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Universidade de São Paulo
Faculdade de Odontologia de Bauru
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THAIS MARCHINI DE OLIVEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia
de Bauru, da Universidade de São Paulo, como
parte dos requisitos para a obtenção do título
de Doutora em Odontologia, área de
Odontopediatria.
BAURU
2007
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Odontologia de Bauru
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THAIS MARCHINI DE OLIVEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia
de Bauru, da Universidade de São Paulo, como
parte dos requisitos para a obtenção do título
de Doutora em Odontologia, área de
Odontopediatria.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos
BAURU
2007
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Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da FOB-
USP: projeto de pesquisa aprovado em 06 de maio de 2005.
Número do protocolo: n
o
.17/2004
Autorizo, exclusivamente pra fins acadêmicos e científicos, a
reprodução total ou parcial desta tese, por processos
fotocopiadores e/ou meios eletrônicos.
Assinatura do autor:
Data:
Oliveira, Thais Marchini
Ol4f Fator de Crescimento Endotelial Vascular na Doença
Periodontal Inflamatória Induzida Experimentalmente
em Ratos/ Thais Marchini de Oliveira -- Bauru, 2007.
xx, 144 p. : il. ; 30 cm.
Tese (Doutorado) -- Faculdade de Odontologia
de Bauru. Universidade de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos
Dados Curriculares
iv
Dados Curriculares
Thais Marchini de Oliveira
01 de dezembro de 1975
Nascimento Bauru – SP
Filiação José Marchini de Oliveira e
Marilene Rodrigues de Oliveira
1994-1997 Curso de Graduação na Faculdade de
Odontologia de Araçatuba – UNESP.
1998-1999 Curso de Especialização em
Odontopediatria, na Faculdade de
Odontologia de Bauru – USP.
1998-2000 Curso de Especialização em
Endodontia, no Hospital de
Reabilitação de Anomalias
Craniofaciais de Bauru – USP.
2001-2003 Curso de Pós-Graduação em
Odontologia em nível Mestrado, Área
de Odontopediatria, na Faculdade de
Odontologia de Bauru – USP.
2003 - Atual Curso de Pós-Graduação em
Odontologia em nível Doutorado, Área
de Odontopediatria, na Faculdade de
Odontologia de Bauru – USP.
Dedicatória e Agradecimentos
vi
“Um dia você aprende que...
O que importa não é o que você tem na vida, mas quem você
tem na vida...
Aprende que não importa aonde já chegou, mas onde está
indo...
E descobre que o tempo não é algo que possa voltar para
trás...
Portanto, plante seu jardim e decore sua alma, ao invés de
esperar que alguém lhe traga flores...
E você vai descobrir que realmente pode suportar...
Que realmente é forte e que pode ir muito mais longe, mesmo
depois de pensar que não se pode mais...
Então, você entende que a vida tem valor, e que você tem valor
diante da vida!”
Senhor DEUS, obrigada por me iluminar em mais uma jornada,
guiando meus passos para que todos os obstáculos encontrados
fossem superados.
Dedicatória e Agradecimentos
viii
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais, José Marchini de Oliveira e Marilene
Rodrigues de Oliveira, exemplo de dedicação, trabalho e amor pela família,
que sempre estiveram me ensinando a trilhar os caminhos da vida e nunca
mediram esforços para garantir meus estudos, sonhos e ideais. Hoje colho os
frutos das sementes que juntos plantamos. É difícil transformar em palavras
sentimentos tão intensos de amor e gratidão. Amo vocês, obrigada por tudo!
Aos meus irmãos, Karina e Thiago, pelo apoio e incentivo incondicional
em todos os momentos da minha vida, e pelo grande amor e carinho
demonstrados a cada dia. Eu tenho muito orgulho de vocês. Amo vocês!
Ao meu querido Fabrício, presente lindo de Deus na minha vida.
Obrigada pelo apoio, incentivo, força, amizade, compreensão e principalmente
pelo seu amor. O que sei, o que sou e o que faço, devo tudo a você. Amo muito
você!
À minha avó, Maria José, que nunca deixou de me abençoar em todos
os momentos da minha vida.
À Tia Aninha, Tio Gic e Mariana pelo amor, carinho e incentivo, por
serem pessoas especiais presente na minha vida me apoiando nas decisões
mais difíceis. Vocês são especiais!
Dedicatória e Agradecimentos
x
MEU RECONHECIMENTO E ADMIRAÇÃO
A todos os mestres,
que têm me ensinado
o valor do aprender
A necessidade da busca
A riqueza dos verbos
A simpatia do sorriso
A força da perseverança
A importância das mudanças
A necessidade de recomeçar,
A tolerância e a humildade
A evolução da ciência
A força do amor
E a beleza de DEUS.
Ao Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos, meu orientador, obrigada por
reconhecer meus méritos e me dar oportunidades, serei eternamente grata.
Entre as coisas que aprendi com você está a necessidade de fazer bem feito
qualquer coisa que se faça. Obrigada pela paciência, sabedoria, rigor científico
e apurado senso crítico, que muito contribuíram para concretização deste
trabalho. Agradeço pela orientação precisa e atenciosa. Muito obrigada por
tudo que fez por mim, fazendo-me trilhar o caminho por mim mesma, pelo seu
incentivo, exemplo, amizade e principalmente pela confiança depositada em
mim.
A Prof
a
Dr
a
. Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado, aprendi
com você a pensar grande e nunca aceitar não como resposta. Você é uma
pessoa especial, com entusiasmo pela vida. Consegue transformar desafios
em grandes oportunidades. Com certeza um dia vou retribuir todas as
oportunidades que você proporciona. Agradeço pela competência, pelos
Dedicatória e Agradecimentos
xi
conhecimentos científicos compartilhados e pelo apoio prestado sempre no
momento certo. Serei eternamente grata pela confiança em mim depositada.
Ao Prof. Dr. Ruy César Camargo Abdo, meu eterno orientador, não
basta ensinar ao homem uma especialidade, porque se tornará assim uma
máquina utilizável e não uma personalidade. É necessário que adquira um
sentimento, um senso prático daquilo que vale a pena ser empreendido,
daquilo que é belo, do que é moralmente correto. Muito obrigada por tudo.
A Prof
a
Dr
a
. Salete Moura Bonifácio da Silva, sua simplicidade e
enorme sabedoria foram e sempre serão qualidades valiosas a serem seguidas
no desenvolvimento de um docente. Serei sempre grata. Obrigada pela valiosa
contribuição para a minha formação profissional e principalmente pela
confiança.
Ao Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira Lima, pelos ensinamentos
transmitidos, que muito contribuíram para o meu enriquecimento no campo da
Odontopediatria.
A todos os professores da disciplina de Odontopediatria, Aymar
Pavarini, Bernardo Gonzáles Vono, José Eduardo de Oliveira Lima, Maria
Aparecida de Andrade Moreira Machado, Maria Thereza Francisca Borro
Bijella, Ruy César Camargo Abdo, Salete Moura Bonifácio da Silva, por
minha formação nesta especialidade.
Dedicatória e Agradecimentos
xii
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Muitas pessoas têm me ajudado a ser a pessoa que quero ser todos os
dias e vocês de uma forma ou de outra contribuíram para isso. Saibam que
cada um de vocês tem o seu exato valor na minha vida, nas minhas
lembranças, no meu futuro e em tudo que faço.
As grandes amigas de república Maria Cláudia, Juliana, Eve e Lidiane
pela amizade que supera qualquer distância e pelo carinho. Vocês são muito
especiais!
À amiga Vivien, pela amizade e companheirismo. Pessoa íntegra,
dedicada e de enorme caráter. Exemplo de profissional competente e
determinado senso crítico. Aprendi muito com você. Agradeço a valiosa
contribuição e pelo trabalho em equipe realizado. Obrigada pela convivência,
pelos ensinamentos e pela confiança. Serei sempre grata por tudo.
Ao amigo Thiago Cruvinel, pela amizade e profissionalismo. Obrigada
pela honestidade, competência e dedicação pelo trabalho. Agradeço a
confiança, ajuda e o trabalho em equipe que conseguimos realizar. É muito
gratificante trabalhar com pessoas como você. Obrigada por tudo.
Ao amigo Thiago José Dionísio, pela competência, profissionalismo,
amizade e dedicação. Obrigada pela disponibilidade em ajudar sempre quando
questionado, pela atenção e por todos os conhecimentos compartilhados.
Agradeço pela ajuda prestada em diversos momentos deste trabalho. Obrigada
pelo exemplo de sensatez e educação. Sem você tudo teria sido muito mais
difícil. Muito obrigado por tudo!
À amiga Ana Eliza Akashi, que admiro muito pela amizade e incentivo
em todas as horas. Profissional exemplar.
Dedicatória e Agradecimentos
xiii
À amiga Vivi, pelo apoio e amizade em todos os momentos deste
trabalho. Obrigada pelos momentos de alegria e descontração que você e o
Mano me proporcionaram. Vocês são especiais!
À amiga Tiza, pelo incentivo, amizade e exemplo de mãe dedicada.
As amigas Bella e Karin, pelo apoio, amizade e momentos de alegria
que vocês proporcionaram durante este trabalho.
À amiga Mariana Gigliotti, pela amizade, carinho e exemplo de
dedicação aos estudos. Obrigada por mostrar que vale a pena ser professor.
Aos colegas de pós-graduação: Dani, Lili, Érika, Heitor, Dani Rios,
Marcelo, Marina, Adriano, Glades, Dafna, Ana Paula, Evaristo, Andréa
Anzai, Carla Sipert, Carol Morandini, Adriana Calvo e Marineli, obrigada
pelos conhecimentos compartilhados, pela convivência e pela ajuda nos
diversos momentos em que precisei.
Aos alunos de Iniciação Cientícia: Mariana, Bruna, Thiago, Carol,
Léo, Paulo, Anderson, Paula, Fabíola e Marcela, obrigada pela
convivência e aprendizado.
As minhas amigas Carol e Carmen, pela amizade, competência e
profissionalismo. Sem a ajuda de vocês seria muito difícil à concretização deste
trabalho. Serei sempre grata por tudo.
À amiga Adriana, obrigada pelo carinho, amizade, estímulos constantes
e pela convivência agradável.
À amiga Cláudia, pela amizade, profissionalismo e pelo exemplo de
pessoa que você é. Obrigada por todos os momentos agradáveis, pela ajuda
sempre oferecida. Eu admiro muito você.
Dedicatória e Agradecimentos
xiv
À amiga Ana Lúcia, pela palavra amiga e de companheirismo sempre
presentes.
À amiga Priscila Zambonato, pela amizade mantida mesmo que à
distância.
À amiga Janete Galante, pelo incentivo, apoio e amizade.
À amiga Carol Lopes, pelo exemplo de força. Obrigada pela amizade e
apoio prestado durante o período desta pesquisa.
Ao Ivan, Arlene, Danilo e Liciane, pela amizade, carinho e incentivo
sempre presente. Obrigada por tudo.
Ao Dr. Fernando, Arlete, Rafael, Paola e Fernanda pelo carinho e
amizade que sempre me receberam.
A todos os meus médicos, em especial, Dr. Paulo e Dr. Alan, pelo
carinho que sempre me receberam e pela capacidade incomum, que alia
talento profissional, humildade e sensatez, desprendida de vaidade e
arrogância. Obrigada por tudo.
As amigas do departamento de odontopediatria Lia, Lílian, Fátima,
Estela, Márcia e o Peterson, pela amizade, colaboração e apoio incessante
em todos os momentos, agradeço de coração pela grande ajuda e atenção
sempre presente.
Ao professor José Roberto Lauris, por todos os conhecimentos e
explicações transmitidas em relação à análise estatística desse trabalho.
Ao Departamento de Ciências Biológicas e as Disciplinas de
Farmacologia, Fisiologia, Histologia, Patologia e Anatomia por propiciarem
e facilitarem a realização deste trabalho através da concessão de seus
Dedicatória e Agradecimentos
xv
materiais e equipamentos. Agradeço aos professores, Dr. Flávio, Dr. Alceu,
Dr
a
Inge , Dr. Gérson, Dr. Rumio, Dr. Gustavo, Dr. Luís Antônio Taveira, Dr.
Jesus e Dr. Antonio de Castro e todos os funcionários
À Vera, Secretária de Departamento de Ciências Biológicas, pelo
incentivo, apoio e por ser sempre prestativa.
À Fatiminha, técnica do Departamento de Patologia, obrigada pela
amizade e disposição constante em ajudar.
Á Tânia, técnica do Departamento de Histologia, sua ajuda foi
indispensável durante as etapas desta pesquisa. Obrigada pela atenção e
competência.
À Dra Elza, pelo incentivo, apoio e pronta permissão na utilização dos
equipamentos do HRAC - USP (Centrinho).
Aos funcionários do biotério central da FOB/USP, Luiz, Erasmo, Elias e
Richard, sempre muito prestativos. Obrigada pela ajuda e incentivo.
Aos funcionários da Biblioteca, pela atenção e serviços prestados.
Aos pacientes que muito contribuíram para o meu enriquecimento
profissional.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para o
sucesso deste trabalho, Deus abençoe todos vocês!!!
Dedicatória e Agradecimentos
xvi
AGRADECIMENTOS ADMINISTRATIVOS
À Faculdade de Odontologia de Bauru – USP, na pessoa do senhor
diretor, Prof. Dr. Luiz Fernando Pegoraro, e da senhora coordenadora de
pós-graduação, Prof
a
Dr
a
Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste estudo.
Sumário
RESUMO xxii
1 Introdução e Síntese Bibliográfica 3
2 Proposição 21
3 Material e métodos 25
3.1 Animais e caracterização dos grupos experimentais ........................ 25
3.2 Indução experimental da doença periodontal inflamatória por meio
da colocação de ligadura .................................................................. 25
3.3 Obtenção de espécimes para os diferentes experimentos e número
de animais......................................................................................... 29
3.4 Análise Microscópica......................................................................... 33
3.5 Extração de RNA total das biópsias de tecido gengival .................... 33
3.6 Quantificação do RNA total ............................................................... 34
3.7 Avaliação da qualidade do RNA total ................................................. 34
3.8 Tratamento do RNA total com DNase ............................................... 35
3.9 Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)..... 35
3.10 Estudo da intensidade de expressão de RNAm............................... 37
3.11 Western Blot .................................................................................. 38
3.12 Análise Imunohistoquímica.............................................................. 39
3.13 Análise Estatística........................................................................... 40
4 Resultados 45
4.1 Observação Macroscópica Clínica .................................................... 45
4.2 Análise Microscópica......................................................................... 49
4.2.1 Tecidos periodontais sadios................................................... 49
4.2.2 Tecidos periodontais submetidos ao progressivo acúmulo
de biofilme por meio da colocação de ligadura em ratos
não tratados com meloxicam................................................. 55
4.2.3 Tecidos periodontais submetidos ao progressivo acúmulo
de biofilme por meio da colocação de ligadura em ratos
tratados com meloxicam........................................................ 67
4.3 Análise da expressão de RNAm ...................................................... 77
4.3.1 RT-PCR................................................................................... 77
4.4 Análise da expressão da proteína VEGF ......................................... 82
4.4.1 Western Blot............................................................................ 82
4.4.2 Cortes histológicos marcados pela imunohistoquímica........... 84
5 Discussão 105
5.1 A Amostra........................................................................................ 105
5.2 Metodologia..................................................................................... 107
5.3 Precisão da Metodologia................................................................. 109
5.4 Resultados ...................................................................................... 110
5.5 Uso de antiinflamatório na odontologia ........................................... 118
5.6 Implicações Clínicas........................................................................ 119
6 Conclusão 125
Referências bibliográficas 129
ABSTRACT 143
Lista de Abreviaturas e Símbolos
° = graus
et al = e colaboradores
HE = hematoxilina-eosina
RT = transcrição reversa
RT-PCR = transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase
PCR = reação em cadeia da polimerase
VEGF = fator de crescimento vascular endotelial
VEGFR-1 = receptor 1 para VEGF
VEGFR-2 = receptor 2 para VEGF
COX-2 = cicloxigenase 2
EDTA = ácido etilenodiamino tetra-acético
DEPC = água com dietil pirocarbonato
PIS = solução de isolamento de proteínas
PMSF =fenil metil sulfonil fluoreto
TBS = solução salina tamponada por tris
PBS = tampão fosfato salina
SDS = Dodecil Sulfato de Sódio
DAB = solução líquida de 3,3’ - diaminobenzidina
PMN = polimorfonucleares
DTT = Ditiotreitol
dNTPs = nucleotídeos ( A, T, C e G)
cDNA = DNA complementar
RNAm = RNA mensageiro
FOB/USP = Faculdade de Odontologia de Bauru / Universidade de São Paulo
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Resumo
xxii
RESUMO
A doença periodontal é caracterizada por alterações inflamatórias, como
vermelhidão e edema da margem gengival, sangramento provocado,
alterações no contorno gengival e perda óssea alveolar. Evidências recentes
sugerem que o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pode ser um
mediador importante na doença periodontal inflamatória. Portanto, este
trabalho teve como objetivos avaliar durante a progressão da doença
periodontal inflamatória induzida experimentalmente em ratos: 1) o efeito do
meloxicam, inibidor preferencial da COX-2, na perda óssea alveolar; 2) a
cinética de expressão de RNAm para COX-2, VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2; e
3) a cinética de expressão da proteína VEGF. Cento e vinte (120) ratos foram
aleatoriamente divididos em: grupo 1 (sem tratamento com meloxicam) e grupo
2 (tratados com meloxicam). Ligaduras de fio de seda foram colocadas na
margem gengival do primeiro molar inferior direito de todos os ratos. O grupo 2
foi tratado por 3, 7, 14 e 30 dias com meloxicam (3 mg/kg/dia, via
intraperitoneal) e o grupo 1 foi usado como controle. As técnicas utilizadas para
as análises foram: análise microscópica, RT-PCR, Western Blot e
imunohistoquímica. Os resultados foram submetidos à análise de Correlação
de Pearson, Análise de Variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey, sendo
adotado nível de significância de 5%. Observou-se, neste estudo, que o
meloxicam foi efetivo em diminuir a perda óssea alveolar nos tecidos
periodontais em todos os períodos de indução da doença periodontal.
Experimentos de RT-PCR revelaram correlação positiva da cinética de
expressão de RNAm para COX-2 e VEGF nos tecidos gengivais afetados pela
doença periodontal inflamatória (R=0,80). A expressão de RNAm para VEGF
Resumo
xxiii
na doença periodontal inflamatória, no período de 14 dias, diminuiu no grupo
de animais tratados com meloxicam, mostrando diferença estatisticamente
significativa quando comparado com os animais não tratados (p=0,023). Não
houve diferença significativa na expressão de RNAm
para os receptores
VEGFR-1 e VEGFR-2 no tecido gengival em nenhum dos períodos de indução
da doença periodontal. Nos experimentos de Western Blot houve tendência de
menor expressão da proteína VEGF na doença periodontal inflamatória no
período de 14 dias nos animais tratados com meloxicam (p=0,08). Em
experimentos de imunohistoquímica foi detectado aumento da expressão da
proteína VEGF nos tecidos afetados pela doença periodontal em todos os
períodos estudados, bem como diminuição da expressão desta proteína nos
tecidos periodontais dos animais tratados com meloxicam. Portanto, a análise
conjunta dos dados sugere importante participação do VEGF na doença
periodontal inflamatória induzida experimentalmente em ratos e o meloxicam,
inibidor preferencial da COX-2, pode modificar a progressão da doença
periodontal neste modelo experimental por diminuir a perda óssea e a
expressão de VEGF.
Palavras-Chave: Antiinflamatório. Cicloxigenase-2. Doença periodontal. Fator
de crescimento vascular endotelial. Inflamação. Meloxicam. Perda óssea
alveolar.
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Introdução e Síntese Bibliográfica
3
1. INTRODUÇÃO E SÍNTESE BIBLIOGRÁFICA
1.1 – INFLAMAÇÃO
A inflamação é uma resposta bioquímica celular de defesa natural do
organismo, não específica, imediata, iniciada após qualquer lesão
celular
27,43,64,101
. A lesão celular pode ocorrer como resultado de trauma,
distúrbios genéticos ou imunes, agentes químicos, extremos de temperatura,
radiação e microrganismos
15,27,43,64,101
. Pode ser definida como uma resposta
local do tecido vascularizado agredido, caracterizada por alterações do sistema
vascular, dos componentes líquidos e celulares, bem como por adaptações do
tecido conjuntivo vizinho. Essas alterações dos componentes teciduais são
resultantes de modificações que ocorrem nas células agredidas, estas
passando a adquirir comportamentos diferentes: movimentos novos, alterações
de forma e liberação de enzimas e de substâncias químicas
15,27,99
. No processo
inflamatório os vasos sangüíneos dilatam-se e tornam-se mais permeáveis,
resultando no aumento do fluxo sangüíneo e na dispersão de plasma e células
para a matriz extracelular. Toda essa transformação morfológica e funcional do
tecido, característica dos processos inflamatórios, visa destruir, diluir ou isolar o
agente lesivo, sendo, portanto, uma reação de defesa e de reparação do dano
tecidual
99,101
.
A inflamação apresenta três etapas: alterações vasculares (mudanças
no calibre/fluxo vascular e incremento na permeabilidade vascular);
extravasamento de leucócitos e fagocitose (adesão/transmigração e
quimiotaxia); e reconstituição tecidual e crescimento celular. O evento mais
importante na fase inicial da inflamação corresponde ao aumento local da
permeabilidade vascular, resultando em infiltração celular e exudação de fluido
Introdução e Síntese Bibliográfica
4
rico em proteínas
27,101
. Tais alterações vasculares levam aos sinais clássicos
da inflamação: rubor, calor, edema e dor
27,101,124
. Essa reação inflamatória
também pode iniciar um processo de reabsorção, tendo como resultado perda
do volume de tecido duro
101
.
O processo inflamatório é influenciado pela ação de determinadas
substâncias químicas liberadas ou formadas enzimaticamente no local da
lesão. O grande número de produtos celulares pode ser resumido em quatro
categorias: citocinas, hormônios, mediadores e fatores de crescimento. Uma
citocina é uma proteína de baixo peso molecular ativa biologicamente que
altera a função da célula que a liberou ou a função das células adjacentes. As
citocinas têm ampla variedade de ações combinadas com a redundância
funcional dentro do sistema inflamatório
45,51,128
. Hormônios são moléculas
biologicamente ativas liberadas na corrente sangüínea, que estimulam a
atividade funcional das células distantes do local de secreção
74
. Os mediadores
são proteínas plasmáticas bem como agentes liberados dos mastócitos e
outros tipos celulares
15
. Os fatores de crescimento são uma família complexa
de moléculas sinalizadoras que regulam a diferenciação, proliferação,
crescimento e maturação das células
128
.
Frente à grande quantidade de moléculas inflamatórias, fica óbvio que
cada uma tem sua importância e participação no processo inflamatório.
Entretanto, uma análise mais atenta deste processo sugere que este sistema
complexo não é plenamente compreendido de modo que não se sabe com
precisão quais moléculas estão envolvidas em cada momento. Se
considerarmos a redundância funcional de muitas citocinas sobre os
componentes celulares, moleculares, bioquímicos e genéticos da inflamação,
Introdução e Síntese Bibliográfica
5
torna-se difícil identificar aquelas moléculas que são necessárias e exigidas
para um evento inflamatório específico
27,43,51
. O papel essencial das moléculas
durante a inflamação precisam ser melhor compreendido, pois o significado
biológico da inflamação é primordialmente associado à defesa do corpo contra
lesões e infecções no sentido de manter o equilíbrio homeostático.
1.2 – INFLAMAÇÃO E DOENÇA PERIODONTAL
Entre os processos inflamatórios que afetam a dentição humana, as
doenças periodontais são as mais comumente observadas. Essas doenças
compreendem um grupo de lesões que afetam os tecidos periodontais de
proteção (gengiva), denominando-se gengivite, induzida por biofilme dentário, e
os tecidos de sustentação (cemento, osso alveolar e ligamento periodontal),
denominando-se periodontite, levando à perda dentária. Existem diferentes
formas de periodontite, que podem afetar os indivíduos em suas diferentes
fases da vida
41,60,124
.
As periodontites compreendem um grupo de desordens com diferentes
etiologias e aparências clínicas
41,94
. A periodontite agressiva compreende um
grupo de doenças periodontais que afetam crianças, adolescentes e adultos
jovens, sendo caracterizada por uma rápida perda de tecido periodontal em
indivíduos com suposta saúde periodontal
5,120
. Em contraste, a periodontite
crônica é caracterizada principalmente pela lenta progressão da perda de
inserção periodontal
41
. Tem-se demonstrado que disfunção dos neutrófilos e
anormalidades no sistema imune contribuem mais para a patogênese da
periodontite agressiva do que para a periodontite crônica
41,60,124
. As doenças
periodontais inflamatórias incluem diversas alterações inflamatórias tanto nos
Introdução e Síntese Bibliográfica
6
tecidos de proteção quanto de sustentação dos dentes, sendo caracterizada,
em suas fases mais avançadas, especialmente pela destruição do ligamento
periodontal, perda da crista óssea alveolar, migração apical do epitélio
juncional e formação de bolsas periodontais
41
. O agente etiológico primário
destas doenças é o biofilme dentário, composto principalmente por bactérias
colonizadoras da superfície dentária, inicialmente gram-positivas
59,87,124
. A partir
do crescente acúmulo de microrganismos do biofilme dentário na margem
gengival, alterações no microambiente possibilitam a colonização de bactérias
gram-negativas
6
. Esta organização confere condições favoráveis ao
desenvolvimento microbiano, uma vez que atuam como barreira, retendo
substâncias produzidas pelas próprias bactérias e, ao mesmo tempo,
protegendo-as de fatores de defesa do organismo hospedeiro e de agentes
antimicrobianos externos
59,87
. Então, os componentes típicos desta espécie,
como os lipopolissacarídeos (LPS), surgem e supostamente interagem com
receptores de superfícies do epitélio sulcular, atingindo o tecido conjuntivo,
onde entram em contato com fibroblastos, células endoteliais e leucócitos
124
.
Clinicamente, essa fase inicial reflete alterações inflamatórias restritas ao
periodonto de proteção, caracterizadas como vermelhidão e edema da margem
gengival, sangramento provocado, alterações no contorno gengival, bem como
perda de adesão tecidual e aumento do fluxo do fluido gengival, no intuito de
diluir e eliminar o agressor
6,41,60
. Estabelece-se, então, o quadro de gengivite,
que não envolve perda de inserção periodontal e é reversível perante a
remoção do biofilme dentário.
A persistência do biofilme dentário em íntima proximidade aos tecidos
periodontais, possibilitando contínuo estímulo antigênico, transforma a resposta
Introdução e Síntese Bibliográfica
7
inflamatória, inicialmente aguda, na qual predominam alterações vásculo-
exsudativas e degradação de colágeno, em lesão crônica, com proliferação do
epitélio juncional e da bolsa periodontal, com perda de suporte dentário
caracterizado pela reabsorção óssea alveolar. Dessa forma, a periodontite
crônica pode ser definida como uma doença tipicamente crônica e
continuamente progressiva, que apresenta repentinos indícios de atividade
41,60,124
. A constante modificação do microambiente local possibilita o
desenvolvimento de um biofilme dentário subgengival, caracterizado por uma
microbiota principalmente gram-negativa anaeróbia e de espiroquetas
65
. O
desenvolvimento desta microbiota e a continuidade do acúmulo de biofilme
dentário resultam em uma grande quantidade de produtos microbianos. Esta
intensa carga antigênica no sulco gengival, por sua vez, ocasiona aumento
marcante na dimensão da resposta do hospedeiro
41
.
Atualmente, há um crescente alerta para as interações potencias entre
os mediadores químicos da inflamação e os fatores de crescimento. Estes
produtos celulares podem contribuir na modulação dos eventos celulares e
humorais dos mecanismos de defesa do hospedeiro contra infecções
bacterianas e assim, provavelmente participar da patogênese de condições
inflamatórias como a doença periodontal inflamatória
5,6,41,60,114,120,124
. Embora a
doença periodontal inflamatória resulte, primariamente, de uma resposta
inflamatória à presença de bactérias no biofilme dentário, é a natureza da
resposta inflamatória que determina a característica destrutiva da doença. Com
o aumento da presença de bactérias, seus produtos interagem com o epitélio
gengival para induzir a expressão e produção de mediadores químicos da
inflamação
60,124
.
Introdução e Síntese Bibliográfica
8
Além das doenças periodontais representarem a maior causa de
desconforto, desfiguração e perda de dentes na população mundial, novas
evidências científicas vêm sugerindo que especialmente as periodontites
aumentam o risco de certas doenças sistêmicas, como as cardiopatias,
doenças respiratórias e doenças coronárias, bem como o nascimento de bebês
prematuros e/ou de baixo peso e possivelmente outras condições
30,46,57
.
1.3- CICLOXIGENASE-2 (COX-2) E INFLAMAÇÃO
Interações entre patógenos microbianos e vários sistemas de resposta
do hospedeiro desempenham papel crítico no desenvolvimento e progressão
da doença periodontal inflamatória via liberação de mediadores inflamatórios e
imunológicos
6,12,94
. A inflamação e a destruição tecidual são eventos iniciais e
constantes durante o processo mediado pelo hospedeiro em resposta à
infecção bacteriana
27,124
. Um importante mecanismo nesse processo é a
ativação da cascata do ácido araquidônico, formado a partir dos fosfolípides de
membrana por meio da ação enzimática da fosfolipase A
2
, que leva à síntese
de metabólitos dessa substância com potentes propriedades pró-
inflamatórias
12,27,99,114
.
O ácido araquidônico pode servir como um substrato precursor para
duas vias enzimáticas: a via das cicloxigenases e a via das lipoxigenases. O
metabolismo do ácido araquidônico via cicloxigenases resulta na produção de
prostaglandinas (PG), tromboxanas e prostaciclinas e via lipoxigenases são
formados leucotrienos e lipoxinas
15,27,86,99,131
.
A cicloxigenase (COX) representa a enzima limitante na produção de
prostaglandinas
27,52,86
, a qual pode estar presente na maioria dos tipos
Introdução e Síntese Bibliográfica
9
celulares, incluindo células epiteliais, células endoteliais, macrófagos e
fibroblastos
27,52,79,111
. Existem três isoformas conhecidas da COX, designadas
como COX-1, COX-2 e COX-3
14,22,24,26,40,52,91,125
. Os genes são regulados por
sistemas independentes e diferentes, apesar da reação enzimática por eles
catalisada ser idêntica
29,113,125
.
Muitos dos efeitos constitutivos de manutenção homeostática da COX
são mediados pela COX-1, enquanto muitos dos efeitos inflamatórios e
induzíveis são mediados pela COX-2
26,27,29,52,79,125
. A terceira isoforma desta
família enzimática, denominada COX-3, é uma proteína derivada da COX-
1
14,22
. Esse fato é indicado pela especificidade tecidual de expressão de cada
isoforma; a COX-1 é uma enzima constitutiva expressa em quase todos os
tecidos humanos, ou seja, uma enzima que participa das funções fisiológicas
importantes do organismo, como agregação plaquetária, manutenção da
função renal e citoproteção gastrintestinal; enquanto a COX-2 é uma enzima
que se apresenta em níveis baixos ou não detectáveis em tecidos sadios
29
,
sendo altamente expressa em tecidos inflamados
26
e a COX-3 é uma enzima
muito abundante no córtex cerebral e coração
14,22
.
Embora aproximadamente 60% homólogas, com peso molecular cerca
de 70kD, e com mecanismos similares de metabolização do ácido
araquidônico
56,110
, as isoformas COX-1 e COX-2 apresentam algumas
diferenças. O sítio de ligação do agente inibidor na isoforma COX-2 é
estruturalmente cerca de 25% maior que o da COX-1
56
, apresentando também
local de ligação secundário, além do sítio catalítico. Isto tem permitido o
desenvolvimento de agentes que bloqueiam a atividade COX-2, de maneira
preferencial ou seletiva especificamente em concentrações que apresentam
Introdução e Síntese Bibliográfica
10
efeitos menores sobre a COX-1. O mesmo medicamento pode funcionar como
um inibidor da COX-2 em baixas concentrações e inibidor competitivo da COX-
1 quando em altas dosagens
70
. Diante de quadros inflamatórios, a atividade da
isoforma COX-1 não parece ser alterada ou apresenta um aumento discreto de
2 a 4 vezes na sua expressão
110
. A COX-2 é constitutivamente expressa em
pequenas quantidades em determinados tecidos como cérebro, intestinos, rins,
testículos, endotélio vascular, glândula tireóide e pâncreas
9
diante de quadro
inflamatório, sua expressão é aumentada cerca de 20 vezes
110
.
A expressão da COX-2 in vitro é induzida por citocinas pró-inflamatórias,
mitógenos e LPS
56,115
. Sua relevância tem sido sugerida no câncer, pois a
COX-2 catalisa a síntese de prostaglandinas, as quais têm papel determinante
na progressão dos tumores por induzir a formação de novos vasos
19,42,47,56,117
.
Expressão aumentada de COX-2 também tem sido implicada na doença de
Alzheimer, artrite reumatóide, psoríase além de algumas condições
neurológicas
29,52,70,75,110,118
.
As prostaglandinas são potentes mediadores numa ampla variedade de
respostas fisiológicas e patológicas, que variam desde a proteção renal e da
mucosa gástrica até a coagulação sangüínea, inflamação e dor
27,78,86
.
Atualmente estão disponíveis antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) que
podem inibir a enzima COX-2 preferencialmente ou seletivamente, ao contrário
dos AINES tradicionais que inibem também a COX-1, sendo estes últimos
responsáveis por efeitos colaterais deletérios que incluem ulceração
gastrintestinal e sangramento, danos renais e disfunção plaquetária
76,79,126,131
.
A prostaglandina E
2
tem sido implicada tanto na reabsorção óssea local
da inflamação quanto na reabsorção sistêmica e como um mediador crucial na
Introdução e Síntese Bibliográfica
11
patogênese das doenças periodontais
11,21,80,82,86
. Ela induz vasodilatação e
aumento na permeabilidade vascular, resultando em sinais clínicos da
inflamação, tais como edema e eritema
79,92,98,125,131
. A PGE
2
está elevada em
locais inflamados e periodotalmente doentes e em tecidos pulpares
sintomáticos em comparação com locais-controle
25,48,69
. A literatura tem
mostrado que tecidos afetados pela doença periodontal inflamatória contêm
níveis mais elevados de PGE
2
que tecidos periodontalmente saudáveis
11,21,50,80-
82,92,98
.
Suportando esses achados, tem sido relatado que os níveis de PGE
2
no
fluido do sulco gengival de pacientes com periodontite estão correlacionados
com a gravidade da doença medida por perda de inserção
121
. Na periodontite
experimentalmente induzida em animais, TUBB et al. (1990)
123
, relataram que
os níveis de PGE
2
no fluido do sulco gengival aumentaram de maneira
concomitante com o tempo em que houve perda de inserção periodontal. TSAI
et al. (1998)
121
mediram os níveis de PGE
2
no fluido do sulco gengival e
estabeleceram que o nível de PGE
2
pode ser utilizado como um indicador da
destruição periodontal. Isso pode ser explicado pelo fato de que esse mediador
também é um potente estimulador da síntese de metaloproteinases por
monócitos e fibroblastos, resultando em destruição do tecido conjuntivo e
reabsorção óssea mediada por osteoclastos
12,16
. BEZERRA et al., em 2000
11
,
estudaram o efeito do meloxicam para inibir a síntese de PGE
2
utilizando o
modelo de indução da doença periodontal inflamatória experimental em ratos,
tendo sido relatada diminuição acentuada da reabsorção do osso alveolar. Com
este propósito, outros autores passaram, então, a estudar a relação entre os
antiinflamatórios, PGE
2
e doença periodontal inflamatória. Como o mecanismo
Introdução e Síntese Bibliográfica
12
de ação dessas drogas é bloquear a síntese de PG por meio da inibição da
COX, sugere-se, portanto, que essa enzima e seus produtos, principalmente a
PGE
2
, tenham papel importante na doença periodontal inflamatória
50,54,55,80,82,98
.
Vários estudos relatados têm mostrado presença elevada de PGE
2
em
tecidos gengivais inflamados, o que pode ser explicado por um aumento local
na expressão da COX-2
10,11,21,50,80-82,92
. Relatos recentes mostram um aumento
da expressão de RNAm para a COX-2 e dos níveis da proteína, com aumento
da formação de PGE
2
, em fibroblastos gengivais após exposição in vitro à
interleucina-1, fator de necrose tumoral- ou LPS
85-87
. Resultados
semelhantes de aumento da expressão da COX-2 também foram observados
em leucócitos, num modelo de inflamação induzida experimentalmente por
periodontopatógeno
59,79,87,97,129
. Outro trabalho realizado por LOHINAI, em
2001
71
, utilizando também modelo de indução da doença periodontal
inflamatória em ratos, mostrou aumento da expressão da COX-2 no tecido
mucogengival ao redor da área afetada pela doença periodontal inflamatória.
Além disso, o tratamento dos animais com um inibidor preferencial da COX-2
(NS-398) reduziu o extravasamento de plasma e a reabsorção óssea,
sugerindo que essa enzima seja induzida na periodontite, desempenhando um
papel importante na inflamação gengival e na destruição do osso alveolar
71
.
A contribuição da COX-2 para a doença periodontal inflamatória ainda
precisa ser estabelecida com precisão. A administração de agentes
farmacológicos ativos locais ou sistêmicos, que inibem a COX-2, pode ser um
método útil para se investigar o papel da COX-2
nas doenças inflamatórias.
Sabe-se que o aumento da expressão de COX-2
está associado com a
progressão da doença periodontal inflamatória, envolvendo destruição de todo
Introdução e Síntese Bibliográfica
13
o tecido conjuntivo e reabsorção óssea
10,11,21,50,80-82,92,98
. Contudo, as vias de
ativação da COX-2
nesta doença ainda não foram completamente esclarecidas.
1.4 - FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) E
INFLAMAÇÃO
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) também conhecido
como fator de permeabilidade vascular é um mitógeno bastante específico para
células endoteliais vasculares. Funciona como um potente fator indutor de
angiogênese para células endoteliais em vasos recém-formados. É o maior
regulador tanto da neovascularização fisiológica quanto da
patológica
18,53,63,67,95,116
.
O VEGF funciona como regulador da permeabilidade vascular, que é
considerada importante para o início da angiogênese. A sobrevivência de
células endoteliais nos vasos recém-formados é dependente do VEGF.
Coerente com seu papel na sobrevivência celular, o VEGF induz a expressão
de proteínas anti-apoptóticas nas células endoteliais
34,37,63,116
.
O VEGF é uma glicoproteína homodimérica de 45 kDa, básica e ligada à
heparina. A família VEGF atualmente inclui seis membros conhecidos como os
VEGF ligantes: VEGF-A, fator de crescimento placentário (PIGF), VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D e VEGF-E
35,38,130
. Os membros da família são glicoproteínas
diméricas secretadas, que contêm resíduos característicos de oito cisteínas
espaçadas. A porção de adesão ao receptor da molécula de VEGF é formada
por uma porção homodimérica antiparalela do VEGF covalentemente ligada por
duas pontes dissulfídicas
33,35,36
.
Introdução e Síntese Bibliográfica
14
O gene de VEGF produz múltiplas espécies de RNAm. Isto determina a
codificação de diferentes isoformas protéicas de VEGF com subunidades
polipeptídicas de 121, 145, 165, 189 e 206 aminoácidos. O VEGF
165
é a
espécie molecular predominante e a principal isoforma, mas transcrições que
codificam o VEGF
189
são também comumente encontradas em células que
expressam o gene VEGF
35,130
. Em contraste, o VEGF
206
é uma forma rara.
VEGF
189
e VEGF
206
são formas mais básicas e se ligam à heparina com maior
afinidade do que o VEGF
165.
VEGF
165
é secretado, embora uma fração
significativa se mantenha ligada à superfície e à matriz extracelular. Entretanto,
o VEGF
189
e VEGF
206
estão quase que completamente seqüestrados na matriz
extracelular.
O VEGF
145
é a maior variante encaixada de várias linhas celulares
tumorais originadas de órgãos reprodutores femininos. VEGF
121
é uma proteína
livremente difusível
96
. Entretanto, essas isoformas podem ser liberadas numa
forma solúvel pela heparina ou heparinase, o que sugere que a área de adesão
é representada por proteoglicanos que contêm moléculas do tipo heparina. As
formas mais longas podem ser liberadas pela plasmina seguida da clivagem na
terminação–COOH. Essa ação cria um fragmento proteolítico bioativo que tem
um peso molecular de aproximandamente 34 kDa
38,130
. Tem sido demonstrado
que a ativação de plasminogênio e a geração de plasmina exercem um
importante papel na cascata angiogênica. As proteínas do VEGF podem tornar-
se disponíveis para as células endoteliais por, pelo menos, dois mecanismos
diferentes: como proteínas livremente difusíveis (VEGF
165
e VEGF
121
) em
seguida à ativação da protease, ou com a clivagem das isoformas mais
longas
32,130
.
Introdução e Síntese Bibliográfica
15
Além disso, há evidências científicas da identificação de receptores
tirosina quinases com propriedades sinalizadoras para o VEGF, o VEGFR-1
(conhecido como Flt-1), e o VEGFR-2 (KDR/Flk-1), os quais dividem
aproximadamente 44% de aminoácidos homólogos
38,130
. O VEGF-C e o VEGF-
D se ligam a um terceiro receptor, VEGFR-3 (Flt-4), que não reconhece o
VEGF-A. O VEGF-C e o VEGF-D também se ligam ao VEGFR-2, porém com
menor afinidade, em comparação ao VEGFR-3
130
. PIGF e VEGF-B se ligam
com alta afinidade apenas ao VEGFR1, enquanto que o VEGF-E se liga
especificamente ao VEGFR-2
38,130
.
O papel crítico do VEGF nos organismos é notavelmente demonstrado
em camundongos deficientes de VEGF. A perda de um simples alelo do VEGF
leva à morte intra-uterina desses camundongos
19
. Elevados níveis de VEGF
têm sido detectados durante a fase de granulação da cicatrização e estão
presentes em tecidos com células endoteliais inativas, confirmando a
importância do VEGF em potencializar a angiogênese numa variedade de
tecidos, respondendo a diversos sinais
58,84
. Entretanto, numerosas questões
básicas ainda estão incompletamente respondidas ou mesmo sem resposta.
Há fortes evidências de que as ações do VEGF no endotélio vascular são
complexas e de forma nenhuma limitadas à indução do crescimento. Estudos
recentes têm enfatizado o papel do VEGF no crescimento celular endotelial, na
prevenção da apoptose de células endoteliais e na formação vascular
colateral
32,34,58,88,119
.
Um vasto número de células, incluindo plaquetas, leucócitos e
neutrófilos, pode secretar o fator de crescimento endotelial vascular
77
,
imprescindível para um correto desenvolvimento embrionário e para
Introdução e Síntese Bibliográfica
16
progressão de outras condições fisiológicas e patológicas, incluindo reparo
tecidual, artrite reumatóide, neovascularização ocular, progressão tumoral,
endometriose e doenças cardiovasculares
17,103
.
Alguns estudos têm demonstrado que o VEGF pode ser um mediador
importante na doença periodontal inflamatória, possivelmente pela expansão
vascular e progressão da inflamação
58,116
. Adicionalmente, sabe-se que o
aumento na expressão de VEGF em alguns processos patológicos ocorre via
PGE
2
58
. Outros relatos documentam que a COX-2 é a enzima responsável pela
produção PGE
2
na doença periodontal inflamatória
11,71
. A literatura também
documenta que a inibição da atividade da COX-2 diminui significativamente a
expressão de VEGF, inibindo a angiogênese em tumores
35,44,95
. Porém, não há
evidências na literatura da expressão simultânea de COX-2 e VEGF nos
tecidos afetados pela doença periodontal inflamatória. Dessa forma, justifica-se
a realização de investigações adicionais para que esses aspectos sejam
esclarecidos.
1.5 - MODELOS ANIMAIS PARA ESTUDO DA DOENÇA PERIODONTAL
INFLAMATÓRIA EXPERIMENTAL
O estudo da doença periodontal inflamatória requer o uso de animais de
laboratório para os testes de agentes terapêuticos e para a avaliação da
segurança e eficiência de técnicas, drogas e ferramentas para a melhora da
cicatrização. Pelo fato da doença periodontal resultar em inflamação, a indução
em humanos não representa um procedimento ético. Portanto, os modelos
animais, nos quais a doença periodontal inflamatória é induzida
experimentalmente, continuarão indispensáveis para o estudo desta doença. A
Introdução e Síntese Bibliográfica
17
facilidade de manejo, o custo relativamente baixo e o curto período de tempo
de estudo fazem do rato um instrumento versátil para estudo da doença
periodontal inflamatória
72
.
Ao contrário de outras doenças infecciosas humanas, que não têm
correspondentes em outras espécies, a doença periodontal inflamatória é
comum no reino animal. Diferentes modelos animais podem ser utilizados para
se avaliar a patogênese ou até mesmo as modalidades terapêuticas possíveis
com relação à doença periodontal inflamatória
92,123
. É importante ressaltar,
porém, que a anatomia da junção dentogengival da região de molares de rato é
muito semelhante àquela descrita no homem, tornando o estudo experimental
da doença periodontal inflamatória nesses animais uma ferramenta bastante
válida
11,72
. Em ratos, esta doença pode ser induzida por meio de manipulação
dietética
62
, da inoculação experimental de microrganismos
periodontopatogênicos ou de seus produtos
62,72,87
e, ainda, por meio de
colocação de ligaduras ao redor da região cervical do molar do animal,
geralmente o primeiro molar superior ou inferior, que funcionam como sítio para
colonização bacteriana
1,10,11,28,50,54,55,68,82,105
.
A irritação mecânica local e a promoção da formação de biofilme
dentário pela colocação de ligadura com fio de seda ou algodão ao redor da
região cervical dos primeiros molares inferiores, tem sido a técnica mais
amplamente utilizada na indução da doença periodontal inflamatória
experimental
1,10,11,28,50,54,55,68,82,102
. Apesar da localização subgengival da
ligadura e de sua associação com agregados e biofilmes, um revestimento
epitelial inicialmente bem definido a separa do tecido conjuntivo subjacente. A
partir de então, em resposta à agressão mecânica e ao acúmulo gradualmente
Introdução e Síntese Bibliográfica
18
mais exuberante do biofilme ao redor da ligadura, ocorrem períodos de
inflamação aguda, com migração de células inflamatórias, seguidos por perda
de tecido conjuntivo e períodos de inflamação crônica, caracterizando a
instalação da doença periodontal inflamatória
54,55
. Uma vez definido o método
de indução da doença periodontal inflamatória experimental, uma série de
estudos pode ser realizada com relação à sua patogênese, evolução e
terapêutica.
R
R
O
O
P
P
O
O
S
S
I
I
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
Proposição
21
2. PROPOSIÇÃO
Levando-se em consideração evidências recentes que sugerem ser o
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) um mediador importante na
doença periodontal inflamatória, o presente trabalho teve como objetivos:
1) avaliar a perda óssea e o efeito do meloxicam, inibidor preferencial da COX-
2, nos tecidos periodontais durante a progressão da doença periodontal
inflamatória induzida experimentalmente em ratos;
2) investigar a cinética de expressão de RNAm
para COX-2, VEGF, VEGFR-1 e
VEGFR-2 nos tecidos periodontais durante a progressão da doença periodontal
inflamatória induzida experimentalmente em ratos, farmacologicamente
tratados ou não com meloxicam, inibidor preferencial da COX-2;
3) investigar a cinética de expressão da proteína VEGF nos tecidos
periodontais durante a progressão da doença periodontal inflamatória induzida
experimentalmente em ratos, farmacologicamente tratados ou não com
meloxicam, inibidor preferencial da COX-2.
M
M
A
A
T
T
E
E
R
R
I
I
A
A
L
L
E
E
M
M
É
É
T
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O
O
D
D
O
O
S
S
Material e Métodos
25
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Animais e caracterização dos grupos experimentais
Foram utilizados ratos Wistar, machos, com peso entre 200 e 250 g
(aproximadamente 60 dias), provenientes do Biotério Central da Faculdade de
Odontologia de Bauru/ Universidade de São Paulo (FOB/USP), divididos em
dois grupos:
GRUPO 1- Animais submetidos à indução da doença periodontal por ligadura,
sem tratamento farmacológico.
GRUPO 2 - Animais submetidos à indução da doença periodontal por ligadura,
e tratados com inibidor preferencial da COX-2 (Meloxicam, 3 mg/kg/dia)
11
, via
intraperitoneal.
3.2 - Indução experimental de doença periodontal inflamatória por meio da
colocação de ligadura
A manipulação animal seguiu o protocolo aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa em Animais da FOB/USP (processo n
o
.17/2004). Os
animais foram anestesiados com tiopental sódico (Thiopentax
®
, 60 mg/kg, via
intraperitoneal).
A ligadura constituiu-se de fio de seda preta 3-0 estéril e foi colocada
na região cervical do primeiro molar inferior direito, tomando-se o cuidado de
penetrar o fio no sulco gengival, portanto em íntima proximidade aos tecidos
gengivais, ficando o nó na região mesial
11,71,102
. Os dentes contralaterais
foram utilizados como controle (tecido sadios) (Figura 1). Os animais foram
Material e Métodos
27
mantidos no biotério da FOB/USP e alimentados com ração normal e água
ad libitum.
Figura 1 – Seqüência da colocação da ligadura na região cervical do primeiro
molar inferior. O nó foi mantido na região mesial e o fio inserido em todas as faces
do dente.
Material e Métodos
29
3.3 – Obtenção de espécimes para os diferentes experimentos e número
de animais
Para o acompanhamento da progressão da doença periodontal
inflamatória, os animais foram sacrificados nos tempos de 3, 7, 14 e 30 dias
após a colocação da ligadura, por meio de dose excessiva de anestésico,
procedendo-se à obtenção de espécimes para os diferentes experimentos.
A mandíbula foi removida, preservando-se o tecido gengival, sendo,
então, separada em duas hemimandíbulas. O material destinado à análise
microscópica e imunohistoquímica foi fixado em Formol 10%, por 24 h e
desmineralizado em solução de EDTA 5%, aproximadamente, durante 45
dias. Os espécimes foram seccionados, resultando em cortes vestíbulo-
linguais. Em seguida, foram incluídos em parafina e cortados em micrótomo
(Leica) com espessura de 5 m, sendo aderidos em lâminas de vidro
comuns para microscopia (Corning).
Para avaliação da perda óssea alveolar, as hemimandíbulas foram
tratadas com solução de peróxido de hidrogênio 30 volumes a 50% em
água, por 24 horas, para remoção dos tecidos moles, lavado em seguida
com PBS 1x e deixado para secar a temperatura ambiente. O material foi
então imerso em azul de metileno 1%, por 5 minutos. Em seguida,
fotografado em lupa de dissecção, com aumento de 20x (Zeiss), com a face
oclusal dos molares posicionada perpendicularmente a base da lupa. Para
cada animal, a perda óssea foi definida como a média da área total entre a
junção amelocementária e a crista óssea alveolar.
Material e Métodos
31
Para os outros experimentos, imediatamente após a morte dos animais, os
tecidos gengivais circundando os primeiros molares inferiores foram
acondicionados em tubos de microcentrífuga e congelados na temperatura de
– 80
o
C (Figura 2), para realização posterior de experimentos envolvendo as
técnicas de RT-PCR e Western Blot .
Figura 2 – Delimitação da área a ser analisada, correspondente a uma faixa de tecido
gengival, que circundava o primeiro molar e cerca de metade do segundo molar inferior.
Com relação ao número de animais utilizados, para cada um dos 4
tempos de avaliação da progressão da doença periodontal inflamatória (3, 7, 14
e 30 dias) foram incluídos 15 animais. Portanto, foi utilizado um total de 120
animais, sendo 60 no grupo 1 (sem tratamento com meloxicam) e 60 no grupo
2 (tratados com meloxicam). Cinco animais foram aleatoriamente utilizados
para obtenção dos espécimes para cada uma das técnicas estudadas: RT-
PCR, Western blot e imunohistoquímica. Vale ressaltar que os animais
utilizados como fonte para a análise microscópica com coloração hematoxilina-
eosina (HE) também foram utilizados para os testes de imunohistoquímica.
Material e Métodos
33
3.4 – Análise microscópica
As lâminas de vidro contendo os cortes vestíbulo-linguais das
amostras foram coradas com HE para a análise microscópica geral e grau
de reabsorção óssea. Está análise morfológica foi descritiva e incluiu
parâmetros microscópicos quanto à distribuição e tipo de infiltrado
inflamatório; presença de reabsorção dentária, efeito do meloxicam na
reabsorção óssea alveolar e presença de biofilme dentário.
3.5 - Extração de RNA total das biópsias de tecido gengival
Para a realização destes experimentos, seguimos as descrições feitas
em publicações do nosso laboratório
106-108
. Logo após a remoção, os tecidos
gengivais foram imediatamente colocados em tubos de centrífuga contendo
Trizol (Invitrogen Life Technologies, Estados Unidos) (0,1 g de tecido/1,0 mL de
Trizol) e congelados a –80
o
C até o momento da extração de RNA total pelo
método guanidino-isotiocianato-fenol-clorofórmio. No momento oportuno, os
tubos foram descongelados e os tecidos homogenizados utilizando-se um
homogenizador de tecidos. Em seguida, os tubos foram incubados por 5 min a
4
o
C e então foi adicionado um volume de 20% de clorofórmio. Os tubos foram
vigorosamente agitados e deixados em repouso a 4
o
C por 5 min, sendo em
seguida centrifugados a 12.000 g por 25 min. A camada superior (fase aquosa)
foi recuperada em alíquotas de 400 L que foram colocadas em tubos de
microcentrífuga de 1,5 mL contendo 400 L de isopropanol. Os tubos foram
agitados vigorosamente e deixados em repouso a 4
o
C por 15 min. Após
centrifugação a 15.000 g por 20 min a 4
o
C, o precipitado de RNA foi obtido e
Material e Métodos
34
em seguida o sobrenadante foi descartado e ao precipitado adicionado 1 mL de
etanol 70% em água com dietil pirocarbonato 0,1% (DEPC), agitando-se
vigorosamente. Foi realizada centrifugação a 15.000 g por 10 min a 4
o
C,
descartando-se o sobrenadante e repetindo-se outra centrifugação com 1 mL
de etanol 70% a 15.000 g por 10 min a 4
o
C. Para permitir a secagem das
amostras, o sobrenadante foi descartado e os tubos foram deixados abertos
em temperatura ambiente por 5 min dentro de uma capela de fluxo laminar
vertical (para impedir a contaminação das amostras). Para redissolver o RNA
total, os tubos de microcentrífuga receberam um volume de 50 L de água
tratada com DEPC 0,1% e foram incubados a 65
o
C por 15 a 30 min até a
dissolução dos precipitados.
3.6 - Quantificação do RNA total
A concentração de RNA total nas amostras foi determinada por diluição
do RNA (fator de diluição conhecido) e leitura em cubetas de quartzo em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm (A
260
). A fórmula para
calcular a concentração de RNA total foi a seguinte: (RNA) = A
260
x 40 x fator
de diluição conhecido, sendo o resultado expresso em mg/mL
106-108
.
3.7 - Avaliação da qualidade do RNA total
A qualidade do RNA total nas amostras foi determinada pela diluição do
RNA (em Tris-HCl 10 mM, pH 7,8) e leitura da absorbância em cubetas de
quartzo em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm
(A
260
e A
280
). Foi calculada a relação A
260
/A
280,
a qual foi considerada aceitável
Material e Métodos
35
se estivesse entre 1,9 e 2,1, pois valores nesse intervalo indicam ausência de
DNA na amostra.
3.8 - Tratamento do RNA total com DNase
Para evitar a possibilidade de contaminação do RNA total extraído de
diferentes tecidos e células por DNA genômico, foi realizado tratamento de
todas as amostras com DNase (RQ1 RNase – Free DNase®, Promega
Corporation). Alíquotas volumétricas diferentes foram utilizadas para a
obtenção de uma quantidade padronizada de 2 µg de RNA total em cada
amostra do estudo. A quantidade final de 2 µg de RNA total foi tratada com 2 U
de DNase. Em cada tubo de microcentrífuga foi adicionado 1 µL do tampão
específico para este tipo de reação (RQ1 RNase-Free 10X Reaction Buffer®,
Promega Corporation). Todos os tubos foram incubados a 37
o
C durante 30
min. Posteriormente, com o objetivo de cessar a reação, foi adicionado um
volume de 1 µL de RQ1 DNase Stop Solution® (Promega Corporation) em
cada amostra, de acordo com as instruções do fabricante. Para finalizar o
procedimento de tratamento com DNase, cada tubo foi incubado a 65
o
C por 10
min. As amostras de RNA total tratadas com DNase foram mantidas a –80
o
C
até o momento oportuno de uso.
3.9 - Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)
Para a realização destes experimentos, também seguimos as descrições
feitas em publicações do nosso grupo
8,107,108
. O RNA total foi utilizado para a
síntese de cDNA, a qual foi realizada num volume de reação de 15 L
Material e Métodos
36
utilizando-se 2 g de RNA total, 0,2 g de hexadeoxinucleotídeos, tampão
para RT (concentrações finais: Tris-HCl 45 mM pH8,3; KCl 68 mM e MgCl
2
9
mM), soroalbumina bovina 0,08 mg/mL, DTT 15 mM, dNTPs 1,8 mM e 150 U
de transcriptase reversa. Todos os reagentes citados fazem parte do “First-
strand cDNA synthesis kit” (Amersham Pharmacia, Estados Unidos). cDNA
foi sintetizado durante um período de 60 min de incubação a 37
o
C e a
reação foi paralisada pelo aquecimento a 90
o
C por 5 min. Os produtos da RT
(3 L) serviram de molde para a amplificação por PCR. Todas as reações
foram realizadas num volume de 50 L em tubos Hot start com os seguintes
reagentes: 20 pmol (0,4 M) de cada primer (sense e anti-sense para cada
alvo; Tabela 1), tampão para PCR (concentrações finais: Tris-HCl 20 mM pH
8,4; KCl 50 mM e MgCl
2
1,5 mM), dNTPs 0,2 mM e 2,5 U de Taq DNA
polimerase (Go Taq® DNA Polymerase, Promega). O processo de ciclagem
térmica consistiu de desnaturação inicial por 2 min a 94
o
C seguida de 30-40
ciclos de amplificação. Cada ciclo consistiu das fases de desnaturação,
anelamento e extensão, sendo os tempos e temperaturas de cada fase
padronizados de acordo com os primers utilizados
47,106-108,112
. Como controle
positivo foi utilizado primer para -actina
102,107,108
. As amostras foram
incubadas por um período adicional de 10 min a 72
o
C (extensão final) após o
término do último ciclo. Para cada par de primers foi realizada PCR em água
estéril para avaliação de possível contaminação dos primers (controle
negativo água). Um novo controle negativo foi realizado para cada amostra
de tecido, utilizando-se RNA como molde de PCR para avaliação de possível
contaminação por DNA genômico (no-RT). Uma alíquota de 10 µL de cada
amostra foi analisada por meio de eletroforese horizontal, em gel de agarose
Material e Métodos
37
a 2% contendo brometo de etídio (0,64 µg/mL). O peso molecular dos
produtos da PCR foi determinado pela comparação com um marcador com
intervalos de peso molecular igual a 100 pb. O cDNA foi visualizado sob luz
ultra-violeta para a detecção da presença de produtos amplificados de
tamanhos antecipados. Nesse momento foi realizada fotodocumentação
(câmera Sony V1, zoom óptico de 4X, distância padrão de 21 cm do centro
do gel; filtro Kodak UV).
Tabela 1 – Primers utilizados na PCR para os diferentes alvos e tamanhos
antecipados dos produtos de amplificação.
Alvo Tamanho
antecipado
Sense (5’-3’) Anti-sense (5’-3’)
-actina
351 pb
AACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTT
AGCAGCCGTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTC
COX-2
253 pb TGGTGCCGGGTCTGATGATG GCAATGCGGTTCTGATACTG
VEGF
165
80pb ATCATGCGGATCAAACCTCACC GGTCTGCATTCACATCTGCTATGC
VEGFR-1
83 pb CGACACTCTTTTGGCTCCTTCTAA TGACAGGTAGTCCGTCTTTACTTCG
VEGFR-2
92 pb GTACCAAACCATGCTGGATTGC CTTGCAGGAGATTTCCCAAGTG
3.10 - Estudo da intensidade de expressão de RNAm
Em cada amostra de tecido gengival, foi realizada análise semi-
quantitativa, utilizando-se como parâmetro de comparação os valores de
intensidade obtidos para a -actina, proteína cujo gene é expresso
constitutivamente, inclusive no modelo experimental estudado
102
. Para esta
análise, foi empregado o software Scion Image® (Scion Corporation, Frederick,
Maryland, E.U.A.). Para cada amostra foi obtida uma relação entre a
Material e Métodos
38
intensidade da banda alvo (COX-2, VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2) e a da banda
de -actina no gel de agarose. Esta relação foi posteriormente utilizada para os
estudos de correlação entre a expressão dos RNAm alvo e o estado de saúde
dos tecidos periodontais.
3.11 - Western Blot
Para estes experimentos foi utilizado o protocolo padronizado por
AMARAL et al.
2-4
. Biópsias de tecido gengival foram descongeladas e
homogenizadas com homogenizador em solução de isolamento de proteína
(PIS) contendo sacarose 250 nM, EDTA 1 mM, fenil metil sulfonil fluoreto
(PMSF) 0,1 mM e fosfato de potássio 5 mM, pH 7,7. A concentração de
proteína foi determinada pelo método de Bradford utilizando kit comercial (Bio-
Rad Kit, Hercules, CA) com albumina como padrão. Foram utilizados 20 ug de
proteína total de cada amostra e as mesmas foram eletroforeticamente
separadas por tamanho, usando-se sistema de gel de poliacrilamida 12%. A
solução tampão consistiu de: glicina 192 mM, Tris 25 mM, SDS 0,5%, pH 8,3. A
eletroforese foi realizada em voltagem de 60V, 15 min e 120V, 60 min.
Marcadores de peso molecular foram simultaneamente utilizados como
tamanho padrão. As proteínas foram transferidas eletroforeticamente para uma
membrana de nitrocelulose (100 V por 1 h) em tampão que consistiu de: glicina
192 mM, Tris 25 mM, metanol 20%, pH 8,3. As membranas foram lavadas em
solução salina tamponada por Tris (TBS), bloqueada com leite seco sem
gordura 5% em TBS por 2 h. Em seguida, incubadas no anticorpo primário
contra VEGF
165
humano produzido em camundongo (Pharmingen) (com
reatividade cruzada para rato - diluição 1:1000), ficando por toda a noite em
Material e Métodos
39
temperatura de 4
o
C. As membranas foram então lavadas e incubadas com
anticorpo secundário biotinilado contra IgG de camundongo produzido em
cabra (Biorad) (diluição 1:500) ficando por 1,5 h. A detecção do sinal foi
realizada com luminescência química aumentada (ECL Plus, Amershan
Pharmacia, Estados Unidos) e as membranas foram expostas a filme de
radiografia. Todos os experimentos de Western Blot foram realizados no
laboratório de Fisiologia da Faculdade de Ciências da UNESP, campus de
Bauru.
3.12 - Análise Imunohistoquímica
Cortes de 5m de espessura foram obtidos em lâminas silanizadas e
colocados na estufa a 56ºC para o início da desparafinização e adesão na
lâmina. Em seguida, acomodadas em cubas de “Coopler” com ranhuras,
passando por três banhos de xilol, dois banhos de etanol absoluto e um de
álcool 95%, 5 min cada. Depois as lâminas foram lavadas e deixadas em dois
banhos de solução salina tamponada por fosfato (PBS) pH=7,2, por 5 min.
Foram transferidas para bandejas, onde foi gotejado e aspirado mais PBS, para
depois gotejar peróxido de hidrogênio 3%, para bloqueio da peroxidase
endógena, por 15 min. Em seguida foram lavadas em PBS, aspiradas, sendo
então gotejados os bloqueadores de proteínas livres do soro e lavadas em PBS
novamente. Para a recuperação dos epítopos das proteínas os cortes foram
submetidos a aquecimento em solução de tampão citrato de sódio 10 mM.
Após recuperação antigênica, os cortes foram lavados em PBS e o excesso
aspirado. O anticorpo primário contra VEGF
165
humano produzido em
camundongo (Santa Cruz Biotechnology Inc) (diluição 1:250) foi gotejado sobre
Material e Métodos
40
as lâminas ficando em câmara úmida por 1 hora em temperatura ambiente. Os
cortes foram lavados com PBS e aspirados para receber o anticorpo
secundário biotinilado (diluição 1:100) (Dakocytomation LSAB2 Kit), ficando
por 15 min em temperatura ambiente e depois lavados com PBS 3 vezes e
incubados na solução de streptavidina-peroxidase por 15 min. Para controle
negativo, um dos cortes foi incubado com soro normal de coelho (diluição
1:1000) no lugar do anticorpo primário. Após a exposição à solução de
streptavidina-peroxidase as lâminas foram lavadas com PBS, sendo aspirado o
excesso, para depois ser gotejada a solução do DAB (solução líquida de 3,3'-
diaminobenzidina, Dakocytomation) por 5 min. As lâminas foram lavadas com
água destilada e contra-coradas por Hematoxilina de Harris 5% por 1 min. Em
seguida as lâminas foram transferidas para as cubas de “Coopler” e passadas
rapidamente por três banhos de álcool etílico absoluto e três de xilol. A
montagem das lâminas foi feita com resina sintética Entelan (Merck).
3.13 – Análise estatística
3.13.1 – Erro do método para medida de intensidade de bandas de PCR
Para estimar o valor do erro intra-examinador sistemático do método, a
intensidade das bandas de metade da amostra foi novamente estudada, 30
dias após a análise inicial. O teste t pareado foi usado para analisar o erro
intra-examinador sistemático do método, por meio da comparação dos valores
da expressão de RNAm para os alvos em duplicata, obtidos em duas análises
distintas com intervalo de 30 dias. Valores de p>0,05 foram considerados para
estimar a viabilidade de utilização do método proposto.
Material e Métodos
41
3.13.2 – Análise estatística entre grupos e variáveis
Após a coleta, os dados foram devidamente analisados por meio de
gráficos e tabelas, sendo utilizada ANOVA seguida do teste de Tukey para
determinar a significância da diferença entre os grupos dentro do mesmo
ensaio. Além disso, o teste de Correlação de Pearson foi utilizado para
observar a existência de correlação entre os alvos estudados. Todos os testes
foram realizados com o programa SIGMASTAT 2.0 (SPSS,Chicago, IL, USA),
tendo sido adotado nível de significância de 5% para que as diferenças fossem
consideradas estatisticamente significativas.
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
Resultados
45
4. RESULTADOS
4.1 – Observação Macroscópica Clínica
A observação macroscópica clínica descritiva dos primeiros molares
inferiores direitos e de seus tecidos periodontais adjacentes revelou grande
quantidade de biofilme aderida aos dentes com ligadura, tornando-se cada vez
mais exuberante com o aumento do tempo de indução experimental (Figura 3).
Os aspectos inflamatórios do tecido gengival, como aumento volumétrico e
sangramento apresentaram-se em diferentes intensidades. Após 3 dias de
indução, observou-se aumento volumétrico e sangramento, especialmente na
região vestibular. Somente notou-se sangramento significativo e mobilidade
dentária ao toque, utilizando-se instrumento sem ponta ativa, a partir de 7 dias
de indução experimental. Após o sacrifício dos animais, observou-se a
progressão da doença periodontal inflamatória e o efeito do meloxicam na
perda óssea alveolar (Figura 4).
Resultados
47
Figura 3 – Progressão da doença periodontal inflamatória com grande quantidade de biofilme,
tornando-se cada vez mais exuberante com o tempo de indução experimental.
Figura 4 –
Ilustração macroscópica da progressão da doença periodontal inflamatória
e a perda óssea alveolar.
Resultados
49
4.2 – Análise microscópica dos cortes histológicos corados pela
hematoxilina-eosina (HE)
4.2.1 – Tecidos periodontais sadios
A estrutura e organização dos tecidos periodontias normais dos molares
dos ratos foram observadas a partir das amostras controle obtidas do lado
oposto à colocação da ligadura. O quadro histomorfológico exibiu epitélio
juncional com sua extremidade apical na altura do limite amelocementário,
apresentando de duas a três camadas de células e superfície não
queratinizada (Figura 5a-b). Em direção coronária, o epitélio aumentou
gradualmente de espessura decorrente do aumento no número de camadas
celulares até o limite com o epitélio do sulco. O epitélio sulcular mostrou-se
pavimentoso estratificado paraqueratinizado e em continuidade com a mucosa
gengival revestida por epitélio pavimentoso estratificado com espessa camada
córnea. Subjacente, aos tecidos epiteliais, o tecido conjuntivo que constitui a
lâmina própria mostrou-se composto por fibras colágenas delgadas, pequeno
vasos sanguíneos e discreto infiltrado inflamatório polimorfonuclear (PMN),
muitas vezes também presentes no interior do epitélio juncional e sulcular
(Figura 5b-c). Lateralmente, a superfície dentária mostrou-se revestida pelo
cemento e nos planos mais profundos por feixes de fibras colágenas
semelhantes às fibras principais do ligamento peiodontal (Figura 5d).
O periodonto de sustentação composto pelo cemento, ligamento
periodontal e o osso alveolar exibiu características de normalidade, ou seja, a
superfície cementária mostrou-se uniforme e regular, revestida por
cementoblastos e raríssimas áreas de reabsorção dentária paralisada e/ou de
superfície irregular, demarcada por uma linha de reversão basofílica revestidas
Resultados
50
por células poliédricas justapostas, sendo caracterizada a reabsorção como
reparada (Figura 5a). O ligamento periodontal exibiu espessura uniforme e
grande celularidade, com fibroblastos de morfologia fusiforme e dispostos em
fascículos (Figura 5c). As fibras colágenas arranjavam-se paralelamente entre
si e se inseriam perpendicularmente às superfícies ósseas e cementárias,
sendo permeadas por inúmeros vasos sanguíneos, com raríssimas células
inflamatórias, compatível com a normalidade. A crista óssea alveolar mostrou-
se arredondada e próxima ao nível da junção amelocementária, sua superfície
apresentava revestida por osteoblastos justapostos e em paliçada, com raras
áreas de reabsorção por osteoclastos, provavelmente relacionadas com a
homeostasia tecidual requerida pela dinâmica do espaço periodontal
(Figura 5a).
No período de 30 dias, nos tecidos periodontais normais não submetidos
à colocação de ligadura, observou-se aumento do infiltrado inflamatório na
lâmina própria do epitélio da papila interdentária (Figura 6a-c) caracterizado
pela presença de inúmeros neutrófilos e macrófagos, porém delimitado pela
presença física das densas fibras colágenas do ligamento gengival, não
comprometendo as estruturas do periodonto de sustentação (Figura 6d). Com
relação ao suporte ósseo, o processo alveolar estava bem preservado com a
crista óssea alveolar apresentando-se arredondada e a superfície óssea
periodontal predominantemente revestida por osteoblastos.
Resultados
51
Figura 5 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado oposto a indução experimental no
período de 7 dias: a) visão panorâmica mostrando a papila interdentária (seta larga azul),
com o epitélio juncional próximo a junção amelodentinária (seta vazada), cemento (C)
uniformemente recobrindo toda a dentina radicular (D), osso alveolar (O) íntegro com a crista
arredondada na altura da junção amelodentinária (seta vazada) e as densas fibras do
ligamento peridontal (LP) inserindo-se ao osso alveolar (O) e ao cemento (C); b) detalhe da
papila interdentária mostrando o epitélio juncional próximo a junção amelodentinária (seta
vazada) e o epitélio (E) sobreposto ao tecido conjuntivo (TC) da lâmina própria, ricamente
celularizado e vascularizado; c) detalhe da figura anterior mostrando algumas células
inflamatórias (seta azul) no interior do tecido conjuntivo (TC) e do epitélio (E); detalhe do
ligamento periodontal (LP) característico da região inserido ao cemento (C) e ao osso
alveolar (O). HE
Resultados
53
Figura 6 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado oposto a indução experimental no
período de 30 dias: a) visão panorâmica mostrando a papila interdentária (seta larga azul),
com o epitélio juncional próximo a junção amelodentinária (seta vazada), cemento (C)
uniformemente recobrindo toda a dentina radicular (D), osso alveolar (O) íntegro com a crista
arredondada na altura da junção amelodentinária (seta vazada) e as densas fibras do
ligamento peridontal (LP) inserindo-se ao osso alveolar (O) e ao cemento (C); b) detalhe da
papila interdentária mostrando o epitélio juncional próximo a junção amelodentinária (seta
vazada) e o epitélio (E) sobreposto ao tecido conjuntivo (TC) com inúmeras células
inflamatórias (seta azul) e vasos sanguíneos vasos (V); c) detalhe da figura anterior
mostrando algumas células inflamatórias (seta azul) no interior do tecido conjuntivo (TC) e do
epitélio (E); detalhe do ligamento periodontal (LP) característico da região inserido ao
cemento (C) e ao osso alveolar (O)
. HE
Resultados
55
4.2.2 – Tecidos periodontais submetidos ao progressivo acúmulo de
biofilme por meio da colocação de ligadura em ratos não tratados com
meloxicam
A análise microscópica dos tecidos periodontais submetidos ao
progressivo acúmulo de biofilme por meio de colocação de ligadura revelou
variações entre os diferentes períodos de indução (3, 7, 14 e 30 dias).
Observou-se reabsorção óssea a partir do 3º dia após a colocação da
ligadura. Notou-se proliferação vascular e reabsorção do osso alveolar de
suporte, especialmente a partir do 7º dia, quando a inflamação atingiu, mais
evidentemente, o periodonto de sustentação, evoluindo para perda do suporte
dentário, especialmente a partir do 14º dia. Nas amostras analisadas, a
progressão da doença periodontal inflamatória não foi marcada tanto pelo
aumento de intensidade do infiltrado inflamatório, mas pela grande perda óssea
nas regiões mais profundas do tecido periodontal de suporte. A partir deste
período, notou-se maior número de áreas de reabsorção do processo alveolar
com perda de grande parte das estruturas necessárias para o suporte dentário.
No 30º dia o nível de perda óssea foi tão grande que chegou a comprometer a
sustentação do primeiro molar inferior, praticamente ausente na região mesial,
acompanhado por marcante exposição de cemento.
A seguir, as avaliações foram expressas de forma descritiva e mais
detalhadas, considerando cada período da indução da doença periodontal
inflamatórias.
No período de 3 dias, a região interproximal apresentou agregados de
biofilme, perda da papila interdentária com completa destruição dos tecidos
Resultados
56
epiteliais compatível com o processo destrutivo e intenso exsudado inflamatório
por PMNs que parecem migrar em direção a agregados de biofilme presentes
na superfície dentária (Figura 7a). Na porção cervical, a região do ligamento
periodontal apresentava inúmeros vasos hiperêmicos e congestos, processo
inflamatório exacerbado e destruição das fibras colágenas, além de inúmeras
áreas de reabsorção óssea pelos osteoclastos, dando origem a inúmeros
fragmentos ósseos envoltos por células inflamatórias, principalmente na porção
cervical (Figura 7b-c)
Aos 7 dias, houve diminuição do rebordo ósseo devido à perda parcial
do osso e do processo alveolar, ficando o terço cervical da raiz exposto ao
meio externo e ao biofilme. Ocorreu o recobrimento da superfície por tecido
epitelial hiperplásico, com inúmeras células inflamatórias e fragmentos ósseos
seqüestrados (Figura 8a). Adjacente ao tecido epitelial, exacerbado infiltrado
inflamatório predominantemente por PMNs preencheu toda a extensão do terço
médio da raiz, em substituição às estruturas do periodonto de sustentação
perdidas (Figura 8b-c). Neste período, eram nítidas as áreas de reabsorção,
tanto dos tecidos dentários quanto do tecido ósseo. (Figura 8d).
Observou-se no período de 14 dias, que o tecido epitelial apresentou
redução da hiperplasia e do número de células inflamatórias e formação de
longas projeções epiteliais, algumas recobrindo pequena superfície do cemento
(Figura 9a-b). O processo inflamatório ficou mais restrito ao tecido conjuntivo
adjacente ao tecido epitelial ou associado aos pequenos fragmentos ósseos
(Figura 9c-d).
Aos 30 dias, o quadro histológico mostrou que o organismo conseguiu
frear a exacerbada destruição tecidual, bloqueando o processo inflamatório
Resultados
57
para a região cervical. O processo inflamatório mostrou-se com quantidade
moderada de PMNs no tecido conjuntivo adjacente ao epitélio (Figura 10a).
Devido à diminuição da altura do rebordo ósseo toda região cervical e parte da
região média da raiz se mostrou exposta ao meio externo e ao biofilme
associado à ligadura, porém, sem sinais de reabsorção tanto do cemento
quanto da dentina. Sinais de reabsorção dos tecidos dentários só foram
observados na porção média e apical recoberta pelo tecido conjuntivo (Figura
10a-d).
Resultados
59
Figura 7 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
inflamatória induzida em rato, sem tratamento com meloxicam, período de 3 dias após a
indução: a) visão panorâmica mostrando a junção amelodentinária (seta vazada), a região
da papila interdentária (seta larga azul) com completa destruição dos tecidos epiteliais e da
crista óssea alveolar (O) e intenso infiltrado inflamatório estendendo-se aproximadamente
até o terço o médio da raiz, com destruição do ligamento periodontal (LP) e do osso e do
processo alveolar (seta larga preta); b) detalhe da região da crista óssea alveolar
mostrando reabsorção do tecido ósseo (O) por osteoclastos (seta preta) e vasos
sanguíneos (V); c) detalhe do periodonto de sustentação no terço médio da raiz exibindo
reabsorção do osso alveolar por osteoclastos (seta preta), processo inflamatório na região
do ligamento periodontal (LP) e o cemento (C); d) detalhe da região do ligamento
periodontal mostrando inúmeras células inflamatórias (seta azul), vasos sanguíneos (V)
hiperêmicos e destruição das fibras do ligamento periodontal (LP). HE
Resultados
61
Figura 8 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
inflamatória induzida em rato, sem tratamento com meloxicam, período de 7 dias após a
indução: a) visão panorâmica mostrando a junção amelodentinária (seta vazada) e a
diminuição da altura do rebordo ósseo (O) devido a perda parcial do osso e do processo
alveolar, ficando o teço cervical da raiz exposta. Presença de tecido epitelial hiperplásico
recobrindo o tecido conjuntivo (TC) com intenso infiltrado inflamatório estendendo-se até o
terço médio da raiz, áreas de reabsorção (seta larga preta) da dentina (D) e presença do
osso e do processo alveolar (O) e do ligamento periodontal (LP) somente na porção apical da
raiz; b) detalhe do tecido epitelial (E) e do tecido conjuntivo (TC) subjacente com inúmeras
células inflamatórias (setas azuis) e o seqüestro ósseo (O) no interior do epitélio (E), c)
detalhe do tecido epitelial exibindo o fragmento ósseo (O) seqüestrado e as células epiteliais
(cabeças de seta) envoltas por inúmeros PMNs (seta azul), c) detalhe mostrando a
reabsorção dos tecidos dentários (seta larga preta), ausência do periodonto de sustentação e
substituição por tecido conjuntivo rico em vasos sanguíneos (V) e células infamatórias. HE
Resultados
63
Figura 9 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
inflamatória induzida em rato, sem tratamento com meloxicam, período de 14 dias após a
indução: a) visão panorâmica mostrando a região da junção amelodentinária (seta vazada)
e a diminuição da altura do rebordo ósseo (O) devido a perda parcial do osso e do processo
alveolar, ficando o teço cervical da raiz exposta. Ausência da papila interdentária e
recobrimento da superfície por tecido epitelial (seta larga azul) não característico da região,
com longas projeções epiteliais; b) detalhe do tecido epitelial (E) e do tecido conjuntivo (TC)
subjacente com inúmeras células inflamatórias (setas azuis) e o seqüestro ósseo (O) no
interior do epitélio (E), c) detalhe do fagmento ósseo envolto por tecido epitelial (E) e
células inflamatórias do tecido conjuntivo (TC), c) detalhe da região média-apical da raiz
mostrando a crista óssea (O), o cemento (C), as fibras do lligamento periodontal (LP) e os
vasos sanguíneos (V). HE
Resultados
65
Figura 10 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
inflamatória induzida em rato, sem tratamento com meloxicam, período de 30 dias após a
indução: a) visão panorâmica mostrando a região da junção amelodentinária (seta vazada),
a diminuição da altura do rebordo devido a perda do osso e do processo alveolar, ficando
praticamente apenas o osso basal (O), exposição da superfície dentária com grande
acúmulo do biofilme bacteriano (P) associado a ligadura (L), ausência da papila
interdentária e recobrimento da superfície por tecido epitelial (seta larga azul) não
característico da região isolando o biofilme bacteriano (P) do tecido conjuntivo (TC); b)
detalhe do biofilme bacteriano (P) na superfície da dentina (D) exposta, associado a
ligadura (L) e do tecido epitelial (E) e do tecido conjuntivo (TC), c) detalhe da área de
reabsorção (cabeça de seta) da estrutura dentária (D), do tecido conjuntivo (TC) e tecido do
epitélial (E), c) detalhe as células inflamatórias (setas azuis) e dos os vasos sanguíneos (V)
no conjuntivo (TC) adjacente ao epitélio (E). HE
Resultados
67
4.2.3 – Tecidos periodontais submetidos ao progressivo acúmulo de
biofilme por meio da colocação da ligadura em ratos tratados com
meloxicam
A análise microscópica dos tecidos periodontais submetidos ao
progressivo acúmulo de biofilme, por meio da colocação de ligadura, revelou
variações morfológicas significativas entre os diferentes períodos de indução,
semelhantes ao observado no grupo não tratado, porém, em menor velocidade
e intensidade.
Observou-se no período de 3 dias, que a região interproximal
apresentou agregados de biofilme, perda da papila interdentária com completa
destruição dos tecidos epiteliais, compatível com o processo destrutivo e
intenso exudado inflamatório por PMNs que parecem migrar em direção a
agregados de biofilmes presentes na superfície dentária (Figura 11a). Na
porção cervical, a região do ligamento periodontal apresentava alguns vasos
hiperêmicos e congestos, processo inflamatório moderado com destruição
parcial das fibras colágenas, além de áreas com reabsorção do osso e do
processo alveolar pelos osteoclastos, dando origem a alguns fragmentos
ósseos envoltos por células inflamatórias, na porção cervical (Figuras 11b-d).
Aos 7 dias, houve diminuição do rebordo ósseo devido à perda parcial
do osso e do processo alveolar, ficando apenas uma pequena parte do terço
cervical da raiz exposta ao meio externo e ao biofilme (Figura 12a). Neste
período, diferentemente do que ocorreu no grupo não tratado, o tecido epitelial
não se mostrou presente e o tecido conjuntivo com inúmeras células
inflamatórias PMNs estava em íntimo contato com o biofilme dentário, além
disso, eram nítidas as áreas de reabsorção por osteoclastos da crista óssea
Resultados
68
alveolar e o processo inflamatório migrando para as regiões mais apicais do
ligamento periodontal, indicando atraso nos eventos celulares com o uso de
antiinflamatórios (Figura 12b-d).
No período de 14 dias, algumas camadas de células epiteliais (Figura
13a-b) desorganizadas, já recobriam a superfície do tecido conjuntivo frouxo.
Este tecido conjuntivo apresentava inúmeras células inflamatórias e estava
circundado pelas fibras dento gengivais que isolava o processo inflamatório dos
demais tecidos periodontais. Com a diminuição da altura do rebordo ósseo
devido à perda parcial do osso e do processo alveolar, observados nos
períodos anteriores, pequena parte do teço cervical da raiz ficou exposta. A
superfície do osso alveolar exibiu inúmeros osteoblastos volumosos, indicando
processo de síntese de novo tecido ósseo (Figura 13c-d)
Aos 30 dias, o quadro histológico indicou que o organismo conseguiu
frear a destruição tecidual, bloqueando o processo inflamatório para a região
cervical. O processo inflamatório mostrou-se com moderada quantidade de
PMNs no tecido conjuntivo adjacente ao epitélio (Figura 14). Devido à pequena
diminuição da altura do rebordo ósseo parte da região cervical da raiz
apresentou-se exposta ao meio externo e ao biofilme associado à ligadura,
porém, sem sinais de reabsorção tanto do cemento quanto da dentina.
Resultados
69
Figura 11 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
Inflamatória induzida em rato, tratado com meloxicam, período de 3 dias após a indução: a)
visão panorâmica mostrando a junção amelodentinária (seta vazada), a região da papila
interdentária (seta larga azul) com completa destruição dos tecidos epiteliais e da crista
óssea alveolar (O) e intenso infiltrado inflamatório estendendo-se aproximadamente até o
terço o médio da raiz, com destruição do ligamento periodontal (LP) e do osso e do
processo alveolar (seta larga preta); b) detalhe dos fragmentos ósseos (O) envoltos por
tecido conjuntivo e células inflamatórias PMNs (asteriscos); c) detalhe do periodonto de
sustentação no terço médio da raiz exibindo reabsorção do osso alveolar por osteoclastos
(seta preta), processo inflamatório na região do ligamento periodontal (LP) e o cemento (C);
d) detalhe da região do ligamento periodontal mostrando inúmeras células inflamatórias
(seta azul), vasos sanguíneos (V) hiperêmicos e a desorganização das fibras do ligamento
periodontal (LP). HE
Resultados
71
Figura 12 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
Inflamatória induzida em rato, tratado com meloxicam, período de 7 dias após a indução: a)
visão panorâmica mostrando a junção amelodentinária (seta vazada) e a diminuição da
altura do rebordo ósseo (O) devido a perda parcial do osso e do processo alveolar por
reabsorção por osteoclastos (seta larga preta), ficando pequena parte do teço cervical da
raiz exposta. Ausência de tecido epitelial, com tecido conjuntivo (TC) em íntimo contato com
o biofilme microbiano (P) e apresentando inúmeras células inflamatórias; b) observar o
tecido conjuntivo próximo ao biofilme microbiano com inúmeras células inflamatórias (setas
azuis) e ausência do tecido epitelial, c) detalhe reabsorção da crista óssea alveolar por
osteoclastos (seta larga preta), c) detalhe do periodonto de sustentação apresentando
reabsorção do osso alveolar (O) por osteoclastos, células inflamatórias (seta azul) e
cemento (C) íntegro;. HE
Resultados
73
Figura 13 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
Inflamatória induzida em rato, tratado com meloxicam, período de 14 dias após a indução:
a) visão panorâmica mostrando a região da junção amelodentinária (seta vazada) e
pequena redução da altura do rebordo ósseo (O) devido a perda parcial do osso e do
processo alveolar. Ausência da papila interdentária e recobrimento da superfície por tecido
epitelial (seta larga azul) não característico da região, permeadas por inúmeras células
inflamatórias, isolando o tecido conjuntivo do biofilme microbiano; b) detalhe do tecido
epitelial (E) e do tecido conjuntivo (TC) subjacente com inúmeras células inflamatórias
(setas azuis) circundadas pelas fibras dentogengival (F), c) detalhe dos inúmeros PMNs
(setas azuis) de permeio as células epiteliais (cabeça de seta), c) detalhe do periodonto de
sustentação mostrando a integridade do osso alveolar (O), das fibras do ligamento (LP),
dos vasos sanguíneos (V) e do cemento (C). HE
Resultados
75
Figura 14 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com doença periodontal
Inflamatória induzida em rato, tratado com meloxicam, período de 30 dias após a indução:
a) visão panorâmica mostrando a região da junção amelodentinária (seta vazada), a
diminuição da altura do rebordo devido a perda do osso e do processo alveolar, ficando
praticamente apenas o osso basal (O), exposição da superfície dentária com grande
acúmulo do biofilme microbiano associado a ligadura (L), ausência da papila interdentária e
recobrimento da superfície por tecido epitelial (seta larga azul) não característico da região
isolando o biofilme microbiano do tecido conjuntivo (TC); b) detalhe do biofilme microbiano
(P) na superfície da dentina (D) exposta, associado a ligadura (L) e do tecido epitelial (E) e
do tecido conjuntivo (TC), c) detalhe do tecido epitelial (E) e do tecido conjuntivo (TC)
subjacente com inúmeras células inflamatórias (setas azuis), d) detalhe do periodonto de
sustentação próximo a crista óssea apresentando osso alveolar de superfície irregular com
reinserção de algumas fibras colágenas (setas), fibras do ligamento periodontal (LP) em
reorganização, os vasos sanguíneos (V) e o cemento (C) íntegro. HE
Resultados
77
4.3 - Análise da expressão de RNAm
4.3.1 - RT-PCR
Inicialmente foi realizada a avaliação da intensidade da expressão de
RNAm
para o gene de expressão constitutiva β-actina. Para algumas amostras
não se obteve sinal das reações de PCR para β-actina. Por suspeitar de
degradação do RNA das referias amostras, optou-se por removê-las. Portanto,
a presente análise baseou-se somente na relação entre a intensidade das
bandas alvo: COX-2, VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2; e das bandas de β-actina.
O teste ANOVA, seguido do teste de Tukey, relacionou os valores
médios entre os níveis de condição periodontal, os períodos de indução da
doença periodontal e a interação entre os grupos. Quando se avaliou a
expressão de RNAm para VEGF
observou-se no período de 14 dias diferença
estatisticamente significativa entre o grupo 1 e 2 (p=0,023). O grupo 2 (tratado
com meloxicam) apresentou valores estatisticamente menores na expressão de
RNAm para VEGF (Figura 15a-b).
Ao avaliar os receptores do VEGF, observou-se que o RNAm para
VEGFR-1 (Figura 16a-b) e o VEGFR-2 (Figura 17a-b) estavam expressos em
todos os períodos e grupos. Porém, não houve diferença estatisticamente
significativa na expressão de RNAm para VEGFR-1 e VEGFR-2.
Resultados
78
Figura 15a – Representação gráfica da expressão de RNAm para VEGF
em relação
ao RNAm para β-actina em tecidos afetados pela doença periodontal e seus
respectivos controles, bem como os tecidos afetados pela doença periodontal em ratos
tratados ou não com meloxicam (n = 3-5 em todos os períodos).
(
*
)
diferença estatisticamente significativa entre tecido afetado pela DP x tecido afetado pela DP
(meloxicam) (p = 0,023).
Figura 15b – Gel de agarose corado com brometo de etídio para observação dos
produtos amplificados por RT-PCR a partir de 2 µg de RNA total de tecido gengival
obtido após indução da doença periodontal inflamatória em ratos. cDNA amplificado
por PCR com primer específico para VEGF
(80pb). Controle água = controle negativo;
M = marcadores de peso molecular de 25 pb.
Resultados
79
Figura 16a – Representação gráfica da expressão de RNAm para VEGFR-1 em
relação ao RNAm para β-actina em tecidos afetados pela doença periodontal e seus
respectivos controles, bem como os tecidos afetados pela doença periodontal em ratos
tratados ou não com meloxicam (n = 3-5 em todos os períodos).
Figura 16b – Gel de agarose corado com brometo de etídio para observação dos
produtos amplificados por RT-PCR a partir de 2 µg de RNA total de tecido gengival
obtido após indução da doença periodontal inflamatória em ratos. cDNA amplificado
por PCR com primer específico para VEGFR-1 (83 pb). Controle água = controle
negativo; M = marcadores de peso molecular de 25 pb.
Resultados
80
Figura 17a –
Representação gráfica da expressão de RNAm para VEGFR-2 em
relação ao RNAm para β-actina em tecidos afetados pela doença periodontal e seus
respectivos controles, bem como os tecidos afetados pela doença periodontal em ratos
tratados ou não com meloxicam (n = 3-5 em todos os períodos).
Figura 17b – Gel de agarose corado com brometo de etídio para observação dos
produtos amplificados por RT-PCR a partir de 2 µg de RNA total de tecido gengival de
rato obtido após indução da doença periodontal inflamatória. cDNA amplificado por
PCR com primer específico para VEGFR-2 (92pb). Controle água = controle negativo;
M = marcadores de peso molecular de 25 pb.
Resultados
81
Com relação à expressão de RNAm para VEGF e COX-2, o teste de
Correlação de Pearson mostrou correlação positiva (R=0,80) entre os dois
alvos estudados na doença periodontal inflamatória (Figura 18).
Figura 18 – Representação gráfica da Correlação de Pearson para expressão de
RNAm para VEGF e COX-2 em tecidos afetados pela doença periodontal inflamatória
induzida em ratos não tratados com meloxicam.
Resultados
82
4.4 - Análise da expressão da proteína VEGF
4.4.1 – Western Blot
Esta análise foi feita para detectar a intensidade da expressão da
proteína
VEGF. Para algumas amostras a quantidade de proteína que seria
utilizada na reação foi insuficiente, assim sendo, optou-se por removê-las.
Portanto, a presente análise baseou-se na relação entre a intensidade da
banda alvo VEGF e da banda VEGF para controle positivo (rim de
camundongo).
O teste ANOVA, seguido do teste de Tukey, relacionou os valores
médios entre os períodos de indução da doença periodontal dos grupos.
Quando se avaliou a expressão da proteína VEGF foram observadas
diferenças estatisticamente significativas entre o lado controle e o lado doença
periodontal dos grupos 1 e 2, nos períodos de 3, 7 e 14 dias (Figura 19a-b). No
período de 14 dias, no controle pós-transcrição, houve uma tendência de
diminuição na expressão da proteína VEGF no grupo 2 (tratado com
meloxicam), lado doença periodontal. No período de 30 dias não houve
diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
Resultados
83
Figura 19a - Representação gráfica da expressão da proteína VEGF
(% do controle
positivo) em tecidos afetados pela doença periodontal e seus respectivos controles,
bem como os tecidos afetados pela doença periodontal tratados ou não com
meloxicam (n = 3-5 em todos os períodos).
(
*
)
diferença estatisticamente significativa em comparação com o respectivo tecido sadio.
(
#
)
tendência de diferença estatisticamente significativa entre
tecido afetado pela DP x tecido afetado
pela DP (meloxicam)
(p = 0,08).
Figura 19b – Revelação radiográfica dos produtos de Western Blot para observação
da expressão da proteína VEGF a partir de tecido gengival de rato obtido após
Resultados
84
indução da doença periodontal inflamatória, no período de 14 dias. A membrana de
nitrocelulose foi exposta ao filme radiográfico e a detecção do sinal realizada com
luminescência química aumentada. Controle positivo = rim de camundongo. Cada
coluna do gel de poliacrilamida foi carregada com 20 µg de proteína total.
4.4.2 – Cortes histológicos marcados pela imunohistoquímica
A análise microscópica da expressão da proteína VEGF durante a
progressão da doença periodontal inflamatória em ratos, farmacologicamente
tratados ou não com inibidor preferencial da COX-2, revelaram variações
morfológicas significativas nos grupos 1 e 2, dependendo do grau do processo
inflamatório.
Foi utilizado como controle positivo pulmão de rato, o qual, expressa
grande quantidade de VEGF especialmente no epitélio alveolar e brônquico,
nas células glandulares do brônquio e em macrófagos alveolares ativados
122
. O
padrão de marcação pode ser observado sem nenhuma coloração de fundo,
indicando boa qualidade das marcações (Figura 20a-e)
Resultados
85
Figura 20 - Detalhe dos cortes histológicos de pulmão de rato imunomarcados contra o antígeno
VEGF: a) aspecto geral do controle positivo anticorpo contra VEGF
(diluição 1:250); b) detalhe do
epitélio brônquico mostrando inúmeras células marcadas (seta); c) detalhe de alguns macrófagos
alveolar ativados (seta) imunomarcados; d-e) controle negativo (soro normal de coelho 1:1000).
No lado controle o tecido conjuntivo que constitui a lâmina própria
apresentou discreto infiltrado inflamatório por PMNs, no interior do epitélio
juncional e sulcular, os quais se encontraram imunomarcados pelo VEGF
Resultados
87
(Figura 21). No lado da doença periodontal ocorreu um aumento no processo
inflamatório que culminou com o aumento no número de PMNs, os quais
expressaram VEGF (Figura 22 e 23).
Durante o processo de acúmulo de biofilme na doença periodontal
inflamatória, no período de 3 dias, observou-se aumento expressivo do número
PMNs imunomarcados pelo VEGF. Este aumento na expressão do VEGF
culmina com a maior reabsorção do osso e do processo alveolar pelos
osteoclastos e em menor intensidade das estruturas dentárias radiculares
(cemento e dentina). Entre 7 e 14 dias, houve exposição da região cervical da
raiz ao meio externo e ao biofilme. O processo inflamatório se mostrou contido
acima da crista óssea remanescente apresentando ainda inúmeras PMNs
imunomarcados pelo VEGF. No período de 30 dias, o processo de destruição
das estruturas remanescentes do periodonto de sustentação praticamente ficou
paralisado e algumas áreas exibiram reparo por tecido conjuntivo com alguns
fibroblastos expressando VEGF.
No grupo 2, animais tratados com meloxicam, o processo inflamatório foi
menos exacerbado e os eventos teciduais demoraram mais tempo para ocorrer
quando comparado com o grupo 1 sem tratamento (Figuras 24). Assim, a
expressão do VEGF pelos PMNs foi menos intensa nos período de 7 e 14 dias,
em relação ao grupo 1. Um fato relevante foi que nos períodos iniciais de 3 e
7dias, praticamente apenas os PMNs expressaram VEGF, enquanto que, nos
períodos de 14 e 30 dias células epiteliais (Figura 25), células dos restos
epiteliais de Malassez (Figura 26) e fibroblastos do ligamento periodontal
(Figura 27) também passaram a expressar VEGF, acompanhando a
reestruturação do periodonto de sustentação.
Resultados
89
Figura 21 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado oposto à indução da
doença periodontal inflamatória experimental em rato não tratado com meloxicam, no
período de 7 dias. Observar alguns PMNs (setas) imunomarcados para VEGF
no
interior do tecido epitelial (E) e mais raramente no tecido conjuntivo (TC).
Imunoperoxidase
Resultados
91
Figura 22 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato não tratado com meloxicam, no período
de 7 dia. Observar inúmeras células inflamatórias imunomarcadas para VEGF (setas)
dispersas no epitélio e no tecido conjuntivo (TC) adjacente e aglomerados ao redor da
ligadura (L) e do biofilme microbiano. Imunoperoxidase
Resultados
93
Figura 23 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato não tratado com meloxicam, no período
de 14 dias. Observar as células inflamatórias (setas) imunomarcadas para VEGF tanto
no epitélio (E) quanto no tecido conjuntivo (TC). Imunoperoxidase
Resultados
95
Figura 24 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato tratado com meloxicam, período de 14
dias. Observar áreas de reabsorção (seta vazada) do cemento (C) e da dentina (D) e
as células inflamatórias (setas) imunomarcadas para VEGF
tanto no epitélio (E) quanto
no tecido conjuntivo (TC). Imunoperoxidase
Resultados
97
Figura 25 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato não tratado com meloxicam, período de
30 dias. Observar células inflamatórias (setas) e epiteliais (seta vermelha)
imunomarcadas para VEGF (setas). Imunoperoxidase
Resultados
99
Figura 26 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato tratado com meloxicam, período de 30
dias. Observar a integridade da dentina (D) e do cemento (C), e os fibroblastos do
ligamento periodontal e as células epiteliais dos restos epiteliais de Malassez
imunomarcadas para VEGF (
*
). Imunoperoxidase
Resultados
101
Figura 27 - Região mesial do primeiro molar inferior do lado com indução da doença
periodontal inflamatória experimental em rato tratado com meloxicam, período de 30
dias. Observar a dentina (D) e o cemento (C) íntegros, e os fibroblastos do ligamento
periodontal imunomarcados para VEGF
(setas). Imunoperoxidase
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
Discussão
105
5. DISCUSSÃO
Visando proporcionar uma melhor interpretação dos resultados obtidos
neste trabalho, serão discutidos inicialmente os aspectos referentes à amostra
bem como a metodologia aplicada para obtenção dos resultados.
Posteriormente, serão realizadas considerações sobre os resultados obtidos
mediante análise dos dados e comparando-os com outros trabalhos existentes
na literatura.
5.1 – A Amostra
Neste estudo, foram utilizados para a composição da amostra 120 ratos
Wistar. Após a erupção dos molares dos ratos, aos 19, 22 e 35 dias de vida
animal para primeiro, segundo e terceiro molares respectivamente, a função
oclusal só é estabelecida aos 25, 28 e 40 dias para primeiro, segundo e
terceiro molares respectivamente
72
. Por isso, neste trabalho, optou-se pela
utilização de animais com idade de 60 dias aproximadamente, de acordo com a
etapa experimental, quando o ponto de contato já se encontra bem
estabelecido. No entanto, com a idade, conforme a atrição interproximal dos
molares ocorre uma perda óssea fisiológica resultante dos processos de
crescimento e remodelação ósseos
127
. Devido a esta reabsorção fisiológica, o
presente estudo foi baseado na comparação com amostras controles, ou seja,
sem colocação de ligadura e provenientes do mesmo animal.
Utilizou-se um modelo experimental de indução da doença periodontal
inflamatória bem estabelecido em ratos, que envolve a colocação de ligadura
ao redor da região cervical do primeiro molar inferior
72
. Neste modelo, a
Discussão
106
ligadura age como um fator promotor da formação de biofilme na área
dentogengival, provocando achatamento e deslocamento dos tecidos gengivais
mesial e distal, bem como reduzindo a integridade tecidual pela ulceração
ocasional do epitélio sucular, o que permite intensa interação entre hospedeiro
e biofilme dentário. A inserção da ligadura com menor trauma possível e sua
manutenção subgengival, porém, sem destruir completamente a adesão
propiciada pela junção dentogengival, possibilita o acúmulo progressivo e
espontâneo de biofilme composto por bactérias presentes na própria microbiota
do animal e causado por sua dieta, sem qualquer manipulação adicional.
Apesar de não ser uma doença espontânea, a manipulação do animal para sua
indução é feita uma única vez e, a partir de então, a doença periodontal
inflamatória progride naturalmente
11
.
Modelos animais têm sido largamente utilizados em benefício da
compreensão da patogênese da doença periodontal inflamatória e na avaliação
de suas variadas modalidades terapêuticas. Embora não se possam esperar
respostas idênticas e agressões semelhantes entre as diferentes espécies,
modelos animais podem funcionar como modelos de tendências biológicas e
fornecer informações impossíveis de se obter em humanos. Neste sentido, os
ratos geralmente são alvo de estudos experimentais da doença periodontal
inflamatória, devido às grandes semelhanças com os humanos em relação à
arquitetura da região de molares, inclusive da junção dentogengival, baixo
custo de pesquisa, fácil manuseio e disponibilidade de utilização de várias
raças com diferentes estados microbiológicos e imunológicos
62,127
. Além disso,
estudos longitudinais da doença periodontal inflamatória em humanos levantam
vários problemas como a determinação do nível de atividade da doença, riscos
Discussão
107
individuais e susceptibilidade à progressão da doença. Então, é importante
escolher um modelo animal experimental que compartilhe características
semelhantes com relação à anatomia e à doença periodontal inflamatória
humana
127
. Entre as inúmeras vantagens de se estudar uma doença
experimentalmente induzida é poder observar, desde por meio da mais
tradicional metodologia até aquelas mais variadas e modernas, seu curso ao
longo do tempo, a fim de se compreender sua patogênese e definir a melhor
forma de tratá-la
62
.
Assim, a fim de posicionar definitivamente a efetividade dos
medicamentos na redução da doença periodontal inflamatórias experimentais
são necessárias comprovações clínicas de médio e longo prazo, que possam
demonstrar o desempenho dos medicamentos. Embora conscientes de
algumas limitações, optamos por este modelo experimental, utilizando ligadura,
para estudar o processo inflamatório na doença periodontal e a presença de
algumas moléculas específicas, tomando-se o cuidado de evitar traumatizar os
tecidos próximos durante a realização da indução.
5.2 – Metodologia
Este trabalho foi desenvolvido em quatro etapas: Análise Microscópica,
RT-PCR, Western Blot e Imunohistoquímica.
Os cortes histológicos para a realização da análise microscópica e
imunohistoquímica foram obtidos com 5 µm de espessura, em micrótomo
rotatório, de acordo com a rotina do Laboratório de Anatomia e Patologia do
Hospital das Clínicas de São Paulo, como utilizada em outros trabalhos
7,102
.
Discussão
108
A técnica de RT-PCR combina a síntese de cDNA, a partir de moldes de
RNA, com PCR para fornecer um método rápido e específico para análise da
expressão gênica. RT-PCR é usada para detectar e semi-quantificar a
expressão da mensagem, geralmente de pequenas quantidades de RNA
106
. No
presente estudo, o controle positivo, tanto para COX-2, VEGF, VEGFR-1 e
VEGFR-2, foi realizado com o gene -actina, utilizado em estudos por SANTOS
et al. (2002,2003)
107,108
. No laboratório de Farmacologia da FOB/USP, onde foi
realizado a RT-PCR, utiliza-se o gene -actina rotineiramente, fazendo parte do
protocolo de padronização dos resultados dos experimentos desenvolvidos.
Estudos do grupo do orientador deste trabalho comprovam que a expressão de
β-actina não se altera no decorrer da progressão da doença periodontal
102
.
O Western Blot é um método altamente específico para detectar
proteínas em um homogenato de células bem trituradas ou extrato de tecido
biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar, após
desnaturação, proteínas com pesos moleculares diferentes. As proteínas são
transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose, sobre a qual serão
usados como sonda anticorpo primário específico contra a proteína de
interesse e anticorpo secundário biotinilado associado peroxidase. A detecção
do sinal é obtida com adição de um substrato quimioluminescente para esta
peroxidase, sendo realizada revelação radiográfica para visualização (bandas).
No presente estudo, o controle positivo, para VEGF, foi realizado com rim de
camundongo, utilizado em estudos de AMARAL et al.(2001a,b,c)
2-4
, bem como
no laboratório de Fisiologia da Faculdade de Ciências – Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, onde foi realizado o Western Blot. Nos
Discussão
109
resultados encontrados neste estudo foi avaliada a quantidade de VEGF na
amostra que foi comparada entre grupos e períodos.
O termo imunohistoquímica compreende o processo de identificação de
antígenos em secções de tecidos com o auxílio de anticorpos específicos. Essa
reação se torna visível por meio de moléculas conjugadas aos anticorpos
utilizados. O anticorpo liga-se ao antígeno específico, que por sua vez é
reconhecido por um anticorpo secundário ao qual se liga um complexo
enzimático streptavidina-biotina-peroxidase. A peroxidase transforma uma
substância cromogênica, em geral a diaminobenzidina que confere a reação
positiva uma coloração acastanhada
20
. O anticorpo utilizado nesta pesquisa foi
policlonal. Os anticorpos policlonais são gerados a partir de vários clones, ou
seja, originam-se de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com
vários epítopos do antígeno, ou seja, reconhecem mais de um epítopo em um
mesmo antígeno. Já os monoclonais reagem apenas com um determinado
epítopo presente em um antígeno
20
. Neste estudo, utilizamos como controle
positivo pulmão de ratos, visto que o pulmão expressa grandes quantidades de
VEGF especialmente no epitélio alveolar e brônquico, nas células glandulares
do brônquio e em macrófagos alveolares ativados
122
.
5.3 – Precisão da Metodologia
Para a confiabilidade dos resultados desse trabalho, procurou-se
minimizar os erros dos métodos de mensuração empregados. Calculou-se a
precisão do investigador pelo erro sistemático intra-examinador. O erro
sistemático reflete uma falta de padronização do método, uma vez que o
examinador tende a sub ou superestimar os valores de suas medições de
Discussão
110
maneira inconsciente, de modo a direcionar os resultados de acordo com as
suas expectativas em relação às conclusões do estudo
31
.
Esses testes foram realizados entre a primeira e segunda medição das
mesmas amostras de RT-PCR, num intervalo de trinta dias. Para Western Blot
não calculamos o erro sistemático intra-examinador, pois o software Scion
Image® utilizado para medir a intensidade das bandas foi o mesmo usado para
RT-PCR. Assim, observou-se que erros na verificação da precisão da
metodologia desse estudo foram admissível (p=0,295), promovendo resultados
transparentes e fidedignos.
5.4 – Resultados
Comparações pertinentes entre os resultados obtidos neste trabalho em
relação a outros presentes na literatura devem ser conduzidas com cautela
devido à escassez de estudos sobre este assunto. É importante ressaltar que
este trabalho é único apesar da existência de alguns semelhantes. Mesmo
diante desta dificuldade, torna-se possível estabelecer parâmetros e avaliar o
estudo realizado.
Um dos objetivos do presente trabalho foi observar a perda óssea
alveolar e o efeito do meloxicam na progressão da doença periodontal
inflamatória experimental induzida por ligadura em ratos. Para isso, foram
analisados cortes microscópicos dos tecidos duro e mole, previamente
mantidos em EDTA, como se fossem material de biópsia. Comparando-se as
imagens obtidas em HE, podemos destacar a riqueza de detalhes fornecida
pela observação microscópica. Uma visão da relação entre o primeiro e o
Discussão
111
segundo molares inferiores, revelou o conseqüente acúmulo de agregados e
biofilme no fio e na própria superfície dentária, revelando a disposição do
infiltrado inflamatório, inclusive nas proximidades do tecido ósseo. As
características básicas da acentuada perda óssea alveolar foram bem definidas
no modelo experimental utilizado, o que não foi observado nas amostras
controle, fortalecendo o papel do biofilme dentário e do fio como um fator local
para o acúmulo do referido biofilme na iniciação da doença periodontal
inflamatória. Ainda, definimos os períodos iniciais como os mais
representativos da indução da doença em ratos, quando já se observam
alterações significativas na junção dentogengival e estabelecimento do
processo de reabsorção óssea. Nossos resultados estão de acordo com vários
outros trabalhos envolvendo a mesma metodologia de indução da doença
periodontal inflamatória em ratos, macacos e beagles, que relatam maior
exuberância da inflamação e da perda óssea alveolar nas primeiras duas
semanas após a colocação da ligadura, com diminuição consistente e gradual
até os períodos mais avançados de indução
1,11,66,93
. Além disso, o elevado
metabolismo destes animais acelera a cinética de evolução da doença, o que
acaba permitindo um estudo longitudinal em menor tempo, ao se comparar
com outras espécies.
Pela análise microscópica descritiva, nos diferentes períodos estudados,
observamos que os animais tratados com meloxicam (grupo 2) apresentaram
menor perda óssea alveolar quando comparados com os não tratados (grupo
1). Assim, diante dos resultados encontrados, sugere-se que o efeito do
meloxicam foi efetivo em diminuir a perda óssea alveolar. Este trabalho
apresentou resultados semelhantes aos de BEZERRA et al., 2000
11
. Estes
Discussão
112
autores observaram diferença estatisticamente significativa entre a reabsorção
do osso alveolar de ratos tratados e não tratados com meloxicam. Os animais
tratados apresentaram diminuição acentuada na reabsorção óssea. Nossos
resultados corroboram o estudo de LOHINAI et al., 2001
71
, que utilizando o
mesmo modelo de indução deste trabalho e tratamento com NS-398, notaram
redução na reabsorção óssea, sugerindo que esta droga desempenhou um
papel importante na inflamação gengival e na destruição do osso alveolar.
Estes resultados também foram relatados por outros autores suportando
os achados deste estudo. GURGEL et al., em 2004
50
, examinaram o efeito da
aplicação diária de meloxicam na progressão da doença periodontal
inflamatória e observaram significante diminuição da taxa de perda óssea.
HOLZHAUSEN et al., em 2005
55
, avaliaram o efeito da aplicação diária de
etoricoxib na progressão da doença periodontal inflamatória e também
observaram significante diminuição da taxa de perda óssea, sugerindo relação
positiva entre presença de COX-2, PGE
2
e severidade da doença periodontal.
O trabalho de NASSAR et al.,2005
82
, também elucidou o efeito do meloxicam
na progressão da perda óssea alveolar durante o desenvolvimento da doença
periodontal inflamatória experimentalmente induzida em ratos. Os resultados
do presente estudo sugeriram que o tratamento sistêmico com antiinflamatório
pode modificar a progressão da doença periodontal inflamatória experimental
no período inicial.
Com relação à análise molecular, similarmente ao estudo de AMARAL et
al. (2001a,c)
2,4
, as intensidades das bandas foram analisadas por um software,
no caso o Scion Image
®
, específico para esta finalidade. No presente estudo, a
expressão de RNAm para VEGF e COX-2 mostrou que os alvos estudados
Discussão
113
apresentaram correlação positiva (R=0,80) durante a progressão do processo
inflamatório. Esta correlação foi observada por PAI et al., em 2001
95
, relatando
que a inibição da atividade da COX-2 diminuiu significantemente a expressão
de VEGF, inibindo por conseqüência a angiogênese em tumores. Com este
propósito, GALLO et al., 2001
44
, também encontraram resultados
correlacionando VEGF e COX-2 em tumores.
Na análise estatística de RT-PCR houve diferença estatisticamente
significativa (p=0,023) na expressão de RNAm para VEGF na doença
periodontal inflamatória entre o grupo 1 e 2, no período de 14 dias. Nos animais
tratados com meloxicam (grupo 2) a expressão de RNAm para VEGF diminuiu
neste período. Este resultado foi confirmado pelo Western Blot. Nesta análise,
observou-se que a expressão da proteína VEGF apresentou diferença
estatisticamente significativa entre o lado sadio e o lado afetado pela doença
periodontal nos grupos 1 e 2, nos períodos de 3 (p=0,037), 7 (p=0,005) e 14
(p=0,008) dias. No lado da indução da doença periodontal o VEGF mostrou-se
mais expresso quando comparado com o controle. Porém, ressalta-se que no
período de 14 dias houve uma tendência para menor expressão da proteína
VEGF nos animais tratados com meloxicam (grupo 2) quando comparados com
os animais não tratados (grupo 1) (p= 0,08). Isto nos leva a crer que nos outros
períodos (3 e 7 dias) alguns fatores podem ter sido compensados por outros
mediadores químicos ou células, pois se a PGE
2
(via COX-2) aumenta a
expressão de VEGF, esperava-se que nos animais tratados com meloxicam o
VEGF estivesse menos expresso em todos os períodos. No período de 30 dias
não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos para os
alvos estudados. Isso foi confirmado pela análise microscópica. Sugere-se que
Discussão
114
neste período o organismo consiga frear a destruição tecidual, bloqueando o
processo inflamatório para a região cervical, sugerindo um quadro de tendência
a normalidade. Diante dos resultados encontrados, podemos sugerir que para
trabalhos futuros utilizando a metodologia apresentada, a indução experimental
até o período de 14 dias é suficiente para avaliação dos fenômenos em
resposta ao biofilme aderido à superfície dentária, simulando a doença
periodontal inflamatória, particularmente nas suas fases iniciais, em que se
evidencia a resposta imune inata.
Não sabemos exatamente o papel do VEGF na doença periodontal
inflamatória, mas ao verificar os resultados deste trabalho sugere-se que a
correlação entre COX-2 e VEGF possa influenciar alterações na
permeabilidade vascular, mostrando-se atuante na doença periodontal
inflamatória, uma vez que o tratamento com inibidor preferencial da COX-2
(meloxicam) foi efetivo em diminuir a perda óssea em todos os períodos
estudados.
O presente estudo validou relatos prévios da elevada concentração de
VEGF na doença periodontal inflamatória. Resultados encontrados na literatura
sugerem que na doença periodontal inflamatória ocorrem mudanças no tecido
periodontal de suporte e sustentação
13,23,58
. BOOTH et al. (1998)
13
relataram
que nos achados clínicos o VEGF está envolvido na doença periodontal
inflamatória. Os resultados mostraram que a concentração de VEGF no fluido
gengival é maior que no plasma. JOHNSON et al. (1999)
58
afirmaram que o
VEGF pode ser um fator de início na progressão da gengivite e periodontite,
possivelmente pela expansão da rede vascular na progressão da inflamação.
Sabe-se que nos tecidos inflamados, existem evidências do aumento da
Discussão
115
expressão de mediadores da inflamação e do aumento no número de vasos, os
quais contribuem para progressão da doença periodontal inflamatória
23
.
A técnica imunohistoquímica com anticorpos para o VEGF demonstrou,
nos grupos 1 e 2, que no lado afetado pela doença periodontal inflamatória
houve maior número de imunomarcações positivas em comparação com o lado
sadio. Entretanto, quando observamos os animais tratados com meloxicam e
os não tratados, menor número de marcações foi nitidamente notado nos
animais tratados. Encontramos na literatura alguns trabalhos que utilizaram o
VEGF para a marcação das células endoteliais como o trabalho de ZHANG et
al., 2001
131
, em que os autores demonstraram que a marcação positiva para o
VEGF não foi somente encontrada nas células endoteliais, mas também em
neutrófilos. No presente trabalho, as células endoteliais e os neutrófilos foram
intensamente marcados por este anticorpo. Esta imunomarcação sustenta a
afirmação da presença ativa do VEGF na doença periodontal inflamatória.
Investigações futuras poderão ajudar elucidar o papel da expressão de VEGF
pelas células endoteliais, macrófagos e neutrófilos na doença periodontal
inflamatória.
Além disso, há evidências na literatura da interação entre PGE
2,
COX-2
e VEGF como relataram MAJIMA et al., em 2000
73
, em respostas comparativas
avaliando tumores. Após a descoberta do VEGF
39
, muitos estudos
preocuparam-se em entender suas funções e mecanismos em eventos
fisiológicos e patológicos
38,42,58,63,88,119
. O VEGF é em grande parte responsável
pelo estímulo da proliferação e diferenciação de células endoteliais, e,
conseqüentemente, pelo aumento da permeabilidade vascular e formação de
novos vasos sangüíneos, sendo um potente fator angiogênico
37,77
. Portanto,
Discussão
116
sua alta expressão durante o período de inflamação contribui para a formação
de edema e conseqüente dor. Nos últimos anos foram observadas interações
importantes deste fator de crescimento com a progressão de tumores sólidos e
revascularização dos tecidos isquêmicos
18,67
, o que despertou grandes
interesses científicos e comerciais, na tentativa de desenvolvimento de novas
terapias voltadas para o tratamento e controle do câncer. A angiogênese está
intimamente relacionada com o crescimento, progressão e metástase dos
tumores. Autores descreveram a interação entre PGE
2,
COX-2 e VEGF na
progressão de tumores
35,44,95
. A COX-2 catalisa a formação de PGE
2,
a qual
aumenta a expressão de VEGF, aumentando a permeabilidade vascular e a
angiogênese. Portanto, ao estimular as células endoteliais, o VEGF
desempenha papel fundamental na angiogênese. No presente trabalho, o
estudo da angiogênese na doença periodontal inflamatória foi iniciado
utilizando a imunomarcação para CD31 (PECAM-1) expresso pelas células
endoteliais. Infelizmente, até o momento os resultados não são numerosos os
quais nos impedem de sugerir ou especular qualquer análise conclusiva.
De acordo com os conhecimentos, através da literatura, sabe-se que
para que ocorra a transdução do sinal, não basta somente à proteína estar
disponível na matriz extracelular. A presença de um receptor protéico é
essencial para permitir a ligação da molécula sinalizadora. A partir desta
ligação uma cascata de eventos (sinalização) é iniciada e o comportamento
celular direcionado de acordo com o tipo de célula-alvo
61
. Os estudos ainda
hoje não relatam um entendimento completo sobre as propriedades individuais
de cada receptor na sinalização do VEGF
35,130
. Os receptores VEGFR-1 e o
VEGFR-2 são expressos pelas células endoteliais da parede vascular. A união
Discussão
117
do VEGF a esses receptores inicia uma cascata de eventos que finalmente
estimula o crescimento, sobrevivência e proliferação das células do endotélio
vascular
89
. As células endoteliais desempenham funções em variados
processos como vasoconstrição e vasodilatação, apresentação de antígenos e
são componentes essenciais dos vasos sangüíneos, capilares, veias e artérias.
O que se sabe é que o VEGFR-1 desempenha a função de forma a limitar a
ligação do VEGF ao VEGFR-2, modulando, assim, a sua atividade, sendo
também um receptor capaz de gerar, de alguma forma, um sinal
mitogênico
34,38
. A literatura é unânime sobre as propriedades biológicas do
VEGFR-2, caracterizando-o como um receptor de maior importância no
processo de angiogênese e aumento dos efeitos da permeabilidade do VEGF,
estando o mesmo envolvido no processo de diferenciação das células
endoteliais
38,83
quimiotaxia e sobrevivência celular
38,130
. Por essa razão, o
VEGFR-1 e o VEGFR-2 foram alvos deste estudo. Entretanto, a expressão de
RNAm para os seus receptores VEGFR-1 e o VEGFR-2 não mostrou diferença
estatisticamente significativa entre o lado controle e o lado da doença
periodontal, nos animais tratados ou não com meloxicam. Sendo assim, o
meloxicam não alterou a expressão dos receptores para VEGF.
Portanto, a análise conjunta dos dados sugere importante participação
do VEGF na progressão da doença periodontal e que o inibidor preferencial da
COX-2 pode diminuir a perda óssea neste modelo experimental por diminuir a
expressão de VEGF. Esta sugestão tem respaldo em resultados recentes da
literatura que mostraram a participação do VEGF na perda óssea em outro
modelo experimental
100
.
Discussão
118
Sabe-se que o desequilíbrio na sinalização entre células e moléculas
leva a uma resposta inflamatória do organismo, dando início à doença
101
.
Diante dos resultados encontrados no presente trabalho e dos achados da
literatura, avalia-se o quão importante é entender o processo inflamatório.
Estamos exaustos de estudar e procurar respostas para eventos, nos quais, a
doença encontra-se instalada. Isso resolve o problema temporariamente.
Precisamos de resultados que permitam intervenção local, bloqueando, assim,
o início e desenvolvimento do processo inflamatório. Após o estabelecimento
da correlação positiva entre COX-2 e VEGF na doença periodontal inflamatória,
vários estudos precisam ser realizados com a necessidade de observações
que não se restrinjam somente às conseqüências da doença, mas para o
entendimento dos processos moleculares que levam à instalação da patologia.
Mesmo com a falta de evidências científicas, este trabalho não nos deixa
dúvida de que os resultados encontrados indicam importante relação entre
COX-2, VEGF e drogas antiinflamatórias preferenciais para COX-2 na doença
periodontal.
5.5 – Uso de antiinflamatórios na odontologia
A grande maioria das afecções odontológicas tem sua etiologia nos
processos inflamatórios. Como observamos, o controle da inflamação e de
suas conseqüências pode ser abordado por diversos meios, principalmente
levando-se em conta a fisiologia do organismo humano
49,109
.
Os antiinflamatórios são indicados em processos inflamatórios
clinicamente relevantes, em que a dor, o edema e a disfunção decorrentes
Discussão
119
trazem desconforto ao paciente. Não devem ser administrados quando o
atendimento odontológico provocar apenas dor, sendo, neste caso, indicado o
uso de analgésicos
90
. Assim, conforme o procedimento odontológico realizado
pode-se indicar o uso dos antiinflamatórios, o que diminui a intensidade e a
duração do processo inflamatório, atenuando assim a dor, o edema e a
hipertermia local. Porém, é muito importante estar atento aos seus possíveis
efeitos colaterais e reações adversas
90
. No momento de sua prescrição, deve-
se levar em conta o estado geral de saúde e as características individuais do
paciente, uma vez que mal indicado e, principalmente, mal prescrito, sua
agressão pode superar o seu benefício.
Na tentativa de promover maior conforto ao paciente, as ciências da
saúde vêm se preocupando constantemente com o desenvolvimento de
mecanismos e técnicas capazes de minimizar os sinais clássicos da
inflamação, como dor e edema. A utilização de antiinflamatórios tem por
objetivo melhorar o resultado clínico e possibilitar a mínima interferência na
rotina de vida do paciente, contribuindo para a maior qualidade de vida.
5.6 – Implicações clínicas
Os reflexos da evolução dos conhecimentos genéticos têm sido
profundamente sentidos em todas as especialidades odontológicas. De fato,
nenhum profissional da saúde, que pretenda exercer suas funções de forma
consciente e responsável, pode estar à parte da revolução genética ocorrida
nas últimas décadas. A barreira que divide a ciência básica da aplicada, a qual
sempre foi tênue, está agora a ponto de desaparecer. Cada vez mais os
clínicos necessitarão acompanhar as novas informações científicas.
Discussão
120
A partir do momento em que as bases moleculares de desordens
geneticamente complexas forem entendidas da mesma maneira que aquelas
mais comuns será possível diagnosticar a suscetibilidade da doença antes do
seu início em indivíduos de risco e iniciar as estratégias de intervenção. O tema
comum por trás de todos esses avanços é que a detecção precoce e
diagnóstica da doença pode ser facilitada pela aplicação das técnicas de
biologia molecular
104
. Os dentistas do futuro próximo deverão ser capazes de
prevenir efetivamente as doenças e promover saúde por meio dessas técnicas
de diagnóstico. A identificação de alvos moleculares de agentes ambientais nos
ajudará a entender o processo da doença e desenvolver estratégias de
tratamento apropriadas. Em tais casos, o entendimento da causa da doença
exercerá papel chave em testes pré-sintomáticos para identificar e determinar
estratégias de tratamento efetivo aos indivíduos de risco
106
. Estas informações
poderão contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos
na doença periodontal, os quais serão úteis nas terapias preventivas e
curativas da doença periodontal inflamatória, pois sendo destrutiva com a
perda de inserção, é responsável pela perda de vários elementos dentários
com o avanço da idade, tendo seu início provavelmente na infância a partir da
instalação de uma gengivite inflamatória crônica.
Com base nos resultados desta pesquisa, propomos a realização de
futuros trabalhos utilizando este modelo de estudo. As modernas técnicas de
análise e manipulação genética associadas a métodos de análise bioquímica
de ácidos nucléicos e de proteínas estão permitindo que modificações sejam
introduzidas nos organismos. Sabemos que a procura por soluções e materiais
ideais para qualquer área de conhecimento dentro da Odontologia, atualmente,
Discussão
121
deve estar direcionada ao conhecimento de proteínas expressas pelo nosso
próprio organismo às quais, com o auxílio dos princípios de biologia molecular
e terapia genética poderão vir a ser investigadas para que, desse modo, os
resultados laboratoriais possam ser transportados para a clínica odontológica.
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Conclusão
125
6. CONCLUSÃO
A análise conjunta dos resultados obtidos neste trabalho, com a
utilização de diferentes técnicas, permite sugerir que:
Existe participação importante do VEGF na doença periodontal
inflamatória induzida experimentalmente em ratos e o meloxicam, inibidor
preferencial da COX-2, pode modificar a progressão da doença periodontal
neste modelo experimental por diminuir a perda óssea e a expressão de VEGF.
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A
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A
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Abstract
143
Abstract
Expression of VEGF on the progression in experimental periodontitis in rats
Inflammatory periodontal disease is characterized by alveolar bone loss
and inflammatory changes in the periodontal tissues, which become
hemorrhagic and edematous. However, there is little information concerning the
biologic mechanisms which may produce these changes. Vascular endothelial
growth factor (VEGF) is a macromolecule of importance in inflammation. The
aims of this study were to investigate the presence of VEGF during progression
of periodontal disease, and to evaluate the effect of a preferential COX-2
inhibitor, meloxicam, on the alveolar bone loss and VEGF expression in
experimentally induced periodontitis. One hundred and twenty (120) Wistar rats
were randomly separated into two groups [group 1 (no treatment with
meloxicam) and group 2 (treatment with meloxicam)]. Silk ligatures were placed
at the gingival margin level of the lower right first molar of all rats. Group 2 was
treated for 3, 7, 14 and 30 days with meloxicam (3 mg/kg/day, intraperitoneal)
and the group 1 was used as control. The expression of VEGF was assessed
by RT-PCR, Western Blot and immunohistochemical analysis. Alveolar bone
loss was determined by microscopic analysis. The results were submitted to the
analysis of Correlation Coefficient by Pearson, Analysis of Variance (ANOVA),
and Tukey’s post test (p<0.05). A reduction of the alveolar bone resorption was
observed in the meloxicam treated group (2), as compared with the control
group (1) in all periods studied. There was a positive correlation between COX-
2 mRNA and VEGF mRNA in the gingival tissue with periodontal disease
(R=0.80). VEGF mRNA expression was significantly lower in rats treated with
Abstract
144
meloxiam after 14 days (p=0.023). No difference in the expression of VEGFR-1
mRNA and VEGFR-2 mRNA was observed for all the periods studied. VEGF
protein expression was significantly higher in diseased sites as compared with
healthy sites (p<0.05). After 14 days lower VEGF protein expression in rats
treated with meloxicam was detected (p=0.08). Altogether these data suggest
an important participation of VEGF in the progression of periodontal disease,
and the systemic therapy with meloxicam, preferential COX-2 inhibitor, can
modify the progression of experimentally induced periodontitis in rats by
reducing the alveolar bone loss and the VEGF expression.
KEY-WORDS: Anti-inflammatory. Cyclooxygenase-2. Periodontal disease.
Vascular endothelial growth factor. Inflammation. Meloxicam. Alveolar bone
loss.
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