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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA FLORESTAL
ESTABELECIMENTO IN VITRO E PROPAGAÇÃO DE
Cordia trichotoma (Vell.) Arrabida ex Steudel
(LOURO-PARDO)
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Tiago Antonio Fick
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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ESTABELECIMENTO IN VITRO E PROPAGAÇÃO DE Cordia
trichotoma (Vell.) Arrabida ex Steudel (LOURO-PARDO)
por
Tiago Antonio Fick
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Florestal, Área de concentração em
Silvicultura, da Universidade Federal de Santa Maria, RS, como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal
Orientador: Prof. Dilson Antônio Bisognin, PhD.
Santa Maria, RS, Brasil
2007
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ii
ERRATA
Página Linha Onde se lê Leia-se
iii 17 Jussara Juçara
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA FLORESTAL
A comissão examinadora, abaixo assinada,
aprova a dissertação de mestrado
ESTABELECIMENTO IN VITRO E PROPAGAÇÃO DE Cordia
trichotoma (Vell.) Arrabida ex Steudel (LOURO-PARDO)
Elaborada por
Tiago Antonio Fick
Como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal
COMISSÃO EXAMINADORA
_________________________________
Prof. Dilson Antônio Bisognin, PhD. (UFSM)
(Presidente/Orientador)
___________________________________
Profa. Dra. Jussara Terezinha Paranhos (UFSM)
______________________________
Profa. Magali Ferrari Grando, PhD. (UPF)
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida. A meus pais, Alfredo e Maria, pelo incentivo e
dedicação à minha formação. À Universidade Federal de Santa Maria, pela
oportunidade oferecida. À Capes pela auxílio financeiro. Ao Prof. Dilson Antônio
Bisognin, pela orientação, críticas e sugestões. À Prof.ª Lia Rejane Reiniger, pela
orientação na elaboração do trabalho. Aos membros da Comissão Examinadora,
pela análise e sugestões. Aos meus colegas e amigos Marlene, Micheli, Kênia,
Marcos, Cleber, Fabrina, e a todos os colegas de laboratório, pelo apoio, ajuda e
incentivo recebido. À querida Susane, pela alegria que traz a minha vida. Minha
sincera gratidão a todos que, de alguma forma, fazem parte de minha vida, pela
companhia ao longo da estrada de nossa existência.
v
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal
Universidade Federal de Santa Maria
ESTABELECIMENTO IN VITRO E PROPAGAÇÃO DE Cordia
trichotoma (Vell.) Arrabida ex Steudel (LOURO-PARDO)
AUTOR: Tiago Antonio Fick
ORIENTADOR: Dilson Antonio Bisognin
Data e Local da defesa: Santa Maria, 23 de julho de 2007
O setor florestal hoje enfrenta um grande desafio, atender à demanda por produtos
madeireiros nobres, abastecido especialmente por espécies nativas brasileiras, dentre elas
o louro-pardo. Nesse sentido, estudos de propagação que contemplem espécies nativas são
necessários para garantir a produção de mudas de qualidade para plantios comerciais,
reduzindo a pressão sobre as matas remanescentes. O objetivo deste estudo foi
desenvolver protocolos de estabelecimento in vitro e de propagação de louro-pardo. Para o
estabelecimento in vitro, estudou-se o efeito do tempo de embebição e de diferentes
protocolos de desinfestação das sementes. A embebiçao se fez em água destilada e
autoclavada por 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h. Para a desinfestação, testou-se a imersão em
solução de hipoclorito de sódio a 2 e 5%, por 0, 5, 10, 15 e 20 min. após 30 min de imersão
em hipoclorito de sódio a 5%, retirada do tegumento e imersão em álcool etílico 70% por 30
s. Sementes sem tegumento foram inoculadas em meio de cultura para germinação. Foram
avaliadas as porcentagens de desinfestação e germinação e o tempo médio de germinação.
O crescimento de explantes de louro-pardo foi quantificado nos meios de cultura 1/2MS e
WPM, pelo número de folhas e raízes primárias emitidas e comprimento da parte aérea e
das raízes primárias, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a inoculação. Para a multiplicação, foram
testadas a adição ao meio de cultura WPM de 6-benzilaminopurina (BAP), ácido naftaleno
acético (ANA) ou ácido giberélico (GA
3
) nas concentrações de 0; 0,05; 0,10; 0,15 ou 0,20 mg
L
-1
e a combinação de 0 ou 0,05 mg L
-1
de ANA com 0; 0,10 ou 0,20 mg L-1 de GA
3
. Foram
avaliados o número de folhas e de entrenós e a altura das plântulas aos 30 dias de cultivo.
Plântulas fornecedoras de segmentos nodais e ápices caulinares foram reidratadas com
meio WPM líquido e mantidas in vitro como microcepas, para aumentar a taxa de
multiplicação. Aos 21 dias após o primeiro e o segundo corte foi avaliado o número de
brotações adventícias e de entrenós por microcepa. Miniestacas de 2,5 a 4; 4,01 a 5,5 e
5,51 a 7 cm foram submetidas à aplicação de 0 ou 1000 mg L
-1
de ácido indol butírico (AIB)
por 10 s na base. Foram avaliadas as porcentagens de sobrevivência, enraizamento e
formação de calos aos 60 dias. A embebição das sementes de louro-pardo por até 24 h
favorece a retirada do tegumento sem afetar a desinfestação e germinação. A imersão das
sementes com tegumento em NaOCl 5% por 30 min, retirada do tegumento e a imersão das
sementes sem tegumento em solução de álcool etílico 70% por 30 s foram suficientes para a
produção in vitro de plântulas assépticas. Plântulas de louro-pardo apresentaram melhor
crescimento em meio de cultura WPM, sem a adição de reguladores de crescimento. A
adição isolada ou combinada de reguladores de crescimento não aumentou a taxa de
multiplicação in vitro. A manutenção de microcepas aumentou a taxa de multiplicação in vitro
em até 1,75 vezes. Miniestacas de louro-pardo de 2,5 a 5,5 cm de comprimento
apresentaram altos índices de sobrevivência, porém não enraizaram.
Palavras-chave: Multiplicação; micropropagação; miniestaca; microcepa; regulador de
crescimento; espécies florestais.
vi
ABSTRACT
Master Thesis
Graduate Program of Forest Engineering
Federal University of Santa Maria
ESTABLISHMENT IN VITRO AND PROPAGATION OF Cordia
trichotoma (Vell.) Arrabida ex Steudel
AUTHOR: Tiago Antonio Fick
ADVISER: Dilson Antonio Bisognin
Data and defense place: Santa Maria, July 23
th
, 2007
The Forest Sector has an accomplishment to attend the demand for noble wood
products, usually get from native Brazilian species as louro-pardo. Therefore, propagation
studies of native species are necessary to produce high quality plants for commercial
exploitation and to reduce deforestation pressure over remained populations of native
species. The objective of this study was to develop protocols of establishment in vitro and
propagation of louro-pardo. Time of seed imbibition and disinfection protocols were studied
for in vitro seedling establishment. Seeds were imbibed in distilled and autoclaved water for
0, 24, 48, 72, 96 and 120 h. Seeds were immersed in a sodium hypochlorite solution of 5%
for 30 min, submitted to tegument excision and immersed in a alcohol solution of 70% for 30
s. Disinfection was done in sodium hypochlorite solutions of 2 and 5% for 0, 5, 10 15 and 20
min. Seeds without tegument were then inoculated in medium culture for germination.
Percentages of disinfection and germination and mean germination time were evaluated.
Seedling growth was quantified in 1/2MS and WPM culture mediums. Number of emerged
leaves and primary roots and length of shoots and primary roots were evaluated at 7, 14, 21
and 28 days after inoculation. The addition to the WPM culture medium of 0; 0.05; 0.10; 0.15
or 0.20 mg L
-1
of 6-benzilaminopurin (BAP), naphthalene acetic acid (NAA) or gibberellic acid
(GA
3
) and the combination of 0 or 0.05 mg L
-1
of NAA with 0; 0.10 or 0.20 mg L
-1
of GA
3
were
tested for propagation. At 30 days after inoculation, number of internodes and leaves and
plantlet height were evaluated. Plantlets of seminal origin were also excised below or above
the first true leaf and the microstumps maintained in vitro with liquid WPM added to the
original medium to increase multiplication rate. Number of sprouts and internodes per
microstump were evaluated at 21 days after first and second excision. Minicuttings from 2.5
to 4, 4.01 to 5.5 and 5.51 to 7 cm were treated with 0 or 1000 mg L
-1
of indol butyric acid
(IBA) by basal immersion for 10 s. Survival and rutting percentage and callus formation were
evaluated at 60 days after treatment. Imbibition of louro-pardo seeds until 24 hours made
easy tegument excision without affecting disinfection and germination. Immersion of seeds
with tegument in a sodium hypochlorite solution of 5% for 30 min, tegument excision and
immersion in a alcohol solution of 70% for 30 s are enough for an acceptable production of in
vitro aseptic seedlings. Louro-pardo seedlings grow satisfactorily in a WPM culture medium
without growth regulators. The addition of growth regulators either isolated or combined to
the WPM medium did not increase in vitro propagation. Maintaining microstump increased
the in vitro multiplication rate in 1.75 fold. Minicuttings of louro-pardo from 2.5 to 5.5 cm
showed high survival percentages, but they did not root. Protocols of plantlet acclimatization
and clonal propagation by minicuttings should be developed to produce high genetic and
physiological quality of louro-pardo plants.
Key words: Multiplication; micropropagation; minicutting; microstump; growth regulator;
forest species.
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Composição dos meios de cultura WPM (Lloyd e McCown, 1981) e MS
(Murashige e Skoog, 1962)...............................................................................22
TABELA 2 – Porcentagens de desinfestação e germinação e tempo médio de
germinação (TMG¹) de sementes de louro-
pardo submetidas a
pré-desinfestação (imersão em NaOCl 5% por 30 min), retirada do tegumento,
imersão em álcool 70% por 30 s e diferentes tempos de imersão em NaOCl 2%
ou 5%.................................................................................................................32
TABELA 3 – Comprimento da parte aérea e de raízes adventícias principais, número
de folhas e número de raízes emitidas em propágulos de louro-pardo, aos 28
dias após a inoculação em meio de cultura ½MS ou
WPM...................................................................................................................33
TABELA 4 – Desenvolvimento de explantes de Cordia trichotoma, na fase de
multiplicação, após 30 dias de isolamento em meio WPM acrescido de 0.05,
0.10, 0.15 ou 0.20 mg L
-1
de Ácido 6-indolbutírico (BAP), Ácido nafataleno
acético (ANA), Ácido giberélico (GA
3
) ou sem a adição
destes.................................................................................................................41
TABELA 5 – Desenvolvimento de explantes de Cordia trichotoma, na fase de
multiplicação, após 50 dias de isolamento em meio WPM acrescido de 0,00 ou
0,05 mg L
-1
de Ácido nafataleno acético (ANA) e 0,00, 0,10 ou 0,20 mg L
-1
de
Ácido giberélico
(GA
3
)...................................................................................................................42
TABELA 6 – Desenvolvimento de brotações em microcepas aos 21 e 42 dias (1
a
e 2
a
coleta) em meio de cultura WPM acrescido de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de
sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado reidratado com WPM liquido sem carvão
ativado................................................................................................................43
TABELA 7 – Desenvolvimento de entre-nós em brotações de microcepas aos 21 e
42 dias (1
a
e 2
a
coleta) em meio de cultura WPM acrescido de 7 g L
-1
de Agar,
30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado reidratado com WPM liquido
sem carvão ativado............................................................................................43
viii
TABELA 8 – Porcentual de sobrevivência de miniestacas de Cordia trichotoma aos
60 dias após aplicação na sua base de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por
10 s.....................................................................................................................44
TABELA 9 – Porcentual de sobrevivência de miniestacas de Cordia trichotoma
classificadas em diferentes tamanhos, aos 60 dias após aplicação na sua base
de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s.................................................................44
TABELA 10 – Porcentual de formação de calos em miniestacas de Cordia trichotoma
aos 60 dias após aplicação na sua base de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por
10 s.....................................................................................................................45
TABELA 11 Porcentual de formação de calos em miniestacas de Cordia trichotoma
classificadas em diferentes tamanhos, aos 60 dias após aplicação na sua base
de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s.................................................................45
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Porcentagens de desinfestação e germinação e tempo médio de
germinação (TMG) de sementes de louro-pardo submetidas a diferentes
tempos de embebição em água destilada antes da pré-desinfestação (imersão
em NaOCl 5% por 30 min), retirada do tegumento e imersão em álcool 70% por
30 s aos 30 dias após a inoculação em meio de semeadura, 7 g de Agar e 30 g
de sacarose por litro de água
destilada.............................................................................................................31
FIGURA 2 – Germinação in vitro de sementes de louro-pardo submetidas a 12 h de
embebição em água destilada, retirada do tegumento e imersão em álcool 70%
por 30 s e inoculadas em meio de semeadura, 7 g de agar e 30 g de sacarose
por litro de água destilada, e plântulas de louro-pardo aos 28 dias de
crescimento em meio WPM na sua formulação completa.................................33
FIGURA 3 – Comprimento (cm) da parte aérea e das raízes adventícias
principais, número de folhas e raízes emitidas em propágulos de louro-pardo
cultivados em meio WPM ou
1/2MS.................................................................................................................34
FIGURA 4 – Propágulo aos 28 dias de crescimento em meio de cultivo WPM
acrescido de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado,
apto ao corte da parte aérea e formação da microcepa, microcepa aos 7 e 14
dias do 1
o
corte, microcepa aos 21 dias do 1
o
corte, apta para o segundo corte
e microcepa aos 21 dias do 2
o
corte..................................................................40
FIGURA 5 – Miniestacas enraizadas de louro-pardo submetidas à aplicação de 0 mg
L
-1
(A) e 1000 mg L
-1
(B) de AIB após 60 dias de cultivo em
telado..................................................................................................................45
x
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................................V
ABSTRACT................................................................................................................VI
1 INTRODUÇÃO GERAL....................................................................................................10
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................12
2.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE...................................................................................................12
2.2 CULTURA DE TECIDOS ......................................................................................................13
2.2.1 Resgate de matrizes...................................................................................................16
2.2.2 Descontaminação .......................................................................................................16
2.2.3 Isolamento....................................................................................................................17
2.2.4 Multiplicação................................................................................................................18
2.2.5 Enraizamento...............................................................................................................21
2.2.6 Meios de cultura..........................................................................................................22
2.2.7 Aclimatização...............................................................................................................22
2.3 MINIESTAQUIA...................................................................................................................23
CAPITULO 1 ESTABELECIMENTO E CRESCIMENTO IN VITRO DE PLÂNTULAS
DE LOURO-PARDO............................................................................................................26
3.1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................27
3.2 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................27
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................................29
3.4 CONCLUSÕES....................................................................................................................35
CAPITULO 2 PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE LOURO-PARDO...........36
4.1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................37
4.2 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................................38
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................................40
4.5 CONCLUSÕES....................................................................................................................46
5 DISCUSSÃO GERAL.......................................................................................................47
6 CONCLUSÃO GERAL .....................................................................................................49
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................50
1 INTRODUÇÃO GERAL
O desenvolvimento da economia sempre pressionou a ocupação das florestas
para a produção de alimentos e pelo retorno econômico da madeira. A demanda por
madeira no Brasil é estimada em valores superiores a 350 milhões de metros
cúbicos, enquanto que a produção de florestas plantadas tem alcançado a produção
de aproximadamente 90 milhões. Portanto, há um permanente déficit suprido por
matas nativas (Ferreira e Galvão, 2000).
O maior desafio do setor florestal é justamente atender à demanda por
produtos florestais, mantendo as áreas e conservando a qualidade das florestas
nativas (Ferreira e Galvão, 2000). A conservação da biodiversidade e a manutenção
das florestas devem ser efetuadas pela importância econômica, ecológica,
ambiental, social e até mesmo estética. Os biomas naturais têm sido imensamente
suprimidos pela ação antrópica, sendo o principal causador dos distúrbios ecológicos
e demográficos nas diferentes espécies de seres vivos (Resende e Mauro, 2003).
A ampliação imediata de investimentos em plantios comerciais se justifica
pela demanda por produtos madeireiros de qualidade. O uso de espécies exóticas,
de rápido crescimento, não atende à demanda por madeira nobre (Carvalho, 2000),
o que exige a instalação de bosques comerciais com espécies nativas, dependente
da disponibilidade de mudas de alta qualidade genética e fisiológica (Carvalho,
2003). Os plantios comerciais de espécies nativas têm sido feitos com mudas
produzidas a partir de sementes, que resultam em povoamentos heterogêneos e
dificultam o manejo das árvores. Portanto, o melhoramento genético de espécies
nativas é essencial, pois é improvável a existência de genótipos de alta qualidade
genética que possam simplesmente serem propagados (Clement, 2001).
Cordia trichotoma (Vell.) Arriba ex steudel é um representante da flora
brasileira bastante apreciado e procurado desde o início da colonização. A madeira
tem grande aceitabilidade na construção de móveis e em acabamentos internos de
construções e embarcações. Por isso, o louro-pardo vem sendo intensamente
explorado em matas remanescentes. A espécie tem grande importância biológica,
social e econômica para a agrosilvicultura e sistemas silvipastoris, uma vez que a
árvore não apresenta competição sobre os campos naturais nem sobre as áreas
cultivadas (Reitz et al., 1988; Scheeren, 2002).
11
A cultura de tecidos é uma pode ser aplicada através da micropropagação,
conservação de germoplasma e na seleção de clones de espécies como o louro-
pardo (Mantovani e Franco, 1998). A micropropagação permite um trabalho de forma
contínua ao longo do ano, o que agiliza a propagação comparado com métodos
convencionais (Grattapaglia e Machado, 1998). Portanto, o uso da cultura de tecidos
para a multiplicação de genótipos superiores de louro-pardo, possibilitaria auxiliar
futuros programas de melhoramento da espécie e agilizaria a instalação de bosques
comerciais homogêneos, com alta qualidade genética.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolos de estabelecimento in
vitro e de propagação de C. trichotoma (louro-pardo).
12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Descrição da espécie
Cordia trichotoma (Boraginaceae), tem ocorrência natural nas áreas tropicais
e subtropicais do Brasil, Argentina e Paraguai (Carvalho, 1988). O gênero Cordia é
uma homenagem ao médico alemão Euricius Cordus (1486-1535) e seu filho
Valerius Cordus (1515-1544) (Marchiori, 2004), e o epíteto específico trichotoma
alude ao estigma e significa “que está dividido em três partes” (Smith, 1970). É uma
árvore do tipo caducifólia, comumente atingindo alturas entre 10-20 m e diâmetros à
altura do peito de até 60 cm. Apresenta ramificação monopoidal quando jovem e
dicotômica ou simpódica quando adulta. A copa pode chegar até 8 m de diâmetro,
apresentando-se alongada, densifoliada e arredondada. Sua característica de formar
tronco reto e fuste bem definido de 6 a 15 m de altura torna uma espécie de
interesse na floresta (Carvalho, 2003). Quanto ao aspecto ecológico sucessional,
trata-se de espécie secundária inicial, com tendência pioneira, sendo bastante
comum na vegetação secundária, no estágio de capoeira e inclusive em capoeirões
(Carvalho, 1994).
As folhas são do tipo polimorfas e apresentam formas extremamente variáveis
na densidade do indumento (Rizzini, 1971). As flores são marcescentes, inicialmente
brancas passando a pardas, com até 2 cm de comprimento. Formam panículas
densamente ramificadas com cerca de 100 flores. O fruto é uma núcula de
pericarpo, não muito espesso e seco, com cálice e corola persistente e marcescente,
de coloração castanha, facilitando a identificação da espécie (Barroso et al., 1999;
Carvalho, 2003).
A espécie apresenta florescimento entre os meses de fevereiro e abril e
maturação dos frutos entre maio e julho. A semente possui dormência tegumentar e
comportamento recalcitrante ao armazenamento, podendo perder a viabilidade já
aos 60 dias. A germinação é do tipo epígea, geralmente irregular e com percentuais
que variam entre 14% e 80% (Carvalho, 2003; Mendonça et al., 2001). A dispersão
do fruto com a semente é do tipo anemocórica, ou seja, promovida pela ação do
vento (Carvalho, 2003; 2004).
13
O louro-pardo é uma espécie comum nas florestas do Alto Uruguai, com
distribuição bastante uniforme e freqüente nas matas mais abertas e capões dos
campos da depressão central do estado do Rio Grande do Sul. A espécie ocorre até
o Ceará, na floresta pluvial atlântica semidecídua, e no cerrado, com menor
freqüência (Lorenzi, 1995). É uma das árvores mais promissoras para
reflorestamentos. Bosques de louro-pardo quando bem manejados atingem
incremento anual acima de 20 m³ há
-1
ano
-1
. A espécie é pioneira, apresentando um
rápido crescimento inicial, com boa capacidade de regeneração em terrenos
anteriormente utilizados para agricultura. Em rotação de 30 a 40 anos, no estado do
Rio Grande do Sul, fornecem excelente madeira para tabuado (Reitz et al, 1988). Em
solos de médio-alta fertilidade e associado a bons tratos silviculturais, é possível
uma rotação inicial já aos 15 anos (Carvalho, 2003).
A madeira, moderadamente pesada e dura, é facilmente trabalhada inclusive
para móveis vergados, sendo ainda de boa durabilidade em ambientes secos
(Lorenzi, 1992).
2.2. Cultura de Tecidos
A cultura de tecidos se define como sendo o cultivo de órgãos e tecidos (ou
células) de vegetais em meio nutritivo, num ambiente asséptico e controlado (Paiva
e Gomes, 1995). Envolve um conjunto de técnicas que, em geral, um explante é
cultivado em meio nutritivo de concentração conhecida ou não (Sousa et al, 2006).
A importância da cultura de tecidos se deve aos ganhos obtidos com a
silvicultura moderna e no enorme potencial de utilização em espécies pouco
estudadas (Gamborg, 2002). As principais vantagens oferecidas pela cultura de
tecidos na propagação vegetal são: a) um pequeno número de explantes pode ser
utilizado para regenerar milhares de plantas; b) genótipos idênticos à planta matriz
são produzidos; c) curto espaço de tempo requerido para produção de grandes
quantidades de mudas; d) espaço físico mínimo em comparação aos métodos
convencionais de propagação; e) eliminação de contaminantes (Sousa et al, 2006);
e f) propagação contínua, independente de fatores ambientais e inerentes às
diferentes épocas do ano (Grattapaglia e Machado, 1998).
14
Diversas técnicas de cultura de tecidos (Tabela 1) têm aplicações no
melhoramento florestal e na propagação de espécies lenhosas cuja produção de
mudas apresenta algum tipo de limitação. Um dos maiores benefícios é a
possibilidade de identificar e fixar componentes aditivos e não-aditivos da
variabilidade genética por meio da propagação clonal (George e Sherrington, 1984).
Conservação e avaliação de germoplasma
– Conservação de germoplasma in vitro
– Multiplicação de genótipos para analise
Aumento de variabilidade genética
– Intercâmbio de germoplasma
– Obtenção de variantes somaclonais
– Obtenção de transformantes através da engenharia genética
Aumento do ganho genético em programas de melhoramento
– Germinação de sementes e cultura de frutos in vitro
– Clonagem de genótipos para teste de capacidade de combinação
– Cultura de anteras e micrósporos para obtenção de haplóides
– Limpeza clonal
Introgressão de genes de interesse para espécies alvo através da quebra
de barreiras de incompatibilidade genética
– Polinização in vitro
– Cultura de embriões
– Fusão de protoplastos
– Haploidização por cultura de anteras
Quadro 1 – Aplicação da cultura de tecidos no melhoramento de plantas
Fonte: adaptado de Ferreira et al. (1998).
Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a micropropagação tem sido a de
maior importância para o melhoramento florestal. O principal objetivo é acelerar a
produção e aumentar o número de genótipos selecionados (Damião Filho, 1995).
Além disso, a micropropagação possibilita manter genótipos híbridos, mutações ou
variantes selecionados e propagar mudas de alta qualidade fitossanitária (Lima,
2000).
15
Para a micropropagação, o primeiro aspecto importante é a seleção da planta
matriz (Damião Filho, 1995), seguido de três fases importantes (Murashige, 1974).
Fase I: seleção de explantes, desinfestação e cultivo em meio nutritivo, sob
condições assépticas. Fase II: multiplicação dos propágulos por meio de sucessivos
subscultivos, em meio de cultura apropriado. Fase III: transferência das partes
aéreas produzidas para meio de cultura com reguladores de crescimento indutores
de raízes e a posterior aclimatização em condições ex vitro. Essas fases não
precisam necessariamente serem seguidas e são adaptadas para cada espécie. Em
alguns casos são também necessárias aplicações de tratamentos químicos na
planta matriz antes da retirada dos explantes, caracterizando uma fase 0
(Grattapaglia e Machado, 1998).
Os processos morfogenéticos, divisão e diferenciação celular integrados,
podem ocorrer em diferentes rotas: calogênese, organogênese e embriogênese
somática. São processos que podem ser manipulados in vitro, na aplicação de
diferentes técnicas de cultura de tecidos (Mantovani e Franco, 1998). O controle
desses processos é interno, no próprio explante, ou externo, no meio de cultura,
pela adição de reguladores de crescimento, e modificando a temperatura e
luminosidade (Thorpe, 1980).
Os explantes mais indicados para a organogênese direta são as gemas
axiliares e ápices caulinares, pois possuem determinação para o crescimento
vegetativo e, satisfeitas as necessidades nutricionais, irão se desenvolver
naturalmente em plantas inteiras. Contudo espécies lenhosas apresentam o
problema da contaminação, por estarem longos períodos expostos às intempéries
(Bonga, 1982) e assim sujeitos à infecção interna e externa por microorganismos
difíceis de eliminar (Melo et al., 1998). Neste caso uso de sementes, facilita a
obtenção de material vegetal asséptico através da germinação in vitro para
desenvolver um protocolo de propagação in vitro em espécies lenhosas (Noleto e
Silveira, 2004; Andrade et al., 2000). O conhecimento de todos os processos é
fundamental para controlar a organogênese in vitro e possibilitar a micropropagação
de plantas selecionadas (Grattapaglia e Machado, 1998).
16
2.2.1 Resgate de matrizes
A cultura de tecidos tem apresentado muitas dificuldades em espécies
florestais (Higashi et al, 2000). Para contornar esse problema no uso de material de
plantas adultas selecionadas, deve-se buscar material fisiologicamente juvenil ou
com rejuvenescimento da habilidade de desenvolver novas raízes (Hartney, 1980),
denominada de resgate de matrizes (Alfenas et al, 2004). O rejuvenescimento do
material adulto para o estágio juvenil pode ser alcançado pela poda drástica, de
aplicações de citocininas e herbicidas, da propagação seriada via enxertia, da
propagação seriada via estaquia e da micropropagação (Higashi, 2000). O
rejuvenescimento de eucalipto (Eucalyptus spp.) tem sido feito por meio da poda
drástica (derrubada) das árvores, seguido da coleta de explantes aos 50-60 dias
após. Para a micropropagação, o uso de técnicas de enxertia ou estaquia é outra
opção para produção de explantes no viveiro, reduzindo a contaminação dos
explantes (Alfenas et al, 2004).
2.2.2 Descontaminação
Outra dificuldade, nas plantas lenhosas para o estabelecimento in vitro, é a
contaminação externa e/ou interna dos tecidos. São várias as substâncias de ação
germicida que podem ser utilizadas na desinfestação de explantes. Os mais comuns
são o etanol, compostos a base de cloro (hipoclorito de sódio ou de cálcio), cloreto
de mercúrio, ácido clorídrico, cloreto de benzalcônio e peróxido de hidrogênio
(Grattapaglia e Machado, 1998). Na desinfestação de segmentos nodais de louro-
pardo, a imersão em álcool 70% por 30 segundos seguido de imersão em hipoclorito
de sódio 10% por 5 min. tem apresentado bons resultados (Mantovani et al, 2001).
A enxertia e estaquia podem auxiliar a descontaminação. Os enxertos,
provenientes das matrizes selecionadas, permanecem em ambiente protegido, no
qual, além de ficarem menos expostos aos agentes contaminantes, recebem
aplicações periódicas de fungicidas, bactericidas e nutrientes (Alfenas et al, 2004). É
em conseqüência da contaminação que muitos trabalhos de cultura de tecidos são
17
iniciados partindo de plântulas assépticas de origem seminal (Andrade et al., 2000).
Nesse caso, é necessária uma eficiente desinfestação das sementes antes da
inoculação em meio de cultura. Em eucalipto, os melhores resultados foram obtidos
com a imersão em água estéril por 18 h, seguido de imersão em solução fungicida
(Captan 1,5 g L
-1
) por 15 min., imersão em álcool 70% por 1 min. e em solução de
hipoclorito de sódio (NaOCl) por 30 min. (Pontes, 1999).
2.2.3 Isolamento
Após a descontaminação, o isolamento é sempre realizado em câmara de
fluxo laminar. A manipulação do explante exige perícia e cuidado, pois determina a
sobrevivência. Uma rápida excisão do explante, inoculação no meio de cultura e
imediata vedação do frasco são fundamentais para evitar a desidratação (Hu e
Wang, 1983). Outra dificuldade é o escurecimento dos explantes, pela oxidação,
comum em explantes de espécies lenhosas (Grattapaglia e Machado, 1998).
Fenômeno resultante do acumulo de polifenóis e produtos da oxidação, como a
melanina, suberina, lignina e outros; que modificam a composição do meio de cultura
e alteram a absorção metabólicos (Andrade et al., 2000).
A lavagem em água corrente antes da desinfestação pode reduzir este
problema, pela lixiviação dos compostos fenólicos (Sato et al., 2001; Grattapaglia e
Machado, 1998), contudo nem sempre traz os resultados esperados, como para o
isolamento de Celtis sp. a lavagem de explantes não é necessária para um efetivo
controle da oxidação (Sato et al., 2001). A imersão prolongada, realização do
preparo (excisão) do explante em água (Bonga, 1982) ou a adição de antioxidantes
ao meio de cultura após a autoclavagem também reduzem a oxidação (Gupta,
1986). Substâncias como o ácido cítrico, ácido ascórbico, peróxido de hidrogênio,
polyvinilpirrolidone (PVP) e carvão ativado são comumente utilizados com este
objetivo. O tipo e a concentração dos mesmos variam para cada espécie e
determinam a sua eficiência (Grattapaglia e Machado, 1998).
18
2.2.4 Multiplicação
A multiplicação é a fase mais longa da micropropagação e visa a produzir o
maior número possível de plantas uniformes e de alta qualidade (Grattapaglia e
Machado, 1998). São diversos os fatores influentes na morfogênese, dos quais os
reguladores de crescimento são considerados de extrema importância (Ponte, 1999).
Os mesmos na concentração e combinação adequadas no meio de cultura são
determinantes para o desenvolvimento vegetal. Citocininas e auxinas são os
principais responsáveis pela indução e multiplicação de gemas na maioria das
espécies de vegetais, com variações nas concentrações exógenas necessárias
(George e Sherrington, 1984).
As auxinas são sintetizadas, principalmente, em tecidos meristemáticos de
órgãos aéreos dos vegetais e são responsáveis pela expansão celular, incorporação
de materiais na parede celular e aumento da elasticidade. Este ultimo permite o
influxo de água na célula, resultando em aumento de pressão sobre a parede
celular, o que provoca a elongação. É também da auxina o fenômeno de
fototropismo nos vegetais, movimento da planta em resposta a um gradiente de luz;
a luminosidade unilateral provoca a migração da auxina para regiões sombreadas,
induzindo assim maior elongação e conseqüente inclinação para o lado iluminado.
As auxinas estão presentes ainda nos fenômenos de geotropismo, dominância
apical, iniciação e alongação caulinar, produção de etileno, crescimento de frutos
abscisão, partenocarpia e partição de assimilidados, e ainda tem ação herbicida em
concentrações altas (Vieira e Monteiro, 2002). Uma das mais rápidas respostas
hormonais observadas em plantas é a indução do crescimento provocada por
auxinas, em especial em secções de coleóptile e de caules de plantas (Santos e
Domingues, 2002). Existem diversas auxinas conhecidas, apenas duas naturais, o
ácido indolacético (AIA), bastante utilizado na cultura de tecidos, e o
indolacetonitrilo, pouco utilizado. As sintéticas são mais comuns, dentre elas temos o
ácido indolbutírico (AIB), 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e ácido nafataleno acético
(ANA) os mais aplicados em cultivos in vitro. Contudo as auxinas em solução
aquosa, apresentam severa degradação devido a uma série de agentes, como
ácidos, radiações ultravioletas e ionizantes, e inclusive pela luz visível quando na
presença de pigmentos sensíveis. O AIA tem a maior sensibilidade a degradação,
19
dentre as auxinas conhecidas, a qual deve-se a ação do oxigênio e peróxido em
presença de um redutor (Vieira e Monteiro, 2002; Neto e Tavares, 2002).
Na fase de multiplicação a concentração da auxina normalmente é sempre
menor do que a da citocinina, para não promover a formação de calo na base do
explante. ANA e AIB normalmente são utilizados em concentrações abaixo de 0,5
mg L
-1
e o AIA, em virtude de sua baixa estabilidade, em concentrações maiores
(Ponte, 1999; Grattapaglia e Machado, 1998).
As citocininas estão presentes sobretudo em regiões meristemáticas e órgãos
em crescimento como nas folhas jovens, sementes, frutos e principalmente no
meristema apical da raiz, sítio de biossíntese desta substância . São essenciais para
a quebra da dominância apical e indução de proliferação de gemas. São promotoras
de crescimento e divisão celular, participando inclusive do alongamento e
diferenciação celular (Vieira e Monteiro, 2002; Hu e Wang, 1983). Há, contudo
efeitos adversos das citocininas quando em quantidades elevadas, toxidez,
entufamento exagerado, formação de roseta (falta de elongamento), má formação
foliar e vitrificação dos explantes (Ponte, 1999; Grattaplaglia e Machado, 1998). Os
efeitos das citocininas nos vegetais são bastante variáveis, em virtude à sua grande
quantidade de metabólicos presentes diversos tipos de tecidos, variando inclusive
entre as diferentes espécies da natureza (Brito e Castro, 2002). A primeira citocinina
isolada foi a cinetina (6-furfurilaminopurina), com grande capacidade promotora de
divisão celular ou citocinese. A zeatina (6-(4-hidroxi-3-trans-metil-2-amino-butenil)
purina) foi a primeira citocinina natural identificada presente em sementes verdes de
milho. As c itocininas sintéticas são as mais conhecidas, como o BA (6-benzilamino
purina), 2iP (6-dimetilamino purina) e PBA (6-(benzilamino)-9-(2-tetrahidronipiranil)-
9H-purina), todas elas ligadas a promoção do crescimento, divisão, alongamento e
diferenciação celular (Vieira e Monteiro, 2002).
Outro fitorregulador passível de utilização na cultura de tecidos é a giberelina
(GA
3
), que promove o crescimento pelo aumento de plasticidade da parede celular.
A aplicação exógena de giberelina pode reverter o processo de nanismo genético,
por promover o aumento do comprimento de entrenós de plantas anãs e devolver a
aparência normal (Vieira e Monteiro, 2002). Cerca de 125 GAs já foram identificadas,
contudo a grande maioria não apresentam atividade biológica propriamente dita; são
precursoras ou metabólicos (Barata et al., 2002).
20
O meio de cultura também pode afetar a taxa de multiplicação, especialmente
a composição dos macronutrientes, como a fonte de nitrogênio utilizada e o balanço
entre íons de nitrato e amônio (Grattapaglia e Machado, 1998). O tipo de agente
solidificante adicionado ao meio, pode levar a diferentes respostas nas culturas in
vitro, devido às diferenças na constituição (Ponte, 1999). O ágar é o composto
gelatinante mais utilizado nos cultivos in vitro, contudo há relatos da presença de
impurezas inibitórias ao desenvolvimento vegetal (Hu e Wang, 1983). Até mesmo
diferentes marcas do produto tem preconizado diferenças no desenvolvimento de
culturas, geradas pelas diferentes propriedades físicas e químicas (Debergh, 1983).
2.2.5 Enraizamento
A indução de raízes adventícias em explantes recém-multiplicados é
extremamente difícil em espécies lenhosas comparado com herbáceas (Ponte, 1999;
Grattapaglia e Machado, 1998). O enraizamento é ainda mais difícil quando o
explante é originado de tecido adulto, em razão da alta especialização das células e
conseqüente baixa capacidade de desdiferenciação (Ponte, 1999; Mantovani e
Franco, 1998). Além disso, tem-se que considerar a presença de inibidores de
enraizamento e a predisposição genética, que varia até mesmo entre clones de uma
mesma espécie (Ponte, 1999; Hartney, 1980).
A capacidade de enraizamento de explantes de material adulto pode ser
recuperada em sucessivos subcultivos in vitro na fase de multiplicação,
procedimento rejuvenescendo o material vegetal (Gupta et al., 1981). O processo de
formação de raízes in vitro divide-se em indução, iniciação e alongamento de raízes.
Nas duas primeiras fases o uso de auxina para indução tem apresentado sucesso,
contudo na terceira fase a presença da mesma pode inibir o crescimento radicular.
São diversas as auxinas que podem ser utilizadas na indução do enraizamento. O
AIB, ANA e AIA tem sido os mais utilizados cujas concentrações mais comuns estão
na faixa de 0,1 a 1,0 mg L
-1
(Grattapaglia e Machado, 1998).
A simples diluição do meio de cultura pode aumentar a eficiência do processo
de enraizamento, pois altas concentrações de sais tendem a inibir o enraizamento.
21
Porém, meio de cultura muito diluído em macronutrientes pode levar a deficiência
mineral na parte aérea (Grattapaglia e Machado, 1998).
2.2.6 Meios de cultura
As diferentes etapas da micropropagação requerem diferentes condições
nutricionais e um adequado balanço hormonal. Os meios de cultura se baseiam nas
exigências nutricionais das plantas, sendo adequados às necessidades de cada
espécie e etapas in vitro (Santos-
Serejo et al., 2006). Meios de cultura
não-adequados podem causar sintomas de deficiência mineral e até a morte dos
propágulos (Monteiro et al., 2000). A presença de hormônios de crescimento no
meio de cultivo é normalmente importante nas fases de multiplicação e
enraizamento.
Existe uma grande variedade de meios de cultura adaptados para diversas
espécies, diferindo sobretudo na constituição e concentração de nutrientes
(Mantovani e Franco, 1998). Os meios comumente usados com espécies florestais
são o MS (Murashige e Skoog, 1962), originalmente desenvolvido para Nicotiana
tabacum, e o WPM (Woody Plant Médium), desenvolvido especialmente para
espécies lenhosas por Lloyd e McCown (1981) (Quadro 02).
Os meios básicos podem sofrer modificações visando atender as
necessidades nutricionais para cada fase da micropropagação. É freqüente a
utilização do mesmo meio básico para a fase de isolamento e multiplicação,
constituído-se de Macro e micronutrientes, vitaminas, inositol, fonte de açúcar e
outros compostos. A variação mais freqüente para a fase de multiplicação relaciona-
se à composição dos macronutrientes. A fonte de nitrogênio e o balanço entre os
íons nitrato e amônio tem feito jus à aplicação. Já na fase de enraizamento, a
diluição da composição básica dos meios de cultura tem diversas vezes possibilitado
melhores resultados. A diluição de 1/2, 1/3 e 1/4 da concentração salina do meio
MS, por exemplo, tem sido bastante freqüente na literatura (Grattapaglia e Machado,
1998).
22
Tabela 01: Composição dos meios de cultura WPM (Lloyd e McCown, 1981) e MS
(Murashige e Skoog, 1962)
Componentes WPM (mg L
-1
) MS (mg L
-1
)
Macronutrientes
Nitrato de Cálcio - Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O 556,000 -
Nitrato de Amônio – NH
4
NO
3
400,000 1650,000
Nitrato de Potássio - KNO
3
- 1900,000
Cloreto de Cálcio – CaCl
2
.2H
2
O 96,000 440,000
Sulfato de Magnésio – MgSO
4
.7H
2
O 370,000 370,000
Fosfato de potássio – KH
2
PO
4
170,000 170,000
Sulfato de Potássio - K
2
SO
4
990,000 -
Micronutrientes
Sulfato de Manganês – MnSO
4
.4H
2
O 22,300 22,300
Sulfato de Zinco – ZnSO
4
.7H
2
O 8,600 8,600
Ácido Bórico – H
3
BO
3
6,200 6,200
Iodeto de Potássio – KI - 0,830
Molibdato de Sódio - Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,250 0,250
Sulfato de Cobre – CuSO
4
.5H
2
O 0,250 0,025
Cloreto de Cobalto – CoCl
2
.6H
2
O - 0,025
Ferro_EDTA
Na
2
EDTA 37,250 37,250
Sulfato de Ferro – FeSO
4
.7H
2
O 27,850 27,850
Vitaminas
Tiamina-Hcl 1,000 0,100
Piridoxina-Hcl 0,500 0,500
Ácido Nicotínico 0,500 0,500
Glicina 2,000 2,000
Mio-inositol 100,000 100,000
Fonte: adaptado de Mantovani e Franco (1998).
2.2.7 Aclimatização
Essa é uma etapa crítica da produção de mudas, pois um grande número de
plantas pode ser perdido por falta de aclimatização. Durante a aclimatização, as
plantas passam de uma condição heterotrófica e de reduzida transpiração para a
autotrófica que demanda altas taxas de transpiração. Além disso, no ambiente ex
vitro há menor disponibilidade de nutrientes e maior exposição a organismos
patogênicos (Grattapaglia e Machado, 1998).
23
Em alguns casos, tem sido possível aclimatizar plantas que não passaram
pelo enraizamento in vitro, como demonstrado em eucalipto por Xavier e Comério
(1997). A aclimatização pode ser dividida em diferentes 3 fases, a exemplo da
metodologia utilizada para Eucalyptus spp. Enraizamento: 20 a 30 dias em casa de
vegetação sob nevoeiro intermitente (alta umidade relativa) e sombreamento mais 5
a 10 dias à sombra antes de exposição em codições de céu aberto. Aclimatização à
sombra: nesta fase a intensidade luminosa é de aproximadamente 50% da obtida
em céu aberto, por meio do uso de sombrite. A irrigação normalmente se faz por
meio de microaspersores. Aclimatização a céu aberto: nesta fase deve-se aumentar
o espaçamento entre as mudas, para inibir a proliferação de doenças. Num primeiro
momento pretende-se o crescimento das mudas, durante 20 a 30 dias. O que se
obtém com irrigação por miniaspersores conjugado com periódicas fertirrigações. No
final da aclimatização a céu aberto obtém-se a rustificação da muda para que esta
resista melhor a condição adversa do campo, durante 15 a 20 dias, podendo ter
fertirrigação conjugada a irrigação por miniaspersores (Alfenas et al., 2004). Contudo
devido a carência de pesquisas, a experiência individual, a familiarização com a
cultura e o material disponível tem determinado o sucesso da aclimatização de
plantas micropropagadas para a maioria das espécies (Grattapaglia e machado,
1998).
2.3 Miniestaquia
A técnica de miniestaquia é uma versão da estaquia convencional, na qual
variam o tamanho e a origem da estaca. A miniestaquia possibilita a obtenção de
mudas com base em qualquer uma das técnicas de propagação. Miniestacas são
obtidas tomando-se por base minicepas e enraizadas em condições específicas. Em
eucalipto foi possível a produção entre 10 e 12 mil mudas m
-2
ano
-1
por meio da
miniestaquia (Mafia et al., 2005; Alfenas et al., 2004). Dois fatores são críticos para
maximizar a produtividade de miniestacas, a produção de brotos e a capacidade de
enraizamento das miniestacas em ambiente de viveiro (Mafia et al., 2005).
Em geral a técnica de miniestaquia dispensa a utilização de fitoregulador ou
são aplicados em baixas concentrações. Os propágulos vegetativos são de cerca de
24
4 a 8 cm de comprimento, de maneira que contenha um par ou dois pares de folhas
por miniestaca, de acordo com a posição de coleta. Para a cultura do Eucalyptus
spp. miniestacas apicais tendem a enraizar melhor, contudo são mais sensíveis a
quaisquer estresses bióticos e abióticos (Alfenas et al., 2004, Xavier et al., 2003;
Titon et al., 2003).
Em pesquisas e quando não se objetiva formação de florestas produtivas,
recomenda-se a coleta de propágulos de plantas novas, oriundas de sementes.
Desta forma facilita a obtenção de variabilidade genética, necessária para
comprovação técnica para a espécie estudada ou recuperada, e é maior e facilidade
de coleta das brotações com menor custo (Wendling, 2005).
Conforme Alfenas et al. (2004), a miniestaquia pode ser dividida em cinco
fases:
- Produção de brotos – tratos culturais da minicepa;
- Enaraizamento;
- Aclimatação à sombra;
- Crescimento;
- Rustificação.
Os procedimentos de enraizamento até a rustificação da muda corresponde
ao processo de aclimatização de mudas micropropagadas, descrito anterioremente.
Para a formação da minicepa, seja ela uma muda de semente, de estaca,
microestaca ou mesmo miniestaca, quando apresentam uma altura de 15 cm são
podadas a cerca de 10 cm de sua base, para estimular a formação de brotações
laterais. O conjunto de minicepas ou minitouças formam o que denomina-se
minijardim clonal ou matrizeiro (Wendling et al., 2005; Alfenas et al., 2004).
Existem diversas formas de condução da minicepa, em diferentes sistemas:
sacos plásticos, vasos e tubetes (Wendling et al., 2005) e canaletão (Alfenas et al.,
2004). A adoção de fertirrigação é necessária para prover a minicepa dos nutrientes
necessários ao seu bom desenvolvimento. Sendo a forma ideal o sistema de
gotejamento na base das minicepas ou então inundação temporária ou subirrigação
capilar em tanques de hidroponia (Alfenas et al., 2004). O recomendado ainda é que
se faça este processo de fertirrigação com maior freqüência e menor quantidade por
aplicação, resultando no melhor aproveitamento dos nutrientes pelas plantas
(Wendling et al., 2005).
25
A produtividade das miniestacas varia de acordo com a genética do material e
com o sistemas de minijardim. Para manter a miniestaca produtiva e seu sistema
radicular ativo, a coleta de brotações tem de ser contínua (cada 4 a 10 dias,
dependendo das condições climáticas relativas a estção do ano) e evitando a poda
drástica da mesma. É necessário ainda dispor de um sistema de cobertura, para
evitar o aparecimento de doenças e o encharcamento excessivo do substrato, com
conseqüente lixiviação dos nutrientes. É preferível que o mesmo seja do tipo retrátil,
perminto assim o seu uso somente quando realmente necessário (Alfenas et al.,
2004).
Outro cuidado necessário ao minijardim é o controle de plantas invasoras, as
quais devem ser erradicadas, pois são competidores agressivos por água e
nutrientes, prejudicando a formação de brotações nas minicepas (Wendling et. al.,
2005; Alfenas et al., 2004).
3 CAPÍTULO 1
ESTABELECIMENTO E CRESCIMENTO IN VITRO DE PLÂNTULAS
DE LOURO-PARDO
RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram desenvolver um protocolo de estabelecimento e
quantificar o crescimento in vitro de plântulas de louro-pardo (Cordia trichotoma) oriundas de
sementes para a produção de explantes assépticos. Para o estabelecimento in vitro,
estudou-se o efeito do tempo de embebição e de diferentes protocolos de desinfestação das
sementes. A embebiçao se fez em água destilada e autoclavada por 0, 24, 48, 72, 96 e 120
h, seguindo-se a desinfestação prévia em NaOCl 5% por 30 min, retirada do tegumento e
imersão em solução de álcool etílico 70% por 30 s. Para a desinfestação, testou-se a
imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2 e 5%, por 0, 5, 10, 15 e 20 min. Foram
avaliadas as porcentagens de desinfestação e germinação e o tempo médio de germinação.
O crescimento de explantes de louro-pardo foi quantificado nos meios de cultura 1/2MS e
WPM, pelo número de folhas e raízes primárias emitidas e comprimento da parte aérea e
das raízes primárias, aos 7, 14, 21 e 28 dias após a inoculação. A embebição das sementes
de louro-pardo por até 24 h favorece a retirada do tegumento sem afetar a desinfestação e
germinação. A imersão das sementes em NaOCl 5% por 30 min seguida da retirada do
tegumento e a imersão das sementes sem tegumento em solução de álcool etílico 70% por
30 s foram suficientes para a produção in vitro de plântulas assépticas. Plântulas de louro-
pardo apresentaram crescimento satisfatório em meio de cultura WPM.
ABSTRACT
The objectives of this work were to develop an in vitro establishment protocol and to
quantify growth of louro-pardo (Cordia trichotoma) seedlings to produce asseptic explants.
Seed imbibition and disinfection were studied for in vitro seedling establishment. Seeds were
imbibed in distilled and autoclaved water for 0, 24, 48, 72, 96 and 120 h and disinfected in a
sodium hypochlorite solution of 5% for 30 min before tegument excision. Seeds without
tegument were submerged in an alcohol solution of 70% for 30 s. Percentages of disinfection
and germination and mean germination time were evaluated. Seedling growth was quantified
in 1/2MS and WPM culture mediums at 7, 14, 21 and 28 days after inoculation. Number of
emerged leaves and primary roots and length of shoots and primary roots were evaluated.
Imbibition of louro-pardo seeds until 24 hours made easy tegument excision without affecting
disinfection and germination. Seed immersion in a hypochlorite solution of 5% for 30 min,
followed by tegument excision and immersion in a 70% alcohol solution for 30 s are enough
for an acceptable production of in vitro aseptic seedlings. Louro-pardo seedlings grow
satisfactorily in a WPM culture medium without growth regulators.
27
3.1 Introdução
A crescente demanda por madeira vem aumentando a pressão sobre
espécies florestais remanescentes. Os grandes plantios comerciais, constituídos
essencialmente de espécies exóticas de rápido crescimento, têm grande importância
na moderação da exploração e manutenção das espécies nativas (Ferreira e Galvão,
2000). Contudo, a produção de tais plantios não atende à demanda, especialmente
da industria de madeiras nobres, o que justifica investimentos em pesquisa e
produção comercial de espécies nativas.
Cordia trichotoma (Boraginaceae) é uma espécie, conhecida popularmente
por louro-pardo, bastante promissora para o emprego em reflorestamentos puros ou
mistos, porém apresenta alta variabilD -0o Tc -0.alore3naceae.exmiscentee
28
Federal de Santa Maria, RS, entre setembro de 2005 e março de 2006. As
sementes, coletadas no município de Cachoeira do Sul, RS, foram fornecidas pelo
Banco de Sementes da Associação de Fumicultores do Brasil (AFUBRA). O lote de
sementes foi recebido em agosto de 2005, com teor de umidade de 8,2% .
Para o estabelecimento in vitro, foram realizados experimentos de embebição e
desinfestação das sementes. Para a embebição, as sementes foram imersas em
água destilada por 0, 24, 48, 72, 96 ou 120 h e, posteriormente, em uma solução
contendo 5% de hipoclorito de sódio (NaOCl) por 30 min (pré-desinfestação). Após a
retirada do tegumento, as sementes foram imersas em solução contendo 70% de
álcool etílico e três gotas de tween 20 por 100 mL de solução por 30 s e após,
inoculadas em meio de semeadura, 30 g de sacarose por litro de água destilada,
solidificado com 7 g L
-1
de Agar e pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem.
Entre cada procedimento, as sementes foram lavadas três vezes em água destilada
e autoclavada.
Para a desinfestação de sementes de Cordia trichotoma, realizou-se dois
testes preliminares. No primeiro as sementes foram escarificadas por 3 segundos
(Carvalho, 2004), submetidas a embebição por 24 horas e então em câmara de fluxo
laminar imersas em solução contendo 70% de álcool etílico e três gotas de tween 20
por 100 mL de solução por 40 s, seguido de imersão em NaOCl 2% ou 5% por 5 ou
15 min e inoculação em meio de semeadura, constituído os tratamentos mais uma
testemunha sem desinfestação e somente com desinfestação em álcool 70% por 40
s. No segundo teste preliminar as sementes, sem serem escarificadas, foram
submetidas a embebição por 24 hs seguindo-se em câmara de fluxo a retirada do
tegumento e seguinte desinfestação com imersão em álcool 70% por 30 s seguido
de imersão em NaOCl 1% ou 4% por 5 min e inoculação em meio de semeadura.
No terceiro teste de desinfestação as sementes foram imersas em água
destilada por 12 h e, posteriormente, em uma solução contendo 5% de NaOCl por 30
min (pré-desinfestação). Após a retirada do tegumento, as sementes foram imersas
em solução contendo 70% de álcool etílico e três gotas de tween 20 por 100 mL de
solução durante 30 s. Em seguida foram aplicados os tratamentos: imersão das
sementes sem tegumento em solução contendo 2% ou 5% de NaOCl por 0, 5, 10, 15
ou 20 min e inoculadas em meio de semeadura. Entre cada procedimento, as
sementes foram lavadas três vezes em água destilada e autoclavada.
29
Para todos os testes, as unidades experimentais foram expostas 7 dias em
fotoperíodo negativo, seguido de fotoperíodo de 16 horas, sob intensidade luminosa
média de 20 ?M M
-2
S
-1
obtidas por lâmpadas fluorescentes brancas, na temperatura
de 25º ? 3ºC. Foram avaliadas as porcentagens de desinfestação e germinação em
intervalos de três dias durante um período de 30 dias após a inoculação,
possibilitando o cálculo do tempo médio de germinação (TMG) pela fórmula
?
?
?
?
?
n
n
n
n
n
nn
N
TN
TMG
1
1
em que N é o número de sementes germinadas e T o tempo em dias
(Harrington, 1972). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente
casualizado, com dez e oito repetições para os testes preliminares de desinfestação
respectivamente e seis repetições de cinco sementes no teste de embebição e
terceiro teste de desinfestação.
O crescimento e enraizamento in vitro de propágulos de louro-pardo foram
quantificados em dois meios de cultivo. A parte aérea das plântulas germinadas em
meio de semeadura e com 30 dias após a inoculação das sementes, foi transferida
para o meio MS com metade de sua concentração – 1/2MS (Murashige e Skoog,
1962) ou Woody Plant Medium – WPM (Lloyd e McCown, 1981) na sua formulação
completa, os quais foram acrescidos de 30 g l
-1
de sacarose e 7 g l
-1
de ágar. O pH
foi ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. Foram avaliados o número de folhas,
número de raízes primárias emitidas, comprimento da parte aérea e o comprimento
das raízes primárias aos 7, 14, 21 e 28 dias após a inoculação ao meio de cultivo. O
delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com dez repetições de
quatro propágulos.
Os dados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e as médias
de germinação e desinfestação comparadas por regressão polinomial a 5% de
probabilidade de erro, para o tempo de embebição e pelo teste de tukey a 5% de
probabilidade de erro no teste de desinfestação.
3.3 Resultados e discussão
Nos testes preliminares de desinfestação de sementes observou-se 100% de
contaminação por lêvedo ou bactéria e não foram observadas sementes
30
(germinadas dados não apresentados). Provavelmente em virtude da alta
contaminação que inibiu o processo de germinação. a elevada contaminação, se
deve certamente pela manutenção do tegumento das sementes, fonte de
microorganismos infctantes de difícil erradicação, este resultado demonstrou a
necessidade de retirada da mesma, procedimento que passou a ser adotado nos
demais testes.
A embebição prolongada das sementes de louro-pardo afetou negativamente
a desinfestação e o percentual de germinação in vitro (Figura 1a). Os melhores
resultados foram obtidos com até 24 h de embebição, com porcentagens de
desinfestação e germinação superiores a 85 e 77%, respectivamente aos 30 dias
após a inoculação. O TMG apresentou uma parábola positiva culminando no maior
valor, pior resultado, para 48 h de embebição (Figura 1b). A embebição facilitou a
retirada do tegumento das sementes, onde estão concentrados os microorganismos
que infectam as sementes. No entanto, a embebição prolongada, superior a 24
horas, afetou negativamente a germinação e aumentou a contaminação.
Os resultados deste trabalho concordam com os obtidos por Mendonça et al.
(2001), que observaram porcentagens de 75% em teste de germinação de sementes
de louro-pardo. Neste experimento, foram observadas porcentagens de germinação
superiores (85 a 100%) com embebição de até 24 h e retirada do tegumento, o que
indica alta qualidade fisiológica das sementes utilizadas. A maior contaminação
observada, quando a embebição foi prolongada, se deveu, provavelmente, ao
aumento da permeabilidade das membranas, levando à perda de soluto e
favorecendo a proliferação de contaminantes no meio de cultivo (Bewley e Black,
1994). A embebição de sementes de tamboril-da-mata (Platymiscium pubencens)
em água até 300 min. aumentou proporcionalmente a percentagem de germinação
(Lima e Borges et al., 2002), o que não foi observado neste experimento.
31
32
desinfestação, visando ao estabelecimento in vitro de plântulas de louro-pardo
(Figura 2a).
Tabela 2 – Porcentagens de desinfestação e germinação e tempo médio de
germinação (TMG¹) de sementes de louro-pardo submetidas a pré-desinfestação
(imersão em NaOCl 5% por 30 min), retirada do tegumento, imersão em álcool 70%
por 30 s e diferentes tempos de imersão em NaOCl 2% ou 5%. Santa Maria, RS,
2006
Tempo de imersão
Desinfestação (%)
Germinação (%)
TMG¹ (dias)
Solução de NaOCl a 2%
0
95,0 a
2
90,0 a
20,0
5
90,0 a
100,0 a
20
,0
10
95,0 a
100,0 a
20,9
15
100,0 a
95,0 a
20,0
20
95,0 a
95,0 a
19,6
Média
95,0
96,0
20,1
CV% 9,8
8,5
-
Solução de NaOCl a 5%
0
95,0 a
90,0 a
20,0
5 95,0 a
100,0 a
19,6
10 95,0 a
100,0 a
20,1
15 100,0 a
85,0 a
20,1
20 90,0 a
85,0 a
21,4
Médi
a
95,0
92,0
20,2
CV% 9,8
11,9
-
1
Tempo Médio de Germinação.
2
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
Diversos tratamentos para desinfestação de sementes têm sido utilizados em
espécies florestais. O tratamento de sementes de canafístula (Peltophorum dubium)
com NaOCl 2% e água quente (95º C) promoveu uma assepsia de 95%, resultado
também obtido quando foi utilizado somente água quente (Oliveira et al., 2003).
Sementes de acácia-negra (Acácia mearnsii) tratadas com NaOCl a 10% por 10
min. e álcool 70% por 40 seg. tiveram 100% de assepsia e germinação (Martins-
Corder e Borges Junior, 1999). Em mogno (Swietenia macrophylla), foi detectada
interação entre a concentração de NaOCl e o tempo de imersão, porém não ocorreu
33
diferença significativa entre os resultados obtidos com álcool 70% e NaOCl (Couto
et al., 2004), resultado parecido com o deste trabalho.
O meio WPM proporcionou maior crescimento e enraizamento dos
propágulos de louro-pardo do que o 1/2MS, em todas as variáveis analisadas
(Tabela 3). Já após 14 dias de cultivo, foi observado o crescimento dos explantes
cultivados no meio WPM (Figura 2b). Contrariamente, no meio 1/2MS, nenhum
crescimento foi verificado nesse período. O crescimento observado no meio WPM
aos 14 dias foi similar ao observado nos explantes em meio 1/2MS aos 28 dias de
cultivo (Figura 3). Portanto, o meio WPM proporcionou uma resposta mais rápida
dos propágulos em relação à emissão de folhas e de raízes.
A
B
Figura 2 – Germinação in vitro de sementes de louro-pardo submetidas a 12 h
de embebição em água destilada, retirada do tegumento e imersão em álcool
70% por 30 s e inoculadas em meio de semeadura, 7 g de agar e 30 g de
sacarose por litro de água destilada (A), e plântulas de louro-pardo aos 28 dias
de crescimento em meio WPM na sua formulação completa (B). Santa Maria,
RS. 2006.
Tabela 3 – Comprimento da parte aérea e de raízes adventícias principais, número
de folhas e número de raízes emitidas em propágulos de louro-pardo, aos 28 dias
após a inoculação em meio de cultura ½MS ou WPM. Santa Maria, RS, 2006
Comprimento (cm)
Número
Meios de cultivo
Parte aérea Raízes adventícias
Folhas Raízes
WPM 1,60 a
1
7,37 a
3,06 a 1,56 a
½ MS 0,73 b 1,27 b
0,52 b 1,08 b
Média 1,17 4,32
1.79 1,32
CV% 27,99 28,44
35,16 19,10
1
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
34
0
2
4
6
8
10
Comprimento (cm)
0
1
2
3
4
Número
0
2
4
6
8
10
7 14 21 28
Dias após a inoculação
Comprimento (cm)
0
1
2
3
4
Número
Figura 3 – Comprimento (cm) da parte aérea (¦) e das raízes adventícias
principais (?), número de folhas (?) e raízes (?) emitidas em propágulos de louro-
pardo cultivados em meio WPM (A) ou 1/2MS (B). Santa Maria, RS, 2006.
O meio de cultura além de fornecer os nutrientes necessários, preconiza o
padrão de crescimento das plantas in vitro (Thorpe et al., 1991; Caldas et al., 1998).
Os mesmos são formulados para atender às necessidades da espécie trabalhada
(Mantovani e Franco, 1998). O meio WPM foi originalmente desenvolvido para
plantas lenhosas em geral (Lloyd e McCown, 1981), o qual, na formulação completa,
foi superior ao MS para a fase de isolamento em laboratório do louro-pardo
(Mantovani et al., 2001), concordando com os resultados observados. Embora o
A
B
35
meio MS e suas diversas modificações e diluições tenha apresentado bons
resultados para inúmeras espécies, em espécies lenhosas não se mostra satisfatório
em diversos casos, e composições mais diluídas em macronutrientes tem tido maior
sucesso (Grattapaglia e Machado, 1998). A maior eficiência do meio de cultura WPM
não é surpresa, portanto, elaborado para plantas lenhosas em geral, apresenta uma
proporção e composição salina diferenciada em relação ao MS e maior
disponibilidade da vitamina Tiamina – HCl, a qual apresenta resultados benéficos
para a multiplicação em concentrações superiores à do meio MS (Mantovani e
Franco, 1998; Grattapaglia e Machado, 1998). A fonte de nitrogênio, Nitrato de
amônio (NH
4
NO
3
) e o Nitrato de potássio (KNO
3
), afeta o balanço dos íons nitrato e
amônio. Baixas concentrações do nitrogênio na forma amoniacal contribuem para a
redução da vitrificação dos tecidos vegetais, por exemplo; estimulando o
crescimento in vitro (Grattapaglia e Machado, 1998). No estabelecimento in vitro de
aceloreira (Malpighia emarginata), esta concentração salina NO
3
-
/NH
4
+
teve grande
influência no crescimento e desenvolvimento de brotações, com um melhor
desenpenho de explantes inoculados em meio WPM, comparado ao MS e DKW
(Melo et al., 1999).
3.4 Conclusões
– A embebição das sementes de louro-pardo em água destilada facilita a
retirada do tegumento.
– A embebição das sementes de louro-pardo em água destilada por até 24 h,
imersão da semente em NaOCl 5% por 30 min seguido da retirada do tegumento e a
imersão das sementes sem tegumento em solução de álcool etílico a 70% por 30 s
possibilitam o estabelecimento in vitro de plântulas assépticas de louro-pardo.
– Propágulos de louro-pardo apresentam melhor crescimento em meio de
cultivo WPM, em comparação ao meio 1/2MS.
4 CAPITULO 2
PROPAGAÇÃO IN VITRO E EX VITRO DE LOURO-PARDO
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi de avaliar a eficiência da aplicação de reguladores de
crescimento na propagação in vitro e ex vitro de louro-pardo. Na propagação in vitro
segmentos nodais e ápices caulinares foram obtidos de plântulas de origem seminal com 28
dias de crescimento em meio WPM. Foram testadas a adição ao meio de cultura WPM de 6-
benzilaminopurina (BAP), ácido naftaleno acético (ANA) ou ácido giberélico (GA
3
) nas
concentrações de 0; 0,05; 0,10; 0,15 ou 0,20 mg L
-1
e a combinação de 0 ou 0,05 mg L
-1
de
ANA com 0; 0,10 ou 0,20 mg L
-1
de GA
3
. Foram avaliados o número de folhas e de entrenós
e a altura das plântulas aos 30 dias de cultivo. Visando o aumento da taxa de multiplicação
plântulas de origem seminal, com 28 dias de crescimento em meio WPM, tiveram sua parte
aérea coletada acima ou abaixo da primeira folha verdadeira fornecendo segmentos nodais
e ápices caulinares, mantendo-se o restante como microcepas no meio de cultivo, o qual foi
reidratado com meio WPM líquido. Aos 21 dias após o primeiro e o segundo corte, foram
avaliados o número de brotações adventícias e de entrenós por microcepa. Na propagação
ex vitro miniestacas de 2,5 a 4, 4,01 a 5,5 e 5,51 a 7 cm foram submetidas à aplicação de 0
ou 1000 mg L
-1
de ácido indol butírico (AIB) por 10 s na base. Foram avaliadas as
percentagem de sobrevivência, enraizamento e formação de calos aos 60 dias. A adição
isolada ou combinada de reguladores de crescimento não aumentou a taxa de multiplicação
in vitro. A manutenção de microcepas aumentou a taxa de multiplicação in vitro em até 1,75
vezes. Miniestacas de louro-pardo de 2,5 a 5,5 cm de comprimento apresentaram 95% de
sobrevivência, sem diferir na utilização ou não de AIB, porém não apresentaram
enraizamento.
IN VITRO AND EX VITRO PROPAGATION OF LOURO-PARDO
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the efficiency of growth regulator application in
the in vitro and ex vitro propagation of louro-pardo. Nodal and apical segments were
obtained from plantlets of seminal origin grown in WPM medium for 30 days were used for in
vitro propagation. The addition to the WPM culture medium of 0; 0.05; 0.10; 0.15 or 0.20 mg
L
-1
of 6-benzilaminopurin (BAP), naphthalene acetic acid (NAA) or gibberellic acid (GA
3
) and
the combination of 0 or 0.05 mg L
-1
of NAA with 0; 0.10 or 0.20 mg L
-1
of GA
3
were tested. At
30 days after inoculation, number of internodes and leaves and plantlet height were
evaluated. Plantlets with seminal origin were also excised below or above the first true leaf
and the microstumps maintained in vitro with liquid WPM added to the original medium to
increase multiplication rate. Number of sprouts and internodes per microstump were
evaluated at 21 days after first and second excision. Minicuttings from 2.5 to 4, 4.01 to 5.5
and 5.51 to 7 cm were treated with 0 or 1000 mg L
-1
of indol butyric acid (IBA) by basal
immersion for 10 s to evaluate ex vitro propagation. Survival and rutting percentage and
callus formation were evaluated at 60 days after treatment. The addition of growth regulators
either isolated or combined to the WPM medium did not increase in vitro propagation.
Maintaining microstumps increased the in vitro multiplication rate in 1.75 fold. Minicuttings of
louro-pardo from 2.5 to 5.5 cm showed high survival percentages, but they did not root.
37
4.1 Introdução
O louro-pardo (Cordia trichotoma) é uma espécie de alto potencial comercial
(Reitz et al., 1988), amplamente empregada na fabricação de móveis luxuosos, em
revestimentos decorativos e acabamentos (Lorenzi, 1992). O grande valor comercial
e a apreciabilidade do louro-pardo aumenta a pressão de exploração sobre as matas
nativas remanescentes, o que exige a instalação de povoamentos puros ou mistos.
O louro-pardo é uma espécie pioneira nos bosques que, se estabelecidos com
mudas de alta qualidade, em solos de boa fertilidade e com adequado manejo
silvicultural, é possível obter um primeiro corte já aos 15 anos (Carvalho, 2003) e
fornece madeira para desdobro de excelente qualidade, em rotação entre 30 a 40
anos (Reitz et al, 1988).
A produção de mudas para estabelecimento de novos povoamentos tem sido
feita partindo de sementes, que mantém alta variabilidade genética e resulta em
baixa quantidade e qualidade do produto (Carvalho, 2003). A propagação vegetativa
possibilita a produção de mudas altamente uniformes tomando por base plantas
matrizes selecionadas. Os propágulos vegetativos de plantas arbóreas são
comumente do tipo caulinar lenhosa (estaquia comum) ou caulinar herbácea
(culturas in vitro e miniestaquia) cujos tecidos estão pré-dispostos à formação de
parte aérea, sendo apenas necessária a indução de raízes (Xavier et al., 2003).
A grande dificuldade da propagação vegetativa de espécies florestais é a
baixa capacidade morfogenética (Noleto e Silveira, 2004). Uma das possibilidades é
o rejuvenescimento de indivíduos adultos por meio da cultura de tecidos para facilitar
multiplicação massal ex vitro. Uma possibilidade de multiplicação é a miniestaquia,
que tem proporcionado consideráveis ganhos na produção de mudas florestais, em
razão do aumento da percentagem de enraizamento, a rapidez do processo de
produção das mudas (Titon et al., 2003), a economia de área nos viveiros, a
facilidade de controle e manejo do banco de explantes (Higashi et al., 2002) e do
rejuvenescimento do material vegetal (Wendling e Xavier, 2005). A miniestaquia tem
sido utilizada com sucesso na produção de mudas de eucalipto e na superação de
problemas de enraizamento em clones recalcitrantes (Xavier et al., 2003).
A formação de raízes é um processo anatômico e fisiológico complexo, ligado
a desdiferenciação e ao redirecionamento do desenvolvimento de células vegetais,
graças a sua totipotência. O uso de fitoreguladores em espécies de difícil
38
enraizamento é bastante comum, e são várias as classes de reguladores que
exercem influência sobre esse processo. Sendo as auxinas, citocininas e as
giberelinas os fitoreguladores que mais afetam o enraizamento de estacas. De uma
maneira geral uma alta relação auxina/citocinina favorece a formação radicular, de
modo inverso estimula a fromação de ramos (parte aérea). As giberelinas inibem o
processo de formação de raízes, promovendo crescimento aéreo. Em geral as
técnicas de miniestaquia dispensam o uso de reguladores de crescimento ou o são
utilizados em concentrações bastante reduzidas, devido ao grau de rejuvnescimento
obtido (Alfenas et al., 2004).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da aplicação de reguladores
de crescimento na multiplicação in vitro e ex vitro de louro-pardo e testar a eficiência
da formação de microcepas in vitro sem adição de reguladores.
4.2 Material e métodos
Os experimentos foram conduzidos no Departamento de Fitotecnia, da
Universidade Federal de Santa Maria, RS, entre os meses de maio de 2006 a abril
de 2007. Foram conduzidos experimentos de multiplicação in vitro e ex vitro.
Para a multiplicação in vitro, segmentos nodais e ápices caulinares de 1 a 1,5
cm, foram obtidos de propágulos de origem seminal, crescidos por 28 dias em meio
de cultura WPM (Lloyd e McCown, 1981) acrescido de 7 g L
-1
de Agar e 30 g L
-1
de
sacarose. Testou-se a eficiência da adição de reguladores de crescimento ao meio
de cultivo WPM, acrescido de 30 g L
-1
de sacarose e 7 g L
-1
de agar, com pH
ajustado para 5,8 antes da esterilização. Inicialmente foi testada a adição ao meio
WPM de 6-benzilaminopurina (BAP), ácido naftaleno acético (ANA) ou ácido
giberélico (GA
3
) nas concentrações de 0,05; 0,10; 0,15 ou 0,20 mg L
-1
. Os 12
tratamentos, mais a testemunha, sem adição de reguladores, foram avaliados em
três repetições de um ápice caulinar e um segmento nodal. Também foi testada a
adição de 0; 0,1 ou 0,2 mg L
-1
de GA
3
combinado com 0 ou 0,05 mg L
-1
de ANA.
Foram utilizadas quatro repetições de um ápice caulinar e um segmento nodal. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Foram avaliados
o número de folhas e de entrenós (viável de individualização) e a altura das
plântulas aos 30 dias de cultivo. Os dados de cada tipo de explante foram
39
transformados em uma única média e então submetidos à analise da variância e
comparados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.
Em um terceiro teste de multiplicação in vitro, efetuou-se a coleta da parte
aérea de propágulos aos 28 dias de crescimento em meio de cultivo WPM acrescido
de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado; com cortes
acima ou abaixo da primeira folha verdadeira (Figura 4a), mantendo-se o restante da
plântula no mesmo meio, o qual foi reidratado manualmente, com auxílio de
erlemayer, com cerca de 1 ml de WPM líquido sem carvão ativado. A estes
propágulos mantidos in vitro após o corte denominou-se de microcepas in vitro
(Figura 4b-e). Aos 21 dias após o primeiro e segundo corte (42 dias do primeiro
corte), foram avaliados o número de brotações adventícias por microcepa e de
entrenós por brotação. As brotações foram utilizadas como fonte de novos
explantes. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualisado, com quatro
repetições. As médias foram comparadas pelo teste F a 5% de probabilidade de
erro.
Para a multiplicação ex vitro, miniestacas foram coletadas de mudas de
origem seminal três a quatro meses de idade e 20 a 30 cm de altura, mantidas em
casa de vegetação, sob sombreamento de 50% e irrigação automática por aspersão.
Instalou-se dois testes, no primeiro testou-se a influência da aplicação de AIB nas
concentrações de 0 ou 1000 mg L
-
¹ por 10 s na base das miniestacas. O
delineamento foi o inteiramente casualizado, com trinta repetições. No segundo teste
miniestacas com tamanhos entre 2,50 a 4,0 cm (Tamanho 1); 4,01 a 5,5 cm (Tam. 2)
e 5,51 a 7,00 cm (Tam. 3) também foram submetidas à aplicação basal de AIB nas
concentrações de 0 ou 1000 mg L
-
¹ por 10 s. O experimento foi um fatorial (tamanho
da miniestaca e concentração de AIB) no delineamento inteiramente casualizado,
com seis repetições. Em ambos os testes as miniestacas foram plantadas em
bandejas de 128 alvéolos, contendo substrato Plantmax + vermiculita 1:2. As
bandejas foram mantidas em casa de vegetação, sob sombreamento de 50% e
irrigação por aspersão por 5 min (hora em hora das 11 às 15 h e a cada 2 horas das
7 às 10 h e das 16 às 19 h). Aos 60 dias foram avaliadas as porcentagens de
sobrevivência, enraizamento e formação de calo.
40
a
b
1 cm
A
1 cm
c
d
d
C
B
d
1 cm
D
1 cm
d
E
1 cm
e
c
d
Figura 4 – Propágulo aos 28 dias de crescimento em meio de cultivo WPM
acrescido de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado,
apto ao corte da parte aérea e formação da microcepa (A), microcepa aos 7 e 14
dias do 1
o
corte (B e C), microcepa aos 21 dias do 1
o
corte, apta para o segundo
corte (D) e microcepa aos 21 dias do 2
o
corte (E). a – pontos para corte acima ou abaixo
da 1
a
folha verdadeira, b – 1
a
folha verdadeira, c – 1
o
corte, d – brotações, e – 2
o
corte. Santa
Maria, RS, 2007.
4.3 Resultados e discussão
Na multiplicação in vitro, a adição de reguladores de crescimento ao meio de
cultura WPM mostrou diferenças significativas somente para a altura de plântula
(Tabela 4). Entretanto, o melhor resultado não diferiu estatisticamente da
testemunha. A combinação de 0,20 mg L
-1
de GA
3
com 0,05 mg L
-1
de ANA
promoveu o aumento da emissão de folhas, em relação à testemunha sem
fitoreguladores, sem contudo apresentar diferenças nas demais variáveis (Tabela 5).
O GA
3
tem sido mais freqüentemente utilizado na micropropagação, para
41
promover o alongamento caulinar (Mantovani et al., 2001). A adição de ANA ao meio
de cultura de isolamento e multiplicação visa a acelerar o crescimento da plântula.
(Vieira e Monteiro, 2002). O BAP normalmente proporciona elevadas taxas de
multiplicação (Mantovani e Franco, 1998).
Tabela 4 – Desenvolvimento de explantes de Cordia trichotoma, na fase de
multiplicação, após 30 dias de isolamento em meio WPM acrescido de 0.05, 0.10,
0.15 ou 0.20 mg L
-1
de Ácido 6-indolbutírico (BAP), Ácido nafataleno acético (ANA),
Ácido giberélico (GA
3
) ou sem a adição destes. Santa Maria, RS, 2007
Tratamentos(mg L
-1
) Altura (mm) Folhas (n
o
) Entrenós (n
o
)
GA
3
/0,10
4,00 a* 3,33 a 2,00 a
ANA/0,05
2,83 ab 2,33 a 2,00 a
BAP/0,15
2,00 ab 2,00 a 1,67 a
0
1,66 ab 2,00 a 1,67 a
GA
3
/0,05
1,66 ab 2,33 a 1,33 a
ANA/0,10
1,33 ab 2,00 a 1,33 a
BAP/0,05
1,17 ab 1,33 a 1,33 a
GA
3
/0,20
1,17 ab 2,00 a 1,33 a
GA
3
/0,15
1,00 ab 2,33 a 1,33 a
ANA/0,15
0,83 b 2,00 a 1,67 a
ANA/0,20
0,83 b 2,33 a 2,00 a
BAP/0,20
0,50 b 2,33 a 1,33 a
BAP/0,10
0,00 b 2,00 a 1,33 a
* Médias seguidas de mesma letra não diferem entre pelo teste de tukey a 5% de probabilidade de
erro.
Neste trabalho, a adição de reguladores de crescimento, isolado ou em
combinação, não promoveram os efeitos esperados, discordando de Mantovani et al.
(2001) que observaram maior crescimento da parte aérea, facilitando a
individualização, contagem e aproveitamento das brotações de louro-pardo. A adição
de 0,01 mg L
-1
de ANA em combinação com 1,0 mg L
-1
de BAP aumentou o número
de brotações por explante, sendo que a concentração de 10 mg L
-1
de BAP inibiu a
formação de brotações, provocou a vitrificação e reduziu a produção de folhas de
louro-pardo (Carvalho, 2003). Na multiplicação do bilimbi (Averrhoa bilimbi), também
não foram observados resultados satisfatórios na combinação de ANA e GA
3
(1 mg L
-1
) meio de cultivo (Oliveira et al., 2001). Em porta-enxertos de pereira, a
42
adição de 0,1 mg L
-1
de ANA e 0,1 mg L
-1
de GA
3
não aumentou a taxa de
multiplicação, o que foi obtido com a adição de 0,2 mg L
-
1 de BAP (Mello-Farias et al.,
1996). A adição de BAP ao meio de cultura foi suficiente para a indução de brotações
em Eucalyptus ssp. (Ponte, 1999), copaíba (Copaifera lagsdorffii) (Noleto e Silveira,
2004) e aroeira (Myracrondruon urundeuva) (Andrade et al., 2000).
Tabela 5 – Desenvolvimento de explantes de Cordia trichotoma, na fase de
multiplicação, após 50 dias de isolamento em meio WPM acrescido de 0,00 ou
0,05 mg L
-1
de Ácido nafataleno acético (ANA) e 0,00, 0,10 ou 0,20 mg L
-1
de Ácido
giberélico (GA
3
). Santa Maria, RS, 2007
Tratamentos
GA
3
/ANA (mg L
-1
) Folhas (n
o
) Altura (mm) Entrenós (n
o
)
0,20/0,05
3,25 a* 5,00 a 0,25 a
0,10/0,05
2,00 ab 5,00 a 0,50 a
0,00/0,00
1,50 b 3,75 a 0,00 a
0,20/0,00
1,50 b 5,25 a 0,75 a
0,00/0,05
1,50 b 3,00 a 0,25 a
0,10/0,00
1,25 b 3,00 a 0,50 a
* Médias seguidas de mesma letra não diferem entre pelo teste de tukey a 5% de probabilidade de
erro.
A adição de ANA ao meio de cultura pode induzir a formação calos, como
observado em goiabeira-serrana (Feijoa sellowiana) (Dal Vesco e Guerra, 1999), e
louro-pardo (Mantovani e Franco, 2001), o que inibe a formação de brotações. Neste
trabalho, a calogênese foi uniforme em todos os tratamentos, independente do tipo e
da concentração de regulador de crescimento (dados não-apresentados). Em face
dos resultados observados, a combinação de ANA/BAP é recomendada em novo
teste de multiplicação, em que espera-se melhores resultados.
Na manutenção da parte basal dos propágulos in vitro, o corte acima ou
abaixo da primeira folha verdadeira para a formação das microcepas promoveu a
emissão de brotações para a coleta de novos explantes. Porém, a posição do corte
não alterou o número de brotações e de entrenós por microcepa (Tabela 6 e 7). A
manutenção in vitro da microcepa possibilitou a obtenção de até sete explantes em
duas coletas, que somado aos quatro explantes já produzidos no crescimento in vitro
aos 28 dias, tem-se um rendimento de até 11 explantes aos 70 dias após a
43
inoculação da semente. Caso as plântulas fossem descartadas no primeiro corte,
seriam produzidos apenas quatro explantes do período de crescimento in vitro.
Portanto, a manutenção da microcepa aumenta a taxa de multiplicação em até 1,75
vezes, demonstrando seu grande potencial de utilização na multiplicação in vitro de
louro-pardo, sem a adição de reguladores de crescimento. As plântulas regeneradas
provavelmente podem ser submetidas ao enraizamento e à aclimatização.
Tabela 6 – Desenvolvimento de brotações em microcepas aos 21 e 42 dias (1
a
e 2
a
coleta) em meio de cultura WPM acrescido de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de sacarose
e 1,5 g L
-1
de carvão ativado reidratado com WPM liquido sem carvão ativado. Santa
Maria, RS. 2007
Microcepa - corte 1
a
coleta 2
a
coleta Total
Acima da 1
a
folha
1,25 a* 1,50 a 2,75 a
Abaixo da 1
a
folha
1,00 a 1,00 a 2,00 a
* Médias seguidas de mesma letra não diferem entre pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
Tabela 7 – Desenvolvimento de entre-nós em brotações de microcepas aos 21 e 42
dias (1
a
e 2
a
coleta) em meio de cultura WPM acrescido de 7 g L
-1
de Agar, 30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado reidratado com WPM liquido sem carvão
ativado. Santa Maria, RS. 2007
Microcepa - corte 1
a
coleta 2
a
coleta Total
Acima da 1
a
folha
3,25 a* 3,50 a 6,75 a
Abaixo da 1
a
folha
3,67 a 2,33 a 6,00 a
* Médias seguidas de mesma letra não diferem entre pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
Nos testes de propagação ex vitro, a imersão das miniestacas de louro-pardo
por 10 s em solução contendo 1000 mg L
-1
de AIB não aumentou a percentagem de
sobrevivência aos 60 dias, comparado com a testemunha (Tabelas 8 e 9). Quanto ao
tamanho da miniestaca, as maiores porcentagens de sobrevivência aos 60 dias
foram obtidas com miniestacas de 2,5 a 5,5 cm de comprimento (Tabela 9). Esses
valores de porcentagens de sobrevivência estão de acordo com os observados em
cedro-rosa (Cedrela fissilis) (Xavier et al., 2003). Além disso, aplicação de 1000 ou
2000 mg L
-1
de AIB não aumentou a sobrevivência de miniestacas de Eucalyptus
grandis (Titon et al., 2003) e E. dunnii (Souza Junior e Wendling, 2003). A viabilidade
técnica de utilização da miniestaquia na propagação de espécies lenhosas também
44
foi comprovada em corticeira-do-mato (Erythrina falcata) (Wendling et al., 2005),
mogno (Swietenia macrophylla), jetiquiba-rosa (Cariniana legalis) e sete-cascas
(Britoa guazumaefolia) (Santos et al., 2000).
Tabela 8 – Porcentual de sobrevivência de miniestacas de Cordia trichotoma aos 60
dias após aplicação na sua base de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s. Santa Maria,
RS, 2007
Solução de AIB (mg L
-1
) Sobrevivência (%)
1000
83,33 a*
0
80.00 a
*Valores seguidos de mesma letra não diferem pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
Tabela 9 – Porcentual de sobrevivência de miniestacas de Cordia trichotoma
classificadas em diferentes tamanhos, aos 60 dias após aplicação na sua base de 0
ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s. Santa Maria, RS, 2007
Classes de tamanho
Solução de AIB (mg L
-1
)
1¹ 2 3 Médias
0
80 100 20 66,7 A²
1000
100 100 60 86,7 A
Médias
90 a² 100 a 40 b
¹ Classes de tamanho: 1: 2,5 a 4 cm, 2: 4,01 a 5,5 cm e 3: 5,51 a 7 cm.
² Valores seguidos de mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem entre si
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.
Apesar da alta percentagem de sobrevivência, apenas quatro miniestacadas,
submetidas ou não à aplicação de AIB, formaram raízes após 60 dias de cultivo em
telado (Figura 5). Foi também observada a formação de calo na base de miniestacas
submetidas ou não à aplicação de AIB (Tabela 10) e nos diferentes tamanhos de
miniestacas (Tabela 11), porém, sem a diferenciação de raízes. O fato da baixa
porcentagem de enraizamento pode estar associado às condições ambientais que
as miniestacas foram submetidas, sem controle de umidade relativa e temperatura
do ar. Para o enraizamento de miniestacas de Erythrina falcata Wendling et al.
(2005) mantiveram a umidade relativa do ar acima de 80%. Umidade relativa acima
de 80% e temperatura do ar entre 22 a 30º C foram suficientes para o enraizamento
de uma alta percentagem de miniestacas de Eucalyptus dunnii (Souza Junior e
Wendling, 2003), cedro-rosa (Cedrela fissilis) (Xavier et al., 2003), mogno (Swietenia
macrophylla), jetiquiba-rosa (Cariniana legalis) e sete-cascas (Britoa guazumaefolia)
45
(Santos et al., 2000). Portanto, o controle eficiente das condições ambientais é
necessário para a obtenção de altas porcentagens de enraizamento de miniestacas,
sendo que novos trabalhos devem ser conduzidos com o objetivo de definir essas
condições para o louro-pardo.
Figura 5 – Miniestacas enraizadas de louro-pardo submetidas à aplicação de 0
mg L
-1
(A) e 1000 mg L
-1
(B) de AIB após 60 dias de cultivo em telado. Santa
Maria, RS, 2007
Tabela 10 – Porcentual de formação de calos em miniestacas de Cordia trichotoma
aos 60 dias após aplicação na sua base de 0 ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s. Santa
Maria, RS, 2007
Solução de AIB (mg L
-1
) Porcentagem de calogênese
1000
36,6 a*
0
30,0 a
*Valores seguidos de mesma letra não diferem pelo teste F a 5% de probabilidade de erro.
Tabela 11 – Porcentual de formação de calos em miniestacas de Cordia trichotoma
classificadas em diferentes tamanhos, aos 60 dias após aplicação na sua base de 0
ou 1000 mg L
-1
de AIB por 10 s. Santa Maria, RS, 2007
Solução de AIB (mg L
-1
)
Classes de tamanho
1¹ 2 3
Médias
0
40 40 0 26, 67 A²
1000
60 40 20 40,00 A
Médias
50 a² 40 a 10 a
¹ Classes de tamanho: 1: 2,5 a 4 cm, 2: 4,01 a 5,5 cm e 3: 5,51 a 7 cm.
² Valores seguidos de mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem entre si
pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro.
A B
46
4.5 Conclusões
– A adição de reguladores de crescimento ao meio de cultura WPM não
influencia o crescimento de explantes e nem aumenta a taxa de
multiplicação in vitro de louro-pardo.
– A manutenção da microcepa em meio de cultivo WPM, contendo 7 g L
-1
de
Agar, 30 g L
-1
de sacarose e 1,5 g L
-1
de carvão ativado, aumenta a taxa
de multiplicação de louro-pardo.
– A aplicação de solução de AIB 1000 mg L
-1
por 10 s na base de
miniestacas de louro-pardo não aumenta a sobrevivência das mesmas.
– Miniestacas entre 2,5 e 5,5 cm de comprimento apresentam a maior
percentagem de sobrevivência.
47
5 Discussão geral
A cultura de tecidos possibilita a manipulação de células, tecidos e órgãos in
vitro, em virtude da competência morfogenética vegetal (Mantovani e Franco, 1998).
A cultura de tecidos é uma opção de propagação vegetativa em relação aos
métodos tradicionais (Rohr, 1989), sendo que a técnica de micropropagação
possibilita a produção de mudas de alta qualidade genética e fitossanitária em larga
escala (Gratapaglia e Machado, 1998). A micropropagação é especialmente
interessante para espécies de alto valor comercial e que tenham algum tipo de
limitação para a produção de mudas partindo de sementes.
O louro-pardo é uma espécie nativa de alto valor comercial, possui sementes
recalcitrantes, com viabilidade aproximada de três meses que dificulta a produção de
mudas ao longo do ano, e dormência tegumentar (Carvalho, 2003). O tegumento
das sementes também dificulta a desinfestação por proteger e/ou manter patógenos
associados. Em testes preliminares de estabelecimento in vitro, verificou-se que a
desinfestação de sementes inteiras atingia valores de apenas 0 a 5%. A embebição
das sementes por até 24 h facilita a retirada do tegumento e a desinfestação da
semente sem afetar a germinação, atingindo, nesse caso, desinfestação de até 95%.
As partes aéreas das plântulas, com 30 dias após a semeadura, podem ser
utilizadas como explantes que, cultivados por igual período em meio WPM sem
reguladores de crescimento, podem ser fonte de explantes para a micropropagação.
A eficiência do meio WPM para a micropropagação de espécies lenhosas também
foi observada para a caixeta (Mantovani et al., 2000) e peroba-rosa (Ribas et al.,
2005).
Para a multiplicação do louro-pardo, a adição de fitorregulador ao meio de
cultura WPM não proporcionou uma maior produção de plântulas. Diferentemente ao
que observaram na multiplicação do viburnum (Viburnum odoratissimum), na qual a
adição de GA
3
apresentou melhores resultados (Schoene e Yeger, 2005). Plântulas
fornecedoras de segmentos nodais e ápices caulinares foram mantidas in vitro com
a adição de meio liquido WPM. As microcepas produziram novas brotações que
forneceram novos explantes aos 21 e aos 42 dias de cultivo. A manutenção da
microcepa tem como vantagens a utilização do mesmo meio de cultura sem adição
48
de fitorregulador, o rápido crescimento promovido pelo sistema radicular
estabelecido e o aumento da taxa de multiplicação. Cada coleta forneceu entre 3 e 4
novos explantes, ou seja, a taxa de multiplicação foi aumentada em
aproximadamente 1,75 vezes com a manutenção da microcepa. A manutenção de
microcepas in vitro provavelmente não foi avaliada em outras espécies lenhosas,
oferecendo grande oportunidade para aumentar a taxa de multiplicação.
A miniestaquia tem sido utilizada com sucesso para a propagação de
corticeira-do-mato (Wendling et al., 2005), cedro-rosa (Cedrella fissilis Vell.) (Xavier
et al., 2003), Eucalyptus sp. (Wendling, 2002), E. grandis (Wendling e Xavier, 2005;
Titon et al., 2003) e E. dunnii (Souza-Junior e Wendling, 2003). Entretanto, o
enraizamento das miniestacas de louro-pardo não foi satisfatório, provavelmente
pela falta de controle da umidade relativa do ar. Altos índices de enraizamento (de
até 100%) foram apresentados para espécies como o Eucalyptus grandis (Titon et
al., 2002), cedro-rosa (Xavier et al., 2003) e corticeira-do-mato (Wendling et al.,
2005) em condições ambientais de umidade relativa do ar de 80%.
49
6 Conclusão geral
Para a germinação in vitro, as sementes de louro-pardo devem ser
submetidas a um período de embebição por até 24 h, seguida da imersão em
solução de hipoclorito de sódio a 5% por 30 min para facilitar a remoção do
tegumento e a desinfetação. Sementes sem tegumento são eficientemente
desinfestadas com a imersão em álcool 70% por 30 s e germinam em meio de
cultura contendo água destilada, 7 g L
-1
de agar 30 g L
-1
. Plântulas produzidas
assepticamente fornecem explantes de segmentos nodais e ápices caulinares,
restando uma microcepa formada pelo sistema radicular e a parte aérea até a
primeira folha verdadeira. Aos 21 dias de cultivo após o primeiro e segundo cortes,
as brotações são utilizadas como fonte de explantes e proporcionam um aumento de
até 1,75 vezes na taxa de multiplicação in vitro do louro-pardo. Miniestacas entre 2,5
e 5,5 cm apresentaram alta porcentagem de sobrevivência, porém com baixa
porcentagem de enraizamento. Novos experimentos devem ser conduzidos para
avaliar o enraizamento de miniestacas de louro-pardo em ambiente com alta
umidade relativa.
50
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Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, 1999.
ANEXOS
60
A
5 cm
B
a
b
B
C
ANEXO A – Aspecto da minicepa (A) e das miniestacas (B) aos 30 dias de cultivo
em telado (C). a – Miniestaca morta, b – miniestacas sobreviventes. Santa Maria,
RS, 2007.
61
ANEXO B – Aspecto das miniestacas de louro-pardo (experimento 2) aos 60 dias de
cultivo em casa de vegetação tipo telado (T1 = Tamanho 1 + AIB 0 mg L
-1
, T2 = Tam1 + AIB
1000 mg L
-1
, T3 =Tamanho 2 + AIB 0 mg L
-1
, T4 = Tamanho 2 + AIB 1000 mg L
-1
, T5 = Tamanho 3 +
AIB 0 mg L
-1
e T6 = Tamnho 3 + AIB 1000 mg L
-1
). Santa Maria, RS, 2007.
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