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Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Márcia Helena Niza Ramalho Sobral
AVALIAÇÃO DO DILUENTE OCULAR A BASE DE ÁGUA DE
COCO NA FORMA EM PÓ, PARA AS VACINAS CONTRA O
VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS,
DOENÇA DE NEWCASTLE E DOENÇA INFECCIOSA DA
BOLSA PELA MENSURAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL EM FRANGOS DE CORTE
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2005
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Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Márcia Helena Niza Ramalho Sobral
AVALIAÇÃO DO DILUENTE OCULAR A BASE DE ÁGUA DE
COCO NA FORMA EM PÓ, PARA AS VACINAS CONTRA O
VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS,
DOENÇA DE NEWCASTLE E DOENÇA INFECCIOSA DA
BOLSA PELA MENSURAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL EM FRANGOS DE CORTE
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2005
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal
Orientador:
Prof. Dr. William Cardoso Maciel
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Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do Trabalho:
Avaliação do diluente ocular a base de água de coco na forma em pó,
para as vacinas contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas, doença de Newcastle e
doença infecciosa da bolsa pela mensuração da resposta imune humoral em frangos de corte.
Autora:
Márcia Helena Niza Ramalho Sobral
Aprovada em 16/12/2005
Banca examinadora
____________________________________________
Prof. Dr. William Cardoso Maciel
Orientador
______________________________________________
Profa. Dra. Virginia Léo de Almeida Pereira
Examinadora
_______________________________________________
Prof. Dra. Maria Verônica Moraes Campello
Examinadora
4
DEDICATÓRIA
Aos meus filh os Eduardo e Mariana, razões
da minha vida, reflexos do meu amor.
Ao meu marido Ricardo, pelo carinho,
compreensão e companheirismo, proporcionando a
conquista desta vitória.
Aos meus pais, Zequinha e Ritinha, pelo
amor incondicional em mim depositado.
Ao meu irmão José Ricardo, pela admiração e
apoio, sempre.
A Deus, por me dar inteligência e sabedoria
para saber escolher os melhores caminhos a percorrer
.
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo Dr. William Cardoso Maciel, por ter acreditado na minha vocação e
ter investido na minha carreira acadêmica.
A toda equipe do Laboratório de Estudos Ornitológicos – LABEO, em especial Walber Feijó de
Oliveira, Josué Moura Romão, Suiany Rodrigues Câmara e Régis Siqueira de Castro Teixeira, pela
acolhida na minha chegada e apoio irrestrito.
A CIALNE – Cia. de Alimentos do Nordeste, na pessoa do Dr. Ronald Carneiro, por ter
acreditado nas nossas propostas, possibilitando o fornecimento dos pintinhos e ração.
A todos os amigos da empresa MERIAL Saúde Animal que nos concederam o financiamento
das sorologias deste trabalho, em especial ao Dr. Clóvis de Oliveira.
Aos meus grandes amigos Dr. Noé Tadeu Correia Velloso e Dr. Charles William de Oliveira
Santana e a toda a equipe da TECNAVIC por saber que estarão sempre dispostos a me ajudar.
A minha sempre amiga Dra. Rosa Patrícia Ramos Salles, pela amizade e ajuda na execução
das sorologias, através do seu laboratório BIOLAB.
Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello pela inestimável ajuda nas análises estatísticas.
A Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela competência e disposição em ajudar e a
todos os membros da empresa ACP Biotecnologia.
As minhas amigas e companheiras Dra. Virginia Léo de Almeida Pereira e Dra. Maria Verônica
Moraes Campello, por terem aceitado meu convite em participar da banca e pela demonstração de
amizade em todos os momentos.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Universidade
Estadual do Ceará, pela competência na transmissão dos conhecimentos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, pelo apoio
científico e financeiro.
Por tudo que vocês fizeram, sou muito grata.
6
RESUMO
As enfermidades virais que mais causam prejuízos econômicos e zootécnicos para a indústria
avícola são a bronquite infecciosa das galinhas (BIG), a doença de Newcastle (DN) e a doença
infecciosa da bolsa (DIB). Estas são controladas através de vacinações que requerem critérios
cada vez mais aperfeiçoados para a sua elaboração e execução a fim de obterem a prevenção
esperada. Devido aos excelentes resultados da água de coco em diversos processos
biotecnológicos na área animal e humana, demonstrando qualidades de proteção celular,
atentou-se para seu uso como diluente de vacinas vivas aviárias. O objetivo deste estudo foi
avaliar a viabilidade da água de coco em pó (ACP-201®), como diluente ocular das vacinas
vivas contra BIG, DN e DIB, através da mensuração da resposta imune humoral em frangos de
corte. Para isto, 1600 pintos de um dia foram alojados em galpões experimentais e divididos
em 15 grupos, onde cada grupo recebeu um programa de vacinação, utilizando diluente
industrial e ACP-201®. Amostras de sangue de 20 aves foram coletadas aos 1, 15, 25, 35 e 45
dias de idade no grupo controle e aos 25, 35 e 45 dias nos demais grupos e os soros obtidos
foram analisados para medir os anticorpos contra BIG e DIB através do ELISA e contra DN,
utilizou-se o teste de Inibição de Hemaglutinação (HI). Nos programas onde se utilizou a vacina
contra BIG com os diferentes diluentes experimentais, a resposta imunológica obtida foi similar
em 71,43% das aves. Os títulos de anticorpos medidos por HI para DN foram estatisticamente
superiores em 71,43% nas aves vacinadas utilizando-se o ACP-201® como diluente,
demonstrando melhor uniformidade. A análise dos títulos de anticorpos obtidos através do
ELISA dos grupos vacinados contra DIB, demonstrou diferença significativa (p<0,05) entre os
diluentes, com títulos sugestivos de desafio de campo nas aves onde foi utilizado o diluente
industrial. O diluente à base de água de coco em pó demonstrou ser eficiente quando
comparado ao diluente industrial para uso em vacinas por via ocular, tendo a vantagem de ser
um produto natural, de origem vegetal, com baixo custo e abundância na natureza.
7
ABSTRACT
The viral diseases that much cause economic and zootechnic damages are Infectious
Bronchitis Disease (IBV), Newcastle Disease (ND) and Infectious Bursal Disease (IBD) for
poultry industry. They are controlled by vaccinal programs, that require improvement
procedures for its elaboration and execution, in order to obtain the expected protection. Due to
the excellent results of coconut water in several biotechnological processes in animal and
human fields, showing qualities of cellular protection, its use as avian live vaccines diluent was
considered. The objective of this work was evaluate the efficacy of the utlilization of the powder
coconut water (ACP-201®) as an ocular dilluent of live vaccines against IBV, ND and IBD,
through the measurement of the humoral imune response in broilers. One thousand and sixty
houndred one-day chicks were housed in experimental sheds and divided in 15 groups, each
one with its own vaccinal program, using industrial dilluent in some groups and ACP-201® in
the others. Were collected blood from 20 broilers at 1; 15; 25; 35 and 45 ages from the control
group and at 25; 35 and 45 ages from the other groups. The sera was tested for measuring the
antibodies against IBV and IBD through ELISA and against ND used the Haemaglutination
Inhibition test (HI). In programs that used the vaccine against IBV with different experimental
dilluents, the imunological response obtained by ELISA was similar in 71.43% of the chickens.
The antibodies levels measured by HI for ND were statistically superior in 71.43% in chickens
vaccined with ACP-201® as dilluent, presenting better uniformity. The analysis of antibodies
levels obtained by ELISA in the groups vaccined against IBD, showed significant difference
(p<0.05) between the dilluents, with levels suggesting outbreak in chicj0.02208 Tc8896 Tw(ng )Tj-0.01104 Tc15.6 0 Td Tc3 0 Td(b)Tj0.04344 Tc5.75977 0 T4 Tc5.75977 0 Td(m)TjV1.5199 0 Td(g)Tj0.13104 Tc5.75977 0 Td(i)Tj0.02208 Tc2.2796(cj0.02208 Tc889.15977 0 Td(h)Tj-0.01104 Tj-0.01104 Tc10.4398 0 Td(w)Tj0.02208 Tc7.31992 0 Td(a)Tj0.13104 Tc5.75977 d1.57104 Tw(s )Tj0.02208 Tc9.83984 0 Td(d)Tj-0.01104 Tc7 0 Td(s)Tj0.02208 Tc5.15977 0 Td(e)Tj-0.09792 Tj0.12 Tc8.8c9.83984 0 Td(i)-4280.1)Tj88 Tc2.27969 0 Td(n)Tj0 Tc5.7597797 0 Td(s)Tj-0.10896 Tc5.1577 0 Td(i)Tj-0.09792 Tc2.75977 0 Td(r)Tj-0.09792 Tc3.47969 0 Td(i)Tj0.02208 Tc2.27969 0 Td(o)Tj0.04344 Tc5.75977 0 Td0.02208 Tw(l )Tj6.02208 Tc-437.384 -17.759Tj0.12 Tc5.63984 977 0 Td(il)Tj-0.13104 Tc4.55977 0 Td(l)Tj0.02208 Tc2.15977 0 Td(uen)Tj0.13104 Tc17.2797 0 Td(t)Tj0 Tc3 0 Td(s)Tj(t)Tj0.02208 Tc-0.09792 c6.11992 0 Td(T)Tj0.02208 Tc6.23984 0 Td0.94896 Tw(he )Tj0.01104 Tc15.2398 4ug
8
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas ...................................................................................................
10
Lista de Quadros, Fotos e Tabelas ..............................................................................
11
1. Introdução ................................................................................................................
13
2. Revisão de Literatura ...............................................................................................
15
2.1 Água de Coco ........................................................................................
15
2.2 Bronquite Infecciosa das Galinhas .........................................................
20
2.3 Doença de Newcastle ............................................................................
28
2.4 Doença de Gumboro ..............................................................................
34
2.5 Testes Sorológicos .................................................................................
41
3. Justificativa ..............................................................................................................
47
4. Hipótese Científica ...................................................................................................
47
5. Objetivos ..................................................................................................................
48
5.1 Objetivo Geral ........................................................................................
48
5.2 Objetivos Específicos .............................................................................
48
6. Experimentos Realizados ........................................................................................
49
6.1 Artigo 1: Immune response of broilers to infectious bronchitis
vaccinations by use of coconut powder water or industrial diluents ......
49
6.2 Artigo 2: Immune response of broilers to Newcastle disease
vaccinations by the use of coconut powder water or industrial diluents
59
6.3 Artigo 3: Resposta imune para vacinações contra Doença Infecciosa
da Bolsa mediante o uso de água de coco em pó e diluente industrial em
frangos de corte ...........................................................................................
71
9
7. Conclusões ..............................................................................................................
82
8. Perspectivas ............................................................................................................
83
Referências Bibliográficas ...........................................................................................
84
Anexos .........................................................................................................................
105
Anexo I – Níveis Nutricionais da Água de Coco ..........................................................
106
Anexo II – Fotos ...........................................................................................................
107
10
LISTA DE ABREVIATURAS
ACP - água de coco em pó
ACP-201® - diluente ocular para vacinas vivas aviárias à base de água de coco em pó
AGP - Imunodifusão em Agar Gel
BIG (IB) - Bronquite infecciosa das galinhas (Infectious bronchitis)
DN (ND) - Doença de Newcastle (Newcastle disease)
DIB - Doença Infecciosa da Bolsa
DI (ID) - Diluente industrial (Industrial dilluent)
ELISA - Imunoensaio com enzimas associadas (enzyme linked immuno-sorbent assay)
GH - glândula de Harder
GL - glândula lacrimal
HALT - tecido linfóide associado à cabeça
HI - Inibição de hemaglutinação (Hemmaglutination Inhibition)
IAA – Ácido 3-indol acético
IgA - Imunoglobulina A
IgG - Imunoglobulina G
IgM - Imunoglobulina M
IPIC - Índice de patogenicidade intracerebral
Nm - nanômetro
mOsm/L - osmolaridade por litro
OIE – Organização Mundial de Saúde Animal
pH - potencial hidrogeniônico
PNSA - Programa Nacional de Sanidade Avícola
RNA - Ácido ribonucléico
RT-PCR - transcrição reversa da reação em cadeia de polimerase
SN - soroneutralização
SPF – Livre de Patógenos Específicos (Specific Pathogen Free)
VBIG (IBV) - vírus da bronquite infecciosa das galinhas (Infectious bronchitis virus)
VDIB - vírus da doença infecciosa da bolsa
VDN (NDV) – vírus da doença de Newcastle (Newcastle disease vírus)
11
LISTA DE FOTOS, QUADROS E TABELAS
Foto 1 – Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas ..................................................
108
Foto 2 – Micrografia eletrônica do vírus da Doença de Newcastle, cepa Ulster 2C ....
108
Foto 3 – Micrografia eletrônica de partículas virais do vírus da Doença Infecciosa da
Bolsa ............................................................................................................................
108
Foto 4 – (A) Casca rugosa. (B) Ovo deformado. (C) Ovo sem casca. Ovos
colocados por galinhas infectadas pelo vírus da BIG ..................................................
109
Foto 5 – Ovo normal (embaixo) e ovo de galinha exposta ao VBIG ...........................
109
Foto 6 – Lesões renais associadas ao BIG causada pela cepa T do vírus .................
109
Foto 7, 8, 9 – Sinais clínicos respiratórios da Doença de Newcastle ..........................
110
Foto 10 – Sinal nervoso causado por cepa velogênica do VDN .................................
110
Foto 11 – Lesões hemorrágicas e edematosas de Bolsa de Fabrício e musculatura
hemorrágica típica de DIB aguda ................................................................................
111
Foto 12 – Lesões hemorrágicas de musculatura de ave infectada pelo VDIB ............
111
Foto 13 – Bolsas de Fabrício infectadas pelo VDIB com diversos graus de lesões ....
111
Foto 14 – Galpão experimental da Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará .......................................................................................................
112
Foto 15 – Pintinhos alojados para este experimento ...................................................
112
Foto 16 - Diluição das vacinas com o ACP-201® ........................................................
112
Foto 17 – Vacinação das aves por via ocular utilizando-se o diluente ACP-201® ......
113
Foto 18 – Aves com anilhas numeradas .....................................................................
113
Foto 19 – Coleta de sangue através de punção da veia braquial ...............................
113
Graph 1(1). Anti-IBV maternal antibodies of control at 1, 15, 35, and 45 days of age
54
Figure 1(2). Anti-NDV antibodies at 1, 15, 25, 35, and 45 days of age of control
group ………………………………………………………………………………………….
64
12
Figure 2(2). Geometric mean titers in log2 of anti-NDV antibodies of experimental
groups at 25, 35 and 45 days of age ………………………………………………………
65
Gráfico 1(3).Títulos de anticorpos contra VIBF do grupo controle ..............................
76
Table 1(1). Experimental vaccination programs ………………………………………….
52
Table 2(1). Anti-IBV antibody titers in GMT of the experimental treatments at 35 and
45 days of age ……………………………………………………………………………….
54
Table 1(2). Experimental vaccination programs ………………………………………….
62
Table 2(2). Percentage of birds vaccinated with the use of ACP-201
®
(n=700) or
Industrial Diluent (n=700) with titers equal or superior to log
2
3 ………………………...
64
Tabela 1(3). Tratamentos vacinais utilizados nos galpões 1 e 2 .................................
74
Tabela 2(3). Títulos de anticorpos contra VIBF expressos em GMT dos tratamentos
experimentais aos 35 e 45 dias ...................................................................................
77
13
1. INTRODUÇÃO
A produção avícola é um empreendimento que requer investimento razoável, cujo
retorno é proporcional à habilidade do empresário em maximizar os ganhos e minimizar as
fontes de perdas e seu crescimento não seria possível sem a adoção de medidas preventivas
contra muitos patógenos, dentre eles os causadores de distúrbios como é o caso dos vírus da
Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), Doença de Newcastle (DN) e Doença Infecciosa da
Bolsa (DIB)
.
Uma vez que problemas sanitários podem comprometer a exportação de produtos
avícolas, essas medidas devem ser adotadas tanto visando à obtenção de melhores resultados
zootécnicos quanto ao compromisso com a produção regional e nacional. Sendo a vacinação a
mais importante medida preventiva contra as enfermidades, as vacinas, vivas ou atenuadas, e
as mortas ou inativadas, vêm sendo desenvolvidas tomando lugar de destaque, pois as
empresas vêm adotando programas de vacinação variáveis, empregando diferentes amostras
vacinais e utilizando equipamentos diversos num constante processo de aperfeiçoamento.
Atualmente, as vacinações que utilizam vacinas com vírus vivo são executadas de
formas individual ou massal. A vacinação individual é realizada por via ocular onde se utiliza o
vírus vacinal associado a um diluente específico a base de água destilada e deionizada,
adicionado de corante e estabilizante. Já as vacinações de forma massal podem ser através da
via “spray” ou então por via água de bebida. A vacinação por via “spray” utiliza máquinas
pulverizadoras de gota grossa empregando-se um diluente específico e a vacinação na água
de bebida é realizada distribuindo-se o vírus vacinal diluído em água potável não clorada e
adicionada a leite em pó desnatado como estabilizante, na proporção de 2g/L de água,
diretamente nos bebedouros das aves.
Um dos fatores que pode influenciar na produção de anticorpos contra doenças virais
é a qualidade no processo de vacinação, devendo ser executado de forma a conservar as
propriedades do antígeno vacinal. Falhas na conservação, transporte e armazenamento das
vacinas, uso de diluentes inadequados e a má qualidade da mão-de-obra operacional são
fatores que reduzem os títulos protetores da vacina.
Como as dificuldades nos programas vacinais são muitas, as empresas de biológicos
avícolas estão sempre pesquisando novos produtos que venham minimizar as falhas nos
processos de vacinação. Neste contexto, a água de coco entra como alternativa possível, pois
14
se trata de um produto bastante acessível, sendo o Estado do Ceará um grande produtor,
possui qualidades bioquímicas que possibilitam a sua utilização como diluente e conservante
seminal, como conservante para órgãos e como meio para cultura de vírus. A sua produção na
forma em pó permitirá a disponibilização em centros de pesquisa que não possuam a matéria-
prima (coco), além de ser facilmente conservada e transportada. Desta forma é um produto que
apresenta as características necessárias para a utilização como diluente vacinal de vírus vivos
atenuados, como é o caso dos vírus vacinais de Bronquite Infecciosa das Galinhas, Doença de
Newcastle e Doença Infecciosa da Bolsa.
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ÁGUA DE COCO
A água de coco ou líquido endospérmico, proveniente do fruto do coqueiro (Cocus
nucifera L.), pertence à subfamília Cocosidea da família Palmea, sendo uma solução natural e
estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, gorduras neutras
(ANEXO 1) fatores de crescimento (fitohormônios) e pobre em fosfolipídios (LAGUNA, 1996),
possuindo ainda indutores da divisão celular e eletrólitos diversos, que lhe confere densidade e
pH compatíveis com o plasma sanguíneo (BLUME & MARQUES Jr., 1994).
Existem outros componentes na água de coco que mostram atividades semelhantes à
das citocininas, que não são derivadas de purinas e, portanto, não se relacionam com a
adenina (NUNES & SALLES, 1993), mas possuem atividades fisiológicas como a floração,
expressão sexual e formação de frutos, consideradas excelentes para as células (NUNES &
SALGUEIRO, 1999). Na Índia, foram isoladas e identificadas na água de coco, substâncias
promotoras de crescimento, como citocinas endógenas e ainda traços de zeatinina ribozídeo. A
zeatinina é a citocina natural mais ativa, sendo dez vezes mais potente que a cinetina. Têm
sido demonstrados vários efeitos das citocinas sobre importantes processos fisiológicos como a
floração, expressão sexual e formação de frutos (NUNES & SALLES, 1993).
A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses (variedade
verde da praia ou anão maduro) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e um
pH de 4,5 a 5,0. No entanto, a utilização da água de coco como diluente se depara com
algumas dificuldades de ordem prática, tais como a disponibilidade de frutos com
características ideais (fruto com 6 meses de maturação) e a impossibilidade de
armazenamento do produto (UCHÔA, 2004). Desse modo, SALGUEIRO et al. (2002)
desenvolveram um diluente à base de água de coco, sendo este padronizado na forma de pó,
permitindo a conservação das suas características benéficas e facilitando o seu uso em regiões
onde não se disponham do fruto.
Inúmeras são as utilidades da água de coco. Em virologia, a água de coco é utilizada
para o desenvolvimento de meristemas vegetativos e florais, cujo cultivo é a base de um
método de cura para as plantas infectadas com vírus. É ainda utilizada como fontes de fatores
de crescimento para as culturas de tecido destinados ao estudo da biossíntese de vírus
16
vegetais (PREVOT, 1968). GOMES (1977) descreveu que a água de coco é considerada anti-
helmíntica, tenicida e diurética. É ainda recomendada contra icterícia e irritações
gastrointestinais.
A água de coco como meio sólido (adicionada de 2% de Agar), é um bom meio de
cultura para fungos, leveduras industriais, bactérias formadoras de ácidos, larvas de mosca-
das-frutas, para germinação de sementes de orquídeas e, quando alcalinizada, para bactérias
intestinais (PICADO, 1942).
Além de se constituir um excelente rehidratante para crianças e idosos desidratados, a
água de coco pode ser ainda um substituto de emergência para o plasma sangüíneo. Estudos
revelam semelhanças de densidade, acidez, aminoácidos essenciais, vitaminas e eletrólitos da
água de coco com o sangue, podendo a mesma ser utilizada como soro improvisado em
paciente com desidratação grave ou desnutrição protéica avançada (Anônimo, 1984). BRITO &
DREISS (1943), relataram que a injeção endovenosa de água de coco, em doentes ascíticos,
com cirrose atrófica ou nefrite ocasionaram resposta diurética sem efeitos colaterais. Para
MAJUMDAR (1951), o uso de água
17
TONIOLLI, 1989a, ARAÚJO, 1990; SALLES, 1989; RODRIGUES et al.,1994), ovinos
(FREITAS, 1992; CRUZ, 1994; SOUSA et al., 1994), suínos (TONIOLLI, 1989b; TONIOLLI &
MESQUITA, 1990), caninos (MONTEZUMA Jr. et al., 1994; UCHOA et al, 2002; UCHOA, 2004)
e peixe de água doce como o Tambaqui (Colossoma macropomum CUVIER) (FARIAS et al,
1999).
Já foi demonstrado que a água de coco tem sido utilizada com sucesso para a
criopreservação de embriões murídeos (BLUME & MARQUES Jr., 1994), cultivo de embriões
murídeos e bovinos (BLUME et al., 1997a) e ainda na maturação de ovócitos bovinos (BLUME
et al., 1997b). BLUME & MARQUES Jr. (1994) demonstraram que a água de coco favorece a
proliferação celular (clivagem) no cultivo de embriões murídeos no estágio de uma célula e
mantém a integridade celular após a congelação e descongelação de embriões de
camundongas. Esses efeitos podem ser devidos à rica composição em açúcares, aminoácidos
e proteínas presentes na água de coco.
Indivíduos oligospérmicos serviram como doadores de sêmen no Hospital Bretaneau
em Tours (França), setor de Reprodução Humana (CECOS). As avaliações foram realizadas
incubando-se a 37ºC o sêmen humano após diluição em meios como MENEZO e diferentes
doses de ácido 3-indol acético (IAA). Observou-se o movimento do flagelo, bem como a
velocidade do espermatozóide em um determinado tempo e campo do microscópio. Os valores
foram superiores para todas as doses de IAA, ou seja, em fentogramas (10
-19
), mostrou valores
superiores nas doses de 10ng e 100ng em relação ao diluente testemunho (MENEZO)
(ROYERE et al. (1994) citado por NUNES & COMBARNOUS, 1995).
Os resultados obtidos por BLESBOIS et al. (1996) evidenciaram um comportamento
favorável da água de coco e suas frações ativas sobre a motilidade progressiva individual do
sêmen de galo e sobre a fertilidade, comparada ao sêmen puro, após inseminação artificial de
galinhas.
SOUZA & OLIVEIRA (1996) utilizaram sêmen de capotes (Numida meleagris) e
encontraram valores de fertilidade semelhante para o sêmen puro e diluído em água de coco.
NOGUEIRA & VASCONCELOS (2000) utilizaram água de coco como meio de cultura
em conservante de córnea de coelhos. O conservante água de coco não apresentou qualquer
alteração em olhos de coelho após uso demorado, comprovada sua higidez frente aos exames
biomicroscópico (in vivo) e histopatológico. Demonstrou in vitro ter propriedades de
manutenção da deturgência e na conservação do epitélio e endotélio.
18
O problema consiste no fato de que a água de coco é um produto oriundo de
vegetações tipicamente tropicais, o que limita a sua difusão em trabalhos em regiões de clima
temperado. Por ser rica em nutrientes, a água de coco é suscetível à contaminação e, por isso,
de difícil conservação. O caráter estéril da água de coco só é mantido no interior do fruto
íntegro, estando susceptível a contaminação microbiana quando exposta ao ambiente por
conta da abertura do fruto. Soma-se a isto a ação de enzimas presentes na água de coco que,
se essenciais para o fruto, em contato com o ar desencadeiam reações indesejáveis,
principalmente com o desenvolvimento de coloração rosada. Além do mais, poucas são as
pessoas aptas a identificar exatamente o estágio de frutificação ideal para uso como
conservante celular.
Encerrada num invólucro pesado, onera seu uso em regiões afastadas dos cultivares
em função do custo de transporte. As tentativas de minorar essa dificuldade se mostraram
incipientes, dada sua perecibilidade, alterando rapidamente suas propriedades nutrientes. Os
envases, como forma de conservação, levaram, até o momento, a alterações nas suas
propriedades, com perdas físico-químicas, organolépticas e biológicas. Embora algumas sejam
conservadas comercialmente de forma aceitável,
19
meios de conservação até então em estudo, não só para sêmen como para outros tipos
celulares.
Já que as amostras são diretamente secas e transformadas em pó, as reações são
inibidas pela mudança de fase e, portanto, mantêm inalterada todas as suas qualidades.
Os cálculos de rendimento permitem restituir, quando de sua reconstituição em água
destilada, os parâmetros originais do líquido endospérmico exigidos na manutenção de suas
propriedades (NUNES et al., 2005)
A invenção se baseia numa seqüência de procedimentos. Conforme a finalidade do
produto, o fruto é selecionado em função de suas propriedades físico-químicas, como: volume,
peso, diâmetro do albúmen, pH, osmolaridade, teor de carboidratos, teor de aminoácidos, teor
de minerais, dentre outros. A obtenção do fruto é iniciada pela rigorosa seleção e higienização
do mesmo, seguida de colheita do líquido endospérmico do coco (água de coco), sob forma
asséptica, realizada amostragem após a filtração. O líquido filtrado é homogenizado e
bombeado para o sistema de secagem. Submetidas a um tratamento térmico, a mostra é seca
e transformada em um pó, destituído de água livre, com alta solubilidade (NUNES et al., 2005).
A invenção está baseada na padronização e estabilização da água de coco na forma
de pó (ACP) e na subseqüente formulação dos meios de conservação, onde são
acrescentados aditivos específicos, dependendo do tipo de material biológico a ser
conservado. Referidos meios poderão ser utilizados para a conservação celular de todas as
espécies animais, incluindo o homem (NUNES & SALGUEIRO, 2005a).
O produto básico (líquido endospérmico do coco), em sua forma processada, confere
estabilidade e longevidade de prateleira, sem problemas de acondicionamento, e supera toda e
qualquer tecnologia de conservação, uma vez que mantém as propriedades inerentes do
produto original. A uniformidade do produto, obtida mediante rigoroso controle de
processamento, em condições específicas, leva à manutenção dos valores agregados do
endosperma líquido do coco (NUNES & SALGUEIRO, 2005b).
NUNES et al. (2005) descrevem alguns produtos à base de ´gua de coco em pó que já
se encontram em fase experimental: meio para desenvolvimento de células germinais de todas
as espécies animais, incluindo o homem; meio de manutenção, crescimento e maturação
celular; meio de capacitação espermática de todas as espécies animais, incluindo o homem;
meio de lavagem celular; meio de coleta, lavagem, cultivo, manutenção e criopreservação para
20
embriões de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de criopreservação
espermática de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de criopreservação de
ovócitos de todas as espécies animais, incluindo o homem; meio de conservação e
criopreservação de tecidos; meio de conservação e criopreservação de órgãos para
transplante; meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e
insetos; geles associados a biopolímeros para uso médico e veterinário na elaboração de
membranas de hidrogel substitutivas; produtos cerâmicos para próteses ósseas e dentárias;
como biomaterial; produtos de confeitaria; bebidas isotônicas, repositores energéticos,
alimentos funcionais, produtos nutricionais para pacientes hospitalares; produtos cosméticos;
juntamente com frutas e/ou verduras naturais, produtos de confeitaria, bebidas isotônicas,
repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais para pacientes hospitalares
e de produtos cosméticos (ou seja, antes de ser transformada em pó, a água de coco é
acrescida de proporções variáveis de frutos e/ou verduras naturais, fazendo com que os
valores nutricionais desses produtos sejam agregados aos da água de coco).
2.2 BRONQUITE INFECCIOSA DAS GALINHAS
A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) tem distribuição mundial (WANG et al.,
1997), sendo um problema freqüente em granjas de frangos de corte, reprodutoras e aves de
postura comercial, nas quais se tem diagnosticado surtos em aves vacinadas (QUIROZ, 1998).
A BIG foi descrita pela primeira vez por SCHALK & HAWN em 1931, no estado de
Dakota, nos Estados Unidos. Na década de 40 cresceu em importância em função de sérios
problemas, sobretudo de ordem respiratória, para plantéis de postura causando grandes
perdas na produção de ovos (DELAPLANE & STUART, 1941). O vírus da BIG foi isolado pela
primeira vez no Brasil em 1957 por Hipólito, que identificou como sendo pertencente ao
sorotipo Massachusetts.
O agente etiológico da BIG é um vírus da família Coronaviridae, pertencente ao
gênero Coronavírus (BAGUST, 1982) (Fig. 1), sendo um vírus que se dissemina rapidamente
no organismo, lá permanecendo por muito tempo. É envelopado, possui RNA de fita simples e
lípedes em sua superfície (OTSUKY et al., 1979). O virus da BIG (VBIG) não possui atividade
hemaglutinante, a não ser que seja tratado com tripsina e fosfolipase C (ALEXANDER et al.,
1976). Sua estrutura é circular com algum pleomorfismo (HOFSTAD, 1984), com diâmetro que
21
varia entre 90 e 200nm. O envelope possui externamente proteínas na forma de espículas, que
conferem ao vírus um aspecto de coroa; daí o nome de Coronavirus (DI FÁBIO & ROSSINI,
2000). O VBIG possui três proteínas estruturais, duas associadas com a proteção do vírus, “S”
presente nas espículas e a “M” presente na membrana, e a outra “N”, associada ao capsídio
22
aves reduzem drasticamente suas investidas aos comedouros e bebedouros, tornando-se
caquéticas, podendo chegar a óbito (WINTERFIELD & HITCHNER, 1962; CUMMING, 1963).
Quando a amostra envolvida é do tipo nefrotrópica, pode ocorrer quadro de urolitíase, onde se
observa depressão, aumento na ingestão de água, com a presença de aves molhadas,
podendo elevar a mortalidade do lote (BROWN et al., 1987; COWEN et al., 1987). Cepas
nefrotóxicas do VBIG tem afetado lotes na Austrália, Europa, Ásia e América do Sul e vários
fatores têm sido determinados que afetam a severidade da doença associada a estas cepas. A
exacerbação da doença renal pode ser devido ao stress causado pelo calor, tipo de ração ou
linhagem, imunodepressão associada com DIB e dieta com altos níveis de cálcio (ZIEGLER et
al., 2002).
As aves de postura jovens geralmente desenvolve
23
Devido à capacidade do vírus em infectar diferentes órgãos, existem grandes
variações do quadro clínico da doença. A enfermidade pode ocorrer sob três formas clínicas e
anatomopatológicas diferentes, independentes ou associadas. A forma respiratória ocorre em
pintos na primeira semanas de vida observando-se tosse, espirros, estertores traqueais (ITO,
1998), dificuldade respiratória (BUTCHER et al., 1990), lacrimejamento, inflamação dos seios
nasais (ITO, 1998), perda do apetite e alta mortalidade, caso haja complicação. A BIG afeta o
trato respiratório inferior e superior (NAKAMURA et al., 1996). Em pintos observa-se edema da
traquéia e brônquios com aumento do exsudato seroso (TOTTORI et al., 1997); coagulação do
exsudato com formação de tampões que se alojam na seringe levando à asfixia e morte
(HOFSTAD, 1984; RIDDELL, 1987); inflamação catarral das vias aéreas e seios nasais com
intensa descarga nasal (ITO, 1998). Na forma reprodutiva observa-se queda na produção de
ovos, ovos deformados e de casca rugosa ou fina, e de baixa qualidade interna (ITO, 1998;
COOK, 1999), discreta sintomatologia respiratória, obstrução do oviduto com acúmulo de ovos
na cavidade abdominal. As aves afetadas no final da postura dificilmente recuperam o seu nível
de produção anterior. Aves no início da produção e em boas condições a produção cai
levemente e recuperam-se mais rapidamente. Em frangas e poedeiras observa-se
degeneração das células epiteliais do oviduto (GORDON & JORDAN, 1982); edemaciação
(RIDDELL, 1987); salpingite; desidratação e murchamento dos óvulos (GORDON & JORDAN,
1982); fibrose com estenose ou obstrução total do lúmen do oviduto (CRINION et al., 1971). A
forma urinária ocorre em frangos de corte (3 a 8 semanas) e em aves adultas observando-se
quadros de nefrite-nefrose (ITO, 1998); urolitíase; aumento pronunciado dos rins (AFANADOR,
1994); saliência dos túbulos renais que estão repletos de uratos; diarréia aquosa (BUTCHER et
al., 1990; ITO, 1998) (Fig. 6). Além destes sinais, em qualquer uma das formas citadas,
observa-se apatia, depressão, queda no consumo de ração e perda de peso (AFANADOR,
1994).
A alta prevalência e a importância econômica da doença resultou em inúmeros
esforços para controlá-la através de imunização (HOFSTAD, 1984). Estudos sorológicos no
Ceará realizados em 1997 em plantéis de frangos de corte e poedeiras comerciais,
comprovaram que plantéis vacinados contra a BIG apresentaram sintomatologia clínica com
uma dinâmica do perfil de anticorpos indicativa de desafios de campo (CARDOSO & POSSO,
1997; CARDOSO & SALLES, 1997). Em estudos complementares na mesma região realizados
por SALLES et al. (2003), os autores concluíram que a administração de vacinas vivas e
inativadas contra a BIG, nas mesmas idades e vias de aplicação, produziu diferentes estados
de respostas sorológicas, demonstrados pelos títulos médios geométricos entre as empresas
analisadas.
24
A disseminação desse vírus ocorre de diversas maneiras, sendo comum a
transmissão horizontal, ou seja, através do contato entre aves doentes e aves sadias,
principalmente de aves vivas ou portadoras de vírus introduzidas em granjas indenes, através
de aerossóis, água e alimentos contaminados, carcaças de aves in natura ou congeladas
contaminadas, esterco dos aviários, equipamentos como caixa de ovos e aves, veículos e
sacos de rações provenientes de regiões infectadas, pelos sapatos de visitantes provenientes
de regiões onde a doença existe, além do uso inadequado de produ sáíc
25
(1997), IgA local tem sido relatada como estando associada com a resistência contra infecções
por VBIG. Observa-se que as aves desafiadas adquirem imunidade ao agente, contudo esta
imunidade declina rapidamente permitindo a reinfecção. A IgA é importante para prevenir a
infecção pelo VBIG no trato respiratório superior e na proteção contra cepas que tendem a
invadir os sistemas reprodutor e urinário, o que é mais comum em poedeiras (ZAVALA, 1999).
Ovos de aves que se recuperaram podem conter anticorpos que serão posteriormente
passados aos pintos. Estes anticorpos não previnem a infecção respiratória, porém amenizam
a severidade da doença.
Estudos sobre a sobrevivência do vírus em água, dado sua utilização para
administração de vacinas, verificaram que a concentração de cobre a 0,2mg/L e 5 ppm de cloro
a 25°C diminuem drasticamente o tempo de sobrevivência. A quantidade de 1 ppm de cloro
não afeta o vírus (DI FÁBIO & ROSSINI, 2000).
Medidas de biossegurança e boas práticas de vacinação são instrumentos básicos
para o controle das enfermidades. Desta forma não se deve misturar pintinhos de diferentes
origens nos criatórios, muito menos de idades diferentes; fazer o controle de outras espécies
animais assim como de visitantes; desinfetar todo e qualquer equipamento que adentre na área
de produção; fazer a retirada das aves mortas várias vezes ao dia; controlar aves silvestres e
roedores nas instalações; atenção na qualidade das matérias-primas utilizadas para
alimentação dos plantéis; verificar se todas as medidas de manejo estão adequadas com as
perspectivas do setor produtivo, etc. (GIAMBRONE, 1998). A capacidade imunológica da ave, a
presença de copatógenos e o nível de estresse por manejo são fatores adicionais. Uma
estratégia de controle do VBIG deve levar em conta a imunodepressão, produto final da DIB e
da anemia infecciosa das galinhas (HOERR et al., 1999).
É preciso determinar os sorotipos existentes na região estudada para a implantação
de um programa vacinal adequado. No Brasil, estudos têm revelado a existência de cepas
Massachusetts, Connecticut, JMK, Gray, Holte e Arkansas 99 (SILVA, 1990). A determinação
dos sorotipos existentes em uma região é feita através do isolamento e caracterização viral.
Pesquisas relatam que, vacinas utilizadas não conferem proteção contra alguns desafios de
campo (DAVELLAR et al., 1984; PARSON et al., 1992; AFANADOR, 1994; WANG et al., 1997).
Isto ocorre em função da variabilidade gênica do VBIG originando cepas variantes (KARAKA,
1990; JIA et al., 1995; WANG et al., 1996). A presença de múltiplos sorotipos ou o
aparecimento de novos sorotipos ou variantes podem dificultar a elaboração de um programa
26
de vacinação (ALVARADO et al., 2003). Proteção cruzada entre diferentes sorotipos pode ser
impraticável (KING, 1988).
A vacinação contra VBIG vem sendo praticada há anos, existindo vacinas vivas
atenuada, que são utilizadas em frangos, na vacinação inicial de matrizes e aves de postura
comercial (CAVANAGH & NAQI, 2003) e as vacinas inativadas. As inativadas têm vantagens
importantes sobre as vacinas vivas porque não causam a doença e tendem a estimular títulos
de anticorpos mais uniformes e duradouros. Já as vacinas vivas, a fim de serem capazes de
estimular a imunidade, precisam ser capazes de replicar na galinha. Se elas forem muito
atenuadas podem ser incapazes de replicação; se elas são pouco atenuadas podem, por si
sós, causar a doença. As vacinas vivas podem, também, ser disseminadas para lotes
suscetíveis. Por isso, cuidados especiais devem ser adotados no uso de tais vacinas,
particularmente em granjas com aves de múltiplas idades, para evitar a exposição das aves
jovens ou das inadequadamente vacinadas ao vírus vivo vacinal, particularmente àqueles
menos atenuados como, por exemplo, o H52. No caso do VBIG, as vacinas inativadas oleosas
não são efetivas a não ser que as galinhas recebam uma primo-vacinação com vacinas
atenuadas vivas. Os frangos deveriam receber somente vacinas vivas atenuadas, aplicadas se
possível por aerossol ou água de bebida (MONDAL & NAQI, 2001), com um dia de idade,
podendo ser revacinadas ainda com poucas semanas de idade. Esta prática causa duas
importantes preocupações: a influência dos anticorpos maternais na ativação da resposta
imune pela vacina e o efeito do vírus vacinal na taxa de depleção dos anticorpos maternais
(MONDAL & NAQI, 2001). Por muitos anos e em todo o mundo, as únicas vacinas disponíveis
contra o VBIG eram do tipo Massachusetts, porque este era o único sorotipo do VBIG
conhecido. Posteriormente, contudo, outros sorotipos começaram a ser descritos nos EUA e de
lá para cá em número considerável de outros países, incluindo, assim, as chamadas “variantes
holandesas”, no fim dos anos 70 e início de 80 (COOK, 1996; KLIEVE et al., 1988). A cepa H
foi uma das primeiras vacinas vivas atenuadas da BIG a ser desenvolvida e continua a ser
usada em muitas partes do mundo a cerca de 50 anos. Ela foi desenvolvida como 52ª. (H52) e
120ª. (H120) passagens e devido a sua habilidade de promover proteção cruzada contra
diferentes sorotipos de VBIG, tem provado ser uma das mais resistentes vacinas atenuadas da
BIG, sendo a vacina H120 provavelmente a mais utilizada no mundo até hoje; o uso da H52
tem declinado com a introdução das mais seguras e eficientes vacinas inativadas (BIJLENGA
et al., 2005). No Brasil, apenas a cepa Massachussets é autorizada para vacinações. As
vacinas inativadas com adjuvante oleoso, aplicadas antes do começo da postura em aves
vacinadas anteriormente com vacina viva, induz títulos altos e duradouros de anticorpos em
todas as idades. Além disto, reduz o uso das vacinas vivas, diminuindo a circulação de vírus
27
vacinais de campo. Está comprovado que os métodos de vacinação de vacinas de vírus vivo
atenuado contra BIG são eficazes na água de beber, por via nasal, pela via ocular e por
aspersão (VILLEGAS & AVELLANEDA, 1994). Todas as vias de aplicação das vacinas
resultaram em aumento de IgA no fluido lacrimal. Interessante notar que insignificante resposta
de IgA foi detectada após vacinação por via cloacal (TORO et al., 1997).
A confirmação da presença destes vírus em lotes avícolas deve ser realizada através
da coleção de resultados de produção obtidos nas granjas, assim como dos sinais clínicos,
soroconversão ou mensuração de anticorpos, isolamento viral, e mais recentemente, por
detecção do material genético viral (CAVANAGH & NAQI, 2003).
O diagnóstico exato da BIG é difícil. Existem duas razões principais para isto. Primeiro,
a doença respiratória e o efeito sobre a produção e qualidade dos ovos produzidos pelo VBIG
são facilmente confundidos com outras enfermidades. Segundo, devido à capacidade do VBIG
em alterar suas características antigênicas, seja por mutação ou por recombinação, novas
variedades antigênicas continuam aparecendo, tornando a identificação cada vez mais difícil
(CAVANAGH et al., 1992, citado por COOK, 1999). O exame sorológico é eficaz para o
diagnóstico de BIG em função da sua especificidade. A sorologia baseia-se na demonstração
de um título ascendente de anticorpos no soro, tornando-se a primeira amostra na fase inicial e
a segunda duas a três semanas após (VILLEGAS & AVELLANEDA, 1994). A existência de
tipos sorológicos diferentes interferirá nos resultados da prova devendo-se utilizar outras cepas
de vírus diferentes da Massachusetts. Algumas provas sorológicas usadas para diagnosticar a
bronquite são a Inibição de Hemoaglutinação (HI), Imunoensaio com Enzimas Associadas
(ELISA), Precipitação em Agar Gel (AGP), Imunofluorescência , Soroneutralização (SN) (DI
FÁBIO., 1993). Atualmente provas mais modernas têm sido desenvolvidas a fim de permitir um
diagnóstico mais rápido e preciso da BIG. Entre estas provas pode-se citar a Transcriptase
Reversa – Reação em Cadeia de Polimerase (FALCONE et al., 1997; KEELER et al., 1998;
ALVARADO et al., 2003), ELISA com anticorpos monoclonais (MOVING et al., 1998) e ELISA
de captura (WIT et al., 1997). O isolamento viral é o método recomendado e de referência para
o diagnóstico da BIG (BRONZONI et al., 1999). O VBIG tem a capacidade de causar nanismo
ou enrolamento resultando em uma forma esférica do embrião, normalmente após a 3ª ou 4ª
passagem em ovos embrionados com 5 a 9 dias pós–inoculação.
A frequência de isolamentos de VBIG em frangos segue padrões de condições
climáticas e períodos de pico de stress devido à qualidade do ar e o calor durante o ciclo anual
de produção. As maiores taxas de isolamento ocorrem durante o período do inverno (HOERR
28
et al., 1999). Segundo MCCONELL et al., (1993) citados por HOERR et al. (1999), a maior
quantidade de isolamentos provêm de frangos durante a 5ª semana, seguidos pelas 4ª e 3ª
semanas. Esta idade é significativa porque reflete o período em que os frangos estão sofrendo
a DIB e quando o vírus da Anemia Infecciosa é capaz de expressar os efeitos da
imunossupressão. De fato, a depressão moderada ou severa de linfócitos da bolsa de
Fabrícius e do timo é um achado histológico comum em casos de frangos nos quais se tem
isolado VBIG. Isto sugere que a imunodepressão que atinge tanto a população dos linfócitos B
como T é fator de risco para BIG (HOERR et al., 1999).
O teste de ELISA como está sendo desenvolvido atualmente, é específico de grupo,
ou seja, não diferencia entre anticorpos produzidos como resposta a um sorotipo específico.
Desde que os kits comerciais do teste de ELISA foram cobertos com a totalidade de VBIG,
passou a detectar anticorpos contra a proteína S, bem como de outras proteínas do VBIG
(WANG et al., 2002). Em frangos de corte, os níveis de anticorpos maternais podem variar de
3000 a 5000, sendo que os títulos resultantes de vacinações e idade mediana podem ser
similares e, em alguns casos, menores que os títulos maternais. Títulos acima de 8000 em
frangos de corte vacinados uma só vez contra BIG podem ser interpretados como muito altos e
podem ser resultantes de uma exposição ao vírus de campo (VILLEGAS & AVELLANEDA,
1992).
A prevenção da BIG depende de muitos fatores como, por exemplo, práticas de
manejo das aves, identificação dos sorotipos prevalentes da região, determinação da proteção
cruzada das vacinas disponíveis e dos vírus de campo, estabelecimento de um eficiente
programa de imunização e controle de outros fatores imunodepressores (QUIROZ, 1998).
2.3 DOENÇA DE NEWCASTLE
A Doença de Newcastle (DN) possui grande importância econômica no setor avícola
mundial pelo fato de inviabilizar as exportações de aves e produtos avícolas quando não há um
controle rigoroso da doença nos diversos países exportadores. A DN é considerada uma
zoonose (HIPÓLITO & FREITAS, 1963), comprometendo a saúde humana, principalmente das
pessoas que trabalham com aves (granjas, frigoríficos, laboratórios), daí seu caráter
ocupacional. A DN esta incluída na lista A de doenças de notificação obrigatória da
Organização Mundial de Saúde Animal – OIE (Office International Epizooties, 2003)
29
(KAPCZYNSKI & KING, 2005). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (BRASIL, 1994) tem a DN como uma das grandes preocupações e através do
Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA), portaria nº 193, de 19 de Setembro de 1994,
recomenda a vigilância sanitária constantemente atualizada.
A DN é uma doença viral altamente contagiosa e fatal. Infecções naturais e
experimentais já foram demonstradas em, pelo menos, 241 espécies de aves, representando
27 das 50 ordens da classe Aves, podendo causar até 100% de mortalidade. Além das
galinhas, o vírus da Doença de Newcastle (VDN) também pode infectar perus, patos, codornas,
gansos, perdizes, pardais, avestruzes, papagaios. Portanto, aves silvestres exóticas e nativas
podem atuar como reservatórios do vírus, tornando comum o surgimento de variantes
patogênicas e sua disseminação entre as aves domésticas e comerciais (OLIVEIRA et al.,
2003). O vírus também pode afetar ainda espécies de répteis e mamíferos que podem
funcionar como vetor mecânico. No homem, a DN pode provocar conjuntivite branda,
autolimitante, uni ou bilateral.
A infecção é causada por um vírus do gênero Avulavirus, família Paramyxoviridae
(KAPCZYNSKI & KING, 2005) (Fig. 2). Definição recente informa que a doença tem como
agente um sorotipo Paramyxovirus aviário tipo 1 (APMV-1) que apresente índice de
patogenicidade intracerebral (IPIC) em pintos – Gallus gallus – SPF (Specific Pathogen Free)
de um dia de idade maior que 0,7, sendo que os demais paramixovirus aviários, do tipo 2 ao 9,
causam paramyxoviroses (SEAL et al., 2000). Os membros desta família têm fita única, RNA
linear, com uma simetria elíptica.
O VDN foi identificado no ano de 1927, por DOYLE, em Newcastle on Tyne
(Inglaterra), após ter acometido aves da ilha de Java, na Indonésia (KRANEVELD, 1926). No
Brasil foi isolado por CUNHA & SILVA (1955), em aves oriundas dos Estados do Pará e
Amapá, provavelmente contaminadas através da importação de carcaças congeladas dos
Estados Unidos por hotéis da região (VAITSMAN & MOUSSATCHÉ, 1954). Posteriormente
surgiram surtos no Rio de Janeiro (SANTOS, 1954) e Minas Gerais (GUIMARÃES & SILVA,
1970). Durante o período de 1971-1979 foi a mais prevalente doença notificada no Brasil (ITO
et al., 1986).
A presença de um envelope formado de membrana celular modificada é uma
importante característica do Paramyxovírus aviário porque esta estrutura produz um meio
ambiente instável, onde a ação da luz solar, luz ultra violeta (UV), aquecimento, oxidação, pH e
da maioria dos agentes químicos destrói o vírus. Temperaturas elevadas e radiação solar
30
facilitam a inativação do vírus pelos agentes químicos, enquanto baixas temperaturas
interrompem sua inativação. O cozimento de produtos cárneos (80°C) destrói o virion. Quando
exposto a luz UV entre 1600 a 1800 A, é inativado em menos de 1,5 segundos. Em aviários, o
VDN permanece ativo por até 235 dias, morrendo rapidamente quando exposto diretamente à
luz solar (PAULILLO & DORETTO Jr., 2000).
Diversos sinais clínicos podem ser observados, pois estes são extremamente variáveis
de acordo com a virulência do vírus, da espécie, idade da ave, de doenças simultâneas, estado
imunológico do animal e predileção do vírus infectante pelos sistemas digestivo, respiratório
e/ou sistema nervoso. BEARD & HANSON (1981), citado por GOHM et al.(1999), agrupam as
cepas do VDN em cinco patotipos baseados nos sinais clínicos apresentados por aves
infectadas: velogênico viscerotrópico, associado com alta mortalidade e lesões intestinais;
velogênico neurotrópico, com alta mortalidade seguida de sinais nervosos (Fig. 10);
mesogênico, com baixa mortalidade e presença de sinais nervosos e respiratórios (Fig. 7; 8; 9);
lentogênico ou vacinal, apresentando suave ou inaparente infeccção respiratória; e entérica
assintomática com inaparente infecção intestinal. Desta forma, algumas aves contraem a
enfermidade e morrem sem mostrar sinais da enfermidade e outras desenvolvem a
enfermidade e se recuperam. Os sinais nervosos observados são tremores, giro da cabeça e
paralisias. Outros sinais que também podem ser observados são depressão, perda do apetite,
perda de peso, diarréia, dificuldade respiratória, secreções nasais e oculares e tosses.
Amostras do VDN são classificadas de acordo com a sua patogenicidade em
velogênicas, mesogênicas e lentogênicas (ALLAN et al., 1973). As cepas lentogênicas e
mesogênicas, possuem patogenicidade leve e moderada. Podemos citar as cepas B1, Lasota,
Cepa H e Beaudette como pertencentes a este grupo. As cepas Victoria Australiana, Italiana e
variante dos pombos são potencialmente patógenas e se classificam dentro do grupo dos vírus
velogênicos ou exóticos, que estão relacionados com o tempo de morte dos embriões
inoculados (ALEXANDER, 2003). Em diversos países, a forma velogênica da doença é
considerada endêmica, com quadros da doença causados por cepas velogênica viscerotrópica
e velogênica neurotrópica reportadas com certa freqüência. Estas informações sugerem que as
formas velogênica e mesogênica do vírus estão ainda presentes em diversos países e que os
programas de vacinação estabelecidos para o controle destas doenças em muitos casos têm
mantido estes vírus de campo sob controle (VILLEGAS, 1998).
A maioria das cepas enzoóticas são lentogênicas e mesogênicas e tem a
característica de produzir imunidade de forma leve e de curta duração. Desta forma, as vacinas
31
de vírus vivo, elaboradas a partir desta cepa produzem uma proteção de curta duração, onde
se deve realizar um reforço através de revacinações (ALEXANDER, 2003).
A disseminação deste vírus ocorre de várias formas, sendo comum a transmissão
horizontal, ou seja, através do contato entre aves doentes e aves sadias A forma de
transmissão vertical parece ainda não estar muito bem esclarecida, não existindo comprovação
científica de que o VDN possa ser difundido através de ovos de galinhas infectadas (SEAL et
al., 2000; CHEN & WANG, 2002). Ovos para incubação provenientes de granjas infectadas
com o vírus da DN são importantes fontes de disseminação do vírus (VAITSMAN &
MOUSSATCHÉ, 1954). Alguns animais, principalmente pequenos roedores, insetos e
artrópodes, os quais transitam entre as aves infectadas e as susceptíveis, podem apresentar
um potencial para a difusão do VDN, transmitindo mecanicamente o vírus.
Os antígenos mais importantes do vírus são as oligoproteínas de superfície, a
neuraminidase-hemaglutinina (HN) e as proteínas de fusão (F), acreditando-se que as
diferenças de virulência e infectividade estão a elas relacionadas. Ambas podem induzir
imunidade protetiva. Anticorpos sejam para HN ou F são detectados em neutralização do vírus
(VN) e anticorpo ao HN pode ser detectado por inibição de hamaglutinação (HI). Títulos de VN
ou HI no soro são consideradas como medidas de uma resposta de proteção (MAKKAY et al.,
1999). As provas sorológicas mais utilizadas para diagnosticar a DN são os testes de inibição
de hemaglutinação, sendo o mais utilizado e o imunoensaio com enzimas associadas – ELISA.
Outros testes como a imunofluorescência indireta, a imunoperoxidase indireta
soroneutralização e AGP têm sido descritos, mas não são rotineiramente utilizados na rotina
dos laboratórios (GELB, 1989; GOHM et al., 1999; DI FÁBIO, 1993)H
32
vacinas vivas usadas no controle do VDN em todo o mundo são, com poucas exceções, as do
tipo lentogênicas: B1, LaSota, F(Asplin), V4, Ulster e VG/GA; cepas mesogênicas são
raramente utilizadas (VILLEGAS, 1998). As estirpes vacinais do VDN replicam-se nos tratos
respiratório e digestivo com a indução de imunidade local e humoral. A amostra Lasota é a
mais virulenta e geralmente induz uma maior resposta imune que a amostra B1 (ALEXANDER,
1991; GLISSON & KLEVEN, 1993). ALLAN (1971), citado por EIDSON et al. (1982) enfatiza
que a eficácia da vacina de vírus vivo depende da sua invasibilidade e do seu poder de
multiplicação dentro da ave para produzir uma adequada resposta imune. O mesmo autor
também sugere que a invasibilidade da cepa do VDN é diretamente relacionada ao seu poder
de virulência, quanto mais invasiva, mais severas serão as reações vacinais. Evidências de
campo e de laboratório sugerem que vacinas inativadas com adjuvantes oleosos podem induzir
altos e duradouros títulos de proteção contra a forma clínica da DN (STONE et al., 1983), bem
como a transmissão de anticorpos maternos para a progênie através da gema, quando
utilizadas em matrizes (BENNEJEAN et al, 1978). Vacinas inativadas em adjuvantes oleosos
são conhecidas por promover uma resposta inflamatória no local da injeção, possibilitando
conduzir o recrutamento e ativação do antígeno presente na célula antes que eles migrem para
os linfonodos locais (JANSEN et al, 2005). Anticorpos maternos desempenham papel protetor e
imunodepressivo em animais recém-nascidos. Assim sendo, aves jovens podem falhar no
desenvolvimento da resposta imunológica quando vacinadas por spray e por via água de
bebida do primeiro ao sétimo dia (GIAMBRONE, 1984). Recentemente diversas vacinas
recombinantes têm sido desenvolvidas para produzir proteção contra VDN (SEAL et al., 2000;
RUSSEL & MACKIE, 2001).
O programa de vacinação para vacinas vivas do VDN, utiliza como rotina as vias de
aplicação ocular, nasal, oral ou água de bebida e spray ou aerosol (HOFACRE et al., 1986). A
via ocular ou nasal induz a produção loca de IgA nas secreções, dando uma rápida proteção,
pois a multiplicação do vírus ao nível das células receptoras das vias respiratórias ocorre antes
da solicitação de células imunocompetentes do animal (LYRA et al, 1979). Esta resposta local
se processa por uma conjugação covalente de IgA sintetizado pelas células do plasma
estabilizado com o componente secretório das células epiteliais. Além de IgA também, foi
detectado IgG na saliva de aves seis semanas após a vacinação por via nasal com cepa
LaSota do VDN, bem como IgM, IgA e IgG no soro e lágrima de aves vacinadas com cepa HB1
por via ocular (RUSSEL & EZEIFEKA, 1995). Por estas razões a aplicação por via ocular é
considerada como a mais efetiva. Entretanto, por motivos práticos e econômicos, a vacinação
na água é a mais utilizada apesar de ser considerada menos eficaz (ALLAN & DAWSON,
1973). Nesse tipo de imunização também está presente a resposta local (IgA) pois, apesar de
33
tratar-se da imunoglobulina predominante nas secreções traqueobronquiais, encontra-se
também nas gastrointestinais das aves (LESLIE et al., 1971). MAULEMANS et al. (1975)
relatam que a vacinação contra a DN por spray em pintos de um dia é eficaz, embora possa
causar reação vacinal mais severa.
Na atualidade, muitos estudos sobre vacinações contra o VDN têm sido feitos em
diversos países da África, da Ásia e na Austrália, utilizando-se cepas termoestáveis aplicadas
principalmente em aves caipiras, administradas por via alimentação (BELL et al., 1995;
REHMANI, 1996; BENSINK & SPRADBROW, 1999; FOSTER et. al., 1999; OAKELEY, 2000;
WAMBURA et al., 2000; THEKISOE et al., 2004) e por via injetável, com adjuvantes oleosos
(REHMANI & SPRADBROW, 1995).
Falhas de proteção normalmente resultam dos seguintes aspectos: vacinas de baixa
qualidade; mau funcionamento de mecanismo de defesa do indivíduo devido a fatores
genéticos ou do seu sistema imunológico; presença de altos títulos de anticorpos maternais
que reduzem uma porção do agente vacinal abaixando os títulos efetivos requeridos para
proporcionar ativação do processo de proteção; fatores estressantes antes ou no momento da
vacinação; fatores nutricionais. Os fatores relacionados a qualidade da vacina para determinar
o grau e duração da imunidade induzida por esta, são: idade de vacinação das aves; conteúdo
viral da vacina; sistema de armazenamento da vacina, potência da vacina e via de aplicação
utilizada. Altas temperaturas severamente afetam as vacinas de DN; impróprias condições de
transporte causam sua rápida deteriorização. Vacinas deixadas a 37-45° por 4-5 dias podem
perder todo o seu conteúdo de vírus vivo; as vacinas serão deterioradas caso não sejam
estocadas a 4°C (GALLILI & BEN-NATHAN, 1998).
De acordo com VAN der ZIJPP (1983) a determinação dos títulos de anticorpos
inibidores da hemaglutinação pós-vacinação para o VDN, pode tornar-se o melhor critério para
avaliação da resistência da ave, assim como da efetividade de uma vacina em estimular a
produção de anticorpos (Ac). Animais vacinados que atingiram títulos de HI entre 1:512 a
1:2048 são resistentes ao desafio com vírus virulento, mas aves com títulos HI abaixo de 1:64
são susceptíveis a doença (ALLAN, 1971).
Vale ressaltar que os esquemas vacinais devem ser adotados de acordo com o
histórico da granja, se houve ou não infecção nesta, e determinar o momento desta infecção.
Para tal é imprescindível ter conhecimento do nível de anticorpos maternos no lote, a
concentração do vírus de campo na granja (pressão viral), a qualidade do manejo de vacinação
executado e a presença de fatores imunodepressores (SANTOS, 2001).
34
A principal estratégia de controle da DN é a interdição de qualquer propriedade com
foco da DN e a destruição dos produtos infectados ou expostos para remover as formas mais
ativas de difusão do DN (PAULILLO & DORETTO Jr., 2000). Em países ou áreas que são livres
do VDN virulento, a primeira meta deve ser prevenir a introdução do vírus. Uma vez que aves
migratórias e selvagens freqüentemente carreiam cepas de baixa virulenta do VDN que são
transmitidas de tempos em tempos para aves domésticas, é comum excluir estes vírus das
políticas de controle. Vírus vacinais são um tanto diferentes a medida que alguns são
suficientemente virulentos para causar doença em aves susceptíveis. Em DN c
35
danos bursais e comprometer severamente os mecanismos de imunidade por anticorpos contra
outras doenças (ROSALES, 1999b).
A DIB foi identificada em praticamente todas as principais regiões avícolas do mundo,
e é considerada uma das maiores causas de perdas na produtividade da avicultura industrial
devido à mortalidade e aos baixos índices de eficiência. A atual expansão mundial de cepas de
campo altamente virulentas e causadoras de índices de mortalidade de até 70% fez com que a
importância da DIB na indústria avícola crescesse (FAUCOMPREZ, 1992). Apesar das
vigorosas estratégias de vacinação, a DIB é ainda uma doença economicamente importante na
avicultura comercial (RAUTENSCHLEIN & HAASE, 2005) e é considerada de difícil controle
(RAUTENSCHLEIN et al.,2005).
A doença foi descrita pela primeira vez por COSGROVE em 1962, após surtos
ocorridos próximos à região de Gumboro, no estado de Delaware, Estados Unidos (LUKERT &
SAIF, 2003). O primeiro caso clínico suspeito dessa doença em plantéis avícolas nacionais,
com amostra viral isolada e identificada, ocorreu em 1978 (SANTOS, 2002).
Segundo LEONG et al. (2000), citado por MÜLLER et al. (2003), a DIB é causada por
um vírus membro da família Birnaviridae, gênero Avibirnavirus (Fig. 3). SOLIS (2000) cita que
este vírus não possui envelope e que apresenta diâmetro entre 55 e 65 nm, com simetria
icosaédrica. Os membros desta família se caracterizam por apresentar seu ácido nucléico em
dois seguimentos duplos de RNA (A e B), daí a origem do nome. O seguimento A contém os
genes que produzem quatro proteínas, designadas VP1, VP2, VP3 e VP4, sendo que a VP2
possui os determinantes antigênicos para a especificidade dos sorotipos e subtipos do vírus da
DIB (VDIB).
De acordo com MÜLLER et al. (2003), dois sorotipos do VDIB podem ser identificados
por teste de neutralização. O sorotipo 1 que infecta matrizes, frangos de corte e poedeiras
comerciais e que está presente em todos os países com produção avícola. Sua incidência é
alta, estando presente tanto em forma virulenta como em forma imunodepressora. O sorotipo 2
infecta também perus e patos, porém nenhuma cepa deste sorotipo tem demonstrado ser
patogênica ou imunodepressora. Cepas variantes do sorotipo 1 vêm dificultando o controle da
Doença de Gumboro. Estas cepas diferem em antigenicidade e patogenicidade das cepas
clássicas do sorotipo 1, podendo causar doença clínica e/ou imunodepressão na presença de
altos níveis de anticorpos maternos (SOLIS, 2000; ROSALES et al., 1989a).
36
A DIB é uma doença infecciosa, altamente contagiosa e recorrente em granjas
infectadas. É transmitida rápida e sucessivamente de plantel para plantel, por contágio direto.
Esterco, ração e água contaminados são fontes comuns de infecção. Besouros, pardais e
outros pássaros voadores, veículos contaminados e o homem podem transmitir a doença
mecanicamente. Não há evidências de que o agente seja transmitido no ovo.
O VDIB é mais estável, vivendo em instalações contaminadas por mais de 100 dias.
Nas fezes, o virion é capaz de permanecer viável por mais de 60 dias. BENTON et al. (1967)
mostraram que este resiste ao tratamento com éter e clorofórmio, se mostrando viável por até 5
h a 56°C, tendo uma redução de sua infectividade a exposição a formalina 0,5% por seis horas.
Certamente a alta resistência do vírus aos diferentes compostos acarreta longa sobrevivência
nas instalações avícolas mesmo quando se aplicam rigorosas medidas de limpeza e
desinfecção (ASHRAF et al., 2005).
No final dos anos 80, uma forma clínica de elevada virulência surgiu na Europa
Ocidental e expandiu-se progressivamente para a maioria das grandes regiões de produção
avícola da Europa meridional, oriental da África, do Oriente Médio e da Ásia (GARDIN, 2000).
Um novo tipo de cepa do VDIB foi reconhecido. Estas cepas sofreram uma variação antigênica
que as habilitaram para induzir imunodepressão em aves com adequados níveis de imunidade
maternal, sendo identificadas como variantes antigênicas imunodepressoras muito virulentas
(vv), isoladas em diversos casos de alta mortalidade e hemorragias generalizadas; o efeito
destas cepas tem sido devastador em diversos países (BANDA et al., 2003). Especula-se que a
ocorrência destas cepas variantes pode ser devido a pressão de seleção da administração de
vacinas de cepas vivas do VDIB (RONG et al., 2005). Nos Estados Unidos, segundo
JACKWOOD & SOMMER-WAGNER (2005), algumas companhias avícolas tiveram que fazer
uso de vacinas autógenas para controlar a imunodepressão causada pelas emergentes cepas
do VDIB.
Após ter passado por surtos da doença na década de 80, no ano de 1997 uma forma
clínica da Doença de Gumboro foi observada no Brasil, no Estado de São Paulo. O vírus foi
isolado e observou-se que este apresentava todas as características do vírus hipervirulento G-
11 (DI FÁBIO, 2000); os exames de análise molecular indicaram a sua maior virulência e maior
patogenicidade. Em estudos de caracterização molecular do VDIB detectados em frangos de
corte feitos por BANDA et al. (2003), as cepas advindas do Brasil mostraram padrões idênticos
aos observados nas cepas de alta virulência do VDIB prevalentes em vários países da Europa,
Ásia e África. Em posteriores estudos de caracterização genética de VDIB altamente virulentos
37
detectados no Brasil, BANDA & VILLEGAS (2004) concluíram que estas cepas apresentaram
maior quantidade de mudanças genéticas, que podem estar influenciadas pelos programas de
manejo praticados na área. O impacto provocado pela alta mortalidade e perdas econômicas
impostas pelo vírus vem repercutindo entre os avicultores, gerando um estado de alerta que
incentiva programas de limpeza, desinfecção e vacinação bem mais agressivos
(BERNARDINO, 2000).
AVELLANEDA & VILLEGAS (1995) citam que aves de todas as idades são
susceptíveis à infecção. A enfermidade clínica, porém, não é vista usualmente em aves com
idade inferior a três semanas, exceto quando se trata de vírus muito virulento de Gumboro.
Desta forma, as aves que têm até cinco semanas de idade são as mais gravemente afetadas.
Na forma clínica ocorre diarréia branca aquosa, depressão, anorexia, prostração, penas
eriçadas e tremores (GORDON, 1985).
Nas formas menos agudas da enfermidade ou infecções subclínicas, os sintomas
clínicos graves estão ausentes, podendo haver restrição no crescimento e produtividade. Esta
forma de apresentação da DIB, de acordo com ROSENBERGER (1995), é a mais importante
em todo o mundo ocorrendo em aves de 1 a 10 dias. Como nesta idade o tecido linfóide
apresenta-se ainda imaturo, a interferência do VDIB deixa as aves mais sensíveis a diversos
agentes infecciosos, respondendo de forma deficiente à vacinação e a desafios de campo.
Na forma hipervirulenta, GARDIN (2000), referindo a frangos de corte observa que o
período de mortalidade ocorre entre os 20 e 30 dias de idade, com índices variando de 1 a
20%. Já em frangas (futuras matrizes e poedeiras), o período de mortalidade ocorre
principalmente entre 30 e 40 dias de idade, com índice variando de 5 a 80%. Ultrapassando o
período de mortalidade, a taxa de crescimento dos frangos sobreviventes é normal, assim
como a taxa de produção de ovos de matrizes e poedeiras comerciais.
O vírus infecta os linfócitos B que são células que maturam nos folículos da bolsa, até
se tornarem células-B antígeno sensíveis. A imunodepressão ocorre devido a vários fatores,
tais como destruição direta das células produtoras de anticorpos e interferência na maturação
das células B. Como a bolsa de Fabrícius está envolvida no adequado funcionamento das
células T (imunidade celular), poderá ocorrer aumento da atividade destas células, levando a
uma
38
necrose e depleção celular nas células da glândula de Harder (MANFREDINI, 1991). Assim
sendo, a imunodepressão ocorre ao nível dos sistemas humoral, celular e local.
De acordo com MARTINS et al. (2005), a infecção pelo VDIB tem efeitos dramáticos
sobre a população dos linfócitos B e a gravidade desta lesão é inversamente proporcional à
idade. A depleção linfóide no início da vida, durante a maturação do sistema imune, gera
supressão de competências do sistema imune humoral. A destruição dos linfócitos B no
microambiente da bolsa cloacal, reduz a geração de clones de células B maduras, incapazes
de executar a síntese de diferentes cadeias de imunoglobulinas (deficiente switch de IgM para
IgG e IgA) e de diversidade na especificidade das regiões hipervariáveis. A colonização
39
O diagnóstico da DIB envolve a análise do histórico do lote, dos sinais clínicos e das
lesões. Nos casos agudos da doença o diagnóstico presuntivo é facilmente estabelecido, pela
observação de alta morbidade, picos de mortalidade, rápida recuperação dos sinais clínicos e
alterações macroscópicas da bolsa de Fabrícius. As aves com menos de três semanas não
manifestam sinais da doença, assim como aquelas acometidas de algumas cepas variantes
americanas ou aves jovens com anticorpos maternos (PEREIRA, 2004).
O diagnóstico laboratorial da DIB pode ser realizado através de estudos
histopatológicos da bolsa de Fabricius, do isolamento viral por inoculação em ovos
embrionados SPF, imunofluorescência, soroneutralização (SN), considerado o único teste
sorológico confiável para diferenciar VDIB isolados em sorotipos antigênicos e subtipos
(MÜLLER et al., 2003), AGP, ELISA e Transcrição Reversa com Reação em Cadeia de
Polimerase (RT-PCR), sendo utilizados para detecção ou para identificação do VDIB (ZHANG
et al., 2005).
O emprego de meios para a prevenção e controle da ocorrência ou da disseminação
das doenças infecciosas virais aviárias, deve estar necessariamente ligado a sua cadeia
epidemiológica, ou seja, às fontes de infecção, à transmissão das doenças e aos susceptíveis.
De maneira geral, existem duas formas diferentes de medidas profiláticas relacionadas
aos susceptíveis, mas que devem ocorrer simultaneamente. Uma é a forma inespecífica de
prevenção relacionada a fatores de biossegurança e a outra é a vacinação. Em situações não
epidêmicas, um bom manejo é o fator mais importante para controlar perdas, como altas
mortalidades, baixo ganho de peso e baixa produção de ovos. Desta forma não se deve
misturar pintinhos de diferentes origens nos criatórios, muito menos de idades diferentes. Deve-
se promover a desinfecção com agentes físicos ou químicos, com boa efetividade,
principalmente no caso da doença de Gumboro, onde o agente etiológico mostra-se bastante
resistente, de todos os fômites que entram em contato com as galinhas, bem como de todo
ambiente em que estas se encontram alojadas, devendo-se ainda evitar o contato com
possíveis disseminadores, como aves silvestres, insetos e roedores, e manter uma ótima
higiene do pessoal de trabalho (ISHIZUKA & SIMON, 2000; GIAMBRONE, 1998).
A vacinação é o procedimento profilático mais recomendado e prático, embora não se
devam desprezar as medidas de biossegurança. Uma grande diversidade de vacinas
atenuadas e inativadas, preparadas a partir de estirpes clássicas e variantes, encontra-se à
disposição no mercado avícola. De acordo com a virulência, existem quatro tipos de vacinas
vivas de sorotipo I: forte ou intermediária plus, intermediária, intermediária suave ou suave
40
atenuada. Em condições experimentais, foi demonstrado que vacinas de VDIB intermediarias
podem romper a barreira de anticorpos maternos, induzindo imunidade protetiva, enquanto que
as vacinas suaves não conseguem (RAUTENSCHLEIN et al., 2005). Após o nascimento, os
pintinhos são vacinados com vacinas vivas. O momento certo para esta vacinação é crucial
para que não haja neutralização do vírus vacinal pelos anticorpos maternais. Os títulos podem
variar consideravelmente entre as aves do lote e revacinações podem ser necessárias
(MÜLLER et al., 2003).
Para assegurar a disponibilidade de anticorpos maternais para a progênie, as matrizes
são vacinadas com vacinas oleosas após primovacinações com vacinas vivas (AL-NATOUR et
al., 2004, ROSALES et al., 1989b). Parece não haver dúvidas da importância da imunidade
mediada por anticorpos na proteção contra a DIB, como também da importância da
transferência de anticorpos maternos da gema para a progênie, resultando em proteção
durante as críticas primeiras três semanas de vida da progênie contra algum vírus de campo
(HITCHNER, 2004). Os anticorpos maternais podem não proteger os pintinhos contra a forma
clínica da doença, mas podem aliviar a severidade da imunodepressão por prevenir a atrofia da
bolsa nas primeiras semanas de vida (LUCIO & HITCHNER, 1979).
Recentes estudos indicam que a imunidade sistêmica humoral parece não ser o
único modo de proteção contra desafio de VDIB. A Indução de imunidade local pode também
ser uma importante via para proteção, pois o VDIB entra na circulação através do sistema
digestivo para depois ser distribuído para outros órgãos (RAUTENSCHLEIN & HAASE, 2005).
Elaborar um programa de vacinação eficiente contra a DIB tem sido difícil para o
veterinário devido às características do próprio vírus, ao nível de exposição das aves no campo
(reflexo das condições de manejo e higiene), aos níveis e uniformidade dos anticorpos
maternais nos lotes de reprodutoras e a diversidade de antígenos do vírus (LUKERT, 1991). Há
muitas cepas vacinais como opções de controle, cada uma delas com características
específicas e os programas devem ser avaliados constantemente (MANFREDINI et al., 1993).
A idéia geral é que não se pode esperar para vacinar o lote até que a última ave do lote tenha
baixos níveis de anticorpos maternos. Isto colocaria o lote em risco por tempo demais, além de
que a vacina se dissemina por vários dias depois da vacinação por todo o lote (MUÑOZ, 2005).
Em uma mesa redonda ocorrida na Universidade de Auburn em 1993, os veterinários
e microbiologistas das empresas avícolas, laboratórios de diagnóstico e companhias
produtoras de vacinas propuseram os atributos de uma vacina ideal como sendo as seguintes:
fornecer imunidade na presença de anticorpos maternos; imunizar o mais precocemente
41
possível; produzir uma imunidade de longa duração; ser administrada em massa a um custo
reduzido; oferecer estas vantagens em uma única aplicação; possuir um marcador para
distingui-la de outros vírus da DIB; ter baixa patogenicidade, devendo, entretanto, competir com
cepas de campo mais virulentas; fornecer amplo espectro de proteção, estimular a imunidade
humoral e celular; não reverter para uma forma mais virulenta (ROSALES, 1999a).
2.5 TESTES SOROLÓGICOS
Os testes sorológicos, além de utilizados para detectar a presença de vírus de campo
nas unidades produtoras avícolas, também são bastante realizados para monitorar o status
imunológico das aves frente aos mais diversos programas vacinais (KING et al., 1991).
A avaliação rotineira às respostas sorológicas ajudam a determinar a qualidade do
manejo de vacinação e a técnica de administração das mesmas, as idades mais convenientes
para sua administração, a interferência na resposta devida a outras vacinas ou práticas de
manejo, a exposição aos vírus patogênicos de campo, incluindo a presença de condições
imunodepressoras que diminuem a resposta dos lotes à vacinação (VILLEGAS & ROSALES,
1996), determinar os níveis de imunidade materna, comparar fabricantes de vacina (ROSALES,
1999b).
A sorologia é uma das ferramentas mais úteis para estabelecer um excelente
programa de medicina preventiva na indústria avícola. São necessários objetivos bem definidos
e interpretação correta dos dados para obter os reais benefícios da sorologia. Além de
conhecer as especificações dos testes (isto é, sensibilidade, especificidade, valor preditivo) e
os dados históricos da população, deve ser estabelecido um programa de monitoria (MUÑOZ,
2005). As provas sorológicas devem realizar-se freqüentemente, estabelecendo programas
práticos e econômicos. Uma vez estabelecido o programa, se podem realizar ajustes e
modificações tanto na freqüência das análises como nos programas de vacinação (VILLEGAS,
1990).
As amostras de soro coletadas de um lote são usadas para determinar a presença e a
quantidade de anticorpos, ou imunidade humoral, através do emprego de vários procedimentos
diferentes. Esses testes estão baseados nos mesmos princípios. No laboratório, as amostras
de soro são expostas a antígenos específicos e são detectadas e avaliadas as suas
42
capacidades de formar complexos antígeno-anticorpo através de procedimentos sorológicos
laboratoriais.
Estão presentes no soro diferentes tipos de anticorpos ou imunoglobulinas
dependendo do estágio da resposta do sistema imunológico no momento em que o soro foi
coletado. As imunoglobulinas IgM são produzidas no início da resposta e após alguns dias, são
seguidas por níveis mais elevados de imunoglobulinas IgG. Alguns procedimentos sorológicos
são mais eficientes na detecção de alguns tipos de imunoglobulinas (tal como a IgM) do que
outros, e portanto este fato deve ser considerado quando se faz a seleção de testes para a
detecção do início de surtos (por exemplo, o teste rápido de aglutinação em placas para
micoplasmas). Dias mais tarde, os resultados das respostas sorológicas iniciais podem ser
confirmados através da coleta adicional de amostras de soro e o emprego de testes que
detectem a IgG com eficiência (testes de inibição de hemaglutinação e ELISA).
Alguns testes sorológicos irão apresentar apenas um resultado positivo ou negativo,
enquanto outros relatam os títulos de anticorpos. As respostas iniciais contra as linhagens das
vacinas irão resultar em títulos mais baixos do que as respostas após as vacinações repetidas
com vacinas vivas e/ou inativadas (respostas secundárias). De modo semelhante, os títulos de
anticorpos resultantes da vacinação geralmente são mais baixos do que os obtidos após um
surto de campo (ROSALES, 1999a).
A sorologia é largamente recomendada e normalmente usada e, apesar de continuar
sendo um elemento de diagnóstico, por si só não fornece o diagnóstico. Deve ser considerada
em conjunto com fatores clínicos, necrópsicos e epidemiológicos, para estabelecer o
diagnóstico. A não ser que estes elementos sejam tomados em consideração, a interpretação
da análise sorológica é virtualmente impossível e, certamente, arriscada (BORNE, 2003).
De acordo com SANTOS & SILVA (2000), existem uma variedade de métodos
sorológicos que podem ser utilizados para determinar o nível relativo de anticorpos presentes
no soro. Essas provas se baseiam nas interações antígeno-anticorpo. Os testes sorológicos
pertencem a três categorias: testes de ligação primária, que são os mais sensíveis em termos
de quantidade de anticorpos detectáveis e medem diretamente a interação antígeno-anticorpo;
testes de ligação secundária, que medem as conseqüências das interações do complexo
antígeno-anticorpo “in vitro”, sendo teoricamente menos sensíveis que os testes de ligação
primária, com exceção do teste de soro neutralização; e os testes de ligação terciária, que
medem as conseqüências da resposta imunitária “in vivo”, sendo usualmente menos sensíveis
43
que os testes de ligação primária, mas refletem de modo mais apropriado as conseqüências
práticas da resposta imunitária.
Os testes sorológicos utilizados mais freqüentemente são o imunoensaio com enzimas
associadas (ELISA), inibição de hamaglutinação (HI), vírus neutralização (VN) ou soro-
neutralização (SN) e imunodifusão em Agar gel (AGP) (VILLEGAS, 1990; BORNE, 2003;
MUÑOZ, 2005).
A técnica de ELISA é uma prova de ligação primária, utilizada para detectar ou medir o
nível de anticorpos (ELISA indireto) ou antígenos (ELISA direto) (TIZARD, 1981). Possui alta
especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e rápido processamento de múltiplas amostras,
sendo empregado para diagnóstico de inúmeras enfermidades de mamíferos e de aves,
incluindo vírus, bactérias, micoplasmas, parasitas, micotoxinas, detecção de drogas, hormônios
e proteínas, entre outros. É uma reação sorológica que se baseia no uso de antígenos e
anticorpos marcados com enzimas, na qual o complexo resultante possui atividade imunológica
e enzimática. Esta técnica detecta e mensura principalmente as imunoglobulinas do tipo IgG e
IgM, podendo detectar quantidades muito pequenas de anticorpos (SANTOS & SILVA, 2000).
Na interpretação dos resultados do teste de ELISA, se faz necessário estabelecer o
conceito de títulos altos, médios e baixos. Títulos altos podem resultar como conseqüência da
exposição das aves ao vírus de campo ou como resultado de programas de vacinação com
várias vacinas ou com vacinas em veículo oleoso e concentradas (VILLEGAS & AVELLANEDA,
1992).
O ELISA tem uma série de reagentes padronizados e placas de micro-orifícios
fabricadas para um teste específico. Os ELISA contêm alguns ou todos os seguintes
componentes: placas revestidas, diluentes de amostra, controles, concentrado de lavagem,
conjugado, substrato e solução de parada. As placas de 96 orifícios são feitas de poliestireno e
são revestidas com antígeno ou o anticorpo imobilizados. O antígeno ou anticorpo presentes
na amostra se ligam na placa. Este revestimento é o local de ligação dos anticorpos ou
antígenos da amostra. Em cada kit são fornecidos controles negativo e positivo. Estes
controles ajudam a normatizar ou a padronizar cada placa. Os controles também são usados
para validar o ensaio e para calcular os resultados das amostras. Os conjugados ELISA são
anticorpos marcados com enzimas que reagem especificamente aos analitos da amostra
ligados à placa. O conjugado não-ligado é lavado após a incubação e antes da adição do
substrato. O concentrado do lavado é uma solução tamponada contendo o detergente usado
para retirar o material não-ligado da placa (MUÑOZ, 2005). Um substrato (cromógeno) é
44
acrescentado, o qual é sensível a ser hidrolizado pela enzima e a mudar de cor. A intensidade
da coloração é proporcional à quantidade de anticorpos ligados. O teste é lido usando um
espectrofotômetro, que fornece os valores da densidade ótica. O resultado pode ser
convenientemente expresso como um título ELISA, pela aplicação de uma fórmula matemática
que transforma as densidades óticas em “títulos”. A interpretação dos resultados requer um
certo grau de experiência e uma boa compreensão da ferramenta ELISA.
O teste de Inibição de Hemaglutinação é um mé a
eonveniente e
45
No sistema alfa, a quantidade do vírus é variável e as quantidades do soro são constantes,
enquanto que no sistema beta, a quantidade do vírus é constante, sendo variáveis as
quantidades do soro (VILLEGAS & AVELLANEDA, 1992).
O teste é baseado no princípio segundo o qual o anticorpo viral liga-se em um vírus
específico com uma resultante neutralização da infectividade ou ação viral sobre um
determinado substrato e medem a capacidade do anticorpo, quando misturado com o antígeno
“in vitro” ou “in vivo” de neutralizar sua atividade biológica e medir os níveis de anticorpos
séricos. É altamente específico e extremamente sensível, detectando principalmente os
anticorpos dos tipos IgG e IgM. Para sua condução utiliza-se substratos vivos, tais como: ovos
embrionados, cultura de células e animais de laboratório (SANTOS & SILVA, 2000).
O teste é realizado em duas partes. Na parte de neutralização, o vírus na diluição
correta é misturado com o soro em um tubo de ensaio, onde são incubados a temperatura
ambiente por um certo período de tempo. O soro para o teste deve ser estéril, aquecido a 56°C
por 30 minutos para destruir substâncias inespecíficas que podem inibir os vírus. O soro deve
ser derivado de galinhas SPF a partir de uma cultura purificada em placa de vírus. As cepas
virais usadas para o teste de neutralização devem ter títulos alto, não devem ter aglomerados
de vírus e devem estar adaptadas ao sistema do hospedeiro usado, em culturas puras,
purificadas de clones e livres de agentes estranhos. Os diluentes podem ser meio de cultura
celular ou outros diluentes reconhecidamente compatíveis tanto com o vírus, quanto com o
sistema de hospedeiro usado (MUÑOZ, 2005). Este método é extremamente confiável em
princípio, porém requer um grande número de culturas (geralmente ovos embrionados), um
laboratório habituado a executar esta técnica e muitos dias de trabalho. Conseqüentemente é
bastante dispendioso, sendo reservado para pesquisas ou estudos das variantes do VBIG,
entre outros.
O teste de imunodifusão em Agar gel (AGP) é uma técnica sorológica utilizada
freqüentemente em medicina veterinária para demonstrar e analisar a reação antígeno-
anticorpo, de boa precisão, procedimento simples e custo relativamente baixo. Tem sido usado
para inúmeras doenças, como DIB, BIG, doença de Marek, laringotraqueíte, influenza, EDS 76
e coriza infecciosa. Esta técnica permite a visualização do complexo antígeno-anticorpo como
uma linha de precipitação. O antígeno é chamado de “precipitinógeno” e o anticorpo de
“precipitina”, reação que ocorre em um meio de difusão semi-sólido, tal como o ágar ou
agarose. A formação de complexos antígeno-anticorpo depende da concentração de íons do
46
meio semi-sólido, pH e temperatura. Os determinantes mais importantes da reação são as
concentrações relativas de antígenos e anticorpos (SANTOS & SILVA, 2000).
Em laboratório de aves é mais usado o procedimento de difusão bidimensional dupla
(MUÑOZ, 2005), no qual o antígeno é colocado em um reservatório perfurado no agar e os
soros a serem testados são colocados em reservatórios perfurados próximos aos que contém
os antígenos. A placa é então incubada por 24 a 48 horas a 37°. Durante este período, os
anticorpos e os antígenos se propagam através do agar. Quando entram em contato uns com
os outros, o complexo produzido se precipita na forma de um arco de precipitação, que indica a
presença de anticorpos no soro (BORNE, 2003). Devido a detecção de anticorpos ser
transitória e a prova ser qualitativa e não quantitativa, não é muito usada na avicultura para
diagnóstico (VILLEGAS & AVELLANEDA, 1992), apesar de seu baixo custo.
47
3. JUSTIFICATIVA
Para a instilação de gota ocular de vacinas vivas atenuadas para controle das doenças
avícolas, utilizam-se diluentes específicos, compostos de sais de sódio, potássio e diversos
corantes e estabilizantes, produzidos a partir de tecnologia internacional, não possuindo,
entretanto, a capacidade de manter o vírus vacinal hábil por um período de tempo suficiente
para a realização das vacinações com segurança.
Com o advento da utilização da água de coco em estudos biotecnológicos nas áreas
animal e humana, obtendo-se excelentes resultados e sua posterior produção na forma em pó,
podendo ser facilmente conservada e transportada, atentou-se para a possibilidade do seu uso
para diluição de vacinas vivas aviárias, por proporcionar
48
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
•
Verificar a viabilidade da utilização do diluente de vacinas vivas aviárias à base da
água de coco em pó (ACP-201®) contra Bronquite Infecciosa das Galinhas, Doença de
Newcastle e Doença Infecciosa da Bolsa, em frangos de corte.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Determinar a eficácia do diluente de vacinas vivas aviárias à base de água de coco
em pó (ACP-201®) contra Bronquite Infecciosa das Galinhas, através da mensuração da
resposta vacinal, utilizando a técnica sorológica de ELISA
•
Determinar a eficácia do diluente de vacinas vivas aviárias à base de água de coco
em pó (ACP-201®) contra a doença de Newcastle , através da mensuração da resposta
vacinal, utilizando a técnica sorológica de Inibição de Hemaglutinação
•
Determinar a eficácia do diluente de vacinas vivas aviárias à base de água de coco
em pó (ACP-201®) contra Doença Infecciosa da Bolsa, através da mensuração da resposta
vacinal, utilizando a técnica sorológica de ELISA
49
6. EXPERIMENTOS REALIZADOS
6.1 ARTIGO 1
1
Immune response of broilers to infectious bronchitis vaccinations by use of
powder coconut water or industrial diluents
Marcia Helena Niza Ramalho Sobral
1
, Josue Moura Romão
2
, Rosa Patricia Ramos Salles
1
,
Régis Siqueira de Castro Teixeira
1
, Suiany Rodrigues Câmara
1
, Adonai Aragão de Siqueira
2
,
Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
3
and William Maciel Cardoso*
4
.
1.
Postgraduate students of Veterinary Sciences of Universidade Estadual do Ceará
2.
Undergraduate students of Veterinary Faculty of Universidade Estadual do Ceará
3.
Fellow DCR CNPq/FUNCAP of Veterinary of Universidade Estadual do Ceará
4.
Professor of Veterinary Faculty of Universidade Estadual do Ceará
ABSTRACT
Some reasons can promote failures in immunization programs against IB as incorrect
procedures during the vaccination processes and the low capacity of maintaining the vaccinal
virus viable that the diluents present. This work had the objective of verifying the efficacy of the
utilization of powder coconut water (ACP-201®) as diluent to IBV vaccines in many vaccination
programs. One thousand and six hundred day old chicks of Ross line were separated in 15
groups. The birds were submitted to different vaccinal programs with the use of powder coconut
water (ACP-201®) and industrial diluent. They were submitted to blood collections and the sera
were tested by indirect ELISA to measurement of anti-IBV antibodies. The utilization of IBV
vaccination programs with the different experimental diluents promoted similar antibody
response among the treatments 2;3;4;5;6;7;9;10;11;12;13 and 14 at 35 days and
1;2;3;4;6;7;8;9;10;11;13 and 14 at 45 days, totaling 71.43% of the birds. The ACP-201®
presented good results as IBV vaccine diluent when compared to industrial diluents and had
advantages like been a vegetal natural product, its low cost, and abundance in nature.
Key-words:
vaccinal diluent, infectious bronchitis, broiler
1
Artigo submetido ao periódico Vaccine em 07 de Novembro de 2005.
50
INTRODUCTION
The infectious bronchitis (IB) is caused by a virus of Coronaviridae family (CAVANAQI
& NAQI, 1977) and is one of the most important diseases in poultry industry (ALVARADO et al.,
2003). There are many serotypes already described (HOPKINS, 1974; JOHNSON &
MARQUARDT, 1975; VILLEGAS, 1998) and Massachusetts is prototype of this group. The
infectious bronchitis promotes financial looses due to egg production drop and the decrease of
internal and external egg quality. Broiler chicks present low levels of weight gain and feed
conversion. The infection can be increased by secondary bacterial infectious by E. coli or S.
aureus, promoting carcass condemnation (VAN ROCKEL et al., 1951; CAVANAGH & NAQI,
1977).
The vaccinal programs against IB in Brazil are done by the use of Massachusetts
strain, which has a large antigenic spectrum comparing to other infectious bronchitis virus (IBV)
serotypes (MARTINS, 1992). These vaccines present efficacy when applied in drinking water,
spray, nasal and ocular routes. The eye-drop vaccinations produce high local immune response
and vaccinal reactions due to gland of Harder stimulation (DAVELAAR & KOUWENHOVEN,
1976).
The eye-drop vaccinations can present failures because the commonly used diluents
for live virus do not present enough capacity of maintaining it viable during all the process
(BORNE & COMTE, 2003).
The evaluation of IBV vaccinal programs can be done by the measurement of anti-IBV
antibodies using the indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), which is precise and
commonly used in poultry industry (WANG et al., 2002).
The coconut water has pH and density similar to blood plasma; therefore it has cell
division (BLUME & MARQUES Jr., 1994) and growth promoters (NUNES & SALLES, 1993).
This way, it has been largely used in spermatozoon cryopreservation (FREITAS, 1988;
SALLES, 1989; TONIOLLI, 1989a; TONIOLLI, 1989b; ARAÚJO, 1990; FREITAS, 1992; CRUZ,
1994; MONTEZUMA Jr., 1994; UCHÔA et al., 2002), cultures of plant cells (PREVOT, 1942),
and as conservation media to cornea transplants in rabbits (NOGUEIRA & VASCONCELOS,
2000). There is interest in its use as diluent to live virus vaccines against poultry diseases due
to its transformation in powder that facilitated its transport and quality conservation.
51
This work had the objective of verifying the efficacy of the utilization of powder coconut
water (ACP-201®) as diluent to IBV vaccines in many vaccination programs.
MATERIAL AND METHODS
Birds
The study was performed in experimental broiler houses (Fig. 14) at the Veterinary
College of Universidade Estadual do Ceará. There were 1600 one-day-old chicks from breeders
aged 36 weeks. The birds were not vaccinated in the hatchery and were raised until 50 days of
age at a density of 10birds/m
2
. Standard management procedures were provided, including ad
libitum water and feed.
Treatments
The birds were randomly lodged in three broiler houses (H1, H2 and H3) with 15
experimental groups (n=100/group): T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7 in broiler house 1 and T8, T9,
T10, T11, T12, T13, T14 in broiler house 2 and CG (control group) in broiler house 3. The birds
of control group received no experimental vaccination (Fig. 15). The birds lodged in H2 received
experimental vaccinations with powder coconut water (ACP-201
®
) as diluent. The birds lodged
in H1 were submitted to experimental vaccinations with the use of an industrial diluent (ID). The
treatments are described in table 1(1). The experimental vaccination programs consisted of
different combinations of vaccines against infectious bronchitis (IB), infectious bursal disease
(IBD), and Newcastle disease (ND) in different combinations of vaccination days.
The vaccinations were performed individually through instillation of a 0,03mL drop by
ocular route.
Vaccines and Diluents
The vaccines and the industrial diluent became from the same laboratory. The
following strains were used: HB1 (titer 10
6,5
), H
120
(titer 10
3,5
), Lukert – intermediate classic (titer
10
3,0
) for ND, IB, and IBD, respectively. The powdered coconut water diluent (ACP-201
®
) was
produced by Ae
52
proportion of 1:1 with distillated sterile water and placed in 30mL eye-dropper containers, for
avian vaccination (Fig. 16).
The industrial diluent, 30mL eye-droppers for 1000 doses, was used according to the
procedures recommended by the laboratory producer (Fig. 17).
Table 1(1)
. Experimental vaccination programs
Group
Diluent
Vaccination programs
1 day of age
8 days of age
16 days of age
Strain
T1
ID
None
IB
None
H
120
T2
ID
None
ND+IB
None
H
120
, HB1
T3
ID
IBD
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T4
ID
IBD+IB
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T5
ID
IBD+IB
ND+IB
IB
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T6
ID
IBD
ND+IB
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T7
ID
IBD
ND+IB+IBD
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T8
ACP-201
®
None
IB
None
H
120
T9
ACP-201
®
None
ND+IB
None
H
120
, HB1
T10
ACP-201
®
IBD
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T11
ACP-201
®
IBD+IB
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T12
ACP-201
®
IBD+IB
ND+IB
IB
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T13
ACP-201
®
IBD
ND+IB
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T14
ACP-201
®
IBD
ND+IB+IBD
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T: treatments; ID: industrial diluent; ACP-201®: powder coconut water; IB: infectious bronchitis; IBD: infectious bursal disease; ND:Newcastle disease
53
Blood collection and serological tests
Twenty birds of each group were individually identified and the blood collections were
performed always in the same birds. The birds of control group were submitted to blood
collections at 1, 15, 35, and 45 days of age to maternal antibody evaluation against IBV. The
other groups were submitted to blood collections at 35 and 45 days of age. All blood samples
were obtained from brachial vein (Fig. 19); the sera were collected and frozen at -20ºC until the
serological tests were performed.
The samples were assayed by indirect ELISA test (Kirkegaard & Perry Laboratories –
KPL) to antibody detection against infectious bronchitis virus.
Statistical analysis
The data were submitted to Kolmogorov-Sminov and Shapiro-Welk tests to
confirmation of normality distribution and Bartlett test to homogeneity of variance among the
treatments. The situations that the requirements of variance analyses were reached, as the
antibody titers at 35 days of age, the GML procedure of SAS (SAS, 2000) was applied and the
means of the variables in each treatment were compared by Duncan test. The situations that
heteroscedasticity
occurred, antibody titers of 45 days of age, the results were analyzed by the
non parametric Kruskal-Wallis test.
RESULTS AND DISCUSSION
There were no respiratory clinical signs in all treatments. The mortality was low (5%)
and all dead birds were submitted to necropsy and it was not found indicative lesions to
respiratory diseases.
The IBV antibody titers of experimental treatments, expressed Geometric Mean Titers
(GMT), are shown in table 2(1) and Graph 1(1).
The maternal antibodies of control group decreased to basal levels between 14 and 21
days of age, as showed in Graph 1(1), as observed by other authors (VILLEGAS &
54
AVELLANEDA, 1994; GELB Jr. et al., 1998), and remained until the end of experiment showing
that there was no IBV challenge.
In spite of the differentiated experimental vaccinal programs, the statistical differences
(p<0,05) occurred only between T1 and T8 at 35 days and between T5 and T12 at 45 days, as
showed in table 2 (1).
Graph 1(1)
.
Anti-IBV maternal antibodies of control group
at 1, 15, 35 and 45 days of age
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
1
15
35
45
Days of age
G
M
T
Table 2(1).
Anti-IBV antibody titers in GMT of the experimental treatments at 35 and 45 days of
age
Industrial Diluent
ACP 201®
Group
35 days
45 days
Group
35 days
45 days
1
191.60 ± 286.28
b
667.20 ± 606.12
8
632.10 ± 529.54
a
1263.70 ± 1657.70
2
418.10 ± 903.67
679.80 ± 1061.00
9
224.40 ± 301.30
257.80 ± 265.03
3
122.50 ± 160.25
961.20 ± 892.05
10
346.40 ± 643.94
1090.70 ± 2276.42
4
559.90 ± 770.69
957.00 ± 1322.20
11
186.50 ± 303.89
772.90 ± 1218.90
5
207.90 ± 457.01
495.50 ± 796.06
B
12
330.60 ± 643.00
1508.00 ± 1631.21
A
6
1410.50 ± 3214.28
3110.70 ± 3930.02
13
223.10 ± 289.98
796.60 ± 803.30
7
886.50 ± 1358.36
2681.50 ± 4058.03
14
138.80 ± 256.85
868.70 ± 1089.47
Different letters mean statistical difference (p<0.05) at the same age, vaccinal program, and different diluents
Antibody titers in GMT = ELISA Test
55
The utilization of IBV vaccination programs with the different experimental diluents
promoted similar antibody response among the treatments 2;4;5;6;7;9;10;11;12;13 and 14 at 35
days and 1;2;3;4;6;7;8;9;10;11;13 and 14 at 45 days, totaling 71.43% of the birds.
The fourteen analyzed groups were reared under commercial conditions with the use of
several vaccinal programs to each experimental diluent, however the birds presented a low
variation antibody response and no titer was suggestive of field challenge (VILLEGAS &
AVELLANEDA, 1992; VILLEGAS & AVELLANEDA, 1994). This situation can be explained by a
correct vaccination process, with adequate vaccine storing before application and absence of
IBV challenge (COOK, 1997).
The anti-IBV maternal antibodies can be detect until the fourth week of age (MARTINS,
1992) and can interfere on the vaccination by neutralizing the IBV (GELB et al., 1998) and
promoting low or null antibody response to vaccine. The birds can also present low titers due to
immunosupression by infectious Bursal disease (IBD) (GELB & NIX, 1998), however this
second hypothesis was not considered due to the excellent growth performance obtained by the
birds in the experiment.
The anti-IBV antibody titers in our experiment were similar to other studies (DI FÁBIO,
1992; MONDAL & NAQI, 2001; WANG et al., 2002; ALVARADO et al., 2003) in different
situations, using the strain H-120, and vaccinating or not in the first day of age (SALLES, 2003).
Many researches have been performed in poultry industry verifying different kinds of
adjuvants to injectable vaccines (HILGERS et al., 1998; ROY et al., 1999; ASIF et al., 2004),
trying to minimize inflammatory reactions and adverse effects. They also seek the cost
reduction that is an important limitation to animal vaccines. There is no report of researches
trying to optimize the maintenance of IBV live vaccines to increase their antigenic response. The
ACP-201® presented good results as IBV vaccine diluent when compared to industrial diluents,
therefore it presents advantages like been a natural product, its low cost, and abundance in
nature.
ACKNOWLEDGES
The authors thank Dr. Ronald Carneiro Câmara of the poultry company CIALNE
(Companhia de Alimentos do Nordeste), Merial-Animal Health, Tecnavic for their assistance in
56
providing the birds and feed; serological tests; vaccines, respectively, Dr. Claudio Cabral for his
help in statistical analyses, the BIOLAB Patologia Animal S/C Ltda and CNPq – Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
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59
6.2 ARTIGO 2
2
Immune response of broilers to Newcastle disease vaccinations by the use of
powder coconut water or industrial diluents
Marcia Helena Niza Ramalho Sobral
1
, Josue Moura Romão
2
, Walber Feijó de Oliveira
1
, Rosa
Patricia Ramos Salles
1
, Régis Siqueira de Castro Teixeira
1
, Suiany Rodrigues Câmara
1
, Adonai
Aragão de Siqueira
2
, Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
3
and William Maciel Cardoso*
4
.
1. Postgraduate students of Veterinary Sciences of Universidade Estade s
60
INTRODUCTION
The Newcastle disease (ND) is a contagious illness which is placed in the list A of OIE
(GOHM et al. 1999). It is caused by paramyxovirus serotype-1 that is a RNA virus of
Paramyxoviridae family, genus Avulavirus. It has been isolated from the most wild and domestic
bird species in the world (ALEXANDER 2003)
.
The ND is a great challenge to Brazilian and world aviculture, due to its high economic
loses. The control of ND has been done for a long time by the use of live and inactive vaccines;
and the lentogenic vaccines commonly used: B1, Lasota, F (Asplin), V4, Ulster an d VG/GA
(VILLEGAS 1998). The strains B1 and Lasota are the most used around the world. The vaccinal
virus can induce a local antibody response with IgA production by the gland of Harder and
lachrymal IgM after oral instillation (SEAL et al. 2000).
The programs and procedures against Newcastle disease virus (NDV) are different
among the countries and in the poultry farms in the same country; it depends on local
parameters (AINI 1990). Many factors influence the success of a vaccinal program, like the
interference of maternal immunity (REHMANI 1996), the production system, the prevalence of
the disease in the region, the selected vaccinal strain and the administration route (GALLILI &
BEN-NATHAN, 1998). Allan reported that the efficacy of the vaccinal virus depends on its
infectivity and multiplication in the chicken to promote an adequate immune response.
The vaccination by ocular route in poultry industry is done by the use of a specific
industrial diluent, based on distilled water, pigment and stabilizers that is not capable to
maintain the virus viable during all the time of the vaccination process.
The powder coconut water (ACP-201
®
) was developed as diluent for avian live
vaccines. It is formulated and produced by ACP Biotechnology company. The ACP-201
®
, is
based on the endospermic liquid of coconut tree (Cocos nucifera L.) with fruit aging about six
months.
The coconut water has pH and density similar to blood plasma; therefore it has cell
division (CRUZ 1994) and growth promoters (PREVOT 1942). This way, it has been largely
used in spermatozoon cryopreservation (TONIOLLI 1989; SALLES 1989; ARAÚJO 1990,
NUNES & SALLES, 1993; CRUZ 1994; MONTEZUMA et al. 1994; UCHOA et al, 2002),
cultures of plant cells (PREVOT 1942), and as conservation media to cornea transplants
61
(NOGUEIRA & VASCONCELOS, 2000). There is interest in its use as diluent to vaccines of live
virus against poultry diseases due to its transformation in powder that facilitated its transport
and quality conservation.
This work had the objective of verifying the efficacy of the utilization of powder coconut o
62
Vaccines and Diluents
The vaccines and the industrial diluent became from the same laboratory. The
following strains were used: HB1 (titer 10
6.5
), H
120
(titer 10
3.5
), Lukert – intermediate classic (titer
10
3.0
) for ND, IB, and IBD, respectively. The powder coconut water diluent (ACP-201
®
) was
produced by ACP-Biotechnology Company (Ceará-Brazil) using ACP
®
as mother solution with
pH (7.0) and osmolarity (300mOsm/Kg). The ACP-201
®
solution was previously diluted by the
proportion of 1:1 with distillated sterile water and placed in 30mL eye-dropper containers, for
avian vaccination (Fig. 16).
Table 1(2)
. Experimental vaccination programs
Group
Diluent
Vaccination programs
1 day of
age
8 days of
age
16 days of
age
Strain
T1
ID
None
ND
None
HB1
T2
ID
None
ND+IB
None
H
120
, HB1
T3
ID
IBD
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T4
ID
IBD+IB
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T5
ID
IBD+IB
ND+IB
IB
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T6
ID
IBD
ND+IB
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T7
ID
IBD
ND+IB+IBD
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T8
ACP-201
®
None
ND
None
HB1
T9
ACP-201
®
None
ND+IB
None
H
120
, HB1
T10
ACP-201
®
IBD
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T11
ACP-201
®
IBD+IB
ND+IB
None
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T12
ACP-201
®
IBD+IB
ND+IB
IB
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T13
ACP-201
®
IBD
ND+IB
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T14
ACP-201
®
IBD
ND+IB+IBD
IBD
H
120
, HB1,
Lukert intermediate
T: treatments; ID: industrial diluent; ACP-201®: powder coconut water; IB: infectious bronchitis; IBD: infectious bursal disease; ND:Newcastle disease
63
Blood collection and serological tests
Twenty birds of each group were individually identified and the blood collections were
performed always in the same birds. The birds of control group were submitted to blood
collections at 1; 15; 25; 35 and 45 days of age to maternal antibody evaluation against NDV.
The other groups were submitted to blood collections at 25; 35 and 45 days of age. All blood
samples were obtained from brachial vein (Fig. 19); the sera were collected and frozen at -20ºC
until the serological tests were performed.
The samples were assayed by Hemagglutination inhibition (HI) to antibody detection
against Newcastle disease virus according to ALLAN & GOUGH (1974a).
Statistical analysis
The data were submitted to Kolmogorov-Sminov and Shapiro-Welk tests to
confirmation of normality distribution and Bartlett test to homogeneity of variance among the
treatments. The situations that the requirements of variance analysis (ANOVA) were reached,
as the antibody titers at 35 days of age, the GML procedure of SAS was applied and the means
of the variables in each treatment were compared by Duncan test. The situations that
heteroscedasticity
occurred, antibody titers of 45 days of age, the results were analyzed by the
non parametric Kruskal-Wallis test.
RESULTS
The anti-NDV antibody titers at 1; 15; 25; 35 and 45 days of age of the birds from
control group are shown in figure 1(2). The figure 2(2) presents the anti-NDV antibodies titers of
the experimental groups vaccinated with the use of industrial diluent or ACP-201
®
at 25; 35 and
45 days of age. The treatments were grouped, according to the vaccinal program, to a better
comparison of the results: T1 and T8=A, T2 and T9=B, T3 and T10= C, T4 and T11=D, T5 and
T12=E, T6 and T13=F, T7 and T14=G.
The table 2(2) presents the percentage of birds in each treatment the obtained the titer
log
2
3 which is considered protective against Newcastle disease virus challenge (ALLAN &
GOUGH, 1974b).
64
Figure 1(2)
.
HI Anti-NDV antibodies at 1, 15, 25, 35, and 45
days of age of control group
0
5
10
15
20
25
1
15
25
35
45
Days of age
G
M
T
Anti-NDV
antibodies
Table 2(2).
Percentage of birds vaccinated with the use of ACP-201
®
(n=700) or Industrial
Diluent (n=700) with titers equal or superior to log
2
3.
Industrial Diluent
ACP-201
®
Age
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
Total
T8
T9
T10
T11
T12
T13
T14
Total
25
80
100
60
70
40
50
40
62.85
100
100
90
100
100
90
100
97.14
35
80
60
100
100
70
100
90
85.71
100
100
50
90
100
90
100
90.00
45
100
60
100
100
100
100
100
94.28
100
100
30
90
100
90
100
87.14
The anti-NDV antibody titers were statistically similar to the groups C and D at 25 days,
E, F and G at 35 days, and D and F at 45 days. However, the antibody titers were statistically
superior in 71. 43% of the birds when they were vaccinated using ACP-201®, comparing to the
birds that were vaccinated using the industrial diluent.
There was no clinical sign of diseases in the birds during the experiment. The total
mortality was 3.65% until 45 days of age that is considered low to the poultry industry, regarding
the local parameters. All dead birds were analyzed, confirming the absence of lesions indicating
any disease.
65
DISCUSSION
This research was performed to verify the efficacy of ACP-201® as NDV vaccinal
diluent, based on great results that ACP obtained by its use in artificial insemination, embryo
transferences, culture of plant cells and conservation of organs to transplant using power
coconut powdered water as solution.
The vaccination to ND was done in the eighth day of age, as recommended by
BACALLAO et al. (1989). Other authors showed that birds vaccinated at older ages obtained
higher anti-NDV antibody titers (ALLAN 1971; YAMANO et al. 1974). There is risk by performing
late vaccinations, because the maternal antibodies decrease and the birds become susceptible
to ND infection (REHMANI 1996).
This author reported that a single vaccination by the use of
Lasota strain at 12 days of age was enough to promote protection until seven weeks of age. In
our experiment the anti-NDV antibodies were evaluated until 45 days of age, the slaughter age
in the region, and 85.71% of the birds in the experiment presented protective antibody titers to
ND.
Three to five weeks post vaccination, there was a peak of titers (log
2
5) in 28.57% of
birds vaccinated with ID and in 42.85% for the birds vaccinated with ACP-201
®
. Some authors
reported similar titers in experiments with the use of NDV thermostable vaccines (AINI et al.
1987; BELL et al. 1995; SPRADBROW & SAMUEL, 1997). JAGNE et al. (1991) found that only
30% of vaccinated birds obtained the titer (log
2
3) four week after vaccination. To the same
Figure 2(2). HI Geometric mean titers in log2 of anti-NDV antibodies of
experimental groups at 25, 35 and 45 days of age
0
50
100
150
200
A
B
C
D
E
F
G
A
B
C
D
E
F
G
A
B
C
D
E
F
G
25 days 35 days 45 days
G
M
T
ID
ACP-201
66
period, 85.71% of the birds in our experiment presented equal or higher titers, while BELL et al.
(1995) found 100% of protection vaccinating with thermostable vaccine, V4, affirming that this
fact can be promoted by the efficacy of ocular rout administration.
The anti-NDV antibody titers found in the first day of age (GMT 21.77) were
intermediate level, despite the hens had been vaccinated with oil vaccines about 15 weeks
before the hatching of the experimental birds. EIDSON et al. (1982)
consider (GMT 7) as low
level and (GMT 84) as high level of maternal antibodies. QUAGLIO et al. (1975)
affirmed that
maternal antibodies interfere on vaccination efficacy. These authors found that high maternal
antibody levels neutralize the vaccinal virus. The experimental birds were vaccinated at eight
days of age and according to LYRA et al. (1979)
in this situation the maternal antibodies are not
capable to interfere on vaccination.
The ocular route induces local production of IgA in secretions, promoting a fast
protection, because the viral replication in receptor respiratory cells occurs before the
solicitation of immune cells. This way, the administration of vaccines by ocular route is
considered the most effective (LYRA et al. 1979)
.
However, for practical and economical needs,
the vaccination through drinking water is the most applied, but the less effective (ALLAN &
DAWSON,1973).
We observed that there was great difference among the antibody response of the
various vaccinal programs, showing no correlation between the groups that received the same
type of vaccinal program. Some authors report the phenomenon of interference between
infectious bronchitis virus and Newcastle disease virus, when they are applied associated
(CARDOSO et al. 2005; HANSON et al. 1956; LUCAS, 1963; THOMPSON et al. 1997).
According to INSEL (1995), the interference among associated vaccines can be promoted by
different mechanisms, including effects of ionic interactions with adjuvants, conductors to
absorption or dislocation of many vaccinal components and interferences by buffers, stabilizers
or others excipients of one vaccine to another. In this situation, the ant-NDV antibody titers
produced by the birds experi19 0 Td1.56 Tw(on )Tj0.01104 Tc16.3199 0 T15977 0 Td(c)Tj-0.13104 Tc5.27969 0 Td(i)Tj0.02208 Tc2.15977 0 Td1.90893.1Td(o)Tj0.131(i)Tj0.02208py i19 0 Td1.56 Tw(on )Tj0.01104 T144 Tc2.27969 0 Td(r)Tj7.02208 Tc2.15977 0 Td(19 0 Td1.56 Tw(on )Tj0.01104 T144Tc7.91992 0 Td2.90208 Tw(N ) Tc8.03984 0 Td(S)208 Tw(N )P14208 Tc9 0 Td8 Tc47.02208 -5.87969 0 Td(x)Tj5199 0 Td(20 Tc3.482458-0.10896 Tc5.15917966-0.0765®Tc3 0 Td3.34896 Tw(h ad)Tj0.1089 Tc5.15977 0104 Tc3.47969 0 T Td0.94896 Tw(ed )Tj0.14208 Tc15.3598 0 Td(b)Tj77 0 Td(t)Tj77 0 Td0.24 Tw01104 T144Tc2.27969 0 Td3.22896 Tw(ng a )Tj0.3.22896 Tw(e be)Tj0.01104 Tc23.4 0 Td(t)Tj-0.13 u02208 Tc2.27969 21Tj-0.13104 Tc3 0 Tc2.4 0 Td111.5199 0 Td(c)Tj-0.09792 Tc5.1 no )Tj09r)Tj0.02208 Tc3.47969 0 Tda
67
research and the literature review is rare to the use of powder coconut water in vaccination
processes, however there is a report of EGLAFONA (1996) using coconut oil (Cocos nucifera
L.) as adjuvant to oil vaccine to measles, obtaining results superior to the other oil adjuvants
evaluated. The powder coconut water (ACP-201®) presented protective and uniform anti-NDV
antibody titers, being a good option to vaccinations with live virus by ocular route, therefore it
presents advantages like been a natural product, its low cost, and abundance in nature.
ACKNOWLEDGES
The authors thank Dr. Ronald Carneiro Câmara of the poultry company CIALNE
(Companhia de Alimentos do Nordeste), Merial-Animal Health, Tecnavic for their assistance in
providing the birds and feed; serological tests; vaccines, respectively, Dr. Claudio Cabral for his
help in statistical analyses, the BIOLAB Patologia Animal S/C Ltda and CNPq – Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
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71
6.3 ARTIGO 3
3
Resposta imune para vacinações contra Doença Infecciosa da Bolsa mediante o
uso de água de coco em pó e diluente industrial em frangos de corte
Immune response of broilers to infectious bursal disease vaccinations by use of powder
coconut powder water or industrial diluents
Marcia Helena Niza Ramalho Sobral
1
, Josue Moura Romão
2
, Rosa Patricia Ramos Salles
1
,
Walber Feijó de Oliveira
1
, Régis Siqueira de Castro Teixeira
1
, Suiany Rodrigues Câmara
1
,
Adonai Aragão de Siqueira
2
, Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
3
and William Maciel
Cardoso*
4
.
1. Alunos de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará
2. Alunos de Graduação da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará
3. Bolsista DCR CNPq/FUNCAP da Universidade Estadual do Ceará
4. Professor da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará
RESUMO
Esta pesquisa teve como objetivo avaliar o uso da água de coco em pó (ACP 201
®
)
como diluente da vacina viva do vírus da Doença Infecciosa da Bolsa (DIB) quando comparado
ao diluente industrial (DI). Foram alojados 1200 pintos de um dia de idade não vacinados,
separados em 11 grupos experimentais de 100 aves cada e um grupo serviu como controle
(n=200). Os outros foram utilizados para comparação do ACP-201® e diluente industrial,
mediante a realização de diversos programas de vacinação. Foram coletadas amostras de
sangue aos 35 e 45 dias de idade estas foram submetidas ao teste de ELISA indireto para
mensuração dos títulos de anticorpos contra o VDIB. As médias dos títulos obtidos para todos
os grupos experimentais foram comparadas utilizando-se o programa estatístico SAS, com
p<0,05. Os resultados demonstraram que os grupos que receberam vacinação com o DI
apresentaram títulos de anticorpos estatisticamente superiores aos que receberam as vacinas
diluídas em ACP 201
®
. Os títulos de anticorpos para os grupos vacinados com DI foram
sugestivos de desafio de campo.
Palavras-chaves
:Doença Infecciosa da Bolsa, vacinações, frangos de corte
3
Artigo submetido ao periódico Acta Scientiae em 14 de Novembro de 2005.
72
ABSTRACT
This research was carried out to verify the use of powder coconut water (ACP-201
®
) as
vaccinal diluent to live infectious bursal disease vaccine comparing to industrial diluent (ID).
1200 day-old chicks, without previous vaccination, were separated into 10 experimental groups
with 100 birds each and one group (n=200) was the control and the others were used to
compare ACP 201
®
and ID in different programs of vaccination. The birds were bled at 35 and
45 days of age and the serum samples were submitted to indirect ELISA test to measurement of
anti-IBDV antibodies. The titers were analyzed by SAS with p<0,05. The results showed that the
groups that received vaccination with vaccines diluted with ID presented higher anti-IBDV
antibody titers comparing to the groups that were vaccinated with ACP 201
®
. The antibody titers
to the groups vaccinated with ID were indicative of field challenge.
Key-words
: infectious bursal disease, vaccination, broiler
INTRODUÇÃO
Doença Infecciosa da Bolsa (DIB) ou Doença de Gumboro é uma doença viral aguda e
altamente contagiosa, que induz alta mortalidade e morbidade em aves jovens, caracterizada
por severas lesões na bolsa de Fabrícius, sendo normalmente subclínica, causando quadro de
imunodepressão em aves de três a seis semanas de idade (SAIF, 1991; LUKERT & SAIF,
2003). Os plantéis afetados pela DIB apresentam respostas reduzidas à vacinação, severas
reações pós-vacinais e suscetibilidade aumentada a infecções simultâneas e secundárias
(ROSALES, 1999). Ela é considerada como a doença que causa o maior impacto econômico
da indústria avícola (AL-NATOUR et al., 2004). O vírus da DIB (VDIB) pertence ao gênero
Avibirnavirus, da família Birnaviridae, possuindo dois sorotipos designados de I e II, embora
somente o sorotipo I tem causado doença em galinhas (BANDA & VILLEGAS, 2004).
O VDIB é muito resistente a vários agentes físicos e químicos, dificultando sua
completa erradicação dos galpões avícolas, mesmo utilizando-se procedimentos de limpeza e
desinfecção (ASHARAF et al., 2005). Não obstante a utilização de estritas medidas higiênicas,
a vacinação é o procedimento profilático mais recomendado e prático (SIMON & ISHIZUKA,
2000; MÜLLER et al., 2003), utilizando-se vacinas com vírus do sorotipo 1 vivas ou inativadas,
sendo inevitável para diminuir altas pressões de infecção e obrigatória para proteger aves
73
contra infecção durante as primeiras semanas de vida (MARDASSI et al., 2004). Após o
nascimento, as aves são imunizadas com vacinas vivas; o período exato da vacinação é crucial
para que os anticorpos maternais persistentes não sejam neutralizados pela vacina (MÜLLER
et al., 2003). Todavia, diferentes programas de vacinação e vias de aplicação das vacinas são
utilizados por produtores e proprietários (AL-NATOUR & SAIF, 2004).
Existem quatro tipos principais de vacinas vivas atenuadas contra a DIB, que, de
maneira geral, têm a capacidade de induzir o mesmo tipo de reação sorológica, porém diferem
em termos de agressividade. Elas são classificadas em cepas do tipo suave, intermediária,
intermediária plus e quente, baseadas em sua habilidade de induzir a imunidade na presença
de anticorpos maternos e em sua patogenicidade residual (BORNE & COMTE, 2003).
Para a instilação de gota ocular de vacinas vivas atenuadas para controle de doenças
avícolas utilizam-se diluentes industriais específicos que não possuem a capacidade de manter
o vírus vacinal hábil por um período de tempo suficiente para a realização das vacinações com
segurança.
A água de coco possui características físico-químicas que lhe confere densidade e pH
compatíveis ao plasma sanguíneo, além de possuir indutores de divisão celular (BLUME &
MARQUES Jr., 1994) e substâncias promotoras de crescimento (NUNES & SALLES, 1993).
Por este motivo vem sendo largamente utilizada, com excelentes resultados, em estudos de
criopreservação de espermatozóides na área de reprodução animal (FREITAS, 1988; SALLES,
1989; TONIOLLI, 1989a; TONIOLLI, 1989b; ARAÙJO, 1990; FREITAS, 1992; CRUZ, 1994;
MONTEZUMA et al., 1994; UCHÔA et al., 2002), em cultivos celulares vegetais (PREVOT,
1942), bem como em meio de cultura na conservação de córnea de coelho para transplante
(NOGUEIRA & VASCONCELOS, 2000). Com a sua posterior produção na forma em pó,
mantendo as suas propriedades naturais, facilitando o seu transporte e conservação, atentou-
se para a possibilidade do seu uso para diluição de vacina viva atenuada contra doenças
avícolas.
O objetivo deste estudo foi verificar a viabilidade da utilização da água de coco em pó
(ACP-201®) como diluente de vacina contra DIB, utilizando diferentes programas de vacinação.
74
MATERIAL E MÉTODOS
Aves
Foram alojados 1200 pintos de um dia de idade não vacinados, provenientes de
matrizes comerciais da linhagem Ross com 43 semanas de idade. As aves foram alojadas em
galpões experimentais tipo Califórnia (Fig. 14), da Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, em condições semelhantes à do campo, até os 50 dias de idade, tendo
recebido ração balanceada e água ad libitum, numa densidade de 10aves/m
2
.
Tratamentos
Mil aves foram distribuídas aleatoriamente em dois galpões (G1 e G2) divididas em
cinco grupos (n=100/grupo), tendo recebido cada grupo um tratamento vacinal diferente,
conforme descritos na tabela 1(3). Duzentas aves foram alojadas em um outro galpão, não
tendo recebido nenhum tratamento, sendo consideradas como Grupo Controle (GC) (Fig. 15).
A imunização foi realizada individualmente através da instilação de uma gota de 0,03mL da
vacina diluída, através da via ocular (Fig. 17).
Tabela 1(3).
Tratamentos vacinais utilizados nos galpões 1 e 2
IDADE (DIAS)
VACINAS
GALPÃO
GRUPO
DILUENTE
01
08
16
G1
T1
DI
DIB
G1
T2
DI
DIB
NDV+BIG
G1
T3
DI
DIB+BIG
NDV+BIG
G1
T4
DI
DIB
NDV+BIG
DIB
G1
T5
DI
DIB
NDV+BIG+DIB
DIB
G2
T6
ACP-201®
DIB
G2
T7
ACP-201®
DIB
NDV+BIG
G2
T8
ACP-201®
DIB+BIG
NDV+BIG
G2
T9
ACP-201®
DIB
NDV+BIG
DIB
G2
T10
ACP-201®
DIB
NDV+BIG+DIB
DIB
DI= Diluente Industrial; BIG= Bronquite Infecciosa das Galinhas; DNC= Doença de Newcastle; DIB= Doença Infecciosa da Bolsa
75
Vacinas e Diluentes
As vacinas e o diluente industrial foram adquiridos no comércio local, todos de um
mesmo fabricante, sendo utilizadas as cepas vivas atenuadas HB1 (10
6,5
DIE
50
), H-120 (10
3,5
DIE
50
), Lukert – clássica intermediária (10
3,0
DIE
50
), respectivamente nas v
76
Análises Estatísticas
Os dados foram inicialmente submetidos aos testes de Kolmogorov-Sminov e Shapiro-
Welk, para confirmação da normalidade da distribuição e o teste de Bartlett para
homogeneidade de variância entre os tratamentos. Para as situações em que foram atendidas
as exigências para as análises de variâncias (ANOVA), esta foi executada por meio do
procedimento GLM do programa SAS (37) e as médias das variáveis expostas para cada
tratamento experimental foram comparadas por meio do teste de Duncan. Nas situações onde
ocorreu heterocedasticidade, mesmo após transformação logarítimica, radicial ou angular, os
resultados foram analisados por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis.
RESULTADOS
Durante a realização do experimento, não foram observados quadros clínicos que
indicassem algum tipo de doença em nenhum dos tratamentos. A mortalidade geral das aves
foi baixa e outros índices zootécnicos estabelecidos no lote, como conversão alimentar e ganho
de peso, foram considerados muito bons, principalmente nas aves alojadas no Galpão 2.
O declínio linear dos anticorpos maternais no tratamento controle até alcançar
indetectáveis níveis após os 35 dias de idade, está demonstrado na gráfico 1(3), estando de
acordo com outros autores (NAQI et al., 1983; FAUCOMPREZ, 1992; HITCHNER, 2004;
RAUTENSCHLEIN, 2005).
Gráfico 1(3).Títulos de anticorpos ao ELISA
contra VDIB do grupo controle
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
1
15
25
35
45
Dias de idade
G
M
T
77
A Tabela 2(3) apresenta os títulos médios de ELISA de anticorpos contra DIB, em
frangos de corte, vacinados por via ocular, utilizando-se diluente industrial (DI) e diluente a
base de água de coco em pó (ACP-201®), em diferentes programas de vacinação, aos 35 e 45
dias de idade.
Tabela 2(3).
Títulos de
anticorpos contra VDIB expressos em GMT dos Tratamentos
Experimentais aos 35 e 45 dias
Diluente Industrial
ACP 201®
Grupos
35 dias
45 dias
Grupos
35 dias
45 dias
1
1305 ± 1688,46
a
2182 ± 1310,17
a
6
109 ± 345,63
b
0 ± 0,00
b
2
302 ± 506,85
a
2276 ± 1213,37
a
7
0 ± 0,00
a
0 ± 0,00
b
3
2281 ± 1864,51
a
2403 ± 1579,24
a
8
186 ± 303,89
b
772 ± 1218,90
b
4
1261 ± 1875,07
a
1420 ± 857,28
a
9
0 ± 0,00
b
81 ± 257,40
b
5
1712 ± 1128,76
a
3394 ± 2086,06
a
10
0 ± 0,00
b
0 ± 0,00
b
As letras (a, b) representam diferença estatística em aves da mesma idade, mesmo programa vacinal e diluentes experimentais diferentes
A utilização da água de coco em pó (ACP-201®) como diluente ocular para vacina
viva, cepa intermediária, contra VDIB permitiu a obtenção de títulos significativamente inferiores
(p>0,05), tanto aos 35 dias de idade quanto aos 45 dias, quando comparados àqueles obtidos
com o uso do diluente industrial, em todos os programas de vacinação utilizados.
Foram encontradas diferenças significativas (p>0,05) nos títulos de anticorpos contra o
VDIB aos 35 e 45 dias de idade, entre praticamente todos os tratamentos em que se utilizaram
o diluente ACP-201® e o diluente industrial, com exceção entre os tratamentos 2 e 7, onde foi
adotado o programa de vacinação de uma dose de vacina contra DIB no dia 1 e outra
aplicação aos 8 dias de uma dose de vacina contra DIB associada a vacina contra NDV, ao 35
dias.
78
DISCUSSÃO
A ausência de problemas sanitários durante o período de criação das aves, em
associação aos resultados zootécnicos estabelecidos, são dados importantes para avaliar a
presença de VDIB de campo (FAUCOMPREZ, 1992).
O grupo controle, criado separadamente sem receber nenhuma vacina, apresentou
ausência de títulos aos 45 dias de idade, período de descarte das aves, demonstrando que as
aves não sofreram exposição ao VDIB durante o experimento (Títulos 1, 15, 25, 35 e 45 dias =
3749, 416, 249, 60, 1).
As amostras de sangue pareadas, para a realização das análises sorológicas, foram
coletadas sempre das mesmas aves, as quais inicialmente foram identificadas por anilhas
numeradas, assegurando respostas mais específicas neste estudo considerado exaustivo
(MUÑOZ, 2005).
Este trabalho não teve como objetivo avaliar os resultados sorológicos dos programas
de vacinação utilizados, sabendo-se que não existe um programa universal de imunização para
a DIB em decorrência da variabilidade da imunidade passiva, tipo de manejo e condições
operacionais (SIMON & ISHIZUKA, 2000; MÜLLER et al., 2003; RAUTENSCLEIN, 2005).
Neste estudo, os diversos programas de vacinação adotados não influenciaram as diferenças
de resultados.
Segundo PEREIRA (2004), os vírus de campo induzem títulos extremamente altos e
as vacinas intermediárias não induzem a formação de altos títulos; entretanto é possível
encontrar aves bem protegidas, com altos títulos de anticorpos indicando desafio, mas não
manifestando sinais da doença. De acordo com dados fornecidos por DI FÁBIO (2001) e por
NAQI et al. (1983), os resultados obtidos pelas aves alojadas no Galpão 1, vacinadas
utilizando-se o diluente industrial, demonstraram títulos, na maioria dos tratamentos, mais altos,
sugerindo-se desafio, quando comparadas as aves alojadas no Galpão 2, onde foi utilizado o
diluente ACP-201® para a vacinação, com 60% das aves demonstrando títulos negativos ao
abate. Os títulos obtidos pelas aves do Galpão 2 também foram próximos aos encontrados por
RAUTENSCHLEIN et al. (2005), com os mesmos anticorpos maternais.
O diluente a base de água de coco em pó (ACP-201®) demonstrou ser uma boa
opção para vacinação por via ocular, principalmente por ser um produto natural, de baixo custo
79
e facilmente encontrado na natureza, necessitando, entretanto, de mais estudos
complementares.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Dr. Ronald Carneiro Câmara da CIALNE (Companhia de
Alimentos do Nordeste), MERIAL-Saúde Animal e TECNAVIC, pelo fornecimento das aves e
rações, testes sorológicos e vacinas respectivamente; Dr. Claudio Cabral pelo seu apoio nas
análises estatísticas; BIOLAB Laboratório de Patologia Animal S/C Ltda e CNPq – Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
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82
7. CONCLUSÕES
Através dos resultados encontrados neste trabalho, foi possível verificar que as aves
vacinadas por via ocular contra o vírus da bronquite infecciosa das galinhas, utilizando-se o
diluente ACP-201®, obtiveram títulos médios de anticorpos semelhantes àquelas onde foi
utilizado o diluente industrial, nas mesmas condições experimentais.
No caso das aves vacinadas contra o vírus da doença de Newcastle utilizando-se o
diluente ACP-201®, os títulos de anticorpos obtidos foram superiores e demonstraram mais
uniformidade do que os títulos obtidos nas aves vacinadas com o diluente industrial.
Para os grupos onde foi utilizada a vacina contra o vírus da doença infecciosa da bolsa
aplicada com ACP-201®, os títulos de ELISA foram inferiores aos obtidos com o uso do
diluente industrial, embora que, neste caso, as aves onde foi utilizado o diluente industrial,
apresentaram resultados sorológicos compatíveis com possível desafio pelo vírus da doença
infecciosa da bolsa.
O ACP-201® utilizado como diluente para vacinas vivas aviárias, aplicadas por via
ocular, contra os vírus da bronquite infecciosa das galinhas, doença de Newcastle e doença
infecciosa da bolsa, demonstrou resposta imune humoral compatíveis aos programas vacinais
estabelecidos.
O caráter inédito deste estudo torna os resultados encontrados de relevante
importância.
83
8. PERSPECTIVAS
Os estudos realizados neste experimento demonstraram que o uso do diluente ACP-
201® é viável para a utilização como diluente para instilação por via ocular de vacinas vivas
contra bronquite infecciosa das galinhas, doença de Newcastle e doença infecciosa da bolsa
em frangos de corte, podendo-se considerar como uma possível alternativa para a indústria de
biológicos avícolas.
A água de coco é um produto bastante cesível
84
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105
ANEXOS
106
Anexo 1 – Níveis nutricionais da água de coco (USDA SR17, 2005)
100g
100g
Calorias
19,0 (79,5 kJ)
Vitaminas
Calorias provenientes de carboidratos
14,8 (62,1 kJ)
Ácido ascórbico
2,4 mg
Calorias provenientes de lipídios
1,7 (7,0 kJ)
Folatos
3,0 mcg
Calorias provenientes de proteínas
2,5 (10,5 kJ)
Niacina
0,1 mg
Água
95 g
Riboflavina
0,1 mg
Cinzas
0,4g
Tiamina
traços
Carboidratos totais
3,7 g
Minerais
Fibra
1,1 g
Cálcio
24,0 mg
Lipídios totais
0,2 g
Cobre
Traços
Lipídios saturados
0,2 g
Enxofre
24.0
Ácido capróico (6:0)
1,0 mg
Ferro
0,3 mg
Ácido caprílico (8:0)
14,0 mg
Fósforo
20 mg
Ácido cáprico (10:0)
11,0 mg
Manganês
0,1 mg
Ácido láurico (12:0)
88,0 mg
Magnésio
25 mg
Ácido mirístico (14:0)
35,0 mg
Potássio
250 mg
Ácido palmídico (16:0)
17,0 mg
Selênio
1,0 mcg
Ácido esteárico (18:0)
10,0 mg
Sódio
105 mg
Ácido oléico (18:1)
8,0 mg
Zinco
0,1 mg
Ácido linoléico (18:2)
2,0 mg
Proteínas
0,7 g
Aminoácidos
Ácido Aspártico
70 mg
Ácido Glutâmico
165 mg
Alanina
37 mg
Arginina
118 mg
Cistina
14 mg
Fenilalanina
37 mg
Glicina
34 mg
Histidina
17 mg
Hidroxiprolina
Traços
Homoserina
Traços
Isoleucina
28 mg
Leucina
53 mg
Lisina
32 mg
Metionina
13 mg
Prolina
30 mg
Serina
37 mg
Tirosina
22 mg
Treonina
26 mg
Triptofano
8 mg
Valina
44 mg
107
FOTOS
108
1
2
3
1
– Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (Berry & Almeida, por Cavanagh & Naqi, 2003)
2
– Micrografia eletrônica do vírus da Doença de Newcastle, cepa Ulster 2C (Collins, por
Alexander, 2003)
3
– Micrografia eletrônica de partículas virais do vírus da Doença Infecciosa da Bolsa (Lukert &
Saif, 2003)
109
4
5
6
4
– (A) Casca rugosa. (B) Ovo deformado. (C) Ovo sem casca. Ovos colocados por galinhas
infectadas pelo vírus da BIG. (R. J. Julian, por Cavanagh & Naqi, 2003)
5
– Ovo normal (embaixo) e ovo de galinha exposta ao VBIG. Notar albúmem liquefeito com
gema separada dele. (Hofstad, por Cavanagh & Naqi, 2003)
6
– Lesões renais associadas ao BIG causada pela cepa T do vírus. (Cumming, por Cavanagh
& Naqi, 2003)
110
7
8
9
10
7, 8, 9
– Sinais clínicos respiratórios da Doença de Newcastle. (Doretto Jr., 2004)
10
– Sinal nervoso causado por cepa velogênica do VDN (Doretto Jr., 2004)
111
11
12
13
11
– Lesões hemorrágicas e edematosas de Bolsa de Fabrício e musculatura hemorrágica
típica de DIB aguda.
12
– Lesões hemorrágicas de musculatura de ave infectada pelo VDIB.
13
– Bolsas de Fabrício infectadas pelo VDIB com diversos graus de lesões.
(
www.theranger.co.uk )
112
14
15
16
14
– Galpão experimental da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará.
15
– Pintinhos alojados para este experimento.
16
- Diluição das vacinas com o ACP-201®.
113
17
18
19
17
– Vacinação das aves por via ocular utilizando-se o diluente ACP-201®.
18
– Aves com anilhas numeradas.
19
– Coleta de sangue através de punção da veia braquial.
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