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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas:
Cardiologia e Ciências Cardiovasculares
Dissertação de Mestrado
ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS DA MIELOPEROXIDASE E GRAVIDADE
DA DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA
Rodrigo Vugman Wainstein
Orientadora: Profa. Dra. Carisi Anne Polanczyk
Co-Orientador: Prof. Dr. Jorge Pinto Ribeiro
Dissertação de Mestrado apresentada no
Programa de Pós-Graduação em Cardiologia e
Ciências Cardiovasculares da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul para obtenção
do título de Mestre
09 de junho de 2008
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2
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas: português 03
Lista de abreviaturas: inglês 04
Artigo de revisão: 05
Associação entre Polimorfismos da Mieloperoxidase e Doença Aterosclerótica
Artigo Original: 24
Lack of Association of Myeloperoxidase Polymorphism and Plasma Myeloperoxidase with
Severity of Stable Coronary Artery Disease
Tabelas e Figuras: 45
Anexos: 52
Anexo 1: Questionário
Anexo 2:Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
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LISTA DE ABREVIATURAS: PORTUGUÊS
DAC Doença Arterial Coronariana
CRM Cirurgia de Revascularização Miocárdica
IAM Infarto Agudo do Miocárdio
ICP Intervenção Coronariana Percutânea
MPO Mieloperoxidase
SCA Síndrome Coronariana Aguda
TRH Terapia de Reposição Hormonal
4
LISTA DE ABREVIATURAS: INGLÊS
ACE Angiotensin Converting Enzyme
ACS Acute Coronary Syndrome
AMI Acute Myocardial Infarction
ARB Angiotensin Receptor Blocker
BMI Body Mass Index
CAD Coronary Artery Disease
CABG Coronary Artery Bypass Graft
Cath Lab Catheterization Laboratory
HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HRT Hormonal Replacement Therapy
MPO Myeloperoxidase
NT-ProBNP N-Terminal Pro-Brain Natriuretic Peptide
PCI Percutaneous Coronary Intervention
5
ARTIGO DE REVISÃO:
Associação entre Polimorfismos da Mieloperoxidase e Doença Aterosclerótica
6
Introdução:
A doença aterosclerótica, em suas diferentes formas de apresentação, é uma
das principais causas de morbi-mortalidade em todo mundo. A cardiopatia isquêmica
destaca-se dentro deste amplo espectro da aterosclerose, principalmente devido a
um aumento progressivo de sua incidência nos últimos anos e grande contribuição
para mortalidade mundial
1.
Deste modo, a busca pelo entendimento desta complexa doença tem
contemplado amplamente todos os processos patológicos responsáveis pela
formação da placa aterosclerótica. O intuito principal destes estudos é de
disponibilizar medidas de prevenção e tratamento, procurando diminuir a sua elevada
morbi-mortalidade. Neste contexto, estratégias de controle de fatores de risco e
tratamento da doença arterial coronariana têm obtido considerável sucesso. Tal
sucesso terapêutico se reflete na diminuição expressiva de desfechos significativos
como mortalidade e eventos isquêmicos maiores através de intervenções específicas.
A patogênese da aterosclerose vem sendo estudada de forma extensiva ao
longo dos anos. Inicialmente, acreditava-se que a doença aterosclerótica provinha tão
somente de um depósito de partículas de gordura na parede dos vasos. Entretanto,
estudos mais contemporâneos evidenciaram que existem outros fatores implicados
na formação da placa de ateroma. A atividade inflamatória, por exemplo, tem
ocupado papel de destaque na patogênese da aterosclerose
1-4
. Estudos recentes têm
demonstrado que a inflamação está associada a todos os estágios desta doença,
desde a formação da placa aterosclerótica até progressão para uma lesão obstrutiva
7
e, finalmente, complicações trombóticas agudas decorrentes da vulnerabilidade da
placa. Estudos clínicos têm demonstrado que o emergente papel da inflamação na
aterosclerose pode ter implicações clínicas significativas. Marcadores de atividade
inflamatória, como a proteína C reativa, foram associados de forma definitiva com
risco de eventos em pacientes com Síndrome Coronariana Aguda e Cardiopatia
Isquêmica Crônica, adicionando informação prognóstica aos fatores de risco
tradicionais
1-4
.
A presença e utilidade clínica de outros mediadores inflamatórios como a
mieloperoxidase é um dos aspectos da atividade inflamatória na aterosclerose que,
apesar de ser alvo de muitas pesquisas atuais, ainda carece de esclarecimentos
científicos adicionais
2
. Dessa forma, está revisão da literatura tem o intuito de
analisar criticamente as evidências sobre o papel da mieloperoxidase e seus
polimorfismos no diagnóstico e tratamento da doença aterosclerótica.
Papel da Mieloperoxidase na Formação da Placa Aterosclerótica:
A mieloperoxidase (MPO) é uma hemeproteína tradicionalmente reconhecida
com uma enzima microbicida expressa em altos níveis nos neutrófilos, monócitos e
em algumas populações de macrófagos humanos. Entretanto, tem havido extenso
acúmulo de evidências de que a MPO tenha potentes propriedades pró-aterogênicas
além das mencionadas previamente.
2-23
Tal proteína e os produtos mediados por
suas reações (radicais livres) estão comprovadamente presentes em lesões
8
ateroscleróticas da circulação coronariana
5
. Existe uma série de mecanismos
associados à atividade aterogênica da MPO, entre os quais se pode citar:
1) Contribui para oxidação do LDL, o que facilita a captura desta
fração do colesterol pelos macrófagos e a formação de células
espumosas (foam cells).
6-8
2) Oxidação do HDL produz uma inativação funcional do mesmo,
diminuindo suas propriedades anti-ateroscleróticas.
9 -12
3) Diminui biodisponibilidade de óxido nítrico, promovendo disfunção
endotelial.
13-18
4) Promove instabilidade da placa aterosclerótica através da ativação
da metaloproteinase-7 o que contribui para ruptura da mesma; e
descamação e morte das células endoteliais o que ocasiona
erosão superficial e aumento da trombogenicidade coronariana.
19-23
Aplicação Clínica da Dosagem dos Níveis Séricos de Mieloperoxidase
Do ponto de vista clínico, existem alguns artigos científicos que demonstram
claramente a possível utilidade assistencial da MPO. Zhang et al
24
demonstraram
que níveis aumentados de MPO podem predizer a presença de doença arterial
coronariana. Neste estudo os níveis de MPO foram divididos em quartis, e os
indivíduos que tinham níveis de MPO mais elevados, no quarto quartil, tinham 15 a 20
vezes mais chance de ter coronariografias anormais (estenose >50% em uma ou
mais coronárias principais) em comparação aos pacientes no primeiro quartil (menor
9
nível de MPO). Tal associação se manteve significativa mesmo após ajustes para
outras variáveis como escore de Framingham e proteína C reativa.
Além de preditor da existência de aterosclerose coronariana, como citado
acima, a MPO tem se mostrado também um potente preditor independente de
eventos isquêmicos coronarianos em pacientes com dor torácica e síndrome
coronariana aguda. Inicialmente Baldus et al
25
demonstraram no ensaio clínico
CAPTURE composto de 1090 pacientes com Síndrome Coronariana Aguda que
níveis aumentados de MPO se correlacionavam à ocorrência de eventos isquêmicos
coronarianos (morte e infarto agudo do miocárdio) em 6 meses (razão de azares (HR)
2,25, [IC 95% 1,32-3,82] p=0,003). Brennan et al
26
publicaram, na mesma época,
ensaio clínico semelhante em que ratificou os achados do estudo CAPTURE em 604
pacientes com dor torácica. Ambos os estudos utilizaram modelos de regressão
logística multivariada em que foram realizados ajustes para variáveis como
marcadores de necrose miocárdica, mediadores inflamatórios e fatores de risco para
cardiopatia isquêmica. A análise destes resultados demonstrou que o nível de MPO é
um preditor independente de eventos coronarianos em 30 dias e 6 meses nestas
populações. Uma particularidade muito relevante destes estudos é que a MPO
identificou um subgrupo de alto risco para eventos coronarianos dentro dos pacientes
com troponina T negativa (HR 7,48 [IC 95% 1,98 a 28,3], p=0,001). Ambos os
estudos concluíram que a MPO além de ser útil para avaliação prognóstica em
pacientes com síndrome coronariana aguda como um todo, também permite a
identificação de pacientes de maior risco entre aqueles que se apresentam com
marcadores de necrose miocárdica negativos.
10
Com base nestes achados, Cavusoglu et al
27
desenharam um estudo com
intuito de verificar se o valor prognóstico da MPO pode se estender até 2 anos. Neste
estudo foram incluídos 193 homens com diagnóstico de SCA e encontrou-se que
após ajuste para diferentes variáveis clínicas, laboratoriais e angiográficas os níveis
séricos de MPO permaneceram como preditor independente de eventos em 2 anos.
Foi utilizado a mediana dos níveis de MPO sérica de toda coorte (20,34ng/mL) para
estratificar os pacientes em dois grupos. O grupo com níveis séricos maiores que a
mediana apresentaram sobrevida de 74% em 2 anos, ao passo que o grupo com
níveis séricos menores que a mediana apresentaram sobrevida de 88% em 2 anos
(p=0,025).
Achados semelhantes aos dos estudos acima foram encontrados quando os
níveis de MPO sérica foram avaliados em pacientes exclusivamente com diagnóstico
de SCA com supradesnivelamento do segmento ST (IAM). Em um estudo publicado
em 2007, Mocatta et al
28
dosaram níveis séricos de MPO em 512 pacientes com IAM
e em 156 pacientes controles (sem doença cardíaca conhecida). Os níveis séricos de
MPO eram significativamente mais elevados nos pacientes 24 a 96 horas pós-IAM.
Neste estudo identificou-se que níveis de MPO sérica acima da mediana é um
preditor independente de mortalidade em 5 anos (razão de chances (RC) 1,8 [IC 95%
1 a 3], p=0,034) em pacientes com IAM. Os autores concluíram que a MPO sérica
pode adicionar valor prognóstico a outros fatores de risco mais tradicionais como
fração de ejeção do ventrículo esquerdo e NT-proBNP em pacientes pós-IAM.
Outro estudo recente publicado por Vasilyev et al
29
identificou que oxidantes
(aldeídos citotóxicos) resultantes das reações mediadas pela MPO, podem ter efeito
modulador no remodelamento miocárdico pós-IAM. Em tal estudo foram usadas
11
células vasculares de modelos murinos com IAM induzido por oclusão crônica da
artéria descendente anterior. Foram comparadas células de ratos desprovidas de
MPO com células de ratos selvagens. Os ratos desprovidos de MPO apresentaram
35% menos dilatação do ventrículo esquerdo (p<0,001) e uma melhora de 52% na
função do ventrículo esquerdo após modelo de isquemia e reperfusão miocárdica
(p<0,0001) em relação aos ratos selvagens. No entanto, não houve diferença
estatisticamente significativa em relação ao tamanho do infarto entre os dois grupos.
Este estudo sugere que os oxidantes gerados pela MPO não afetam
significativamente necrose tissular após IAM, porém tem um efeito negativo no
remodelamento e função ventricular.
Finalmente, a MPO sérica foi também associada a risco de desenvolvimento
de doença arterial coronariana (DAC) em pacientes previamente saudáveis. Em 2007,
Meuwese et al
30
publicaram um estudo de caso-controle em que foram coletadas
amostras de MPO sérica basais em 3375 pacientes. Foram incluídos 1.138 homens e
mulheres previamente hígidos que desenvolveram DAC em 8 anos e 2.237 pacientes
que não desenvolveram doença cardiovascular. Os níveis séricos de MPO foram
significativamente maiores nos pacientes que desenvolveram DAC e se
correlacionaram significativamente com proteína C reativa e contagem total de
leucócitos. Dosagem de MPO sérica foi estratificada por quartis, sendo que o quarto
quartil manteve significância estatística para risco de DAC mesmo após ajuste para
outros fatores de risco tradicionais (RC 1,36 [IC 95% 1,07 – 1,73]). Níveis elevados de
MPO aumentaram risco de DAC mesmo em pacientes com LDL <130mg/dl,
HDL>50mg/dl e proteína C reativa < 2mg/l. Concluindo-se que MPO sérica pode
predizer risco de DAC mesmo em pacientes saudáveis.
12
Polimorfismos Genéticos da Mieloperoxidase
Interesse crescente tem surgido sobre a genética funcional (influência do
genótipo para o risco de desenvolver doenças e também como determinante de sua
apresentação e evolução) e sobre a farmacogenética (influência do genótipo como
determinante das respostas individuais ao tratamento farmacológico). Para tentar
compreender esta ligação entre o genótipo e as manifestações clínicas da DAC, em
especial, diversos estudos têm buscado avaliar a influência de características
genotípicas no risco de desenvolver esta doença, em sua apresentação clínica e na
resposta aos diferentes tratamentos disponíveis. Como foco principal está o estudo
de polimorfismos, ou seja, variações genéticas (mutações) não-letais que aparecem
em pelo menos 1% da população. Diferenças alélicas no DNA do gene resultam em
variações polimórficas de seus produtos, nos quais se incluem proteínas envolvidas
nas mais diversas funções do organismo. Existem centenas de polimorfismos em
cada gene e estes polimorfismos podem ou não ter algum significado funcional.
31
Ao longo dos últimos anos o estudo da MPO na cardiopatia isquêmica
conseguiu reunir evidências científicas que permitem indicá-la como um marcador
significativo de presença e risco de cardiopatia isquêmica. Dessa forma, o próximo
passo foi o estudo de alterações genéticas que pudessem modificar a expressão da
MPO. Piedrafita et al
32
demonstraram que existe um polimorfismo funcional
localizado em uma região promotora (posição -463) do gene que expressa a MPO. O
13
polimorfismo consiste na troca de um alelo G por um alelo A, produzindo três
diferentes genótipos AA, GA e GG. A presença do alelo A ao invés do G diminuiria a
expressão da MPO pelas células. O genótipo GG predomina na população norte-
americana (60-66%) e pode estar associado a um aumento de 2-3 vezes os níveis de
MPO em relação aos genótipos AG/AA. Nikpoor et al
33
realizaram um estudo onde
foi determinado qual o polimorfismo presente em um grupo com doença arterial
coronariana (229 pacientes) e em controles (217 pacientes). Neste estudo a presença
do alelo A foi menos freqüente em pacientes com coronariopatia (RC 0,138, IC 95%
0,04-0,47). Análise de regressão logística mostrou que a associação entre o
polimorfismo da MPO e a presença de cardiopatia isquêmica é independente de
outros fatores de risco. Da mesma forma, Pecoits-Filho et al
34
demonstrou em uma
coorte de 155 pacientes com insuficiência renal crônica pré-dialítica que a prevalência
de doença cardiovascular é maior em pacientes que possuem o alelo G ou são
homozigóticas GG (0% AA, 18% AG, 35% GG).
Como citado anteriormente, a MPO está associada à presença de disfunção
endotelial. A partir disso, Makela et al
35
realizaram um estudo com 49 pacientes
jovens e hígidos para testar a relação entre os polimorfismos da MPO e alterações na
reatividade coronariana. O grau de disfunção endotelial foi medido através da reserva
de fluxo coronariano durante um teste de hiperemia reativa a adenosina. Os
pacientes foram divididos em três grupos de acordo com seu genótipo para MPO (AA,
AG e GG). O autor identificou diferenças significativas quanto à reserva de fluxo
coronariano entre os três genótipos da MPO, mesmo após ajustado para fatores de
risco para aterosclerose. Os homens com genótipo GG obtiveram uma reserva de
fluxo 18% menor que os com os demais genótipos com baixa expressão de MPO
14
(p=0,019), evidenciando que o tipo de polimorfismo da MPO pode estar
correlacionado com reatividade coronariana.
Mais recentemente, Asselberg et al
36
demonstraram que o polimorfismo -463
G/A é preditor independente de eventos coronarianos (morte cardiovascular, infarto
agudo do miocárdio e hospitalização por angina instável). Neste estudo 139 pacientes
entre 18 e 80 anos com cardiopatia isquêmica confirmada angiograficamente foram
acompanhados por cerca de 5 anos. Até o final do seguimento 19 eventos
coronarianos tinham ocorrido (2 mortes cardiovasculares, 5 IAM e 12 hospitalizações
por angina instável). Pacientes com genótipo GG tiveram significativamente mais
eventos que os pacientes com genótipo AA/AG (19% vs. 4%, p=0,01).
Entretanto, outros estudos que tentaram relacionar grau de extensão da
aterosclerose em vasos extracardíacos com o polimorfismo da MPO obtiveram
resultados conflitantes aos observados quando foi estudada especificamente a
circulação coronariana. Makela et al
37
publicaram um estudo no ano de 2003
utilizando uma coorte 300 homens entre 33 e 69 anos submetidos a autópsia devido a
morte súbita. Neste estudo foi observada a extensão da aterosclerose da artéria aorta
através de planimetria computadorizada e correlacionada com genótipos de alta
expressão de MPO (GG) e baixa expressão de MPO (AA/AG). Paradoxalmente, os
resultados deste estudo mostraram que em pacientes com menos de 53 anos os
genótipos de baixa expressão de MPO apresentaram cerca de 40% maior carga
aterosclerótica na aorta que os pacientes com genótipo de alta expressão de MPO.
Dando continuidade a esta linha de pesquisa, Makela et al
38
seguiram relacionando
carga aterosclerótica com polimorfismos da MPO em estudo publicado em 2008.
Neste estudo mais recente, a avaliação da gravidade da aterosclerose foi aferida
15
através da medição do espessamento da camada íntima-média das carótidas por
ecografia com Doppler. Foram selecionados 198 pacientes (161 não-diabéticos e 37
diabéticos tipo 2). Novamente, ao contrário do esperado, o espessamento da camada
íntima-média das carótidas de pacientes sem diabetes foi 7,3% maior nos portadores
de genótipos de baixa expressão de MPO, sendo que os resultados se mantiveram
estatisticamente significativos (p=0,015) mesmo após ajuste para fatores e confusão
como tabagismo e colesterol total. No entanto, não houve associação entre genótipo
e carga aterosclerótica nos paciente portadores de diabete tipo 2, embora
constituíssem um grupo muito pequeno neste estudo. Não há nestes estudos uma
hipótese que indique a razão pela qual os genótipos de baixa expressão de MPO
estão mais relacionados à aterosclerose extracoronariana do que os genótipos de alta
expressão de MPO. Uma das possíveis razões citada nos artigos de Makela et al é
que os pacientes portadores do alelo A possuem mais fatores de risco para
aterosclerose do que os homozogóticos GG, especialmente dislipidemia
39
.
Entretanto, tal explicação continua criando um paradoxo visto que o genótipo GG (alta
expressão de MPO) tem sido associado à presença de doença arterial coronariana e
eventos isquêmicos subseqüentes.
Associação entre Intervenções Farmacológicas e Expressão do Gene da
Mieloperoxidase
Como exposto acima, estudos iniciais obtiveram sucesso em associar
presença de doença arterial coronariana e risco de eventos com o polimorfismo
genético da MPO na posição -463G/A. A partir disso, alguns pesquisadores passaram
16
a focar em possíveis intervenções farmacológicas que pudessem alterar a expressão
de mieloperoxidase e a evolução do processo de aterogênese.
Em 2003, Makela et al
40
publicaram um estudo com 87 mulheres pós-
menopáusicas e não-tabagistas acompanhadas por 5 anos em que o uso de terapia
de reposição hormonal (TRH) foi correlacionada com genótipo da MPO e gravidade
da aterosclerose na aorta abdominal e artérias carótidas medida através de
ultrassonografia. As pacientes foram distribuídas em 3 grupos: 25 pacientes usaram
estradiol e progesterona, 32 pacientes usaram somente estradiol e 30 pacientes não
usaram terapia de reposição hormonal (grupo controle). Neste estudo, a progressão
da gravidade da aterosclerose foi mais rápida nas pacientes do genótipo GG não-
submetidas a TRH do que nas pacientes com o mesmo genótipo submetidas a ambos
os tipos de TRH (p=0,042). Os demais pacientes portadores do alelo A, no entanto,
não apresentaram diferença significativa na progressão da aterosclerose entre os
grupos que receberam TRH e grupo controle. O racional biológico deste estudo
provém de experimentos anteriores e dá conta de que o estradiol é capaz de
aumentar a atividade da MPO, porém de uma maneira que diminui a produção total
de radicais livres amplamente associados com a formação da placa aterosclerótica. A
partir destes resultados, os autores concluíram que a TRH pode retardar o processo
de aterogênese, sendo especialmente benéfica nas pacientes portadoras do genótipo
GG.
Fármacos hipolipemiantes, como as estatinas, são fundamentais no
tratamento e prevenção da aterosclerose. O mecanismo de ação das estatinas
concentra-se na inibição da HMG-CoA reductase que é uma enzima primordial na
formação do colesterol. Entretanto, especula-se que as estatinas possam ter
17
benefícios pleiotrópicos independentes dos níveis de colesterol através de efeitos
antioxidantes e antiinflamatórios. Neste sentido, as estatinas também foram
estudadas no que se refere à expressão de mieloperoxidase. Kumar et al
41
publicaram um estudo em 2005 em que identificaram que as estatinas foram capazes
de suprimir a expressão de MPO mRNA de 20 a 200 vezes. Este resultado foi
identificado in vitro em monócitos humanos e in vivo em macrófagos de ratos. O efeito
supressivo foi observado em estatinas naturais e sintéticas como sinvastatina,
atorvastatina, pravastatina e lovastatina. Tal efeito ocorreu independente do genótipo
associado ao polimorfismo da MPO. A redução dos níveis de MPO mRNA nos ratos
alimentados com estatina se correlacionou com diminuição dos níveis da atividade da
enzima MPO. Os autores deste estudo sugerem que ao menos parte dos possíveis
efeitos pleiotrópicos das estatinas possam se dever a diminuição da expressão de
MPO.
Conclusão
Através desta revisão da literatura conclui-se que a mieloperoxidase é uma
importante participante na formação da placa aterosclerótica. Nesse sentido,
pesquisas atuais remetem para a possibilidade da utilização clínica desta enzima e
seu polimorfismo genético na região promotora -463G/A, principalmente no que se
refere ao diagnóstico e prevenção da cardiopatia isquêmica em todo seu espectro de
apresentação. Além disso, o conhecimento mais aprofundado e detalhado da
mieloperoxidase e sua expressão genética podem auxiliar no entendimento dos
efeitos terapêuticos de algumas intervenções farmacológicas utilizadas atualmente.
No entanto, a associação entre gravidade da doença aterosclerótica e polimorfismos
18
da mieloperoxidase ainda é controversa, necessitando de estudos adicionais para
esclarecer esta hipótese.
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myeloperoxidase in ma62(n)-2.00147( )-5t82hpero63(m)-7(a)-4( )-5nd asot82(e)-4dn oxidaive i-83(m)-7(p)-4(a)-4(i)2(r1)3(m)-2.00195(e)-4(n)6(t)-2.00195( )-5in
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24
Original Article
Lack of Association between Myeloperoxidase Polymorphisms
and Severity of Stable Coronary Artery Disease
25
Abstract
Background: Myeloperoxidase (MPO) is an enzyme involved in the process of
atherosclerosis. The expression of MPO has been related to a functional promoter
polymorphism located at the -463 position, consisting of a G to A base substitution. In
recent studies, this polymorphism has been linked to the presence of atherosclerosis
and risk of cardiovascular events.
Objectives: To test the hypothesis that MPO polymorphism and MPO plasma levels
are associated with coronary artery disease (CAD) severity.
Methods: 135 consecutive patients submitted to elective coronary angiography were
enrolled in this study. The CAD severity was assessed using a pre-defined
angiographic score and blood samples were collected in order to assess the MPO
genetic polymorphism and its plasma levels.
Results: The MPO genotype was determined in 118 patients (mean [±SD] age,
60.5±11.5 years; 60% male). Among these patients, 12 (10%) were homozygous for
the AA genotype, 69 (58%) for the GG genotype, and 37 (32%) were heterozygous.
MPO plasma levels were not related with this polymorphism, and were 8.7 ± 4.7
ng/mL for AA, 8.6± 7.0 ng/mL for AG and 9.4± 5.6 ng/dL for GG genotypes (p=0.75).
The CAD severity was not associated with MPO genotypes separately (p=0.53) or
when analyzed as high and low expression genotypes (p=0.43), even after adjusting
for risk factors in a logistic regression model. There was a trend towards greater
proportion of patients with higher CAD score and MPO above mean levels.
26
Conclusion: Our data indicate that, in stable patients submitted to coronary
angiography, there is no association between MPO polymorphism and MPO plasma
levels with CAD severity.
Introduction
Atherosclerosis at its different clinical presentations is one of the leading
causes of morbidity and mortality worldwide. Coronary artery disease (CAD) plays an
important role in the spectrum of atherosclerosis, mainly due to its increase in
incidence and great contribution to mortality. Risk factors involved in the
atherogenesis process have raised great interest in the last years. Among those
factors, the role of inflammation and inflammatory markers on the formation of the
atherosclerotic plaque can be highlighted.
1-4
Myeloperoxidase (MPO) is a leucocyte-derived enzyme with an essential role
in the immune system and inflammatory regulation
2
. Such protein and the products
derived from its reactions (free radicals) are demonstrably present in human coronary
atherosclerotic plaques
5
. Several mechanisms can explain the pro-atherogenic
effects of MPO, such as: LDL oxidation and formation of foam cells, functional
inactivation of HDL, endothelial dysfunction due to decrease of nitric oxide
bioavailability, activation of metalloproteinase 7 and increase in vascular cell
apoptosis which contributes to endothelial erosion and plaque vulnerability
6-23
.
Recent studies were able to identify MPO plasma levels as an independent
predictor of the CAD presence and subsequent ischemic events in patients with Acute
Coronary Syndromes (ACS)
24-29
. Likewise, the protective effect of MPO deficiency
against cardiovascular diseases has also been described.
30
27
Throughout the last years, MPO related research has pointed to strong
evidence that allows the characterization of this enzyme as a potential predictor of
presence and risk of ischemic heart disease. Thus, the next step was the study of
genetic changes that could modify the expression of MPO. A few polymorphisms are
described for the MPO gene, including a functional polymorphism located at the
promoter region of this gene that affects its transcription
33
. The presence of an A
rather than G at position 463 bp seems to decrease the expression of MPO enzyme,
giving rise to three different genotypes: AA, AG e GG. The GG genotype
predominates in the North-American population (60-66%), but whether it is associated
with more elevated MPO serum levels than the AG and AA genotypes is still
debatable
34-38
. Other studies have shown that the high expression genotype (GG) is a
statistically significant predictor of CAD, ischemic events and endothelial dysfunction
when compared to low expression genotypes (AA/AG)
34-37
. Nevertheless, conflicting
data exist on the relation of MPO levels and its polym
28
In this cross-sectional study performed at the Hospital de Clínicas de Porto
Alegre Cardiac Catheterization Laboratory, 135 consecutive patients who had a
clinical indication of elective coronary angiography were enrolled between August
2007 and April 2008. Exclusion criteria were: age less than 18 years old; current or
recent hospitalization (< 30 days) for ACS, previous history of percutaneous coronary
intervention (PCI) or coronary artery by-pass surgery (CABG), history or current
treatment of cancer and leukemia and acute or chronic active inflammatory disease.
Clinical Protocol:
Clinical information was obtained through a standardized questionnaire
(appendix 1) after admission. The questionnaire included demographic and
anthropometric data as well as information on risk factors for atherosclerosis and
current medications.
Approximately 10 ml of blood was collected from the femoral artery sheath
immediately after its insertion during the cardiac catheterization. No additional venous
or arterial puncture was needed. Study protocol and consent forms were approved by
Institutional’s Ethical Committee. Written informed consent was obtained from all
patients (appendix 2).
Clinical variables:
Diabetes was defined as clinically known and treated diabetes mellitus.
Patients were diagnosed as hypertensive if they were documented to have a blood
pressure >140/90 mm Hg on >2 or more occasions or were already on
antihypertensive therapy. Hyperlipidemia was diagnosed in patients who had been
29
given lipid-lowering medication or had a history of total cholesterol levels >240 mg/dl.
Smoking was defined as the inhaling use of cigarettes, cigars, or pipes in any quantity.
Smokers were classified as non-smokers only if they had not smoked at all in the 6
months preceding the date of angiography. Family history of CAD was defined as a
premature cardiac event in a first degree relative (< 55 years in men and < 65 years in
women). Previous AMI was considered in patients who had had history of this event
before.
Angiographic Data:
Angiographic analysis was performed by the same investigator who was
blinded for genotype results and MPO plasma levels. Stenosis severity was
determined by visual estimation (in ≥ 2 orthogonal views). CAD severity was assessed
using a 6 level score
41
: (1) normal coronary angiogram; (2) nonsignificant CAD (<70%
stenosis in ≥ 1 epicardial vessel and <50% stenosis of left main coronary artery); (3)
significant 1-vessel disease (≥70% stenosis in 1 major epicardial vessel); (4)
significant 2-vessel disease (≥70% stenosis in 2 major epicardial vessels); (5)
significant 3-vessel disease (≥70% stenosis in all 3 major epicardial vessels); and (6)
significant left main CAD (≥50% stenosis of left main coronary artery). Major epicardial
vessels considered were the left anterior descendent artery, the circumflex artery and
the right coronary artery. The branches of these arteries could have been
contemplated by the severity score if they had similar size and extension of the major
epicardial arteries.
Biochemical Analysis:
30
Samples for MPO measurement were collected in heparinized tubes and stored
in a recipient with ice. All samples were stored for less than 4 hours before
centrifugation. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with high sensitivity
(Invitrogen – ZenMyeloperoxidase, OR, United States) was used to perform MPO
measurement, and duplicate samples were made. After they were thawed, plasma
samples were diluted in an extraction solvent (acetone, hydrochloricacid, and water)
and centrifuged with a specific protocol: 3000 rpm speed for 10 minutes at a
temperature of 4°C. The supernatant material was lyophilized in a centrifugal
evaporator for approximately 6 hours, reconstituted, and the assay carried out
immediately afterward. The standart solutions were prepared according to procedures
recommended by the manufacturer. The detection concentration range was 0.2 to
100ng/mL.
MPO Genotypes:
Genomic deoxyribonucleic acid was extracted from peripheral blood by
standard protocols. The polymorphic site at position –463 of the MPO gene was
amplified with use of forward primer MPOf (5´-CGG TAT AGG CAC ACA ATG
GTGAG-3´) and reverse primer MPOr (5´-GCA ATG GTT CAA GCGATT CTT C-3´)
as described in the literature. Polymerase chain reaction (PCR) was performed with
Taq polymerase(PerkinElmer); the cycling condition was 94°C for 5 minutes followed
by 30 cycles of 94°C for 1 minute, 56°C for 1 minute, and 72°C for 1 minute.
Samples were sequenced in the ACTGene Laboratory (Centro de
Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brazil) using the automatic sequencer ABI-
PRISM 3100 Genetic Analyzer armed with 50 cm capillaries and POP6 polymer
31
(Applied Biosystems). DNA templates (30 to 45 ng) were labeled with 3.2 pmol of the
primer 5’- CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTGAG -3’ and 2 µL of BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems) in a final volume of 10 µL.
Labeling reactions were performed in a GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems) termocycler with a initial denaturing step of 96 ºC for 3 min followed by
25 cycles of 96 ºC for 10 sec, 55 ºC for 5 sec and 60 ºC for 4 min. Labeled samples
were purified by isopropanol precipitation followed by 70% ethanol rinsing.
Precipitated products were suspended in 10 µL formamide, denatured at 95 ºC for 5
min, ice-cooled for 5 min and electroinjected in the automatic sequencer. Sequencing
data were collected using the software Data Collection v1.0.1 (Applied Biosystems)
programmed with the following parameters: Dye Set “Z”; Mobility File
“DT3100POP6{BDv3}v1.mob”; BioLIMS Project “3100_Project1”; Run Module 1
“StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100”; and Analysis Module 1 “BC-
3100SR_Seq_FASTA.saz”.
Statistical Analysis:
Continuous variables are expressed as mean ± standard deviation or median ±
interquartile amplitudes (IQA) and categorical variables as numbers and percentages.
The distribution of myeloperoxidase levels was Gaussian, and parametric tests
were used to analyze data. Differences between groups and associations between
categorical variables were evaluated using analyses of variance, Student-T test or chi-
square tests, when appropriate. Logistic regression model was used to estimate the
relative risk for CAD severity score and patients were categorized according to low or
32
high levels of MPO or its genotypes, adjusted for the effect of other clinical
characteristics (variables with p <0.10 were included in the model). The analysis of
MPO was performed using cutoff points at mean (9.7ng/mL) and at tertiles, with
similar results. Probability values <0.05 were considered statistically significant. All
analyses were performed with SPSS 11.5 for Windows.
Results
The sample included 135 patients: 81 patients (60%) were men, the mean age
was 60.5 ± 11.3 years, BMI 28.5 ± 5.7 and abdominal circumference 101 ± 14.5 cm.
As for comorbidities, 32 (24%) were active smokers, 84 (62%) were dyslipidemic, 94
(70%) had family history of CAD, 40 (30%) had diabetes, 85 (63%) were sedentary,
115 (85%) were hypertensive, and 43 (32%) had history of previous MI. Regarding
treatment, 83 (62%) were on use of ACE inhibitors or ARB, 78 (58%) were on beta-
blockers and 71 (52%) were using statins. Further characteristics are listed in Table 1.
Genotype classification for MPO polymorphism was obtained in 118 patients. MPO
plasma levels were obtained in 131 patients. Genotypes were not identified In 17
patients due to DNA extraction difficulties and MPO measurements were not
performed in 3 patients due to technical problems related to sample hemolysis. All
excluded subjects had matching clinical characteristics.
CAD Severity Score:
Normal or nonsignificant CAD (score 1 and 2) were found in 51 patients (39%).
Significant CAD (score 3 to 6) was found in 80 patients (61%). Among those subjects
with significant CAD, 45 patients (56%) had significant 1-vessel disease, 22 (28%) had
33
significant 2-vessel disease, 8 (10%) had significant 3-vessel CAD, and 5 (6%) had
significant left main disease.
MPO polymorphism and CAD Severity Score:
The genotype frequencies were as follows: 69 (58.5%) for GG, 37 (31.5%) for
AG and 12 (10%) for AA. The allele frequencies were 0.72 and 0.28 for G and A,
respectively. The genotype frequencies were in accordance with previous studies, and
the genotypes were in Hardy–Weinberg equilibrium
34-37
.
No statistically significant association was found between MPO polymorphism
and CAD severity in the genotypic distribution (Table 2, p=0.53) or when analyzed as
high and low expression genotypes (Table 3, p=0.43). In univariate analysis, male
sex, age, dyslipidemia, previous MI and statin use were associated with higher CAD
score.
MPO Plasma Levels, MPO Polymorphism and CAD Severity Score:
Results are presented in Figures 1 and 2. Mean MPO plasma levels were 9.65
± 6.1 ng/mL. MPO plasma levels had no association with different MPO
polymorphism: 8.7 ± 4.7 ng/mL for AA, 8.6± 7.0 ng/mL for AG and 9.4± 5.6 ng/dL for
GG genotypes (p=0.75). Expression of allele A was not related to significantly lower
MPO levels than homozygosis for allele G, 8.6 ± 6.5 ng/mL and 9.4 ± 5.6 ng/mL,
respectively (p=0.28).
There was a trend towards higher MPO plasma levels and CAD severity score:
9.0 ± 0.7 ng/mL for scores 1 and 2, and 9.6 ± 0.70 ng/mL for more severe CAD
(p=0.15). When MPO levels were dichotomized in mean levels, a greater proportion of
34
patients with elevated MPO levels were observed in scores 5 and 6 (Figure 3). In a
multivariate analysis, adjusting for gender, dyslipidemia and prior MI, MPO levels were
no longer predictive of more severe CAD (for severity score greater than 2, OR 1,035;
95%CI 0.96 to 1.12;p=0.33).
Some clinical variables were related to MPO levels, such as male sex, smoking,
dyslipidemia, body mass index, prior MI and statin use. In linear regression analysis,
male gender and patients with dyslipidemia had higher MPO levels (r-square=0.06;
model p value=0.02). Medications in use were not related to MPO levels.
Discussion
To our knowledge, the present study is the first to investigate the association
between MPO polymorphism and MPO plasma levels with CAD severity. We found no
significant association of MPO polymorphism or its plasma levels with the extension of
coronary atherosclerosis using a severity score.
In recent years, MPO has emerged as a potential participant in the promotion
and propagation of atherosclerosis
22,23,
. The MPO enzyme functions as an
antimicrobial agent in neutrophils and monocytes by forming potent oxidants and
reactive oxygen species, such as hypochlorous acid. Expression of MPO is restricted
to the myeloid lineage and is highest in bone marrow precursors, peaking at the
promyelocyte stage. Under normal conditions, MPO is mostly expressed in this stage,
and sharply decrease as these progenitors differentiate toward granulocyte or
monocyte lineage. Consistent with these, peripheral blood leukocytes lack detectable
MPO mRNA, although MPO protein continues to be stored at high levels in
cytoplasmatic lysossomes
42
.
35
A few polymorphisms are described for the MPO gene, including a functional
polymorphism located at the promoter region of this gene that affects its transcription
33
. This polymorphism, which is believed to alter an SP1 transcription factor binding
site, is a G to A substitution at position 463 bp upstream of the transcription site. Over
expression of this polymorphism have been described in some disease and causally
related to them, like in myeloid leukemia patients, in whom GG genotypes appeared in
79-82% of leukemia cells
42
. On the other extreme, individuals with total or subtotal
MPO deficiency appear less likely to develop atherosclerosis. GG genotypes has been
associated with increased incidence of CAD
24
, worse prognosis in patients with
suspected or at high risk for CAD
25-28
.
However, contrary to these findings, others failed to demonstrate a relation
between MPO genetics and atherosclerosis. Makela et al. found no association
between aortic atherosclerosis extension and high-expression MPO genotypes (GG)
39
. The same group demonstrated the absence of association between MPO
polymorphism on its high expression genotypes with carotid intima-media thickness
measured by high-resolution ultrasonography
40
. Our findings are in accordance with
the results of these two studies that correlated atherosclerotic burden with MPO
polymorphism in extra-coronary arteries
39, 40
. Interestingly in all of these populations,
genotypes frequencies were similar, patients were heterogeneous and at risk for CAD.
It seems reasonable to consider that chance may have played a role in prior studies or
the magnitude of association is smaller than expected and our study was no powered
to demonstrate it.
The association between MPO plasma levels and its polymorphism is weak and
controversial. A pioneer study in patients with acute myeloid leukemia demonstrated
36
that increased MPO mRNA levels correlate with GG genotype
42
. In their study, acute
myeloid leukemia cells in culture were processed and MPO levels were measured by
western blot analysis, and GG genotype had 1-6 times higher relative MPO protein
levels. Although this study suggested that GG homozygosis had greater MPO mRNA
in immature cells, there is no convincing evidence that peripheral or circulating MPO
levels under steady state are higher among these subjects. Hoy et al
38
, for example,
were not able to associate high expression genotype (GG) with more elevated MPO
plasma levels in 82 healthy donors. Beyond that, clinical variables such as age and
number of white cells explained must of MPO variability, similar findings also observed
in our study. Considering that MPO enzymes are stored in intracellular structures and
are released under leukocyte activation, it is expected to be more elevated in acute
phase settings. Reinforcing this hypothesis, we have recently demonstrated that MPO
levels are higher in patients with stable angina compared with AMI patients, and
mainly among ST elevation MI
43
. From this study, stable subjects scheduled for
elective catheterization had low serum MPO levels, although we can not infer on MPO
intracellular levels.
Our study has some limitations. We did not perform quantitative coronary
angiography, which might have influenced continuous variables of coronary
atherosclerosis. However, our CAD score obtained through visual analysis thus reflect
the severity of coronary atherosclerotic involvement of studied patients. Another
possible limitation was the fact that only a minority of our subjects presented severe
CAD (score 5 and 6). Nonethess, traditional clinical variables related with CAD
37
In conclusion, the relationship of MPO and CAD severity is still controversial.
Despite the fact that there reasonable evidence to support MPO plasma levels and its
genotypic presentations as independent predictors of presence and prognosis of CAD,
the same factors seem to have no influence on the severity of coronary
atherosclerosis in humans.
38
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45
Figure Legends
Figure 1. Association between MPO plasma levels and CAD score.
Figure 2. Association between MPO polymorphism and MPO plasma levels.
Figure 3. Association between CAD severity and MPO above mean levels
(>9.7ng/mL).
46
Table 1. Clinical Characteristics
Characteristics N=135 (%)
Demographic Data
Male 81 (60)
Age* (yr) 60.5±11
Anthropometric Data
Weight*(kg) 76 ± 15
Height*(m) 1.6±0.1
BMI*(kg/m
2
) 28.5±5.8
Abdominal circumference (cm) 100.7±14.5
Risk Factors
Smoking 32 (23.7)
Dyslipidemia 84 (62.2)
Family History 94 (69.6)
Diabetes Mellitus 40 (29.6)
Sedentary 85 (63)
Systemic hypertension 115 (85.2)
Previous myocardial infarction 43 (31.9)
Drugs
AAS 108 (80)
Ticlopidine 8 (5.9)
Clopidogrel 6 (4.4)
ACEi or ARB 83 (61.5)
Calcium Antagonist 26 (19.3)
Nitrate 56 (41.5)
Beta-blocker 78 (57.8)
Statin 71 (52.6)
Insulin 8 (5.9)
Diuretic 65 (48.1)
Metformin 25 (18.5)
Sulfonylurea 10 (7.4)
Warfarin 2 (1.5)
Data expressed as means ± standard deviation or number (percentages).; ACE inhibitors– angiotensin
converting enzyme inhibitors; ARB – angiotensin receptor blocker; BMI – Body mass index.
47
Table 2: Association between MPO polymorphism and CAD score
CAD severity (score) MPO Genotype N
AA AG GG
Normal (1) 4(13%) 9(30%) 18(58%) 31
Nonsignificant disease (2) 0(0%) 4(34%) 8(66%) 12
1-vessel disease (3) 6(14%) 12(26%) 27(60%) 45
2-vessel disease (4) 1(5%) 10(50%) 9(45%) 20
3-vessel disease (5) 1(16%) 2(34%) 3(50%) 6
Left-main disease (6) 0(0%) 0(0%) 4(100%) 4
12(10%) 37(31.5%) 69(58.5%) 118
48
Table 3: Association between high and low expression genotypes with CAD
score
Allele
AA e AG GG Total
CAD score 1
13(42%) 18(58%) 31
2
4(33%) 8(67%) 12
3
18(40%) 27(60%) 45
4
11(55%) 9(45%) 20
5
3(50%) 3(50%) 6
6
0(0%) 4(100%) 4
49(41.5%) 69(58.5%) 118
49
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 (n=38) 2 (n=13) 3 (n-45) 4 (n=22) 5 (n=8) 6 (n=5)
CAD severity score
MPO levels (ng/mL)
P for trend=0.13
Qui-square=0.04
Figure 1. Association between MPO plasma levels and CAD score
50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
MPO levels (ng/mL)
AA AG GG
Genotype
P=0.75
Figure 2. Association between MPO polymorphism and MPO plasma levels
51
35
43
77
0
20
40
60
80
100
MPO >9.7ng/mL (mean)
1-2 3-4 5-6
CAD severity score
P=0.02
%
Figure 3. Association between CAD severity and MPO above mean levels
(>9.7ng/mL)
52
Appendix 1
Questionário
Nome:
Prontuário:
Sexo:
Data de Nascimento: Idade:
Número no projeto:
Peso: Altura: IMC: Circ Abdominal:
Fatores de Risco:
Tabagismo (s) (n)
Dislipidemia (s) (n)
História Familiar de CI (s) (n)
Diabete Melittus (s) (n)
Sedentarismo (s) (n)
HAS (s) (n)
IAM prévio (s) (n)
Medicamentos em uso:
Antiplaquetário (s) (n) AAS ( ) Ticlopidina ( ) Clopidogrel ( )
IECA/ARA2 (s) (n) Antagonista do Cálcio (s) (n) Nitrato (s) (n) Beta-bloq (s) (n)
Estatina (s) (n) Insulina (s) (n) Diurético (s) (n)
Hipoglicemiante Oral (s) (n) Metformin ( ) Sulfaniluréia ( )
53
Appendix 2
Appendix 2
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
AUTORIZAÇÃO PARA PARTICIPAR EM UM PROJETO DE PESQUISA
ESTUDO: ASSOCIAÇÃO ENTRE A GRAVIDADE DA DOENÇA ARTERIAL
CORONARIANA E POLIMORFISMOS DA MIELOPEROXIDASE
O senhor (a) está sendo convidado a participar de um protocolo de pesquisa. Este
protocolo tem como objetivo obter maior conhecimento a respeito de alterações
genéticas relacionadas a doença isquêmica do coração.
1. EXPLICAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS
Após a assinatura deste termo, o Sr.(a) responderá um questionário para coleta de
dados. Armazenaremos uma amostra do seu sangue (aproximadamente 10 ml) para
dosar marcadores inflamatórios e pesquisar a presença de uma alteração genética
em uma enzima que pode estar relacionada à presença de lesões nos vasos do
coração. Os resultados obtidos com as amostras de sangue serão confrontados com
o do cateterismo cardíaco que o Sr(a) está prestes a fazer.
2. POSSÍVEIS RISCOS E DESCON5112(d)-4(e)3(ca)e-2(q)6(u42(u)-4c(r)13(e3(a)-4(p)a)-4( )-112(d)42(q)6(u)-4(e)-4(l)12(n )-212(r)4 0 Td[((d)42(4(t)8(e)-cu42(u)-4c(r3(p)-4(p)-2( )-52(-4(s)10(p)6(e4)10(a)-4(s)-112(d)42(q)6(u-132(a)-4( )-132(p)6(a)-4)]TJ3)-4(st)4( )-72(dq)6(u42(u)-4c(r)13(es(a)-4(s142(m)-7(ã)6(o99)3(c)10(e)-(e)-4(r)4a)-4)]o(p)-4(( )-754(o)-44s)10(p)6(e4)58(e)-)-4(e)-4( )-52(sa)-4(n4-4(g)6(u)-4(ása)-4(n4-4a)-4(r)3(a)-4( )-122(co)-4(l)2.00195-4(so)-4(ssq)6(u)-4(i002(co)6(m)2o99)3(c )277.998]TJ-316.68 - )-732(d)62(e)-4(r)33( )-292(o)6(s )-72)-142(ds2(a)-4(ci)2( - )-732(4( )-132(a)-4o)6(s )-72)-2(e)-4(s )8(a)-4( )8(f)I)-2(D)2(A)-32so)-4(ss-32s4( )-2(d)-4(o)6( )-2(ca)-4(t)8(1e)-4(122(t)-2 )-72)-)-152.002(l)2soss-32s4(t)é(e)-4(su)32(p)oss-32s-2( )-Qpr na ss-320195())2.e-4(r)3(a)-4( )os dp
54
Sua participação é voluntária, não havendo qualquer ônus ou gratificações referentes
à sua participação no estudo.
4. DIREITO DE DESISTÊNCIA
O Sr. (a) poderá desistir de participar do estudo a qualquer momento. Sua decisão de
não participar não afetará o seu atendimento no Hospital nem trará prejuízos ao
senhor (a).
5. CONFIDENCIALIDADE DOS DADOS:
Todas as informações obtidas através deste estudo podem ser publicadas com
finalidade científica, mantendo seu anonimato, isto é, o seu nome não aparecerá.
Todas as informações estarão a sua disposição se assim desejar.
6. CONSENTIMENTO
Declaro ter lido (ou foram lidas) e entendido as informações acima antes de assinar
esse formulário. Foi-me dada oportunidade de fazer perguntas, esclarecendo minhas
dúvidas. Por este instrumento, tomo parte no presente estudo.
Assinatura do paciente..........................................................
Entrevistador..........................................................................
Data......./....../..........
Pesquisadores Responsáveis
Dra. Carisi Polanczyk
Telefone: 2101.8344
Dra. Rodrigo Vugman Wainstein
Telefone: 21018342/ 21018433
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
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