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MARCELO FRANCISCO POMPELLI
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE PLANTAS DE
CAFÉ CULTIVADAS EM DIFERENTES NÍVEIS DE NITROGÊNIO E
IRRADIÂNCIA
Tese
apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de
Doctor
Scientiae
VIÇOSA
MINAS GERAIS
–
BRASIL
2008
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ii
MARCELO FRANCISCO POMPELLI
RESPOSTAS ANATÔMICAS E FISIOLÓGICAS DE PLANTAS DE
CAFÉ CULTIVADAS EM DIFERENTES NÍVEIS DE NITROGÊNIO E
IRRA
DIÂNCIA
Tese
apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de Doctor Scientiae
APROVADA:
27
de fevereiro de 2008
_______________________________
Pr
of
a
.
Marília Contin Ventrel
la
(Co
-
Orientadora)
_______________________________
Prof.
Cláudio Pagotto Ronchi
_______________________________
Prof.
Hugo Alves Pinheiro
_______________________________
Dr. Rogério Ferreira Ribas
__________________
__________
Prof.
Fábio Murilo Da
Matta
(Orientador)
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ii
DEDICO
Aos meus pais, pelo dom da vida
,
A minha esposa Gilmara pela maravilhosa companhia
,
A minha irmã Neide por tudo e sempre...
OFEREÇO
Ao meu irmão Nelson Pompelli “
in memorian
”,
que de onde
estiver,
tenho certeza
,
roga pelo sucesso de seus entes queridos...
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, porque sem sua presença na minha vida, nada teria sentido, sem seu
amor e compreensão como pai, me sentiria só neste mundo.
À Universidade Federal de Viçosa (UFV) e ao Departamento de Biologia
Vegetal, pela oportunidade
de
realização deste curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão da bolsa de estudos e
à
Fapemig pelo financiamento do projeto original.
Aos meus pais, po
is
sem seu amor e apoio incondicional, não estaria aqui.
Obrigad
o mãe, por teu amor e sacrifício em toda minha vida e pelo incentivo prestado
na superação e
m
mais es
t
a conquista. Obrigado pai pela sua companhia.
À minha querida esposa Gilmara, que foi mais que uma companheira, foi
amiga, conselheira, leal
;
adjetivos fundamentais que fazem dela uma pessoa inigualável.
Obrigado
por você existir na minha vida; sem você, com certeza, não teria concluído
est
a árdua tarefa.
Ao professor Fábio Murilo DaMatta, que, desde o início, me ajudou com
orientação profissional, formação e aprendizagem nesta
importante
etapa. Obrigado pel
a
sua dedicação
e apoio durante o desenvolvimento des
t
e trabalho.
À professora Marília Contin Ventrella, que dedicou muitas horas na co-
orientação. Muitas foram as dificuldades, muitas foram as superações. Obrigado pela
sua
amizade, cumplicidade, paciência e correspondência nos momentos de aflição.
Aos professores d
a
Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, Raimundo Santos
Barros,
Marco Aurélio Pedron e Silva e Marcelo Ehlers Loureiro. Obrigado pelos
ensinamentos.
Agradecimento especial ao professor Raimundo Santos Barros, que atuou
na co-orientação deste trabalho e não mediu esforços para juntos chegarmos ao êxito na
pesquisa.
Ao
s professores Hugo Alves Pinheiro e Cláudio Pagotto Ronchi e ao
Dr. Rogério Ferreira Ribas. Em especial aos professor
es
Hugo A. Pinheiro e
Cláudio
iv
P. Ronchi, que se
desloca
ram de suas Universidades para participação da defesa desta
tese
.
Ao
s amigos Werner C. Antunes, Paulo C. Cavatte e Agnaldo R.M. Chaves
pelos constantes apoios metodológicos e estatísticos. Agradecimento especial ao amigo
Werner
, pela parceria em um dos capítulos desta tese, fruto que nos rendeu um
artigo
aceito para publicação em Annals of Applied Biology. Obrigado pela
incondicional
ajuda
de todos vocês.
À amiga Elaine Cristina Cabrini, pela amizade e pelos inúmeros auxílios no
laborat
ório
;
tenho fé na sua boa índole. Obrigado por tudo.
Aos colegas do grupo café (Gustavo, Diego, Carla Quin
hones,
Ângela Ten
Caten,
Fábio
Santos
e Karine), pelo apoio na realização deste trabalho. Agradecimento
especial
à
Carla Quinhones
,
pelo auxílio incondicional no dia
-a-
dia do laboratório e pela
forte amizade.
Aos bolsistas do grupo café (Samuel, Ricardo, Elaine Celin e Fábio), sem
vocês essa etapa teria, com certeza, sido
muito
mais árdua. Agradecimento especial ao
amigo Samuel, cuja dedicação transpassou os limites do laboratório.
Aos funcionários Carlos Raimundo, Geraldo (Marreco), Mercês, Oswaldo,
Regina
ldo, Zé Antônio e Zé Maria, pela amizade
e
apoio
.
A todos que, de uma forma ou de outra, colaboraram para o êxito deste
trabalho, meu eterno agradecimento.
"Agradecer é admitir que houve momento
s
em que se precisou de alguém; é reconhecer
que o
homem jama
is poderá lograr para si
o dom de ser
auto
-
suficiente. Ninguém
cresce sozinho; sempre é preciso um olhar
de apoio, uma palavra
de
incentivo, um
gesto de compreensão, uma
atitude e amor.
A todos vocês que compartilharam os
v
meus ideais, dedico essa vitória,
com a
mais profunda gratidão e respeito!"
vi
BIOGRAFIA
MARCELO FRANCISCO POMPELLI, filho de Lourdes Maria Pompelli e Domingos
Pompelli, nasceu em Chapecó (SC)
,
em 23 de agosto de 1974
. Entre 1993
e 1997 cursou
graduação em Ciências Biológicas (Licenciatura e Bacharelado) na Universidade do
Oeste de Santa Catarina
. Entre 1999 e 2002 cursou Mestrado em
Biotecnologia Vegetal,
Agrícola e Florestal, na Universidade Federal de Santa Catarina, defendendo a
dissertação intitulada "
Morfogênese
in vitro, Métodos de Micropropagação e
Conservação de Germoplasma de Dyckia distachya Hassler”; que lhe rendeu sete
artigos publicados em revistas nacionais e internacionais, além de comunicações em
congressos
. No ano de 2003, cursou P
ós
-Graduação em nível de Extensão Univers
itária
em Educação à Distância, na Universidade Metodista de São Paulo. Entre de 2002 e
2004, atuou como professor titular das disciplinas de Fisiologia Vegetal e Botânica de
Fanerógamas, na Universidade do Oeste de Santa Catarina, na qual publicou, em 200
2,
um
livro sobre Sistemática de Fanerógamas. Em março de 2004, ingressou n
o
Doutorado em Fisiologia Vegetal, na Universidade Federal de Viçosa, MG.
Em
fevereiro de 2008 foi aprovado, como pesquisador nível C, para desenvolver o projeto
intitulado “
Inovaçõ
es tecnológicas para o semi-árido nordestino: fenologia, clonagem,
capacidade de resistência à seca, salinidade e assimilação do nitrogênio em pinhão-
manso (Jatropha curcas L
.)
”
, na Universidade Federal de Alagoas.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOL
OS E
ABREVIATURAS
..........................................................
viii
RESUMO
...................................................................................................................
xi
i
ABSTRACT
............................................................................................................... xv
I. Introdução Geral .....................................................................................................
01
1.1. Literatura citada ............................................................................................. 04
II. Capítulo I:
Respostas alométricas e morfologia foliar em café cultivado sob
diferentes
níveis de irradiância e de nitrogênio
............................... 07
2.1. Introdução ...................................................................................................... 07
2.2. Materiais & Métodos ..................................................................................... 09
2.2.1.
Material vegetal e condições de
cultivo
............................................ 09
2.2.2.
Avaliações
alométricas ...................................................................... 10
2.2.3.
Avaliações anatômicas
...................................................................... 10
2.2.4.
Nitrogênio total .................................................................................. 11
2.2.5.
Procedimentos estatísticos ................................................................
. 11
2.3
. Result
ados e Discussão ................................................................................. 1
2
2.3.1.
Avaliações
alométricas ...................................................................... 12
2.3.2. Avaliações
anatômicas
...................................................................... 14
2.5.
Literatura citada ............................................................................................. 1
9
II
I.
Capítulo
I
I:
Fotossíntese, metabolismo antioxidativo e fotoproteção em plantas
de
Coffea arabica
L.
avaliadas no inverno e submetidas a
diferentes níveis
de irradiância e nitrogênio
.................................... 23
3
.1. Introdução ...................................................................................................... 23
3
.2. Material & Métodos ...................................................................................... 25
3
.2.1. Desenho experimental ....................................................................... 25
3.2.2. Pa
râmetros agrometereológicos ........................................................ 2
5
3.
2.3. Área foli
ar específica ......................................................................... 26
3
.2.4. Trocas gasosas e
parâmetros de fluorescênci
a .................................. 26
3.2.5.
Ensaios bioquímicos .......................................................................... 27
viii
3
.2.5.1. Clorofilas e carote
nóides .................................................... 27
3
.2.5.2. Açúcares so
lúveis, amido e aminoácidos ........................... 28
3
.2.5.3. Nitrogênio total ...................................................................
28
3
.2.5.4. Fluxo metabólico ................................................................ 28
3.2.5.5. A
tivida
de da sintetase da glutamina.................................... 28
3
.2.5.6. Enzimas d
o metabo
lismo antioxidativo .............................. 29
3.2.5.7
. Proteínas solúveis totais ..................................................... 29
3
.2.6. Danos celulares .................................................................................. 29
3
.2.7. Pro
cedimentos estatísticos ................................................................
. 30
3
.3. Resultados e Discussão ................................................................................. 30
3
.3.1. Ambiente, características foliares
e metabolismo do nitrogênio ....... 30
3.3.2. Trocas ga
sos
as e metabolismo do carbono ........................................ 32
3
.3.3. Fluorescência, fotoproteção
e metabolismo antioxidativo ................ 35
3
.4. Síntese dos princip
ais resultados e conclusões .............................................. 45
3
.5. Literatu
ra citada ............................................................................................. 46
IV. Chapter III
:
Allometric models for non
-
dest
ructive leaf area es
timation in
c
offee
(
Coffea arabica
and
C. canephora
) ...................................... 51
4.1. Abstract ......................................................................................................... 51
4.2.
Introduction ...................................................................................................
52
4.3.
Materials and Methods .................................................................................. 5
3
4.4.
Results ........................................................................................................... 5
4
4.5.
Discussion ..................................................................................................... 5
6
4.6.
Acknowledgements ....................................................................................... 5
7
4.7.
References ..................................................................................................... 5
8
5. Conclus
ões
gera
is
................................................................................................... 69
Apêndice I
.................................................................................................................. 71
ix
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
A = anteraxantina
A
= taxa de assimilação líquida de carbono
AC = área das células epidérmicas ordinárias
AE = área estomática
AF = área foliar total
AFE = área foliar específica
APX = peroxidase do ascorbato
CAT
= catalase
CE = área do complexo estomático
CHL = clorofila
C
i
/C
a
= razão entre a
s
concentraç
ões
interna e ambiente de CO
2
D
= fração da energia
dissipada termicamente
DC = densidade d
as
células epidérmicas ordinárias
DE = densidade estomática
DEPS = estado de epoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas
DP = diâmetro polar do estômato (comprimento)
EM = espessura foliar
EP =
erro
-
padrão da média
EROs = espécies reativas de oxigênio
F
0
= fluorescência inicial
FAA
50
= formalina, ácido acético glacial
, álcool 50% (5:5:90; v/v)
F
m
= fluorescência máxima
emitida
F
m
’
= fluorescência máxima sob luz
F
s
= fluorescência
em
steady
-
state
FS = fotossistema
F
v
/F
m
=
eficiência fotoquímica máxima
do FSII
GR = redutase da glutationa
g
s
= condutância estomática
GS =
sintetase da glutamina
IE = índice estomático
LE = diâmetro equatorial do estômato (largura)
MDA = aldeído malônico
x
MF = massa fresca
N = nitrogênio
P
= fração da energia absorvida
utilizada na
fase
fotoquímica d
a fotossíntese
PA = biomassa da parte aére
a
P
E
= fração da energia absorvida não utilizada na fotoquímica nem dissipada
termicamente
RFA = radiação fotossinteticamente ativa
Rubisco = carboxilase/oxigenase da ribulose
-1,5-
bisfosfato
SOD = d
i
smutase do superóxido
SR = biomassa do sistema radicular
V = violaxantina
Z = zeaxantina
e
= déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera
FSII
= rendimento quântico do transporte de elétrons
GT =
-
glutamil hidroxamato
xi
RESUMO
POMPELLI, Marcelo Francisco, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de
2008. Respostas anatômicas e fisiológicas de plantas de café cultivadas em
diferentes níveis de nitrogênio e irradiância. Orientador: Fábio Murilo DaMatta.
Co
-
Orientadores
:
Marcelo Ehlers Loureiro e
Marília Contin
Ventrella
.
Dois experimentos foram conduzidos separadamente e analisados como tal, a
fim de investi
garem
-se os efeitos da irradiância e da nutrição diferencial de nitrogênio
sobre (i) as respostas alométricas e morfológicas e (
ii
) os mecanismos de fotoproteção
em plantas de café, sob condições de inverno. Procurou-se, ainda, avaliar os atuais
modelos alométricos usados para a estimativa da área foliar do cafeeiro e propor um
novo modelo usando medições não-destrutivas do limbo foliar nas duas espécies de
cafeeiros mais cultivados no mundo (Coffea arabica e C. canephora). No primeiro
experimento, plantas
de
C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44 foram cultivadas em
vasos de 12 L, a pleno sol ou sob redução de 50% da irradiância; para cada tratamento
de luz, três níveis de nitrogênio (0, 16 e 23 mM, respectivamente níveis deficiente,
adequado e em excesso) foram aplicados. A deficiência de N causou uma redução
marcante no acúmulo de biomassa, independentemente do ambiente lumínico. Em todo
o caso, as mudas cultivadas a pleno sol acumularam mais biomassa que as plantas
sombreadas, um forte indício de que as taxas fotossintéticas líquidas foram maiores nas
primeiras. A disponibilidade de luz, mas não de nitrogênio, promoveu alterações na
morfologia da epiderme: um aumento da expansão foliar, nas plantas sombreadas,
resultou em diminuição da densidade estomática de forma mais expressiva que a
redução o
xii
limitações difusivas. As plantas sombreadas exibiram taxas fotossintéticas
significativamente maiores em relação às das plantas cultivadas a pleno sol. Em
contraste, a capacidade fotossintética potencial foi maior nas últimas, bem como nas
plantas +N. Isso sugere que os efeitos positivos da nutrição nitrogenada sobre a
fotossíntese,
in situ, pode ter sido aparentemente atenuados pelas resistências difusivas
impostas, presumivelmente, pelas baixas temperaturas noturnas. As plantas –
N
apresentaram menor concentração de clorofilas, especialmente nas plantas cultivadas a
pleno sol. Nessas plantas, uma menor concentração de carotenóides, em base de massa,
e a menor atividade da peroxidase do ascorbato foram circunstancialmente associadas
ao acúmulo de H
2
O
2
, que pode ter acarretado danos às membranas cloroplastídicas. Por
outro lado, as plantas +N apresentaram maiores concentrações de clorofilas e
carotenóides, fato que possivelmente contribuiu para a elevação da fração da energia
luminosa usada na fotoquímica e uma diminuição da fração dissipada termicamente,
particularmente nas plantas cultivadas à sombra. Nas plantas cultivadas a pleno sol, a
atividade da catalase e da sintetase da glutamina (em decorrência da fotoinibição), são
evidências circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a
pleno sol. Em todo o caso, a aclimatação da maquinaria fotossintética a condições de
pleno sol foi fortemente dependente da disponibilidade de nitrogênio. No terceiro
experimento, mostrou-se que as atuais metodologias de estimação da área foliar do
cafeeiro, em geral, levam a uma subestimação da área foliar real. Desenvolveu-se um
modelo potencial (Y = ß
0
X
ß1
), baseado nas duas dimensões do limbo [Área foliar =
0,6626 x (Comprimento x Largura)
1,0116
]; R
2
= 0,996) com alta precisão
acurácia,dispersão normal dos resíduos e ausência de viés, independentemente da
cultivar, do tamanho e da forma da folha . O comprimento apenas (nas não a largura)
pode ser utilizado, com boa acurácia, para a predição da área foliar, porém às expensas
de uma ligeira perda de precisão, principalmente nas folhas com razão
comprimento/largura menor que 2,0 ou maior que 3,0 (8% das folhas amostra
das).
xiii
ABSTRACT
POMPELLI, Marcelo Francisco, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, F
ebruary
2008.
Anatomical and physiological responses
of
coffee plants grown under
differ
ent levels of nitrogen and irradiance. Adviser: Fábio Murilo DaMatta. Co-
Advisers: Marcelo Ehlers Loureiro and Marília Contin Ventrella.
Two experiments were carried out and analysed separately in order to investigate
the effects of irradiance and nitrogen supply on (i) the allometric and morphological
responses and (
ii
) photoprotection mechanisms in coffee plants under winter conditions.
In addition, the currently used allometric models for estimating the area of a coffee leaf
was examined, and a new, reliable and accurate model using non-
destructive
measurements of leaf dimensions for the two coffee (Coffea arabica and C. canephora
)
species economically important worldwide was developed. In the first experiment,
plants of C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44 were grown in 12L-pots either at full
exposure or under 50% full sunlight; for each light treatment, three nitrogen levels (0,
16, and 23 mM, which were considered as deficient, adequate, and excessive levels,
respectively) were applied. Nitrogen deficiency caused a remarkable reduction in
biomass accumulation, independently of irradiance treatments. In any case, the
seedlings grown at full exposure accumulated more biomass than the shaded
individuals, indicating that photosynthetic rates were higher in the former. Availability
of light, but not of nitrogen, led to changes
in epidermis morphology: an increase of leaf
expansion in shaded plants resulted in decreased stomatal density, which was stronger
than the reduction found in stomatal index. Such changes were apparently independent
on variations in stomatal dimensions, but dependent on alterations in the mean area of
epidermal cells. In the second experiment, plants were grown as in the first experiment,
with the exception that only two nitrogen levels (0 and 23 mM) were applied. The low
night temperatures combined with high irradiances, especially in plants grown at full
exposure, significantly impaired the rate of net carbon assimilation due mainly to
diffusive limitations. Shaded plants showed greater in situ photosynthetic rates than
sun
-grown plants. In contrast, the potential photosynthetic capacity was larger in the
xiv
latter, as well as in +N plants than in
–
N plants. This suggests that the positive effects of
nitrogen nutrition upon in situ photosynthesis should have been masked by the
remarkable diffusive resistances presumably imposed by the low night temperatures.
The –N plants had the lowest concentrations of chlorophylls, especially in sun-
grown
plants. In these plants, the smaller concentration of carotenoids on a fresh weight basis
and the lower activity of ascorbate peroxidase were circumstantially linked to increased
H
2
O
2
levels, which may have caused damage to chloroplast membranes. On the other
hand, the +N plants showed higher concentrations of chlorophylls and carotenoids,
which possibly brought about an increase of the light fraction used in photochemistry
and a decrease of the light fraction dissipated thermally, particularly under shade
conditions. In sun-grown plants, activities of catalase and glutamine synthase increased
(despite the occurrence of photoinhibition), which circumstantially evidence higher
photorespiration rates in plants grown in the open. In any case, the acclimation of the
photosynthetic machinery under full sunlight was strongly dependent on the nitrogen
availability.
In the third experiment, it was shown that the current main non-
destructive
methodologies for estimating the area of coffee leaves underestimate the true leaf area.
A power model (Y =
ß
0
X
ß1
) based on two leaf dimensions [Leaf area = 0.6626(Length x
Width)
1.0116
; R
2
= 0.996
] with high precision and accuracy, random dispersion pattern of
residuals and also unbiased, irrespective of cultivar and leaf size and shape, was
developed. Even when the length (but not width) alone was used as the single leaf
dimension, the power model developed still predicted with good accuracy the leaf area,
but at the expense of some loss of precision, as particularly found for 8% of the leaves
sampled with length-
to
-width ratios below 2.0 or above 3.0.
1
I
. INTRODUÇÃO GERAL
Das
103 espécies
descr
itas
de
Coffea
(Davies et al. 2006), apenas duas,
C. ara
bica
L. e C. canephora Pierre ex Froehner têm importância econômica no
mercado internacional, recebendo seus produtos
comercializados
a denomi
nação
genérica de “café arábica” e “café robusta”, respectivamente. O café, depois do
petróleo, é considerado a principal mercadoria no mundo. Seu mercado gera,
anualmente, mais de 90 bilhões de dólares. Cerca de 8% da população mundial,
i.e
., 500
milhões
de pessoas, estão envolvidas no mercado do café, desde o plantio até o
consumo final. Atualmente, cerca de 63% da produção mundial de café deriva-se de
café arábica e os 37% restantes, de café robusta. O Brasil, desde o século XIX, vem-
se
destacando como o maior produtor mundial de café, seguido pela Colômbia e Vietnam
(DaMatta & Ramalho 2006).
Originário das florestas tropicais da África, onde é encontrado em estado
espontâneo como vegetação de sub-bosque, desenvolvendo-se, portanto,
permanentemente sob sombra, o caf
eeiro
expandiu-se e adaptou-se às mais variadas
condições ecológicas da faixa tropical. No Brasil, atualmente, os cafezais vêm sendo
conduzidos quase exclusivamente a pleno sol, enquanto em muitos países da América
Central, por exemplo, a espécie é mais freqüentemente cultivada em sistemas
arborizados. Não obstante, cafeeiros cultivados a pleno sol produzem satisfatoriamen
te
e, na maioria dos casos, mais que os plantios à sombra. Como conseqüência, o
sombreamento, como prática cultural regular, foi abandonado em várias regiões do
mundo, como no Brasil e no Quênia (Malavolta 2000). Entretanto, tem-se observado
interesse crescente na reimplantação do sombreamento em cafezais, particularmente
porque essa prática está associada à conservação de recursos do ambiente e por permitir
menor uso de insumos para uma produção sustentável de café
(DaMatta & Rena 2002)
.
Apesar de a grande maioria dos trabalhos indicar que o cafeeiro exibe folhas
com características típicas de sombra, sua taxa de assimilação líquida de carbono (A
)
pode ser maior a pleno sol que à sombra, desde que a abertura estomática não seja
limitante
(DaMatta & Rena 2002). Na maioria dos trabalhos em que se observa maior A
à sombra que a pleno sol, menor condutância estomática (g
s
) para folhas expostas
2
parece explicar, em parte, essas observações (Freitas et al. 2003; Kumar & Tieszen
1980)
. Ressalte-se, todavia, que, pelo menos no Brasil, as cultivares atualmente
plantadas foram selecionadas em ensaios de competição quase sempre conduzidos a
pleno sol e, portanto, podem, potencialmente, apresentar adaptações a altas irradiâncias
em extensão superior àquelas selecionadas para ambientes sombreados (DaMatta 2004)
.
Com efeito, observa-se freqüentemente em cafeeiros a pleno sol, por exemplo, redução
da área foliar específica (AFE), cloroplastos com menos
grana
e menos tilacóides por
granum
(Fahl
et al. 1994), alta razão clorofila a/b e reversão da fotoinibição
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-0.09765 2063 1129 Tm(3677445)T765 0o765 0 0 -0.09765 3808 2854 Tm(f)50045)T765 0 0 -0.09765 3745 3199 Tm(a93j45)T765 0 0 -0.09765 2063 1129 Tm(402845)T765 0 0 -0.09765 2479 2854 Tm(409j45)T765 0 0 -0.09765 4807 2854 Tm(n)Tj45)T765 0 0 -0.09765 4807 2854 Tm(n)Tj45)T765 0i0 -0.09765 3808 2854 Tm(432845)T765 0 0 -0.09765 4941 3544 Tm(a395445)T765 0o765 0 0 -0.09765 3808 2854 Tm(4)Tj45)T765 0 0 -0.09765 3745 3199 Tm(4657445)T765 0 0 -0.09765 4548 1474 Tm(e757445)T765 0 0 -0.09765 4597 3544 Tm(t81245)T765 0t0 -0.09765 2308 1129 Tm(486745)T765 0i0 -0.09765 3808 2854 Tm(492j45)T765 0 0 -0.09765 5162 1129 Tm(a02j45)T765 0 0 -0.09765 5030 3544 Tm(511245)T765 0 0 -0.09765 5133 2509 Tm(a21245)T765 0 2048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 1874 3889 Tm(d)Tj45)T765 0àf( )Tj0.09765 0 0 -0.09765 6640 3544 Tm(550 045)T765 0 0 -0.09765 5041 3199 Tm(l60 045)T765 0l0 -0.09765 3416 2509 Tm(570j45)T765 0 0 -0.09765 4807 2854 Tm(5)T245)T765 0n0 -0.09765 2991 2854 Tm(5)9245)T765 09765 0 0 -0.09765 6352 2854 Tm(p05545)T765 0 0 -0.09765 4807 2854 Tm(614445)T765 0x0 -0.09765 2119 2164 Tm(624445)T765 0p0 -0.09765 6340 2509 Tm(t)T4T45)T765 0 0 -0.09765 2557 2164 Tm(64T4T45)T765 0 0 -0.09765 5264 3199 Tm(6Tj145)T765 0i0 -0.09765 3808 2854 Tm(6577445)T765 0ç0 -0.09765 6665 1474 Tm(l)Tj45)T765 0 0 -0.09765 6483 1819 Tm(o754445)T765 0o765 0 0 -0.09765 3808 2854 Tm(6928T45)T765 0 0 -0.09765 5264 3199 Tm(7006T45)T765 0 0 -0.09765 2557 2164 Tm(7106T45)T765 0 0 -0.09765 7090 2854 Tm(,)Tj45)T765 0 0 -0.09765 5030 3544 Tm(7250045)T765 0r0 -0.09765 7317 2164 Tm(s)Tj45)T765 0.f( )Tj/F1 2048 Tf0.08154 0 0 -0.08765 7440 3544 Tm(o)T145)T765 0E0 -0.09765 3901 3199 Tm(756j45)T765 0m0 -00 0 -0.09765 7113 3199 Tm(e)T245)T765 0t0 -0.09765 2308 1129 Tm(780 045)T765 0 0 -0.09765 7714 3199 Tm(s90 045)T765 0d0 -0.09765 2063 1129 Tm(o00 045)T765 0 0 -00 0 -0.09765 2926 2509 Tm(p2T245)T765 0 0 -00 0 -0.09765 2926 2509 Tm(p395445)T765 0c0 -0.09765 8483 2854 Tm(d)T445)T765 0 0 -0.09765 5030 3544 Tm(85T345)T765 0 0 -0.09765 5264 3199 Tm(8650045)T765 0of0.09765 0 0 -0.09765 8549 3199 Tm(s750045)T765 0,765 0 0 -0.09765 8874 1819 Tm(a)Tj45)T765 0 0 -00 0 -009765 0 0 -0.09765 1874 3889 Tm(r)Tj4)Tj048 Tf( )Tj0.09765 .09765 5654 3199 Tm(1)Tj4)Tj048 emelhantTf0.09765 0 0 -0.09765 8549 3199 Tm(27Tj4)Tj048 m0 -0.09765 2926 2509 Tm(s)T84)Tj048 e0 -0.09765 2308 1129 Tm(3 Tj4)Tj048 0 -0.09765 3382 2164 Tm(t1Tj4)Tj048 t0 -0.09765 2308 1129 Tm(31T34)Tj048 e0 -00 0 -0.09765 3901 3199 Tm(í4)Tj048 à765 0 0 -0.09765 2717 1819 Tm(35374)Tj048 m0 -0.09765 2926 2509 Tm(36914)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(r)T14)Tj048 i0 -0.09765 3808 2854 Tm(f)374)Tj048 o0 -0.09765 3745 3199 Tm(a9374)Tj048 r0 -0.09765 4002 3544 Tm(9)T44)Tj048 i0 -0.09765 3808 2854 Tm(40T9T4)Tj048 0 -00 0 -0.09765 4290 2509 Tm(s)414)Tj048 d0 -0.09765 4345 3199 Tm())14)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(a)Tj4)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 4629 1129 Tm(o)004)Tj048 e0 -0.09765 2308 1129 Tm(i)Tj4)Tj048 Tf( .09765 4548 1474 Tm(e7Tj4)Tj048 p0 -0.09765 2308 1129 Tm(486j4)Tj048 é0 -0.09765 3808 2854 Tm(49554)Tj048 c0 -0.09765 5041 3199 Tm(l)T44)Tj048 i0 -0.09765 3808 2854 Tm(51004)Tj048 e0 -0.09765 2308 1129 Tm(51Tj4)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 5354 2509 Tm(p)Tj4)Tj048 l0 -0.09765 5417 2854 Tm(c)T54)Tj048 e0 -0.09765 2308 1129 Tm(55T44)Tj048 0 -0.09765 5619 1474 Tm(o)T44)Tj048 h0 -0.09765 3416 2509 Tm(57034)Tj048 o0 -0.09765 3745 3199 Tm(58034)Tj048 s0 -0.09765 5030 3544 Tm(58814)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(59704)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 5354 2509 Tm(61414)Tj048 t0 -0.09765 2308 1129 Tm(61964)Tj048 r0 -0.09765 4002 3544 Tm(62634)Tj048 o0 -0.09765 3745 3199 Tm(63634)Tj048 0 -0.09765 6452 2854 Tm(l)634)Tj048 i0 -0.09765 3808 2854 Tm(65194)Tj048 c0 -0.09765 5041 3199 Tm(6)Tj4)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(o)Tj4)Tj048 i0 -0.09765 3808 2854 Tm(6)Tj4)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 5354 2509 Tm(69224)Tj048 c0 -0.09765 5041 3199 Tm(701j4)Tj048 u0 -0.09765 7113 3199 Tm(e)T04)Tj048 l0 -0.09765 5417 2854 Tm(,)T64)Tj048 t0 -0.09765 2308 1129 Tm(72224)Tj048 i0 -0.09765 7274 3544 Tm(s)T84)Tj048 v0 -0.09765 7379 1819 Tm(m)Tj4)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(74T64)Tj048 d0 -0.09765 3901 3199 Tm(75664)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(7)Tj4)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 5354 2509 Tm(78254)Tj048 o0 -0.09765 3745 3199 Tm(M)Tj4)Tj048 r0 -0.09765 4002 3544 Tm(7)T24)Tj048 i0 -0.09765 7274 3544 Tm(o00 04)Tj048 g0 -0.09765 3416 2509 Tm(81474)Tj048 i0 -0.09765 7274 3544 Tm(o2034)Tj048 n0 -0.09765 8305 3199 Tm(i)T34)Tj048 á0 -0.09765 2926 2509 Tm(p3924)Tj048 r0 -0.09765 4002 3544 Tm(84584)Tj048 i0 -0.09765 7274 3544 Tm(o)Tj4)Tj048 0 -0.09765 3783 1129 Tm(86024)Tj048 Tf( 0 0 -0.09765 5354 2509 Tm(ã)Tj4)Tj048 d0 -0.09765 3901 3199 Tm(88T34)Tj048 e0 -00 0 -009765 0 0 -0.09765 1874 3889 Tm(r)Tj5)Tj65 0 0 -0.09765 5030 3544 Tm(m)Tj5)Tj65 0m0 -0.09765 2119 2164 Tm(n)T75)Tj65 0b0 -0.09765 2219 2164 Tm(o)T75)Tj65 0 0 -0.09765 2286 3889 Tm(v)7j5)Tj65 0 0 -0.09765 2376 3199 Tm(a)Tj5)Tj65 0n0 -0.09765 2463 1819 Tm(a)Tj5)Tj65 0t0 -0.09765 2308 1129 Tm(e5185)Tj65 0 0 -0.09765 2376 3199 Tm(a)Tj5)Tj65 09765 0 0 -0.09765 2717 1819 Tm(f)565)Tj65 09765 .09765 2755 3199 Tm(i83j5)Tj65 0 0 -0.09765 2991 2854 Tm(b)355
3
da
plasticidade aos diferentes ambientes lumínicos
(Pandey
et al. 2003). Em geral, as
plantas desenvolve
m
“folhas de sol” e “de sombra” quando aclimatadas a diferentes
níveis de luminosidade
. Assim,
folhas de sombra, por sua maior área foliar
(Fahn 1990),
apresentam menos estômatos por unidade de área que uma folha característica de sol
(Onwueme & Johnston 2000; Salisbury 1927). Por outro lado, a
razão
entre o número
de estômatos e número de células comuns da epiderme se mantém, em geral, con
stante,
independentemente das condições de crescimento das plantas (Fahn 1990; Salisbury
1927; Teare et al.
1971)
.
O nitrogênio (N) é o quarto elemento mais abundante na composição das
plantas, depois do carbono e dos elementos da água (Epstein 1972). A alta exigência do
cafeeiro em N é um fato conhecido há muito tempo, e é acentuada com a idade da planta
(Malavolta
et al. 2002), particularmente com o início da produção de grãos. Plantas
lenhosas, em geral, apresentam teores foliares
médios de N em torno de 1
-
2%, enquanto
no cafeeiro esses teores são de 3-4%, podendo chegar a 4-5%. Ademais, valores abaixo
de 2,3% (ou em alguns casos abaixo de 2,7%) já são considerados como deficientes para
a cultura (Moraes 1981). Não havendo outros fatores limitantes, a nutrição nitrogenada
promove
o rápido desenvolvimento da planta, o aumento das ramificações dos ramos
frutíferos, o número de gemas florais, a formação abundante de folhas e,
conseqüentemente, o aumento da produtividade do cafeeiro (Malavolta 1980).
Sabe
-
se
que
plantas cultivadas sob quantidades inadequadas de N não expressam totalmente seu
potencial genético, pois, sob tais condições, ocorre uma série de alterações
morfofisiológicas, afetando, negativamente, o desenvolvimento das culturas
(Evans
1989).
Cabe ressaltar, ainda, que plantas bem nutridas, especialmente em N, possuem,
via de regra, um sistema antioxidante (demonstrado por um aumento na atividade das
enzimas
do sistema antioxidativo) e fotoprotetor mais robusto
(Ramalho
et al. 1998;
Ramalho
et al. 2000; Yu et al. 1999), fato importante para a aclimatação da planta a
diferentes estresses, c
omo
altas
irradiâncias, deficiências minerais ou baixas
temperaturas.
A área foliar de uma planta pode ser grandemente afetada pela disponibilidade
de luz e de nutrientes. Com efeito, a área foliar é uma variável-chave para a maioria dos
estudos fisiológicos e agronômicos envolvendo crescimento, interceptação de luz,
transpiração e eficiência fotossintética
(Blanco & Folegatti 2005)
. Portanto
, a área foliar
afeta fortemente o crescimento e a produtividade, e a estimativa de área foliar é, pois,
um componente fundamental dos modelos de crescimento das
plantas
(Lizaso
et al.
2003)
. No cafeeiro, entretanto, o método não-destrutivo atualmente mais utilizado para
4
mensuração da área foliar, desenvolvido por Barros et al. (1973), leva a uma
subestimação considerável da área foliar (Tavar
es
-
Júnior
et al. 2002). Assim, o
desenvolvimento de um novo método não-destrutivo para estimar-
se
, precisa e
acuradamente
,
a área foliar do cafeeiro reveste
-
se de particular importância.
Pretendeu
-
se
, neste trabalho, estudar o efeito da luz e do nitrogênio sobre
as
características morfológicas da epiderme, em especial sobre a anatomia dos estômatos,
procurando
-se explicar a variabilidade da densidade e do índice estomático com os
níveis de luz. Adicionalmente,
avaliou
-
se
a fotossíntese e os mecanismos de
fotoproteção do cafeeiro nas condições de inverno de Viçosa, sudeste do Brasil,
cultivando
-
se
plantas a pleno sol e à sombra, sob dois níveis de nitrogênio. Em adição
,
procurou
-se avaliar os métodos atualmente utilizados para a
estimação
da área foliar do
c
afeeiro
, bem como propor
um novo método
não
-destrutivo
de mensuração, que seja, ao
mesmo tempo
,
confiável, preciso
acurado
e prático.
(Barros
et al.
1973)
1.1
–
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-Júnior JE, Favarin JL, Dourado-Neto D, Maia AHN, Fazuoli LC,
Bernardes MS (2002) Análise comparativa de métodos de estimativa de área foliar em
cafeeiro.
Bragantia 61
: 199
-203
Teare ID, Peters
on CJ, Law AG
(1971) Size and frequency of leaf stomata in cultivars
of
Triticum aestivum
and
Triticum
species. Crop Sci 11
: 496
-498
Yu Q, Osborne LD, Rengel Z (1999) Increased tolerance to Mn deficiency in
transgenic tobacco overproducing superoxide dism
utase.
Ann Bot 84
: 543
-547
7
II. CAP
ÍTULO I
Respostas alométricas e morfologia foliar em caf
é cultivado
sob diferentes níveis de irradiância e de nitrogênio
2
.1
–
Introdução
A luz é um dos
fator
es
-chave que afeta o crescimento e a distribuição dos
tecidos ao longo da planta (Fahn 1990). A aclimatação fotossintética envolve uma
variedade de respostas,
tanto
em níveis anatômico, morfológico, bioquímico e
fotossintético. Há uma íntima relação entre as características foliares e a irradiância na
qual as folhas são expostas, em especial durante nos primeiros estádios do
desenvolvimento. Em geral, as plantas desenvolvem “folhas de sol” e “folhas de
sombra” quando aclimatadas a diferentes níveis de irradiância. As principais diferenças
anatômicas entre as folhas de sol e de sombra têm sido largamente documentadas. A
s
folhas de sol apresentam, geralmente, tecidos paliçádicos mais bem desenvolvidos,
maior superfície mesofílica por unidade de área, menor área foliar específica (AFE) e
folhas mais espessas quando comparadas a folhas desenvolvidas à sombra (Esau 1976;
Fah
n 1990)
.
Conjuntamente com o mesofilo, a epiderme também sofre alterações
consideráveis com mudanças na intensidade luminosa. A superfície foliar, em geral, é
maior nas folhas de ambientes com algum grau de sombra, apresentando células
maiores e estômatos
mais distantes entre si. Nesse sentido, a densidade estomática (DE),
que representa o número de estômatos por unidade de área, pode variar, dentre outros
fatores, com a irradiância, temperatura, concentração de CO
2
, e com o status hídrico da
planta, ou mesmo com o genótipo (Christophe
8
que levam à diferenciação da epiderme (incluindo os estômatos) e outros tecidos
foliares
(Fahn 1990), exibiria variações mínimas ou negligenciáveis em resposta a
variações do ambiente, conforme preconizado por Salisbury (1927). Desde 1927, pois, o
IE passou a ser usado como mais uma característica morfológica da folha, s
ervindo,
muitas vezes, como ferramenta taxonômica (Ayodele & Olowokudejo 2006; Mishra
1997; Teare et al. 1971). Entretanto, questiona-se a invariabilidade do IE, uma vez que
já foi demonstrado que ele pode variar, dentre outros fatores, com a irradiância
(Lake
et
al.
2001; Pandey et al. 2003; Rahim & Fordham 1991), com a concentração de CO
2
atmosférico
(Miyazawa
et al. 2006; Uhl & Kerp 2005) e com o status hídrico da planta
(Liao
et al. 2005; Zhao et al. 2006). A despeito dessas considerações, muitos autores
descrevem que isso seria um mero erro na interpretação dos dados (Mishra 1997;
Schoch
et al. 1980; Tichá 1982). Em todo o caso, correlações negativas entre o IE e a
densidade de células epidérmicas ordinárias (DC)
(Liao
et al. 2005; Miyazawa et al.
2006; Pandey et
al.
2003) ou a área ocupada pelos estômatos (AE) (Mishra 1997), ou
ainda
correlação
positiva entre o IE e a DE (Hovenden & Schoor 2006; Mishra 1997;
Pandey
et al. 2003; Uhl & Kerp 2005), entre o IE e a área das células epidérmicas
ordinárias (AC) (Rahim & Fordham 1991) ou mesmo entre o IE e a condutância
estomática (g
s
)
(Miyazawa
et al. 2006) têm sido reportadas em diversos trabalhos
recentes.
Em função de sua origem em ambientes sombreados, o cafeeiro vem sendo
tradicionalmente considerado como uma espécie de sombra. Todavia, há considerável
capacidade de aclimatação das plantas a pleno sol; com efeito, em muitas situações,
cafeeiros a pleno sol produzem mais que aqueles à sombra (DaMatta 2004a, 2004b).
Saliente
-se que a aclimatação às altas irradiâncias parece largamente dependente do
status de nitrogênio (N) na planta
(Ramalho
et al. 2000), o que explicaria, pelo menos
em parte, a alta exigência do cafeeiro em N (DaMatta 2004a). Registre-se, também, que
tanto a disponibilidade de luz, como a de N, podem ter impactos significativos sobre a
fotossíntese e sobre o crescimento e a morfologia da planta (Fownes & Harrington
2004; Guo et al. 2007; Ramalho et al. 2000; Seemann 1989; Warren 2004; Warren &
Adams
2004)
, mas muito pouco tem sido explorado sobre os efeitos combinados desses
dois fatores em cafeeiros. Neste estudo, foram avaliados os efeitos da disponibilidade de
luz e do N sobre o crescimento e sobre a morfologia foliar em geral, e sobre a
morfologia do estômato em particular, em plantas jovens de café arábica cultivada em
vasos.
9
2.2 –
Material
&
Métod
os
2.2.1 –
Material vegetal e condições de cultivo
Os
experimento
s foram
conduzido
s em Viçosa (20º45’S, 42°54’W, 650 m
de
altitude), Minas Gerais, em fatorial 2 x 3, sendo duas irradiâncias (pleno sol e à sombra
– 50%) e três níveis de nitrogênio (0, 16 e 23 mM), seguindo-se de um delineamento
inteiramente casualizado. Mudas de café (C. arabica L. cv Catuaí Vermelho IAC 44),
com
3-4 pares de folhas,
for
am
plantadas em vasos de 12 L, contendo uma mistura de
60% de areia e 40% de solo. Após a análise da composição da mistura,
realizou
-
se
a
adubação e a correção do pH do substrato, de acordo com análise de solo e
recomendações técnicas para a cultura. A umidade do s
ubstrato
foi
mantida próxima à
capacidade de campo,
via
irrigações periódicas. Metade das plantas
foi
cultivada a pleno
sol, e a outra metade
,
sob telado (sombrite
®
), com 50% da radiação solar. Nos primeiros
45 dias após o transplante, as plantas
foram
fertiirrigadas
quinzenalmente
com solução
nutritiva completa de Hoagland (Epstein 1972). Após esse período, 250 mL de solução
nutritiva de Hoagland, modificada ou não, foram aplicados semanalmente, de modo a
obterem
-se três níveis de N: 0, 16 e 23 mM (Tabela 1), respectivamente, níveis de N
deficiente, adequado e em excesso para a cultura. As avaliações e amostragens
foram
realizadas entre novembro de 2005 e março de 2006, utilizando-se das folhas mais
novas, totalmente ex
pandidas
.
Tabela
1
.
Composição de macro e micronutrientes de solução nutritiva de Hoagland
(Epstein
1972)
, com modificações, de modo a fornecer
três
níveis de N. A composição dos demais
micronutrientes
foi
mantida conforme Eps
tein (1972)
.
Sal
0 mM
16 mM
23 mM
KCl
4 mM
---
---
KH
2
PO
4
2 mM
---
---
CaCl
2
4 mM
---
---
MgSO
4
1 mM
1 mM
1 mM
KNO
3
---
6 mM
6 mM
NH
4
H
2
PO
4
---
2 mM
2 mM
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O
---
4 mM
4 mM
NH
4
NO
3
---
---
1 mM
NaNO
3
---
---
6 mM
Fe-
EDTA
0,1 mM
0,1 mM
0,1
mM
10
2.2.2
–
Avaliações alométricas
Cinco meses após o plantio, as plantas foram fracionadas em parte aérea
(folhas e caule) e sistema radicular. As seguintes características morfológicas foram
avaliadas:
(i) área foliar total, (ii) área foliar específica, (iii) biomassa da parte aérea (PA),
(iv) biomassa do sistema radicular (SR), (v) biomassa total e (vi) razão PA : SR. Para a
determinação da área foliar total, as folhas foram digitalizadas, com a utilização de um
scanner de mesa Genius 1200XE (KYE Systems UK Ltd., Croydon, Surrey, UK) e as
imagens foram analisadas pelo software Image-
Pro
®
Plus (version 4.1, Media
Cybernetics,
Inc., Silver Spring, EUA
).
Na determinação do acúmulo de biomassa, as
frações foram secas em estufa 70ºC, 72 h, quando sua massa foi determinada. Para
determinação da AFE, dez discos foliares, de 1,4 cm
2
, foram secos até peso constante.
Para cálculo da AFE utilizou-
se da seguinte fórmula:
(Carmello
-
Guerreiro 1995)
)(
sec
)(
cos
)(
2
12
kg
amassa
m
dis
dos
foliar
área
kg
m
AFE
2.2.3 –
Avaliações anatômicas
De cada repetição, coletou-se uma folha completamente expandida, que foi
fixada por 48 h, em FAA
50
, e mantida em etanol 70% (Johansen 1940) até o uso.
Fragmentos foliares foram tratados com clorofórmio, 95%, 2 h, sob agitação e, em
seguida, com etanol 70% e água corrente. Posteriormente, os fragmentos foram tratados
com NaOH 10%, 2 h, sob agitação, seguidos de NaOCl 10% até completa clarificação
dos tecidos. Subseqüentemente, os fragmentos foram corados com solução de violeta
cristal, 1%, por 48 h. Os fragmentos foram, então, desidratados em série etílica /
xilólica, e montados entre lâmina e lamínula com resina sintética (Permount
®
).
Para a
determinação
da densidade estomática e das células ordinárias da epiderme, foram
escolhidos, aleatoriamente, 20 campos de 0,171 mm
2
, de acordo com Salisbury (1927).
Para determinação do IE utilizou
-
se da fórmula: IE (%) = [(DE) / (DE + DC)] x 100, em
que DE e DC, signi
ficam, respectivamente densidade estomática e densidade das células
ordinárias da epiderme. A partir das medidas de comprimento e largura do estômato,
obtiveram
-se a razão comprimento : largura e a área do estômato, considerando-o como
uma elipse [área =
x (C
/2)
x (L/2)], em que C e L representam o comprimento e
largura, respectivamente. A área das células epidérmicas ordinárias foi obtida por
subtração entre a área total do campo microscópico e a área ocupada pelos complexos
estomáticos. A densidade das células ordinárias foi calculada a partir de 20 campos,
11
com auxílio do programa de análise de imagens, descrito abaixo. Para a determinação
da espessura foliar, fragmentos fixados em FAA
50
foram incluídos em 2-
hidroxietil
-
metacrilato
(Leica Microsystems Nussloch, GmbH, Heibelberg, Alemanha), segundo as
recomendações do fabricante, seccionados a 7 m e corados com azul de toluidina
(O’Brien
et al. 1965) e montados entre lâmina e lamínula com resina sintética
(Permount
®
).
Todas as medições foram obtidas com auxílio do programa Image Pro
®
Plus version 4.1
(Media Cyber
netics, Inc., Silver Spring, EUA
).
10 m
Comprimento
Largura
Poro
2.
2.4
–
Nitrogênio total
Amostras foliares foram secas a 70
o
C, por 72 h, das quais se determinaram o
nitrogênio orgânico (Jackson 1958) e o nitrogênio nítrico
(Ca
taldo
et al. 1975). A soma
das duas frações representa o nitrogênio total.
2.2.5
–
Procedimentos estatísticos
Cada unidade experimental foi composta por uma planta por vaso. As
análises de correlações foram feitas utilizando-se do programa estatístico
St
atistica 7.0
(St
atSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA) e as diferenças entre as médias dos tratamentos
foram
analisadas
pelo teste estatístico de Newman Keuls, mediante o p
rograma
e
statístico
Sigmaplot 9.0 com Sigmastat integration (Systat Software, Inc., San Jose,
CA, EUA).
(Salisbury 1927)
Figura 1. Complexo estomático, evidenci-
ando a tomada das dimensões do est
(diâmetro polar: comprimento e diâmetro
equatorial: largura)
.
Em cinza, são represen-
tadas as células subsidiárias. A área do com-
plexo estomático foi tomado pelo contorno
das células su
bsidiárias e células
-
guarda.
12
2.3
–
Resultados e Discussão
2.3.1
–
Avaliações alométricas
O cultivo das mudas de cafeeiro a pleno sol causou uma diminuição
significativa na área foliar total e na AFE (13,5% e 16%, respectivamente; Tabela 2).
Por outro lado, o acúmulo de biomassa de raízes e biomassa total foi, em média, maior
(50% e 19%,
respectivamente
) nas plantas cultivadas a pleno sol que à sombra
(Tabela
2). Menor área foliar, porém com maior acúmulo de biomassa, indica que a fotossíntese
das plantas a pleno sol, ao longo do tempo, deve ter sido maior que nas plantas à
sombra. Essas informações suportam as sugestões de DaMatta (2004a,b) de que o
cafeeiro não deve ser considerado uma espécie de sombra, apesar de ter evoluído em
ambientes sombreados.
Via de regra, a maioria dos pesquisadores parece concordar que mudas de café
crescem melhor à sombra que a pleno sol (Maestri & Barros 1977). Todavia,
geralmente, em experimentos em que se comparam plantas nas duas condições de
irradiância, o volume de substrato em que as plantas crescem é, ordinariamente, muito
pequeno. Como a pleno sol a evapotranspiração é maior que à sombra, uma menor
disponibilidade de água para mudas a pleno sol poderia explicar o seu menor
crescimento.
O fato de a planta apresentar folhas maiores (e maior área foliar) (Tabela
2) e mais verdes (maior concentração de clorofila por unidade de massa; dados não
mostrados) à sombra que a pleno sol, pode transmitir uma falsa percepção de maior
vigor da planta à sombra. Nesse contexto, cultivando mudas de café por sete meses em
sacolas (11 x 22 cm; ~850 cm
3
),
Paiva
et al. (2003) verificaram que, sob 50% de
sombreamento, as mudas apresentavam maior área foliar e massa seca que a pleno sol;
os mesmos autores verificaram, também, que a razão parte aérea : sistema radicular (em
base de massa) foi, respectivamente, 6,0 e 5,6, nas plantas sob 50% de sombra e a pleno
sol. Observa-se, no presente trabalho (Tabela 2), que, ao contrário daqueles autores, a
razão PA : SR foi, respectivamente, 2,2 e 1,5, nas plantas sob 50% de sombra e a pleno
sol. Elevados valores de razão PA : SR são indicativos de uma forte restrição espacial
ao crescimento radicular e, assim, provavelmente, o balanço entre as raízes e a parte
aérea é perd
ido,
i.e.
, as raízes não conseguem suprir a parte aérea, especialmente de
água
(Poorter & Nagel 2000), diferentemente do que foi aqui observado, em que o
crescimento radicular não foi diminuído pelo volume do substrato. Ademais, as plantas
cultivadas à sombra apresentam maior área foliar total e específica e maior razão de
massa foliar (Tabela 2), e as plantas cultivadas a pleno sol maior biomassa do sistema
13
radicular. Assim, verifica-se que o cafeeiro cultivado à sombra aloca mais biomassa
para a parte aérea que radicular, enquanto as cultivadas a pleno sol a
locam
,
proporcionalmente,
mais biomassa para o sistema radicular, de forma a compensar a
maior demanda evaporativa da parte aérea nas condições de plena irradiância. Tomados
em conjunto, essas informações sugerem que o cafeeiro, mesmo na fase de muda, pode
crescer a maiores taxas a pleno sol que à sombra, desde que o volume de substrato não
limite a disponibilidade de água para a planta como um todo. Em todo o caso, não se
pode descartar potenciais diferenças interespecíficas no que diz respeito ao crescime
nto
das plantas de café a pleno sol e à sombra, bem como o papel diferencial de
fitorreguladores (
e.g.
auxinas, giberelinas) na expansão celular
(Kende
et al. 1998;
Yang
et al.
1996)
e na alocação diferencial de biomassa ao longo da planta.
O suprimento de nitrogênio, de modo semelhante à irradiância, também alterou
a partição de biomassa das plantas. Verificou-se que as plantas supridas com 16 e
23 mM de N acumularam mais biomassa total quando em comparação com as
deficientes. Entretanto, a nutrição nitrogenada se traduziu em efeitos mais significativos
no acúmulo de biomassa na PA do que no SR, fato também reportado em mudas jovens
de
Picea
engelmannii cultivadas sob 10 ou 100 mg N L
-1
, tanto a pleno sol quanto
Tabela
2
.
Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0, 16 e 23 mM) sobre os teores
foliares de N e variáveis alométricas em plantas jovens de Coffea arabica L. cultivadas a pleno
sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam
significância estatístic
a (
teste
t
, p
= 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de
nitrogênio, enquanto letras minúsculas denotam significância entre os níveis de nitrogênio,
dentro de uma mesma irradiância.
Plantas à sombra
Plantas a pleno sol
Parâmetros
0
mM
16 mM
23
mM
0
mM
16 mM
23 mM
N total
(g kg
-1
MS)
19,9 ± 0,7
Ac
32,1 ± 1,3
Ab
35,7 ± 0,5
Aa
20,1 ± 0,2
Ac
29,2 ± 1,0
Ab
37,2 ± 0,8
Aa
Área foliar total
(dm
2
)
8,4 ± 0,6
Ab
19,9 ± 0,8
Aa
21,3 ± 1,4
Aa
7,2 ± 0,7
Bb
17,8 ± 0,8
Ba
17,9 ± 1,8
Ba
Área foliar
especí
fica (m
2
kg
-1
)
15,9 ± 0,6
Aa
13,6 ± 0,8
Aa
14,5 ± 0,8
Aa
14,1 ± 0,4
Ba
11,6 ± 0,8
Ba
11,3 ± 0,6
Ba
Biomassa das folhas
(g)
6,1 ± 0,5
Ab
14,1 ± 0,7
Aa
15,2 ± 1,1
Aa
5,6 ± 0,5
Ab
15,3 ± 0,8
Aa
14,5 ± 1,6
Aa
Biomassa da parte
aérea (g)
9,5 ± 0,8
Ab
19
,5 ± 1,0
Aa
20,8 ± 1,6
Aa
9,4 ± 0,9
Ab
22,1 ± 1,6
Aa
20,7 ± 2,5
Aa
Biomassa do
sistema radicular (g)
7,6 ± 1,1
Ba
7,9 ± 0,7
Ba
8,4 ± 1,6
Ba
10,8 ± 1,5
Aa
14,1 ± 1,4
Aa
11,0 ± 2,2
Aa
Biomassa total
(g)
17,2 ± 1,9
Bb
27,4 ± 1,7
Ba
29,2 ± 3,0
Ba
20
,2 ± 2,4
Ab
36,2 ± 2,9
Aa
31,7 ± 4,3
Aa
Parte aérea /
Sistema radicular
1,33 ± 0,11
Ab
2,51 ± 0,11
Aa
2,69 ± 0,25
Aa
0,91 ± 0,06
Bb
1,62 ± 0,09
Ba
2,04 ± 0,23
Ba
14
sob 30% de irradiância (McKinnon & Mitchell 2003). Dessa forma, a razão PA : SR
elevou
-se com o aumento do suprimento de N, independentemente do regime de luz
empregado
(Tabela 2).
Assim, acredita
-
se que a partição de biomassa entre a parte aérea
e radicular tenha sofrido alterações diferenciais com a adubação nitrogenada, d
e
maneira
semelhante ao anteriormente reportado em plantas de mandioca cultivadas em
diferentes
concentrações de nitrogênio
(Cruz
et al. 2003).
15
plantas cultivadas à sombra, a expansão celular pode ter sobrepujado as divisões
celulares
que acarretam aumento do número de células, uma vez que se observou um
aumento médio de 35% na área individual das células e uma redução média de 20% da
sua densidade (Tabela 3). Apesar do fato do
número de divisões celulares ser controlado
geneticamente
(Nadeau & Sack 2003), o ambiente pode exercer forte pressão e alterar
esse padrão; dessa forma, folhas sombreadas, fr
eqüentemente,
apresentam incremento
do número de divisões
celulares
, como forma de incrementar a área foliar, conforme
descrito para
Populus
sp.
(Ceulem
ans
et al. 1995). Em alguns casos, tanto o número de
divisões
celulares
quanto a área média das células podem ser aumentados com a
diminuição da intensidade luminosa (Friend & Pomeroy 1970; Salisbury 1927; Yano &
Terashima 2001). A análise de correlações (Tabela 4) demonstra que houve uma
interação negativa significativa (r = -0,987 p = 0,001) entre a densidade das células
epidérmicas
ordinárias
e a sua área, de modo que, com o sombreamento, a área foliar
unitária é maior, fato que eleva também o volume das células epidérmicas e,
conseqüentemente
, reduz sua freqüência. Comportamento semelhante ao observado
neste estudo também foi reportado em
Allium sativum
(Rahim & Fordham 1991)
.
As folhas de C. arabica têm padrão dorsiventral, com parênquima lacunoso,
ocupando, em média, 74% do volume do mesofilo (Tabela 3), além de serem
hipoestomáticas, com estômatos paracíticos (Figura 1). Não se verificou diferenças
significativas entre a espessura foliar das plantas cultivadas a pleno sol ou à sombra.
Entretanto, tanto as superfícies adaxial e abaxial da epiderme foram mais espessas nas
plantas cultivadas à sombra que a pleno sol (Tabela 3). É possível, porém
,
que
,
devido a
maior demanda evaporativa das plantas cultivadas a pleno sol, a composição da parede
periclinal externa das folhas destas plantas apresentem uma maior proporção de ceras e
cutícula que nas plantas cultivadas à sombra, em especial na superfície adaxial da
epiderme, conforme anteriormente demonstrado para a espécie
(Fahl
et al. 1994). Cabe
ressaltar
, ainda, que o parênquima paliçádico foi significativamente mais espesso nas
folhas desenvolvidas a pleno sol
16
Sabe
-
se
que a diferenciação estomática é uma característica estabelecida
durante os primeiros estádios do desenvolvimento da folha (Nadeau & Sack 2002;
Radoglou & Jarvis 1990), mas a rota exata ou sinalização que
governa
es
s
a
diferenciação não está totalmente esclarecida (Bergmann 2004; Lake et al. 2001;
Miyazawa
et al. 2006; Salisbury 1927; Serna & Fenoli 2000). Recentemente,
tem
-
se
relatado que, durante a ontogenia foliar, DE e IE são influenciados pela intensidade de
luz e pela concentração de CO
2
na qual as folhas maduras se encontravam, o que sugere
que tais folhas tenham um papel significativo no desenvolvimento das novas folhas,
provavelmente pela geração de um sinal sistêmico que envolve a planta como um todo
(Brownlee 2001; Köhler & Mueller-Roeber 2004; Lake et al. 2001; Miyazawa et al.
2006; van Hoof et al. 2006; Yano & Terashima 2001). Apesar de alguns relatos sobre a
alteração do IE em folhas expos
tas a diferentes irradi
âncias
(Brownlee 2001; Lake et al.
2001; Miyazawa et al. 2006; Pandey et al. 2003; Rahim & Fordham 1991), pouco se
conhece sobre as reais causas dessa alteração.
Tabela
3. Efeito do sombreamento sobre as características anatômicas da
fol
ha,
em plantas
jovens de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP
(n = 10). Letras maiúsculas denotam
diferenças
signific
ativas
(teste t, p = 0,05) entre as médias
dos tratamentos
.
Parâmetros
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Área foliar unitária (dm
2
) 0,
41 ± 0
,
01 B
0,
56 ± 0
,
02 A
Densidade estomática (estômatos mm
-2
) 184,
42 ± 3
,
59 A
138,
84 ± 4
,
57 B
Índice estomático (%)
20,
08 ± 0
,
23 A
19,
09 ± 0
,
28 B
Densidade
das
células ordinárias (
células
mm
-2
) 733,
65 ± 7
,
95 A
587,
86 ± 13
,
11 B
Diâmetro polar do estômato (
m)
26,
80 ± 0
,
18 ns
26,
89 ± 0
,
23 ns
Diâmetro equatorial do estômato (
m)
17,
79 ± 0
,
10 ns
17,
85 ± 0
,
16 ns
Área do estômato (
m
2
)
374,
72 ± 3
,
81 ns
377,
24 ± 5
,
25 ns
Área do complexo estomático (
m
2
)
1136,
46 ± 36
,
14 ns
1137,94 ± 24,
02 ns
Área das células ordinár
ias (
m
2
)
1069,
09 ± 21
,
79 B
1437,
24 ± 26
,
75 A
Superfície adaxial da epiderme (
m)
23,17 ± 0,70 B
25,50 ± 0,42 A
Superfície abaxial da epiderme (
m)
16,11 ± 0,39 B
17,28 ± 0,43 A
Parênquima paliçádico (
m)
58,97 ± 1,40 A
54,71 ± 1,24 B
Parênquima lacunoso (
m)
163,85 ± 4,70 A
155,21 ± 4,71 A
Espessura total da folha (
m)
262,1 ± 5,83 A
252,7 ± 5,58 A
PP : PL
0,37 ± 0,01 A
0,35 ± 0,01 A
Espaços de ar no PL (%)
21,63 ± 0,80 B
25,96 ± 0,77 A
Demonstrou
-se, neste
estudo
, que as células ordinárias da epiderme têm uma
alta plasticidade, diferentemente do que ocorre com as células subsidiárias ou mesmo
17
com as células-guarda. O sombreamento das folhas acarretou uma elevação de 35% na
área das células epidérmicas ordinárias e uma redução de 20% da sua freqüência, fato
que, em conjunto afetam diretamente o IE, uma vez que foi evidenciado neste estudo,
uma
interação positiva entre o IE e a DC (r = 0,500 p = 0,05), e negativa entre o IE e
AC (r = -
0,571
p = 0,001). Apesar disso, nenhuma alteração significativa foi percebida
nas dimensões das células
subsidiárias
ou mesmo nas das
células
-
guarda.
Em função
disso, o IE das folhas desenvolvidas a pleno sol e à sombra foi, respectivamente,
20,08% e 19,09%, uma elevação de 5,2% em favor das folhas de sol. Situações
semelhantes às apresentadas neste estudo também foram reportadas em Allium sativum
(Rahim & Fordham 1991), em Arabidopsis thaliana
(Lake
et al. 2001), em
Populus
trichocarpa
(Miyazawa
et al. 2006) e em Ginkgo biloba
(Pandey
et al. 2003)
.
Não
obstante,
a alteração do IE não foi correlacionada com nenhuma das características
estomáticas avaliadas (Tabela 4), de forma distinta do apresentado por muitos autores,
que descrevem que as alterações no IE são reflexos da alteração das dimensões do
estômato, uma vez que a elevação da
DE
, com conseqüente diminuição das suas
dimensões, elevaria o IE na mesma proporção
(Ceulemans
et al. 1995; Ciha & Brun
1975; Lake et al. 2001; Liao et al. 2005; Rahim & Fordham 1991; Salisbury 1927).
Tabela
4
.
Coeficientes de correlação entre as características foliares, em plantas jovens de
Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. IE = índice estomático,
AF = área foliar, AFE = área foliar específica, DE = densidade estomática, DC = densidade das
células epidérmicas, DP = diâmetro polar do estômato, LE = diâmetro equatorial do estômato,
AE = área
estom
ática
, CE = área do complexo estomático, AC = área das células epidérmicas,
EM = espessura foliar. Os valores são significativos a p = 0,05 (*), p = 0,01 (**), p = 0,
001
(***), ou não signifi
c
ativos
(ns; p > 0,05).
IE
AF
AFE
DE
DC
DP
LE
AE
CE
AC
EM
IE
___ -
0,423
*
-
0,018
ns
0,767
***
0,500
*
0,179
ns
0,344
ns
0,318
ns
0,090
ns
-
0,571
***
-
0,236
ns
AF
___ ___
0,315
ns
-
0,736
***
-0
,769
***
0,033
ns
-
0,398
*
-
0,223
ns
0,273
ns
0,744
***
-
0,162
ns
AFE
___ ___ ___ -
0,415
*
-
0,548
**
-
0,203
ns
0,171
ns
-
0,010
ns
-
0,130
ns
0,538
**
-
0,399
ns
DE
___ ___ ___ ___
0,937
*
0,035
ns
0,221
ns
0,149
ns
-
0,027
ns
-
0,956
***
0,029
ns
DC
___ ___ ___ ___ ___ -
0,041
ns
0,115
ns
0,038
ns
-
0,086
ns
-
0,987
***
0,181
ns
DP
___ ___ ___ ___ ___ ___
0,300
ns
0,799
***
0,309
ns
-
0,007
ns
-
0,217
ns
LE
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
0,813
***
-
0,326
ns
-
0,086
ns
-
0,340
ns
AE
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -
0,019
ns
-
0,049
ns
-
0,343
ns
CE
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -
0,043
ns
-
0,020
ns
AC
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ -
0,160
ns
EM
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
18
Ad
PP
LC
PL
Ab
FV
Figura
2
.
Superfície abaxial (A, B)
da
folha, seção transversal da folha (C, D) e seção
paradérmica do parênquima lacunoso (E, F) de plantas de
Coffea arabica
L. cultivadas a
pleno sol (A, C, E) ou à sombra (B, D, F). Ad = Superfície adaxial da folha,
Ab = superfície abaxial da folha, PP = parênquima paliçádico, PL = parênquima
lacunoso,
PE = Parede periclinal externa, PI = Parede periclinal interna, LC = lacunas
de ar no parênquima lacunoso, Cl = cloroplastos, FV = feixe vascular, Es = Estômato,
CS = Cavidade estomática.
Barra 50
m
Neste estudo,
a DE
foi afetada pelo sombreamento
em maior extensão que
o IE
(33% e 5,2%, respectivamente), variações similares às relatadas em Ginkgo biloba
(Pandey
et al. 2003) e em Vigna sinensis
(Schoch
et al. 1980). Com o aumento da
expansão foliar, em resposta ao sombreamento, houve uma redução na DE, sem
alterações aparentes nas dimensões dos estômatos, porém com alterações significativas
na área média das células ordinárias da epiderme (Tabela 4 e Figura 2). Isso sugere
que
19
a diferenciação estomática
seja
regulada por um mecanismo morfofisiológico diferente
daquele que determina a divisão
ou
a expansão das células epidérmicas e comprova a
plasticidade diferencial das células ordinárias da epiderme na alteração do IE com a
alteração nos níveis de irradiância.
Os resultados
apresentados
neste trabalho
mostram que o
sombreamento afeta a
DE e o IE, embora as alterações neste último sejam mais discretas. Essa alteração
diferencial faz d
a última
uma característica mais aplicável para inferências
taxonômicas,
enquanto a primeira é mais adequada para indicar a plasticidade morfológica da espécie
aos diferentes ambientes de luz. Neste sentido, as variações
em
IE ou mesmo em DE,
em café, podem
ser
atribuídas
à maior plasticidade das células epidérmicas ordinárias, e
não às células estomáticas como apresentado p
ara
outras espécies (Ciha & Brun 1975;
Hovenden & Shimanski 2000; Mishra 1997; Onwueme & Johnston 2000; Pallardy &
Kozlowski 1979; Poole & Kürschner 1999)
.
2
.5
–
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23
III. CAPÍTULO II
Fotossíntese, metabolismo antioxidativo e fotoproteção em plantas de
Coffea ar
a
bica
L.
avaliadas no inverno e submetidas a diferentes níveis
de irradiância e nitrogênio
3
.1
–
Introdução
O café arábica é originário das florestas tropicais da África, onde é encontrado
em estado espontâneo como vegetação de sub-bosque. Entretanto, as cultivares
largamente utilizadas no Brasil foram selecionadas em ensaios de competição quase
sempre conduzidos a pleno sol e, portanto, podem, potencialmente, apresentar
adaptações a altas irradiâncias em extensão superior àquelas selecionadas para
ambientes sombreados (DaMatta 2004). Em todo o caso, o cafeeiro, a pleno sol, pode
ser submetido a um excesso de energia radiante que, por seu turno, pode limitar a
fotossíntese p
ela inativação d
os centros
de reação
, devido, em parte,
à
superexcitação da
cadeia de transporte de elétrons, que gera espécies reativas de oxigênio (EROs,
e.g.
H
2
O
2
,
1
O
2
, OH , O
2
-
) danosas aos lipídios de membrana (Blankenship 2006). Não
obstante, as plantas podem reduzir a absorção da luz,
e.g.
via redução da concentração
de clorofilas e aumento da reflectância da radiação incidente
(Lambers
et al. 1998)
.
Adicionalmente, a fotoproteção pode ser alcançada pelo aumento da dissipação do
excesso de energia via carotenóides ou pela elevação do metabolismo das EROs, que,
em geral, envolve três mecanismos: (i) a participação de antioxidantes (
e.g.
-
tocoferol,
-caroteno, luteína, violaxantina, anteraxantina e zeaxantina) associados às membranas
lipídicas, (ii) pequenas moléculas antioxidantes solúveis em água (
e.g.
ascorbato,
glutationa) e (iii) antioxidantes enzimáticos incluindo as enzimas dismutase do
superóxido, catalase, peroxidase do guaiacol e as enzimas do ciclo ascorbato-
glutationa
(
e.g.
peroxidase do ascorbato, redutase do monodesidroascorbato e redutase do
desidroascorbato) (
Nishiyama
et al. 2006). Coletivamente, esses mecanismos podem
24
la
rgamente minimizar potenciais aumentos na concentração de EROs
(Blankenship
2006; Bray et al. 2000; Holt et al. 2005). Sem um sistema fotoprotetor eficaz, pode
ocorrer fotoinibição da fotossíntese, caracterizada p
or
um declínio sustentado no
rendimento quântico da fotossíntese e um decréscimo
da eficiência fotoquímica máxima
do fotossistema (FS) II (F
v
/F
m
) e, em muitos casos, por um decréscimo no rendimento
quântico potencial do FSII
(Corcuera
et al. 2005; DaMatta & Maestri 1997; Ögren
1991)
. Nesse sentido, a participação dos carotenóides na fotoproteção da maquinaria
fotossintética é de fundamental importância
(Demmig
-
Adams
et al.
1996b)
.
As plantas são capazes de aclimatar suas taxas fotossintéticas a diferentes
intensidades luminosas, o que
implica
em mudanças substanciais no conteúdo e/ou
composição da maquinaria
fotossintétic
a
(Demmig
-
Adams
et al. 1996b). Registre-
se
que a aclimatação a diferentes ambientes lumínicos pode grandemente depender da
disponibilidade de nutrientes
(Lambers
et al. 1998), particularmente o N (Evans &
Poorter 1997). Nesse sentido, a fertilização nitrogenada, via de regra, tem efeitos
positi
vos
sobre o crescimento e pode atenuar os efeitos deletérios de
condições
ambienta
is
sub
-
ótimas,
i.e.,
temperaturas marginais
(Hikosaka 1997; Lawlor
et al.
1987;
Ramalho
et al. 2003) e altas intensidades luminosas
(Carelli
et al. 2006; Evans &
Poorter 1997; Fahl et al.
1994; Ferrar & Osmond 1986; Osmond 1987).
O cafeeiro é uma espécie lenhosa sempre-verde que apresenta taxas de
assimilação líquida de CO
2
(A) relativamente baixas, não excedendo a 12 mol CO
2
m
-2
s
-1
(Andrade Neto 2005; DaMatta 2004). Nas condições de inverno de Viçosa,
sudeste do Brasil, tem-se observado taxas negligenciáveis de crescimento (Barros &
Maestri 1974; DaMatta et al. 1999; Silva et al. 2004) em paralelo a uma redução
marcante das taxas de fotossíntese
(Chaves
et al. 2008; Silva et al. 2004), fato atribuído
tanto a limitações estomáticas como não estomáticas. Portanto, a baixa utilização
fotoquímica da luz pode resultar em fotodanos principalmente no inverno, época em que
são comuns noites com baixas temperaturas seguidas de dias ensolarados. Ademais,
nessa época e, em condições de campo, as folhas do cafeeiro podem exibir menor
concentração de N, em função da grande remoção desse elemento pelos frutos (até 95%
do N total da planta; Cannell 1975), que são colhidos normalmente até junho, fato que
pode levar a uma deficiência nitrogenada na planta. Em última análise, a deficiência de
N poderia exacerbar a ocorrência 56 2 84.81 0.56250 81.93 -2 0.09765 0 6509765 0 0 -0.09765 3777 10811 Tm3901 Tm(a)Tj0.09765 0 0 -0.097086 Tm(a)Tj0.09765 0 0 -0.09765 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2840 118.09765 5137 10466 Tm(o)Tj0965 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -020965 33412 11d.09765 5335 10121 Tm(r)Tj0909765 0 0 -0.09765 3462 11846 Tm(r)T50.09765 0 0 -0.09765 4362 11846 Tm(c)Tj0865 33412 11846 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -060865 33412 110.09765 5734 10121 Tm(e)Tj0
a
25
típicas de inverno do sudeste do Brasil,
a
principal região produtora de café arábica do
mundo.
Os objetivos deste trabalho foram, portanto, avaliar o comportamento
fotossintético e fotoprotetor de plantas de café no inverno submetidas a diferentes níveis
de N e avaliar os efeitos da disponibilidade desse elemento sobre a aclimatação das
plantas a diferentes ambientes lumínicos.
(Cannell 1975; Ramalho
et al.
2000)
3.2 –
Mat
erial & Métodos
3.2
.1
–
Desenho experimental
Os
experimento
s foram
conduzido
s em Viçosa (20º45’S, 42°54’W, 650 m
de
altitude), Minas Gerais, em fatorial 2 x 2, sendo duas irradiâncias (pleno sol e à sombra
– 50%) e dois níveis de nitrogênio (0 e 23 mM), se
guindo
-se um delineamento
inteiramente casualizado. Mudas de café (C. arabica L. cv Catuaí Vermelho IAC 44),
com
3-4 pares de folhas,
foram
plantadas em vasos de 12 L, contendo mistura de 60%
de areia e 40% de solo. Após a análise da composição da mistura,
realizou
-
se
a
adubação e a correção do pH do substrato, de acordo com análise química e
recomendações técnicas para a cultura. A umidade do s
ubstrato
foi
mantida próxima à
capacidade de campo,
via
irrigações periódicas. Metade das plantas
foi
cultivada a
pleno
sol, e a outra metade
,
sob telado (sombrite
®
), com 50% da radiação solar. Nos primeiros
45 dias após o transplante, as plantas
foram
fertiirrigadas
quinzenalmente
com solução
nutritiva completa de Hoagland (Epstein 1972). Após esse período, 250 mL de solução
nutritiva de Hoagland, modificada ou não, foram aplicados semanalmente, de modo a
obterem
-se dois níveis de N: 0 e 23 mM,
conforme
a T
abela
1. As avaliações e
amostragens
foram
realizadas entre junho e julho de 2007, u
tilizando
-se das folhas mais
novas, totalmente expandidas, do terceiro ou quarto par, a partir do ápice, de ramos
plagiotrópicos.
3.2.2 –
Parâmetros agrometeorológicos
O déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera ( e) foi
calculad
o conforme Landsberg (1986). Para isso, foram tomadas, ao longo do período
de avaliação das trocas gasosas, as temperaturas do ar (bulbo seco e bulbo úmido) e da
folha, utilizando-se, respectivamente, de um psicrômetro e de um termopar associado à
pinça de um fluorômetro modulado (FMS2, Hansatech, Norfolk, Reino Unido).
26
A radiação fotossinteticamente ativa (RFA) foi medida com um sensor também
acoplado à pinça do fluorômetro. Alternativamente, RFA foi também medida com um
fotômetro/radiômetro (Li
-
185, LI
-
Co
r, Lincoln, Nebraska, EUA).
(Landsberg 1986)
Tabela
1
.
Composição de macro e micronutrientes da solução nutritiva de Hoagland
(Epstein
1972)
, com modificações, de modo a fornecer
dois
níveis de N. A composição dos demais
micronutrientes
foi
mantida c
onforme Epstein (1972)
.
Sal
0 mM (
–
N)
23 mM (+N)
KCl
4 mM
---
KH
2
PO
4
2 mM
---
CaCl
2
4 mM
---
MgSO
4
1 mM
1 mM
KNO
3
---
6 mM
NH
4
H
2
PO
4
---
2 mM
Ca(NO
3
)
2
4H
2
O
---
4 mM
NH
4
NO
3
---
1 mM
NaNO
3
---
6 mM
Fe-
EDTA
0,1 mM
0,1 mM
3.2.3 –
Área foliar específ
ica (AFE)
Dez discos de 1,4 cm
2
foram coletados de cada planta, secos em estufa a 70ºC,
por 72 h, quando sua massa foi determinada. Para cálculo da AFE utilizou-se da
seguinte fórmula:
)
kg
(a
sec
massa
)m(
cos
disdos
foliar
área
)
kg
m(
AFE
2
12
3.2.4 –
Trocas gasosas e parâmetros de fluoresc
ência
A taxa de assimilação líquida do carbono (A), a condutância estomática (g
s
) e a
razão entre as concentrações interna e ambiente de CO
2
(
C
i
/C
a
) foram medidas às 12:00
-
14:00 h, em sistema aberto, sob concentração de CO
2
ambiente, com um analisador de
gases a infravermelho portátil (LICOR 6400, Li-COR, Lincoln, Nebraska, EUA).
Os parâmetros de fluorescência da clorofila (CHL) a foram também determinados
naqueles horários, bem como na antemanhã, nas mesmas folhas utilizadas para as
medições das trocas gasosas, por meio do fluorômetro com pulso modulado, descrito
acima. Após serem adaptados ao escuro, por 30 min, tecidos foliares foram inicialmente
expostos a pulsos de luz vermelho-distante [1-2 mol (fótons) m
-
2
s
-1
] para a
determinação da fluorescência inicial (F
0
). Em seguida, pulsos de luz saturante, com
27
irradiância de 6000 mol (fótons) m
-
2
s
-
1
e duração de 1 s, foram aplicados para
determinar
-se a fluorescência máxima emitida (F
m
). Nas amostras adaptadas ao escuro,
a eficiência máxima do FSII foi estimada pela razão entre as fluorescências variável e
máxima,
F
v
/F
m
= (F
m
-F
0
)/
F
m
. Para a obtenção da fluorescência
em
steady
-
state
(F
s
),
utilizou
-se uma irradiância actínica artificial de 500 e 1000
mol
(fótons) m
-2
s
-1
,
respectivamente para plantas cultivadas à sombra ou a pleno sol. Essa irr
adiância,
aplicada por 300 s, foi equivalente à irradiância média interceptada pelas folhas à
sombra e ao sol. Subseqüentemente, pulsos de luz saturante [6000
mol (fótons) m
-2
s
-1
;
1 s] foram aplicados para medir-se a fluorescência máxima das amostras sob luz (F
m
’).
Com esses parâmetros, estimou-se a fração da energia absorvida utilizada na fase
fotoquímica da fotossíntese (P), a fração da energia dissipada termicamente (D) e a
fração de energia absorvida não utilizada na fotoquímica nem dissipada termicamente
(P
E
)
(Demmig
-
Adams
et al.
1996b)
.
3.2.5 –
Ensaios bioquímicos
Para a determinação da atividade da sintetase da glutamina (GS) e de
carboidratos e aminoácidos, amostras foliares foram coletadas entre 7:00-9:00 h. Para a
determinação de enzimas do metabolismo antioxidativo, e danos celulares, amostras
foliares foram também coletadas entre 12:00-14:00 h. Para determinação da
concentração de pigmentos, amostras foliares foram coletadas na antemanhã e entre
12:00
-14:00 h. Todo o material vegetal foi imediatamente congelado em nitrogênio
líquido e, em seguida, armazenado a
-
80ºC, até o uso.
3.2.
5.1
–
Clorofilas e carotenóides
Dois discos foliares foram homogeneizados em acetona 90%, a 4
ºC.
O homogenato foi transferido para um microtubo, e expurgado com N
2
gasoso durante
2 min. Após 30 min de repouso, os microtubos foram centrifugados a 15000 g, 10 min,
4ºC. O sobre.09765 0 (g)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7000 10366.09765 0 0 -0.09765 3158 68166 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 96766 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3158 68320 Tm(.09765 0 (g)Tj0.09765 0 0 -0.09420 Tm(.09765t09765 0 0 -0.09765 3476 6471 TTm(e)Tj0.09760.09765 0 0 -0.09765 3807 10611 Tm(C)Tj0.09765 0 0 -0.09765 3735 49917 Tm(b)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2786 13836 Tm(.09765t09765 0 0 -0.09765 3476 64811 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 49948 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 94048 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 4349 10220 Tm(.09765f09765 0 0 -0.09765 4289 96761 Tm(o)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2686 14361 Tm(o)Tj0i)Tj0.09765 0 0 -0.09765 4519 96764 Tm(.09765f09765 0 0 -0.09765 4289 96036 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 44636 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4331 75611 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 4744 78518 Tm(r)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2853 14864 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4900 78513 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 95013 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 5472 71121 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4900 75264 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 4744 75320 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 5306 75087 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4900 7571 TTm(e)Tj0.09765 0 0 -0.09765 5253 64521 Tm(.09765é09765 0 0 -0.09765 5661 71614 Tm(s)Tj0.09760.09765 0 0 -0.09765 5472 71036 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 95913TTm(e)Tj0.09760.09765 0 0 -0.09765 3807 13664 Tm(s)Tj0.09765 0 0 -0.09765 6123 49921 Tm(.09765 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 6278 10366 Tm(.09765f09765 0 0 -0.09765 4289 96467 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 4691 TTm(.09765.09765 0 0 -0.09765 4331 76566 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 4744 76635 Tm(.09765.09765 0 0 -0.09765 5306 76702 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 5472 76711 Tm(4)Tj0.09765 0 0 -0.09765 6980 81963 Tm(o)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2686 17014 Tm(s)Tj0 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 7478 10290 Tm00 10366.09765 0 0 -0.09765 3214 97396 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 3957 4791 TTm(O)Tj(â09765 0 0 -0.09765 7533 75066 Tm(s)Tj0 )Tj5 0 0 -0.09765 7673 10396 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 7763 78566 Tm(O)Tj(.09765 0 0 -0.09765 4744 7816 TTm(.09765.09765 0 0 -0.09765 5306 77902 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 5472 78664 Tm(s)Tj0d09765 0 0 -0.09765 8173 96764TTm(e)Tj0.09760.09765 0 0 -0.09765 3807 1036 TTm(.09765p09765 0 0 -0.09765 8439 10365 Tm(o)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2686 1711 TTm(.09765.09765 0 0 -0.09765 5306 78602 Tm00 10366 )Tj0.09765 0 0 -0.09765 5472 78366 Tm(s)Tj0d09765 0 0 -0.09765 8173 96873TTm(e)Tj0.09760.097648 Tf0.09765 0 0 -0.09765 1874 10711 TTm()Tj/F1 2048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 6014 70711 TTm()Tj/,45.0976ETq10.097 Tf311 TTm()cm92.21 -96 m92.21 -32 l92.21 -24 93.12 -6 Tm3.81 -66 c94.43 -63 95.31 -6 Tm.43 -61 c97.62 -60 98.87 -1 Tm(En-60 c101.81 -6 Tm.17 -66 Tm4.21 -6 Tc106.12 -63TTm.12 -67 Tm.21 -2 Tc111.21 -2 Tl110.68 -6 T108.56 -6 Tm5.17 -3Tc102.66 0.3161 TTz(En2Tm3.31 Tc88.56 2103.81 0.5661 T81.93 - Tc79( 1- 785.17 -66 76.21 -67Tc70.12 -60 63.87 -4 57.93 -1 c66 T.1 T46.87 3967.1 T3Tc39.62 3106.21 7.1 T33.93 1.17 c31(En0.66366 28.43 -6107.21 -3 c07.62 5.87 26.17 14( 12En21( 1c09(En26( 129.21 79.56 29.21 315 1c0921 35( 12E.87 37.87 27 39.93 c07.1 Tm Tf3.12 43 2021 43Tc18.17 66 T.43 67.6 T14.87 40.66Tc12.81 37.86 T1.21 34.21 T1.21 31Tc11.21 79.1 T12.(En2687 T3 24.6 Tc14.87 1 T16( 112.6 T165 18( 1c15.17 0.66366 1.21 -6 1.21 -61 c1.21 -96 l33.21 -96 l33.21 -33 l33.21 -27 34.31 -2 T3543 -69 c365 1-66 38.62 -64 4T.1 T-6 Tc44.43 -9785.17 -8950.66T-9 c53.68 -8 57.21 -9 6243 -6 Tc67(En-6 Tm.93 -17 76.21 -21 c76.21 -96 l92.21 -96 lhfQBT048 Tf0.09765 0 0 -0.09765 2583 96561 TTm()Tjf0.09L0.09765 0 0 -0.09765 2187 10623 TTm()Tj/ )Tj0.09765 0 0 -0.09765 2292 10803 TTm()Tj/O09765 0 0 -0.09765 2942 10717 TTm()Tj/ )Tj0.09765 0 0 -0.09765 3114 96751 TTm()Tj/.09765 0 0 -0.09765 3394 78251 TTm()Tj/.09765 0 0 -0.09765 3368 68166 TTm()Tj/g09765 0 0 -0.09765 3419 10026 TTm()Tj/.09765 0 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28
440 nm, e as áreas dos cromatogramas dos respectivos padrões (VKI, Horsholm,
Dinamarca), obtidos naquele comprimento de onda, de acordo com método descrito em
Ramalho
et al. (1997). O estado de epoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas
(DEPS), envolvendo os componentes do ciclo das xantofilas, violaxantina (V),
anteraxantina (A) e zeaxantina (Z), foi calculado con
30
(Biosystems LTDA, São José dos Pinhais, PR, Brasil). Detalhes adicionais estão
descritos em Lima
et al.
(2002).
(Lima
et al.
2002)
3.2.7 –
Procedimentos estatísticos
À exceção dos parâmetros fotossintéticos e de fluorescência, que
foram
tomados em blocos, as demais variáveis
foram
submetidas à análise de variância
segundo delineamento inteiramente casualizado. Quando necessário, os dados foram
transformados para seguir uma distribuição normal, usando-se para isso o teste de
Kolmogorov-
Smirnov.
As análises de correlações foram feitas utilizando-se do
programa estatístico Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, EUA) e as
diferenças entre as médias dos tratamentos
foram
analisadas
pelo teste t, mediante o
p
rograma
e
statístico
Sigmaplot 9.0 com Sigmastat integration (Systat Software, Inc.,
San Jose, CA, EUA).
3.3 –
Resultados e Discussão
3
.3.1
–
Ambiente, c
aracterísticas foliares e metabolismo do nitrogênio
Nos meses de avaliação, a temperatura mínima médi
a foi de 8,7ºC, e a máxima,
de 25,5ºC. Entretanto, foi comum o registro de temperaturas abaixo de 6ºC e superiores
a 28ºC (Figura 1). Grande parte das coletas foi realizada no mês de julho, quando se
registraram as temperaturas anuais mais baixas (a média anual das temperaturas
mínimas e máximas foram, respectivamente, 15,8ºC e 26,6ºC). Salienta-se que, em
Viçosa (MG), durante o inverno, há predominância de baixas temperaturas,
especialmente noturnas, com baixa nebulosidade e baixa umidade relativa do ar ao
longo do dia. Em todo o caso, as plantas dos diferentes ambientes lumínicos estiveram
expostas a déficits de pressão de vapor similares, em torno de 3,0 kPa, ao meio-
dia
(Figura 2).
O teor
foliar
de
nitrogênio total foi, em média, 58% maior nas plantas +N em
relação às plantas –N, que exibiram teores deficientes de N,
i.e.
, inferior a 27 g kg
-1
MS
(Moraes 1981), independentemente do ambiente lumínico, ao contrário das plantas +N,
em que o teor foliar foi superior a 30 g kg
-1
MS (Tabela 2), independentemente da
irradiância.
O aumento da disponibilidade de N foi acompanhado por aumento do teor de
aminoácidos solúveis totais (30%) e de proteínas solúveis totais (146%), bem como na
atividade da GS (~115%) (Tabela 2). Resultados semelhantes foram observados em
31
plantas de Manihot esculenta cultivadas com 3 e 12 mM de N
(Cruz
et al. 2004).
Mesmo sem efeito aparente do sombreamento sobre a concentração de aminoácidos totais
(Tabela 2), a atividade da GS foi significativamente maior (30%) nas plantas cultivadas a
pleno sol em comparação àquelas sob sombra (Tabela 2) para um dado nível de N. Essas
diferenças sugerem que o aumento relativo da atividade da enzima nas plantas a pleno sol
possa estar mais diretamente associado à fotorrespiração que com a síntese de nov
os
aminoácidos
(Guo
et al. 2007; Linka & Weber 2005; Oliveira et al. 2002).
A fotorrespiração também poderia explicar a maior atividade da GS nas plantas +N, uma
vez que se sabe que a atividade da enzima é diminuída sob deficiência do mineral
(Cruz
et
al.
2003)
.
Temperatura (ºC)
A
0,0
8,0
16,0
24,0
32,0
1 3 5 7 9
11
13 15
17
19
21 23
25
27 29
0,0
8,0
16,0
24,0
32,0
1 3 5 7 9
11
13 15
17 19
21
23 25
27 29
31
B
Temperatura (ºC)
Figura
1
:
Temperaturas máximas ( ) e mínimas ( ) diárias registradas em junho (A) e
julho (B) de 2007. As linhas horizontais representam a média mensal daquelas temperaturas e as
regiões grifadas de cinza, as datas de coleta.
Fonte:
Estação Climatológica, UFV.
Aa
e (kPa)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
+ N
N
Aa
Aa
Aa
Figura
2: Déficit de pressão de vapor entre o interior da folha e a atmosfera ( e) em plantas de
Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância (colunas
cheias)
em 0 ou 23 mM de N. Cada coluna representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas
diferentes denotam significância estatística (
teste
t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para
um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas denotam significância entre os níveis
de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
32
A AFE foi, em média, 7% maior nas plantas desenvolvidas à sombra em relação
àquelas desenvolvidas a pleno sol (Tabela 2). Em contrapartida, as plantas +N mostraram
menor AFE (em média 8%) quando comparadas às plantas –N. A influência da
irradiância sobre a AFE tem sido largamente documentada em diferentes espécies
vegetais
(Fahn 1990; Salisbury 1927; V
alladares
et al. 2000), em que folhas de sombra,
por receberem menor intensidade de fluxo de fótons, traduzem esse efeito pelo aumento
da área foliar por unidade de massa. Por outro lado, parece não haver relação entre a
nutrição mineral e a AFE, num padr
ão que se acredita ser mais influenciado pela alocação
diferencial dos nutrientes, em especial o nitrogênio, entre as plantas dos distintos
ambientes lumínicos do que da nutrição per se (Evans & Poorter 1997; Fahl et al. 1994;
Valladares
et al. 2000)
.
Neste estudo, entretanto, o
incremento
da disponibilidade de N
promoveu redução na AFE em extensão maior que o efeito
da luz (Tabela 2).
Tabela
2: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre as
características foliares, frações nitrogenadas, aminoácidos livres totais, atividade da sintetase da
glutamina
(avaliadas pela produção de -glutamil hidroxamato;
GT)
e proteínas solúveis totais
em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias ± EP
(n =
6
-
10).
Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (
teste
t
, p
= 0,05) entre
os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúscula s
33
por outros autores sob condições semelhantes de cultivo às deste estudo
(DaMatta
et al.
1997; Silva et al. 2004). Dentre os mecanismos que explicariam os baixos valores de A
,
em café, a baixa condutância difusiva,
i.e.
estomática e mesofílica,
parece
ser
preponderante
nessa resposta
(Araújo 2006; Silva
et al.
2004)
. De qualquer modo, o frio
afeta negativamente as taxas fotossintéticas, tanto no cafeeiro
(DaMatta
et al. 1997;
Ramalho
et al. 2003; Silva et al. 2004)
como
em outras espécies
lenhosas
(Corcuera
et
al.
2005), devido, em parte, ao comprometimento da capacidade de fixação do CO
2
provocada pelas baixas temperaturas. Todavia, é provável que limitações difusivas
tenham papel de destaque na magnitude de A, fato evidenciado pelos baixos valores de
g
s
e de C
i
: C
a
. Com efeito, tem-se sugerido, para o cafeeiro, que as baixas temperaturas
noturnas podem afetar em larga extensão g
s
, independentemente de as temperaturas
diurnas serem adequadas às trocas gasosas
(Bauer
et al. 1985). Acredita-se, também,
que, em café, o frio possa diminuir a condutância mesofílica, reduzindo a
disponibilidade de CO
2
nos sítios de carboxilação da rubisco e, pois,
afetando
negativamente
A
(Bauer
et al. 1985; Silva et al. 200
4)
. Cumpre ressaltar que, apesar da
estimativa de C
i
ser sujeita a uma série de erros potenciais, especialmente quando g
s
é
baixa, parece razoável admitir-se que, devido à natureza homobárica das folhas do café,
não se tenha sobrestimado a razão C
i
: C
a
(DaMatta 2003). Por outro lado, salienta-
se
que a capacidade fotossintética potencial, que pode ser deduzida da radioatividade total
incorporada (ensaio sob condições saturantes de luz e CO
2
e, portanto, sem efeitos de
limitações difusivas) foi inferior nas plantas –N em relação às plantas +N,
independentemente se cultivado à sombra ou a pleno sol (Tabela 4). Isso demonstra que
os efeitos positivos da nutrição nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido
aparentemente atenuados ou mesmo anulados pelas resistências difusivas impostas
presumivelmente pelas baixas temperaturas noturnas, especialmente nas plantas a pleno
sol (
cf.
Tabelas 3 e 4).
Os tratamentos aplicados não afetaram consistentemente as concentrações de
glicose e de frutose (Figura 3). Em contraste, os teores de sacarose e de amido foram
menores nas plantas –N que nas +N, independentemente da irradiância. Considerando-
se que as plantas –N acumularam menos biomassa (dados não mostrados), os seus
menores teores de sacarose e de amido podem ser um reflexo de uma menor taxa de
fotossíntese, integrada ao longo do tempo nas pla
ntas
–
N.
34
Tabela
3: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a assimilação
líquida de carbono (A), a condutância estomática (g
s
) e a razão entre a concentração interna e
externa de CO
2
(C
i
: C
a
) em plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de
irradiância. Cada valor representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes denotam
significância estatística (
teste
t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um mesmo nível de
nitrogênio, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância entre os níveis de
nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol
Plantas
à
sombra
Características
–N
+N
–N
+N
A
(
mol CO
2
m
-2
s
-1
)
1,5 ± 0,1
Ba
1,6 ± 0,1
Aa
2,1 ± 0,2
Aa
2,1 ± 0,3
Aa
g
s
(mmol m
-2
s
-1
) 19,0 ± 0,7 Aa 12,2 ±
0,1 Ab
13,1 ±
0,7 Ba
10,8 ±
1,0 Ab
Ci
:
C
a
0,55 ±
0,04 Aa
0,46 ±
0,05 Aa
0,46 ±
0,04 Aa
0,41 ±
0,04 Aa
Tabela
4: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a partição do
14
C fotossintético em folhas de plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de
irradiância.
Valores de radioatividade incorporada nas diferentes frações (aniônica = ácidos
orgânicos; catiônica = aminoácidos; neutra = açúcares solúveis totais; e insolúvel = amido e
componentes de parede celular) são expressos em kBq m
-2
. Valores representam a média ± EP
(n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (
teste
t, p = 0,05) entre os
níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Frações
–N
+N
–N
+N
Aniônica
60 ± 1,0 Ab
87 ± 1,0 Aa
58 ± 2,5 Ab
77 ± 1,4 Ba
Catiôn
ica
79 ± 1,4 Ab
162 ± 4,8 Aa
69 ± 2,8 Ab
146 ± 3,4 Ba
Neutra
1202 ± 21,3 Ab
1833 ± 24,5 Aa
1111 ± 23,7 Bb
1724 ± 22,7 Ba
Insolúvel
139 ± 1,4 Aa
86 ± 1,0 Ab
98 ± 4,3 Ba
89 ± 1,6 Ab
Total
1480 ± 21,2 Ab
2168 ± 25,4 Aa
1337 ± 23,6 Bb
2036 ± 21,6 Ba
Os dados de fluxo metabólico (Tabela 4)
,
obtidos
sob condições ótimas de luz,
CO
2
e temperatura,
indica
m
que as plantas cultivadas a pleno sol exibiram maior
capacidade fotossintética (maior radioatividade total incorporada; 6-
10%)
quando
c
ompara
das
às plantas de sombra, a despeito de
A
ter sido ligeiramente, porém
significativamente, menor nas plantas ao sol.
Verificou
-se, ainda, que a capacidade
fotossintética potencial das plantas –N foi, em média, 33% menor que a das plantas +N
em fixar o
14
CO
2
. Todavia, a partição de
14
C para a síntese de amido foi maior nas
plantas
–
N
(Tabela
4
).
Nessas plantas, pode ter ocorrido um desbalanço entre C e N, de
forma que grande parte do carbono fotossintético foi acumulada transientemente nas
folhas, sob a forma de amido primário, em vez de seguir para síntese de aminoácidos e
ácidos orgânicos, como deve ter ocorrido nas plantas suplementadas com N.
Essa
hipótese pode ser confirmada pelo efeito inverso na síntese de açúcares solúveis
,
que foi
maior nas plantas suplementadas. Além disso, o NO
3
-
,
per se, pode diretamente afetar a
35
síntese de amido, por
reprimir
a atividade da pirofosforilase
da
ADP
-glicose, mas não
da sintase da sacarose-fosfato, sugerindo que a síntese de amido poderia ser estimulada
sob baixos níveis
de
N
(Stitt et al.
1989)
.
glicose mmol kg MF
-1
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Bb
Aa
Aa
Aa
Ab
Ab
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
Aa
Ba
Ab
Aa
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
0,00
40,00
80,00
120,00
160,00
Bb
Ab
Aa
Aa
Aa
Aa
+ N
N
+ N
N
frutose mmol kg MF
-1
amido mmol kg MF
-1
sacarose mmol kg MF
-1
Figura
3: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a concentração
de
açúcares solúveis e amido
em plantas de
Coffea arabica
L. As plantas foram cultivadas a pleno
sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância (colunas cheias). Cada coluna representa a
média
± EP (n = 6)
.
Letras maiúsculas diferentes de
notam significância estatística
(
teste
t
, p
= 0,05) entre
os níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
3
.3.
3 –
Fluorescência, fotoproteção e metabolismo an
tioxidativo
A razão F
v
/F
m
das plantas –
N
cultivadas a pleno sol foi menor que 0,75
(Figura 4), valor inferior ao mínimo encontrado
nas
plantas
cultivadas
à sombra, porém
semelhante ao valor apresentado por
DaMatta
et al. (1997)
para
cafeeiros avaliados no
inverno.
Nas plantas –N, cultivadas a pleno sol, independentemente do horário de
avaliação, houve queda discreta (10%), porém significativa na razão F
v
/F
m
, fato não
observado entre as plantas +N e –N cultivadas à sombra (Figura 4). Possivelmente,
devido aos efeitos combinados das baixas temperaturas noturnas e altas irradiâncias
diurnas, valores de
F
v
/F
m
inferiores a 0,65 foram observados nas plantas
–
N cultivadas a
pleno sol (Figura 4). Os menores valores de F
v
/F
m
reportados no inverno podem estar
relacion
ados à presença de um aceptor de elétrons parcialmente reduzido, possivelmente
devido à baixa mobilidade da plastoquinona sobre a membrana tilacoidial,
36
especialmente após noites frias seguidas de dias com altas irradiâncias (Havaux 1987;
Larcher & Neuner 1989),
como acontece em Viçosa
,
no inverno.
Ressalte
-
se
, ainda,
que
essa
redução pode ter
sido
uma
co
nseqüência,
e não
uma
causa, da perda de capacidade
de assimilação do carbono, na medida em que menores taxas de
fotossíntese
requereriam menos ATP e menos NADPH
(Silva
et al. 2004). Ressalte-se, também, que
decréscimos sustentados na razão F
v
/F
m,
no inverno, têm sido associados com a
retenção noturna de grandes quantidades de zeaxantina e anteraxantina, fato atribuído
aos efeitos inibitórios do frio sobre a enzima dese
poxidase da violaxantina, que converte
a zeaxantina e anteraxantina a violaxantina, com a diminuição da irradiância
(Demmig
-
Adams & Adams III 1992; Demmig-
Adams
et al. 1996a). Neste estudo, o
acúmulo
noturno de anteraxantina e zeaxantina (Tabelas 4 e 5) são evidências circunstanciais
de
que o frio tenha afetado aquela enzima, fato suportado pela correlação negativa entre o
acúmulo de A+Z e a queda de F
v
/F
m
(r = -0,832 p
0,001; Figura 6a). Out
ras
evidências de que o frio, por inibir a desepoxidase da violaxantina, provoca diminuições
significativas na razão F
v
/F
m
também foram reportadas em outras espécies
(Logan
et al.
1998a; Verhoeven et al. 1997). Com efeito, a queda da razão F
v
/F
m
, associada com
elevação de F
0
, nas plantas cultivadas a pleno sol, porém mais marcantemente nas
plantas
–
N,
pode
ainda
se
r atribuído
à
fotoinativação do FSII,
possivelmente associad
a
à
degradação da
proteína D1
(Martínez
-
Ferri
et al.
2004; Ramalho
et al.
2003)
, ou então a
um desacoplamento parcial e temporário entre as antenas e os centros de reação dos
fotossistemas
(DaMatta & Maestri 1997). A persistência da fotoinativação do FSII nas
plantas
–N, cultivadas a pleno sol, pode ser confirmada pela ausência de recupera
ção
do
F
v
/F
m
na
antemanhã
. Em contraste, os
maiores
valores de F
v
/F
m
das
plantas
+N,
especialmente naquelas cultivadas à sombra, mostram que e
stas
foram
menos
afetadas
pela imposição dos estresses, na medida em que exibiram recuperação da eficiência do
FSII (Figura 4), com maiores valores de P e menores de D e P
E
(Figura 5).
(DaMatta
et
al.
1997)As membranas tilacoidais das plantas aclimatadas às baixas irradiâncias
possuem uma grande concentração de pigmentos-antena associados aos centros de
reação dos fotossistemas e uma menor quantidade de componentes de transporte de
elétrons
(Anderson 1986).
A
elevação na concentração de carotenóides e/ou uma
redução da concentração de clorofilas pode auxiliar as plantas a minimizar a
fotooxidação
(Corcuera
et al. 2005). Dessa
forma
, uma menor concentração de
clorof
ilas nas plantas cultivadas a pleno sol, sem alterações significativas nos níveis de
N nas folhas, fez reduzir a razão CHL/N nessas plantas, indicando que o decréscimo na
concentração de clorofilas não foi diretamente associado à disponibilidade de N. Ness
e
37
contexto, a menor concentração de CHL pode ser considerada como um mecanismo de
ajuste entre a absorção e a utilização fotoquímica da luz. Portanto nas plantas cultivadas
a pleno sol, bem como naquelas deficientes em N, uma menor concentração de
clorofil
as, e menor razão CHL/N, seria vantajoso, uma vez que diminuiria a absorção de
fótons,
contribu
indo, assim, na atenuação dos efeitos deletérios das altas irradiâncias
(Martínez
-
Ferri
et al. 2004). Ademais, como A e Z também são capazes de dissipar o
excesso de luz absorvida, atenuando a formação de
1
O
2
, o aumento do
pool
de
xantofilas, tanto em base de massa ou de CHL, e a conversão de V em A e Z (Tabelas 6
e 7) nas folhas das plantas –N, independentemente da irradiância, podem indicar maior
capacidade fotoprotetora
(Logan
et al. 1998a). Entretanto, a menor absorção de luz e a
fotoproteção associada ao ciclo das xantofilas não foram suficientes para evitar danos à
maquinaria fotossintética, visto que foram registrados, nas plantas cultivadas a pleno
sol, menores valores de F
v
/F
m
e maiores valores de F
0
(Figura 4), além de maiores
concentrações de H
2
O
2
, MDA e maiores taxas de extravasamento de eletrólitos (Tabela
8
; ver à frente).
50
90
130
170
210
50
90
130
170
210
F
0
B
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
F F
v m
/
C
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
F F
v m
/
12:00 h
05:00 h
D
Aa*
Bb*
Ba*
Ab*
F
0
A
12:00 h
05:00 h
Aa
Bb
Aa
Aa
Ab
Aa
Ab
Aa*
Aa*
Ba*
Ba*
Aa
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Figura 4
:
Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (
0
mM; colunas pretas) e
23
mM; colunas cinzas) sobre a fluorescência basal (F
0
) e
a
eficiência fotoquímica máxima
do FSI
I (
F
v
/F
m
) em plantas de
Coffea arabica
L. As plantas foram cultivadas a pleno sol (
A, C
)
ou sob 50% de sombreamento (B, D). Cada coluna representa a média ± EP (n = 10).
Letr
as
maiúsculas diferentes denotam significância estatística entre os horários, para um mesmo nível
de nitrogênio e irradiância, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância
estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (
teste
t,
p
= 0,05
) e asteríscos (*) denotam significância entre os níveis de irradiância (
teste
t
,
p
=
0,001).
38
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Ab
A
Bb
Aa
Ba
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Ba
Aa
Bb
Ab
0,00
0,05
0,10
0,15
Ba
Aa
Ba
Aa
B
C
+ N
N
+ N
N
P
D
P
E
Figura
5: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a fração da
energ
ia utilizada na fase fotoquímica da fotossíntese (A), da energia dissipada na forma de calor
(B) e na energia não utilizada na fase fotoquímica e nem dissipada como calor
(C)
, avaliadas em
plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol (colunas vazias) ou sob 50% de irradiância
(colunas cheias). Cada coluna representa a média ± EP (n = 10). Letras maiúsculas diferentes
denotam significância estatística (teste t, p = 0,05) entre os níveis de irradiância, para um
mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância entre os
níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Embora uma das principais respostas freqüentemente observadas em plantas
desenvolvidas à sombra seja o decréscimo da razão CHL
a/b
, neste trabalho (Tabela 5
),
a exemplo de outros relatos em café
(Chaves
et al. 2008; Dias 2006; Fahl et al. 1994),
tal razão parece responder pouco ou nada
às
variações na irradiância. Ademais, houve
peque
na ou nenhuma alteração na razão clorofilas/carotenóides entre plantas ao sol e
sob sombra, quando o padrão esperado de resposta seria um decréscimo relativo nessa
razão nas plantas à plena exposição solar, de modo a permitir-lhes uma maior
capacidade de dissipação da energia de excitação, principalmente via operação do ciclo
das xantofilas
(Demmig
-Adams & Adams III 1996; Ma et al. 2003). Por outro lado,
v
erificou
-
se,
uma
queda, da antemanhã para o meio-
dia,
da concentração
de
CHL
, com
a elevação d
a irradiância,
fato também relatado em outros estudos
(Corcuera
et al.
2005;
Martín
ez
-
Ferri
et al. 2004), o que poderia auxiliar na redução da absortância foliar nas
horas de maior elevação solar.
39
Tanto em base de CHL como em base de massa, independentemente
dos
tratamentos e dos horários de avaliação, a luteína foi o principal carotenóide acumulado
nas plantas (em média 41,3% na antemanhã e 38% ao meio-dia) (Figura 7). O teor dos
demais carotenóides variou, de forma que a violaxantina foi o segundo principal
carotenóide na antemanhã (20%) e o de menor acúmulo ao meio-dia (3,9%). Com a
elevação da irradiância, a zeaxantina tomou lugar de destaque, passando da quinta para
a segunda colocação (6,4% e 24% na antemanhã e meio-dia, respectivamente).
A posição dos demais carotenóides variou pouco, mas dentre estes pode-se destacar o
-caroteno, com acúmulo relativo de 5,7 e 9,9% na antemanhã e ao meio-
dia,
respectivamente.
Em base de CHL, a concentração de anteraxantina, luteína, zeaxantina
e
-caroteno foi maior nas plantas –N em comparação às +N, especialmente nas plantas
expostas a pleno sol, as quais apresentaram menor razão / -caroteno devido à queda
mais acentuada nos níveis de -
caroteno
que
nos de -
caroteno
(Tabela 6).
Tais resultados confirmam o papel da luteína, zeaxantina e do -caroteno como os
principais carotenóides envolvidos na dissipação térmica da energia radiante e estão em
consonância com os dados apresentados para o gênero
Coffea
(Ramalho
et al. 200
3)
ou
mesmo
para
outr
as espécies lenhosas
(Corcuera
et al. 2005; Demmig-
Adams
et al.
1996b; Valladares et al. 2000).
Ressalte
-se, também, que as correlações da razão F
v
/F
m
com as concentrações d
e zeaxantina (r =
-
0,674) e de zeaxantina mais anteraxantina (r =
-0,832) na antemanhã (Figura 6a) sugerem que o acúmulo noturno desses carotenóides
deve ter papel de destaque na queda da razão F
v
/F
m.
Resultados
semelhantes foram
também reportados em
Vitis
labrusca
(Chen & Chen 2003), em
Mahonia repens
(Logan
et al. 1998b) e em outras espécies herbáceas
(Logan
et al. 1998a). Apesar de o frio ter
causado danos aos fotossistemas, fato evidenciado pelas variações em F
v
/F
m
e F
0
(Figura 4), os maiores conteúdos absolutos de carotenóides em base de massa, incluindo
aqueles do ciclo das xantofilas, especialmente nas plantas +N cultivadas à sombra
(Tabela 5 e 7), traduziu-
se
-lhes, possivelmente, em maior capacidade de dissipar a
radiação excessiva. Como conseqüência, a formação de H
2
O
2
, MDA e extravasamento
de eletrólitos (Tabela 8) foram reduzidos.
Saliente
-se, também, que houve uma
correlação positiva entre a concentração de N e a razão F
v
/F
m
(Figura 6b), o que sugere
que a manutenção de elevada eficiência fotoquímica do FSII pode ser altamente
dependente da disponibilidade de N.
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Fv/Fm
A
+
Z
(
c
h
l
)
A
0,85
0,90
B
N
Fv/Fm
0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85
0,90
15
18
21
24
27
30
33
36
Figura
6: Correlações de Pearson entre a concentração (em base de clorofila) de anteraxanti
na
+ zeaxantina (A + Z) e a razão entre as fluorescências variável e máxima (F
v
/F
m
) (r = -0,832, p
= 0,001
)
(A) e entre a concentração foliar de N e a razão
F
v
/F
m
(r =
0,596, p
= 0,001
)
(B),
em
plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol e sob 50% de irradiância. Os dados foram
obtidos na antemanhã.
Tabela
5
:
Efeito
do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre o c
onteúdo
foliar
de clorofilas e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50%
de irradiância. Valores representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam
significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância,
enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância estatística entre os níveis de
nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (
teste
t,
p
= 0,05); asteríscos (*) denotam
significância entre os níveis de irradiância (
teste
t,
p
=
0,001).
Plantas a pleno
s
ol
Plantas à sombra
Características
05:00 h
12:00 h
05:00 h
12:00 h
-N
+N
-N
+N
-N
+N
-N
+N
CHL (
a
+
b)
(g kg
-1
MF)
1,6
5
Ab
3,37
Aa
1,03
Bb
2,56
Ba
1,79
Ab*
4,02
Aa*
1,62
Ab*
3,82
Aa*
CHL (
a
/
b)
(g kg
-1
MF)
2,61
Aa
2,67
Aa
2,83
Aa
2,55
Aa
2,61
Aa
2,61
Aa
2,88
Aa
2,63
Aa
CHL / Carot.
(g kg
-1
MF)
2,60
Aa
2,96
Aa
2,23
Aa
2,95
Aa
2,88
Aa
3,08
Aa
2,97
Aa
3,21
Aa
CHL
/ N
(mg kg
-1
)
80,48
Aa
125,35
Aa
50,42
Bb
75,90
Aa
99,15
Ab*
133,26
Aa*
81,12
Ab*
99,15
Aa*
Carot. / N
(mg kg
-1
)
18,90
Aa
25,23
Aa
13,36
Ba
16,70
Aa
25,02
Aa*
28,70
Aa*
21,02
Aa*
20,89
Aa*
Carotenóides totais
(g kg
-1
MF)
0,42
Ab
0,71
Aa
0,29
Bb
0,53
Ba
0,52
Ab
0,87
Aa
0,35
Bb
0,79
Aa
41
Tabela 6: Conteúdo foliar de xantofilas e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a
pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 e 23 mM de N. Os valores são expressos em g kg
-1
de
clorofila e representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam
significância estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância,
enquanto letras minúsculas diferentes denotam significância estatística entre os níveis de
nitrogênio, dentro de um mesmo horário e irradiância (teste t, p = 0,05); asteríscos (*) denotam
significância entre os níveis de irradiância (teste
t
, p
=
0,001).
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Características
05:00 h
12:00 h
05:00 h
12:00 h
-N
+N
-N
+N
-N
+N
-N
+N
Neoxantina
32,8 Aa
34,8 Aa
28,4 Aa
34,5 Aa
56,1 Aa*
37,3 Ab*
32,4 Ba*
34,6 Aa*
Violaxantina
52,8 Aa
40,5 Ab
5,4 Ba
7,3 Ba
72,5 Aa
43,2 Ab
5,0 Bb
16,7 Ba
Anteraxantina
30,6 Aa
20,4 Aa
23,6 Aa
9,5 Bb
40,6 Aa
14,1 Ab
13,0 Ba
13,8
Aa
Luteína
97,2 Aa
91,9 Aa
114,1 Aa
92,5 Aa
157,8 Aa
93,1 Ab
85,6 Ba
79,3 Aa
Zeaxantina
20,4 Ba*
12,4 Ba*
116,8 Aa*
54,2 Ab*
37,0 Aa
7,9 Bb
52,2 Aa
31,4 Aa
-
Caroteno
4,5 Aa
4,4 Ba
6,2 Aa
8,7 Aa
4,5 Ba*
5,6 Ba*
9,3 Ab*
12,9 Aa*
-
Caroteno
17,1 Ba
11,2 Ba
30,1 Aa
18,0 Ab
14,1 Ba
13,0 Ba
23,8 Aa
21,7 Aa
-
Caroteno
0,28 Ab
0,40 Aa
0,21 Ab
0,54 Aa
0,32 Ab*
0,44 Ba*
0,40 Ab*
0,60 Aa*
V + A + Z
103,8 Aa
7
3,4 Aa
145,7 Aa
70,9 Ab
150,1 Aa
65,1 Ab
70,2 Ba
61,8 Aa
A + Z
50,9 Ba*
32,9 Bb*
140,3 Aa*
63,6 Ab*
77,5 Aa
21,9 Ab
65,2 Aa
45,1 Ab
DEPS
0,33 Ba
0,28 Ba
0,87 Aa
0,78 Aa
0,36 Ba
0,20 Bb
0,84 Aa
0,62 Ab
0
Acúmulo relativo (%)
A
-caroteno
-carotenoZeaxantinaLuteínaAnteraxantinaNeoxantinaViolaxantina
20
40
60
80
100
B
0
Acúmulo relativo (%)
20
40
60
80
100
+ N
plantas à sombra plantas a pleno sol plantas à sombra plantas a pleno sol
N N
+ N
N
+ N
N
+ N
Figura
7:
Acú
mulo relativo de carotenóides do ciclo das xantofilas,
-
caroteno e
-
caroteno em
plantas de Coffea arabica cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 ou 23 mM de
N. Os dados foram avaliados na antemanhã (A) e ao meio-dia (B).
Cada
porção de
coluna
representa a média
de seis repetições
.
42
Ta
bela
7
:
Conteúdo
foliar
de
xantofil
as e carotenos em plantas de Coffea arabica cultivadas a
pleno sol ou sob 50% de irradiância em 0 e 23 mM de N. Os valores são expressos em mg kg
-1
MF e representam a média ± EP (n = 6). Letras maiúsculas diferentes denotam significância
estatística entre os horários, para um mesmo nível de nitrogênio e irradiância, enquanto letras
minúsculas diferentes
denotam significância estatística entre os níveis de nitrogênio, dentro de
um mesmo horário e irradiância (
teste
t,
p
= 0,05)
;
asteríscos (*) denotam significância entre os
níveis de irradiânc
ia
(
teste
t,
p
=
0,001).
Plantas a pleno sol
Plantas à sombra
Características
05:00 h
12:00 h
05:00 h
12:00 h
-N
+N
-N
+N
-N
+N
-N
+N
Neoxantina
55,4 Ab
114,5 Aa
29,6 Bb
87,9 Ba
73,4 Ab*
152,2 Aa*
51,6 Bb*
129,0 Ba*
Violaxantina
90,1 Ab
134,8 Aa
5,4 Bb
18,6 Ba
100,1 Ab*
176,4 Aa*
8,0 Bb*
62,7 Ba*
Anteraxantina
48,3 Aa
65,7 Aa
19,8 Ba
24,2 Ba
51,8 Aa
56,9 Aa
20,6 Bb
53,2 Aa
Luteína
162,9 Ab
301,3 Aa
104,9 Bb
235,7 Ba
211,9 Ab*
379,9 Aa*
136,1 Bb*
298,0 Ba*
Zeaxantina
32,4 Ba
39,9 Ba
96,8 Aa
137,4 Aa
47,1 Aa
31,8 Bb
83,0 Aa
121,1 Aa
-
Caroteno
7,6 Ab
14,5 Aa
6,5 Ab
21,4 Aa
7,5 Bb*
23,0 Ba*
14,5 Ab*
45,6 Aa*
-
Caroteno
27,1 Aa
36,7 Aa
29,7 Ab
44,5 Aa
22,9 Bb*
52,8 Ba*
37,2 Ab*
80,1 Aa*
-
Caroteno
0,28 Aa
0,40 Aa
0,21 Ab
0,54 Aa
0,32 Ab*
0,44 Ba*
0,40 Ab*
0,60 Aa*
V + A + Z
170,
8 Ab
240,4 Aa
122,0 Ab
180,2 Ba
198,9 Ab
265,1 Aa
111,5 Bb
237,0 Aa
DEPS
0,33 Ba
0,28 Ba
0,87 Aa
0,78 Aa
0,36 Ba
0,20 Bb
0,84 Aa
0,62 Ab
Avaliaram
-se quatro enzimas importantes na remoção de EROs. Enquanto a
SOD e a GR são distribuídas em vários compartimentos celulares (
e.g.
mitocôndria,
cloroplasto) a APX é tipicamente cloroplastídica
(Bray
et al. 2000), enquanto a CAT se
restringe basicamente aos peroxissomos (Buchanan & Wolosiuk 2006). As atividades
da SOD e da GR não foram significativamente afetadas pelos tratamentos. Por outro
lado, a atividade da APX foi significativamente menor nas plantas –N, especialmente à
sombra, em relação às plantas +N, enquanto a atividade da CAT foi menor nas plantas à
sombra em relação às plantas a pleno sol, independentemente da nutrição nitrogenada
(Figura 8). Registre-
se
que a CAT é a principal enzima responsável pela remoção de
H
2
O
2
produzido na fotorrespiração (Buchanan & Wolosiuk 2006) e, portanto, sua maior
atividade a pleno sol (~23%) pode ser tomada como evidência indireta do aumento da
fotorrespiração a pleno sol, reforçando a sugestão feita anteriormente de que maiores
atividades de GS, a pleno sol, também estaria associada com diferenças na magnitude
da fotorrespiração. Nas plantas –N, a redução da atividade da APX sem alterações na
atividade da SOD pode ter acarretado maior acúmulo de H
2
O
2
nessas plantas, fato
circunstancialmente suportado
pela relação negativa
(-
0,845 p
0,001)
entre a atividade
da APX e a concentração de H
2
O
2
. De modo oposto, a maior atividade da APX nas
plantas +N pode estar associada à uma maior capacidade de metabolizar EROs,
conforme sugerido para
Mahonia repens
(Logan
et al. 1998b)
.
Considerando
-
se
os
43
Tabela
8: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a produção de
peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
), aldeído malônico (MDA) e extravasamento de eletrólitos
em
plantas de Coffea arabica L. cultivadas a pleno sol ou sob 50% de irradiância. Médias
±
EP
(n = 7). Letras maiúsculas diferentes denotam significância estatística (
teste
t, p = 0,05) entre os
níveis de irradiância, para um mesmo nível de nitrogênio, enquanto letras minúsculas
diferentes
denotam significância entre os níveis de nitrogênio, dentro de uma mesma irradiância.
Plantas a pleno sol
Plantas
à
sombra
Características
–N
+N
–N
+N
H
2
O
2
(m
mol
kg
-1
MS)
6,38 ± 0,25 Aa
2,61 ± 0,09 Ab
3,84 ± 0,10 Ba
0,67 ± 0,05 Bb
Aldeído malônico
(
mol
kg
-1
MS)
186,3 ± 7,
5
Aa
96,
7
±
3,4
Ab
190,
7
± 19,
4
Aa
79,0 ±
3,6
Ab
Extravasamento de
eletrólitos (%)
6,14 ± 0,60
Aa
2,44 ± 0,17
Ab
6,
06 ± 0,41
Aa
2,83 ± 0,23
Ab
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Aa
Aa
Aa
Aa
0
20
40
60
80
100
Bb
Ab
Aa
Aa
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
Ba
Aa
Ba
Aa
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Aa
Aa
Aa
Aa
SOD U g MF
-1
APX U g MF
-1
GR U g MF
-1
CAT U g MF
-1
N
+ N
N
+ N
Figura
8: Efeito do sombreamento e da nutrição nitrogenada (0 e 23 mM) sobre a atividade da
dismutase do superóxido (SOD), peroxidase do ascorbato (APX), catalase (C
AT
) e redutase da
glutation
a (
GR
) em plantas de Coffea arabica L. As plantas foram cultivadas a pleno sol
(colunas v
44
plantas desenvolvidas sob altas irradiâncias, conforme já sugerido em café
(Ramalho
et
al.
2000) e também para outras espécies (Chen & Chen 2003; Logan et al. 1998a). Em
todo o caso, sugere-se, aqui, que a maior atividade da APX, associada à maior
disponibilidade de N, tenha papel de des
taque na fotoproteção das plantas +N.
45
3
.4
–
Síntese dos principais resultados
e conclusões
Níveis mais elevados de N, nas plantas suplementadas, promoveu maior síntese
de aminoácidos e proteínas solúveis totais nessas plantas, fato associado, pelo menos
em
parte, à maior atividade da GS.
As baixas temperaturas noturnas, aliadas às altas irradiâncias, especialmente
nas plantas cultivadas a pleno sol, afetaram significativamente a assimilação líquida de
carbono, devido, principalmente, a limitações difusivas. Nas plantas cultivadas à
sombra, todavia, reportaram-se taxas fotossintéticas significativamente maiores quando
comparadas às plantas de sol. A capacidade fotossintética potencial, entretanto, foi
maior nas plantas a pleno sol, bem como nas +N. Isso demonstra que os efeitos
positivos da nutrição nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido
aparentemente atenuados pelas resistências difusivas impostas, presumivelmente, pelas
baixas temperaturas noturnas.
As plantas –N apresentaram folhas amar
eladas,
i.e.
, mostraram menor
concentração de clorofilas
(Tabela
5; Apêndice 1
)
, com redução ainda mais pronunciada
nas plantas cultivadas a pleno sol. Nessas plantas, ocorreu menor concentração de
carotenóides, em base de massa, e menor atividade da APX, fatos possivelmente
associados ao acúmulo mais pronunciado de H
2
O
2
, que pode ter acarretado danos às
membranas cloroplastídicas. Por outro lado, as plantas +N apresentaram maiores
concentrações de clorofilas e carotenóides, fato que contribuiu para a elevação de
P (31%) e queda de D (18,5%), de forma ainda mais pronunciada nas plantas cultivadas
à sombra. Em todo o caso, verificou-se que a aclimatação do cafeeiro a pleno sol
envolve uma combinação entre a menor absorção de luz (devido à diminuição da
concen
tração de clorofila) e um aumento da dissipação térmica nas antenas dos
fotossistemas. Nas plantas cultivadas a pleno sol, houve maior atividade da CAT, apesar
da ocorrência de fotoinibição crônica. Tal fato, associado com a maior atividade da GS,
são indícios circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a
pleno sol, que levaria a um maior consumo de poder redutor, menor impacto sobre os
fotossistemas e maior capacidade fotoprotetora. Em todo o caso, a aclimatação da
maquinari
a fotossintética a condições de plena irradiância é fortemente dependente da
disponibilidade de N. Estes resultados explicam, pelo menos em parte, as altas
exigências em N pelo cafeeiro quando cultivado a pleno sol, apesar de suas baixas taxas
de fotossínt
ese e de eficiência fotossintética do uso desse elemento.
46
2.5
–
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51
IV
. C
HAPTER
II
I
Allometric models for non
-
destructive leaf area estimation in coffee
(
Coffea arabica
and
C. canephora
)
1
W.C. Antunes
2
, M.F. Pompelli
2
, D.M. Carretero
2
& F.M. DaMatta
2
1
Manuscript
in press
to publication in Annals of Applied Biology, 2008
2
Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa, 36570-
000
Viçosa, MG, Brasil
Correspondence
F.M. DaMatta, Departamento de Biol
ogia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa,
36570
-
000 Viçosa, MG, Brasil
E-
mail:
[email protected]
Running title: L
eaf area estimation in coffee
4.1
–
Abstract
We aimed to evaluate the currently used allometric models, as well as to propose a
reliable and accurate model using non-destructive measurements of leaf length and/or
width, for estimating the area of leaves of eight field-grown coffee cultivars. For model
construction, a total of 1,563 leaves were randomly selected from different levels of the
tree canopies and encompassed the full spectrum of measurable leaf sizes (0.3 to 263
cm
2
) for each genotype. Power models better fit coffee leaf area than linear models. To
validate the model, an independent data set of 388 leaves was used. We demonstrated
that the currently used allometric models are biased, underestimating the area of a
coffee leaf. We developed a single power model (Y = ß
0
X
ß1
)
based on two leaf
dimensions [Leaf area = 0.6626(Length x Width)
1.0116
; standard errors: ß
0
= 0.0064,
ß
1
= 0.0019; R
2
= 0.996]
with high precision and accuracy, random dispersion pattern of
residuals and also unbiased, irrespective of cultivar and leaf size and shape. Even when
the length (but not width) alone was used as the single leaf dimension, the power model
developed still predicted with good accuracy the leaf area, but at the expense of some
loss of precision, as particularly found for 8% of the leaves sampled with length-
to
-
width ratios below 2.0 or above 3.0
.
Keywords
:
Coffea arabica, Coffea canephora
, estimating model
52
4.2
–
Introduction
Among 103 species of the
Coffea
genus
(Davies
et al.
2006),
Coffea arabica
L.
(arabica coffee) and C. canephora Pierre ex Froehner (robusta coffee) dominate the
world coffee trade, being responsible for about 65% and 35%, respectively, of world
coffee production. Coffee is one of the most important commodities in international
agricultural trade, generating over US$ 90 billion each year and involving about 500
million people in its management, from cultivation to final product for consumption.
It is currently grown in some 80 countries in four continents. Brazil is the world’s
largest coffee producer, followed alternately by Colombia and Vietnam. Many African
countries including Uganda, Burundi, Rwanda and Ethiopia have coffee as their main
source of foreign exchange
(DaMatta & Ramalho 2006).
Leaf area (LA) is a key variable for most agronomic and physiological studies
involving plant growth, light interception, photosynthetic ef
ficiency, evapotranspiration,
and responses to fertilisers and irrigation (Blanco & Folegatti 2005). Therefore, LA
strongly influences crop growth and productivity and estimation of LA is a fundamental
component of crop growth models
(Lizaso
et al.
2003)
. However, the measurement of
the surface area of a large number of leaves is often costly, time-consuming and
destructive. A modelling approach involving linear relationships between LA and one or
more dimensions of the leaf is an inexpensive, rapid, reliable, and a non-
destructive
alternative for accurately measuring LA
(Lu
et al. 2004; Williams III & Martinson
2003)
. However, in many studies the adequacy of the model assumptions for estimating
LA has not been carefully examined. In this regard, small or minor violations of the
underlying assumptions can invali
date the inferences drawn from the analysis in a major
way. A simple and effective method for detecting model deficiencies in regression
analysis is the examination of residual plots. Residual analysis may lead to suggestions
of structure or point to information in data that might be missed or overlooked if the
analysis is based only on summary statistics
(Chatterjee & Hadi 2006)
.
The most commonly used method employing leaf dimensions for estimating
the area of a coffee leaf was proposed by Barros et al. (1973). They obtained a linear
model without intercept in which the LA (dependent variable) can be calculated as the
product of the leaf length (L) and width (W) (independent variables) multiplied by a K
coefficient (0.667). Other two similar equations [LA = 0.63LW, with the K coefficient
der
ived as the ratio of LA to the product of L and W (Awantramani & Gopalakrishna
1965)
; and LA = 0.220 + 0.649 LW, with coefficients estimated using least square
linear regression analysis (Rey & Alvarez 1991)] were also proposed for estimating the
53
area of a coffee leaf. However, these equations have been chosen based only on values
obtained for the coefficient of determination (R
2
) and the standard error of estimates,
without assessing their accuracy. In fact, Tavares-Júnior et al. (2002), confronting the
method of Barros et al. (1973) against a standard method for measuring LA, found that
it was biased, significantly underestimating the true leaf area. In addition, these models
were just developed for a single arabica coffee genotype, and hence no information is
available on whether or not such models can be successfully extrapolated to other coffee
genotypes. From the a.09765 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09765 0 0 -0.090.09765 0 0 -0.09765 3790 30.09765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -07i
, 3250.09765 0 0 -0.09765 4429 2854 Tm(e)Tj( )100.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm( )Tj0.09765 0i0 -0.09765 4552 2509 Tm(e)T40.09765 0 0 -0.09765 4676 2854 Tm(r)9j0.09765 0 0 -0.09765 2419 3544 Tm(489j0.09765 0 0 -0.09765 4374 2854 Tm(l9550.09765 0 0 -0.09765 3516 3544 Tm(e)Tj(51400.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(52290.09765 0 0 -0.09765 2063 3544 Tm(c)T90.09765 0 0 -0.09765 5760 2164 Tm(d)Tj( 5250.09765 0 0 -0.09765 5804 2509 Tm(r5920.09765 0i0 -0.09765 4552 2509 Tm(e)Tj0.09765 0g9765 5600 2509 Tm(e)Tj( )T765 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09758T765 0 0 -0.r9765 5760 2164 Tm(d)Tj( )T465 0 0 -0.09765 379p9 Tm(0)Tj0.09760T465 0 0 -0.u0 -0.09765 6029 1474 Tm(a)T40.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm(61920.09765 0l0 -0.09765 6189 2854 Tm(t)T80.09765 0 0 -0.09765 6353 2509 Tm(f)Tj( )T40.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(t)Tj765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -076)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2608 3544 Tm(66660.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(t721765r9 1819 Tm(l)Tj0.09765 0 0 -0768100.09765 0 0 -0.09765 6841 2854 Tm(d)Tj( )060.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(e)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7299 2854 Tm(c)Tj0.09765 0 0 -0.09765 7299 2854 Tm(c)Tj5 0 0 -0.u0 -0.09765 6029 1474 Tm(73Tj5 0 0 -0. 0 -0.09765 7378 2164 Tm(r)T00.09765 0 0 -0.09765 3701 3544 Tm(75280.09765 0 0 -0.09765 6189 2854 Tm(75840.09765 0 0 -0.09765 3516 3544 Tm(e)Tj(77690.09765 0 0 -0.09765 4676 2854 Tm(792j0.09765 0 0 -0.09765 2163 3544 Tm(802j0.09765 0 0 -0.09765 8639 2509 Tm(d12j0.09765 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(e)120.09765 0l0 -0.09765 8237 2509 Tm(e)Tj( )640.09765 0 0 -0.09765 7970 2854 Tm(f)Tj0.09765 0 0 -0.09765 2163 3544 Tm(85Tj0.09765 0r0 -0.09765 8501 2164 Tm(d)Tj( )940.09765 0L0 -0.09765 8716 2164 Tm(h)T765 0 0 -0.A0 -0.09765 8883 2854 Tm(s)Tj( )Tj/F1 2048 Tf0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(a)Tj0)Tj65 0s9765 1930 2509 Tm(t)Tj( )T10)Tj65 0 0 -0.09765 2263 3544 Tm(t)Tj0)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(i15j0)Tj65 0 0 -0.09765 1874 2164 Tm(m30j0)Tj65 0 0 -0.09765 2572 2509 Tm(a3960)Tj65 0 0 -0.09765 2263 3544 Tm(t4520)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(i5Tj0)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(e)Tj0)Tj65 0n0 -0.09765 2632 2164 Tm(f)Tj( )830)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(e)Tj0)Tj65 0f0 -0.09765 2927 2509 Tm(,)Tj( )230)Tj65 0c0 -0.09765 3037 2509 Tm(s)T20)Tj65 0o0 -0.09765 2519 3544 Tm(321j0)Tj65 0f0 -0.09765 3171 2509 Tm(g)T90)Tj65 0f0 -0.09765 3171 2509 Tm(g)Tj0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(343f0)Tj65 0 0 -0.09765 3412 2854 Tm(d)Tj( )980)Tj65 0 0 -0.09765 2516 2509 Tm(36540)Tj65 0s9765.09765 3671 1819 Tm(r)Tj( )T70)Tj65 0n0 -0 379p9 Tm(0)Tj0.09765T70)Tj65 0 0 -0.09765 3874 1474 Tm(e)960)Tj65 0 0 -0.09765 3986 1819 Tm(c)8j0)Tj65 0 0 -0.09765 8167 1474 Tm(i)Tj0
54
individual leaf (taken as a reference) was measured with an area meter
(Area Measurement
System, Delta
-
T Devices, Cambridge, UK).
Several linear and non-linear regression models between L and W dimensions
and LA were run for each genotype. Equality of a set of linear regression models among
genotypes was examined using the test for model identity (slopes and intercepts)
described by Graybill (2000). Here, we present only linear and power relationships
since they better fit coffee LA than other tested models. When power models
(Y = ß
o
X
ß1
) were used, both dependent and independent variables were subjected to
logarithmic transformation before analysis. To compare the estimated LA with the
observed LA graphical procedures described by Graybill (2000) were adopted.
Statistical criteria for model selection were based on the F test, coefficient of
det
ermination, standard error of estimates, and dispersion pattern of residuals. These
criteria allowed us to evaluate the occurrence of bias, and model precision and accuracy.
In this regard, bias denotes the statistical difference between a population mean or test
results and an accepted reference or true value, accuracy represents the overall distance
between the estimated (or observed) value and the true value, and precision denotes the
variation among individual measurements (variance) (see further details in Walther &
Moore 2005).
(Graybill 2000; Walther & Moore 2005)
All the statistical analyses were performed using the software Statistica version
7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA), DataFit version 8.0.32 (Oakdale Engineering, Oakdale,
PA, USA) and Minitab 14 (Minitab Inc, State College, PA, USA).
4.4
–
Results
Separate regression models that estimate LA from L, W, and the L-W product
did not differ signif
icantly
(a = 0.05) among genotypes for the L-W power model we
developed (Table 1) and for the other power models (Table 2). Therefore, data for these
genotypes were pooled and single regression models were fitted to the combined data.
The coefficient of determination adjusted for the degrees of freedom (R
a
2
) for all tested
models was highly significant, exceeding 97.5% (Table 2). Noteworthy, the linear
models without (LA = 0.667 LW) and with (LA = 0.220 + 0.649 LW) intercept
respectively developed by Barros et al. (1973) and by Rey & Alvarez (1991) showed
good precision (low SE; Table 2) but were biased (-0.051 and -0.074, respectively,
p = 0.0001), leading to a significant underestimation of LA (Fig. 1). The linear model
(LA = 0.701 LW) we developed had also good precision, but its bias (0.002,
p
=
0.0001)
55
led to an overestimation of LA (Fig. 1). It is also worth noting that the model assu
ming
an elliptical shape of leaves failed to adequately predict LA, that is, it also led to an
overestimation of LA (data not shown) probably because coffee leaves are not perfectly
elliptical.
The biased model LA = 0.701 LW was modified by introducing a c
onstant
ß
o
(-0.527). Compared with this model, the modified model (LA = -0.527 + 0.706 LW)
showed similar and high R
a
2
value, but was more precise and accurate and unbiased
(Table
2,
Fig.
2A). Nonetheless, the dispersion pattern of residuals did not follow a
norm
al distribution (
i.e.
a heteroscedastic behaviour) when the L-W product approaches
zero
(Fig.
2A, inset). This feature translates into underestimation of LA, especially for
small leaves with L < 5 cm or W < 2 cm (relative errors of 60%).
The best estimation of the area of a coffee leaf could be obtained through the
power model LA = 0.6626(LW)
1.0116
. This model, in addition to showing high R
a
2
,
accuracy and precision, and lack of bias (Table 2
, Fig. 1, Fig.
2
B), could also rigorously
estimate LA regardless of leaf dimensions (Fig. 2B, inset, Fig. 3). The reduction of
estimation errors was manifested through the increasing F
calc
and the decreasing sum of
residual squares as compared with the linear regression models (Table
2
).
A simplification of the L-W power model was tested by taking a single-
leaf
dimension (Fig. 4A), either L (LA = 0.2132L
2.1176
) or W (LA = 2.1125W
1.8643
)
(Table
2). When developing such a model, we noted that the residual scatter plot had a
heteroscedastic behaviour (shown for L in Fig. 4B, but also valid for W, data not
shown). In this context, the ordinary least square method for estimating the model
coefficients cannot be reliably used unless corrective action for removing
heteroscedascity needs to be adopted (Chatterjee & Hadi 2006). This was done by
logarithmic transformation of data resulting in residual scatter plot with random mean
and variance distribution (Fig. 4C). The developed power models based on single-
dimension factors, when compared with the L-W power model, showed a slight
decrease in R
a
2
and lower precision, but with similar accuracy (Table 2, Fig. 1).
In fact, the LA estimated by the power models strongly agreed with the observed values,
with R
2
= 0.977, 0.982, and 0.996, respectively for L, W, and L
-
W models
(Fig.
5)
.
In the model validation analysis, the
0
and
1
coefficients were compared by
using the calibration and validation data sets. As shown in Fig. 6, the predictive power
of the L and L-W models performed well whereas the W model failed to adequately
predict the area of an individual leaf.
56
Despit
e being appropriate for estimating LA, the power model using L as the
single
-leaf dimension factor may be limited (which was not the case of the two-
leaf
dimension model), particularly for leaves with L/W ratio < 2.0 or > 3.0; in this range, an
underestima
tion and an overestimation of LA was found for that model (being the
opposite when using W as the single factor; Fig. 3). It should be mentioned, however,
that only 3.3% of the sampled leaves randomly showed L/W ratio < 2.0, and 4.7% with
L/
W ratio > 3.0 (
data not shown).
Since we calibrated a model derived from a large sample size, the minimum
number of leaves necessary to develop our model was examined. This was performed
using the Minitab software which randomly selected 10 samples for each predefined
sa
mple size, and then the
0
and
1
coefficients obtained for each sample size were
compared with the coefficients found for the entire data set. It is feasible to reduce the
amount of leaf samples to about 200 to develop a reliable regression model to predi
ct
the area of coffee leaves
(Fig.
7
).
4.5
–
Discussion
In this paper we describe how LA can be accurately estimated from simple
non-destructive measurements in coffee, for which a power model incorporating either
the leaf length alone or both leaf length and width together was developed. We also
demonstrated that the currently used linear allometric models for estimating the area of
a coffee leaf are inappropriate. Although showing relatively high R
a
2
and high precision,
they are not accurate, causing an
underestimation of LA.
Regardless of its high apparent precision and accuracy, the linear model with
intercept we developed has also proven to be inadequate, particularly for small leaves
with L/W ratio > 3.0 (Fig. 2B, Fig. 4). It should be mentioned that when the dispersion
pattern of residuals follows a heteroscedastic behaviour and no corrective action is
taken, application of ordinary least squares to the raw data will result in estimated
coeffic
p
c
57
crops like black pepper (Kandiannan et al. 2002), grapevine (Williams III & Martinson
2003)
, and dwarf coconut tree
(Sousa
et al.
2005)
.
Differences in leaf shape may occur even within individuals, as found in
Salix
viminalis
(Verwijst & Wen 1996). In the current study, however, we did not find
consistent differences in leaf shape (as judged from the L/W ratio;
Verwijst
& Wen
1996) within and between coffee species (data not shown). In contrast, random
differences in leaf shape among the sampled leaves were detected. Whereas caution
must be exercised when using the L model for estimating the area of leaves with L
/W
ratios below 2.0 or above 3.0, the L-W power model allowed reliable LA estimations
regardless of differences in leaf shape (Fig. 3). Nonetheless, bearing that limitation in
mind, the s
ingle
-leaf dimension power model incorporating L may be an interestin
g
option since it requires measurement of only one leaf dimension, thus simplifying
measurement procedures (Williams III & Martinson 2003), an important aspect
specially in field when a large number of leaves has to be monitored. Furthermore,
when using the L model there is obviously no need to measure W, which is not as easily
gauged as L because the need of considering an imaginary perpendicular line to the leaf
L and also because fully expanded coffee leaves are not always perfectly flat. These
facts must be judiciously considered when measuring W to obtain reliable LA
estimations using the L
-
W model.
In conclusion, we developed simple predictive models to accurately estimate
the area of leaves for all the genotypes we investigated, including the most widely
grown cultivars of both arabica and robusta coffee in Brazil. Power models better fit
coffee LA than linear models, and thus the earlier proposed models should be avoided
for LA estimation. Compared with the L-W power model, the L-based model also
allowed reliable LA estimations, but at the expense of some loss of precision, as
particularly found for 8% of the sampled leaves (2.0 < L/W ratio < 3.0). In contrast,
irrespective of cultivar and leaf developmental stages and shapes, we demonstrated that
the L-W power model is an excellent and non-destructive tool for studying leaf growth
and development in coffee.
4.6
–
Acknowledgements
Scholarships granted by the Brazilian Government (W.C. Antunes and
M.F. Pompelli – CNPq, and D.M. Carretero – CAPES) are gratefully acknowledged.
Special thanks are due to Mr. Geraldo de Jesus for his assistance in the selection of
leaves in Germplasm Bank of the Federal U
niversity of Viçosa.
This study was partially
58
funded by the Minas Gerais State Research Foundation, Brazil (Grant CAG APQ-3995-
3.08/7).
4.7
–
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-498
59
Table
1.
Analysis of variance (ANOVA) for model
(Y =
ß
o
X
ß1
)
identity test, in which X is the product of
length and width. Both dependent and independent variables were log-transformed before
analysis. Data derived from the calibration data set (n
= 1,563 leaves).
Source of variation (SV),
degrees of freedom
(DF), sum of squares (SS), mean squares (MS), and calculated
F
(
F
calc
).
SV
DF
SS
MS
F
calc
Parameters
(16)
(3,377.2199)
-
Reduction (ß’
s
)
2 3,377.1977 -
Reduction (H
o
)
14 0.0222 0.00159 1.26
Residual
1,546
1.9518 0.00126
Total
1,562 3,379.1717
F
5%
(14,
8) = 1.69
60
Table
2
.
Statistical models, regression coefficients, standard errors of estimates (SE), coefficients of
determination adjusted for the degrees of freedom (R
a
2
), degrees of freedom of residuals (R-
DF), residual sum of squares (R-SS) and calculated F (F
calc
) and equations of leaf area as a
function of linear dimensions of leaves (length, L, and width, W) of diverse coffee genotypes.
Model
Coefficients
SE
R
a
2
R-DF
R-SS
F
calc
Estimative of LA (Y)
Y
#
= ß
1
x + e
i
ß
1
= 0.667
-
0.9889
430
- -
Y = 0.667*L*W
ß
o
= 0.2197
ß
1
= 0.649
Y = ß
1
x + e
i
ß
1
= 0.70125
0.000797
0.9957
1,562
9,855.56
360,018.6
Y = 0.70125*L*W
ß
o
= -0.52665
0.001165
ß
1
= 0.70604
0.094246
ß
o
= 0.66256
0.006137
ß
1
= 1.01156
0.001871
ß
o
= 0.21318
0.005606
ß
1
= 2.11756
0.009113
ß
o
= 2.11246
0.030150
ß
1
= 1.86425
0.006936
Y = ß
o
x
ß
1
e
i
0.9833
1,561
38,076.51
91,018.5
Y = 2.11246*W
1.86425
Y = ß
o
x
ß
1
e
i
0.9781
1,561
49,827.86
69,044.8
Y = 0.21318*L
2.11756
Y = ß
o
x
ß
1
e
i
0.9959
1,561
9,615.62
368,800.9
Y = 0.66256*(L*W)
1.01156
Y = 0.2197 + 0.649*L*W
Y = ß
o
+ ß
1
x + e
i
0.9958
1,561
9,659.45
367,120.6
Y = -0.52665 + 0.70604*L*W
Y
##
= ß
o
+ ß
1
x + e
i
-
0.9425
878
- -
# Barros et al.
(1973)
## Rey & Alvarez (1991)
61
Figure legends
Figure 1.
Statistical analysis of the d
eviation of the estimated area from the observed area for an
individual leaf. Leaf area for coffee was estimated using several models in which
0
and
1
are
coefficients. Vertical bars denote means, and spreads denote 95% confidence intervals of the
differ
ence. L = length; W = width. See further details in the text.
Figure
2. The relationship between estimated leaf area and leaf dimensions (L, length; W,
width) for eight coffee genotypes using a linear (A) and a power (B) model. The initial portion
of analysis of dispersion pattern of residuals for the respective models is shown in the insets.
Arrow indicates an underestimated area for small leaves when using the linear model (A –
inset).
Figure
3. Difference between the real leaf area and the calculated leaf area for the different
models and classes of length-
to
-width (L/W) ratio. Vertical bars denote means, and spreads
denote 95% confidence intervals. Statistical differences (p = 0.05, t test) are denoted by
asterisks.
Figure
4. The relationship between estimated leaf area and leaf length (L) for eight coffee
genotypes using a power model (A). Symbols as in Figure 11. In the insets, dispersion pattern of
residuals relative to the model Y =
0
(L)
1
(B) and dispersion pattern of log-
transformed
residuals o
f that model presenting a homoscedastic distribution (C) are shown.
Figure
5
. The relationship between estimated and observed leaf area for eight coffee genotypes.
Symbols as in Figure 11. Leaf area was estimated using power models (see Table 14) based on
both single leaf dimensions, length (A) or width (B), and the product of two-leaf dimensions,
length and width (C). Dotted line represents the 1:1 relationship.
Figure
6. Statistical comparisons of the
0
and
1
coefficients of the power models Y = ß
o
(X
)
ß1
using the calibration (black circles; n = 1,563) and the validation (white circles; n = 388) data
sets. Vertical bars represent the 99% confidence intervals for
coefficient means.
Figure
7
.
0
estimation in the model = ß
o
(LW)
ß1
as a function of sample size. Vertical bars
represent the 99% confidence intervals for the
0
coefficient means. The numbers above the bars
denote the sample size (n = 10) (A). The entire data set was composed by a sample of 1,563
leaves. In the inset, inverted polynomial regression for
0
deviation as a function of leaf size
showing the approximate minimum sample size (indicated by the arrow) to develop a regression
model to reliably predict the area of coffee leaves (B).
62
Estimated difference (cm
2
leaf
-1
)
F
ig. 1
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
-3.0
-3.5
Observe
Barros
et al.
(1973)
ß
1
(LW
ß
o
+
ß
o
(LW)
*
*
Rey and Alvarez
(1991)
*
ß
o
(W)
ß1
ß
o
(L)
ß1
63
0
50
100
150
200
250
300
64
L/W classes
Estimated difference (cm
2
leaf
-1
)
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
Fig.
3
ß
1
(LW)
ß
o
(LW)
ß
1
ß
o
(L)
ß
1
ß
o
(W)
ß
1
ß
o
+ ß
1
(LW)
L/W > 3.0
*
*
*
*
*
L/W
<
2.0
2.0 < L/W
<
3.0
*
65
Length (cm)
0 5
10
15 20 25 30 35
Leaf area (cm
2
)
0
50
100
150
200
250
300
Fig.
4
0
5
10
15
20
25
30
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
66
Estimated leaf area (cm
2
)
0
50
100
150
200
250
300
67
's coefficients
Fig.
6
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
^
^
Y =
ß
o
(LW)
ß
1
ß
1
ß
o
^
^
Y = ß
o
(L)
ß
1
ß
o
ß
1
^
^
Y = ß
o
(W)
ß
1
ß
o
ß
1
68
Sample size
o
Fig.
7
10
20
100
50
200
300
1563
A
B
^
0.80
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0.00
0
200 400 1400 1600
Variabilidade (
0
)
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
69
V. CONCLUSÕES GERAIS
Neste trabalho, foram realizados dois experimentos, conduzidos
separadament
e e analisados como tal, para investigar os efeitos da irradiância e da
nutrição diferencial de nitrogênio sobre (i
)
as respostas alométricas e morfológicas e
(
ii
) os mecanismos de fotoproteção em plantas de café avaliadas no inverno.
Procurou
-se, ainda, avaliar as atuais metodologias de estimação da área foliar do
cafeeiro e propor uma nova equação que permitisse a estimação com acurácia e
precisão da área foliar do cafeeiro nas duas espécies mais cultivadas no Brasil
(
Coffea arabica
e
C. canephora
).
No primeiro experimento, verificou-se que a deficiência de N acarretou
redução marcante no acúmulo de biomassa, independentemente do ambiente lumínico.
Em todo o caso, mesmo na fase de muda, as plantas cultivadas ao sol acumularam mais
biomassa que as plantas à sombra, um forte indício de que as taxas fotossintéticas
líquidas foram maiores nas primeiras.
Verificou
-se, ainda, que os efeitos da nutrição
nitrogenada sobre as características alométricas e morfológicas avaliadas foram mais
relevantes entre 0 e 16 mM de N que entre 16 e 23 mM de N. Dessa forma, a nutrição
supra
-ótima de N (23 mM) não teria efeitos significativos, tal que justificasse sua
utilização a nível de campo. A disponibilidade de luz, mas não a de N, promoveu
alterações na morfologia da epiderme; com o aumento da expansão foliar, em resposta
ao sombreamento, houve redução na densidade estomática, que foi bem mais
pronunciada que a redução observada no índice estomático. Essas alterações ocorreram
sem variações aparentes nas dimensões dos estômatos, porém com alterações
significativas na área média das células ordinárias da epiderme, sugerindo uma
plasticidade diferencial das células ordinárias da epiderme na alteração do índice
estomático, em resposta a variações da irradiância.
No segundo experimento, as plantas foram submetidas a dois níveis de N
(0 e 23 mM), sendo também cultivadas a pleno sol e à sombra; entretanto, as plantas
foram avaliadas no inverno. As baixas temperaturas noturnas, aliadas às altas
irradiâncias, especialmente nas plantas cultivadas a pleno sol, afetaram
significativamente a assimilação líquida de carbono, devido, principalmente, a
70
limitações difusivas. Nas plantas cultivadas à sombra, todavia, reportaram-se taxas
fotossintéticas significativamente maiores quando comparadas às de plantas a pleno sol.
A capacidade fotossintética potencial, por outro lado, foi maior nas plantas a pleno sol,
bem como nas plantas +N. Isso demonstra que os efeitos positivos da nutrição
nitrogenada sobre a fotossíntese, in situ, devem ter sido aparentemente atenuados pelas
resistências difusivas impostas, presumivelmente, pelas baixas temperaturas noturnas.
Verificou
-
se ainda, que as baixas temperaturas noturnas, afetam diretamente a eficiência
do FSII, tal que a razão F
v
/F
m
é fortemente reduzida nas plantas cultivadas a pleno sol,
de modo ainda mais pronunciado nas plantas deficientes em N. Essas plantas, todavia,
apresentaram menor concentração de clorofilas, com redução ainda mais pronunciada
nas plantas cultivadas a pleno sol. Nessas plantas, oc
orreu
, ainda, menor concentração
de carotenóides, em base de massa, e menor atividade da APX, fatos possivelmente
associados ao acúmulo mais pronunciado de H
2
O
2
, que pode ter acarretado danos às
membranas cloroplastídicas. Por outro lado, as plantas +N apresentaram maiores
concentrações de clorofilas e de carotenóides, fato que contribuiu para a elevação de
P
e
queda de
D,
de forma ainda mais pronunciada nas plantas cultivadas à sombra. Nas
plantas cultivadas a pleno sol, houve maior atividade da CAT, apesar da ocorrência de
fotoinibição crônica. Tal fato, associado com a maior atividade da GS, são indícios
circunstanciais de maior atividade fotorrespiratória das plantas cultivadas a pleno sol.
Em todo o caso, a aclimatação da maquinaria fotossintética a condições de pleno sol foi
fortemente dependente da disponibilidade de N.
Adicionalmente, foram avaliadas as principais metodologias não-destrutivas de
estimação da área foliar do cafeeiro, verificando-se que essas metodologias, em geral,
levam a uma subestimação da área foliar. Desenvolveu-se, neste trabalho, uma nova
equação para estimar-se, não-destrutivamente, a área foliar; o modelo foi desenvolvido
a partir de oito genótipos de café (arábica e robusta), gerando-se uma equação potencial
(x = 0,663 CL
1,01
2
) (x = área foliar, C = comprimento, L = largura) capaz de estimar
com alta precisão (99,6%), acurácia e ausência de viés a área de folhas de diferentes
idades, forma e tamanho em cafeeiros. Uma simplificação do modelo pôde ser
alcançada a partir de apenas uma dimensão linear da folha, gerando-se uma equação do
tipo x = 0,213 L
2,118
. Nesse modelo, a precisão foi ligeiramente reduzida (97,8%).
Entretanto, o modelo pode ser perfeitamente utilizado para folhas com razão
comprimento/largura entre 2,0 e 3,0, onde se enquadra a maioria (92%) das 1563 folhas
utilizadas no desenvolvimento dos modelos em questão, ou mesmo em experimentos
que
não requeiram tamanha precisão na estimação da área foliar
.
71
APÊNDICE I
Arquitetura da copa de plantas de Coffea arabica L. cultivadas sob 0, 16 e 23 mM de N
(respectivamente da direita para a esquerda) a pleno sol (A) e à sombra (B). Verificar que nas
plantas +N (16 e 23 mM)
a
alocação de biomassa foi maior que nas plantas -
N
(0 mM).
Verificar ainda que
nas plantas deficie
ntes ocorreu
um maior amarelamento das
folhas, de modo
ainda mais pronunciado nas plantas cultivadas a pleno sol, evidência indireta de maior
comprometimento do sistema fotossintético e fotoprotetor.
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