Download PDF
ads:
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências
Programa de Pós-Graduação em Botânica
Cultura de anteras e embriogênese de
genótipos selecionados de cevada
(Hordeum vulgare L. ssp. vulgare)
Ana Cristina Mazzocato
Bióloga pela UFSM
Mestre em Fitotecnia pelo PPG Agronomia - UFRGS
Tese submetida ao Programa
de Pós-Graduação em
Botânica como um dos
requisitos para a obtenção do
título de Doutor em Ciências:
Botânica
Orientador: Prof. Dr. Jorge Ernesto de Araujo Mariath
Co-orientadora: Profa. Dra. Helga Winge
Porto Alegre, 2005
ads:
iii
Este trabalho foi integralmente desenvolvido no Instituto de
Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no
Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Botânica e nos
Laboratórios de Cultura de Tecidos Vegetais e Citogenética Vegetal do
Departamento de Genética. Os órgãos financiadores foram a
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),
o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), Convênio C. C. Brahma - Maltaria Navegantes/ UFRGS;
Convênio AmBev – Maltaria Navegantes/ UFRGS e FAPERGS.
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese aos meus pais, que
sempre com muito amor me ensinaram a
lutar muito por tudo o que sonhei, e que
muitas vezes deixaram de realizar os
seus próprios sonhos em função dos
meus...
Sempre lembro do meu pai dizer: “Nada é
fácil na vida, mas também nada é
impossível para que não possamos
realizar”.
Obrigada aos meus grandes exemplos de
vida: Severino e Ereni Mazzocato.
v
Os sonhos são
como as conchas
que o mar
depositou sobre a areia.
É necessário recolhê-las
e escutar a sua voz.
Romano Battaglia
vii
SUMÁRIO
Agradecimentos ..................................................................
x
Resumo .............................................................................
xii
Abstract .............................................................................
xiv
Considerações Preliminares ..................................................
1
1 – Introdução ....................................................................
2
1.1 – Caracterização da espécie e subespécies de cevada ......
3
1.2 – Importância econômica da cevada cultivada .................
6
1.3 – Melhoramento da cevada ...........................................
7
1.4 – Produção de plantas haplóides via cultura de anteras ....
9
1.5 – Desenvolvimento do micrósporo e do grão de pólen ......
15
1.6 – Rotas alternativas do micrósporo e do grão de pólen .....
17
1.7 – Citologia dos micrósporos e grãos de pólen de cevada ...
20
1.8 – Histologia da antera ..................................................
22
1.9 – Estudos histológicos em órgãos cultivados in vitro ........
24
Objetivos ........................................................................
27
2 – Material e Métodos .........................................................
29
2.1 – Material ..................................................................
30
2.1.1 – Obtenção das linhagens selecionadas ..................
30
2.2 – Métodos ..................................................................
31
2.2.1 – Cultura de anteras de cevada e 3
a
geração
de seleção ......................................................
31
• Coleta de espigas para a cultura de
anteras............................................................
32
• Pré-tratamento à baixa temperatura................
35
viii
• Determinação do estádio de desenvolvimento
dos micrósporos e dos grãos de
35
• Cultivo in vitro das anteras
................................
36
a) Meios de cultura ..........................................
36
b) Indução da embriogênese do micrósporo e do
grão
de pólen ..................................................
36
c) Exame das anteras em cultivo ........................
40
• Transferência de estruturas embriogênicas –
Regeneração
-
I .................................................
42
Regeneração-II ................................................
43
• Transferência das plântulas verdes para
vermiculita ......................................................
43
• Determinação do nível de ploidia das plantas
verdes regeneradas ..............................
.........
44
• Transferência das plantas para recipientes
com substrato
44
• Análises estatísticas
.........................................
45
2.2.2 – Escolha das linhagens e espigas para as análises
cito
-
e histológicas .......................................
46
2.2.3 – Análises Citológicas ..........................................
47
• Análise estatística..........................................
............................................
50
2.2.4 – Análises histológicas .........................................
51
• Análises estatísticas........................................
55
3 – Resultados ....................................................................
58
3.1 – Cultura de anteras de cevada .....................................
59
• Etapa da coleta de espigas e determinação do
estádio de desenvolvimento dos micrósporos e grãos de
59
• Etapa da indução de estruturas embriogênicas
............
60
• Etapa de regeneração de plântulas verdes
..................
65
• Etapa de regeneração de plantas adultas
....................
68
3.2 – Análise citológica da cultivar MN-599 de cevada ...........
73
3.3 – Análise histológica e comparações pontuais com a
análise citológica da
cultivar MN-599 de cevada...........
89
3.4 – Análise histológica das linhagens selecionadas de
cevada ...................................................................
122
3.4.1 – Linhagem S
3
A23 ..............................................
122
3.4.2 – Linhagem S
3
A22 ..............................................
130
3.4.3 – Linhagem S
3
B63 ..............................................
137
3.5 – Análise comparativa das linhagens selecionadas e da
cultivar MN-599...................................................................
143
4 – Discussão .....................................................................
149
4.1 – Cultura de anteras de cevada .....................................
150
• Etapa da coleta de espigas e determinação do
estádio de desenvolvimento dos micrósporos/grãos de
150
• Etapa da indução da embriogênese...................
153
• Etapa da regeneração de plântulas verdes
...................
159
• Etapa da regeneração de plantas adultas
.............
........
162
4.2 – Análise citológica da cultivar MN-599 de cevada ...........
165
4.3 – Análise histológica e comparações pontuais com a
análise citológica da cultivar MN-599 de cevada ................
172
4.4 – Análise histológica de linhagens selecionadas (cultivares
de cevada A
-
05 e BR
-
2) ............................................
184
• Linhagem S
3
A23............................................
184
• Linhagem S
3
A22............................................
186
• Linhagem S
3
B63............................................
188
4.5 –
Análise comparativa das linhagens selecionadas e da
cultivar MN-599 ..................................................................
189
5 – Considerações Finais ......................................................
197
6 – Trabalhos Futuros ..........................................................
202
7 – Referências Bibliográficas ................................................
209
x
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, por terem acreditado em mim. Ao Mariath por
ter concordado em trabalhar com embriogênese em cevada, pela confiança e
pela amizade, sem contar os momentos divertidos que passamos juntos. À
Helga por sempre ter confiado em mim, pelo apoio imprescindível em retomar
esse trabalho no doutorado, e também, pela amizade adquirida durante todos
os anos de convivência.
Aos professores que contribuíram para a minha formação, pelos
conhecimentos e incentivo para a realização desse trabalho. Gostaria também
de agradecer ao prof. Jarenkow, Coordenador do PPG-Botânica, pela paciência
e disponibilidade, e especialmente aos componentes da banca.
Aos colegas do Laboratório de Anatomia Vegetal (LAVeg) pelo apoio,
amizade e companheirismo, especialmente às “corujas” que em muitas noites
me acompanharam no lab: Alba, Bibi, Diana e Adriano. Todos foram (e ainda
são!!!) especiais para mim: Karen, João, Jaque, Fredi, Ju, Clarice, Alexandra,
Cecília, Rinaldo, Evelise, Rivete, Dani, Marco...
Aos colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCT) e do
Laboratório de Citogenética, ambos do Departamento de Genética.
Agradecimento especial à Sílvia, Mozart, Eliana, Juliana e Eliane.
Aos meus colegas de curso pelos conhecimentos compartilhados e pelas
palavras de carinho, tornando essa etapa muito mais agradável.
À professora Vera Gayeski e ao pessoal do Laboratório da Drosophila,
Departamento de Genética, pela utilização do microscópio estereoscópico.
À minha amiga estatística Norma de Souza pela imprescindível
disponibilidade e carinho dispensados nos momentos da análise estatística.
Muito obrigada pela paciência!!!!
À Denise B. Ramos primeiramente pela nossa grande amizade adquirida
durante os agradáveis dias de trabalho na Cito, e também, pela ajuda na
realização da etapa da análise citológica.
À Lia R. Rodrigues pelas longas discussões sobre o assunto, tanto por
telefone quanto pessoalmente, e também, pela amizade e incentivo.
À Angelita pela paciência, amizade e disponibilidade no auxílio da
formatação da tese, sem contar com as inúmeras ajudas na bibliografia.
Aos funcionários da UFRGS, especialmente aos seguranças Alex e
Marcelo, que sempre se disponibilizaram a me acompanhar nas “famosas
escadarias”. Também, um agradecimento especial ao Sr. Astrogildo,
segurança do Instituto de Informática, pela amizade adquirida. À Dilma pela
correção das Referências Bibliográficas.
Aos funcionários do Bar do Ildo, pela amizade e paciência em me
escutarem.
Às pessoas que me enviaram material para a qualificação: Elci Henz
Franco e Juçara Paranhos, minhas amigas e orientadoras de Santa Maria, e ao
Flávio. Agradeço também ao Prof. Arthur Fett-Neto pelas valiosas explicações
e ao incentivo dos amigos nessa etapa, especialmente a Rose, Lia, e ao
pessoal do laboratório. Agradecimento especial aos professores da banca:
Maria Helena Zanettini, Paulo Luiz de Oliveira e Rinaldo Pires dos Santos, pelas
discussões, valiosas para o meu amadurecimento com relação ao assunto da
tese.
Aos amigos: Diana, Carol, Adriano, Paulo, Anderson, Ednair e Elizete (o
grupo “estrangeiro”), e a TODOS os demais amigos, que sem o apoio deles,
essa tese teria sido mais difícil de ser realizada. Não poderia esquecer de
agradecer à minha “mãe adotiva”, Alba Lins, uma pessoa maravilhosa, que
além de colega de laboratório se tornou mais do que uma amiga, uma
verdadeira “mãe” para mim.
Aos meus pais, Severino e Ereni Mazzocato e meus irmãos, Ana Paula e
Gustavo, que sempre com muito amor e paciência souberam lidar com esse
momento delicado, tentando, como sempre, superar a minha grande ausência.
Não tenho nem palavras..... Muito obrigada por tudo o que fizeram até hoje
por mim!!!!!
À minha família em geral, que teve paciência para entender a minha
ausência. Obrigada pelo amor, pelas orações, pensamento positivo e por
sempre acreditarem em mim.
Ao Flávio pelo amor, confiança, paciência e, principalmente, por me
agüentar nos últimos momentos da tese... Quantas noites mal-dormidas! Ah!
Não poderia esquecer de agradecer também pelos valiosos artigos enviados da
UNICAMP.
À família Pavan, pelo amor, orações e força, fazendo com que eu já me
sentisse inteiramente pertencente a essa família.
À Laize e Telmo, meus primos e amigos, que me deram força e uma
grande ajuda com a bibliografia na USP.
À minha “nova família” Mazzocato, especialmente ao tio Bernardino,
Lívia, Guilherme e Dudu; e aos italianos, meus grandes amigos virtuais: Gian
Domenico, Elio e Giacomo. Ao tio Bernardino meu agradecimento especial,
juntamente com a D. Cecília, por terem me proporcionado várias sextas-feiras
agradáveis e acolhedoras, fazendo com que eu me sentisse em família,
mesmo longe dos meus pais.
Aos meus amigos e colegas do curso de italiano, especialmente aos
professores que foram solidários em relação aos meus atrasos em função da
tese, e às minhas amigas, Maria e Marcelle, que sempre me acompanharam
desde o início, me incentivando em todos os aspectos.
Ao pessoal do Yoga, especialmente ao professor André, amigo que me
consolou em momentos difíceis e me ensinou a viver o presente, e às amigas
Michele Poletto e Silma Rocha (Leni). À Leni também por ter me ajudado a
entender melhor esse lado espiritual, me incentivando, consolando e fazendo
com que eu acreditasse que as coisas acontecem no momento certo. Esse
agradecimento é extensivo aos amigos Weldon, Terezinha, Bruna e Maria.
À família Mariath, sempre tão solidária e paciente comigo. Nunca vou
esquecer aquela tarde do chá inglês.
Aos meus novos amigos...... Em especial à Darlise Brufatto (a Lise!!!),
minha companheira de “tese”, ao Marco Candolo, pela “assistência” no
computador e pela nossa grande amizade, e ao Jonathan Gordon, grande
amigo e incentivador.
À CAPES pela bolsa concedida.
Às agências financiadoras do projeto: CNPq, Fapergs, Convênio
UFRGS/Maltaria Navegantes – AmBev.
A todas as pessoas que de uma forma ou de outra contribuíram para a
realização dessa tese.
xii
RESUMO
A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode
ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides
férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente
trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do
micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare).
Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de
anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da
indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in
vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação
com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas,
por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota
embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de
regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro
as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens
selecionadas da cultivar A-05 (S
3
A22 e S
3
A23), e da cultivar BR-2(S
3
B63 e,
apenas na cultura de anteras, S
3
B61), bem como da cultivar MN-599 (não-
selecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias,
duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início
do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas
multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e
incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram
secionados longitudinalmente com 3 µm de espessura. Para as análises
citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas
sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à
baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três
anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o
cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e
estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas
após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve
diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN-
599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que
desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos
xiii
embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a
linhagem S
3
A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os
embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S
3
B63 não apresentou
embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa
linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a
formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da
cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as
cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses
resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa
da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e
grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2
o
dia
de cultivo in vitro) até o final (34
o
dia), foram observados micrósporos, o
mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen
multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro,
em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do
cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3
o
dia, enquanto que
os multicelulares a partir do 4
o
dia de cultivo. As estruturas multicelulares
foram observadas a partir do 8
o
dia. A quantidade e o tamanho das estruturas
multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do
14
o
ao 20
o
dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da
proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22
o
dia (cultivar MN-
599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da
antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras.
Para as linhagens, a partir do 18
o
dia foram observadas estruturas
multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares
permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2.
MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário
adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior
número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as
linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário
para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos
mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo
observados mais cedo na linhagem S
3
A22 e S
3
A23, do que na cultivar MN-599.
xiv
ABSTRACT
The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can
be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained
from single anthers established in vitro is evaluated. The present work
pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen
embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the
improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses
of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the
induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with
strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for
divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to
green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green
plant regeneration (strains S
3
A22 and S
3
A23 selected from cultivar A-05) or
worse response to induction and better to green plant regeneration (S
3
B63
and S
3
B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from
cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were
cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of
the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro
culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA,
dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The
blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3µm thick sections. For
the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other
from the middle and another from the top of each just collected spike. After
the low temperature (5
o
C) pretreatment, but before in vitro culture, three
anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples
were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture,
three anthers were fixed – until the 18
th
day. Anthers and multicellular
structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and
transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between
in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in
their initial production of embryogenic structures, but the total, final
production did not differ. But differences were observed between cultivar MN-
599 and strain S
3
A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well-
xv
differentiated embryos, but embryos of strain S
3
A22, besides in smaller
number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically
analyzed samples of strain S
3
B63. However, considering that another sample
of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can
propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after
34 days in culture. One should emphasize that significant differences were
found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation.
These results indicate that selection was more efficient for the plant
regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro
culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first
sample of histological analyses (2
nd
day of in vitro culture) until the last one
(34
th
day in culture), microspores were always present; the same was
observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were
observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two
controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated
grains were observed, in culture, from the 3
rd
day on. Multicellular were
present in vitro culture from the 4
th
day on. Multicellular structures were first
observed at 8
th
day. Multicellular structures varied in number and size at
different samples of histological analysis, reaching the largest size from the
14
th
to the 20
th
day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses.
From the 22
nd
day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of
multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and
predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the
18
th
day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed.
The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four
classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem;
3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The
largest class was that of amorphous structures, when compared with the
remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and
the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos
formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of
cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain
S
3
A22 and S
3
A23; however these strains produced embryos earlier than the
cultivar.
1
CONSIDERAÇÕES PRELIMINARES
A tese foi escrita na forma tradicional devido ao interesse em
manter o registro dos detalhes das análises, bem como da ordem
cronológica das etapas do trabalho, visando futuras pesquisas
complementares. Para tanto, é importante ressaltar que para a
posterior publicação dos artigos científicos o texto será reformatado de
acordo com as normas da(s) revista(s). As estampas estão configuradas
conforme a formatação da(s) revista(s) pretendida(s) para a publicação
de cada etapa do trabalho, o que agilizará a publicação dos artigos
resultantes da tese.
2
1 - INTRODUÇÃO
3
1.1 – Caracterização da espécie e subespécies de
cevada
A cevada pertence à tribo Triticeae da família Poaceae. O gênero
Hordeum é reconhecido como um grupo monofilético, sendo composto
por 32 espécies, incluindo diplóides, tetraplóides e hexaplóides, com um
número básico de sete cromossomos (Bothmer, 1991; Bothmer et al.,
1995). Essas espécies incluem formas anuais, perenes (constituem a
maioria), autógamas e alógamas, que habitam a maior parte das áreas
temperadas, nos hemisférios norte e sul, estendendo-se às áreas
subtropicais na América do Sul (sul do Brasil, Uruguai, Argentina e
Chile), regiões árticas na América do Norte e Ásia Central. Algumas
espécies ocorrem a mais de 4500 metros acima do nível do mar, nos
Andes e Himalaia. A maior concentração de espécies encontra-se no sul
da América do Sul, com 17 espécies nativas (Bothmer et al., 1995).
A única espécie cultivada do gênero, Hordeum vulgare L., é
diplóide com 2n=2x=14 cromossomos, monóica, autógama e
constituída por duas subespécies, vulgare e spontaneum. Hordeum
vulgare L. ssp. vulgare inclui todas as formas cultivadas, enquanto a
outra é constituída pelas cevadas selvagens, interférteis com as da ssp.
vulgare (revisão em Minella, 1999). A subespécie Hordem vulgare L.
ssp. vulgare foi domesticada de raças selvagens de Hordeum vulgare L.
ssp. spontaneum, não ocorrendo barreira reprodutiva entre elas.
A cevada cultivada é anual e de autopolinização. As
inflorescências (espigas) são formadas por uma sucessão de espiguetas,
que formam tríades ligadas ao nó da raque, de maneira oposta dística,
em cada lado da raque (Figura 1). Nas cevadas com duas fileiras de
espiguetas, as flores laterais de cada tríade de espiguetas são inférteis;
na cevada de seis fileiras de espiguetas, todas as flores das tríades de
espiguetas são férteis.
4
5
As espiguetas consistem de lema e pálea, sendo esta tão longa
quanto ou muito mais reduzida que o corpo da lema (Bothmer &
Jacobsen, 1985).
Esta cultura é originária do Oriente próximo (Dunwell, 1986),
onde foram encontradas evidências arqueológicas de cevadas de duas
fileiras de espiguetas e grãos cobertos, de mais de 8000 anos atrás. Foi
introduzida com sucesso nas Américas, no século XVI (Hancock, 1992).
Segundo Harlan (1976), todas as formas selvagens de Hordeum
são espécies com espigas de duas fileiras de espiguetas. Sob
domesticação, há mais de 8.000 anos, apareceram cevadas de seis
fileiras de espiguetas, em que todas as três espiguetas, de cada nó,
produzem grãos.
De acordo com Hancock (1992), entre as formas cultivadas há as
que possuem seis fileiras ao invés de duas fileiras de espiguetas, são
portadoras de uma única mutação recessiva (vv), podendo apresentar
também um gene recessivo (n) que permite que as cascas dos grãos
sejam facilmente removidas. A cevada de grão nu é mais aceitável
como alimento humano, sendo essas cultivares as preferidas nas
regiões onde a cevada faz parte da dieta alimentar (Harlan, 1976).
Este cereal é considerado uma cultura de estação fria, de ciclo de
vida curto e de grande capacidade reprodutiva, sendo mais facilmente
adaptado, que a maioria dos cereais, a grande amplitude de ambientes
em função dessas características (Brown, 1983; Dunwell, 1986).
Apesar da cevada cultivada apresentar um grande potencial
adaptativo, ela é extremamente sensível à presença de alumínio (Al
3+
)
no solo, o qual tem levado a uma severa limitação da produção dessa
cultura no Brasil, onde níveis tóxicos do metal ocorrem em mais de
50% das áreas agriculturáveis (Olmos & Camargo, 1976).
6
1.2 - Importância econômica da cevada cultivada
A cevada foi uma das primeiras plantas domesticadas para a
alimentação humana, sendo o cereal mais antigo em cultivo (revisão
em Minella, 1999). É hoje a quinta maior cultura mundial e a quarta
cultura entre os cereais (Hancock, 1992), com média anual de,
aproximadamente, 170 milhões de toneladas (FAO, 1995), quantidade
que vem sendo mantida (Minella, 1996). Em termos mundiais, seu uso
principal é na alimentação animal, como grão forrageiro, pastagem,
feno e silagem. O segundo maior uso é na produção de malte,
consumindo cerca de 20 milhões de toneladas anualmente. A
alimentação humana representa o terceiro maior uso, sendo consumida
na forma integral, de malte ou de farinha (revisão em Minella, 1999).
No Brasil, a quase totalidade da produção serve de matéria-prima para
obtenção de malte para produção de cerveja.
Entretanto, a quantidade que é produzida no país é insuficiente
para a demanda da indústria cervejeira, o que tem levado à importação
do produto, sendo o Brasil considerado o segundo maior importador de
malte do mundo (Minella, 1996). Em virtude de sua ampla adaptação
ecológica, sua utilidade como alimento humano e animal e
superioridade do seu malte para obtenção de cerveja, a cevada vem se
mantendo entre os grãos mais produzidos desde os primórdios da
agricultura (Poehlman, 1985).
No Brasil, desde o início, a produção comercial desse cereal tem
sido quase exclusivamente para consumo na indústria cervejeira, que
busca a melhora da qualidade do malte, o que inclui a exigência de
baixas concentrações de proteínas nos grãos (não maior do que 10 a
12%), ao contrário da exigência para o consumo na alimentação, que
deve ter alta porcentagem de proteína nos grãos de cevada. Mais
recentemente, algumas instituições de pesquisa, especialmente o IAC
7
(Instituto Agronômico de Campinas), iniciaram melhoramento de
cultivares de cevada para a alimentação (Castro et al., 1995).
O melhoramento da qualidade nutricional da cevada vem
recebendo grande atenção. Foram descobertos genes que influenciam a
quantidade e a qualidade de proteína, pois a eficiência de conversão do
grão e a sua digestibilidade para o animal são consideradas críticas.
Ênfase maior está sendo dada à pesquisa em busca de resistência
genética a diversos patógenos da cevada (Harlan, 1976).
A falta de competitividade com outros grãos, como por exemplo o
milho, faz com que a produção da cevada para outros fins não seja
consolidada (Minella, 1999).
1.3 - Melhoramento da cevada
Um dos aspectos de grande importância no melhoramento da
cevada é o estudo da tolerância ao alumínio, já que a cevada é
considerada extremamente sensível a esse metal, como citado
anteriormente.
Echart (2001) detectou a existência de um único gene de
tolerância ao Al
3+
na cultivar de cevada FM-404, ligado ao marcador de
RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição),
Xwg464 a 21,6cM de distância (cM: centimorgan: unidade de distância
relativa entre genes ligados). O marcador de Al
3+
encontra-se no braço
longo do cromossomo 4 da cevada, confirmando a localização do gene
de tolerância ao Al
3+
neste cromossomo, realizada anteriormente por
Kleinhofs et al. (1993). Com isso, pode ser realizado melhoramento
assistido (com o uso de marcadores moleculares) para a obtenção de
cultivares superiores, adaptadas aos nossos solos.
Um aspecto que dificulta o melhoramento da cevada é que a
variabilidade do germoplasma é bastante restrita, pois a maior parte
8
das cultivares brasileiras é geneticamente semelhante por parentesco
(Maris, 1992), o que também ocorre em nível mundial (Peeters, 1988;
Luizzi & Castro, 1991). Como há necessidade de melhoramento
contínuo das cultivares para adaptá-las a novas condições ambientais,
inclusive de ocorrência de pragas e moléstias, essa séria limitação da
variabilidade no germoplasma da cultura traz grandes dificuldades à
obtenção de novas cultivares.
Uma das técnicas que vem auxiliando o melhoramento genético
da cevada é a da cultura de anteras. Embora as principais instituições
brasileiras que realizam melhoramento genético da cevada, utilizem
técnicas de biotecnologia, como a cultura in vitro de anteras, esta
técnica certamente necessita de aperfeiçoamento para aumentar sua
eficiência, que ainda pode ser considerada baixa.
A cultura de anteras, uma das técnicas de grande utilidade para o
melhoramento de gramíneas de autopolinização, como é o caso da
cevada, envolve a cultura in vitro de anteras de plantas F
1
de
cruzamentos controlados, com a conseqüente obtenção de plantas
duplo-haplóides. Em cevada, a taxa de duplicação espontânea dos
cromossomos, em geral, é superior a 50%. A principal vantagem dessa
técnica é a redução do tempo para o lançamento de uma nova cultivar,
principalmente devido ao grande aumento da eficiência na seleção de
combinações genéticas desejadas, presentes nos micrósporos de
plantas F
1
ou qualquer geração segregante de cruzamentos
intercultivares. No método convencional de melhoramento, essas
combinações são facilmente desfeitas com a segregação ao longo das
numerosas gerações de seleção.
3lu5eimento /Fts com 2Pvesfeiom c 10.4355 Tw (hn16hor.ni-21.1 0. tas cs aj2uooraui9 1l1Tw aame-22.5 ToC276i85mtivasot(nu3at7rlevad03 Tc 0 Tw (1) TjPm 2Pvesfeio22efos) 6%cs aj2ul5Tc (1)plantas )p52s24..,vesfeio22eT374enthNo4opaumee.w (hn16hor.ni5 T48,2as com a3i(m ) Tj,vesfeio75 na seleçr.ni5 T48,2as com a3rasilei.28c 0.5445ag7a sel47elan0.884nt) Tj382.5 0e9ol Torate2 e0 TD 0 276n0.884nt
9
de Bebidas das Américas), com a qual as equipes da UFRGS (Instituto
de Biociências e Faculdade de Agronomia) colaboram, e a FAPA
(Fundação Agronômica de Pesquisa do Paraná). Atualmente, são esses
os grupos de pesquisa que estão trabalhando diretamente com o
melhoramento da cevada cervejeira no Brasil. Em Campinas – SP, o IAC
(Instituto Agronômico de Campinas) possui um grupo de pesquisadores
dedicados ao melhoramento de cultivares de cevada para a alimentação
(Castro et al., 1995).
Dentre as formas de melhoramento existentes, podem ser
citadas: melhoramento clássico (convencional), melhoramento a partir
da produção de plantas haplóides e também envolvendo transferência
de DNA exógeno.
Nesta tese será tratada somente a técnica da produção de
haplóides via cultura de anteras.
1.4 – Produção de plantas haplóides via cultura de
anteras
Haplóides (monoplóides) são organismos ou células que possuem
somente um conjunto completo de cromossomos (n) ou um genoma
(Snustad et al., 1997).
Os organismos haplóides são desejáveis por duas razões:
mutações induzidas são todas prontamente detectáveis e, por
duplicação de seus cromossomos, com colchicina, por exemplo, obtêm-
se diretamente indivíduos homozigotos para todos os genes (Nitsch &
Nitsch, 1969).
Portanto, a produção de haplóides com novas combinações
desejadas, em alta freqüência, é de grande valor para melhoristas e
geneticistas, por ser a forma mais rápida de avançar em linhagens
10
selecionadas para completar a homozigose e aumentar a eficiência da
seleção (Snape & Simpson, 1981).
Os haplóides podem ocorrer espontaneamente na natureza ou
serem induzidos experimentalmente, por várias técnicas, dentre as
quais pode ser citada a cultura de anteras in vitro (Bajaj, 1983).
A técnica de cultura de anteras, basicamente, consiste em
estimular, através do cultivo in vitro, em meio de cultura com
composição química especial (que inclui sais minerais, vitaminas e
fitorreguladores adequados), o micrósporo ou o grão de pólen jovem a
dividir-se continuamente, formando calos embriogênicos ou embriões.
Dessa forma, a cultura de anteras apresenta-se como uma
ferramenta alternativa em relação ao melhoramento genético
convencional, permitindo o desvio da rota gametofítica (que forma o
grão de pólen) para a esporofítica (onde um pólen jovem retoma as
divisões mitóticas podendo formar um embrião).
Tanto micrósporos quanto gametófitos (grãos de pólen jovens)
podem ser estabelecidos in vitro para indução da embriogênese. Os
micrósporos geralmente ingressam na microgametogênese por meio de
uma divisão celular típica (assimétrica) ou atípica (simétrica), como um
passo inicial para a embriogênese. Nos gametófitos, a embriogênese
pode partir de divisões da célula vegetativa, generativa ou de ambas
(Pretová et al., 1993).
O primeiro protocolo de cultura de anteras de cevada foi
desenvolvido pelo pesquisador alemão D. Clapham (1971, 1973). Este
pesquisador observou que os micrósporos davam origem a calos que
regeneravam plantas numa freqüência muito baixa e, em grande parte,
albinas. Posteriormente, Foroughi-Wehr et al. (1976) trabalhando com
diferentes variedades de cevada, em diferentes épocas do ano,
verificaram que o genótipo e o estado fisiológico da planta doadora
eram de grande importância para o sucesso do estabelecimento do
cultivo in vitro.
11
A partir dos trabalhos pioneiros citados acima, a viabilidade da
aplicação da cultura de anteras em cevada ficou evidente, sendo
desenvolvidos numerosos estudos, inclusive no Brasil (Stival, 1995;
Assmann, 1996; Assmann & Winge, 1996; Silva et al., 1997 e 2000) no
sentido de aumentar a eficiência da técnica. Na Figura 2 é apresentado
um esquema das etapas da cultura de anteras de cevada in vitro
(Assmann, 1996).
Embora atualmente existam protocolos de cultura de anteras
estabelecidos para a cevada, o processo da embriogênese do
micrósporo e do grão de pólen ainda não está adequadamente
elucidado, limitando o controle das respostas das anteras cultivadas in
vitro, principalmente no que diz respeito à eficiência da regeneração de
plantas verdes.
Esse processo permite a formação de uma planta haplóide
(Raghavan, 1987) ou duplo-haplóide (Croughan, 1995) a partir de um
micrósporo ou de um grão de pólen imaturo.
A cultura de anteras já foi empregada para a obtenção de calos,
embrióides e plantas em mais de 247 espécies, 88 gêneros e 34
famílias. Entretanto, a pesquisa referente ao desenvolvimento de
técnicas eficientes de cultivo in vitro de anteras restringe-se a algumas
espécies de interesse comercial, como é o caso do fumo, do trigo, da
cevada, do milho etc. (Peters et al., 1999).
McKone & Halpern (2003) definem a androgênese como um modo
de reprodução em que a progênie possui material genético nuclear
oriundo somente do genitor masculino. Esses autores relatam que o
referido processo foi demonstrado in vivo em três tipos de organismos:
Corbicula (Corbiculidae, Bivalvia, Mollusca) e Bacillus (Insecta, ordem
Phasmatoptera), do reino animal e Cupressus dupreziana, uma espécie
vegetal lenhosa.
12
Figura 2 – Esquema das etapas da cultura de anteras de cevada in vitro
(Assmann, 1996).
13
A “embriogênese do micrósporo”, “embriogênese do pólen” ou
“embriogênese haplóide” (Raghavan, 1987) é o processo pelo qual
micrósporos ou grãos de pólen imaturos até o estádio bicelular mudam
irreversivelmente o padrão de desenvolvimento gametofítico para o
esporofítico, originando plantas maduras com número cromossômico
gamético (Góralski et al., 1999).
Portanto, a partir do termo encontrado em maior número de
citações na literatura para descrever esse evento, “androgênese”,
decidiu-se utilizar um termo mais apropriado, onde estariam
representados tanto os micrósporos como os grãos de pólen jovens, já
que a separação de uma fase e outra é muito tênue, ainda mais quando
se faz o cultivo das anteras in vitro. Por esse motivo são encontrados
vários trabalhos na literatura onde há confusões em reconhecer e
discernir a geração esporofítica da gametofítica. Desse ponto em diante
será abordada a “androgênese” como “embriogênese do micrósporo e
do grão de pólen”.
A embriogênese do micrósporo e do grão de pólen foi
primeiramente demonstrada por Guha e Maheshwari (1964, 1966) em
cultura de anteras de Datura innoxia, em que foram produzidas plantas
haplóides.
Há duas técnicas para a produção de plantas haplóides: cultura de
anteras e cultura de micrósporos e/ou grãos de pólen isolados. No
momento em que se estiver realizando cultivo in vitro de micrósporos,
podemos estar incluindo grãos de pólen imaturos, uma vez que há
variação nos estádios de desenvolvimento dentro da mesma antera e
principalmente entre as anteras da mesma espiga.
Nos últimos anos, a cultura de micrósporos e de grãos de pólen
imaturos isolados vem despertando grande interesse da maioria dos
pesquisadores por se tratar de uma técnica mais eficiente com relação à
cultura de anteras. Os embriões formados certamente terão uma única
origem, ao contrário da cultura de anteras que, em algumas espécies,
14
ocorre proliferação de origem esporofítica (Rodrigues et al., 2004).
Rodrigues et al. (2005) relatam que para a soja, Glycine max (L.)
Merril, os embriões obtidos tiveram origem unicelular, a partir da
epiderme e da camada média, ou multicelular, do conectivo da antera.
Em cevada, vários trabalhos já foram realizados mostrando a eficiência
da técnica de cultivo de micrósporos isolados (Kasha et al., 2001a;
Kasha et al., 2001b; Ritala et al., 2001), inclusive no caso de genótipos
considerados recalcitrantes (Li & Devaux, 2001).
Com relação à cultura de anteras de cevada, numerosos trabalhos
foram realizados nesse sentido, com cultivares de primavera e de
inverno, principalmente nas do hemisfério norte, entre os quais podem
ser citados: Dale (1975); Dunwell et al. (1987) e Hoekstra et al.
(1992).
No Brasil, como em outros países, trabalhos foram realizados
visando o estabelecimento de procedimentos que aumentem a eficiência
da técnica de cultura de anteras de cultivares de cevada, podendo ser
citados os de Stival (1995), Assmann (1996), Assmann & Winge
(1996), Mazzocato et al. (1998), Silva et al. (1997; 2000).
A resposta da embriogênese do micrósporo e do pólen é afetada
por vários fatores, como a vitalidade das plantas doadoras, por ser um
fator fundamental para a obtenção de bons resultados na cultura de
anteras (Hoekstra et al., 1992). Outro fator importante para a obtenção
de respostas positivas em cultura de anteras é o tempo de duração do
pré-tratamento, principalmente à baixa temperatura (Huang &
Sunderland, 1982).
A composição do meio de cultura afeta de modo relevante a
resposta da embriogênese. Além disso, diversos trabalhos têm
mostrado interação entre o meio de cultura (composição) e o genótipo
das plantas (cultivares) (Olsen, 1987; Hoekstra, 1992; Assmann, 1996;
Assmann & Winge, 1996).
15
Ainda, Szarejko & Kasha (1991) relataram que a baixa eficiência
da regeneração de plantas verdes, o albinismo e o forte efeito genético
atuando sobre as respostas do material in vitro, são os maiores
problemas para a cultura de anteras de cevada.
1.5 – Desenvolvimento do micrósporo e do grão de
pólen
As flores são compostas por três principais conjuntos de órgãos
apendiculares: o perianto (apêndices externos de proteção e, ou,
atração de polinizadores), o androceu e o gineceu (Mariath et al.,
2003).
Em decorrência do assunto da tese, será abordado somente o
caso do androceu.
O androceu compreende o conjunto de estames da flor. Os
estames estão, freqüentemente, diferenciados em antera e filete. Em
geral, os estames têm como principal função, a produção de esporos
(andrósporos, ou também, micrósporos) (Mariath et al., 2003).
A rota esporofítica, como o nome sugere, formará esporos
(micrósporos) no final do processo, sendo, portanto, conhecida também
como androsporogênese ou microsporogênese. As células-mãe de
micrósporos (2n) são formadas durante o desenvolvimento dos estratos
parietais da antera, mais precisamente pelo tecido esporogênico.
Durante o início da prófase meiótica ocorre um depósito de calose
entre a plasmalema das células-mãe e a parede original dessas células.
É importante enfatizar que, mesmo com esse depósito, ainda é mantida
a comunicação celular, pois conexões citoplasmáticas atravessam a
calose. Antes de ocorrer a meiose II, as conexões desaparecem
resultando no isolamento das tétrades dentro do lóculo da antera
(Mariath et al., 2003).
16
Após, a parede de calose é dissolvida, ocorrendo a liberação de
16
17
1.6 – Rotas alternativas do micrósporo e do grão
de pólen
Na formação dos grãos de pólen, em seu processo usual, logo
após a meiose, o micrósporo sofre uma divisão mitótica assimétrica,
dando origem ao grão de pólen com duas células de dimensões
desiguais, a célula generativa e a célula vegetativa. Normalmente a
primeira das duas células divide-se novamente formando os gametas
masculinos: um que fecundará a oosfera e o outro, a célula-média
(Bhandari, 1984). Segundo Raghavan (1987), a divisão assimétrica
inicial desencadeia uma série de eventos bioquímicos diferentes nas
duas células filhas, determinando que sigam rotas de diferenciação
divergentes e tenham destinos diferentes.
Entretanto, muitas angiospermas, em especial as gramíneas,
podem seguir programas alternativos com divisões continuadas que
conduzem à formação de estruturas embriogênicas, que podem, se
cultivadas em meio adequado, gerar plântulas verdes, haplóides. O
cultivo in vitro de anteras ou micrósporos e/ou grãos de pólen isolados,
utilizando meio de cultura com composição adequada, atua como
estímulo para iniciar uma rota alternativa de eventos. Pré-tratamento
com baixas temperaturas, antes das anteras de cevada serem
estabelecidas em meio de indução, tem sido relatado como essencial ao
ingresso em rota alternativa (Wilson et al., 1978). Outros tipos de pré-
tratamento também são utilizados, como por exemplo, o manitol, e
também, altas temperaturas aplicadas em anteras de dicotiledôneas.
Na literatura, são relatadas quatro rotas principais de
desenvolvimento de embriões a partir de micrósporos e grãos de pólen
(Figura 3), sendo aqui descritas segundo Sunderland & Dunwell (1974)
e Bhojwani & Razdan (1983):
18
ROTA I ð o micrósporo sofre uma divisão simétrica cujas duas
células-filhas idênticas, com características do tipo vegetativo,
contribuem para o desenvolvimento do esporófito haplóide.
ROTA II ð nessa rota, a primeira divisão mitótica e a
diferenciação são as usuais. Porém, a célula generativa não é funcional
e degenera rapidamente ou após uma ou duas divisões. Apenas a célula
vegetativa participa da formação do embrião. Esse modo de
desenvolvimento foi relatado para várias espécies, por diversos autores,
como por exemplo, em cevada por Clapham (1971), sendo
posteriormente confirmado por Sunderland et al. (1979).
ROTA III ð nessa rota, a primeira divisão mitótica e a
diferenciação das duas células resultantes é a usual. Contudo, nesse
caso, a embriogênese se dá somente com a contribuição da célula
generativa.
ROTA IV ð a primeira divisão é assimétrica e ambas as células,
vegetativa e generativa, continuam a dividir-se e participam do
desenvolvimento do embrião.
Independentemente do padrão inicial de segmentação, tendo
ingressado na rota embriogênica, o pólen ou micrósporo sofre divisões
tornando-se multicelular (Bhojwani & Razdan, 1983) e resultando,
futuramente, em uma planta.
19
Figura 3 - Esquema das principais rotas do desenvolvimento do micrósporo e
do grão de pólen in vitro, mostrando a embriogênese direta e a indireta, sendo
que a última passa pela fase de calo antes de formar a planta (Bhojwani &
Razdan, 1983).
20
Além da existência documentada de quatro rotas de segmentação
do micrósporo e do grão de pólen, anteriormente relatadas, sabe-se
atualmente que existem várias rotas de diferenciação que podem ser
derivadas das quatro anteriormente descritas, resultando em vários
padrões de diferenciação, como no caso proposto para cevada por Chen
et al. (1984). Na verdade, devido aos poucos estudos na área da
embriologia vegetal, não se tem confirmação de quantas rotas são
possíveis e quais delas são efetivamente embriogênicas.
Os primeiros estudos para investigar a origem dos embriões
haplóides mostraram que, em Nicotiana e Datura, dentre a população
de grãos de pólen de uma antera, alguns possuíam dois núcleos
idênticos devido à divisão simétrica, sendo estes potencialmente
embriogênicos (Norreel, 1970). Desde então, vários trabalhos têm
mostrado uma correlação entre a freqüência da primeira divisão
simétrica e a freqüência de embriões haplóides, sugerindo que esse tipo
de mitose seria um sinal reconhecido pela célula para ativar o programa
esporofítico (Grando & Moraes-Fernandes, 1997).
Ainda com relação à Figura 3, na segunda parte, é mostrada a
embriogênese direta e a indireta, sendo que a última passa pela fase de
calo antes de formar uma plântula. Essa etapa de diferenciação é
importante para a obtenção de plantas haplóides ou duplo-haplóides.
1.7 - Citologia dos micrósporos e grãos de pólen de
cevada
Assim como em outras espécies vegetais, por exemplo, Glycine
max (Kaltchuk-Santos et al., 1993) e Nicotiana tabacum L. (Horner &
Street, 1978; Heberle-Bors, 1982), também foi registrada em cevada
(Dale, 1975; Roberts-Oehlschlager & Dunwell, 1991) a ocorrência de
dimorfismo do micrósporo e andrófito (grão de pólen). São descritas
21
subpopulações de grãos de pólen, conhecidos como “pólen-p” ou
“pólen-s”, caracterizados por serem pequenos, corarem pouco e
apresentarem retardo no desenvolvimento, sendo a primeira mitose
simétrica (Dale, 1975).
Embora a freqüência desses grãos varie com o genótipo, com as
condições ambientais de desenvolvimento e com a aplicação de
gametocidas na meiose, a freqüência de “pólen-p” em cevada é menor
que 2%. Essa observação foi realizada por R. E. Jenkins (1987), da
Universidade de East Anglia – Inglaterra, em sua tese de doutorado. De
forma semelhante, Roberts-Oehlschlager & Dunwell (1991)
encontraram grãos de pólen multicelulares de aproximadamente oito
células numa freqüência entre 5-6% do total da população de grãos de
pólen de cevada, com o mesmo genótipo e crescidos sob condições
similares aos do trabalho citado anteriormente.
O comportamento dos grãos de “pólen-p”, especialmente a sua
divisão mitótica simétrica, levou vários autores a sugerirem que esses
grãos dariam origem aos embriões haplóides obtidos em cultura.
Roberts-Oehlschlager & Dunwell (1991) analisaram, por
microscopia eletrônica de varredura, os eventos iniciais da
embriogênese em anteras de cevada cultivadas in vitro, confirmando
indicações de outros autores de que os grãos de “pólen-p” localizavam-
se na parte central das lojas, e não em contato com o tapete,
explicando assim a forma sempre arredondada e seu tamanho menor,
por deficiência de nutrição. Por outro lado, esses autores observaram
que a maioria dos grãos que formaram unidades multicelulares – as
estruturas (potencialmente) embriogênicas – eram grãos que estavam
em contato com o tapete, e não apenas os “pólens-p”. Os referidos
autores, no entanto, parecem apoiar a sugestão de Dunwell (1985) de
que mesmo que os grãos de “pólen-p” não sejam os únicos
potencialmente embriogênicos, eles poderiam servir como marcadores
do potencial embriogênico da espiga.
22
Nesse sentido, Binarova et al. (1997) demonstraram que tanto os
micrósporos quantos os grãos de pólen típicos originaram esporófitos
androgenéticos in vitro.
Atualmente, são encontrados poucos registros sobre “pólen-p” na
literatura e, quando observados nas análises, os mesmos são descritos
como ocorrendo em baixa freqüência, como é o caso da cevada
(Ramos, 2003). Talvez, isso se deva ao fato de que, quando são
realizadas análises conjuntas, cito- e histológicas, seja minimizado o
possível “erro” na interpretação dos tipos morfológicos de micrósporos e
grãos de pólen observados no decorrer das análises.
1.8 – Histologia da antera
Numerosos estudos desse órgão já foram e vêm sendo realizados,
como por exemplo, Oliveira & Mariath (2001) que estudaram o
desenvolvimento da antera e pólen in vivo em Anacardium occidentale
L. Estudos como esse são necessários para que se conheça a anatomia
da antera e para possibilitar posteriores análises aplicadas em espécies
de interesse agronômico e comercial, como nesse caso, onde o estudo
realizado foi utilizado como base para programas de biotecnologia em
A. occidentale.
Como não foram encontradas descrições na literatura do
desenvolvimento da antera de cevada in vivo, optou-se por utilizar o
padrão histológico das monocotiledôneas, que é o caso da cevada,
exemplificado aqui pela Oryza sativa L., o arroz.
Raghavan (1988) descreve o desenvolvimento da antera de arroz
desde os estádios iniciais, relatando que esse órgão possui uma forma
cilíndrica a ovóide. Em seção transversal observou que a antera consiste
de uma massa de células meristemáticas circundada por uma camada
bem definida de células isodiamétricas, constituindo a epiderme. Células
23
da camada subdérmica, localizadas nas regiões dos lobos da antera em
formação, dividem-se periclinalmente dando origem a célula parietal
primária em direção à periferia da antera e iniciais esporogênicas em
direção ao interior. A camada parietal primária se divide periclinalmente
formando o estrato parietal secundário externo e o secundário interno.
A camada parietal secundária interna divide-se e produz a camada
média e o tapete, enquanto que a externa forma o endotécio.
Com o estabelecimento dos estratos parietais, as iniciais
esporogênicas sofrem duas divisões mitóticas ortogonais para formar
quatro células cada, constituindo o tecido arquesporial ou tecido
esporogênico. É estimado que cada um dos quatro lobos de uma antera
de arroz contenha aproximadamente 60 microsporócitos. A antera,
posteriormente, sofre uma expansão radial e um alongamento,
separando os microsporócitos em posições características nas quatro
lojas. Deposições subseqüentes de calose ocorrem na parede radial dos
microsporócitos e nos lados voltado para o tapete. Os microsporócitos
completam a divisão meiótica rapidamente, mas pode ser observada a
formação de parede celular no final da meiose I e outra é formada em
cada díade no final da meiose II, caracterizando o tipo sucessivo de
citocinese de formação das tétrades (Raghavan, 1988). Os eventos
posteriores já foram descritos em item anterior (maiores detalhes ver
item 1.5).
O filete, haste que liga a antera ao receptáculo e parte
constituinte do estame, possui um único feixe vascular em,
aproximadamente, 95% das angiospermas (Wilson, 1942). Em mono- e
dicotiledôneas é, freqüentemente, anficrival ou ainda colateral com
floema, geralmente envolvendo o xilema numa extensão considerável
(também chamado de feixe hemianficrival) (Schmid, 1976).
24
1.9 - Estudos histológicos em órgãos cultivados in
vitro
Métodos histológicos têm contribuído significativamente para o
conhecimento dos efeitos do cultivo in vitro sobre os processos de
desenvolvimento de micrósporos. Um bom estudo histológico baseado
em mudanças anatômicas e histoquímicas fornece informações sobre os
processos celulares, além de mostrarem indícios que permitem que
sejam formuladas hipóteses para trabalhos futuros (Yeung, 1999).
Estudando a capacidade embriogênica de híbridos entre cultivares
e linhagens brasileiras de cevada, F
1
de 11 cruzamentos, Stival (1995)
e Silva et al. (2000) realizaram análises citológica e histológica de
micrósporos, a partir de amostras semanais até o 25
o
dia de cultivo in
vitro. As estruturas embriogênicas foram observadas ao final do
primeiro mês. Os autores confirmaram a existência de um padrão
esporofítico de desenvolvimento, através de mitoses subseqüentes que
levaram à formação de grãos de pólen multicelulares, em um primeiro
momento e, logo a seguir, à formação de embriões ou de massas
celulares desorganizadas (calos). A análise histológica confirmou a
presença de embriões típicos, identificando estruturas que fazem parte
de um embrião convencional, como por exemplo, o escutelo, o
coleóptilo, a coleorriza e os meristemas apical caulinar e da raiz (Silva
et al., 2000).
Também em cevada, Maraschin et al. (2003 a, b) agregaram
técnicas moleculares e de imunolocalização à tradicional histologia,
demonstrando pela técnica de TUNEL (terminal deoxytransferase [TdT]-
mediated dUTP-X nick end labeling) a apoptose, ou morte celular
programada (PCD), em alguns micrósporos e na epiderme das anteras
pré-tratadas durante quatro dias com solução de manitol. A partir de
seções transversais da antera, foi realizada a imunolocalização das
isoformas da proteína dimérica 14-3-3, altamente conservada,
25
envolvida no controle da apoptose, entre outras funções celulares. Sob
microscopia óptica, os autores verificaram que após o pré-tratamento
das anteras a imunolocalização foi restrita aos micrósporos, indicando a
entrada, na rota embriogênica, pois essas proteínas possuem uma
correlação com a diferenciação dos tecidos na embriogênese.
Em estudo subseqüente, Maraschin et al. (2005) demonstraram o
desenvolvimento da embriogênese de grãos de pólen isolados, através
da microscopia óptica, confocal e microscopia eletrônica de transmissão.
A partir da observação detalhada da morfologia dos grãos de pólen,
verificaram que só são capazes de formar ELSs (estruturas tipo
embrião, embrióides, “embryo-like structures”) aqueles grãos de pólen
que seguiram as divisões mitóticas, formaram estruturas multicelulares
(MCSs) e foram capazes de liberar as ELSs rompendo a esporoderme.
Devido à escassez de abordagens histológicas em estudos sobre a
embriogênese de micróporos e grãos de pólen, decidiu-se relatar alguns
trabalhos com esse enfoque, mas a partir de material obtido através da
embriogênese somática. As analogias entre os processos embriogênicos
são importantes para as comparações no item discussão do presente
trabalho.
Estudos histológicos de embriões somáticos de diferentes
espécies, realizados por vários pesquisadores, descreveram duas
prováveis origens para os embriões: unicelular (Jones & Rost, 1989) ou
multicelular (Taylor & Vasil, 1995).
O primeiro trabalho sobre as evidências detalhadas da
embriogênese somática em cevada foi realizado por Ryschka et al.
(1991), estudando paralelamente o trigo. Foram realizadas análises
histológicas e citológicas, por microscopia eletrônica de varredura,
obtendo-se três rotas de formação dos embrióides: células únicas da
face abaxial da epiderme do escutelo dividiram-se periclinalmente
dando origem a um pró-embrióide bipolar; camada subdérmica
possuindo células únicas com alta atividade de divisão resultando na
26
formação de dois ou mais pró-embrióides, e algumas células
expandidas do meristema pró-vascular do escutelo iniciaram pró-
embrióides com maior ou menor desenvolvimento.
Estudando os eventos morfológicos nos estádios iniciais da
indução de calos de cevada, Oka et al. (1995) realizaram uma
comparação histológica entre os explantes de embriões maduros e
imaturos durante o início da formação do calo e a morfogênese.
Observaram que a origem dos calos regenerados de embriões imaturos
e maduros foi, respectivamente, do escutelo e da folha ou base foliar.
Nonohay et al. (1999), com o objetivo de analisar a origem dos
embriões somáticos em cevada (Hordeum vulgare ssp. vulgare),
realizaram estudos histológicos em escutelos de embriões imaturos
cultivados in vitro. Verificaram que o local de origem do embrião
somático (SSEO) poderia originar-se de uma célula superficial de um
calo, possivelmente com origem unicelular, ou de células epidérmicas e
subdérmicas de um calo, indicando uma origem multicelular. Rotas
alternativas de formação do embrião somático e de aglomerados de
embriões foram sugeridas.
No caso da soja, foram realizados estudos por Kaltchuk-Santos et
al., (1997) para verificar a origem dos embriões obtidos na cultura in
vitro. Os autores relataram a ocorrência de um embrião
“androgenético”, identificado a partir de seções histológicas. Como já
citado anteriormente, em estudo posterior, Rodrigues et al. (2005)
verificou que os embriões de soja obtidos in vitro possuíam origem
somática, oriundos dos estratos da antera.
Nesse sentido, os estudos histológicos, especialmente quando
acompanhados de citológicos, são importantes na medida em que
podem propiciar a análise das etapas de todo o processo de
desenvolvimento, desde as alterações no desenvolvimento usual dos
micrósporos e grãos de pólen e a origem dos embriões, até a formação
da planta, permitindo um melhor entendimento da embriogênese do
27
micrósporo e do grão de pólen em plantas, no caso específico desse
estudo, em cevada.
OBJETIVOS
Este trabalho, que fez parte de um projeto mais amplo, “Genética,
cultura de tecidos e transferência de DNA em plantas: gênero
Hordeum”, e tendo em vista as considerações anteriores, propôs-se a:
• Analisar a embriogênese, em especial a etapa da indução da
rota embriogênica, em genótipos selecionados de cevada;
• Comparar o processo de indução da embriogênese, através de
análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro,
de linhagens selecionadas através da seleção divergente para a
alta ou para baixa resposta na indução da rota embriogênica,
em comparação com a cultivar não-selecionada;
• Analisar e quantificar o tempo necessário para o surgimento de
cada tipo morfológico do processo de embriogênese do
micrósporo e do grão de pólen imaturo através de estudos
citológicos de anteras fixadas a cada três dias após o início do
cultivo in vitro.
28
“O que você pensa, você cria;
O que você sente, você atrai;
O que você acredita, você conquista.”
29
2 - MATERIAL E MÉTODOS
30
2.1 – Material
Foram utilizadas sementes de linhagens selecionadas a partir de
cultivares brasileiras de cevada, Hordeum vulgare L. ssp. vulgare,
recomendadas para plantio na região sul do Brasil. As linhagens e a
cultivar analisadas foram as seguintes:
Linhagens S
3
A22 e S
3
A23 ð selecionadas a partir de sementes da
cultivar A-05, obtida pela então Companhia Antárctica Paulista, hoje
integrante da AmBev (Companhia de Bebidas das Américas). Foram
selecionadas para alta freqüência de indução de embriogênese do
micrósporo e do grão de pólen e baixa freqüência de regeneração de
plantas (plantas verdes);
Linhagens S
3
B61 e S
3
B63 ð selecionadas a partir de sementes da
cultivar BR-2, desenvolvida pela Embrapa – CNPT (Centro Nacional de
Pesquisa do Trigo). Foram selecionadas a baixa freqüência de indução
de embriogênese do micrósporo e do grão de pólen, porém alta
eficiência de regeneração de plantas verdes;
Cultivar MN-599 ð semente geneticamente pura obtida pela
Maltaria Navegantes, hoje integrante da AmBev. Não foi selecionada. As
sementes foram cedidas pela Embrapa – CNPT, do Banco de Sementes
de Cevada.
2.1.1 - Obtenção das linhagens selecionadas
As quatro linhagens de cevada utilizadas no presente trabalho
fizeram parte de um programa de seleção divergente quanto às suas
respostas na indução da embriogênese do micrósporo e do grão de
pólen e regeneração de plantas verdes. A hoje Dra. Eliana M. Assmann,
então integrante de nossa equipe, realizou as duas primeiras gerações
de seleção (S
1
e S
2
) em numerosas linhagens de seleção que, na
geração S
2
, já puderam ser diferenciadas em suas respostas (dados
31
não-publicados). A terceira geração de seleção foi realizada por
Mazzocato (1997) como será apresentado no item 2.2.1, a seguir.
Com base nos resultados obtidos em seu Mestrado, Assmann
(1996) iniciou uma pesquisa de seleção divergente nas respostas
embriogênicas, na indução e na regeneração, de plantas de duas
cultivares de cevada, BR-2 e A-05. Essas plantas e sua descendência
originaram linhagens. Ao final de duas gerações de seleção foram
escolhidas as linhagens da cultivar A-05 que produziram, na cultura de
anteras, elevada resposta na fase de indução de estruturas
embriogênicas, porém baixa regeneração de plantas, especialmente
plantas verdes. Por outro lado, a cultivar BR-2 foi submetida a uma
seleção no sentido inverso, isto é: baixa indução, porém alta eficiência
na regeneração de plantas verdes. A cultivar MN-599, como no trabalho
original de Assmann apresentou respostas intermediárias, tanto na
indução como na regeneração de plantas verdes, não foi selecionada,
portanto, não foram obtidas linhagens a partir dela.
2.2 – Métodos
2.2.1 – Cultura de Anteras de Cevada e 3
a
Geração de Seleção
Durante o período de setembro de 1996 a fevereiro de 1998,
foram obtidos dados, por Mazzocato, A.C., sobre a cultura de anteras
das quatro linhagens e da cultivar de Hordeum vulgare L. ssp. vulgare,
no projeto “Estudos sobre a androgênese em anteras de cevada,
Hordeum vulgare ssp. vulgare, cultivadas in vitro” sob a orientação da
Profa. Dra. Helga Winge do Departamento de Genética – UFRGS.
As quatro linhagens (S
2
A22 e S
2
A23; S
2
B61 e S
2
B63) selecionadas
por Assmann, por duas gerações, juntamente com a cultivar não-
32
selecionada MN-599 foram submetidas à cultura de anteras para mais
uma geração de seleção e a conseqüente avaliação e escolha do
material para os estudos citológicos e histológicos do processo da
embriogênese do micrósporo e do pólen em cevada.
As linhagens e a cultivar (que aqui denominaremos de genótipos)
utilizadas no trabalho foram de cevada com espigas de duas fileiras.
Somente entraram na cultura in vitro as espigas que apresentaram
micrósporos no estádio uninucleado inicial (UI) até grãos de pólen no
estádio uninucleado final (UT).
Com base nos resultados da cultura de anteras (Mazzocato et al.,
1998), foi realizada a terceira geração de seleção divergente, in vitro,
das linhagens sob seleção. A terceira geração de seleção, como descrito
a seguir, seguiu o mesmo método utilizado anteriormente por Assmann
(dados não-publicados).
Foi realizada a seleção das linhagens da cultivar A-05 (gerando as
linhagens S
3
A22 e S
3
A23) que produziram, na cultura de anteras,
elevada resposta na fase de indução de estruturas embriogênicas,
porém baixa regeneração de plantas verdes. Por outro lado, as
linhagens da cultivar BR-2 foram submetidas a uma seleção no sentido
inverso, isto é: baixa indução, porém alta eficiência na regeneração,
originando as linhagens S
3
B61 e S
3
B63. Foram ainda submetidas à
cultura, anteras de plantas não-selecionadas da cultivar MN-599, como
controle.
Coleta das espigas para a cultura de anteras
As espigas foram coletadas, preferencialmente, no mesmo estádio
de desenvolvimento, para que as anteras apresentassem micrósporos e
grãos de pólen no estádio adequado para o cultivo in vitro, ou seja,
entre uninucleado inicial e final, avaliado através dos seguintes
marcadores morfológicos das plantas (Revers, 1993):
33
- distância interlígulas ð distância (cm) entre a lígula da folha
bandeira e a da folha imediatamente abaixo no mesmo afilho
(Figura 4).
- comprimento das aristas emergentes ð parte visível das
aristas da espiga, na maior parte ainda completamente
cobertas pela bainha da folha bandeira.
- altura do afilho ð distância (cm) entre o nó na base do qual sai
a primeira coroa de raízes e a lígula da folha bandeira, no
ápice.
34
não-emergidas. De cada espiga foram fixadas em Farmer (3:1 - etanol
absoluto : ácido acético glacial) (Johansen, 1940), três espiguetas: da
base (B), meio (M) e ápice (A), do mesmo lado (lado 1) da espiga
(Figura 5) para a determinação do estádio de desenvolvimento dos
micrósporos e grãos de pólen (utilizadas também como controle inicial,
controle zero – C0. Ver item 2.2.3 – Análises Citológicas e Figura 6 –
esquema 1: Fixação antes da cultura).
As folhas foram então retiradas, juntamente com cerca de dois
terços do comprimento da parte superior das aristas. Cada espiga foi
então colocada numa placa de petri (9 cm de diâmetro) contendo uma
tira de papel filtro estéril embebida em água destilada também estéril,
para evitar o ressecamento da espiga (Huang & Sunderland, 1982).
Coleta
das
Espigas
Pré-tratamento a 5 °C
Citologia do estádio
de desenvolvimento do
micrósporo e do grão de pólen
Lado 1
Lado 2
A
B
M
Figura 5 – Esquema do pré-tratamento à baixa temperatura de espigas,
coleta e fixação das espiguetas para a determinação citológica do estádio de
desenvolvimento do micrósporo e do grão de pólen (controle zero - C0). Placa
de petri com uma tira de papel filtro úmido e espiga sem as três espiguetas
que foram antes retiradas para a fixação e análise. Local vazio das espiguetas
marcado em azul, do lado 1 da espiga: A – ápice; M – meio; B – base.
35
Pré-tratamento à baixa temperatura
As placas de petri com as espigas desinfetadas externamente
foram seladas com tiras de PVC e colocadas em caixas de papelão, onde
permaneceram no escuro, em câmara fria a 5 °C por 10 dias, segundo
protocolo de Assmann (1996).
Determinação do estádio de desenvolvimento dos
micrósporos e dos grãos de pólen
Enquanto as espigas eram submetidas ao pré-tratamento à baixa
temperatura, uma antera de cada uma das três espiguetas fixadas (A,
M ou B) foi analisada citologicamente.
As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico para a
determinação dos estádios dos micrósporos e grãos de pólen de cada
espiga submetida ao pré-tratamento. Para a confecção de cada lâmina,
uma antera teve uma extremidade cortada e os micrósporos e grãos de
pólen forçados a sair, com auxílio de uma lanceta, sendo corados com
carmim propriônico 0,6%.
As outras duas anteras de cada espigueta foram estocadas para
posterior análise citológica detalhada, constituindo o controle zero (C0),
ou seja, espigas recém-coletadas e sem qualquer tratamento (Ver item
2.2.3 – Análises Citológicas).
Todas as espigas que apresentaram anteras no intervalo de
desenvolvimento dos micrósporos e grãos de pólen entre uninucleado
inicial (UI) e final (UT), foram utilizadas para o cultivo in vitro. O
restante das espigas, ou seja, aquelas que apresentaram alta
freqüência de grãos de pólen em estádios de desenvolvimento mais
avançados que UT (a partir da primeira divisão), foram eliminadas da
amostra.
O estádio de uninucleado inicial (UI) é caracterizado por
apresentar um núcleo central. O uninucleado médio (UM) apresenta um
36
núcleo mais lateral e o uninucleado final (UT), como sendo um grão de
pólen, apresenta vacuolação e um núcleo compacto localizado no pólo
oposto ao poro. O micrósporo (UI) e o grão de pólen (UT) serão
apresentados (em fotos) no subitem dos Resultados: 3.3 - Análise
Histológica da cultivar MN-599 de Cevada, Figura 17 A e B,
respectivamente.
Cultivo in vitro das anteras
a) Meios de cultura
Os meios de cultura utilizados durante todo o trabalho foram
aqueles que, entre os testados por Assmann (1996), modificados de
Hoekstra et al. (1992) mostraram ser os mais eficientes para as
cultivares brasileiras [Tabela 1].
O preparo dos meios foi realizado a partir de soluções estoque,
sendo os mesmos autoclavados a 1,5 atm, a 127 °C de temperatura,
durante 15 minutos sendo, posteriormente, distribuídos em placas de
petri (meios de indução I-3 e regeneração-I) ou tubos de ensaio (meio
de regeneração-II).
b) Indução da embriogênese do micrósporo e do grão
de pólen
Do material submetido ao pré-tratamento de frio e analisado
citologicamente quanto ao estádio de desenvolvimento dos micrósporos
e dos grãos de pólen, 3.870 anteras, de 67 espigas com micrósporos
nos estádios uninucleado inicial a final foram estabelecidas no meio de
37
37
Tabela 1 – Composição dos meios de cultura usados para indução, regeneração-I e regeneração-II
Reagentes Indução [I-3] (mgL
-1
) Regeneração-I [RI-3] (mgL
-1
)
Regeneração-II [RII-3] (mgL
-1
)
NH
4
NO
3
165 165 165
KNO
3
1750 1900 1900
CaCl
2
.2H
2
O 450 440 440
MgSO
4
.H
2
O 350 370 370
KH
2
PO
4
200 170 170
FeNa
2
.EDTA 40 40 40
H
3
BO
4
5 6,2 6,2
MnSO
4
.4H
2
O 15 22,3 22,3
ZnSO
4
.7H
2
O 13,4 11,7 11,7
KI 0,75 0.83 0,83
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 0,25 0,25
CuSo
4
.5H
2
O 0,025 0,025 0,025
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,025 0,025
Ácido Nicotínico 1 1 1
Piridoxina.HCl 1 1 1
Tiamina.HCl 1 1 1
Glutamina 750 750 750
Mio-inositol 100 100 100
Ácido Pantotênico 1 - -
Cloreto de Colina 1 - -
L-Ácido Ascórbico 2 - -
Vitamina B12 0,02 - -
Riboflavina 0,2 - -
Ácido Fólico 0,4 - -
Biotina 0,01 - -
Colecalciferol 0,01 - -
Ácido p-Amino-benzóico 0,02 - -
Caseína Hidrolisada 1000 - -
Maltose 30000 17000 10000
Agarose 6000 6000 8000
Sacarose - - -
ANA 2 0,5 -
Cinetina 0,5 2 -
38
indução I-3 (Assmann, 1996). Inicialmente, cada espiga foi desinfetada
em tubo de ensaio com solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) 3-4%
com adição de Tween 20% (1 gota/100 mL), durante 10 minutos,
seguida de três lavagens com água destilada estéril. O excesso de água
das espigas foi retirado com papel filtro estéril.
Antes das anteras serem plaqueadas, uma espigueta do meio (M),
uma antera da base (B) e uma antera do ápice (A) [do lado 2 da
espiga], foram fixadas em Farmer (ver item 2.2.2 – Análises
Citológicas) [Figura 7 – esquema 1: Fixação antes da cultura in vitro).
Esse material fixado, obtido de todas as espigas que entraram em
cultivo in vitro foi utilizado como controle 1 (C1).
As anteras das demais espiguetas foram cuidadosamente
excisadas com pinça de ponta fina (n
o
5) e colocadas em placa de petri
(9 cm de diâmetro) contendo cerca de 30 mL de meio de indução,
sendo as anteras dispostas em linhas paralelas, ficando as três anteras
da mesma flor mais próximas entre si e mais afastadas das anteras das
flores vizinhas. Foram deixados espaços livres para representar as
espiguetas e anteras coletadas e fixadas nas etapas anteriores
(controles C0 e C1) (ver Figura 7 – esquema 2).
As placas com as anteras em meio de indução foram vedadas com
Parafilm e mantidas a 25 °C, no escuro durante o período da indução.
O delineamento do trabalho envolveu, basicamente, três
abordagens, sendo que a partir desse momento será importante serem
ressaltados os seguintes detalhes (Figura 6):
1
a
abordagem) Cultura de Anteras de plantas da geração S
2
ð
Todas as espigas estabelecidas no meio de indução seguiram até o final
da cultura, ou seja, além da fase de indução, passaram pelas fases de
regeneração-I e II. Esta etapa, como nos demais casos, incluiu os
controles zero e 1 (C0 e C1) para os quais foram fixadas anteras e
espiguetas antes da cultura in vitro. As plântulas produzidas na
39
Figura 6 – Resumo das etapas do trabalho. Duas gerações de seleção para: maior resposta na indução ( ); maior resposta na regeneração
de plantas verdes ( ). As cores representam as etapas: verde – 1
a
etapa; rosa claro – 2
a
etapa; e rosa – 3
a
etapa. *: analisada até 22 dias.
Cultivar
A-05
Linhagem
selecionada S
2
A22
S
3
A22
Cultivar não-
selecionada MN-
599
Cultivar
BR-2
Cultivar
MN-599
Linhagem
selecionada S
2
A23
Linhagem
selecionada S
2
B63
S
3
A23
S
3
B63
MN
-
599
cultura
S
3
B61
plantas
sementes
Cultura de
anteras
Linhagem
selecionada S
2
B61
Análise
Citológica
Amostras
de todas
as
linhagens
e cultivar
MN-599
Coleta e
fixação de
anteras
para a
citologia
Coleta e
fixação de
anteras
para a
histologia
Análise
Histológica
Amostras
de todas
as
linhagens
e cultivar
S
3
A22
S
3
B63
MN-599
S
3
A23 *
40
regeneração foram cultivadas, em casa de vegetação, para produção de
sementes representantes da terceira geração selecionada (S
3
).
Observação: espigas e/ou anteras contaminadas durante a cultura
foram eliminadas;
2
a
abordagem) Coleta e fixação de anteras para análise
citológica ð A análise citológica (“Blocos” – ver figura 7 – esquema 3)
foi realizada na espiga M088 da cultivar MN-599, escolhida pelo número
de anteras semelhante a cada coleta realizada (a cada três dias) [ver
Tabela 2].
3
a
abordagem) Coleta e fixação de anteras para análises
histológicas ð A análise histológica (“Especiais” – ver tabelas 3 e 4) foi
realizada nas espigas A090 (linhagem S
3
A22), B069 (linhagem S
3
B63) e
M094 (cultivar MN-599). As espigas representam plantas que foram
escolhidas com base nas respostas nas fases de indução e regeneração
de plantas verdes.
Com base nos detalhes descritos anteriormente, a partir desse
momento quando forem referidos: exame das anteras, transferência de
estruturas, ou seja, todos os aspectos relacionados às fases da cultura
de anteras, estar-se-á reportando somente à 1
a
abordagem ð Cultura
de anteras até a produção de plantas, pois nas outras duas abordagens
não foram realizadas porque as anteras foram utilizadas para as
análises.
a) Exame das anteras em cultivo
Para as análises histológicas, as anteras foram coletadas e
fixadas, a cada dois dias após o início do cultivo in vitro, e para as
análises citológicas, a cada três dias (Figura 7 – esquema 3)
[Detalhadas nos itens 2.2.3 e 2.2.4].
41
Figura 7 – Esquema de fixação de espiguetas e anteras antes do cultivo in
vitro (1), da distribuição das anteras na placa de cultivo (2) e exemplo da
seqüência de fixação das anteras em cultivo (3) no esquema de “BLOCOS”.
42
Aos sete dias de indução foi contado o número de anteras
estabelecidas in vitro, sendo também verificada a presença ou não de
contaminação.
Aos 21 dias foi feita a contagem do número de anteras
responsivas, ou seja: com estruturas embriogênicas liberadas no meio
de cultura, bem como o número de estruturas embriogênicas com 1
mm ou mais de diâmetro. Essa contagem aos 21 dias permitiu avaliar
diferenças na velocidade de resposta entre as linhagens e cultivar.
Nesse mesmo período também foi verificada a presença ou não de
contaminação.
Transferência de estruturas embriogênicas – Regeneração-I
As estruturas embriogênicas formadas foram transferidas, a cada
10 dias, a partir dos 28 dias até os 68 dias para placas de petri
contendo meio de regeneração-I (RI-3) (Assmann, 1996). As estruturas
embriogênicas formadas de 1 mm ou maiores, apresentam o tamanho
mínimo ideal para que tenham capacidade de regenerar plântulas,
segundo Olsen (1987) e Szarejko & Kasha (1991). Após cada
transferência das estruturas, as placas foram novamente vedadas com
filme PVC aderente e mantidas em ambiente controlado (25 ± 1 °C
fotoperíodo de 16 horas ~ 25 ? mol m
-2
s
-1
).
Foram realizados exames das placas a cada 10 dias, até os 68
dias, sendo registrados o número de anteras responsivas, o número de
estruturas embriogênicas formadas, contaminações por fungos e/ou
bactérias, e formação de plântulas.
O exame final, antes da eliminação das placas de indução, foi
realizado aos 78 dias de cultura in vitro. Foi, então, registrado o número
de anteras não-responsivas, de anteras responsivas e de anteras muito
responsivas, de acordo com a produção de estruturas obtidas. Essa
contagem foi importante para verificar a existência de correlação entre
o número de anteras com grande resposta (com muitas estruturas
43
embriogênicas produzidas) e o número total de estruturas
embriogênicas produzidas.
No momento da eliminação das placas, foi realizada uma
avaliação das mesmas, segundo o aspecto geral, crescimento das
estruturas e formação de folhas e/ou raízes das plântulas.
Regeneração-II
As plântulas verdes obtidas, da regeneração das estruturas
embriogênicas, foram individualmente transferidas para tubos de ensaio
com meio de regeneração-II (RII-3) (Assmann, 1996), sem reguladores
de crescimento. Foram mantidas a 25 °C, fotoperíodo de 16 horas de
luz para posterior desenvolvimento. Eventuais plantas albinas foram
registradas e eliminadas.
Transferência das plântulas verdes para vermiculita
Quando as plântulas apresentaram raízes e parte aérea bem
desenvolvidas, foram transferidas para recipientes plásticos (250 mL)
com vermiculita e solução nutritiva (Solução estoque: MgSo
4
.7H
2
O –
4,2 g; K
2
HPO
4
– 1,4 g; KNO
3
– 5,8 g; Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O – 8,5 g). Em cada
recipiente plástico foram colocados dois canudos de polietileno, para dar
apoio ao filme de PVC, que cobriu o recipiente, dando assim mais
espaço para a plântula crescer e manter úmido o ambiente da mesma.
O filme de PVC foi mantido por sete dias sendo que, a partir do terceiro
dia, começaram a ser feitos furos no mesmo até a sua completa
retirada, no sétimo dia, permitindo a gradual adaptação da plântula ao
ambiente mais seco da câmara de cultura. As plântulas foram mantidas
em câmaras B.O.D. (Demanda Biológica de Oxigênio) a 25 °C para
aclimatação e posteriormente transferidas para a casa de vegetação.
44
Determinação do nível de ploidia das plantas verdes
regeneradas
Foram coletadas pontas de raízes de 219 plantas verdes
regeneradas, que foram pré-tratadas com PDB (para-diclorobenzeno)
durante 24 horas a 4 °C, lavadas em água destilada e após, fixadas em
Farmer em temperatura ambiente durante 24 horas. Após esse período,
o material fixado foi transferido para álcool 70% e estocado em
geladeira (4 °C) para posterior análise do nível de ploidia.
As raízes coletadas foram hidrolisadas em HCl 1N a 60 °C. A
confecção de cada lâmina foi realizada a partir de uma (ou mais)
ponta(s) de raiz(es) da mesma planta, sendo secionada(s) em várias
partes com auxílio de agulha histológica e bisturi. As seções obtidas
foram coradas com carmim propiônico 0,6%, espalhadas sobre a
lâmina, e cuidadosamente cobertas com a lamínula, evitando a
formação de bolhas. As lâminas foram seladas e analisadas em
microscópio óptico, sendo contado o número de cromossomos de cada
célula em metáfase, por planta.
Transferência das plantas para recipientes com substrato
Após a coleta de pontas de raízes, as plantas foram transferidas
para recipientes de polietileno preto, contendo solo compostado como
substrato, e mantidas no telado.
Na época do florescimento foram separadas as plantas que
possuíam espiga(s) com semente(s), sendo estas protegidas por um
recipiente de papel até o amadurecimento das sementes. As sementes
maduras foram coletadas, devidamente identificadas e armazenadas,
representando o resultado da terceira geração de seleção divergente.
45
Análises Estatísticas
Todos os resultados obtidos foram tabulados utilizando o
programa Excel. Os arquivos foram organizados por tipo de dados
obtidos e de acordo com a análise estatística a ser utilizada.
Os resultados envolvendo dados quantitativos foram analisados
pela Estatística Descritiva (média, mediana, desvio padrão, etc) e pelo
Teste Não-Paramétrico de Kruskal-Wallis (Análise de Variância Não-
Paramétrica). O programa utilizado foi o SPSS (Statistical Package for
Social Science), versão 12.0 em nível de significância de 5%. Foi
utilizado o teste DMS (diferença mínima significativa) de comparações
múltiplas para verificar diferenças existentes na análise de variância.
Para essas análises, foram previamente retiradas das amostras
(banco de dados) as espigas de plantas de cevada que foram
eliminadas por contaminação por fungos ou bactérias até o final da
etapa da indução (I-3), ou seja, até os 68 dias.
A unidade experimental foi a espiga, definida para cada cultivar e
linhagem.
Foram realizadas, em cada etapa do trabalho, as seguintes
análises:
1. ETAPA DE INDUÇÃO DE ESTRUTURAS EMBRIOGÊNICAS –
Foram realizadas análises de variância não-paramétrica para verificar se
houve diferenças entre as linhagens selecionadas, entre si e com a
cultivar MN-599 não-selecionada, quanto ao:
a) Número de anteras responsivas aos 21 dias de indução: em
proporção de anteras responsivas em relação ao total de anteras que
foram estabelecidas em meio de indução);
46
b) Número de estruturas embriogênicas aos 28 dias de indução,
com tamanho ≥ 1 mm, que puderam ser transferidas para o meio de
regeneração-I. Foi utilizada a proporção de estruturas formadas por
antera plaqueada x 100;
c) Número total de estruturas formadas, número de
estruturas/antera e número de estruturas formadas por espiga e por
antera.
2. ETAPA DE REGENERAÇÃO DE PLÂNTULAS VERDES – Foi
igualmente utilizada a análise de variância não-paramétrica, para
verificar se houve diferença entre as linhagens/cultivar na capacidade
de regeneração de plântulas verdes, em proporção ao número de
estruturas embriogênicas transferidas para o meio de regeneração-I.
Também foi analisado o número total de estruturas transferidas para
RI, acompanhadas e analisadas até o final da regeneração, ou seja, até
a determinação do número de plantas férteis/número de plantas
adultas.
2.2.2 – Escolha das linhagens e espigas para
as análises cito- e histológicas
Para as análises cito- e histológicas, foi escolhida uma espiga
de cada genótipo selecionado, com base nas respostas divergentes na
indução e na regeneração, obtidas na cultura de anteras. Das linhagens
escolhidas, uma espiga de cada linhagem selecionada e duas espigas da
cultivar não-selecionada foram escolhidas para as referidas análises
(ver Tabelas 2 e 4):
- cultivar A-05 – linhagem S
3
A22 – espiga A090 (“especiais”);
linhagem S
3
A23 – espiga A053 (“especiais”);
47
- cultivar BR-2 – linhagem S
3
B63 – espiga B069 (“especiais”);
- cultivar MN-599 não-selecionada – espigas M094 (“especiais”) e
M088 (“blocos”).
A partir da seleção das linhagens e das espigas, foram realizadas
as análises cito- e histológicas. A análise citológica foi realizada
somente na cultivar MN-599, planta M088, que serviu como controle
por ser a cultivar não-selecionada.
Tabela 2 (material fixado “BLOCOS”) ð Citologia.
Tabela 4 (material fixado “ESPECIAIS”) ð Histologia.
2.2.3 – Análises Citológicas
Durante o cultivo in vitro das anteras, foi fixado material para o
estudo detalhado do processo de indução da embriogênese para cada
uma das quatro linhagens selecionadas (S
3
A22 e S
3
A23; S
3
B61 e
S
3
B63), e para a cultivar não-selecionada (MN-599), para as análises
cito- e histológicas. O esquema completo para a análise citológica foi
delineado da seguinte forma:
a) Material fixado em Farmer [(3:1 - etanol absoluto : ácido acético
glacial) e após 24 horas, transferido para álcool 70% e estocado em
refrigerador] antes da cultura de anteras (ver Figura 7; Esquema 1):
a
1
) Três espiguetas (de uma das duas fileiras – lado 1),
respectivamente, da base (B), do meio (M) e do ápice (A), foram
fixadas antes do pré-tratamento a baixa temperatura (5 °C, 10 dias),
totalizando nove anteras/espiga. Uma antera de cada espigueta foi
analisada na etapa do cultivo de anteras in vitro, para a determinação
48
dos estádios dos micrósporos para decidir sobre a entrada ou não da
espiga em cultura. As outras duas anteras de cada espigueta foram
analisadas posteriormente para a comparação com as anteras
submetidas ao pré-tratamento de frio.
a
2
) Espiguetas e anteras (lado 2 da espiga), fixadas após o pré-
tratamento a baixa temperatura (5 °C, 10 dias), no momento das
anteras serem plaqueadas, do seguinte modo: uma espigueta do meio
(M), uma antera da base (B) e uma antera do ápice (A), totalizando
cinco anteras/espiga, para avaliar se houve ou não avanço no
desenvolvimento dos micrósporos e dos grãos de pólen das espigas que
entraram em cultura, durante os 10 dias a 5 °C.
a
3
) As demais anteras da espiga entraram em cultura.
b) De cada espiga que entrou na cultura, foram fixadas anteras em
eppendorfs com FAA 50% (Johansen, 1940) [álcool etílico absoluto
50%, formaldeído 40% e ácido acético glacial (90 : 5 : 5), e após 24
horas, transferido para álcool 70%] em grupos de duas a quatro,
segundo o esquema descrito a seguir:
Três anteras por linhagem/cultivar fixadas a cada três dias, de
acordo com os Esquemas 1 e 3 da Figura 7, até 18 dias de cultivo in
vitro (em regra, foram fixadas três anteras de cada bloco e de cada lado
a cada três dias). No total foram fixadas 900 anteras, com 60
anteras/linhagem em média [“BLOCOS”]. As anteras (juntamente com
suas estruturas internas ou liberadas do interior do lóculo) foram
fixadas em eppendorfs com FAA 50% (Johansen, 1940) em grupos
(duas a quatro anteras) separadamente por bloco e por lado. Ver Figura
7; Esquemas 1, 2 e 3, Tabela 2.
As análises citológicas das anteras cultivadas in vitro foram
realizadas a partir de material obtido em etapa anterior (ver Tabela 2),
como citado anteriormente, fixado em FAA 50% (Johansen, 1940)
49
[álcool etílico absoluto 50%, formaldeído 40% e ácido acético glacial
(90 : 5 : 5)], transferido para álcool 70% após 24 horas e mantido em
câmara fria (5 °C).
As oito amostras foram constituídas por dois controles – antes do
cultivo in vitro (C0, antes do pré-tratamento de baixa temperatura, e
C1, após o pré-tratamento, porém antes da cultura in vitro) e seis
amostras obtidas após o início do cultivo in vitro, coletadas a cada 3
dias (Exp3 até Exp18).
As anteras, em lâmina histológica com uma gota de carmim
propiônico a 0,6%, foram cortadas em uma das extremidades e os
micrósporos/grãos de pólen forçados a sair, por uma leve pressão com
auxílio de uma lanceta. As lâminas foram montadas e vedadas com luto
(breu e cera de abelha).
Tabela 2 - Número total de anteras fixadas a cada três dias, até o 18
o
dia após
o início do cultivo in vitro (“BLOCOS”). A barra azul indica a espiga escolhida
para as análises citológicas da cultivar
Dias após a indução
Linhagem
Espiga
Data da
indução
3°
dia
6°
dia
9°
dia
12°
dia
15°
dia
18°
dia
S
3
A22 A105 11.10.96
12
13
13
10 11 11
S
3
A22 A111 12.10.96
8
9
9
9 10 10
S
3
A23 A022 01.10.96
13
14
14
8 9 9
S
3
A23 A079 08.10.96
9
10
10
12 7 7
S
3
A23 A081 08.10.96
9
10
10
7 8 7
S
3
B61 B039 03.10.96
10
11
11
8 9 9
S
3
B61 B040 03.10.96
12
- 26
8 10
10
S
3
B61 B042 03.10.96
10
- 22
5 6 6
S
3
B61 B043 03.10.96
11
- 24
10 10 10
S
3
B63 B061 04.10.96
10
11
11
11 10 10
S
3
B63 B066 05.10.96
8
9
9
8 9 9
S
3
B63 B067 05.10.96
10
11
11
8 9 9
MN-599 M051 04.10.96
6
7
7
9 9 9
MN-599 M052 04.10.96
6
6
4
5 3 4
MN-599 M088 08.10.96
10
11
10
8 8 8
MN-599 M124 17.10.96
10
11
11
9 10 10
50
Os micrósporos e grãos de pólen foram analisados em microscópio
Zeiss Axioplan quanto às porcentagens de micrósporos, grãos de
pólen binucleados, bicelulares, trinucleados, tricelulares,
multinucleados, multicelulares, presença e número de estruturas
embriogênicas e “pólen-p”. Foi analisada também a ocorrência ou não
de divisão simétrica, tanto nos “grãos de pólen-p”, como nos outros
grãos.
Das lâminas selecionadas, foram obtidas fotomicrografias do
material através dos microscópios Zeiss Axioplan, Olympus BX 41, e
Leica DM R, utilizando câmara digital Nikon Coolpix 990 acoplada ao
microscópio DM R Leica.
A barra azul indica o material analisado. O material disponível,
que não foi escolhido para o presente estudo, poderá complementar
trabalhos futuros.
Análise Estatística
Todos os resultados obtidos foram tabulados utilizando o
programa Excel. Os arquivos foram organizados de acordo com a
análise estatística a ser realizada.
Após a análise citológica do material, foi montada uma tabela com
os resultados gerais, que geraram os gráficos da análise do
desenvolvimento dos micrósporos e grãos de pólen, porcentagem de
anteras responsivas e número médio de estruturas por antera
responsiva observadas por amostra a cada três dias.
Foram confeccionados gráficos com a porcentagem de todos os
tipos celulares observados nas amostras controles (C0 e C1) e nas
amostras coletadas a cada três dias (Exp3 a Exp18).
51
2.2.4 – Análises Histológicas
De cada espiga que entrou na cultura, foram fixadas anteras
isoladas em eppendorfs com FAA 50% (Johansen, 1940), segundo
esquema descrito a seguir:
Quatro anteras por linhagem/cultivar fixadas a cada dois dias, até
34 dias em cultivo in vitro, totalizando 346 anteras amostradas até o
início da formação de estruturas embriogênicas, em média, com 50 ou
mais anteras/cultivar [“ESPECIAIS”]. As anteras isoladas (juntamente
com suas estruturas embriogênicas liberadas ou não do interior do
lóculo) foram fixadas separadamente, de acordo com o lado de origem
da espiga, em eppendorfs com FAA. Ver Figura 7; Esquemas 1 e 2, e
Tabela 3.
As anteras de cevada, juntamente com as suas estruturas
internas ou liberadas do interior do lóculo, coletadas das placas de petri
com meio de cultura, foram fixadas individualmente em eppendorfs (ver
Tabela 3) com FAA 50% (Johansen, 1940) ð álcool etílico absoluto
50%, formaldeído 40% e ácido acético glacial (90 : 5 : 5), e após 24
horas, transferidas para álcool 70% e mantidas a 5 °C em câmara fria
até análise.
Para o processamento do material, as anteras (com suas
estruturas embriogênicas internas) bem como as estruturas
embriogênicas isoladas foram desidratadas em série etílica. Após, foram
tratadas com três passagens em etanol absoluto : clorofórmio ð 3 : 1;
1 : 3 e 1 : 1, e novamente transferidas para etanol absoluto.
Posteriormente, foram pré-infiltradas (com uma gota de fucsina básica
para melhor visualização do material), infiltradas e incluídas em
hidroxietilmetacrilato (Historesina-Jung) para montagem dos blocos. Os
mesmos foram colados em suportes metálicos ou de madeira,
dependendo do tamanho do bloco. Após, foram realizadas seções
52
Tabela 3 - Esquema para a obtenção das anteras “ESPECIAIS”: Exemplo da
espiga A090 (S
3
A22). Cada antera fixada (individualmente em eppendorf) está
identificada pelo lado da espiga, pela espigueta (n
o
) e pela posição da antera
na placa de cultivo (letra)
Dia da fixação Anteras fixadas
Lado 1 Lado 2
2 3a e 9a 6a e 12
a
4 4a e 10a 1b e 13b
6 5a e 11a 2a e 8
a
8 6a e 12a 3a e 9
a
10 2a e 8a 4a e 10 a
12 6b e 12b 5a e 11
a
14 3b e 9b 6b e 12b
16 4b e 10b 5b e 13c
18 5b e 11b 2b e 8b
20 6c e 12c 3b e 9b
22 5c e 11c 4b e 10b
24 2b e 8b 5c e 11b
26 3c e 9c 6c e 12c
28 4c e 10c 1c e 11c
30 2c e 8c 2c e 10c
32 - 3c e 9c
34 - 4c e 8c
longitudinais de 3 µm de espessura em micrótomo de rotação MICROM
Zeiss.
Para a coloração do material foi utilizado o corante Azul de
Toluidina O, a 0,05%, pH 4,4 (O’Brien & McCully, 1981).
Na tabela 4 encontra-se o material disponível para a análise das
anteras do grupo de “ESPECIAIS”. Note a linhagem S
3
A23 que não foi
escolhida para a análise, mas que acabou sendo analisada até aos 22
dias de cultivo, por ter sido o primeiro material a ser trabalhado, ou
53
Tabela 4 – Relação do material disponível no grupo das anteras “ESPECIAIS”. Em cada dia indicado foram
fixadas quatro anteras (duas anteras de cada lado da espiga). Barras azuis identificam as espigas
analisadas histologicamente
Linhagem
Espiga
Data da Indução
Dias após a indução
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
S
3
A22 A090 09.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 * 2 * 2 * - -
S
3
A23 A053 04.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 * 2 * 2 * 2 *
S
3
B61 B056 04.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 * 2 * 2 * - -
S
3
B63 B069 05.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 * 2 * 2 * - - - - -
M050 03.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 - - - - - - - - MN-599
M094 09.10.96 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 * 2 * 2 * 2 * - -
*= anteras fixadas oriundas do mesmo lado da espiga (lado 2).
54
seja, as anteras foram utilizadas como treinamento para a realização
das lâminas, mas em vista dos bons resultados obtidos decidiu-se pela
sua inclusão no estudo.
As lâminas utilizadas para observação ao microscópio óptico e
para a realização de fotomicrografias foram montadas com óleo de
imersão. A análise das lâminas foi realizada em microscópios de campo
claro Olympus BX 41 e Dialux 20 EB Leitz, ambos providos de
câmara fotográfica analógica. Os cortes selecionados também foram
fotomicrografados pela câmara digital Nikon Coolpix 990 acoplada ao
microscópio DM R Leica. Nesse mesmo microscópio também foram
analisadas lâminas em contraste interferencial (DIC) para destacar
nuances das estruturas internas das células, principalmente para
melhor observação dos núcleos. Também foi utilizada a microscopia de
epifluorescência, com os seguintes fluorocromos:
- auramina O ð para evidenciar a esporopolenina (Vithanage &
Knox, 1979); Filtro de excitação de 450 – 490 nm.
- calcoflúor (White, M2R – Sigma ) 0,01% em solução aquosa
ð para evidenciar a constituição celulósica da parede celular
(Pacini et al., 1999). Filtro de excitação de 350 – 390 nm.
Os testes histoquímicos foram realizados da mesma forma que os
fluorocromos, colocando-se uma gota do material sobre o corte
histológico e a seguir, colocando a lamínula sobre o mesmo. Foram
utilizados:
- lugol (solução aquosa de iodo e iodeto de potássio) Sass, 1951
ð para evidenciar amido;
55
- coomassie brilliant blue R-250 – 0,25% em solução acética 7%
ð para identificar proteínas totais (Southworth, 1973). CI
(color index): 42660.
Foi utilizada a microscopia de polarização para a confirmação da
presença de amido no material analisado, no microscópio DM R Leica.
Após todos os procedimentos, também foram realizadas
fotomicrografias dos resultados evidenciados.
As imagens selecionadas foram processadas no programa Adobe
Photoshop CS e as estampas montadas no programa Corel Draw 11.0.
As lâminas produzidas durante o trabalho serão registradas e mantidas
no Laminário do Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de
Botânica da UFRGS.
Para fins comparativos foi realizada uma análise pontual de
embriões maduros e de anteras, ambos obtidos in vivo. Esse material
seguiu o mesmo procedimento histológico descrito anteriormente.
Análises Estatísticas
Os critérios de classificação de cada antera foram definidos a
partir do menor ou maior número de ocorrências dos tipos celulares
analisados e observados.
Foram montadas tabelas de presença (+) e ausência (-) com os
tipos morfológicos analisados, para cada cultivar e linhagens analisadas.
Para que a análise pudesse ser realizada, foram atribuídos os valores
zero (0, -, ausência) e um (1, +, presença).
A variável número de estruturas embriogênicas (ELSs) foi
subdividida em quatro variáveis para a análise: sem forma, MAC
56
(estruturas com meristema apical caulinar), MAR (estruturas com
meristema apical radical adventício embrionário) e embriões.
A partir do agrupamento dos resultados da análise qualitativa
realizada, foram feitos os testes de X
2
(qui-quadrado) para as ELSs e o
não-paramétrico de Kruskal-Wallis (análise de variância não-
paramétrica). Foi utilizado o programa SPSS (Statistical Package for
Social Science), versão 12.0 em nível de significância de 5%. Foi
utilizado o teste DMS (diferença mínima significativa) de comparações
múltiplas para verificar diferenças existentes nos resultados, através de
análise de variância.
A coleta e análise do material a cada dois dias foram necessárias
para que fossem obtidos resultados mais representativos e seguros com
relação à embriogênese da cevada.
57
“Em algum lugar além do arco-íris,
os céus são mais azuis e os sonhos que
você ousa sonhar realmente
acontecerão”.
149
4 - DISCUSSÃO
150
4.1 - CULTURA DE ANTERAS DE CEVADA
Como a cultura de anteras envolveu várias etapas, para uma
melhor sistematização a discussão será abordada segundo os tópicos
descritos nos resultados.
Etapa da coleta de espigas e Determinação do estádio de
desenvolvimento dos micrósporos/grãos de pólen
O fato das aristas emergentes serem observadas somente nas
cultivares BR-2 e MN-599 (mesmo que em pequena quantidade) pode
ser explicado por uma mais rápida maturação das espigas dessas
cultivares. Este aspecto mostra que cada cultivar possui um ritmo de
crescimento específico em fases diferentes do ciclo vital. Como relatado
por Revers (1993), as cultivares A-05 e BR-2 mostraram diferenças
quando comparadas em diferentes fases do ciclo de vida, chamando a
atenção para a velocidade mais lenta de germinação da BR-2, mesmo
que tenha atingido antes o estádio ideal para a coleta das anteras
quando comparada novamente à A-05.
Deve ser ressaltado que, de acordo com dados de Revers (1993),
somente da cultivar BR-2 poderiam ser coletadas espigas com aristas
emergentes (até 11,4±2,5 mm), estando ainda as mesmas, no estádio
adequado para o cultivo in vitro dos micrósporos e grãos de pólen.
Com relação aos outros marcadores morfológicos utilizados, foram
realizadas correlações entre cada um deles (altura dos afilhos e
distância interlígulas) com as cultivares, tendo sido obtidas correlações
positivas (Assmann, 1996). A distância interlígulas foi o melhor
marcador do estádio ideal de desenvolvimento dos micrósporos e grãos
de pólen, com diferenças significativas entre a cultivar BR-2 e as
demais cultivares analisadas (Revers, 1993). Segundo esse autor, a
151
altura dos afilhos não deve ser considerada um marcador do estádio de
desenvolvimento, embora revele diferenças entre as cultivares.
Há evidências de que as condições fisiológicas das plantas
doadoras das espigas para a cultura de anteras têm importância
fundamental para a resposta in vitro na formação de estruturas
embriogênicas, segundo Olsen (1987) e Szarejko & Kasha (1991).
Dessa forma, Revers (1993) constatou que a região de Porto
Alegre - RS não se encontra entre as recomendadas para o plantio da
cultura, sendo provável que as diferenças observadas no experimento
com relação às regiões indicadas para a produção, possam ser
atribuídas a fatores ambientais.
Ainda com relação ao comprimento das aristas, Assmann (1996)
verificou a existência de correlação com o valor médio calculado para os
estádios dos micrósporos e grãos de pólen da mesma espiga, nas
cultivares A-05 e BR-2. Na cultivar MN-599 a correlação não foi testada
devido ao número baixo de espigas, somente duas, que apresentaram
aristas emergentes. Foi encontrada uma correlação positiva (r= 0,378)
para a cv. BR-2 entre as duas variáveis (r
2
= 14,3%). Na cultivar A-05
verificou-se correlação positiva significante (r = 0,743), com r
2
=
55,2%, embora a amostra tenha sido menor do que a da BR-2.
Com relação às outras variáveis analisadas, o mesmo autor
referido anteriormente também encontrou correlação positiva entre
cada uma delas (altura dos afilhos e distância interlígulas) com o
estádio de desenvolvimento dos micrósporos e grãos de pólen.
Dessa forma, foi comprovada a necessidade da utilização dos
marcadores morfológicos para uma coleta mais eficiente de espigas com
micrósporos e grãos de pólen nos estádios adequados para a cultura in
vitro de anteras de cevada, sendo que o efeito de cultivar foi observado
para todos os marcadores (Assmann, 1996).
O estádio ideal dos micrósporos e grãos de pólen para a cultura in
vitro de anteras de cevada, tem sido demonstrado por vários autores
152
como sendo entre o uninucleado inicial (UI) ou médio (UM) a final (UT)
[Dale, 1975; Chen et al., 1984; Assmann, 1996; Gilpin et al., 1997].
Mas alguns autores também utilizaram anteras para a cultura in vitro
com grãos de pólen entre o estádio unicelular final ao bicelular (Wilson
et al., 1978; Paire et al. 2003).
Como já relatado nos resultados, foram observadas aristas
emergentes em algumas espigas, especialmente naquelas da cultivar
BR-2. Resultado semelhante foi observado por Revers (1993), onde
essa característica foi observada somente na referida cultivar, em cerca
de 30% das espigas cujos grãos de pólen estavam no estádio adequado
para o cultivo in vitro.
Assmann (1996) compara as três cultivares analisadas (as
mesmas utilizadas no presente trabalho) com relação às aristas
emergentes e o estádio do pólen. Verificou que na cultivar A-05
somente 2% das espigas correspondentes à subamostra UNI-1
a
DIV
(para maiores detalhes das classes, ver tabela 5) apresentaram aristas.
O mesmo foi verificado para a cultivar MN-599, apresentando menos de
1% (somente uma espiga) das espigas na classe referida
anteriormente. Portanto, conclui que para essas cultivares não se deve
coletar espigas com aristas emergentes.
Por outro lado, na cultivar BR-2, o tamanho da arista aparece
como um importante marcador morfológico para auxiliar na coleta das
espigas com o estádio ideal dos micrósporos e grãos de pólen. A autora
citada anteriormente verificou que 95% da amostra das espigas da
subamostra UNI-1
a
DIV e todas as espigas da amostra na classe BI-TRI
apresentaram aristas emergentes.
Da mesma forma, no presente trabalho foram encontradas aristas
emergentes na cultivar BR-2, com valores chegando até 1 e 1,5 cm,
não significando que os micrósporos e grãos de pólen estivessem num
estádio mais adiantado do desenvolvimento, mas sim, estavam no
estádio ideal para o cultivo in vitro. Material mais adiantado no
153
desenvolvimento, com presença de aristas emergentes, somente foi
observado nas outras duas cultivares, A-05 e MN-599, concordando
com Assmann (1996) que no momento da coleta das espigas dessas
duas cultivares não se deve coletá-las com aristas emergentes. Isso só
pode ser realizado para a cultivar BR-2, que apresentou uma velocidade
mais lenta no desenvolvimento das espigas, e conseqüentemente dos
micrósporos e grãos de pólen.
Há relatos na literatura de que se pode utilizar a medida do
tamanho da flor de cevada para obter alguma indicação da maturidade
da antera, entretanto esse tamanho é afetado pela posição da flor na
inflorescência, pelo genótipo e pela idade da planta (Atanassov et al.,
1995), o que também dificultaria a coleta de espigas apresentando o
estádio ideal dos micrósporos e grãos de pólen para o cultivo in vitro.
Uma solução poderia ser o aumento do número amostral das espigas, o
que nem sempre é viável, mas ainda, pode-se utilizar o maior número
possível de marcadores morfológicos para minimizar o erro de coleta de
espigas com desenvolvimento tardio.
Etapa da Indução da Embriogênese
As diferenças observadas entre as linhagens e a cultivar não-
selecionada, com relação à formação de estruturas embriogênicas, não
foram comprovadas pela análise estatística, mas verifica-se que há uma
tendência à significância (Tabela 6), devido à probabilidade ser próxima
do nível de significância de 5%. Esse fato pode ser explicado também
pelo tamanho da amostra, ou seja, se o número de espigas que
permaneceram em cultivo in vitro, sem contaminação (53 espigas),
fosse aumentado, poderia ser comprovada a significância através do
teste estatístico, sendo assim, as linhagens e a cultivar seriam
diferentes com relação à produção de estruturas embriogênicas in vitro.
Em trabalho anterior, realizado por Assmann (1996), foi
154
encontrada significância nos testes estatísticos para as mesmas
variáveis, com as mesmas cultivares, mas com um número amostral de
espigas maior.
O fato relatado anteriormente foi semelhante à produção de
estruturas formadas/espiga, pois mesmo sendo encontrada uma
aparente diferença na produção das mesmas entre os genótipos
analisados, não houve diferença significativa, apenas uma tendência à
significância (Tabela 6). O número de anteras responsivas formadas aos
21 dias de indução (formação inicial das estruturas embriogênicas)
também não mostrou diferença significativa entre os genótipos
analisados. Novamente, Assmann (1996) encontrou efeito do genótipo.
Por outro lado, Revers (1993) em estudo preliminar de cultura de
anteras das mesmas cultivares analisadas no presente estudo, verificou
que as cultivares A-05 e MN-599 foram semelhantes entre si com
relação às respostas das anteras in vitro, tanto aos sete, quanto aos 28
dias, onde a cultivar BR-2 diferiu das duas cultivares citadas
anteriormente.
Assmann (1996) em sua discussão atribuiu a diferença de
respostas encontradas em seu trabalho e no de Revers (1993), com as
mesmas cultivares, à interação significativa observada entre os
genótipos analisados e os pré-tratamentos testados e/ou meio de
cultura que também diferiram, pois Revers (1993) utilizou somente um
pré-tratamento, à temperatura constante durante 28 dias. No presente
trabalho foi utilizado somente um período de pré-tratamento, 10 dias a
5 °C, o que pode explicar também a não significância entre os
genótipos analisados.
Por outro lado, no presente trabalho foi encontrada diferença
significativa entre os genótipos quanto à produção de estruturas
embriogênicas aos 28 dias de cultivo in vitro, demonstrando a
intensidade de produção rápida. Essa comparação não foi realizada
pelos autores anteriormente citados.
155
Deve-se enfatizar que a análise estatística não foi realizada para
todas as variáveis devido ao fato dessa etapa não ser o foco principal
desse trabalho de doutorado.
A formação precoce das estruturas embriogênicas aos 28 dias,
período da primeira transferência das mesmas para o meio de
regeneração R-I, mostrou que a linhagem S
3
A23 (da cv. A-05) obteve o
maior número, e a cultivar MN-599 o menor. Assmann (1996) registrou
que a cultivar A-05 produziu o maior número de estruturas
embriogênicas na indução, aos 21 dias. Portanto, foram encontrados
resultados semelhantes ao presente trabalho, mas no 21
o
dia de cultivo.
Novamente, para a variável “n
o
total de estruturas formadas”, a
diferença na produção dessas estruturas entre as cultivares não foi
significativa, mesmo que tenha sido observado um grande número
delas na cultivar A-05, especialmente na linhagem selecionada S
3
A22
(Tabela 6). Da mesma forma que Assmann (1996), pode-se inferir, no
caso do presente estudo, que mesmo que a cultivar A-05 tenha
apresentado visualmente um maior número de estruturas
embriogênicas in vitro, ao final do período de indução a produção
dessas estruturas não diferiu estatisticamente entre as cultivares A-05,
BR-2 e MN-599. A autora anteriormente citada encontrou a cultivar MN-
599 como a menos produtiva nas condições testadas. Essa observação
pôde ser confirmada pela significância da probabilidade obtida.
Stival (1995) observou que um dos híbridos F
1
que obteve a
maior produção de estruturas embriogênicas, no melhor meio testado,
era oriundo de um cruzamento envolvendo a cultivar BR-2. Essa
observação pode ser comparada com o presente trabalho, já que foi
obtido um valor semelhante dessa cultivar com a que obteve a maior
resposta, a cultivar A-05, linhagem S
3
A22 (Tabela 6), não diferindo
significativamente para a variável “n
o
total de estruturas formadas”.
Com relação ao período de pré-tratamento à baixa temperatura,
Assmann (1996) testou três diferentes períodos, 10, 20 e 30 dias,
156
verificando que o período que proporcionou maior produção de
estruturas embriogênicas, de um modo geral para as três cultivares
analisadas, foi o de 10 dias. A conclusão foi obtida a partir de
observações em que o teste de significância mostrou equivalência nos
três pré-tratamentos, para os três meios testados, nas cultivares A-05 e
BR-2. Nesse mesmo período, e utilizando o meio de cultivo I-3, a
cultivar MN-599 apresentou uma maior produção de estruturas
embriogênicas, quando testados os outros dois meios e os outros dois
períodos, sendo que em geral essa é a cultivar menos produtiva. Foi
observado também que a cultivar BR-2 obteve a menor produção.
Dessa forma, foi notado o efeito do pré-tratamento sobre as cultivares,
com a cultivar MN-599 mostrando-se com a menor produção de
estruturas embriogênicas quanto maior a exposição à baixa
temperatura, ao contrário da cv. BR-2. A partir desse resultado, foi
utilizado no presente trabalho o período de 10 dias no pré-tratamento,
com temperatura de 5 °C.
Nesse sentido, Bhojwani & Razdan (1983) salientam que o
tratamento à baixa temperatura aplicado ao botão floral, previamente
ao estabelecimento in vitro das anteras, aumenta o número de
micrósporos que desenvolvem embriões. Por outro lado, Szarejko &
Kasha (1991) não encontraram benefícios, quando foi comparado o
material cultivado in vitro diretamente (0 dias) com aquele pré-tratado.
Entretanto, muitos autores utilizaram um período maior de pré-
tratamento, 28 dias, para várias cultivares de cevada do hemisfério
norte (Huang & Sunderland, 1982; Dunwell et al., 1987; Olsen, 1987).
Mesmo que esse tempo utilizado no pré-tratamento tenha sido
considerado ideal para algumas cultivares de cevada do hemisfério
norte, para as cultivares brasileiras parece não ser o mais
recomendável (Assmann, 1996).
Segundo Jähne & Lörz (1995) a duração e a temperatura de pré-
tratamento diferem em trabalhos de cultura de micrósporos de arroz,
157
demonstrando que as condições de pré-tratamento devem ser
otimizadas para os diferentes genótipos, tendo sido esse fato também
observado para as cultivares brasileiras de cevada, segundo Assmann
(1996).
Da mesma forma que no presente trabalho pode ser inferida essa
conclusão acerca da forte influência do genótipo na capacidade
embriogênica das cultivares, na literatura também é encontrada essa
afirmação para a cevada (Foroughi-Wehr et al., 1982; Dunwell et al.,
1987; Szarejko & Kasha, 1991).
Foroughi-Wehr & Zeller (1990), Dunwell et al. (1987) e Larsen et
al. (1991) relataram que não necessariamente a formação de um
grande número de estruturas embriogênicas in vitro corresponde ao
potencial de regeneração de plantas verdes. Isso pôde ser constatado
na cultivar A-05, em que o maior número de estruturas embriogênicas
não resultou na maior produção de plantas verdes, o que será discutido
posteriormente.
Ainda com relação ao efeito do genótipo, Foroughi-Wehr & Zeller
(1990) demonstraram diferentes resultados da embriogênese em 25
cultivares germânicas de trigo, observando desde uma baixa ou quase
nenhuma produção, até alta freqüência de regeneração de plantas a
partir de estruturas embriogênicas derivadas do pólen. Grando (1990)
verificou em estudo de linhagens duplo-haplóides, para a mesma
espécie citada anteriormente, diferenças que só puderam ser atribuídas
ao efeito do genótipo.
Uma vez que o pré-tratamento é uma condição para ativar o
estresse, responsável por ativar a rota gametofítica, anteras de cevada
podem ser estabelecidas durante quatro dias em meio de cultura
contendo 0,3 M de manitol (Jähne & Lörz, 1995). Foi observado por
Roberts-Oehlschlager & Dunwell (1990) que essa resposta do pré-
tratamento de manitol foi superior ao de baixa temperatura.
Li et al. (2001) utilizaram como pré-tratamento, drogas de
158
hipometilação do DNA (azacitidina e etionina), indicando que poderiam
aumentar a freqüência de calos e embriões. Os resultados sugeriram
que esse tipo de pré-tratamento pode aumentar a freqüência de
desdiferenciação do micrósporo. A função das drogas de hipometilação
do DNA parece ser a mesma dos pré-tratamentos à baixa temperatura e
de manitol.
Wojnarowiez et al. (2004) comentam que entre os reguladores
osmóticos utilizados no pré-tratamento, o manitol foi o mais eficiente.
Sorbitol e sacarose, também utilizados no experimento, fizeram com
que os plastídios se diferenciassem pouco, porém constataram um
acúmulo de uma grande quantidade de amido. Os autores comentam
que esse acúmulo de amido não está correlacionado com o albinismo.
No trabalho de Revers (1993) não foi observada a formação de
estruturas embriogênicas, podendo esse fato ser explicado pela
composição do meio de cultura utilizado pelo autor, seguindo protocolo
de Olsen (1987) com modificações. Os reguladores de crescimento
utilizados foram cinetina e 2,4-D (2,4-diclorofenoxiacético), de acordo
com Kao (1991), utilizados por esse autor para a indução de estruturas
embriogênicas. Assmann (1996) testando três diferentes meios de
cultura verificou que o meio de indução-1 (I-1), modificado de Olsen
(1987), mas diferente daquele utilizado por Revers (1993), foi o que
ofereceu as mais baixas condições de indução das anteras em cultura
para a formação de estruturas embriogênicas.
No presente trabalho foi igualmente utilizada cinetina como citada
anteriormente, mas ANA (ácido naftalenoacético) no lugar do 2,4-D, a
partir da sugestão de Assmann (1996) que verificou ser essa
combinação bastante benéfica para a indução da embriogênese a partir
das anteras em cultura.
Num estudo comparando dois meios de cultura em 11 populações
F
1
de cruzamentos intervarietais de cevada, Stival (1995) mostrou
haver efeito significativo da interação entre os genótipos e o meio de
159
indução.
Segundo Cai et al. (1992) a composição dos fitorreguladores no
meio de indução mostrou ter um efeito significativo na eficiência da
cultura para os genótipos de cevada testados. São utilizadas várias
combinações, pois segundo Clapham (1977), as anteras de cereais
necessitam de auxinas e citocininas, tanto simultaneamente, quanto em
seqüência. Dessa forma, as respostas do material em cultivo parecem
depender dos níveis endógenos ótimos desses fitorreguladores.
Atualmente não se utilizam fitorreguladores, principalmente no
cultivo de micrósporos e grãos de pólen isolados, como demonstrado
por Fan et al. (1988) em Brassica napus L. e em Zea mays L. por Obert
et al. (2000).
Etapa de Regeneração de Plântulas Verdes
Os resultados obtidos na etapa de regeneração referem-se à
diferenciação das estruturas embriogênicas que foram transferidas para
o meio de regeneração.
Foram encontrados cinco tipos de estruturas a partir desses
resultados: estruturas indiferenciadas (amorfas), brotos albinos, brotos
verdes, plântulas albinas e plântulas verdes. Para a análise no presente
trabalho foram utilizados somente os dados das duas últimas citadas
(Tabela 9). As plântulas verdes formadas foram cultivadas em meio de
regeneração-II (R-II), adequado para o desenvolvimento das partes
aérea e radical.
Assmann (1996) encontrou efeito do genótipo para a variável
analisada “proporção de estruturas indiferenciadas”, sendo também
encontrado efeito do pré-tratamento à baixa temperatura, com um
maior número de estruturas indiferenciadas aos 20 dias desse período.
A mesma autora verificou que a cultivar MN-599 diferiu das
demais cultivares, com um maior número de plântulas albinas
160
regeneradas. Foi observado também, que quanto maior o tempo de
pré-tratamento do material, maior foi a proporção de plântulas albinas,
mostrando que o maior tempo a baixas temperaturas foi decisivo no
aumento da regeneração dessas plântulas.
Szarejko & Kasha (1991) concluíram que a alta freqüência de
regenerantes albinos não foi alterada pela composição dos meios de
cultura testados, mas sim pela forte influência do genótipo com relação
a essa variável. Da mesma forma, Kao et al. (1991) verificaram efeito
do genótipo sobre a freqüência de plantas albinas regeneradas. Por
outro lado, Assmann & Winge (1996) observaram que os diferentes
meios de cultura testados tiveram influência na formação de plântulas
albinas. Essas autoras verificaram interação dos fatores genótipo e meio
de indução influenciando a produção de plântulas albinas, mais
especificamente no meio I-1 a cultivar MN-599 diferiu das demais, que
foram equivalentes entre si, tendo regenerado mais albinas.
Também em cevada, Olsen (1987) verificou que quando a maioria
das estruturas formadas foi considerada do tipo calo, a produção inicial
foi baixa e a maioria das plantas regeneradas era albina. Por outro lado,
Hoekstra et al. (1992) relataram a formação de 0,4 plantas albinas por
antera estabelecida in vitro. Cai et al. (1991) obtiveram a regeneração
de 44,9 a 62,6 plantas albinas por 100 anteras estabelecidas,
dependendo do genótipo.
A cultivar A-05 apresentou a linhagem S
3
A23 com a maior
proporção de plântulas albinas, o dobro do valor da linhagem S
3
A22.
Isso significa que essa cultivar produz grande quantidade de estruturas
embriogênicas (Tabela 6), mas tem problemas na regeneração, tanto
de plântulas verdes, quanto de plântulas albinas (Tabela 9). A diferença
entre as cultivares na produção de plântulas albinas também foi
constatada por Assmann (1996), em que a cultivar MN-599 diferiu
significativamente das outras duas, A-05 e BR-2, apresentando o maior
número de plântulas albinas.
161
O albinismo é um problema sério encontrado na cultura de
anteras de gramíneas. Segundo Harada et al. (1991), vários fatores
têm sido apontados como afetando o grau de albinismo durante a
cultura: o genótipo e o estado fisiológico da planta doadora, o estádio
de desenvolvimento dos micrósporos e grãos de pólen, a temperatura
de cultivo, o pré-tratamento a baixa temperatura e a concentração de
açúcar em combinação com os fitorreguladores. Entretanto a causa
primária ainda não é conhecida.
Além desses fatores, Cistué et al. (1995) observaram que a
duração do cultivo está altamente correlacionada com a produção de
uma alta proporção de regenerantes albinos. É possível que o período
maior em cultura no escuro ou que mudanças no balanço de nutrientes,
ao longo desse período de cultivo possam levar ao aumento de
albinismo. Da mesma forma, Kühlmann & Foroughi-Wehr (1989)
verificaram que as estruturas que se formavam nos primeiros 30 dias se
desenvolviam em plantas, e as originadas posteriormente, em grande
parte, mostraram proliferação de calos e uma menor regeneração de
plantas. Kao et al. (1991) observaram que de 20 plantas obtidas de
uma única antera, a maior parte das que foram regeneradas dentro de
70 dias, foi verde e a maioria das induzidas posteriormente foi albina.
Larsen et al. (1991) discutem que aparentemente todos os genes
que controlam as porcentagens de plantas verdes em cultura de
anteras, particularmente em cevada, são herdados
cromossomicamente.
Caredda et al. (2004) sugeriram que o albinismo a partir de
material obtido da embriogênese in vitro diferiu entre as cultivares de
cevada analisadas. Na cultivar de inverno Igri, a alteração dos
plastídeos ocorreu durante a etapa de regeneração, visto que nas
linhagens de inverno eles foram afetados em embriões derivados de
micrósporos, indicando que o albinismo não foi iniciado durante a
regeneração, mas sim no início do processo de embriogênese.
162
Etapa de Regeneração de Plantas Adultas
O maior número de plantas verdes foi produzido pelas duas
linhagens da cultivar BR-2. Observação semelhante foi relatada por
Stival (1995), mostrando que a cultivar BR-2 é mais produtiva com
relação à regeneração de plantas verdes, mesmo não produzindo
grande quantidade de estruturas embriogênicas como a cv. A-05.
Assmann (1996) observou que a baixa proporção obtida de
plantas verdes poderia ter sido devido à baixa capacidade genética de
regeneração das cultivares testadas. Entretanto, como referido
anteriormente, Stival (1995) observou resultados satisfatórios em
cruzamentos que utilizaram a cultivar BR-2 como genitor.
Uma série de fatores tem sido apontada como responsável pela
regeneração de uma maior proporção de plantas verdes. Entre esses
fatores estão principalmente, o genótipo, o pré-tratamento e a
composição dos meios de cultivo in vitro. Cai et al. (1992) cita ainda
outros fatores como, estádio de desenvolvimento dos micrósporos,
condições físicas durante o estabelecimento das anteras in vitro e
condições de crescimento das plantas doadoras.
Segundo Guo & Pulli (2000), talvez a mais importante influência
na cultura de micrósporos seja o genótipo das plantas doadoras, como
no caso estudado em Phleum pratense L.
Quanto ao nível de ploidia das plantas regeneradas, foi observado
um valor relativamente alto de plantas diplóides, sendo que para a
cultivar BR-2 esse valor foi muito próximo nas duas linhagens,
ultrapassando 50%. A cultivar MN-599 e uma das linhagens da cultivar
A-05, a S
3
A22, apresentaram valores semelhantes, com mais de 70%
das plantas diplóides. O mesmo tipo de análise foi realizada por
Assmann (1996), onde, mesmo numa amostra reduzida, verificou que
cerca de 50% das plantas verdes regeneradas eram haplóides e o
restante duplo-haplóides, supondo a ocorrência de duplicação
163
espontânea. A autora também não verificou a ocorrência de
tetraplóides, como observado no presente trabalho.
A duplicação espontânea dos cromossomos tem sido documentada
para a cultura de anteras de cevada em uma porcentagem de 50 a 80%
dos regenerantes verdes derivados do micrósporo ou do pólen
(Foroughi-Wehr et al., 1982; Jähne & Lorz, 1995). Wilson (1977) relata
uma alta porcentagem de micrósporos e pólen diplóides, indicando que
a duplicação do número cromossômico ocorre subseqüentemente à
formação da célula haplóide, sendo resultado direto das condições de
cultura. Interação significativa entre o nível de ploidia e o genótipo foi
observada por Stival (1995), onde detectou diferenças entre o material
de cruzamentos, testado quanto à freqüência de plantas haplóides e
diplóides, tendo os cruzamentos que envolveram a BR-2 apresentado
baixa freqüência de duplicações espontâneas, indicando controle
genético dessa característica.
Em Brassica napus L. cv. Topas são relatados casos de duplicação
espontânea com proporções de 30 a 40% de diplóides, sendo que
XuHan et al. (1999) atribuiu essa duplicação à endomitose, e não à
fusão nuclear, por não terem encontrado mitoses sem a formação de
parede celular.
Segundo Clapham (1977), é desejável obter diplóides
homozigotos a partir de haplóides, quando a duplicação não ocorre
espontaneamente in vitro. Para isso, a colchicina é o anti-mitótico mais
empregado para o restabelecimento da condição diplóide da planta,
garantindo a fertilidade da mesma em detrimento do pareamento
normal dos cromossomos. González-Melendi et al. (2005) utilizando
microscopia confocal, eletrônica e óptica mostraram evidências de que a
fusão nuclear é o principal mecanismo de diploidização, ocorrendo no 6
o
dia de cultivo, como no presente trabalho.
A perda de plântulas verdes após a transferência para o meio RII
até a transferência das mesmas para recipientes com substrato,
164
também pode ser explicada por problemas técnicos na manutenção da
temperatura ideal da câmara de crescimento. Em alguns períodos, a
temperatura foi superior a 25 °C, o que, para a cevada, é considerada
uma temperatura alta. O mesmo fato foi registrado por Assmann
(1996), que relatou que o baixo número de plântulas e plantas verdes
obtidas foi influenciado pelo mau funcionamento do sistema de
climatização.
165
4.2 - ANÁLISE CITOLÓGICA DA CULTIVAR MN-599 DE
CEVADA
Para a análise citológica, de cada espiga coletada, foram utilizadas
três espiguetas, com diferentes localizações na espiga, para verificar o
estádio dos micrósporos/grãos de pólen da espiga, antes da cultura in
vitro das anteras (ver Material e Métodos para maiores detalhes). A
possibilidade de seleção prévia das espigas com anteras em estádios
adequados para a cultura, permitiu economia de tempo, redução de
gastos e aumento da eficiência na obtenção de respostas embriogênicas
dos micrósporos/grãos de pólen.
Examinando a variação no grau de desenvolvimento do
micrósporo e do pólen em diferentes anteras, ao longo das espigas de
cevada, Assmann (1996) verificou que o uso de três espiguetas
permitiu uma melhor caracterização de cada espiga quanto aos estádios
de desenvolvimento dos micrósporos e grãos de pólen.
As análises citológicas realizadas por Ekberg & Eriksson (1965)
nas cultivares suecas de cevada “Forma” e “Bonus”, permitem supor
que a análise realizada no presente trabalho, de três espiguetas,
coletadas na base, meio e ápice (e utilizando a média das modas) deve
representar razoavelmente bem o estádio geral de desenvolvimento dos
grãos de pólen de cada espiga. Embora a distribuição ao longo da
espiga, dos estádios de desenvolvimento das anteras das nossas
cevadas seja diferente das suecas (Assmann, dados não-publicados), a
utilização do mesmo método de coleta tem se mostrado adequado.
A variação, nos estádios de desenvolvimento dos micrósporos/
grãos de pólen, entre anteras e espiguetas da mesma espiga, que já
tinha sido constatada por Wilson (1977), e confirmada no presente
trabalho, reduz a eficiência da resposta mesmo quando a maioria das
anteras contêm micrósporos/grãos de pólen no estádio uninucleado,
166
entre inicial e final - os mais adequados para a cultura in vitro.
Essa variação inicial explica a variação nas respostas obtidas
entre as anteras da mesma espiga estabelecida em meio de cultura,
bem como a variação entre micrósporos da mesma antera.
As análises, realizadas no presente estudo, foram realizadas por
espiga e por antera. As anteras de cada espiga, estabelecidas em uma
placa de petri e posteriormente fixadas para análise a cada três dias a
partir do início da cultura, permitiu um exame das mudanças que
ocorreram no desenvolvimento dos micrósporos/grãos de pólen.
Por essa razão, a partir da análise dos resultados obtidos, pode-se
dizer que micrósporos continuaram presentes até os dezoito dias de
cultivo in vitro das anteras, mostrando que nem todos continuam seu
desenvolvimento. Foram também encontrados muitos micrósporos
degenerados e colapsados ao longo da análise. Essa observação foi
ampliada pela presença dos demais estádios iniciais do desenvolvimento
normal dos grãos de pólen. Por outro lado, a análise permitiu avaliar em
quantos dias de cultivo, foi detectada, pela primeira vez, um novo
estádio de desenvolvimento in vitro dos micrósporos/grãos de pólen.
Binucleados assimétricos (não apresentados na tabela), em
freqüências dependentes da amostra, e simétricos, sempre raros, desde
os controles e ao longo da cultura, puderam ser observados em todas
as amostras. Entretanto, somente aos seis dias de cultivo, foram
detectados os primeiros bicelulares simétricos, um sinal de possível
ingresso na rota embriogênica.
Esses estádios puderam ser detectados pelo fato de a análise
citológica permitir a observação tridimensional do grão de pólen
evidenciando as duas células, generativa e vegetativa. Esse mesmo tipo
de observação não pôde ser realizada, com a mesma facilidade, na
análise histológica pelo fato da análise ser realizada em um só plano,
através de seções histológicas de 3 µm (ver item 3.3).
A partir do 3
o
dia de cultivo in vitro puderam ser detectados grãos
167
de pólen trinucleados simétricos, indicando uma possível entrada na
rota da embriogênese do micrósporo e do pólen.
A observação dos bicelulares simétricos a partir do Exp6, indicou
que os mesmos poderiam ser considerados também precursores do
ingresso na rota do processo de embriogênese. Isso se deve ao fato de
esse tipo celular não ser encontrado na rota normal do desenvolvimento
do grão de pólen (rota gametofítica), pois os bicelulares são
assimétricos.
Tricelulares simétricos, observados da Exp6 em diante, em baixas
freqüências, mostraram uma tendência da possível formação de
estruturas embriogênicas. A formação de multinucleados (já observados
a partir da Exp3) e de multicelulares, a partir da Exp6, confirmam essa
tendência. Dessa forma, os trinucleados simétricos podem ser
considerados um dos precursores da formação de estruturas
embriogênicas.
As primeiras estruturas embriogênicas foram observadas com
nove dias de cultura in vitro (Exp9). A partir dessa amostra, o número
médio de estruturas por antera cresceu significativamente (aumentou
mais de 50 vezes).
Fan et al. (1988) observaram que a primeira divisão produziu dois
núcleos difusos corados, sendo que as divisões subseqüentes deram
origem a grãos de pólen multinucleados. Esses autores observaram
ainda que grãos de pólen binucleados produziram embriões através de
divisões do núcleo vegetativo. O que foi observado pelos autores, em
menor número, foi a produção de calos a partir de micrósporos, sendo
que estes não continuam a dividir-se, resultando em calos degenerados.
Os resultados obtidos não apóiam a sugestão de alguns autores
sobre a importância do “pólen-p” para a formação de estruturas
embriogênicas e conseqüente obtenção de plantas haplóides e duplo-
haplóides de cevada. Heberle-Bors (1982) concluiu que a ocorrência de
"pólen-p" está integrada no desenvolvimento sexual das plantas, já que
168
condições alteram o balanço sexual em direção à feminilidade,
resultando na produção de grãos de pólen estéreis, sendo indicados
como competentes para a embriogênese in vitro. O mesmo autor
encontrou "pólen-p" com núcleo tipo-vegetativo.
Como relatado anteriormente, há muitas hipóteses sobre a função
e ocorrência dos grãos de “pólen-p”, mas nada que seja esclarecedor.
Alguns autores tentam explicar que esses pólens não são
imprescindíveis para a embriogênese, como por exemplo, Roberts-
Oehlschlager & Dunwell (1991). Os autores relatam que esses grãos
não seriam os únicos capazes de formar um embrião in vitro, pois
observaram que a maioria dos grãos de pólen que estavam em contato
com o tapete é que formaram estruturas multicelulares.
Binarova et al. (1997) estudando o tratamento de estresse em
Brassica napus L., relataram que a síntese de DNA iniciou em ambas
células, generativa e vegetativa, mas somente a vegetativa foi capaz de
completar o ciclo celular e dividir posteriormente.
Andrófitos (grãos de pólen) com células extranumerárias foram
observados, no presente trabalho, somente nas amostragens de
material in vitro (a partir da Exp6), provavelmente devido à indução
pelo pré-tratamento desencadeando divisão celular e possibilitando uma
maior freqüência dos tipos celulares com maior número de células.
Assmann (1996) e Assmann & Winge (1996) analisaram o efeito da
composição de diferentes meios de indução e de regeneração sobre as
freqüências da produção de estruturas embriogênicas e de embriões de
cevada (cultivares brasileira); os melhores meios entre os testados, foi
utilizado no presente trabalho.
A divisão celular simétrica também pode ser explicada da mesma
forma, pois Wilson et al. (1978) verificaram que, após o pré-tratamento
(2 dias) nas anteras responsivas, o número de grãos de pólen
binucleados aumentou em aproximadamente 10 vezes, como resultado
da divisão atípica (simétrica). Quando o período de pré-tratamento foi
169
prolongado além de dois dias, o desenvolvimento dos grãos de pólen
chegou ao estádio trinucleado, mas não ocorreu deposição de amido.
Após 10 a 14 dias, grãos de pólen multicelulares volumosos foram
evidentes, aparentemente sem células derivadas da célula generativa.
Cultivados por vários dias a mais, ocorreu a ruptura da exina e a
liberação de uma estrutura embriogênica amorfa.
Kasha et al. (2001b) testando combinações de pré-tratamento,
observaram que durante o período de quatro dias de pré-tratamento de
0,3 M de manitol, a maioria das primeiras divisões foi simétrica, tanto
em 25 °C quanto em 4 °C. Por outro lado, durante 28 dias de pré-
tratamento a 4 °C, 90% das divisões foram simétricas. Os autores
ainda reforçam que essas duas rotas observadas em cevada são
influenciadas pelos métodos de pré-tratamento. Entretanto, Assmann
(1996) mostrou que pré-tratamento a 5
o
C, por 30 dias, não regenerou
plantas verdes em cultivares brasileiras de cevada, confirmando e
ampliando resultados obtidos por Revers (1993), que utilizou 28 dias e
mesma temperatura. Os melhores resultados, obtidos por Assmann,
envolveram o meio I-3, após pré-tratamento de 10 dias à baixa
temperatura.
Com pré-tratamento à baixa temperatura, Peng et al. (1997)
encontraram, após 7 a 9 dias, primeira divisão mitótica simétrica,
resultando na produção de dois núcleos idênticos em grãos de pólen de
aspargo.
Deve ser ressaltado que a divisão simétrica não é um fenômeno
exclusivo do cultivo in vitro, mas que também ocorre in vivo, registrado
por Filho et al. (2003) em Brachiaria decumbens. Esse fato foi atribuído
a uma mutação, provavelmente afetando a formação do microtúbulo no
citoesqueleto.
Oliveira et al. (2001) também constataram, em andrófitos de
Anacardium occidentale L. obtidos in vivo, que a partir da primeira
mitose anômala foram produzidos grãos de pólen binucleados com
170
células idênticas, ou quase, demonstrando uma provável simetria.
Por outro lado, a formação de andrófitos multinucleados pode não
ser uma resposta exclusiva ao cultivo. Rodrigues et al. (2005)
registraram o aumento da proporção de andrófitos multinucleados de
soja, tanto em botões florais mantidos em 4 °C no escuro quanto em
anteras sob cultivo, sem diferença significativa. Apesar de eles terem
alcançado a etapa de multinucleados, não houve celularização em
ambos os tratamentos.
Em contrapartida, mas estudando cevada, Szarejko & Kasha
(1991) não encontraram benefícios do pré-tratamento à baixa
temperatura, quando foi comparado o material cultivado in vitro
diretamente (0 dia) com aquele pré-tratado.
Foi observado que durante o período de pré-tratamento, as
metáfases dos grãos de pólen foram quase todas haplóides, devido ao
número de cromossomos observados na análise citológica (Wilson et
al., 1978).
A observação de uma maior concentração de grãos de pólen
multinucleados e/ou multicelulares na região proximal da antera (em
relação ao filete) pode ser explicada pelas reservas nutritivas existentes
no lóculo, pelo transporte célula/célula do meio externo para o interior
do esporângio ou pela manutenção da função translocadora dos
elementos vasculares do filete. Esse fenômeno mereceria uma análise
mais detalhada esclarecendo se essas hipóteses são ou não
verdadeiras. Na região distal (em relação ao filete), foram encontrados
somente alguns grãos de pólen multinucleados, da mesma forma que
estruturas embriogênicas.
Demonstrando a importância do efeito posicional da antera,
também em cevada, na cultivar Akka, Dale (1975) encontrou grãos de
pólen dimórficos, verificando que os mesmos ocorriam
predominantemente na porção basal da antera, ou seja, na região
proximal. Porém, Oliveira et al. (2001) observaram, no clone CP76 de
171
A. occidentale L., que a distribuição dos grãos de pólen anômalos foi
uniforme nos esporângios.
Deve ser ressaltado também que foram encontrados micrósporos
vazios e “normais” em ambas regiões da antera, novamente
demonstrando que o “timing” no desenvolvimento dos micrósporos e/ou
grãos de pólen é diferente entre eles e também quando comparados
com outras anteras, inclusive da mesma cultivar. Jähne & Lörz (1995)
comentam a sincronia no desenvolvimento dos micrósporos e pólen de
cevada. Essa sincronia não pode ser afirmada, porque cada micrósporo
ou grão de pólen reage em períodos de tempo diferentes a certos
estímulos, mesmo estando numa mesma antera. No presente trabalho
foi constatada essa assincronia, pois numa mesma antera foram
observados vários tipos celulares: micrósporos, grãos de pólen variando
de binucleados a multicelulares, e até mesmo, estruturas
embriogênicas. Em anteras de espigas recém-coletadas são
normalmente encontrados micrósporos/grãos de pólen em diversos
estádios próximos de desenvolvimento, mostrando a assincronia dos
mesmos. Grãos de “pólen-p”, encontrados na parte central da antera,
normalmente estão em estádios mais atrasados - provavelmente por
gradiente nutricional (Roberts-Oehlschlager & Dunwell, 1991).
172
4.3 - ANÁLISE HISTOLÓGICA E COMPARAÇÕES
PONTUAIS COM A ANÁLISE CITOLÓGICA DA CULTIVAR
MN-599 DE CEVADA
O comportamento diferencial de cada antera com relação à
formação de estruturas embriogênicas foi estudado em intervalos de
tempo pré-estabelecidos, ou seja, de dois em dois dias na histologia e
de três em três dias na citologia. Nesse estudo observou-se uma
considerável variação no desenvolvimento dos micrósporos e dos grãos
de pólen. Esse resultado pode ser explicado devido a posição da
espigueta na espiga, desenvolvimento diferencial de micrósporos e
grãos de pólen, e genótipo.
No presente trabalho, ao mesmo tempo em que foram observados
micrósporos, também foram observados grãos de pólen e, dependendo
da data de análise do material, estruturas embriogênicas, presentes na
mesma antera, demonstrando uma assincronia no desenvolvimento dos
tipos celulares. Essa observação está de acordo com Pulido et al.
(2005), onde foram realizadas análises a partir de material obtido da
cultura de anteras e da cultura de micrósporos isolados. Ao contrário da
observação realizada, Jähne & Lörz (1995) e Góralski et al. (1999),
referem-se à sincronia de desenvolvimento.
Um outro aspecto observado a partir da análise citológica, diz
respeito à análise de grãos de pólen binucleados simétricos e
assimétricos, ao longo do período de desenvolvimento in vitro. Na
análise histológica correspondente, essa descrição quanto à simetria
não pôde ser constatada, devido ao fato de serem seções seriadas do
material analisado. Uma análise precisa dependeria da observação de
cada seção para cada tipo celular, o que ficaria inviável, devido à
quantidade de material e lâminas a serem analisadas.
173
A questão da simetria nos grãos de pólen e a própria divisão
simétrica, tem causado controvérsia, devido ao fato dos estudos não
demonstrarem com clareza tanto a simetria das divisões, como os
resultados.
Alguns autores referem-se a núcleos com divisão simétrica, como
é o caso de Maraschin et al. (2005), mas o tamanho da célula é
diferente, como demonstrado em grãos de pólen multinucleados
analisados em microscopia de fluorescência.
Ríhová & Tupý (1999) demonstraram que acima de 95% das
divisões foram simétricas e produziram núcleos iguais. Alguns
micrósporos que se dividiram simetricamente produziram,
eventualmente, estruturas com 3 a 10 núcleos.
Portanto, com base no acima exposto, optou-se por não entrar no
mérito da discussão da simetria, pelo menos na análise histológica. É
necessário um estudo mais profundo e detalhado de simetria, para que
de posse destes resultados, pudéssemos elucidar de forma mais precisa
esta questão.
O fato de serem observados alguns grãos de pólen com um maior
número de cromossomos quando comparado com um normal nos
sugere uma hipótese sobre fusão nuclear, devido ao fato do material
ser proveniente de cultivo in vitro. Segundo Kasha et al. (2001b), a
fusão nuclear é considerada um fenômeno freqüente em plantas obtidas
a partir da cultura in vitro. Os autores relataram que a alta freqüência
de núcleos fusionados em cevada indica que a fusão nuclear ocorreu
entre os núcleos simétricos e assimétricos. No entanto, Oliveira et al.
(2001) observaram a ocorrência de fusão nuclear in vivo em
Anacardium occidentale L., a partir de grãos de pólen onde a parede
celular foi incompletamente formada na citocinese, ou até mesmo, sem
a ocorrência da mesma. Dessa forma, o núcleo que iria compor a célula
generativa migra em direção ao núcleo-irmão. A fusão ocorre após
gradual difusão da cromatina e alteração da morfologia de ambos os
174
núcleos na região de contato. Posteriormente, ocorre a confluência da
cariolinfa dos núcleos, originando um núcleo maior, posicionado na
região central do grão de pólen.
A grande quantidade de amido encontrada tanto nos grãos de
pólen jovens e multicelulares, quanto nas estruturas multicelulares
pode ser explicado como uma fonte de energia acumulada para a
divisão celular durante a primeira fase do crescimento, como
demonstrado por Oka et al. (1995) em embriões de cevada, onde a
reserva foi encontrada em células epidérmicas e subdérmicas da base
foliar.
Da mesma forma que no presente trabalho, McCormick (1993)
encontrou acúmulo de amido nos grãos de pólen, marcando o
comprometimento para a rota de desenvolvimento do pólen.
Demonstrando a importância do amido, Ríhová & Tupý (1999)
observaram que houve acúmulo no pólen de batata durante o
desenvolvimento normal em anteras, sendo que o amido pode ser
utilizado como um marcador para testar a expressão do “destino”
celular gametofítico na dependência do modo de divisão do micrósporo.
A formação de estruturas semelhantes a embriões localizadas na
epiderme de estruturas embriogênicas também foi registrada por
Rodrigues et al. (2005) para a soja, onde também se referiu a embriões
destacando-se da epiderme, mas a partir de anteras submetidas ao
cultivo in vitro, e não diretamente da epiderme ou protoderme das
estruturas multicelulares. De forma semelhante ao do presente
trabalho, Ryschka et al. (1991) também encontraram estruturas na
epiderme semelhantes a embriões, que foram denominadas de pró-
embrióides, a partir do cultivo de embriões imaturos de cevada. No
presente trabalho foram encontradas estruturas semelhantes a essas,
dando-se preferência à adoção da descrição realizada por Cai et al.
(1992), onde foi utilizado o termo “estruturas”, devido ao fato da
formação de embriões e de calos simultaneamente em uma mesma
175
antera.
A característica das células dessas estruturas globulares,
apresentando tecido parenquimatoso, com as características típicas de
uma célula parenquimatosa, destacando a presença de um vacuoma
bem desenvolvido, também foi relatado por Haensch (2004) para
Pelargonium x hortorum Bailey e Rodrigues et al. (2005) para a soja.
Segundo Hoekstra et al. (1992), micrósporos isolados de cevada
podem desenvolver-se em estruturas tipo-embriões (ELSs) após 21 dias
de cultura. Alguns autores consideram grãos de pólen multicelulares
como estruturas embriogênicas e/ou embriões (Pulido et al., 2001) e
vice-versa (Moraes et al., 2004), ou quando o pólen apresenta a
esporoderme iniciando o rompimento (Hause & Hahn, 1998), como é o
caso mostrado aos 10 dias de cultivo. Pulido et al. (2001), em cevada,
classifica ainda os multicelulares em embriões homogêneos e
heterogêneos, com relação ao tamanho das células. Moraes et al.
(2004), em soja, destacam estruturas multicelulares como grãos de
pólen multicelulares. Na literatura há muitas variações conceituais,
afetando conseqüentemente a classificação dos tipos celulares. No
presente trabalho foi considerada estrutura multicelular e/ou
embriogênica, a etapa em que o pólen multicelular rompeu a
esporoderme, ainda que parcialmente, apresentando algumas células
para o desenvolvimento ontogenético posterior.
Hause & Hahn (1998) investigando a embriogênese de Brassica
napus L. cultivar “Topas”, três dias após a indução in vitro, puderam
separar em seis grupos os tipos celulares observados, de micrósporos
até estruturas multicelulares jovens (MCs). O agrupamento foi baseado
em diferenças de tamanho, estrutura da parede, estrutura e distribuição
de organelas e o grau de vacuolação. Somente um grupo multicelular
representou o real pró-embrião, capaz de formar embriões e regenerar
plântulas. Esse tipo multicelular apresentou características de células
meristemáticas e embriogências, destacando as características de
176
parede celular fina, contendo plasmodesmos e vacúolos pequenos.
No presente trabalho foram encontradas estruturas multicelulares
a partir dos 8 dias de cultivo in vitro, porém eram estruturas em fase
inicial de diferenciação. Também foram constatadas estruturas jovens,
multinucleados e multicelulares que não progrediram no
desenvolvimento. De forma semelhante, Custers et al. (1994)
verificaram que em Brassica napus L., mesmo após sucessivas induções
de divisões embriogênicas, as estruturas multicelulares jovens (MCs)
interromperam seu desenvolvimento e degeneraram.
Em concordância com o trabalho de Hause & Hahn (1998)
tratando da embriogênese inicial de Brassica napus L., foi constatado
que os grãos de pólen multicelulares e/ou estruturas multicelulares
iniciais com a esporoderme parcialmente rompida, apresentaram maior
diferenciação celular na região onde as células já estavam livres da
esporoderme. Segundo esses autores, esse comportamento seria uma
forma de degeneração, por apresentarem células com características
diferentes daquelas observadas em células meristemáticas, como citado
anteriormente. Dessa forma, a ruptura precoce da parede celular do
grão de pólen in vitro ocasiona um elevado crescimento das células,
vacuolação e posterior degeneração. Esse comportamento foi
comumente encontrado no presente trabalho, desde as etapas iniciais
do desenvolvimento, até a formação de estruturas embriogênicas.
Além do exposto anteriormente, o extravasamento de material
celular de grãos de pólen multinucleados e multicelulares ainda pode
ser explicado pelo processo de fixação do material. Nessa etapa a célula
cessa sua atividade, e, dependendo do tipo de fixador, pode ter maior
ou menor perda de material celular. Nesse caso específico do trabalho,
para a análise histológica foi utilizado o fixador FAA 50% (Johansen,
1940) que provoca a coagulação dos componentes nucleares e
dissolução da maior parte das organelas celulares, com manutenção
177
apenas dos plastídios. A parede celular se mantém com poucas
alterações visíveis em microscopia de luz.
Os grãos de pólen multinucleados e multicelulares intensamente
corados, mencionados nos resultados como “potencialmente
embriogênicos”, foram observados através da análise de seções
seriadas, podendo ser deduzido que esse tipo morfológico desencadeou
a formação das estruturas embriogênicas. Mas a observação do material
também permitiu constatar que grãos de pólen corados normalmente
com azul de toluidina entraram na rota da embriogênese do micrósporo
e do grão de pólen. Segundo Hause & Hahn (1998), esse tipo celular
com citoplasma intensamente corado apresentou grandes amiloplastos.
Os autores não verificaram o desenvolvimento posterior, pois não foi
observada atividade mitótica no referido tipo celular, a partir do estudo
das etapas iniciais da embriogênese de Brassica napus L.
As estruturas realmente embriogênicas, ou seja, aquelas onde
houve a formação de um embrião, foram poucas, sendo observadas a
partir dos 24 dias de cultura. Essa constatação só pôde ser realizada
através da análise da histologia, com o apoio da morfologia interna das
estruturas. Foi verificado que estruturas que possuíam a morfologia
semelhante à ELSs, apresentando aparentemente alguns embriões, na
verdade não puderam ser consideradas como tal, por demonstrarem,
através da histologia, somente a formação de parênquima com tecido
vascular, sem diferenciação em embrião. Outras estruturas
embriogênicas apresentaram polaridade semelhante ao embrião
zigótico, ou seja, mostrando bipolaridade. Em alguns casos foram
observadas até plântulas em desenvolvimento. Haensch (2004),
anteriormente citado, chama a atenção para a bipolaridade das
estruturas embriogênicas, ressaltando novamente a importância da
bipolaridade para a formação de um embrião semelhante ao zigótico.
Deve ser ressaltado que na literatura são escassos os trabalhos
mostrando a ontogenia da embriogênese dos micrósporos e dos grãos
178
de pólen obtidos in vitro. Em geral, os autores se concentram no estudo
das etapas iniciais do processo. Ainda, alguns autores se concentram no
estudo das etapas iniciais do desenvolvimento in vitro, por se tratar da
etapa da mudança de rota de desenvolvimento, como é o caso do
estudo de Hause & Hahn (1998).
Foram encontradas estruturas embriogênicas com tecido vascular
evidente, mostrando uma diferenciação das mesmas, em função da
posição-dependência. Para essas estruturas se manterem no meio de
cultura, sem degradação, elas precisam sofrer diferenciação celular,
desenvolvendo tecido vascular para que haja transporte de solutos,
retirados do meio, para toda a estrutura. Observação semelhante foi
realizada em ELSs de soja por Rodrigues et al. (2005), que após 21
dias, células típicas do tecido pró-vascular diferenciaram na porção
parenquimatosa dos calos oriundos do conectivo, dando origem a
elementos traqueais.
As estruturas embriogênicas que não apresentaram meristema
radical mostraram elementos vasculares com espessamentos helicoidais
a espiralados, dependendo da seção analisada. Observação semelhante
foi realizada por Haensch (2004) em ELSs somáticas de Pelargonium x
hortorum Bailey, onde foram encontrados elementos do feixe xilemático
com espessamento espiralado. Como as estruturas analisadas não
apresentaram uma orientação para poderem ser emblocadas, em
alguns casos pôde-se ter idéia do tipo de espessamento encontrado nas
paredes dos elementos vasculares das mesmas.
Os cordões pró-vasculares encontrados em algumas estruturas
embriogênicas, como células achatadas e dispostas concentricamente,
também foram encontradas em outras plantas obtidas in vitro, como
por exemplo em Catasetum pileatum Reichb. f. (Kraus, 1986) e em
erva-mate, Ilex paraguariensis St. Hil. (Cassol, 1997). Na literatura
esses cordões pró-vasculares (ou meristemóides) são descritos como
pequenos agregados de células em divisão, podendo tornar-se centros
179
de formação de ápices aéreos, primórdios radicais ou embriões
incipientes (Doods, 1986). Por outro lado, Shanker & Mohan Ram
(1990) definem os cordões pró-vasculares como sendo zonas discretas
de xilema e floema separados por um meristem pró-vascular, enquanto
os meristemóides são desprovidos de vascularização.
Em Nicotiana spp., Ronchi (1981) discute a função dos cordões
vasculares em calos, sugerindo que uma vez diferenciadas as células de
xilema e floema, essas providenciariam um caminho de condução que
levaria ao desenvolvimento de estruturas organizadas. Outra função
seria regular o gradiente de fitorreguladores sintetizados em regiões
específicas do calo, sendo responsáveis pela diferenciação de diferentes
tipos de estruturas organizadas, dependendo do balanço dos
fitorreguladores. Deve ser ressaltado que o controle do processo
morfogênico no tecido do calo pode ser diferente daquele da planta
como um todo, pois a diferenciação do tecido vascular, que precede a
morfogênese, ocorre na ausência de um meristema organizado.
Pérez-Francés et al. (1995) também relataram a presença de
células nodulares em calos de Erysimum scoparium, onde foi verificada
uma grande quantidade de amido. Os autores enfatizam ainda que,
freqüentemente, muitas células localizadas no centro dos cordões pró-
vasculares foram intensamente coradas em seções histológicas com
toluidina, como encontrado no presente trabalho.
A transdiferenciação em elementos traqueais (TEs) in vitro é
induzida pela combinação de auxina e citocinina e, em alguns casos, por
ferimento. O processo de transdiferenciação pode ser dividido em várias
etapas, sendo algumas semelhantes às observadas in vivo (Fukuda,
1997). Células isoladas do mesofilo de Zinnia elegans L. foram
transdiferenciadas em TEs, células características que compõem os
elementos xilemáticos na planta, caracterizadas pela formação de
espessamentos secundários de parede celular e morte celular
programada. Motose et al. (2004) observaram que a indução da
180
interação célula a célula foi mediada pela atuação de um fator secretor
local, o xilogênio para atividade xilogênica, sendo essa atividade
incluída nas frações das proteínas arabinogalactanos (AGPs), que são
um grupo de proteoglicanos de plantas. Em Asparagus officinalis L.
encontraram TEs aos 10 dias de cultura e em Zinnia elegans durante 96
h de cultura, sugerindo que o xilogênio não é espécie-específico, mas é
comum em diversas angiospermas. A partir dos resultados, concluíram
que o xilogênio é um AGP que é essencial para a diferenciação do TE.
No presente trabalho foram observadas células de estruturas
embriogênicas apresentando TE, variando a freqüência e a diferenciação
das mesmas com os dias de cultivo in vitro. Pode-se dizer que as
estruturas possuem posição-dependência do meristema, por influência
do meio de cultura. Não foi realizado um estudo aprofundado com
relação a esse aspecto, por não ser o objetivo do trabalho, mas poderia
ser estudada a ontogenia, concomitante com o uso dos AGPs para
análise imunohistoquímica, no sentido de explicar como e quando é
iniciada a diferenciação do tecido vascular in vitro.
Elementos traqueais também foram encontrados por Cassol
(1997) em calos compactos e pulverulentos de erva-mate,
apresentando espessamento helicoidal, como aqueles encontrados no
presente trabalho. Os calos ou estruturas analisados também
apresentaram espessamento aparentemente helicoidal, mas geralmente
os calos ditos pulverulentos, mostraram ser uma massa celular amorfa.
Os tricomas, aparentemente da parte aérea, observados na
epiderme de algumas ELSs também foram encontrados por
Bandyopadhyay et al. (2004) em Tectona grandis L., a partir do cultivo
de ápices aéreos. Sabe-se que os tricomas são apêndices epidérmicos
possuindo várias formas, estrutura e função, sendo associados a um
tricoblasto, comum em epidermes de raízes. No presente estudo,
provavelmente estariam relacionados à nutrição, já que as estruturas,
as ELSs, permaneceram em contato com o meio de cultura por um
181
longo período, até a coleta para a análise. Esses apêndices foram
observados preferencialmente nas estruturas “mais velhas”, ou seja, as
que permaneceram um período maior em contato com o meio.
Os ápices aéreos e radicais podem ter suas estruturas histológicas
similares aos zigóticos, ou seja, constituídos de centro quiescente,
protoderme, meristema pró-vascular e meristema fundamental.
Anatomicamente, as raízes das estruturas embriogênicas de
cevada possuíram todos os sistemas histológicos de uma raiz primária,
inclusive com a presença de um centro quiescente. Em erva-mate,
Cassol (1997) também encontrou raízes neoformadas com as mesmas
caracterísiticas. Da mesma forma em que foram observados sinais de
degeneração das camadas de células marginais, nos dois trabalhos,
indicando uma repetição in vitro da ontogenia da raiz, já que essa
característica ocorreu mesmo quando o órgão não estava sofrendo
algum tipo de resistência, havendo necessidade de proteção do ápice
meristemático.
As estruturas embriogênicas apresentaram ápices aéreos em
diferenciação, com a presença de vascularização, podendo ser
evidenciados primórdios foliares e escutelo. Em alguns embriões foi
detectada a presença de um possível epiblasto. Essa estrutura é
característica de algumas Poaceae, especialmente da tribo Triticeae,
como é o caso da cevada (Norstog, 1961) e trigo (Cocucci & Astegiano,
1978).
Em alguns embriões foram verificados meristema apical caulinar
(MAC) organizados em três camadas. Derman (1947) estabelece o
conceito de camadas histogênicas, apresentando um meristema
composto de três camadas meristemáticas fundamentais: L1 ou C1
(dérmica) e L2 ou C2 (subdérmica), apresentando divisões anticlinais;
L3 ou C3 (central), com divisões em diversos planos. Bowman & Eshed
(2000) comentam que o MAC é inicialmente formado durante a
182
embriogênese, e as derivadas desse meristema formarão o parênquima
fundamental da planta.
Plântula, segundo Font Quer (1993), refere-se ao embrião já
desenvolvido, como conseqüência da germinação. No presente estudo,
em algumas estruturas embriogênicas obtidas in vitro foi verificado, já
pela análise morfológica, a presença tanto de uma parte aérea, com
folha(s) verde(s) ou albina(s), como da parte radicular, ou de ambas. A
análise histológica confirmou a morfológica, nos referidos casos,
indicando tratar-se de uma plântula.
Lins (2005) estudando embrião zigótico de monocotiledônea,
Philodendron Schott (Araceae), considerou plântula as fases de
desenvolvimento compreendidas entre a emergência da radícula e da
primeira raiz adventícia. Assim, foi possível o registro da emergência de
todos os tipos de raízes desenvolvidas pelas espécies analisadas. A
referida autora, na sua discussão em comparação com outros autores,
considerou que a germinação se inicia com o rompimento da testa e
tégmen e a emergência da radícula.
Em concordância com o presente trabalho, Stival (1995) comenta
a dificuldade de se diferenciar claramente as estruturas de cevada
obtidas in vitro, através do microscópio estereoscópico. Ainda, a autora
ressalta que a diferenciação ocorreu tanto pela via embriogênica quanto
pela organogênica. A partir da rota embriogênica foram obtidas
plântulas com um considerável grau de desenvolvimento histológico.
Por outro lado, as ELSs obtidas pela via organogênica apresentaram
diferenciação em raiz e parte aérea, com a presença de tecido vascular.
Essas observações foram semelhantes às encontradas no presente
trabalho, ressaltando-se uma maior organização histológica das
plântulas, bem como das ELSs, onde puderam ser visualizadas uma
vascularização mais diferenciada. Como neste trabalho foram estudadas
várias estruturas embriogênicas (ELSs) até a obtenção de plântulas, em
183
diferentes períodos de tempo, pôde-se obter um melhor
acompanhamento e entendimento da diferenciação celular e histológica.
Ainda em cevada, Nonohay et al. (1999) estudaram calos
embriogênicos obtidos a partir do cultivo in vitro de embriões imaturos
oriundos do escutelo. Foram observados embriões somáticos mostrando
os principais tecidos, com um elevado padrão de organização celular.
No entanto, quando esses embriões foram comparados com o embrião
zigótico, foram considerados atípicos. Em comparação com o presente
trabalho, os embriões obtidos também se mostraram diferentes
daqueles descritos pelos autores. Nesse caso, dependendo da cultivar
ou linhagem analisada, foi encontrada uma maior diferenciação na parte
aérea, como referido pelos autores, ou na parte radical, que foi o caso
da cultivar não-selecionada MN-599.
Oka et al. (1995) comentam que o termo “embriogênico” não é
bem definido devido aos poucos estudos anatômicos com relação ao
desenvolvimento do embrião. Os autores mostram embriões somáticos
de cevada com estruturas semelhantes ao embrião zigótico. Dessa
forma, como relatado anteriormente, o termo estruturas
“embriogênicas” (ELSs) deveria ser utilizado somente quando se tivesse
certeza que a estrutura estaria formando um embrião.
Estudando a embriogênese in vitro de soja, uma dicotiledônea,
Rodrigues (2004) relatou a ocorrência de ELSs incompletas, bem como
de ELSs com formação inicial do cotilédone e do ápice radicular. É
comentada também a presença de tecido vascular, com destaque para
os elementos traqueais, semelhantes aos encontrados no presente
trabalho, mostrando um padrão de histodiferenciação.
Para a cultura in vitro, sabe-se que a rota embriogênica é
imprescindível na formação de plântulas, sendo essencial para a alta
freqüência de regeneração. Cai et al. (1992) comentam essa
importância para a cultura de anteras de cevada.
184
4.4 - ANÁLISE HISTOLÓGICA DAS LINHAGENS
SELECIONADAS (CULTIVARES DE CEVADA A-05 E BR-2)
Nesse item serão comentadas algumas variações encontradas nas
linhagens analisadas, para posteriormente serem feitas as comparações
com a cultivar não-selecionada MN-599.
Nas linhagens da cultivar A-05 (S
3
A22 e S
3
A23) foi encontrada
uma alta freqüência de estruturas embriogênicas, mesmo que
estatisticamente não tenha sido encontrada diferença significativa,
visualmente essa diferença foi percebida; bem como, um maior número
de plântulas albinas.
Linhagem S
3
A23
Na linhagem S
3
A23 foi observado um grão de pólen multinucleado
rompido e com material extravasado, aos 12 dias de cultivo in vitro. Há
evidências de que a partir do material extravasado ocorra a formação
de estruturas embriogênicas, como mostrado nas figuras do item 3.4.
Um grão de pólen multicelular observado aos seis dias pode ser
considerado como estrutura embriogênica por alguns autores (Pulido et
al., 2001). Por outro lado, no presente trabalho foi considerada
estrutura embriogênica somente quando a esporoderme se rompe
liberando um número significativo de células, sendo estas capazes de
seguir o desenvolvimento. A esporoderme pode ainda estar
parcialmente rompida, mas as células devem estar organizadas de tal
forma que se possa fazer uma homologia com um pró-embrião zigótico.
Esse caso foi observado aos 8 dias de cultivo in vitro. Aos 16 dias foi
observado um embrião em desenvolvimento, semelhante ao pró-
embrião zigótico (Goldberg, et al. 1994) inclusive com a presença de
suspensor. Emons (1994) comenta que células semelhantes ao
185
suspensor, cuja estrutura é encontrada no embrião zigótico, geralmente
não estão presentes nos embriões obtidos através da embriogênese
somática. Entretanto, essa autora relatou a presença de estruturas
semelhantes ao suspensor em Picea mariana e P. glauca, através da
embriogênese somática.
Como foi já relatado para a cultivar MN-599, foi observada a
divisão simétrica para a linhagem S
3
A23. Ríhová & Tupý (1999),
anteriormente citados, comentam que acima de 95% das divisões foram
simétricas.
Aos 18 dias foram encontrados embriões em desenvolvimento.
Devido a dificuldade de análise do material, não se pôde precisar o
estádio de desenvolvimento, mas há indícios que poderiam ser
embriões, com desenvolvimento de raiz, e com a parte aérea mais
evidente. Pôde ser evidenciado um embrião, o qual possuía uma
bipolaridade semelhante ao embrião zigótico, podendo inclusive ser
destacada a presença de várias divisões mitóticas ocorrendo no
meristema apical. Tal fato mostra a capacidade de diferenciação e
alongamento celular da região. Esse embrião foi o único considerado
como bipolar na linhagem S
3
A23, segundo os dados que podem ser
visualizados na tabela 14. Chasan & Walbot (1993) comentam que o
desenvolvimento de embriões somáticos é similar ao do embrião
zigótico, embora difiram na iniciação e nos eventos finais da
embriogênese. Como a maioria dos trabalhos na literatura aborda a
análise de embriões obtidos a partir da embriogênese somática,
algumas comparações são realizadas no presente trabalho. Essa
comparação é pertinente, pois nos dois sistemas abordados, os
embriões são obtidos in vitro.
Os outros embriões foram considerados como possuindo apenas
MAC (meristema apical caulinar), por estar bem evidenciado, e outro,
como sem forma, pois a formação de raiz, além de inicial, não se tinha
uma evidência mais concreta para poder ser feita uma afirmação.
186
Linhagem S
3
A22
A celularização observada nos multinucleados foi um fator de
grande importância com relação ao ingresso na rota da embriogênese
do micrósporo e do pólen in vitro. Essa ocorrência celular foi observada
a partir do 6
o
dia, período em que pode ser marcado como início da
embriogênese in vitro.
Novamente a divisão simétrica, ou uma aparente simetria, foi
observada. Como explicado anteriormente, para se ter uma divisão
simétrica é necessário que sejam evidenciados células e núcleos com o
mesmo tamanho.
Os micrósporos e grãos de pólen testados quanto a presença de
amido reagiram positivamente, mostrando uma elevada quantidade.
Segundo Ríhová & Tupý (1999) o amido pode ser utilizado como um
marcador do ingresso dos grãos de pólen na rota gametofítica.
Muitas constatações realizadas para a cultivar MN-599 se repetem
para as linhagens analisadas, como é o caso de ruptura de multicelular
com material extravasado, e fusão nuclear. Para não haver repetição de
discussão de assuntos tratados anteriormente, nesse item serão
abordados somente assuntos relevantes, sendo que posteriormente, no
último item da discussão, a Análise comparativa, serão realizadas as
devidas comparações.
Os multicelulares que apresentaram células com núcleos do tipo
vegetativo ou generativo foram semelhantes aos analisados por Wilson
et al. (1978). Os autores comentam que quando não ocorre a formação
de parede celular, são produzidos grãos de pólen volumosos
(“gigantes”). Nesse caso, com núcleos descendentes da célula
generativa. Entretanto, é mais freqüente a ocorrência de descendentes
de núcleos vegetativos nos grãos de pólen multicelulares, como
constatado no presente trabalho e relatados por vários autores,
inclusive os citados anteriormente (Wilson et al., 1978).
187
Na rota III verifica-se que a célula generativa, do grão de pólen
típico, é capaz de formar um embrião in vitro. Esse caso foi relatado em
Glycine max (L.) Merrill por Kaltchuk-Santos et al. (1997), mas
também, para a mesma espécie foi relatada a ocorrência das rotas I
(Kaltchuk-Santos et al., 1993) e IV (Kaltchuk-Santos et al., 1997),
mostrando que não somente o grão de pólen simétrico seja capaz de
originar um embrião in vitro. Ainda que existam muitos trabalhos
descrevendo esse aspecto e apoiando a simetria como um fator chave
para que ocorra a embriogênese, como por exemplo os trabalhos de
Fan et al. (1988) e Peng et al. (1997), os dados encontrados na
literatura não são suficientemente detalhados para se ter uma idéia
clara do que realmente ocorre no desenvolvimento do micrósporo e do
grão de pólen.
Foi observada a presença de tricoma, como já discutido para a
cultivar MN-599. Esse apêndice foi observado preferencialmente em
estruturas apresentando vários feixes vasculares. Williams &
Maheswaran (1986) relatam que estruturas tipo-tricomas (“hair-like
structures”) mostraram deposição de calose e cutinização da parede.
Para os autores não ficou claro se essas características foram
associadas com a embriogênese somática ou com a iniciação de
tricomas, que poderiam ser iniciadas na embriogênese somática em
estádio posterior.
Nas estruturas observadas aos 34 dias, produzidas a partir de
uma das anteras analisadas, todas as estruturas foram classificadas
como SFD mas com zonas de diferenciação, por apresentarem nódulos
vasculares. Como referido anteriormente, esses nódulos vasculares são
considerados como zonas discretas de xilema e floema (Shanker &
Mohan Ram, 1990), ou centros de formação de ápices aéreos,
primórdios radicais ou embriões incipientes (Doods, 1986). Essa
explicação é pertinente, pois as estruturas pareciam estar se
188
diferenciando em primórdios caulinares e também, em tecidos
vasculares.
Linhagem S
3
B63
A presença de parede primária é necessária para a divisão e
expansão celulares. A comprovação da parede celular nas estruturas
multicelulares em desenvolvimento, através da reação com calcoflúor,
mostrou uma organização das mesmas, onde foram evidenciados
inclusive os espaços intercelulares. Segundo Kraus et al. (2003), a
parede é formada nos primeiros estádios do desenvolvimento da célula.
189
4.5 - ANÁLISE COMPARATIVA DAS LINHAGENS
SELECIONADAS (CULTIVARES DE CEVADA A-05 E
BR-2) E DA CULTIVAR MN-599
Segundo Allard (1960), seleção, em genética, é a discriminação
entre indivíduos quanto ao número de descendentes que contribuem
para as gerações seguintes. Borém (1997) completa esse conceito
comentando ainda que seleção é o favorecimento de determinados
indivíduos em relação a outros.
A seleção realizada no presente trabalho é pioneira, no sentido da
obtenção de melhores respostas in vitro das anteras a partir de
linhagens selecionadas. Dessa forma, até o presente momento não
foram encontrados trabalhos semelhantes na literatura que utilizaram a
seleção no sentido genético, para a obtenção de plantas de cevada
geneticamente melhoradas quanto à capacidade de melhor responder
ao cultivo in vitro de suas anteras. Em trigo (Triticum aestivum L.),
Mihály et al. (2002) utilizaram a técnica de cultura de anteras para a
produção de linhagens resistentes a herbicidas, previamente
selecionadas para a alta resposta na cultura de “tecidos somáticos”. Os
autores não informaram de que forma foi realizada essa seleção,
ressaltando apenas que, das seis linhagens testadas, obtiveram quatro
linhagens transgênicas com plantas T
2
(2
a
geração de transformação
genética) homogêneas resistentes a herbicidas.
São encontrados vários artigos na literatura abordando “seleção”,
porém utilizando essa palavra para referir-se à escolha do material
obtido in vitro, como por exemplo em aveia (Avena sativa L.), onde
foram selecionados calos embriogênicos para a transformação de
genética de plantas (Cavichioli-Lamb et al., 2001; Lamb et al., 2002).
Segundo Bouharmont (1994), a regeneração de plantas a partir de
células não-diferenciadas no cultivo in vitro, é freqüentemente uma
fonte de variabilidade. Bouharmont & Dekeyser (1985) comentam que
190
uma alta freqüência de modificações é induzida em cultivo in vitro,
sendo que algumas delas são muito utilizadas. A partir da seleção in
vitro, em nível celular, foram obtidas, por exemplo, plantas tolerantes à
salinidade (Croughan et al., 1981), ao alumínio (Swaminathan, 1982) e
ao glifosato (Zambrano et al., 2003).
Ainda, uma outra abordagem pode ser utilizada em seleção, onde
algumas características agronomicamente importantes são selecionadas
para o melhoramento das espécies. Essa é a abordagem mais
comumente utilizada. Podem ser citados alguns trabalhos, como por
exemplo o de Mazzocato et al. (2002), onde foram testados genótipos
de milho em solução mínima para selecionar os tolerantes ao alumínio;
e o de Rosal et al. (2000) com o objetivo de avaliar a eficiência da
seleção precoce para o caráter produtividade de grãos na cultura do
feijão.
Comparando-se os embriões das linhagens selecionadas e da
cultivar, foram verificadas diferenças com relação à diferenciação dos
mesmos. Para essas comparações, são necessárias, primeiramente,
algumas comparações com embriões zigóticos:
Nas monocotiledôneas são encontradas grandes diferenças
morfológicas e anatômicas, inclusive no embrião zigótico, como é o caso
de Poaceae. Cocucci (2005) propõe um sistema de classificação de
sementes com a sua respectiva fórmula. No caso das Poáceas, a
fórmula da semente é 42: o embrião apresenta vários nós, tornando-se
plantulóide do tipo multinodal. Os tecidos de reserva originam-se no
endosperma (xenófito). Portanto, é um embrião multinodal do tipo
endospérmico.
Esau (1974) chama a atenção para essa família Poaceae,
comentando que o desenvolvimento e a estrutura do embrião são tão
complexos que geram o maior número de problemas de interpretação
morfológica do que qualquer outro embrião vegetal. Devido a essas
características, Cocucci & Astegiano (1978) consideram o embrião das
191
Poáceas como altamente especializado, possuindo estruturas novas,
sem haver homologia com outros embriões de Monocotiledôneas. As
referidas estruturas são as seguintes: escutelo, coleóptilo, coleorriza e
epiblasto. O escutelo é um órgão peltiforme que possui função
haustorial, considerado como o cotilédone das monocotiledôneas.
Segundo Guignard & Mestre (1971), durante a evolução a folha
cotiledonar transformou-se em escutelo. O epiblasto é um apêndice
não-vascularizado, contínuo com o escutelo e que, juntamente com
parte desse último, circunda o coleóptilo, o qual contém o ápice caulinar
(Cocucci & Astegiano, 1978). Alguns embriões apresentam epiblasto,
como é o caso de Triticum sp. e Avena sp., analisados pelos referidos
autores, pertecentes à tribo Triticeae, na qual encontra-se também a
cevada. Natesh & Rau (1984) comentam sugestão de que o epiblasto
denota um vestígio de um segundo cotilédone, em comparação com as
dicotiledôneas. A coleorriza é uma massa quase cônica, não-
vascularizada, cujo vértice se relaciona com o suspensor embrionário
(Cocucci & Astegiano, 1978).
Ressaltando ainda as variações encontradas nos embriões de
monocotiledôneas, Keating (2002) comenta que Araceae, entre a
família das monocotiledôneas, é a que possui mais variações
morfológicas relativas à expansão das estruturas embrionárias até
plântulas, e que o estudo de germinação das sementes favorece o
entendimento dessas variações.
Dessa forma, o estudo anatômico de plantas obtidas in vitro se
mostra imprescindível na definição das estruturas encontradas em um
embrião semelhante ao zigótico, no caso do presente trabalho,
denominados como ELSs (estruturas tipo-embrião). Poucos foram os
trabalhos encontrados na literatura descrevendo a embriogênese do
micrósporo e do grão de pólen obtidos in vitro. De forma semelhante,
há carência de trabalhos descrevendo tanto a morfologia quanto a
anatomia das estruturas embriogênicas obtidas in vitro. Até o presente
192
momento, esse trabalho é também pioneiro no estudo detalhado da
ontogenia da embriogênese, desde o micrósporo até plântula.
Johansen (1950), discutindo as teorias com relação ao
crescimento e diferenciação dos embriões de plantas, postulou que os
destinos das linhagens de células embriogênicas são determinados no
período em que a polaridade é estabelecida no zigoto ou no pró-
embrião. No desenvolvimento convencional, a disposição de células em
relação aos tecidos e órgãos que eles formam podem ser extremamente
ordenadas (teoria da disposição), sugerindo que o desvio do padrão
normal de tal disposição pode ser desastroso para o embrião. A
precisão geométrica cujas células embriogênicas devem dividir-se para
a distribuição seqüencial e ordenada das células embriogênicas pode ser
uma conseqüência do comportamento parcimônico (teoria da
parcimônia: “o embrião produz somente as células absolutamente
necessárias”).
Os embriões obtidos in vitro, mesmo quando semelhantes ao
zigótico, apresentam grandes diferenças. Isso pôde ser observado nos
embriões analisados, onde a bipolaridade não estava bem definida. Para
conseguir a polaridade, uma célula deve ligar e integrar uma série de
sinais extrínsecos e intrínsecos através de uma cascata de sinalização
que leva à localização intracelular específica de complexos de
macromoléculas ao longo do eixo (Quatrano & Shaw, 1997). Paquette &
Benfey (2001) comentam que no estádio pró-embriogênico o
crescimento da planta é altamente polarizado, com proliferações
celulares ocorrendo quase que exclusivamente nas duas porções finais
do eixo longitudinal: o ápice da raiz e o ápice caulinar. Fan et al. (1988)
relatam que o desenvolvimento regular do embrião depende da
produção de uma parede celular completa para separar as células-
filhas. Em concordância com esses autores, Quatrano & Shaw (1997)
relatam que a parede celular é necessária para a fixação de um eixo
193
polar no zigoto e para a determinação do destino celular em embriões
com duas células.
Análises de genes necessários para a formação do eixo
embrionário sugerem que a sinalização entre os domínios
embriogênicos pode ser essencial para a formação da raiz (Harada,
1999). Como anteriormente citado, os ápices radicais embrionários
adventícios, geralmente, também não apresentaram um elevado grau
de diferenciação. Da mesma forma, os ápices caulinares, sendo
observadas grandes massas celulares, simulando um escutelo. Alguns
embriões (ELSs) apresentaram raízes aparentemente bem definidas,
com tecidos em diferenciação. Nesses embriões foram observados a
protoderme, o meristema fundamental e o pró-vascular. Em alguns
casos, a protoderme já estava bem definida, diferenciando-se em
epiderme.
Dentre as estruturas radicais, a coifa, pôde ser comparada ao
embrião zigótico, por apresentar-se bem definida. Os primórdios
radicais, provavelmente de origem do mesocótilo, conseqüentemente se
desenvolveriam em raízes embrionárias adventícias. Segundo Font Quer
(1993), nas plantas de muitas monocotiledôneas o mesocótilo se refere
à porção caulinar situada entre o hipocótilo e o epicótilo. Esau (1982)
considera o mesocótilo como a região entre o nó escutelar e o
coleóptilo. Cocucci & Astegiano (1978) relatam que em Triticum, após a
germinação do embrião, o desenvolvimento do mesocótilo foi
praticamente nulo. A observação de raízes adventícias na região
radicular das ELSs, foi semelhante ao encontrado em embriões zigóticos
de Montrichardia linifera (Arruda) Schott por Lins & Oliveira (1994),
demonstrando que, também nessa espécie, somente as raízes
adventícias se desenvolveram, ressaltando novamente a complexidade
de desenvolvimento dos embriões de monocotiledôneas.
Para uma melhor elucidação da análise histológica dos embriões
(ELSs) obtidos in vitro, foram realizadas algumas seções de embriões
194
zigóticos maduros de cevada (dados não-mostrados). Os embriões
encontrados foram semelhantes ao observado por Norstog (1961) aos
21 dias, apenas mais diferenciados. Nessas seções foram observadas
cinco raízes, sendo que quatro apresentaram posição mais lateral, as
embrionárias adventícias, de origem provável do mesocótilo. A outra
raiz, observada no eixo embrionário, pode ser identificada como uma
radícula. Norstog (1961) apresentou um esquema de uma seção de um
embrião zigótico, e esquemas de seções de embriões obtidos in vitro a
partir de embriões imaturos, aos 14, 21, 25 e 30 dias de cultivo.
Fazendo-se uma comparação do embrião zigótico com aqueles
observados in vitro, verificam-se algumas diferenças, principalmente
referentes à diferenciação das células, ao período de tempo de
desenvolvimento e à polaridade. No caso do ápice radical, como já
relatado, a formação da coifa foi semelhante nas duas observações, no
presente trabalho e no de Norstog (1961). De forma semelhante, Kraus
(1986) também não constatou grandes diferenças nos ápices
radiculares observados in vitro em plântulas de Catasetum pileatum
obtidas a partir de explantes radiculares, quando comparadas com
plântulas obtidas em casa de vegetação. Outro resultado observado
pela referida autora, em concordância com o presente trabalho, foi a
caracterização da coifa. Essa estrutura apresentou-se constituída por
várias camadas de células na porção mais apical, mostrando as
características celulares semelhantes ao embrião zigótico. Após a coifa,
foi evidenciada a protoderme unisseriada, e internamente a ela, o
meristema fundamental, formado por várias camadas celulares,
aproximadamente isodiamétricas. O centro quiescente é responsável
por toda a formação das células derivadas, que darão origem a
protoderme, meristema fundamental e meristema pró-vascular.
Maraschin et al. (2003) comparando ELSs de cevada obtidas in
vitro após 21 dias de indução com embriões zigóticos de 21 dias após a
polinização, não encontraram diferenças nos padrões de expressão da
195
proteína 14-3-3. Essa proteína está presente na embriogênese, fazendo
parte do processo de diferenciação celular. Os autores não fazem
comparações dos tecidos embrionários observados nos embriões
zigóticos e nos embriões obtidos in vitro. Porém, a partir das imagens
podem ser realizadas algumas comparações com o presente trabalho:
os embriões obtidos in vitro apresentaram diferenças, obviamente em
uma menor organização celular, quando comparados aos zigóticos. Essa
diferença na organização não se refletiu na formação dos tecidos e na
organização final do embrião obtido in vitro, já que foram apontados os
mesmos tecidos para os dois tipos analisados. Podem ser citados:
escutelo, meristema apical caulinar, coleóptilo, primórdios foliares,
mesocótilo, meristema apical radical e coifa. Essas mesmas estruturas
foram observadas no presente trabalho. Os autores anteriormente
citados não comentam sobre a característica adventícia embrionária
dessas raízes (o meristema apical radical embrionário adventício).
Na comparação pontual do material obtido in vitro e in vivo, os
grãos de pólen maduros com uma grande quantidade de amido marcam
a rota de desenvolvimento da embriogênese do pólen, segundo
McCormick (1993), armazenando a energia necessária para a
maturação do pólen.
O desenvolvimento de toda a planta, a partir de uma única célula,
como é o caso do presente estudo, em que foram utilizados micrósporos
(mas também andrófitos imaturos) in vitro, requer tanto a
determinação de muitos tipos celulares, como a organização dessas
células em um padrão elaborado (Henry et al., 1994). Esses autores
ainda discutem que todos os genótipos possuem informações genéticas
necessárias para a embriogênese zigótica. A variação encontrada nas
diferentes respostas do material in vitro depende da regulação da
informação genética, ou da capacidade das células vegetais entrarem
em um novo programa, em diferentes etapas do desenvolvimento.
196
Comparando-se ainda o embrião zigótico e o embrião obtido in
vitro, Norstog (1961) comenta que as células de pró-embriões
cultivados in vitro retêm a capacidade para iniciar o desenvolvimento de
primórdios radiculares e foliares, além da interrupção das relações
ontogenéticas normais. O autor ainda discute que a simetria bilateral do
embrião da cevada resulta do crescimento massivo, na porção mais
superior e envolvente do escutelo. Com relação aos primórdios, o autor
salienta que a diferenciação ocorreu após a produção de um número
significativo de células. A partir desses comentários, pode-se inferir que
no presente trabalho, como foram observados embriões com escutelo
super desenvolvido, esse crescimento acentuado serviria para o
armazenamento de energia para o desenvolvimento do embrião in vitro
e conseqüente para a diferenciação dos tecidos.
Norstog (1961) relatou que o desenvolvimento de primórdios
caulinares múltiplos em pró-embriões de cevada obtidos in vitro, pôde
ser atribuído a um sistema relativamente imperfeito de gradientes
estabelecidos nas culturas. Esses primórdios caulinares múltiplos
também foram encontrados na análise de embriões somáticos de
cevada por Nonohay et al. (1999). No presente trabalho não foram
observados primórdios caulinares múltiplos, porém foram constatadas
regiões do meristema caulinar onde houve uma grande proliferação
celular. Portanto, pode-se dizer que a parte aérea foi superdesenvolvida
no embrião in vitro, ressaltando uma diferença em comparação com o
embrião zigótico.
A partir da discussão nesses subitens, serão traçadas algumas
considerações pertinentes a esse assunto no item a seguir.
197
5 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
198
A partir dos resultados obtidos e da discussão antes realizada,
podem ser traçadas as seguintes considerações:
Com relação aos períodos aparentemente descontínuos no
desenvolvimento dos tipos celulares observados, foi verificado, em
análises do conteúdo das anteras, que não há sincronia de estádios de
desenvolvimento dos micrósporos/grãos de pólen dentro de cada
espiga. De acordo com a posição da espigueta ao longo de cada lado da
espiga, as análises mostraram: a) alguma variação entre os estádios
dos micrósporos/grãos de pólen de cada antera; b) entre espiguetas; c)
variação mais acentuada entre espiguetas ao longo do mesmo lado da
espiga, e d) alguma variação entre os dois lados da mesma espiga. Isso
está em concordância com outros estudos anteriormente realizados
(Ekberg & Eriksson, 1965, em cevadas suecas; Assmann dados não-
publicados, em cevadas brasileiras).
Houve diferenças entre uma das linhagens selecionadas da
cultivar A-05 em relação a cultivar MN-599, na produção inicial de
estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu quando avaliada a
produção total. Entretanto, houve diferenças significativas entre as
linhagens da cv. A-05 e as da BR-2 quanto à regeneração de plântulas
verdes, maior na BR-2. Esses resultados indicam ter havido maior
eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração, do que na de
indução. O ingresso na rota esporofítica e conseqüente formação de
estruturas embriogênicas foi observado claramente a partir do 8
o
dia de
cultivo in vitro. Entretanto, já no 6
o
dia de cultura, foram observados
bicelulares simétricos – o que pode ser considerado um primeiro sinal
de ingresso na rota esporofítica. Calos e estruturas embriogênicas
liberadas dos lóculos das anteras, apresentaram embriões observados
pela primeira vez aos 18 dias de cultivo in vitrop
199
Análise Estatística). Por outro lado, a cultivar não-selecionada MN-599,
pode ser considerada também competente, porém com uma menor
produção de estruturas embriogências in vitro. Essa cultivar foi eficiente
na diferenciação das mesmas para embriões, produzindo embriões
histodiferenciados.
Portanto, a análise histológica comprovou os dados da produção
da cultura de anteras, mostrando que a seleção foi eficiente, a partir do
grande número de estruturas formadas nas linhagens da cultivar A-05.
A cultivar MN-599 apresentou um considerável potencial para a
formação de embriões. Como não foram observados embriões da
linhagem S
3
B63 na análise histológica, a hipótese é de que a formação
aconteça com um maior tempo de cultivo in vitro. Essa linhagem foi
analisada histologicamente até 28 dias, e como foi selecionada para
uma alta regeneração de plântulas verdes, esses embriões foram
formados posteriormente a esse período. Os dados da cultura de
anteras revelaram que essa linhagem produziu um considerável número
de plântulas.
A histologia mostrou-se de grande importância na identificação
das estruturas realmente embriogênicas, ou seja, aquelas que
formaram embriões. Através da morfologia, sem o emprego
concomitante da histologia, podem ser formuladas hipóteses errôneas
acerca da origem dos embriões obtidos in vitro.
Os padrões de histodiferenciação que foram observados no
presente trabalho foram semelhantes ao de embriões somáticos
observado por Emons (1994). Essa comparação pode ser feita ao
embrião zigótico, uma vez que há algumas semelhanças. Deve ser
ressaltado que os embriões obtidos in vitro apresentaram alterações no
padrão de desenvolvimento de estruturas, como os ápices caulinares,
destacando o escutelo como uma estrutura superdesenvolvida nos
embriões obtidos in vitro. Esse comportamento pode ser devido à
importância dessa estrutura para a reserva de nutrientes para a
200
plântula, e no caso da cultura in vitro, esses embriões dependem do
desenvolvimento do escutelo para poderem se manter nesse ambiente
artificial.
Houve variação no desenvolvimento dos meristemas das
linhagens e da cultivar analisadas. Observou-se que nas duas linhagens
da cultivar A-05 ocorreu menor diferenciação do meristema radical,
quando comparadas à cultivar não-selecionada MN-599. Essa cultivar
apresentou estruturas embriogênicas e embriões com meristema radical
diferenciado, mostrando uma maior diferenciação nesse meristema
quando comparado ao caulinar.
Diferenças entre as linhagens e a cultivar não-selecionada
também foram observadas com relação ao tempo de formação dos tipos
celulares e das estruturas embriogênicas e embriões. No caso das
linhagens, a formação de estruturas embriogênicas semelhantes à pró-
embriões foi verificada primeiramente aos 14 dias na linhagem S
3
A22,
enquanto que na linhagem S
3
A23 somente foi constatada aos 16 dias
de cultivo in vitro. Na linhagem S
3
B63 não foi observada, dentro do
período analisado, a formação de embriões.
A cultivar não-selecionada e as linhagens diferiram não só pelo
tempo de formação dos embriões, mas pelo desenvolvimento dos
embriões, mais diferenciados na cultivar não-selecionada MN-599, e
observados antes nas duas linhagens da cultivar A-05: S
3
A23 e S
3
A22
Por outro lado, a cultivar MN-599 teve comportamento
semelhante à linhagem S
3
A22 com relação à vascularização. Uma
hipótese para essa constatação é de que os feixes vasculares foram
encontrados somente na cultivar e nessa linhagem.
É pertinente ressaltar que este trabalho, por ser pioneiro no
estudo detalhado da ontogenia da embriogênese, desde o micrósporo
até plântula, permitiu, além de um melhor entendimento dos aspectos
da embriogênese in vitro, mas também a consolidação de uma linha de
pesquisa integrada entre Botânica e Genética.
201
Pela carência de artigos científicos publicados com relação a esse
estudo, a divulgação dos resultados obtidos nesse trabalho trará uma
contribuição significativa para outros grupos e Centros de Pesquisa.
Dessa forma, poderão utilizá-lo como referência para apoio e
comparações de novos estudos a serem realizados com cevadas de
outras regiões.
202
6 - TRABALHOS FUTUROS
203
A partir de material já coletado poderão ser realizados trabalhos
posteriores, nos seguintes aspectos:
6.1 - Análises citológicas de anteras cultivadas in vitro
O material já está coletado e fixado em FAA 50% (Johansen,
1940) e encontra-se armazenado em “eppendorfs” com etanol 70%.
Essas anteras são as de BLOCOS, citadas anteriormente no Material e
Métodos (Figura 6 e Tabela 2). Na Figura 6 pode-se observar o
esquema de obtenção do material e na tabela 2, podem ser observadas
a origem do material e a quantidade de material estocado.
Esse material, já obtido, poderá ser analisado para aumentar o
tamanho amostral do presente trabalho, já que foi analisada somente
uma espiga da cultivar MN-599 (espiga M088) e realizar a análise
citológica das amostras das linhagens S
3
A22 e S
3
B63, para comparação
com os resultados da análise histológica, e/ou futuramente, para servir
de comparação com o material obtido in vivo.
6.2 – Análises cito-histológicas de espigas de cevada
(cultivar MN-599) obtidas in vivo
Antes de iniciar a coleta das espigas de cevada, foram realizadas
as seguintes medidas de cada planta (Figuras 44 B, C e D e Figuras
45 A, B e C):
- altura – altura da planta até a lígula da folha bandeira,
em centímetros (cm);
204
- distância interlígulas – distância (cm) entre a lígula da
folha bandeira e a da folha imediatamente abaixo no
mesmo afilho (ver Figura 4 – Material e Métodos);
- tamanho da espiga – em centímetros
Foram coletadas, em diferentes momentos do seu
desenvolvimento, as espigas, e conseqüentemente as espiguetas, de
plantas de cevada cultivadas em casa de vegetação/telado, da cv. MN-
599, tanto para a análise histológica quanto para a citológica. De cada
amostra coletada, de um lado de cada espiga foram retiradas as
espiguetas, em laboratório (Figuras 44 E e F e Figura 46 D), para a
fixação em TRUMP (para a análise histológica), e do outro lado foram
fixadas as espiguetas, todas juntas e ainda inseridas na espiga, em
Farmer (para a análise citológica). O material obtido in vivo foi fixado
da seguinte forma:
- Trump: Glutaraldeído 1% : formaldeído 4% em tampão fosfato
0,1M - pH 7,2 – Trump (McDowell, 1978) para as análises
histológicas. O material (183 eppendorfs com 352 espiguetas)
encontra-se estocado em geladeira;
- Farmer (3 : 1 – etanol absoluto : ácido acético glacial) e
posteriormente (24 horas) transferido para etanol 70% para as
análises citológicas. O material também encontra-se estocado
em geladeira.
- Foram fixadas 29 espigas (na verdade, 29 meias-espigas,
porque somente um lado da espiga foi fixado em Farmer, e a
outra metade – cada espigueta, foi fixada em glutaraldeído :
formaldeído).
205
O material obtido será utilizado, em trabalhos futuros, como
testemunha para a comparação do processo in vivo, com as respostas
do material, analisado no presente trabalho, obtido in vitro.
Nas Figuras 44-46 são apresentadas as etapas da coleta, bem
como o material coletado.
206
207
20
8
209
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
210
ALLARD, R.W. Principles of plant breeding. 3. ed. New York: John
Wiley, 1960. 485 p.
ASSMANN, E.M. Estudo da resposta androgenética na cultura de
anteras in vitro de três cultivares brasileiras de cevada,
Hordeum vulgare vulgare, Poaceae. 1996. 128f. Dissertação
(Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Instituto de Biociências,
Curso de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1996.
ASSMANN, E.M.; WINGE, H. Response to in vitro anther culture of three
brazilian cultivars of barley, Hordeum vulgare vulgare. In:
INTERNATIONAL OAT CONFERENCE, 5, 1996, Saskatoon.
INTERNATIONAL BARLEY GENETICS SYMPOSIUM, 7, 1996, Saskatoon.
Proceedings... Saskatoon: University Extension Press, University of
Saskatchewan, 1996. v. 2, p. 455-457.
ATANASSOV, A. et al. In vitro production of haploid plants. World
journal of microbiology & biotechnology, v. 11, p. 400-408, 1995.
BAJAJ, Y.P.S. In vitro production of haploids. In: SHARP, W.R.;
AMMIRATO, P.V., YAMADA, Y. (Ed.) Handbook of plant cell culture:
techniques for propagation and breeding. New York: MacMillan, 1983. p.
228-287.
BANDYOPADHYAY, T. et al. Trichomes: their diversity, distribution and
density in acclimatization of teak (Tectona grandis L.) plants grown in
vitro. Plant cell, tissue and organ culture, v.78, p. 113-121, 2004.
BHANDARI, N.N. The microsporangium. In: JOHRI (Ed.). Embryology
of Angiosperms. Berlin: Springer, 1984. cap. 2, p. 53-121.
211
BHOJWANI, S.; RAZDAN, M.K. Plant tissue culture: theory and
practice (Developments in crop science, 5). Amsterdam: Elsevier,
1983, cap. 7, p. 113-141.
BINAROVA, P. et al. A short severe heat shock is required to induce
embryogenesis in late bicellular pollen of Brassica napus L. Sexual
plant reproduction, v. 10, p. 200-208, 1997.
BORÉM, A. Melhoramento de plantas. Viçosa: UFV, 1997. 547 p.
BOTHMER, R. von. The wild species of Hordeum: relationships and
potential use for improvement of cultivated barley. In: SHEWRY, P.R.,
(Ed.). Barley: genetics, molecular biology and biotechnology. London:
CAB International, 1991.
BOTHMER, R. von; JACOBSEN, N. Origin, taxonomy and related species.
In: Barley: Agronomy monograph, Madison, v. 26, p. 19-56, 1985.
BOTHMER, R. von et al. An ecogeographical study of the genus
Hordeum: systematic and ecogeographic studies on crop genepools,
2.ed. Rome: IPGRI, 1995. 129 p.
BOUHARMONT, J. Application of somaclonal variation and in vitro
selection to plant improvement. Acta horticulturae, v. 355, p. 213-
218, 1994.
BOUHARMONT, J.; DEKEYSER, A. Plant regeneration from calli for in
vitro selection in rice. In: OKA, H.I.; KHUSH, G.S. (Ed.). Rice
Genetics Newsletter. Misima: Rice Genetics Cooperative, 1985. cap.
36, v. 2, p. 91.
212
BOWMAN, J.L.; ESHED, Y. Formation and maintenance of the shoot
apical meristem. Trends in plant science, v. 5, n. 3, p. 110-115,
2000.
BROWN, A.D.H. Barley. In: TANKSLEY, S.D.; ORTON, T.J., (Ed.).
Isoenzymes in plant genetics and breeding. Part. B. Amsterdam:
Elsevier, 1983. p.57-77.
CAI, Q. et al. The effect of sugars and growth regulators on embryoid
formation and plant regeneration from barley anther culture. Plant
breeding, v. 109, p. 218-226, 1992.
CAREDDA, S. et al. Plastid ultrastructure and DNA related to albinism in
androgenetic embryos of various barley (Hordeum vulgare) cultivars.
Plant cell, tissue and organ culture, v. 76, p. 35-43, 2004.
CASSOL, B. Calogênese e morfogênese a partir de explantes
embrionários de Ilex paraguariensis St. Hil. (Aquifoliaceae).
1997. 109 f. Dissertação (Mestrado em Botânica) - Programa de Pós-
Graduação em Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1997.
CASTRO, J.L.; CAMARGO, C.E.O.; FURLANI, P.R. Coleção IAC de cevada
na Estação Experimental de Capão Bonito, SP. In: SIMPÓSIO NACIONAL
DE RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS. 1995. Campinas. Programa e
Resumos... Campinas: IAC, 1995. p.72.
CAVICHIOLI-LAMB, C.R. et al. Regeneração de plantas a partir de
segmentos de base de folhas em aveia. Ciência rural, v. 31, n. 5, p.
751-755, 2001.
213
CHASAN, R.; WALBOT, V. Mechanisms of plant reproduction: questions
and approaches. The plant cell, v. 5, p. 1139-1146, 1993.
CHEN, C.C.; KASHA, K.J.; MARSOLAIS. A. Segmentation patterns and
mechanisms of genome multiplication in cultured microspores of barley.
Canadian journal of genetics and cytology, v. 26, p. 475-483,
1984.
CISTUÉ, L. et al. Effects of culture conditions on isolated microspore
response of barley cultivar. Plant cell, tissue and organ culture, v.
42, p. 163-169, 1995.
CLAPHAM, D. In vitro development of callus from the pollen of Lolium
and Hordeum. Zeitschrift für pflanzenzüchtung, v. 65, n. 4, p. 285-
292, 1971.
CLAPHAM, D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro. Zeitschrift
für pflanzenzüchtung, v. 69, n. 2, p. 142-155, 1973.
CLAPHAM, D.H. Haploid inductions in cereals. In: REINERT, J.; BAJAJ,
Y.P.S. (Ed.). Applied and fundamental aspects of plant cell,
tissue, and organ culture. Berlin: Springer, 1977. cap. 2, p. 279-298.
COCUCCI, A.E. Morphogenetic seed types of Spermatophyta. Plant
systematics and evolution, v. 250, p. 1-6, 2005.
COCUCCI, A.E.; ASTEGIANO, M.E. Interpretacion del embrion de las
Poaceas. Kurtziana, v. 11, p. 41-54, 1978.
214
CROUGHAN, T.P. Anther culture for doubled haploid production. In:
GAMBORG, O.L.; PHILLIPS, G.C. (Ed.). Plant cell, tissue and organ
culture – Fundamental methods. Berlin: Springer, 1995. p. 143-154.
CROUGHAN, T.P.; STAVAREK, S.J.; RAINS, D.W. In vitro development
of salt resistant plants. Enviromental and experimental botany, v.
21, p. 317-324, 1981.
DALE, P.J. Pollen dimorphism and anther culture in barley. Planta,
Berlin, v. 127, p. 213-220, 1975.
DERMAN, H. Periclinal cytochimeras and histogenesis in cranberry.
American Journal of Botany, 34: 32-43, 1947.
DOODS, J.H. Experiments in plant tissue culture. Cambridge:
Cambridge University Press, 1986. 232p.
DUNWELL, J.M. Barley. In: ZAITLIN, M. et al. (Ed.). Biotechnology in
plant sciences. New York: Academic Press, 1985. p. 49-76.
DUNWELL, J.M. Barley. In: EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; AMMIRATO, P.V.
(Ed.). Handbook of plant cell culture. New York: MacMilan. 1986. v.
4, p. 49-76.
DUNWELL, J.M.; FRANCIS, R.J.; POWELL, W. Anther culture of Hordeum
vulgare L.: a genetic study of microspore callus production and
differentiation. Theoretical and applied genetics, v. 74, p. 60-64,
1987.
ECHART, C.L. Controle genético e mapeamento do gene de
tolerância ao alumínio em cevada. 2001. 100 f. Tese (Doutorado em
Genética e Biologia Molecular). Programa de Pós-Graduação em
215
Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biociências, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2001.
EKBERG, I.; ERIKSSON, G. Demonstration of meiosis and pollen mitosis
by photomicrograps and the distribution of meiotic stages in barley
spikes. Hereditas, v. 53, p. 127-136, 1965.
EMONS, A.M.C. Somatic embryogenesis: cell biological aspects. Acta
botanica neerlandica, v. 43, n. 1, p. 1-14, 1994.
ESAU, K. Anatomia das plantas com sementes. São Paulo: Edgard
Blücher, 1974. 293 p.
ESAU, K. Anatomia de las plantas com semilla. Buenos Aires:
Editorial Hemisferio Sur, 1982. 512 p.
FAN, Z.; ARMSTRONG, K.C.; KELLER, W.A. Development of microspores
in vivo and in vitro in Brassica napus L. Protoplasma, v. 147, p. 191-
199, 1988.
FAO. Yearbook of production. Rome: FAO, 1995.
FILHO, R.G.J. et al. Absence of microspore polarity, symmetric divisions
and pollen cell fate in Brachiaria decumbens (Gramineae). Genome, v.
46, p. 83-88, 2003.
FONT QUER, P. Diccionario de botánica. Barcelona: Editorial Labor,
1993.
216
FOROUGHI-WEHR, B.; FRIEDT, W.; WENZEL, G. On the genetic
improvement of androgenetic haploid formation in Hordeum vulgare L.
Theoretical and applied genetics, v. 62, p. 233-239, 1982.
FOROUGHI-WEHR, B. et al. Plant production from cultured anthers of
Hordeum vulgare L. Zeitung für pflanzenzüchtung, v. 77, p. 198-
204, 1976.
FOROUGHI-WEHR, B.; ZELLER, F.J. In vitro microspore reaction of
different German wheat cultivars. Theoretical and applied genetics,
v. 79, n. 1, p. 77-81, 1990.
FUKUDA, H. Tracheary element differentiation. The plant cell, v. 9, p.
1147-1156, 1997.
GERRITS, P.O.; SMID, L. A new, less toxic polymerization system for
the embedding of soft tissues in glycol methacrylate and subsequent
preparing of serial sections. Journal of microscopy, v. 132, p. 81-85,
1983.
GILPIN, M.J. et al. Morphological and molecular analysis of androgenic,
selfed and backcrossed plants produced from a Hordeum vulgare X H.
bulbosum hybrid. Plant breeding, v. 116, p. 505-510, 1997.
GOLDBERG, R.B.; PAIVA, G. de; YADEGARI, R. Plant embryogenesis:
Zygote to seed. Science, v. 266, p. 605-614, 1994.
GONZÁLEZ-MELENDI, P. et al. Three dimensional confocal and electron
microscopy imaging define the dynamics and mechanisms of
diploidisation at early stages of barley microspore-derived
embryogenesis. Planta, v. 222, p. 47-57, 2005.
217
GÓRALSKI, G. et al. Androgenic development: a fascinating embryo
formation process. Acta biologica cracoviensia, v. 41, p. 51-65,
1999.
GRANDO, M.F. Capacidade androgenética e sua relação com o
dimorfismo do pólen em linhagens duplo-haplóides de trigo
(Triticum aestivum L.) obtidas por cultura de anteras. 1990. 186
f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular). Programa
de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de
Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
1990.
GRANDO, M.F.; MORAES-FERNANDES, M.I. Two poit deterministic
model for acquisition of in vitro pollen grain androgenetic capacity
based on wheat studies. Brazilian journal of genetics, v. 20, n. 3, p.
467-476, 1997.
GUHA, S.; MAHESHWARI, S.C. In vitro production of embryos from
anthers of Datura. Nature, v. 204, n. 4957, p. 497, 1964.
GUHA, S.; MAHESHWARI, S.C. Cell division and differentiation of
embryos in the pollen grains of Datura in vitro. Nature, v. 212, n.
5057, p. 97-98, 1966.
GUIGNARD, J.-L.; MESTRE, J.-C. L’embryon des graminées.
Phytomorphology, v. 20, n. 2, p. 190-197, 1971.
GUO, Y.-D.; PULLI, S. An efficient androgenic embryogenesis and plant
regeneration method through isolated microspore culture in timothy
(Phleum pratense L.). Plant cell reports, v. 19, p. 761-767, 2000.
218
HAENSCH, K.-T. Morpho-histological study of somatic embryo-like
structures in hypocotyl cultures of Pelargonium x hortorum Bailey.
Plant cell reports, v. 22, p. 376-381, 2004.
HANCOCK, J.F. Plant evolution and the origin of crop species.
Englewood-Cliffs: Prentice Hall, 1992. 305 p.
HARADA, J.J. Signaling in plant embryogenesis. Current opinion in
plant biology, v. 2, p. 23-27, 1999.
HARADA, T.; SATO, T.; ASAKA, D. et al. Large-scale deletions of rice
plastid DNA in anther culture. Theoretical and applied genetics, v.
81, p. 157-161, 1991.
HARLAN, J.R. Barley. In: SIMMONDS, N.W. Evolution of crop plants.
London: Longman, 1976. p. 93-98.
HAUSE, G.; HAHN, H. Cytological characterization of multicellular
structures in embryogenic microspore cultures of Brassica napus L.
Botanica acta, v. 11, p. 204-211, 1998.
HEBERLE-BORS, E. In vitro pollen embryogenesis in Nicotiana tabacum
L. and its relation to pollen sterility, sex balance and floral induction of
pollen donor plants. Planta, Heidelberg, v. 156, p. 396-401, 1982.
HENRY, Y.; VAIN, P.; DE BUYSER, J. Genetic analysis of in vitro plant
tissue culture responses and regeneration capacities. Euphytica, v. 79,
p. 45-58, 1994.
219
HORNER, M.; STREET, H.E. Pollen dimorphism - Origin and significance
in pollen plant formation by anther culture. Annals of botany, v. 42, p.
763-771, 1978.
HOEKSTRA, S. et al. Anther and microspore culture of Hordeum vulgare
L. cv. Igri. Plant science, Ireland, v. 86, p. 89-96, 1992.
HUANG, B.; SUNDERLAND, N. Temperature-stress pretreatment in
barley anther culture. Annals of botany, v. 49, p. 77-88, 1982.
JÄHNE, A.; LÖRZ, H. Cereal microspore culture. Plant science, v. 109,
p. 1-12, 1995.
JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw-Hill, 1940.
523 p.
JOHANSEN, D.A. Plant embriology. Waltham: Chronica Botanica,
1950.
JONES, T.J.; ROST, T.L. The developmental anatomy and ultrastructure
of somatic embryos from rice (Oryza sativa L.) scutellum epithelial cells.
Botanical gazette, v. 150, p. 41-49, 1989.
KALTCHUK-SANTOS, E.; BODANESE-ZANETTINI, M.H.; MUNDSTOCK,
E.C. Pollen dimorphism in soybean. Protoplasma, v. 174, p. 74-78,
1993.
KALTCHUK-SANTOS, E. et al. Cytological analysis of early microspore
divisions and embryo formation in cultured soybean anthers. Plant cell,
tissue and organ culture, v. 49, p. 107-115, 1997.
220
KAO, K.N. et al. Culture conditions for induction of green plants from
barley microspores by anther culture methods. Plant cell reports, v.
9, p. 595-601, 1991.
KASHA, K.J. et al. An improved in vitro technique for isolated
microspore culture of barley. Euphytica, v. 120, p. 379-385, 2001a.
KASHA, K.J. et al. Nuclear fusion leads to chromosome doubling during
mannitol pretreatment of barley (Hordeum vulgare L.) microspores.
Journal of experimental botany, v. 52, n. 359, p. 1227-1238,
2001b.
KEATING, R.C. Acoraceae and Araceae. In: GREGORY, M.; CUTLER, T.F.
(Ed.). Anatomy of the monocotyledons. Oxford: Claredon Press.
2002. 322 p.
KLEINHOFS, A. et al. A molecular, isozyme and morphological map of
the barley genome. Theoretical and applied genetics, v. 86, p. 705-
712, 1993.
KNOX, R.B. The pollen grain. In: JOHRI (Ed.). Embryology of
Angiosperms. Berlin: Springer, 1984. cap. 5, p. 197-271.
KRAUS, J.E. Formação e desenvolvimento in vitro de estruturas
semelhantes a protocormos em ápices radiculares de Catasetum
pileatum Reichb. f. (Orchidaceae): Aspectos fisiológicos,
estruturais e histoquímicos. 1986. 153 f. Tese (Doutorado em
Botânica) - Programa de Pós-Graduação em Botânica, Instituto de
Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1986.
221
KRAUS, J.E. et al. A célula vegetal. In: APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.;
CARMELLO-GUERREIRO, S.M. (Ed.), Anatomia Vegetal. Viçosa: UFV,
2003. cap. 2, p. 31-86.
KÜHLMANN, U.; FOROUGHI-WEHR, B. Production of doubled haploid
lines in frequencies sufficient for barley breeding programs. Pant cell
reports, v. 8, n. 2, p. 78-81, 1989.
LAMB, C.R.C. et al. Embriogênese somática e regeneração de plantas a
partir de embrião maduro de aveia. Pesquisa agropecuária
brasileira, v. 37, n. 2, p. 123-130, 2002.
LARSEN, E.T.; TUVESSON, I.K.D.; ANDERSEN, S.B. Nuclear genes
affecting percentage of green plants in barley (Hordeum vulgare L.)
anther culture. Theoretical and applied genetics, v. 82, 417-420,
1991.
LI, H.; DEVAUX, P. Enhancement of microspore culture efficiency of
recalcitrant barley genotypes. Plant cell reports, v. 20, p. 475-481,
2001.
LI, W.-Z. et al. The effects of DNA hypomethylating drugs on
androgenesis in barley (Hordeum vulgare L.). In vitro cell. dev.
biology , plant, v. 37, p. 606-608, 2001.
LINS, A.L.F.A. Aspectos do desenvolvimento vegetativo de
espécies de Philodendron Schott (Araceae), com ênfase na
origem do sistema radical. 2005. 159 f. Tese (Doutorado em Ciências
– Botânica) - Programa de Pós-Graduação em Botânica, Instituto de
Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
2005.
222
LINS, A.L.F.A.; OLIVEIRA, P.L. Origem, aspectos morfológico e
anatômico das raízes embrionárias de Montrichardia linifera (Arruda)
Schott (Araceae). Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi, série
Botânica, v. 10, n. 2, p. 221-236, 1994.
LUIZZI, D.V.; CASTRO, A.J. Variabilidad genetica, su aporte al
desarollo del cultivo de cebada en el Uruguay. In: REUNIÓN
NACIONAL DE INVESTIGADORES EN CEBADA CERVECERA, 2, 1991,
Colonia. Anais... Colonia: 1991. n. 1, p. 1-13. (Publicação avulsa).
MARIATH, J.E.A.; SANTOS, R.P.; BITTENCOURT JR., N.S. Flor. In:
APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B.; CARMELLO-GUERREIRO, S.M. (Ed.),
Anatomia Vegetal. Viçosa: UFV, 2003. cap. 13, p. 329-373.
MARASCHIN, S. de F. et al. 14-3-3 isoforms and pattern formation
during barley microspore embryogenesis. Journal of experimental
botany, v. 54, n. 384, p. 1033-1043, 2003a.
MARASCHIN, S. de F.; LAMERS, G.E.M; WANG, M. Cell death and 14-3-
3 proteins during the induction of barley microspore androgenesis.
Biologia, v. 58, n. 1, p. 59-68, 2003b.
MARASCHIN, S. de F. et al. Time-lapse tracking of barley androgenesis
reveals position-determined cell death within pro-embryos. Planta, v.
220, p. 531-540, 2005.
MARIS, A.F. Caracterização isoenzimática de cultivares brasileiras
de cevada (Hordeum vulgare L.). 1992. 107 f. Monografia
(Bacharelado em Ciências Biológicas – ênfase Genética). Curso de
Bacharelado em Ciências Biológicas, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 1992.
223
MAZZOCATO, A.C.; Estudos sobre o processo de androgênese em
anteras de cevada, Hordeum vulgare L. ssp. vulgare, cultivadas in vitro.
Relatório técnico, Aperfeiçoamento/Pesquisa – APB. Processo: CNPq
522568/96-3, 1997. Porto Alegre: Departamento de Genética/UFRGS,
1997.
MAZZOCATO, A.C.; ASSMANN, E.M.; WINGE, H. Respostas
androgenéticas divergentes em cultivares brasileiras de cevada por
efeito de seleção. Genetics and molecular biology, v. 21, n. 3 supl.,
p. 221, 1998.
MAZZOCATO, A.C.; MARIATH, J.E.A.; WINGE, H. Análises cito-
histológicas do processo androgenético em linhagens selecionadas de
cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). In: REUNIÃO ANUAL DE
PESQUISA DE CEVADA, 23, 2003, Passo Fundo. Anais e ata... Passo
Fundo: Embrapa Trigo, 2003. p. 83-91.
MAZZOCATO, A.C. et al. Tolerância ao alumínio em plântulas de milho.
Ciência rural, v. 32, n.1, p. 19-24, 2002.
McCORMICK, S. Male gametophyte development. Plant cell, v. 5, p.
1265-1275, 1993.
McDOWELL, E.M. In: TRUMP, J. (Ed.). Diagnostic electron
microscopy. New York: John Wiley, 1978. p. 113-139.
McKONE, M.J.; HALPERN, S.L. The evolution of androgenesis. The
american naturalist, v. 161, n. 4, 2003.
224
MIHÁLY, R. et al. In vitro selection of transformed foreign gene (bar) in
wheat anther culture. Acta biologica szegediensis, v. 46, n. 3-4, p.
9-10, 2002.
MINELLA, E. Melhoramento genético de cevada para tolerância à
toxicidade de alumínio. In: Reunião de Pesquisa da Cevada, 16, 1996,
Guarapuava – PR. Relatório Técnico... 1996.
MINELLA, E. Melhoramento da cevada. In: BORÉM, A. (Ed.).
Melhoramento de espécies cultivadas. Viçosa: UFV, 1999. p. 253-
272.
MORAES, A.P. et al. Effect of temperature shock on soybean microspore
embryogenesis. Brazilian archives of biology and technology, v.
47, n. 4, p. 537-544, 2004.
MOTOSE, H.; SUGIYAMA, M.; FUKUDA, H. A proteoglycan mediates
inductive interaction during plant vascular development. Nature, v.
429, p. 873-878, 2004.
NATESH, S.; RAU, M.A. The embryo. In: JOHRI (Ed.). Embryology of
Angiosperms. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1984. cap. 8, p.
377-443.
NITSCH, J.P.; NITSCH, C. Haploid plants from pollen grains. Science, v.
163, p. 85-87, 3 jan. 1969.
NONOHAY, J.S.; MARIATH, J.E.A.; WINGE, H. Histological analysis of
somatic embryogenesis in Brazilian cultivars of barley, Hordeum vulgare
vulgare, Poaceae, Plant cell reports, v. 18, p. 929-934, 1999.
225
NORREEL, B. Étude cytologique de l’androgénèse expérimentale chez
Nicotiana tabacum et Datura innoxia. Bulletin de la société
botanique de France, p. 461-478, 1970.
NORSTOG, K. The growth and differentiation of cultured barley
embryos. American journal of botany, v. 48, p. 876-884, 1961.
OBERT, B. et al. Effect of different saccharides on viability of isolated
microspores and androgenic induction in Zea mays. Biologia
plantarum, v. 43, n. 1, p. 125-128, 2000.
O’BRIEN, T.P.; McCULLY, M.E. The study of plant structure
principles and selected methods. Melbourne: Termarcarphi Pty,
1981. 345 p.
OKA, S.; SAITO, N.; KAWAGUCHI, H. Histological observations on
initiation and morphogenesis in immature and mature embryo derived
callus of barley (Hordeum vulgare L.). Annals of botany, v. 76, p.
487-492, 1995.
OLIVEIRA, J.M.S.; MARIATH, J.E.A. Anther and pollen development in
Anacardium occidentale (Anacardiaceae) clone CP76.
Phytomorphology, v. 51, n. 1, p. 91-100, 2001.
OLIVEIRA, J.M.S.; MARIATH, J.E.A.; BUENO, D.M. Grãos de pólen
anômalos no clone CP76 de Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae).
Revista brasileira de botânica, v. 24, n. 4, p. 425-433, 2001.
OLMOS, I.L.J.; CAMARGO, M.N. Aluminum toxicity in brazilian soils:
characterization and distribution. Ciência e cultura, v. 28, p. 171-180.
1976.
226
OLSEN, F.L. Induction of microspore embryogenesis in cultured anthers
of Hordeum vulgare: the effects of ammonium nitrate, glutamine and
asparagine as nitrogen sources. Carlsberg research
communications, v. 52, p. 393-404, 1987.
PACINI, E.; FRANCHI, G.G.; RIPACCIOLI, M. Ripe pollen structure and
histochemistry of some gymnosperms. Plant systematics and
evolution, v. 217, p. 81-99, 1999.
PAIRE, A. et al. Proteins produced by barley microspores and their
derived androgenic structures promote in vitro zygotic maize embryo
formation. Plant cell, tissue and organ culture, v. 73, p. 167-176,
2003.
PAQUETTE, A.J.; BENFEY, P.N. Axis formation and polarity in plants.
Current opinion in genetics & development, v. 11, p. 405-409,
2001.
PEETERS, J.P. The emergence of new centers of diversity: evidence
from barley. Theoretical and applied genetics, v. 76, p. 327-378.
1988.
PENG, M.; ZIAUDDIN, A.; WOLYN, D.J. Development of asparagus
microspores in vivo and in vitro is influenced by gametogenic stage and
cold treatment. In vitro cellular and development biology, plant, v.
33, p. 263-268, 1997.
PÉREZ-FRANCÉS, J.P.; VALDÉS, F.; MARTÍN, R. Callus induction and
culture from explants of Erysimum scoparium in a growth regulator-free
medium. Plant cell, tissue and organ culture, v. 43, p. 223-228,
1995.
227
PETERS, J.A.; BOBROWSKI, V.L.; ROSINHA, G.M.S. Produção de
haplóides e duplo-haplóides. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO,
J.A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação genética de
plantas. Brasília: Embrapa-SPI / Embrapa-CNPH, 1999. v. 2, p. 569-
611.
POEHLMAN, J.M. Adaptation and distribution. In: RASMUSSON, D.C.
(Ed.). Barley. Madison-WI: American Society of Agronomy, Crop
Science Society of America and Soil Science Society of America,
Publishers, 1985.
PRETOVÁ, A. et al. Structural observations during androgenic
microspore culture of the 4c1 genotype of Zea mays L. Euphytica, v.
65, p. 61-69, 1993.
PULIDO, A. et al. Early stages of pollen embryogenesis in barley anther
cultures induced by pre-treatment with mannitol. International
journal of developmental biology, v. 45, p. 55-56, 2001.
PULIDO, A. et al. Cytological and ultrastructural changes induced in
anther and isolated-microspore cultures in barley: Fe deposits in
isolated-microspore cultures. Journal of structural biology, v. 149, p.
170-181, 2005.
QUATRANO, R.S.; SHAW, S.L. Role of the cell wall in the determination
of cell polarity and the plane of cell division in Fucus embryos. Trends
in plant science, v. 2, n. 1, p. 15-21, 1997.
RAGHAVAN, V. Developmental strategies of the angiosperm pollen: a
biochemical perspective. Cell diferentiation, v. 21, p. 213-226, 1987.
228
RAGHAVAN, V. Anther and pollen development in rice (Oryza sativa).
American journal of botany, v. 75, n. 2, p. 183-196, 1988.
RAMOS, D.B. Análise citológica da rota androgenética em cevada.
2003. 24 f. Relatório (Estágio Curricular em Biotecnologia) – Curso
Técnico em Biotecnologia, Escola Técnica, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul. Porto Alegre, 2003.
REVERS, L.F. Estudo comparativo da resposta à cultura de
anteras in vitro, de cultivares brasileiras de cevada, Hordeum
vulgare L. Poaceae. 1993. 71 f. Monografia (Bacharelado em Ciências
Biológicas – ênfase Genética). Curso de Bacharelado em Ciências
Biológicas, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, 1993.
RÍHOVÁ, L.; TUPÝ, J. Manipulation of division symmetry and
developmental fate in cultures of potate mirospores. Plant cell, tissue
and organ culture, v. 59, p. 135-145, 1999.
RITALA, A.; MANNONEN, L.; OKSMAN-CALDENTEY, K.-M. Factors
affecting the regeneration capacity of isolated barley microspores
(Hordeum vulgare L.). Plant cell reports, v. 20, p. 403-407, 2001.
ROBERTS-OEHLSCHLAGER, SL; DUNWELL, JM. Barley anther culture:
Pretreatment on manitol stimulates production of microspore-derived
embryos. Plant cell, tissue and organ culture, v. 20, p. 235-240,
1990.
ROBERTS-OEHLSCHLAGER, S.L.; DUNWELL, J.M. Barley anther culture:
The effect of position on pollen development in vivo and in vitro. Plant
cell reports, v. 9, p. 631-634. 1991.
229
RODRIGUES, L.R. Eventos embriogênicos em tecidos estaminais
de Glycine Max (L.) Merr. 2004. 135 f. Tese (Doutorado em Genética
e Biologia Molecular) – Programa de Pós-Graduação em Genética e
Biologia Molecular, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do sul, Porto Alegre, 2004.
RODRIGUES, L.R.; OLIVEIRA, J.M.S.; MARIATH, J.E.A. Anatomia vegetal
aplicada ao estudo de sistemas androgênicos in vitro. Revista
brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 2, n. 3, p. 143-150, 2004.
RODRIGUES, L.R. et al. Histology of embryogenic responses in soybean
anther culture. Plant cell, tissue and organ culture, v. 80, p. 129-
137, 2005.
RONCHI, V.N. Histological study of organogenesis in vitro from callus
culture of two Nicotiana species. Canadian journal of botany, v. 59,
n. 11, p. 1969-1977, 1981.
ROSAL, C.J.S. et al. Seleção precoce para a produtividade de grãos no
feijoeiro. Bragantia, v. 59, n. 2, p. 189-195, 2000.
RYSCHKA, S.; RYSCHKA, U.; SCHULZE, J. Anatomical studies on the
development of somatic embryoids in wheat and barley explants.
Biochem. physiol. pflanzen, v. 187, p. 31-41, 1991.
SASS, J.E. Botanical microtechnique. Ames: The Iowa state college,
1951. 391 p.
SCHMID, R. Filament histology and anther dehiscence. Botanical
journal of the linnean society, v. 73, p. 303-315, 1976.
230
SHANKER, S.; MOHAN RAM, H.Y. Plantlet regeneration from tissue
culture of Sesbania grandiflora. Current science, v. 59, n. 1, p. 39-43,
1990.
SILVA, A.L.S.da et al. Production of androgenetic barley doubled haploid
lines. Pesquisa agropecuária brasileira, v. 32, n. 11, p. 1159-1166,
1997.
SILVA, A.L.S.da; MORAES-FERNANDES, M.I.; FERREIRA, A.G.
Ontogenetic events in androgenesis of brazilian barley genotypes.
Revista brasileira de biologia, v. 60, n. 2, p. 315-319, 2000.
SNAPE, J.W.; SIMPSON, E. The genetical expectations of doubled
haploid lines derived from filial generations. Theoretical and applied
genetics, v. 60, p. 123-128, 1981.
SNUSTAD, D.P.; SIMMONS, M.J.; JENKINS, J.B. Principles of
genetics. New York: John Wiley, 1997. 829 p.
SOUTHWORTH, D. Cytochemical reactivity of pollen walls. Journal of
histochemistry and cytochemistry, v. 21, p. 73-80, 1973.
STIVAL, A.L. Aspectos fisiológicos, anatômicos e agronômicos da
indução e regeneração de duplo-haplóides androgenéticos em
genótipos brasileiros de cevada (Hordeum vulgare L.). 1995. 100
f. Dissertação (Mestrado em Botânica) - Programa de Pós-Graduação
em Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, 1995.
SUNDERLAND, N. Anther culture as a means of haploid induction. In:
KASHA, K.J. (Ed.) Haploids in higher plants - advances and potential.
231
II – Methods of producing haploids. C – Culture methods. Guelph:
University of Guelph, 1974. p. 91-122.
SUNDERLAND, N.; DUNWELL, J.M. Pathways in pollen embryogenesis.
In: STREET, H.E. (Ed.) Tissue culture and plant science, London:
Academic Press, p. 141-167, 1974.
SUNDERLAND, N. et al. Multicellular pollen formation in cultured barley
anthers. Journal of experimental botany, v. 30, n. 119, p. 1133-
1144, 1979.
SWAMINATHAN, M.S. Biotechnology research and third world
agriculture. Science, v. 218, p. 967-974.
SZAREJKO, I.; KASHA, K.J. Induction of anther culture derived doubled
haploids in barley. Cereal research communications, v. 19, n. 1/2,
p. 219-236, 1991.
TAYLOR, M.G.; VASIL, I.K. The ultrastructure of somatic embryo
development in pearl millet (Pennisetum glaucum; Poaceae). American
journal of botany, v. 82, n. 2, p. 205-219, 1995.
VITHANAGE, H.I.V.M.; KNOX, R.B. Pollen development and quantitative
cytochemistry of exine and intine enzymes in sunflower, Helianthus
annuus L. Annals of botany, v. 44, p. 95-106, 1979.
WILLIAMS, E.G.; MAHESWARAN, G. Somatic embryogenesis: Factors
influencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group.
Annals of botany, v. 57, n. 2, p. 443-462, 1986.
232
WILSON, C.L. The telome theory and the origin of the stamen.
American journal of botany, v. 29, p. 759-764, 1942.
WILSON, H.M. Culture of whole barley spikes stimulates high
frequencies of polen calluses in individual anthers. Plant science
letters, v. 9, n. 3, p. 233-238, 1977.
WILSON, H.M.; MIX, G.; FOROUGHI-WEHR, B. Early microspore
divisions and subsequent formation of microspore calluses at high
frequency in anthers of Hordeum vulgare L. Journal of experimental
botany, v. 29, n. 108, p. 227-238, 1978.
WOJNAROWIEZ, G. et al. Barley anther culture: assessment of
carbohydrate effects on embryo yield, green plant production and
differential plastid development in relation with albinism. Journal of
plant physiology, v. 161, p. 747-755, 2004.
XUHAN, X. et al. Polyploidization in embryogenic microspore cultures of
Brassica napus L. cv. Topas enables the generation of doubled haploid
clones by somatic embryogenesis. Protoplasma, v. 208, p. 240-247,
1999.
YEUNG, E.C. The use of histology in the study of plant tissue culture
systems – Some practical comments. In vitro cellular &
developmental biology, plant, v. 35, n. 2, p. 137-143, 1999.
ZAMBRANO, A.Y.; DEMEY, J.R.; GONZÁLEZ, V. In vitro selection of a
glyphosate-tolerant sugarcane cellular line. Plant molecular biology
reporter, v. 21, p. 365-373, 2003.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo