
life Technologies) a 1%, com marcador fago-lambda e corado com brometo de etídeo para
análise em luz ultravioleta e fotografado (Olympus – Digital Câmara – C-7070 Wide) para
verificação de sua qualidade.
33
Amplificação do DNA
Para cada amostra, foi realizada uma reação em cadeia da polimerase multiplex em um
volume final de 25µL contendo 2,5mM de MgCl
2
, 10 pmoles de cada primer (Aml-X foward:
5’ CAGTAGCTCCAGCTCCAGCT 3’; Aml-X reverse: 5’ GTGCATCCCTTCATTGGC 3’;
SRY foward: 5’ ATGAATAGAACGGTGCAATCG 3’; SRY reverse: 5’
GAAGAGGTTTTCCCAA AGGC 3’) (PHUA et al., 2003), 200µM de cada dNTP, 1U de
Taq-polimerase, tampão 1X PCR (20mM de Tris-HCl pH 8.4, 50mM de KCl, 2mM de
MgCl
2
), 7µL de DNA e completado o volume com água ultra-pura.
O protocolo de amplificação consistiu em uma desnaturação inicial a 94ºC por cinco
minutos, seguida de 34 ciclos de 94ºC por quarenta e cinco segundos, 58ºC por quarenta e
cinco segundos e 72ºC por um minuto; com uma extensão final de 72ºC por sete minutos no
final do ciclo. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de
agarose 2% e corados com Brometo de Etídeo, visualizados em transluminador UV e
comparadas com marcador de 50bp DNA ladder (Invitrogen, USA) (PHUA et al, 2003).
Segundo Almeida e Alvarez (2003), são considerados machos os animais que
apresentam a formação de duas bandas, uma com 116 pb, correspondente a amplificação da
seqüência do gene SRY presente apenas em machos, e outra com 300 pb correspondente a
amplificação da seqüência do gene Aml-X presente em ambos os sexos. São consideradas
fêmeas as que apresentam formação apenas da banda com 300 pb (PHUA et al, 2003). A
análise estatística utilizada para o tamanho dos fetos foi descritiva.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve dificuldade em visualizar a punção do líquido amniótico, pelo ultra-
som, nos úteros que apresentaram gestações gemelares neste tipo de exame realizado
diretamente no útero obtido de matadouro, mas podem dificultar a visualização ultra-
sonográfica in vivo como observaram Bürstel et al. (2001) e Santos et al. (2006).
A visualização das amostras de DNA extraídas de células amnióticas, em gel de
agarose 1%, apresentaram quantidade inferior a 50ng de DNA por µL quando comparadas na
quantificação com fago-lambda, sendo considerada uma baixa quantidade conforme Phua et
al. (2003).
34
Das 45 amostras analisadas, 24 (53,33%) apresentaram a formação de duas bandas,
uma com 116 pb e outra com 300 pb, correspondentes à amplificação das seqüências dos
genes SRY e Aml-X respectivamente, caracterizando conceptos machos (Figura 1), enquanto
21 (46,66%) amostras amplificaram apenas o seguimento de 300pb correspondente ao gene
Aml-X, caracterizando fêmeas (Figura 2).
Em todos os casos o sexo foi confirmado pela análise morfológica dos fetos, com
exceção de um concepto cujo tubérculo genital ainda não havia migrado e consequentemente
não havia dado início à formação de genitália. Este concepto, a fêmea F21, apresentou 3,3cm
de comprimento e segundo Kadu e Kaikini (1987) possui idade gestacional inferior a 40 dias
de gestação, o que representa uma sexagem fetal de alta precocidade, sugerindo maiores
estudos para gestações ainda no primeiro terço.
Santos et al. (2006) afirmam que identificar o sexo fetal em pequenos ruminantes antes
do 50
o
dia, através da ultra-sonografia, aumenta o percentual de erro no diagnóstico. Essa
proposição tem a finalidade de evitar que fetos machos sejam indevidamente sexados como
fêmeas, porque existe a possibilidade da migração do tubérculo genital (estrutura responsável
pela formação de parte da genitália externa) ocorrer de forma mais tardia. Utilizando a técnica
de PCR, em contrapartida, uma maior margem de segurança pode ser obtida por se tratar da
análise do DNA fetal, o que motiva ainda mais os estudos para realização da sexagem fetal
através desta ferramenta molecular de alta especificidade.
35
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Figura 1 – Resultado da amplificação por PCR, apresentando bandas correspondentes ao AML-X
(300pb) e SRY (116pb) em ovinos machos.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Figura 2 – Resultado da amplificação por PCR, apresentando a banda correspondente ao AML-X
(300pb) em ovinos fêmeas.
300b
p
116bp
300b
p
36
O gene Aml-X serviu de parâmetro apresentando sua seqüência amplificada em todas
as amostras como sugerido por Pfeiffer e Brenig (2005), o que representa um controle de
qualidade para a reação de amplificação. Foi possível realizar a identificação do sexo
utilizando uma seqüência do gene SRY em todas as amostras, confirmando o proposto por
Luz et al. (2000).
Apesar da pequena quantidade de DNA presente no líquido amniótico, a reação em
cadeia da polimerase é uma técnica bastante eficaz para reproduzir uma seqüência alvo
desejada, como afirmaram Champe e Harvey (1997).
As amostras analisadas apresentaram variação entre a idade gestacional demonstrada
na Tabela 1, porém não houve diferença entre os três grupos para a realização da sexagem
fetal, já que em todas as amostras foi possível realizar extração de DNA e amplificação dos
segmentos desejados.
Tabela 1. Número de fetos (n), Tamanho (cm), a Média (M) e o erro padrão da média (EPM)
do CCC – paquímetro (cm) em relação à sexagem fetal (M- machos; F – fêmeas).
Tamanho (cm) Sexo morfológico Sexo genético
Grupos n
M ± EPM M F M F % Acertos
I 8
7,16 ± 0,59
6 2 6 2 100
II 25 16,03 ± 0,90 14 11 14 11 100
III 12 34,25 ± 1,77 4 8 4 8 100
Total 45 24 21 24 21
CONCLUSÃO
A técnica de PCR, utilizando os marcadores SRY e Aml-X, permite realizar a
identificação do sexo fetal à partir das células amnióticas de ovinos, com rapidez e
confiabilidade, em estágios precoces da gestação.
37
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, G.P.; ALVAREZ, R.H. Métodos de determinação do sexo de embriões bovinos.
Boletim da Indústria Animal, v.60, n.2, p.185-196, 2003.
BÜRSTEL, D.; MEINECKE-TILLMANN, S.; MEINECKE, B.; 2001. Ultrasonographic
determination of fetal sex in small ruminants. ANNUAL CONFERENCE OF THE
EUROPEAN. SOCIETY FOR DOMESTIC ANIMAL REPRODUCTION. 5, 2001, Vienna.
Anais… Vienna: ESDAR Newsletter, v.6, p.53 - 54.
CASTRO, F.C.; CASTRO, M.J.B.V.; CABRAL, A.C.V.; FILHO, G.B.; VITOR, R.W.A.;
LANA, A.M.A.; ANDRADE, G.M.Q. Comparação dos Métodos para Diagnóstico da
Toxoplasmose Congênita. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v.23, n.5, p.
277-282, 2001.
CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A. Bioquímica ilustrada. 2ª ed. Porto Alegre: Artes Médicas,
1997. p. 446.
ENNIS, S.; GALLAGHER, T. F. A PCR-based sex determination assay in cattle based on the
bovine amelogenin locus. Animal Genetic, v.25, p. 425-427, 1994.
FUCHS, F.; RIIS, P. Antenatal determination of foetal sex: in prevention of hereditary
diseases. Lancet, v.276, p.180-182, 1960.
GARCIA, J. F.; AVELAR, G. A.; DIAS, F. E. F. Aplicação de tecnologias de análise genética
no diagnóstico em Medicina Veterinária. In: CONGRESSO PERNAMBUCANO DE
MEDICINA VETERINÁRIA, 5, 2003. Anais…, 2003, Recife. p.100-103.
KADU, M.S.; KAIKINI, A.S. Prenatal development of caprinos foetus. Indian Journal of
Animal Science, v. 57, n. 9, p. 962-969, 1987.
KAMIMURA, S.; N. NISHIYAMA, S. OOKUTSU, K. GOTO u. K. HAMANA
Determination of bovine fetal sex by PCR using fetal fluid aspirated by transvaginal
ultrasound-guided amniocentesis. Theriogenology, v.47, p.1563-1569, 1997.
38
LOPES, A.C.V.; PIMENTEL, K.; ALMEIDA, A.M.; MATOS, E.C.; TORALLES, M.B.P.
Complicações materno-fetais da biópsia de vilo corial: experiência de um centro especializado
do Nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v.29, n.7, p.360-
367, 2007.
LUZ, M. R. et al. Sexagem de embriões bovinos fecundados in vitro pela técnica de PCR
multiplex. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 37, n. 6,
2000. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413-
95962000000600006&lng=en&nrm=iso>. Acesso em: 25 Feb 2008. doi: 10.1590/S1413-
95962000000600006
MANIATIS, T.; FRITSCH, E. F; SAMBROOK, J. (Ed.) Molecular cloning: a laboratory
manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 3 v.
MAKONDO, K.; AMIRIDIS, G.S. JEFFCOATE, I.A.; O'SHAUGHNESSY, P.J.; BOYD,
J.S.; PATERSON, C.;, ROBERTSON, L. Use of polymerase chain reaction to sex the bovine
fetus using cells recovered by ultrasound-guied fetal fluid aspiration. Animal Reproduction
Science, v.49, p. 125-133, 1997.
MESSIAS, J. B. Estimativa do peso fetal caprino (Capra hircus L., 1758) através de medidas
obtidas por ultra-sonografia e paquímetro. 2002. 37f. Dissertação (Mestrado em Ciência
Veterinária) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife.
MUFTI, A.M.; WANI, G.M.; WANI, N.A.; BUCHOO, B.A.; KHAN, M.Z. Prenatal
development of ovine fetus. Small Ruminant Research, v.38, p.87-89, 2000.
PFEIFFER, I.; BRENIG, B. X- and Y-chromosome specific variants of the amelogenin gene
allow sex determination in sheep (Ovis aries) and European red deer (Cervus elaphus). BMC
Genetic, v. 6, p. 16, 2005.
PHUA, A. C. Y.; ABDULLAH, R. B.; MOHAMED, Z. A PCR- Based sex determination
method for possible application in caprine gender selection by simultaneous amplification of
39
the Sry and Aml-X genes. Journal of Reproduction and Development, v. 49. n. 4, p. 307-
311, 2003.
SANSEVERINO, M.T.V.; KESSLER, R.G.; BURIN, M.G.; STEIN, N.R.; HERMAN, R.F.;
MATTE, U.; BARRIOS, P.M.M.; MAGALHAES, J.A. Diagnóstico pré-natal: avanços e
perspectivas. Revista do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, v.3, p.301-316, 2001.
SANTOS, M.H.B.; MORAES, E.P.B.X.; GUIDO, S.I.; BEZERRA, F.Q.G.; MELO, A.N.;
LIMA, P.F.; OLIVEIRA, M.A.L. Sexagem fetal em ovelhas Santa Inês por ultra-sonografia.
Ciência Rural, v.36, n.2, p.573-578, 2006.
SMITH, K.C.; McGLADDERY, A.J.; BINNS, M.M.; MUMFORD, J.A. Use of
transabdominal ultrasound-guided amniocentesis for detection of equid herpesvirus 1-induced
fetal infection in utero American Journal of Veterinary Research, v.58, p.997-1002, 1997.
STEELE, M.W.; BREG, W.R. Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells. Lancet
v.287, p.383-385, 1966.
SULLIVAN, K. M.; MANNUCCI, A.; KIMPTON, C. P.; GILL, P. A rapid and quantitative
DNA sex test: fluorescence-based PCR analysis of X-Y homologous gene amelogenin.
Biotechniques, v.15, p. 636-641, 1993.
40
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nas condições em que foi realizado este estudo, os dados analisados permitem concluir que:
a) O líquido amniótico é uma importante ferramenta a ser cada vez mais usado em diversas
áreas, em especial na biologia molecular, por permitir estudos avançados sobre o feto antes do
nascimento, como a identificação do sexo.
b) A técnica de reação em cadeia da polimerase é eficiente e prática para realizar a sexagem
fetal em ovinos a partir de baixas quantidades de DNA quando utilizados os primers SRY e
AML-X.
c) Apesar de invasiva, a técnica de amniocentece guiada por ultra-sonografia pode constituir
uma via de acesso rápida e simples para punção do líquido amniótico, com fins de realizar a
sexagem fetal na espécie ovina.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
