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CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E ANÁLISE POR
MICROSSATÉLITES DE DNA DE ISOLADOS DE CAMPO
DO Schistosoma mansoni SAMBON, 1907, OBTIDOS EM ESTEIO,
RIO GRANDE DO SUL.
RAFAEL LUCYK MAURER
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ii
FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS – ZOOLOGIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E ANÁLISE POR MICROSSATÉLITES
DE DNA DE ISOLADOS DE CAMPO DO Schistosoma mansoni SAMBON,
1907, OBTIDOS EM ESTEIO, RIO GRANDE DO SUL.
Rafael Lucyk Maurer
Orientador: Prof. Dr. Carlos Graeff-Teixeira
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
2005
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iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................... v
LISTA DE TABELAS................................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................... vii
DEDICATÓRIA.......................................................................................................... .ix
AGRADECIMENTOS................................................................................................... x
RESUMO................................................................................................................... xii
ABSTRACT............................................................................................................... xiii
1. Introdução............................................................................................................. 1
1.1 O parasito......................................................................................................... 1
1.2 Aspectos gerais da esquistossomose.............................................................. 2
1.3 Morfologia do S. mansoni................................................................................ 5
1.3.1 Aparência externa......................................................................................... 6
1.3.2 Macho........................................................................................................... 6
1.3.3 Fêmea........................................................................................................... 7
1.4 Diversidade morfológica e morfométrica em
S. mansoni................................. 7
1.5 Genoma do S. mansoni................................................................................... 8
1.6 Diversidade gênica em S. mansoni.................................................................. 9
1.7 Microssatélites na análise populacional......................................................... 11
1.8 Microssatélites na parasitologia..................................................................... 14
2. Justificativa........................................................................................................ 15
3. Objetivos............................................................................................................. 17
3.1 Objetivo geral................................................................................................. 17
3.2 Objetivos específicos..................................................................................... 17
iv
4. Materiais e métodos........................................................................................... 18
4.1 Análise morfológica dos vermes.................................................................... 18
4.1.1 Coloração.................................................................................................... 18
4.1.2 Morfometria................................................................................................. 19
4.2 Análise estatística dos dados morfológicos................................................... 19
4.3 Análise molecular........................................................................................... 20
4.4 Extração de DNA........................................................................................... 20
4.5 Análise de microssatélites.............................................................................. 21
4.6 Iniciadores para PCR de microssatélites....................................................... 21
4.7 PCR de microssatélites.................................................................................. 22
4.8 Determinação do tamanho dos alelos de microssatélites.............................. 23
4.9 Análise dos dados obtidos com microssatélites: parâmetros de
genética de populações ............................................................................................ 23
5. Resultados.......................................................................................................... 25
5.1 Morfologia...................................................................................................... 25
5.2 Análise com microssatélites........................................................................... 30
5.3 Análise interpopulacional............................................................................... 34
6. Discussão........................................................................................................... 36
7. Conclusão........................................................................................................... 40
Referências bibliográficas...................................................................................... 41
APÊNDICE................................................................................................................ 55
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Ciclo de vida do S.mansoni........................................................................ 2
Figura 2 – Distribuição da esquistossomose no país de acordo com a prevalência de
infecção humana...................................................................................... 3
Figura 3 – Fluxo migratório humano e distribuição dos hospedeiros intermediários da
esquistossomose...................................................................................... 5
Figura 4 – Microssatélites com repetições em tandem CT....................................... 11
Figura 5 – Representação esquemática do processo de deslizamento das fitas de
DNA durante a replicação...................................................................... 13
Figura 6 – Distribuição das freqüências alélicas para os quatro loci dos isolados
Esteio e JV............................................................................................. 32
Figura 7 – Distribuição das freqüências alélicas para os 4 loci das cepas de LE e
MAP........................................................................................................ 33
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Lista das seqüências de Schistosoma mansoni contendo os
microssatélites utilizados no trabalho, n° de acesso no banco de dados,
repetições e classificação das repetições................................................ 21
Tabela 2 - Seqüências dos iniciadores, temperaturas de anelamento e número das
seqüências com loci de microssatélites estudados.................................. 22
Tabela 3 - Valores mínimos e máximos, médios e desvio padrão em milímetros das
mensurações realizadas em machos e fêmeas através de microscopia
óptica do Isolado Esteio. O n° de lobos está representado em
unidades................................................................................................... 26
Tabela 4 - Valores mínimos e máximos, médios e desvio padrão em milímetros das
mensurações realizadas em machos e fêmeas através de microscopia
óptica do Isolado JV. O n° de lobos está representado em
unidades................................................................................................... 28
Tabela 5 - Valor médio dos caracteres analisados em milímetros e análise de
variância dos isolados Esteio e JV para vermes machos. Diferenças
significativas para p<0,05......................................................................... 29
Tabela 6 -
Valor médio dos caracteres analisados em milímetros e análise de
variância dos isolados Esteio e JV para vermes fêmeas. Diferenças
significativas para p<0,05......................................................................... 29
Tabela 7 -. Número de alelos, heterosigozidade esperada (He) e observada (Ho)
para cada locus examinado nos isolados de campo e cepas de
laboratório................................................................................................. 31
Tabela 8 -
Estimativa das distâncias genéticas entre os pares das populações
utilizando F
ST
............................................................................................ 34
Tabela 9 - Estimativa da distância genética entre os pa res das populações utilizan do
R
ST
............................................................................................................ 35
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Graus Celsius
µg Micrograma, 10
-6
gramas
µL Microlitro, 10
-6
litros
µM Micromolar, 10
-6
molar
A Adenina
AFA Álcool Formol Acético
AP-PCR Reação em cadeia da polimerase com iniciadores arbitrários –
“Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
C Citosina
CPqRR Centro de Pesquisas René Rachou
DNA Ácido desoxiribonucléico – “Desoxyribonucleic acid”
dNTP Desoxirribonucleotídeos Tri Fosfato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EST Etiqueta de Seqüência Transcrita – “Expressed Sequence Tag”
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
fmol Fentamoles, 10
-15
moles
F
ST
Índice de fixação
G Guanina
Kb Kilobase, 10
3
bases
M Molar
mL Mililitro, 10
-3
litros
mM Milimolar, 10
-3
molar
mm Milímetro, 10
-3
metros
NCBI Centro Nacional para Informações em Biotecnologia – “National Center
for Biotechonology Information”
ng Nanograma, 10
-9
gramas
nm Nanômetro, 10
-9
metros
ORF Janela de leitura aberta – “Open reading frame”
p/v Peso por volume
pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase – “Polymerase Chain Reaction”
pH Potencial hidrogeniônico
viii
pmol Picomoles, 10
-12
moles
PRE Elemento repetitivo polimórfico – “Polymorphic Repetitive Element”
RAPD Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso – “Random Amplified
Polymorphic DNA”
RFLP Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição – “Restriction
Fragment Length Polymorphism”
RNA Ácido ribonucléico – “Ribonucleic acid”
rpm Rotações por minuto
R
ST
Índice de fixação análogo ao F
ST
, porém, utilizado para microssatélites
SDS Duodecil sulfato de sódio
SSR Repetições de seqüências simples – “Simple Sequence Repeats”
T Timina
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris borato EDTA
Tris Tri-hidroximetil amino metano
v/v Volume por volume
WHO Organização Mundial da Saúde – “World Health Organization”
ix
DEDICATÓRIA
A meu pai (in memorian), minha mãe, meus irmãos, meu cunhado e aos meus
sobrinhos. Aos inúmeros camundongos que perderam a vida para a realização
desse trabalho. Dedico.
x
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Graeff-Teixeira por ter me aceito como orientado
e ter me apresentado ao mundo da ciência.
A Fernanda Teixeira dos Santos por ter me aceitado como estagiário no laboratório
e agüentado os meus erros de principiante.
A professora Ana Cristina pela amizade, pela paciência nos dias de estresse e pelo
auxílio na correção da dissertação.
A professora Cinara pela amizade e apoio nas apresentações.
Aos colegas de laboratório: Renata, Caroline, Candida, Paula, Cecília, Juliana,
Pablo, Alex, Sabine, Rafael e aos que saíram ou entraram no decorrer do meu
mestrado.
Ao colega Juliano Romanzini por ter me auxiliado na preparação de lâminas e
muitas outras atividades referentes aos meus experimentos.
A minha namorada por ter agüentado dias de estresse, mau humor e, é claro, pela
força, carinho e paixão dedicada. Minha vida.
A Profa. Dr. Anna Kohn e equipe do Laboratório de Helmintos Parasitos de Peixes
do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ – RJ pelos ensinamentos nas técnicas de
morfologia de parasitas.
Ao Dr. Guilherme Côrrea-Oliveira e equipe do Laboratório de Parasitologia Celular e
Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou da FIOCRUZ – MG pela
oportunidade de aprender as técnicas em microssatélites.
Ao Dr. Álvaro José Romanha e sua equipe por terem me recebido com carinho e
pelo convívio nos dias que fiquei em Minas Gerais.
xi
Aos amigos que fiz em Belo Horizonte: Nilton, Maureen, Bernardo, Luciana,
Fernanda(s), Regina que me deram apoio e muita ajuda nos meus experimentos.
Aos Laboratórios de Pneumologia, coordenado pela Profa. Dra. Denise Cantarelli
Machado e Laboratório de Patologia Geral e Buco- Dental, coordenado pelo Prof.
João Miguel Messina da Cruz pela permissão do uso dos equipamentos de
microscopia.
Aos meus amigos da PUC-RS em geral pelo apoio e ajuda.
Aos meus amigos de São Borja.
Aos meus primos, Eraldo e Maria da Graça, pelo carinho, amizade e ao apoio dado
quando na minha ausência eram solicitados.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
As secretárias Luiza e Josi do curso de Pós em Zoologia.
A PUC-RS pela oportunidade e pelo fornecimento da estrutura física.
xii
RESUMO
A esquistossomose mansônica foi detectada no Rio Grande do Sul pela primeira vez
em 1997, constituindo o foco mais meridional das Américas. A partir daquela data,
vários trabalhos foram desenvolvidos para caracterizar epidemiologicamente este
foco de transmissão de ultra baixa endemicidade e de recente introdução. O objetivo
desse trabalho é caracterizar morfologicamente o paras ito e analisar a estrutura
populacional através de marcadores microssatélites, comparando com as cepas de
laboratório LE e MAP. Dois isolados de campo chamados de “Esteio” e “JV” foram
obtidos, respectivamente, a partir de fezes e moluscos naturalmente infectados e de
um paciente. Os vermes adultos, obtidos de camundongos experimentalmente
infectados, foram fixados, clarificados e co
xiii
Morphological characterization and microsatellite analysis of field strains of
Schistosoma mansoni Sambon, 1907, from Esteio, Rio Grande do Sul.
ABSTRACT
Intestinal schistosomiasis was detected in Rio Grande do Sul for the first time in
1997, becoming the southernmost focus in the Americas. Starting from that date,
several investigations were undertaken for the epidemiological characterization of
this transmission focus of very low endemicity and recent introduction. The objective
is to describe the parasite morphology and to analyze the population structure using
microsatellite markers, comparing field isolates with laboratory strains, LE and MAP.
Two isolates called “Esteio” and “JV” were obtained respectively, from feces and
mollusks naturally infected and from a single patient. The adult worms, obtained from
the experimental infection of mice were fastened, clarified and stained for the
measurements taken with an optical microscope. Molecular analy sis was performed
with 4 microsatellite markers. The morphological data of adult worms did not differ
from those reported in the literature. The small variance in measurements can be
attributed to phenotypic plasticity of the populations of that trematode. The use of 4
microsatellite markers allowed the detection of a smaller number of alleles in the field
strains when compared to the findings with the labor atory strains. There is a great
genetic divergence found (R
ST
<0,253) when compared isolates and laboratory
strains.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O parasito
O Schistosoma mansoni Sambon, 1907, é um trematódeo digenético
(Trematoda: Digenea), parasito do homem e de alguns mamíferos, em cujas veias
do sistema portal se localizam os v ermes adultos. Pertence à família
Schistosomatidae, cujas formas adultas são dióicas, possuem duas ventosas, tubo
digestivo formado inicialmente por esôfago único, o qual em seguida se bifurca para
posteriormente se unir em um só ramo terminal, o ceco (CUNHA, 1970).
Esta espécie desenvolve sua fase adulta como parasito da luz dos vasos
sangüíneos, habitando preferencialmente as vênulas do plexo hemorroidário
superior e os ramos mais finos das veias mesentéricas, particularmente da
mesentérica inferior. Aí as fêmeas põem seus ovos.
Depois de atravessarem a mucosa intestinal, os ovos são eliminados com
as fezes (letra B da figura 1) e, quando c hegam em tempo útil a uma coleção de
água doce superficial, libertam suas larvas (C)– miracídios – que nadam durante
algum tempo até encontrarem moluscos do gênero Biomphalaria Preston, 1910.
Após penetrar nos tecidos do molusco (D), o miracídio transforma-se em um novo
tipo larvário, o esporocisto, que, por poliembrionia, gera esporocistos primários e,
depois, larvas infectantes para os hospedeiros vertebrados, as cercárias (E).
Voltando ao meio líquido, as cercárias que abandonaram o hospedeiro invertebrado
ficam nadando na água, quase sempre em direção a superfície, até que tenham a
oportunidade de entrar em contato com a pele do hospedeiro vertebrado (homem ou
outro animal suscetível), através da qual penetram ativamente. Cada cercária qu e
consegue sobreviver transforma-se logo em esquistossômulo, última forma larvária
do parasito, figura 1.
Os esquistossômulos que não forem destruídos na pele ganham a
circulação geral e vão ao coração, depois aos pulm ões (onde também podem ser
retidos e destruídos) e, em seguida ao fígado e, acidentalmente a outros lugares.
Somente os que chegam ao sistema porta intra-hepático podem completar seu
desenvolvimento e alcançar a fase adulta (A).
A infecção humana por S. mansoni costuma ser, na maioria das vezes,
assintomática ou oligossintomática; mas pode produzir alterações
anatomopatológicas cujo caráter e gravidade cobre extensa gama de s ituações, o
que imprime a essa doença grande polimorfismo e, em muitos casos, prognóstico
incerto. Em algumas áreas endêmicas, 4 a 5% dos pacientes desenvolvem lesões
hepatoesplênicas graves (REY, 2001).
Figura 1: Ciclo de vida do S. mansoni (REY, 2002).
1.2 Aspectos gerais da esquistossomose
A esquistossomose é endêmica em 76 países distribuídos pela África, Ásia
e América. Segundo CHITSULO et al. (2000) cerca de 200 milhões de pessoas
estão infectadas e 652 milhões de pessoas estão em risco de adquirir a infecção.
Acredita-se que 85% dos infectados vivam no continente africano (CHITSULO et al.,
2000). No Brasil, apenas o S. mansoni está presente infectando mais de 15 milhões
de pessoas distribuídas por 19 estados (COURA & AMARAL, 2004) e 25 milhões em
risco (WHO, 2001), figura 2.
2
Fig. 2: Distribuição da esquistossomose de acordo com a prevalência da infecção
humana (COURA & AMARAL, 2004).
O parasitismo humano por S. mansoni parece ser decorrente de uma
linhagem de parasitos que evoluiu anterior mente em roedores (COMBES, 1990).
Admite-se que esta espécie tenha surgido na Ásia e migrado para a África (SNYDER
& LOKER, 2000). Ao longo desse processo evolutivo, foram selecionadas
subpopulações devido ao desenvolvimento do helminto em diversas ordens de
vertebrados e espécies de moluscos da família Planorbidae (FRANDSEN, 1979;
PITCHFORD, 1979).
A introdução da esquistossomose no país se deu, provavelmente, a partir de
meados do século XVI, com o ingresso de populações africanas, ocupadas em
regime de escravidão com a cultura da cana-de-açúcar na região Nordeste
(SNYDER & LOKER, 2000). Condições ecológicas favoráveis e a presença do
hospedeiro intermediário, caramujo do gênero Biomphalaria, determinaram a
instalação da esquistossomose mansônica no Brasil (PESSÔA et al., 1988).
3
Com a abolição da escravatura e com a inauguração dos grandes ciclos da
economia brasileira (ouro, algodão, café), ocorreu migração interna e a dispersão da
esquistossomose para novas ár eas: inicialmente, Pernambuco e Bahia, expandindo-
4
se posteriormente para todo o Nordeste, Sudeste, Pará, Paraná e, mais
recentemente, Santa Catarina, Goiás e Distrito Federal, onde foram registrados
casos autóctones (KATZ, 1997).
A industrialização, com a instalação de fábricas de grande porte que
alimentam o sonho de melhores salários , estimula o fluxo migratório nas áreas
rurais, aumentando a densidade populacional na periferia das grandes cidades.
Aliada à falta de saneamento básico e à educação sanitária deficiente, contribui par a
o crescimento e alastramento da doença (SANTOS, 1996), figura 3.
A chegada da esquistossomose no Rio Grande do Sul já havia sido alertada
por CUNHA-NETO, 1972 e por PARAENSE & CORRÊA, 1987. Em 1997 foi
descoberto o primeiro caso autóctone no estado do Rio Grande do Sul, no município
de Esteio, região metropolitana de Porto Alegre (GRAEFF-TEIXEIRA et al., 1999).
Com isso o RS passou a ter o foco mais meridional de transmissão da América. Na
mesma época, foi descoberta a presença da Biomphalaria glabrata (Say, 1818) no
município de Esteio, até então não descrita no Rio Grande do Sul (CARVALHO et
al., 1998).
Fig. 3: Fluxo migratório humano e distribuição dos hospedeiros intermediários da
esquistossomose (COURA & AMARAL, 2004).
Em 2000 conseguiu-se isolar o parasito da natureza a partir de fezes
humanas de dois pacientes juntamente com moluscos naturalmente infectados, e
“Esteio” foi nome dado ao isolado. Em 2002, na reunião técnica sobre áreas de
baixa endemicidade de esquistossomose, promovida pelo Ministério da Saúde em
Porto Alegre criticou-se a maneira como foi isolado em laboratório o parasito. Então,
novamente, o S. mansoni foi re-isolado de um único paciente, chamando-se isolado
“JV”.
1.3 Morfologia do S. mansoni
A exposição a seguir resume os dados pesquisados nas seguintes fontes:
KASTNER et al., 1975; KOHN et al., 1979b; PARAENSE & CORRÊA, 1981;
5
6
RODRIGUEZ, 1986; MACHADO-SILVA et al., 1994, 1995, 1998; CONCEIÇÃO et al.,
2000; REY, 2001; MARTINEZ et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2003.
1.3.1 Aparência externa
Tanto o macho quanto a fêmea é cilíndrico, afilando-se para as
extremidades. Ambos são de cor leitosa, sendo a fêmea geralmente mais escura por
apresentar maior quantidade de pigmento sangüíneo, a hemozoína, no interior do
sistema digestivo. Apresentam estes vermes na extremidade anterior, duas
ventosas, uma oral ou anterior que circunda a boca e uma posterior ou ventral,
também chamada de acetábulo, que é pedunculada e cuja função é a de fixar o
parasito à parede capilar. Sob o acetábulo estes parasitos apresentam a abertura do
orifício genital para o exterior.
1.3.2 Macho
Com um comprimento entre 4,08 e 14,0 mm e largura do corpo a nível
testicular variável, geralmente entre 0,21 e 0,55 mm, o macho apresenta uma
acentuada curvatura ventral. A parte anterior do corpo é curta e mais ou menos
cilíndrica, encontrando-se nela as duas ventosas. A ventosa oral varia de 0,16 a 0,24
mm de comprimento por 0,16 a 0,28 mm de largura e o acetábulo 0,21 a 0,31 mm de
comprimento por 0,17 a 0,30 mm de largura. A distância entre a extremidade
anterior da ventosa oral e anterior da acetabular varia de 0,34 a 0,57 mm. O
segmento posterior ao acetábulo é mais largo e achatado formando com as suas
margens justapostas e curvadas ventralmente, formando o canal ginecóforo. Por não
possuir órgão copulador, o esperma do macho é derramado no canal ginecóforo,
penetrando no orifício vaginal da fêmea que se encontra ali alojada.
O aparelho genital masculino compreende 6 a 8 lobos testiculares, situados
dorsalmente ao nível do início do canal ginecóforo, abaixo do acetábulo; variando de
0,04 a 0,11 mm de comprimento e 0,04 a 0,13 mm de largura. Os lobos são
intercomunicados e os espermatozóides dirigem-se para a vesícula seminal através
de um canal deferente único antes de atingirem o exterior pelo orifício genital.
7
1.3.3 Fêmea
Com um comprimento entre 6,43 e 17,00 mm e largura ao nível do ovário
variável, geralmente entre 0,05 e 0,22 mm, a fêmea é, portanto, mais comprida e
filiforme que o macho. As duas ventosas são pequenas, variando de 0,06 a 0,10 mm
de comprimento e 0,05 a 0,09 mm de largura a ventosa oral. A ventosa ventral mede
de 0,04 a 0,07 mm de comprimento por 0,03 a 0,06 mm de largura. A distância entre
as ventosas varia de 0,14 a 0,30 mm de comprimento.
O aparelho genital feminino possui um ovário oblongo, ligeiramente lobado,
e fica na metade anterior do corpo. O ovário mede em seu comprimento de 0,33 a
0,58 mm e na sua largura de 0,07 a 0,14 mm. Um oviduto curto conduz ao oótipo,
que se continua com o tubo uterino. Neste encontram-se 1 ou 2 ovos, raramente 3
ou 4, o comprimento do ovo uterino varia de 0,09 a 0,17 mm e com largura oscilando
entre 0,04 a 0,07 mm. O espinho do ovo possui a variação de 0, 02 a 0,03 mm de
comprimento. Os dois terços posteriores do corpo estão ocupados pelas glândulas
vitelogênicas e seu canal sinuoso, que se une ao oviduto pouco antes deste
alcançar o oótipo.
1.4 Diversidade morfológica e morfométrica em S. mansoni
Os estudos morfológicos e morfométricos de vermes adultos de S. mansoni
são usados para esclarecer questões taxo nômicas da principal espécie conhecida a
infectar o homem (SAMBON, 1907; PIRAJÁ DA SILVA, 1908), detectar diferenças
nos vermes recuperados de diferentes hospedeiros (KASTNER et al., 1975; DIAS &
PIEDRABUENA, 1980; MACHADO-SILVA et al., 1994; NEVES et al., 1998) e de
parasitos provenientes de diferentes cepas (MAGALHÃES & CARVALHO, 1973;
PARAENSE & CORRÊA, 1981; MACHADO-SILVA et al., 1995). O isolamento em
laboratório do parasito de um foco de introdução recente é uma oportunidade
excelente para a caracterização morfológica e morfométrica, além de determinar as
características biológicas desse organismo.
8
1.5 Genoma do S. mansoni
O S. mansoni tem um genoma diplóide com 7 pares de cromossomos
autossômicos e um par de cromossomos sexuais (SHORT & MENZEL, 1960;
SHORT et al., 1979). A fêmea é heterogamética, possuindo o par de cromossomos
ZW e o macho o par ZZ (MENZEL & SHORT, 1960; SHORT & GROSSMAN, 1981).
O tamanho do genoma haplóide é de aproximadamente 2,7 x 10
8
pb, consistindo de
cerca de 4-8% de seqüências de DNA altamente repetitivas (>
9
al., 1991; DREW & BRINDLEY, 1995). A seqüência repetitiva de W1 consiste de
uma seqüência degenerada de 476 pb e pode estar presente em até mais de 500
cópias no cromossomo W, foi utilizada como sonda (WEBSTER et al., 1989) e
posteriormente, como alvo para PCR (DIAS-NETO et al., 1993a), na sexagem de
cercárias.
Seqüências repetitivas, distribuídas de maneira dispersa ou em arranjos
pelo genoma, foram encontradas como parte da estrutura de RNA mensageiro
(mRNA), sendo até mesmo traduzidas em proteínas (SPOTILA et al., 1991; SMITH
et al., 1992). Uma delas é o elemento repetitivo polimórfico (PRE) de 62 pb que está
presente em transcritos de vários tamanhos em vermes adultos. Um destes mRNAs
corresponde ao gene SM 750. O transcrito maduro possui na sua extremidade 3’,
anterior à cauda poli A, cinco cópias diretas do PRE, sendo que parte da primeira
repetição está contida dentro da única janela de leitura aberta (ORF), composta de
57 aminoácidos (SPOTILA et al., 1991). Curiosamente, um minissatélite polimórfico
encontrado no DNA mitocondrial (mtDNA) de 558 pb do parasito possui algumas
regiões idênticas à SM 750, carregando inclusive várias cópias em tandem do PRE.
O significado desse achado ainda é desconhecido, mas foi sugerida uma possível
transferência desta seqüência do núcleo para a mitocôndria (PENA et al., 1995).
Dados mais atuais referentes ao genoma do S. mansoni podem ser
encontrados na página do “Schistosome Genome Network”
www.nhm.ac.uk/hosted_sites/schisto.
1.6 Diversidade gênica em S. mansoni
A variabilidade genética do S. mansoni foi inicialmente avalia da através da
análise eletroforética de isoenzimas. FLETCHER et al. (1981c) realizaram estudos
com cepas de S. mansoni que apresentavam diferenças em relação ao nível de
infectividade em moluscos B. glabrata, observando que 3 dos 18 loci mostravam-se
polimórficos, sem, entretanto, conseguir determinar uma clara correlaç ão entre
infectividade e polimorfismo isoenzimático. NAVARRO et al. (1992) utilizaram a
mesma técnica para o estudo de cepas de diferentes regiões (Venezuela e Brasil),
observando diferenças entre as cepas. Porém, quando analisaram vermes
individuais de cada cepa, todos os locus demonstraram ser monomórficos dentro de
uma mesma cepa. Resultados semelhantes, utilizan do a mesma técnica, também
10
foram encontrados por FLETCHER et al. (1981a,b) e LoVERDE et al. (1985a,b)
estudando populações de regiões distintas.
A técnica de “Southern blotting” foi a primeira técnic a de análise molecular
do genoma de esquistossomos. A utilizaçã o de sondas de RNA ribossomal (rRNA),
hibridadas ao DNA genômico previamente digerido com enzimas de restrição, foi
descrita para a distinção de espécies e cepas deste parasito (SIMPSON et al., 1984;
McCUTCHAN et al., 1984; VAN KEULEN et al., 1985). Marcadores moleculares
detectáveis como polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição (Restriction
Fragments Lenght Polymorphisms – RFLP) com uma sonda de gene ribossomal,
foram correlacionados com o surgimento de resistência ao quimioterápico hicantone
em S. mansoni (BRINDLEY et al., 1991), o que, não foi encontrado por Vieira et al.
(1991), em relação à resistência ao quimioterápico oxaminiquina, quando utilizad a a
mesma técnica.
O surgimento da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) na
década de 1980, desenvolvida por SAIKI et al. (1985) e MULLIS & FALOONA, 1987,
permitindo a síntese enzimática de milhões de cópias de um segmento específico de
DNA, tornou-se uma ferramenta extremamente atrativa nos estudos de variabilidade
genética. Resultados obtidos após a análise de diferentes cepas de S. mansoni
utilizando iniciadores aleatórios na PCR e m AP-PCR (DIAS-NETO et al., 1993b,c)
confirmaram os achados obtidos por técnicas como eletroforese de isoenzimas ou
uso de sondas de rRNA (SIMPSON et al., 1984; VAN KEULEN et al., 1985; VIEIRA
et al., 1991). Os perfis de DNA obtidos mostraram a existência de um alto grau de
similaridade genômica entre todas as ce pas utilizadas no estudo. BARRAL et al.
(1993), utilizando esta técnica com populações que foram isoladas de regiões
geograficamente distantes como o Brasil e a África, e mantidas por diferentes
intervalos de tempo em laboratório, mostraram um alto grau de similaridade entre as
cepas estudadas, encontrando apenas 5% de polimorfismo entre as mais de 300
bandas obtidas através de 50 iniciadores.
Segundo DESPRES et al. (1991,1992) e LE et al. (2000), outra abordagem
promissora para estudos de variabilidade, seria a análise de polimorfismos de
tamanho de regiões do DNA mitocondrial (mtDNA). O mtDNA apresenta uma taxa de
divergência 3 a 5 vezes maior que o DNA genômico (BROWN et al., 1979;
AQUADRO & GREENBERG, 1983; HARRISON et al., 1989), e em S. mansoni
mostrou variabilidade entre diferentes clones de uma mesma cepa (PENA
et al.,
1995). Um fator limitante para as análises feitas com mtDNA, é que ele não
expressa diploidia e tampouco herança do tipo mendeliana não sendo, portanto
aplicável a outros tipos de estudos populacionais, não servindo para estudos de
ligação e também sem aplicabilidade para estudos em outras espécies do gênero
(JANNOTTI-PASSOS et al.,1997).
1.7 Microssatélites na análise populacional
No fim dos anos 80, os microssatélites, também chamados de SSR (Simple
Sequence Repeats – Repetições de Seqüências Simples), foram isolados e
descritos simultaneamente por três grupos de cientistas, como pequenas seqüências
com 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem (LITT & LUTY, 19 89; WEBER & MAY,
1989; TAUTZ, 1989), figura 4.
Fig. 4: Microssatélite com repetições em tandem de dinucleotídeos CT.
Os microssatélites foram classificados por WEBER (1990) como perfeitos,
quando existe um motivo único de repetição, sem interrupções, imperfeitos, quando
existem bases diferentes intercaladas na seqüência que se repete e compostos,
quando uma repetição perfeita ou imperfeita está associada à outra repetição com
um motivo diferente. Um estudo realizado com 100 loci de repetições (CA)n
demonstrou uma freqüência baixa de microssatélites com um número de repetições
maior que 24 e que as repetições perfeitas predominam (64%), enquanto que as
compostas são relativamente infreqüentes (11%) (WEBER, 1990).
Os microssatélites têm sido detectados dentro dos genomas de todos os
organismos até agora analisados (HANCOCK, 1999), principalmente no interior de
regiões não codificantes do genoma. Pode ser também encontrado numa taxa
menor em seqüências de regiões promotoras codificantes, como a região promotora
do gene Drosophila Ubx (BIGGIN & TJIAN, 1988), sítios de ligação para várias
11
12
proteínas regulatórias (LUE et al., 1989; CSINK & HENIKOFF, 1998), como por
exemplo, ligação de poli (GA)-poli(GT)- proteína em fibroblastos humanos
(AHARONI et al., 1993).
Em genomas de eucariotos estas seqüências são muito mais freqüentes do
que em procariotos e melhor distribuídas ao acaso no genoma. Apresentam
tamanhos mais variantes, formando loci genéticos muito mais p olimórficos
(HAMADA et al., 1982). Nos procariotos as quantidades de seqüências repetidas em
tandem são muito baixas (HANCOCK, 1995; FIELD & WILLS, 1998).
A maioria dos microssatélites (48-67%) encontrados em muitas espécies
estudadas são dinucleotídeos (WANG et al., 1994; SCHUG et al., 1998) No genoma
humano, dentre todas as seqüências repetitivas em tandem (mono a
hexanucleotídeos), o poli A/T é o mais comum (BECKMANN & WEBER, 1992;
STALLINGS 1992; TÓTH et al., 2000; WREN et al., 2000). Das repetições
dinucleotídeos, a mais freqüente é AC, que ocorre duas vezes mais que repetições
do tipo AT e três vezes mais que repetições AG (BECKMANN & WEBER, 1992). Os
procariotos têm poucos microssatélites quando comparados com o genoma de
eucariotos e possuem repetições do tipo poli A/T em sua maioria, seguidas das
repetições AT (BELKUM et al., 1998; GUR-ARIE et al., 2000).
O polimorfismo e a ampla distribuição genômica fazem dos microssatélites
um dos marcadores genéticos mais úteis disponíveis para caracterização de
indivíduos (HAGELBERG et al., 1992) ou para estudos populacionais (JARNE &
LAGODA, 1996) e para a construção de mapas genéticos a fim de identificar loci
envolvidos em doenças genétic as (DIETRICH et al., 1996). Mic rossatélites podem
ser facilmente classificados com o uso
BRUFORD, 1999); e à dificuldade em se identificar e caracterizar microssatélites em
algumas espécies (BEAUMONT & BRUFORD, 1999).
O “deslizamento” da DNA polimerase durante a replicação do DNA é tido
como a principal causa da variação no núm ero de repetições nesses loci, como foi
demonstrado in vivo por SCHLÖTTERER & TAUTZ (1992), caracterizando a alta
taxa de mutação (10
-2
a 10
-6
eventos por locus por geração) destas regiões repetidas
quando comparadas com as regiões codificantes. Alguns destes erros são corrigidos
pela atividade das exonucleases que revisam e r eparam o DNA, mas outros
escapam de serem corrigidos, tornando-se mutações. Os diferentes números de
repetições caracterizam os diferentes alelos que podem ser detectados via
eletroforese utilizando-se géis de poliacrilamida ou agarose especial de alta
resolução.
Aumento no tamanho da repetição
Início
Desanelamento
Renaturação
e desalinhamento
A
nova fita tem
tamanho diferente
da fita molde.
Diminuição no tamanho da repetição
Fig. 5: Representação esquemática do deslizamento das fitas do DNA durante a
replicação (ELLEGREN, 2000).
Durante a replicação as fitas de DNA podem se desanelar e se anelar
novamente em locais errados formando alças, figura 5. Em conseqüência, após o
reanelamento, se a alça formada estiver na fita molde do DNA, haverá uma
contração do microssatélite com redução no número de repetições. Por outro lado,
se esta alça estiver na fita que estiver sendo formada, haverá uma expansão do
microssatélite com o aumento no número de repetições, (ELLEGREN, 2004).
13
14
1.8 Microssatélites na parasitologia
Na parasitologia, os microssatélites têm sido descritos e já foram
empregados em diversos parasitos, tanto humanos como de outros animais. Na
parasitologia humana podemos citar a identificação de microssatélites em diferentes
espécies do gênero Plasmodium (BELKUM et al., 1992) com especial referência à
espécie Plasmodium falciparum, parasito responsável por malária em humanos (SU
& WELLEMS, 1996). Citamos ainda a descrição de microssatélites em
tripanossomatídeos como Trypanosoma cruzi, parasito causador da doença de
Chagas (OLIVEIRA et al., 1998) e Leishmania spp (ROSSI et al.,1994; RODRIGUEZ
et al.,1997; RUSSEL et al.,1999). No campo da parasitologia animal podemos citar a
identificação de microssatélites em Trichinella pseudospiralis, parasito de aves e
mamíferos (ZARLENGA et al., 1996) e Haemonchus contortus, parasito
gastrointestinal de ovinos e caprinos (HOEKSTRA et al., 1997), dentre outros
parasitos.
Os primeiros marcadores microssatélite para S. mansoni foram
desenvolvidos por DURAND et al. (2000). Os autores descreveram 33 marcadores
de microssatélite de S. mansoni ao procurarem em um a biblioteca e um banco de
dados. Estes marcadores detectaram uma considerável variabilidade nos parasitos
obtidos de ratos selvagens em Guadalupe. Além desse achado, uma estrutura
genética sexo-específico da população foi inesperadamente observada
(PRUGNOLLE et al., 2002). BLAIR et al. (2001) desenvolveram outros 20
marcadores para S. mansoni e verificaram que a população africana era mais
diversa do que outra relatada por DURAND et al. (2000) em Guadalupe. Em uma
busca no banco de dados, RODRIGUES et al. (2002a) desenvolveram outros seis
marcadores. Usando estes loci, RODRIGUES et al. (2002a) observaram que as
populações de campo estudadas eram mais diversas que uma cepa de laboratório,
mas não significativamente distintas umas das outras, apontando à ocorrência de
um alto fluxo gênico no campo. Uma procura completa de todo o banco de dados da
NCBI além das bibliotecas de seqüenciamento genômico enriquecidas com
microssatélites aumentaram o número de loci identificados (RODRIGUES et al.
2002b). O alto conteúdo de AT (65%) relatado para o genoma de S. mansoni foi
refletido nas classes de repetições identificadas (SIMPSON et al., 1982; MARX
et
al., 2000).
15
2 JUSTIFICATIVA
A identificação do foco de transmissão ativa de esquistossomose em Esteio
representa uma oportunidade epidemiológica: a de investigar e monitorar esta
infecção em sua fase inicial de instal ação, com a possibilidade até mesmo da
erradicação do foco ou, pelo menos, de eficaz controle. Outro aspecto de relevância
é o caráter de baixa endemicidade do foco; próprio de uma área de introdução
recente do parasito, trazendo dificuldades para o diagnóstico e monitoramento da
infecção, tanto em hospedeiros vertebrados como em hospedeiros invertebrados
(GRAEFF-TEIXEIRA et al., 2004).
Sua elevada freqüência na população de muitas regiões e o déficit orgânic o
que acarreta para considerável número de indivíduos, comprometendo o
desenvolvimento dos jovens e a produtividade dos adultos, ou condu zindo os
pacientes com formas hepatosplênicas a um estado de dependência que pesa
sensivelmente na economia doméstica ou da coletividade, justificam os esforços que
se fazem para conhecê-la melhor e para encontrar soluções adequadas (REY,
2002).
Diversos estudos demonstram diferenças significativas no fenótipo, tanto em
populações intra quanto inter-geográficas de S. mansoni. Cepas provenientes do
mesmo ou de diferentes regiões geográficas demonstraram diferenças na produção
de ovos (KASSIM et al., 1979), infecção em moluscos (RICHARDS & SHADE, 1987),
manifestações clínicas da doença e a infectividade em humanos (IMBERT-
ESTABLET & COMBES, 1986; WHO, 1993), e suscetibilidade a drogas (ARAÚJO et
al., 1980; DIAS et al., 1982).
A análise do DNA permite um estudo direto do genoma do parasito.
Diferenças inter e intra-específicas nas seqüênc ias de DNA têm sido observadas
pela análise do rDNA por RFLP (McCUTCHAN et al., 1984; SIMPSON et al., 1984;
WALKER et al., 1986 e 1989; VIEIRA et al., 1991). Análises utilizando RAPD têm
demonstrado considerável diferenciação molecular entre espécies de Schistosoma
(DIAS-NETO et al., 1993b; KAUKAS et al., 1994, MONÉ et al., 2003) e apresenta
sutis variações genéticas entre cepas obtidas de diferentes continentes (BARRAL et
al., 1993; DIAS-NETO, 1993b,c).
O uso de marcadores microssatélites na análise populacional apresenta
várias qualidades, incluindo codominância, alelismo, herança mendeliana e
16
variabilidade, além do prévio conhecimento de sua localização dentro do genoma.
Os microssatélites possuem a capacidade de analisar diversos loci em único estudo.
Embora o número de loci de microssatélites polimórficos descrito ainda seja
pequeno, os estudos mencionados anteriormente, conclusivamente demonstram a
utilidade de marcadores de microssatélites polimórficos para es tudos genéticos e
populacionais dos esquistossomos. O uso destes marcadores ajudará na
compreensão da dinâmica populacional em áreas endêmicas ou de recente
introdução.
17
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar o S. mansoni isolado do foco em Esteio.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sobre os isolados Esteio e JV de S. mansoni:
Caracterizar morfologicamente o trematódeo;
Verificar se há diferença entre os dois isolados, tanto morfologicamente
como molecularmente, utilizando marcadores microssatélites;
Determinar a diferença, com o us o de microssatélites, entre cepas
mantidas em laboratório, LE e MAP, e os isolados de campo JV e Esteio.
18
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Os isolados Esteio e JV do foco de transmissão em Esteio têm sido mantidos
em camundongos Swiss. Os moluscos da espécie Biomphalaria glabrata criados em
laboratório para manutenção do ciclo são infectados com 10 miracídios cada,
provenientes das fezes de roedores infectados e, após 4-5 semanas, são expostos à
luz artificial por no mínimo 3 horas para liberação de cercárias. As cercárias
coletadas, em torno de 100, são usadas para infectar os roedores por via
subcutânea. Um lote de camundongos é utiliza do para manutenção do ciclo e o
outro, após 45 dias, é sacrificado e os vermes coletados manualmente do sistema
porta-hepático.
O município de Esteio (aproximadamente 29°50’ S para 29°54’ S e 51°12’
para 51°10’ W) está localizado a 15 quilômetros de Porto Alegre e possui uma área
territorial de 27,60 quilômetros quadrados. Tem uma altitude média de 29 metros e
possui uma área total de 32,5 quilômetr os quadrados. Esteio possui acesso
privilegiado, por via rodoviária através da BR 116 e da RS 118, por via ferroviária,
através do metrô de superfície e por via fluvial, pelo Rio dos Sinos.
De acordo com a estimativa do IBGE do ano de 2003, o município de Esteio
dispõe de uma população de 82.972 habitantes. A população de 0 a 14 anos é de
aproximadamente 21.597 habitantes e o restante da população apresenta idade
superior.
Cinco inquéritos coproscópicos foram realizados em Esteio, em outubro de
1997, setembro de 1998, dezembro de 1999, maio e outubro de 2000. Pelo fato de
que a maioria dos infectados possuía menos de 1 ovo por grama de fezes, foi feita a
proposta de classificar este foco como de ultra-baixa endemicidade (GRAEFF-
TEIXEIRA et al.,2004).
4.1 Análise morfológica dos vermes
4.1.1 Coloração
Os vermes coletados foram separados sexualmente com o auxílio de dois
pincéis pequenos e colocados entre lâmina e lamínula de vidro, fixados em soluç ão
álcool-formol-acético (A.F.A). Após a fixação dos ver mes, eles foram corados pelo
19
carmim clorídrico alcoólico por 5 minutos, lavados em álcool 70%, colocados em
álcool 90% por 5 minutos e álcool 100% por 10 minutos. Diafanizados em Creosoto
de Faia por 5 minutos e em seqüência passados em placa de Petri, c ontendo
Creosoto mais Bálsamo do Canadá na concentração de 3:1, 1:1 e 1:3, para ser feita
a montagem da lâmina em Bálsamo do Canadá e analisada a morfologia dos
vermes (KASTNER et al., 1975; KOHN et al., 1979a,b,1987; ARAÚJO et al., 1991).
4.1.2 Morfometria
Os exemplares fixados foram analisados em microscópio óptico com câmera
acoplada. Foi utilizado o microscópio Axiolab MC 80 DX, marca Zeiss, com ocular
milimetrada, devidamente calibrada.
20
4.3 Análise molecular
Para a análise molecular foram utilizados ve rmes adultos machos e fêmeas
das cepas de laboratório LE e MAP. A cepa LE foi isolada de um paciente em Belo
Horizonte em 1959 (PELLEGRINO et al., 1967; ARAÚJO et al., 1980; VALADARES
et al., 1981). A cepa MAP foi isolada de um paciente em Campinas-SP em 1977 (de
SOUZA DIAS et al., 1982), essa cepa mostrou-se resistente para oxaminiquine e
hicantone, porém não para praziquantel e niridazol (de SOUZA DIAS et al., 1982).
Ambas as cepas vem sendo mantidas no laboratório de Malacologia
CPqRR/FIOCRUZ.
Utilizou-se para análise molecular 20 vermes de cada sexo das c epas LE,
MAP e do isolado Esteio, da geração F3; do isolado JV, geração P, foram utilizad os
27 vermes machos e 14 fêmeas.
4.4 Extração de DNA
Vermes individuais foram colocados em microtubos de 0,5 mL e submersos
em nitrogênio líquido por alguns segundos, imediatamente após, transferidos para
um recipiente com água fervente para destruir o tegumento. Os vermes individuais
foram digeridos em um tampão de extração composto de 50 mM Tris-HCl pH 8,0,
100 mM EDTA, 100 mM NaCl e 0,5% de SDS, com 100 µg/mL de proteinase K, por
16 horas a 56°C. A enzima foi desativada a 95°C por 10 minutos, acrescentou-se ao
produto da digestão acetato de sódio 3 M pH 5,2 e etanol absoluto resfriado. Os
tubos foram colocados em temperatura de -70°C por 1 hora. Centrifugou-se por 10
minutos em micro-centrífuga a 14.000 rpm em temperatura de 4°C. O sobrenadante
foi desprezado e o sedimento lavado 2 vezes com etanol 70° resfriado, centrifugado
a frio por 10 minutos na velocidade de 14.000 rpm. O sobrenadante foi desprezado
e, após evaporar o etanol, o sedimento foi ressuspendido em TE e reidratado
overnight a 4°C.
A concentração de DNA foi determinada por leitura espectrofotométrica no
aparelho BioPhotometer (Eppendorf) a 260 nm, sendo a qualidade de DNA
determinada pela relação da absorbância: A 260/280 nm.
21
4.5 Análise de microssatélites
Os microssatélites utilizados estão descritos no GenBank com os seguintes
códigos de acesso: L25065, AF009659, AF325694 e AF325695, observar a tabela 1.
Tabela 1 – Lista das seqüências de Schistosoma mansoni contendo os
microssatélites utilizados no trabalho, n° de acesso no banco de dados, repetições e
classificação das repetições.
Acesso Repetição Classificação
L25065 (ATT)
7
Perfeita
AF009659 (CTT)
10
Perfeita
AF325694 (ATT)
11
Perfeita
AF325695 (TAGA)
7
Perfeita
4.6 Iniciadores para PCR de microssatélites
Os iniciadores utilizados para a anális e dos indivíduos foram desenhados
utilizando-se o programa de computador OLIGO
®
versão 3.3 (Molecular Biology
Insights – Cascade, USA), seguindo os seguintes parâmetros: o tamanho esperado
para cada fragmento gerado na PCR dos diferentes microssatélites não poderia
sobrepor o outro. Assim o tamanho dos produtos deveria estar situado entre 150 pb
e 500 pb, possibilitando a aná lise simultânea de mais de um fragmento. O tamanho
dos iniciadores deveria estar entre 18 e 22 nucleotídeos, com as temperaturas de
anelamento entre 58°C e 60°C. Os iniciadores não poderiam apresentar
complementaridade principalmente nas suas extremidades 3’ ou com os outros
iniciadores.
Os iniciadores foram sintetizados pela Life Technologies (Gaitherburg, USA)
e Bio.Synthesis (Lewisville, USA), sendo que um dos iniciadores de cada par foi
marcado em sua porção 5’ com fluoresceína, permitindo seu uso em análises no
seqüenciador automático de DNA, A.L.F. – Automatic Laser Fluorescence
(Pharmacia-LKB), com o programa ALF Fragment Manager, a seqüência dos
iniciadores está descrita na tabela 2.
22
Tabela 2 – Seqüências dos iniciadores, temperaturas de anelamento e número das
seqüências com loci de microssatélites estudados.
Iniciadores Seqüência 5’→3’ TA Acesso
SmBr5-F
SmBr5-R
GAA TTA CTG TCC CTT TAT CTC
F-AAA CTA TTC ATT ACT GTC GGG
58°c L25065
SmBr6-F
SmBr6-R
CTT AAC AGA CAT ACA CGC
F-GAA TAC AGG CTA TAA TCT ACA
58°C AF009659
1TTA-F
1TTA-R
ATT GGC GTC AGT AGA AGA GA
F-ATT CAC CCA TTG TCT TAA AAC C
60°C AF325694
13TAGA-F
13TAGA-R
ACA GCA CCC GTC CGG AGG
F-TTA AAA TTC ATT CGA ACT GAA G
60°C AF325695
TA – temperatura de anelamento
Acesso – número de acesso das seqüências no GenBank™.
F- Fluoresceína
Os iniciadores para os loci SmBr5 e SmBr6 foram utilizados por
RODRIGUES et al. (2002a) e fazem parte de duas etiquetas de seqüênc ia
transcritas (EST) e são elas uma proteína transportadora de glicose e a porção final
3’ de uma proteína c-GMP dependente, respectivamente.
Os outros dois iniciadores, 1TTA e 13TAG A, foram construídos a partir do
DNA genômico, não estando localizado em uma região codificante (CURTIS et
al.,2001).
4.7 PCR de microssatélites
Os iniciadores foram usados em amplificações por PCR de fragmentos de
DNA de vermes adultos individuais de diferentes cepas. Nestas reações us amos 2
ng de DNA, 0,15 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen), tampão da enzima
(1,5 mM de MgCl
2
, Tris-HCl 10 mM pH 8,0, KCl 50 mM), 10 pmoles de cada iniciador
e 200 µM de dNTP, para um volume total de reação de 10 µL. A PCR foi realizada
em termociclador Perkin Elmer – Gene Amp PCR System 2400, por 35 ciclos
consistindo de 5 min a 95°C para desnaturação, 30 seg. de anelamento para os
iniciadores na temperatura calculada para cada iniciador, 30 seg. a 72°C para
23
extensão, 30 seg. a 95°C para desnaturação, retornando por 34 vezes ao passo 2,
finalizando com 30 seg. a 72°C e mantido a 4°C após o término da reação.
Após a PCR, 3 µL dos produtos de amplificação foram submetidos à análise
em géis de poliacrilamida a 8%, utilizando-se como padrão de peso molecular ØX
174 RF DNA/Hae III Fragments (Invitrogen), fixados em 150 mL de solução de
etanol a 10% (v/v) com 0,5% de ácido acético (v/v) e corados com nitrato de prata a
0,3%. Finalmente, os géis foram lavados em água deionizada e revelados em
solução aquosa de hidróxido de sódio 3% (p/v) com 0,5% de formaldeído (v/v), até o
aparecimento das bandas (SANGUINETTI et al., 1994).
4.8 Determinação do tamanho dos alelos de microssatélites
O tamanho esperado dos alelos varia conforme o iniciador usado. Para o
microssatélite SmBr5 o tamanho é de aproximadamente 331pb, o microssatélite
SmBr6 fica na faixa de 241pb (RODRIGUES et al., 2002a). Os microssatélites 1TTA
e 13TAGA apresentam valores próximos a 155pb e 458pb, respectivamente.
Para determinação exata do tamanho dos alelos dos microssatélites
amplificados, 1µL do produto da PCR foi desnaturado a 95°C por 5 min, submetido à
eletroforese em gel de poliacrilamida 6% desnaturante com 7M de uréia, utilizando-
se tampão de corrida TBE 0,6X (1M de Tris, 0,83 M de ácido bórico e 10 mM de
EDTA) em seqüenciador automático de DNA A.L.F. – Automatic Laser Fluorescence
(Pharmacia-LKB) por 4 horas. Também foram aplicados no gel 10 fmoles de um
padrão de peso molecular fluorescente de 50-500 pb (Pharmacia) como referência
de mobilidade dos fragmentos. Esta metodologia permite a análise simultânea de até
35 amostras em cada corrida. Os resultados obtidos foram analisados com os
programas ALF Fragment Manager e Allele Link (Pharmacia).
4.9 Análise dos dados obtidos com microssatélites: parâmetros de genética de
populações
A variação genética e a estrutura genética das populações de S. mansoni
foram analisadas baseando-se nos dados obtidos com as amplificações dos
microssatélites.
24
Os estudos genéticos foram feitos utilizando-se o software ARLEQUIN
versão 2.000 (SCHNEIDER et al., 2000). Os dados de tamanho de
alelo/locus/indivíduo, depois de tabulados, f oram lançados no programa.
Primeiramente, o programa traz um resumo das informações referentes aos tipos de
dados analisados e as análises realizadas com seus devidos graus de acuidad e,
além do resultado do cálculo, mostrado abaixo:
¾ Nome da população (amostra) estudada
¾ Índices de diversidade como:
¾ N° total de alelos que diz respeito à combinação em um ou mais loci.
¾ N° total de loci e o n° de loci polimórficos na amostra e a heterozigose
esperada para aquela amostra segundo o equilíbrio de Hardy-Weinberg.
¾ Lista dos diferentes alelos de cada locus com suas respectivas freqüências.
¾ O teste do equilíbrio de Hardy-Weinberg mostra uma tabela com os loci, o n°
de indivíduos analisados em cada um e os valores observados e esperados de
heterozigose para cada um, bem como valores para o teste exato das
probabilidades (P) e do desvio padrão.
Cada um dos testes implementados pelo programa é seguido das
respectivas referências bibliográficas.
Para cada locus calculou-se o número de alelos, as freqüências alélicas
observadas, as freqüências genotípicas observadas e esperadas. Os valores da
heterozigose observada e esperada dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram
calculados.
No estudo interpopulacional, calculou-se um índice de fixação (F
ST
)
(WRIGHT, 1921) entre todas as possíveis combinações de populações par a par,
estimando-se assim, as distâncias entre elas com relação à freqüência dos alelos
em cada população. Este índice reflete a divergência genética entre subpopulações
e é um dos principais índices em genética de populações para determinar grau de
estruturação destas populações. Como o cálculo de F
ST
tem como pressupostos,
baixas taxas de mutação para os loci estudados, e que excessos de sim ilaridade
entre as populações se devam a migrações (SLATKI N, 1995), calculamos então o
índice R
ST
, análogo ao índice de fixação que leva em consideração as maiores taxas
de mutação encontradas em loci de microssatélites, além de características próprias
das mutações nestes loci (SLATKIN, 1995).
25
5 RESULTADOS
5.1 MORFOLOGIA
As mensurações realizadas nos espécimes do isolado Esteio serão
apresentados a seguir, na tabela 3, com os valores mínimos e máximos para os
caracteres, assim como a média e o desvio padrão para cada medida.
27
Os dados do isolado JV, nas mensurações realizadas, estão descritos na
tabela 4. Os valores estão separados em mínimo e máximo, além das médias e
desvio padrão para os espécimes analisados.
29
O cálculo de análise de variância para os dois isolados demonstrou
diferenças significativas, para p<0,05, nos seguintes caracteres examinados:
comprimento do verme macho e o comprimento de cada lobo testicular, para as
fêmeas apenas o comprimento total do corpo revelou diferença significativa para os
dois isolados.
A análise de variância fator único (ANOVA) comparando os dois isolados,
Esteio e JV, estão representados nas tabelas 5 e 6.
Tabela 5: Valor médio dos caracteres analisados em milímetros e anális e de
variância dos isolados Esteio e JV para vermes machos. Diferenças significativas
para p<0,05.
Caracteres Macho Esteio Macho JV Valor de p
Comprimento 5,88 4,53 p<0,05
Largura ao nível da medida 0,31 0,28 NS
Comprimento da ventosa oral 0,14 0,14 NS
Largura da ventosa oral 0,15 0,15 NS
Comprimento do acetábulo 0,17 0,15 NS
Largura do acetábulo 0,15 0,14 NS
Distância entre ventosas 0,31 0,29 NS
Número de lobos testiculares 8,17 7,85 NS
Comprimento de cada lobo 0,08 0,07 p<0,05
Largura de cada lobo 0,04 0,04 NS
NS: não significante
Tabela 6: Valor médio dos caracteres analisados em milímetros e anális e de
variância dos isolados Esteio e JV para vermes fêmeas. Diferenças significativas
para p<0,05.
Caracteres Fêmea Esteio Fêmea JV Valor de p
Comprimento 6,96 5,00 p<0,05
Largura ao nível da medida 0,14 0,14 NS
Comprimento da ventosa oral 0,05 0,05 NS
Largura da ventosa oral 0,04 0,05 NS
Comprimento do acetábulo 0,03 0,04 NS
Largura do acetábulo 0,04 0,05 NS
Distância entre ventosas 0,01 0,13 NS
Comprimento do ovário 0,24 0,22 NS
Largura do ovário 0,09 0,10 NS
Comprimento do ovo 0,09 0,09 NS
Largura do ovo 0,03 0,04 NS
Comprimento do espinho 0,02 0,01 NS
NS: não significante
30
5.2 Análise com microssatélites – Isolados Esteio e JV
Os dados relativos ao tamanho de alelos/locus/indivíduo foram lançados no
programa Arlequin 2.000 e foram feitas análises de freqüências dos alelos de cada
locus e os testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg locus a locus. Os resultados
obtidos com os dois isolados, Esteio e JV, e as cepas de laboratório LE e MAP estão
sumariados a seguir, na tabela 7.
Fig. 6: Distribuição das freqüências alélicas para os quatro loci dos isolados Esteio e
JV.
32
Fig. 7: Distribuição das freqüências alélicas para os 4 loci das cepas LE e MAP.
33
34
5.3 Análise interpopulacional
A tabela 8 representa a matriz construída pelo programa Arlequin 2.000,
utilizando o índice de fixação (F
ST
), relativo às freqüências dos alelos, para estimar
as distâncias genéticas entre os pares das populações estudadas um a um.
Tabela 8: Estimativa das distâncias genéticas entre os pares das populações
utilizando F
ST
.
Populações JV Esteio LE MAP
JV 0,00000
Esteio 0,03193 0,00000
LE 0,12833 0,13088 0,00000
MAP 0,19341 0,20198 0,19095 0,00000
35
A tabela 9 representa a matriz construída pelo programa Arlequin 2.000,
utilizando R
ST
(SLATKIN, 1995), relativo às freqüências dos alel os, para estimar as
distâncias genéticas entre os pares de populações uma a uma.
Tabela 9: Estimativa da distância genética entre os pares das populações utilizando
R
ST
.
Populações JV Esteio LE MAP
JV 0,00000
Esteio 0,03299 0,00000
LE 0,14722 0,15059 0,00000
MAP 0,23979 0,25309 0,23602 0,00000
36
6 DISCUSSÃO
A presença de um foco de transmissão da parasitose no RS deu “status” ao
Estado em possuir o foco mais meridional da América até o presente momento. A
esquistossomose possui sua distribuição nos trópicos, sendo considerada uma
doença tropical. O RS possui um clima subtropical com estações bem definidas.
Entretanto, o parasito aqui se estabeleceu. Acredita-se que o grande fluxo rodoviário
associado com a presença de indústrias de grande porte nas redondezas do foco
inicial possa ser a maneira mais provável da introdução da esquistossomose no
estado (GRAEFF-TEIXEIRA et al., 2004).
Como relatado anteriormente, o isolado Est eio é proveniente de caramujos
naturalmente infectados e de fezes oriundas de dois pacientes. O isolado JV é de
apenas um paciente infectado.
Devido às críticas para com a maneira do isolamento do parasito da
natureza, realizaram-se medições para determinar se há diferença morfológica entre
os parasitos. O comprimento total do corpo de ambos os sexos ap resentou
diferenças significativas. O comprimento de cada lobo testicular também apresentou
diferença. Os outros caracteres mensurados não apresentaram diferenças. Esses
dados parcialmente concordam com os descritos por MACHADO-SILVA et al. (1995)
onde cepas simpátricas mostram pequenas variações morfológicas. Muitas vezes,
essas pequenas diferenças significativas não vão além de um caractere estudado,
sendo variações intra-específicas.
Inúmeros estudos morfológicos dos vermes adultos são usados para
esclarecer questões taxonômicas (SAMBON, 1907; PIRAJÁ DA SILVA, 1908),
detectar diferenças nos vermes recuperados de diferentes hospedeiros (KASTNER
et al., 1975; DIAS & PIEDRABUENA, 1980; MACHADO-SILVA et al., 1994; NEVES
et al., 1998) e de parasitas provenientes de diferentes cepas (MAGALHÃES &
CARVALHO, 1973; PARAENSE & CORRÊA, 1981; MACHADO-SILVA et al., 1995).
Baseado nos estudos referidos foram feitas comparações com os dados
obtidos pela análise dos isolados gaúchos.
Nos vermes machos de ambos os isolados, o comprimento total, o
comprimento e largura da ventosa oral, o comprimento e largura do acetábulo e a
distância entre as ventosas apresentaram valores abaixo da média e desvio padrão
da bibliografia acima.
37
Nos vermes fêmeas houve diferenças dos isolados gaúchos com relação às
cepas estudadas. O isolado Esteio apresentou valores abaixo da média e desvio
padrão nos seguintes caracteres: comprimento e largura da ventosa oral,
comprimento do acetábulo, comprimento do ovário e largura do ovo. O isolado JV,
nas seguintes características: comprimento total do corpo, comprimento da ventosa
oral, distância entre ventosas, comprimento do ovário e comprimento do espinho.
Embora tais características sejam menores que as relatadas em estudos
anteriores, a plasticidade fenotípica do S. mansoni parece ser a explicação para tais
variações (NEVES et al., 2004). Organismos que vivem em ambientes com
condições heterogêneas podem produzir diferentes fenótipos sob influência das
variadas condições a que estão submetidos (POULIN, 1996).
No foco de transmissão de Esteio, o número de ovos encontrados por
grama de fezes é muito baixo, em muitos casos inferiores a um ovo (GRAEFF-
TEIXEIRA et al., 2004). Curiosamente, em um estudo recente, realizou-se uma
possível associação do tamanho do parasito com o número de ovos nas fezes
(MARTINEZ et al., 2003).
Como os vermes dos isolados de Esteio se mostraram menores em
comprimento e a carga de ovos nas fezes é baixa, es se poderia ser um dos motivos
da baixa eliminação de ovos nas fezes por pacientes infectados em Esteio. Porém,
em focos de baixa intensidade de transmissão o número de vermes machos
encontrados é maior (D’ANDREA et al., 2000). Assim sendo, um estudo com um
casal de vermes poderia esclarecer se a redução de tamanho dos vermes afeta a
oviposição e a migração para os locais de deposição dos ovos.
A análise, por microssatélites, dos isolados Esteio e JV, utilizando 4 loci,
apresentou 17 e 21 alelos, enquanto as cepas de laboratório, LE e MAP,
apresentaram 23 e 25 alelos, respectivamente. Não foi possível a determinação do
tamanho de 4 alelos, 1 em cada isolado e 2 na cepa MAP devido a problemas
operacionais. Eles poderiam representar a repetição de um alelo existente ou um
novo alelo e para evitar qualquer problema eles foram ignorados na discussão.
Entre os dois isolados de campo houve uma pequena diferença nos alelos
encontrados. O isolado Esteio apresentou apenas um alelo que não foi enc ontrado
no isolado JV enquanto esse isolado apresentou 5 alelos. A estimativa de distância
genética (F
ST) relativa ao número de diferentes alelos foi de aproximadamente 3,2%.
38
Ao analisarmos os loci SmBr5 e 6 verificam os a presença de 4 alelos para
Esteio e 5 para JV, enquanto a cepa LE apresentou 12 alelos e a cepa MAP 9.
Esses loci estão presentes em uma EST, porém não fazem parte da região
codificadora da proteína. Espera-se que em regiões codificantes a pressão seletiva
seja maior (RODRIGUES et al., 2002a).
Com relação aos outros dois loci o mesmo não é obs ervado. A presença de
13 alelos para Esteio, 16 para JV, 11 para cepa LE e 16 para MAP está de acordo
como previsto por KOKOSKA et al., 1998, onde em regiões não codificantes as
pressões genéticas são reduzidas permitindo um aumento da variabilidade e da
informatividade da seqüência repetitiva.
Em um estudo comparativo de populações de campo com cepas de
laboratório utilizando 7 loci para microssatélites, STOHLER e co laboradores (2004)
encontraram um maior número de alelos em populações de campo do que em cepa s
de laboratório, atribuíram ao efeito fundador e aos freqüentes gargalos de garrafa
(bottleneck, em inglês) populacionais durante a manutenção em la boratório o motivo
dessa deficiência de alelos. Porém, eles não calcularam a divergência genética das
populações pelos índices F
ST
e R
ST
.
Fazendo uma comparação com o número de alelos encontrados em nosso
estudo com o anterior, poderíamos supor que os isolados de campo analisados
estão passando por um processo de efeito fundador devido ao baixo n° de alelos
encontrados. Entretanto, não podemos confirmar essa hipótese com os resultados
encontrados pois utilizamos outros loci para o nosso estudo.
Populações de laboratório e de campo do molusco hospedeiro do parasito
apresentaram pequena variabilidade genética quando analisado por SSR-PCR
(CAMPOS et al., 2002).
O índice de fixação (F
ST
) pode ser usado entre pares de populações como
uma estimativa da distância genética entre eles. O marcador utilizado para esse
índice deve ter taxas de mutação baixas e a presença de similaridade das
populações deve ser devido às migrações. Porém, os microssatélit es possuem altas
taxas de mutações havendo a possibilidade de surgir distorções em estimativas de
uma série de parâmetros genéticos. Por esse motivo, SLATKIN (1995) desenvolveu
um modelo estatístico, nomeado R
ST,
análogo ao F
ST,
para o estudo de divergência
entre populações por ser adequado ao processo mais aceito atualmente de mutação
dos microssatélites, modelo do passo único (Stepwise mutation model - SMM).
39
Segundo este modelo, alelos com tamanhos mais próximos são considerados mais
similares do que alelos com tamanhos mais distantes.
As tabelas 8 e 9 apresentam os valores de F
ST
e R
ST
para as amostras
estudadas e verifica-se uma grande diferenciação entre as matrizes, com valores
superiores a 24%. Sugerido por WRIGHT (1978), os seguintes parâmetros
qualitativos servem para a interpretação da diferenciação genética das amostras: 0-
0,05 pequena, 0,05-0,15 moderada, 0,15-0,25 grande, e >0,25 indica uma
diferenciação genética muito grande.
RODRIGUES e colaboradores (2002a), utilizando esses mesmos
marcadores acima, compararam 10 isolados de campo do município de Dioniso-MG
onde a prevalência da esquist ossomose é maior do que 16%. Eles notaram uma
pequena diversidade, não mais que 2,7% entre os isolados de campo, sugerindo um
alto fluxo gênico na região.
Os valores encontrados para os 4 loci estudados demonstraram desvios ao
equilíbrio de Hardy-Weinberg, indicando uma possível deficiência de heterozigotos.
A recente introdução dessa parasitose no RS pode ser o motivo desse encontro.
Acredita-se que o longo tempo de manutenção em laboratório, das cepas LE e MAP,
possa ser o motivo para esse achado.
Pelos microssatélites analisados não foi possível fazer uma correlação da
resistência às drogas pela cepa MAP. A maioria dos alelos encontrados está
presente em todas as amostras. Um estudo com outros loci poderia localizar a
região genômica dos parasitos dessa cepa que conferem essa resistência.
Os nossos dados possivelmente sugerem que as populações de
esquistossomos estudadas estão passando por um processo de efeito fundador,
principalmente os isolados de Esteio. Outra alternativa poderia ser a pressão
seletiva sobre os loci estudados, impedindo eles de acumularem mutações no
decorrer das gerações.
A divergência genética encontrada abr e caminho para um estudo mais
amplo da população do parasito do Estado. Um estudo com uma amostra maior de
vermes e/ou com um número maior de loci de microssatélites possa apresentar
resultados diferentes dos aqui apresentados. Podendo, inclusive, esclarecer
questões epidemiológicas em um foco de ultra baixa endemicidade.
40
7 CONCLUSÃO
Em relação aos resultados obtidos podemos chegar as seguintes conclusões:
• Não há diferença significativa entre os isolados Esteio e JV levando-se em
consideração a maioria dos caracteres morfológicos analisados.
• Não há dif erença notável do Schistosoma mansoni do foco de transmissão de
Esteio com o conjunto de dados das cepas estudadas pela bibliografia.
• As variações observadas em alguns car acteres podem ser atribuídas à
plasticidade fenotípica.
• Há uma grande divergência genética ent re as populações estudadas quando
comparados os isolados de campo com as cepas de laboratório.
41
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R.C., MIYASATO P.A., NASCIMENTO A.L., OHLWEILER F.P., REIS E.M.,
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55
APÊNDICE
Amostra do isolado Esteio
Project information:
--------------------
NbSamples = 1
DataType = MICROSAT
GenotypicData = 1
GameticPhase = 1
RecessiveData = 0
==============================
Settings used for Calculations
==============================
General settings:
-----------------
Deletion Weight = 1
Transition Weight Weight = 1
Tranversion Weight Weight = 1
Epsilon Value = 1e-07
Significant digits for output = 5
Use original haplotype definition
Alllowed level of missing data = 0.05
Active Tasks:
-------------
Standard indices:
-----------------
Hardy-Weinberg equilibrium test:
--------------------------------
No. of steps in Markov chain = 100000
No. of Dememorisation Steps = 1000
Required precision on Probability = 0
Significance level = 2
Test association at the Locus and Haplotype levels
===========================================================================
ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL
===========================================================================
===========================================================================
Sample : Esteio
===========================================================================
===============================
Standard diversity indices : (Esteio)
===============================
Reference: Nei, M., 1987.
No. of gene copies : 80
No. haplotypes : 45
No. of loci : 4
56
No. of usable loci : 4 loci with less than 5.00 % missing data
No. of polymorphic sites : 4
Gene diversity : 0.9804 +/- 0.0056
Allele Data base content:
Alleles for the locus 0:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.2875 0.0509 322
2 0.7125 0.0509 328
Alleles for the locus 1:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.4125 0.0554 256
2 0.5875 0.0554 259
Alleles for the locus 2:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.2750 0.0502 450
2 0.2125 0.0460 478
3 0.0375 0.0214 482
4 0.1250 0.0372 454
5 0.0875 0.0318 462
6 0.0625 0.0272 470
7 0.0250 0.0176 ?
8 0.0875 0.0318 458
9 0.0750 0.0296 446
10 0.0125 0.0125 466
Alleles for the locus 3:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.6625 0.0532 158
2 0.2500 0.0487 146
3 0.0625 0.0272 152
4 0.0250 0.0176 161
===============================
Hardy-Weinberg equilibrium : (Esteio)
===============================
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Exact test using a Markov chain (for all Loci):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Locus #Genot Obs.Heter. Exp.Heter. P. value s.d. Steps done
0 40 0.22500 0.41487 0.00544 0.00022 100172
1 40 0.57500 0.49082 0.33520 0.00139 100172
2 39 0.38462 0.85148 0.00000 0.00000 100172
3 40 0.17500 0.52278 0.00000 0.00000 100172
57
Exact test using a Markov chain (for all Haplotypes):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Markov Chain test: P value : 0.01080 +/- 0.00009 (100172 steps
done
Amostra do isolado JV
Project information:
--------------------
NbSamples = 1
DataType = MICROSAT
GenotypicData = 1
GameticPhase = 1
RecessiveData = 0
==============================
Settings used for Calculations
==============================
General settings:
-----------------
Deletion Weight = 1
Transition Weight Weight = 1
Tranversion Weight Weight = 1
Epsilon Value = 1e-07
Significant digits for output = 5
Use original haplotype definition
Alllowed level of missing data = 0.05
Active Tasks:
-------------
Standard indices:
-----------------
Hardy-Weinberg equilibrium test:
--------------------------------
No. of steps in Markov chain = 100000
No. of Dememorisation Steps = 1000
Required precision on Probability = 0
Significance level = 2
Test association at the Locus and Haplotype levels
===========================================================================
ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL
===========================================================================
===========================================================================
Sample : JV
===========================================================================
58
===============================
Standard diversity indices : (JV)
===============================
Reference: Nei, M., 1987.
No. of gene copies : 82
No. haplotypes : 41
No. of loci : 4
No. of usable loci : 4 loci with less than 5.00 % missing data
No. of polymorphic sites : 4
Gene diversity : 0.9425 +/- 0.0153
Allele Data base content:
Alleles for the locus 0:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.4146 0.0547 322
2 0.5854 0.0547 328
Alleles for the locus 1:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.5000 0.0556 256
2 0.4024 0.0545 259
3 0.0976 0.0330 262
Alleles for the locus 2:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.0366 0.0209 470
2 0.4146 0.0547 478
3 0.2073 0.0450 450
4 0.2073 0.0450 454
5 0.0244 0.0171 482
6 0.0244 0.0171 474
7 0.0244 0.0171 466
8 0.0122 0.0122 486
9 0.0122 0.0122 490
10 0.0122 0.0122 462
11 0.0244 0.0171 458
Alleles for the locus 3:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.1829 0.0430 152
2 0.5976 0.0545 158
3 0.0732 0.0289 146
4 0.0244 0.0171 ?
5 0.0976 0.0330 161
6 0.0244 0.0171 155
59
===============================
Hardy-Weinberg equilibrium : (JV)
===============================
Reference: Guo, S. and Thompson, E. 1992.
Levene H. (1949).
Exact test using a Markov chain (for all Loci):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Locus #Genot Obs.Heter. Exp.Heter. P. value s.d. Steps done
0 41 0.53659 0.51551 0.74713 0.00138 100172
1 41 0.68293 0.58567 0.02405 0.00049 100172
2 41 0.34146 0.75821 0.00000 0.00000 100172
3 40 0.57500 0.58291 0.00000 0.00000 100172
Exact test using a Markov chain (for all Haplotypes):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Markov Chain test: P value : 0.02646 +/- 0.00009 (100172 steps
done
Amostra da cepa LE
Project information:
--------------------
NbSamples = 1
DataType = MICROSAT
GenotypicData = 1
GameticPhase = 1
RecessiveData = 0
==============================
Settings used for Calculations
==============================
General settings:
-----------------
Deletion Weight = 1
Transition Weight Weight = 1
Tranversion Weight Weight = 1
Epsilon Value = 1e-07
Significant digits for output = 5
Use original haplotype definition
Alllowed level of missing data = 0.05
Active Tasks:
-------------
Standard indices:
-----------------
Hardy-Weinberg equilibrium test:
--------------------------------
No. of steps in Markov chain = 100000
No. of Dememorisation Steps = 1000
Required precision on Probability = 0
60
Significance level = 2
Test association at the Locus and Haplotype levels
===========================================================================
== ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL
===========================================================================
===========================================================================
== Sample : LE
===========================================================================
===============================
== Standard diversity indices : (LE)
===============================
Reference: Nei, M., 1987.
No. of gene copies : 80
No. haplotypes : 56
No. of loci : 4
No. of usable loci : 4 loci with less than 5.00 % missing data
No. of polymorphic sites : 4
Gene diversity : 0.9848 +/- 0.0059
Allele Data base content:
Alleles for the locus 0:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.2750 0.0502 328
2 0.2125 0.0460 334
3 0.0250 0.0176 322
4 0.2875 0.0509 325
5 0.1500 0.0402 331
6 0.0250 0.0176 343
7 0.0250 0.0176 340
Alleles for the locus 1:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.4000 0.0551 256
2 0.1625 0.0415 262
3 0.2750 0.0502 259
4 0.0875 0.0318 265
5 0.0750 0.0296 253
Alleles for the locus 2:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.3125 0.0521 466
2 0.0375 0.0214 462
3 0.2000 0.0450 450
4 0.0125 0.0125 486
5 0.3125 0.0521 478
6 0.0375 0.0214 474
7 0.0625 0.0272 454
8 0.0250 0.0176 494
61
Alleles for the locus 3:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.1000 0.0338 149
2 0.4000 0.0551 158
3 0.5000 0.0563 146
===============================
== Hardy-Weinberg equilibrium : (LE)
===============================
Reference: Guo, S. and Thompson, E. 1992.
Levene H. (1949).
Exact test using a Markov chain (for all Loci):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Locus #Genot Obs.Heter. Exp.Heter. P. value s.d. Steps done
0 40 0.72500 0.78291 0.00000 0.00000 100172
1 40 0.62500 0.75411 0.00059 0.00008 100172
2 40 0.57500 0.77532 0.00000 0.00000 100172
3 40 0.75000 0.58734 0.15067 0.00092 100172
Exact test using a Markov chain (for all Haplotypes):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Markov Chain test: P value : 0.30845 +/- 0.00007 (100172 steps
done
Amostra da cepa MAP
Project information:
--------------------
NbSamples = 1
DataType = MICROSAT
GenotypicData = 1
GameticPhase = 1
RecessiveData = 0
==============================
Settings used for Calculations
==============================
General settings:
-----------------
Deletion Weight = 1
Transition Weight Weight = 1
Tranversion Weight Weight = 1
Epsilon Value = 1e-07
Significant digits for output = 5
Use original haplotype definition
Alllowed level of missing data = 0.05
62
Active Tasks:
-------------
Standard indices:
-----------------
Hardy-Weinberg equilibrium test:
--------------------------------
No. of steps in Markov chain = 100000
No. of Dememorisation Steps = 1000
Required precision on Probability = 0
Significance level = 2
Test association at the Locus and Haplotype levels
===========================================================================
== ANALYSES AT THE INTRA-POPULATION LEVEL
===========================================================================
===========================================================================
== Sample : MAP
===========================================================================
===============================
== Standard diversity indices : (MAP)
===============================
Reference: Nei, M., 1987.
No. of gene copies : 80
No. haplotypes : 55
No. of loci : 4
No. of usable loci : 4 loci with less than 5.00 % missing data
No. of polymorphic sites : 4
Gene diversity : 0.9845 +/- 0.0054
Allele Data base content:
Alleles for the locus 0:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.3250 0.0527 322
2 0.4000 0.0551 328
3 0.2250 0.0470 331
4 0.0500 0.0245 325
Alleles for the locus 1:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.5125 0.0562 259
2 0.0500 0.0245 256
3 0.0375 0.0214 268
4 0.3500 0.0537 262
5 0.0500 0.0245 271
63
Alleles for the locus 2:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.1625 0.0415 482
2 0.1875 0.0439 454
3 0.0500 0.0245 486
4 0.2375 0.0479 450
5 0.2000 0.0450 458
6 0.0500 0.0245 446
7 0.0250 0.0176 478
8 0.0125 0.0125 466
9 0.0375 0.0214 470
10 0.0125 0.0125 462
11 0.0250 0.0176 ?
Alleles for the locus 3:
No. Freq. s.d. Allele:
1 0.6625 0.0532 149
2 0.1375 0.0387 158
3 0.1000 0.0338 152
4 0.0500 0.0245 161
5 0.0125 0.0125 170
6 0.0125 0.0125 173
7 0.0250 0.0176 ?
===============================
== Hardy-Weinberg equilibrium : (MAP)
===============================
Reference: Guo, S. and Thompson, E. 1992.
Levene H. (1949).
Exact test using a Markov chain (for all Loci):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Locus #Genot Obs.Heter. Exp.Heter. P. value s.d. Steps done
0 40 0.35000 0.71297 0.00000 0.00000 100172
1 40 0.42500 0.62880 0.00128 0.00011 100172
2 39 0.35897 0.84682 0.00000 0.00000 100172
3 39 0.28205 0.51382 0.00000 0.00000 100172
Exact test using a Markov chain (for all Haplotypes):
Forecasted chain length :100000
Dememorization steps :1000
Markov Chain test: P value : 0.00000 +/- 0.00000 (100172 steps
done
64
Análise interpopulacional
===========================================================================
== Comparisons of pairs of population samples
===========================================================================
List of labels for population samples used below:
-------------------------------------------------
Label Population name
----- ---------------
1: JV
2: Esteio
3: LE
4: MAP
------------------------
Population pairwise FSTs
------------------------
Distance method: No. of different alleles (FST)
1 2 3 4
1 0.00000
2 0.03193 0.00000
3 0.12833 0.13088 0.00000
4 0.19341 0.20198 0.19095 0.00000
===========================================================================
== Comparisons of pairs of population samples
===========================================================================
List of labels for population samples used below:
-------------------------------------------------
Label Population name
----- ---------------
1: JV
2: Esteio
3: LE
4: MAP
------------------------
Population pairwise FSTs
------------------------
Computing conventional F-Statistics from haplotype frequencies
1 2 3 4
1 0.00000
2 0.01546 0.00000
3 0.03361 0.01603 0.00000
4 0.03698 0.02301 0.01616 0.00000
65
===========================================================================
Comparisons of pairs of population samples
===========================================================================
List of labels for population samples used below:
-------------------------------------------------
Label Population name
----- ---------------
1: JV
2: Esteio
3: LE
4: MAP
----------------------------------------------------
Matrix of Slatkin linearized FSTs as t/M=FST/(1-FST)(M=N for haploid data,
M=2N for diploid data)
----------------------------------------------------
Reference: Slatkin, M., 1995.
1 2 3 4
1 0.00000
2 0.03299 0.00000
3 0.14722 0.15059 0.00000
4 0.23979 0.25309 0.23602 0.00000
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