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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE BAURU
THIAGO CRUVINEL DA SILVA
Estudo in vivo dos efeitos biomoduladores de um laser em
baixa intensidade no fator de crescimento endotelial vascular
BAURU
2007
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
THIAGO CRUVINEL DA SILVA
Estudo in vivo dos efeitos biomoduladores de um laser em baixa
intensidade no fator de crescimento endotelial vascular
Área de concentração: Odontopediatria
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Maria Aparecida de Andrade
Moreira Machado
BAURU
2007
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, da Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Odontologia
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Silva, Thiago Cruvinel da
Si38e Estudo in vivo dos efeitos biomoduladores de um
laser em baixa intensidade no fator de crescimento
endotelial vascular/Thiago Cruvinel da Silva. – Bauru,
2007.
154 p.: il.; 31 cm.
Dissertação. (Mestrado) – Faculdade de
Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Maria Aparecida de Andrade
Moreira Machado
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a
reprodução total ou parcial desta dissertação/tese, por processos
fotocopiadores e/ou meios eletrônicos.
Assinatura do autor:_____________________________________
Data: ____/_____/______
Comitê de Ética da FOB-USP: Projeto de pesquisa aprovado
Protocolo n
o
: 02/2005
Data: 04/04/2005
THIAGO CRUVINEL DA S
THIAGO CRUVINEL DA STHIAGO CRUVINEL DA S
THIAGO CRUVINEL DA SILVA
ILVAILVA
ILVA
Dados Curriculares
04 de março de 1979
São José do Rio Preto - SP
Nascimento
Filiação
Antonio Carlos Pereira da Silva
Maria Isabel R. Cruvinel F. Monteiro
1999 - 2003
Curso de Graduação em Odontologia
– Faculdade de Odontologia de Bauru
da Universidade de São Paulo - USP
2005 - 2007
Curso de Pós-graduação em
Odontologia, área de Odontopediatria,
nível Mestrado – Faculdade de
Odontologia de Bauru da Universidade
de São Paulo – USP, com bolsa CNPq
Associações
• CROSP – Conselho Regional de
Odontologia
• SBPqO – Sociedade Brasileira de
Pesquisa Odontológica
DEDICATÓRIA
A Deus
DeusDeus
Deus, força motriz do universo, que em nós deposita uma pequena
parte de sua energia para podermos caminhar em paz, em busca de nossa
felicidade. Sua presença é notada nas mínimas coisas. Agradeço pela vida
maravilhosa que possuo. Graças a Ti nunca estarei sozinho no mundo.
Enquanto eu crer na Tua existência nada me faltará. Obrigado Senhor.
À minha querida mãe, Maria Isabel
Maria IsabelMaria Isabel
Maria Isabel e meu padrasto, João Monteiro
João MonteiroJoão Monteiro
João Monteiro,
pelo apoio e incentivo incondicionais. Vocês são meu porto seguro, pessoas
com que posso contar em todos os momentos difíceis e desanimadores.
Agradeço a Deus todos os dias por poder desfrutar de suas companhias e
experiências.
Ao meu pai, Antonio Carlos
Antonio CarlosAntonio Carlos
Antonio Carlos, Cirurgião Dentista, que mesmo distante
me mostrou como é importante acreditar e lutar para que barreiras até então
intransponíveis sejam superadas de forma aparentemente simples.
Ao meu irmão, Diogo
DiogoDiogo
Diogo, amigo sensato e conselheiro. Sua forma de
agir e pensar sempre influenciaram minhas condutas perante a vida. Com você
aprendi a lutar, respeitando sempre as opiniões alheias e fortalecendo minhas
próprias convicções.
Ao meu grande amor, Agnes
AgnesAgnes
Agnes, exemplo constante de dedicação e
companheirismo. Agradeço por todos os momentos que você esteve ao meu
lado, compartilhando desejos, frustrações e realizações. Minha caminhada teria
sido muito mais árdua sem sua presença. Você representa uma grande razão
para que eu continue buscando meus objetivos. Obrigado.
Ao meu primo e padrinho, Gustavo
GustavoGustavo
Gustavo, pessoa fundamental na escalada de
mais um degrau. Nunca vou esquecer da sua disposição em ajudar e incentivar
minhas conquistas. Guardo como exemplos importantes sua generosidade e
abdicação.
Aos meus avós, Edson
EdsonEdson
Edson e Neuza
NeuzaNeuza
Neuza, pela vitalidade, amor, perseverança e
exemplos de uma vida digna. Seus ensinamentos ecoam e transgridem épocas
ou costumes. A voz de suas experiências me acompanhará eternamente.
A vocês, com todo amor, carinho e admiração, dedico este trabalho.
A vocês, com todo amor, carinho e admiração, dedico este trabalho.A vocês, com todo amor, carinho e admiração, dedico este trabalho.
A vocês, com todo amor, carinho e admiração, dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Mais que um trabalho realizado, esta pesquisa representa o ponto de
chegada do curso de Mestrado em Odontopediatria. Sinto-me feliz em ter
partilhado momentos de aprendizado tão intenso, seja ele profissional ou
pessoal. Os contatos pessoais enriqueceram minhas experiências,
possibilitando vencer desafios com mais coragem e determinação. Graças a
vocês, hoje posso me considerar um profissional mais completo e preparado.
Agradeço profundamente:
À Prof
ProfProf
Prof
a
a a
a
Dr
DrDr
Dr
a
a a
a
Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado
Maria Aparecida de Andrade Moreira MachadoMaria Aparecida de Andrade Moreira Machado
Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado, minha
orientadora desde a graduação, verdadeira mestre, condutora dos meus
princípios didáticos e científicos. Nossa convivência proporcionou a mim
crescimento profissional e o mais importante, pessoal. Sou
verdadeiramente grato por sua determinação, exigência e motivação.
Sei como foi difícil conseguir concretizar a viabilidade deste estudo, o
que me incentivou ainda mais para continuar. Sinto-me, aqui,
responsável por representar seu nome e sua reputação profissional.
Espero ter correspondido a suas expectativas.
Ao Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos
Prof. Dr. Carlos Ferreira dos SantosProf. Dr. Carlos Ferreira dos Santos
Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos, co-orientador deste trabalho.
Professor de magnífica didática, extremamente exigente e detalhista,
sempre preocupado em ajudar e solucionar problemas referentes aos
seus alunos, até mesmo os pessoais. Sinto-me honrado em poder ter
participado, mesmo que de forma fugaz, da sua equipe de trabalho.
Ao Prof. Dr. Vanderlei Salvador Bagnato
Prof. Dr. Vanderlei Salvador BagnatoProf. Dr. Vanderlei Salvador Bagnato
Prof. Dr. Vanderlei Salvador Bagnato, colaborador imprescindível na
execução deste estudo. O curso realizado em São Carlos foi
fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos da
laserterapia em baixa intensidade. Além disso, a parceria voluntária com
a FOB/USP, cedendo materiais e equipamentos, foi um exemplo de
postura de um cientista tão reconhecido e respeitado. Espero ainda
poder contar muito com seus ensinamentos. Obrigado.
À Faculdade de Odontolog
Faculdade de OdontologFaculdade de Odontolog
Faculdade de Odontologia de Bauru
ia de Bauru ia de Bauru
ia de Bauru –
––
– USP
USP USP
USP, na pessoa do senhor diretor,
Prof. Dr. Luiz Fernando Pegoraro, e da senhora coordenadora de pós-
graduação, Prof
a
Dr
a
Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado.
À Prof
ProfProf
Prof
a
a a
a
Dr
DrDr
Dr
a
a a
a
Salete Moura Bonifácio da Silva
Salete Moura Bonifácio da SilvaSalete Moura Bonifácio da Silva
Salete Moura Bonifácio da Silva, coordenadora do curso de
mestrado em Odontopediatria, professora a que eu constantemente
recorri para solucionar questões clínico-didáticas. Sua contribuição para
minha formação como mestre foi fundamental. Apesar de sua sólida
formação acadêmica e científica, sempre esteve atenta às questões
didáticas que interferiam na qualidade de aprendizagem dos alunos de
graduação. Com isso, transmitiu a mim a essência e importância de um
professor universitário da área de saúde: promover o bem social através
da formação de recursos humanos mais qualificados para o exercício
profissional.
Ao Prof. Dr. Ruy César Camargo Abdo
Prof. Dr. Ruy César Camargo AbdoProf. Dr. Ruy César Camargo Abdo
Prof. Dr. Ruy César Camargo Abdo e Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira
Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira
Prof. Dr. José Eduardo de Oliveira
Lima
LimaLima
Lima, incentivadores constantes da busca pelo aperfeiçoamento clínico,
a essência da Odontologia de qualidade. Filósofos, seus pensamentos
simples, adquiridos depois de anos de experiência, traduzem ao aluno
sua maior necessidade, segurança para enfrentar o que lhes espera
pela frente.
Ao Departamento de Ciências Biológicas, Disciplinas de Farmacologia,
Departamento de Ciências Biológicas, Disciplinas de Farmacologia, Departamento de Ciências Biológicas, Disciplinas de Farmacologia,
Departamento de Ciências Biológicas, Disciplinas de Farmacologia,
Fisiologia
FisiologiaFisiologia
Fisiologia, Histologia e Anatomia
Histologia e AnatomiaHistologia e Anatomia
Histologia e Anatomia por propiciarem e facilitarem a realização
deste trabalho através da concessão de seus materiais e equipamentos.
Agradeço aos professores, Dr. Alceu, Dr
a
Inge, Dr. Flávio, Dr. Jesus, Dr.
Gérson, Dr. Rumio, bem como à secretária Vera, ao mirim Thiago, às
funcionárias Dani e Tânia, sempre muito prestativos, bem-humorados e
extremamente profissionais.
Ao Thiago José Dionísio
Thiago José DionísioThiago José Dionísio
Thiago José Dionísio, técnico do laboratório de Fisiologia e
Farmacologia, muito competente e extremamente participativo,
responsável por solucionar diversos problemas ocorridos no transcorrer
deste trabalho. Sua ajuda tornou minha caminhada mais simples e
transmitiu segurança em momentos difíceis. Muito obrigado.
À Dr
DrDr
Dr
a
a a
a
Elza
ElzaElza
Elza, profissional do setor de Imunogenética do Hospital de
Reabilitação de Anomalias Craniofaciais – USP (Centrinho), pela
solicitude e pronta permissão na utilização de equipamentos daquele
setor. Pessoas como você são imprescindíveis para o aprimoramento
técnico e científico de jovens pesquisadores brasileiros.
Ao Prof. Dr. José Roberto Pere
Prof. Dr. José Roberto PereProf. Dr. José Roberto Pere
Prof. Dr. José Roberto Pereira Lauris
ira Laurisira Lauris
ira Lauris, pela sempre atenciosa forma de
nos atender e realizar a análise estatística de nossas pesquisas. Sua
ajuda é crucial para a aceitação de nossos trabalhos em revistas de alto
impacto científico.
Aos funcionários do biotério central da FOB/USP, Luiz
LuizLuiz
Luiz, Erasmo
ErasmoErasmo
Erasmo, Elias
EliasElias
Elias e
Richard
RichardRichard
Richard , sempre tão prestativos e cuidadosos. A qualidade do trabalho
desta equipe foi fundamental para os bons resultados alcançados neste
intento.
À Fátima
FátimaFátima
Fátima, D. Lia
D. LiaD. Lia
D. Lia, Estela
EstelaEstela
Estela, Lilian
LilianLilian
Lilian e Peterson
PetersonPeterson
Peterson, funcionários da
Odontopediatria, pelo respeito, carinho, compreensão e profissionalismo.
Vocês foram essenciais para o bom andamento de nossas atividades.
Conseguimos integrar uma equipe de trabalho saudável, alternando
momentos de muita seriedade e descontração.
À Thaís
Thaís Thaís
Thaís e Vivien
Vivien Vivien
Vivien, pela amizade, companheirismo e profissionalismo.
Nossas relações foram estreitadas por uma série de coincidências, a
começar pela orientadora e co-orientador. Porém, nosso trabalho em
conjunto foi tão produtivo e prazeroso que acabamos desenvolvendo
coisas até então impensáveis, pelo menos para mim. Aprendi muito com
vocês durante esses anos. Graças a Deus pude contar com a ajuda de
duas pessoas tão competentes. Agora, espero podermos continuar
trabalhando de alguma forma juntos. Muito obrigado, de coração.
À Ana
Ana Ana
Ana Paula
PaulaPaula
Paula, Dafna
DafnaDafna
Dafna e Vivian
VivianVivian
Vivian, colegas e amigas do curso de mestrado,
as quais me ajudaram a entender a importância de opiniões divergentes
para o crescimento de um grupo de trabalho. Com o passar dos dias,
acabamos formando uma grande equipe com poucos participantes.
Conseguimos interagir com os colegas do doutorado, participar de
projetos inovadores e aumentar o nível de nossas responsabilidades.
Arriscamos e muitas vezes acertamos. Sinto orgulho de ter participado
de uma turma tão pequena e com tantos frutos, os quais já começaram
a ser colhidos. Desejo muita felicidade e sucesso profissional para todas
vocês.
À Tiza
TizaTiza
Tiza, Andréa
AndréaAndréa
Andréa e Evaristo
EvaristoEvaristo
Evaristo, amigos do curso de doutorado, com os quais
tive a honra de conviver de forma tão afável e próxima. Nossas
experiências foram muito valiosas para o meu aprimoramento humano.
Cada um de vocês, ao seu modo, contribuiu muito para que eu tomasse
novas decisões e planejasse outras etapas da minha vida.
Ao Adriano
AdrianoAdriano
Adriano, Dani Rios
Dani RiosDani Rios
Dani Rios, Érica
ÉricaÉrica
Érica, Gládis
GládisGládis
Gládis, Heitor
HeitorHeitor
Heitor, Leandra
LeandraLeandra
Leandra, Marcelo
MarceloMarcelo
Marcelo e Marina
MarinaMarina
Marina,
amigos e verdadeiros professores. Vocês foram peças fundamentais na
minha caminhada rumo à pós-graduação. Meu ano de estágio dentro da
Odontopediatria tornou-se muito mais produtivo graças ao nosso
convívio.
Aos meus tios
tiostios
tios e primos
primosprimos
primos, tão importantes durante a minha caminhada
pessoal e profissional. Fazer parte de uma família de cirurgiões-
dentistas torna o momento da conclusão deste curso ainda mais
especial. Obrigado por estarem sempre presentes em minha vida,
mesmo que não conseguindo partilhar constantemente de suas
companhias.
À D. Ondina
D. OndinaD. Ondina
D. Ondina e Hermes
HermesHermes
Hermes, pela simplicidade e hospitalidade em que sempre
me receberam em sua casa. Espero logo ser admitido na família.
Prometo tentar fazê-la crescer mais ainda, dentro em breve. Muito
obrigado por todos os cuidados que vocês tiveram comigo esses anos.
Sinto-me honrado em ter tido a oportunidade de tê-los conhecido.
Aos meus amigos Bruno Vidoti
Bruno VidotiBruno Vidoti
Bruno Vidoti (Kiwi), Carlos Eduardo
Carlos EduardoCarlos Eduardo
Carlos Eduardo (Baiacu), Carol
Carol Carol
Carol
Magalhães
MagalhãesMagalhães
Magalhães, Danilo
DaniloDanilo
Danilo (Tonto), Danilo Costa Marques
Danilo Costa MarquesDanilo Costa Marques
Danilo Costa Marques (Verme), Eduardo
EduardoEduardo
Eduardo
(Noel), Fábio Shiratori
Fábio ShiratoriFábio Shiratori
Fábio Shiratori (Xang), Fernando
FernandoFernando
Fernando (Ozzy), Humberto
HumbertoHumberto
Humberto (Sossego),
Juliano
JulianoJuliano
Juliano (Jaca), Leonardo
LeonardoLeonardo
Leonardo, Marcelo
MarceloMarcelo
Marcelo (Diastema), Marcelo
MarceloMarcelo
Marcelo Hamata
HamataHamata
Hamata (Kzo
Raro), Marcos Massaharu
Marcos MassaharuMarcos Massaharu
Marcos Massaharu (Mano), Miguel
MiguelMiguel
Miguel, Otávio
OtávioOtávio
Otávio (Alemão), Moacyr Tadeu
Moacyr TadeuMoacyr Tadeu
Moacyr Tadeu,
Renato Yaedú
Renato YaedúRenato Yaedú
Renato Yaedú (Índio), Renato Salina
Renato SalinaRenato Salina
Renato Salina (Barata), Ricardo Henrique
Ricardo HenriqueRicardo Henrique
Ricardo Henrique (Napão),
Ricard
RicardRicard
Ricardo Chaguri
o Chagurio Chaguri
o Chaguri (Ostra), Prof.
Prof. Prof.
Prof. Dr. Rodrigo
Dr. RodrigoDr. Rodrigo
Dr. Rodrigo (Rodrigão), Rodrigo
RodrigoRodrigo
Rodrigo (Elias), Tati
Tati Tati
Tati
Sales
SalesSales
Sales (Nazaré), William
WilliamWilliam
William (Palito), que compartilharam sonhos, desejos,
alegrias, tristezas, comemorações e desabafos. Tenho certeza que
durante esses anos de mestrado fui muitas vezes chato, impertinente,
ranzinza e extremamente senil. Isso faz com que eu respeite ainda mais
cada um de vocês, afinal de contas sempre foram muito tolerantes.
Espero poder continuar contando com vocês. Às vezes me calo diante
da necessidade e importância da amizade. Porém, nem por isso amo-os
menos.
Aos Pacientes
PacientesPacientes
Pacientes, crianças que despertaram em mim o interesse em ajudá-
las, desbravando o tão interessante e complexo universo infantil. A
vocês dedico meus estudos e aspirações pessoais e profissionais.
À MMOptics
MMOpticsMMOptics
MMOptics
pela concessão do equipamento “Twin Laser”,
indispensável para realização deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo apoio financeiro concedido durante a realização deste estudo.
“
““
“O que sou eu, gritei um dia para o infinito
O que sou eu, gritei um dia para o infinitoO que sou eu, gritei um dia para o infinito
O que sou eu, gritei um dia para o infinito
E o meu grito subiu, subiu sempre
E o meu grito subiu, subiu sempreE o meu grito subiu, subiu sempre
E o meu grito subiu, subiu sempre
Até se diluir na distância
Até se diluir na distânciaAté se diluir na distância
Até se diluir na distância.”
.”.”
.”
Vinícius de Moraes
Resumo
ResumoResumo
Resumo
RESUMO
A irradiação laser em baixa intensidade (LLLT) pode promover
acelerada epitelização, maior grau de vascularização e aumento da síntese de
colágeno nas feridas cirúrgicas. Porém, poucas são as evidências
demonstrando que a LLLT influencie diretamente na expressão do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF). Este estudo investigou e correlacionou
a cinética de expressão de RNAm
para VEGF-A
165
durante o processo de
reparo tecidual de feridas em língua de ratos, irradiadas (grupo GIII) ou não
irradiadas (grupo GII) com o laser diodo GaAlAs. Foram realizadas pesagens
sistemáticas (dias 0, 1, 2, 4 e 6) para estudar os padrões de crescimento e
desenvolvimento dos animais. Animais não operados (grupo controle, GI) foram
utilizados para posteriores comparações estatísticas dos valores de variação
de peso (análise de variância a um critério, teste de Tukey, p<0,05). Após a
cirurgia (dia 0), duas sessões de irradiação laser foram realizadas, uma logo
após o procedimento operatório (laser infravermelho, 35 J/cm
2
) e a segunda,
48h após o início do experimento (laser vermelho visível, 5 J/cm
2
). Os animais
foram sacrificados 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, para obtenção de amostras
de tecido lingual através de biópsia. O RNA total foi extraído pela utilização do
método guanidino-isotiocianato-fenol-clorofórmio. Após a transcrição reversa –
reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), os resultados da eletroforese
horizontal permitiram avaliar a razão da expressão de RNAm para GAPDH e
VEGF-A
165
nos grupos GI, GII e GIII (análise de variância a dois critérios, teste
de Tukey, p<0,05). A média de variação de peso dos animais do grupo GII foi
ao mesmo tempo maior que a do grupo GIII e menor que a do grupo GI em
todos os dias de análise, observando-se diferença estatisticamente significativa
(p<0,05). Apenas durante o sexto dia, não foram observadas diferenças
significativas entre as médias de variação de peso dos grupos GII e GIII
(p=0,220) e GI e GII (p=0,409). Os valores da expressão de RNAm para VEGF-
A
165
no grupo GII foram estatisticamente maiores que os do grupo GI
(p=0,0285) e GIII (p=0,0101) no primeiro dia de análise. Não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas entre os grupos GI, GII e GIII quando
comparados nos demais períodos de tempo. Portanto, o laser diodo GaAlAs foi
capaz de biomodular a expressão do RNAm para VEGF-A
165
durante o primeiro
dia do processo de reparo tecidual de feridas em língua de ratos.
Palavras-chave: cicatrização de feridas, terapia a laser de baixa intensidade,
fator de crescimento endotelial vascular, ratos.
Abstract
AbstractAbstract
Abstract
ABSTRACT
In vivo study of the biomodulator effects of low level laser
therapy on vascular endothelial growth factor
Low level laser therapy (LLLT) can promote accelerated
epithelization, greater of vascularization and increase of collagen synthesis in
surgical wounds. However, few evidences proved that LLLT directly influence in
the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF). This study
investigated and correlated the kinetic of expression of mRNA VEGF-A
165
during the tissue repair of wounds in tongues of irradiated (group GIII) or not
irradiated rats (group GII) with GaAlAs diode laser. Systematic weighings were
performed on days 0, 1, 2, 4 and 6 to study the growth and development
standards of the rats, using not operated animals (control group, GI) for future
statistical comparisons (one-way ANOVA and Tukey’s test, p<0.05). Two
sessions of laser irradiation were accomplished, the first one right after the
surgical procedure (infrared laser, 35 J/cm
2
) and the second one, 48h after of
the beginning of the experiment (visible red laser, 5 J/cm
2
). The animals were
sacrificed on days 1, 3, 5 and 7 and samples of tongue tissue were obtained.
The total RNA was extracted by using of guanidine-isotiocianate-phenol-
chloroform method. After the reverse transcription – polymerase chain reaction
(RT-PCR), the results of horizontal electrophoresis permitted to assess the ratio
of mRNA GAPDH and VEGF-A
165
expression for groups GI, GII and GIII (two-
way ANOVA, Tukey’s test, p<0.05). The weight variation of animals of group GII
was both greater than that of animals of group GIII and lower of than that of
animals of group GI in daily analysis, observing statistically significant
differences (p<0.05). Only during the sixth day, significant differences between
the averages of weight variation of the groups GII and GIII (p=0.220) and GI
and GII (p=0.409) were not observed. The expression of mRNA VEGF-A
165
in
group GII was statistically greater than that of group GI (p=0.0285) and GIII
(p=0.0101) in the first day. Significant differences among the groups GI, GII and
GIII were not observed in other time periods. Therefore, GaAlAs diode laser
was able to modulate the expression of mRNA VEGF-A
165
during the first day of
tissue repair process of wounds in rat tongues.
Keywords: wound healing, low level laser therapy, vascular endothelial growth
factor, rats.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 41
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................
47
2.1 Processo de reparo tecidual.......................................................................... 49
2.2 Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores..
56
2.3 Terapia laser em baixa intensidade (LLLT) ............................................... 63
3 PROPOSIÇÃO....................................................................................................... 77
4 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................... 81
4.1 Animais e caracterização dos grupos experimentais..............................
83
4.2 Excisão cirúrgica lingual................................................................................ 83
4.3 Utilização do laser diodo arsenieto de gálio e alumínio......................... 84
4.4 Critérios de exclusão da amostra.................................................................
86
4.5 Obtenção de espécimes para a execução dos experimentos e
número de animais.................................................................................................
86
4.6 Extração de RNA total das biópsias de tecido lingual............................ 87
4.7 Quantificação do RNA total............................................................................
89
4.8 Avaliação da qualidade do RNA total.......................................................... 89
4.9 Tratamento do RNA total com DNase..........................................................
89
4.10 Transcrição reversa – reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) ... 90
4.11 Estudo da intensidade para expressão de RNAm para VEGF-A
165
.... 93
4.12 Análise estatística.......................................................................................... 94
5 RESULTADOS.......................................................................................................
95
6 DISCUSSÃO...........................................................................................................
105
6.1 A respeito dos métodos empregados......................................................... 107
6.2 A respeito dos resultados obtidos............................................................... 113
6.2.1 Em relação à variação de peso dos animais.......................................... 113
6.2.2 Em relação à variação dos níveis de expressão de RNAm para
VEGF-A
165
..................................................................................................................
115
7 CONCLUSÕES...................................................................................................... 125
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 129
APÊNDICES.............................................................................................................. 147
ANEXO A................................................................................................................... 153
ANEXO B................................................................................................................... 155
ANEXO C................................................................................................................... 157
1
1 1
1 Introdução
IntroduçãoIntrodução
Introdução
Introdução
43
1 INTRODUÇÃO
O processo de angiogênese é definido como o brotamento de vasos
sangüíneos a partir de um outro pré-existente (GUPTA; ZHANG, 2005) e
caracterizado por uma cascata de eventos incluindo degradação enzimática da
membrana basal, migração e proliferação de células endoteliais e formação tubular
(KLAGSBRUN; D’AMORE, 1996). Este fenômeno fascinou mentes por muitos
séculos. Leonardo da Vinci comparou o sistema vascular com uma árvore que se
desenvolvia a partir do coração. Comparava os brotamentos da raiz com os
capilares sangüíneos e o tronco da árvore com a aorta e artérias (RISAU, 1997).
Com a evolução das pesquisas, as explicações trazidas pela biologia molecular e
celular permitiram um melhor entendimento da angiogênese fisiológica e patológica.
Uma vasta variedade de fatores de crescimento e citocinas agem
diretamente no estímulo e inibição de processos que completam o desenvolvimento
de novos vasos sangüíneos (CONWAY; COLLEN; CARMELIET, 2001). Dentre os
fatores de crescimento envolvidos no processo de angiogênese tecidual, sabe-se
que o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) aparece como o mais
importante (RISAU; FLAMME, 1995; FERRARA, 1996). O VEGF foi originalmente
identificado como uma proteína capaz de aumentar a permeabilidade vascular
(SENGER et al., 1983). Posteriormente, também foi constatada sua habilidade em
promover crescimento e diferenciação das células endoteliais vasculares (LEUNG et
al., 1989).
Estudos mostram a importância da angiogênese durante o processo de
reparo tecidual (SCHAFFER; NANNEY, 1996; MARTIN, 1997). O reparo tecidual
após cirurgias consiste em processo fisiológico que envolve o fechamento e
Introdução
44
epitelização da ferida cirúrgica, remodelação do tecido conjuntivo e a formação de
cicatriz (CERTOSIMO et al., 1998).
Muitas pesquisas têm se preocupado com o desenvolvimento de terapias
coadjuvantes que possam auxiliar o resultado clínico final de cirurgias, promovendo
conforto e segurança ao paciente através de um processo cicatricial mais acelerado
e eficaz, o que minimizaria riscos de complicações futuras decorrentes de infecções
e cicatrizes pronunciadas. O laser em baixa intensidade foi desenvolvido na busca
por procedimentos que pudessem diminuir a dor, estimular a reparação, a
cicatrização e a regressão de edema, com conseqüente ação antiinflamatória e de
bioestimulação celular (DONATO; BORAKS, 1993).
Atualmente, a laserterapia em baixa intensidade é indicada após
procedimentos clínicos e cirúrgicos odontológicos realizados em crianças e adultos,
como restaurações, exodontias, cirurgias periodontais e colocação de implantes
osseointegrados. Além disso, também é bastante utilizada como coadjuvante no
tratamento de alterações patológicas, tais como: gengivite, estomatite aftosa,
gengivoestomatite herpética, hipersensibilidade dentinária, mucosite, pericoronarite,
queilite angular, nevralgia trigeminal, disfunção temporomandibular e alveolite
(BRUGNERA JÚNIOR et al., 2003).
Relatos na literatura sugerem que a irradiação laser em baixa intensidade
pode promover acelerada epitelização, maior grau de vascularização e aumento da
síntese de colágeno nas feridas cirúrgicas (TAKEDA, 1988; KERT; ROSE, 1989;
REDDY; STEHNO-BITTEL; ENWEMEKA, 1998; BISHT et al., 1999; YAAKOBI et al.,
2001; 2005; BAYAT et al., 2005; CORAZZA, 2005; MAIYA; KUMAR; RAO, 2005;
MOHAMMED IHSAN, 2005; SALATE et al., GÁL et al., 2006). Além disso, trabalhos
que investigaram os efeitos da terapia laser em culturas de células obtiveram
Introdução
45
resultados satisfatórios quanto à proliferação celular e modulação da liberação de
fatores de crescimento (YU et al., 1994; WEBB; DYSON; LEWIS, 1998; AGAIBY et
al., 2000; ALMEIDA-LOPES et al., 2001; KIPSHIDZE et al., 2001; SCHINDL, 2003;
AIMBIRE et al., 2006).
Entretanto, não há fortes evidências científicas demonstrando que a
irradiação laser em baixa intensidade influencie diretamente na angiogênese
fisiológica e patológica, bem como na expressão do fator de crescimento endotelial
vascular. Dessa forma, justifica-se a realização de estudos complementares para o
esclarecimento deste aspecto. As informações geradas em tais experimentos
poderão contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos do reparo
tecidual, podendo gerar o desenvolvimento de formas terapêuticas que visam
melhorar este processo.
2 Revisão de Literatura
2 Revisão de Literatura2 Revisão de Literatura
2 Revisão de Literatura
Revisão de Literatura
49
2 REVISÃO DE LITERATURA
Este capítulo foi dividido didaticamente em tópicos pertinentes às
condições aplicadas neste trabalho.
2.1 Processo de reparo tecidual
Os tecidos podem ser lesados tanto por fatores traumáticos quanto por
fatores patológicos. Lesões traumáticas podem ocorrer devido a agressões químicas
e físicas. As formas físicas que produzem traumatismos aos tecidos incluem
temperaturas extremas, ressecamento e/ou obstrução do fluxo sangüíneo arterial ou
venoso, incisões, contusões e radiação. As lesões por causas químicas ocorrem
pela exposição aos ácidos e/ou bases (HUPP, 1998).
Substituir células lesadas ou mortas precedendo ao reparo tecidual é
fundamental para a sobrevivência do organismo. Os agentes lesivos, ao mesmo
tempo em que provocam um dano celular, também estimulam importantes eventos
para contenção da lesão, além de prepararem as células que não foram letalmente
danificadas a se replicarem e substituírem as células mortas (ROBBINS et al., 2000).
O conceito de ferida tecidual pode ser definido como uma interrupção da
continuidade anatômica e/ou funcional de tecidos vivos causada por um tipo de
agente lesivo (KRAWCZYK, 1978). O processo de cicatrização de feridas consiste
em uma seqüência altamente controlada de eventos bioquímicos e celulares que
coordenadamente contribuem para a restauração global da integridade funcional de
tecidos lesados (SCHARFFETTER-KOCHANEK; KLEIN; KRIEG, 1998). A reparação
Revisão de Literatura
50
não é linear e sim uma integração de processos dinâmicos, os quais envolvem
mediadores solúveis, elementos figurados do sangue, produção de matriz
extracelular e células parenquimatosas (CORAZZA, 2005).
A cicatrização ou reparo de feridas pode ser classificado em dois tipos:
primeira intenção, quando ocorreu reaproximação das bordas do ferimento por meio
de sutura; e segunda intenção, quando a ferida cirúrgica é deixada exposta,
existindo espaço entre as bordas do ferimento. Este último tipo de cicatrização
requer grande quantidade de migração epitelial, deposição de colágeno, contração e
remodelação durante todo o processo. Além disso, a cicatrização por segunda
intenção é mais lenta, produzindo um tecido conjuntivo mais fibroso (HUPP, 1998).
O reparo normal de tecidos pode ser dividido em três estágios
caracterizados por inflamação, proliferação e remodelação, não ocorrendo distinção
exata de tempo entre cada período, mas sim eventos característicos, prefixando a
duração de cada fase (REED, 1996).
A resposta inflamatória aguda pós-traumática inicia-se logo após a
formação da ferida por um agente lesivo e se estende aproximadamente por 10 dias
(REED, 1996). Este estágio pode ser caracterizado por três fases que se sobrepõem
(ALLER; ARIAS; ARIAS, 2004; ALLER et al., 2004a). A fase imediata ou também
chamada de fase nervosa é caracterizada por respostas sensitivas e motoras
(ALLER et al., 2004a). O sistema aferente é composto por múltiplos receptores
neurais, particularmente de nociceptores, os quais detectam estímulos
potencialmente danosos e provocam a sensação de dor (HOLDCROFT; POWER,
2003). A resposta eferente é mediada pelo sistema motor somático, usualmente
consistindo na retirada de uma fonte de irritação da parte afetada do corpo
(CLARKE; HARRIS, 2004).
Revisão de Literatura
51
Um trauma significativo também produz respostas vasomotoras locais,
com o intuito de recuperar a hemostasia. A perda de sangue tecidual ativa as
plaquetas e a coagulação sangüínea. O coágulo formado providencia uma barreira
física, limitando o influxo de bactérias e debris contaminados que prejudicariam o
reparo tecidual. Além disso, mantém a hidratação do tecido subjacente, reduzindo a
possibilidade de infecção e melhorando a migração de células e fatores necessários
ao processo de reparo (CERTOSIMO et al., 1998).
Uma vasoconstrição transitória é observada após a ruptura de vasos
sangüíneos, com duração de 10 a 15 minutos. Ela tem início pela liberação de
aminas vasoativas e se mantém pela influência da liberação de prostaglandinas
secretadas pelas células danificadas (MONACO; LAWRENCE, 2003). Porém, após
um curto período de tempo, diversos fatores, como produtos endoteliais,
prostaglandinas, fatores derivados de mastócitos e, em particular, a histamina,
estimulam a ocorrência da vasodilatação (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
Além disso, a norepinefrina, responsável pela vasoconstrição da microcirculação, é
destruída por enzimas intracelulares (CORAZZA, 2005).
À vasodilatação sobrevém um aumento do fluxo sangüíneo, causando
eritema e calor, sinais clássicos da inflamação (ROBBINS et al., 2000; ALLER et al.,
2006). A permeabilidade vascular facilitada promove extravasamento de líquidos
ricos em proteínas em direção ao espaço intersticial, causando edema (ROBBINS et
al., 2000). Este processo ocorre com o intuito fundamental de facilitar o acesso de
células e mediadores inflamatórios ao local da injúria tecidual, representando um
mecanismo de nutrição pela difusão, o que requer baixo consumo de energia
(ALLER et al., 2006).
Revisão de Literatura
52
Durante a próxima fase do estágio inflamatório, chamada de fase
intermediária ou imune, os tecidos epiteliais e órgãos são infiltrados por células
inflamatórias e bactérias (ALLER et al., 2004b). As células inflamatórias liberam
enzimas lisossômicas e produtos de oxigênio, além de facilitarem a limpeza de
debris tecidual e bactérias (MEDRADO et al., 2003).
Em resposta a estímulos químicos e mecânicos, presença de bactérias e
fatores derivados das células, neutrófilos e monócitos são as primeiras células
atraídas até o local da lesão. A principal ação dos neutrófilos é a fagocitose. Além
disso, estas células são fontes de espécies de oxigênio reativo, importante para a
síntese protéica, ácidos nucléicos e uma ampla variedade de espécies moleculares
(FUJIMAKI et al., 2003). Os monócitos se diferenciam em macrófagos no espaço
tecidual, atuando como auxiliar dos neutrófilos na fagocitose de microorganismos
invasores, resíduos de tecidos e células. Os mastócitos possuem grânulos dispersos
no interior do seu citoplasma, compostos por um complexo heparina-protéico,
atuando como receptores da histamina. A histamina pode estimular a formação de
colágeno e cicatrização quando presente em baixas concentrações. Já a heparina
estimula a migração de células endoteliais (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2000). O
processo de degranulação de mastócitos pode estimular a reparação tecidual devido
à liberação de fatores quimiotáticos eosinofílicos de anafilaxia (ECF-A) e fator
quimiotático neutrofílico (NCF) que modulam o processo inflamatório, agindo como
atraentes químicos de células (EL SAYED; DYSON, 1996). Leucócitos semelhantes
a neutrófilos, macrófagos, mastócitos e linfócitos-T são capazes de produzir
citocinas e fatores de crescimento que regulam o processo de angiogênese e
fibroplasia (AGAIBY et al., 2000).
Revisão de Literatura
53
A infiltração celular intersticial é favorecida pela ação de componentes
intrínsecos e extrínsecos da cascata da coagulação. A ativação de trombina a partir
do precursor protrombina catalisa a conversão de fibrinogênio de origem
intravascular em fibrina insolúvel (ROBBINS et al., 2000; MONACO; LAWRENCE,
2003; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Durante a conversão, formam-se
fibrinopeptídeos, indutores da permeabilidade vascular e atividade quimiotática de
leucócitos. Além disso, a trombina tem capacidade de aumentar a aderência
leucocitária e proliferação de fibroblastos (ROBBINS et al., 2000).
Na fase tardia ou endócrina do estágio inflamatório do processo de reparo
tecidual, a nutrição é mediada pela recuperação da função capilar, possibilitando a
utilização do oxigênio no metabolismo oxidativo. Este metabolismo é caracterizado
por uma grande produção de trifosfato de adenosina (ATP), o qual é necessário para
direcionar múltiplos processos celulares mais complexos e especializados. A
quantidade produzida de ATP é fundamental para o fornecimento de energia
metabólica e restauração das propriedades da membrana celular, além de regular a
velocidade e a qualidade do reparo tecidual (ALLER et al., 2004b; ALLER et al.,
2006).
As hemáceas ocupam o espaço intersticial na fase endócrina da
inflamação com intuito de prover quantidades significativas de oxigênio aos tecidos
lesados. Estas células sangüíneas são transportadas por capilares recém formados,
o que confere à angiogênese um papel fundamental neste período inflamatório
(MCCOURT et al., 1999; LINGEN, 2001).
O termo angiogênese pode ser definido como a emissão de novos
capilares sangüíneos a partir de outros vasos pré-existentes (GUPTA; ZHANG,
2005). Após a vasodilatação inicial, ocorre o aumento da permeabilidade e
Revisão de Literatura
54
degradação da matriz circundante, o que permite ativar a proliferação de células
endoteliais e a migração para formação de lumens (CONWAY; COLLEN;
CARMELIET, 2001). A angiogênese é essencial para que ocorra o desenvolvimento
de tecidos, a homeostasia, a cicatrização e reparo, processos inflamatórios e
progressão de tumores sólidos (FOLKMAN; SHING, 1992).
A formação de novos vasos é um processo complexo e de vários estágios,
regulado por moléculas indutoras e inibidoras da neovascularização (POLVERINI,
1995). O aumento de novos capilares através de vasos pré-existentes no processo
de desenvolvimento e a diferenciação das células endoteliais durante a
vasculogênese dependem em grande parte da atuação do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF) (RISAU; FLAMME, 1995), o mais essencial fator pró-
angiogênese (FERRARA, 1996; MCCOURT et al., 1999).
A angiogênese providencia uma rota de vasos sangüíneos para a
distribuição de oxigênio e outros nutrientes, bem como um conduto para
componentes da resposta inflamatória durante o reparo de feridas (GUPTA; ZHANG,
2005). Um crescimento inadequado ou não regulado de vasos sangüíneos pode
resultar em atraso durante o processo de reparo. O VEGF é naturalmente expresso
durante diferentes fases da cicatrização (BATES; JONES, 2003). O uso tópico de
VEGF-A
165
foi capaz de reduzir em 50% o tempo de cicatrização de feridas em ratos
diabéticos (KIRCHNER et al., 2003). A expressão aumentada de VEGF em terapias
gênicas resulta em aumento da densidade vascular e mais rápido fechamento da
ferida, havendo um significante aumento na deposição do tecido de granulação
(BATES; JONES, 2003).
Durante as primeiras 24 horas após uma lesão, fibroblastos e células
endoteliais vasculares começam a proliferar para formar em 3 a 5 dias o tecido de
Revisão de Literatura
55
granulação, caracterizado histologicamente pela formação de novos e pequenos
vasos permeáveis, proliferação de fibroblastos, presença de macrófagos, colágeno
imaturo e substância matricial. Os macrófagos são responsáveis pela fagocitose e
auxiliam na liberação de fatores de crescimento em conjunto com as plaquetas. Com
a proliferação do tecido de granulação, ocorre o estímulo dos fibroblastos e
conseqüente produção de colágeno, caracterizando o processo de fibroplasia,
presente no estágio proliferativo do reparo tecidual. Na cicatrização de feridas por
segunda intenção ocorre a formação de uma quantidade muito maior de tecido de
granulação para completar o reparo, quando comparada com a cicatrização por
primeira intenção (ROBBINS et al., 2000).
No estágio de proliferação, a presença de colágeno tipo III e tipo V produz
parte da membrana basal e uma sustentação estrutural, respectivamente. Inicia-se o
processo de contração da ferida, desenvolvido por fibroblastos especiais ricos em
actina localizados nas bordas das feridas, denominados miofibroblastos. Tais células
realizam contração concêntrica, promovendo o fechamento do ferimento (REED,
1996).
A remodelação, o último estágio do processo de reparo tecidual, consiste
na reposição parcial do colágeno tipo III, predominante no estágio proliferativo, pelo
colágeno fibrilar maduro, tipo I) (CORAZZA, 2005). As fibras colágenas tornam-se
mais espessas e orientadas em paralelismo, resultando em maior resistência à
tensão (REED, 1996).
Revisão de Literatura
56
2.2 Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi originalmente
descrito como uma proteína homodimérica, com peso molecular variando entre 34 e
42 KDa, que tinha a capacidade de aumentar a permeabilidade vascular na pele. Por
isso, foi inicialmente chamado de fator de permeabilidade vascular (VPF) (SENGER
et al., 1983). Em 1989, Ferrara e Henzel identificaram um fator de crescimento para
células endoteliais, chamando-o de VEGF, o qual foi posteriormente seqüenciado,
verificando-se idêntica estrutura ao VPF (LEUNG et al., 1989; KECK et al., 1989).
O VEGF possui a capacidade de aumentar a vascularização tecidual
através da indução da migração e proliferação das células endoteliais (FERRARA,
1996), bem como pela sobrevivência destas células, através da ligação com o
receptor VEGFR-2 e aumento da regulação de uma proteína anti-apoptótica
denominada BcI-2 (NÖR et al., 1999; TELLES et al., 2003).
Um vasto número de células, incluindo plaquetas, leucócitos
polimorfonucleares e neutrófilos, pode secretar o fator de crescimento endotelial
vascular (MCCOURT et al., 1999), imprescindível para um correto desenvolvimento
embrionário e para progressão de outras condições fisiológicas e patológicas,
incluindo reparo tecidual, artrite reumatóide, neovascularização ocular, progressão
tumoral, endometriose e doenças cardiovasculares (BYRNE; BOUCHIER-HAYES;
HARMEY, 2005; ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006).
Bioquimicamente, o VEGF pode ser descrito como uma glicoproteína com
ligante heparina. Atualmente, sete membros fazem parte de sua família: VEGF-A,
VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F e o fator de crescimento placentário
(PlGF) (HOEBEN et al., 2004; ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006). Todos
Revisão de Literatura
57
os membros da família possuem em comum um domínio homólogo, caracterizado
por oito resíduos de cisteína (éxons) separadas por sete íntrons (FERRARA;
GERBER; LE COUTER, 2003).
O VEGF-A está localizado no cromossomo 6p21.3 (ROY; BHARDWAJ;
YLÄ-HERTTUALA, 2006). Em tecidos normais adultos, altos níveis de RNAm para
VEGF-A são encontrados nos pulmões, rins, coração e glândula adrenal. O VEGF-A
existe em pelo menos sete isoformas homodiméricas. Os monômeros são
constituídos por 121, 145, 148, 165, 183, 189 e 206 aminoácidos. Estas isoformas
diferem umas das outras através da presença ou ausência das seqüências
codificadas pelos éxons 6 e 7, exceto na isoforma VEGF-A
148,
onde ocorre uma
variável alternativa nos éxons 6 e 7, que codifica dois domínios distintos de ligante
heparina (Figura 1). A presença ou ausência desses domínios influencia a
solubilidade e a ligação com o receptor para VEGF. O ligante heparina decodificado
pelo éxon 6 determina a ligação com a matriz extracelular, tornando as isoformas
que possuem este domínio (VEGF-A
145
, VEGF-A
189
e VEGF-A
206
) altamente ligadas
a proteoglicanos da superfície celular, enquanto as isoformas que não possuem este
domínio são difusíveis (NEUFELD et al., 1999; HOEBEN et al., 2004). Portanto, as
isoformas apresentam distintas funções que se sobrepõem no processo de
angiogênese (TAMMELA et al., 2005).
Por estimular às células endoteliais a realizarem proliferação, brotamento,
migração e formação tubular (FERRARA; GERBER, LE COUTER, 2003), o VEGF-A
é considerado uma molécula chave na indução de angiogênese e vasculogênese. A
expressão aumentada de VEGF-A produz uma pronunciada resposta angiogênica
em diferentes tecidos. Entretanto, resulta em vasos que são freqüentemente
grandes, dilatados e com presença de orifícios (BHARDWAJ et al., 2003;
Revisão de Literatura
58
RISSANEN; RUTANEN; YLÄ-HERTTUALA, 2004). Além disso, o VEGF-A realiza a
mediação do extravasamento de fluido e proteínas plasmáticas, podendo contribuir
para uma melhor migração de células endoteliais na matriz extracelular (BOOTLE-
WILBRAHAM et al., 2001).
Fonte: Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AL, Bruijn EA. Vascular
endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 2004; 56: 549-80.
Figura 1 – Estrutura gênica do VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D. O VEGF-A é constituído por 8
éxons e possui 7 isoformas, constituídas por 121, 145, 148, 165, 183, 189 e 206 aminoácidos. Uma
isoforma adicional de 110 aminoácidos é resultado de uma quebra proteolítica das isoformas 165 e
189. Existem duas isoformas do VEGF-B, a de 167 e a de 186 aminoácidos. Todos os membros da
família VEGF preservam um domínio homólogo, decodificado pelos éxons de 1 a 5.
O gene humano VEGF-B é constituído por oito éxons e seis íntrons e está
localizado no cromossomo 11. Apresenta duas isoformas expressas em humanos,
uma constituída por 167 aminoácidos e outra constituída por 186 aminoácidos (ROY;
BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006). O VEGF-B
167
é mais abundante e expresso
em muitos tecidos, incluindo os músculos esqueléticos e miocárdio, enquanto a
isoforma 186 é expressa em menores concentrações e somente em um número
limitado de tecidos. O VEGF-B se liga aos receptores VEGFR-1 e Nrp-1 e pode
Revisão de Literatura
59
formar heterodímeros com o VEGF-A. Nenhuma de suas isoformas se liga aos
receptores VEGFR-2 e VEGFR-3 (NASH et al., 2005).
O papel preciso do VEGF-B in vivo não é precisamente conhecido.
Estudos com ratos que apresentavam deficiência de VEGF-B mostraram um
desenvolvimento de corações menores e recuperação prejudicada após infarto
induzido do miocárdio, sugerindo que a formação coronariana colateral pode ser
parcialmente atribuída ao VEGF-B (BELLOMO et al., 2000). Foi sugerida, também, a
participação do VEGF-B na angiogênese inflamatória (MOULD et al., 2003).
O gene VEGF-C é constituído por sete éxons e localiza-se no
cromossomo 4q34. Este fator de crescimento é produzido através da ativação de
uma proteína precursora por proteases no espaço extracelular, com o intuito de
gerar proteínas homodiméricas com alta afinidade aos receptores VEGFR-2 e
VEGFR-3. O VEGF-C induz mitose, migração e sobrevivência de células endoteliais
(ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006). É considerado um fator de
crescimento primariamente linfangiogênico, mediado pelo receptor VEGFR-3
(ENHOLM et al., 2001). Entretanto, o aumento da permeabilidade vascular induzida
pelo VEGF-C é mediada pelo receptor VEGFR-2 (KARKKAINEN et al., 2004). O
VEGF-C também está envolvido em progressões tumorais e processos inflamatórios
relacionados à linfangiogênese (ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006).
O VEGF-D é expresso em muitos tecidos adultos como endotélio vascular,
coração, músculos esqueléticos, pulmão e intestino. Seu gene está localizado no
cromossomo Xp22.31. É secretado como uma glicoproteína com 48% de homologia
estrutural ao VEGF-C. Liga-se aos receptores VEGFR-2 e VEGFR-3 (JELSTCH et
al., 1997) com o intuito de promover proliferação de células endoteliais e, portanto,
mostrando potencial angiogênico e linfangiogênico. Em adultos, pode induzir
Revisão de Literatura
60
crescimento de vasos linfáticos como resposta a eventos patológicos (BALDWIN et
al., 2005).
Um membro da família VEGF foi descoberto no genoma do Orf virus que
infecta ovelhas, cabras e ocasionalmente humanos (LYTTLE et al., 1994). Este tipo
de infecção causa lesões proliferativas de pele. Muitas cadeias deste vírus codificam
diferentes variantes de VEGF-E, que se ligam especialmente aos receptores
VEGFR-2 e Nrp-1, sendo hábeis para estimular mitogênese de células endoteliais e
permeabilidade vascular. Sua expressão gênica induz forte resposta angiogênica
(ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006).
Recentemente foi descoberto o VEGF-F, identificado em veneno de
cobras. O VEGF-F apresenta 50% de sua estrutura primária idêntica ao do VEGF-
A
165
e se liga seletivamente ao receptor VEGFR-2 (SUTO et al., 2005), bloqueando a
atividade do VEGF-A
165
in vitro e in vivo (YAMAZAKI et al., 2005).
As principais funções do VEGF são promover sobrevivência, induzir
proliferação e melhorar a migração e invasão de células endoteliais, contribuindo
para a angiogênese. Essas funções são reguladas pela interação do VEGF com
seus receptores tirosinoquinase (BYRNE; BOUCHIER-HAYES; HARMEY, 2005) e
conseqüente via de transdução de sinais, gerando uma resposta intracelular
(ROBBINS et al., 2000).
Os receptores para VEGF foram inicialmente identificados em células
endoteliais. O VEGF se liga a três tipos de receptores tirosinoquinases: flt-1
(VEGFR-1), Flk-1/ KDR (VEGFR-2) e flt-4 (VEGFR-3). Os dois primeiros receptores
foram primariamente encontrados no endotélio vascular enquanto o VEGFR-3 foi
encontrado no endotélio linfático. Todos eles possuem um domínio extracelular, uma
simples região transmembrana e uma seqüência de tirosinoquinase interrompida
Revisão de Literatura
61
pela inserção de domínios de quinase (SHIBUYA et al., 1990; TERMAN et al., 1991).
Mais recentemente foi identificada a neuropilina (Nrp-1), um receptor para a família
semaforina/colapsina de guia de mediadores neuronais (BYRNE; BOUCHIER-
HAYES; HARMEY, 2005). A Nrp-1 age como um co-receptor melhorando a interação
entre VEGF e VEGFR-2, formando complexos com o receptor VEGFR-1 (ROY;
BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006).
O receptor VEGFR-1 (flt-1) é uma proteína transmembrana com peso
molecular de 180 KDa, que se liga ao VEGF-A, PlGF e VEGF-B. A sua afinidade
pelo VEGF é dez vezes maior que ao do VEGFR-2, mas sua atividade de
tirosinoquinase é dez vezes mais fraca que a do VEGFR-2 (PARK et al., 1994). Além
de ser expresso em células endoteliais, o VEGFR-1 está presente em monócitos,
osteoblastos, macrófagos, pericitos, células sangüíneas, células musculares lisas
vasculares e em células coloretais tumorais (BARLEON et al., 1996).
O receptor VEGFR-2 é uma glicoproteína com 230 KDa de peso molecular
e liga-se ao VEGF-A, VEGF-C e VEGF-D. É o mediador primário para VEGF (GILLE
et al., 2001), transmitindo sinais do VEGF em células endoteliais, gerando
vasodilatação, proliferação e migração dessas células (ROY; BHARDWAJ; YLÄ-
HERTTUALA, 2006). Além das células endoteliais, células hematopoiéticas
progenitoras, células endoteliais circulantes progenitoras, células do ducto
pancreático, células progenitoras da retina e megacariócitos expressam VEGFR-2
(BYRNE; BOUCHIER-HAYES; HARMEY, 2005).
O receptor VEGFR-3 é uma proteína glicolisada com peso molecular de
170 KDa, primeiramente clonada a partir de células eritroleucêmicas humanas e
cDNA placentário. Encontra-se expresso em células endoteliais embrionárias, mas
durante o desenvolvimento humano, sua expressão em vasos sangüíneos diminui e
Revisão de Literatura
62
torna-se restrita ao tecido endotelial linfático adulto (KAIPAINEN et al., 1995).
Entretanto, o VEGFR-3 é altamente regulado em células endoteliais de tumores
vasculares (ROY; BHARDWAJ; YLÄ-HERTTUALA, 2006).
Células tumorais podem secretar elevados níveis de VEGF sob condições
de estresse como hipóxia, radiação e quimioterapia (RIEDEL et al., 2004), o que
pode contribuir inadvertidamente para a resistência de células tumorais aos
tratamentos de câncer convencionais (LE GOUILL et al., 2004). Em resposta à
hipóxia, tumores podem secretar fatores de crescimento angiogênicos para estimular
o crescimento de vasos sangüíneos e distribuição de oxigênio. Este processo é
mediado pelo fator induzido por hipóxia (HIF-1). Em normóxia, HIF-1α, proteína
citoplasmática sensível aos níveis de oxigênio, é rapidamente degradada, enquanto
que em condições de hipóxia é estabilizada e translocada para o núcleo celular.
Durante o processo de reparo tecidual, ovulação e arteriosclerose, situações
fisiológicas em que se verifica a hipóxia, também ocorre um aumento da regulação
dos níveis de VEGF (BYRNE; BOUCHIER-HAYES; HARMEY, 2005). Muitos fatores
de crescimento, como o fator de crescimento transformador – ß (TGF- ß), fator de
crescimento epidérmico (EGF) e o fator de crescimento derivado de plaquetas
(PDGF) induzem a expressão de RNAm para VEGF-A (ENHOLM et al., 1997). Além
disso, a prostaglandina E
2
também causa rápida indução de RNAm para VEGF-A.
Os mecanismos dessa indução ainda não estão bem esclarecidos (HARADA et al.,
1994).
Revisão de Literatura
63
2.3 Terapia laser em baixa intensidade (LLLT)
A palavra LASER é um acrônimo de origem inglesa que significa “Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation”, ou seja, amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação (MELLO; MELLO, 2001).
A luz laser é monocromática, composta por fótons de mesmo comprimento
de onda e cor. Esta característica é importante devido à absorção seletiva dos
tecidos. Além disso, seus fótons são coerentes e propagam-se na mesma direção,
movendo-se em fases no tempo e no espaço. A colimação é outra característica que
distingue o laser de outras fontes luminosas, sendo possível através da
unidirecionalidade e paralelismo da luz ao eixo do tubo que produz esta energia,
possibilitando uma divergência angular muito pequena e conseqüente capacidade
de concentração do feixe de luz em um ponto focal (GENOVESE, 2000).
Para produzir a luz laser, os aparelhos devem possuir alguns
componentes básicos. Uma fonte externa utiliza de uma energia elevada para
excitar os átomos através do bombeamento do meio ativo. O meio ativo é
constituído por materiais (sólidos, semi-sólidos, líquidos, gasosos, semicondutores e
excímeros) que podem produzir a radiação laser. Os átomos emitem fótons que se
propagam em várias direções dentro da chamada cavidade ressonante. A cavidade
ressonante nada mais é que um tubo contendo espelhos em suas extremidades. Em
um dos lados, os espelhos são totalmente refletores e do outro lado são
parcialmente refletores (80% da luz são refletidas e 20% transmitidas através do
espelho para o exterior). Os fótons emitidos que se propagam paralelamente ao eixo
da cavidade ressonante têm grande possibilidade de encontrar outro átomo excitado
Revisão de Literatura
64
e estimular a emissão de fótons adicionais coerentes, amplificando e gerando um
grande fluxo de luz de alto nível energético (GENOVESE, 2000).
Dois meios ativos bastante utilizados nas irradiações com laser em baixa
intensidade são a mistura gasosa de hélio e neônio (He-Ne) ou os semicondutores
diodo de arsenieto de gálio (As-Ga), arsenieto de gálio e alumínio (GaAlAs) e
arsenieto de gálio, índio e fósforo (AlGaInP) que produzem radiação na faixa situada
entre 630 e 950 nm (BAXTER, 1994). A adição de alumínio na mistura de arsenieto
de gálio permite a produção de lasers visíveis na faixa do vermelho. Este laser
supostamente apresenta potencial terapêutico elevado em lesões superficiais e
profundas, através de um regime de emissão contínua e com comprimento de onda
variando entre 620 e 830 nm (GENOVESE, 2000).
Atualmente a luz laser é utilizada como “balanceador e normalizador de
funções” (OSHIRO; CALDERHEAD, 1991), pois pode ser utilizada tanto como
processo estimulador (TAKEDA, 1988) quanto como inibidor de efeitos (SASAKI;
OSHIRO, 1989).
Estudos de Lyons et al. (1987) e Kameya et al. (1995) mostraram que a
fotoestimulação com laser em baixa intensidade pode induzir proliferação e divisão
celular, aumento da síntese de ATP e produção de ácidos nucléicos. Os ácidos
nucléicos constituintes do DNA possuem um espectro de absorção significativa na
faixa intermediária e inferior do ultravioleta e na região do infravermelho. Segundo
Baxter (1994), na faixa do ultravioleta próximo e no espectro vermelho visível os
ácidos nucléicos não apresentam absorção significativa.
A conversão de adenosina difosfato (ADP) em adenosina trifosfato (ATP),
necessária para o suprimento de energia e direcionamento do metabolismo celular,
pode ser influenciada pela luz. Segundo Abt (1995), os citocromos mitocondriais,
Revisão de Literatura
65
responsáveis pela reação anteriormente descrita, são cromóforos ou moléculas
fotossensíveis, portanto excitáveis pela luz laser que penetra através dos tecidos.
Danhof (2000) observou que o laser trabalha diretamente na permeabilidade da
membrana celular, facilitando a mobilidade de íons cálcio, sódio e potássio, portanto,
normalizando o potencial da membrana, atuando como modulador da atividade
funcional da célula. Também é capaz de aumentar indiretamente a produção de
ATP. Silveira, Streck e Pinho (2007) avaliaram a atividade dos complexos II e IV da
cadeia respiratória mitocondrial após irradiação de feridas cutâneas de ratos Wistar
com utilização do laser diodo arsenieto de gálio (904 nm) pelo período de 10 dias.
Os resultados mostraram um aumento significativo na atividade dos complexos
estudados quando o laser foi utilizado.
O estudo de Takeda (1988) avaliou os efeitos da laserterapia em baixa
intensidade (GaAs, 904 nm, 20 J/cm
2
, 5 min, 1X/dia, 7 dias) no reparo tecidual de
alvéolos dentários de primeiros molares superiores direitos de 24 ratos Wistar
machos, através de achados histopatológicos. Os animais foram divididos em dois
grupos, um experimental e o outro controle. Três animais de cada grupo foram
sacrificados nos dias 0, 2, 4 e 7. Os resultados mostraram que a proliferação
fibroblástica no segundo dia foi mais acentuada no grupo experimental. Além disso,
a formação de tecido osteóide no quarto dia foi mais intensa nos alvéolos irradiados
quando comparados aos não irradiados. No sétimo dia, verificou-se maior
proeminência de deposição de trabeculado ósseo no grupo teste. Portanto, a
utilização do laser semicondutor arsenieto de gálio foi efetiva no processo de reparo
alveolar em ratos.
Kert e Rose (1989) relataram alguns efeitos positivos da terapia laser em
baixa intensidade, incluindo estímulos no crescimento e regeneração celulares,
Revisão de Literatura
66
aumento da atividade celular e da revascularização. Honmura et al. (1992)
compararam o efeito antiinflamatório do laser diodo arsenieto de gálio e alumínio
(780 nm; contínuo; 10 mW; 31,8 J/s/cm
2
; 30s) com o efeito da administração diária
de indometacina, um antiinflamatório não esteroidal. Para isso, os autores avaliaram
a formação granulomatosa, edema e permeabilidade vascular durante o processo
inflamatório induzido em ratos Wistar, pelo período de sete dias. Os resultados
mostraram que o laser inibiu em pelo menos 20% a permeabilidade vascular no
estágio agudo e a formação granulomatosa no estágio crônico da inflamação.
Comparado aos efeitos da indometacina, o laser foi mais eficaz apenas na
diminuição da formação granulomatosa, enquanto a indometacina mostrou-se mais
eficiente no controle do edema e permeabilidade vascular.
Fernando, Hill e Walker (1993) questionaram os efeitos benéficos da
terapia laser em baixa intensidade após obterem resultados sem diferenças
estatisticamente significantes entre o pós-operatório da exodontia de terceiros
molares bilaterais simétricos, submetidos ou não à laserterapia.
Hall et al. (1994) avaliaram os efeitos do laser pulsado arsenieto de gálio
(904 nm) na cicatrização de feridas bilaterais confeccionadas na região caudal de
ratos Sprague-Dawley. Os animais foram divididos em dois grupos. O grupo I
recebeu tratamento com laserterapia por 21 dias, com aplicações diárias de 0,2
J/cm
2
durante um minuto. O grupo II teve uma de suas feridas irradiada por uma luz
placebo. Os animais de ambos os grupos apresentavam uma segunda ferida para
controle. Os resultados clínicos (grau de sangramento, infecção, formação de crosta
e epitelização) e microscópicos não diferiram em ambos os grupos durante o
período observado.
Revisão de Literatura
67
Para investigar o possível efeito estimulatório da aplicação diária do laser
de He-Ne (632,8 nm, 1 J/cm
2
) na produção de matriz de colágeno por fibroblastos,
Reddy, Stehno-Bittel e Enwemeka (1998) realizaram, durante 14 dias, irradiações
sobre o tendão calcâneo direito, previamente seccionado e religado, de 24 coelhos,
divididos em grupo teste e controle. A quantidade total de colágeno nos tendões
tratados com laser (395,15 ± 9,5 µg) foi significativamente maior quando
comparados com os tendões do grupo controle (314,85 ± 11,1 µg). Portanto, a
terapia laser em baixa intensidade promoveu a produção de colágeno, melhorando o
reparo tendinoso.
Webb, Dyson e Lewis (1998) observaram um aumento significante na
contagem das células oriundas de tecido hipertrófico após irradiação laser de 2,4
J/cm
2
. Concluíram que a luz pode ter induzido a secreção de fatores de crescimento,
aumentando as taxas de mitose e/ou diminuindo a morte celular. Bisht et al. (1999)
verificaram que o laser He-Ne (5 mW) foi capaz de promover epitelização
antecipada, conseqüência do aumento da reação fibroblástica, além de infiltração
leucocitária e angiogênese em feridas cirúrgicas produzidas no dorso de ratos.
Agaiby et al. (2000) trataram culturas de células endoteliais da aorta com
laser pulsado em baixa intensidade (5.000 Hz, 820 nm, 50 mW) em diversas
densidades de energia (1,2, 3,6, 6,0 e 8,4 J/cm
2
). As células alcançaram a máxima
atividade proliferativa quando foram tratadas com dosimetrias iguais a 1,2 e 3,6
J/cm
2
, enquanto o tratamento com as maiores densidades de energia gerou um
efeito inibitório na proliferação celular, notado por contagem mais baixa de células
em relação ao grupo controle.
Almeida-Lopes et al. (2001) estudaram os efeitos proliferativos da
aplicação de luz laser em baixa intensidade sobre cultura de fibroblastos advindos
Revisão de Literatura
68
da mucosa oral humana e nutridos com soro fetal bovino em concentrações de 5%
(estresse nutricional) e 10% (condições ideais). Para tanto, utilizaram quatro
diferentes comprimentos de onda e três diferentes potências de energia [670 nm, 10
mW (L1); 780 nm, 50 mW (L2); 692 nm, 30 mW (L3) e 786 nm, 30 mW (L4)] e a
mesma dosimetria (2 J/cm
2
). A primeira fase do estudo comparou os efeitos dos
lasers L1 e L2, verificando-se indução significativamente maior da proliferação de
fibroblastos quando o laser infravermelho (780 nm) foi utilizado em condições de
estresse nutricional. Já os lasers de igual potência de energia (L3 e L4)
apresentaram efeitos similares sobre os fibroblastos. A influência da irradiação laser
no aumento da proliferação celular foi verificada somente em condições de estresse
nutricional.
Kipshidze et al. (2001) observaram o efeito da irradiação do laser diodo
He-Ne (contínuo, 632 nm) na secreção de VEGF por células musculares lisas,
cardiomiócitos e fibroblastos, além da proliferação de células endoteliais humanas
cultivadas in vitro. Culturas de células diversas foram irradiadas uma única vez com
diferentes dosimetrias, as quais variaram de 0,1 a 6,3 J/cm
2
.
A irradiação laser
aumentou a produção de VEGF por todos os tipos celulares estudados, além de
estimular a proliferação de células endoteliais. Os máximos efeitos estimulatórios da
irradiação laser foram observados em dosimetrias diferentes para cada grupo de
células (0,5 J/cm
2
para células musculares lisas, 2,1 J/cm
2
para fibroblastos e 1,05
J/cm
2
para cardiomiócitos). Nos cardiomiócitos também foram estudadas as
expressões de RNAm para VEGF e TGF-ß. Quando estas células foram tratadas
com dosimetrias iguais a 1,05, 1,57 e 2,1 J/cm
2
, ocorreu um aumento significativo
na expressão de RNAm para ambos os fatores de crescimento, comparados aos
Revisão de Literatura
69
grupos não tratados. Em dosimetrias maiores, entretanto, o efeito estimulatório foi
gradativamente diminuído.
Whelan et al. (2001) irradiaram feridas cirúrgicas de ratos com o uso de
LED (880 nm, 4 J/cm
2
) durante 14 dias. Nos dias 0, 4, 7 e 14, os autores realizaram
análise bioquímica dos níveis do fator de crescimento fibroblástico básico (FGF-2) e
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) pela utilização de ELISA. Os níveis
de FGF-2 foram mais expressivos no grupo teste quando comparado com o grupo
controle em todos os dias de análise. Já os níveis de VEGF foram semelhantes em
ambos os grupos estudados. A expressão aumentada de FGF-2 no grupo teste
demonstrou eficiência de ação do LED durante o processo de cicatrização de
feridas.
Yaakobi et al. (2001) ocluíram a artéria coronária de 18 ratos para simular
uma lesão por reperfusão isquêmica no coração. Após a cirurgia, um tratamento
com laser diodo de arsenieto de gálio (804 nm, 38 mW) começou a ser realizado
com utilização de fibra óptica levada diretamente até o coração. O tratamento foi
capaz de aumentar o número de vasos sangüíneos e células endoteliais. Schindl
(2003) também verificou a capacidade da laserterapia em baixa intensidade (670
nm) em estimular a proliferação de células endoteliais cultivadas in vitro,
especialmente quando tratadas com uma dosimetria igual a 8 J/cm
2
.
Lucas et al. (2002) realizaram um estudo de metanálise com o objetivo de
avaliar os resultados e qualidade de pesquisas voltadas ao entendimento da
influência da terapia laser em baixa intensidade na cicatrização de feridas em
animais e em cultura de células. Para tanto, foram utilizados os seguintes critérios
de inclusão: (1) o estudo avaliou o efeito da laserterapia na cicatrização de feridas
em células ou animais; (2) o comprimento de onda estudado foi 632,8 nm (He-Ne)
Revisão de Literatura
70
ou 660-950 nm (GaAs/ GaAlAs); (3) publicações escritas em inglês, alemão, francês
ou holandês. Após a seleção dos estudos, os autores atribuíram um ponto para cada
uma das oito características avaliadas, quando foram realizadas e descritas de
forma clara. As características foram: (1) relação investigada entre dose e resposta;
(2) experimento aleatorizado; (3) tempo adequado para investigação; (4)
monitoramento de parâmetros fisiológicos; (5) avaliação cega dos resultados; (6)
avaliação de pelo menos dois resultados aferidos; (7) avaliação dos resultados na
fase aguda da cicatrização da ferida (1-10 dias); (8) avaliação dos resultados na fase
crônica do processo de cicatrização da ferida (3-30 dias). Os estudos foram
classificados de acordo com a qualidade metodológica: pobre (pontuação <5),
moderada (pontuação igual a 5 ou 6) e boa (pontuação igual a 7 ou 8). Ao todo,
foram selecionados 36 estudos, os quais continham 49 parâmetros de resultados, 30
reportando um efeito positivo para a irradiação laser e 19 reportando um efeito
negativo. Nenhum dos estudos que avaliaram a LLLT de forma positiva foi
considerado de boa qualidade, enquanto quatro estudos que consideraram negativo
o uso da terapia laser obtiveram 7 ou 8 pontos. A pontuação média obtida pelos
estudos em relação à qualidade metodológica foi igual a 4 (pobre). Os resultados,
portanto, não puderam providenciar uma resposta inequívoca para a eficácia do
tratamento com LLLT e nem mesmo justificar a realização de estudos clínicos em
grande escala de pacientes, já que não ocorreram grandes diferenças entre os
resultados destes experimentos e os estudos clínicos.
Damante (2003) avaliou a efetividade da terapia laser em baixa
intensidade (GaAlAs – 670nm) na cicatrização de gengivoplastias realizadas na
região dos dentes anteriores de maxila ou mandíbula em humanos. Clínica e
Revisão de Literatura
71
histomorfometricamente, o processo cicatricial não diferiu entre as áreas irradiadas e
não irradiadas.
Enwemeka et al. (2004) realizaram estudo de metanálise com o intuito de
obter respostas com fortes evidências científicas em relação à influência de lasers
em baixa intensidade no reparo tecidual e controle da dor. Foram selecionadas 34
pesquisas que estudaram o reparo tecidual em animais e humanos e nove
pesquisas que estudaram o controle da dor em humanos. Os resultados mostraram
que a laserterapia é uma modalidade altamente eficaz para melhorar o reparo
tecidual e controle da dor, sendo que o comprimento de onda do aparelho pode
influenciar os resultados do tratamento. Estes resultados estão de acordo com o
estudo de metanálise realizado por Woodruff et al. (2004), o qual se ateve à análise
de reparo de feridas auxiliado pela laserterapia.
Bayat et al. (2005) estudaram a influência do laser He-Ne (contínuo, 632,8
nm, 10 mW) na cicatrização de feridas dorsais (3,8cm
2
) em 78 ratos submetidos a
queimaduras de terceiro grau. Os animais foram divididos em quatro grupos: dois
grupos, 20 animais em cada, que receberam tratamento diário com LLLT em contato
com o tecido, um com densidade de energia igual a 1,2 J/cm
2
(120s) e o outro com
densidade de energia igual a 2,4 J/cm
2
(240s); um grupo controle (n=19), o qual não
recebeu nenhum tipo de tratamento; um grupo tratado com aplicação tópica de
nitrofurazona 0,2%, creme. Os resultados histológicos do tratamento foram avaliados
7, 16 e 30 dias após as queimaduras. Além disso, no 15
o
dia após a produção das
lesões foram avaliados os efeitos microbiológicos da LLLT através da contagem das
bactérias Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Os resultados
mostraram que o laser He-Ne (2,4 J/cm
2
) induziu a destruição das bactérias
estudadas. Além disso, a LLLT (1,2 J/cm
2
) causou um significante aumento na
Revisão de Literatura
72
média de secção de vasos sangüíneos na área da lâmina estudada no sétimo dia
após as queimaduras.
Corazza (2005) estudou os efeitos de um laser em baixa intensidade no
processo de angiogênese durante a cicatrização de feridas, produzidas de forma
circular (15 mm de diâmetro) no quadríceps de 120 ratos, os quais foram divididos
em cinco grupos: LASER5 (tratamento com laser GaAlAs, 5 J/cm
2
), LED5
(tratamento com LED, 5 J/cm
2
), LASER20 (tratamento com laser GaAlAs, 20 J/cm
2
),
LED20 (tratamento com LED, 20 J/cm
2
) e controle. Os grupos irradiados receberam
aplicação pontual de contato a cada 24 horas. Os resultados foram analisados 3, 7,
14 e 21 dias após a confecção das feridas cirúrgicas. Os tratamentos por irradiação
não influenciaram a redução da ferida de forma significativa. O grupo LED5
apresentou maior vascularização em relação aos outros grupos. Além disso, pode-
se perceber que os estímulos fotônicos nos três primeiros dias foram fundamentais
para a evolução da densidade de volume dos vasos sangüíneos. Portanto, ambas as
fontes de luz ajustadas a 5 J/cm
2
podem demonstrar resultados expressivos no
estímulo angiogênico em pele lesada.
Com o objetivo de determinar os efeitos dinâmicos do laser He-Ne (632,8
nm; 4,8 J/cm
2
) na cicatrização de feridas em ratos diabéticos, Maiya, Kumar e Rao
(2005) confeccionaram feridas circulares de 4 cm
2
no dorso de 48 animais que foram
divididos em dois grupos. Ambos os grupos, teste e controle, tiveram suas feridas
irradiadas durante cinco dias. Porém, o grupo controle foi irradiado com o laser
desligado, denotando-se num estudo cego. As análises bioquímicas e
histopatológicas das feridas mostraram que o grupo tratado com laserterapia teve o
processo de reparo melhorado e acelerado, sendo concluído no 18
o
dia no grupo
teste e no 59
o
dia no grupo controle.
Revisão de Literatura
73
Mohammed Ihsan (2005) avaliou a eficácia da irradiação com laser diodo
arsenieto de gálio e alumínio (10 mW, 904 nm) na promoção da circulação colateral
e aumento da microcirculação em artérias femurais de 34 coelhos, obstruídas
cirurgicamente. A irradiação laser foi realizada durante 10 minutos logo após o
procedimento operatório e nos três dias subseqüentes. Amostras de sangue e tecido
foram coletadas 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia, através do prévio
sacrifício de dois animais em cada tempo estipulado. Os resultados obtidos
mostraram um aumento significativo de fatores angiogênicos (adenosina, hormônio
do crescimento e fator de crescimento fibroblástico). Além disso, numerosos vasos
sangüíneos colaterais proliferaram nas áreas teciduais analisadas, com marcante
crescimento no diâmetro dos vasos originais. Portanto, a laserterapia em baixa
intensidade foi capaz de acelerar a circulação colateral e melhorar a microcirculação.
Salate et al. (2005) estudaram a influência do laser em baixa intensidade
no processo de angiogênese ocorrido durante o reparo tecidual. Para tanto, foram
realizadas rupturas parciais do tendão calcâneo direito de 96 ratos Wistar. Os
animais receberam tratamento com uma luz laser contínua (InGaAlP, 660 nm,
MMOptics
®
) em um ponto simples, durante 10 segundos. O primeiro grupo de
animais (n=24) foi subdividido e irradiado com uma dose igual a 2,5 J/cm
2
durante 3,
5 e 7 dias. O segundo grupo (n=24) foi irradiado com uma dose igual a 10 J/cm
2
da
mesma forma que o primeiro. Um terceiro grupo de animais (n=24) recebeu
tratamento laser com o equipamento desligado enquanto o quarto grupo (n=24) não
recebeu nenhum tipo de tratamento. Após os períodos estipulados, os animais foram
sacrificados, produzindo-se lâminas da região tendinosa, as quais foram coradas
com HE. Os vasos sangüíneos foram contados utilizando-se um sistema de vídeo
(Sony). Os resultados deste estudo indicaram que o número de vasos sangüíneos
Revisão de Literatura
74
aumentou notavelmente nos ratos tratados com laser quando comparados aos
animais do grupo controle. Além disso, pôde-se perceber que quanto maior a dose
utilizada, mais acentuada foi a resposta angiogênica, demonstrando que o laser em
baixa intensidade pode apresentar importante efeito na promoção da
neovascularização durante o reparo tendinoso.
Aimbire et al. (2006) estudaram a capacidade biomoduladora de um laser
em baixa intensidade (GaAlAs, 650 nm) sobre a inflamação aguda e o fator de
crescimento de necrose tumoral (TNF-α) após traumatismo pulmonar induzido por
complexo imune em ratos Wistar. Os animais foram irradiados utilizando-se três
diferentes densidades de potência (12,5; 31,25 e 62,5 mW/ cm
2
) durante 42
segundos, cinco minutos após a indução da reação imune. Após 4 horas do início do
procedimento, os animais foram sacrificados. Os níveis liberados de TNF- α foram
reduzidos, sendo altamente dependentes da densidade de potência utilizada. A
redução da liberação do fator de crescimento foi mais evidente quando a densidade
de potência igual a 31,25 mW/cm
2
e a dose total de energia de 0,11 J foram
utilizadas. Yu et al. (1994) também puderam concluir que a liberação de TGF-β
2
e
PDGF foi modulada em fibroblastos irradiados com luz laser utilizada em diversos
comprimentos de onda (630, 640, 650 e 660nm) e em duas dosimetrias diferentes
(2,4 e 4,8 J/cm
2
). Almeida-Lopes et al. (2001) observaram melhores resultados de
proliferação celular quando potências mais altas e tempos de irradiação menores
foram utilizados.
Gál et al. (2006) realizaram duas incisões paralelas na porção dorsal da
pele de 49 ratos Sprague-Dawley para avaliarem os efeitos histopatológicos da
irradiação com uso de luz laser (AlGaInP, contínuo, 670 nm, dose diária de 30 J/cm
2
)
durante o processo de reparo tecidual. A ferida lateral foi utilizada como controle e
Revisão de Literatura
75
não recebeu nenhum tipo de tratamento. Nos respectivos períodos de tempo de 24,
48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas após a cirurgia, sete animais foram sacrificados e
os sítios das feridas foram removidos para posterior produção de lâminas. Quando
comparada com o processo de cicatrização das feridas não irradiadas, o grupo teste
apresentou uma fase inflamatória de duração mais curta, bem como aceleração das
fases proliferativa e de maturação, influenciando positivamente durante todas as
fases do processo cicatricial ocorrido em pele de ratos.
Portanto, pode-se perceber que os resultados benéficos na utilização da
laserterapia em baixa intensidade durante o processo de reparo tecidual,
especialmente na angiogênese, são controversos. Pesquisas devem ser realizadas
com o objetivo de verificar a relevância deste procedimento clínico e o melhor
entendimento dos seus mecanismos de ação e interação biológica.
3 Proposição
3 Proposição3 Proposição
3 Proposição
Proposição
79
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo teve por objetivo investigar a correlação entre a cinética de
expressão de RNAm
para VEGF-A
165
durante o processo de reparo tecidual de
ferida cirúrgica em língua de ratos Wistar, sob irradiação e não irradiação com o
laser diodo arsenieto de gálio e alumínio (GaAlAs).
4 Material e Métodos
4 Material e Métodos4 Material e Métodos
4 Material e Métodos
Material e Métodos
83
MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais e caracterização dos grupos experimentais
Foram utilizados 45 ratos Wistar, machos, com peso entre 240 g e 340 g
(aproximadamente 60 dias de vida), provenientes do Biotério Central da Faculdade
de Odontologia de Bauru/ Universidade de São Paulo (FOB/USP). Após o
procedimento cirúrgico, os animais foram aleatoriamente divididos em três grupos:
GRUPO GI – Animais não operados (grupo controle);
GRUPO GII – Animais operados e não irradiados com o laser diodo Arsenieto de
Gálio e Alumínio;
GRUPO GIII – Animais operados e posteriormente irradiados com o laser diodo
Arsenieto de Gálio e Alumínio.
Após a marcação numérica aleatória de todos os animais, realizou-se a
pesagem dos ratos visando à observação dos seus padrões de crescimento e
desenvolvimento.
4.2 Excisão cirúrgica lingual
A manipulação animal seguiu o protocolo previamente aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa em Animais da FOB/USP (processo n
o
.02/2005,
Anexos A, B e C). Os animais de todos os grupos foram mantidos no Biotério Central
da FOB/USP e alimentados com ração normal e água ad libitum. No momento do
procedimento operatório, os animais foram anestesiados com tiopental sódico
Material e Métodos
84
(Thiopentax
®
, 60 mg/kg, via intra-peritoneal) e posteriormente pesados (Figuras 3A e
3B).
Através de excisão cirúrgica, uma ferida foi confeccionada na porção
lateral direita da língua de todos os animais envolvidos na pesquisa (Figura 3C).
Para tanto, foi utilizada uma lâmina de bisturi 15-C para o procedimento, enquanto
uma pinça hemostática reta foi responsável por padronizar a área de todas as
feridas, as quais se estendiam da superfície dorsal até a superfície ventral, com área
aproximada de 12,4 mm
2
(Figura 2). O sangramento produzido foi controlado pela
utilização de compressão local com gaze estéril, não sendo realizada sutura.
4.3 Utilização do laser diodo arsenieto de gálio e alumínio
Para a realização do procedimento terapêutico de irradiação laser em
baixa intensidade, foi utilizado o aparelho Twin Laser
®
, MMOptics, São Carlos, Brasil
(Figura 3D), previamente calibrado pelo fabricante. Este equipamento possui dois
comprimentos de onda, um no espectro vermelho visível e outro no infravermelho. O
aparelho adotado neste estudo opera com os seguintes parâmetros:
Figura 2 – Esquema representativo do procedimento de excisão cirúrgica em língua de rato. Medidas
realizadas em milímetros (mm).
Material e Métodos
85
• Meio ativo: Arsenieto de Gálio e Alumínio (GaAlAs);
• Alimentação: 127 – 220 V ~/ 50 – 60 Hz;
• Comprimentos de onda da luz: 660 nm (vermelho visível) e 780 nm
(infravermelho);
• Potência óptica útil: 40 mW (660 nm); 70 mW (780 nm);
• Área do feixe de saída: 0,04 cm
2
;
• Temporizador ajustável.
Este protocolo foi baseado no relatado por Lizarelli (2005). Com o objetivo
de promover cicatrização de feridas em tecidos moles, duas sessões de irradiação
laser foram realizadas: primeira sessão, imediatamente após o procedimento
cirúrgico (laser infravermelho, 35 J/cm
2
por ponto de aplicação); segunda sessão,
dois dias após a cirurgia (laser vermelho visível, 5 J/cm
2
por ponto de aplicação). Os
animais foram imobilizados e anestesiados de maneira similar ao procedimento
cirúrgico durante a segunda sessão terapêutica com o laser diodo GaAlAs. Neste
estudo, optou-se pela supressão da terceira sessão de irradiação sugerida por
Lizarelli (2005) em função do risco de morte produzido pela anestesia.
Em cada sessão, a irradiação laser foi realizada em dois pontos distintos,
no centro da área operada, tanto pela face dorsal como pela ventral (Figura 3E). A
ponta ativa do equipamento foi posicionada perpendicularmente ao tecido lingual a
uma distância aproximada de 1mm (DAMANTE, 2003). A duração da irradiação
laser em cada ponto da ferida obedeceu a seguinte relação: t (s) = DE (J/cm
2
) x S
(cm
2
)
/ P (W), ou seja, 20 s quando utilizado o laser infravermelho e 10 s quando foi
utilizado o laser vermelho visível (ALMEIDA-LOPES, 2004).
Material e Métodos
86
4.4 Critérios de exclusão da amostra
Animais que apresentassem condições pós-operatórias que poderiam
retardar o processo de reparo tecidual (PETERSON et al., 1998), como infecção,
presença de lacerações acidentais ocorridas durante o trans-operatório e problemas
de ordem sistêmica, seriam excluídos da amostra. Porém tais situações não foram
observadas em nenhum dos animais durante o transcorrer do estudo.
4.5 Obtenção de espécimes para execução dos experimentos e número de
animais
Os animais foram sacrificados 1, 3, 5 e 7 dias após a realização da
excisão cirúrgica lingual, por meio de dose excessiva de anestésico. Para cada um
dos dias estipulados, foram utilizados 5 animais de cada grupo (GII e GIII). Por meio
de biópsia tecidual, a porção anterior da língua foi removida imediatamente após o
sacrifício dos animais. Em seguida foram acondicionadas em tubos de
microcentrífuga contendo Trizol (0,1 g de tecido/1,0 mL de Trizol), previamente
pesados em balança de precisão (Figura 3F). Posteriormente foram congelados na
temperatura de –80
o
C, com o intuito de realizar os experimentos envolvendo a
técnica de RT-PCR.
Tabela 1 – Distribuição do número de animais por grupos e tempos de sacrifício em dias
Dia de Sacrifício
Grupos
1 3 5 7
Total
GI
0 0 0 5 5
GI
I
5 5 5 5 20
GII
I
5 5 5 5 20
Total
10 10 10 15
4
5
Material e Métodos
87
4.6 Extração de RNA total das biópsias de tecido lingual
A realização destes experimentos seguiu o protocolo para extração de
RNA estabelecido por Santos et al. (2002) e Santos et al. (2003), disciplina de
Farmacologia da FOB - USP. No momento da extração de RNA total pelo método
guanidino-isotiocianato-fenol-clorofórmio, os tubos foram descongelados e
novamente pesados em balança de precisão. Então, os tecidos foram
homogenizados (Figura 4A). Depois, os tubos foram incubados por 5 min a 4
o
C,
sendo logo em seguida adicionado um volume de 20% de clorofórmio em cada
amostra. Após este processo, os tubos foram vigorosamente agitados em vórtex e
deixados em repouso a 4
o
C por 5 min, procedendo-se a centrifugação (12.000 g, 25
min) das soluções contidas nos tubos (Figura 4B). A fase aquosa superior foi
recuperada em alíquotas de 500 µL (Figura 4C) e posteriormente colocadas em
tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 µL de isopropanol. Os tubos foram
mais uma vez agitados vigorosamente e deixados em repouso a 4
o
C por 15 min.
Após nova centrifugação (15.000 g, 20 min, 4
o
C), o sobrenadante foi descartado,
adicionando-se 1 mL de etanol 70% em solução com água com dietil pirocarbonato
(DEPC) 0,1%, agitando-se vigorosamente (Figura 4D). Mais dois procedimentos de
centrifugação (15.000 g, 10 min, 4
o
C) com 1 mL de etanol 70% foram realizados,
descartando-se o sobrenadante após cada etapa. Então, os tubos foram deixados
abertos em temperatura ambiente por 5 min dentro de uma capela de fluxo laminar
vertical, permitindo a secagem das amostras. Para nova dissolução do RNA total
precipitado, foi utilizado um volume de 50 µL de água tratada com DEPC 0,1% em
cada tubo de microcentrífuga, os quais foram incubados a 65
o
C por 30 min.
Material e Métodos
88
Figura 3 – Seqüência de procedimentos operatórios. A) animal anestesiado; B) animal posicionado
na mesa cirúrgica; C) confecção de ferida cirúrgica lingual; D) aparelho laser utilizado (Twin Laser,
MM Optics); E) irradiação laser em baixa intensidade; F) biópsia lingual em tubo de microcentríguga
contendo trizol.
Material e Métodos
89
4.7 Quantificação do RNA total
A concentração de RNA total nas amostras foi determinada por diluição do
RNA (fator de diluição conhecido, igual a 0,25) e leitura da absorbância da amostra
em cubetas de quartzo em espectrofotômetro (Figura 4E) no comprimento de onda
de 260 nm (A
260
). A fórmula para calcular a concentração de RNA total foi a
seguinte: [RNA] = A
260
x 40 x fator de diluição conhecido, sendo o resultado
expresso em µg/mL. Essa metodologia foi utilizada previamente por Santos et al.,
(2002) e Santos et al. (2003).
4.8 Avaliação da qualidade do RNA total
A qualidade do RNA total nas amostras foi determinada pela diluição do
RNA em Tris-HCl (10 mM, pH 7,8) e leitura da absorbância da amostra em cubetas
de quartzo em espectrofotômetro (Figura 4E) nos comprimentos de onda de 260 e
280 nm (A
260
e A
280
). A relação A
260
/A
280
foi calculada
,
sendo considerados aceitáveis
apenas os valores que estivessem entre 1,9 e 2,1, indicando ausência de DNA na
amostra analisada.
4.9 Tratamento do RNA total com DNAse
Para evitar a possibilidade de contaminação do RNA total extraído de
diferentes tecidos e células por DNA genômico, foi realizado tratamento de todas as
amostras com DNAse (RQ1 RNase – Free DNAse
®
, Promega Corporation).
Alíquotas volumétricas diferentes foram utilizadas para a obtenção de uma
Material e Métodos
90
quantidade padronizada de 2 µg de RNA total em cada amostra do estudo (tabela 4).
A quantidade final de 2 µg de RNA total foi tratada com 2 µL de DNAse. Em cada
tubo de microcentrífuga também foi adicionado mais 1 µL do tampão específico para
este tipo de reação (RQ1 RNase-Free 10X Reaction Buffer
®
, Promega Corporation).
Todos os tubos foram incubados a 37
o
C durante 30 minutos. Posteriormente, com o
objetivo de cessar a reação, foi adicionado um volume de 1 µL de RQ1 DNAse Stop
Solution
®
(Promega Corporation) em cada amostra, de acordo com as instruções do
fabricante. Para finalizar o procedimento de tratamento com DNAse, cada tubo foi
incubado a 65
o
C por 10 minutos. As amostras de RNA total tratadas com DNAse
foram mantidas a –80
o
C até o momento oportuno de uso.
4.10 Transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR)
A realização destes experimentos também seguiu as descrições
realizadas em trabalhos da disciplina de Farmacologia da FOB-USP (SANTOS et al.,
2002; SANTOS et al., 2003). Todo o RNA total tratado com DNAse foi utilizado para
a síntese de cDNA, realizada em um volume de reação total de 33 µL, utilizando-se
2 µg de RNA total, 0,2 µg de hexadeoxinucleotídeos, tampão para RT
(concentrações finais: Tris-HCl 45 mM pH 8,3; KCl 68 mM e MgCl
2
9 mM),
soroalbumina bovina 0,08 mg/mL, DTT 15 mM, dNTPs 1,8 mM e 150 U de
transcriptase reversa. Todos os reagentes citados fazem parte do First-strand cDNA
synthesis kit
®
(Amersham Bioscience, E.U.A.). O cDNA foi sintetizado pelo uso de
um termociclador (Figura 4F) após um período de 60 min de incubação a 37
o
C. A
reação foi paralisada pelo aquecimento a 90
o
C por 5 min. Os produtos da RT (3 µL)
serviram de molde para a amplificação por PCR. Todas as reações foram realizadas
Material e Métodos
91
num volume de 50 µL em tubos “Hot start” com os seguintes reagentes: 20 pmol (0,4
µM) de cada “primer” (“sense” e “anti-sense” para cada alvo, Tabela 2), tampão para
PCR (concentrações finais: Tris-HCl 20 mM pH 8,4; KCl 50 mM e MgCl
2
1,5 mM),
dNTPs (0,2 mM) e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Go Taq
®
DNA Polymerase,
Promega). O processo de ciclagem térmica consistiu de desnaturação inicial (2
min/94
o
C, VEGF-A
165
; 2 min/95
o
C, GAPDH) seguida de 45 ciclos de amplificação.
Cada ciclo consistiu das fases de desnaturação, anelamento e extensão, sendo as
temperaturas e tempos de cada fase padronizados de acordo com os “primers”
utilizados: VEGF, 94
o
C, 1 min, desnaturação; 65
o
C, 30 s, anelamento; 72
o
C, 1 min,
extensão; GAPDH, 95
o
C, 30 s, desnaturação; 60
o
C, 30 s, anelamento; 72
o
C, 1 min
30 s, extensão. Os “primers” para o GAPDH foram utilizados como controle positivo
(SANTOS et al., 2002; SANTOS et al., 2003). Todas as amostras foram incubadas
por um período adicional de 10 min a 72
o
C após o término do último ciclo (extensão
final). Para cada par de “primers” foi realizada PCR em água estéril para avaliação
de possível contaminação dos primers (controle negativo água). Um novo controle
negativo foi realizado para cada amostra de tecido, utilizando-se RNA como molde
de PCR para avaliação de possível contaminação por DNA genômico (no-RT). Uma
alíquota de 10 µL de cada amostra foi analisada por meio de eletroforese horizontal
(Figura 4G), em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (0,64 µg/mL). O
peso molecular dos produtos da PCR foi determinado pela comparação com um
marcador com intervalos de peso molecular igual a 100 pb. O cDNA foi visualizado
sob luz ultra-violeta para a detecção da presença de produtos amplificados de
tamanhos antecipados (Figura 4H). Nesse momento foram realizadas fotografias do
gel (fotodocumentação) utilizando uma câmera Sony V1 (zoom óptico de 4X,
distância padrão de 21 cm do centro do gel; filtro Kodak UV).
Material e Métodos
92
Figura 4 – Seqüência de procedimentos laboratoriais. A) homogeinização do tecido lingual; B) tubos
posicionados no interior de centrífuga; C) aspecto da solução após centrifugação (observação do
precipitado); D) fase sólida representa o RNA total; E) leitura da absorbância em espectrofotômetro;
F) termociclador utilizado durante a RT-PCR; G) gel de agarose a 2% carregado para início da
eletroforese; H) resultado final da eletroforese revelando os produtos previamente esperados.
Material e Métodos
93
Todos os experimentos envolvendo as técnicas de extração de RNA total
e RT-PCR foram realizados no laboratório da disciplina de Farmacologia da
Faculdade de Odontologia de Bauru – USP.
Tabela 2 – Primers utilizados na PCR para os diferentes alvos e tamanhos antecipados dos produtos
de amplificação
Alvo
Tamanho
antecipado
Sense (5’-3’)
Anti-sense (5’-3’)
GAPDH
318 pb
GAAGGGTGG
GGCCAAAAG
GGATGCAGGG
ATGATGTTCT
VEGF-A
165
80 pb
ATCATGCGGAT
CAAACCTCACC
GGTCTGCATTCA
CATCTGCTATGC
4.11 Estudo da intensidade de expressão de RNAm para VEGF-A
165
Utilizando-se como parâmetro de comparação os valores de intensidade
de banda obtidos para o GAPDH, proteína cujo gene é expresso constitutivamente,
foi realizada análise semi-quantitativa para cada amostra de tecido lingual. Para
tanto, foi empregado o software Scion Image
®
(Scion Corporation, Frederick,
Maryland, E.U.A.), de acordo com as orientações do fabricante. Para estimar o valor
do erro intra-examinador sistemático do método, a intensidade das bandas de
metade da amostra foi novamente avaliada trinta dias após a análise inicial. Foi
obtida uma relação entre a intensidade da banda de GAPDH e da banda de VEGF-
A
165
no gel de agarose para cada amostra. Esta relação foi posteriormente utilizada
para os estudos de correlação entre a expressão de RNAm para VEGF-A
165
entre os
grupos GI, GII e GIII (Figura 7).
Material e Métodos
94
4.12 Análise estatística
Os dados foram coletados e posteriormente analisados, através da
utilização do software Statistica 5.0 (StatSoft
Inc., Tulsa, E.U.A.). Para observar
diferenças entre a expressão de RNAm para VEGF-A
165
entre os grupos GI, GII e
GIII, foi utilizada análise de variância a dois critérios seguida pelo teste de Tukey.
Para avaliar as diferenças entre os índices de variação dos pesos dos animais dos
diversos grupos, procedeu-se o uso da análise de variância a um critério seguida
pelo teste de Tukey. Em todos os testes, o nível de significância de 5% foi adotado
para que as diferenças fossem consideradas estatisticamente significativas. Além
disso, o teste de correlação de Pearson foi utilizado para observar a existência de
relação entre concentração de RNA total obtida e o peso do produto da biópsia
tecidual proveniente de amostras de língua de ratos. O teste t pareado foi usado
para analisar o erro intra-examinador sistemático do método, através da comparação
dos valores da expressão de RNAm para VEGF-A
165
em duplicata, obtidos em duas
análises distintas com intervalo de trinta dias. Valores de p>0,05 foram considerados
para estimar a viabilidade de utilização do método proposto.
5 Resultados
5 Resultados5 Resultados
5 Resultados
Resultados
97
5 RESULTADOS
Durante todo o estudo foram operados 49 animais, dos quais 4 (8,16%)
foram perdidos por óbito, sendo 1 (2,04%) durante o procedimento cirúrgico e 3
(6,12%) durante as primeiras 24 horas do pós-operatório.
Os animais de cada grupo foram pesados em balança própria nos dias 0,
1, 2, 4 e 6, até o momento do sacrifício, com o intuito de realizar a observação da
interferência dos procedimentos clínicos no crescimento e desenvolvimento dos
ratos durante o transcorrer da pesquisa. Todos os grupos e respectivos subgrupos
puderam ser diretamente comparados com os cinco animais pertencentes ao grupo
controle (GI), os quais não sofreram nenhum tipo de manipulação (Figura 5, Tabela
3).
Figura 5 – Média da variação percentual de peso dos animais durante o período experimental. A)
animais sacrificados no 1
o
dia; B) animais sacrificados no 3
o
dia; C) animais sacrificados no 5
o
dia; D)
animais sacrificados no 7
o
dia. As linhas amarelas correspondem aos valores do grupo controle (GI),
enquanto as linhas azuis correspondem ao grupo GII e as vermelhas ao grupo GIII.
O peso dos animais variou de 242 g a 336 g (dia 0), 233 g a 339 g (dia 1), 235
g a 340 g (dia 2), 239 g a 357 g (dia 4) e 254 g a 337 g (dia 6). Nos grupos GII e GIII
-3,00
-2,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
Variação de peso (%)
-4,00
-2,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
Variação de peso (%)
-6,00
-4,00
-2,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
Variação de peso (%)
-4,00
-2,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
Variação de peso (%)
A
B
D
C
Resultados
98
e em seus subgrupos (1, 3, 5 e 7 dias), foi observada uma tendência de perda de
peso até o segundo dia do pós-operatório, principalmente durante o primeiro dia
após a cirurgia. A partir do quarto dia, foi verificada uma tendência de recuperação
de peso em relação ao segundo dia. Os 20 (100%) animais pertencentes aos
subgrupos 5 e 7 dias, de ambos os grupos, ganharam peso entre os dias 2 e 4,
sendo que 14 (70%) ultrapassaram ou igualaram os valores de peso iniciais (dia 0).
Os animais do grupo GI não perderam peso de forma significativa em
nenhum momento do estudo. Os maiores índices de ganho de peso foram
observados durante os dois primeiros dias. A partir de então, os índices tornaram-se
mais homogêneos, sendo que durante o intervalo do segundo e quarto dias do
experimento, foi observada uma perda média de peso de 0,16%. No sexto dia,
porém, estes mesmos animais voltaram a ganhar peso em relação ao dia de
controle anterior (dia 4).
A análise de variância a um critério demonstrou haver diferenças
estatisticamente significativas entre as médias de variação de peso dos grupos GI,
GII e GIII durante os dias 1, 2, 4 (p<0,001) e 6 (p=0,029) após o procedimento
operatório. O teste de Tukey determinou as diferenças entre os grupos em cada
período do controle de peso. Nos dias 1 e 2, a média de variação de peso do grupo
GI (Tabela 3, Apêndice A) foi significativamente maior que as dos grupos GII e GIII
(p<0,001), enquanto a média de variação de peso do grupo GII mostrou-se
estatisticamente maior que a do grupo GIII (p<0,001). No dia 4, a média de variação
de peso entre os grupos GI, GII e GIII apresentou similaridade estatística aos dois
primeiros dias de análise, sendo que a média do grupo GI foi maior que a dos
grupos GII (p=0,004) e GIII (p<0,001), enquanto que a média do grupo GII foi maior
que a do grupo GIII (p=0,006). Durante o sexto dia de análise das médias de
Resultados
99
variação de peso entre os grupos, foram observadas diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos GI e GIII (p=0,023), não ocorrendo o mesmo quando
foram comparados os grupos GI e GII (p=0,409) e GII e GIII (p=0,220). No sexto dia
de análise, o número de animais avaliados foi sensivelmente reduzido (Tabela 3), o
que dificultou a demonstração de diferenças estatisticamente significativas neste
período.
Tabela 3 – Média da variação de peso, em porcentagem, dos grupos GI, GII e GIII, seguido dos
respectivos valores de desvio-padrão. O número de animais avaliados em cada período de tempo
pode ser observado entre parênteses
Dias de análise do controle de peso GRUPOS
1 (45) 2 (35) 4 (25) 6 (15)
GI 3,88 ± 0,68 7,83 ± 1,22 7,66 ± 1,10 8,44 ± 1,33
GII - 0,49 ± 0,94 - 0,50 ± 1,20 3,62 ± 2,48 6,50 ± 2,77
GIII
-1,89 ± 0,91 - 2,95 ± 1,53 0,51 ± 1,81 3,89 ± 2,61
Com o intuito de verificar o peso das amostras de tecido lingual após
biópsia, realizou-se a pesagem prévia dos tubos de microcentrífuga em balança de
precisão. No momento oportuno, os tubos e o conteúdo biológico foram
descongelados e novamente pesados. Os valores obtidos foram expressos em
miligramas (mg), os quais variaram de 106,2 mg a 257,10 mg. Foi observada uma
correlação positiva média entre os valores de peso da biópsia de tecido lingual e a
concentração final de RNA total obtida após o processo de extração (teste de
correlação de Pearson, r=0,4894) (Figura 6). Para obtenção de uma quantidade
padronizada de RNA (2 µg), foram coletados volumes diferentes das diversas
amostras (Tabela 4).
Resultados
100
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00
Peso do tecido proveniente de biópsia lingual
[RNA total]
Figura 6 – Estudo da correlação entre o peso da amostra de tecido proveniente de biópsia lingual e
concentração de RNA total.
Após a realização de RT-PCR, foi realizada eletroforese horizontal em gel
de agarose a 2%. Os géis foram fotografados, sendo que as intensidades de banda
de RNAm para GAPDH e VEGF-A
165
foram determinadas pela utilização do
software Scion Image
®
, específico para esta finalidade. Para avaliar o erro intra-
examinador sistemático do método, procedeu-se a realização do teste t pareado
(p=0,377). Em acordo com a proposta do trabalho, observou-se a viabilidade de
utilização do método de análise. Portanto, através do valor obtido pela relação entre
intensidade de banda de RNAm para GAPDH e VEGF-A
165,
pode-se comparar a
expressão de RNAm para VEGF-A
165
entre os grupos GI, GII e GIII nos diferentes
períodos de tempo do estudo.
Por intermédio da análise de variância a dois critérios, pode-se notar
interação entre as variáveis grupo e tempo (F=8,1505). Além disso, foram
observadas diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre os diferentes
tempos (p<0,001) e subgrupos analisados (p<0,001), formados a partir da interação
grupo e tempo. Porém, quando o tempo não foi levado em consideração, diferenças
Resultados
101
significativas entre os grupos GI, GII e GIII não foram observadas (p=0,1765).
Portanto, subsídios iniciais foram apresentados para a provável rejeição da hipótese
Tabela 4 – Valores de peso total (mg) do tecido lingual para extração de RNA total, concentração final
de RNA total por amostra tecidual e volume (µL) utilizado para padronização da obtenção de 2 µg de
RNA de cada amostra para realização de RT-PCR
Amostra
Peso do tecido
após biópsia (mg)
[RNA] µg/µL Volume de amostra final
para 2 µg de RNA (µL)
1 209,70 3,07 0,65
2 182,60 3,74 0,53
3 257,10 6,20 0,32
4 199,30 2,33 0,86
5 143,00 2,30 0,87
6 170,70 3,07 0,65
7 183,70 5,00 0,40
8 158,50 3,96 0,50
9 196,30 1,81 1,10
10 207,30 4,55 0,44
11 143,20 3,68 0,54
12 172,50 2,50 0,80
13 240,10 6,87 0,29
14 133,00 2,68 0,75
15 173,70 4,89 0,41
16 135,80 2,75 0,73
17 169,10 3,64 0,55
18 168,30 4,34 0,46
19 181,50 3,84 0,52
20 184,40 3,95 0,50
21 142,60 2,12 0,94
22 187,20 3,79 0,53
23 134,20 3,88 0,51
24 168,50 3,19 0,66
25 154,20 2,98 0,67
26 166,00 3,82 0,52
27 125,40 2,72 0,73
28 184,90 3,56 0,56
29 170,90 2,42 0,83
30 125,60 3,16 0,63
31 142,30 2,08 0,96
32 170,40 3,72 0,54
33 155,90 4,39 0,45
34 154,80 3,77 0,53
35 145,60 5,18 0,39
36 127,60 3,79 0,53
37 146,90 4,05 0,49
38 130,10 2,25 0,89
39 136,40 4,22 0,47
40 106,20 2,52 0,57
41 152,20 1,93 1,04
42 154,20 2,48 0,80
43 174,70 2,98 0,67
44 178,80 2,65 0,75
45 148,00 2,41 0,83
Resultados
102
nula, ou seja, a afirmação de não haver diferenças estatisticamente significativas na
comparação da expressão de RNAm para VEGF-A
165
entre os diferentes grupos e
tempos estudados.
O teste de Tukey determinou onde ocorreram as diferenças
estatisticamente significativas na expressão de RNAm para VEGF-A
165
quando
foram comparados tempos e subgrupos diversos, adotando-se nível de significância
igual a 5%. Quando os grupos GII e GIII, nos diferentes tempos estudados, foram
comparados isoladamente ao grupo GI, pode-se observar uma diferença
estatisticamente significativa apenas em relação ao grupo GII, subgrupo 1 dia
(p=0,0285). Os demais subgrupos dos grupos GII e GIII não apresentaram
diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo GI.
Quando os níveis de expressão de RNAm para VEGF-A
165
foram
comparados nos diferentes tempos de um mesmo grupo, foram observadas
diferenças estatisticamente significantes entre: GII, 1 dia e 5 dias (p<0,001); GII, 1
dia e 7 dias (p<0,001); GII, 3 dias e 5 dias (p=0,002); GII, 3 dias e 7 dias (p=0,0051);
GIII, 3 dias e 5 dias (p=0,0268). Portanto, a média de expressão de VEGF-A
165
variou mais dentro do grupo GII quando comparado com o grupo GIII.
Quando os níveis de expressão de RNAm para VEGF-A
165
foram
comparados entre os grupos GII e GIII nos mesmos períodos de tempo, foram
observadas diferenças estatisticamente significantes apenas no primeiro dia
(p=0,0101). Portanto, pode-se notar uma interferência da terapêutica utilizada na
expressão de RNAm para VEGF-A
165
(Figuras 7 e 8).
Resultados
103
1L1C
3L
3C 5C 5L 7C 7L GI H
2
O no-RT GAPDH1L1C
3L
3C 5C 5L 7C 7L GI H
2
O no-RT GAPDH
Figura 7 – Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio dos produtos da RT-PCR para
detecção e quantificação da expressão de RNAm para VEGF-A
165
no tecido lingual dos 45 ratos
estudados. As bandas representam os grupos GI, GII (C) e GIII (L) nos diferentes períodos do estudo,
além dos controles positivo (GAPDH) e negativo (no-RT).
Figura 8 – Média dos valores obtidos pela razão da intensidade de banda de GAPDH e VEGF-A
165
nos grupos GI, GII e GIII e respectivos períodos de análise (1, 3, 5 e 7 dias). Em cada subgrupo
encontram-se representados os determinados valores de erro padrão. A presença de asterisco (*)
indica diferença estatisticamente significativa entre os grupos no mesmo período de análise.
Mesmo não tendo sido observadas diferenças estatisticamente
significativas a partir do 3º dia de análise do presente estudo, a laserterapia em
baixa intensidade parece ter influenciado o aumento dos níveis de expressão de
Resultados
104
RNAm para VEGF-A
165
no grupo GIII em relação ao grupo GII. A comparação entre
as médias dos dois grupos nos mesmos períodos de tempo pode elucidar esta
observação (Figuras 7 e 8, Tabela 5, Apêndices B e C).
Quando os níveis de expressão de RNAm para VEGF-A
165
dos grupos GII
e GIII foram comparados durante o terceiro, quinto e sétimo dias de análise, pode-se
observar que o grupo GIII apresentou valores 8,68%, 37,43% e 46,82% maiores que
os do grupo GII, respectivamente.
Tabela 5 – Resultados da expressão média de VEGF-A
165
nos grupos GI, GII e GIII. Valores
numéricos obtidos através da razão entre a intensidade de banda de GAPDH e VEGF-A
165
após
fotodocumentação e análise no programa Scion Image
®
. Letras maiúsculas semelhantes indicam
diferença estatisticamente significativa entre os valores comparados na mesma linha, enquanto letras
minúsculas semelhantes indicam diferença estatisticamente significativa entre os valores comparados
na mesma coluna
PERÍODO DE
SACRIFÍCIO
(DIAS)
GII
GIII
1 0,770 ± 0,098
Aabc
0,504 ± 0,069
A
3 0,661 ± 0,114
de
0,699 ± 0,022
a
5 0,317 ± 0,083
bd
0,487 ± 0,053
a
7 0,426 ± 0,426
ce
0,575 ± 0,072
GI (7) 0,523 ± 0,164
a
0,523 ± 0,164
6 Discussão
6 Discussão6 Discussão
6 Discussão
Discussão
107
6 DISCUSSÃO
6.1 A respeito da metodologia utilizada
Na tentativa de promover maior conforto ao paciente após procedimentos
operatórios, as ciências da saúde vêm se preocupando constantemente com o
desenvolvimento de mecanismos e técnicas capazes de minimizar os sinais
clássicos da inflamação, como dor e edema, e acelerar o processo de reparo
tecidual. A utilização de analgésicos e antiinflamatórios tem por objetivos melhorar o
resultado clínico do sítio cirúrgico e possibilitar a mínima interferência na rotina de
vida do paciente no transcorrer do pós-operatório, contribuindo para a maior
qualidade de vida.
A terapia laser em baixa intensidade se utiliza de energia física não
invasiva com o intuito de melhorar os processos de cicatrização, reparo ósseo e
nervoso, regeneração muscular e controle da dor (TAKEDA, 1988; REDDY, 2003;
ALMEIDA-LOPES, 2004; CORAZZA, 2005; LIZARELLI, 2005). Esta técnica emergiu
nos últimos anos como uma nova modalidade terapêutica. Porém, ainda não está
sendo indicada como tratamento de escolha, mas sim como um auxiliar que pode
modular a quantidade e qualidade de processos biológicos relacionados à
recuperação da homeostasia durante o reparo tecidual (OSHIRO; CALDERHEAD,
1991).
A qualidade dos trabalhos científicos que estudam os efeitos da
laserterapia em baixa intensidade (LLLT) é questionável. Pesquisadores criticam a
utilização indiscriminada e empírica da LLLT em humanos (CULLUM et al., 2001), já
que os resultados deste tratamento em animais e em cultura de células parecem não
Discussão
108
ser conclusivos (LUCAS et al., 2002). A possível biomodulação de processos
fisiológicos e patológicos é controversa, principalmente quando baseada em
resultados de alguns estudos clínicos aleatorizados duplo-cegos (BEZUUR;
HABETS; HANSSON, 1988; HANSEN; THOR, 1990; FERNANDO; HILL; WALKER,
1993). Mesmo assim, os trabalhos de metanálise de Enwemeka et al. (2004) e
Woodruff et al. (2004) mostraram que a terapia laser em baixa intensidade é eficaz
no controle da dor e reparo tecidual em humanos.
A motivação do presente trabalho surgiu da necessidade de maiores
evidências científicas que pudessem contribuir e auxiliar na tomada de decisão para
indicar o uso clínico da terapia laser em baixa intensidade de forma a atuar no
controle do processo biomodulatório da reparação tecidual. Estudos prévios (LYONS
et al., 1987; KAMEYA et al., 1995) referiram a capacidade da LLLT em produzir
ácidos nucléicos. Além disso, sabe-se que a neoformação de vasos é preponderante
para que ocorra o reparo de tecidos (FOLKMAN; SHING, 1992). O fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) é em grande parte responsável pelo
estímulo da proliferação e diferenciação de células endoteliais, e, portanto, pelo
aumento de novos vasos sangüíneos (FERRARA, 1996; MCCOURT et al., 1996).
Mais especificamente, o VEGF-A é considerada uma molécula chave na indução de
angiogênese e vasculogênese (ROY; BHARDWAJ; HERTTUALA, 2006), sendo que
o VEGF-A
165
está entre suas isoformas mais abundantes (NOMI et al., 2002).
Portanto, o estudo in vivo da modulação do RNAm para VEGF-A
165
pelo laser em
baixa intensidade pode contribuir para a elucidação da interferência de terapias
fotônicas durante o processo de cicatrização e reparo, principalmente pela utilização
de variáveis objetivas, como a expressão de RNAm e proteínas.
Discussão
109
Os motivos que podem justificar a escolha pela confecção de feridas
padronizadas em língua de ratos Wistar através de excisão cirúrgica são muitos. O
primeiro deles é a facilidade de acesso durante o procedimento operatório e
obtenção de biópsias teciduais para o estudo da expressão de RNAm para VEGF-
A
165
. O segundo motivo foi o interesse em verificar a capacidade de biomodulação
do fator de crescimento endotelial vascular promovida pela LLLT em tecidos moles
bucais. Além disso, procedimentos de incisão e excisão cirúrgica em língua de ratos
já foram bastante utilizados como parte de protocolos metodológicos (LUOMANEN;
VIRTANEN, 1991; LUOMANEN; VIRTANEN, 1993; EVRARD; NAMMOUR;
DOUROV, 1996; CAREW et al., 1998; ZEINOUN et al., 2001; CAMACHO-ALONSO;
LÓPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005), os quais não apresentavam os
mesmos objetivos de estudo, porém sempre necessitaram do acompanhamento da
dinâmica do processo de reparo neste tecido.
A maioria dos trabalhos que se preocupa com a influência da LLLT no
reparo tecidual utiliza como modelo a pele de animais (ATABEY et al., 1995; AL-
WATBAN; ZHANG, 1999; WALKER et al., 2000; REDDY, 2003; CORAZZA, 2005).
Contudo, o interesse pelo entendimento da laserterapia em baixa intensidade no
processo de reparo de tecidos bucais motivou o desenvolvimento de um novo
protocolo metodológico. A viabilidade deste trabalho foi verificada através de
informações obtidas na literatura em relação à anatomia e histologia da língua de
ratos. A superfície dorsal da língua é constituída por uma fina camada de epitélio
escamoso estratificado queratinizado, rico em papilas gustativas. A lâmina própria,
uma pequena banda de tecido conjuntivo fibroso entre o epitélio e uma subcamada
de feixes musculares, forma numerosas papilas inter-epiteliais produzindo uma
borda de epitélio ondulada e irregular. Os músculos são todos estriados e conectam
Discussão
110
o osso hióide, mandíbula e cartilagens da laringe. Os feixes musculares são
separados por uma fina camada de fibras elásticas e tecido conjuntivo adiposo,
oferecendo suporte para vasos sangüíneos e linfáticos, fibras nervosas e gânglios
(HUMMEL; RICHARDSON; FEKETE, 1966). Além disso, Luomanen (1987) observou
intensa proliferação capilar em língua de ratos após realização de incisão cirúrgica
com uso de lâmina de bisturi, o que comprova a capacidade de neoformação de
vasos nesse tecido e a possibilidade do estudo da expressão de RNAm para VEGF-
A
165
neste órgão.
A ponta ativa de uma pinça hemostática reta serviu como mapa para
obtenção de medidas padronizadas da forma e tamanho da ferida cirúrgica. As
excisões teciduais sempre foram realizadas entre a linha média e a borda lateral
direita da língua com o uso de lâmina de bisturi 15-C. Este tipo de procedimento
operatório foi escolhido por oferecer algumas vantagens, como a confecção de um
defeito de grande volume, envolvimento de todos os tecidos presentes no órgão e
capacidade para realização de análises químicas, histológicas e celulares do local
estudado. Além disso, segundo Davidson (1998), o processo de angiogênese pode
ser melhor monitorado durante o reparo tecidual deste tipo de ferida cirúrgica.
Os parâmetros técnicos relacionados ao aparelho laser utilizado (Twin
Laser, MMOptics
®
) foram adotados de acordo com suas definições prévias. O
protocolo de irradiação laser das feridas linguais utilizado neste estudo foi baseado
em informações de Lizarelli (2005). Este autor recomenda a irradiação de toda a
extensão da lesão de tecidos moles humanos com laser infravermelho (70 mW, 780
nm, 35 J/cm
2
, 20s) logo após o procedimento operatório, além de mais duas sessões
de irradiação da ferida com laser vermelho visível (40 mW, 660 nm, 5 J/cm
2
, 10s),
48h e 72h após a cirurgia. Porém, no presente trabalho, apenas dois pontos do
Discussão
111
ferimento, um localizado no dorso e o outro no ventre da língua, foram irradiados
pela luz laser, atingindo praticamente toda a extensão da ferida cirúrgica devido ao
seu pequeno tamanho. A quantidade de pontos determinados para o procedimento
de irradiação laser na ferida pode ser considerado apenas mais um parâmetro
determinado pelo desenho metodológico do estudo, já que a proposta não foi
comparar a qualidade do processo de reparo tecidual das feridas entre os grupos,
mas sim a expressão de um fator de crescimento relacionado a ele. Deve-se
salientar, ainda, que o protocolo proposto por Lizarelli (2005) se refere à utilização
do laser em humanos e, portanto, as condições deste trabalho foram adaptadas para
experimentação animal. Sendo assim, levando-se em consideração limitações como
a necessidade de aplicação repetida de anestesia geral, tamanho dos animais, área
da ferida cirúrgica e altas dosimetrias utilizadas, optou-se pela supressão da última
sessão de irradiação com o laser vermelho visível.
O número de sessões de LLLT e os parâmetros de utilização do laser
variam muito nos trabalhos analisados (WEBB; DYSON; LEWIS, 1998; AGAIBY et
al., 2000; ALMEIDA-LOPES et al., 2001; KIPSHIDZE et al., 2001; LUCAS et al.,
2002; SUTHIN et al., 2003; MEDRADO et al., 2003; PUGLIESE et al., 2003; REDDY,
2003; WOODRUFF et al., 2004; CORAZZA, 2005; POURZARANDIAN et al., 2005;
SALATE et al., 2005). Normalmente, os trabalhos até então publicados se utilizam
da irradiação laser em apenas um comprimento de onda em cada grupo de animais
e/ou células estudados. No presente trabalho, cada animal foi irradiado com dois
comprimentos de onda distintos, o que é bastante incomum ou até mesmo
inexistente na literatura, porém recomendado por Lizarelli (2005). A dificuldade de
desenvolvimento de protocolos clínicos padronizados para aplicação da LLLT em
humanos e animais sugere trabalhos que se preocupem com o estudo da interação
Discussão
112
de diferentes comprimentos de onda e densidade de energia, com o intuito de
entender melhor as influências deste tipo de tratamento nos tecidos biológicos
(TAKEDA, 1988; ALMEIDA-LOPES et al., 2001; KIPSHIDZE et al., 2001; REDDY,
2003; SALATE et al., 2005).
A divisão do número total de animais em dois grupos foi determinada pela
simples necessidade de se comparar a diferença entre a expressão do fator de
crescimento endotelial vascular após exposição ou não à irradiação laser (GaAlAs).
Cada grupo foi dividido em quatro subgrupos determinados pelos tempos de
sacrifício dos animais após o procedimento operatório (1, 3, 5 e 7 dias). Estes
tempos foram baseados nas sessões de laserterapia, realizadas até 48h depois da
cirurgia, permitindo que os efeitos residuais do tratamento pudessem ser
observados. Alguns autores que estudaram o reparo tecidual em ratos Wistar se
utilizaram do mesmo período de tempo de análise do presente trabalho (TAKEDA,
1988; SALATE et al., 2005). Portanto, o curto espaço de tempo do estudo foi
propositado, buscando-se a interferência imediata da terapia fotônica na modulação
do RNAm para VEGF-A
165
.
As análises laboratoriais da expressão de RNAm para VEGF-A
165
e
GAPDH foram conduzidas de acordo com protocolos previamente definidos por
estudos realizados pela disciplina de Farmacologia da Faculdade de Odontologia de
Bauru (SANTOS et al., 2002; SANTOS et al., 2003). Após a quantificação do RNA
total extraído de todas as amostras teciduais, foi necessária a padronização da
quantidade de RNA necessária para a continuação dos procedimentos laboratoriais.
Portanto, o resultado da expressão de RNAm para VEGF-A
165
não foi influenciado
diretamente pelo peso do tecido lingual presente em cada amostra. Sabendo-se que
cada micrograma (µg) de RNA total deveria ser tratado com 1 µL de DNAse, houve
Discussão
113
necessidade de diluir todas as amostras de RNA total para que o volume de DNAse
utilizado não prejudicasse a qualidade das reações e alteração da resposta da
eletroforese. Uma quantidade de 2 µg de RNA total foi utilizada para a continuação
dos procedimentos. Para evitar a saturação dos produtos esperados, foram
utilizados 45 ciclos de termociclagem, não atingindo a fase tardia da PCR. A
expressão dos RNAm de ambos os alvos foi avaliada após fotodocumentação das
imagens reveladas pela transiluminação dos géis de agarose provenientes da
eletroforese horizontal. Similarmente ao estudo de Kipshidze et al. (2001), as
intensidades das bandas foram analisadas por um software, no caso o Scion
Image
®
, específico para esta finalidade. A análise do erro do método sistemático
intra-examinador demonstrou a viabilidade de utilização dos dados obtidos.
6.2 Dos resultados obtidos
6.2.1 Em relação à variação de peso dos animais
Com o objetivo de monitorar um parâmetro fisiológico relacionado à
qualidade do crescimento e desenvolvimento dos animais, foi realizado o processo
de pesagem 0, 1, 2, 4 e 6 dias após o procedimento operatório. Pela análise dos
presentes dados, pode-se notar uma tendência de perda de peso dos animais
pertencentes aos grupos GII e GIII até dois dias após a cirurgia, enquanto o grupo
GI ganhou peso neste período. Esta diferença pode ser explicada pela confecção da
ferida cirúrgica na língua dos ratos, o que sugere maior dificuldade de alimentação e
presença de dor (CAREW et al., 1998) advindas dos processos inflamatórios iniciais
do reparo tecidual (CERTOSIMO et al., 1998; ROBBINS et al., 2000; ALLER et al.,
Discussão
114
2006), quadro hemorrágico agudo gerado pelo traumatismo local e tempo
necessário para a recuperação dos sentidos após administração de anestesia geral.
Além disso, os ratos pertencentes ao grupo GI estabilizaram seus pesos,
demonstrando diferença no comportamento da variação destes valores entre os
animais operados e não operados. Foram observadas diferenças estatisticamente
significantes entre os valores de variação de peso dos grupos GI, GII e GIII, em
todos os dias de avaliação, exceto na comparação dos grupos GII e GIII durante o
sexto dia, quando foi verificada uma sensível diminuição do número de animais para
a análise dos dados. Mesmo assim, o valor médio de variação de peso do grupo GII
foi 67% maior que o do grupo GIII. Durante todos os dias de análise, o grupo GI
apresentou os maiores valores médios de variação de peso, enquanto o grupo GIII
apresentou os menores valores. O fato de o grupo GIII ter perdido mais peso no
decorrer do estudo pode ser explicado por uma simples observação dos
pesquisadores, a detecção de maior volume de sangramento no transcorrer do
procedimento de irradiação laser das feridas. O processo de perda e ganho de peso
dos animais não foram influenciados positivamente pelas propriedades analgésicas
e antiinflamatórias da LLLT. Porém, este aspecto não deve ter influenciado os
resultados da expressão de RNAm para VEGF-A
165
aqui obtidos, já que a partir do
quarto dia de avaliação, os animais apresentaram uma nova tendência de ganho de
peso, caracterizando um quadro de normalidade sistêmica do desenvolvimento
frente a um estímulo agressivo.
Discussão
115
6.2.2 Em relação à variação dos níveis de expressão de RNAm para VEGF-A
165
Primeiramente, deve ser levado em consideração que os resultados aqui
discutidos representam a expressão de um fator de crescimento estudado in vivo.
Este fato dificulta a comparação dos presentes dados com outros obtidos por
estudos que trabalharam com cultura de células ou tecidos diferentes da língua de
ratos. Células cultivadas in vitro estão muito mais expostas aos efeitos extrínsecos
de modalidades terapêuticas que células organizadas em tecidos animais, sujeitas a
um maior número de barreiras físicas, dificultando seu acesso à luz. Além disso,
estudos in vitro analisam as respostas de um único tipo celular a um determinado
estímulo, diferentemente dos estudos in vivo. O reparo tecidual em feridas cutâneas
foi tantas vezes revisitado durante esta explanação devido ao fato de ser
considerado o modelo para a descrição geral deste processo. Porém, torna-se
complicado comparar sem ressalvas os resultados aqui descritos com os demais
relatados na literatura. Parece ser mais importante, neste momento, observar a
verdadeira influência da LLLT na expressão de RNAm para VEGF-A
165
e entender
como os presentes resultados foram alcançados.
Após a descoberta do fator de crescimento endotelial vascular (FERRARA;
HENZEL, 1989), muitos estudos preocuparam-se em entender suas funções e
mecanismos em eventos fisiológicos e patológicos (FOLKMAN; D’AMORE, 1996;
JOHNSON; SERIO; DAI, 1999; NÖR et al., 1999; ROBERTS-CLARK; SMITH, 2000;
YUAN; JIN; LIN, 2000; FERRARA; GERBER; LE COUTER, 2003; KOHNO et al.,
2003; TELLES et al., 2003). Nos últimos anos foram observadas interações
importantes deste fator de crescimento com a progressão de tumores sólidos (TAE
et al., 2000; CARLILE et al., 2001; ISHIBASHI et al., 2001; KUMAMOTO; OHKI;
Discussão
116
OOYA, 2002), o que despertou grandes interesses científicos e comerciais, na
tentativa de desenvolvimento de novas terapias voltadas para o tratamento e
controle do câncer.
Porém, poucos são os estudos sobre a interação direta da laserterapia em
baixa intensidade com a expressão do VEGF (KIPSHIDZE et al., 2001; WHELAN et
al., 2001). Além disso, tais pesquisas não foram realizadas em modelos animais,
mas sim em cultura de células. O efeito da LLLT durante o processo de angiogênese
foi mais bem estudado através da avaliação quantitativa ou qualitativa dos vasos
sangüíneos formados durante o reparo tecidual (TAKEDA, 1988; BISHT et al., 1999;
YAAKOBI et al., 2001; BAYAT et al., 2005; CORAZZA, 2005; MOHAMMED IHSAN,
2005; SALATE et al., 2005) ou da proliferação de células endoteliais in vitro
(AGAIBY et al., 2000; SCHINDL et al., 2003) após utilização de terapias fotônicas.
Os mecanismos de ação da terapia laser em baixa intensidade durante o
processo de reparo tecidual e angiogênese ainda não estão bem esclarecidos.
Durante os últimos anos, buscou-se a explicação da possível influência de um feixe
de luz monocromático colimado na biomodulação de eventos fisiológicos e
patológicos. A teoria mais aceita para os mecanismos de interação da luz com
células e moléculas animais surgiu da observação da produção de oxigênio reativo
intracelular (ROS) após irradiação laser in vitro (KARU et al., 1989). Moléculas
fotossensíveis endógenas, como NADPH, porfirinas, flavinas e citocromos
mitocondriais, seriam responsáveis pela absorção do espectro de luz visível e
posterior transferência de elétrons para moléculas próximas de oxigênio. As
espécies de ROS (H
2
O
2
, oxigênio singleto, óxido nítrico e radical hidroxila)
aumentariam a ligação da proteína GTP com a GTPase Rac-1, preponderante em
múltiplos caminhos de transdução de sinal para síntese protéica. Grandes
Discussão
117
concentrações de ROS são letais para célula, enquanto pequenas concentrações
podem estimular a proliferação celular, expressão gênica e contração muscular
através da maior produção de ATP ocasionada pelo estímulo do mecanismo de
respiração mitocondrial. A concentração de íons cálcio, agente celular responsável
pelo estímulo de inúmeros processos biológicos, também pode ser aumentada pelas
espécies de ROS, o que sugere atuação da fotobiomodulação em reações
bioquímicas (LUBART et al., 2005). Além de modular espécies de oxigênio reativo, a
LLLT pode aumentar a atividade de certos agentes antioxidantes, os quais
competem com a ação dos ROS, diminuindo seus efeitos sobre as reações químicas
intracelulares e combatendo o efeito nocivo dos radicais livres sobre a célula (KIM;
PAK; LEE, 2000). Os efeitos da laserterapia em baixa intensidade na produção de
ROS é dependente do comprimento de onda, dose e intensidade de energia
utilizados (LUBART et al., 2005).
Partindo-se dos princípios elucidados acima, os conceitos de saturação e
estimulação de processos biológicos pela utilização da LLLT nos tecidos parecem
poder ser explicados. Trabalhos envolvendo a laserterapia em baixa intensidade,
com diferentes parâmetros de comprimento de onda e dosimetria, obtiveram
resultados intrigantes quando objetivaram estudar sua relação com a expressão de
fatores de crescimento e eventos biológicos. Normalmente, foram observadas
dosimetrias ótimas e limitantes para tipos celulares diferentes. Kipshidze et al.
(2001) demonstraram que o pico de secreção de VEGF nas culturas de células de
fibroblastos, células musculares lisas e cardiomiócitos foi obtido com o uso de
diferentes dosimetrias: 1,05 J/cm
2
, 0,5 J/cm
2
e 2,1 J/cm
2
, respectivamente. Porém,
quando as culturas de células foram irradiadas em dosimetrias maiores ou menores
que seus valores ótimos, ou a liberação de VEGF foi diminuída ou foi parcialmente
Discussão
118
inibida. Agaiby et al. (2000) verificaram que maiores níveis de proliferação de células
endoteliais in vitro foram alcançados quando densidades de energia iguais a 1,2
J/cm
2
e 3,6 J/cm
2
foram utilizadas, sendo que efeitos inibitórios foram percebidos em
densidades maiores (6 e 8,4 J/cm
2
). Para iniciar a proliferação, necessariamente as
células endoteliais devem estar aderidas em uma superfície, impedindo sua
descamação e morte por apoptose. A LLLT aumenta a eficácia de adesão das
células endoteliais (BOUMA et al., 1994; KIPSHIDZE et al., 1998). O estudo de
Corazza (2005) também observou um maior nível de proliferação de vasos
sangüíneos durante o reparo de feridas cutâneas de ratos irradiadas com laser (5
J/cm
2
)
quando comparadas ao grupo controle. Quando a dosimetria utilizada foi igual
a 20 J/cm
2
, um efeito de saturação celular foi observado após 21 dias de tratamento
com a terapia fotônica, sendo verificado pelos números similares de vasos
sangüíneos entre os grupos teste e controle. A justificativa do autor para a possível
saturação foi baseada em duas hipóteses: inexistência de moléculas suficientes para
absorver a energia irradiada durante 21 dias de procedimento ou prejuízo da
atividade antioxidante pela utilização de altas doses de energia e conseqüente
avanço deletério dos radicais livres sobre o DNA celular. Os resultados
apresentados para liberação de fatores de crescimento e proliferação celular, de
vasos sangüíneos ou fibras colágenas em relação à dependência da dosimetria são
similares aos trabalhos de Yu et al. (1994), Medrado et al. (2003), Pugliese et al.
(2003) e Pourzarandian et al. (2005).
No presente trabalho, a utilização do laser infravermelho em baixa
intensidade (35 J/cm
2
) resultou em menores níveis de expressão de RNAm para
VEGF-A
165
no grupo GIII quando comparado aos valores do grupo GII, no primeiro
dia de análise. Além disso, os valores do grupo GIII foram similares àqueles
Discussão
119
observados no grupo GI. Uma das hipóteses que pode explicar este fenômeno é a
teoria da saturação celular, limitante para a liberação de fatores de crescimento e
inibidora de funções antioxidantes adequadas. Além disso, Kipshidze et al. (1998)
demonstraram que a irradiação laser utilizando altas dosimetrias foram citotóxicas
para células vasculares. Entretanto, os níveis mais baixos da expressão de VEGF
nesta fase do reparo tecidual podem não ter interferido negativamente na evolução
do processo de reparo, já que o VEGF também é responsável por induzir o aumento
da permeabilidade vascular pela desorganização de proteínas juncionais endoteliais
(DVORAK et al., 1995) e, portanto, sua alta expressão durante o período de
inflamação aguda contribui para a formação de edema e conseqüente dor pós-
operatória. O laser parece ter biomodulado a expressão do RNAm para o fator de
crescimento endotelial vascular, tornando seus níveis mais próximos aos de um
tecido em homeostasia e minimizando os desequilíbrios biológicos advindos da
inflamação aguda.
Durante o início da fase inflamatória do processo de reparo tecidual, as
células se tornam hipometabólicas em resposta às injúrias traumáticas. Através de
mecanismos tróficos primitivos, como a glicólise anaeróbica e queda da temperatura,
conseguem diminuir seu gasto de energia (ALLER et al., 2006). Além disso, os
edemas celular e intersticial podem representar um mecanismo de nutrição por
difusão, requerendo baixos níveis de energia. Nesta fase, a presença de
concentrações suficientes de glicose pode sustentar a produção de ATP, embora a
glicólise seja menos eficiente que a fosforilação oxidativa para este fim. O aumento
da atividade de enzimas glicolíticas pode ocorrer devido ao fator induzido por hipóxia
(HIF-1), permitindo melhoria da expressão de genes e dos índices de sobrevivência
celular em condições de limitação de oxigênio (HADDAD, 2004). O uso incorreto do
Discussão
120
oxigênio persiste durante a fase imune da inflamação. Os monócitos e granulócitos
produzem a quantidade de ATP necessária para suas atividades através da glicólise
anaeróbica, sendo que o HIF-1α é essencial para aumentar a regulação de enzimas
da via glicolítica e, portanto, o suprimento suficiente de ATP para estas células. O
correto uso do oxigênio durante o metabolismo oxidativo é retomado com o
restabelecimento da função capilar durante a fase endócrina da inflamação. Este
metabolismo é caracterizado pela grande produção de ATP, usado para dirigir
múltiplos processos especializados celulares com limitada geração de calor (ALLER
et al., 2004a; ALLER et al., 2004b). A expressão do RNAm para VEGF pode sofrer
interferência direta da hipóxia tecidual (ISHIBASHI et al., 2001), pois a necessidade
metabólica do oxigênio para a produção de ATP exerce pressão para formação de
vasos sangüíneos durante o reparo. Não foram encontrados trabalhos que
estudaram a influência da LLLT na expressão de HIF-1α. Kipshidze et al. (2001)
especularam a possibilidade do laser em baixa intensidade gerar hipóxia, o que seria
um estímulo importante para a expressão gênica de VEGF. Portanto, faz-se
necessária a melhor compreensão dos processos de oxigenação dos tecidos após
irradiação laser, bem como a influência da LLLT na expressão de HIF-1α.
Concentrações fisiológicas de outros fatores de crescimento como o TGF-
β (fator de crescimento transformador – β), EGF (fator de crescimento epidérmico) e
PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) induzem a expressão de RNAm
para VEGF-A. O fator de crescimento de necrose tumoral – α (TNF-α) também
possui a capacidade de aumentar a transcrição do gene VEGFR-2 nas células
endoteliais, aumentando sua migração e, conseqüentemente, estimulando a
cicatrização (HOEBEN et al., 2004). O estudo de Aimbire et al. (2006) demonstrou a
capacidade da LLLT em biomodular a expressão de TNF-α após traumatismo
Discussão
121
pulmonar induzido por complexo imune em ratos. A terapia laser em baixa
intensidade foi capaz de induzir a liberação de TGF- β e PDGF em fibroblastos (YU
et al., 1994) e TGF- β em cardiomiócitos (KIPSHIDZE et al., 2001). Diferentes
densidades de energia podem promover efeitos diversos na modulação da produção
dos fatores de crescimento, sendo que a regulação de citocinas celulares de via
autócrina podem estar associadas com o fenômeno da biomodulação (YU et al.,
1994). Portanto, a LLLT pode apresentar uma influência indireta na expressão de
RNAm para VEGF, através da modulação das concentrações de outros fatores de
crescimento que estimulam a produção de VEGF.
A literatura sugere que a terapia laser em baixa intensidade reduz o
número de células inflamatórias durante o processo de reparo tecidual (MEDRADO
et al., 2003). Porém, é observada uma contraposição quando são utilizadas baixas
densidades de energia. Ao mesmo tempo em que o número de células é diminuído,
ocorre o aumento da sua atividade funcional (YOUNG et al., 1989; AGAIBY et al.,
2000; KIPSHIDZE et al., 2001), com provável elevação na liberação de citocinas e
fatores de crescimento, o que caracteriza as terapias fotônicas como
biomoduladoras. Baseado em resultados prévios, permitimo-nos propor que a
utilização de altas densidades de energia pode diminuir o número de células
inflamatórias, ao mesmo tempo que contribui para a queda da atividade metabólica
dos tecidos. Esta teoria pode ser considerada mais uma explicação plausível para a
menor expressão de RNAm para VEGF-A
165
no grupo GIII durante o primeiro dia de
análise do presente estudo.
A expressão de RNAm para VEGF-A
165
apresentou uma tendência de
aumento à partir do terceiro dia de análise do presente trabalho, quando as feridas
cirúrgicas em língua de ratos foram irradiadas com a luz laser em baixa intensidade.
Discussão
122
Porém, os valores da expressão de RNAm para VEGF-A
165
não foram considerados
estatisticamente diferentes entre os grupos GI, GII e GIII. Este fato pode ser
explicado por alguns fatores, como o número reduzido de animais utilizados em
cada grupo, a grande variabilidade dos resultados obtidos em cada subgrupo,
observado pelos altos valores de desvio e erro padrão, e a utilização de uma sessão
única de irradiação com o laser vermelho visível, não permitindo a avaliação do
efeito cumulativo desta terapia.
A tendência de aumento da expressão do RNAm para VEGF-A
165
pode
ser explicada baseada em argumentos previamente explicitados. Baseado nos
resultados de Young et al. (1989), Agaiby et al. (2000) e Kipshidze et al. (2001), que
demonstraram que baixas doses de energia podem aumentar a liberação de fatores
de crescimento, pode ser deduzido que a densidade de energia utilizada (5 J/cm
2
)
contribuiu para a maior expressão do RNAm para VEGF-A
165
. Provavelmente isso
ocorre devido à produção de espécies de oxigênio reativo em concentrações baixas,
benéficas para a promoção de efeitos estimulatórios celulares (KARU et al., 1989;
LUBART et al., 2005). Em relação ao comprimento de onda utilizado, a literatura não
é unânime em afirmar se as reações celulares e teciduais são mais estimuladas pelo
laser vermelho visível ou infravermelho (YOUNG et al., 1989; ALMEIDA-LOPES et
al., 2001; REDDY, 2003). Alguns tipos celulares, entre eles fibroblastos,
cardiomiócitos, células musculares lisas, queratinócitos e células endoteliais liberam
VEGF em condições fisiológicas ou quando estimuladas por fatores diversos
(FRANK et al., 1995; KIPSHIDZE et al., 2001; SEN et al., 2002; SUTHIN et al.,
2003). Estudos mostraram a interferência da irradiação laser nestes tipos celulares,
favorecendo proliferação, migração, adesão e sobrevivência (YOUNG et al., 1989;
WEBB; DYSON; LEWIS, 1998; AGAIBY et al. 2000; ALMEIDA-LOPES et al., 2001;
Discussão
123
KIPSHIDZE et al., 2001; MEDRADO et al., 2003; POURZARANDIAN et al., 2005), o
que pode corroborar com os resultados obtidos após a utilização do laser vermelho
visível no presente trabalho. Outro fator que deve ser levado em consideração na
interpretação dos dados obtidos é a possibilidade de promoção de hipóxia tecidual
após irradiação com LLLT, gerada pela produção de calor após choque molecular
(KIPSHIDZE et al., 2001). Caso isso tenha ocorrido, mais uma explicação plausível
poderia ser sugerida na explicação para a tendência de maiores expressões de
RNAm para VEGF-A
165
observadas no grupo GIII quando comparadas com o grupo
GII.
Pode-se notar, ainda, que após a utilização do laser vermelho visível, os
valores médios da expressão de RNAm para VEGF-A
165
foram sempre maiores no
grupo GIII quando comparados com os do grupo GII. Portanto, os níveis de
expressão de RNAm para VEGF-A
165
obtidos 3, 5 e 7 dias após a cirurgia parecem
ser dependentes da influência da LLLT. Através da análise estatística, pode-se
observar que os níveis de expressão de RNAm para VEGF-A
165
no grupo GIII foram
mais homogêneos que no grupo GII, o que também pode caracterizar uma relação
de dependência dos resultados obtidos com a terapia fotônica. Esta maior
homogeneidade pode ser interpretada como uma tendência à manutenção dos
níveis de expressão próximos aos de um tecido em homeostasia.
Caso fossem estipuladas determinações precisas e singulares a respeito
da compreensão dos mecanismos de ação da laserterapia em baixa intensidade
sobre a expressão do RNAm para VEGF-A
165
durante o processo de reparo tecidual
em feridas cirúrgicas linguais, esta análise poderia ser considerada especulativa. É
fato que os resultados clínicos e laboratoriais obtidos através do uso da LLLT podem
ser explicados pelo entendimento isolado e/ou simultâneo das diversas teorias
Discussão
124
elucidadas anteriormente, o que justifica ainda mais a realização de estudos
complementares sobre os processos de fotobiomodulação.
O estudo da expressão dos receptores VEGFR-1 e VEGFR-2, bem como
da expressão de VEGF-A
165
são preponderantes para a interpretação mais
detalhada dos dados obtidos. O fato de o laser em baixa intensidade ter modulado a
expressão do RNAm para VEGF-A
165
não significa que as expressões finais de
VEGF-A
165
no tecido estudado serão alteradas da mesma forma. Algumas hipóteses
podem ser utilizadas para exemplificar os possíveis acontecimentos. A primeira
delas é considerar um aumento ou diminuição da expressão dos receptores tipo
tirosinoquinase. Mesmo com grandes quantidades de RNAm para VEGF-A
165
, caso
ocorresse uma diminuição da expressão dos receptores VEGFR-1 e VEGFR-2, a
expressão final de VEGF-A
165
seria também diminuída. O inverso também seria
verdadeiro, ou seja, um aumento da expressão de tais receptores poderia aumentar
a expressão de VEGF-A
165
mesmo que a expressão de RNAm para VEGF-A
165
fosse
reduzida. Portanto, estudos complementares são importantes para a melhor
interpretação dos efeitos dinâmicos biomodulatórios da LLLT no fator de crescimento
endotelial vascular em feridas linguais de ratos Wistar.
7 Conclusões
7 Conclusões7 Conclusões
7 Conclusões
Conclusões
127
7 CONCLUSÕES
Através da análise dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se
concluir que:
• Através da utilização dos parâmetros deste estudo, o laser diodo arsenieto de
gálio e alumínio foi capaz de biomodular a expressão do RNAm para VEGF-A
165
durante o reparo tecidual de feridas em língua de ratos;
• Após a primeira sessão de irradiação com o laser infravermelho, a expressão de
RNAm para VEGF-A
165
foi significativamente menor no grupo GIII (animais
irradiados) quando comparado com o grupo GII (animais não irradiados);
• Após a segunda sessão de irradiação com utilização do laser vermelho visível,
não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
GII e GIII durante os demais períodos de análise do estudo (3, 5 e 7 dias);
• Quando os grupos GII e GIII foram comparados com o grupo GI, os valores da
expressão de RNAm para VEGF-A
165
foram semelhantes em todos os casos,
exceto quando os grupos GI e GII foram comparados durante o primeiro dia de
análise;
• Estudos devem ser realizados com o intuito de observar a influência da
laserterapia em baixa intensidade durante o processo de neoformação de vasos
e suas interações com fatores de crescimento, proteínas e células participantes
da angiogênese fisiológica e patológica.
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Apêndices
ApêndicesApêndices
Apêndices
Apêndices
149
APÊNDICE A – Média dos valores de peso dos grupos GI, GII e GIII e seus respectivos subgrupos.
Entre parênteses podem ser notados os índices de variação de peso, positivos ou negativos,
expressos em porcentagem
DIAS GRUPOS
0 1 2 4 6
GII (1) 310,80
309,8 (-0,30%)
GIII (1) 296,40
290,8 (-1,87%)
GII (3) 291,20
289,2 (-0,64%)
288,4 (-0,96%)
GIII (3) 271,80
267,0 (-1,75%)
263,8 (-2,63%)
GII (5) 310,40
309,6 (-0,21%)
309,4 (-0,32%)
322,4 (3,86%)
GIII (5) 297,80
289,8 (-2,65%)
286,0 (-3,97%)
296,4(-0,47%)
GII (7) 286,20
284,6 (-0,66%)
286,0 (-0,07%)
296,4 (3,56%)
304,8 (6,50%)
GIII (7) 289,20
285,6 (-1,20%)
284,0 (-1,80%)
293,2 (1,38%)
300,0 (3,73%)
GI (7) 260,00
270,0 (3,84%)
280,2 (7,77%)
279,8 (7,61%)
281,8 (8,38%)
APÊNDICE B – Resultados da expressão de VEGF-A
165
no grupo GII (animais não tratados). Valores
numéricos obtidos através da razão entre a intensidade da banda de GAPDH e VEGF-A
165
após
fotodocumentação e análise no programa Scion Image
®
. Os grupos comparados com letras
semelhantes possuem diferenças estatisticamente significativas
Animais 1 dia 3 dias 5 dias 7 dias Grupo
Controle
Peso
1 0,841 0,628 0,193 0,281 0,278
2 0,791 0,822 0,354 0,554 0,609
3 0,822 0,641 0,367 0,420 0,611
4 0,627 0,553 0,354 0,448 0,595
5 0,519 0,561 0,502 0,256 0,330
Média 0,770
ABC
0,661
DE
0,317
AD
0,426
BE
0,523
C
DP 0,098 0,114 0,083 0,112 0,164
EP
0,044 0,051 0,037 0,050 0,073
APÊNDICE C – Resultados da expressão de VEGF-A
165
no grupo GIII (animais tratados com laser).
Valores numéricos obtidos através da razão entre a intensidade de banda de GAPDH e VEGF-A
165
após fotodocumentação e análise no programa Scion Image
®
. Os grupos comparados com letras
semelhantes possuem diferenças estatisticamente significativas
Animais
1 dia 3 dias 5 dias 7 dias Grupo
Controle
Peso
1 0,604 0,718 0,514 0,509 0,278
2 0,469 0,712 0,408 0,540 0,609
3 0,494 0,696 0,515 0,576 0,611
4 0,450 0,669 0,512 0,675 0,595
5 0,565 0,687 0,482 0,575 0,330
Média 0,504 0,699
A
0,487
A
0,575 0,523
DP 0,069 0,022 0,053 0,072 0,164
EP
0,031 0,010 0,024 0,032 0,073
Anexos
AnexosAnexos
Anexos
Anexos
153
ANEXO A
Anexos
155
ANEXO B
Anexos
157
ANEXO C
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