ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
ANA PATRÍCIA SOUZA DE LIMA
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES CULTIVADAS
DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus vannamei EM
PERNAMBUCO
RECIFE-PE
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ANA PATRÍCIA SOUZA DE LIMA
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES CULTIVADAS
DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus vannamei EM
PERNAMBUCO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros
e Aqüicultura da Universidade Federal
Rural de Pernambuco, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do
grau de Mestre em Recursos Pesqueiros e
Aqüicultura.
Orientador: Dra. Maria Raquel Moura
Coimbra, Depto. de Pesca e Aqüicultura, da
UFRPE.
RECIFE-PE
Fevereiro, 2007.
ads:
Ficha catalográfica
Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE
L732e Lima, Ana Patrícia Souza de
Estrutura genética de populações cultivadas do camarão
marinho Litopenaeus vannamei em Pernambuco, Brasil /
Ana Patrícia Souza de Lima. -- 2007.
83 f. : il.
Orientadora : Maria Raquel Moura Coimbra
Dissertação (Mestrado em Recursos Pesqueiros e Aqüi –
cultura) - Universidade Federal Rural de Pernambuco. De –
partamento de Pesca e Aqüicultura.
Inclui anexo e bibliografia
CDD 639. 543
1. Litopenaeus vannamei
2. Microsatélites
3. Consangüinidade
4. Variabilidade genética
5. Pernambuco, BR
I. Coimbra, Maria Raquel Moura
II. Título
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Programa de Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e Aqüicultura
Parecer da comissão examinadora da defesa de dissertação de mestrado de
ANA PATRÍCIA SOUZA DE LIMA
ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES CULTIVADAS DO CAMARÃO
MARINHO Litopenaeus vannamei EM PERNAMBUCO
Área de concentração: Aqüicultura
A comissão examinadora, composta pelos professores abaixo, sob a presidência
do primeiro, considera a candidata ANA PATRÍCIA SOUZA DE LIMA
Como_________________________ .
Recife, _____ de Fevereiro de 2007.
________________________________________
Profa. Dra. Maria Raquel Moura Coimbra (UFRPE)
Orientador
________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Maggioni (UECE)
Membro externo
________________________________________
Profa. Dra. Emiko Shinozaki Mendes (UFRPE)
Membro interno
________________________________________
Prof. Dr. Silvio Ricardo Maurano Peixoto (UFRPE)
Membro interno
________________________________________
Prof. Dr. Eudes de Souza Correia (UFRPE)
Suplente
Aos meus pais e irmã, por todo
amor que sempre me dedicaram.
A Cláudio A. Generoso, por todo
amor dedicado e por estar sempre
presente em todos os momentos
da minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Deus por mais uma conquista.
À minha orientadora, Prof
a
Maria Raquel Moura Coimbra, por toda dedicação,
paciência, confiança e amizade.
Ao Prof. Rodrigo Maggioni, por ter cedido as instalações do NUGEN para
complementação deste trabalho e por toda ajuda prestada.
Ao Prof Manoel Adrião, coordenador do Laboratório de Fisiologia Animal
Molecular Aplicada – FAMA, pelo livre acesso às instalações e ajuda
proporcionada.
Ao Prof. Reginaldo, do Laboratório Genoma pelo suporte e colaboração.
Aos proprietários, gerentes e funcionários das larviculturas de camarão, nas quais
realizei coletas, pela receptividade e colaboração.
Aos Amigos e companheiros de laboratório, Andréa, Suzianny, Ebenezer,
Hozana, Henrique, Karine e Marília pela ajuda e dedicação para a realização
deste trabalho.
As amigas, Ana Cristina Pinheiro, Cristina Generoso, Cristiane Generoso, Daniela
Ferraz e Irlanda Aguiar por estarem sempre presentes em minha vida.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... i
SUMÁRIO
Lista de Tabelas ii
Lista de Figura iii
Resumo iv
Abstract v
1. Introdução 10
2. Objetivos
2.1 Geral
2.2 Específicos
13
3. Revisão da literatura 14
3.1 Carcinicultura Marinha: Importância Mundial 14
3.2 Cenário da Carcinicultura Brasileira 15
3.3 Programas de melhoramento 17
3.4 Estudos em genética de populações de camarão
(selvagens e de cultivo)
19
3.5 Marcadores moleculares utilizados em estudos
populacionais
20
4. Artigo Científico 23
“Avaliação Genética de duas Larviculturas de Camarão
Marinho Ltopenaeus Vannamei do Estado de Pernambuco, Brasil.”
5. Artigo Científico 43
“Monitoramento Genético na Reposição de Matrizes do
Camarão Marinho Litopenaeus Vannamei em Pernambuco, Brasil”
6. Referências bibliográficas 60
Anexos
72
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... ii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais produtores mundiais de camarão cultivado. 15
Artigo I
Tabela 1. Repetições, primers Forward e reverse e tamanho esperado
(pb) para os cinco locus de microssatélites analisados.
28
Tabela 2. Variabilidade genética das populações de Litopenaeus
vannamei de duas larviculturas para cinco loci.
32
Tabela 3. Índices de Wright (F
IS
e F
ST
) para as duas larviculturas de L.
vannamei.
34
Tabela 4.
Diferenciação genética das larviculturas por locus
34
Artigo II
Tabela 1. Variabilidade genética das populações monitoradas de
Litopenaeus vannamei para 3 loci de microssatélites.
46
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... iii
LISTA DE FIGURAS
Artigo I
Figura 1. Histogramas das freqüências dos alelos para cada locus de
microssatélites do L. vannamei
34
Artigo II
Figura 1. Histogramas das freqüências dos alelos para cada locus de
microssatélites do L. vannamei
48
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... iv
RESUMO
Desde 1997 a introdução de novos reprodutores de Litopenaeus vannamei está
proibida pelo o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA), Portaria de nº. 119, o que levanta questões sobre a viabilidade
de programas de melhoramento no Brasil, uma vez que não há mais renovação dos
plantéis.
O objetivo do presente trabalho foi caracterizar geneticamente duas
larviculturas de Litopenaues vannamei e monitorar a variabilidade genética de uma
das larviculturas, com reposição de matrizes, em três períodos sucessivos, ambas,
localizadas no estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A caracterização genética
foi feita usando 5 loci de microssatélites e um total de 100 amostras teciduais de
reprodutores, para o monitoramento foram utilizados 3 loci de microssatélites e um
total de 150 amostras teciduais de reprodutores. Foi evidenciado que há
variabilidade genética suficiente nas duas larviculturas, para subsidiar programas de
melhoramento genético, baseado na freqüência dos alelos, nos coeficientes de
endogamia F
IS
(Larv. A = 0,380 e Larv. B = 0,250) e heterozigosidades que variaram
de Ho= 0,190 a 0,810 e He= 0,460 a 0,870, respectivamente. Os resultados do
monitoramento mostraram que a reposição de matrizes no sistema de ciclo fechado
não interferiu na variabilidade genética desta larvicultura, o que pode ser
evidenciado através da freqüência dos alelos, nas heterozigosidades obtidas que
foram de Ho= 0,460 e He= 0,660 na primeira coleta, de Ho= 0,420 e He= 0,620 na
segunda coleta e de Ho= 0,600 e He= 0,660 na terceira coleta, e nos valores do
coeficiente de endogamia F
IS
(0,37 para a primeira coleta, 0,39 para a segunda
coleta e 0,13 para a terceira coleta) encontrados. Os resultados aqui relatados
podem ser considerados bons, refletindo a história da atividade no Brasil que se
destacou pela introdução de reprodutores de diversas origens.
Palavras-chaves: Litopenaeus vannamei, SSR, STR, Consangüinidade,
Variabilidade genética, Monitoramento.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... v
ABSTRACT
Although Brazil has an an important position in the world shrimp farming industry
scenario, information on the genetic basis of the most important species, the exotic
Litopenaeus vannamei, still scarce. The Brazilian shrimp industry has been facing
difficulties, such as US antidumping action against shrimp products, unfavorable
currency exchange rate impacts and viruses outbreaks. Shrimp resistant to viral
diseases, as well as with better growth rates are wanted in breeding programs for this
species in Brazil. A Federal Normative Instruction, instituted in 1997, prohibited
shrimp importation into Brazil as a sanitary precaution to prevent the spread of
shrimp diseases, and since then, all shrimp broodstock rely on the domesticated
stocks. This fact raises questions about the success of a breeding program on this
species, because one can not know if the genetic variability is enough to guarantee
selection response. The objective of this study was to genetically characterize the
broodstock of two shrimp hatcheries and to monitor the genetic variability of one of
them after three consecutive broodstock replacements in the state of Pernambuco,
Northeast Brazil. Genetic characterization of the two hatcheries was carried out
using 5 microsatellite loci and pleopods tissue samples taken from 100 shrimp (50 of
each broodstock). For the monitoring 3 microsatellite loci were used in 150 shrimp
samples (50 of each broodstock replacement). Our results showed that there is
sufficient genetic variability in both hatcheries based on the alleles frequency,
inbreeding coefficient, F
IS
(Larv. A = 0,380 e Larv. B = 0,250), and observed and
expected heterozygosities ranging from Ho= 0,190 to 0,810 and He= 0,460 to 0,870,
respectively. The monitoring results showed that in closed systems, broodstock
replacement does not interfer in the genetic variability, based on the alleles
frequency, observed and expected heterozygosities (Ho= 0,460 and He= 0,660 in
first sample collection, Ho= 0,420 and He= 0,620 in the second sample collection and
Ho= 0,600 and He= 0,660 in the third sample collection), inbreeding coefficient, F
IS
(0,37 for the 1
st
, 0,39 for the 2
nd
and 0,13 for the 3
rd
sample collection). Our results
suggested that genetic variability is high, thus reflecting the history of the shrimp
activity in Brazil, where broodstock from different origins were introduced in the
country up to 1997.
Keywords: Litopenaeus vannamei, Microsatellite Markes, Inbreeding Depression,
Genetic Variability.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 10
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, o cultivo de camarão marinho consolidou-se a partir da década de
80, com a introdução da espécie Litopenaeus vannamei, nativa da Costa Pacífico do
México, América Central e América do Sul. Apesar de se tratar de uma espécie
exótica, o país possui o completo domínio de seu ciclo biológico, tecnologia de
manejo operacional e dispõe de alimentos balanceados (ROCHA, 1999).
Segundo o censo coordenado pela Associação Brasileira dos Criadores de
Camarão (ABCC), o Brasil assumiu em 2003 o posto de principal produtor de
camarão do hemisfério ocidental, que corresponde a aproximadamente 17% do total
cultivado mundialmente. Dados de 2003 mostraram a existência de 997 fazendas de
cultivo de camarão marinho no Brasil, perfazendo um total de 16.598 hectares de
área em produção, sendo que 91% delas estão situadas na região nordeste, a qual é
responsável por 95% da produção do país (ROCHA et al., 2004).
A atividade vem sofrendo impactos no Brasil, em função de questões
comerciais internacionais como a aplicação de sobretaxas na exportação do
camarão brasileiro, a chamada ação “anti-dumping”, movida por agências de pesca
dos EUA, o incremento da produção de L. vannamei na Ásia, o câmbio desfavorável
à importação e surtos virais, como a Mionecrose infecciosa
. O vírus da Mionecrose
infecciosa (IMNV)
foi identificado no Nordeste e apontado como uma das causas
para a diminuição da produção nacional em 2004 (LIGHTNER et al., 2004;
PINHEIRO et al. 2007; RODRIGUES, 2005). Mais recentemente, a doença da
Mancha Branca (WSSV-White Spot Syndrome Vírus) foi diagnosticada em Santa
Catarina, acarretando sérios prejuízos para a região (PAREDES, 2005).
Camarões resistentes às infecções virais e com melhores taxas de
crescimento que garantam alta produtividade são metas indispensáveis para
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 11
contrabalançar os baixos preços do mercado. Tais metas refletem a necessidade de
investimentos em programas de melhoramento para esta espécie no Brasil.
Uma das formas de melhorar uma dada característica em uma população é
eliminar os indivíduos com baixo desempenho naquela característica. Um dos
obstáculos a esta abordagem é a perda potencial da diversidade genética oriunda da
utilização de um número reduzido de reprodutores (SILVERSTEIN et al., 2004). A
sustentabilidade de um programa de melhoramento depende, portanto, da
variabilidade genética existente no conjunto original de reprodutores para a
característica de interesse. Se a variabilidade genética é pequena desde o início ou
se reduz ao longo das gerações, poderá ocorrer depressão endogâmica ou um
decréscimo na resposta à seleção (KINGHORN, 1983; SU et al. 1996).
A caracterização molecular permite estimar parâmetros de grande importância
para compreender a diversidade e a estrutura genética das populações e com isso
direcionar as estratégias de conservação e exploração da variabilidade genética
(FERREIRA E GRATTAPAGLIA, 1998). A variabilidade genética pode ser medida e
quantificada em análises moleculares, que permitem determinar pontos de referência
nos cromossomos, tecnicamente denominados de marcadores moleculares. Dentre
os marcadores mais informativos estão os de microssatélites, tendo em vista sua
expressão co-dominante e o multialelismo, além de um alto conteúdo de informação
polimorfica (PIC) (CURRAN, 1997).
O fato do L. vannamei ser uma espécie exótica, cuja introdução de novos
reprodutores está proibida pelo o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos
Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), Portaria de nº. 119, de 17 de outubro de
1997
, levanta questões sobre a viabilidade de programas de melhoramento no
Brasil, uma vez que não há mais renovação dos plantéis.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 12
A Rede de Carcinicultura do Nordeste (RECARCINE) foi criada em 2004, por
iniciativa da FINEP, com o intuito de organizar sub-redes de pesquisadores no
Nordeste capacitados a investigar temas estratégicos dentro da carcinicultura. A
sub-rede de genética (RECARGENE) da RECARCINE, cujos participantes
pertencem a diferentes instituições de Pernambuco, Ceará, Rio Grande do Norte e
Piauí, se propôs a avaliar a estrutura genética do germoplasma existente na região,
a fim de diagnosticar a viabilidade de programas de melhoramento.
O Laboratório de Genética Aplicada (LAGA) da Universidade Federal Rural de
Pernambuco participa deste projeto como responsável pela avaliação das
larviculturas de Pernambuco, genotipando matrizes com o uso de marcadores
moleculares de microssatélites.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 13
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar a variabilidade genética e os níveis de consangüinidade de duas
larviculturas do camarão marinho Litopenaeus vannamei, do estado de Pernambuco
e monitorar a variabilidade genética de uma população cultivada com reposição de
matrizes, visando à criação de bases para um programa de seleção de reprodutores.
2.2 Objetivos Específicos
• Caracterizar geneticamente, em termos de variabilidade e níveis de
consangüinidade duas larviculturas do camarão marinho L. vannamei, no
estado de Pernambuco, através de marcadores moleculares de
microssatélites.
• Monitorar a variabilidade genética de uma larvicultura de L. vannamei do
estado de Pernambuco, com reposição de matrizes, em três períodos
sucessivos, através de marcadores moleculares de microssatélites.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 14
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Carcinicultura marinha: importância mundial
O cultivo do camarão marinho surgiu para satisfazer as necessidades de
subsistência no sudoeste da Ásia, mantendo-se por séculos com características de
produção artesanal. Em meados dos anos 30 no Japão, foi feita a primeira desova
em laboratório de fêmeas capturadas do mar, para produção de pós-larvas em
escala comercial (HUDINAGA, 1942). Em termos comerciais, o crescimento do
cultivo de camarão marinho só se consolidou a partir da década de 80, tendo como
base de sustentação o aprimoramento das tecnologias nutricionais, a crescente
demanda do produto no mercado internacional, a boa rentabilidade do agronegócio
e sua capacidade de gerar renda, empregos e divisas (ROCHA et al., 2004).
Em 2005, a carcinicultura mundial foi praticada em 2.220.000 hectares e com
produção de 2.057.000 toneladas. O resultado econômico-social dessa atividade
gerou uma receita de US$ 12,0 bilhões de dólares e seis milhões de empregos para
as populações litorâneas dos países produtores (ROCHA, 2005).
A maior parte da produção mundial provém do hemisfério oriental, tendo
China, Tailândia, Vietnã, Indonésia e Índia como principais países produtores
(Tabela 1). O camarão tigre asiático, Penaeus monodon, e o camarão branco do
pacífico, Litopenaeus vannamei, são as duas espécies mais cultivadas e que
predominam no mercado internacional, com cerca de 70% do volume ofertado
(WWW.FAO.ORG / SHRIMP, ACESSO EM: DEZEMBRO, 2006).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 15
Tabela 1. Principais produtores mundiais de camarão cultivado.
2005
Principais países
produtores
Produção em
toneladas
Área em produção
(ha)
Produtividade
(kg/ha/ano)
China
480.000 300.000 1360
Tailândia
325.000 64.000 5078
Vietnã
310.000 722.00 429
Indonésia
300.000 395.000 759
Índia
121.000 154.000 786
Equador
130.000 150.000 867
*America Central
82.000 40.000 2050
México
81.000 43.000 1884
Bangladesh
77.000 145.000 531
Brasil 65.000 16.000 4063
Filipinas
43.000 30.000 1433
Outros
125.000 161.000 776
Total
2.067.000 2.220.000 931
FONTE: GAA / SHRIMP OUTLOOK 2005 / FAO / GLOBEFISH
*
America Central (Honduras, El Salvador, Guatemala, Belize, Nicaragua e Panamá)
3.2 Cenário da carcinicultura brasileira
No Brasil, os primeiros experimentos com camarão cultivado iniciaram-se na
década de 70, tendo como espécie pioneira o Marsupenaeus japonicus, através da
implementação do Projeto Camarão, uma iniciativa do governo do Rio Grande do
Norte, para estudo da viabilidade do cultivo desse crustáceo em substituição à
extração do sal. Contudo, a carência de aperfeiçoamento tecnológico acarretou no
insucesso do cultivo (MAPA et al., 2001).
Posteriormente a falta de êxito com o Marsupenaeus japonicus, o setor da
carcinicultura optou pela domesticação das espécies nativas, Farfantepenaeus
subtilis, Farfantepenaeus paulensis e Litopenaeus schimitti. Da mesma forma,
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 16
durante 10 anos de cultivo, o desempenho produtivo desses indivíduos não foi
satisfatório em termos financeiros (MAPA et al., 2001).
Na década de 80, o camarão L. vannamei foi introduzido no Brasil. Entretanto,
somente em meados dos anos 90 os laboratórios brasileiros dominaram a
reprodução e larvicultura dessa espécie, iniciando a distribuição comercial de pós-
larvas e intensificando as validações tecnológicas nas fazendas de camarão,
demonstrando assim, a supremacia desta espécie em relação às nativas (ROCHA,
2001).
No período de 1997 até 2003, o cultivo de camarão marinho L. vannamei no
Brasil cresceu rapidamente, aumentando em 317% a área cultivada e um incremento
na produtividade de 499% (ROCHA, 2004).
Segundo dados da Associação Brasileira de Criadores de Camarão (ABCC),
a carcinicultura responde por 99% das exportações de camarão do Brasil. De 3,6
toneladas em 1997, a produção do setor saltou para 90.160 toneladas em 2003. A
região Nordeste é responsável por 92% da produção brasileira de camarão
cultivado, onde os estados do Rio Grande do Norte e do Ceará respondem, juntos,
por 70%, seguidos por Bahia, Pernambuco e Piauí respectivamente
(WWW.MERCADODAPESCA.COM.BR, ACESSO EM: DEZEMBRO, 2006).
Entretanto, o ano de 2004 foi marcado por uma crise no setor, quando a
produção de camarão sofreu uma queda de 15,84%, passando para 75.904
toneladas e a produtividade caiu de 6.084 kg/ha/ano para 4.573 kg/ha/ano, com
reduções nas exportações em 12,5% (MADRID, 2005). As exportações continuaram
reduzindo nos anos de 2005 (24.567 toneladas) e 2006 (19.830 toneladas).
Vários fatores foram apontados como responsáveis por esta redução, entre
eles, a aplicação de sobretaxas na exportação do camarão brasileiro, a ação “anti-
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 17
dumping”, movida por agências norte americanas de pesca, que provocou uma
queda de 52% nas exportações brasileiras de camarão para os EUA; os preços
baixos do camarão no mercado internacional; a desvalorização do dólar e o surto
viral da Mionecrose infecciosa (WWW.REVISTARURAL.COM.BR, ACESSO EM:
DEZEMBRO, 2006).
O aumento da susceptibilidade às doenças e reduzidas taxas de crescimento
podem refletir baixos níveis de variabilidade genética para estas características
(WOLFUS et al., 1997). Camarões resistentes às infecções virais e com melhores
taxas de crescimento que garantam alta produtividade são metas indispensáveis
para contrabalançar os baixos preços do mercado. A necessidade da
sustentabilidade econômica reflete investimentos em programas de melhoramento
para esta espécie no Brasil.
3.3 Programas de melhoramento
Programas de melhoramento são relativamente raros na aqüicultura quando
comparados à agropecuária. Entretanto, os benefícios são descritos para algumas
espécies de peixe, incluindo o salmão do Atlântico (FRIARS, 1993; GJEDREM &
FIMLAND, 1995), a tilápia do Nilo (EKNATH et al., 1993), a truta arco-íris
(GJEDREM, 1992) e a carpa comum (BAKOS, 1979; WOHLFARTH et al., 1980).
Camarões peneídeos devem responder melhor às iniciativas de
melhoramento com relação às espécies de peixe em função de sua alta fecundidade
e reduzido intervalo de geração. Apesar disto, a indústria do camarão tem sido lenta
em adotar programas de melhoramento. Esta relutância se deve, em parte, a
percepções do passado, relativas à baixa variabilidade genética e a dificuldades nos
processos de domesticação de espécies de camarão (PULLIN et al., 1998).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 18
Os programas de melhoramento têm como objetivo modificar a média
fenotípica de uma característica específica. Uma das formas de melhorar é eliminar
os indivíduos com baixo desempenho naquela característica. Contudo, um dos
obstáculos a esta abordagem é a perda potencial da diversidade genética oriunda da
utilização de um número reduzido de reprodutores (SILVERSTEIN et al., 2004). A
eficiência de um programa de melhoramento depende essencialmente da
variabilidade genétioramenHistlmentnoos njuntse
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 19
A perda da variabilidade genética em cultivos causada pela falta de
renovação dos reprodutores do plantel e estratégias inadequadas de cruzamento foi
relatada em cultivos de L. stylirostris (BIERNE et al., 2000), Penaeus monodon (XU
et al., 2001), e L. vannamei no Equador (GARCIA et al. 1994) e México (WOLFUS et
al., 1997).
3.4 Estudos em genética de populações de camarão (selvagens e de cultivo)
Em todo mundo muitos estudos de genética molecular foram realizados em
camarões, como a análise estrutural e funcional de genes importantes (CHIOU et al.,
2005; JARASRASSAMEE et al., 2005; LIU et al., 2005), o estudo do genoma
mitocondrial (PODSIADLOWSKI E BARTOLOMAEUS, 2005) e o desenvolvimento
de marcadores (CRUZ et al. 2002; MEEHAN et al., 2003). A análise do DNA foi
usada para determinar os níveis da variação intraespecífica e diferenciação genética
da população de diversas espécies de camarão (BENZIE, 2000; CRUZ et al., 2004;
MAGGIONI et al., 2003; VALLES-JIMENEZ et al., 2005).
A deterioração genética aumenta com a diminuição do tamanho da população
pelo efeito “bottleneck” ou “gargalo de garrafa” do estoque fundador, o que se deve a
duas razões principais; pela consangüinidade e pela deriva genética (SBORDONI et
al., 1986; BENZIE, 2000).
O conhecimento da variação genética intra-específica é fundamental para a
utilização e conservação dos recursos genéticos naturais e da biodiversidade
(TABERLET, 1998). Informações sobre a heterogeneidade dentro e entre estoques
pela análise de relações genéticas entre plantéis de reprodutores possibilita
minimizar os efeitos deletérios do endocruzamento, através do planejamento
apropriado dos cruzamentos (ALLEGRUCCI et al., 1998; SEKINO et al., 2002).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 20
Os estudos em genética de camarão iniciaram-se há 20 anos na Itália, com
marcadores de aloenzimas (SBORDONI et al.,1986). No Brasil, grande parte dos
estudos em genética voltou-se a espécie L. vannamei. A maior parte destes estudos
utilizou diferentes marcadores moleculares, como os de microssatélites e Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD), (FREITAS, 1999; FREITAS E GALETTI, 2002),
o que permitiu o diagnóstico da variação genética encontrada nos diversos plantéis
de reprodutores de L. vannamei provenientes de larviculturas do Brasil.
Uma outra iniciativa surgiu em 2003, o Shrimp Genome Project (ShEST)
tendo como objetivo o seqüenciamento de milhares de Expressed Sequence Tags
(EST) do camarão marinho L. vannamei, ainda em andamento. Apesar do grande
passo dado em pesquisas com genética de camarão, o Brasil ainda não dispõe de
informações sistematizadas da base genética de seus plantéis reprodutores,
baseadas em técnicas moleculares reproduzíveis entre laboratórios e que possam
ser utilizadas em longo prazo.
A genética é uma das ferramentas que pode colaborar para o êxito da
atividade através da caracterização de linhagens específicas, do monitoramento da
variabilidade genética dos plantéis, do estudo de distâncias genéticas e da
elaboração de programas de cruzamentos seletivos
.
3.5 Marcadores moleculares utilizados em estudos populacionais
As proteínas e isoenzimas foram os primeiros marcadores utilizados,
seguidos pelo Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Variable Number Tandem Repeats (VNTR),
que constituem os minissatélites e os microssatélites, e pelo Amplified Fragment
Lenght Polymorphism (AFLP). No entanto, esses marcadores não apresentam um
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 21
uso comum, possuindo características distintas utilizáveis em aplicações específicas
(FERREIRA E GRATTAPAGLIA, 1998).
Sbordoni et al. (1986) fizeram um dos primeiros estudos em camarões
marinhos cultivados da espécie Marsupenaeus japonicus, através de marcadores
isoenzimáticos, o que representou um marco no uso de marcadores moleculares na
carcinicultura. Apesar de um baixo grau de polimorfismo, essas análises enzimáticas
foram fundamentais para o estudo da variabilidade genética em camarão.
Os estudos moleculares baseados em DNA vêm se mostrando muito mais
eficientes que os genético-bioquímicos, especialmente, com relação ao
polimorfismo, principalmente com o advento da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) (BALL et al., 1998; BENZIE, 2000; ESPINOSA et al., 2003; GARCIA et al.,
1996; MEEHAN et al., 2003; XU et al., 1999, 2001; WOLFUS et al., 1997). Essa
tecnologia facilitou a descrição de várias classes de marcadores moleculares com
aplicações em programas de criação de camarão, incluindo identificação de
populações e análise de variabilidade genética (FREITAS E GALETTI, 2002;
GARCIA et al., 1996; SUNDEN E DAVIS, 1991).
Um marcador de DNA é tipicamente uma pequena região do DNA
apresentando polimorfismo entre indivíduos (LIU, 1998). O termo “marcador” tem
sido utilizado para designar fatores morfológicos, bioquímicos ou genéticos passíveis
de serem identificados e que permite o estudo comparativo de genótipos.
Diferentes marcadores de DNA têm sido utilizados na análise de parâmetros
genéticos populacionais, entre eles os marcadores de microssatélites que possuem
todas as características desejáveis a serem utilizadas em estudos de genética de
populações por apresentarem alto polimorfismo, serem co-dominantes e
seletivamente neutros (POWELL et al., 1996).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 22
Loci de microssatélites são constituídos por seqüências curtas de DNA
repetitivo, de 1 a 6 pares de bases, repetidas várias vezes de maneira idêntica e
adjacente (repetição em tandem). As seqüências de DNA que flanqueiam as
microssatélites são conservadas, o que permite a construção de um par de
pequenos fragmentos iniciadores da fita réplica, denominados primers, de 20 a 30
bases, e sua amplificação pode ser feita via Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR). O polimorfismo das seqüências de microssatélite é baseado nas diferenças
de comprimento das seqüências amplificadas, pois o número de repetições em cada
microssatélite é variável (LITT E LUTY, 1989; WEBER et al., 1989).
Além disto, estes marcadores são co-dominantes, ou seja, ambos os alelos
de um indivíduo heterozigoto são visualizados (FERREIRA E GRATTAPAGLIA,
1998).
Os marcadores de microssatélites estão sendo cada vez mais utilizados em
análises de estrutura populacional de várias espécies, como: bovinos (BECKMANN
E SOLLER, 1990; FRIES, 1993), ovinos (CRAWFORD et al., 1994), eqüinos
(MARKLUND et al., 1994), humanos (WEBER, 1990), salmão (SLETTAN et al.,
1993), ostras européias (NACIRI et al., 1995) e na maior parte das espécies de
peneídeos de importância comercial (CRUZ et al., 2004; VALLES-JIMENEZ et al.,
2005; WOLFUS et al., 1997).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 23
4. ARTIGO CIENTÍFICO
AVALIAÇÃO GENÉTICA DE DUAS LARVICULTURAS DE CAMARÃO MARINHO
Ltopenaeus vannamei DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL.
Artigo a ser submetido para o Journal of the World Aquaculture Society
LIMA, A. P. S.
1
; SANTOS, A. C. L.
1
; SILVA, S. M. B. C.
1
; MAGGIONI, R.
2,3
;
COIMBRA, M. R. M.
1*
1
Departamento de Pesca e Aqüicultura, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Brasil; Laboratório de Genética Aplicada – LAGA, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Brasil
2
Núcleo de Genômica e Bioinformática – NUGEN, Universidade Estadual do Ceará,
Brasil
3
Faculdade de Educação, Ciências e Letras do Sertão Central – FECLESC,
Universidade Estadual do
Ceará, Brasil
*
Autor para correspondência:
Maria Raquel Moura Coimbra, Laboratório de Genética Aplicada – LAGA,
Departamento de Pesca e Aqüicultura, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n – Dois Irmãos Recife-PE, Brasil, CEP 52171-900,
Tel: 81-33206522, email: [email protected].
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 24
Resumo
Nos últimos anos a aqüicultura cresceu rapidamente no Brasil, particularmente na
produção de camarões marinhos, tendo a espécie exótica Litopenaeus vannamei,
como a principal espécie cultivada. Em 1997 o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) proibiu a introdução de novos
reprodutores, pela Portaria de nº. 119, desde então, a formação de novos plantéis de
L. vannamei passou a ser baseada de animais provenientes de centros de
reprodutores nacionais. Baixos níveis de variabilidade genética podem afetar
negativamente na produtividade através do aumento da susceptibilidade às doenças
e reduzidas taxas de crescimento. A detecção da variabilidade genética pode ser
analisada por diferentes técnicas de biologia molecular, utilizando marcadores
moleculares de microssatélites. O objetivo do pesente trabalho foi caracterizar
geneticamente duas larviculturas de Litopenaues vannamei do estado de
Pernambuco, Nordeste do Brasil. A caracterização genética foi feita usando 5 loci de
microssatélites e um total de 100 amostras teciduais de reprodutores, para as duas
larviculturas. Foi evidenciado que há variabilidade genética suficiente para subsidiar
programas de melhoramento genético, baseado na freqüência dos alelos, nos
coeficientes de endogamia F
IS
(Larv. A = 0,380 e Larv. B = 0,250) e
heterozigosidades que variaram de Ho = 0,190 a 0,810 e He = 0,460 a 0,870,
respectivamente. A diferenciação entre as larviculturas, F
ST
(0.0215), indicou uma
pequena diferenciação genética e que a maior parte da diferença entre as
populações se deve a variações intrapopulacionais, o que foi confirmado pela
análise de variância molecular (AMOVA). Os resultados aqui relatados podem ser
considerados bons, refletindo a história da atividade no Brasil que se destacou pela
introdução de reprodutores de diversas origens.
Palavras-chave: Litopenaeus vannamei, SSR, STR , Variabilidade Genética,
Consangüinidade,
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 25
1. Introdução
O crescimento da aqüicultura notabilizou-se no Brasil, particularmente na
produção de camarões marinhos, tendo a espécie exótica Litopenaeus vannamei,
como a principal espécie cultivada. De acordo com os dados da Food and
Agricultural Organization (FAO), a carcinicultura gerou para o ano de 2003, um total
1.278.363 toneladas para o país, das quais 40,66% foram oriundas do camarão
marinho Litopenaeus vannamei (FAO, 2005).
A carcinicultura cresceu rapidamente e atualmente responde por 99% das
exportações de camarão do Brasil. Entretanto, o ano de 2004 foi marcado por uma
crise no setor, quando a produção de camarão sofreu uma queda de 15.84%, em
função de questões comerciais internacionais, tais como a aplicação de sobretaxas
na exportação do camarão brasileiro, a chamada ação “anti-dumping” movida por
agências de pesca dos EUA; o incremento da produção de L. vannamei na Ásia; o
câmbio desfavorável à importação e os surtos virais da Mionecroe infecciosa
(MADRID, 2005).
O aumento da susceptibilidade às doenças e reduzidas taxas de crescimento
podem refletir baixos níveis de variabilidade genética para estas características
(WOLFUS et al., 1997). Assim, camarões resistentes a patógenos e com melhores
taxas de crescimento que garantam alta produtividade são metas indispensáveis
para contrabalançar os baixos preços do mercado.
Animais de cultivo geralmente apresentam baixos níveis de variabilidade
genética, diferentemente das populações naturais onde normalmente esse valor é
alto (NEI, 1978; SOLÈ-CAVA, 2001). A variabilidade genética é o atributo mais
importante em uma população e constitui o material sobre o qual a seleção atua.
Uma população com alta variabilidade terá maiores possibilidades de responder aos
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 26
programas de melhoramento e enfrentar com sucesso as adversidades do ambiente
(SOTO-HERNÁNDEZ E GRIJALVA-CHON, 2004).
A maior parte da produção brasileira de pescado oriundo da aqüicultura é
constituída por espécies exóticas. Tendo em vista o risco de estas espécies
constituírem vetores de organismos patogênicos, a introdução de novos
reprodutores, inclusive de crustáceos foi proibida pelo o Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), Portaria de nº. 119, de 17
de outubro de 1997. A partir desta data, a formação de novos plantéis de camarão
passou a ser composta de reprodutores domesticados, o que levanta questões
sobre a existência de variabilidade genética que viabilize programas de
melhoramento no Brasil.
A variabilidade genética em populações vem sendo analisada mediante a
utilização de técnicas de biologia molecular, que usam marcadores moleculares.
Dentre estes se destacam os de microssatélites, que apresentam comportamento
co-dominante, são altamente polimórficos e seletivamente neutros, podendo ser
utilizados em estudos que abordam desde análises de estrutura genético-
populacional até estudos de paternidade (SCHLÖTTERER, 2000).
O objetivo deste trabalho foi caracterizar geneticamente, em termos de
variabilidade e níveis de consangüinidade, duas larviculturas do camarão marinho
Litopenaeus vannamei, no estado de Pernambuco, através de microssatélites.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 27
2. Material e métodos
2.1 Coleta das amostras
Amostras teciduais de reprodutores foram coletadas em dois laboratórios
produtores de pós-larva de L. vannamei, A (N= 50, 25♂ e 25♀) e B (N= 50, 25♂ e
25♀), localizados no Estado de Pernambuco, Brasil, durante janeiro de 2006. A fim
de que a sobrevivência dos reprodutores não fosse comprometida, o 5º par de
pleópodos foi retirado, sendo imediatamente armazenado em etanol a 95%,
procedimento padrão para a preservação do DNA genômico em amostras de tecido
animal (SAMBROOK et al., 1989).
2.2 Extração do DNA
O DNA foi extraído seguindo o protocolo padrão de Fenol/Clorofórmio/Álcool
Isoamílico (FCI), com algumas modificações (SAMBROOK et al., 1989). Para cada
amostra eram usados 700µL de tampão de extração (Tris-HCl 100mM pH 7.5, 1%
SDS) e 30µL de proteinase K (10µg/ml). A mistura foi incubada a 50°C por 2 horas e
depois a 37°C “overnight”. Em seguida, o DNA foi purificado sucessivamente com
FCI (25:24:1), clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e centrifugado a cada etapa a
10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um microtubo e o DNA
total foi precipitado com 1 mL de etanol absoluto gelado, seguido de centrifugação a
10.000 g por 10 minutos. Para a remoção final do excesso de sal e etanol o
precipitado foi lavado com 500 µL de etanol a 70% e brevemente centrifugado
(10.000 g por 5 min). O DNA foi re-suspendido em TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0,
EDTA 1 mM pH 8.0) e armazenado em freezer a -20ºC.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 28
2.3 Amplificação dos loci de microssatélites por PCR
Cinco pares de primers descritos na literatura foram selecionados com base
na definição dos amplicons e reprodutibilidade (Tabela 1). As reações de PCR foram
conduzidas utilizando-se as seguintes condições: desnaturação a 94°C por 4 min; 35
ciclos sucessivos de desnaturação a 94°C por 30s, anelamento a 50°C por 45s,
extensão a 72° C por 1 min e extensão final a 72° por 10 min. Cada reação continha
1U de Taq polimerase, 200µM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCL (pH 8.3), 50 mM
de KCl, 2,5mM de MgCl
2
, 1µM de cada primer e 100ng de DNA para um volume final
de 10 µL..
Tabela 1. Repetições, primers Forward e reverse e tamanho esperado (pb) para os cinco loci de
microssatélites analisados.
Locus de
Microssatélite
Repetições
Primers Forward e
Reverse (5’→3’)
Tamanho
esperado(pb)
Referência
bibliográgica
TUMXLv8.2
…(AT)
3
…(AT)
3
…(AT)
3
…(AT)
3
…(AT)
3
…(AC)
3
…(AT)
3
F: CCTCCTGTCCATTCAGCAG
R:GGTCAGATATGTATTCGAGTRCGG
244
MEEHAN et
al., (2003)
TUMXLv5.27
…(TC)
4
…(CT)
4
…(TC)
3
…(CT)
3
…(TC)
5
…
F: CAGACCCTAAATCTCCGTGC
R: TGGAAAGGTCAGAGGTCACG
175
MEEHAN et
al., (2003)
TUMXLv5.38
…
(TC)
8
…(CT)
4
…(TC)
4
…
F: CCTTTATGACTTCCCCCGAC
R: CCGTACAGAAACGGAACGTC
215
MEEHAN et
al., (2003)
TUMXLv8.32
…(CA)
3
…(TA)
4
…
F:TTACCGCCTAAGAGCGAATG
R:TGTCCTTTCGTACCAGTCAAG
220
MEEHAN et
al., (2003)
Pvan0013
(TA)
5
… (AT)
4
F: TGCTCTGGTAACGACAAACG
R: AGACCTGTGGCGAAGTGC
282-284
CRUZ et al.,
(2002)
2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida vertical a 4% ou 5%, dependendo do tamanho do fragmento
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 29
esperado. A eletroforese durou em média 1 hora e 30 min a 2000 V, 60MA e 55W.
Ao término da corrida, o gel de poliacrilamida foi fixado com ácido acético 10%,
seguido de coloração com nitrato de prata a 0,1% e revelado com carbonato de
sódio. O registro da imagem foi feito em um scanner .
2.5 Análises estatísticas
As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa computacional
GENEPOP (RAYMOND E ROUSSET, 1995), onde parâmetros tais como número de
alelos (A), heterozigosidades observada (H
o
) e esperada (H
e
), os índices de fixação
de Wright, diferenciação genética por locus e o desequilíbrio de ligação e foram
calculados. A significância dos testes múltiplos foi corrigida pelo método de
Bonferroni (RICE, 1989). O índice de fixação F
IS
é o coeficiente de endogamia de um
grupo de indivíduos em relação à subpopulação que eles pertencem, já o F
ST
permite caracterizar a distribuição da variabilidade genética entre populações por ser
um índice que descreve a variação existente nas freqüências alélicas entre
populações (BEAUMONT et al., 2003).
O número de alelos efetivos (a
e
) foi calculado através da seguinte fórmula:
a
e
= 1/Σx
2
i
, onde o x
i
é a freqüência de cada alelo por locus (CROW E KIMURA,
1970).
O conteúdo de informação polimórfica (PIC) é um indicador da qualidade do
marcador em estudos genéticos, sendo calculado de acordo com Botstein et al.,
(1980), com a seguinte fórmula:
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 30
, Onde:
K = número de alelos; X
i
= freqüência relativa do alelo i na amostra; X
j
= freqüência
relativa do alelo j na amostra.
A análise de variância molecular (AMOVA) foi estimada com o programa
computacional Arlequin 2.000 (SCHNEIDER et al., 2000) baseado em 1000
permutações.
3 Resultados
3.1 Análise da diversidade genética
A variabilidade genética das larviculturas do L. vannamei para os cinco loci de
microssatélites está descrita na Tabela 2. O número de alelos variou de 3 a 12, o
número de alelos efetivos (a
e
) variou de 1,64 a 7,69, e a heterozigosidade
observada (Ho), de 0,140 a 0,840. Os loci que apresentaram o maior número de
alelos foram o TUMXLv 5.38 e o TUMXLv 5.27.
O conteúdo de informação polimórfica (PIC) dentro das larviculturas variou de
0,36 a 0,85 (Tabela 2). Segundo a classificação de Botstein et al. (1980),
marcadores com valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito
informativos, valores entre 0,25 e 0,50 mediamente informativos e valores inferiores
a 0,25, pouco informativos.
As probabilidades encontradas nas análises do desequilíbrio de ligação,
quando corrigidas pelo método de Bonferroni, não foram significativas, indicando
que não há associação entre os loci, ou seja, que cada locus avaliado situa-se
provavelmente em um cromossomo diferente do L. vannamei.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 31
A distribuição da freqüência e o tamanho dos alelos para os 5 loci de
microssatélites estão representados na figura 1. Um único locus, TUMXLv 8.2,
apresentou os mesmos alelos para as duas larviculturas. O restante dos loci
compartilhou a maior parte dos alelos nas duas larviculturas, mas também
apresentou alelos únicos para cada uma delas. Os alelos de maior freqüência foram
para o locus TUMXLv 5.27 o de 174 pb, de 176 pb e de 178 pb, já para o locus
TUMXLv 5.38 foram os de 204 pb, 208 pb e 210 pb, para o lócus TUMXLv 8.2 foram
os de 230 pb e 248 pb, para o locus TUMXLv 8.32 foram os alelos 220 pb, 222 pb e
224 pb e finalmente para o locus Pvan0013, o alelo 282 pb foi o de maior
freqüência.
3.2 Estatísticas F de Wright e AMOVA
Os valores médios encontrados para o F
IS
foram de 0,380 para a larvicultura
A e 0,250 para a larvicultura B. Os valores F
IS
indicam uma redução na proporção
média de genótipos heterozigotos (Tabela 3).
O valor do F
ST
total foi de 0.0215 indicando uma pequena diferenciação
genética (Tabela 3) e que a maior parte da diferença entre as populações se deve a
variações intrapopulacionais. Este fato pôde ser confirmado pela análise de
variância molecular (AMOVA), onde a variação entre as larviculturas foi de 0,0215,
enquanto que entre indivíduos dentro das larviculturas foi de 0,280 e, entre
indivíduos foi de 0,700. A diferenciação genética por locus, mostrou que há diferença
significativa entre as larviculturas para os loci TUMXLv 5.38 e Pvan 0013 (Tabela 4).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 32
Tabela 2. Variabilidade genética das populações de Litopenaeus vannamei de duas larviculturas para
cinco loci
Locus
População TUMXLv 5.27 TUMXLv5.38 TUMXLv 8.2 TUMXLv8.32 Pvan 0013 MÉDIA
Larvicultura A
Nº de indivíduos 41 44 40 43 37 41
A 9 9 3 5 4 6
a
e
5,56 6,67 2,70 3,23 2,04 4,04
Ho 0,680 0,770 0,230 0,400 0,240 0,460
He 0,830 0,860 0,640 0,700 0,520 0,710
PIC 0,79 0,83 0,58 0,63 0,52 0,67
Larvicultura B
Nº de indivíduos 40 44 35 44 43 41,20
A 8 12 3 4 3 6
a
e
6,67 7,69 2,13 2 1,64 4,03
Ho 0,730 0,840 0,140 0,500 0,280 0,500
He 0,860 0,880 0,540 0,510 0,390 0,640
PIC 0,80 0,85 0,43 0,45 0,36 0,58
Total de todas as
populações
Nº de indivíduos 81 88 75 87 80 411
Média n alelos 8,5 10,5 3 4,5 3,5 6
Média Ho 0,710 0,810 0,190 0,450 0,260 0,480
Média He 0,850 0,870 0,590 0,610 0,460 0,680
Média PIC 0,80 0,84 0,51 0,54 0,44 0,63
"A indica o número de alelos; a
e
, número de alelos efetivos; Ho, heterozigosidade
observada; He, heterozigosidade esperada; PIC, conteúdo de informação polimórfica"
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 33
Locus TUMXLv 5.27
0
0,1
0,2
0,3
166 168 170 172 174 176 178 180 182
Larvi A
Larvi B
Locus TUMXLv 8.2
0
0,2
0,4
0,6
230 246 248
Larvi A
Larvi B
Locus TUMXLv 5.38
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
200 202 204 206 208 210 212 214 216 218 220 222
Larvi A
Larvi B
Locus TUMXLv 8.32
0
0,2
0,4
0,6
0,8
216 220 222 224 228
Larvi A
Larvi B
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 34
Locus Pvan 0013
0
0,2
0,4
0,6
0,8
276 278 280 282 284
Larvi A
Larvi B
Figura 1. Histogramas das freqüências dos alelos para cada locus de microssatélites do L. vannamei.
Tabela 3. Índices de Wright (F
IS
e F
ST
) para as duas larviculturas de L. vannamei
a
Locus F
IS
F
ST
Larvicultura A Larvicultura B
TUMXLv 5.27 0,1771
0,1607
0.0281
TUMXLv 5.38 0,1017
0,0430
-0.0006
TUMXLv 8.2 0,6532
0,7381
0.0132
TUMXLv 8.32 0,4360
0,0105
0.0608
Pvan 0013 0,5352
0,2921
0.0070
Média 0,380
0,250
0.0215
a
Dados obtidos através do GENEPOP (RAYMOND E ROUSSET, 1995).
Tabela 4. Diferenciação genética das larviculturas por locus
a
População Locus
TUMXLv 5.27 TUMXLv 8.2 TUMXLv 5.38 TUMXLv 8.32 Pvan 0013
Larvi.A x Larvi.B 0,00021 0,00723 0,07479 0,00399 0,06929
a
Dados obtidos através do GENEPOP (RAYMOND E ROUSSET, 1995),
Para todos os valores, P > 0,05, indica que há diferença genética significativa por locus entre as
larviculturas.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 35
4. Discussão
Alguns estudos genéticos importantes vêm sendo realizados na espécie
Litopenaeus vannamei, tais como o estudo do genoma mitocondrial
(PODSIADLOWSKI E BARTOLOMAEUS, 2005), o desenvolvimento de marcadores
(CRUZ et al. 2002; MEEHAN et al., 2003) e diferenciação genética de populações
naturais e cultivadas através de marcadores moleculares (VALLES-JIMENEZ et al.,
2005).
Devido a grande importância econômica que esta espécie representa para o
país, em especial para a região Nordeste, e diante dos surtos virais em países
vizinhos ao Brasil, o IBAMA proibiu a importação de animais desta espécie em 1997
devido ao risco da introdução de patógenos. Assim, a carcinicultura nacional tem
baseado sua produção a partir de plantéis reprodutivos domesticados, o que
despertou a necessidade de se adotar medidas de manejo que visem não só o
desempenho produtivo, mas também a sustentabilidade dos plantéis sob o ponto de
vista genético. Uma vez conhecendo a base genética dos plantéis existentes, os
efeitos de endocruzamento poderão ser evitados através de cruzamentos
programados que minimizem a endogamia (BORLASE et al., 1993).
Estudos desenvolvidos no passado com L. vannamei mostraram uma
variação alélica significativa para loci de microssatélites. Nas Filipinas, por exemplo,
de 21 a 47 alelos foram encontrados em populações de L. vannamei (WOLFUS et
al., 1997). Entretanto, recentemente, Valles-Jimenez et al. (2005) identificaram de 2
a 16 alelos por locus para cinco loci de microssatélites em populações naturais de L.
vannamei do México e Panamá, valores muito similares aos encontrados no
presente trabalho (de 3 a 12 alelos por locus) para 5 loci de microssatélite. Este fato
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 36
possibilita afirmar que as larviculturas de Pernambuco possuem um número de
alelos compatível com o de populações naturais desta espécie.
A heterozigosidade média relatada por Valles-Jimenez et al. (2005), em
populações naturais de L. vannamei (Ho= 0,164 a 0,535; He= 0,385 a 0,857),
mostraram menor variação do que as encontradas no presente estudo (Ho= 0,190 a
0,810; He= 0,460 a 0,870). Todas as heterozigosidades médias observadas por
larviculturas foram menores que as esperadas, refletindo um marcado afastamento
das proporções esperadas de Hardy-Weinberg, um fato comum em cativeiro quando
condições de cruzamento aleatório e tamanho populacional infinito não são
atendidas.
Como estimadores de variabilidade o número e distribuição dos alelos são
também importantes. Assim uma avaliação genética apropriada deve considerar
tanto a heterozigosidade quanto o número e distribuição dos alelos para se obter
uma estimativa fiel (BEARDMORE et al., 1997).
Os valores de PIC (0,36 a 0,85) aqui encontrados estão dentro do esperado
para esse grupo de marcadores de microssatélites, podendo ser considerados de
médio a muito informativos. Valores de PIC entre 0,195 e 0,871 foram descritos por
Meehan et al., (2003) para dezenas de marcadores de microssatélites, incluindo
quatro dos marcadores avaliados no presente trabalho.
A diferença genética encontrada entre as duas larviculturas (F
ST
= 0.0215),
embora estatisticamente diferente de zero, não pode ser considerada alta. Luan et al
(2006) observaram valores muito próximos (F
ST
=0,023) em uma comparação entre
uma população selvagem e de cultivo de Marsupenaeus japonicus, enquanto Soto-
Hernández et al. (2004), registraram valores mais altos (F
ST
=0,086) com aloenzimas
em populações selvagens e cultivadas de L. vannamei. A diferença genética
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 37
encontrada no presente trabalho indica que estas larviculturas tiveram acesso a um
grupo de reprodutores de origem genética similar e que o manejo de seleção de
matrizes é igualmente comum, ou seja, reprodutores são adquiridos de maneira
aleatória de diferentes centros de engorda pelas larviculturas do nordeste. A análise
de variância molecular (AMOVA) mostrou que a maior parte da diferença entre as
populações deve-se, todavia, a diferenças entre indivíduos, o que é esperado no
caso de populações homogêneas.
Os valores médios de F
IS
foram de 0,380 para a larvicultura A e de 0,250 para
a larvicultura B, significativamente diferente de zero, indicando a perda da
variabilidade genética dos plantéis. Isto se deve provavelmente à limitação física
para a manutenção de grandes plantéis, a falta de introdução de novos pools
gênicos e ao cruzamento entre indivíduos aparentados. Ainda assim, os valores de
F
IS
encontrados podem ser considerados moderados, tendo em vista que
populações naturais do México mostraram níveis médios em torno de 0,53 (VALLES-
JIMENEZ et al., 2005), e em populações de L. vannamei selvagens e de cultivos que
mostraram níveis médios de 0,63 (SOTO-HERNÁNDEZ et al. 2004).
O nordeste se destaca na carcinicultura brasileira por concentrar a maior
produção do país. A diferenciação genética entre os indivíduos nas larviculturas de
Pernambuco evidencia a existência de variabilidade genética, o que se deve a
formação original da base genética dos plantéis com origens múltiplas, tais como
Panamá, Equador, Venezuela, Peru, Guatemala, México e Costa Rica, introduzidas
até 1997 em diferentes estados. Esta situação é extremamente favorável, uma vez
que mesmo com quase uma década de fronteiras fechadas, sem renovação de
matrizes, foi possível conservar uma variabilidade genética que viabilize um
programa de melhoramento genético visando à produção de animais resistentes a
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 38
determinados patógenos ou com menores taxas de conversão alimentar. O
monitoramento continuado destes plantéis deve ser tomado como uma ferramenta
importante na preservação desta variabilidade.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 39
5. Conclusões
Os loci de microssatélites selecionados permitiram caracterizar geneticamente
a estrutura genética das populações devido à definição e reprodutibilidade dos
amplicons, compondo um conjunto de marcadores distribuídos de maneira aleatória
no genoma do L. vannamei, o que viabilizará ao longo do tempo avaliação da
condição genética das larviculturas.
A pequena diferenciação genética entre os dois laboratórios de maturação do
estado de Pernambuco mostrou-se compatível com a história da carcinicultura
brasileira, onde os estoques reprodutores foram fundados a partir de uma
amostragem bastante ampla do germoplasma da espécie.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 40
6. Referências Bibliográficas
BEARDMORE, J. A., MAIR, G. C., LEWIS, R. I. Biodiversity in aquatic systems in
relation to aquaculture. Aquaculture Research 28:829-839, 1997.
BEAUMONT, A. R.; HOARE, K. Biotechnology and Genetics in Fisheries and
Aquaculture. ed. Blackwel Science158 p, 2003.
BORLASE, S. C., LOEBEL, D. A., FRANKHAM, R., NURTHEN, R. K., BRISCOE, D.
A., DAGGARD, G. E. Modeling problems in conservation genetics using captive
Drosophila populations: Consequences of equalization of family sizes. Conservation
Biology 7:122-131, 1993.
BOTSTEIN, D., WHITE, R. P., SKOLNICK, M., DAVIS, R. W. Construction of a
genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J
Anim Genet 32:314–331, 1980.
CROW, J. F. & KIMURA, M. An introduction to population genetics theory Harper &
Row, New York, 1970.
CRUZ, P., MEJIA-RUIZ, C. H., PEREZ-ENRIQUEZ, R., IBARRA, A. M. Isolation and
characterization of microsatellites in Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus)
vannamei. Molecular Ecology Notes 2(3): 239-241, 2002.
FAO. Aquacult-PC: Fishery information, data and statistics (FIDI), time series of
production from aquaculture (quantities and values) and capture fishers (quantities).
FAO: Programa Computacional, 2005.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 41
SOTO-HERNÁNDEZ, J., GRIJALVA-CHON, J. M. Genetic differentiation in hatchery
strains and wild white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931) from
northwest Mexico. Aquaculture International 12: 593–601, 2004.
LUAN, S., KONG, J., WANG, Q. Y. Genetic variation of wild and cultured populations
of the Kuruma prawn Marsupenaeus japonicus (Bate 1888) using microsatellites.
Aquaculture Research, 37, 785-792, 2006.
MADRID, R. M. Análise das exportações da carcinicultura brasileira de 1999 a 2003:
cinco anos de sucesso e 2004, o início de uma nova fase. Revista da ABCC, 1: p.76-
84, 2005.
MEEHAN, D., XU, Z., ZUNIGA, G., ALCIVAR-WARREN, A. High frequency and
large number of polymorphic microsatellites in cultured shrimp, Litopenaeus
vannamei (Crustacea: deacapoda). Mar. Biotechnol. V. 5, p. 311-330, 2003.
NEI, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small
number of individuals. Genetics 89:583-590, 1978.
PODSIADLOWSKI, L., BARTOLOMAEUS, T. Organization of the mitochondrial
genome of Mantis shrimp Pseudosquilla ciliate (Crustacea: Stomatopoda). Mar.
Biotechnol. 7 (6), 618–624, 2005.
RAYMOND, M.; ROUSSET, F. GENEPOP (version 1.2): population genetics
software for exact tests and ecumenicism. Journal Heredity, 86, V. 3, p. 248-249,
1995.
RICE, W. R. Analyzing Tabbles of Statistical Tests. Evolution 43: 223-225, 1989
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 42
SAMBROOK, J., FRITSCH, E. F. E., MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989.
SCHOLOTTERER, C. Evolutionary Dynamics of Microsatellite DNA. Journal
Chromosoma, 6, 365-371, 2000.
SCHNEIDER, S., ROESSLI, D., EXCOFFIER, L. Arlequin ver 2.000: A Software for
Population genetics data Analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of
Geneva, Switzerland, 2000.
SOLÈ-CAVA, A. M. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: Matioli,
S. R. (Ed.) Biologia Molecular e Evolução p. 172 - 192; Ed. Holos, 2001.
SOTO-HERNÁNDEZ, J., GRIJALVA-CHON, J. M. Genetic differentiation in hatchery
strains and wild white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931) from
northwest Mexico. Aquaculture International 12: 593–601, 2004.
VALLES-JIMENEZ, R., CRUZ, P., PEREZ-ENRIQUEZ, R. Population genetic
structure of Pacific write shrimp (Litopenaeus vannamei) from México to Panamá:
Microsatellite DNA variation. Marine Biotechnology 6:475-484, 2005.
WOLFUS, G. M., GARCIA,O. K., ALCIVAR-WARREN, A. Application of the
microsatellite technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs.
Aquaculture 152: 35-47, 1997.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 43
5. ARTIGO CIENTÍFICO
MONITORAMENTO GENÉTICO NA REPOSIÇÃO DE MATRIZES DO CAMARÃO
MARINHO Litopenaeus vannamei EM PERNAMBUCO, BRASIL.
Artigo a ser submetido para o periódico Aquaculture Research
LIMA, A. P. S.
1
; SANTOS, A. C. L.
1
; SILVA, S. M. B. C.
1
; SILVA, E. J.O.
1
;
DANTAS, H. L.
1
; MAGGIONI, R.
2 3
; COIMBRA, M. R. M.
1*
1
Departamento de Pesca e Aqüicultura, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Brasil; Laboratório de genética Aplicada – LAGA, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Brasil
2
Núcleo de Genômica e Bioinformática – NUGEN, Universidade Estadual do Ceará,
Brasil
3
Faculdade de Educação, Ciências e Letras do Sertão Central – FECLESC,
Universidade Estadual do
Ceará, Brasil
*
Autor para correspondência:
Maria Raquel Moura Coimbra, Laboratório de genética Aplicada – LAGA,
Departamento de Pesca e Aqüicultura, Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n – Dois Irmãos Recife-PE, Brasil, CEP 52171-900,
Tel: 81-33206522, email: [email protected].
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 44
Resumo
O Brasil ocupa hoje posição de destaque no panorama da carcinicultura
mundial, entretanto, não dispõe de informações sistematizadas da base genética de
seus plantéis. Para a manutenção da sustentabilidade genética de uma espécie é
necessário que a população disponha de diversidade genética. Em populações
cultivadas, o monitoramento da variação genética é recomendado para permitir o
acompanhamento de eventuais mudanças na variabilidade causadas pelo
endocruzamento, deriva genética ou pela seleção. O manejo de reprodutores em
cultivos de camarão pode causar redução ou eliminação da variabilidade genética.
Em muitos sistemas de larvicultura de camarão, a obtenção de reprodutores é feita
em sistema fechado, ou seja, as pós-larvas são levadas para fazendas de engorda
específicas, onde crescem até serem selecionadas para formar um novo lote de
matrizes, fechando-se o ciclo e mantendo-se a mesma origem genética. Diferentes
marcadores moleculares têm sido utilizados na análise de parâmetros genéticos
populacionais, entre eles os marcadores de microssatélites. Objetivou-se monitorar a
variabilidade genética de uma larvicultura de L. vannamei do estado de Pernambuco
ao longo de três reposições sucessivas de matrizes em três momentos diferentes,
através de marcadores de microssatélites. Pelos resultados obtidos, ficou
evidenciada que a reposição intercalada de matrizes, adotada em alguns sistemas
de cultivo fechado no Brasil, não vem comprometendo a variabilidade genética
destas larviculturas, o que foi mostrado através das heterozigosidades médias que
foram na primeira coleta de Ho = 0,460 e He = 0,660, na segunda coleta de Ho =
0,420 e He = 0,620, e na terceira coleta de Ho = 0,600 e He = 0,660, e dos alelos
que permaneceram praticamente constantes nas três reposições. Os resultados
encontrados nesse estudo provavelmente foram em função da grande diversidade
do estoque fundador com múltiplas origens.
Palavras-chaves: Litopenaeus vannamei, Microssatélites, Monitoramento, Reposição
de Matrizes.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 45
1.Introdução
A carcinicultura marinha é o segmento mais bem sucedido da carcinicultura
mundial, proporcionando empregos diretos e indiretos para milhões de trabalhadores
e milhões em receita (ROCHA et al., 2004). O Brasil ocupa hoje posição de destaque
no panorama da carcinicultura mundial, entretanto, não dispõe de informações
sistematizadas da base genética de seus plantéis.
Para a manutenção da sustentabilidade genética de uma espécie é
necessário que a população disponha de diversidade genética, a fim de garantir sua
sobrevivência em longo prazo. Em populações cultivadas, programas de
monitoramento da variação genética são recomendados para permitir o
acompanhamento de eventuais mudanças na variabilidade causadas pelo
endocruzamento, deriva genética ou pela seleção (ALLENDORF E RYMAN, 1987).
A perda da variabilidade genética em cultivos causada pela falta de
renovação dos reprodutores do plantel e estratégias inadequadas de cruzamento foi
relatada em cultivos de Penaeus stylirostris (BIERNE et al., 2000), Penaeus
monodon (XU et al., 2001), e Litopenaeus vannamei no Equador e México (GARCIA
et al., 1994; WOLFUS et al., 1997).
No Brasil, a introdução de novos reprodutores da espécie L. vannamei está
proibida pelo o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA), Portaria nº. 119, de 17 de outubro de 1997, devido ao risco
dessas espécies serem vetores de patógenos exógenos, passando assim a serem
utilizados animais provenientes de diferentes centros reprodutores de camarão
nacionais para formação de novos plantéis.
O manejo de reprodutores em cultivos de camarão pode acentuar a redução
ou eliminação da variabilidade genética, pois o cultivo em pequenas populações
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 46
propicia o cruzamento entre indivíduos aparentados. O endocruzamento favorece a
homozigose, podendo causar depressão por endogamia, interferindo negativamente
na produtividade ou até mesmo expondo à manifestação alelos deletérios
(FALCONER E MACKAY, 1996; BROWN et al 1990).
Em muitos sistemas de larvicultura de camarão, a obtenção de reprodutores é
feita em sistema fechado, ou seja, nestes sistemas os reprodutores são obtidos de
uma única fazenda de engorda associada, sistematicamente suprida por pós-larvas
de uma única larvicultura. Muito embora várias desovas sejam necessárias para
povoar os diversos viveiros de uma fazenda, a origem genética destes reprodutores
é uma só. Este fato desperta a questão: há ou não uma perda gradativa de
variabilidade genética ao longo de sucessivas reposições de reprodutores nas
larviculturas?
A identificação de marcadores genéticos estáveis, além de estimar os níveis
de variação genética, pode discriminar linhagens e indivíduos, auxiliando no
monitoramento de estoques cultivados e no desenvolvimento de programas de
melhoramento genético (CARVALHO E PITCHER, 1995).
Diferentes marcadores moleculares têm sido utilizados na análise de
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 47
2. Material e Métodos
2.1 Coleta das amostras
No período de fevereiro a outubro de 2006, foram realizadas três coletas com
intervalos aproximados de quatro meses, de acordo com a reposição das matrizes
(coletas 1, 2 e 3), totalizando 150 animais, com proporções iguais de ambos os
sexos. Os indivíduos foram coletados de um plantel comercial da espécie L.
vannamei oriundos de uma larvicultura localizada no estado de Pernambuco. O 5º
par de pleópodos foi retirado do animal tomando-se o cuidado para não
comprometer a sobrevivência do indivíduo, e imediatamente armazenado em etanol
a 95%, procedimento padrão para a preservação do DNA em amostras de tecido
animal (SAMBROOK et al., 1989).
Na larvicultura era adotado um sistema de ciclo fechado, ou seja, as pós-
larvas seguiam para a fazenda de engorda, associada a esta larvicultura e, após
uma seleção baseada em tamanho e na ausência de lesões visíveis, retornavam,
após um ano, como matrizes para a mesma larvicultura.
2.2 Extração do DNA
O DNA foi extraído seguindo o protocolo padrão de Fenol/Clorofórmio/Álcool
Isoamílico (FCI), com algumas modificações (SAMBROOK et al., 1989). Para cada
amostra eram usados 700µL de tampão de extração (Tris-HCl 100mM pH 7.5, 1%
SDS) e 30µL de proteinase K (10µg/ml). A mistura foi incubada a 50°C por 2 horas e
depois a 37°C “overnight”. Em seguida, o DNA foi purificado sucessivamente com
FCI (25:24:1), clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e centrifugado a cada etapa a
10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um microtubo e o DNA
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 48
total foi precipitado com 1 mL de etanol absoluto gelado, seguido de centrifugação a
10.000 g por 10 minutos. Para a remoção final do excesso de sal e etanol o
precipitado foi lavado com 500 µL de etanol a 70% e brevemente centrifugado
(10.000 g por 5 min). O DNA foi re-suspendido em TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0,
EDTA 1 mM pH 8.0) e armazenado em freezer a -20ºC.
2.2 Amplificação do DNA com 3 loci de microssatélites via PCR
Para o monitoramento foram escolhidos 3 pares de primers, TUMXLv 5.38,
TUMXLv 8.2, PVan 0013 (CRUZ et al., 2002; MEEHAN et al., 2003), com base na
definição dos amplicons e reprodutibilidade.
As reações de PCR foram conduzidas utilizando as seguintes condições:
desnaturação a 94°C por 4 min; 35 ciclos sucessivos de desnaturação a 94°C por
30s, anelamento a 50°C por 45 s, extensão a 72° C por 1 min e extensão final a 72°
por 10 min. Cada reação continha 1U de Taq polimerase, 200µM de cada dNTP, 10
mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KCl, 2,5mM de MgCl
2
, 10µM de cada primer e
100ng de DNA para um volume final de 10 µL.
2.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida vertical a 4% ou 5%, dependendo do tamanho do fragmento
esperado. A eletroforese durou em média 1 hora e 30 minutos a 2000 V, 60MA e
55W. Ao término da corrida, o gel de poliacrilamida foi fixado com ácido acético a
10%, seguido de coloração com nitrato de prata a 0,1% e revelado com carbonato
de sódio. O registro da imagem foi feito em um “scanner”.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 49
2.4 Análises estatísticas
As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o programa computacional
GENEPOP (Raymond & Rousset, 1995), onde parâmetros, tais como número de
alelos (A), heterozigosidades observada (H
o
) e esperada (H
e
), coeficiente de
endogamia, F
IS
, e o desequilíbrio de ligação, corrigido pelo método de Bonferroni
(RICE, 1989), foram calculados. O número de alelos efetivos (a
e
) foi calculado
através da seguinte fórmula: a
e
= 1/Σx
2
i
, onde o x
i
é a freqüência de cada alelo por
locus (CROW E KIMURA, 1970).
3 Resultados
A variabilidade genética das populações monitoradas de L. vannamei para os
3 loci de microssatélites está descrita na tabela 1. O valor médio da
heterozigosidade observada (Ho) variou de 0,420 a 0,600 e da heterozigosidade
esperada (He) variou de 0,620 a 0,660.
Em relação ao número médio de alelos (A) em cada coleta, houve uma
variação de 4,33 a 5 e o número médio de alelos efetivos (a
e
) variou de 3,29 a 3,79.
Para o locus TUMXLv 5.38, os alelos mais comuns (204 pb, 206 pb, 208 pb,
210 pb, 212 pb e 214 pb) estavam presentes nas três coletas (Figura 1). Os alelos
de maior freqüência para o locus TUMXLv 8.2 foram os alelos 230 pb, 246 pb e 248
pb nas três coletas, sendo o alelo 248 pb o de maior freqüência nas duas primeiras
coletas e o alelo 230 pb, na coleta 3. Quanto ao locus Pvan 0013, os alelos 278 pb,
280 pb e 282 pb eram os mais comuns e presentes em todas as coletas e o alelo
276 pb esteve presente apenas nas coletas 1 e 3 (Figura 1).
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 50
Os valores médios de F
IS
encontrados foram de 0,37 para a coleta 1, 0,39
para a coleta 2 e 0,13 para a coleta 3, havendo uma diferença irrelevante entre a
primeira e a segunda coleta, mas uma diminuição significativa entre a segunda e a
terceira coleta.
As probabilidades encontradas nas análises do desequilíbrio de ligação,
quando corrigidas pelo método de Bonferroni, não foram significativas, indicando
que não há associação entre os loci, ou seja, que cada locus avaliado
provavelmente situa-se em um cromossomo diferente do L. vannamei.
Tabela 1. Variabilidade genética das populações monitoradas de Litopenaeus vannamei
para 3 loci de microssatélites
População
Locus Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3
TUMXLv 5.38
Nº de indivíduos 38 36 34
A 8 8 6
a
e
5,38 7,14 5
Ho 0,970 0,830 0,880
He 0,840 0,870 0,810
TUMXLv 8.2
Nº de indivíduos 38 40 41
A 3 3 3
a
e
2,33 2,63 2,70
Ho 0,180 0,280 0,610
He 0,570 0,630 0,640
Pvan 0013
Nº de indivíduos 38 43 39
A 4 3 4
a
e
2,27 1,59 2,17
Ho 0,240 0,160 0,310
He 0,560 0,370 0,540
Média
Indivíduos 38 39.67 38
A 5 4.67 4.33
a
e
3,33 3,79 3,29
Ho 0,460 0,420 0,600
He 0,660 0,620 0,660
"A indica o número de alelos; a
e
, número de alelos efetivos; Ho, heterozigosidade
observada; He, heterozigosidade esperada.”
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 51
Locus TUMXLv 5.38
0
0,1
0,2
0,3
0,4
204 206 208 210 212 214 216 218
Coleta 1
Coleta 2
Coleta 3
Locus TUMXLv 8.2
0
0,2
0,4
0,6
230 246 248
Coleta 1
Coleta 2
Coleta 3
Locus Pvan 0013
0
0,2
0,4
0,6
0,8
276 278 280 282
Coleta 1
Coleta 2
Coleta 3
Figura 1 Histogramas das freqüências dos alelos para cada locus de microssatélites do L.vannamei.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 52
4. Discussão
No Brasil, programas de melhoramento para o L. vannamei ainda são
incipientes, contudo uma grande preocupação se instalou nas larviculturas de
camarão com respeito à provável perda da variabilidade, devido a não-renovação de
matrizes, como conseqüência da Portaria que proibiu importação de crustáceos.
Esta perda não pode ser avaliada de maneira direta e necessita recorrer à perda
decorrente da reposição de matrizes em sistemas fechados. Em tais sistemas, as
pós-larvas são levadas para fazendas de engorda específicas, onde crescem por um
ano, até serem selecionadas para formar um novo lote de matrizes, voltando para a
larvicultura, fechando-se o ciclo e mantendo-se a mesma origem genética.
Um dos parâmetros básicos e relevantes em estudos de estrutura
populacional é a heterozigosidade. Quanto mais heterozigota for uma população,
maior será sua capacidade em lidar com parâmetros ambientais variáveis
(BEAUMONT E HOARE, 2002). Em sistemas de aqüicultura espera-se que a
heterozigosidade seja menor do que em populações naturais, uma vez que os
acasalamentos em cativeiro não acontecem aleatoriamente.
Tamayo (2006), utilizando 4 loci de microssatélites, comparou dois estoques
de parentais (Go) e suas respectivas progênies (F
1
) de populações cultivadas de L.
vannamei, onde uma redução da heterozigosidade foi detectada. Este autor
encontrou uma heterozigosidade observada (Ho) para um dos estoques parentais de
0,400 e He= 0,600 e para sua progênie, Ho= 0,290 e He= 0,440, enquanto que para
o segundo estoque parental Ho= 0,628 e He= 0,663 e para sua progênie Ho= 0,547
e He= 0,622.
Cruz et al. (2004) mostraram em um estudo de famílias cultivadas de L.
vannamei por três gerações, de G
0
a G
2
, que a heterozigosidade observada (Ho) e
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 53
esperada (He) da geração G
0
foi de 0.650 e 0,770, para a geração G
1
foi Ho= 0,710
e He= 0,720 e para a G
2
, foi Ho= 0,720 e He= 0,710, respectivamente, revelando um
aumento gradativo dos valores em função da introdução de novos reprodutores
masculinos da linhagem fundadora na geração G
1
.
Na Itália, um estudo desenvolvido com Penaeus japonicus da geração F
1
a F
6
mostrou uma diminuição da heterozigosidade média de 0,102 a 0,039, através de
aloenzimas (SBORDONI et al, 1986). No entanto, estes autores verificaram que boa
parte desta perda se deveu ao efeito de bottleneck entre a F
1
e a F
2
, onde apenas 4
reprodutores da F
1
foram utilizados para produzir a F
2
. A partir da F
2
até a F
6
, os
valores de heterozigosidade permaneceram relativamente constantes.
No presente estudo, as heterozigosidades observadas e esperadas para as 3
coletas ao longo de um ano, não sofreram alterações relevantes. A Ho variou de
0,420 a 0,600, enquanto que a He oscilou entre 0,620 a 0,660. Este aumento da
heterozigosidade observada pode refletir o efeito aleatório das amostragens ou
ainda diferenças no tamanho efetivo populacional dos reprodutores utilizados para
produzir os indivíduos coletados nas três amostragens. O coeficiente de endogamia
(F
IS
) é um parâmetro que descreve o déficit de heterozigotos em uma população e,
portanto, reflete os efeitos das alterações na heterozigosidade. Os valores de F
IS
podem variar de 0 a 1, onde 1 é o valor máximo de endogamia que pode ser
encontrado em uma população. Os valores médios encontrados para o F
IS
revelaram
uma diminuição entre a segunda e a terceira coleta, de 0,39 para 0,13, refletindo os
efeitos das alterações na heterozigosidade.
Valores de F
IS
diferindo de 0 evidenciam o endocruzamento e,
consequentemente, perda na variabilidade genética. No entanto, o valor encontrado
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 54
em populações naturais do México por Valles-Jimenez et al (2005) para L.
vannamei, foi muito superior (F
IS=
0.53) ao aqui descrito. Tamayo (2006) encontrou
valores próximos aos aqui apresentados, contudo uma das gerações consecutivas
mostrou um aumento do F
IS
(de 0,08 para 0,14).
Além da heterozogisidade um outro estimador de variabilidade genética, que
deve ser considerado é o número de alelos presentes na amostra (BEARDMORE et
al., 1997). A diversidade alélica também é uma medida útil de variabilidade genética
dentro de uma população, desde que, as comparações sejam feitas com amostras
similares.
Dentro das três coletas o número de alelos por locus variou de 3 a 8, estando
próximo aos encontrados por Cruz et al. (2004), de 1 a 9 alelos, em análises de
gerações consecutivas (G
0
a G
2
) de L. vannamei. Meehan et al (2003) caracterizou
dois dos locus (TUMXLv 5.38 e TUMXLv 8.2), aqui avaliados em populações SPF
cultivadas de L. vannamei e encontrou 8 e 9 alelos, respectivamente. Os nossos
dados revelaram um número máximo de alelos de 8 e 3 para estes dois loci,
indicando uma redução no locus TUMXLv 8.2, possivelmente devida à deriva
genética no momento inicial da importação da espécie para o Brasil.
O locus Pvan 0013 foi caracterizado por Cruz et al.(2002), que verificaram
apenas 2 alelos em populações cultivadas de L. vannamei. Valles-Jimenez et al.
(2005) observaram em populações naturais de L. vannamei para o locus Pvan 0013
um número máximo de 6 alelos. É interessante ressaltar que dos 6 alelos
encontrados por aqueles autores, 3 estiveram presentes nas nossas amostras (de
um total de 4 alelos), sendo o alelo 282 pb o de maior freqüência nos dois estudos.
Com a falta de renovação dos plantéis brasileiros e com o sistema de ciclo
fechado adotado por algumas larviculturas, era de se esperar uma tendência de
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 55
perda da variabilidade genética, o que não foi evidenciado nesse estudo. Muito
embora a estratégia de coletas aqui adotada não reflita diretamente gerações
consecutivas, ela retrata intervalos de gerações intercalados, cuja origem genética é
a mesma e que descreve uma situação transcorrida na maior parte das larviculturas
que possuem fazendas de engorda associadas. Com os resultados aqui obtidos,
percebe-se claramente que o número de reprodutores utilizados até o momento
neste tipo de estratégia, não comprometeu a variabilidade genética ao longo de um
ano.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 56
5. Conclusão
A reposição intercalada de matrizes, em um laboratório de maturação de
Pernambuco, não levou a perda significativa de variabilidade genética,
provavelmente em conseqüência da origem múltipla do estoque fundador.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 57
6. Referências Bibliográficas
ALLENDORF, F. W., RYMAN, N. Genetic management of hatchery stocks. In:
Population Genetics and Fishery Management, Ryman, N., Utter, F. (Eds). Seattle:
University of Washington Press, pp 141-159, 1987.
BEARDMORE, J. A., MAIR, G. C., LEWIS, R. I. Biodiversity in aquatic systems in
relation to aquaculture. Aquaculture Research 28:829-839, 1997.
BEAUMONT, A. R., HOARE, k. Biotechnology and genetics in fisheries and
aquaculture. Langue : ANGLAIS 304p, Date de parution: 12-2002.
BIERNE, N.; BEUZART, I.; VONAU, V.; BONHOMME, F.; BEDIER, E. Microsatelite
associated heterosis in hatchery-propagated stocks of the shrimp Penaeus stylirotris.
Aquaculture 184, pp.202-219, 2000.
BROWN, A. H. D.; CLEGG, M. T.; KAHLER, A. L.; WEIR, B. S. Plant Population
Genetics, Breedind, and Genetic Resources. 1 ed. Massachusetts: Sinauer
Associates Inc, 449 p, 1990.
CARVALHO, G. R., PITCHER, T. J. Molecular genetics in fisheries. London; New
York: Chapman & Hall, 1995.
CROW, J. F. & KIMURA, M. An introduction to population genetics theory Harper &
Row, New York, 1970.
CRUZ, P., MEJIA-RUIZ C. H., PEREZ-ENRIQUEZ, R., IBARRA, A. M.,
ANDGAFFNEY, P. M. Genetic variability assessed by microsatellite in a breeding
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 58
program of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Marine Biotechnology
6:157-164, 2004.
CRUZ, P., MEJIA-RUIZ, C. H., PEREZ-ENRIQUEZ, R., IBARRA, A. M. Isolation and
characterization of microsatellites in Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus)
vannamei. Molecular Ecology Notes 2(3): 239-241, 2002.
FALCONER, D. S.; MACKAL, T. F. C. Introduction to Quantitative Genetics. 4 ed.
England: Longman, 464p, 1996.
GARCIA, D. K., FAGGART, M. A., RHOADES, L., ALCIVAR-WARREN, A., WYBAN,
J. A., CARR, W. H., SWEENEY, J. N. Genetic diversity of cultured Penaeus
vannamei shrimp using three molecular genetic techniques. Mol Mar Biol Biotechnol
3: 270-280, 1994.
MEEHAN, D., XU, Z., ZUNIGA, G., ALCIVAR-WARREN, A. High frequency and
large number of polymorphic microsatellites in cultured shrimp, Litopenaeus
vannamei (Crustacea: deacapoda). Mar. Biotechnol. V. 5, p. 311-330, 2003.
RAYMOND, M.; ROUSSET, F. GENEPOP (version 1.2): population genetics
software for exact tests and ecumenicism. Journal Heredity, 86, V. 3, p. 248-249,
1995.
ROCHA, I. P.; RODRIGUES, J., AMORIM, L. A carcinicultura brasileira em 2003.
Revista da ABCC 1: p 30-36, 2004.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E. F. E., MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 59
SBORDONI et al, 1986SBORDONI, V., DE METTHAEIS, M., COBOLLI SBORDONI,
M., LA ROSA, G., MATTOCCIA, M. Bottleneck effects and the depression of genetic
variability in hatchery stocks of Penaeus japonicus (Crustacea, Decapoda).
Aquaculture 57: 239-251, 1986.
SCHOLOTTERER, C. Evolutionary Dynamics of Microsatellite DNA. Journal
Chromosoma, 6, 365-371, 2000.
TAMAYO, R. J. M. Assessment of genetic variability in two lots of white shrimp,
Litopenaeus vannamei (Bone, 1931) introduced to Cuba. Master thesis - International
Fisheries Management Department of Aquatic Biosciences, Norwegian College of
Fishery Science - University of Tromsø, Norway, May 2006.
VALLES-JIMENEZ, R., CRUZ, P., PEREZ-ENRIQUEZ, R. Population genetic
structure of Pacific write shrimp (Litopenaeus vannamei) from México to Panamá:
Microsatellite DNA variation. Marine Biotechnology 6:475-484, 2005.
WOLFUS, G. M., GARCIA,O. K., ALCIVAR-WARREN, A. Application of the
microsatellite technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs.
Aquaculture 152: 35-47, 1997.
XU, Z., PRIMAVERA, J. H., DE LA PENA, L. D., PETTIT, P., BELAK, J., ALCÍVAR-
WARREN, A. Genetic diversity of wild and cultured black tiger shrimp (Penaeus
monodon) in the Philippines using microsatellites. Aquaculture 199: 13-40, 2001.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 60
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALLEGRUCCI, I. G., CESARONI, D., VENANZETTI, F., CATAUDELA, S.,
SBORDONI, V. Length variation in mtDNA control region in hatchery stocks of
European sea bass subjected to acclimation experiments. Genetics Selection
Evolution 30:275-288, 1998.
ALLENDORF, F. W., RYMAN, N. Genetic management of hatchery stocks. In:
Population Genetics and Fishery Management, Ryman, N., Utter, F. (Eds). Seattle:
University of Washington Press, pp 141-159, 1987.
ARGUE, B. J.; ARCE, M. A.; LOTZ, J. M.; MOSS, S. M. Selective breeding of Pacific
white shrimp (Litopenaeus vannamei) for growth and resistance to Taura Syndrome
Virus. Aquaculture 204, pp. 447–460, 2002.
BAKOS, J. Crossbreeding Hungarian races of common carp to develop more
productive hybrids. In: Pillay, T.V.R., Dill, W. (Eds.), Advances in Aquaculture.
Fishing News Books, Farnham, Surrey, UK, pp. 633–635, 1979.
BALL, A. O., LEONARD, S., CHAPMAN, R. W. Characterization of (GT)
n
microsatellites from native white shrimp (Penaeus setiferus). Molecular Ecology
7:1247-1263, 1998.
BEARDMORE, J. A., MAIR, G. C., LEWIS, R. I. Biodiversity in aquatic systems in
relation to aquaculture. Aquaculture Research 28:829-839, 1997.
BEAUMONT, A. R.; HOARE, K. Biotechnology and Genetics in Fisheries and
Aquaculture. ed. Blackwel Science158 p, 2003.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 61
BEAUMONT, A. R., HOARE, k. Biotechnology and genetics in fisheries and
aquaculture. Langue : ANGLAIS 304p, Date de parution: 12-2002.
BECKMANN, J. S., SOLLER, M. Toward a unified approach to genetic mapping of
eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites. Bio/Technology 8:, 1990.
BENZIE, J. A. H. Population genetic structure in penaeid prawns. Aquaculture
Research 31:95-119, 2000.
BIERNE, N.; BEUZART, I.; VONAU, V.; BONHOMME, F.; BEDIER, E. Microsatelite
associated heterosis in hatchery-propagated stocks of the shrimp Penaeus stylirotris.
Aquaculture 184, pp.202-219, 2000.
BORLASE, S. C., LOEBEL, D. A., FRANKHAM, R., NURTHEN, R. K., BRISCOE, D.
A., DAGGARD, G. E. Modeling problems in conservation genetics using captive
Drosophila populations: Consequences of equalization of family sizes. Conservation
Biology 7:122-131, 1993.
BOTSTEIN, D., WHITE, R. P., SKOLNICK, M., DAVIS, R. W. Construction of a
genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J
Anim Genet 32:314–331, 1980.
BROWN, A. H. D.; CLEGG, M. T.; KAHLER, A. L.; WEIR, B. S. Plant Population
Genetics, Breedind, and Genetic Resources. 1 ed. Massachusetts: Sinauer
Associates Inc, 449 p, 1990.
CARVALHO, G. R., PITCHER, T. J. Molecular genetics in fisheries. London; New
York: Chapman & Hall, 1995.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 62
CHIOU, T. T., WU, J. L., CHEN, T. T., LU, J. K. Molecular cloning and
characterization of cDNA of penaeidin-like antimicrobial peptide from tiger shrimp
(Penaeus monodon). Mar. Biotechnol.7 (2), 119–127, 2005.
CRAWFORD, A. M., MONTGOMERY, G. W., PIERSON, C. A., BROWN, T.,
DODDS, K. G., SUNDEN, S. L. F., HENRY, H. M., EDE, A. J., SWARBRICK, P. A.,
BERRYMAN, T., PENTY, J. M., HILL, D. F. Sheep linkage mapping: nineteen linkage
groups derived from the analysis of paternal half-sib families. Genetics, 137: 573-
579, 1994.
CROW, J. F. & KIMURA, M. An introduction to population genetics theory Harper &
Row, New York, 1970.
CRUZ, P., MEJIA-RUIZ C. H., PEREZ-ENRIQUEZ, R., IBARRA, A. M.,
ANDGAFFNEY, P. M. Genetic variability assessed by microsatellite in a breeding
program of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). Marine Biotechnology
6:157-164, 2004.
CRUZ, P., MEJIA-RUIZ, C. H., PEREZ-ENRIQUEZ, R., IBARRA, A. M. Isolation and
characterization of microsatellites in Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus)
vannamei. Molecular Ecology Notes 2(3): 239-241, 2002.
CURRAN, J. L. Human linkage mapping. Livro: Genome mapping: A practical
approachy. Editado por: Raul H. Dear. Capitulo 1, p 1-25, 1997.
EKNATH, A. E., TAYAMEN, M. M., PALADA DE VERA, M. S., DANTING, J. C.,
REYES, R. A., DIONISSIO, E. E., CAPILI, J. B., BOLIVAR, H. L., ABELLA, T. A.,
CIRCA, A. V., BENSTEN, H. B., GJERDE, B., GJEDREM, T. AND PULLIN, R. S. V.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 63
Genetic improvement of farmed Tilapias: the performance of eight strains of
Oreochromis niloticus tested in different farm environments. Aquaculture 111, pp.
171–188, 1993.
ESPINOSA, G., DIAZ, R., MATOS, J., BECQUER, U., ROMO, J., BORRELL, Y.
Variación aloenzimática em poblaciones cubanas del camarón blanco L. schmitti.
Revista de Investigaciones Marinas 24:11-19, 2003.
FALCONER, D. S.; MACKAL, T. F. C. Introduction to Quantitative Genetics. 4 ed.
England: Longman, 464p, 1996.
FAO. Aquacult-PC: Fishery information, data and statistics (FIDI), time series of
production from aquaculture (quantities and values) and capture fishers (quantities).
FAO: Programa Computacional, 2005.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de Marcadores
Moleculares em Análise Genética. EMBRAPA- CENARGEN, Brasília 220p.,1998.
FREITAS, P. D., GALETTI, P. M. JR. A genética de camarão no Brasil. Revista da
ABCC 1:30-32, 1999.
FREITAS, P. D., GALETTI, P. M. JR. PCR-based VNTR core sequence analysis
inferring genetic diversity in shrimp Litopenaeus vannamei. Genetics and Molecular
Biology 25:431-434, 2002.
FRIARS, G. W. Breeding Atlantic Salmon: A primer. Atlantic Salmon Federation, St
Andrews, NB, Canada, 13 pp. 1993.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 64
FRIES, R. Mapping the bovine genome: methodological aspects and strategy. Anim.
Genet., 24:111-116. 1993.
GARCIA, D. K., DHAR, A. K., ALCIVAR-WARREN, A. A. Molecular analysis of a
RAPD marker (B20) reveals two microsatellites and differential mRNA expression in
Penaeus vannamei. Molecular Marine Biology and Biotechnology 5: 71-83, 1996.
GARCIA, D. K., FAGGART, M. A., RHOADES, L., ALCIVAR-WARREN, A., WYBAN,
J. A., CARR, W. H., SWEENEY, J. N. Genetic diversity of cultured Penaeus
vannamei shrimp using three molecular genetic techniques. Mol Mar Biol Biotechnol
3: 270-280, 1994.
GJEDREM, T., FIMLAND, E., 1995. Potential benefits from high health and
genetically improved shrimp stocks. In: Browdy, C.L., Hopkins, J.S. (Eds.),
Proceedings of the Special Session on Shrimp Farming Swimming Through Troubled
Water, Aquaculture, February 1–4, San Diego, CA, USA, 253 pp. 1995.
GJEDREM, T. Breeding plans for rainbow trout. Aquaculture 100, pp. 73–92, 1992.
GOYARD, E.; PENET, L.; CHIM, L.; CUZON, G.; BUREAU, D.; BEDIER, E.
Selective breeding of the Tahitian domesticated population of Pacific blue shrimp
(Litopenaeus stylirostris): perspectives for the New Caledonian shrimp industry.
World Aquaculture 33, pp. 28–30, 2002.
HETZEL, D. J. S; CROCOS, P. J.; DAVIS, G. P.; MOORE, S. S.; PRESTON, N. C.
Response to selection and heritability for growth in the Kuruma prawn, Penaeus
japonicus.. Aquaculture 181: 215-223, 2000.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 65
HUDINAGA, M. Reprodution, Development and Rearing of Penaeus japonicus Bate.
Jap. J. 10: 305-303, 1942.
JARASRASSAMEE, B., SUPUNGUL, P., PANYIM, S., KLINBUNGA, S.,
RIMPHANICHAYAKIT, V., TASSANAKAJON, A. Recombinant expression and
characterization of five-domain Kazal-type serine proteinase inhibitor of black tiger
shrimp (Penaeusmonodon).Mar. Biotechnol. 7 (1), 46–52, 2005.
JONES, A. G., AVISE, J. C. Microsatellite analysis of maternity and the mating
system in the Gulf pipefish Syngnathus scovelli, a species with male pregnancy and
sex-role reversal. Molecular Ecology. 6:203-213, 1997.
KINGHORN, B. P. A Review of quantitative genetics in fish breeding. Aquaculture 31,
283-304, 1983.
LIGHTNER, D.V.; PANTOJA, C. R. Infectious Myonecrosis (IMN): current status
report on the biology of the etiological agent and development of diagnostic methods.
In: FEIRA NACIONAL DO CAMARÃO, Rio Grande do Norte. Anais. p.22, 2004.
LITT, M.; LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification
of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle action gene. American Journal of
Human Genetics, V.44, p. 398-401, 1989.
LIU, F., LIU, Y., LI, F., DONG, B., XIANG, J. Molecular cloning and expression profile
of putative antilipopolysaccharide factor in Chinese shrimp (Fenneropenaeus
chinensis). Mar. Biotechnol. 7 (6), 600–608, 2005.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 66
LIU, B. H. Statistical genomics linkage, mapping and QTL analysis. Boca Raton CRC
Press. Boca Raton. 156p, 1998.
LUAN, S., KONG, J., WANG, Q. Y. Genetic variation of wild and cultured populations
of the Kuruma prawn Marsupenaeus japonicus (Bate 1888) using microsatellites.
Aquaculture Research, 37, 785-792, 2006.
MADRID, R. M. Análise das exportações da carcinicultura brasileira de 1999 a 2003:
cinco anos de sucesso e 2004, o início de uma nova fase. Revista da ABCC, 1: p.76-
84, 2005.
MAGGIONI, R., ROGES, A. D., MACLEAN, N. Population structure of Litopenaeus
schmitti (Decapoda Penaeidae) from the Brazilian coast identified using six
polymorphic microsatellite loci. Molecular Ecology Notes 12: 3213-3217, 2003.
MARKLUND, S., ELLEGREN, H., ERIKSSON, S., SANDBERG, K., ANDERSSON, L.
Parentage testing and linking analysis in the horse using a set of highly polymorphic
microsatellites. Anim. Genet., 25: 19-23, 1994.
MEEHAN, D., XU, Z., ZUNIGA, G., ALCIVAR-WARREN, A. High frequency and
large number of polymorphic microsatellites in cultured shrimp, Litopenaeus
vannamei (Crustacea: deacapoda). Mar. Biotechnol. V. 5, p. 311-330, 2003.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO (MAPA).
Plataforma tecnológica do camarão marinho cultivado: seguimento de mercado.
Departamento de Pesca e Aqüicultura. – Brasília : MAPA/SARC/DPA, CNPq. ABCC,
2001.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 67
NACIRI, Y., VIGOUROUX, Y., DALLAS, J., DESMARAIS, E., DELSERT, C.,
BONHOMME, F. Identification and inheritance of (GA/TC), and (AC/GT), repeats in
the european flat oyster Ostrea edulis CL.). Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 4: 83-89,
1995.
NEI, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small
number of individuals. Genetics 89:583-590, 1978.
PAREDES, L. E. Carcinicultura Marinha - o Vírus da mancha Branca no Brasil.
Revista da ABCC 7: p. 30, 2005.
PINHEIRO, A. C. A. S., LIMA, A. P. S., SOUZA, M. E., NETO, E. C. L., ADRIÃO, M.,
GONÇALVES, V. S. P., COIMBRA, M. R.M. Epidemiological status of Taura
syndrome and Infectious myonecrosis viruses in Penaeus vannamei reared in
Pernambuco (Brazil). Aquaculture 262, 17-22, 2007.
PODSIADLOWSKI, L., BARTOLOMAEUS, T. Organization of the mitochondrial
genome of Mantis shrimp Pseudosquilla ciliate (Crustacea: Stomatopoda). Mar.
Biotechnol. 7 (6), 618–624, 2005.
POWELL, W.; MACHRAY, G. C.; PROVAN, J. Polymorphism revealed by simple
sequence repeats. Trendes of Plant Science, V.1, p. 215-222, 1996.
PULLIN, R. S. V., WILLIAMS, M. J. AND PRESTON, N. Domestication of
crustaceans. Asian Fish. Sci. 11, pp. 71–80, 1998.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 68
RAYMOND, M.; ROUSSET, F. GENEPOP (version 1.2): population genetics
software for exact tests and ecumenicism. Journal Heredity, 86, V. 3, p. 248-249,
1995.
RICE, W. R. Analyzing Tabbles of Statistical Tests. Evolution 43: 223-225, 1989
ROCHA, I. P. Uma análise da produção de demanda e preços do camarão no
mercado internacional. Revista da ABCC, 7: p 24-35 , 2005
ROCHA, I. P.; RODRIGUES, J., AMORIM, L. A carcinicultura brasileira em 2003.
Revista da ABCC 1: p 30-36, 2004.
ROCHA, I. P. Evolução e estado atual da carcinicultura brasileira. Plataforma
Tecnológica do Camarão Marinho Cultivado. Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento. Departamento de Pesca e Aqüicultura. 276p. Cap.IV.p.177–196,
2001.
ROCHA, I.P. Carcinicultura brasileira: Situação atual e sugestões para a sua
sustentabilidade. Revista da ABCC 2: p 26-28, 1999.
RODRIGUES, J. Carcinicultura Marinha - Desempenho em 2004. Revista da ABCC
2: p 38, 2005.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E. F. E., MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989.
SBORDONI, V., DE METTHAEIS, M., COBOLLI SBORDONI, M., LA ROSA, G.,
MATTOCCIA, M. Bottleneck effects and the depression of genetic variability in
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 69
hatchery stocks of Penaeus japonicus (Crustacea, Decapoda). Aquaculture 57: 239-
251, 1986.
SCHOLOTTERER, C. Evolutionary Dynamics of Microsatellite DNA. Journal
Chromosoma, 6, 365-371, 2000.
SCHNEIDER, S., ROESSLI, D., EXCOFFIER, L. Arlequin ver 2.000: A Software for
Population genetics data Analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of
Geneva, Switzerland, 2000.
SEKINO, M., HARA, M., TANIGUCHI, N. Loss of microsatellite and mitochondrial
DNA variation in hatchery strains of Japanese flounder Paralichthys olivaceus.
Aquaculture 213:101-122, 2002.
SILVERSTEIN, J. T., REXROAD, C. E., KING, T. L. Genetic variation measured by
microsatellites among three strains of domesticated rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss, Walbaum). Aquaculture Research 35, 40-48, 2004.
SLATKIN, M. A measure of population subdivision based on microsatellite allele
frequencies. Genetics 139: 457 – 462, 1995.
SLETTAN, A., OLSAKER, I., LIE, O. Isolation and characterization of variable (GT)
n
repetitive sequences from atlantic salmon (Salmo solar L.). Animal Genetic 24:195-
197, 1993.
SOLÈ-CAVA, A. M. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: Matioli,
S. R. (Ed.) Biologia Molecular e Evolução p. 172 - 192; Ed. Holos, 2001.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 70
SOTO-HERNÁNDEZ, J., GRIJALVA-CHON, J. M. Genetic differentiation in hatchery
strains and wild white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone, 1931) from
northwest Mexico. Aquaculture International 12: 593–601, 2004.
SU, A. F. G., LARS-ERIK, A. L., GRAHAM A. E., GALL, B. Genetic and
environmental variation of body weight in rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss).
Aquaculture 144: 71-80,1996.
SUNDEN, S. L. F., DAVIS, S. K. Evaluation of genetic variation in a domestic
population of Penaeus vannamei (Boone): A comparison with three natural
populations. Aquaculture 97:110-115, 1991.
TABERLET, P. Biodiversity at the intraspecific level: The comparative
phylogeographic approach. Journal of Biotechnology 64:91-100, 1998.
TAMAYO, R. J. M. Assessment of genetic variability in two lots of white shrimp,
Litopenaeus vannamei (Bone, 1931) introduced to Cuba. Master thesis - International
Fisheries Management Department of Aquatic Biosciences, Norwegian College of
Fishery Science - University of Tromsø, Norway, May 2006.
VALLES-JIMENEZ, R., CRUZ, P., PEREZ-ENRIQUEZ, R. Population genetic
structure of Pacific write shrimp (Litopenaeus vannamei) from México to Panamá:
Microsatellite DNA variation. Marine Biotechnology 6:475-484, 2005.
WEBER, J. L. Informativeness of human (dC-dA), (dG-dT), polymorphisms.
Genomics, 7: 524-530, 1990.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 71
WEBER, J. L.; MAY, P. E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can
be typed using the polymerase chain-reaction. American Journal of Human Genetics,
V. 44, n. 3, p. 388-396, 1989.
WOHLFARTH, G. W., LAHMAN, M., MOAV, R. Badmidgeh 32, pp. 3–5, 1980.
200765, 1980.WTf0 Tc 0 TOLFUSFARTHMAN,GARCIA,O 1980.1 Tf-0.00004 72665, 112 8c 5.05 0KAN,ALCIVAR-WARREN(LIM980. Tf-0.0001 5030.018( Appl Amaginarnasing980. .0003 T70.002-112 8c 9.15 -2.3microsatellitTdechnique fo980.1 Tf-0.0001 T74865, 11.7021.175 0 r a Joy)-5(zed ugman Ge diversity in)-8( ) Tf0.0003 T7 0.00113.641.175 0 shrimp breeded uprogramsER, J.)-8( )]TJ0 Tc0.002- 1234c 9.15 -2.3AquaculEste 112: 35-47–97 1980.
L. DAN,PETTIT; MA, BELAKWEBEN,ALCÍVAR-980. T2370.0013 Tw4 219.15 -2.3 TARREN(LIMHuman Ge diversity)-5(arnawild )-8( ) Tf0.0003 2360.00118.431.175 (and culEsted black tiger shrimp ((71 )Tj/TT1 -0 Tc 0.0f0 Tc 05.4221.175 0 PLitopena6(n)-4( )]TJ-7.001533.85c 9.15 -2.3monodonTm(,)Tj/TT0 )]TJ-0.0001 T0 0.0424.1621.175 0 ) inasingPhilippinestyped nmicrosat ellitTs[(quaculEste 199:113-40, )-1 1980.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 72
ANEXOS
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NO Journal of the World Aquaculture Society
Guide for Authors
Papers submitted to the Journal of the World Aquaculture Society are considered for
publication on the basis of scientific competence and the significance of the
information to aquaculture. Authors should realize, however, that even an important
study that is conducted using appropriate methodology may not be accepted for
publication if the paper is poorly organized or difficult to understand. Beyond that,
papers that are well written will be reviewed quicker and published in less time
because there will be fewer revisions. Although most authors are concerned primarily
with the acceptability of their paper for publication, there are two other important
reasons to be concerned about the quality of your paper. First, the goal of publishing
a journal article is to convey information from the writer to the reader. If your paper is
difficult to read, other scientists may decide not to waste time trying to read it or,
worse, they may read the paper but misinterpret the information. In short, a poorly
written paper will not serve the only purpose for which it is written. There is also an
important fiscal benefit to the Society when authors submit carefully prepared
manuscripts. Publishing a scientific journal is expensive, and a significant part of that
expense consists of charges for copyediting and making corrections at the proof
stage. These costs can be dramatically reduced if authors are careful when they
prepare papers for publication. Below are some comments and suggestions that will
help you avoid some of the problems we routinely find in papers submitted to the
Journal.
Read some good books on writing and graphics.
Writing is difficult, yet most scientists spend little time trying to improve their writing
skills. Aside from practice, practice, practice, the best way to improve your writing is
to read good writing, and lots of it. The next best way is to read books about good
writing. In addition to the many excellent books on English grammar and writing,
there are at least two books that should be read by all scientists. First is "How to
Write and Publish a Scientific Paper" by Robert A. Day (1998, Oryx Press, Phoenix,
Arizona, USA). This relatively inexpensive book is an excellent (and humorous)
introduction to scientific writing. The second is the classic book on scientific graphics,
"The Visual Display of Quantitative Information," by Edward R. Tufte (1997, Graphics
Press, Cheshire, Connecticut, USA). Tufte's book is not a "how-to"guide for preparing
effective illustrations; it is rather a straightforward and engrossing discussion of the
theory and practice of statistical graphics.
Make sure that your paper conforms to the format outlined in our "Checklist for
Manuscript Preparation."
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 73
Books about writing help develop your general writing style. However, each scientific
journal has specific requirements (which vary from journal to journal) for the format
and organization of manuscripts submitted for peer review. The formatting guidelines
for manuscripts submitted to our Journal are listed in a "Checklist" printed on the last
two pages of every March issue of the Journal. A copy of the "Checklist" is also
posted at this website. You must submit a completed copy of the "Checklist" with
your original submission. We occasionally change our guidelines so be sure to look
at the "Checklist" printed in the most current March issue of the Journal.
Proofread your manuscript carefully to make sure that all typographical errors
are corrected, that the text says exactly what you want it to say, and that all
data entries in tables and figures are correct.
We do not allow changes at the proof stage unless they are needed to correct errors
made during typesetting or composition. So make sure that the final version of the
manuscript that you send the editor is perfect in every respect.
Make sure that the title page of your paper is in the correct format.
The manuscript title page should be the easiest part of a scientific paper to prepare,
yet improper title page format is one of the most common problems in papers
submitted to the Journal. Our copyeditor spends a considerable amount of time
rewriting title pages so that they will be typeset correctly. An example of the proper
title page layout is presented at the end of these guidelines. Note that the
corresponding author is assumed to be the first-listed author unless there is a
footnote to the contrary. To reduce ambiguity in indexing services, be sure to identify
authors by at least one name (not just initials) in addition to the surname (family
name). Example: use "Craig S. Tucker" instead of "C. S. Tucker." And do not
abbreviate institutional affiliations in author's addresses. Examples: use "Universidad
Nacional Autónoma de México" instead of "UNAM"; use "International Center for
Living Aquatic Resources Management" instead of "ICLARM."
Make sure that all abbreviations for units of measure conform to those
indicated on the inside back cover of the Journal.
A list of abbreviations that can be used without explanation is printed on the inside
back cover of each Journal issue, beginning with March, 1999 (Volume 30, No. 1).
Accepted abbreviations are also listed in our Editorial Policy at this website.
References to specific equipment or proprietary products must include the
name and address (city, state or territory, and country) of the manufacturer or
producer of the product.
Here is an example: "Dissolved oxygen was measure with a YSI Model 51
polarographic oxygen meter (Yellow Springs Instrument Company, Yellow Springs,
Ohio, USA)."
Software used to conduct statistical analyses are tools and should be
referenced like equipment, rather than as supporting evidence.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 74
A correct citation for a statistical analysis might be "Data were analyzed by paired-
comparison t-test (Steel and Torrie 1960) using SAS Version 6.1 software (SAS
Institute, Inc., Cary, North Carolina, USA)." In this example, the text by Steel and
Torrie is referenced as supporting the choice of that particular statistical analysis and
SAS is referenced only as the supplier of the tool used to conduct the analysis. The
in-text reference to SAS is not, therefore, listed in the Literature Cited.
Cross-check literature citations in the text with the references listed in the
Literature Cited section, and vice versa.
Incorrect reference citations are the most common problems we find in scientific
manuscripts. References are often cited in the text or in tables but not listed in the
literature cited, or references are listed in the Literature Cited but never cited in the
text. In a recent paper submitted to the Journal, seven citations in the text were not
listed in the Literature Cited and 31 references listed in the Literature Cited were not
cited anywhere in the text. Cross-checking the references is easy: read the paper
carefully and every time you come to a reference in the text, put a check by it in the
text and next to the corresponding citation in the Literature Cited. If you find that a
citation is mentioned in the text but is missing in the Literature Cited, make a note to
add it. When you finish, make sure every citation in the Literature Cited has a check
mark by it. If a citation is not checked, delete it.
Make sure all references are in the proper format.
Examples of the proper format for references are presented at the end of these
guidelines. One key to citing references correctly is to remember that sufficient
information must be given in the citation to allow a person to retrieve the publication.
Note that we do not abbreviate anything in the citation except Co. (for Company), Inc.
(for Incorporated), Ltd. (for Limited), USA, UK, and D.C.
Make sure references are in the correct order in the Literature Cited.
The following rules apply:
References are listed alphabetically by first author's surname.
If two or more authors share the same surname, then the ordering is determined by a
letter-by-letter comparison of the first author's initials (Example: Jones, A. K.
precedes Jones, B. S.)
! If two or more works by the same author are listed, ordering is by date (Example,
Jones, A. K. 1996 precedes Jones, A. K. 1998) ! If two or more works by the same
first author are listed, ordering is as follows:
• all works published as single author (ordered by date), then
• all works published with two authors (alphabetized within this grouping), then
• all works published with three or more authors (alphabetized within this
grouping).
Here is an example sequence determined by these rules:
Allman, D. 1972
Allman, G. 1970
Clapton, E. 1970
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 75
Clapton, E. 1975
Clapton, E. 1975 and J. Hendrix 1968
Clapton, E. and J. Hendrix 1972
Clapton, E. and A. King 1970
Clapton, E., J. Hendrix, J. Page, and E. Vedder 1973
Clapton, E., C. Santana, and K. Richards 1987
Clapton, E., P. Townshend, and G. Harrison 1971
Knopfler M. 1980
Vedder, E. 1992
Carefully proofread your tables for correct data entry and correct format.
Typographical errors, misplaced decimal points, and other simple mistakes are
common in tables, so carefully check each entry in all tables to make sure they are
correct. We prefer that you do not use superscript letters or numbers to indicate the
results of a mean separation test (such as Duncan's Multiple Range Test, Tukey's
HSD, or others). The preferred format is regular lower-case letters following the
mean.
Here is an example line of data in a table:
Fish Weight (g)
465.5a
484.6 ab 514.2 bc
600.3 c
Also be sure to indicate in the table heading (caption) whether comparisons are
made within columns (up-and-down) or rows (reading across). For example, a typical
sentence in the table heading explaining the mean separation test might read:
"Means in each row followed by different letters were found to differ at the 0.05
probability level by Tukey's HSD test (Steel and Torrie 1960)"
Figures should be printed one per page, without page numbers or captions.
Captions should be on a separate page titled "Figure Legend." Each figure should be
alone on a page. In pencil, lightly write the figure number in the lower right-hand
corner of the figure. Do not insert figures into the text; do not put a page number on
the figure; do not put a caption on the figure; and do not staple the figure to the
manuscript. All figure captions should be listed sequentially on one page titled
"Figure Legend."
Make sure that all illustrations are essential.
Computer graphics programs have made it easy to prepare visually appealing graphs
and other line drawings. This convenience has a negative consequence, however,
because many authors now use graphics when information can be more effectively
presented in another way. For example, authors often use graphs to present data
that are better suited for presentation in tables. Use graphs when the information is
visual; that is, when the data show trends or when illustrations make large data sets
coherent and interesting. If the goal is simply to present numbers, especially if the
goal is to present exact numbers, then the data are best presented in tables. And
never present the same data in tables and graphs: choose one or the other based on
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 76
the most effective means of conveying the information to the reader. Another
common misuse of graphics is when graphs, especially bar graphs, are used to
present only a few data points. Such information can often be presented in one
sentence in the text, with considerable savings in expensive journal space.
Make sure that illustrations will withstand the photographic reduction required
when the article is composed for printing in the Journal.
Graphs that look great when printed on full-sized paper may be incomprehensible
when reduced to the size needed to fit them on a journal page. Simple graphs and
figures are usually reduced to one-column width, which is approximately 7 cm (2.75
inches) wide. Complex figures, such as those containing several graphs within a
single illustration, are usually printed across two columns, which is still only 14 cm
(5.5 inches) wide. Thus, it is important to prepare illustrations so they look good when
reduced to those smaller sizes. Use a type size large enough to be legible when
reduced, do not present too much information in a single figure, and do not use hair-
thin lines, small symbols, finely textured fill patterns, or other graphics that may
disappear or become faint or indefinite when the illustration is photoreduced.
Examples of handsome illustrations (as well as a good many abominations) abound
in scientific journals: study them and try to emulate the style of those illustrations that
are particularly effective.
Include an electronic copy of your manuscript when you send the Managing
Editor the final draft of your paper.
Computer disks should be submitted only with final versions of papers that have been
accepted for publication. The preferred medium is a 3½ diskette formatted for IBM-
compatible (PC) to 1.44 MB capacity. Save files in Rich Text Format, an option
available from most word-processing applications. The electronic version must match
the hard copy exactly or publication may be delayed. The file should contain the title
page, the abstract, the complete body of the text, the acknowledgements, references,
and figure captions. Electronic versions of tables should not be included because
tables are typeset from the hard copy. Clearly identify the disk with the senior
author's name, short title, and the word-processing software and version number
used to prepare the file.
FORMAT FOR THE TITLE PAGE OF A MULTI-AUTHORED PAPER
Effect of Salinity on the Growth Rate of
Penaeus setiferus in Ponds
Cristina Pascual and Evangelina Valera
Laboratorio de Ecofisiologia, Departmento de Biologia, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional Autónoma
México, Apartado Postal 69, Ciudad del Carmen, Campeche, México
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 77
Laida Ramos
Centro de Investigaciones Marinas, Avenida 1a, Numero 2808, Miramar, La Habana,
Cuba
Luis A. Soto
Laboratorio de Ecología del Bentos, Instituto de Ciencias del Mary Limnología,
Universidad Nacional Autonoma
México, México 04510, D.F. México
Jesse L. Tucker
Center for Reproduction and Culture of Penaeid Shrimp,
Humboldt State University, Arcata, California 95521 USA
Carlos Rosas
1
Laboratorio de Ecofisiologia, Departmento de Biologia, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional Autónoma
México, Apartado Postal 69, Ciudad del Carmen, Campeche, México
______________________
1
Corresponding author (Note that no footnote is required if the first author is the
corresponding author)
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 78
Citations to abstracts, conference proceedings, government reports and other "grey"
literature are discouraged in all scientific writing. Information from those sources is
usually not subject to peer review and, more important, copies of the reference are
difficult for readers to obtain. If, however, citations from these secondary sources are
absolutely essential, make sure that sufficient information is presented in the citation
to allow readers to access the publication. Follow these examples:
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 79
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NO periódico Aquaculture Research
Submission. One original and three copies of each typescript should be submitted to
either of the editors:
Dr S J de Groot, PO Box 97, 2080 AB Santpoort-zuid, the Netherlands.
Dr Ronald W Hardy, Director, UI Hagerman Fish Culture Experiment Station, 3059 F
National Fish Hatchery Road, Hagerman, ID 83332, USA.
Authors from the Americas, Japan, China, S E Asia and Australia may submit to Dr
Hardy. Authors from all other countries may submit to Dr de Groot.
A disk should accompany the final version of the manuscript. Authors are requested
to use an IBM-compatible system (see below for more details). All manuscripts must
be accompanied by a valid email address.
Papers are accepted on the understanding that they have not been and will not be
published elsewhere. Copyright of accepted manuscripts and all published material
becomes the property of the Journal.
Online production tracking is available for your article through BlackwellÍs Author
Services.
Author Services enables authors to track their article - once it has been accepted -
through the production process to publication online and in print. Authors can check
the status of their articles online and choose to receive automated e-mails at key
stages of production so they donÍt need to contact the production editor to check on
progress. Visit www.blackwellpublishing.com/bauthor for more details on online
production tracking and for a wealth of resources including FAQs and tips on article
preparation, submission and more.
Preparation of the manuscript. All sections of the typescript should be on one side
of A4 paper, double-spaced and with 30mm margins. Line numbering and a font size
of 12pt should be used. Articles are accepted for publication only at the discretion of
the Editor(s). Authors will receive prompt receipt of their paper and a decision will be
reached within 3 months of receipt. A manuscript should consist of the following
sections:
Title page. This should include:
the full title of the paper
the full names of all the authors
the name(s) and address(es) of the institution(s) at which the work was carried out
(the present address of the authors, if different from the above, should appear in a
footnote)
the name, address, telephone and fax numbers, and e-mail address of the author to
whom all correspondence and proofs should be sent
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 80
a suggested running title of not more than 50 characters, including spaces
four to six keywords for indexing purposes
Main text. Generally, all papers should be divided into the following sections and
appear in the order: (1) Abstract or Summary, not exceeding 150-200 words, (2)
Introduction, (3) Materials and Methods, (4) Results, (5) Discussion, (6)
Acknowledgments, (7) References, (8) Figure legends, (9) Tables, (10) Figures.
The Results and Discussion sections may be combined and may contain
subheadings. The Materials and Methods section should be sufficiently detailed to
enable the experiments to be reproduced. Trade names should be capitalized and
the manufacturer's name and address given.
All pages must be numbered consecutively from the title page, and include the
acknowledgments, references and figure legends, which should be submitted on
separate sheets following the main text. The preferred position of tables and figures
in the text should be indicated in the left-hand margin.
Units and spellings. Systeme International (SI) units should be used. The salinity of
sea water should be given as gL-1. Use the form gmL-1 not g/ml. Avoid the use of g
per 100 g, for example in food composition, use g kg-1. If other units are used, these
should be defined on first appearance in terms of SI units, e.g. mmHg. Spelling
should conform to that used in the Concise Oxford Dictionary published by Oxford
University Press. Abbreviations of chemical and other names should be defined when
first mentioned in the text unless they are commonly used and internationally known
and accepted.
Scientific names and statistics. Complete scientific names, including the authority
with correct taxonomic disposition, should be given when organisms are first
mentioned in the text and in tables, figures and key words together with authorities in
brackets, e.g. 'rainbow trout,
Oncoryhnchus mykiss (Walbaum)' but 'Atlantic salmon
Salmo salar L.' without brackets. For further information see American Fisheries
Society Special Publication No. 20, A List of Common and Scientific Names of Fishes
from the United States and Canada.
Carry out and describe all appropriate statistical analyses.
References (Harvard style). References should be cited in the text by author and
date, e.g. Lie & Hemre (1990). Joint authors should be referred to in full at the first
mention and thereafter by et al. if there are more than two, e.g. Hemre et al. (1990).
More than one paper from the same author(s) in the same year must be identified by
the letters a, b, c, etc. placed after the year of publication. Listings of references in
the text should be chronological. At the end of the paper, references should be listed
alphabetically according to the first named author. The full titles of papers, chapters
and books should be given, with the first and last page numbers.
Chapman D.W. (1971) Production. In: Methods of the Assessment of Fish Production
in Freshwater (ed. by W.S. Ricker), pp. 199-214. Blackwell Scientific Publications Ltd,
Oxford.
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 81
Utting, S.D. (1986) A preliminary study on growth of Crassostrea gigas larvae and
spat in relation to dietary protein. Aquaculture 56, 123-128.
Authors are responsible for the accuracy of their references. References should only
be cited as 'in press' if they have been accepted for publication. Manuscripts in
preparation, unpublished reports and reports not readily available should not be
cited. Personal communications should be cited as such in the text.
It is the authors' responsibility to obtain permission from colleagues to include their
work as a personal communication. A letter of permission should accompany the
manuscript.
Illustrations and tables. These should be referred to in the text as figures using
Arabic numbers, e.g. Fig.1, Fig.2 etc. in order of appearance. Three copies of each
figure should be submitted and each figure should be marked lightly on the back with
its appropriate number, together with the name(s) of the author(s) and the title of the
paper. Where there is doubt as to the orientation of an illustration, the top should be
marked with an arrow.
Photographs and photomicrographs should be unmounted glossy prints and should
not be retouched. Labelling, including scale bars if necessary, should be clearly
indicated on an overlay or photocopy. Magnifications should be included in the
legend.
It is the policy of Aquaculture Research for authors to pay the full cost for the
reproduction of their colour artwork. Therefore, please note that if there is colour
artwork in your manuscript when it is accepted for publication, Blackwell Publishing
require you to complete and return a colour work agreement form before your paper
can be published. This form can be downloaded as a pdf from the internet. The web
address for the form is:
http://www.blackwellpublishing.com/pdf/SN_Sub2000_X_CoW.pdf
If you are unable to access the internet, or are unable to download the form, please
contact the Production Editor
[email protected], and they will be
able to email or FAX a form to you.
Any article received by Blackwell Publishing with colour work will not be
published until the form has been returned.
Line drawings should be on separate sheets of white paper in black indelible ink (dot
matrix illustrations are not permitted); le
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 82
All tables and figures that are reproduced from a previously published source must
be accompanied by a letter of permission from the Publisher or copyright owner.
Please send us digital versions of your figures. These should be supplied as eps or tif
files only. See http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/illustration.asp for further
details.
Avoid using tints if possible; if they are essential to the understanding of the figure, try
to make them coarse.
In the full-text online edition of the Journal, figure legends may be truncated in
abbreviated links to the full-screen version. Therefore, the first 100 characters of any
legend should inform the reader of key aspects of the figure.
Acknowledgments. These should be brief and must include references to sources
of financial and logistical support.
Short Communications. These should differ from full papers on the basis of scope
or completeness, rather than quality of research. They may report significant new
data arising from problems with narrow, well defined limits, or important findings that
warrant rapid publication before broader studies are complete. Their text should
neither exceed 1500 words (approximately six pages of typescript) nor be divided up
into conventional sections. When submitting Short Communications, authors should
make it clear that their work is to be treated as such.
Disks. The Journal encourages submission of accepted manuscripts on disk. These
should be IBM-compatible. An accurate hard copy must accompany each disk,
together with details of the type of computer used, the software employed and the
disk system if known. Do not justify. Particular attention should be taken to ensure
that any articles submitted in this form adhere exactly to the journal style in all
respects. Further details can be obtained from the Publisher; the Editor(s) will supply
'disk submission' forms on acceptance of a manuscript. Disks will not be returned to
the author.
Copyright. It is a condition of publication that authors grant Blackwell Publishing Ltd
the exclusive licence to publish all articles including abstracts. Papers will not be
passed to the publisher for production unless the exclusive licence to publish has
been granted. To assist authors an exclusive licence form will be supplied by the
editorial office. Alternatively authors may like to download a copy of the form
click
here.
Correspondence to the Journal is accepted on the understanding that the
contributing author licences the publisher to publish the letter as part of the journal or
separately from it, in the exercise of any subsidiary rights relating to the journal and
its contents.
Page proofs and reprints. The corresponding author will receive an email alert
containing a link to a web site. A working email address must therefore be provided
for the corresponding author. The proof can be downloaded as a PDF (portable
document format) file from this site. Acrobat Reader will be required in order to read
this file. This software can be downloaded (free of charge) from the following web
LIMA, A.P.S. 2007 Estrutura genética de populações de Litopenaeus vannamei... 83
site: http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html This will enable the file
to be opened, read on screen and printed out in order for any corrections to be
added. Further instructions will be sent with the proof. Hard coopy proofs will be
posted if no email address is available. Only typographical errors can be corrected at
this stage. Excessive changes made by the author in the proofs, excluding
typesetting errors, will be charged separately.
Offprints. A PDF offprint of the online published article will be provided free of
charge to the corresponding author, and may be distributed subject to the Publisher's
terms and conditions. Paper offprints of the printed published article may be
purchased if ordered via the method stipulated on the instructions that will
accompany the proofs. Printed offprints are posted to the correspondence address
given for the paper unless a different address is specified when ordered. Note that it
is not uncommon for printed offprints to take up to eight weeks to arrive after
publication of the journal. Additional paper offprints may be ordered online. Please
click on the following link, fill in the necessary details and ensure that you type
information in all of the required fields:
http://offprint.cosprinters.com/cos/bw/main.jsp?SITE_ID=bw&FID=USER_HOME_PG
If you have any queries about offprints please email [email protected]
Author material archive policy. Please note that unless specifically requested,
Blackwell Publishing will dispose of all hardcopy or electronic material
submitted two issues after publication. If you require the return of any material
submitted, please inform the editorial office or production editor as soon as possible if
you have not yet done so.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
