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Centro de Ciências Biológicas
Departamento de Ciências Patológicas
Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental
ALTERAÇÕES METABÓLICAS NA CAQUEXIA INDUZIDA POR TUMOR
WALKER-256 EM RATOS: ANORMALIDADES DE PARÂMETROS
PLASMÁTICOS E HEPÁTICOS
PRISCILA CASSOLLA
LONDRINA-PR
2008
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PRISCILA CASSOLLA
ALTERAÇÕES METABÓLICAS NA CAQUEXIA INDUZIDA POR
TUMOR WALKER-256 EM RATOS: ANORMALIDADES DE
PARÂMETROS PLASMÁTICOS E HEPÁTICOS
Dissertação submetida ao Mestrado em Patologia
Experimental da Universidade Estadual de Londrina
como requisito parcial à obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª Drª Helenir Medri de Souza
Londrina
2008
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Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca
Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
C345a Cassolla, Priscila.
Alterações metabólicas na caquexia induzida por tumor Walker-256 em
ratos : anormalidades de parâmetros plasmáticos e hepáticos/ Priscila
Cassolla. – Londrina, 2008.
99f.
Orientador: Helenir Medri de Souza.
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental)
-
Universidade Estadu
-
al de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-
Graduação
em Patologia Experimental, 2008.
Bibliografia: f.88-99.
1. Patologia experimental – Teses. 2. Caquexia – Patologia experimental –
Teses. 3. Desnutrição – Patologia experimental – Teses. 4. Câncer – Patologia
experimental – Teses. I. Souza, Helenir Medri de. II. Universidade Estadual
de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em
Patologia Experimental. III. Título.
CDU 579.26
PRISCILA CASSOLLA
ALTERAÇÕES METABÓLICAS NA CAQUEXIA INDUZIDA POR TUMOR
WALKER-256 EM RATOS: ANORMALIDADES DE PARÂMETROS
PLASMÁTICOS E HEPÁTICOS
Dissertação submetida ao Mestrado em Patologia Experimental da
Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª Drª Helenir Medri de Souza
Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. Roberto Barbosa Bazotte
Universidade Estadual de Maringá
Profª Drª Cássia Thaïs Bussamra Vieira Zaia
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 26 de fevereiro de 2008
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Lourdes e Edison, que são um exemplo
de força, determinação e humildade.
À Helenir, mais que orientadora, considero-a
como minha segunda mãe.
AGRADECIMENTOS
À Deus, acima de tudo.
Ao meu querido pai, Edison Cassolla (Véio), que sempre me apoiou em relação aos
estudos e que agora começou a compreender a minha opção profissional.
À minha mãe, Lourdes Yoko Daikuhara Cassolla (mamis), que esteve disposta a me
ajudar o tempo todo, sua prestatividade foi ímpar para atingir meus objetivos.
Às minhas irmãs Patrícia Cassolla (Zá), Poliane Cassolla (Zolinha) e Penélope Cassolla
(Zê), que são pessoas em quem eu confio, pelo apoio e também pelas críticas. Cresci
muito com vocês.
Aos meus familiares, pela compreensão da minha correria no dia-a-dia e das minhas
ausências nas reuniões de família. Vocês são muito importantes pra mim.
À minha inspiração profissional e pessoal, Profª Drª Helenir Medri de Souza, tão
cuidadosa e dedicada, ensinou-me com paciência e sabedoria cada passo da pesquisa,
da burocracia - passando pelos experimentos - à escrita. Não há palavras suficientes
para demonstrar a minha gratidão por tudo o que você fez (e ainda faz) por mim.
À Profª Drª Glaucia Regina Borba Murad, que não mediu esforços para me auxiliar
desde a bancada aos conselhos pessoais, exemplo de respeito e profissionalismo.
À Profª Drª Cássia Thaïs Bussamra Vieira Zaia e ao Prof. Dr. Dimas Augusto Morozin
Zaia, não só pela loucura da dosagem de ácidos graxos livres, mas também pela
amizade e pela disposição em ajudar.
Ao Prof. Dr. Luís Carlos Carvalho Navegantes, que deu a brilhante sugestão de fazer o
grupo controle pair fed, contribuindo para o enriquecimento deste trabalho.
Aos integrantes do Grupo de Pesquisa da Caquexia da UEL, que se esforçaram para
uma integração multidisciplinar, ampliando os meus conhecimentos, em especial ao
Prof. Dr. Rubens Cecchini, por ter convidado o Laboratório de Fisiologia Metabólica
para participar do grupo.
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental, pela
cumprida tarefa de ensinar.
À Profª Drª Maria Angélica Ehara Watanabe, atual coordenadora do Programa de Pós-
graduação em Patologia Experimental, pela amizade, competência, e por ser tão
prestativa e prática na resolução dos problemas.
Aos funcionários dos Departamentos de Ciências Patológicas e Fisiológicas, em
especial à Vânia Darc de Castro – secretária da Pós-graduação do Depto de Ciências
Patologias, à Ana Maria Rodrigues – secretária do Depto de Ciências Patológicas, à
Daniela Grosso Borin – secretária do Depto de Ciências Fisiológicas e aos técnicos do
Depto de Ciências Fisiológicas.
Aos estagiários e agregados do Laboratório de Fisiologia Metabólica, Sayonara R.
Oliveira (Sá), Ana Paula S. Dornellas (Aninha), Suéllen K. F. Vilas Boas (Suka), Camilla
Y. Kawanishi (Prima), Thaís F. Liboni (Thá), Rafael E. Pedro (Rafa), João Carlos T.
Silva Filho e Wesley F. de Mello, que foram de muita ajuda na execução das tarefas e
que me propiciaram, além de muitos risos, a oportunidade de ensiná-los e de,
raramente, exercitar a minha paciência.
Aos meus queridos amigos Adriane F. Evangelista (Feijão), Marcela Y. Ogo
(Marcelitcha), Andréa C. Koishi (Ander), Tatiane V. Machado (TatE), Milton C. Gobbo
(MiRtinho), Paulo D. A. Torres (Kbça), Denise H. Kitamura (Deee), Thiago Y. C.
Massuda (Trankera), Érica A. Kavati (Eriquinha), Alexandre A. Sasaki (Sasaki), Juliana
T. T. Fritzen (Ju) e Tatiane F. Petroni (Tati), os quais me ajudaram inúmeras vezes em
termos acadêmicos e/ou de descontração, vocês são especiais pra mim.
À minha turma de mestrado, Aida Mehanna, Alissana E. I. Camargo, Débora F. V.
Rodrigues, Josiane Mendes, Patrícia S. Suzuki, Rosália H. F. Vivan e Vânia A. M. Terra,
pelo aprendizado em conjunto e pelos ótimos momentos compartilhados.
À CAPES, pela concessão da bolsa, possibilitando minha permanência no mestrado.
"O que você sabe não vale nada, o
único valor está no que você faz
com aquilo que sabe".
Provérbio Kung-Fu
CASSOLLA, PRISCILA. Alterações metabólicas na caquexia induzida por tumor Walker-
256 em ratos: anormalidades de parâmetros plasmáticos e hepáticos. Dissertação
submetida ao Mestrado em Patologia Experimental da Universidade Estadual de
Londrina como requisito parcial à obtenção do título de Mestre.
RESUMO
A caquexia, síndrome associada à perda de peso e redução da ingestão de alimentos,
ocorre em muitas doenças crônicas como o câncer e é importante causa de morbidade
e mortalidade. Relativamente pouco é conhecido sobre as alterações metabólicas na
caquexia, suas causas e tratamento. O objetivo do presente estudo foi o
estabelecimento do modelo de caquexia induzida por tumor Walker-256 em ratos e a
caracterização do perfil metabólico plasmático e hepático nesta condição. Para a
implantação do tumor, células Walker-256 foram injetadas subcutaneamente no
flanco direito traseiro de ratos machos Wistar na concentração de 8x10
7
células/animal. No 5º, 8º, 11º e 14º dia após a inoculação das células avaliou-se as
massas corporal, tumoral e do músculo gastrocnêmio, a ingestão alimentar, o
conteúdo de glicogênio hepático e a concentração de vários parâmetros plasmáticos
(colesterol, triacilgliceróis, ácidos graxos livres, glicerol, lactato, uréia e glicose). A
maioria das análises também foi feita em animais submetidos a um esquema de
alimentação reduzida (animais controle pair fed), semelhante a dos animais com
tumor portadores de anorexia, ou em animais controles com alimentação ad libitum.
Foram também avaliados, no 12º dia de desenvolvimento tumoral, a neoglicogênese e
o consumo de oxigênio hepáticos a partir de vários precursores de glicose (alanina 2,5
mM, piruvato 5 mM, lactato 2 e 8 mM e glicerol 2 mM) em estudos de perfusão de
fígado in situ. Nestes experimentos os animais portadores de tumor e seus controles
foram submetidos a 24 horas de privação alimentar. Todos os dados obtidos foram
testados quanto à distribuição e homogeneidade das variâncias e testes estatísticos
adequados foram empregados para análise dos resultados. De uma forma geral,
especialmente no 14º dia após a inoculação das células Walker-256, os animais
portadores do tumor apresentaram: a) redução (p<0,05)
da massa corpórea e perda de
massa muscular; b) redução (p<0,05) da ingestão alimentar, glicemia e do conteúdo
de glicogênio hepático; c) aumento (p<0,05) dos triacilgliceróis, ácidos graxos livres,
lactato e uréia plasmáticos e d) não alteração (p>0,05)
no colesterol e glicerol
plasmático. Estas alterações não ocorreram nos animais controle pair fed, exceto a
glicemia e o conteúdo de glicogênio hepático, e em sua maioria acompanhou o
aumento progressivo da massa tumoral. Adicionalmente, houve inibição (p<0,05)
da
neoglicogênese e do consumo de oxigênio hepáticos nos animais portadores de tumor
(12
o
dia) quando os precursores utilizados foram a alanina, o piruvato ou o lactato 2
mM, mas não (p>0,05)
o glicerol ou o lactato 8 mM. Os resultados indicam que, além
dos sinais característicos da síndrome da caquexia como emagrecimento, catabolismo
muscular e anorexia, os animais portadores de tumor Walker-256 apresentam várias
alterações metabólicas plasmáticas e hepáticas, algumas das quais se iniciam já no 5º
dia após a inoculação das células tumorais, e são acentuadas no decorrer do
desenvolvimento do processo caquético. As evidências de que as alterações do perfil
metabólico dos animais portadores de tumor não foram encontradas nos animais
controle pair fed indicam que as mesmas não são decorrentes da menor ingestão
alimentar. Estas alterações, e também as observadas na neoglicogênese,
provavelmente, são mediadas por fatores produzidos pelo tumor ou pelo hospedeiro
(citocinas) em resposta à presença do tumor.
Palavras-chave: caquexia, câncer, alterações metabólicas, colesterol, triacilgliceróis,
ácidos graxos, glicerol, lactato, uréia, glicemia, glicogênio hepático, neoglicogênese
hepática.
CASSOLLA, PRISCILA. Metabolic alterations in the Walker-256 tumor-induced cachexia
in rats: abnormalitys of plasmatic and hepatic parameters. Dissertação submetida ao
Mestrado em Patologia Experimental da Universidade Estadual de Londrina como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre.
ABSTRACT
Cachexia, syndrome associated with loss of weight and reduction in food intake,
occurs in many chronic diseases, as cancer, and it is an important cause of morbity
and mortality. Relatively little is known about metabolic alterations in cachexia, its
causes and treatment. The present study’s objective was the establishment of a model
of Walker-256 tumor-induced cachexia in rats and the characterization of plasmatic
and hepatic metabolic profile in this condition. For tumor implantation, Walker-256
cells were injected subcutaneously into the back right flank of Wistar male rats at
concentration of 8x10
7
cells/animal. On the 5
th
, 8
th
, 11
th
and 14
th
day post-inoculation
of cells, corporal, tumoral and gastrocnemius muscle masses, food intake, content of
hepatic glycogen and concentration of several plasmatics parameters (cholesterol,
triacylglycerols, free fatty acids, glycerol, lactate, urea and glucose) were evaluated.
Most of the analyses also were made in animals submitted to a scheme of reduced
feeding (pair fed control animal), like anorexia-bearing animals with tumor, or in
controls with feeding ad libitum. In addition, on 12
th
day of tumoral development, the
hepatic gluconeogenesis and oxygen uptake from severals precursors of glucose
(alanine 2,5 mM, pyruvate 5 mM, lactate 2 e 8 mM e glycerol 2 mM) in situ liver
perfusion studies were evaluated. In these experiments the tumor-bearing animals and
its controls were submitted to 24 hours of alimentary privation. All obtained data
were tested in respect distribution and variances homogeneity and suitable statistical
tests were employed to analyse the results. In general, especially on 14
th
day post-
inoculation of Walker-256 cells, the tumor-bearing animals presented: a) reduction
(p<0,05)
of corporal mass and loss of muscular mass; b) reduction (p<0,05)
of food
intake, glycemia and content of hepatic glycogen; c) increased (p<0,05)
plasmatics
triacylglycerols, free fatty acids, lactate and urea and d) no change (p>0,05)
in
plasmatic cholesterol and glycerol. These changes did not occur in pair fed control
animals, except the glycemia and the content of hepatic glycogen, and in its majority
it followed the gradual increase of the tumoral mass. Addicionally, there was
inhibition (p<0,05) of hepatic gluconeogenesis and oxygen uptake in the tumor-bearing
animals (12
th
day) when the precursors used were alanine, pyruvate or lactate 2 mM,
but not (p>0,05) the glycerol or lactate 8 mM. The results indicates that, beyond of
caracteristic signals of the cachexia syndrome such as weakning, muscular catabolism
and anorexia, the Walker-256 tumor-bearing animals presented several plasmatic and
hepatic metabolic alterations, some of which were already initiated on the 5
th
day
post-inoculation of tumoral cells, and were accented during the development of
cachectic process. The evidences that the alterations of the metabolic profile of
tumor-bearing animals were not found in pair fed control animals indicates that they
aren’t deccurrent of lower food intake. These alterations, and also the ones observed
on gluconeogenesis, probably, are mediated by factors produced by the tumor or the
host (cytokines) in reply to the presence of tumor.
Key-words: cachexia, cancer, metabolic alterations, cholesterol, triacylglycerols, fte
fatty acis, glycerol, lactate, u(a)157(,)-2.8( )8702.2(g)8.8(l)-2.9(yc)9.6(e)10.7(m)-2.1(i)-2.6(a)1.0(,)-2.8( )8702.2(h)11.7((p)269(a)11.3(t)5.5(i)-2.6(c)1.8( )8702.2(g)-1.4(l)-2.9(y)10.1(c)1.8(o)2.7(g)8.8(en)2.9(,)-2.8( )8509.9(h)1.4(ep)12.9(a)1.0(t)5.5(i)-2.6(c)1.8( )] TJETQq/Cs1 cs 0 0 0 scnBT/TT4 1 Tf11.68000 0 0 11.68000 83.37826 414.31149 cm1.00000 0 0 1.00000 0 0 Tm[(g)-1.4(l)-2.9(yc)11.9(o)2.7(n)11.7(eo)3.2(g)8.8(en)12.2(es)4.7(i)-2.6(s)4.3.)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................
20
1.1 Caquexia associada ao câncer ...................................................
21
1.2 Alterações no metabolismo de lipídeos na caquexia associada ao câncer 22
1.3 Alterações
no metabolismo de proteínas na caquexia associada ao
câncer ...............................................................................
26
1.4
Alterações no metabolismo de carboidratos na caquexia associada ao
câncer
...............................................................................
29
2 OBJETIVOS
.........................................................................
34
2.1 Geral .................................................................................
35
2.2 Específicos ..........................................................................
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
...........................................................
36
3.1 Reagentes
...........................................................................
37
3.2 Animais ..............................................................................
37
3.3 Implantação do tumor Walker-256
..............................................
38
3.4 Experimentos para caracterização da caquexia em ratos port
adores de
tumor Walker-256 e avaliação de parâmetros relacionados ................
38
3.5
Experimentos para avaliação das alterações metabólicas de parâmetros
plasmáticos e do conteúdo de glicogênio hepático
..........................
40
3.6 Experimentos de perfusão de fígado in situ
para avaliação da
neoglicogênese e do consumo de oxigênio hepáticos
........................
40
3.7 Procedimentos Analíticos
.........................................................
43
3.7.1 Determinação da concentração de colesterol total
..........................
43
3.7.2 Determinação da concentração de triacilgliceróis
...........................
43
3.7.3 Determinação da concentração de ácidos graxos livres
.....................
44
3.7.4 Determinação da concentração de glicerol....................................
44
3.7.5 Determinação da concentração de lactato
....................................
44
3.7.6 Determinação da concentração de piruvato...................................
45
3.7.7 Determinação da concentração de uréia
......................................
45
3.7.8 Determinação da concentração de glicose
....................................
45
3.7.9 Determinação da concentração de glicogênio hepático
.....................
46
3.7.10
Determinação do consumo de oxigênio hepático
.............................
46
3.8 Procedimentos Estatísticos
.......................................................
47
4 RESULTADOS .......................................................................
48
4.1 Caracterização da caquexia em ratos portadores de tumor Walker-
256
e avaliação de parâmetros relacionados .......................................
49
4.2 Avaliação dos lipídeos plasmáticos
.............................................
51
4.3 Avaliação de precursores neoglicogênicos plasmáticos
......................
54
4.4 Avaliação da uremia...............................................................
56
4.5 Avaliação da glicemia
.............................................................
57
4.6 Avaliação do conteúdo de glicogênio hepático
...............................
58
4.7
Avaliação da neoglicogênese hepática e do consumo de oxigênio a
partir de vários precursores de glicose
........................................
59
5 DISCUSSÃO..........................................................................
67
6 CONCLUSÕES.......................................................................
84
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.................................................
87
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Concentrações de colesterol plasmático de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256 no 5º, 8º,
11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais ...........
51
Figura 2 -
Concentrações de triacilgliceróis plasmático de ratos
controle, controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256
no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a inoculação das células
tumorais.................................................................
52
Figura 3 -
Concentrações de ácidos graxos livres plasmático de ratos
controle, controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256
no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a inoculação das células
tumorais
.................................................................
53
Figura 4 -
Concentrações de glicerol plasmático de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256 no 5º, 8º,
11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais ...........
54
Figura 5 - Conce
ntrações de lactato plasmático de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256 no 5º, 8º,
11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais ...........
55
Figura 6 -
Concentrações de uréia plasmática de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-
256 no 5º, 8º,
11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais ...........
56
Figura 7 - Glicemia de ratos controle, controle pair fed
e portadores de
tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após
a inoculação
das células tumorais...................................................
57
Figura 8 -
Percentagem de conteúdo de glicogênio hepático em relação
ao controle de ratos controle pair fed
e portadores de tumor
Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º
dias após a inoculação das
células tumorais........................................................
58
Figura 9 -
Produção de glicose, consumo de oxigênio e as respectivas
áreas sob as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos
portadores de tumor Walker-
256 (WK) e controles durante a
infusão de L-alanina ...................................................
61
Figura 10 -
Produções hepáticas de uréia, piruvato e lactato e as
respectivas áreas sob as curvas em ratos portadores de tumor
Walker-256 (WK) e controles durante a infusão de L-alanina...
62
Figura 11 -
Produção de glicose, consumo de oxigênio e as respectivas
áreas sob as curvas (AUCs) em fígados de ratos portadores de
tumor Walker-
256 (WK) e controles durante a infusão de
piruvato..................................................................
63
Figura 12 -
Produção de glicose, consumo de oxigênio e as respectivas
áreas sob as curvas (AUCs) em fígados de ratos portadores de
tumor Walker-256 (WK) e controles durante a infusão de L-
lactato...................................................................
64
Figura 13 -
Produção de glicose, consumo de oxigênio e as respectivas
áreas sob as curvas (AUCs) (em fígados de ratos portadores de
tumor Walker-256 (WK) e controles durante a infusão de L-
lactato...................................................................
65
Figura 14 -
Produção de glicose, consumo de oxigênio e as respectivas
áreas sob as curvas (AUCs) em fígados de ratos portadores de
tumor Walker-256
(WK) e controles durante a infusão de
glicerol...................................................................
66
Figura 15 -
Neoglicogênese pelos precursores alanina, piruvato, lactato e
glicerol, e as principais enzimas que regulam a via..............
82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
mg
10
-6
grama
mmol
10
-6
mol
1,3-DPGA 1,3-difosfoglicerato
2-PGA 2-fosfoglicerato
3-PGA 3-fosfoglicerato
4-AAP 4-aminoantipirina
4-AF 4-aminofenazona
ADP Adenosina difosfato
AIDS Síndrome da imunodeficiência adquirida
AKT Proteína quinase B
AMP Adenosina monofosfato
AMPc Adenosina monofosfato cíclica
AMPK Proteína quinase dependente de AMP
ANOVA Análise de Variância Unidimensional
Anti-(IFN-g) Anticorpo anti-interferon-g
Anti-(IL-6) Anticorpo anti-interleucina-6
ATP Adenosina trifosfato
AUC Área sob a curva
Ca
+2
Íon cálcio
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior
CAT Carnitina acil transferase
CE Colesterol esterase
CO Colesterol oxidase
CO
2
Dióxido de carbono
CoA Coenzima A
CPT Carnitina palmitoil transferase
CRF Fator liberador de corticotropina
DHAP Dihidroxiacetona fosfato
DHBS 3,5-dicloro-2-hidroxibenzenosulfonato
dL 10
-1
litro
DNA Ácido desoxirribonucléico
EPAs Ácidos graxos poliinsaturados
ERK Quinase relacionada com sinal extracelular
Fru-1,6-P
2
Frutose-1,6-bifosfato
Fru-6-P Frutose-6-fosfato
g Grama
GAP Gliceraldeído 3-fosfato
Gli-6-P Glicose-6-fosfato
Glicerol-P Glicerol-fosfato
GLUT-1 Transportador de glicose-1
GLUT-3 Transportador de glicose-3
GLUT4 Transportador de glicose-4
gmc Ganho de massa corpórea do grupo controle
GMPc Guanosina monofosfato cíclica
GPO Glicerol-1-fosfato oxidase
H
+
Íon hidrogênio
H
2
O Água
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
H
2
SO
4
Ácido sulfúrico
HIF Fator induzido por hipóxia
HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase
HSL Lipase hormônio-sensível
IkB Inibidor de kB
IkBa Inibidor de kB-a
IFN-a Interferon-a
IFN-γ Interferon-γ
IKK-b Quinase inibitória de kB-b
IL-1 Interleucina-1
IL-1a Interleucina-1a
IL-1b Interleucina-1b
IL-12 Interleucina-12
IL-6 Interleucina-6
IRS-1 Substrato do receptor de insulina-1
KCl Cloreto de potássio
Kg 10
3
grama
KH Tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato
LDH Lactato desidrogenase
LMF Fator mobilizador de lipídeos
LPL Lipoproteína lipase
MAFbx Atrofia de músculo F-box
Mal Malato
MCA Sarcoma murino A
MCG Sarcoma murino G
MEK Proteína quinase ativada por mitógeno
mfe Massa corpórea final do animal com tumor
mg 10
-3
grama
mie Massa corpórea inicial do animal com tumor
min Minuto
mL 10
-3
litro
mm 10
-3
metros
mM 10
-3
molar
mmg Massa do músculo gastrocnêmio em grama
mmgc Massa do músculo gastrocnênio em g%
mt Massa do tumor
MuRF1 Proteína do músculo do dedo anelar-1
n Número amostral
N
2
Nitrogênio molecular
Na
+
Íon sódio
NaCl Cloreto de sódio
NaClO Hipoclorito de sódio
NAD
+
Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NaOH Hidróxido de sódio
NF-
k
B Fator nuclear
k
B
NH
2
Cl Monocloroamino
NH
3
Amônia
NHE-1 Lançadeira Na
+
/H
+
-1
NHE-6 Lançadeira Na
+
/H
+
-6
nm 10
-9
metro
NO Óxido nítrico
NPY Neuropeptídeo Y
O
2
Oxigênio molecular
OAA Oxaloacetato
ºC Graus Celsius
PBS Salina tamponada com fosfato
PEP Fosfoenolpiruvato
PEPCK Fosfoenolpiruvatocarboxiquinase
PGE2 Prostaglandina E2
pH Potencial hidrogeniônico
PI3K Proteína quinase-3
PIF Fator indutor de proteólise
PKB Proteína quinase B
PKC-d Proteína quinase C-d
POD Peroxidase
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
ROS Espécies reativas do oxigênio
SOCS-3 Proteína supressora da sinalização de citocinas-3
TNF-a Fator de necrose tumoral-a
TNFR1 Receptor de TNF-1
UEM Universidade Estadual de Maringá
VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade
WK Walker-256
ZAG
Proteína a-2 zínica
Introdução
21
1 INTRODUÇÃO
1.1 Caquexia associada ao câncer
Algumas situações patológicas são capazes de provocar mudanças no
metabolismo energético. É o caso da caquexia, presente em muitas doenças crônicas,
tais como câncer, AIDS, insuficiência cardíaca crônica, artrite reumatóide, falência
pulmonar crônica, cirrose hepática, deficiência renal e sepse (MARTIGNONI
et al.,
2003; PLATA-SALAMÁN, 2000).
A caquexia (do grego kako’s, má; e ‘hexis, condição) é uma síndrome
complexa e multifatorial, caracterizada pela diminuição involuntária do peso
corpóreo, decorrente da redução da ingestão de alimentos e principalmente da perda
de tecido adiposo e massa muscular (INUI, 1999; TISDALE, 1997, 1999, 2000, 2002,
2004; VICENTINO et al., 2002a).
As alterações observadas na caquexia são multidimensionais e altamente
coordenadas. A mais evidente é uma redistribuição do conteúdo protéico do corpo,
com depleção preferencial do músculo esquelético e aumento na síntese de proteínas
envolvidas na resposta de fase aguda (KOTLER, 2000).
Estudos de revisão relatam que a incidência da caquexia associada ao câncer
varia pelo tipo de tumor, apresentando-se com as seguintes freqüências: alta (83% a
87%) em pacientes com câncer pancreático e gástrico; intermediária (48% a 61%) em
pacientes com câncer de cólon, próstata e pulmão; e baixa (31% a 40%) em pacientes
com câncer de mama, sarcomas e leucemia (LOBERG et al., 2007; TISDALE, 1999). De
um modo geral, cerca de 20% das mortes de portadores de câncer são atribuídas à
caquexia, com a morte ocorrendo tipicamente quando a perda de peso é de
aproximadamente 30% (LOBERG et al., 2007).
Os mecanismos que influenciam o desenvolvimento da caquexia do câncer
incluem, entre outros, a dinâmica da resposta do hospedeiro (ativação da resposta
inflamatória sistêmica e mudanças metabólicas, imunológicas e neuroendócrinas) e as
características do tumor e/ou dos produtos derivados do tumor (ARIAS et al., 2007;
TISDALE, 2005).
22
Sugere-se que fatores produzidos pelo tumor e pelo tecido do hospedeiro, na
presença de certos tumores, desempenham papel importante na redução da massa
tecidual e, por esta razão, são chamados de mediadores da caquexia. Dentre estes
fatores, encontram-se citocinas, fator mobilizador de lipídeos (LMF/ZAG), fator
indutor de proteólise (PIF), hormônios catabólicos, neuropeptídeos,
neurotransmissores e toxormônios (LOBERG et al., 2007; RAMOS et al., 2004; RUBIN,
2003; TISDALE, 1999, 2003).
Os mediadores da caquexia atuam em múltiplos alvos, como adipócitos,
miócitos, hepatócitos, medula óssea, células endoteliais e neurônios, induzindo uma
complexa cascata de respostas biológicas que culminam em progressiva perda de peso,
anorexia, anemia, astenia, depleção de estoque de lipídeos, severa perda protéica do
músculo esquelético (LOBERG et al., 2007) e várias outras alterações no metabolismo
de lipídeos, proteínas e carboidratos.
1.2 Alterações no metabolismo de lipídeos na caquexia associada ao câncer
A gordura constitui 90% das reservas energéticas de um adulto, e o aumento
da mobilização de massa adiposa é uma das características da caquexia no câncer para
suprir a alta demanda energética do tumor (TISDALE, 1997, 2000). Os estudos
demonstram que 85% dos lipídios contidos no tecido adiposo podem ser oxidados
durante o processo caquético (FEARON, 1992; TISDALE, 2003) pelo aumento da lipólise
e/ou pela redução da lipogênese (TISDALE, 2003).
Segundo Tisdale (1999), pacientes com câncer e perda de peso possuem um
turnover (reciclagem) de ácidos graxos e glicerol elevado quando comparados com
sujeitos saudáveis ou pacientes com câncer sem perda de peso. O aumento do gasto
energético de repouso, encontrado na caquexia, pode explicar a elevada oxidação
lipídica que ocorre no portador de tumor (VICENTINO et al., 2002a).
Para serem oxidados, os ácidos graxos do citoplasma precisam atravessar as
membranas externas e internas da mitocôndria. Ainda no citoplasma, os ácidos graxos
são ativados, recebendo uma coenzima A (CoA) e tornando-se acil-CoA numa reação
catalisada pela enzima acil-CoA sintetase (GROFF et al., 1995). A acil-CoA atravessa a
membrana mitocondrial interna por meio de um processo dependente de carnitina e
23
das enzimas carnitina acil transferase I (CAT I), localizada na face externa desta
membrana, carnitina acil transferase II (CAT II), localizada na face interna e carnitina-
acilcarnitina translocase, que atua entre as duas faces da membrana interna. As duas
primeiras enzimas são também denominadas carnitina palmitoil transferase I e II (CPT
I e II), devido ao fato do ácido palmítico ser o principal ácido graxo metabolizado
(CURI et al., 2002).
Variações na atividade das CATs no câncer não estão bem definidas. Vicentino
et al. (2002a) observaram redução de aproximadamente 50% na atividade da CAT I
mitocondrial nos fígados de ratos em jejum portadores de tumor Walker-256, o que
acarretou em diminuição da cetogênese a partir de ácidos graxos exógenos (palmitato,
estearato e oleato). Embora, nestes mesmos estudos (VICENTINO et al., 2002a) foram
mostradas apenas pequenas variações na atividade da CAT II, aumentando, quando o
oleoil-CoA foi o substrato e diminuindo quando o substrato foi o estearoil-CoA,
Seelaender et al. (1998) mostraram que o componente inibido na presença de tumor
maligno, como o Walker-256, é a CAT II. O controle da expressão da CAT II em fígado
de ratos portadores de tumor parece ser modulado, dentre outros fatores, pela
prostaglandina E2 (PGE2) (SEELAENDER et al., 1998), a qual está associada com a
proliferação de células tumorais por inibir a apoptose e por promover a angiogênese
(MUND et al., 2007).
Com a menor atividade das CATs no fígado, há redução da oxidação lipídica no
hepatócito, o que pode contribuir para o acúmulo de lipídeos na circulação observado
em portadores de tumor (VICENTINO et al.
24
necrose tumoral-a (TNF-a), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interferon-a
(IFN-a), quimiocinas e interleucina-12 (IL-12) (ABBAS
&
LICHTMAN, 2005).
Uma das características das citocinas, TNF-α, IL-6, IL-1α e interferons (INF-α e
INF-γ), e do fator inibidor de leucemia (LIF) é a capacidade de inibirem a lipoproteína
lipase (LPL), enzima localizada na superfície das células endoteliais dos vasos
sangüíneos dos tecidos adiposo e muscular, que degrada os tracilgliceróis do plasma
em ácidos graxos e glicerol (BERG et al., 1994). A potência de inibição da LPL é
diferente dentre as citocinas, isto é, IL-6 < LIF < TNF-α (TISDALE, 1999). Essas
citocinas também são capazes de ativar a enzima lipase hormônio-sensível (HSL), que
estimula a hidrólise dos triacilgliceróis nos adipócitos (ARNER, 1995).
Embora a IL-6 tenha aumentado a concentração de triacilgliceróis em ratos,
em humanos ela é identificada como um potente modulador do metabolismo de
lipídeos, aumentando a oxidação lipídica e a reesterificação de ácidos graxos sem
causar hipertriacilgliceridemia (VAN HALL et al., 2003).
Já o TNF-α estimula diretamente a lipólise em humanos pela ativação da
proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) e da quinase relacionada com sinal
extracelular (ERK), confluindo com a diminuição da expressão da fosfodiesterase 3B, a
enzima degradante de adenosina monofosfato cíclica (AMPc), resultando em aumento
do AMPc intracelular, o qual ativa a proteína quinase A (TISDALE, 2003; WARNE, 2003),
estimuladora da HSL.
Além de estimular a lipólise (MacDOUGALD
&
MANDRUP, 2002; TISDALE, 1999,
2002, 2003; WARNE, 2003), o TNF-α é capaz de promover aumento da apoptose de
adipócitos e pré-adipócitos (PRINS et al., 1997; WARNE, 2003) e diminuição do
processos de adipogênese e lipogênese (MacDOUGALD
&
MANDRUP, 2002; WARNE,
2003). Essa citocina é capaz de causar severa hipertriacilgliceridemia por: a) inibição
da LPL e ativação da HSL, como já visto, e inibição de outras enzimas envolvidas na
síntese de gorduras, como a acetil-CoA carboxilase (PAPE
&
KIM, 1988), ácido graxo
sintase (PEKALA et al., 1983), glicerol fosfato desidrogenase e proteínas carreadoras
de ácidos graxos (TORTI et al., 1985) e b) no fígado, estimulação da lipogênese
(BULLÓ-BONET et al., 1999; TISDALE, 1999) e da formação da lipoproteína de muito
baixa densidade (VLDL) (BULLÓ-BONET et al., 1999).
25
A mobilização de ácidos graxos do tecido adiposo pode ocorrer antes da perda
de peso corpóreo, sugerindo a presença do LMF, que é produzido e liberado pelo
tumor ou pelas metástases, agindo de maneira similar à dos hormônios lipolíticos
(TISDALE, 2000). O LMF é um dos responsáveis pela perda de massa adiposa no
processo de caquexia no câncer, por manter a taxa de degradação de triacilgliceróis
maior do que a de síntese (TISDALE, 2003, 2004).
Os ácidos graxos poliinsaturados (EPAs) têm se mostrado benéficos no
tratamento de indivíduos com câncer, por prevenir a ação do LMF em aumentar a
concentração de AMPc em adipócitos. Em estudos in vitro em ratos com tumor MAC16,
os EPAs inibiram a atividade biológica do LMF e, em estudos in vivo, os EPAs também
foram efetivos contra os efeitos da caquexia e promoveram inibição do crescimento do
tumor (TISDALE
&
BECK, 1991).
Como resultado do intenso processo de lipólise na caquexia, há aumento dos
ácidos graxos circulantes. No tecido adiposo, os ácidos graxos inibem a atividade da
LPL, que é, por outro lado, estimulada pela insulina, reduzindo o clearance
(desaparecimento) dos triacilgliceróis da circulação.
A longa exposição a altas concentrações de ácidos graxos prejudica a secreção
de insulina pelas células-b pancreáticas (MLINAR et al., 2007). No músculo, altas
concentrações de ácidos graxos inibem a síntese de glicogênio muscular (MLINAR et
al., 2007) e favorecem a beta-oxidação, a qual diminui a captação e a oxidação da
glicose (DELARUE
&
MAGNAN, 2007; MLINAR et al., 2007), efeitos que são opostos aos
da insulina. No fígado, a alta concentração de ácidos graxos representa substrato
abundante para síntese de triacilgliceróis e VLDL, e para estimulação da
neoglicogênese (MLINAR et al., 2007). E ainda resulta em acúmulo de diacilglicerol,
ativação de duas quinases serina/treonina, PKC-d e IKK-b (proteína quinase C-d e
quinase inibitória de
k
B-
b
), ativação da via clássica pró-inflamatória IKK-
b
/I
k
B/NF-
k
B
(quinase inibitória de kB-b/inibidor de kB/fator nuclear kB), e aumento na expressão
hepática e níveis plasmáticos de citocinas inflamatórias (BODEN et al., 2005). Em
conjunto, os efeitos dos ácidos graxos nos diferentes tecidos implicam em resistência
insulínica hepática e periférica (MLINAR et al., 2007; BODEN et al., 2005).
26
1.3 Alterações no metabolismo de proteínas na caquexia associada ao câncer
O conteúdo de proteína no músculo esquelético depende do balanço
energético entre sua síntese e degradação (COSTELI
&
BACCINO, 2003; TISDALE, 2002).
Estudos realizados em modelos experimentais de câncer, bem como em humanos
portadores de tumor, têm mostrado que a atrofia muscular pode resultar da elevada
degradação, reduzida síntese ou ambas (TISDALE, 1999, 2000). A depleção de
proteínas pode ser um dos principais fatores associados ao decréscimo de sobrevida
dos pacientes caquéticos (LOBERG et al., 2007; TISDALE, 2002).
Há três mecanismos proteolíticos importantes responsáveis pelo catabolismo
das proteínas no músculo esquelético (TISDALE, 2001): a) uma via lisossomal, mediada
por proteases (catepsinas), envolvida principalmente com a proteólise de proteínas
extracelulares e receptores de superfície da célula (LECKER et al., 1999); b) um
processo citosólico, dependente de Ca²
+
, que envolve proteases (calpaínas) ativadas
por este íon, e é ativado principalmente quando há lesão no tecido, necrose e autólise
(GOLL et al., 1992); e c) um mecanismo dependente de ATP, ubiquitina-proteassoma,
que parece ser o principal responsável pela proteólise acelerada em uma variedade de
patologias como a sepse, acidose metabólica, diabetes aguda e caquexia induzida por
câncer (LECKER et al., 1999).
As três vias proteolíticas podem estar envolvidas na caquexia, porém o
sistema ubiquitina-proteassoma é considerado o mais importante (TISDALE, 2001,
2002, 2003). Como esse processo requer ATP, ele pode contribuir no gasto energético
observado na caquexia do câncer (TISDALE, 2001). Sob condições normais, a atividade
desta via é estimulada por glicocorticóides e hormônio tiroideano e é inibida pela
insulina (KOTLER, 2000). Na caquexia, a ativação desta via pode ser desempenhada
por mediadores humorais, tais como o PIF e algumas citocinas (KOTLER, 2000; LOBERG
et al., 2007).
O PIF, uma glicoproteína sulfatada produzida diretamente pelo tumor
(TODOROV et al., 1997), induz a proteólise no músculo esquelético por ativar a via
ubiquitina-proteassoma dependente de ATP e reduz a síntese protéica muscular, como
demonstrado no músculo gastrocnêmio (TISDALE, 2000, 2001). A administração de PIF
em camundongos não-portadores de tumor produziu um estado de caquexia, com
27
rápida perda de peso, devido à depleção seletiva de massa magra (TISDALE, 1999,
2000).
A degradação de proteínas in vitro está associada com significativa elevação
de PGE2, a qual pode atuar como mensageiro intracelular, porque a atenuação do
catabolismo protéico com um anticorpo monoclonal para o PIF também inibiu a
resposta da PGE2 (TISDALE, 2000). O PIF também parece ser capaz de aumentar a
expressão do NF-kB (fator capaz de induzir a expressão de genes envolvidos com a
degradação protéica) em cultura de células musculares, elevando a proteólise
(ARGILÉS et al., 2005).
Tem sido sugerido que citocinas, em particular o TNF-α (KOTLER, 2000;
TISDALE, 2003), a IL-6 (TISDALE, 2003), a IL-1 (KOTLER, 2000; TISDALE, 2003) e o INF-γ
(ACHARYYA et al., 2004; TISDALE, 2003), podem estar associadas à proteólise e
apoptose no músculo esquelético (ARGILÉS et al., 2005). A administração in vivo de
TNF-α aumentou a expressão do gene e a concentração de ubiquitina livre e conjugada
em músculo esquelético de ratos (ARGILÉS et al., 2003; SAINI et al., 2006).
O TNF-α liga-se aos receptores de superfície (TNFR1) e ativa o fator de
transcrição NF-kB por uma cascata de eventos que resulta em degradação do I-kBα,
proteína que inibe o NF-kB. Este processo depende da produção mitocondrial, induzida
por TNF-α, de ROS que conduz à rápida degradação do I-kBα e ativação da via
ubiquitina. Esses eventos culminam na translocação do NF-kB ao núcleo e expressão
de genes envolvidos na indução da proteólise muscular (SAINI et al., 2006).
Em conjunto com a massiva perda de proteína do músculo esquelético,
durante a caquexia do câncer, o DNA muscular é também reduzido por fragmentação,
resultando em apoptose. Este fenômeno pode estar associado com o TNF-α, uma vez
que esta citocina pode mimetizar a resposta apoptótica em músculos de animais
saudáveis (ARGILÉS et al., 2005).
A IL-6 encurta a meia-vida de proteínas de vida longa e aumenta a atividade
do proteassoma 26S e das catepsinas B e B+L (TISDALE, 1999). Um estudo mostrou que
o tratamento com um anticorpo para a IL-6 reverteu com sucesso os parâmetros-chave
da caquexia em camundongos portadores de adenocarcinoma de cólon, entretanto há
28
um estudo com músculo incubado de rato que não encontrou efeito direto da IL-6 na
proteólise muscular (ARGILÉS et al., 2003, 2005).
Embora sejam capazes de ativar a expressão do gene da ubiquitina, não há
estudos demonstrando a degradação protéica diretamente pela IL-1 ou pelo IFN-γ.
Porém o tratamento de ratos com IL-1b demonstrou seu efeito sinérgico com o TNF-α
(TISDALE, 2003) e também uma regulação positiva na expressão das ubiquitina ligases
MuRF1 e MAFbx/atrogina-1 (COSTELI
&
BACCINO, 2003). Adicionalmente, a utilização
de anticorpo monoclonal contra INF-γ foi capaz de reverter a degradação muscular
associada ao crescimento do carcinoma pulmonar de Lewis em camundongos (ARGILÉS
et al., 2003, 2005, TISDALE, 2003).
Alguns tumores, como o Walker-256, são capazes de produzir toxormônios
que inibem a incorporação de aminoácidos em proteínas miofibrilares. A inibição da
síntese protéica em músculo estriado, e também in vitro (cell-free), pelo toxormônio
é de particular significância como causa direta da caquexia (RUBIN, 2003).
A perda de massa muscular é refletida nas concentrações de aminoácidos
plasmáticos. A maioria dos estudos reporta um decréscimo de aminoácidos
neoglicogênicos em portadores de tumor, em contraste aos indivíduos severamente
mal-nutridos, onde as concentrações de aminoácidos de cadeia ramificada no plasma
estão normais ou até aumentadas (TISDALE, 2003). Aminoácidos neoglicogênicos são
aqueles cujo catabolismo origina piruvato ou um dos intermediários do ciclo de Krebs,
importantes para a neoglicogênese e para a síntese de glicogênio no fígado e músculo
dos animais (GUAITANI et al., 1982).
A célula tumoral é capaz de usar qualquer substrato como fonte energética:
glicose, lipídeos, corpos cetônicos e mesmo aminoácidos. A utilização de glicose e
ácidos graxos de cadeia longa diminui a taxa de utilização de glutamina, indicando
que as células tumorais dão preferência aos primeiros substratos, se presentes
(MEDINA, 2001). Neoplasias altamente malignas se desenvolvem com pouca
vascularização, portanto, altas taxas glicolíticas anaeróbica e glutaminolíticas suprem
essa falta de irrigação sanguínea, permitindo que o tumor sobreviva em áreas de
hipóxia (MAZUREK et al., 1997).
29
A glutamina e a alanina são dois eficientes transportadores de nitrogênio e de
esqueleto carbônico entre os diferentes tecidos do organismo. O íon amônio é
extremamente tóxico à maioria das células, a menos que seja carreado por um
aminoácido. A glutamina é o principal veículo para o transporte de amônia em uma
forma não-tóxica e a principal fonte de nitrogênio das células tumorais, já que é o
aminoácido mais abundante do corpo. Isso acarreta profundas mudanças no
metabolismo do hospedeiro, acomodando-o às necessidades crescentes de glutamina
pelo tumor (TISDALE, 2005). No tumor, a glutamina é utilizada como fonte de energia,
quando convertida a lactato (glutaminólise), ou para a síntese de novos componentes
nitrogenados, inclusive purinas e pirimidinas. Assim, o tumor produz respostas
específicas no metabolismo do nitrogênio, de modo que todo o organismo do
hospedeiro é mobilizado para que a taxa circulante de glutamina aumente (MEDINA,
2001).
1.4 Alterações no metabolismo de carboidratos na caquexia associada ao câncer
O metabolismo de carboidratos é dependente do estado alimentar do
indivíduo. Com a menor ingestão alimentar, como durante a anorexia - definida por
perda do apetite e pela saciedade precoce, ocorrem inúmeras mudanças metabólicas
(CASPER, 1996; TISDALE, 2001).
A anorexia está presente em mais da metade dos pacientes com câncer e, de
um modo geral, as citocinas parecem induzir anorexia por inibição do neuropeptídeo Y
(NPY), o mais potente estimulador do apetite (neuropeptídeo orexigênico) e/ou por
estimulação do fator liberador de corticotrofina (CRF), um neuropeptídeo
anorexigênico (Inui
&
MEGUID, 2003).
O TNF-a parece modular neurônios sensíveis à glicose do núcleo ventromedial
e da área hipotalâmica lateral provocando supressão da ingestão alimentar de maneira
dose-dependente (RAMOS et al., 2004). A IL-1 induz anorexia principalmente devido
ao desenvolvimento de saciedade precoce, a qual tem sido correlacionada com
aumento da atividade serotoninérgica (RAMOS et al. 2004). Com relação à IL-6, seu
mecanismo não está claro, mas estudos mostram melhora de apetite e ganho de peso
pela menor expressão desta citocina após aplicação de corticosteróides ou
30
antagonistas específicos, como anticorpo anti-(IL-6) (MARTIGNONI et al., 2003).
Também não se sabe o mecanismo pelo qual o IFN-
g
provoca anorexia. A administração
de anti-(IFN-g) em ratos com sarcoma MCG reduziu a anorexia e a perda de peso, e
aumentou o tempo de sobrevida, mas o efeito foi fugaz mesmo com reforço de
anticorpo, mostrando que tal citocina não causa o estado de anorexia-caquexia
isoladamente (NETO et al., 2001). Adicionalmente, alguns hormônios circulantes, que
são conhecidos por terem efeitos importantes na regulação da ingestão alimentar e no
peso corpóreo, tais como leptina (anorexigênico) e grelina (orexigênico), parecem
exercer alguma função nesta síndrome. Entretanto, os papéis da leptina e da grelina
na anorexia do câncer são pobremente definidos, e ainda podem variar dependendo
dos diferentes estados da doença, agudo ou crônico (RAMOS et al., 2004).
Embora a anorexia provoque mudanças no metabolismo de carboidratos e seja
freqüentemente associada à caquexia do câncer, outros fatores contribuem para tais
alterações, como, por exemplo, a atividade metabólica do próprio tumor (TISDALE,
2001).
A arquitetura dos tumores sólidos possui importância na determinação dos
substratos metabólicos utilizados para a produção de energia. Grandes tumores
sólidos, como o Walker-256, de crescimento rápido e pouca vascularização,
apresentam pobre suprimento sanguíneo. Muitas regiões tumorais tornam-se hipóxicas
e utilizam, preferencialmente, a via glicolítica anaeróbica para a produção de energia
(VICENTINO et al., 2002b).
Assim, nestes tipos de tumor, a glicose é a fonte primária de energia
(TISDALE, 2000), e a quantidade requerida pelas células tumorais é cerca de quatro a
cinco vezes à das células normais (TIJERINA, 2004), estabelecendo-se um mecanismo
de competição por este substrato entre o tumor e os demais tecidos do hospedeiro.
O aumento na captação de glicose e de sua conversão para lactato é
necessário para manter o nível de ATP para sobrevivência e proliferação contínua das
células tumorais, e estes mecanismos são mediados pelo fator induzido por hipóxia
(HIF), um fator de transcrição capaz de estimular a expressão de mais de 70 genes
(BRAHIMI-HORN et al., 2007).
31
Sob estas condições de hipóxia, a rápida taxa de utilização de glicose pelas
células tumorais juntamente com a anorexia resultam em hipoglicemia no hospedeiro
e elevação da concentração de lactato sangüíneo, o qual é convertido novamente à
glicose no fígado pela via da neoglicogênese, estabelecendo entre o tumor e o fígado
um ciclo fútil, conhecido como ciclo de Cori (BONGAERTS et al., 2006; PIFFAR et al.,
2003).
O turnover da glicose pelo ciclo de Cori aumenta de 20%, em indivíduos
normais, para 50%, em indivíduos com caquexia neoplásica, sendo responsável pela
eliminação de 60% do lactato produzido pelo tumor (TISDALE, 2000). A atividade
aumentada do ciclo de Cori contribui para o aumento do gasto energético na
caquexia, visto que a neoglicogênese a partir do lactato utiliza seis moléculas de ATP
para cada conversão de lactato a glicose, e a oxidação anaeróbica de glicose pelas
células tumorais produz 4 ATPs, sendo então parte da energia dissipada em forma de
calor (BONGAERTS et al., 2006; MORLEY et al., 2006; TISDALE, 2002).
A liberação hepática de glicose está aumentada em até 40% em indivíduos
com câncer (TAYEK, 1992), o que pode ser explicado pela elevada neoglicogênese e
pela ação do LMF, o qual possui potencial de ativar a glicogenólise em hepatócitos
através de aumento no AMPc. O fluxo hepático aumentado de glicose para o sangue é
necessário para suprir o requerimento de energia do tumor e do hospedeiro portador
do tumor (HIRAI et al., 1997).
Embora haja trabalhos demonstrando que em portadores de tumor há maior
liberação de glicose pela neoglicogênese hepática, há estudos de perfusão de fígado
que evidenciaram diminuição da neoglicogênese, especialmente quando a alanina foi o
precursor neoglicogênico utilizado (KELMER-BRACHT et al., 2006).
A menor taxa neoglicogênica hepática pode contribuir para a baixa
concentração de glicose plasmática encontrada nos pacientes caquéticos com câncer.
Os mesmos apresentam hipoinsulinemia, bem como elevadas concentrações de
glucagon, hormônio do crescimento e cortisol plasmáticos (BONGAERTS et al., 2006).
As concentrações de insulina plasmática têm se mostrado diminuídas em casos de
hipoglicemia associada a alguns tipos de tumores, como o Walker-256 (PIFFAR et al.,
2003), e a taxa de secreção de insulina, pelas ilhotas de Langerhans, em resposta ao
32
estímulo glicose, se mostra baixa em ratos portadores de tumor Walker-256
(FERNANDES et al., 1990).
Resistência insulínica tem sido observada em animais portadores de
caquexia/câncer. A menor atividade da LPL das células endoteliais, em ratos
portadores de sarcoma MCA, pode ser decorrente da resistência à insulina (NOGUCHI
et al., 1996). Em células adiposas de ratos com sarcoma MCA há decréscimo na
quantidade total de GLUT4 no estado basal e na translocação de GLUT4 em resposta
ao estímulo insulínico (YOSHIKAWA et al., 1997). A resistência insulínica nestas células
pode ser causada pela inibição da fosforilação da tirosina do substrato do receptor de
insulina-1 (IRS-1) (YOSHIKAWA et al., 1999).
Em humanos portadores de carcinoma e caquéticos, a intolerância à glicose e
a resposta anormal à insulina parecem ser a mesma de animais, indicando decréscimo
da função hepática e resistência à insulina (ROFE et al., 1994; TAYEK, 1992).
Algumas citocinas podem atuar diretamente no metabolismo de carboidratos
de indivíduos caquéticos, como o TNF-α, que é capaz de promover resistência à
insulina em hepatócitos (HOTAMISLIGIL, 1999; TORISU et al., 2007), células adiposas
(HOTAMISLIGIL, 1999; MLINAR et al., 2007; PATIAG et al., 2000; YOSHIKAWA et al.,
1999; WARNE, 2003) e músculo esquelético (PLOMGAARD et al., 2005).
A infusão in vivo de TNF-α em humanos saudáveis reduziu a ação estimulatória
da insulina no IRS-1, por aumentar a fosforilação do resíduo de serina e diminuir a
fosforilação da tirosina em músculo esquelético, além de reduzir a fosforilação da
proteína quinase B (PKB ou AKT), o que pode prover um mecanismo de resistência
insulínica na captação de glicose, porque a translocação do GLUT4 é dependente,
dentre outros, da fosforilação da PKB (PLOMGAARD et al., 2005). A PKB é uma quinase
específica para serinas/treoninas que se encontra provavelmente inativa nas células
na ausência de estímulo insulínico, tornando-se ativa após sua fosforilação e assim
regulando a sinalização da insulina, o metabolismo da glicose bem como o
crescimento, o ciclo e a proliferação celular (DOWNWARD, 1998).
Outros achados indicam que o receptor de insulina seja modificado ou o
próprio TNF-α promova a produção de um inibidor para o receptor de insulina,
atenuando a captação de glicose (HOTAMISLIGIL, 1999). Além dos receptores
33
transmembranas, há duas proteínas receptoras solúveis para o TNF-α (BULLÓ-BONET
et al., 1999), as quais estão em maior concentração em pacientes com câncer
(ELSASSER-BEILE et al., 1994). Embora não esteja completamente elucidado, é
possível que o TNF-α exerça as respostas citotóxicas e as alterações metabólicas
quando ligado a um desses receptores (PATIAG et al., 2000). O TNF-α pode exercer os
seus efeitos de forma autócrina ou parácrina, quando em baixa concentração, ou de
maneira endócrina, quando liberado no sangue em maior concentração (BULLÓ-BONET
et al., 1999).
A interleucina-6 (IL-6) é outra citocina implicada na resistência à insulina
durante a caquexia (TISDALE, 1997) e está correlacionada ao aumento da
concentração circulante de TNF-α, visto que o TNF-α induz a produção da IL-6, que,
por sua vez, inibe a expressão do gene do TNF-α (LANGSTEIN
&
NORTON, 1991; NETO
et al., 2001).
A IL-6 induz, in vivo e in vitro, a expressão da proteína supressora da
sinalização de citocinas-3 (SOCS-3) hepática, capaz de inibir a sinalização do receptor
de insulina, promovendo resistência à insulina (SENN et al., 2003) e ainda funciona
como uma E3 ubiquitina-ligase (principal enzima da cascata de ubiquitinação da via
proteolítica ubiquitina-proteassoma, conhecida também como atrogina-1) para IRS-1
(TORISU et al., 2007). A SOCS-3 associa-se com o receptor de insulina, suprimindo a
sua autofosforilação, a fosforilação da tirosina do IRS-1, a associação do IRS-1 com a
subunidade p85 da proteína quinase-3 (PI3K) e a ativação da PKB (SENN et al., 2003;
TORISU et al., 2007).
Em resumo, os dados da literatura demonstram que na caquexia por câncer há
alterações complexas e profundas no metabolismo de lipídeos, proteínas e
carboidratos. Entretanto, não há estudos caracterizando parâmetros plasmáticos e
hepáticos das alterações metabólicas ao longo do período de desenvolvimento da
caquexia/câncer, particularmente em ratos portadores do tumor Walker-256. A
neoglicogênese hepática é outra questão obscura na caquexia associada ao câncer,
especialmente no modelo Walker-256. Diante disto, seguem-se os objetivos do
presente trabalho.
Objetivos
35
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Investigar possíveis alterações metabólicas em parâmetros plasmáticos e
hepáticos na caquexia induzida por tumor Walker-256.
2.2 Específicos
· Caracterizar a caquexia ao longo do desenvolvimento do tumor Walker-256
em ratos e avaliar a ingestão alimentar e a massa do músculo gastrocnêmio
no dias 5, 8, 11 e 14 após a inoculação das células tumorais.
· Avaliar o perfil lipídico (colesterol, triacilgliceróis e ácidos graxos livres) e a
concentração de precursores neoglicogênicos (glicerol e lactato)
plasmáticos, bem como a uremia, glicemia e o conteúdo de glicogênio
hepático em ratos portadores de tumor Walker-256 no 5
o
, 8
o
, 11
o
e 14
o
dias
após a inoculação das células tumorais.
· Avaliar em estudos de perfusão de fígado, no 12
o
dia após a inoculação das
células tumorais, a neoglicogênese e o consumo de oxigênio a partir de
vários precursores de glicose (L-alanina, piruvato, L-lactato e glicerol).
Material e Métodos
37
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Reagentes
Os sais do líquido de perfusão, os precursores neoglicogênicos e os demais
reagentes foram adquiridos da SIGMA, MERCK, REAGEN, J.T. Backer, Mallinckrodt,
Nuclear ou CAQ – Casa Química.
3.2 Animais
Foram utilizados ratos machos adultos, da linhagem Wistar, pesando entre 220
e 230 g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina e
mantidos em gaiolas coletivas no Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas, a
uma temperatura de 23±2ºC, com ciclo claro/escuro de 12 horas, livre acesso à água e
alimentados com ração Nuvilabâ para roedores. Os experimentos, cujos protocolos
foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Estadual de Londrina, foram sempre iniciados no mesmo horário para minimizar
variações circadianas.
Nos experimentos para caracterização da caquexia ou para avaliação das
alterações metabólicas plasmáticas e do conteúdo de glicogênio hepático foram
utilizados de 5 a 20 animais por grupo, nos seguintes grupos:
· Grupo Walker-256 (WK): ratos portadores de tumor Walker-256 alimentados à
vontade, os quais foram subdivididos em 4 subgrupos – 5º, 8º, 11º e 14º dias
após a inoculação das células tumorais;
· Grupo Controle Pair Fed: ratos sem tumor que receberam diariamente a
mesma quantidade de ração (alimentação reduzida) que ingerem os animais
do grupo tumor, os quais foram subdivididos em 4 subgrupos – 5º, 8º, 11º e 14º
dias após a inoculação de PBS (salina tamponada com fosfato);
· Grupo Controle: ratos sem tumor (inoculação de PBS), alimentados à vontade.
Nos experimentos para avaliação da neoglicogênese e do consumo de oxigênio
hepáticos foram utilizados de 4 a 12 animais por grupo, nos seguintes grupos:
38
·
Grupo Controle: ratos sem tumor (inoculação de PBS), com 24 horas de
privação alimentar;
· Grupo Walker-256 (WK): ratos portadores de tumor Walker-256, no 12º dia
após a inoculação das células tumorais, com 24 horas de privação alimentar.
3.3 Implantação do tumor Walker-256
Células Walker-256, cedidas pelo Laboratório de Metabolismo Hepático da
Universidade Estadual de Maringá (UEM), foram mantidas através de passagens
semanais por inoculação asséptica intraperitoneal de 1,0 ou 2,0x10
6
células/animal.
Após 7 dias de crescimento ascítico, os animais anestesiados com éter etílico foram
eutanasiados por deslocamento cervical e o exsudato peritoneal foi retirado e
submetido à centrifugação diferencial a 4°C para obtenção das células tumorais. As
células foram ressuspensas em PBS (tampão fosfato 16,5 mM, contento NaCl 137 mM e
KCl 2,7 mM), pH 7,4, e sua viabilidade avaliada pelo método de exclusão do azul de
tripan em câmara de Neubauer.
Os ratos do grupo tumor foram inoculados com 8,0x10
7
células tumorais
viáveis/animal, subcutaneamente, no flanco direito traseiro. Para os grupos pair fed e
demais controles foi inoculado PBS no mesmo local. Para estes procedimentos os
animais foram previamente anestesiados com éter etílico.
3.4 Experimentos para caracterização da caquexia em ratos portadores de tumor
Walker-256 e avaliação de parâmetros relacionados
No dia antecedente ao 5
o
, 8
o
, 11
o
ou 14
o
dias após a inoculação das células
tumorais (grupo WK) ou PBS (grupo controle), os animais foram alojados em gaiolas
metabólicas individuais, contendo 40 g de ração e água à vontade, para a análise de
ingestão alimentar. Após 24 horas, a sobra da ração foi pesada e subtraída da
quantidade ofertada inicialmente, para o cálculo da quantidade diária ingerida por
100 gramas de peso corporal (g%). Baseado nas médias de ingestão alimentar foi
realizado o grupo controle pair fed.
39
Em seguida, os animais foram pesados, anestesiados com éter etílico e
eutanasiados por deslocamento cervical. Logo após, a massa tumoral total (tumor do
flanco e metástases) foi cuidadosamente dissecada e pesada para o cálculo da % de
perda de massa corpórea de acordo com a equação abaixo. Os animais foram
considerados caquéticos quando apresentaram perda de massa corpórea próxima ou
maior que 10%.
% Perda de massa corpórea = [mie–mfe+(mt)+gmc] x 100
Onde:
mie = massa corpórea inicial do animal com tumor;
mfe = massa corpórea final do animal com tumor;
mt = massa do tumor;
gmc = ganho de massa do grupo controle.
Assim como a massa tumoral, o músculo gastrocnêmio também foi
cuidadosamente dissecado e pesado. A massa obtida em g foi submetida ao cálculo
abaixo para expressão em g%:
mmgc = mmg x 100
Onde:
mmgc = massa do músculo gastrocnêmio em g%;
mmg = massa do músculo gastrocnêmio em g da pata contralateral à inoculada;
mfe = massa corpórea final do animal com tumor;
mt = massa do tumor.
(mie+gmc)
mfe
-
mt
40
3.5 Experimentos para avaliação das alterações metabólicas plasmáticas e do
conteúdo de glicogênio hepático
Nos dias 5, 8, 11 e 14 após a inoculação das células tumorais (grupo WK) ou
PBS (grupos controle pair fed e controle), os animais foram pesados e submetidos à
decapitação para coleta de sangue. O fígado foi imediatamente retirado e congelado
para posterior quantificação do conteúdo de glicogênio. As amostras de sangue foram
rapidamente centrifugadas e os plasmas armazenados em freezer para posterior
determinação das concentrações de colesterol total, triacilgliceróis, ácidos graxos
livres, glicerol, lactato, uréia e glicose.
3.6 Experimentos de perfusão de fígado in situ para avaliação da neoglicogênese e
do consumo de oxigênio hepáticos
No 12
o
dia após a inoculação das células tumorais (grupo WK) ou PBS (grupo
controle), os animais foram pesados e submetidos à técnica de perfusão de fígado in
situ, introduzida no Brasil por Kelmer-Bracht et al (1984).
O sistema para a perfusão de fígado é basicamente composto por:
reservatórios para o líquido de perfusão, uma bomba peristáltica e um oxigenador de
membrana, acoplados a um banho-maria com bomba de circulação externa de água
aquecida e um cilindro com mistura carbogênica (O
2
/CO
2
=95/5%).
O oxigenador de membrana é formado por um cilindro duplo de alumínio, ao
redor do qual estão enrolados tubos de silicone de parede fina (0,25 mm), com
diâmetro interno de 2 mm e comprimento total de 15 metros. A câmara interna do
cilindro de alumínio é termostatizada pelo banho-maria, por meio da bomba de
circulação externa de água aquecida. O cilindro de alumínio está isolado do ambiente
por uma cobertura cilíndrica de plástico transparente, mantendo-se no seu interior
uma atmosfera de O
2
e CO
2
,
nas proporções de 95:5. O sistema ainda contém um
dispositivo que impede a entrada de bolhas de ar no fígado (capta-bolhas).
O líquido de perfusão utilizado foi o tampão Krebs/Henseleit-bicarbonato (KH)
(KREBS
&
HENSELEIT apud KELMER-BRACHT, 1993) modificado por Souza (1999). No
sistema de perfusão o líquido de perfusão é impulsionado pela bomba peristáltica em
41
direção ao oxigenador de membrana. Neste local se processam as trocas gasosas. O O
2
e o CO
2
contidos na atmosfera carbogênica (95% O
2
/ 5% CO
2
), por troca passiva,
passam para o líquido de perfusão que circula no interior dos tubos de silicone. A fina
espessura da parede destes tubos, seu pequeno diâmetro e o seu comprimento total
(grande área de secção transversa) favorecem as trocas. Com os fluxos normalmente
utilizados (nunca acima de 45 mL por minuto), o tempo de permanência do líquido no
oxigenador de membrana é de aproximadamente 1 minuto, e a saturação, próxima a
99%. Desse modo, o líquido saturado de ar (21% de O
2
, 78% de N
2
além de outros), por
troca passiva, satura-se com 95% de O
2
e 5% de CO
2.
A entrada de CO
2
no líquido de
perfusão diminui o seu pH inicial de 7,6 para 7,4. O líquido de perfusão deixa o
oxigenador, saturado de O
2
e CO
2
,
aquecido a 37
o
C e com pH 7,4, passa pelo capta-
bolhas e se desloca em direção à cânula a ser inserida na veia porta.
Para a perfusão do fígado, os animais controles e portadores do tumor Walker-
256 foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/Kg) e fixados em mesa
cirúrgica. O abdômen foi aberto até a altura do diafragma por uma incisão longitudinal
central e duas incisões laterais, com exposição do fígado e dos demais órgãos.
Ligaduras frouxas foram colocadas ao redor da veia cava inferior, logo acima da veia
renal direita, e ao redor da veia porta. Em seguida a veia porta foi canulada sob baixo
fluxo, aproximadamente 10 mL/minuto e, imediatamente após a canulação, os vasos
abdominais abaixo do fígado foram seccionados para que houvesse completo
dessangramento deste órgão. Esta incisão dá vazão ao líquido extra que é bombeado
para o sistema circulatório, evitando o aumento excessivo de pressão no fígado. Logo
após, o fluxo foi elevado para garantir a oxigenação hepática, e a ligadura em torno
da veia porta foi amarrada para fixação da cânula. O tórax foi aberto para exposição
completa do fígado, e a veia cava inferior, acima do diafragma, foi ocluída para
desviar o líquido, que deixa o fígado através da veia hepática, para a veia cava
inferior, abaixo do fígado. Posteriormente, a veia cava inferior (porção infra-hepática)
foi canulada e a extremidade livre da cânula foi conectada a uma câmara de acrílico
onde estava posicionado o eletrodo de Clark para registro da concentração de oxigênio
no líquido efluente (perfusado).
42
Logo após, o fluxo através do fígado foi ajustado para valores que permitissem
sua oxigenação adequada (aproximadamente 4 mL.min
-1
.g
-1
de fígado). Este fluxo está
muito acima dos valores fisiológicos (0,15 mL.min
-1
.g
-1
) e visa compensar a ausência de
eritrócitos no líquido de perfusão.
A perfusão do fígado foi, portanto, realizada em sistema aberto (não-
recirculante), sendo o direcionamento do fluxo no sentido do hepatócito periportal
para o hepatócito perivenoso (perfusão monovascular anterógrada).
Após os 20 minutos iniciais de perfusão, para a estabilização do consumo de
oxigênio, o líquido efluente do fígado, depois de passar pelo eletrodo de oxigênio, foi
coletado em intervalos de 2 minutos para determinação da concentração de glicose,
lactato, piruvato ou uréia. Durante este período a perfusão do fígado dos animais
controles e portadores de tumor Walker-256 foi realizada por um dos seguintes modos:
*KH= Krebs-Henseleit
Ao término do experimento, o fígado foi retirado e pesado para que a
produção de glicose, lactato, piruvato ou uréia por grama de fígado (mmol.min
-1
.g
-1
)
pudesse ser quantificada. A expressão dos resultados em relação ao peso do órgão
permite comparações de experimentos nos quais foram empregados fígados com
diferentes pesos.
Finalmente, o tumor foi cuidadosamente dissecado e pesado para confirmação
do estado caquético, pela equação descrita anteriormente.
0-10 min 10-40 min 40-60 min
KH*
KH + piruvato 5 mM, L-lactato 2 mM, L-lactato 8 mM
ou glicerol 2 mM
KH
KH KH + L-alanina 2,5 mM
43
3.7 Procedimentos analíticos
3.7.1 Determinação da concentração de colesterol total
A concentração de colesterol total no plasma foi determinada por método
enzimático, conforme descrito por Tietz (1995), onde os ésteres de colesterol são
clivados a colesterol e ácidos graxos pela colesterol-esterase (CE). O colesterol
resultante é oxidado enzimaticamente pela colesterol-oxidase (CO) a peróxido de
hidrogênio e colest-4-en-3-ona. O peróxido de hidrogênio, em presença da peroxidase
(POD), produz a ligação oxidativa do fenol com a 4-aminoantipirina (4-AAP) e dá
origem a um cromógeno com máximo de absorção no comprimento de onda de
505 nm.
ésteres de colesterol
CE
colesterol + ácidos graxos
colesterol + O
2
CO
colest-4-en-3-ona + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-AAP + fenol
POD
quinoneimina + 4 H
2
O
3.7.2 Determinação da concentração de triacilgliceróis
A concentração de triacilgliceróis no plasma foi determinada por método
enzimático baseado na reação de Trinder (1969). Neste método, os triacilgliceróis são
convertidos pela lipase a glicerol e ácidos graxos, o glicerol a glicerol-1-fosfato pela
glicerolquinase e o glicerol-1-fostato resultante é oxidado enzimaticamente pela
glicerol-1-fosfato oxidase (GPO) a peróxido de hidrogênio e di-hidroxiacetona fosfato.
O peróxido de hidrogênio, em presença da peroxidase (POD), produz a ligação
oxidativa do 3,5-dicloro-2-hidroxibenzenosulfonato (DHBS) com a 4-aminoantipirina (4-
AAP) e dá origem a um cromógeno com o máximo de absorção no comprimento de
onda de 505 nm.
triglicérides
lipase
glicerol + ácidos graxos
glicerol + ATP
glicerolquinase
glicerol-1-fosfato + ADP
glicerol-1-fosfato + O
2
GPO
di-hidroxiacetona fosfato + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-AAP + DHBS
POD
quinoneimina + 2 H
2
O
44
3.7.3 Determinação da concentração de ácidos graxos livres
Os ácidos graxos livres foram determinados pelo método de Falholt et al.
(1973). Neste método os ácidos graxos livres são extraídos do plasma por meio de
solução extratora (clorofórmio-heptano-metanol e tampão fosfato). Os ácidos graxos
reagem com o reativo de cor (difenilcarbazida + difenilcarbazona em etanol) dando
origem a um cromógeno que se quantifica espectrofotometricamente a 550 nm.
ácido graxo livre + difenilcarbazida composto colorido
3.7.4 Determinação da concentração de glicerol
O glicerol plasmático foi quantificado por “kit” enzimático específico para
dosagem de triacilgliceróis, utilizando-se o mesmo procedimento de determinação dos
triacilgliceróis, descrito anteriormente, exceto que a lipase, a enzima que cliva os
triacilgliceróis da amostra em glicerol e ácidos graxos não foi adicionada ao ensaio. As
reações a seguir resumem o procedimento:
triglicérides
lipase
glicerol + ácidos graxos
glicerol endógeno + ATP
glicerolquinase
glicerol-1-fosfato + ADP
glicerol-1-fosfato + O
2
GPO
di-hidroxiacetona fosfato + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-AAP + DHBS
POD
quinoneimina + 2 H
2
O
3.7.5 Determinação da concentração de lactato
O lactato plasmático e do perfusado foi quantificado por método enzimático,
segundo a técnica de Gutmann
&
Wahlefeld (1974). Neste método, o L-lactato é
oxidado a piruvato pelo NAD
+
em uma reação catalisada pela lactato-desidrogenase
(LDH), conforme esquematizado a seguir. A formação de NADH é proporcional à
concentração de L-lactato e medida espectrofotometricamente a 340 nm.
L-lactato + NAD
+ LDH
piruvato + NADH + H
+
45
3.7.6 Determinação da concentração de piruvato
A concentração de piruvato no perfusado foi quantificada por método
enzimático, de acordo com técnica de Czok
&
Lamprecht (1974). Nesse método, o
piruvato é convertido enzimaticamente em L-lactato, com oxidação de quantidades
estequiométricas de NADH, em uma reação catalisada pela LDH, que pode ser
observada abaixo. A oxidação de NADH é proporcional à quantidade de piruvato
convertido e medida espectrofotometricamente a 340 nm.
piruvato + NADH + H
+
LDH
L-lactato + NAD
+
3.7.7 Determinação da concentração de uréia
As concentrações de uréia no plasma e no perfusado foram determinadas por
método enzimático, de acordo com a técnica de Gutmann
&
Bergmeyer (1974), no
qual a uréia é hidrolisada pela urease a amônia e gás carbônico. A amônia reage em
pH alcalino com hipoclorito de sódio e fenol, sob ação catalisadora do nitroprussiato
de sódio, para formar azul de indofenol, como segue adiante. A concentração de azul
de indofenol é proporcional à concentração de uréia na amostra e é medida
espectrofotometricamente a 600 nm.
uréia + H
2
O
urease
2NH
3
+ CO
2
2NH
3
+ 2NaClO 2NH
2
Cl + 2NaOH
2NH
2
Cl + 2 fenol + 2NaOH
2-p-aminofenol + 2NaCl + 2H
2
O
2-p-aminofenol + 2 fenol + O
2
2 indofenol + 2 H
2
O
3.7.8 Determinação da concentração de glicose
As concentrações de glicose no plasma e no perfusado foram medidas pelo
método da glicose-oxidase (BERGMEYER
&
BERNT, 1974). Neste método, a glicose é
oxidada enzimaticamente pela glicose-oxidase (GOD) a ácido glucônico e peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
). O H
2
O
2
, em presença de peroxidase (POD), produz a ligação
oxidativa do fenol com a 4-aminofenazona (4-AF) e dá origem a um cromógeno com
46
máximo de absorção em 505 nm de comprimento de onda. O esquema a seguir resume
estas reações:
glicose + O
2
+ H
2
O
GOD
ácido glucônico + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-AF + fenol
POD
4 (p-benzoquinona-monoimino) fenazona + H
2
O
3.7.9 Determinação da concentração de glicogênio hepático
O glicogênio hepático foi quantificado pelo método da antrona, segundo a
técnica de Hassid
&
Abraham (1957). Nesse método resíduos de glicose liberados pela
hidrólise ácida do glicogênio (ácido sulfúrico) reagem com a antrona e dão origem a
um composto colorido que se quantifica espectrofotometricamente a 620 nm.
glicogênio + H
2
SO
4
resíduos de glicose
glicose + antrona composto colorido
3.10 Determinação do consumo de oxigênio hepático
O consumo de oxigênio pelo fígado foi calculado a partir da seguinte equação:
Consumo de O
2
= [O
2
porta] - [O
2
cava] x Fluxo (mmol/min.g)
Peso fígado
Onde:
[O
2
porta] = concentração de oxigênio que entra no fígado, ou seja, aquela presente
no líquido de perfusão (860 mM), quando saturado com 95% de oxigênio da mistura
carbogênica.
[O
2
cava] = concentração de oxigênio que deixa o fígado, ou seja, aquela presente no
líquido de perfusão efluente, após passar pelo fígado. A concentração de oxigênio no
perfusado efluente foi medida polarograficamente através de um eletrodo de oxigênio
(eletrodo de Clark ou oxímetro), durante todo o período de perfusão.
47
3.8 Procedimentos estatísticos
Os experimentos foram realizados de forma inteiramente casualizada e todos
os dados obtidos foram testados quanto à distribuição normal (testes de Shapiro-Wilk e
Lilliefors) e à homogeneidade das variâncias (testes de Levene e Brown Forsythe). Na
constatação de que foram satisfeitas as condições para aplicação dos testes
estatísticos paramétricos de comparação de médias, as seguintes análises estatísticas
foram realizadas:
a) os dados das análises plasmáticas de colesterol total, triacilgliceróis, ácidos
graxos livres, glicerol e glicemia e também o conteúdo de glicogênio hepático, por
terem apresentado as devidas características de independência, foram comparados
por Análise de Variância Unidimensional (ANOVA), seguida por teste de Newman-Keuls;
b) as diferenças entre as áreas sob as curvas (AUCs) na perfusão de fígado
foram avaliadas pelo teste t de Student para amostras independentes. As AUCs foram
calculadas, no intervalo de tempo onde o fígado foi submetido à perfusão com o
precursor neoglicogênico (L-alanina, piruvato, L-lactato ou glicerol).
Nos conjuntos de dados em que não foram observadas distribuição normal e,
principalmente, homogeneidade das variâncias, testes estatísticos não-paramétricos
foram adotados. Para avaliação dos resultados de massa do músculo gastrocnêmio,
ingestão alimentar e concentrações de uréia e lactato plasmáticos, os quais conferem
mais de dois tratamentos e caracterizados como independentes, foi aplicado o teste
de Kruskal-Wallis seguido por teste de Dunn.
Os resultados foram expressos como média dos resultados ± erro padrão da
média. Todos as análises foram realizadas utilizando-se os programas STATISTICA 6.0 e
GRAPHPAD PRISM 4.0, adotando-se nível de significância de 5% (p<0,05).
Resultados
49
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização da caquexia em ratos portadores de tumor Walker-256 e
análise de parâmetros relacionados
A tabela 1 ilustra os valores das massas tumorais nos 5º, 8º, 11º e 14º dias
após a inoculação das células Walker-256. Como pode ser observado, houve
aumento progressivo na massa tumoral do flanco e das metástases, que alcançaram
valores próximos a 24 g e 12 g respectivamente no 14º dia de tumor. Metástases
foram encontradas principalmente em linfonodos lombares, na cavidade abdominal
e nódulos torácicos. A massa tumoral total, que corresponde à soma das massas do
flanco e das metástases, foi de aproximadamente 36 g no 14º dia de tumor,
representando uma fração considerável (cerca de 16%) do peso do animal.
Os animais portadores do tumor Walker-256 apresentaram perda
progressiva de massa corpórea ao longo do desenvolvimento do tumor, que pode
ser correlacionada com o crescimento da massa tumoral total (tabela 1). No 5º dia
após a inoculação das células tumorais, a perda de massa corpórea foi de
aproximadamente 10%, o que caracteriza a presença da caquexia já no início do
desenvolvimento tumoral. No 14º dia, a perda de massa corpórea foi de
25,66±1,25%, um valor bastante acentuado.
A tabela 1 também demonstra que houve redução na massa do músculo
gastrocnêmio e na ingestão alimentar nos animais portadores de tumor no 11º e 14º
dias, em comparação com animais controles. A redução da ingestão alimentar foi
de 32% no 11º dia e de 31% no 14º dia, caracterizando a presença da anorexia
nestes animais.
50
Tabela 1 – Caracterização da caquexia em ratos portadores de tumor Walker-256
e análise de parâmetros relacionados. Massas tumorais do flanco, das metástases
e total, percentagem de perda de massa corpórea, massa do músculo gastrocnêmio
e ingestão alimentar diária em ratos controle alimentados e portadores de tumor
Walker-256 (WK) nos dias 5, 8, 11 e 14 após inoculação das células tumorais.
Controle
WK-5 WK-8 WK-11 WK-14
Massa tumoral flanco (g)
6,66
±
0,49 10,20
±
1,03 16,04
±
1,48 24,13
±
1,60
Massa tumoral metástases (g)
0,05
±
0,03 1,75
±
0,34 3,08
±
1,26 12,47
±
1,57
Massa tumoral total (g)
6,71
±
0,49 11,95
±
1,27 19,12
±
2,43 36,12
±
2,27
Perda de massa corpórea (%)
8,93
±
1,98 9,32
±
1,20 13,93
±
1,67 25,66
±
1,25
Massa do gastrocnêmio (g%)
0,59
±
0,01 0,57
±
0,01 0,57
±
0,01 0,53
±
0,02* 0,52
±
0,02**
Ingestão alimentar/24 h (g%)
8,30
±
0,24 7,73
±
0,61 8,80
±
0,24 5,59
±
0,40** 5,73
±
0,57**
Valores representam a média ± erro padrão da média, n= 13 a 20. *p<0,05 e
**p<0,01 versus controle (ANOVA One-Way, seguido por Newman-Keuls).
51
4.2 Avaliação dos lipídeos plasmáticos
Como pode ser observado na figura 1, não houve mudanças nas
concentrações plasmáticas de colesterol total dos grupos WK e controle pair fed
para todos os dias analisados quando comparadas ao grupo alimentado, porém
observou-se diminuição a partir do 11º dia após a inoculação das células tumorais
em relação ao grupo controle pair fed correspondente.
Figura 1 – Concentrações de colesterol plasmático de ratos controle, controle
pair fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a
inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro padrão da
média de 10 a 16 experimentos. Resultados analisados por ANOVA One-Way seguida
de Newman-Keuls.
#
p<0,05 e
# # #
p<0,001 versus controle pair fed.
52
As concentrações plasmáticas de triacilgliceróis em ratos portadores de
tumor Walker-256 aumentaram a partir do 8º dia quando comparada ao grupo
controle e também a partir do 5º dia em relação ao grupo controle pair fed. Em
contraste, os animais controle pair fed mostraram redução, em todos os dias
analisados, nos triacilgliceróis plasmáticos em relação ao grupo controle (figura 2).
O aumento nos triacilgliceróis foi de 119% no 8º dia, 152% no 11º dia e 147% no 14º
dia de tumor em relação ao controle.
Figura 2 – Concentrações de triacilgliceróis plasmático de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias
após a inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro
padrão da média de 9 a 16 experimentos. Resultados analisados por ANOVA One-
Way seguida de Newman-Keuls. **p<0,01 e ***p<0,001 versus controle,
#
p<0,05 e
# # #
p<0,001 versus controle pair fed.
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
***
#
# # #
# # #
# # #
***
***
***
***
**
**
WK
Controle Pair fed
Controle
Triacilgliceróis plasmático (mg/dL)
53
Os animais portadores de tumor Walker-256 apresentaram aumento nas
concentrações de ácidos graxos livres plasmático apenas no 14º dia comparado ao
controle, cerca de 78%, porém houve aumento nos ácidos graxos livres já no 11º dia
de tumor em relação ao controle pair fed. Não houve alteração dos ácidos graxos
livres plasmático entre os grupos controle pair fed e controle (figura 3).
Figura 3 – Concentrações de ácidos graxos livres plasmático de ratos controle,
controle pair fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias
após a inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro
padrão da média de 9 a 15 experimentos. Resultados analisados por ANOVA One-
Way seguida de Newman-Keuls. ***p<0,001 versus controle,
#
p<0,05 e
# # #
p<0,001
versus controle pair fed.
0
25
50
75
100
125
150
175
200
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
# # #
#
***
WK
Controle Pair fed
Controle
Ácidos graxos livres plasmático (
m
mol/dL)
54
4.3 Avaliação de precursores neoglicogênicos plasmáticos
As concentrações de glicerol no plasma mantiveram-se inalteradas ao longo
do desenvolvimento do tumor e no grupo controle pair fed em relação ao controle.
Somente no 14º dia houve aumento de glicerol plasmático em relação ao grupo
controle pair fed correspondente (figura 4).
Figura 4 – Concentrações de glicerol plasmático de ratos controle, controle pair
fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a
inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro padrão da
média de 8 a 15 experimentos. Resultados analisados por ANOVA One-Way seguida
de Newman-Keuls.
# #
p<0,01 versus controle pair fed.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
# #
WK
Controle Pair fed
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
Controle
Glicerol plasmático (mM)
55
No que se refere ao lactato plasmático, houve aumento progressivo de sua
concentração a partir do 8º dia de desenvolvimento tumoral tanto em relação ao
grupo controle como em relação ao grupo controle pair fed correspondente (figura
5), e nenhuma alteração foi observada no grupo controle pair fed quando
comparada ao controle. O aumento no lactato foi de 128%, 218% e 282%
respectivamente no 8º, 11º e 14º dias de tumor em relação ao grupo controle.
Figura 5 – Concentrações de lactato plasmático de ratos controle, controle pair
fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a
inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro padrão da
média de 10 a 13 experimentos. Resultados analisados por Kruskal Wallis seguido
por teste de Dunn. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 versus controle,
# # #
p<0,001
versus controle pair fed.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
# # #
# # #
# # #
**
*
***
WK
Controle Pair fed
Controle
Lactato plasmático (mM)
56
4.4 Avaliação da uremia
Houve aumento significativo (231%) da concentração de uréia plasmática
somente no 14º dia após a inoculação das células Walker-256, embora haja
tendência de aumento ao longo do desenvolvimento tumoral (5º, 8º e 11º dias) em
relação ao grupo controle. Este indicativo é apoiado pela elevação da uréia
plasmática nos portadores de tumor desde o 8º dia em relação ao grupo controle
pair fed correspondente (figura 6), entretanto, não há diferenças entre as
concentrações de uréia plasmática entre animais dos grupos controle pair fed e
controle.
Figura 6 – Concentrações de uréia plasmática de ratos controle, controle pair
fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a
inoculação das células tumorais. Cada barra representa a média ± erro padrão da
média de 9 a 15 experimentos. Resultados analisados por Kruskal Wallis seguido por
teste de Dunn. **p<0,01 versus controle,
# #
p<0,01 e
# # #
p<0,001 versus controle
pair fed.
0
25
50
75
100
125
150
175
200
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
# # #
# # #
# #**
WK
Controle Pair fed
Controle
Uréia plasmática (mg/dL)
57
4.5 Avaliação da glicemia
Desde as fases iniciais de desenvolvimento da caquexia, e também no
grupo controle pair fed, as glicemias reduziram em relação ao grupo controle,
alcançando redução de 56% no 14º dia de tumor. A queda glicêmica nos portadores
de tumor teve nível de significância maior que o controle pair fed correspondente
a partir do 8º dia, apresentando-se diminuída, em aproximadamente 41%, em
relação a este no 14º dia após inoculação das células Walker-256 (figura 7).
Figura 7 – Glicemia de ratos controle, controle pair fed e portadores de tumor
Walker-256 no 5º, 8º, 11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais.
Cada barra representa a média ± erro padrão da média de 9 a 15 experimentos.
Resultados analisados por ANOVA One-Way seguida de Newman-Keuls. *p<0,05,
**p<0,01 e ***p<0,001 versus controle,
# # #
p<0,001 versus controle pair fed.
0
30
60
90
120
150
180
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
WK
Controle Pair fed
# # #
***
***
**
*
****
*
*
Controle
Glicemia (mg/dL)
58
4.6 Avaliação do conteúdo de glicogênio hepático
Os animais do grupo tumor apresentaram menor conteúdo de glicogênio
hepático em relação ao grupo controle, exceto no 8º dia, ainda que este apresente
tendência de redução, atingindo diminuição de 94% do conteúdo de glicogênio no
14º dia de tumor. Os animais do grupo controle pair fed mostraram redução do
glicogênio hepático a partir do 11º dia da restrição de ingestão alimentar, embora a
tendência apareça desde ao 5º dia. Não houve diferença entre o conteúdo de
glicogênio do grupo tumor e controle pair fed para todos os dias analisados (figura
8).
Figura 8 – Percentagem de conteúdo de glicogênio hepático em relação ao
controle de ratos controle pair fed e portadores de tumor Walker-256 no 5º, 8º,
11º e 14º dias após a inoculação das células tumorais. Cada barra representa a
média ± erro padrão da média de 5 a 20 experimentos. Resultados analisados por
Kruskal Wallis seguido por teste de Dunn. *p<0,05 e ***p<0,001 versus controle.
0
25
50
75
100
125
150
*
***
***
*
***
5º dia 8º dia 11º dia 14º dia
Controle Pair fed
WK
Controle
Glicogênio hepático (% do controle)
59
4.7 Avaliação da neoglicogênese e do consumo de oxigênio hepáticos a partir de
vários precursores de glicose
A neoglicogênese e o consumo de oxigênio dos animais no 12º dia de
desenvolvimento do tumor Walker-256 e dos animais do grupo controle, sem tumor,
ambos com 24 horas de privação alimentar, foram avaliados em fígados submetidos
à perfusão com os seguintes substratos neoglicogênicos: L-alanina 2,5 mM, piruvato
5 mM, L-lactato 2 mM e 8 mM e glicerol 2 mM. Nos experimentos de perfusão com
L-alanina, foram também analisadas as produções hepáticas de uréia, piruvato e
lactato.
Os valores basais de produção de glicose, observados nos 10 primeiros
minutos de perfusão, os quais correspondem à liberação de glicose proveniente do
glicogênio hepático residual, pós-privação alimentar de 24 horas, foram
semelhantes nos dois grupos (figuras 9A, 11A, 12A, 13A e 14A). Entretanto, os
valores basais de consumo de oxigênio foram menores (12C, 13C e 14C) ou
tenderam a serem menores (9C e 11C) nos animais portadores de tumor.
A infusão dos precursores neoglicogênicos no fígado no 10º minuto do
período de perfusão promoveu aumento na produção de glicose e no consumo de
oxigênio nos animais controle e portadores de tumor (figuras 9, 11, 12, 13 e 14), os
quais tenderam a retornar aos seus valores basais quando a infusão do precursor foi
interrompida.
Entretanto, o aumento na produção de glicose e consumo de oxigênio
hepáticos a partir do precursor L-alanina 2,5 mM foi menor nos animais portadores
de tumor (figuras 9A e 9C), como demonstrado pelas áreas sob as curvas (AUCs)
(figuras 9B e 9D). Houve redução de 58% na AUC da produção de glicose e de 56%
no consumo de oxigênio nos animais portadores de caquexia.
A infusão de L-alanina 2,5 mM também elevou a produção hepática de
uréia, piruvato e lactato em ambos os grupos (figuras 10A, 10B e 10C), porém o
aumento da produção de uréia e piruvato pelo fígado de ratos portadores de tumor
foi reduzido em relação ao controle, e não houve alteração na produção hepática
de lactato, como demonstrado pela analise das AUCs (figura 10D).
Similarmente, embora menos acentuados, a produção de glicose e o
consumo de oxigênio foram menores nos animais portadores de tumor (figuras 11A
60
e 11C), quando o precursor neoglicogênico infundido no fígado foi o piruvato 5 mM,
como evidenciado pelas AUCs (figuras 11B e 11C). As AUCs do grupo tumor foram
reduzidas em 33% para a produção de glicose e 27% para o consumo de oxigênio.
Da mesma maneira, houve inibição da neoglicogênese hepática e do
consumo de oxigênio a partir do L-lactato 2 mM nos animais portadores de tumor
(figuras 12A e 12C). Como pode ser observado pelas AUCs (figuras 12B e 12D),
houve diminuição de 26% da AUC para produção de glicose e de 40% para consumo
de oxigênio.
Diferentemente dos demais precursores neoglicogênicos, a infusão de
glicerol 2 mM resultou em aumento semelhante da produção de glicose e consumo
de oxigênio em fígados de animais portadores de tumor e animais controles (figura
14).
O L-lactato 8 mM também foi capaz de estimular a neoglicogênese hepática
e o consumo de oxigênio pelo fígado (figuras 13A e 13C) de forma similiar nos dois
grupos, como mostrado nas AUCs (figuras 13B e 13D). Vale ressaltar que esta
concentração de lactato, 8 mM, é semelhante à encontrada no sangue dos ratos
com tumor, 11 dias após a inoculação das células Walker-256.
61
Figura 9 –
Produção de glicose (A), consumo de oxigênio (C) e as respectivas áreas sob
as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e
controles durante a infusão de L-alanina 2,5 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de
privação alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e
Métodos. L-alanina 2,5 mM foi infundida no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto
representa a média ± erro padrão da média de 5 a 7 experimentos. Diferenças entre as
AUCs dos grupos tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-
pareado. **p < 0,01
versus
controle.
0
2
4
6
8
**
Controle
WK
B
Glicose
AUC de 10-40 min (
m
mol g
-1
)
0
5
10
15
20
**
Controle
WK
D
Oxigênio
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
0 10 20 30 40
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Controle
WK
Infusão de L-alanina 2,5 mM
A
Tempo de perfusão (min)
Produção de glicose (
m
mol min
-1
g
-1
)
0 10 20 30 40
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Controle
WK
Infusão de L-alanina 2,5 mM
C
Tempo de perfusão (min)
Consumo de oxigênio (
m
mol min
-1
g
-1
)
62
Figura 10 –
Produções hepáticas de uréia, piruvato e lactato (A, B e C) e as respectivas
áreas sob as curvas (D) em ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e controles
durante a infusão de L-alanina 2,5 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de privação
alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e Métodos. L-
alanina 2,5 mM foi infundida no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto representa a
média ± erro padrão da média de 4 a 7 experimentos. Diferenças entre as AUCs dos grupos
tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-pareado. *p < 0,05 e
**p < 0,01
versus
controle.
63
0
5
10
15
20
*
D
Controle
WK
Oxigênio
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
Figura 11 –
Produção de glicose (A), consumo de oxigênio (C) e as respectivas áreas sob
as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e
controles durante a infusão de piruvato 5 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de privação
alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e Métodos.
Piruvato 5 mM foi infundido no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto representa a
média ± erro padrão da média de 6 a 8 experimentos. Diferenças entre as AUCs dos grupos
tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-pareado. *p < 0,05
versus
controle.
0
4
8
12
16
*
Controle
WK
B
Glicose
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Controle
WK
A
Infusão de piruvato 5 mM
Tempo de perfusão (min)
Produção de glicose (
m
mol min
-1
g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
0
1
2
3
4
Controle
WK
C
Infusão de piruvato 5 mM
Tempo de perfusão (min)
Consumo de oxigênio (
m
mol min
-1
g
-1
)
64
0
4
8
12
16
20
Controle
WK
*
B
Glicose
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
0
5
10
15
20
25
***
Controle
WK
D
Oxigênio
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
Figura 12 –
Produção de glicose (A), consumo de oxigênio (C) e as respectivas áreas sob
as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e
controles durante a infusão de L-lactato 2 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de
privação alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e
Métodos. L-lactato 2 mM foi infundido no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto
representa a média ± erro padrão da média de 8 a 12 experimentos. Diferenças entre as
AUCs dos grupos tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-
pareado. *p < 0,05 e ***p < 0,001
versus
controle.
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Controle
WK
Infusão de L-lactato 2 mM
A
Tempo de perfusão (min)
Produção de glicose (
m
mol min
-1
g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Controle
WK
Infusão de L-lactato 2 mM
C
Tempo de perfusão (min)
Consumo de Oxigênio (
m
mol min
65
0
4
8
12
16
20
Controle
WK
B
Glicose
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
0
5
10
15
20
25
Controle
WK
D
Oxigênio
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
Figura 13 –
Produção de glicose (A), consumo de oxigênio (C) e as respectivas áreas sob
as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e
controles durante a infusão de L-lactato 8 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de
privação alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e
Métodos. L-lactato 8 mM foi infundido no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto
representa a média ± erro padrão da média de 5 a 7 experimentos. Diferenças entre as
AUCs dos grupos tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-
pareado.
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Controle
WK
Infusão de L-lactato 8 mM
A
Tempo de perfusão (min)
Produção de glicose (
m
mol min
-1
g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Controle
WK
Infusão de L-lactato 8 mM
C
Tempo de perfusão (min)
Consumo de oxigênio (
m
mol min
-1
g
-1
)
66
0
4
8
12
16
20
Controle
WK
B
Glicose
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
Figura 14 –
Produção de glicose (A), consumo de oxigênio (C) e as respectivas áreas sob
as curvas (AUCs) (B e D) em fígados de ratos portadores de tumor Walker-256 (WK) e
controles durante a infusão de glicerol 2 mM
. Fígados de ratos com 24 horas de privação
alimentar foram submetidos à perfusão
in situ
como descrito em Material e Métodos.
Glicerol 2 mM foi infundido no intervalo entre 10 e 40 minutos. Cada ponto representa a
média ± erro padrão da média de 5 a 6 experimentos. Diferenças entre as AUCs dos grupos
tumor Walker-256 e controle analisadas pelo teste t de Student não-pareado.
0
2
4
6
8
Controle
WK
D
Oxigênio
AUC de 10 a 40 min (
m
mol g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Controle
WK
Infusão de glicerol 2 mM
A
Tempo de perfusão (min)
Produção de glicose (
m
mol min
-1
g
-1
)
0 10 20 30 40 50 60
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Controle
WK
Infusão de glicerol 2 mM
C
Tempo de perfusão (min)
Consumo de oxigênio (
m
mol min
-1
g
-1)
Discussão
68
5 DISCUSSÃO
A implantação do tumor Walker-256 em ratos tem sido considerada um bom
modelo experimental para estudar a síndrome da caquexia no câncer (GUAITANI et al.,
1982), pois é uma neoplasia bem caracterizada, com crescimento rápido e uniforme,
facilmente mantida em laboratório, que raramente apresenta regressões e com
eficiência comprovada em testes terapêuticos (MORAES et al., 1997; OLIVEIRA et al.,
1998).
Em nossos estudos (tabela1), houve aumento acelerado e progressivo das
massas tumorais do flanco, das metástases e, conseqüentemente, da massa tumoral
total após a inoculação das células tumorais. A massa tumoral total foi equivalente a
16% do peso do animal no 14º dia após a inoculação das células Walker-256. Estes
resultados confirmam dados prévios da literatura de que este carcinossarcoma é de
crescimento rápido (VICENTINO et al., 2002a).
Desde a fase inicial, ou seja, no 5º dia após a inoculação das células Walker-
256, ratos portadores de tumor apresentaram perda de massa corpórea de
aproximadamente 10% (tabela 1), valor que caracteriza a presença de caquexia nesses
animais, a qual se agravou ao longo do tempo. Estes achados evidenciam o
estabelecimento deste modelo experimental de caquexia em nosso laboratório.
Embora sejam considerados caquéticos logo de início, houve redução da massa
muscular esquelética, mensurada pela massa do músculo gastrocnêmio, e da ingestão
alimentar somente a partir do 11º dia após a inoculação das células tumorais (tabela
1), demonstrando a sarcopenia e a presença de anorexia nesses animais nos estágios
mais tardios do desenvolvimento tumoral.
A redução da massa muscular esquelética pode ter sido decorrente da elevada
degradação e/ou da reduzida síntese protéica (TISDALE, 1999, 2000) e/ou da apoptose
celular (ARGILÉS et al., 2005), promovidas por citocinas (TNF-α, IL-6, IL-1 e INF-γ) e
outros fatores como o PIF (KOTLER, 2000; LOBERG et al., 2007). Diversos estudos têm
demonstrado que as citocinas e o PIF induzem a ativação de vias proteolíticas,
principalmente da via ubiquitina-proteassoma (TISDALE, 2001, 2002, 2003) e que o PIF
69
(TISDALE, 2000, 2001) e toxormônios (RUBIN, 2003) produzidos pelo tumor reduzem a
síntese protéica muscular esquelética.
A perda de massa corpórea na ausência de redução da ingestão alimentar no
início do desenvolvimento tumoral (tabela 1) e a não alteração da massa do músculo
gastrocnêmio quando animais sadios foram submetidos a um esquema de alimentação
reduzida semelhante aos dos animais com tumor (resultados não mostrados)
confirmam dados anteriores (TISDALE, 2002) de que a caquexia associada ao câncer
pode ocorrer na ausência da anorexia, o que ressalta a importância dos mediadores da
caquexia neste processo. Portanto, a anorexia sozinha não é suficiente para explicar
as complexas alterações metabólicas que ocorrem durante a caquexia, inclusive, a
suplementação nutricional e a manipulação farmacológica do apetite são incapazes de
restaurar o peso e a massa magra corpórea (TISDALE, 2002).
A anorexia, observada nos portadores de tumor (11º e 14º dias – tabela 1),
provavelmente foi resultante da ação de citocinas periféricas (TNF-a, IL-1, IL-6 e IFN-
g) as quais podem atravessar a barreira hemato-encefálica e ligarem–se a receptores
específicos no sistema nervoso central. Cada família de citocina anorexigênica utiliza
um sistema de transdução diferente, sugerindo que a anorexia induzida por caquexia é
um fenômeno complexo que envolve muitas vias de sinalização (RAMOS et al., 2004).
No intuito de estudar se as possíveis alterações metabólicas plasmáticas
presentes na caquexia poderiam ser decorrentes, pelo menos em parte, da anorexia,
quatro grupos de animais sadios, porém com alimentação reduzida (animais controle
pair fed), semelhante à ingestão alimentar dos animais portadores de tumor no 5º, 8º,
11º ou 14º dias (tabela 1), foram conduzidos.
Considerando que a perda de massa adiposa contabiliza uma grande parte da
dramática perda de peso observada no câncer em humanos e em modelos animais, e
que o metabolismo lipídico é marcadamente alterado nesta patologia (BERTEVELLO &
SEELAENDER, 2001) avaliou-se inicialmente, no presente trabalho, o perfil lipídico
plasmático.
Foi possível observar diminuição do colesterol total plasmático em portadores
de tumor Walker-256 no 11º e no 14º dias do desenvolvimento tumoral apenas em
relação aos grupos controle pair fed correspondentes, e uma tendência de redução
70
nestes mesmos dias nos grupos tumor em relação ao grupo controle (figura 1). No
entanto, Pizato et al. (2005) encontraram redução de aproximadamente 43% na
concentração plasmática de colesterol total em ratos no 14º dia de desenvolvimento
do tumor Walker-256 versus controle (animais sem tumor). Segundo Shaw (2006), o
estresse energético como hipoglicemia e estresse oxidativo, presentes em portadores
de câncer, eleva a concentração intracelular de adenosina monofosfato (AMP), a qual
ativa a proteína quinase dependente de AMP (AMPK), enzima que inativa a HMG-CoA-
redutase, suprimindo a síntese de colesterol.
Em relação aos triacilgliceróis plasmático, em contraste à progressiva redução
na sua concentração nos animais controle pair fed, os animais Walker-256
apresentaram hipertrigliceridemia a partir do 8º dia da implantação tumoral em
relação ao grupo controle (figura 2). Esta elevação da trigliceridemia pode ter sido
decorrente da inibição da LPL.
Vários estudos têm mostrado que as citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6,
IL-1α, INF-α e INF-γ) e os ácidos graxos livres (DELARUE
&
MAGNAN, 2007;
HOTAMISLIGIL, 1999; METER & GRESSNER, 2004; TISDALE, 1999; WARNE, 2003; YU &
GINSBERG, 2005) promovem inibição direta da LPL, e também inibição indireta,
através do desenvolvimento de resistência insulínica.
A citocina com maior potencial de inibição da LPL é o TNF-
a
(TISDALE, 1999).
O TNF-α pode reduzir diretamente a atividade desta enzima por diminuir sua
transcrição gênica, reduzindo a lipogênese e levando à deslipidação de adipócitos
maduros (MORIN et al., 1994). Fried
&
Zechner (1989) demonstraram que o TNF-a
suprimiu potencialmente os níveis de RNAm, a taxa de síntese e a atividade da LPL em
tecido adiposo humano. Ademais, Uchida et al. (1997) observaram que o TNF-a
estimula, em adipócitos do tecido adiposo marrom, a expressão da NO sintase
induzível, seguido pela produção de NO, o qual medeia o efeito supressor do TNF-a na
atividade da LPL através da produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc).
O TNF-α pode ainda indiretamente, via resistência insulínica, reduzir a
atividade da LPL, visto que a insulina é o principal regulador positivo (upregulation)
da síntese e atividade da LPL no tecido adiposo (YU & GINSBERG, 2005). No estado de
resistência insulínica ocorre depleção dos estoques de gordura tanto pela menor
71
hidrólise de triacilgliceróis dos quilomicrons (redução da lipogênese) mediada pela
LPL, quanto por inibição não efetiva da lipólise no tecido adiposo mediada pela HSL
(YU
&
GINSBERG, 2005), o que implica no acúmulo de triacilgliceróis circulantes.
Além de inibição da LPL, o TNF-a pode elevar os triacilgiceróis circulantes por
alterar a expressão de outras citocinas envolvidas no metabolismo lipídico, como a IL-
1 e IL-6 (YU
&
GINSBERG, 2005; VAN HALL et al., 2003), por inibir várias enzimas
envolvidas na síntese de gorduras (PAPE
&
KIM, 1988; PEKALA et al., 1983; TORTI et
al., 1985) e por estimular a lipogênese e formação de VLDL no fígado (GRUNFELD &
PALLADINO apud BULLÓ-BONET et al., 1999).
No que se refere aos ácidos graxos livres plasmáticos, houve aumento apenas
no 14º dia de tumor em relação aos animais controle (figura 3). Como não houve
diferença entre os grupos controle pair fed e controle pode-se constatar que o
aumento encontrado foi causado pela presença do tumor e não pela anorexia.
O aumento nos ácidos graxos circulantes dos animais com tumor
provavelmente foi devido à maior mobilização das reservas de tecido adiposo, e têm
sido freqüentemente relacionado com o envolvimento de citocinas. As citocinas TNF-
α, IL-6, IL-1α e o INF-γ podem ativar a HSL, enzima que estimula a hidrólise dos
triacilgliceróis do tecido adiposo (ARNER, 1995), como já mencionado.
Além das citocinas, outro fator que pode ter contribuído para a elevação dos
ácidos graxos é o LMF liberado pelo tumor ou pelas metástases. O LMF age de maneira
similar a dos hormônios lipolíticos, através da elevação intracelular de AMPc, mediada
por receptor β3-adrenérgico (TISDALE, 1997, 2003, 2004), e conseqüente fosforilação
e ativação da HSL (McGARRY, 1997). O LMF é, então, um dos responsáveis pela perda
de massa adiposa no processo de caquexia no câncer, por manter a taxa de lipólise
maior do que a de lipogênese, agindo diretamente no tecido adiposo liberando ácidos
graxos livres e glicerol (TISDALE, 1997, 2003, 2004). Como o LMF, o TNF-a estimula a
lipólise por elevação intracelular de AMPc, através da ativação de quinases reguladas
por sinal extracelular (ZHANG et al., 2002).
O aumento dos ácidos graxos plasmáticos nos animais portadores do tumor
pode também ter ocorrido pela menor capacidade de sua oxidação pelo fígado, em
decorrência da menor atividade das CATs, enzimas responsáveis pelo transporte de
72
ácidos graxos através da membrana mitocondrial interna dos hepatócitos. Um estudo
mostrou reduzida atividade principalmente da CAT I (VICENTINO et al., 2002a)
enquanto outro (SEELAENDER et al., 1998) encontrou que o componente inibido em
ratos portadores de tumor Walker-256 é a CAT II.
As células tumorais parecem também contribuir diretamente para o aumento
dos ácidos graxos livres plasmático, não só pela síntese do LMF, mas também pela
lipogênese acelerada dessas células, visto que quase todos os cânceres humanos
superexpressam constitutivamente o gene da enzima ácido graxo sintase. O início e a
manutenção dos altos níveis da ácido graxo sintase em células pré-malignas e malignas
são devidos às mudanças na expressão gênica e no metabolismo induzidas pela hipóxia
e alta acidez (MENENDEZ
&
LUPU, 2006).
Embora os dados demonstrem que a elevação dos triacilgliceróis foi mais
precoce (8
o
dia - figura 2) do que a dos ácidos graxos (14
o
dia – figura 3) nos
portadores de tumor versus controle, sugerindo em um primeiro momento que a
inibição da lipogênese possa ter precedido a estimulação da lipólise, esta seqüência
temporal pode não ser real face às complexas inter-relações metabólicas entre os
tecidos.
É possível que liberação de ácidos graxos dos adipócitos já esteja aumentada
em fases mais precoces do desenvolvimento do tumor, antes do 14
o
dia, e que os
mesmos estejam sendo utilizados como fonte de energia pelas células do hospedeiro
(MULLIGAN et al., 1992) e do tumor. Estudos têm demonstrado que um aumento de
ácidos graxos diminui a utilização de glicose pelas células do hospedeiro por meio do
ciclo de Randle (RANDLE apud DELARUE
&
MAGNAN, 2007), um mecanismo poupador
de glicose que favoreceria a sua utilização pelas células tumorais. Adicionalmente, os
ácidos graxos se tornam os principais combustíveis das células do hospedeiro e do
tumor quando a glicose não supre eficazmente o gasto de energia (LANGSTEIN
&
NORTON, 1991). É possível também que a não elevação dos ácidos graxos plasmáticos
nos dias 5, 8 e 11 após a inoculação das células tumorais versus controle, se deva a
sua utilização na síntese de triacilgliceróis no fígado, os quais são exportados dos
hepatócitos como VLDL.
73
O aumento da lipólise em pacientes com câncer resulta, além do aumento de
ácidos graxos circulantes, em liberação de glicerol pelos adipócitos. Entretanto, no
presente estudo não houve diferença no glicerol plasmático entre os grupos portadores
de tumor e controle. Houve aumento na sua concentração apenas no 14
o
dia de tumor
em relação aos animais controle pair fed (figura 4), evidenciando que esta elevação
não foi decorrente da diminuição da ingestão alimentar, visto que há tendência de
redução nos animais controle pair fed. Seria esperado, pela ativação da HSL causada
pelo LMF, TNF-α e outras citocinas, um aumento na concentração de glicerol no
plasma no 14
o
dia de tumor correspondente à elevação dos ácidos graxos livres (figura
3). Porém, isto não foi observado e provavelmente se deve ao fato que o glicerol
liberado dos adipócitos pode estar sendo utilizado como precursor neoglicogênico pelo
fígado, para produção de glicose, que é a principal fonte energética para o tumor.
Tumores de crescimento rápido, como o Walker-256, tendem a ter pobre
suprimento sanguíneo o que pode levar o tumor à baixa oxigenação e utilização
preferencial da via glicolítica anaeróbica para a produção de energia (PIFFAR et al.,
2003; VICENTINO et al., 2002b). A hipóxia desvia o fluxo metabólico da célula tumoral
para a via glicolítica anaeróbica através da ativação do fator induzido por hipóxia
(HIF) (BRAHIMI-HORN et al., 2007) o qual aumenta a expressão: a) de transportadores
de glicose (GLUT-1 e GLUT-3), para aumentar a captação de glicose; b) da enzima
piruvato desidrogenase quinase-1, que fosforila e inibe o complexo piruvato
desidrogenase, logo, suprime o metabolismo do piruvato pelo ciclo de Krebs e a
fosforilação oxidativa; c) da enzima que converte o piruvato a lactato, a lactato
desidrogenase-A; d) do transportador monocarboxilato-4 H
+
/lactato, o qual expulsa da
célula o íon H
+
e o lactato; e) de duas isoformas de lançadeiras Na
+
/H
+
(NHE), NHE-1 e
NHE-6, responsáveis por transportar o H
+
para o exterior da célula em antiporte com o
Na
+
; e f) da anidrase carbônica IX, que contribui para expulsar o H
+
da célula tumoral,
quando acoplada aos transportadores de bicarbonato, desempenhando também papel
importante na manutenção do pH intracelular da célula tumoral (BRAHIMI-HORN et
al., 2007).
74
O desvio do fluxo metabólico da célula tumoral para a via glicolítica
anaeróbica pelo HIF aumenta, portanto, o consumo de glicose por esta célula e
conseqüentemente a produção de lactato, produto final desta via (TISDALE, 2002).
Em nosso estudo, as concentrações plasmáticas de lactato nos animais Walker-
256, diferentemente dos animais controle pair fed, foram progressivamente
crescentes ao longo do desenvolvimento do tumor (figura 5), atingindo no 14º dia uma
concentração aproximadamente três vezes maior do que o grupo controle. O perfil de
aumento do lactato foi semelhante ao encontrado para as massas tumorais (tabela 1)
sugerindo que a vascularização do tumor não acompanhou seu rápido crescimento, o
que conferiu um microambiente hipóxico às células tumorais.
O lactato plasmático liberado pelas células tumorais é captado e convertido no
fígado, pela neoglicogênese, à glicose, a qual é liberada para a corrente sangüínea e
utilizada novamente pelo tumor, culminando na produção de mais lactato,
estabelecendo-se desse modo um ciclo tumor-fígado, semelhante ao ciclo fútil
músculo-fígado que ocorre durante o exercício físico, conhecido como ciclo de Cori
(BONGAERTS et al., 2006; LOBERG et al., 2007; TISDALE, 2002). Vale ressaltar que a
maior taxa de captação e oxidação de glicose pelas células tumorais (LOBERG et al.,
2007; TIJERINA, 2004) e a possível resistência insulínica periférica e hepática do
hospedeiro (BOYD, 2003; LOBERG et al., 2007) favorecem a utilização deste substrato
energético pelo tumor.
Outro parâmetro metabólico plasmático avaliado no presente trabalho foi a
uréia. Ratos portadores do tumor Walker-256 apresentaram aumento na concentração
plasmática de uréia no 14º dia do desenvolvimento tumoral em relação ao grupo
controle, mas o aumento mostrou-se significativo desde o 8º dia em relação aos grupos
controle pair fed correspondentes (figura 6). Estes resultados confirmam os achados
de Corbello-Pereira et al. (2004), que sugeriram um acréscimo da atividade
ureagênica dos animais com tumor Walker-256, visto que foram observadas maiores
concentrações de uréia no plasma.
Entretanto, estudos de perfusão de fígado de ratos com tumor Walker-256
encontraram baixas taxas de produção de uréia a partir dos precursores alanina,
alanina + ornitina, amônia, amônia + lactato, amônia + piruvato e glutamina e maiores
75
taxas quando o substrato ureagênico foi a arginina, sugerindo maior atividade da
arginase, última enzima do ciclo da uréia que catalisa a hidrólise da arginina em uréia
e ornitina (CORBELLO-PEREIRA et al., 2004).
Em outros estudos foi encontrado aumento nos níveis dos aminoácidos leucina,
lisina, alanina e valina (NAVARRO et al., 1966), assim como aumento nas
concentrações de ornitina, asparagina e arginina (BLAAW et al., 1997) em ratos com
tumor Walker-256. O aumento da arginina plasmática somada à atividade aumentada
da arginase no fígado poderia explicar, pelo menos em parte, a elevação da uremia
encontrada nos ratos portadores de tumor (figura 6).
A alteração no perfil dos aminoácidos plasmáticos que alcançam o fígado, em
ratos portadores de tumor, é possível haja vista a elevada proteólise da síndrome
caquética e o intenso consumo de aminoácidos pelas células tumorais. Segundo Medina
et al. (1990), o consumo de aminoácidos por estas células é muito superior às suas
necessidades metabólicas. Essas células, portanto, são consideradas seqüestradoras de
nitrogênio (MEDINA et al., 1992).
Os aminoácidos captados pelas células tumorais que não são utilizados para
síntese de proteínas e nucleotídeos (purinas e pirimidinas) podem ser usados na
produção de uréia, pois há estudos (REBECA et al., 2006) demonstrando que as células
Walker-256, na forma ascítica, são capazes de sintetizar uréia, sendo esta produção
maior no 6º do que no 4º dia de desenvolvimento tumoral. Desse modo, considerando a
similaridade do perfil de aumento da uréia (figura 6) e das massas tumorais (tabela 1),
é possível que a produção aumentada de uréia pelas células Walker-256 tenha
contribuído de forma muito importante para elevação da uremia nos animais com
câncer.
Da mesma forma do que para os aminoácidos, as células tumorais são também
consideradas seqüestradoras de glicose (MEDINA et al., 1992), o que poderia resultar
em hipoglicemia do hospedeiro.
Como pode ser observado na figura 7, animais Walker-256 tiveram redução da
glicemia desde a fase inicial do desenvolvimento tumoral de forma mais severa que os
animais controle pair fed, pois apresentaram diferenças com maior nível de
significância em relação ao grupo controle a partir do 8º dia, sendo que a glicemia foi
76
menor que o grupo controle pair fed no 14º dia após a inoculação das células
tumorais.
Apesar da anorexia interferir na glicemia do portador de câncer, outros
fatores devem estar envolvidos na severa redução da concentração de glicose
plasmática, pelo menos nos estágios mais tardios do desenvolvimento tumoral, como
evidenciado pela redução da glicemia no 14º dia de tumor em relação ao grupo
controle pair fed correspondente (figura 7).
A alta atividade metabólica das células tumorais em um ambiente hipóxico,
como já mencionado, implica na utilização da glicólise como principal via para
produção de ATP (BRAHIMI-HORN, 2007), o que aumenta grandemente o consumo de
glicose, pois para atingir o mesmo saldo energético, o metabolismo anaeróbico
necessita de cerca de 40 vezes a quantidade de glicose utilizada sob condições
aeróbicas (BONGAERTS et al., 2006). Este aumento do consumo de glicose pelo tumor
é apontado como um dos responsáveis pela hipoglicemia característica da síndrome
caquética associada ao câncer.
Em humanos saudáveis, a hipoglicemia provoca aumento na produção hepática
de glicose, primeiramente pela depleção de glicogênio hepático e depois pela
neoglicogênese, para restaurar a concentração de glicose plasmática ao normal
(HOLROYDE & REICHARD, 1981). Logo, a diminuição da ingestão alimentar (anorexia) a
qual promove por si só diminuição da glicemia (figura 7) pode ser importante na
redução do conteúdo de glicogênio no fígado.
De fato, nesta pesquisa, animais controle pair fed apresentaram redução de
glicogênio hepático no 11º e 14º dias versus animais controle (figura 8), provavelmente
pela estimulação da glicogenólise, conseqüente à queda da glicemia. Resultados
semelhantes foram encontrados para os animais portadores de tumor. Esses dados e a
similaridade no conteúdo de glicogênio hepático entre os animais controle pair fed e
com tumor indicam a anorexia como principal responsável pela redução da
concentração de glicogênio hepático. Porém, a anorexia pode não ser o único
mecanismo envolvido na depleção do glicogênio, visto que sua concentração foi menor
nos ratos portadores de tumor no 5º dia versus animais controle e que houve
77
tendência de redução no 5º e 14º dia em comparação aos animais controle pair fed
correspondentes (figura 8).
Outros mecanismos envolvidos na redução do glicogênio no fígado na caquexia
induzida por câncer são: a) capacidade diminuída de captação de glicose exógena e de
sua transformação em glicogênio (glicogenogênese), que pode ser decorrente em
parte da menor atividade da glicoquinase, enzima específica para fosforilação da
glicose no fígado (VICENTINO et al., 2002b), cuja atividade pode estar diminuída em
função da resistência hepática à insulina, promovida pela IL-6 (SENN et al., 2003) e b)
maior tendência de liberação de glicose das reservas de glicogênio (glicogenólise)
(VICENTINO et al., 2002b), que pode ser devida à ação glicogenolítica do LMF (HIRAI et
al., 1997).
Em suma, os resultados descritos até aqui demonstram que, na caquexia
associada ao tumor Walker-256, há uma série de distúrbios metabólicos, com
alterações profundas no perfil lipídico, concentração de precursores neoglicogênicos
plasmáticos, uremia, glicemia e conteúdo de glicogênio no fígado. Estas alterações
foram se agravando ao longo do processo de desenvolvimento tumoral, sendo muito
acentuadas no 14
o
dia de tumor. Estes resultados acrescentam conhecimento
científico, principalmente porque não há outros estudos em que estes parâmetros
metabólicos foram avaliados ao longo do desenvolvimento da caquexia,
particularmente a induzida por tumor Walker-256.
Finalmente, nós avaliamos no presente trabalho, em estudos de perfusão de
fígado in situ, a neoglicogênese hepática e o consumo de oxigênio a partir de vários
precursores de glicose (alanina, piruvato, glicerol e lactato), já que não há consenso
na literatura se a neoglicogênese está aumentada ou diminuída no câncer.
Há trabalhos demonstrando que no estado portador de tumor há maior
liberação de glicose pela neoglicogênese hepática. Pacientes com vários tipos de
cânceres apresentaram maior neoglicogênese a partir do lactato, alanina e glicerol
(TAYEK et al., 1992; LUNDHOLM
et al. apud TISDALE, 2000) e o aumento da
neoglicogênese foi associado com maior atividade da PEPCK em ratos com tumor
(NOGUCHI, 1996). Por outro lado, há estudos de perfusão de fígado que evidenciaram
diminuição da neoglicogênese em ratos portadores de tumor Walker-256 quando a
78
alanina foi o precursor neoglicogênico utilizado (CORBELLO-PEREIRA et al.¸2004; LIU
et al. apud KELMER-BRACHT et al., 2006).
O primeiro precursor utilizado aqui para avaliar a neoglicogênese hepática foi
a alanina. Como ilustra a figura 15, a alanina captada pelo hepatócito é convertida a
piruvato pela enzima desaminadora alanina aminotransferase, que transfere o NH
3
da
porção amino da alanina ao a-cetoglutarato formando glutamato. O glutamato, dentro
da mitocôndria, libera o íon amônio utilizado na síntese da uréia. O piruvato formado
é convertido em glicose, por uma série de reações catalisadas por enzimas, algumas
das quais são reguladoras-chave da via como a piruvato carboxilase, PEPCK, frutose
1,6-bifosfatase e glicose 6-fosfatase, ou pode ser convertido a lactato pela lactato
desidrogenase (COOMES, 1997; SALWAY, 1994).
Assim, a infusão de alanina no fígado resulta em produção de glicose,
piruvato, lactato e uréia (figuras 9 e 10). Parte da glicose formada é utilizada como
fonte de energia para o fígado, visto que a própria via neoglicogênica necessita de
ATP, através de metabolismo aeróbico, com aumento do consumo de oxigênio
,
o
aceptor final de elétrons.
Desse modo, a infusão hepática de qualquer precursor neoglicogênico
aumenta, além da produção de glicose, o consumo de oxigênio, como ilustrado nas
figuras 9, 11, 12, 13 e 14. Observa-se também, nestas figuras, que os valores basais do
consumo de oxigênio hepático (0 a 10 minutos de perfusão) foram menores (figuras
12C, 13C e 14C) ou tenderam a ser menores (figuras 9C e 11C) nos animais com tumor
Walker-256, provavelmente devido à menor oxidação de ácidos graxos livres face à
redução das atividades das CATs, como observado nos estudos de Vicentino et al.
(2002a).
Entretanto, a infusão de alanina nos fígados dos animais no 12º dia de
desenvolvimento de tumor Walker-256 resultou em menor produção de glicose, uréia e
piruvato, em tendência de redução da produção de lactato e em menor consumo de
oxigênio em relação aos animais controles, não portadores de câncer (figuras 9 e 10).
A inibição da neoglicogênese foi de aproximadamente 60% (figura 15).
A redução da produção hepática de uréia e piruvato a partir da alanina sugere
que a enzima que converte a alanina a piruvato, a alanina aminotransferase, esteja
79
inibida nos animais portadores de tumor, conforme demonstrado por Herzfeld
&
Greengard (CORBELLO-PEREIRA et al., 2004).
Em concordância, Corbello-Pereira et al. (2004) encontraram redução da
neoglicogênese e no consumo de oxigênio hepáticos em animais portadores de tumor
Walker-256 quando os precursores foram a alanina e alanina + aspartato, redução
somente da neoglicogênese pela infusão de alanina + ornitina, mas não houve
alteração da neoglicogênese estimulada pelos precursores lactato + amônia, piruvato +
amônia, aspartato + amônia, aspartato, arginina, citrulina, aspartato + citrulina,
glutamina e glutamina + aspartato.
Adicionalmente, quando o precursor neoglicogênico infundido no fígado foi o
piruvato, houve redução da neoglicogênese e do consumo de oxigênio no grupo tumor,
respectivamente, em 33% e 27%. Quando o precursor foi o lactato também houve
inibição de 26% e 40%, respectivamente, para neoglicogênese e consumo de oxigênio
no grupo tumor (figuras 11 e 12).
O menor grau de redução da neoglicogênese pelo piruvato e lactato (@ 30%)
em relação ao encontrado pela alanina (@ 60%) reforça os achados anteriores de
inibição da alanina aminotransferase nos animais portadores de tumor, como pode ser
deduzido a partir da análise da figura 15.
Como as porcentagens de inibição pelo piruvato e pelo lactato na
neoglicogênese foram próximas, inclusive a do lactato um pouco menor, pode-se
inferir (figura 15) que a atividade da lactato desidrogenase hepática não esteja
alterada em portadores de tumor Walker-256. Enzimas que poderiam estar inibidas
nestes animais são a frutose 1,6-bifosfatase, glicose 6-fosfatase, piruvato carboxilase
e PEPCK.
Entretanto, a ausência de inibição da neoglicogênese a partir do glicerol nos
animais portadores de tumor (figura 14) descarta a possibilidade de inibição da frutose
1,6-bifosfatase e da glicose 6-fosfatase, enzimas regulatórias que catalisam reações
posteriores à entrada do glicerol.
Em conjunto, os resultados anteriores sugerem inibição da alanina
aminotransferase, piruvato carboxilase e/ou da PEPCK nos animais portadores de
80
tumor, mas não excluem a possibilidade, também, de redução da captação hepática
dos precursores de glicose.
A procura dos agentes que causam mudanças na neoglicogênese hepática tem
sido concentrada nas citocinas pró-inflamatórias, como TNF-a e interleucinas, em
pacientes e animais com câncer, sepse e artrite crônica (KERLMER-BRACHT et al.,
2006). O TNF-a em baixas doses (18 mg/Kg) diminuiu a expressão da PEPCK em
camundongos (Hill
&
McCallum apud KELMER-BRACHT et al., 2006), este efeito pode
estar relacionado com a redução da neoglicogênese hepática pelo substrato alanina.
Kelmer-Bracht et al. (2006) demonstraram que a administração de baixas doses de
TNF-a e IL-1b, isoladamente (10 mg/Kg) ou simultaneamente (5 mg/Kg de cada
citocina), inibiu a neoglicogênese hepática a partir da alanina em ratos. Porém,
Blumberg et al. (1995) observaram que altas doses de TNF-a (150 mg/Kg) são capazes
de aumentar a neoglicogênese, da alanina, in vivo. Estes dados permitem inferir que o
tipo de efeito das citocinas na neoglicogênese, estimulatório ou inibitório, pode ser
dependente da sua concentração circulante e do tipo de citocinas, que poderiam
sofrer alterações em função do perfil de resposta imune, o qual varia de acordo com o
estágio de desenvolvimento do tumor, com o tamanho da massa tumoral, com o tipo
de tumor, entre outros. Isto poderia explicar, pelo menos em parte, a discordância
entre os resultados da literatura.
Em todas as perfusões in situ realizadas anteriormente foram utilizadas
concentrações de precursores neoglicogênicos definidas como saturantes, vale
ressaltar, saturantes para animais sadios. Porém, a capacidade do fígado para
responder a um substrato neoglicogênico in vivo depende da sua concentração
plasmática e também da concentração de fatores regulatórios (CORBELLO-PEREIRA et
al., 2004).
Com base nisto, perfusões de fígado em animais no 12º dia de desenvolvimento
do tumor foram conduzidas para análise da neoglicogênese estimulada pela infusão de
lactato 8 mM (figura 13), uma concentração próxima àquela observada no plasma
(7,75 mM) de animais no 11º dia de tumor (figura 5), isto é, uma concentração de
lactato acima da saturante (2 mM) para animais sem tumor.
81
As produções de glicose nos grupos controles das perfusões com lactato 2 mM e
8 mM foram as mesmas, confirmando que a concentração 2 mM já é saturante aos
animais sadios (figuras 12 e 13). Em contrapartida, a neoglicogênese e o consumo de
oxigênio do grupo tumor foram semelhantes ao controle quando infundido o lactato 8
mM, como se a via e a respiração aeróbica fossem restauradas pela maior
concentração do substrato.
Isto indica uma alteração da concentração saturante de lactato para produção
de glicose em fígados de animais portadores de tumor Walker-256, mas não se pode
afirmar se a concentração saturante é maior ou menor que 8 mM.
É possível que a elevação do lactato plasmático para valores superiores a 2
mM, concentração encontrada em ratos normais, seja importante para impedir uma
queda ainda mais acentuada da glicemia no 14
o
dia de tumor, visto que a
neoglicogênese mostrou-se inibida para 2 mM e não para 8 mM.
Igualmente, o glicerol deve ter um papel relevante no impedimento de uma
hipoglicemia mais grave, diante da inibição da neoglicogênese a partir dos outros
precursores. Assim, estes dois precursores de glicose devem contribuir
significativamente para manutenção da homeostase glicêmica, a qual é importante
não só como fonte energética para o tumor, mas principalmente para manutenção da
vida do hospedeiro portador do câncer.
A utilização do glicerol como precursor de glicose nos animais Walker-256
pode também explicar a manutenção das concentrações plasmáticas deste substrato a
valores encontrados em animais sadios controle e controle pair fed, apesar do
aumento de ácidos graxos livres plasmáticos provindos da lipólise no tecido adiposo.
83
A inibição da neoglicogênese a partir da alanina, um precursor neoglicogênico
importante, e também do piruvato, corroboram com a hipoglicemia aos 14 dias após a
inoculação das células Walker-256. Então, a acentuada redução da glicemia neste dia,
queda de 56% versus animais controle e de 41% em comparação aos controle pair fed
(figura 7), pode ser resultante não apenas do aumento do consumo de glicose pelo
tumor, face ao aumento da massa tumoral que praticamente dobrou no 14o dia em
relação ao 11o (tabela 1), mas também da inibição da neoglicogênese destes
precursores, que no 14o dia pode estar ainda mais acentuada.
No entanto, isto é apenas uma possibilidade. Vale refletir que os nossos
estudos para avaliação da neoglicogênese foram realizados em perfusão de fígado in
situ, uma técnica onde o fígado é isolado da circulação. É possível, que in vivo o
fígado sofra a influência de fatores circulatórios, alterados no estado portador do
tumor, como os ácidos graxos. Um aumento nos ácidos graxos plasmáticos e
conseqüentemente na sua oxidação hepática poderia estimular a neoglicogênese
(MLINAR et al., 2007) pela maior geração de acetil-CoA, a qual ativa a piruvato
carboxilase e PEPCK, e também pela maior geração de NADH e ATP, que são usados na
neoglicogênese. Isto poderia explicar, pelo menos em parte, o aumento da liberação
hepática de glicose encontrada em alguns indivíduos com câncer (TAYEK, 1992).
Se de fato in vivo os ácidos graxos estimulam a neoglicogênese no estado
portador do tumor, a hipoglicemia observada no 14
o
dia de tumor (figura 7) seria
decorrente principalmente do aumento da massa tumoral. Contudo, mais estudos são
necessários para esclarecer esta questão.
Este trabalho buscou mostrar as alterações metabólicas ao longo do
desenvolvimento da caquexia, um passo importante para estudos futuros no sentido de
entender a complexicidade da caquexia do câncer e traçar possíveis medidas de
tratamento mais eficazes que as atuais, levando-se em consideração o estágio da
doença.
Conclusões
85
6 CONCLUSÕES
Ø
O tumor Walker-256, implantado subcutaneamente em ratos, apresenta
crescimento rápido com alto poder de realizar metástases e é capaz de induzir, no
hospedeiro, o desenvolvimento da caquexia tão logo ao seu implante, com
aproximadamente 10% de perda de peso já no 5º dia após a inoculação das células
tumorais.
Ø A caquexia induzida pelo tumor Walker-256 provocou redução de massa magra e
anorexia a partir do 11º dia do desenvolvimento tumoral, mas alterações no
metabolismo de carboidratos e no perfil lipídico foram observadas em estágios mais
precoces.
Ø
Os primeiros parâmetros alterados nos animais portadores de tumor foram a
glicemia e o conteúdo de glicogênio hepático, os quais reduziram progressivamente
ao longo do período de desenvolvimento do tumor.
Ø
No 8º dia de desenvolvimento tumoral houve aumento de lactato e triacilgliceróis
plasmáticos, enquanto que os controles pair fed correspondentes tiveram,
respectivamente, nenhuma alteração e redução destes compostos. Apesar da
aparente redução, o conteúdo de glicogênio hepático não apresentou diferença
significativa neste dia.
Ø No 11º dia após a inoculação das células tumorais as alterações foram muito mais
proeminentes, com hipoglicemia, maior redução do glicogênio hepático, maior
concentração de lactato plasmático, hipertrigliceridemia e tendência de redução no
colesterol plasmático. Ao comparar os resultados com o grupo controle pair fed, a
contribuição da anorexia parece estar presente apenas na diminuição da glicemia e
do glicogênio hepático.
Ø No 14º dia do desenvolvimento do tumor Walker-256, a perda de peso atingiu cerca
de 26%, conferindo uma caquexia bastante avançada neste estágio do curso da
doença. A hipoglicemia tornou-se mais severa e diferente em relação ao controle
86
pair fed, o conteúdo de glicogênio hepático foi equivalente a 8% do conteúdo de
animais controles, o lactato plasmático apresentou um aumento exacerbado de
282%, a hipertrigliceridemia e a tendência de redução do colesterol plasmático
foram mantidas aos níveis encontrados no 11º dia e, somado a essas mudanças,
houve aumento na concentração plasmática dos ácidos graxos livres.
Ø
Os estudos de perfusão de fígado in situ em animais, no 12º dia de desenvolvimento
tumoral, mostraram diferentes graus de inibição da neoglicogênese e do consumo
de oxigênio, de acordo com o precursor utilizado (alanina > piruvato = lactato 2
mM), ou nenhuma alteração (lactato 8 mM e glicerol) nestes parâmetros.
Ø
A diminuição da neoglicogênese hepática pode ter sido resultante da inibição da
alanina aminotransferase, piruvato carboxilase e/ou da PEPCK. As atividades da
lactato desidrogenase, frutose 1,6-bifosfatase e glicose 6-fosfatase provavelmente
não foram alteradas nos animais portadores de câncer.
Em suma, pode-se concluir que os animais portadores de tumor Walker-256
apresentaram sinais característicos da caquexia, como emagrecimento, catabolismo
muscular e anorexia, e também muitas alterações metabólicas de parâmetros
plasmáticos e hepáticos, algumas das quais se iniciaram já no 5º dia após a inoculação
das células tumorais, e acentuaram-se no decorrer do desenvolvimento do processo
caquético. Tais alterações não foram resultado da menor ingestão alimentar, pois elas
não foram encontradas nos animais controle pair fed. É provável que fatores
produzidos pelo tumor ou pelo hospedeiro (citocinas) em resposta à presença do tumor
sejam os mediadores dessas alterações e, também, das observadas na neoglicogênese
hepática.
Referências Bibliográficas
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