( PDF ) Avaliação da cinética de biodegradação dos compostos tóxicos: benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno (btex) e fenol

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO DOS COMPOSTOS

TÓXICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO, XILENO (BTEX) E FENOL

Autora: Daniela Estelita Goes Trigueros

Toledo – PR – Brasil

Fevereiro de 2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ

CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO DOS COMPOSTOS

TÓXICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO, XILENO (BTEX) E FENOL

Autora: Daniela Estelita Goes Trigueros

Orientador: Prof. Dr. Aparecido Nivaldo Módenes

Co-Orientador: Prof. Dr. Alexander Dimitrov Kroumov

Toledo – PR – Brasil

Fevereiro de 2008

Dissertação de Mestrado submetida à Universidade

Estadual do Oeste do Paraná, como

parte dos

requisitos necessários à obtenção do Grau de

Mestre em Engenharia Química, área

Desenvolvimento de Processos Químicos.

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Catalogação na Publicação elaborada pela Biblioteca Universitária

UNIOESTE/Campus de Toledo.

Bibliotecária: Marilene de Fátima Donadel - CRB – 9/924

Trigueros, Daniela Esteli ta Goes

T828a Avaliação da cinética de biodegradação dos composto

tóxicos : benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno (BTEX) e fenol

/ Daniela Estelita Góes Trigueros. -- Toledo, PR : [s. n.], 2008.

157 f.

Orientador: Dr. Aparecido Nivaldo Módenes

Co-orientador: Dr. Alexander Dimitrov Kroumov

Dissertação (Mestre em Engenharia Química) -

Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Campus de Toledo.

Centro de Engenharias e Ciências Exatas.

1. Biodegradação 2. Hidrocarbonetos 3.BTEX (Benzeno,

Tolueno, Etilbenzeno, Xileno) 4. Cinética 5. Fenol 6. Poluição

de água - Prevenção e controle 7. Compostos tóxicos - Cinética

de biodegradação 8. Modelagem I. Módenes, Aparecido

Nivaldo, Or. II. Kroumov, Alexander Dimitrov, Or. III.T

CDD 20. ed. 660.2815

660.2994

O valor das coisas não está no tempo que elas duram,

mas na intensidade com que acontecem. Por isso,

existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e

pessoas incomparáveis. (Fernando Pessoa)

Ao meu pai, José Miguel Trigueros, pelas sábias palavras

Dedico

Ao Prof. Dr. Aparecido Nivaldo Módenes pela orientação, pelo incentivo e apoio

durante esta jornada,

Ao Prof. Dr. Alexander Dimitrov Kroumov por indicar o caminho e pela confiança

depositada durante todo o desenvolvimento deste trabalho,

Ao Prof. Dr. Fernando Espinoza Quiñones pela solicitude e disposição em ajudar

sempre,

A Cleusa e a Juliana pelo carinho, amizade e atenção durante os momentos mais

difíceis,

A CAPES, pelo apoio financeiro,

E a todo o corpo docente do Programa de Pós Graduação em Engenharia Química...

Meus agradecimentos

iii

SUMÁRIO

Lista de Figuras......................................................................................................................v

Lista de Ilustrações................................................................................................................x

Lista de Tabelas.....................................................................................................................xi

Nomenclatura.......................................................................................................................xiii

Resumo..................................................................................................................................xv

Abstract...............................................................................................................................xvii

Capítulo 1 ............................................................................................................................. 1

1.1. Contextualização do Tema ...................................................................................... 1

1.2. Objetivos da Pesquisa ............................................................................................. 1

1.3. Organização da Dissertação ................................................................................... 2

Capítulo 2 ............................................................................................................................. 3

2.1. Recursos Hídricos.................................................................................................... 3

2.2. Gasolina e Compostos Tóxicos .............................................................................. 5

2.3. Compostos BTEX..................................................................................................... 8

2.4. Tecnologias de Remediação ................................................................................... 9

2.5. Processos Biotecnológicos e a Biodegradação .................................................. 14

Capítulo 3 ........................................................................................................................... 16

3.1. Modelagem e Avaliação da Biodegradação dos Compostos BTEX ................... 16

3.1.1. Microorganismos utilizados na biodegradação de compostos tóxicos .............................................. 36

3.1.1.1. Utilização de cultura pura ...... ......... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ........ 36

3.1.1.2. Utilização de mistura de cultu ras ............. .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ........ 38

3.1.2. Metabolismo aeróbico e anaeróbico dos compostos BTEX ............................................................... 40

3.1.3. Caminhos metabólicos ....................................................................................................................... 41

3.2. Mecanismos de Regulação Gênica....................................................................... 45

Capítulo 4 ........................................................................................................................... 48

4.1. Princípio da Análise de Sistema no Desenvolvimento de Processos

Biotecnológicos Sofisticados ............................................................................... 48

4.2. Modelos Cinéticos de Crescimento Microbiano .................................................. 50

4.2.1. Classificação dos modelos cinéticos .................................................................................................. 50

4.2.2. Taxa de crescimento específico .......................................................................................................... 50

4.2.3. Modelos para único substrato............................................................................................................ 51

4.2.3.1. Modelo d e Monod ...... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ... 51

4.2.3.2. Modelo d e Andrews .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ..... 53

4.2.4. Modelos para múltiplos substratos .................................................................................................... 53

4.2.4.1. Modelo d e Inibição Co mpetitiva ..... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ....... 54

4.2.4.2. Modelo d e Inibição Não-Co mpetitiva... ......... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 55

4.2.4.3. Modelo d e Inibição Acompetitiva ......... ......... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 55

4.2.4.4. Modelo SKIP .............. ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 55

4.3. Balanços de Massa ................................................................................................ 56

4.3.1. Operação descontínua........................................................................................................................ 56

4.3.2. Operação contínua ............................................................................................................................. 56

4.3.3. Operação contínua – com reciclo ...................................................................................................... 57

4.3.4. Processo aeróbico .............................................................................................................................. 57

4.4. Métodos de Identificação de Parâmetros ............................................................. 59

4.4.1. Enxame de Partículas ou Particle Swarm Optimization - PSO.......................................................... 61

4.5. Procedimento para Identificação dos Parâmetros............................................... 65

Capítulo 5 ........................................................................................................................... 67

5.1. Biodegradação dos Compostos BTEX ................................................................. 67

5.1.1. Modelos cinéticos para a biodegradação de único substrato ............................................................ 69

5.1.1.1. Modelo d e Monod ...... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ... 69

5.1.1.2. Modelo d e Andrews .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ..... 70

5.1.1.3. Avaliação dos modelos cinétic os na biodegrad ação individual d os substratos BT EX ...... ....... 70

5.1.2. Modelos cinéticos para a biodegradação de múltiplos substratos..................................................... 77

5.1.2.1. Modelo d e Inibição Co mpetitiva ..... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ....... 78

5.1.2.2. Modelo d e Inibição Não-Co mpetitiva... ......... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 78

5.1.2.3. Modelo d e Inibição Acompetitiva ......... ......... ......... .......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 79

5.1.2.4. Modelo SKIP .............. ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... ......... .. 79

5.1.2.5. Avaliação dos modelos cinétic os na biodegrad ação da mistura BTEX . ......... ......... ......... ........ 80

5.2. Biodegradação dos Compostos BTF.................................................................... 87

5.2.1. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação individual dos substratos BTF......................... 90

5.2.2. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno............................. 96

5.2.3. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-fenol............................... 104

5.2.4. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura tolueno-fenol................................ 110

5.2.5. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol ................. 116

Capítulo 6 ......................................................................................................................... 122

6.1. Conclusões........................................................................................................... 122

6.2. Sugestões............................................................................................................. 125

Referências ...................................................................................................................... 126

Anexos.............................................................................................................................. 147

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 – Porcentagem em massa dos compostos BTEX na gasolina. ............................. 5

Figura 2.2 – Fenômenos que ocorrem durante o derramamento de gasolina. ....................... 8

Figura 2.3 – Estrutura química dos compostos BTEX. ........................................................... 9

Figura 3.1 – Esquema da clivagem do catecol via orto. ....................................................... 42

Figura 3.2 – Esquema da clivagem do catecol via meta. ..................................................... 42

Figura 3.3 – Esquema do mecanismo de repressão catabólica. .......................................... 46

Figura 4.1 – Esquema do modelo completo matemático do biorreator................................. 48

Figura 4.2 – Trajetória de uma partícula do algoritmo PSO.................................................. 61

Figura 4.3 – Esquema do algoritmo PSO............................................................................. 63

Figura 5.1 – Simulações do modelo de Monod e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o benzeno. ...................................................................... 72

Figura 5.2 – Simulações do modelo de Andrews e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o benzeno. ...................................................................... 72

Figura 5.3 – Simulações do modelo de Monod e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o tolueno. ........................................................................ 72

Figura 5.4 – Simulações do modelo de Andrews e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o tolueno. ........................................................................ 72

Figura 5.5 – Simulações do modelo de Monod e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o etilbenzeno. ................................................................. 72

Figura 5.6 – Simulações do modelo de Andrews e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o etilbenzeno. ................................................................. 72

Figura 5.7 – Simulações do modelo de Monod e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o xileno. .......................................................................... 73

Figura 5.8 – Simulações do modelo de Andrews e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o xileno. .......................................................................... 73

Figura 5.9 – Evolução dos melhores valores globais da função objetivo aplicando o modelo

de Andrews na biodegradação do etilbenzeno. ............................................... 74

Figura 5.10 – Simulações da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de Monod

para os compostos BTEX. ............................................................................... 75

Figura 5.11 – Simulações da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de

Andrews para os compostos BTEX. ................................................................ 76

Figura 5.12 – Simulações do modelo SKIP e dados experimentais (DEEB & ALVAREZ-

COHEN, 1999) para o BTEX. .......................................................................... 82

Figura 5.13 – Simulações do modelo de Inibição Competitiva e dados experimentais (DEEB

& ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX....................................................... 83

Figura 5.14 – Simulações do modelo de Inibição Não-Competitiva e dados experimentais

(DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX. .......................................... 84

Figura 5.15 – Simulações do modelo de Inibição Acompetitiva e dados experimentais (DEEB

& ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX....................................................... 84

Figura 5.16 – Evolução dos melhores valores globais da função objetivo aplicando o modelo

SKIP na biodegradação do BTEX.................................................................... 85

Figura 5.17 – Utilização dos compostos BTEX e simulação do crescimento da biomassa

aplicando o modelo SKIP. ............................................................................... 86

Figura 5.18 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para o benzeno...................................................................................... 92

Figura 5.19 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para a biomassa. ................................................................................... 92

Figura 5.20 – Simulação do modelo de Monod e dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para o benzeno................................................................................................ 92

Figura 5.21 – Simulação do modelo de Monod e dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa. ............................................................................................. 92

Figura 5.22 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para o tolueno........................................................................................ 93

Figura 5.23 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para a biomassa. ................................................................................... 93

Figura 5.24 – Simulação do modelo de Monod e dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para o tolueno.................................................................................................. 93

Figura 5.25 – Simulação do modelo de Monod e dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa. ............................................................................................. 93

Figura 5.26 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para o fenol. .......................................................................................... 94

Figura 5.27 – Simulação do modelo de Andrews e dados experimentais (HAMED et al.,

2003) para a biomassa. ................................................................................... 94

Figura 5.28 – Simulação da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de Andrews

para o benzeno................................................................................................ 95

Figura 5.29 – Simulação da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de Andrews

para o tolueno.................................................................................................. 95

Figura 5.30 – Simulação da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de Andrews

para o fenol. .................................................................................................... 95

vii

Figura 5.31 – Simulação do modelo de inibição competitiva modificado e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno. ............ 98

Figura 5.32 – Simulação do modelo de inibição competitiva modificado e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a biomassa..................................... 98

Figura 5.33 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno................................................... 99

Figura 5.34 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa. ......................................................................... 99

Figura 5.35 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno.................................... 99

Figura 5.36 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa............................................................ 99

Figura 5.37 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno.................................. 100

Figura 5.38 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 100

Figura 5.39 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a mistura benzeno-tolueno. ........................................................................... 100

Figura 5.40 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a biomassa. ................................................................................................... 100

Figura 5.41 – Rota metabólica do tolueno, benzeno e fenol por Pseudomonas putida F1. 101

Figura 5.42 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva modificado para o benzeno. ...................................... 103

Figura 5.43 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva modificado para o tolueno. ........................................ 103

Figura 5.44 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a mistura benzeno-fenol..................................................... 106

Figura 5.45 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa. ....................................................................... 106

Figura 5.46 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-fenol...................................... 107

Figura 5.47 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 107

Figura 5.48 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-fenol...................................... 108

Figura 5.49 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 108

viii

Figura 5.50 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a mistura benzeno-fenol. ............................................................................... 108

Figura 5.51 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a biomassa. ................................................................................................... 108

Figura 5.52 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva modificado para o benzeno. ...................................... 110

Figura 5.53 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva modificado para o fenol............................................. 110

Figura 5.54 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a mistura tolueno-fenol....................................................... 111

Figura 5.55 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa. ....................................................................... 111

Figura 5.56 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura tolueno-fenol........................................ 112

Figura 5.57 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 112

Figura 5.58 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura tolueno-fenol........................................ 113

Figura 5.59 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 113

Figura 5.60 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a mistura tolueno-fenol. ................................................................................. 114

Figura 5.61 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a biomassa. ................................................................................................... 114

Figura 5.62 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva para o tolueno. .......................................................... 115

Figura 5.63 – Simulação da taxa específica de crescimento na mistura aplicando o modelo

de inibição competitiva para o fenol............................................................... 115

Figura 5.64 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno-fenol. ....................................... 118

Figura 5.65 – Simulação do modelo de inibição competitiva e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa. ....................................................................... 118

Figura 5.66 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno-fenol. ........................ 119

Figura 5.67 – Simulação do modelo de inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 119

Figura 5.68 – Simulação do Modelo de Inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura benzeno-tolueno-fenol. ........................ 119

Figura 5.69 – Simulação do modelo de inibição não-competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.......................................................... 119

Figura 5.70 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a mistura benzeno-tolueno-fenol. .................................................................. 120

Figura 5.71 – Simulação do modelo SKIP e dados experimentais (HAMED et al., 2003) para

a biomassa. ................................................................................................... 120

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Ilustração 1 – Esquema da degradação aeróbica e anaeróbica dos compostos BTEX. ..... 147

Ilustração 2 – Caminhos metabólicos da biodegradação aeróbica do tolueno utilizando-se (a)

Pseudomonas putida mt-2 e (b) Pseudomonas mendocina KR1. .................. 148

Ilustração 3 – Caminhos metabólicos da biodegradação aeróbica do tolueno utilizando-se (a)

Burkholderia G4, (b) Pseudomonas pickettii PKO1 e (c) Pseudomonas putida

F1. ................................................................................................................. 149

Ilustração 4 – Caminhos metabólicos da biodegradação aeróbica do etilbenzeno utilizando-

se Pseudomonas sp NCIB............................................................................. 150

Ilustração 5 – Caminho metabólico da biodegradação aeróbica do o-xileno utilizando-se

Burkholderia cepacia MB2. ............................................................................ 151

Ilustração 6 – Caminhos metabólicos da biodegradação aeróbica do p-xileno utilizando-se

Pseudomonas putida..................................................................................... 152

Ilustração 7 – Caminho metabólico da biodegradação aeróbica do m-xileno utilizando-se

Pseudomonas putida mt-2. ............................................................................ 153

Ilustração 8 – Caminho metabólico da biodegradação anaeróbica do tolueno utilizando-se

Azoarcus sp. T ou Thauera aromática. .......................................................... 154

Ilustração 9 – Caminho metabólico da biodegradação anaeróbica do etilbenzeno utilizando-

se Azoarcus sp. EBN1 ou EB1. ..................................................................... 155

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 – Propriedades físico-químicas dos compostos BTEX ......................................... 6

Tabela 2.2 – Quantidades de postos de combustíveis nas regiões e estados brasileiros ...... 7

Tabela 3.1 – Reações redox envolvidas na degradação dos compostos BTEX associadas à

energia livre de Gibbs...................................................................................... 41

Tabela 3.2 – Caminhos metabólicos caracterizados por microorganismos aeróbicos

degradadores dos compostos BTEX ............................................................... 47

Tabela 4.1 – Modelos cinéticos não-estruturados para único substrato ............................... 52

Tabela 4.2 – Modelos cinéticos não-estruturados para múltiplos substratos........................ 54

Tabela 4.3 – Valores dos parâmetros do método PSO utilizados nos modelos cinéticos..... 66

Tabela 5.1 – Dados experimentais do processo de biodegradação do BTEX ...................... 68

Tabela 5.2 – Dados experimentais do processo de biodegradação do benzeno.................. 68

Tabela 5.3 – Dados experimentais do processo de biodegradação do tolueno.................... 68

Tabela 5.4 – Dados experimentais do processo de biodegradação do etilbenzeno ............. 68

Tabela 5.5 – Dados experimentais do processo de biodegradação do o-xileno ................... 69

Tabela 5.6 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação dos

compostos BTEX individualmente - Modelo de Monod .................................... 71

Tabela 5.7 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação dos

compostos BTEX individualmente - Modelo de Andrews ................................. 71

Tabela 5.8 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos cinéticos de único

substrato na biodegradação dos compostos BTEX ......................................... 74

Tabela 5.9 – Valores da taxa máxima de crescimento específico e concentração crítica dos

compostos BTEX estimados aplicando o modelo de Andrews......................... 77

Tabela 5.10 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de múltiplos

substratos na biodegradação dos compostos BTEX........................................ 80

Tabela 5.11 – Valores dos parâmetros cinéticos e estequiométricos estimados para os

compostos BTEX aplicando o Modelo SKIP .................................................... 81

Tabela 5.12 – Valores dos parâmetros interativos estimados para os compostos BTEX

aplicando o Modelo SKIP ................................................................................ 81

Tabela 5.13 – Dados experimentais do processo de biodegradação do fenol...................... 88

Tabela 5.14 – Dados experimentais do processo de biodegradação do benzeno................ 88

Tabela 5.15 – Dados experimentais do processo de biodegradação do tolueno.................. 89

Tabela 5.16 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura benzeno-

tolueno ............................................................................................................ 89

xii

Tabela 5.17 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura benzeno-

fenol ................................................................................................................ 89

Tabela 5.18 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura tolueno-fenol

........................................................................................................................ 90

Tabela 5.19 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura benzeno-

tolueno-fenol.................................................................................................... 90

Tabela 5.20 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação dos

compostos BTF individualmente aplicando os modelos de único substrato ..... 91

Tabela 5.21 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de único

substrato na biodegradação dos compostos BTF ............................................ 95

Tabela 5.22 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação da

mistura benzeno-tolueno aplicando os modelos de múltiplos substratos ......... 96

Tabela 5.23 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de múltiplos

substratos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno .............................. 97

Tabela 5.24 – Valores dos parâmetros estimados aplicando o Modelo de Inibição

Competitiva modificado na biodegradação da mistura benzeno-tolueno.......... 98

Tabela 5.25 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação da

mistura benzeno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos ........... 104

Tabela 5.26 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de múltiplos

substratos na biodegradação da mistura benzeno-fenol................................ 105

Tabela 5.27 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação da

mistura tolueno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos ............. 110

Tabela 5.28 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de múltiplos

substratos na biodegradação da mistura tolueno-fenol.................................. 112

Tabela 5.29 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação da

mistura benzeno-tolueno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos

...................................................................................................................... 116

Tabela 5.30 – Valores dos parâmetros interativos estimados para a cinética de

biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol aplicando o modelo SKIP. 117

Tabela 5.31 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de múltiplos

substratos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol ................... 117

Tabela 5.32 – Cinética de biodegradação de múltiplos substratos BTEX e BTF selecionados

na literatura ................................................................................................... 121

Tabela 1 – Sumário da cinética de crescimento obtida em vários estudos de biodegradação

de compostos tóxicos .................................................................................... 156

xiii

NOMENCLATURA

TOD

caminho metabólico - enzima tolueno dioxigenase

TOL

caminho metabólico - enzima mono-oxigenase

TOM

caminho metabólico - tolueno 2 mono-oxigenase

TBU

caminho metabólico - enzima tolueno 3 mono-oxigenase

TMO

caminho metabólico - enzima tolueno 4 mono-oxigenase

coeficiente de aceleração local ( - )

coeficiente de aceleração global ( - )

concentração de saturação de oxigênio dissolvido (mg L

-1

)

concentração de oxigênio dissolvido (mg L

-1

)

taxa de diluição (h

-1

)

fluxo volumétrico ou taxa de alimentação (L h

-1

)

(

)

)(

melhor

→

desempenho do vetor melhor posição atual da partícula

( - )

(

)

)X(f

→

desempenho do vetor nova posição da partícula

( - )

(

)

)X(f

melhor

→

desempenho do vetor nova melhor posição da partícula

( - )

(

)

)(

melhor

→

desempenho do vetor melhor posição do grupo ( - )

parâmetro de iteração do substrato

sobre o substrato

( - )

constante de saturação (mg L

-1

)

constante de inibição (mg L

-1

)

constante de saturação do oxigênio; (mg L

-1

)

Kla

coeficiente global de transferência de massa do oxigênio (h

-1

)

número de iteração ( - )

OTR

taxa de transferência de massa do oxigênio (mg L

-1

)

OUR

taxa de consumo de oxigênio (mg L

-1

)

resíduo mínimo ou função objetivo ( - )

valor simulado da variável substrato (mg L

-1

)

valor experimental da variável substrato (mg L

-1

)

máx

máximo valor experimental da variável substrato (mg L

-1

)

concentração do substrato em que

µ atinge o valor máximo

(mg L

-1

)

SGR

taxa de crescimento específico (h

-1

)

xiv

concentração do substrato

(mg L

-1

)

ini

concentração inicial do substrato

na alimentação (mg L

-1

)

volume do reator (L)

(

)

→

vetor velocidade atual da partícula

( - )

(

)

→

vetor velocidade de atualização da partícula

( - )

concentração celular (mg L

-1

)

valor simulado da variável biomassa (mg L

-1

)

valor experimental da variável biomassa (mg L

-1

)

máx

máximo valor experimental da variável biomassa (mg L

-1

)

mín

→

limite mínimo da partícula ( - )

máx

→

limite máximo da partícula ( - )

(

)

→

vetor posição atual da partícula

( - )

(

)

→

vetor nova posição da partícula

( - )

melhor

→

vetor melhor posição visitada pela partícula

( - )

(

)

melhor

→

vetor melhor posição visitada pelo grupo ( - )

S/X

coeficiente de rendimento (mg mg

-1

)

2/ Ox

coeficiente de rendimento no oxigênio; (mg mg

-1

)

iteração ( - )

variável aleatória no intervalo de (0,1) ( - )

taxa de crescimento específico no substrato

-1

)

máx

taxa máxima de crescimento específico (h

-1

)

2xO

taxa de crescimento específico no oxigênio; (h

-1

)

2máxO

taxa máxima de crescimento específico no oxigênio; (h

-1

)

µ valor máximo de

quando a concentração é

-1

)

(

)

variável fator de inércia ( - )

final

fator de inércia final ( - )

inicial

fator de inércia inicial ( - )

TRIGUEROS, Daniela Estelita Goes. Avaliação da Cinética de Biodegradação

dos Compostos Tóxicos: Benzeno, Tolueno, Etilbenzeno, Xileno (BTEX) e

Fenol. 157p. 2008. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)

Universidade Estadual do Oeste do Paraná.

RESUMO

Os hidrocarbonetos aromáticos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos,

coletivamente conhecidos como BTEX são compostos tóxicos presentes em

derivados de petróleo, como a gasolina, e utilizados em larga escala nas indústrias

químicas e petroquímicas. Estes compostos quando liberados no meio ambiente

contaminam o solo e as águas subterrâneas, podendo inviabilizar a exploração de

aqüíferos, que atualmente representam uma fonte alternativa de água potável.

Portanto, é fundamental a pesquisa de processos de biodegradação, particularmente

quando múltiplos substratos estão presentes no sistema. Neste trabalho investigou-

se a cinética de biodegradação dos compostos BTEX, individualmente e em mistura.

Para tanto, o desempenho de diversos modelos não-estruturados de crescimento

microbiano, baseado na cinética no nível da população, foi avaliado utilizando-se

dados experimentais obtidos da literatura. As equações do balanço material em

operação batelada foram numericamente resolvidas (método RKF45) aplicando os

modelos de Monod e Andrews à cinética de biodegradação individual dos

substratos. Igualmente, as equações aplicadas à cinética de biodegradação da

mistura BTEX foram resolvidas considerando os modelos de inibição competitiva,

acompetitiva e não-competitiva, bem como o modelo soma cinética dos parâmetros

de interação (sum kinetic interactions parameters – SKIP). Para o entendimento dos

mecanismos envolvidos na biodegradação de múltiplos substratos tóxicos, também

foram investigadas a cinética de biodegradação dos compostos BTF (benzeno,

tolueno e fenol), individualmente e em misturas binárias e ternária. Neste caso,

algumas modificações nos modelos de inibição foram propostas para descrever a

cinética de biodegradação das misturas benzeno-tolueno e benzeno-fenol. Os

parâmetros cinéticos foram estimados por meio de um método de otimização global

conhecido como Enxame de Partículas (Particle Swarm Optimization – PSO),

xvi

implementado no software Maple

, utilizando a função dos mínimos quadrados como

critério estatístico. Os parâmetros obtidos no presente trabalho mostraram-se

coerentes com valores relatados na literatura. A biodegradação individual dos

substratos BTEX foi adequadamente representada pelos modelos de Andrews e

Monod. O modelo SKIP proporcionou a melhor representação da cinética de

biodegradação da mistura BTEX, e conseguiu mostrar a existência de interações

não específicas entre os substratos BTEX. Além do ótimo ajuste do modelo SKIP,

inferências sobre o comportamento dos demais modelos avaliados indicam uma

mistura de inibições competitiva e não-competitiva, concordando com o fato de que,

a mistura de culturas microbianas utilizada na biodegradação, pode apresentar

múltiplos caminhos metabólicos para a biodegradação dos compostos BTEX. Por

meio do modelo SKIP estimou-se as interações entre os substratos BTEX, onde o

etilbenzeno apresentou o maior efeito de inibição sobre os demais compostos, ao

passo que o xileno mostrou o menor efeito. O modelo de inibição apoeml rmmdo–2c0çóKmmdd–m0.xpcóde–2c0çóD

xvii

TRIGUEROS, Daniela Estelita Goes. Evaluation of Biodegradation Kinetics of

Toxics Compounds: Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene (BTEX) and

Phenol. 157p. 2008. Master dissertation in Chemical Engineering

West Paraná State University

ABSTRACT

The aromatics hydrocarbons usually known as BTEX (benzene, toluene,

ethylbenzene, and xylenes isomers) are toxics compounds presented in many

petroleum products, such as gasoline, and are also widely used in chemical and

petrochemical industries. When these compounds are released in the environment a

contamination of the soil and the groundwater took place. As a result, the use of the

aquifers becomes impossible. Groundwaters nowadays represent an alternative

potable water source in many countries. Therefore, it’s crucially important to study

the biodegradation process, in particular when multiple substrates are presented in

the system. In this work, the kinetics of BTEX biodegradation was studied,

individually and as in mixture. Hence, the performance of the different microbial

growth unstructured models, based on the population level kinetics were investigated

by using experimental data from literature. The equations of the material balances,

for batch operation mode, were numerically solved (RKF45 method) applying the

Monod and Andrews models to describe an individual substrates biodegradation

kinetics. Similarly, the applied equations describing mixture substrates

biodegradation kinetics were solved by using the competitive, noncompetitive and

uncompetitive inhibitions models as well as the sum kinetic interactions parameters

(SKIP) model. Moreover, in order to understand the mechanisms involved in the

biodegradation process of the BTP toxics compounds (benzene, toluene, and

phenol), individually and as the binary and ternary mixtures, were investigated. In this

case, some inhibition models modifications were proposed in order to describe the

biodegradation kinetics of the benzene-toluene and benzene-phenol mixtures. The

kinetic parameters were estimated by using Particle Swarm global optimization

method. The experimental data were taken from the literature and the programs were

coded in Maple software. The least square method was used as a statistical criterion

xviii

of the search. The evaluated kinetic parameters values obtained in the present study

were found to describe very well experimental data and to be in accordance with the

values reported in the literature. The simple Monod and Andrews models accurately

predict the BTEX individual biodegradation kinetics. The SKIP model provided the

best description of BTEX biodegradation kinetics, showing the existence of non

specific interactions between the BTEX substrates. The other models behavior

indicated a presence of a competitive and a noncompetitive inhibition in the mixtures,

agreeing with the reality that a mixture culture used in the biodegradation can have

multiples metabolic pathways to the BTEX biodegradation. By applying the SKIP

model, the interactions between BTEX substrates was estimated, where the

ethylbenzene expressed a higher inhibitory effect in the mixtures, whereas the xylene

shown a smaller one. The competitive inhibition model adequately described the BTP

binary and ternary mixtures biodegradation process, because substrates

biodegradation is catabolized via the same enzymatic pathway of Pseudomonas

putida F1. Moreover, the inhibition models modifications proposed described better

the biodegradation kinetics of benzene-toluene and benzene-phenol mixtures.

Finally, the obtained results in this work have shown that the best models can be

successfully applied for optimization of toxics compounds biodegradation process by

applying different bioreactors types and operational conditions.

Keywords: biodegradation, PSO, modeling, BTEX, phenol.

Capítulo 1 – Introdução

Capítulo 1

1.1. Contextualização do Tema

Os hidrocarbonetos aromáticos conhecidos coletivamente como BTEX

(benzeno, tolueno, etilbenzeno e orto-meta-para-xileno), presentes em produtos

derivados de petróleo são extremamente tóxicos e frequentemente contaminam o

meio ambiente em conseqüência de descargas industriais e derramamentos de

combustíveis. Os impactos ambientais decorrentes da presença destes compostos

em combustíveis, como a gasolina, têm sido objeto de crescente preocupação de

órgãos ambientais em todo o mundo. Uma das grandes preocupações está

relacionada à preservação dos recursos hídricos com ênfase às águas subterrâneas,

cuja contaminação pode inviabilizar a exploração de aqüíferos.

Frente à necessidade cada vez maior de preservação dos recursos hídricos, é

crescente a busca por tecnologias que minimizem os impactos causados pela

presença de compostos tóxicos no meio ambiente. Dentre as tecnologias utilizadas

na remediação e tratamento de áreas impactadas por combustíveis derivados de

petróleo, a biodegradação vem despontando como uma técnica bastante eficaz,

podendo ser utilizada como complemento às tecnologias convencionais. A

biodegradação de poluentes depende da atividade de microorganismos aeróbios e

anaeróbios capazes de metabolizá-los e a utilização destes microorganismos em

reatores, visando o tratamento dos mais diferentes tipos de águas residuárias, vem

se tornando uma nova estratégia de biorremediação.

A realização de pesquisas que relatem a biodegradação de compostos

tóxicos, como o BTEX, com o objetivo de restaurar a qualidade de águas

subterrâneas até níveis previstos pelos órgãos de fiscalização ambiental, é

fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias de remediação. Para

isso, o conhecimento da cinética de biodegradação é crucial para a predição da taxa

de remoção dos poluentes e alcance de tecnologias mais eficientes.

1.2. Objetivos da Pesquisa

O objetivo geral da pesquisa consiste na avaliação do desempenho de

modelos cinéticos de crescimento microbiano em descrever a biodegradação dos

Capítulo 1 – Introdução

compostos BTEX, individualmente e em mistura, determinando a modelagem

matemática que melhor descreve a cinética de biodegradação nas condições

referentes aos dados experimentais obtidos da literatura.

Além disso, também serão avaliados os modelos para descrever a cinética de

biodegradação dos compostos BTF (benzeno, tolueno e fenol), individualmente e em

misturas binárias e ternária, com a finalidade de ajudar na compreensão dos

mecanismos envolvidos na biodegradação de compostos tóxicos em geral.

Para tanto, o trabalho tem como objetivo específico a implementação de um

método de busca, conhecido como Enxame de Partículas, utilizando-o como

ferramenta na estimativa dos parâmetros dos modelos cinéticos avaliados.

1.3. Organização da Dissertação

Este capítulo apresenta a justificativa do tema e objetivos a serem atingidos e

mostra a estrutura da dissertação organizada nos capítulos subseqüentes:

O Capítulo 2 refere-se aos aspectos relevantes do tema proposto, tais como a

importância da eliminação de compostos tóxicos do meio ambiente, tecnologias de

remediação de áreas impactadas, entre outros assuntos pertinentes.

O Capítulo 3 traz uma revisão e análise da literatura, abordando os principais

trabalhos relacionados à biodegradação de compostos BTEX e outros compostos

tóxicos, bem como os microorganismos utilizados no processo, além de modelos

cinéticos de crescimento microbiano adotados para descrever a biodegradação.

O Capítulo 4 apresenta a metodologia adotada, além de alguns conceitos

fundamentais para a compreensão de processos de biodegradação. Além disso,

apresenta o método Enxame de Partículas, implementado neste trabalho, para

estimativa dos parâmetros dos modelos cinéticos.

O Capítulo 5 apresenta os resultados alcançados e a discussão sobre o

desempenho de diversos modelos não-estruturados de crescimento microbiano, na

descrição da biodegradação de compostos tóxicos BTEX e BTF, a partir do qual as

modificações foram propostas.

O Capítulo 6 apresenta as conclusões e sugestões para futuros trabalhos.

Por fim, são apresentadas as Referências que contribuíram para a realização

deste trabalho, e em Anexos tem-se algumas informações importantes para uma

melhor compreensão do mesmo.

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

Capítulo 2

2.1. Recursos Hídricos

A deterioração da qualidade das águas superficiais vem gerando problemas

de escassez dos recursos hídricos do planeta. Segundo a Organização das Nações

Unidas, atualmente mais de um bilhão de pessoas vivem sob condições insuficientes

de disponibilidade de água para consumo e, cerca de cinco bilhões e meio de

pessoas estarão vivendo em áreas com moderada ou séria falta de água nos

próximos 25 anos (SETTI et al., 2001). Estima-se que o volume total de água no

planeta seja de 1.385.984 km

, sendo que desse total 99,4% apresenta-se em

oceanos, mares e geleiras, ou seja, inadequada e indisponível para o consumo

humano. A parcela disponível na forma de água doce corresponde a 0,6%, dos

quais 98,5% estão na forma de águas subterrâneas (REBOUÇAS, 2002). Água

subterrânea é toda a água que ocorre abaixo da superfície da Terra, preenchendo

os poros ou vazios intergranulares das rochas sedimentares, ou as fraturas, falhas e

fissuras das rochas compactas, e que sendo submetida às forças de adesão e de

gravidade desempenha um papel essencial na manutenção da umidade do solo, do

fluxo dos rios, lagos e brejos (BORGUETTI et al., 2004).

Nas últimas décadas as águas subterrâneas vêm assumindo papel relevante

como fonte de abastecimento doméstico, industrial e agrícola, tornando-se uma

reserva estratégica de água doce para o abastecimento público no planeta. A

Organização das Nações Unidas estima que entre 1,5 e 2,7 bilhões de pessoas no

mundo são abastecidos pelas águas subterrâneas (MORRIS, 2003). Um

levantamento realizado pelo IBGE (2003) determinou que aproximadamente 61% da

população brasileira utilizam esta fonte de abastecimento para fins domésticos, dos

quais 10% provêm de poços rasos (até 30 m de profundidade), 20% de nascentes

ou fontes e 70% de poços profundos (acima de 50 m de profundidade). No estado

de São Paulo, 72% dos municípios são, total ou parcialmente, abastecidos por

águas subterrâneas (CETESB, 2007). A demanda de 70 a 90% do abastecimento

público de países como, Alemanha, Áustria, Bélgica, Dinamarca, França, Holanda,

Hungria, Itália, Marrocos, Rússia e Suíça, provém de águas subterrâneas e, na

Arábia Saudita este fornecimento é de 100% (REBOUÇAS et al., 2002).

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

Em geral, as águas subterrâneas são fontes potenciais de água de boa

qualidade e baixo custo de exploração devido a sua potabilidade e não necessidade

de pré-tratamento, pois a sua purificação ocorre durante a percolação no subsolo,

por meio dos processos de filtração e depuração. Contudo, a qualidade das águas

subterrâneas vem sendo questionada devido à contaminação por compostos

tóxicos, e a maior preocupação está relacionada à possível inviabilização da

exploração de aqüíferos.

Visto que o armazenamento de combustíveis é realizado em tanques

subterrâneos, os vários problemas decorrentes deste procedimento têm se tornado

fonte de poluição ambiental relevante, afetando a qualidade do solo e das águas

subterrâneas. Além disso, a contaminação também ocorre por meio dos poços da

produção de petróleo, refinarias, tubulações e terminais de distribuição, atividades

de mineração, utilização de defensivos agrícolas, esgotos, aterros sanitários e

resíduos industriais. Dos diversos compostos orgânicos que estão presentes em tais

atividades, os hidrocarbonetos aromáticos benzeno, tolueno, etilbenzeno e os

isômeros do xileno, coletivamente conhecidos como BTEX, são os contaminantes

mais preocupantes devido a sua extrema toxidade. São altamente poluentes, em

particular devido a sua alta toxicidade e solubilidade em água, além de o benzeno

ser comprovadamente carcinogênico. Os compostos BTEX estão presentes em

combustíveis derivados de petróleo e correspondem ao maior constituinte da

gasolina.

No Brasil, o número alarmante de vazamentos de tanques de armazenamento

subterrâneo não tem sido surpresa, já que no país a instalação de aproximadamente

160.000 tanques ocorreu na década de 70, para uma vida útil de 25 anos. Assim, a

contaminação de aqüíferos pelo derramamento de combustíveis derivados de

petróleo tornou-se uma ameaça à qualidade das águas subterrâneas, e, portanto

apresenta-se como um assunto de grande interesse nas últimas décadas. Dentre as

diversas pesquisas referentes à compostos tóxicos BTEX existentes no Brasil e no

mundo estão os trabalhos de LODAYA (1989), OLIVEIRA (1992), CAPUANO &

JOHNSON (1996), CORSEUIL & ALVAREZ (1996a), CORSEUIL & MARINS (1997),

SPILBORGS (1997), DOURADO (1998), FERREIRA (2000), MAXIMIANO (2001),

SILVA et al. (2002), SCHREIBER & BAHR (2002), KOUSSIS et al. (2003),

RICHNOW et al. (2003), KAIPPER (2003) e MINDRISZ (2006).

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

2.2. Gasolina e Compostos Tóxicos

A gasolina é um combustível derivado do petróleo, constituído por uma

mistura de mais de cem hidrocarbonetos, primariamente alcanos de cadeia linear e

cicloalcanos. A gasolina com características primárias, quando vaporizada em

mistura com o ar, tende a sofrer ignição espontânea no cilindro de um motor de

combustão interna. Isso ocorre antes que a gasolina seja comprimida e receba uma

descarga elétrica para provocar sua ignição e, consequentemente, o motor perde

potência. Para superar este problema, toda gasolina é formulada para conter

substâncias antidetonantes, como o benzeno, tolueno, etilbenzeno e orto-meta-para-

xilenos. Estes compostos correspondem aos indicadores específicos utilizados para

se caracterizar a contaminação de áreas por gasolina (MINDRINSZ, 2006), pois são

altamente solúveis em água e, portanto, são os poluentes que primeiro atingirão as

águas subterrâneas. Os compostos BTEX são os hidrocarbonetos mais abundantes

da gasolina, podendo representar uma parcela de 18% a 25% em massa (ANP,

2006). As porcentagens dos compostos BTEX na gasolina são apresentadas na

Figura 2.1.

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

sua gasolina. Frente ao cenário ambiental atual enfatiza-se a importância do etanol,

no Brasil e no mundo, como o oxigenado mais correto a ser utilizado como aditivo da

gasolina, em substituição ao MTBE.

A mobilidade da gasolina na água e no solo são influenciadas pelas

propriedades físico-químicas dos hidrocarbonetos presentes, dentre as quais as

mais importantes são a solubilidade, a pressão de vapor, a densidade, a viscosidade

dinâmica e o coeficiente de partição octanol-água (MILLER, 2001 apud TROVÃO,

2006). O coeficiente de partição octanol-água é definido como a razão da

concentração de um composto orgânico dissolvido entre o octanol e a água, em

equilíbrio, e descreve a tendência de partição de um composto entre a fase orgânica

e a fase aquosa. Quanto maior esta razão, maior será a hidrofobicidade do

composto. Na Tabela 2.1 são apresentadas algumas propriedades físico-químicas

dos compostos BTEX.

Tabela 2. 1 – Propriedades físico-químicas dos compostos BTEX

Composto

Fórmula

Molecular

Massa

Molar

(g mol

-1

)

Densidade

(g cm

-3

)

Solubilidade em

água (25° C)

(mg L

-1

)

Pressão de

vapor

(atm)

Constante de

Henry

(10

)

(atm m

mol

-1

)

Coeficiente

de partição

octanol/água

Log K

(25° C)

Benzeno C

78,10 0,880 1780 0,1250 5,5 2,13

Tolueno C

92,10 0,867 515 0,0370 6,6 2,69

Etilbenzeno

106,20 0,867 152 0,0125 8,7 3,13

p - Xileno C

106,20 0,860 198 0,00895 5,0 3,15

m - Xileno

106,20 0,864 187 0,00803 5,0 3,20

o - Xileno C

106,20 0,880 175 0,00697 4,0 3,12

Fonte: KAIPPER (2003)

Além das diversas atividades que promovem a degradação ambiental, citadas

anteriormente, também são freqüentes poluidores os derramamentos acidentais de

combustíveis em postos de revenda (TROVÃO, 2006). Segundo a Agência Nacional

de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) em 2005 existiam no Brasil

35.585 postos de combustíveis cadastrados, além de 13 refinarias, 24 terminais

marítimos, 27 terminais terrestres, 551 bases de distribuição, 165 distribuidoras, e

uma produção de aproximadamente 1,75 milhão barris/dia de petróleo (ANP, 2006).

A Tabela 2.2 apresenta a quantidade de postos de combustíveis presentes nas

regiões e estados brasileiros, segundo o anuário estatístico ANP (2006).

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

Tabela 2. 2 – Quantidades de postos de combustíveis nas regiões e estados

brasileiros

Regiões

estados

Quantidade de

postos

Regiões

estados

Quantidade de

postos

Norte 2047 Nordeste 6963

Acre 103 Alagoas 391

Amapá 85 Bahia 1744

Amazonas 391 Ceará 1040

Pará 724 Maranhão 635

Rondônia 373 Paraíba 613

Roraima 85 Pernambuco 1235

Tocantins 286 Piauí 579

Sul 7352

Rio Grande do Norte 512

Paraná 2671 Sergipe 214

Santa Catarina 1878

Sudeste 15999

Rio Grande do Sul 2803 Espírito Santo 633

Centro-Oeste 3224

Minas Gerais 4335

Distrito Federal 317 Rio de Janeiro 2185

Goiás 1385 São Paulo 8846

Mato Grosso 921

Mato Grosso do Sul 601

Total de postos

35585

Fonte: ANP - anuário estatístico 2006

Observa-se que a Região Sudeste apresenta-se com o maior número de

postos de combustíveis, na qual o Estado de São Paulo possui 8.846 postos,

quantidade maior que qualquer uma das regiões brasileiras. Os maiores problemas

de contaminação surgiram nesta Região, onde as primeiras legislações foram

estabelecidas, juntamente com o órgão ambiental do Estado de São Paulo, a

CETESB (MINDRISZ, 2006). Segundo dados da CETESB (2007), dos acidentes

ambientais que ocorreram em postos de revenda no Estado de São Paulo, 19,7%

foram nas cidades do interior, 72% nos municípios da Região Metropolitana e 8,3%

na região litorânea, sendo que os tanques de armazenamento subterrâneo foram

responsáveis por 32% desses acidentes. Além disso, a gasolina foi o produto com

maior vazamento representando uma parcela de 71,6% dos compostos.

No Estado do Paraná, o abastecimento de água das cidades de Cascavel e

Campo Largo foi interrompido em 2001, devido à contaminação de mananciais

fornecedores, por vazamentos em postos de combustíveis da região (MANZOCHI,

2001).

Os fenômenos envolvidos durante um derramamento de gasolina em

subsuperfície são visualizados na Figura 2.2. Primeiramente, o fluido tende a migrar

verticalmente, infiltrando-se na zona não saturada (solo) até atingir a zona saturada

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

(aqüíferos), controlado basicamente pelos processos de advecção e difusão, os

quais correspondem ao transporte do fluido em função do gradiente e ao movimento

de uma substância de uma área com alta concentração para uma área com baixa

concentração, respectivamente. Durante este percurso, os diversos componentes da

gasolina se particionam nas fases sólida, líquida e gasosa, e permanecem sujeitos à

biodegradação. Uma fração da gasolina volatiliza-se e é transferida à atmosfera;

outra permanece retida nos espaços vazios dos poros na zona não saturada; uma

terceira fração fica aderida à matéria orgânica existente no meio e, finalmente, uma

fração chega às águas subterrâneas, tornando-se uma ameaça em potencial para a

saúde pública (FERREIRA, 2000).

Figura 2. 2 – Fenômenos que ocorrem durante o derramamento de gasolina.

(FERREIRA, 2000)

2.3. Compostos BTEX

Os hidrocarbonetos monoaromáticos BTEX, além de serem encontrados em

derivados de petróleo, também são largamente utilizados em indústrias químicas

como matérias-primas para síntese de outros produtos (PHELPS & YOUNG, 2001;

RIBEIRO, 2005). O benzeno é utilizado na produção de borrachas, plásticos, Nylon,

pesticidas e tintas. O tolueno é um importante produto químico comercial usado

geralmente como um agente de diluição de tintas e como solventes na produção de

resinas, colas e óleos. O etilbenzeno é usado na produção do estireno e polímeros

sintéticos. Os xilenos geralmente são usados como solventes em borrachas e nos

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

processos de tingimento de couro, além de serem utilizados na produção do anidrido

ftálico, bactericidas, herbicidas, óleos lubrificantes e ácido para-ftálico. Na Figura 2.3

são apresentadas as estruturas químicas dos compostos BTEX.

Os compostos BTEX são considerados substâncias perigosas aos seres

humanos principalmente por serem depressores do sistema nervoso central, além

de causarem danos ao sistema respiratório, gastrointestinal, reprodutivo e outros

efeitos.

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

o-Xileno

m-Xileno

p-Xileno

Figura 2. 3 – Estrutura química dos compostos BTEX.

O benzeno é comprovadamente o composto mais tóxico de todos os BTEX,

pois se trata de uma substância carcinogênica e mutagênica (BONO et al., 2001;

FERNANDES et al., 2002), podendo causar leucemia, se ingerida, mesmo em

baixas concentrações durante períodos não muito longos de tempo. Uma exposição

à altas concentrações em curtos períodos, por inalação ou ingestão pode causar até

mesmo a morte (MENDES, 1993).

A portaria nº518/2004 do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004) determina que

as concentrações máximas de BTEX permitidos para que a água seja considerada

potável é de 5 µg L

-1

para o benzeno, 170 µg L

-1

para o tolueno, 200 µg L

-1

para o

etilbenzeno e 300 µg L

-1

para os xilenos. Segundo Fernandes (1997), em qualquer

vazamento, as concentrações de compostos tóxicos alcançam valores três mil vezes

superiores.

2.4. Tecnologias de Remediação

Normalmente a remediação de sítios contaminados é uma tarefa complexa

que exige o conhecimento de diversas tecnologias. Existem vários processos de

remediação, físico-químicos e biológicos, usados para descontaminação de solo e

tratamento de águas subterrâneas, incluindo, remoção da fase livre (SPILBORGHS,

1997; NOBRE & NOBRE, 2003), biodegradação utilizando diferentes receptores de

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

elétrons (HUTCHINS, 1991), extração de vapor do solo (CAPUANO & JOHNSON,

1996; RAHBEH & MOHTAR, 2007), remediação pela eletrocinética (MAINI et al.,

2000), adição de nitrato (HUTCHINS et al., 1991; SHIM et al., 2005), bioventilação

pela injeção de ar no solo (SOO CHO et al., 1997), utilização de lodo para promover

subsídios à biodegradação anaeróbica (LODAYA et al., 1991), adsorção em carvão

ativado (KUHN et al., 1985; MARTINS, 2004), torres de aeração ou air-stripping

(SILVA, 2004), barreiras reativas permeáveis (LOURENÇO, 2006), dentre outros.

Contudo, a técnica de remediação adotada deve ser aplicada conforme as

condições particulares de cada sítio contaminado, atendendo às características

físico-químicas dos contaminantes envolvidos, às condições hidrogeológicas do local

impactado, às limitações, como a dificuldade no transporte de nutrientes ou

receptores de elétrons, e ao controle das condições para aclimatação e degradação

dos contaminantes (CORSEUIL & WEBER, 1994; SPILBORGHS, 1997; NOBRE &

NOBRE, 2003). Além disso, é necessário atender à legislação ambiental vigente e

avaliar as relações custo e benefício do processo de tratamento escolhido,

lembrando que a associação de diversas tecnologias de tratamento às vezes faz-se

necessária, resultando processos caros e demorados, principalmente, pela

complexidade das instalações.

A seguir, são descritas algumas técnicas utilizadas no tratamento de águas

subterrâneas e solos contaminados por hidrocarbonetos derivados de petróleo.

A técnica denominada remoção da fase livre consiste em um bombeamento

direto dos hidrocarbonetos de petróleo e a separação dos líquidos por meio de um

separador água-óleo (MILLER, 2001 apud TROVÃO, 2006). Não é considerado

efetivo na remediação de águas subterrâneas, visto que uma grande porcentagem

dos hidrocarbonetos permanece adsorvida ao solo, atuando como uma fonte

contínua de contaminação em fase dissolvida (SPILBORGHS, 1997; NOBRE &

NOBRE, 2003).

No sistema de extração de vapores do solo (soil vapor extraction – SVE) o

vácuo é aplicado para induzir o fluxo controlado de ar, promovendo fluxo contínuo de

ar no solo e, consequentemente, a biodegradação in-situ dos contaminantes (SOO

CHO et al., 1997). A tecnologia é aplicada somente para compostos voláteis com

constante de Henry acima de 1,315.10

-5

atm m

mol

-1

ou pressão de vapor maior que

6,58.10

-4

atm, como por exemplo, os compostos BTEX. O gás retirado segue para

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

uma estação de tratamento de vapores onde a concentração da emissão gasosa é

controlada (NOBRE & NOBRE, 2003; RAHBEH & MOHTAR, 2007).

Outra tecnologia bastante utilizada em indústrias petroquímicas é o processo

air-stripping (SILVA, 2004). A técnica fundamenta-se na remoção por aeração,

permitindo que os contaminantes orgânicos voláteis sejam transferidos da fase

líquida para a fase gasosa. Os métodos de aeração incluem packed towers, aeração

por difusão, aeração por bandejas e por jateamento (NEGRÃO, 2002). Juntamente

com o air-stripping deve ser utilizado um sistema de recuperação de vapor, como

uma coluna de carvão ativado.

Na bioventilação o ar passa através do solo, mantendo as condições

aeróbicas necessárias para que microorganismos presentes promovam a

biodegradação sejad

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

Pump-and-treat (MACKAY & CHERRY, 1989 apud KAIPPER, 2003) é um dos

métodos mais comuns no tratamento de aqüíferos contaminados por compostos

voláteis. O processo consiste na extração de águas contaminadas e tratamento ex-

situ, que pode ser realizado por diferentes processos como sistemas de air-stripping

para a remoção dos compostos voláteis, extração por adsorção em carvão ativado

para constituintes dissolvidos e sistemas biológicos para poluentes biodegradáveis.

A reinjeção de águas tratadas no subsolo, além de reduzir custos na disposição de

efluentes, pode promover maiores taxas de lavagem do solo, diminuindo o tempo de

remediação (NOBRE & NOBRE, 2003; TIBURTIUS et al., 2004).

Existem também, os processos oxidativos avançados (TIBURTIUS et al.,

2005, RINALDI, 2006), os quais têm como principal característica a geração de

radicais hidroxilas que reagem rapidamente com muitos compostos orgânicos, ou

por adição à dupla ligação ou por abstração do átomo de hidrogênio em moléculas

orgânicas alifáticas. O resultado é a formação de radicais orgânicos que reagem

com oxigênio, dando início a uma série de reações de degradação que podem

culminar em espécies inócuas, como dióxido de carbono e água. Vários processos

de produção do radical hidroxila têm sido estudados, geralmente, utilizando ozônio,

peróxido de hidrogênio, semicondutores e reagente de Fenton.

Dentre estas tecnologias, a atenuação natural surge como menos agressiva

ao meio ambiente, sendo economicamente viável devido aos baixos custos

energéticos necessários para as reações bioquímicas. O termo atenuação natural

possui diversas denominações, tais como bioatenuação, biorremediação intrínseca,

remediação natural, atenuação natural monitorada e intemperismo (FERNANDES,

2002; SCHNEIDER et al., 2005). Existem inúmeros estudos de campo (KAO &

WANG, 2000; SKUBAL et al., 2001; ALVAREZ & HUNT, 2002; RICHNOW et al.,

2003; KOUSSIS et al., 2003; NUNES & CORSEUIL, 2005; MAK et al., 2006), os

quais sugerem que muitos microorganismos presentes no sítio impactado degradam

naturalmente alguns hidrocarbonetos de petróleo, até níveis aceitáveis de

concentração, antes mesmo de alcançarem uma fonte de água potável. Os grupos

alvos que sofrem a atenuação natural são os compostos orgânicos voláteis não

halogenados, semi-voláteis e combustíveis derivados de petróleo. Segundo

BORDEN et al. (1995) e CORSEUIL & ALVAREZ (1996a), o conceito de atenuação

natural é o fenômeno que envolve o uso de microorganismos endógenos que

possuem a capacidade de degradar compostos tóxicos, como o BTEX, dentro de

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

aqüíferos, transformando-os em dióxido de carbono e água. A tecnologia baseia-se

em um conjunto de mecanismos naturais combinados, como processos de diluição,

volatilização, biodegradação, adsorção e reações químicas que permitem reduzir

naturalmente a concentração dos contaminantes. A adição de outros compostos

como nitrato e fosfato, pode acelerar a atividade biológica dos microorganismos

(HUTCHINS et al., 1991; BROHOLM & ARVIN, 2000; SCHREIBER & BAHR, 2002)

facilitando a biorremediação. No entanto, a atenuação natural não é uma tecnologia

que age sozinha, sem monitoramento ou acompanhamento. Seu monitoramento

requer amostragens e análises químicas, dados para modelagem da evolução dos

contaminantes e determinação das taxas de degradação para previsão do

deslocamento da pluma de contaminação (emissão contínua do poluente a partir de

uma fonte pontual). A remediação é demonstrada por meio da redução da pluma de

contaminação e do incremento dos produtos de degradação dos compostos

originais. Quando a taxa de biodegradação for igual, ou maior que a taxa de

deslocamento dos contaminantes, a pluma deixará de se deslocar e diminuirá de

tamanho. Portanto, se a fonte receptora não for atingida, não haverá a necessidade

de implantação de tecnologias físico-químicas de remediação, tais como as

mencionadas anteriormente, e a remediação natural seria a solução mais econômica

de tratamento e recuperação do local contaminado (CORSEUIL & MARINS, 1997).

Entretanto, se a atenuação natural não evitar o deslocamento da pluma até uma

fonte potencial de água potável, é necessária a adoção de outras tecnologias que

acelerem a transformação dos contaminantes.

Nem sempre uma determinada técnica implementada é suficiente para atingir

o objetivo de restaurar a qualidade das águas subterrâneas até níveis de

potabilidade requeridos pela legislação ambiental e, para tanto, novas tecnologias de

remediação devem ser aplicadas em complemento às técnicas convencionas. Neste

contexto, muitas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de desenvolver

modelos matemáticos de processos de biodegradação em biorreatores, como

alternativa de simulação e de previsão de processos de biorremediação, visando à

minimização de custos e a maximização da eficiência do tratamento.

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

2.5. Processos Biotecnológicos e a Biodegradação

A grande maioria dos processos biotecnológicos divide-se em reações de

crescimento microbiano (reações microbiológicas) e as reações catalisadas por

enzimas (reações bioquímicas). A utilização de microorganismos e/ou enzimas,

capazes de sintetizar compostos químicos tais como proteínas, antibióticos e álcool,

além de produzir biomassa e inúmeros alimentos é uma tecnologia antiga.

Atualmente os processos biotecnológicos tornaram-se fundamentais também na

produção de energia, como o biogás e o etanol. A utilização de culturas microbianas

é importante não somente para produção de combustíveis a partir de biomassa e

produção de metabólitos secundários em aplicações farmacêuticas, mas também na

biodegradação de produtos químicos perigosos. Desta forma, os processos

biotecnológicos têm sido largamente utilizados na biodegradação de compostos

tóxicos, como no tratamento de efluentes municipais, industriais e tratamento de

águas subterrâneas, revelando-se como uma tecnologia de tratamento relativamente

econômica, se comparada aos processos físico-químicos, além de apresentar alta

eficiência e menor efeito adverso ao ambiente (METCALF & EDDY, 1991 apud

RODRIGUES, 2006).

A biodegradação em biorreatores proporciona menores tempos de

tratamento, devido ao maior contanto entre os microorganismos, nutrientes e

compostos tóxicos. Além disso, todos os parâmetros do processo podem ser

controlados e otimizados, reduzindo ou eliminando as limitações de transferência de

massa. O crescimento de microorganismos em um reator biológico ocorre a partir do

fornecimento de nutrientes adequados e substratos, como fonte de carbono e

energia, na presença de condições favoráveis. Os microorganismos precisam de

macronutrientes para síntese de componentes celulares, tais como nitrogênio para

síntese de aminoácidos e enzimas, fósforo para síntese de ATP e DNA, enxofre para

síntese de algumas co-enzimas, cálcio para estabilização da parede celular e

magnésio para estabilização dos ribossomos. Também necessitam de

micronutrientes, como traços de ferro, níquel, cobalto, molibdênio e zinco, para a

realização de funções metabólicas. Além disso, o controle das condições favoráveis

de temperatura, pH, aeração e agitação são fundamentais, pois estas variáveis

também influenciam fortemente na atividade microbiana.

Capítulo 2 – Aspectos Relevantes

O processo de biodegradação baseia-se em reações de oxido-redução

biológica, por meio de microorganismos, em presença de um aceptor de elétrons e

nutrientes, capazes de decompor a matéria orgânica em substâncias mais simples.

A transferência de elétrons é essencial para a respiração celular e libera a energia

(ATP) necessária para funções vitais aos microorganismos. As bactérias aeróbicas

utilizam oxigênio como aceptor de elétrons, produzindo gás carbônico e água, e as

bactérias anaeróbicas utilizam outros compostos, como nitrato (

−3

NO ), íon Fe (

III

) e

sulfato (

−2

SO ), produzindo metano e água.

O metabolismo aeróbico corresponde ao mecanismo mais favorecido

energeticamente pelos microorganismos que oxidam compostos orgânicos.

Conseqüentemente, o oxigênio é preferencialmente utilizado sobre os aceptores de

elétrons anaeróbicos, pois proporciona mais energia à comunidade microbiana

resultando taxas mais rápidas de degradação do poluente. Dentre os aceptores de

elétrons das reações anaeróbicas, o nitrato é um dos íons mais encontrados em

águas naturais, ocorrendo geralmente em baixos teores nas águas superficiais, mas

podendo atingir altas concentrações em águas subterrâneas (BORDEN et al., 1995).

As características físico-químicas e estruturais da molécula contaminante,

bem como as características físico-químicas do meio, tais como pH, temperatura,

disponibilidade de água, luz e aceptores de elétrons, apresentam significativa

influência na transformação e/ou quebra de um determinado composto.

Qualquer composto sofrerá biodegradação somente se houver uma enzima

ou um sistema enzimático capaz de catalisá-lo. Se uma molécula não for

decomposta em um determinado ambiente pode ser considerada persistente, mas

se resistir à biodegradação em vários e diferentes ambientes, então o composto é

conhecido como recalcitrante (MATHEUS, 1997).

Portanto, o termo biodegradação pode ser definido como um processo

metabólico que envolve a quebra completa de um composto orgânico em seus

componentes inorgânicos, referido comumente como mineralização. A

biotransformação, por sua vez, consiste na alteração química da estrutura molecular

do composto orgânico ou inorgânico, resultando em uma molécula com

características diferentes da original, em geral pela perda de uma propriedade

específica, porém com a complexidade inicial (WALTER & CRAWFORD, 1997 apud

MONTENEGRO, 2001).

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Capítulo 3

Os estudos sobre a biodegradação de compostos tóxicos vêm sendo

realizados intensamente por vários pesquisadores. A biodegradação dos compostos

BTEX tem sido extensamente estudada, tanto no solo e águas subterrâneas

(MORGAN et al., 1993; WILLIAMS et al., 1997; MEIER-LOHR et al., 1998; TSAO et

al., 1998; ESSAID et al., 2003; NAKHLA, 2003; RICHNOW et al., 2003; KOUSSIS et

al., 2003; MAK et al., 2006), quanto em biorreatores (CHOI et al., 1992; GOUDAR et

al., 2000; LU et al., 2000; MASON et al., 2000; deNARDI, 2002; SHIM et al., 2002;

WILSON et al., 2002; PRUDEN et al., 2003; GUSMÃO et al., 2006; ZEIN et al., 2006;

deNARDI et al., 2007).

O conhecimento da cinética de crescimento microbiano em compostos tóxicos

e das relações entre múltiplos substratos presentes no meio são fundamentais para

a otimização e alcance de processos mais eficientes. Além disso, a identificação das

interações presentes na degradação de misturas de substratos pode contribuir para

o entendimento das razões que levam, por exemplo, um composto BTEX resistir à

biodegradação, enquanto outros são mais facilmente consumidos.

Assim, a modelagem da cinética de biodegradação destes compostos

possibilita o estudo da influência dos parâmetros do processo no crescimento da

biomassa e consumo dos substratos, além da formação de produtos, sendo

importante para a compreensão da fisiologia microbiana, bem como mecanismos de

controle interno.

3.1. Modelagem e Avaliação da Biodegradação dos Compostos BTEX

Os primeiros relatos sobre a biodegradação dos compostos BTEX envolviam

apenas o benzeno, o tolueno e um dos isômeros do xileno.

ARVIN et al. (1989) relataram a biodegradação aeróbica do benzeno, na

presença de outros compostos aromáticos, utilizando duas associações

microbianas. A biodegradação do benzeno foi estimulada pela presença de ambos

os substratos, tolueno e orto-xileno, em mistura binária. Entretanto, quando tolueno

e orto-xileno estiveram juntamente presentes com benzeno, um efeito contrário foi

observado. As principais razões que levam a estes efeitos de interação (sinergéticos

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

e/ou antagônicos) durante a biodegradação dos compostos BTEX podem ser

atribuídas a inibição competitiva (CHANG et al., 1993; OH et al., 1994; BIELEFELDT

& STENSEL, 1999a,b), toxidade (HAIGLER et al., 1992) e formação de

intermediários tóxicos por enzimas não específicas (WANG & LOH, 1999), além de

indução enzimática (DEEB et al., 2001) e repressão catabólica (NARANG, 2006).

ALVAREZ & VOGEL (1991) mediram as taxas de biodegradação dos

compostos benzeno, tolueno e para-xileno, individualmente e em misturas binária e

ternária, utilizando duas culturas puras de bactérias (Pseudomonas sp. cepa CFS-

215 e Arthrobacter sp. cepa HCB) e uma mistura de culturas, e observaram casos de

não-interação, inibição competitiva e cometabolismo. No entanto, os autores não

modelaram estes efeitos interativos. Em mistura de culturas, a presença do tolueno

intensificou a taxa degradação do para-xileno, porém, diminuiu drasticamente

quando o tolueno foi completamente degradado. Este fenômeno é explicado pelo

processo de degradação cometabólica do para-xileno. Em Pseudomonas, a

presença do tolueno foi fundamental para a degradação do para-xileno e intensificou

a degradação do benzeno. Logo, o crescimento de Pseudomonas sp. CFS-215 é

melhor em tolueno, e sua presença ajuda na proliferação da bactéria, levando a um

maior número de microorganismos capazes de degradar o benzeno e para-xileno. É

possível também que o tolueno tenha provocado uma indução enzimática, sugerindo

que Pseudomonas sp. cepa CFS-215 pode utilizar a mesma enzima (por ex.: enzima

tolueno dioxigenase) para catalisar a degradação do tolueno e do benzeno. A

degradação do tolueno ocorreu mais rapidamente quando esteve sozinho do que

quando esteve junto com benzeno e/ou para-xileno, sugerindo a hipótese de que

estes substratos utilizam-se da mesma enzima, isto é, da mesma rota metabólica, e

assim ocorram efeitos de inibição competitiva. Por outro lado, Arthrobacter foi

incapaz de degradar tolueno e para-xileno, individualmente e em misturas. A

degradação destes compostos somente ocorreu na presença do benzeno, sugerindo

que o cometabolismo seja responsável por este efeito benéfico. Já a degradação do

benzeno foi afetada negativamente pela presença do tolueno e/ou para-xileno,

sugerindo que efeitos de inibição competitiva tenham ocorrido.

O fenômeno do cometabolismo ocorre quando a presença de um substrato

mais facilmente metabolizável, similar ao composto resistente à biodegradação,

inicia o crescimento do microorganismo e promove a indução de enzimas que

facilitam a degradação do substrato resistente. O cometabolismo é resultante da

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

inespecificidade de alguns complexos enzimáticos, e ocorre sem que exista,

necessariamente, analogia estrutural entre a enzima induzida e o poluente

(VENKATARAMANI, 1985; WANG & LOH, 2000).

CHANG et al. (1993) avaliaram os parâmetros cinéticos e estequiométricos de

Monod (

máx

, Ks e

Υ ) na biodegradação do benzeno, tolueno e para-xileno, por

duas culturas puras de Pseudomonas B1 e X1. Os experimentos conduzidos com

cada substrato individualmente, possibilitaram a avaliação da cinética de

degradação e medição dos parâmetros (

máx

, Ks e

Υ ). Os resultados mostraram

que Pseudomonas B1 utiliza o benzeno e o tolueno, mas não o para-xileno, e

Pseudomonas X1 é capaz de degradar o tolueno e o para-xileno, mas não o

benzeno, sugerindo que P. B1 utiliza o caminho TOD (enzima tolueno dioxigenase),

enquanto P. X1 utiliza o caminho TOL (enzima tolueno mono-oxigenase). Os autores

realizaram a modelagem do processo, predizendo os efeitos de inibição competitiva

(BAILEY & OLLIS, 1986) entre dois substratos, dada pela equação 3.1. Observaram

que a presença do tolueno resultou inibição competitiva do benzeno e degradação

cometabólica do para-xileno. As taxas de biodegradação da mistura benzeno-

tolueno foram muito menores as respectivas taxas de biodegradação individual. Os

valores das constantes de inibição do benzeno (

Ki ) e tolueno (

Ki ) foram

determinados pelo ajuste do modelo, onde verificaram serem equivalentes aos

valores das constantes de saturação (

Ks e

Ks ), respectivamente.

sbx

bmáx

SKs

−=

(3.1)

Sendo:

máx

taxa máxima de crescimento específico no benzeno;

constante de saturação do benzeno;

constante de inibição do tolueno;

sbx /

coeficiente de rendimento no benzeno;

concentração de células;

concentração do benzeno;

concentração do tolueno.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Assim, nas condições experimentais avaliadas por CHANG et al. (1993) os

parâmetros cinéticos do modelo de inibição competitiva podem ser obtidos a partir

de experimentos da biodegradação individual dos substratos.

A continuação desta linha de pesquisa envolvendo três substratos foi feita por

OH et al. (1994). Os autores estudaram os efeitos de interação entre benzeno,

tolueno e para-xileno, utilizando uma associação microbiana e uma cultura pura de

Pseudomonas putida O1. Além disso, conduziram os experimentos para avaliar as

taxas de biodegradação de cada substrato individualmente e em misturas, a fim de

obter a diferença quantitativa da fisiologia microbiana entre os dois casos. Os

autores determinaram os valores dos parâmetros de Monod (

máx

, Ks e

Υ ) para a

biodegradação do benzeno; utilizaram o modelo de Andrews no ajuste aos dados da

biodegradação do tolueno e mostraram que o para-xileno não pôde ser utilizado

como substrato por nenhuma das culturas. A biodegradação parcial do para-xileno

ocorreu somente na presença do benzeno ou tolueno, sugerindo o fenômeno de

cometabolismo. Os experimentos em misturas de substratos foram realizados com a

mistura binária de benzeno-tolueno, e um modelo de inibição (BAILEY & OLLIS,

1986), dado pela equação 3.2, ajustou-se aos dados experimentais, resultando duas

constantes de inibição (

K e

K ). Neste caso, as taxas de biodegradação da

mistura de substratos, não puderam ser avaliadas por meio de parâmetros cinéticos

da biodegradação dos compostos individuais. Os parâmetros de inibição entre os

dois substratos foram determinados a partir de um modelo de regressão não-linear,

e os resultados mostraram que

K e

K são diferentes das razões

respectivamente. Logo, o modelo de inibição adotado por OH et al. (1994) é

diferente do modelo de inibição utilizado por CHANG et al. (1993). Portanto, seus

parâmetros cinéticos não podem ser obtidos por meio dos experimentos da

biodegradação individual dos substratos.

sbxtbtbb

máx

SKKsS

Υ++

−=

(3.2)

Sendo:

máx

taxa máxima de crescimento específico no benzeno;

constante de saturação do benzeno;

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

constante de inibição do benzeno sobre o tolueno;

concentração de células;

concentração do benzeno;

concentração do tolueno;

sbx /

coeficiente de rendimento no benzeno.

BIELEFELDT & STENSEL (1999a) foram os primeiros a relatarem a avaliação

quantitativa da biodegradação de uma mistura de cinco substratos (BTEoXpX). Os

experimentos foram conduzidos com mistura de culturas em testes batelada para

determinar como a presença de múltiplos substratos poderia afetar a fisiologia

microbiana, e consequentemente às taxas de biodegradação quando comparados

às taxas de biodegradação dos substratos individuais. Deste modo, a cinética de

degradação de compostos individuais foi comparada à cinética de degradação de

compostos múltiplos. As taxas de biodegradação dos substratos benzeno, tolueno,

etilbenzeno, orto-para-xilenos em misturas foram preditas através do modelo de

inibição competitiva (BAILEY & OLLIS, 1986), e os autores concluíram que

possivelmente efeitos de inibição competitiva na mistura dos cinco substratos

estiveram presentes. As taxas de degradação dos compostos individuais foram

preditas através do modelo de Monod e os parâmetros cinéticos (

máx

, Ks e

Υ )

foram determinados para cada composto. Os resultados das taxas de degradação

mostraram que a cultura degradou os componentes mais rapidamente quando

estiveram presentes sozinhos do que quando estiveram presentes em misturas. Os

autores relacionaram o modelo de Monod e o modelo de inibição competitiva

determinando um modelo simplificado, assumindo que a constante de inibição de

cada substrato é equivalente a sua constante de saturação ( KsKi

≈

), e que a

concentração inicial do substrato é muito maior que Ks . Este modelo simplificado

relaciona a taxa de biodegradação de um componente da mistura com a taxa de

biodegradação individual do mesmo, por meio da equação 3.3.

∑

BTEX

mistura

dtdS

(3.3)

Assim, a taxa de biodegradação de um composto na presença de múltiplos

substratos, nas condições avaliadas por BIELEFELDT & STENSEL (1999a), pode

ser apresentada com parâmetros cinéticos da biodegradação individual dos

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

substratos e na proporção de sua concentração na mistura. O estudo mostra que

tanto o modelo simplificado quanto o modelo de inibição competitiva se ajustou bem

aos dados experimentais do processo de biodegradação dos compostos BTEX.

Tendo em vista que a biorremediação de lugares contaminados por gasolina

requer a degradação microbiana de misturas complexas, é importante compreender

os efeitos de intensificação ou inibição causada pela presença concorrente de

múltiplos substratos. Desta forma, a biodegradação dos compostos BTEX também

tem sido largamente investigada na presença de outros compostos aromáticos como

o fenol. A biodegradação da mistura destes compostos aromáticos foi investigada

por ROGERS & REARDON (2000), utilizando Burkholderia species JS150. Os

autores observaram a utilização simultânea de ambos os substratos, fenol e tolueno,

com o tolueno o primeiro a ser completamente degradado. O tolueno inibiu a

biodegradação do fenol, enquanto o fenol apresentou pouco efeito na taxa deçóKmmds –2.cp0.mret,

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

benzoato, em mistura binária e ternária, são utilizados simultaneamente. Fenol e

benzoato utilizam-se da mesma rota metabólica, e acetato é um dos intermediários

formados durante o metabolismo. Os resultados mostraram uma inibição recíproca

entre fenol e acetato, e a biodegradação simultânea do fenol e benzoato, em que

nenhum efeito inibitório foi observado. Em mistura ternária, todos os compostos

foram utilizados simultaneamente e nenhum comportamento diáuxico foi observado.

Recentemente, ABUHAMED et al. (2004) investigaram a possibilidade da

biodegradação do benzeno, tolueno e fenol, em elevadas concentrações iniciais, e

estudaram a cinética de crescimento de Pseudomonas putida F1 (ATCC700007)

durante a biodegradação aeróbica individual dos substratos, bem como em misturas,

determinando as interações entre os substratos. Para a biodegradação de um único

substrato, o modelo de Andrews foi usado para descrever a taxa de crescimento

específico, possibilitando a determinação dos parâmetros cinéticos (

máx

, Ks e Ki ).

Para as misturas benzeno-tolueno, benzeno-fenol e tolueno-fenol, um modelo de

soma cinética, dado pela equação 3.4, similar ao modelo proposto por YOON et al.

(1977) apud REARDON et al. (2000), foi usado e os parâmetros de interação entre

os substratos (

I ) foram determinados.

112

221

SKs

máxmáx

+++

(3.4)

Sendo:

taxa de crescimento específico;

1máx

2máx

taxa máxima de crescimento específico nos substratos 1 e 2;

S ,

concentração dos substratos 1 e 2;

Ks ,

constante de saturação dos substratos 1 e 2;

grau de inibição do substrato 2 sobre o substrato 1;

grau de inibição do substrato 1 sobre o substrato 2.

O parâmetro

I indica o grau que o substrato “

” afeta a biodegradação do

substrato “

”. Os parâmetros cinéticos (

máx

, Ks e Ki ) utilizados nesta equação são

os mesmos obtidos a partir do modelo de Andrews para biodegradação individual do

substrato. Os resultados mostraram que o tolueno inibiu a biodegradação do

benzeno (OH et al., 1994), e o fenol inibiu a biodegradação do tolueno e benzeno.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Por outro lado, a presença do benzeno ou tolueno intensificou a biodegradação do

fenol. As células de Pseudomonas putida F1 foram adaptadas em 30 mg L

-1

tolueno ou benzeno. Observou-se que a biodegradação do benzeno ou tolueno, em

concentrações de 15, 30 e 90 mg L

-1

, ocorreu mais rapidamente em células

adaptadas do que em células não adaptadas. O tempo de biodegradação do

benzeno, por exemplo, decresceu de 24 horas para 6 horas. Nenhum efeito

significativo foi observado na biodegradação do fenol, utilizando células adaptadas

no fenol. Contudo, a utilização de células adaptadas no benzeno ou tolueno diminuiu

o tempo de degradação de 50 mg L

-1

de fenol, de 90 para 18 horas.

O crescimento de Pseudomonas putida F1 na presença de benzeno, tolueno

e fenol foi estudado por REARDON et al. (2000). Os autores avaliaram a cinética de

crescimento microbiano utilizando os substratos individuais, bem como em misturas

binárias e ternária. Na mistura tolueno-fenol, o tolueno inibiu fortemente a

biodegradação do fenol, e o fenol teve pouco efeito sobre a biodegradação do

tolueno. O tolueno foi consumido antes que o fenol, e a biodegradação do fenol não

começou até que o tolueno estivesse praticamente esgotado. Também, em mistura

tolueno-benzeno, a presença do tolueno inibiu a biodegradação do segundo

substrato. Na biodegradação da mistura benzeno-fenol, benzeno foi primeiramente

utilizado e o consumo do fenol não começou antes que a concentração do benzeno

atingisse valores próximos de zero. Finalmente, em mistura ternária, o tolueno foi o

primeiro substrato a ser consumido e esgotado, e a biodegradação do benzeno

iniciou-se mais tarde. O consumo significativo do fenol não começou antes que a

concentração do tolueno estivesse aproximadamente igual a zero e a concentração

do benzeno estivesse baixa. Este é um exemplo que mostra claramente os

mecanismos regulatórios internos de utilização dos substratos, nos quais a

repressão catabólica seria o mecanismo mais provável envolvido neste processo.

Mas, apesar das aparências, este não é um caso de repressão catabólica, pois P.

putida F1 utiliza o mesmo caminho (TOD) para metabolizar os substratos BTF. Este

é um dos poucos trabalhos que apresentam o desempenho de modelos não-

estruturados em descrever a cinética de crescimento microbiano. Os autores

mostraram que os modelos de Monod e Andrews foram adequados para descrever

os dados experimentais de crescimento da biomassa e utilização dos substratos

individualmente. Baseados nos parâmetros cinéticos estimados a partir da

biodegradação individual dos compostos, os autores avaliaram diferentes modelos

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

matemáticos para descrever a biodegradação dos múltiplos substratos, e concluíram

que o modelo SKIP representa adequadamente a biodegradação das misturas

binárias e ternária dos compostos BTF.

HAMED et al. (2003) investigaram as interações entre os substratos durante a

biodegradação aeróbica do benzeno, tolueno e fenol utilizando Pseudomonas putida

F1 ATCC (700007). Os testes foram conduzidos em reator batelada e mostraram

que os microorganismos foram capazes de consumir completamente todos os

substratos em concentrações elevadas. Os resultados mostraram que efeitos de

inibição pelo substrato ocorreram acima de 30 mg L

-1

de benzeno, 28 mg L

-1

tolueno e 50 mg L

-1

de fenol, quando estes foram utilizados individualmente. Os

substratos benzeno e tolueno, quando presentes em mistura, foram utilizados

simultaneamente, sendo que o tolueno inibiu a biodegradação do benzeno. Já

durante a biodegradação das misturas binárias benzeno-fenol e tolueno-fenol os

substratos, em ambos os casos, foram utilizados sequencialmente, sendo que o

fenol foi o segundo substrato a ser consumido. Por fim, a biodegradação da mistura

benzeno-tolueno-fenol mostrou que o benzeno e o tolueno foram consumidos mais

rapidamente do que o fenol. A presença do benzeno e/ou fenol não influenciou

significativamente no tempo de biodegradação do tolueno. E a presença do tolueno

e/ou benzeno afetou a biodegradação do fenol. Entretanto, nenhum dos

comportamentos revelados foi representado matematicamente, até o presente.

BIELEFELDT & STENSEL (1999b) investigaram a biodegradação aeróbica do

tricloroetano e de compostos aromáticos, como os compostos BTEX, por uma

associação de microorganismos enriquecida no fenol. Todos os compostos BTEX

foram utilizados simultaneamente, mas a uma taxa menor do que as taxas de

biodegradação individual dos compostos. Os efeitos dos múltiplos substratos foram

modelados pelo modelo de inibição competitiva (YOON et al., 1977 apud BAILEY &

OLLIS, 1986), representando satisfatoriamente a biodegradação dos compostos

BTEoXpX em mistura, porém baseado nos parâmetros cinéticos da biodegradação

individual dos compostos.

Outra linha de pesquisa fundamental para a busca de tecnologias eficientes

no tratamento e preservação do meio ambiente consiste na obtenção de

informações e compreensão dos efeitos da biodegradação dos compostos tóxicos

BTEX na presença de MTBE (metil terc butil éter). A condução de experimentos e o

projeto de biorreatores que operam com ambos os compostos (NA et al., 2002;

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

SEDRAN, 2004; LIN et al., 2007) não é uma tarefa fácil devido à complexidade do

sistema, mas é crucial para o desenvolvimento de melhores estratégias de

tratamento e tem sido investigado em diversos estudos.

Geralmente, os compostos MTBE e BTEX coexistem em águas subterrâneas

contaminadas por gasolina e elevadas concentrações de MTBE podem impedir

potencialmente a biodegradação dos compostos BTEX. Por isso, é importante

compreender se a presença do MTBE afeta ou não as taxas de biodegradação dos

compostos BTEX, e se a presença dos compostos BTEX provoca repressão nas

taxas de biodegradação do MTBE. Poucos estudos têm investigado os efeitos de

interações entre as misturas de MTBE e BTEX. Na maioria destes estudos, MTBE

não apresentou efeitos negativos nas taxas de biodegradação do BTEX por culturas

incapazes de crescer no MTBE, sugerindo que a presença do MTBE não afeta a

viabilidade das culturas degradadoras do BTEX (SALANITRO et al., 1999; DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 2000). Por outro lado, as taxas de biodegradação do MTBE

foram afetadas pela presença de compostos BTEX (EWEIS et al., 1998; CHURCH et

al., 1999). A utilização de culturas puras pode ser útil na caracterização dos efeitos

de interação, causados pela presença concorrente de múltiplos substratos. No

entanto, uma cultura pura capaz de crescer em MTBE e BTEX ainda não foi

encontrada.

DEEB & ALVAREZ-COHEN (2000) quantificaram o impacto que interações

entre os substratos BTEX provocam em suas taxas de biodegradação, investigando,

além disso, os efeitos da presença do MTBE. Durante a biodegradação foram

realizadas a caracterização e a quantificação das interações positivas e negativas,

em misturas dos compostos BTEX, e em misturas entre os compostos BTEX e

MTBE. Os experimentos foram conduzidos utilizando-se uma mistura de cultura

derivada de um aqüífero contaminado por gasolina, e duas culturas puras

identificadas como Rhodococcus rhodochrous e Rhodococcus bronchialis. As três

culturas foram capazes de biotransformar completamente os compostos BTEX

individualmente e em misturas, em um grande intervalo de concentrações. Em uma

concentração de 40 mg L

-1

, a biodegradação de cada composto, individualmente,

seguiu a ordem: tolueno, benzeno, etilbenzeno, orto-para-meta-xileno. Durante a

biodegradação das misturas binárias dos compostos BTEX, a presença do

etilbenzeno provocou um efeito inibitório nas biodegradações do benzeno, tolueno e

xilenos, ao passo que, a presença desses compostos em mistura binária com o

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

etilbenzeno proporcionou efeitos desprezíveis na biodegradação do etilbenzeno

(DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999). Os autores utilizaram o modelo cinético de

Lineweaver-Burk, na tentativa precoce de caracterizar os efeitos inibitórios do

etilbenzeno, e revelaram uma mistura de inibição competitiva e não-competitiva. Os

autores sugerem que o tolueno e o etilbenzeno são degradados pelo mesmo

caminho metabólico, ou seja, Rhodococcus sp. RR1 utiliza-se da mesma enzima

para metabolizar ambos os substratos; o mesmo resultado encontrado pelos autores

em 1999. A biodegradação cometabólica dos xilenos, neste estudo, é consistente

com os relatos de ALVAREZ & VOGEL (1991), CHANG et al. (1993) e OH et al.

(1994). Além disso, os autores investigaram a mineralização dos compostos BTEX a

. Apesar da presença do etilbenzeno afetar negativamente a biodegradação do

BTX, isto não ocorreu durante a mineralização. Os autores concluíram que a mistura

de culturas é mais eficiente do que as culturas puras na mineralização dos

compostos BTEX, e isto pode ser atribuída à presença de diferentes espécies

microbianas, possibilitando a utilização de diversos caminhos metabólicos, e aos

efeitos de interações entre as espécies. Quanto à presença do MTBE, nenhuma das

culturas foi capaz de crescer no MTBE. Os autores concluíram que este composto

não afetou as taxas de biodegradação dos compostos BTEX.

Com a finalidade de determinar se a presença do MTBE afeta negativamente

as taxas de biodegradação dos compostos BTEX, DEEB et al. (2001) avaliaram as

interações entre os substratos MTBE e BTEX durante uma biotransformação

aeróbica por uma cultura pura em reator batelada. A cultura pura, designada PM1,

membro da Leptothrix do grupo β-Proteobacteria, foi capaz de crescer no MTBE

como única fonte de carbono e energia e de mineralizar o composto MTBE a CO

. A

biodegradação do MTBE foi avaliada quando esteve presente sozinho e quando

esteve em mistura binária com cada um dos compostos BTEX. Observou-se que a

presença do MTBE intensifica a taxa de biodegradação do benzeno (20 mg L

-1

provavelmente por indução enzimática. Para provar a hipótese de que MTBE

promove a biodegradação do benzeno por geração de energia que acelera esta

indução enzimática, foram conduzidos as biodegradações da mistura benzeno-

piruvato e benzeno-etanol. Assim, o mesmo efeito estimulatório encontrado pela

presença do MTBE, também foi observado quando o benzeno esteve presente em

mistura binária, em concentrações de 20 mg L

-1

, com piruvato ou etanol. Portanto,

isto sugere que a presença de um “gerador de energia” foi o fator que governou a

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

intensificação de enzimas necessárias à biodegradação do benzeno. Seguindo a

biodegradação do benzeno em mistura com piruvato, uma adição de tolueno foi

degradada sem fase de adaptação, sugerindo que o benzeno e tolueno são

metabolizados pelo mesmo caminho. Por outro lado, a presença do benzeno

retardou a biodegradação do MTBE, em uma concentração de 20 mg L

-1

. A

biodegradação do MTBE também foi severamente inibida pela presença do tolueno,

etilbenzeno, meta-xileno ou para-xileno. Logo, os resultados encontrados pelos

autores mostram que o BTEX interfere diretamente a biodegradação do MTBE,

utilizando PM1, sugerindo inibição enzimática como provável causa, ao passo que a

presença do MTBE promove a intensificação da biodegradação dos compostos

BTEX, provavelmente por indução enzimática.

PRUDEN (2002) investigou o efeito do BTEX na biodegradação do MTBE e

TBA (terc butil álcool), comparando as taxas de biodegradação do MTBE juntamente

com BTEX, às taxas de biodegradação do MTBE como única fonte de carbono. Os

autores utilizaram uma mistura de cultura enriquecida no MTBE e BTEX. Sob regime

contínuo, todos os compostos foram utilizados simultaneamente. Em operação

batelada, a presença do BTEX não teve efeito significativo na biodegradação do

MTBE, mas teve um leve efeito na biodegradação do TBA. Na presença

insignificante do BTEX, o TBA foi utilizado em uma taxa mais rápida do que o MTBE.

Os efeitos dos múltiplos substratos BTEX na biodegradação do MTBE

também foram investigados por PRUDEN & SUIDAN (2004), SEDRAN et al. (2002)

e LIN et al. (2007). PRUDEN & SUIDAN (2004) não encontraram nenhum efeito

negativo da presença dos compostos BTEX na taxa de biodegradação do MTBE,

utilizando uma cultura pura, designada UC1. A bactéria UC1 apresentou alta

similaridade (99%) com a PM1, ou seja, também do grupo da β-Proteobacteria. Por

outro lado, LIN et al. (2007) encontraram significativa inibição dos compostos BTEX

sobre o MTBE, utilizando Pseudomonas aeruginosa, representando os efeitos por

meio dos modelos de inibição competitiva e não-competitiva.

O principal motivo da adição de compostos oxigenados na gasolina, como

MTBE e etanol, está relacionada ao aumento da octanagem do motor, isto é,

aumento da resistência à auto-ignição, além de diminuir a emissão de monóxido de

carbono na atmosfera (FERNANDES, 1997). Entretanto, a ocorrência de um

derramamento de gasolina aditivada no ambiente pode agravar o impacto ambiental

devido ao comportamento de co-solvência do etanol (FERNANDES & CORSEUIL,

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

1996; FERNANDES, 1997). O efeito da co-solvência do etanol, que representa a

capacidade do etanol em aumentar a solubilidade da gasolina em água (CORSEUIL

& FERNANDES, 1999), aumenta a solubilização dos compostos BTEX em água,

provocando consequentemente aumento da velocidade de deslocamento das

plumas de contaminação em águas subterrâneas. CORSEUIL & FERNANDES

(1999) constataram que frações de etanol na fase aquosa na faixa de 10%

aumentam em 30% a massa total dos compostos BTX, sendo que o efeito foi maior

para o xileno, composto menos solúvel em água dentre os BTX.

A biodegradação aeróbica e anaeróbica do BTEX, com relação à presença de

etanol, tem sido bastante investigada no Brasil (CORSEUIL & ALVAREZ, 1996b;

CORSEUIL et al., 1998; CORSEUIL & FERNANDES, 1999; LOVANH et al., 2002;

KAIPPER, 2003; SCHNEIDER et al., 2005; NUNES & CORSEUIL, 2005).

Frequentemente, os compostos BTEX são biodegradados por enzimas

induzíveis, as quais podem ser repreendidas quando substratos facilmente

degradáveis estão presentes em concentrações elevadas (DUETZ et al., 1994;

DUETZ et al., 1996), exercendo provavelmente um efeito diáuxico que inibe a

diversidade metabólica dos microorganismos, impossibilitando, por repressão

catabólica, a biodegradação do BTEX.

Os estudos de CORSEUIL et al. (1998) demonstraram que, em condições

aeróbias, o etanol retarda a biodegradação dos compostos BTEX, devido à

utilização preferencial de etanol pelos microorganismos. MALAMUD et al. (2005)

também observaram que o etanol foi o primeiro contaminante a ser biodegradado e

os compostos BTEX apresentaram decréscimo de massa significativo somente após

o desaparecimento do etanol, evidenciando a biodegradação preferencial do etanol

em relação aos compostos BTEX.

No entanto, NUNES & CORSEUIL (2005) avaliaram a biodegradação

anaeróbica da gasolina, aditivada com 23 a 25% de álcool, e observaram aspectos

positivos da presença do etanol. A redução da massa dos compostos BTEX e etanol

foram avaliados como conseqüência do uso de receptores de elétrons (oxigênio

dissolvido) e o aparecimento de subprodutos metabólicos (acetato, íon ferro

metano). Os autores constataram que as massas de metano e íon ferro foram muito

superiores àquela do oxigênio dissolvido, e a biomassa remanescente, gerada

durante a biodegradação anaeróbica do etanol, passou a utilizar os compostos

BTEX como substrato principal, intensificando suas taxas de biodegradação. O

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

mesmo foi encontrado por SCHNEIDER et al. (2005), os quais observaram que, em

seis anos de monitoramento de uma área contaminada por gasolina, as massas do

benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos foram reduzidas em 99, 96, 76 e 80%,

respectivamente. Entretanto, mesmo havendo uma remoção significativa da massa

de poluentes da fonte, a extensão das plumas não foi reduzida na mesma

proporção. Isto indica que o etanol inibe a biodc0çóKmmdd–2ógp0.mKãKóKmmd –2..p0.mçdm–c0ffKç.da–2c0çóKmmdssa–m0.xpcód –pKK0çcpJê( 2óKãKdo–2c0çóKmmdd–2c0ógp0.mKãKóKmmKfçdo–2c0çóKmmd –2m0çóKmmde–2c0çóKmmd –2.ãp0.mça9

prop uer f.mmmd,–2p0.mKãX mtei nte hê( 2cóã0fça2pf0móaê” %dd–m0.xpcódmdr–c0ffKç.da–xxm0.xpJêçóKmmdn–m0.çdp–2c0çóxppdl–p0.mKãKdu–2c0çóKmmdm–c0ffK–2.ãp0.mça9mtumçd9–2c0çóKmmd6–2c0çódp–2códt–2p0.mKãpÖ foenacde–2c0çóKmmds –2ó.p0.mçd0çóKmmdt–2p0.t–2p0.mKãKdo–2c0çóKmmdmmKxde–2c0m0mçdo–2c00çóKmmçãmdsóKmmds –2mp0.mçdd–m0.xpcóçóKmmd2p0.dd–m0.xpcódu–m0.xpcód.mKãKdKfóKd –2Kp0.x0óKãKd –2.ãp0.óKmmmdc0çóKmmdd–2ógp0.p0.mçdm–c0ff.mKãKd –2xp0.mçde–2c0çóKm-mKãKd –2smds –2ó.p0.mçd0cn–2c0çóKmmdo–2c0çóKmmdl–p0.mKãKd –2.ãp0.m0cn–2c0ç–2.ãp0.mçde–2c0çóKmmdt–.c0ffKçde–2c0çó.mKãKd –2sKmmdd–m0.xpcódu–cÖ–2ófp0.mçdo–2c0çóKmmdn–m0.sóKmmdo–2c0çóKmmdl–p0.Kç.do–2c0çóKãKdH–p0.mKãKdN–p0.mKãKdEçde–2c0çó.mKãKd –2mmdo–2c0çóxppd códu–cÖ–2ófpc0çóxppdl–pêd –2pxp0.mçd7–2c0çóKmmd6p%db–2c0çóKmmde–2cça9–m0.xpcó–m0.xpcódu–2 –2Kp0.mçdu–m0.xpcóãKdN–p0.2.p0–m0.xpcódm–2m00cn–2c0çóKmmdo–2c0çóKmmdl–p0.mKãKd –2.ãp0.m0pin6p%db–2c0ç2Kp0.mf.aêÜ d.ãp0.Kdb–2c0çóKmmde–2c0çóKmmd –2de–2cbÖ–2.ãp0.mça9ssas um.t

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

& ALVAREZ-COHEN (1999) focaram seus estudos na caracterização dos efeitos do

etilbenzeno na biodegradação do benzeno, tolueno e isômeros do xileno. Os

experimentos foram conduzidos para identificar as interações entre os substratos,

causadas pela presença concorrente de múltiplos compostos BTEX, durante a

biodegradação aeróbica por duas associações microbianas e por uma cultura pura

identificada como Rhodococcus rhodochrous. Além disso, os estudos também foram

conduzidos para determinar a temperatura ótima para a atividade microbiana e

degradação dos compostos BTEX. As três culturas foram capazes de utilizar todos

os compostos individualmente e em misturas. Os autores observaram interações

negativas e positivas, e sugeriram a presença de não-interação, inibição competitiva,

inibição não-competitiva, estimulação e cometabolismo. As taxas de biodegradação

individuais dos seis compostos (BTEo-p-mX), foram comparadas às taxas de

biodegradação em misturas binárias e ternária. Individualmente, tolueno foi mais

rapidamente consumido, seguido pelo benzeno, etilbenzeno e, finalmente, os

isômeros do xileno, todos em concentração de 20 mg L

-1

. Com a associação

microbiana, as taxas de biodegradação do benzeno e tolueno, em mistura binária

com o-xileno, em concentrações de 20 mg L

-1

, foram levemente intensificadas pela

presença do o-xileno; efeito contrário aos relatos de que xilenos são fortes inibidores

de benzeno e tolueno (ALVAREZ & VOGEL, 1991; OH et al., 1994). Por outro lado,

a presença do benzeno, tolueno ou etilbenzeno afetaram negativamente as taxas de

biodegradação do o-xileno, em concentração de 40 mg L

-1

. Na degradação dos

múltiplos substratos, em concentração total de 20 mg L

-1

, etilbenzeno foi consumido

mais rapidamente, seguido pelo tolueno, benzeno e xilenos. A avaliação das taxas

de biodegradação, de todas as possíveis combinações de misturas BTEX, revelou

que, em cada uma destas misturas, os isômeros do xileno foram sempre os últimos

a serem consumidos, ao passo que o etilbenzeno foi o primeiro. Assim, os autores

concluíram que o etilbenzeno é o inibidor mais potente em todas as suas possíveis

misturas, tanto em associação microbiana quanto em R. rhodochrous, e os isômeros

do xileno são cometabolicamente degradados (ALVAREZ & VOGEL, 1991, CHANG

et al., 1993, OH et al., 1994). As taxas de biodegradação do tolueno, em diferentes

concentrações de etilbenzeno, (8, 15, 23 e 30 mg L

-1

com associação microbiana; 5,

10 e 15 mg L

-1

com R. rhodochrous), sugeriram que uma combinação de inibição

competitiva e não-competitiva ocorreu entre ambos os substratos. Outro efeito de

inibição observado inclui a retardação da biodegradação do benzeno e do tolueno na

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

presença do tolueno e do benzeno, respectivamente. Contudo, os autores não

modelaram estes efeitos de inibição encontrados durante os experimentos.

Como apresentado no início deste capítulo, a modelagem da biodegradação

de compostos tóxicos pode seguir modelos cinéticos simples como Monod e

Andrews. Mas, segundo BALOO & RAMKRISHNA (1991a,b) o modelo de Monod

descreve bem o crescimento de microorganismos e a taxa de consumo de um único

substrato sob condições estacionárias, e falha ao descrever o estado transiente do

processo. Segundo os autores, o principal motivo da existência desta diferença é

causado pela regulação metabólica, na qual o controle de todas as reações e

funções microbianas em nível molecular não é incorporado na descrição do

crescimento microbiano.

Quando a biodegradação ocorre na presença de múltiplos substratos, a

descrição quantitativa dos efeitos biocinéticos de interações devem seguir modelos

mais elaborados, como os modelos de inibição acompetitiva, não-competitiva

(SEGEL, 1975 apud REARDON et al., 2000) e competitiva (YOON et al., 1977 apud

REARDON et al., 2000). YOON et al. (1977) também propuseram o modelo SKIP

(apud REARDON et al., 2000) que incorpora parâmetros de interação entre os

substratos, mas não qualifica o tipo de interação presente. Contudo, estes modelos

também falham ao descrever complexos mecanismos de regulação interna.

A modelagem cinética utilizando modelos não-estruturados, como os

clássicos modelos de Monod e Andrews e os modelos utilizados para descrever o

crescimento microbiano em múltiplos substratos (SEGEL, 1975; YOON et al., 1977),

parte da hipótese de que os dados experimentais são baseados somente na

fisiologia microbiana, e apesar de serem inadequados para descrever os

mecanismos complexos de regulação interna, são fundamentais para o

entendimento da cinética no nível da população microbiana.

Um dos fenômenos que deve ser considerado quando microorganismos

utilizam muitos substratos corresponde ao fenômeno diáuxico e os mecanismos

internos de controle envolvidos em nível molecular, como a repressão catabólica que

geralmente ocorre quando dois ou mais substratos estão sendo utilizados. O

fenômeno diáuxico pode envolver a utilização seqüencial ou simultânea dos

substratos presentes (TURNER & RAMKRISHNA, 1986; BALOO & RAMKRISHNA,

1991a,b; KROUMOV, 1999; PATNAIK, 2000, NARANG, 2006).

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Durante a utilização seqüencial das rotas metabólicas, caracterizada pelo

fenômeno diáuxico, um substrato pode inibir a biodegradação de outro por

toxicidade, repressão catabólica, inibição enzimática, depreciação de elétrons

receptores ou formação de intermediários metabólicos. Por outro lado, através da

utilização simultânea de rotas metabólicas, a eficiência de biodegradação é

intensificada em comparação às taxas de crescimento durante a biodegradação

individual dos substratos. Esta intensificação tem sido atribuída à promoção de

elevadas taxas de crescimento (KLEČKA & MAIER, 1988) e ocorre devido à indução

não-específica de enzimas para biodegradação de substratos similares ou a

convergência de rotas metabólicas para utilização de múltiplos substratos. Porém,

mesmo que os compostos sejam utilizados simultaneamente, algumas vezes eles

não são catabolizados pela mesma rota metabólica, necessitando compreender

quais outros mecanismos de regulação gênica estão envolvidos na biodegradação.

A repressão catabólica é o mecanismo que regula a utilização preferencial de

um substrato, ao invés de outros disponíveis (NARANG, 2006). Este fenômeno

ocorre quando fontes de carbono rapidamente metabolizáveis reprimem a expressão

de genes que codificam enzimas relacionadas ao metabolismo de outras fontes de

carbono.

Os mecanismos regulatórios, que causam as preferências microbianas por

determinado substrato e consumo destes sequencialmente e/ou simultaneamente,

foi aplicado por KROUMOV (1999), baseando-se na teoria operon lac de Jacob-

Monod, para desenvolver um modelo para utilização de dois substratos (celobiose e

xilose) por Ruminococcus albus. O modelo considera os mecanismos regulatórios do

processo de indução-repressão avaliando os caminhos metabólicos e as mudanças

de atividade na enzima chave, a qual é considerada como o passo de controle para

a utilização do substrato preferencial, neste caso a xilose. O autor discute em seu

trabalho os possíveis mecanismos pelos quais a celobiose afeta a utilização da

xilose. Em um dos casos, provavelmente a celobiose compete com a xilose, por

meio de inibição competitiva, pelo sítio ativo da enzima responsável pelo transporte

ou catabolismo destes açúcares. Por outro lado, o autor diz que a celobiose pode

reprimir a formação da enzima chave requerida para o catabolismo da xilose.

Segundo o autor, o aparecimento de uma segunda fase lag é manifestado pela

repressão da xilose, e, portanto o controle da utilização da xilose por repressão

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

catabólica, em nível molecular, é a hipótese mais provável para descrever o

comportamento da celobiose na utilização da xilose.

Segundo MONOD (1947) apud NARANG (2006), o crescimento diáuxico é

caracterizado pelo aparecimento de duas fases de crescimento exponencial

separados por uma fase de adaptação chamada de adaptação diáuxico. Durante o

crescimento diáuxico, o consumo do primeiro substrato é seguido por um período de

adaptação dos microorganismos ao segundo substrato.

Diversos modelos estruturados têm sugerido diferentes perspectivas de como

os microorganismos utilizam de maneira ótima suas fontes de energia, e são

desenvolvidos a fim de avaliar os mecanismos de regulação interna envolvidos no

crescimento microbiano em sistemas com múltiplos substratos. Desde 1982

diferentes modelos cibernéticos têm sido apresentados na literatura (KOMPALA et

al., 1984; KOMPALA et al., 1986; TURNER & RAMKRISHNA, 1988; RAMKRISHNA

et al., 1996; NARANG, 1997; JONES & KOMPALA, 1999; HAMILTON et al., 2005;

NARANG, 2006). Estes modelos cibernéticos avaliam a regulação genética de tais

sistemas, especialmente sistemas que apresentam crescimento diáuxico,

considerando os microorganismos como “optimal strategists”. Além disso, tais

modelos cibernéticos também têm sido desenvolvidos para simular a fase de

adaptação diáuxico (LIU et al., 1998; BRANDT et al., 2004; CASASÚS et al., 2005;

HAMILTON et al., 2005). O trabalho de Patnaik (2000) apresenta uma revisão do

desenvolvimento da modelagem cibernética.

KOMPALA et al. (1984) desenvolveram um modelo cibernético para o

crescimento de uma população microbiana em múltiplos substratos. O modelo,

baseado em equações de balanço para a enzima chave, substratos e biomassa, foi

capaz de simular o crescimento diáuxico, sugerindo que os microorganismos

maximizam suas taxas de crescimento total a cada instante. A enzima chave é a

enzima responsável pela utilização do substrato preterido e quando esta enzima não

é sintetizada significa que a informação da seqüência de aminoácidos que formam

esta enzima não pode ser lida em nível molecular e então, tem-se a repressão

catabólica. No entanto, o modelo apresentado pelos autores possui algumas

limitações, as quais puderam ser anuladas (KOMPALA et al., 1986) em trabalhos

subseqüentes.

TURNER & RAMKRISHNA (1988) utilizaram o modelo cibernético de

KOMPALA et al. (1984) de maneira modificada, para simular o crescimento de

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

microorganismos na presença de dois substratos (glucose e xilose). Os autores

observaram que, após um momento inicial transiente, apenas um único estágio

estacionário foi atingido. Então, a modificação foi feita pela incorporação, na

expressão da taxa da enzima chave, de um termo de contribuição de indução para a

síntese da enzima e outro termo de contribuição constitutiva. Desta forma, a

simulação mostrou a presença de duas fases estacionárias na concentração celular.

Isto aconteceu devido à presença de um número suficiente de enzimas, devido à

incorporação do termo de contribuição constitutiva, para consumir o substrato

adicional e com isto o novo estágio estacionário foi estabelecido.

CASASÚS et al. (2005) desenvolveram um modelo para simular o

crescimento diáuxico de bactéria desnitrificante. Os processos incluídos no modelo

são: o crescimento aeróbico de biomassa heterotrófica; o crescimento anaeróbio de

biomassa heterotrófica; a deterioração de biomassa; a taxa de síntese da enzima

oxigenase (associada com crescimento aeróbio); a taxa de síntese da enzima

reductase (associada com crescimento anaeróbio); e a deterioração das enzimas

oxigenase e reductase. O modelo apresentou o surgimento de duas fases de

crescimento exponencial separados por uma fase de adaptação. A diferença, neste

caso, foi o emprego da modelagem de crescimento diáuxico na presença de duas

condições diferentes de operação no mesmo sistema, uma aeróbica e outra

anaeróbica.

O trabalho de NARANG (2006) solidifica todas as definições apresentadas

sobre crescimento diáuxico e efeitos do mecanismo de repressão catabólica. O autor

define a fase de adaptação diáuxico como sendo o tempo necessário às células para

configurar as enzimas periféricas a níveis suficientemente altos para o substrato em

excesso e, após esta fase, haverá o consumo deste substrato. Segundo NARANG

(2006), o fenômeno de crescimento microbiano em múltiplos substratos é um

exemplo de mecanismos pelos quais as expressões de genes são controladas.

Além da presença de substratos concorrentes, também se deve considerar o

efeito de intermediários metabólicos produzidos, os quais podem prejudicar a

biodegradação dos contaminantes. Os subprodutos metabólicos podem ser tóxicos

aos microorganismos ou podem ser degradados preferencialmente aos

contaminantes. Avaliar a relação entre o acúmulo de subprodutos metabólicos e a

cinética de biodegradação é muito importante para o melhor entendimento do

processo. WANG & LOH (1999) desenvolveram e aplicaram com sucesso um

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

modelo incorporando o efeito de intermediários metabólicos na degradação do fenol,

utilizando cultura pura. Recentemente, NUHOGLU & YALCIN (2005) adaptaram e

aplicaram satisfatoriamente o modelo de WANG & LOH (1999) na degradação do

fenol, utilizando mistura de culturas, mostrando que em concentrações de fenol

maiores do que 100 mg L

-1

, o modelo de Andrews não se ajustou aos dados

experimentais.

Logo, a pesquisa na área da modelagem dos fenômenos de controle e

regulação interna de utilização de múltiplos substratos é uma tentativa de incorporar

o conhecimento sobre caminhos metabólicos aos balanços de componentes

mensuráveis no nível da população. Os primeiros modelos não-estruturados, como o

modelo de Monod, são tentativas de descrever a fisiologia microbiana no nível da

população, quando o substrato é limitante. No ambiente em que existem misturas de

vários substratos é fundamental compreender como ocorre a regulação gênica e a

adaptação dos microorganismos, as quais promovem uma seqüência de utilização

preferencial dos substratos.

Portanto, o mais importante é saber como unificar os processos no nível

molecular (controle interno) com processos no nível da população (fisiologia

microbiana). Para isso, o futuro da área da modelagem e desenvolvimento de

modelos estruturados depende de métodos analíticos disponíveis para determinar os

intermediários metabólicos e a atividade enzimática envolvidos nos caminhos

metabólicos do processo de biodegradação. Todas estas informações devem ser

conhecidas para, então, serem utilizadas na otimização e controle de processos de

biodegradação de compostos tóxicos utilizando modelos estruturados.

Embora o crescimento microbiano em mistura de substratos BTEX, e outros

compostos tóxicos, seja comumente encontrado na literatura, a modelagem

matemática da cinética ainda se encontra limitada, se comparada aos modelos

cinéticos de um único substrato. Como exemplos, os trabalhos de DEEB &

ALVAREZ-COHEN (1999) e HAMED et al. (2003), citados anteriormente, não

apresentaram a modelagem cinética do processo. Os autores mostraram o estudo

da biodegradação de compostos tóxicos, focando nas interações entre os substratos

e na habilidade dos microorganismos durante a biotransformação de tais compostos.

Assim, o presente trabalho vem contribuir com os avanços na área da

modelagem de processos de biodegradação, pois tem por objetivo a avaliação de

modelos cinéticos de crescimento microbiano que representem adequadamente os

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

processos de biodegradação dos compostos BTEX (benzeno, tolueno, etilbenzeno e

xileno) e BTF (benzeno, tolueno e fenol), individualmente e em misturas.

3.1.1. Microorganismos utilizados na biodegradação de compostos tóxicos

A habilidade de alguns microorganismos em utilizar compostos BTEX, como

única fonte de carbono, foi estabelecida em 1908 quando STORMER isolou a

bactéria Bacillus hexavarbovorum e verificou sua capacidade de crescer

aerobicamente em tolueno e xileno (GIBSON & SUBRAMANIAN, 1984 apud

ALVAREZ & HUNT, 2002). A capacidade de bactérias do solo metabolizar

compostos aromáticos sob condições aeróbicas foi demonstrada em 1928 por GRAY

& THORNTON, os quais relataram que em 146 das 245 amostras de solo

contaminado, as bactérias foram capazes de metabolizar naftaleno, fenol e cresol.

Segundo DEL ‘ARCO (1999), produtos importados, constituídos por

microorganismos liofilizados têm sido utilizados no Brasil para solucionar problemas

causados por derramamentos de petróleo e derivados, com uma eficiência nem

sempre satisfatória. A falta de especificidade destes microorganismos e a ausência

de adaptação a fatores como temperatura, nutrientes e microbiota, são as causas da

ineficiência. Logo, existe a necessidade de obter culturas microbianas capazes de

degradar compostos tóxicos, sob condições físico-quimicas e biológicas específicas,

implementando processos que minimizem os impactos provocados pelos mesmos.

Inúmeros microorganismos são citados na literatura como sendo capazes de

utilizar hidrocarbonetos aromáticos em seu metabolismo. A maioria é constituída por

bactérias (DOURADO, 1998; NOCENTINI et al., 2000; SRACEK et al., 2001;

MEYSAMI & BAHERI, 2003; NICHOLSON & FATHEPURE, 2004; SHINODA et al.,

2004; SHIM et al., 2005), havendo, também, actinomicetos, fungos e leveduras

(YADAV & REDDY, 1993; MARTIRANI et al., 1996; MATHEUS, 1997;

KOTTERMAN, 1998; GARCÍA et al., 2000; PRENAFETA-BOLDÚ et al., 2002;

SANTOS & LINARDI, 2004; RODRIGUES, 2006).

3.1.1.1. Utilização de cultura pura

Inúmeras culturas bacterianas puras têm sido relatadas por crescerem

aerobicamente em compostos BTEX, como única fonte de carbono, incluindo

gêneros Acinetobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia,

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Norcardia,

Pseudomonas, Rhodococcus, Ralstonia, dentre outros. Estudos recentes também

têm mostrado a habilidade de culturas puras, conhecidas como UC1 e PM1, ambos

pertencentes ao grupo β-proteobacteria, em utilizar compostos tóxicos como BTEX,

MTBE e TBA (DEEB et al., 2001; PRUDEN, 2002).

O gênero Acinetobacter está amplamente citado na literatura como potencial

assimilador de hidrocarbonetos de petróleo (CHAÎNEAU, et al., 1999; GALLEGO et

al., 2001). DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999) apresentaram a habilidade de

Rhodococcus rhodochrous na biodegradação dos seis compostos BTEX.

Posteriormente, DEEB & ALVAREZ-COHEN (2000) isolaram Rhodococcus sp. RR1

e RR2 a partir de uma mistura de culturas, e as utilizaram na biodegradação dos

compostos BTEX, observando a mineralização de cinco dos seis compostos BTEX

em um amplo intervalo de concentrações. Mais adiante, JUNG & PARK (2004)

mostraram a capacidade de Rhodococcus pyridinovorans PYJ-1 em degradar

misturas de benzeno, tolueno e m-xileno, bem como os compostos individuais.

GUSMÃO (2005) identificou a presença de diferentes microorganismos,

envolvidos com o processo de remoção do BTEX, presentes em biofilme em reator

anaeróbico horizontal de leito fixo, entre os quais estão membros do gênero

Paracoccus, Bacteroides e Pseudomonas. Os membros do gênero Pseudomonas

são caracterizados por degradar centenas de compostos orgânicos diferentes, como

hidrocarbonetos de petróleo, pesticidas, inseticidas, herbicidas e plásticos. A

habilidade de espécies Pseudomonas na biodegradação dos compostos BTEX é

bastante conhecida (CAVALCA et al., 2000; REARDON et al., 2000; REARDON et

al., 2002; HAMED et al., 2003; SHIM et al., 2005). Duas espécies de Pseudomonas

redutoras de nitrato (Pseudomonas sp. BS2201 e BS2203), isolados de um solo

contaminado por petróleo, também foram capazes de degradar os hidrocarbonetos

(GRISHCHENKOV et al., 2000). Além disso, diferentes espécies de Pseudomonas,

tais como aeruginosa, oleovorans, boropolis, putida, foram utilizadas na investigação

da cinética de crescimento microbiano em presença de BTEX (REARDON et al.,

2002; ALAGAPPAN & COWAN, 2004; ABUHAMED et al., 2004), nas interações

entre os substratos BTEX (HAMED et al

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

energia (REARDON et al., 2000, ABUHAMED et al. 2004; SHIM et al. 2005), e

igualmente a outras Pseudomonas, muitas de suas enzimas induzíveis são não

específicas, permitindo uma utilização simultânea de vários substratos similares,

sem excesso de codificação genética. Além disso, seus caminhos metabólicos

possuem um elevado grau de convergência, possibilitando uma eficiente utilização

de um grande intervalo de substratos.

Contudo, culturas puras não podem utilizar, simultaneamente e

eficientemente, todos os compostos BTEX, além de outros compostos como o MTBE

(UTKIN et al., 1992; PAJE & COUPERWHITE, 1996; DEEB & ALVAREZ-COHEN,

2001). A grande motivação de pesquisadores envolvidos em estudos de

biodegradação é a busca por microorganismos versáteis capazes de degradarem,

de maneira eficiente, uma grande variedade de poluentes a baixo custo operacional.

Esforços relativos à modificação genética de bactérias (BERTONI et al., 1996;

APPLEGATE et al., 1998) têm sido desenvolvidos a fim de encontrarem

microorganismos que incorporem caminhos metabólicos para mineralizar todos os

seis compostos BTEX e suas misturas. A completa mineralização da mistura dos

compostos BTpX por P. putida é possível a partir modificações genéticas que

combinam os caminhos TOD e TOL (LEE et al., 1995a; LEE et al., 1995b; OH &

BARTHA, 1997).

Portanto, os avanços na engenharia genética têm proporcionado o

direcionamento dos caminhos metabólicos, por meio do isolamento de genes de

diferentes microorganismos, com a finalidade de construir microorganismos

recombinantes capazes de codificar a degradação de uma variedade de compostos

tóxicos com grande eficiência.

3.1.1.2. Utilização de mistura de culturas

Tendo em vista que uma única espécie microbiana dificilmente será capaz de

realizar a mineralização de uma variedade de compostos tóxicos, metabolizando

apenas frações restritas de substratos, a biodegradação de misturas complexas de

hidrocarbonetos torna-se mais efetiva quando envolve a ação de culturas mistas

capazes de catabolizar uma variedade de reações.

O crescimento de microrganismos em cultura pura é substancialmente

diferente do crescimento em uma mistura de culturas, devido às diversas interações

existentes entre as espécies. Estas interações podem intensificar (interações

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

sinergéticas) ou inibir (interações antagônicas) a proliferação dos microorganismos

(JO et al., 2007). Em processos fermentativos, as interações antagônicas

representam um mecanismo de controle de microorganismos patogênicos. Já em

processos de biodegradação, as interações sinergéticas intensificam as taxas de

degradação de compostos tóxicos.

Quando uma associação microbiana cresce em mistura de substratos,

qualquer um dos substratos pode ser utilizado como fonte de carbono e energia, e

portanto, vários caminhos metabólicos podem ser observados.

DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999, 2000) conduziram experimentos para

testar a biodegradação dos compostos BTEX utilizando-se uma associação

microbiana originária de um aqüífero contaminado por gasolina, no qual

Rhodococcus sp. foi identificada como uma das culturas presentes no meio.

SHIM & YANG (1999) e SHIM et al. (2002) verificaram a biodegradação dos

compostos BTEX por uma mistura de Pseudomonas putida e Pseudomonas

fluorescens em um biorreator com leito de fibras. Esta mistura também foi utilizada

por SHIM et al. (2005) com o objetivo de estudar a cinética de biodegradação dos

compostos BTEX em condições aeróbicas, utilizando-se peróxido de hidrogênio, e

em condições anaeróbicas com a utilização de nitrato.

REARDON et al. (2002) investigaram a habilidade da mistura de cultura P.

putida F1 e Burkholderia sp. J150 em degradar os hidrocarbonetos aromáticos,

benzeno, tolueno e fenol, individualmente e em mistura binária. Os autores

concluíram que interações entre as duas espécies tiveram um impacto significativo

na cinética de degradação dos substratos.

Recentemente, HEKMAT et al. (2006) desenvolveram uma modelagem

matemática para representar a biodegradação de compostos orgânicos voláteis,

utilizando múltiplos substratos e múltiplas espécies, no qual proto-cooperação e

competição foram identificados como interações entre as espécies.

Outros exemplos de interações metabólicas entre as espécies de uma

associação microbiana são apresentados por MØLLER et al. (1998) e

CHRISTENSEN et al. (2002). Estes trabalhos mostram que os processos de

biodegradação com múltiplas espécies representam sistemas dinâmicos bastante

complexos e, portanto, seu entendimento é limitado.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

3.1.2. Metabolismo aeróbico e anaeróbico dos compostos BTEX

Os microorganismos utilizam os elétrons aceptores de acordo com princípios

termodinâmicos. Quanto maior a energia livre de Gibbs liberada na reação, maior

será a eficiência da população microbiana em catalisar a reação. Na Tabela 3.1 são

apresentadas as reações redox envolvidas na degradação dos compostos BTEX.

Segundo CHRISTENSEN et al. (2000), termodinamicamente a preferência

dos microorganismos pelos elétrons aceptores segue a seguinte ordem: oxigênio,

nitrato, manganês, ferro e sulfato.

Em processos anaeróbicos, a bioquímica e a microbiologia mostram-se mais

complexas do que em processos aeróbicos, devido a grande variedade de rotas

metabólicas disponíveis (WIDDEL & RABUS, 2001; SHINODA et al., 2004). A

degradação da matéria orgânica até metano e dióxido de carbono, envolve uma

cadeia seqüencial de caminhos metabólicos, e requer ação combinada e

coordenada de diferentes grupos de bactérias anaeróbias.

Até 1984, acreditava-se que a biodegradação de compostos aromáticos não

era possível na ausência de oxigênio molecular. Posteriormente, vários estudos

demonstraram a capacidade de culturas em utilizar anaerobicamente os compostos

BTEX, sob condições desnitrificantes, manganês-redução, ferro-redução, sulfato-

redução e condições metanogênicas (HUTCHINS et al., 1991; HOLLIGER &

ZEHNDER, 1996; LOVLEY, 1997; NALES et al., 1998; PHELPS & YOUNG, 1999;

HEIDER et al., 1999; GRISHCHENKOV et al., 2000; WIDDEL & RABUS, 2001;

NAKAGAWA et al., 2002; VILLATORO-MONZÓN et al., 2003; HEIDRICH et al.,

2004; MALIYEKKAL et al., 2004; GUSMÃO et al., 2006; deNARDI et al., 2007).

Evidências da biodegradação anaeróbica do benzeno têm sido relatadas em

condições metanogênicas (WEINER & LOVLEY, 1998), sulfato-redução (PHELPS et

al. 1998; ANDERSON & LOVLEY, 2000), ferro-redução (LOVLEY et al., 1996;

ROONEY-VARGA et al., 1999) e nitrato-redução (BURLAND & EDWARDS, 1999).

Entretanto, algumas investigações também têm considerado o benzeno um

composto recalcitrante em condições anaeróbicas (COLBERG & YOUNG, 1995).

Este comportamento geralmente é explicado devido a estabilização das ligações

carbono-carbono e a estrutura simétrica do anel que tornam o benzeno altamente

resistente à quebra, além de outros fatores.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Tabela 3. 1 – Reações redox envolvidas na degradação dos compostos BTEX

associadas à energia livre de Gibbs

Reações redox ∆G° (kJ mol

-1

)

Benzeno

−+

+→++

32266

6635,7 HCOHOHOHC

-3066

23366

366 NHCONOHC +→+

−−

-3002

+−+

++→++

3266

306425430 FeHCOOHHFeOOHHC

-1370

−−+−

++→++ HSHCOHOHSOHC 75,3625,23754,3

466

-105

Tolueno

−+

+→++

32287

7739 HCOHOHOHC

-3670

232387

6,376,02,02,7 NHCOOHHNOHC ++→++

−+−

-3593

+−+

++→++

3287

367516536 FeHCOOHHFeOOHHC

-1635

−−+−

++→++ HSHCOHOHSOHC 5,475,235,4

487

-118

Etilbenzeno/Xilenos

−+

+→++

322108

8835,10 HCOHOHOHC

-4291/-4307

2323108

2,482,14,04,8 NHCOOHHNOHC ++→++

−+−

-4201/-4217

+−+

++→++

32108

428607642 FeHCOOHHFeOOHHC

-1917/-1933

−−+−

++→++ HSHCOHOHSOHC 25,5875,2325,5

4108

s0çóKmmdo–2c0çóKb2p0.mKãKdR–p0.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

exemplos tem-se a formação do catecol durante a biodegradação aeróbica, e a

produção de benzoil-CoA, durante a biodegradação anaeróbica de compostos

aromáticos (HARWOOD & GIBSON, 1997). Estes são chamados de metabólitos

centrais, e são, por sua vez, metabolizados por enzimas de caminhos centrais,

sendo utilizado como subproduto de crescimento, resultando em intermediários

durante a reação. Por fim, estes intermediários sofrem a quebra do anel, por meio do

ciclo de Krebs, para formar compostos tais como, o ácido pirúvico, acetaldeído,

ácido succínico e acetil CoA.

A ação das enzimas oxigenase consiste na primeira etapa da respiração

aeróbica e promove a introdução do oxigênio na molécula de hidrocarboneto. Os

compostos aromáticos são convertidos em dihidroxi-aromáticos, tais como: catecol,

gentisate e protocatechuate. O catecol é o intermediário mais comumente formado

durante a degradação de hidrocarbonetos aromáticos, e pode ser completamente

degradado pela clivagem do anel aromático, por meio da via meta ou via orto

(FARRELL & QUILTY, 1999). A via orto (β-cetoadipato), apresentada na Figura 3.1,

envolve a quebra de ligação entre os átomos de carbono ligados aos grupos

hidroxila do catecol, por meio da enzima catecol 1,2-dioxigenase, levando a

formação de cis-muconato, e subsequentemente acetil-CoA e succinato. Por outro

lado, catecois clivados pela via meta (α-cetoadipato) sofrem a quebra de ligação

entre o átomo de carbono adjacente ao grupo hidroxila, através da enzima catecol

2,3-dioxigenase (HENDRICKX et al., 2006), formando semialdeído 2-

hidroximucônico (2HMS) e, posteriormente, piruvato e acetaldeído, como pode ser

visto na Figura 3.2.

COOH

ácido cis-cis-mucônico

catecol

COO

acetil-CoA

succinato

β-cetoadipato

β-cetoadipil-CoA

COOH

CO-SCoA

COOH

SCoA

COO

Figura 3. 1 – Esquema da clivagem do catecol via orto.

semialdeído

2-hidroximucônico

catecol

CCOO

acetaldeído

piruvato

COOH

2-oxo-4-pentenoato

4-hidroxi-2-oxavalerante

COOH

Figura 3. 2 – Esquema da clivagem do catecol via meta.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Qualquer uma das cinco rotas metabólicas primárias (TOD, TOL, TOM, TBU e

TMO) caracterizadas até o presente momento, pode ser utilizada para a degradação

de no mínimo três dos compostos BTEX (ZYLSTRA, 1994 apud BIELEFELDT &

STENSEL, 1999a), por uma variedade de bactérias aeróbicas. Pseudomonas putida

F1 possui o gene TOD e ataca o anel aromático utilizando a enzima tolueno

dioxigenase. Burkholderia cepacia G4 possui o gene TOM que codifica a enzima

tolueno 2-mono-oxigenase. Pseudomonas pickettii PKO1 possui o gene TBU que

codifica a enzima tolueno 3-mono-oxigenase. Pseudomonas mendocina KR1

apresenta o gene TMO que expressa a enzima tolueno 4-mono-oxigenase.

Pseudomonas putida mt-2 possui o plasmídeo TOL responsável pelo ataque do

grupo metil de aromáticos. A Tabela 3.2 apresenta as rotas metabólicas envolvidas

na biodegradação dos compostos BTEX, por meio de bactérias aeróbicas, as quais

podem ser visualizadas com maiores detalhes, em anexos, nas Ilustrações 1 a 7.

CAVALCA et al. (2000), em estudos conduzidos para selecionar bactérias

degradadoras de compostos aromáticos, caracterizaram nas cepas a presença de

genes que codificam as enzimas tolueno-dioxigenase, xileno-mono-oxigenase e

catecol 2,3-dioxigenase. Quinze das cinqüenta cepas isoladas foram identificadas

como P. putida, P. aureofaciens, P. aeruginosa e Alcaligenes xilosoxidans. Estas

espécies foram crescidas em vários hidrocarbonetos aromáticos, dentre os quais

estão os compostos BTEX. O benzeno, m-xileno e p-xileno foram utilizados por

53,3% das quinze espécies, seguida pelo etilbenzeno com utilização de 66,7%.

Todas as quinze espécies foram capazes de utilizar o tolueno, e nenhuma cresceu

no o-xileno. O caminho TOL foi detectado quando a utilização dos substratos ocorre

com P. putida e A. xilosoxidans, enquanto o caminho TOD foi encontrado com P.

aureofaciens, A. xilosoxidans e P. putida. O crescimento da P. putida CM23 no

benzeno, tolueno e m-p-xileno sugeriu a presença das rotas metabólicas TOD e

TOL, os quais se referem ao ataque dioxigenase (ZYLSTRA & GIBSON, 1989 apud

REARDON et al., 2000) e mono-oxigenase (KAHNG et al., 2001) do anel aromático,

respectivamente.

Por outro lado, os mecanismos anaeróbicos de utilização de hidrocarbonetos

têm sido completamente diferentes das reações de oxigenase. Segundo WIDDEL &

RABUS (2001) o mecanismo de reação inicial da degradação do benzeno na

ausência de oxigênio molecular é desconhecida.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Vários caminhos de transformação anaeróbica têm sido relatados para o

tolueno, incluindo a oxidação do grupo metila com a formação de ácido benzóico;

carboxilação do anel aromático formando ácido toluico; hidroxilação do grupo metila

formando álcool benzílico e para-hidroxilação do anel aromático formando p-cresol

(COLBERG & YOUNG, 1995). Frequentemente, a biodegradação anaeróbica do

tolueno ocorre pela adição do fumarato ao grupo metila (KANE et al., 2002), até a

formação do subproduto benzoil-CoA. Este caminho metabólico foi primeiramente

elucidado utilizando Azoarcus sp. T (BELLER & SPORMANN, 1998) e Thauera

aromática (BIEGERT et al., 1996), e pode ser visualizado em Anexos, Ilustração 8.

Inicialmente, fumarato é adicionada ao grupo metil, catalizada pela enzima

benzilsuccinato sintase, resultando em benzilsuccinato, o qual é convertido em

fenilitaconil-CoA, sendo ambos identificados como intermediários. Maiores detalhes

são revisados em SPORMANN & WIDDEL (2001).

SHINODA et al. (2004) concluíram que Thauera sp. DNT-1 utiliza o tolueno

por meio de ambas as enzimas, tolueno dioxigenase (caminho metabólico aeróbico-

TOD) e benzilsuccinato sintase (caminho metabólico anaeróbico). Ambos são

apresentados no Anexo, Figuras 8.3 e 8.8, respectivamente.

A biodegradação anaeróbica do etilbenzeno sob condições desnitrificantes foi

demonstrada para culturas bacterianas puras por RABUS & WIDDEL (1995) e BALL

et al. (1996), utilizando bactérias desnitrificantes Azoarcus sp. strain EBN1 e EB1,

respectivamente, ambas pertencentes ao grupo β-Proteobacteria. O processo pode

ser visualizado em Anexos, Ilustração 9, sendo iniciado por desidrogenação do

etilbenzeno até 1-fenil-etanol, e pela subseqüente conversão até benzoil-CoA, que

consiste no intermediário central na degradação anaeróbica de uma variedade de

hidrocarbonetos aromáticos. Como intermediários foram identificados o 1-fenil-

etanol, acetofenona, benzoil-CoA e acetil-CoA.

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

3.2. Mecanismos de Regulação Gênica

Algumas enzimas, como aquelas que participam de caminhos metabólicos

centrais, são sempre produzidas independentemente das condições ambientais,

sendo conhecidas como enzimas constitutivas. A indução de enzimas degradativas

envolve a ativação de regiões específicas do genoma bacteriano, conforme a teoria

operon lac de Jacob-Monod. As enzimas que iniciam a utilização dos compostos

BTEX são geralmente induzíveis. Tais enzimas somente são produzidas quando um

indutor, como por exemplo, o tolueno, está presente em uma concentração mais

elevada do que a concentração inicial mínima para a indução (LINKFIELD et al.,

1989 apud ALVAREZ & HUNT, 2002). Geralmente, esta concentração inicial é muito

baixa, na ordem de alguns microgramas por litro (ROBERTSON & BUTTON, 1987

apud ALVAREZ & HUNT, 2002).

O tolueno é geralmente um bom indutor de enzimas oxigenase e a sua

presença tem sido relatada por intensificar a biodegradação do benzeno, etilbenzeno

e isômeros do xileno (ARVIN et al., 1989; ALVAREZ & VOGEL, 1991; GÜLENSOY &

ALVAREZ, 1999), apesar de outros estudos mostrarem que o tolueno pode inibir a

biodegradação do benzeno e fenol (OH et al., 1994; ROGERS & REARDON 2000;

HAMED et al., 2003; ABUHAMED et al., 2004).

Regular os tipos e quantidades de compostos que serão sintetizados é muito

efetivo para a otimização do crescimento de uma população microbiana. A

expressão de genes que não estavam se manifestando resulta síntese de enzimas,

e ilar oraicrem n ila

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

gênicos. A indução da expressão gênica, a repressão da expressão gênica e a

repressão catabólica são as três categorias de regulação gênica.

Segundo a teoria do operon lac de Jacob-Monod (JACOB & MONOD, 1961

apud NARANG, 2006), na ausência de um indutor, o gene regulador codifica uma

molécula repressora que se liga ao gene operador. Assim, o gene responsável pela

codificação da síntese de enzimas induzíveis permanece reprimido. A presença de

um substrato indutor converte a molécula repressora a uma forma inativa incapaz de

se ligar ao gene operador, liberando a síntese da respectiva enzima. Desta forma, a

indução da expressão de um ou mais genes resulta síntese de enzimas em resposta

à presença, no meio, de um substrato para uma determinada via catabólica. Este

mecanismo pode ser visualizado na Figura 3.3. Por outro lado, a repressão da

expressão gênica bloqueia a síntese de uma ou mais enzimas, atuando em uma via

biossintética, porque o produto da atividade enzimática atingiu uma concentração

ideal ou limitante na célula. Dentro dessas duas categorias de regulação gênica,

existem vários mecanismos reguladores que vão determinar se um produto gênico

em particular será ou não sintetizado.

Figura 3. 3 – Esquema do mecanismo de repressão catabólica.

E DNA

Gene promotor

RNA

polimerase

Repressor

AUSÊNCIA DE INDUTOR

Gene operador

Capítulo 3 – Revisão da Literatura

Tabela 3. 2 – Caminhos metabólicos caracterizados por microorganismos aeróbicos degradadores dos compostos BTEX

Substrato

Microorganismo Enzima Caminho

metabólico

Subproduto

Intermediário

Metabólito

Central

Referência

B P. putida F1 tolueno dioxigenase TOD benzeno cis-dihidrodiol

catecol

GIBSON et al. (1968)

apud LOVANH et al. (2002)

T Burkholderia cepacia G4 tolueno 2 mono-oxigenase

TOM

o-cresol 3 metilcatecol NEWMAN & WACKETT (1995)

T P. pickettii PKO1 tolueno 3 mono-oxigenase

TBU m-cresol 3 metilcatecol

KUKOR & OLSEN (1991); OLSEN et al.

(1994); BYME et al. (1995)

T P. mendocina KR1 tolueno 4 mono-oxigenase

TMO p-cresol 4-hidroxibenzoato

WHITED & GIBSON (1991);

YEN et al. (1991)

T P. putida F1 tolueno dioxigenase TOD tolueno cis-dihidrodiol

3 metilcatecol

ZYLSTRA & GIBSON (1989)

apud CAVALCA et al. (2000)

T P.putida mt-2 tolueno mono-oxigenase TOL benzil álcool benzoato

WILLIAMS & MURRAY (1974)

apud LOVANH et al. (2002);

BURLAGE et al. (1989)

apud HENDRICHX et al. (2006)

E P. sp NCIB naftaleno dioxigenase estireno ou

2-hidroxiacetofenona

E P. sp NCIB etilbenzeno dioxigenase cis 2-3, dihidroxi

2,3 dihidroetilbenzeno

3 etilcatecol

LEE & GIBSON (1996)

o-X Burkholderia cepacia MB2

xileno mono-oxigenase TOL o-metil-benzil álcool 3 metilcatecol JORGENSEN et al. (1995)

m-X P. putida mt-2 xileno mono-oxigenase TOL m-metil-benzil álcool 3 metilcatecol

DAVEY & GIBSON (1974)

apud JO et al. (2007)

p-X P. putida xileno mono-oxigenase TOL p-metil-benzil álcool 4 metilcatecol DUETZ et al. (1998)

o-p-X P. putida PPO1 tolueno dioxigenase TOD 3-6-dimetilcatecol

GIBSON et al. (1974) apud TSAO et al.

(1998); TSAO et al. (1998)

Capítulo 4 – Metodologia

Capítulo 4

4.1. Princípio da Análise de Sistema no Desenvolvimento de Processos

Biotecnológicos Sofisticados

A revisão da literatura mostra que o desenvolvimento de processos

biotecnológicos não é uma tarefa fácil, pois muitos processos físico-químicos e

bioquímicos estão envolvidos. Obviamente, o estudo de sistemas biotecnológicos

tão sofisticados, em escala real, não é possível. Assim, KAFFAROV et al. (1985)

sugerem que o conhecimento sobre o desempenho e projeto de biorreatores podem

ser sumarizados utilizando um princípio de decomposição de análise de sistema,

que consiste na divisão do sistema em subsistemas, os quais podem ser estudados

e modelados separadamente, e mais adiante, todos os conhecimentos avaliados a

partir dos subsistemas, são unificados para formar o modelo completo do biorreator.

Portanto, seguindo esta estratégia, a modelagem matemática completa de

biorreatores pode ser construída a partir de cinco níveis hierárquicos de

conhecimento, como apresentados na Figura 4.1.

III

Mode lo comp leto do bio rreator

Modelo de Transferê ncia

de Massa

Mode lo da Hidrodinâmica

Mode lo de Transferê ncia

de Calo r

Mode lo de micr o mist ura

Modelo de macro mist ura

Modelo de Cresciment o

da Biomassa

Mode lo de Co nsu mo

do Substrato

Modelo de Fo r mação

do Produto

Mode lo da Cinét ica

Figura 4. 1 – Esquema do modelo completo matemático do biorreator.

Capítulo 4 – Metodologia

O primeiro nível hierárquico é o estágio chave no desenvolvimento do

processo e requer experimentos cinéticos para obtenção de informações sobre o

crescimento microbiano, utilização de substratos, síntese da enzima chave e

formação de produtos.

O segundo nível hierárquico utiliza informações obtidas no primeiro nível de

conhecimento para completar o modelo cinético. É importante lembrar que o modelo

cinético deve ser bastante realístico, representando apenas parâmetros chaves

mensuráveis envolvidos na referido processo.

O terceiro nível hierárquico tem uma correlação direta com processos físicos

de distribuição gás e líquido no vaso do reator. Utilizando os princípios análogos às

propriedades de mistura de sistema gás-líquido-sólido é possível modelar qualquer

desempenho de biorreator em função de efeitos de mistura e dinâmica de fluidos e

produtividade total do biorreator em processos cinéticos microbianos.

O quarto nível hierárquico combina processos de transferência de massa,

transferência de calor e hidrodinâmica a partir de suas influências e relações com a

cinética microbiana. Completando este nível de conhecimento pode-se

desempenhar análises do sistema apenas por meio de simulações no computador

sem conduzir experimentos em escala real. A validação do modelo pode ser feita

apenas com o projeto de poucos experimentos em pontos críticos onde os

resultados das simulações divergem significativamente de todo o experimento. Isto é

particularmente verdadeiro quando o desempenho de um novo biorreator é aplicado

com características hidrodinâmicas desconhecidas.

O quinto nível hierárquico corresponde à etapa final no procedimento para o

desenvolvimento do modelo, no qual os conhecimentos de todos os cinco níveis são

combinados para completar a modelagem matemática do biorreator. A validação

deste nível tem sido feita com base em experimentos em planta piloto ou escala

industrial, em que limitações à transferência de massa e distribuição do tempo de

residência são responsáveis pela deformação dos valores dos parâmetros cinéticos

e decréscimo da produtividade total do biorreator. Simulações com o modelo

matemático completo do biorreator economizam tempo e dinheiro e, além disso,

eliminam possíveis erros durante o desenvolvimento dos processos e projeto do

reator, resultando interpretação final de sistemas biotecnológicos sofisticados.

Assim, a modelagem matemática e simulação de biorreatores têm como

principal objetivo prever o comportamento estacionário e dinâmico do processo,

Capítulo 4 – Metodologia

possibilitando a determinação das condições operacionais ótimas, representando

uma ferramenta moderna e poderosa no desenvolvimento de processos

biotecnológicos.

4.2. Modelos Cinéticos de Crescimento Microbiano

4.2.1. Classificação dos modelos cinéticos

Os modelos cinéticos de processos biotecnológicos, em geral, podem ser

classificados, quanto ao número de componentes usados na representação celular,

em modelos não-estruturados e modelos estruturados. Os modelos não-estruturados

avaliam o comportamento cinético do processo, admitindo que o material celular seja

representado por uma única variável, e não existem variações de componentes

intracelulares. Já os modelos estruturados permitem descrever o estado das células

com maiores detalhes, considerando os componentes intracelulares.

Quanto à heterogeneidade da população microbiana, os modelos cinéticos

também são classificados em duas categorias. Neste caso, existem os modelos não-

segregados que admitem uma população homogênea, nos quais todas as células

apresentam o mesmo comportamento; e os modelos segregados, que consideram

uma população heterogênea, nos quais as células possuem distribuição de idade,

tamanho, dentre outras propriedades.

4.2.2. Taxa de crescimento específico

A equação cinética para um substrato “

” descreve a influência de sua

concentração e de outros compostos (inibidores ou ativadores) na taxa de

crescimento específico

. A taxa de crescimento específico pode ser afetada pela

presença de inibidores no meio de cultura, como alguns substratos, intermediários e

produtos formados.

A expressão para a taxa de crescimento específico é função do modelo

cinético, além do microorganismo. Quando a biodegradação ocorre na presença de

múltiplos substratos, a taxa de crescimento específico celular pode ser apresentada

por meio da forma aditiva (equação 4.1) e da forma multiplicativa (equação 4.2):

∑

SGR

(4.1)

Capítulo 4 – Metodologia

∏

SGR

(4.2)

Dentre os modelos cinéticos não-estruturados tem-se o clássico modelo de

MONOD (1942) apud REARDON et al. (2000), a partir do qual surgiram diversos

outros modelos que descrevem o consumo de substratos, formação dos produtos e

crescimento da biomassa. Além disso, alguns também incorporam a influência de

componentes tais como, inibidores e ativadores. As Tabelas 4.1 e 4.2 apresentam

alguns modelos não-estruturados para o crescimento celular em único substrato e

múltiplos substratos, respectivamente.

4.2.3. Modelos para único substrato

4.2.3.1. Modelo de Monod

O trabalho fenomenológico mais importante sobre cinética de crescimento

microbiano foi desenvolvido em 1942 por MONOD. O modelo de Monod aplica-se

para a população microbiana e representa características cinéticas integrais da

biomassa. Este fato é crucial para entender a fisiologia microbiana no nível da

população e acelerou o desenvolvimento de outros modelos cinéticos, tais como

Tessier, Moser e Contois (BAILEY & OLLIS, 1986).

Monod admite que todos os componentes do meio de cultura, menos um,

estão presentes em altas concentrações balanceadas, tal que mudanças nestas

condições não afetam significativamente a taxa de crescimento celular. Assim, um

simples componente torna-se limitante (substrato), e somente as variações na

concentração deste componente causariam alterações no comportamento do meio

de cultura.

A equação de Monod, conforme a Tabela 4.1, relaciona a taxa de crescimento

em função da concentração do substrato. A constante de Monod Ks , denomiKmmdn–2c0çóKmmdo–m0.xpó.xpcódn–2c0cmKãKdh–m0.xpcódo–2c0Ö MFLacenoae obel FL

Capítulo 4 – Metodologia

Tabela 4. 1 – Modelos cinéticos não-estruturados para único substrato

Modelo Equação Referência

Limitação e

Inibição pelo

substrato

máx













WU et al. (1988) apud

LIMA et al. (2001)

máx

MONOD (1942) apud

REARDON et al. (2000)

(

)

máxx

−

−= 1

µµ

TESSIER (1942) apud

BAILEY & OLLIS (1986)

máx

MOSER (1958) apud

BAILEY & OLLIS (1986)

Limitação pelo

substrato

SXK

máx

CONTOIS (1959) apud

BAILEY & OLLIS (1986)

SKs

máx













WEBB (1963) apud

NUHOGLU & YALCIN (2005)

























SKs

máx

YANO et al. (1966) apud

NUHOGLU & YALCIN (2005)

SKs

máx

ANDREWS (1968) apud

REARDON et al. (2000)













−

máx

AIBA (1968) apud

NUHOGLU & YALCIN (2005)

























∑

máx

SSKs

YANO & KOGA (1969) apud

SHALABY (2003)

Inibição pelo

substrato













−=













−













−

máxx

µµ

EDWARDS (1970) apud

NUHOGLU & YALCIN (2005)

Capítulo 4 – Metodologia

4.2.3.2. Modelo de Andrews

A inibição pelo substrato é freqüentemente expressa pelo modelo de Andrews

(ANDREWS, 1968 apud REARDON et al., 2000), similar à equação de Haldane para

cinética enzimática. Conforme SHALABY (2003) o modelo de Andrews é baseado na

taxa de crescimento específico (ALLSOP et al., 1993), mas também pode ser

relatada para taxa de consumo específico de substrato (SOKOL, 1988).

Uma equação bastante versátil para inibição pelo substrato foi proposta por

YANO & KOGA (1969), como apresentada na Tabela 4.1. A equação de Yano &

Koga foi utilizada por SCHRÖDER et al. (1997) para descrever a degradação do

fenol por Burkholderia cepacia G4 em operação contínua, ajustando-se melhor aos

dados do que várias outras equações testadas. A equação de Andrews pode ser

obtida a partir da equação de Yano & Koga quando 1

j .

Dos vários modelos de inibição pelo substrato, a equação de Andrews tem

sido extensamente utilizada para descrever a biodegradação do fenol (KOTTURI et

al., 1991; SEKER et al., 1997; ABUHAMED et al., 2004; KUMAR et al., 2005;

NUHOGLU & YALCIN, 2005; JIANG et al., 2007).

4.2.4. Modelos para múltiplos substratos

A modelagem matemática da cinética microbiana em múltiplos substratos é

bastante complexa. Os microorganismos crescidos em múltiplos substratos mostram

preferência por muitos dos compostos presentes no meio, favorecendo suas

biodegradações (PATNAIK, 2000) em detrimento da biodegradação dos compostos

preteridos. Vários fenômenos devem ser considerados quando microorganismos

utilizam muitos substratos, tais como a repressão catabólica, indução e repressão

enzimática, os quais promovem a utilização seqüencial ou simultânea dos

substratos. A Tabela 4.2 apresenta alguns modelos não-estruturados adequados

para sistemas com múltiplos substratos.

Capítulo 4 – Metodologia

Tabela 4. 2 – Modelos cinéticos não-estruturados para múltiplos substratos

Modelo Equação Referência

( )( )

2211

SKsSKs

máx

(utilização simultânea de S

e S

)

MEGEE et al. (1972)

apud LIMA et al. (2001)

Limitação por múltiplos

substratos

























SKs

máxmáx

µµ

(utilização simultânea de S

e S

)

TSAO & HANSON (1975)

apud LIMA et al. (2001)

Inibição

Não-Competitiva

























jii

imáx

SSKs

Inibição

Acompetitiva













imáx

SKs

SEGEL (1975) apud

REARDON et al. (2000)

Inibição

Competitiva

























jii

imáx

SSKs

SKIP

( )

jijii

imáx

ISSKs

YOON et al. (1977) apud

REARDON et al. (2000)

Limitação e Inibição por

múltiplos substratos

SKs

máxmáx

(utilização preferencial de S

)

DUNN et al. (1992) apud

LIMA et al. (2001)

4.2.4.1. Modelo de Inibição Competitiva

A utilização simultânea, observada durante a biodegradação de mistura de

substratos, suporta a hipótese de que estes são utilizados pela mesma rota

metabólica, o que sugere a presença de inibição competitiva entre os substratos.

Durante a inibição competitiva o inibidor e o substrato, os quais geralmente

possuem estrutura química similar, competem pelo mesmo sítio ativo da enzima

responsável pela metabolização dos compostos. O modelo de inibição competitiva,

proposto por YOON et al. (1977) apud REARDON et al. (2000), apresentado na

Tabela 4.2, representa a taxa de crescimento específico do substrato “

” na

Capítulo 4 – Metodologia

presença de um substrato “

”. O modelo pode ser facilmente estendido para vários

substratos presentes no sistema, como apresentado na equação 4.3:

∑

≠













jii

imáx

SSKs

(4.3)

4.2.4.2. Modelo de Inibição Não-Competitiva

O modelo de inibição não-competitiva, proposto por SEGEL (1975) apud

REARDON et al. (2000), pode ser adequado quando o substrato inibidor liga-se

tanto ao complexo enzima-substrato, quanto à enzima livre, inativando-os. O

modelo, apresentado na Tabela 4.2, representa o taxa de crescimento específico no

substrato “

” na presença de um substrato “

”. Também pode ser representada pela

equação (4.4), quando mais substratos estão envolvidos no processo:

∑

≠

























jii

imáx

SSKs

(4.4)

4.2.4.3. Modelo de Inibição Acompetitiva

O modelo de inibição acompetitiva, apresentado por SEGEL (1975) apud

REARDON et al. (2000), pode ser utilizado quando o substrato inibidor se liga ao

complexo enzima-substrato, inativando-o, e não a enzima livre. A taxa de

crescimento específico dada pela inibição acompetitiva entre dois substratos “

” e

“

” é apresentada na Tabela 4.2, para o substrato “

”. Estendendo o modelo para

mais do que dois substratos presentes no processo, a taxa de crescimento

específico no substrato “

” pode ser representado pela equação (4.5):

∑

≠

imáx

SKs

(4.5)

4.2.4.4. Modelo SKIP

Quando as interações entre os substratos não correspondem à inibição

enzimática, então um modelo alternativo pode ser utilizado, conhecido como modelo

SKIP (sum kinetics interactions parameters). Este modelo foi proposto por YOON et

Capítulo 4 – Metodologia

al. (1977) apud REARDON et al. (2000), sendo adequado para ajustar interações

não-específicas entre dois substratos, pela incorporação do parâmetro de interação

I , que indica o grau que o substrato “

” afeta a biodegradação do substrato “

”.

Neste caso, a taxa de crescimento específico para o substrato “

” pode ser

apresentada pela equação, dada na Tabela 4.2. O modelo também pode ser

estendido para vários substratos presentes no sistema, como apresentado na

equação 4.6:

∑

≠

Capítulo 4 – Metodologia

(

)

( )

tXtSSDR

tdS

iini

−−=

(4.11)

Se SGRDR

, então a taxa de crescimento celular torna-se negativa e a

concentração celular decrescerá até que ocorra o fenômeno conhecido como “wash

out” ou arraste de células. O “wash out” pode ser usado para calcular a taxa de

crescimento máximo ou a taxa de conversão do substrato, sendo uma técnica

utilizada para avaliar o comportamento do microorganismo (ESENER et al., 1981

apud SHALABY, 2003).

Em condições estacionárias, as equações diferenciais (4.10) e (4.11) são

iguais a zero e se transformam nas equações (4.12) e (4.13), respectivamente:

SGRDR

(4.12)

( )

tXtSSDR

iini

=−

(4.13)

A equação (4.12) mostra que a taxa de crescimento específico das células

pode ser controladas por meio da taxa de diluição.

4.3.3. Operação contínua – com reciclo

A operação do sistema contínuo com recirculação tem como objetivo a

obtenção de alta densidade celular no reator, aumentando-se as taxas de

crescimento celular e consumo de substrato e, portanto, aumentando-se a eficiência

total no biorreator. O reciclo externo torna-se uma alternativa viável em processos

como tratamento biológico, os quais não requerem preocupação com assepsia.

O balanço para biomassa é dado pela equação (4.14) e para o substrato “

” é

dado pela equação (4.15):

(

)

( ) ( )( ) ( )

tXSGRtXX

tXDR

tdX

Nreatores

.. +−+−=

(4.14)

(

)

( )

tXtSS

tSSDR

tdS

Nreatores

iiiini

−−+−=

(4.15)

4.3.4. Processo aeróbico

O oxigênio é necessário para todos os processos aeróbicos por definição. A

taxa de crescimento específico microbiano relativo ao consumo de oxigênio, segue a

cinética de Monod, conforme apresentada pela equação (4.16):

Capítulo 4 – Metodologia

(

)

( )

tCKs

máx

(4.16)

Desta forma, a taxa de consumo do oxigênio é dada pela equação (4.17):

(

)

( )

tdC

OUR

−==

(4.17)

A taxa de transferência de oxigênio na fase vapor é apresentada pela

equação (4.18), e deve ser igual ou superior à taxa de consumo de oxigênio pelos

microorganismos:

(

)

( )

)(

tCCKla

tdC

OTR

OOO

−==

(4.18)

Sendo:

2xO

taxa de crescimento específico no oxigênio;

OUR

taxa de consumo do oxigênio;

OTR

taxa de transferência de massa do oxigênio;

2máxO

taxa máxima de crescimento específico no oxigênio;

constante de saturação do oxigênio;

2/ Ox

coeficiente de rendimento no oxigênio;

concentração de células;

concentração do oxigênio dissolvido no meio;

concentração de saturação do oxigênio dissolvido;

Kla

coeficiente global de transferência de massa do oxigênio.

Na maioria dos experimentos batelada, encontrados na literatura, verifica-se

que os mesmos são conduzidos sob condições operacionais (agitação e aeração)

em que é mantida uma alta taxa de transferência de massa do oxigênio da fase

gasosa para a fase líquida. Neste caso, os modelos cinéticos de crescimento

microbiano não consideram o oxigênio como um substrato limitante, assumindo uma

adequada aeração do meio.

Desta forma, o oxigênio dissolvido não limita a taxa de crescimento

microbiano, podendo ser desconsiderada durante a modelagem do processo de

biodegradação em operação batelada.

Capítulo 4 – Metodologia

4.4. Métodos de Identificação de Parâmetros

A etapa de identificação de parâmetros é fundamental para o

desenvolvimento e aplicação de modelos matemáticos de diversas áreas do

conhecimento. Uma das ferramentas utilizadas nesta etapa consiste nos métodos de

otimização numérica, os quais podem ser divididos em métodos determinísticos e

estocásticos. Os métodos determinísticos são técnicas específicas utilizados para

resolver um limitado grupo de problemas, dentre os quais se enquadra as técnicas

de programação matemática.

A identificação de parâmetros em processos químicos e biotecnológicos é

uma tarefa bastante complexa, dependendo do número de compostos envolvidos no

processo, resultando um elevado número de parâmetros a serem determinados.

Além disso, estes processos geralmente resultam modelos não-lineares,

necessitando de métodos de otimização não convencionais, como as técnicas

metaheurísticas. Ao contrário das heurísticas convencionais, as metaheurísticas são

de caráter geral e têm condições de escapar de ótimos locais, onde os mecanismos

utilizados para este fim são responsáveis pela caracterização e diferenciação dos

diversos métodos desta categoria. Exemplos clássicos são os algoritmos genéticos,

enxame de partículas, redes neurais e recozimento simulado, além da busca tabu e

colônia de formigas, dentre outros.

De acordo com o princípio utilizado para explorar o espaço de soluções, as

técnicas metaheurísticas dividem-se em métodos de busca local e métodos de

busca global. Os métodos recozimento simulado e a busca tabu são exemplos de

métodos de busca local. A exploração do espaço de soluções é feita por meio de

movimentos, os quais são aplicados a cada passo sobre a solução corrente,

gerando outra solução promissora em sua vizinhança. Os métodos baseados em

busca global, tais como algoritmos genéticos e enxame de partículas, consistem em

manter um conjunto de boas soluções e combiná-las com o objetivo de alcançar

soluções ainda melhores.

Genetic Algorithm (GA) foi originariamente proposto por HOLLAND (1975) e

baseia-se na teoria evolucionária das espécies. Assim, aplicam-se operadores

genéticos (seleção natural, cruzamento e mutação) sobre uma população inicial e

suas próximas gerações. Cada indivíduo da população é codificado em um

cromossomo, que representa uma possível solução ao problema. A adaptação de

Capítulo 4 – Metodologia

um indivíduo é então avaliada pelo valor da função objetivo (seleção natural) e os

indivíduos altamente adaptados são permitidos a se reproduzirem pela troca de

informação genética (cruzamento) com outro indivíduo altamente adaptado,

produzindo indivíduos ainda melhores, ou seja, filhos com características de ambos

os pais. As mutações são freqüentemente permitidas pela alteração de alguns genes

dos cromossomos. Os melhores indivíduos podem substituir toda a geração anterior

ou substituir apenas os indivíduos menos adaptados. Geralmente, os algoritmos

genéticos proporcionam excelentes resultados na procura de ótimos globais, embora

sua convergência seja considerada relativamente lenta.

Simulated Annealing (SA) é uma técnica de busca local probabilística,

proposta originalmente por KIRKPATRICK et al. (1983). Fundamenta-se em uma

analogia com a termodinâmica, ao simular o resfriamento de um conjunto de átomos

aquecidos, operação conhecida como recozimento. O método faz analogia com o

seguinte processo: um sólido é aquecido a altas temperaturas e gradualmente

resfriado para permitir a sua cristalização. Como o processo de aquecimento permite

que os átomos se movimentem aleatoriamente, se o resfriamento não é realizado

muito rapidamente, então os átomos terão tempo suficiente para se alinharem de

modo a atingir um estado de mínima energia. Desta forma, o estado do sólido

corresponde a uma solução viável e a energia de cada estado corresponde ao valor

da função objetivo. Neste procedimento, a busca é permitida a prosseguir mesmo se

o movimento causar um aumento na função objetivo, pelo uso de um parâmetro

chamado temperatura. O valor da temperatura é controlado pelo processo de

resfriamento, sendo que valores baixos resultam em um algoritmo de busca local, ao

passo que valores altos reduzem a velocidade de convergência.

Tabu Search (TS) (GLOVER, 1986) é um método de busca local que consiste

em explorar o espaço de soluções movendo-se de uma solução para outra que seja

seu melhor vizinho. Esta estratégia, juntamente com uma estrutura de memória para

armazenar as soluções geradas (lista tabu) possibilita escapar dos ótimos locais (LIN

& MILLER, 2004).

Particle Swarm Optimization (PSO) (KENNEDY & EBERHART, 2001) tem

sido bastante aplicado em diversas áreas da ciência. A otimização por enxame de

partículas, é um método de busca global criado por KENNEDY & EBERHARDT em

1995, baseado na simulação do comportamento social de animais, os quais

observaram que estes apresentavam movimento localmente aleatório, mas

Capítulo 4 – Metodologia

globalmente determinado. Este método é utilizado em problemas de otimização não-

lineares sem restrições, e similar aos algoritmos evolucionários, o método PSO

também é baseado em uma população de indivíduos, denominada enxame de

partículas. Entretanto, a única modificação sofrida pelo indivíduo (partícula) é sua

localização no espaço por meio do operador velocidade, diferentemente de

algoritmos evolucionários, tais como em algoritmos genéticos, nos quais os

indivíduos sofrem alterações genéticas por meio dos operadores cruzamento,

mutação e seleção.

4.4.1. Enxame de Partículas ou Particle Swarm Optimization - PSO

No método de otimização conhecido como enxame de partículas (PSO), a

cada indivíduo da população (partícula) é atribuído um vetor que corresponde a uma

possível solução do problema. Cada partícula possui uma posição e uma velocidade

no espaço de busca, de dimensão igual ao número de parâmetros do problema,

resultando em um enxame de tamanho igual ao número de partículas. As partículas

atuam sob três influências que se combinam vetorialmente, atualizando sua

velocidade e posição no espaço: (

) vetor posição atual; (

) vetor melhor posição

visitada pela partícula e (

iii

) vetor melhor posição visitada pelo enxame.

A posição atual da partícula é dada pela equação (4.19):

(

)













−+=

→→→→

mínmáxmín

XXXX

(4.19)

A Figura 4.2 mostra como a trajetória de uma partícula, que inicialmente

encontra-se em repouso, é ajustada a cada iteração.

(

)

→

(

)

→

(

)

(

)













−

→→

XXc

melhor

(

)

(

)













−

→→

XXc

melhor

(

)

→

posição atual

próxima posição

Figura 4. 2 – Trajetória de uma partícula do algoritmo PSO.

Capítulo 4 – Metodologia

A cada iteração são atualizadas as velocidades das partículas e

consequentemente, as posições das partículas. A equação (4.20) é usada para

calcular as novas velocidades das partículas de acordo com suas velocidades

anteriores e componentes que direcionam para a melhor posição da partícula e a

melhor posição do enxame:

(

)

( )

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)













−+













−+=

→→→→→

→

XXcXXcVV

melhormelhor

2211

λλω

(4.20)

Sendo:

(

)

→

vetor próxima velocidade da partícula

;

(

)

→

vetor velocidade atual da partícula

;

(

)

→

vetor posição atual da partícula

;

(

)

→

vetor próxima posição da partícula

;

(

)

melhor

→

vetor melhor posição visitada pela partícula

;

(

)

melhor

→

vetor melhor posição visitada pelo grupo;

constante de aceleração local;

constante de aceleração global;

variável aleatória.

fator de inércia;

iteração;

A primeira parcela da equação 4.20 mantém cada partícula na direção prévia;

a magnitude deste vetor depende do fator de inércia (

). A segunda e terceira

parcelas representam a influência da melhor posição individual e da melhor posição

do enxame, respectivamente, sendo que suas magnitudes dependem das

constantes de aceleração (

c e

c ) e variáveis aleatórias (

Neste trabalho um valor apropriado para o fator de inércia

(

)

foi conseguido

pela equação (4.21):

( )













−

−+=

inicialfinalinicial

ωωωω

(4.21)

Sendo:

número de iterações.

Capítulo 4 – Metodologia

A utilização da equação (4.21) refina a busca da solução encontrada, evitando

que nas últimas iterações o método escape dos valores ótimos. Existem alguns

trabalhos que utilizam o fator de inércia como uma constante, no entanto, a

diferenciação na utilização deste parâmetro depende do problema a ser otimizado.

A Figura 4.3 apresenta o algoritmo para a implementação do método de

busca PSO. Para a inicialização da população são pré-definidos: o número de

indivíduos ou partículas, o número de iterações, o número de parâmetros, o limite de

busca (

mín

→

máx

→

), os fatores de inércia e as constantes de aceleração.

Sim

Não

Inicialização da população

Cálculo da Aptidão

Atualização da Posição das

partículas

Melhor posição visitada pela

partícula

Melhor posição visitada pelo

grupo (enxame)

Avaliação da posição atual das

partículas (limite de busca)

Entre com parâmetros

do método PSO

Atualização da Velocidade

das partículas

Critério de parada

atingido?

Melhor posição

global

Figura 4. 3 – Esquema do algoritmo PSO.

A partir daí, as partículas “voam” para novas posições de acordo com a

equação (4.22). O desempenho de cada partícula é medido de acordo com uma

função de aptidão pré-definida que é relacionada ao problema a ser resolvido.

(

)

(

)

(

)

11 +

→→

→

VXX

(4.22)

Capítulo 4 – Metodologia

O desempenho de cada partícula é medido de acordo com a função objetivo

pré-estabelecida como critério estatístico, avaliando-se, neste trabalho, o mínimo

global. Após um número especificado de iterações, a melhor solução encontrada é

utilizada como informação no processo de restrição do espaço de busca, sendo

restringidos apenas os parâmetros de maior sensibilidade sobre a função objetivo

global. Essa avaliação da sensibilidade dos parâmetros é possível por meio do

diálogo gráfico, utilizando o software Maple

Partindo dos conceitos básicos de um algoritmo metaheurístico, se faz

necessário realizar uma análise comportamental do algoritmo. Desta forma,

necessita-se distinguir os fatores e constantes do método para a obtenção de

melhores resultados.

O fator de inércia (

) controla o grau de convergência da busca e, neste

trabalho, decresce linearmente de 9,0=

inicial

a 4,0=

final

Os valores de

são variáveis aleatórias sorteadas no intervalo (0,1), as

quais modificam as velocidades das partículas em cada iteração, perturbando suas

trajetórias a fim de atingir um ótimo global, evitando ótimos locais.

As constantes

c e

c são denominadas coeficientes de aceleração local e

global, respectivamente, e seus valores devem ser 0

>c e 2

≤c . Segundo

OLIVEIRA (2005), o algoritmo tende a convergir mais lentamente se valores altos de

c são adotados, mas atinge melhores desempenhos. Por outro lado, valores baixos

c , apesar de diminuir o desempenho do algoritmo, resultam em convergência

mais rápida. O aumento de

c implica uma maior velocidade de convergência, pois

este fator é responsável pela velocidade parcial relativa à melhor posição global.

Contudo, a ponderação alta para essa parcela da velocidade implica em diminuição

da diversificação do algoritmo, uma vez que todas as partículas tendem para a

mesma posição. Isso resulta obtenção de ótimos locais, ao invés de ótimos globais,

diminuindo a eficiência do algoritmo. Valores de

cc < aumentam a chance de

escapar de ótimos locais, porém atrasam o encontro dos ótimos globais.

Atingido o critério de parada, conforme o desempenho da função objetivo,

dado pelas expressões (4.23) e (4.24), tem-se a melhor posição global, isto é, a

melhor posição visitada pelo enxame:

Capítulo 4 – Metodologia

(

)

(

)

11 +

→

melhor

(

)

(

)

)()(

1 k

melhor

XfXf

→

(4.23)

(

)

(

)

11 +

→

melhormelhor

XX se

(

)

(

)

)()(

1 k

melhormelhor

XfXf

→

(4.24)

É importante lembrar que métodos de otimização mais complexos, como os

citados anteriormente, podem ser utilizados para resolução de modelos não-lineares.

Contudo, adotou-se o método de otimização por enxame de partículas, pois

converge para um ótimo global, de maneira relativamente rápida, sem “cair” em

ótimos locais e, geralmente, fornece resultados próximos aos obtidos por algoritmos

genéticos, porém são mais rápidos e mais simples de programar.

4.5. Procedimento para Identificação dos Parâmetros

Os parâmetros cinéticos, estequiométricos e interativos dos modelos

avaliados são estimados utilizando o método enxame de partículas (PSO), com

dados experimentais extraídos da literatura (DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999;

HAMED et al., 2003). O procedimento também inclui o diálogo gráfico utilizando o

software Maple

, possibilitando a análise de sensibilidade dos parâmetros e

avaliação da resposta do sistema.

A busca pelos valores dos parâmetros pelo método PSO foi guiada pelo

significado microbiológico de cada parâmetro e serviu de base às variações do limite

de busca, em que a tendência dos melhores valores foi preservada. A determinação

do intervalo de possibilidades dos parâmetros inicia-se por meio de uma estimativa

inicial, baseada no conhecimento da fisiologia microbiana, além de valores

apresentados na literatura. Em seguida, por meio de repetidas buscas e análises

dos resultados obtidos, é possível a diminuição até um espaço de busca pequeno

que restringe os valores ótimos baseados nos parâmetros com maior sensibilidade

do processo. Os dados experimentais são graficados juntamente com as simulações

dos modelos avaliados, utilizando as mesmas condições iniciais e o mesmo número

de iterações. Na Tabela 4.3 são apresentados os valores utilizados para os

parâmetros do método PSO.

A avaliação da eficiência dos modelos é feita por meio do valor mínimo da

função objetivo global, dada pelos mínimos quadrados, encontrada para o mesmo

número de iterações em cada caso estudado. Para as variáveis substrato (S) e

Capítulo 4 – Metodologia

biomassa (X), o cálculo da função objetivo é dado pelas equações 4.25 e 4.26,

respectivamente:

∑













−

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Capítulo 5

Neste capítulo são avaliados os modelos cinéticos não-estruturados de

crescimento microbiano para a biodegradação de único e múltiplos substratos, BTEX

e BTF, em operação batelada.

5.1. Biodegradação dos Compostos BTEX

Os dados experimentais utilizados para a avaliação dos modelos cinéticos

propostos foram extraídos de DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999) e são

apresentados na Tabela 5.1 para a biodegradação da mistura dos compostos BTEX,

e nas Tabelas 5.2, 5.3, 5.4 e 5.5 para a biodegradação individual destes compostos.

Os experimentos de DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999) testando a

biodegradação dos compostos BTEX, individualmente e em mistura, foram

conduzidos em reator batelada a 35 °C, no qual duas associações microbianas e

uma cultura pura foram capazes de degradar todos os compostos BTEX. As

associações de culturas, derivadas de um aqüífero contaminado por gasolina, foram

enriquecidas no tolueno a 20 °C e 35 °C, respectivamente. A cultura pura

caracterizada como Rhodococcus rhodochrous foi isolada a partir da associação

microbiana enriquecida no tolueno a 35 °C. Rhodococcus rhodochrous foi capaz de

degradar cada um dos compostos BTEX, individualmente e em mistura.

Os reatores foram operados a uma taxa de mistura de 175 rpm, na qual as

limitações por transferência de massa do oxigênio são superadas segundo CHANG

& ALVAREZ-COHEN (1995). O oxigênio foi necessário para manter 15 a 21% de

oxigênio na fase líquida constante no headspace. Totalizando o volume de 250 mL,

cada um dos reatores apresentaram 125 mL de líquido (sais minerais e células), 123

mL de headspace e 2 mL para promover a mistura e preservar a agregação das

células. Os microorganismos foram mantidos no intervalo de pH 6,8 a 7. As massas

de aromáticos adicionadas foram calculadas usando as constantes da lei de Henry,

volume do líquido e do gás no reator e concentrações dos substratos na fase líquida

e gasosa. Os valores das constantes da lei de Henry para os compostos BTEX

foram determinados a 35 °C e calculadas como descrito por ASHWORTH et al.

(1987) apud DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999).

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 1 – Dados experimentais do processo de biodegradação do BTEX

Tempo

(h)

Benzeno

(mg L

-1

)

Tolueno

(mg L

-1

)

Etilbenzeno

(mg L

-1

)

o-Xileno

(mg L

-1

)

0 20,00 20,00 20,00 20,00

2,00 18,80 16,70 13,00 19,10

2,50 18,00 14,20 9,50 18,50

3,00 17,50 12,00 6,40 18,00

3,50 16,25 9,00 3,20 17,25

4,25 10,50 1,00 0,50 15,70

5,50 0 0 0 8,00

6,00 - - - 5,50

6,50 - - - 4,10

6,80 - - - 3,20

8,20 - - - 0

Fonte: DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

Tabela 5. 2 – Dados experimentais do processo de biodegradação do benzeno

Tempo (h) Benzeno (mg L

-1

)

0 20,00

1,20 14,00

2,00 7,50

2,75 3,00

3,00 1,00

3,25 0

Fonte: DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

Tabela 5. 3 – Dados experimentais do processo de biodegradação do tolueno

Tempo (h) Tolueno (mg L

-1

)

0 20,00

1,20 15,00

2,00 8,20

2,70 1,00

2,80 0,10

Fonte: DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

Tabela 5. 4 – Dados experimentais do processo de biodegradação do etilbenzeno

Tempo (h) Etilbenzeno (mg L

-1

)

0 20,00

1,23 15,00

1,98 10,00

2,65 5,65

3,23 1,50

3,65 0

Fonte: DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 5 – Dados experimentais do processo de biodegradação do o-xileno

Tempo (h) o-Xileno (mg L

-1

)

0 20,00

1,20 16,85

2,10 14,50

2,85 7,50

3,80 2,00

4,00 1,75

4,40 0

Fonte: DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

Os balanços de massa em reator batelada para a biomassa e para o

composto “

” são expressos pelas equações (4.7) e (4.8), respectivamente. Admite-

se que I

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

stxtt

tmáx

tSKs

tdS

)(

Υ+

−=

(5.2)

sexee

emáx

tSKs

tdS

)(

Υ+

−=

(5.3)

sxxxx

xmáx

tSKs

tdS

)(

Υ+

−=

(5.4)

5.1.1.2. Modelo de Andrews

Os balanços individuais para os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e

orto-xileno são expressos pelas equações (5.5), (5.6), (5.7) e (5.8), respectivamente:

sbx

bmáx

tSKs

tdS

)(

−=

(5.5)

stx

tmáx

tSKs

tdS

)(

−=

(5.6)

sex

emáx

tSKs

tdS

)(

−=

(5.7)

sxx

xmáx

tSKs

tdS

)(

−=

(5.8)

O software Maple

foi utilizado para obter a solução numérica das equações

diferenciais, o ajuste de parâmetros e as simulações dos modelos. Adotou-se o

método de Runge-Kutta-Fehlberg de 4ª e 5ª ordens para a resolução numérica das

equações diferenciais, utilizando-se as seguintes condições iniciais: 20 mg L

-1

para a

concentração inicial de substrato e 11,925 mg L

-1

para a concentração inicial de

células. O valor da concentração inicial de células foi estimado pelo método PSO,

juntamente com os parâmetros de cada modelo.

5.1.1.3. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação individual

dos substratos BTEX

As Figuras 5.1 a 5.8 apresentam as simulações dos modelos de Monod e

Andrews à biodegradação dos compostos BTEX individualmente, juntamente com os

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

dados experimentais conduzidos em reator batelada, utilizando uma mistura de

culturas microbianas (DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999).

Os parâmetros cinéticos e estequiométricos dos modelos de Monod e

Andrews utilizados nas simulações são apresentados nas Tabelas 5.6 e 5.7,

respectivamente. A busca pelos valores dos parâmetros utilizando o método PSO foi

guiada pelo significado microbiológico de cada parâmetro que serviu de base às

variações do limite de busca, na qual a tendência dos melhores valores foi

preservada.

Tabela 5. 6 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

dos compostos BTEX individualmente - Modelo de Monod

Parâmetros Benzeno Tolueno Etilbenzeno Xileno

máx

-1

) 0,30 0,33 0,27 0,24

(mg L

-1

) 1,25 0,64 0,85 0,58

x/s

(mg mg

-1

) 0,73 0,82 0,81 0,95

Utilizando-se o modelo de Monod verifica-se que a taxa máxima de

crescimento específico

máx

µ mostra-se similar para os compostos BTEX e o baixo

valor de Ks indica que a cultura apresentou maior afinidade com o xileno e desta

forma resultou maior valor para o coeficiente de rendimento

s/x

Υ no xileno.

Tabela 5. 7 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

dos compostos BTEX individualmente - Modelo de Andrews

Parâmetros Benzeno Tolueno Etilbenzeno Xileno

máx

-1

) 0,22 0,46 0,26 0,19

(mg L

-1

) 0,92 0,65 1,50 2,55

x/s

(mg mg

-1

) 0,48 0,95 0,40 0,15

(mg L

-1

) 150 45 20 5

Aplicando o modelo de Andrews verifica-se que a taxa máxima de

crescimento específico

máx

µ é maior no tolueno e os dados experimentais mostram

que este foi utilizado mais rapidamente, ao passo que a utilização do xileno foi mais

demorada e proporcionou menor valor de

máx

µ . Neste caso, o valor de Ks mostra

que a cultura apresenta maior afinidade com o tolueno e desta forma resulta maior

valor do coeficiente de rendimento

s/x

Υ no tolueno.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Figura 5. 1 – Simulações do modelo de

Monod e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o benzeno.

Figura 5. 2 – Simulações do modelo de

Andrews e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o benzeno.

Figura 5. 3 – Simulações do modelo de

Monod e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o tolueno.

Figura 5. 4 – Simulações do modelo de

Andrews e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o tolueno.

Figura 5. 5 – Simulações do modelo de

Monod e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o

etilbenzeno.

Figura 5. 6 – Simulações do modelo de

Andrews e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o

etilbenzeno.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Figura 5. 7 – Simulações do modelo de

Monod e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o xileno.

Figura 5. 8 – Simulações do modelo de

Andrews e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o xileno.

Nas Figuras 5.1, 5.3, 5.5 e 5.7 observa-se um ótimo ajuste entre as

simulações do modelo de Monod e os dados experimentais. Verifica-se que o

modelo de Monod prediz satisfatoriamente a cinética de biodegradação individual

dos compostos BTEX, principalmente em baixas concentrações (CHANG et al.,

1993). O modelo de Andrews também se ajustou bem aos dados experimentais,

como pode ser visto nas Figuras 5.2, 5.4, 5.6 e 5.8. Logo, o modelo de inibição pelo

substrato também pode representar os dados experimentais de DEEB & ALVAREZ-

COHEN (1999). Concentrações iniciais de substratos mais elevadas (acima de 40

mg L

-1

) favorecem o ajuste pelo modelo de Andrews (BIELEFELDT & STENSEL,

1999a; SHIM & YANG, 1999; SHIM et al., 2005), pois fornece maiores informações

sobre o sistema que apresenta efeitos de inibitórios, quando a concentração dos

substratos encontra-se perto de valores tóxicos ao crescimento celular. Além disso,

se o número de dados experimentais é maior que o número de parâmetros do

modelo, o modelo que apresenta a maior quantidade de parâmetros também se

torna privilegiado durante o ajuste aos dados experimentais.

A Tabela 5.8 apresenta a comparação entre os modelos de Monod e

Andrews, avaliando o resíduo mínimo obtido durante a estimativa dos parâmetros

pelo método PSO. Ambos os modelos alcançaram valores da função objetivo

similares para os compostos, benzeno, etilbenzeno e xileno.

Como pode ser verificado nas Figuras 5.1 a 5.8, não foi possível a avaliação

do sistema com relação ao crescimento dos microorganismos, por falta de dados

experimentais da concentração de biomassa. No entanto, os valores dos

coeficientes de rendimento estimados e utilizados na simulação do crescimento da

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

biomassa, mostraram-se coerentes com diversos valores extraídos da literatura,

sendo que alguns são apresentados na Tabela 1, em Anexos.

Tabela 5. 8 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos cinéticos

de único substrato na biodegradação dos compostos BTEX

Função Objetivo (equação 4.25)

Substrato

Modelo de Monod Modelo de Andrews

Benzeno 2 10

-3

2 10

-3

Tolueno 10 10

-3

2,40 10

-3

Etilbenzeno 1 10

-3

0,75 10

-3

Xileno 19,50 10

-3

16,70 10

-3

A aplicação de 300 partículas e 25 iterações durante a implementação do

método PSO, utilizando um microcomputador AMD Sempron 2800 Hz, 512MB de

memória RAM, necessitou de um tempo médio de 3 minutos para a estimativa dos

parâmetros de ambos os modelos cinéticos de Monod e Andrews. Em geral, a

convergência do resíduo mínimo ocorreu em menos do que 25 iterações, como pode

ser verificado, por exemplo, na Figura 5.9 que mostra a evolução dos valores globais

da função objetivo aplicando o modelo de Andrews à biodegradação do etilbenzeno.

Figura 5. 9 – Evolução dos melhores valores globais da função objetivo aplicando o modelo

de Andrews na biodegradação do etilbenzeno.

Durante este procedimento verificou-se que, independentemente do número

de iterações aplicados, se o intervalo de busca estimado contém os valores ótimos,

então a convergência torna-se rápida.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Nas Figuras 5.10 - (a), (b), (c), e (d) - são apresentadas as simulações das

taxas de crescimento específico dos microorganismos, em cada composto BTEX,

em função de suas respectivas concentrações.

(a) (b)

Figura 5. 10 – Simulações da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de Monod

para os compostos BTEX.

A constante de saturação Ks do modelo de Monod é definida como a

concentração de substrato no qual

µ é igual à metade de

máx

. Quanto menor o

valor de Ks , maior será a afinidade entre o microorganismo e o substrato.

Entretanto, se o substrato é inibitório não é possível observar um

máx

“real” e desta

forma, Ks assume um significado hipotético. Dos três parâmetros cinéticos do

modelo de Andrews a constante Ki representa o efeito inibitório do substrato, mas

quando este valor é muito elevado, a equação de Andrews assume a forma da

equação de Monod.

Nas Figuras 5.11 - (a), (b), (c) e (d) - são apresentadas as simulações da

dependência da taxa de crescimento específico da associação microbiana em

função da concentração dos substratos BTEX aplicando o modelo de Andrews.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

(a) (b)

Figura 5. 11 – Simulações da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de

Andrews para os compostos BTEX.

A taxa máxima de crescimento específico “real” em substratos inibitórios pode

ser determinada estimando-se o ponto crítico da primeira derivada da equação de

Andrews. Assim, determina-se a concentração crítica de substrato e a taxa máxima

de crescimento específico do microorganismo, a partir das equações (5.9) e (5.10),

respectivamente.

KsKiS =

(5.9)

121

KsKi

máxmáx

µµ

(5.10)

Desta forma, a intensidade de inibição pelo substrato pode ser medida pela

razão entre as constantes de saturação e inibição, e não somente pelo valor de Ki .

As razões de

determinadas utilizando os valores apresentados na

Tabela 5.7 são iguais a 0,510 para o xileno; 0,075 para o etilbenzeno; 0,014 para o

tolueno e 0,006 para o benzeno. Portanto, o xileno representa o substrato com maior

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

efeito inibitório dentre os compostos BTEX, ao passo que o benzeno possui o menor

efeito; resultado similar ao apresentado por SHIM et al. (2005).

Utilizando os valores dos parâmetros cinéticos obtidos para o modelo de

Andrews (Tabela 5.7), estimam-se os valores da taxa máxima de crescimento

específico e concentração crítica dos substratos BTEX, apresentados na Tabela 5.9,

os quais podem ser visualizados a partir das simulações apresentadas na Figura

5.11.

Tabela 5. 9 – Valores da taxa máxima de crescimento específico e concentração

crítica dos compostos BTEX estimados aplicando o modelo de Andrews

Substrato

-1

)

S (mg L

-1

)

Benzeno 0,19 11,56

Tolueno 0,37 5,70

Etilbenzeno 0,17 5,47

Xileno 0,08 3,57

5.1.2. Modelos cinéticos para a biodegradação de múltiplos substratos

Embora o crescimento microbiano em mistura de substratos seja comumente

encontrado em biorremediação, tratamento de efluentes e processos de

fermentação, a modelagem matemática da cinética do sistema em múltiplos

substratos ainda tem sido limitada. O desempenho de modelos cinéticos não-

estruturados foi avaliado, assumindo que a biodegradação da mistura dos

compostos BTEX possa ser representada pelos modelos de inibição competitiva,

inibição não-competitiva, inibição acompetitiva e pelo modelo SKIP.

Os balanços para cada um dos substratos presentes na mistura dos

compostos BTEX são dados pelas equações (5.11), (5.12), (5.13) e (5.14), para o

benzeno, tolueno, etilbenzeno e orto-xileno, respectivamente:

(

)

( )

tdS

−=

(5.11)

(

)

( )

tdS

−=

(5.12)

(

)

( )

tdS

−=

(5.13)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

(

)

( )

tdS

−=

(5.14)

O software Maple

foi utilizado para obter a solução numérica das equações

diferenciais, o ajuste de parâmetros e as simulações dos modelos. Adotou-se o

método de Runge-Kutta-Fehlberg de 4ª e 5ª ordens para a resolução numérica das

equações diferenciais, utilizando-se as seguintes condições iniciais: 20 mg L

-1

para a

concentração inicial de BTEX e 2,45 mg L

-1

para a concentração inicial de células.

Por falta de dados experimentais, o valor da concentração inicial de células foi

estimado pelo método PSO, juntamente com os parâmetros de cada modelo.

5.1.2.1. Modelo de Inibição Competitiva

As taxas de crescimento específico no benzeno, tolueno, etilbenzeno e orto-

xileno são dadas pelas equações (5.15), (5.16), (5.17) e (5.18), respectivamente,

para a mistura dos compostos BTEX:

















































tbb

bmáx

SSKs

(5.15)

















































btt

tmáx

SSKs

(5.16)

















































bee

emáx

SSKs

(5.17)

















































bxx

xmáx

SSKs

(5.18)

5.1.2.2. Modelo de Inibição Não-Competitiva

As taxas de crescimento específico no benzeno, tolueno, etilbenzeno e orto-

xileno são dadas pelas equações (5.19), (5.20), (5.21) e (5.22), respectivamente,

para a mistura dos compostos BTEX:

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

















































tbb

bmáx

SSKs

(5.19)

















































btt

tmáx

SSKs

(5.20)

















































bee

emáx

SSKs

(5.21)

















































bxx

xmáx

SSKs

(5.22)

5.1.2.3. Modelo de Inibição Acompetitiva

As taxas de crescimento específico no benzeBzFFMCnzeBFLBBFLFLBFLFLFLB” dFL–êØ 2.ã0papp4ecí2.fp0.m.çpaêČ 2.ã0ãpa2ç0óaê”.ã0papp4et ntF pcãmaóçp-ê é éóóãØ fax dF–êØØ 2cf0ma2.l2pxm0mça2Kxm0ãmaê” dn–m0.xpcódz–.fde–2c0êØ 2.ç.0papp4ecccccafafaç0cccccafafa“Üa5é ωKdco–2c0çcccafafa“%d7–.0ãcxóçd9–xxm0.xpJfiBMiB8..ê 8ú..2f0ma.KêÜ d –êØ 9ê é é ω ç0cccccafafaç0cccccafafa“Ü35ê 8ú..a.paêČ .afafa.pa= ωacãçcd5–2c02maê”çmKãKd8– ppa..pãFL2K é ωxa.p0Kpê” dFL2K é ωxaα âaé ωacãçcd5–2c02maê”çmKãKd8– pxx.0cxFL2K é ωxa.p0Kóxaó.FL2K é ωxaα âaé ωacãçcd5–2c02maê”çmKãKd8– p.xp0.óFL2K é ωxa.pcfpc ã.FL2K é ωxaα âaé óa= ωacãçcd5–2c02maê”çmKãKd8– dççØ fax ãaê” .N–êØ fK0p.ax ãaê” .Nα âaé ωçpaêČ pã.0.pa2ã0cmaê” dF–êØ 8úpó.a.p0f.2ó0ó2c0çóKmmdl–p0.KKm.p.ã0mKêØ móaê” dN–êØ xxma2N–êØ dI–g p0mçaê” dV–êØ 2.ã dÜ–êØ ê” dM–ê”xxma20.p0mçaê dQ–êØ 2c.0m.p.aê” dS–êØ 8ú..fa.ã dÜ–êØ pçaê” dQ–êØ .2ó0ó2c0çóKçpçaê”Ø 2cK0ça2.aê” dF–xcK2cm0.pa.ã0cpaØ 2cm0.pa.ã0cpaaçpxm0çcfFQxçp 2c.0cpxmØ 2c2 ê 8úafafaç0ccêØ 8úxmdC–êØ 2.ãpaê” dM–êØ 2pm0móa2ã0c” dC–êØ8mdC–êØ 2.K0ãpaêØ 8úxmdC–êØ 2.ãpaê” dX–Kpa.K0pçaê” dFL–K0ECQCFL dFL–êØ 2xmmçaê”ê” dFL–êØ 2pf0.ma2K0ãpaK” dN–Ø 2fmçaê”ã0cmaê” dFL–êØ ç0.ma.K0pçaêã.ω ç0ccdM–afaê” dB–êØ 2cK.2ó0ó2c0çóKxó0cpa22f0póa” dQ–êØ 2.çmp2ã0mdC–êØ 2.Ø 9ê é ê é ω pófpaxçKx0mKc 2..0mmdC–êØ 2. CC CFLFXMdçdàdaxxç0L22)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

( )

xbxebetbtbb

bmáx

ISISISSKs

++++

(5.27

)

( )

xtxetebtbtt

tmáx

ISISISSKs

++++

(5.28

)

( )

xextetbebee

emáx

ISISISSKs

++++

(5.29

)

( )

exetxtbxbxx

xmáx

ISISISSKs

++++

(5.30)

5.1.2.5. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura

BTEX

As Figuras 5.12 a 5.16 apresentam as simulações dos modelos de inibição e

modelo SKIP aplicados para a biodegradação dos compostos BTEX em mistura,

juntamente com os dados experimentais de estudos conduzidos em reator batelada

a 35 °C, utilizando mistura de cultura (DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999).

No estudo da cinética de biodegradação da mistura BTEX a dificuldade em

encontrar o valor ótimo global e o esforço computacional foram maiores, devido ao

maior número de parâmetros a serem estimados – 12 parâmetros para os modelos

de inibição e 24 parâmetros para o modelo SKIP. A partir da análise do resíduo

mínimo obtido para cada modelo, apresentada na Tabela 5.10, além de inspeção

visual das simulações, foi possível determinar o modelo que melhor descreve os

dados experimentais da biodegradação da mistura BTEX.

Tabela 5. 10 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de

múltiplos substratos na biodegradação dos compostos BTEX

Modelo Função Objetivo (equações 4.25)

SKIP

6,60 10

-3

Inibição Competitiva 26,80 10

-3

Inibição Não-Competitiva 56,50 10

-3

Inibição Acompetitiva 38,95 10

-3

O modelo cinético SKIP representou melhor os dados experimentais de DEEB

& ALVAREZ-COHEN (1999), resultando em um menor valor da função objetivo. Os

vinte e quatro parâmetros do modelo, apresentados nas Tabelas 5.11 e 5.12,

necessitaram de um esforço computacional bastante elevado e foram obtidos após

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

um tempo médio de 55 minutos, utilizando-se um microcomputador AMD Sempron

2800 Hz, 512 MB de memória RAM. Além disso, apresentaram grande dificuldade

em correlacionar cada parâmetro de maneira a obter seus significados

microbiológicos coerentes.

Tabela 5. 11 – Valores dos parâmetros cinéticos e estequiométricos estimados para

os compostos BTEX aplicando o Modelo SKIP

Parâmetros

Substrato

máx

-1

) K

(mg L

-1

) Y

x/s

(mg mg

-1

)

Benzeno 0,41 1,11 0,30

Tolueno 0,42 1,24 0,18

Etilbenzeno 0,45 1,75 0,32

Xileno 0,05 20 0,05

Tabela 5. 12 – Valores dos parâmetros interativos estimados para os compostos

BTEX aplicando o Modelo SKIP

1,0000 10,0000 0,0070 0,0023 4,5000 0,0005

0,1750 0,0250 0,1000 1,1000 1,7136 7,0750

O método de estimativa dos parâmetros, desenvolvido neste trabalho, mostra-

se muito eficiente na predição da cinética de biodegradação de compostos tóxicos,

e, portanto pode ser bastante útil na modelagem destes processos, particularmente

em processos complexos em que múltiplos substratos estão envolvidos. Os valores

dos parâmetros estimados neste trabalho podem ser comparados com valores

encontrados na literatura, alguns apresentados na Tabela 1, em Anexos. Um dos

problemas encontrados no estudo da cinética de biodegradação é a variabilidade

potencial dos parâmetros cinéticos. Os relatos utilizando-se culturas puras mostram

que a taxa máxima de crescimento específico

máx

µ varia de 0,0194 a 0,73 h

-1

benzeno e 0,0064 a 0,86 h

-1

no tolueno. Em estudo recente, LIN et al. (2007)

utilizaram o modelo de Andrews para descrever a cinética de biodegradação

individual dos compostos BTEX por Pseudomonas aeruginosa. Estes autores

encontraram valores bastante baixos para

máx

µ (Tabela 1 em Anexos), sendo igual a

0,034 h

-1

no etilbenzeno. As investigações da cinética de biodegradação do xileno,

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

em mistura de culturas, mostram valores de

máx

µ no intervalo 0,0047-0,383 h

-1

, Ks

no intervalo 0,16-13,2725 mg L

-1

s/x

Υ entre 0,05-0,52 mg mg

-1

. Na biodegradação

do b

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

A utilização simultânea observada durante a biodegradação dos compostos

BTEX é uma evidência de que o processo esteja ocorrendo devido à indução não-

específica de enzimas para degradação dos substratos similares ou à convergência

de rotas metabólicas para utilização de múltiplos substratos. Entretanto, mesmo que

os compostos sejam degradados simultaneamente, algumas vezes estes não são

utilizados pela mesma rota metabólica, necessitando compreender quais outros

mecanismos de regulação gênica estão envolvidos na biodegradação.

Os resultados dos modelos de inibição são apresentados nas Figuras 5.13 a

5.15. Estes modelos apresentaram maiores dificuldade na estimativa da taxa

máxima de crescimento específico

(

)

máx

, que resultaram valores no intervalo de

0,42-0,75 h

-1

para os compostos, benzeno, tolueno e etilbenzeno, e 0,14-0,36 h

-1

para o xileno. Os modelos de inibição necessitaram de 37 minutos, em média,

durante a estimativa dos parâmetros, utilizando um microcomputador AMD Sempron

2800 Hz e 512 MB de memória RAM. Na Figura 5.13 observa-se uma boa predição

do modelo de inibição competitiva para os substratos BTEX.

Figura 5. 13 – Simulações do modelo de Inibição Competitiva e dados experimentais (DEEB &

ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX.

DEEB & ALVAREZ-COHEN (2000), durante investigações sobre as

interações entre os substratos BTEX em mistura, utilizando espécies Rhodococcus,

encontraram interações positivas (cometabolismo) e negativas (inibição competitiva

e não-competitiva). BIELEFELDT & STENSEL (1999a,b) também encontraram

efeitos de inibição competitiva durante a biodegradação das misturas BTEX e, desta

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

Xileno

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

forma, modelaram os dados experimentais aplicando o modelo de inibição

competitiva proposto por YOON et al. (1977).

As Figuras 5.14 e 5.15 apresentam as simulações dos modelos de inibição

não-competitiva e acompetitiva, respectivamente, com uma pequena diferença entre

as simulações e os dados experimentais dos substratos BTEX.

Figura 5. 14 – Simulações do modelo de Inibição Não-Competitiva e dados experimentais

(DEEB & ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX.

Figura 5. 15 – Simulações do modelo de Inibição Acompetitiva e dados experimentais (DEEB

& ALVAREZ-COHEN, 1999) para o BTEX.

Analisando as simulações, aplicando os modelos de inibição competitiva e

não-competitiva, respectivamente, verificada nas Figuras 5.13 e 5.14, provavelmente

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

Xileno

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

Xileno

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

tenha ocorrido uma mistura de inibições entre os substratos BTEX, como sugerem

DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999).

Para que os modelos possam ser discriminados, somente a inspeção visual

dos resultados simulados comparados aos dados experimentais e o valor da função

objetivo podem não ser suficientes. Análises estatísticas devem ser realizadas para

assegurar a qualidade dos resultados obtidos. No entanto, neste trabalho esta

metodologia não foi possível, pois os autores DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999)

não forneceram dados importantes para uma análise estatística, tais como, erro

experimental, quantidade e repetição dos experimentos, dentre outros.

Na Figura 5.16 verifica-se a evolução dos valores globais da função objetivo

ao longo do procedimento iterativo aplicando o modelo SKIP. O processo iterativo

termina com os valores globais ótimos de cada parâmetro e com o menor valor da

função objetivo adotada durante a implementação do método PSO.

Figura 5. 16 –

Evolução dos melhores valores globais da função objetivo aplicando o modelo

SKIP na biodegradação do BTEX.

Os ótimos resultados alcançados durante a busca dos parâmetros deve-se a

estimativa inicial em um intervalo muito próximo dos valores ótimos, baseado no

conhecimento da fisiologia microbiana, ou seja, no conhecimento do comportamento

da população, adquirido durante a realização deste trabalho. Verificou-se que o

método PSO funciona muito bem quando os parâmetros estão “longe” do ótimo

global. E quando estão próximos, torna-se mais difícil o trabalho de busca, pois os

ótimos locais competem com os ótimos globais, e a busca torna-se instável.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Uma outra maneira de obter os parâmetros é adotar o método de

decomposição da função objetivo proposto por KROUMOV et al. (2006). O método

tem como fundamento a subdivisão da busca da solução global em etapas de busca

de soluções locais. Assim, diminui-se a dimensão da tarefa de busca e as melhores

soluções locais são preservadas para posteriormente efetuar a busca global.

Admitindo-se que o modelo SKIP descreve satisfatoriamente bem os dados

experimentais da biodegradação da mistura BTEX, assume-se que o crescimento da

biomassa possui a tendência apresentada na Figura 5.17.

Figura 5. 17 – Utilização dos compostos BTEX e simulação do crescimento da biomassa

aplicando o modelo SKIP.

A vantagem do modelo SKIP é que possibilita a quantificação das interações

entre os substratos BTEX, devido à presença de parâmetros de interação

I , os

quais representam a influência do substrato “

” sobre a taxa de biodegradação do

substrato “

”. A partir dos valores estimados pelo método PSO determina-se o grau

de interação entre os quatro compostos tóxicos BTEX. Conforme a Tabela 5.12, os

valores dos parâmetros interativos

I ,

I e

I mostram que a presença dos

compostos benzeno, tolueno ou xileno apresentam pouco ou nenhum efeito de

inibição sobre a biodegradação do etilbenzeno. Como esperado, o grau de inibição

do tolueno sobre a biodegradação do benzeno é muito maior do que o grau de

inibição do benzeno sobre a biodegradação do tolueno (

bttb

II >> ). O etilbenzeno

pode ser considerado o maior inibidor durante a biodegradação dos compostos

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

Xileno

Biomassa

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

BTEX, conforme os parâmetros

I ,

I e

I , ao passo que o xileno apresenta um

efeito inibitório quase insignificante, como verificado pelos parâmetros

I ,

I e

I .

A associação microbiana utilizada no experimento de DEEB & ALVAREZ-

COHEN (1999) apresenta diversas espécies de microorganismos, as quais

provavelmente possuem múltiplos caminhos metabólicos para a biodegradação dos

compostos BTEX. Consequentemente efeitos de mistura de diferentes inibições

entre os substratos BTEX não são surpreendentes. Uma das culturas puras isoladas

a partir da associação microbiana foi caracterizada como Rhodococcus sp., espécie

que exibe uma variada capacidade metabólica, incluindo o ataque dioxigenase e

mono-oxigenase do anel aromático e clivagem do anel catecol por ambas as vias

orto ou meta (KIM et al., 2004; MARUYAMA et al., 2005).

A falta de especificidade do modelo SKIP não o torna inadequado para

descrever a biodegradação da mistura dos compostos BTEX, apenas não possibilita

a qualificação das interações envolvidas entre os substratos. Para adicionar maiores

informações sobre as interações e caminhos metabólicos presentes na

biodegradação de compostos tóxicos aromáticos, a seguir são apresentados a

avaliação da modelagem cinética da biodegradação do benzeno, tolueno e fenol,

utilizando Pseudomonas putida F1.

5.2. Biodegradação dos Compostos BTF

Os dados experimentais utilizados para avaliar o desempenho dos modelos

cinéticos foram extraídos de HAMED et al. (2003). Neste estudo, foi utilizado

Pseudomonas putida F1 ATCC 700007 para a biodegradação de todos os

compostos BTF, individualmente e em misturas. Os microorganismos foram pré-

adaptados em benzeno a 30 mg L

-1

e tolueno a 28 mg L

-1

. As células foram

distribuídas em frascos de 160 mL, contendo 16 mL de solução de sais minerais e,

em seguida, os substratos benzeno, tolueno e fenol foram adicionados. Os

experimentos foram conduzidos a 30 °C e pH 7, utilizando-se um shaker com uma

velocidade de agitação de 150 rpm. Conforme CHANG & ALVAREZ-COHEN (1995)

esta taxa de mistura mostrou-se superar as limitações por transferência de massa do

oxigênio. As massas de aromáticos adicionadas foram calculadas usando as

constantes da lei de Henry, volume do líquido e do gás no reator e concentrações

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

dos substratos na fase líquida e gasosa. Os valores das constantes da lei de Henry

para os compostos BTF foram determinados a 30 °C e calculadas como descrito por

ASHWORTH et al. (1987) apud HAMED et al. (2003).

Nas Tabelas 5.13 a 5.15 são apresentados os dados experimentais da

biodegradação individual dos compostos BTF, juntamente com os dados de

crescimento da biomassa.

Tabela 5. 13 – Dados experimentais do processo de biodegradação do fenol

Tempo (h) Fenol (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 200,00 28,00

2 200,00 28,00

4 200,00 28,00

6 200,00 31,20

8 191,67 32,00

10 179,17 43,20

12 154,17 45,60

14 150,00 46,40

16 141,67 47,20

18 118,75 48,80

20 116,67 55,20

22 91,67 59,20

24 83,33 68,00

26 79,17 78,40

28 66,67 80,80

30 62,50 83,20

32 20,83 85,60

35 0 88,00

Fonte: HAMED et al. (2003)

Tabela 5. 14 – Dados experimentais do processo de biodegradação do benzeno

Tempo (h) Benzeno (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 60,00 45,00

1 60,00 45,00

2 48,75 51,62

3 37,50 85,18

4 26,25 144,55

5 3,75 206,50

6 0 240,00

7 0 240,00

Fonte: HAMED et al. (2003)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 15 – Dados experimentais do processo de biodegradação do tolueno

Tempo (h) Tolueno (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 55,00 46,15

1 48,00 46,15

2 45,92 90,38

3 21,70 123,10

4 10,42 156,25

5 4,17 192,31

6 1,04 188,46

7 0 180,77

Fonte: HAMED et al. (2003)

Os dados experimentais da biodegradação das misturas benzeno-tolueno,

benzeno-fenol e tolueno-fenol são apresentados nas Tabelas 5.16, 5.17 e 5.18.

Tabela 5. 16 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura

benzeno-tolueno

Tempo (h) Benzeno (mg L

-1

) Tolueno (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 60,00 55,00 16,36

1 60,00 55,00 16,36

2 60,00 53,75 27,27

3 57,50 47,50 32,73

4 51,25 36,25 62,73

5 40,00 16,25 147,27

6 20,00 2,50 226,36

7 2,50 0 349,10

8 0 0 393,85

9 0 0 398,86

Fonte: HAMED et al. (2003)

Tabela 5. 17 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura

benzeno-fenol

Tempo (h) Benzeno (mg L

-1

) Fenol (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 60,00 200,00 30,00

2 60,00 200,00 30,00

4 60,00 200,00 30,00

6 50,00 200,00 32,75

8 25,25 200,00 92,25

9 3,25 200,00 189,25

10 0 110,00 214,25

12 - 72,00 221,43

14 - 50,00 225,75

16 - 30,00 239,25

18 - 0 226,25

Fonte: HAMED et al. (2003)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 18 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura

tolueno-fenol

Tempo (h) Tolueno (mg L

-1

) Fenol (mg L

-1

) Biomassa (mg L

-1

)

0 55 200,00 30,00

1 55 200,00 28,48

3 25 200,00 28,92

5 0 200,00 75,64

7 0 143,25 93,48

9 - 112,25 102,48

11 - 82,75 150,00

13 - 12,75 172,48

15 - 0 196,15

17 - 0 190,48

Fonte: HAMED et al. (2003)

Os dados experimentais da biodegradação da mistura ternária benzeno-

tolueno-fenol e crescimento da biomassa, obtidos de HAMED et al. (2003), são

apresentados na Tabela 5.19.

Tabela 5. 19 – Dados experimentais do processo de biodegradação da mistura

benzeno-tolueno-fenol

Tempo

(h)

Benzeno

(mg L

-1

)

Tolueno

(mg L

-1

)

Fenol

(mg L

-1

)

Biomassa

(mg L

-1

)

0 60,00 55,00 200,00 48,70

2 60,00 55,00 200,00 48,70

4 48,48 33,35 200,00 83,48

6 27,27 9,10 200,00 180,00

8 0 0 200,00 290,43

10 - - 84,85 297,40

12 - - 50,00 300,87

13 - - 34,85 306,10

14 - - 19,70 309,57

15 - - 0 299,15

Fonte: HAMED et al. (2003)

5.2.1. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação individual dos

substratos BTF

Os modelos de Andrews e Monod foram aplicados para descrever os dados

experimentais de HAMED et al. (2003), nos quais 60 mg L

-1

de benzeno, 55 mg L

-1

de tolueno e 200 mg L

-1

de fenol foram biodegradados individualmente. Os

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

parâmetros dos modelos foram estimados pelo método PSO, e são apresentados na

Tabela 5.20. O procedimento de estimativa dos parâmetros requereu um tempo de

10 a 15 minutos, aplicando 300 partículas e 25 iterações no método PSO.

Tabela 5. 20 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

dos compostos BTF individualmente aplicando os modelos de único substrato

Parâmetros

Modelos Substratos

máx

-1

)

(mg L

-1

) Y

x/s

(mg mg

-1

) K

(mg L

-1

)

Benzeno 0,48 3,10 3,18 97

Tolueno 0,47 4,80 2,54 107

Andrews

Fenol 0,11 76,50 0,32 84

Benzeno 0,34 3,00 3,15 -

Monod

Tolueno 0,33 1,85 2,55 -

O objetivo foi identificar parâmetros cinéticos e estequiométricos que

apresentam significado microbiológico adequado às condições estudadas por

HAMED et al. (2003). Os parâmetros cinéticos variam em um intervalo grande, pois

dependem do microorganismo utilizado, cultura pura ou mistura de culturas, além

das condições ambientais. A taxa máxima de crescimento específico

(

)

máx

µ para o

fenol tem sido relatada por estar no intervalo de 0,131-0,363 h

-1

utilizando-se mistura

de culturas e 0,10-0,90 h

-1

utilizando-se Pseudomonas putida F1.

Como mencionado anteriormente, o caráter inibitório do substrato pode ser

determinado através da razão entre as constantes de saturação e inibição. Desta

forma, a partir dos parâmetros apresentados na Tabela 5.20, obtêm-se os valores:

0,032 para o benzeno, 0,045 para o tolueno e 0,91 para o fenol. Isto significa que o

fenol apresenta o maior efeito inibitório ao crescimento celular, seguido pelo tolueno

e benzeno.

As simulações do modelo de Andrews, para a biodegradação do benzeno e

para o crescimento da biomassa, juntamente com os dados experimentais, são

apresentadas nas Figuras 5.18 e 5.19, respectivamente. As simulações do modelo

de Monod são apresentadas nas Figuras 5.20 e 5.21, para a biodegradação do

benzeno e para o crescimento da biomassa, respectivamente.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Figura 5. 18 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para o benzeno.

Figura 5. 19 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa.

Figura 5. 20 – Simulação do modelo de

Monod e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para o benzeno.

Figura 5. 21 – Simulação do modelo de

Monod e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para a biomassa.

A inabilidade dos modelos Monod e Andrews em descrever exatamente o

crescimento da biomassa durante a utilização do benzeno pode ser devido ao efeito

inibitório de intermediários metabólicos formados durante a biodegradação. Esta

dificuldade também foi relatada por REARDON et al. (2000), os quais sugerem a

formação de semialdeído 2-hidroximucônico.

As Figuras 5.22 e 5.23 apresentam as simulações do modelo de Andrews e

as Figuras 5.24 e 5.25 apresentam as simulações do modelo de Monod, para a

biodegradação do tolueno e para o crescimento da biomassa, respectivamente,

juntamente com os dados experimentais.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Figura 5. 22 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para o tolueno.

Figura 5. 23 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa.

Figura 5. 24 – Simulação do modelo de

Monod e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para o tolueno.

Figura 5. 25 – Simulação do modelo de

Monod e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para a biomassa.

Analisando as Figuras 5.18, 5.20, 5.22 e 5.24, verifica-se uma satisfatória

relação entre as simulações da utilização dos substratos e os dados experimentais,

sugerindo uma ótima eficiência alcançada pelo método PSO implementado neste

trabalho. Os maiores desvios ocorreram quando os modelos descrevem o

crescimento da biomassa, principalmente na fase de adaptação, como pode ser

vistos nas Figuras 5.19, 5.21, 5.23 e 5.25. Durante o procedimento de identificação

de parâmetros é fundamental o conhecimento sobre o valor exato da concentração

inicial de células, podendo ser este um dos motivos que acarretou na dificuldade em

descrever o crescimento da biomassa. A dificuldade em determinar a concentração

inicial de células é frequentemente relatada (CHANG, et al., 1993; WANG & LOH,

1999), e por isso tem sido estimada juntamente com os parâmetros dos modelos.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

As Figuras 5.26 e 5.27 apresentam as simulações do modelo de Andrews

para a biodegradação do fenol e crescimento da biomassa, respectivamente,

juntamente com os dados experimentais. As simulações mostram claramente que o

modelo de Andrews não representou os dados experimentais de utilização do fenol,

tampouco os dados de crescimento da biomassa. Uma explicação para este

comportamento poderia ser atribuída à elevada concentração inicial de substrato

(200 mg L

-1

), implicando inibição do crescimento celular devido à toxicidade do fenol.

Figura 5. 26 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED et

al., 2003) para o fenol.

Figura 5. 27 – Simulação do modelo de

Andrews e dados experimentais (HAMED

et al., 2003) para a biomassa.

No entanto, analisando o sistema com relação ao crescimento da biomassa, é

possível observar que ocorreu um crescimento diáuxico. Este fenômeno surge

quando dois ou mais substratos estão envolvidos na biodegradação, e sugere que o

mecanismo de regulação interna, conhecido como repressão catabólica, esteve

presente durante o metabolismo. Logo, evidentemente intermediários metabólicos

estiveram presentes durante a biodegradação do fenol e, portanto o modelo de

Andrews não é capaz de considerá-los. Este resultado foi o mesmo encontrado por

ALLSOP et al. (1993).

Neste caso, a modelagem cinética da biodegradação do fenol requer dados

experimentais da utilização dos intermediários metabólicos produzidos e, além disso,

deve levar em conta os mecanismos de regulação gênica responsáveis pelas

interações entre os substratos para descrever adequadamente, tanto a utilização

dos substratos quanto o crescimento da biomassa.

Os valores do resíduo mínimo estimados aplicando os modelos de Monod e

Andrews estão apresentados na Tabela 5.21.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 21 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de único

substrato na biodegradação dos compostos BTF

Função Objetivo (equações 4.25 e 4.26)

Modelos

Benzeno Tolueno Fenol

Monod 64 10

-3

40 10

-3

Andrews 45 10

-3

43 10

-3

50 10

-3

Nas Figuras 5.28 e 5.29 são apresentadas as simulações da dependência da

taxa de crescimento específico em função da concentração dos substratos benzeno

e tolueno, respectivamente, aplicando o modelo de Andrews.

Figura 5. 28 – Simulação da taxa de

crescimento específico aplicando o modelo

de Andrews para o benzeno.

Figura 5. 29 – Simulação da taxa de

crescimento específico aplicando o modelo

de Andrews para o tolueno.

Apesar do modelo de Andrews não descrever bem os dados experimentais da

biodegradação do fenol, a Figura 5.30 admite que a taxa de crescimento específico

em função da concentração do fenol segue a cinética de Andrews.

Figura 5. 30 – Simulação da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de

Andrews para o fenol.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

A taxa máxima de crescimento específico no benzeno é de 0,35 h

-1

e no

tolueno é de 0,33 h

-1

, nas concentrações críticas de 17,34 mg L

-1

e 22,67 mg L

-1

respectivamente. Estes valores são obtidos a partir das equações (5.9) e (5.10) e

são visualizadas nas Figuras 5.28 e 5.29.

A partir das investigações sobre a cinética de biodegradação individual dos

substratos, é possível avaliar as mudanças na fisiologia microbiana quando a

biodegradação ocorre em misturas de substratos. Além disso, os modelos simples

são utilizados como base para avaliação dos modelos sofisticados apresentados

para a biodegradação dos múltiplos substratos.

5.2.2. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-

tolueno

Na Tabela 5.22 são apresentados os valores dos parâmetros dos modelos

cinéticos propostos, estimados pelo método PSO.

Tabela 5. 22 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

da mistura benzeno-tolueno aplicando os modelos de múltiplos substratos

Parâmetros

Modelos

Substratos

máx

-1

)

(mg L

-1

)

x/s

(mg mg

-1

)

Benzeno 0,85 7,80 3,20 - - Inibição

Competitiva

Tolueno 0,40 1,40 2,95 - -

Benzeno 0,83 31,00 2,12 - - Inibição

Acompetitiva

Tolueno 0,81 9,50 2,00 - -

Benzeno 0,85 38,60 1,55 - - Inibição

Não-Competitiva

Tolueno 0,85 12,40 1,85 - -

Benzeno 0,85 15,00 3,20 5,00 -

SKIP

Tolueno 0,41 2,00 2,85 - 0,20

Os valores do resíduo mínimo dos modelos aplicados para descrever a

biodegradação da mistura benzeno-tolueno são apresentados na Tabela 5.23, onde

verifica-se que o modelo de inibição competitiva e o modelo SKIP apresentaram os

melhores ajustes aos dados experimentais; resultado similar ao encontrado por

REARDON et al. (2000).

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

Tabela 5. 23 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de

múltiplos substratos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno

Modelos Função Objetivo (equações 4.25 e 4.26)

Inibição Competitiva 0,093

Inibição Acompetitiva 0,400

Inibição Não-Competitiva 0,632

SKIP

0,104

oioitos it ueos t-

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

tolueno, e os dados experimentais mostram que ambos foram consumidos

praticamente ao mesmo tempo. O valor de Ks mostra que Pseudomonas putida F1

apresenta maior afinidade com o tolueno, mesmo que o coeficiente de rendimento

s/x

Υ seja pouco maior no benzeno.

Tabela 5. 24 – Valores dos parâmetros estimados aplicando o Modelo de Inibição

Competitiva modificado na biodegradação da mistura benzeno-tolueno

Substratos µ

máx

-1

) K

(mg L

-1

) Y

x/s

(mg mg

-1

) K

(mg L

-1

)

Benzeno 0,837 28,50 3,23 140

Tolueno 0,844 7,60 2,82 35,70

O método PSO foi implementado em um microcomputador AMD Sempron

2800 Hz, 512 MB de memória RAM. A estimativa dos seis parâmetros dos modelos

de inibição requereu um tempo de 25 a 28 minutos, aplicando 300 partículas e 25

iterações. O modelo SKIP e o modelo de inibição modificado, os quais apresentam

oito parâmetros, necessitaram de 27 e 34 minutos em média, respectivamente.

As simulações do modelo de inibição competitiva modificado, juntamente com

os dados experimentais obtidos por HAMED et al. (2003), são apresentadas nas

Figuras 5.31 e 5.32, para a utilização da mistura benzeno-tolueno e para o

crescimento da biomassa, respectivamente.

Figura 5. 31 – Simulação do modelo de

inibição competitiva modificado e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

mistura benzeno-tolueno.

Figura 5. 32 – Simulação do modelo de

inibição competitiva modificado e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

Como pode ser visto, o modelo de inibição competitiva modificado descreveu

muito bem a utilização de ambos os substratos benzeno e tolueno. O desvio na

simulação do crescimento da biomassa pode ser atribuído à prolongada fase de

Benzeno

Tolueno

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

adaptação (primeiras 3 horas), a qual não é levada em conta na modelagem

cinética. Usualmente, em tratamento de efluentes, a adaptação dos

microorganismos aos compostos tóxicos presentes no ambiente leva tempo, e se

este período de adaptação for muito longo, os esforços na modelagem, geralmente,

são concentrados no ponto em que o processo se inicia. Os demais modelos

cinéticos aplicados para descrever os dados experimentais da mistura benzeno-

tolueno também tiveram dificuldade em ajustar o perfil do crescimento da biomassa.

As simulações dos demais modelos aplicados para descrever o consumo dos

substratos são apresentadas nas Figuras 5.33, 5.35, 5.37 e 5.39, e mostram-se

adequadamente ajustadas aos dados experimentais e, portanto, resultaram em

representações similares.

Figura 5. 33 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-tolueno.

Figura 5. 34 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.

Figura 5. 35 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-tolueno.

Figura 5. 36 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

Benzeno

Tolueno

Benzeno

Tolueno

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

100

Entretanto, as simulações para o crescimento da biomassa, aplicando o

modelo de inibição acompetitiva e o modelo de inibição não-competitiva, apresentam

distorções em relação aos dados experimentais, como pode ser notado nas Figuras

5.36 e 5.38, além de resultarem em maiores valores da função objetivo, como

apresentados na Tabela 5.21.

Figura 5. 37 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

mistura benzeno-tolueno.

Figura 5. 38 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

O modelo SKIP apresentou um comportamento similar ao modelo de inibição

competitiva, tanto no consumo de substratos quanto no crescimento da biomassa,

visualizados nas Figuras 5.39 e 5.40. Este fato pode ser atribuído aos valores dos

parâmetros

I ,

Ks e

Ks estimados. Se

tbtb

KsKsI = e

btbt

KsKsI = , então o

modelo SKIP reduz-se à inibição competitiva.

Figura 5. 39 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a mistura benzeno-tolueno.

Figura 5. 40 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa.

Benzeno

Tolueno

Benzeno

Tolueno

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

101

HAMED et al. (2003) conduziram seus experimentos utilizando Pseudomonas

putida F1, cujas enzimas induzíveis são não-específicas, permitindo uma utilização

simultânea de vários substratos similares. Os autores mostraram que a

biodegradação do benzeno e tolueno em mistura ocorreu simultaneamente, onde o

tolueno foi o primeiro composto a ser esgotado. Assim, é possível concluir que o

tolueno inibiu a biodegradação do benzeno muito mais do que o benzeno inibiu a

utilização do tolueno, comportamento bastante conhecido (CHANG et al., 1993; OH

et al., 1994; REARDON et al., 2000; ABUHAMED et al., 2004). Os valores dos

parâmetros de interação (

I ,

I ) estimados aplicando o modelo SKIP (Tabela 5.23)

comprovam este comportamento, ou seja, o grau de inibição do tolueno sobre a

biodegradação do benzeno é muito maior do que o grau de inibição do benzeno

sobre a biodegradação do tolueno ( 00,5I

= e 20,0=

I ). ABUHAMED et al. (2004)

encontraram os valores 16,5I

= e 49,0I

= e REARDON et al. (2000) encontraram

os valores 30,000,5I

±= e 003,001,0I

±= .

A biodegradação do benzeno e tolueno por Pseudomonas putida F1 tem sido

extensamente estudada. Os relatos mostram que a mesma rota metabólica pode ser

utilizada para catabolizar ambos os substratos. A Figura 5.41 apresenta as rotas

metabólicas envolvidas na biodegradação aeróbica do tolueno, benzeno e fenol,

utilizando-se Pseudomonas putida F1.

Fenol

cis-dihidrodiol

3-metilcatechol

semialdeído

hidroxi mucônico

2-hidroxi-6-oxo-

2,4-heptadienoato

Tolueno

cis-dihidrodiol

Benzeno

cis-dihidrodiol

Tolueno

Benzeno

catecol

tolueno

dioxigenase

CCOO

acetaldeído

piruvato

COOH

Fenol

tolueno

dioxigenase

Figura 5. 41 – Rota metabólica do tolueno, benzeno e fenol por Pseudomonas putida F1.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

102

Pseudomonas putida F1 inicia a oxidação do tolueno incorporando dois

átomos de oxigênio molecular no anel aromático para formar tolueno cis-dihidrodiol

(GIBSON et al., 1970 apud HAMED et al., 2003); mais adiante, uma reação de

desidrogenação forma 3-metilcatecol. A clivagem do extradiol na posição 2,3 pela

enzima metil catecol 2,3-dioxigenase resulta 2-hidroxi-6-oxo-2,4-heptadienoato, que

em seguida é metabolizado até 2-hidroxipenta-2,4-dienoato e acetato. Estes

microorganismos também podem crescer no fenol, onde catecol e semialdeído 2-

hidroximucônico foram identificados como subprodutos intermediários (SPAIN &

GIBSON, 1988 apud HAMED et al., 2003). O caminho metabólico de degradação do

benzeno por P. putida F1 também envolve a adição de dois átomos de oxigênio,

catalizada pela enzima tolueno dioxigenase, para formar benzeno cis-dihidrodiol,

seguido pela desidrogenação até catecol. Todos estes intermediários identificados

são em seguida metabolizados aos intermediários do ciclo de Krebs, acetaldeído e

piruvato.

Portanto, a utilização simultânea observada durante a biodegradação da

mistura benzeno-tolueno suporta a hipótese de que as reações envolvidas são

catabolizadas pela mesma enzima, caracterizada como tolueno dioxigenase (TOD)

(ZYLSTRA & GIBSON, 1989 apud REARDON et al., 2000). Isto significa que os

substratos são utilizados pela mesma rota metabólica, o que sugere a presença de

inibição competitiva entre os substratos. Durante a inibição competitiva, substratos

que possuem estrutura química similar, como o benzeno e o tolueno, competem pelo

mesmo sítio ativo da enzima e portanto, são adequados os resultados encontrados

pelo ajuste do modelo de inibição competitiva aos dados experimentais. Além disso,

a adição do termo de inibição pelo substrato tornou o ajuste do modelo de inibição

competitiva ainda melhor.

Nas Figuras 5.42 e 5.43 são apresentadas as simulações das taxas de

crescimento específico no benzeno e no tolueno, aplicando o modelo de inibição

competitiva modificado, em função de suas concentrações.

A eficiência da biodegradação é intensificada quando ocorre utilização

simultânea de rotas metabólicas em comparação às taxas de crescimento durante a

biodegradação individual dos substratos. Esta intensificação pode ser atribuída às

taxas elevadas de crescimento e ocorre devido à indução não-específica de enzimas

para biodegradação de substratos similares ou à convergência de rotas metabólicas

para a utilização de múltiplos substratos.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

103

As simulações da taxa de crescimento específico aplicando o modelo de

inibição competitiva modificado foram realizadas, adotando-se a metodologia de

análise de superfície, com o objetivo de comparar as taxas de biodegradação dos

substratos em mistura com as taxas de biodegradação individuais dos substratos.

Conforme a Figura 5.42, à medida que a concentração do tolueno aumenta, a

taxa de crescimento específico no benzeno decresce. O mesmo é verificado na

Figura 5.43, à medida que a concentração do benzeno aumenta a taxa de

crescimento específico no tolueno diminui. Quantitativamente essa diminuição é

maior observada para a taxa específica de crescimento no benzeno, mostrando um

maior grau de inibição pelo tolueno.

Figura 5. 42 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva modificado

para o benzeno.

Figura 5. 43 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva modificado

para o tolueno.

Neste caso, as taxas máximas de crescimento específico no benzeno e no

tolueno aumentaram quando ambos foram utilizados em mistura, se comparadas às

respectivas taxas máximas de crescimento nos compostos individuais. Os valores

aumentaram de 0,35 para 0,45 h

-1

no benzeno e 0,33 para 0,44 h

-1

no tolueno. No

entanto, verifica-se que a biodegradação do benzeno na presença do tolueno

ocorreu em 8 horas, enquanto individualmente o benzeno foi completamente

consumido em 6 horas. Por outro lado, a presença do benzeno não afetou

significativamente o tempo de biodegradação do tolueno (7 horas).

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

104

5.2.3. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-

fenol

A modelagem da cinética de biodegradação da mistura benzeno-fenol partiu

das seguintes suposições: (a) HAMED et al. (2003) mostraram que efeitos de

inibição pelo substrato ocorreram em concentrações acima de 30 mg L

-1

benzeno; (b) considerou-se a inadequação do modelo de Andrews em ajustar-se aos

dados experimentais em elevados valores da concentração inicial do fenol (200 mg

-1

), atribuída à inibição por intermediários metabólicos, conforme verificado em

WANG & LOH (1999).

Assim, propôs-se adicionar, em todos os modelos cinéticos avaliados, o termo

de inibição pelo substrato

(

)

, para a biodegradação do benzeno, e o termo de

inibição causada pela presença de intermediários metabólicos

(

)













−

, para a

biodegradação do fenol, na modelagem da biodegradação da mistura benzeno-fenol.

Após realizar as modificações em todos os modelos, utilizou-se o método

PSO na estimativa dos parâmetros cinéticos, os quais são apresentados na Tabela

5.25. O procedimento realizado, utilizando 300 partículas e 25 iterações, necessitou

de um tempo de 32 a 47 minutos durante a estimativa dos oito parâmetros dos

modelos de inibição, e 40 minutos para a estimativa dos dez parâmetros do modelo

SKIP.

Tabela 5. 25 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

da mistura benzeno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos

Parâmetros

Modelos

Substratos

máx

-1

)

(mg L

-1

)

x/s

(mg mg

-1

)

(mg L

-1

)

Benzeno 0,50 0,020 2,36 24,00 - - Inibição

Competitiva

Fenol 0,14 41,00 0,30 84,00 - -

Benzeno 0,85 0,20 1,73 22,00 - - Inibição

Acompetitiva

Fenol 0,28 82,00 0,37 54,00 - -

Benzeno 0,84 0,46 1,73 29,00 - - Inibição

Não-competitiva

Fenol 0,31 72,00 0,51 62,00 - -

Benzeno 0,71 0,16 1,25 8,50 0,001

SKIP

Fenol 0,30 35,00 0,55 75,00 - 84

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

105

Observa-se que os valores dos parâmetros foram obtidos corretamente. A

taxa máxima de crescimento específico

máx

no benzeno mostra-se maior, o que

pode indicar que o benzeno foi utilizado primeiramente ao fenol; o baixo valor de Ks

mostra que Pseudomonas putida F1 apresenta maior afinidade com o benzeno,

proporcionando maior coeficiente de rendimento

sx /

Υ ; e os valores de

indicam

que o fenol apresenta elevado efeito inibitório.

ABUHAMED et al. (2004) utilizaram com sucesso o modelo SKIP na

modelagem da biodegradação dos compostos BTF e estimaram os parâmetros de

interação 08,1I

= e 27,0I

= . Isto significa que o benzeno intensificou a

biodegradação do fenol e o fenol inibiu a biodegradação do benzeno. Valores

contrários foram relatados por REARDON et al. (2000), os quais estimaram

002,001,0I

±= e 5,15,18I

±= , mostrando um comportamento similar ao

encontrado neste trabalho, ou seja, o benzeno inibe a biodegradação do fenol.

As simulações dos modelos são apresentadas nas Figuras 5.44 a 5.51, onde

se observa que os modelos de inibição, competitiva e não-competitiva,

apresentaram os melhores ajustes, como pode ser confirmado pelos valores da

função objetivo apresentadas na Tabela 5.26.

Tabela 5. 26 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de

múltiplos substratos na biodegradação da mistura benzeno-fenol

Modelos Função Objetivo (equações 4.25 e 4.26)

Inibição Competitiva 0,188

Inibição Acompetitiva 0,400

Inibição Não-Competitiva 0,360

SKIP

0,390

Assim, considerando as modificações propostas, as taxas específicas de

crescimento no benzeno e no fenol, aplicando o modelo de inibição competitiva,

podem ser apresentadas pelas equações (5.33) e (5.34), respectivamente.

























+++

bmáx

SKs

(5.33)

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

106

( )

























−

fmáx

SKs

(5.34)

Verifica-se que, dentre os modelos avaliados, o modelo de inibição

competitiva descreve muito bem, tanto a utilização dos substratos, quanto o

crescimento da biomassa, observado nas Figuras 5.44 e 5.45.

Figura 5. 44 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-fenol.

Figura 5. 45 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.

Durante a biodegradação do benzeno e fenol em mistura observou-se uma

utilização seqüencial dos substratos. Assim, o benzeno foi primeiramente consumido

e a degradação do fenol não iniciou antes que a concentração do benzeno atingisse

valores próximos de zero. Este comportamento é conhecido como repressão

catabólica e caracteriza o crescimento diáuxico, onde duas fases de crescimento

exponencial são apresentadas pela biomassa. Portanto, neste caso, o benzeno

estaria reprimindo a expressão de genes que codificam enzimas necessárias ao

metabolismo do fenol. REARDON et al. (2000) também verificaram este

comportamento e sugeriram que a biodegradação do benzeno pode ser inibida

competitivamente pela presença do fenol, e que o efeito do benzeno sobre a

biodegradação do fenol é muito mais complexo.

Os dados experimentais da biomassa apresentam crescimento diáuxico, mas

o conhecimento de que a mesma enzima, conhecida como tolueno dioxigenase, é

utilizada para iniciar a oxidação do benzeno e fenol é relevante para sugerir que

inibição competitiva esteja ocorrendo entre ambos os substratos.

Benzeno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

107

As Figuras 5.46 e 5.47 apresentam as simulações do modelo de inibição

acompetitiva, para a biodegradação da mistura benzeno-fenol e para o crescimento

da biomassa, juntamente com os dados experimentais, onde também se observa um

bom desempenho do modelo.

Figura 5. 46 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-fenol.

Figura 5. 47 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

A biodegradação individual do benzeno ocorreu em 6 horas, e quando na

presença do fenol, sua utilização completa aumentou para 10 horas. Isso mostra que

o fenol prejudica a taxa de biodegradação do benzeno, nas condições que este

experimento foi conduzido, provavelmente por aumentar o tempo de adaptação dos

microorganismos. Por outro lado, verifica-se que o benzeno diminuiu o tempo de

biodegradação do fenol. Individualmente, o fenol foi completamente esgotado em 35

horas, e quando esteve em mistura com o benzeno, seu tempo de biodegradação foi

menor, atingindo 18 horas. Isto pode ser atribuído ao fato de que a biomassa

remanescente da biodegradação do benzeno passa a utilizar rapidamente o

segundo substrato. Além disso, benzeno e fenol produzem exatamente o mesmo

intermediário (semialdeído 2-hidroximucônico) durante a metabolização por

Pseudomonas putida F1, sugerindo a utilização da mesma enzima. Assim, as

enzimas primeiramente requeridas para a utilização do benzeno metabolizam

rapidamente o fenol.

As simulações do modelo de inibição não-competitiva, para a degradação da

mistura benzeno-fenol e para o crescimento da biomassa, são apresentadas nas

Figuras 5.48 e 5.49. Neste caso, o substrato inibidor, o benzeno, estaria inativando o

complexo enzima-fenol.

Benzeno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

108

Figura 5. 48 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

mistura benzeno-fenol.

Figura 5. 49 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

As simulações do modelo SKIP, para a biodegradação da mistura benzeno-

fenol e para o crescimento da biomassa, são apresentadas nas Figuras 5.50 e 5.51.

Este modelo foi satisfatoriamente utilizado por REARDON et al. (2000) e

ABUHAMED et al. (2004) para representar a biodegradação da mistura benzeno-

fenol por meio de Pseudomonas putida F1.

Figura 5. 50 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a mistura benzeno-fenol.

Figura 5. 51 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa.

Todos os modelos falharam ao descrever a fase de adaptação do

microorganismo (até 6 horas), pois este fator não é levado em conta na modelagem

cinética. A fase de crescimento exponencial também não é adequadamente descrita

pelos modelos. O comportamento do sistema deve ser analisado em dois níveis. O

primeiro é baseado na resposta do sistema durante a metabolização dos substratos,

e o segundo refere-se ao crescimento da biomassa como função da biodegradação

Benzeno

Fenol

Benzeno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

109

do substrato. Verifica-se que a utilização do fenol somente inicia-se quando a

concentração do benzeno aproxima-se de zero, ou seja, o benzeno aparentemente

estaria reprimindo a síntese de enzimas requeridas para a degradação do fenol. Isto

também pode ser verificado pelo alto valor do parâmetro

I estimado (Tabela 5.25),

na tentativa de ajustar os dados aplicando o modelo SKIP, sendo que este valor foi

interpretado como sendo o grau de inibição do benzeno sobre a biodegradação do

fenol. Por outro lado, o fenol tem pouco efeito na biodegradação do benzeno.

Após 9 horas, aproximadamente, o crescimento da biomassa continua apenas

devido à utilização do fenol. A concentração do benzeno encontra-se esgotada às 10

horas, enquanto 110 mg L

-1

de fenol permanece sujeito à biodegradação. Assim,

após as 10 horas somente o composto fenol torna-se responsável pelo crescimento

da biomassa e os valores dos coeficientes de rendimento estimados (Tabela 5.25)

descrevem muito bem esta tendência, isto é, alto coeficiente de rendimento no

benzeno e baixo coeficiente de rendimento no fenol.

Apesar dos substratos benzeno e fenol não serem utilizados

simultaneamente, o satisfatório ajuste do modelo de inibição competitiva suporta a

hipótese de que as reações envolvidas são catabolizadas pela mesma enzima,

caracterizada como tolueno dioxigenase. Portanto, os substratos são utilizados pela

mesma rota metabólica da P. putida F1, que pode ser visualizadas na Figura 5.41.

Finalmente, as taxas de crescimento específico no benzeno e no fenol são

representadas em função de suas concentrações nas Figuras 5.52 e 5.53,

respectivamente. Admite-se que o modelo de inibição competitiva modificado melhor

descreve a biodegradação da mistura benzeno-fenol. As análises de superfície

mostram claramente os efeitos de inibição pelo substrato benzeno, verificado na

Figura 5.52, independentemente da concentração do fenol. A taxa máxima de

crescimento específico no benzeno em mistura aumentou (0,35 para 0,46 h

-1

). Após

este valor máximo de 0,46 h

-1

, a taxa de crescimento específico no benzeno sofre

um decréscimo maior se comparado a biodegradação individual (Figura 5.28). Isto

também pode explicar porque a biodegradação do benzeno em mistura foi mais

demorada (10 horas) se comparado à biodegradação do composto individualmente

(6 horas). A Figura 5.53 mostra que no fenol, a taxa de crescimento específico é

observada somente quando a concentração do benzeno é nula, e efeitos de inibição

pela presença de intermediários metabólicos são observados a partir de 200 mg L

-1

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

110

onde a taxa de crescimento específico começa a decrescer. Comparações entre as

taxas de biodegradação do fenol, individualmente e em mistura, não são possíveis,

pois, neste caso, o modelo de Andrews não pôde ajustar adequadamente os dados

experimentais de HAMED et al. (2003).

Figura 5. 52 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva modificado

para o benzeno.

Figura 5. 53 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva modificado

para o fenol.

5.2.4. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura tolueno-

fenol

A partir do método de busca PSO, implementado neste trabalho, foi possível a

estimativa dos parâmetros cinéticos e estequiométricos, apresentados na Tabela

5.27.

Tabela 5. 27 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

da mistura tolueno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos

Parâmetros

Modelos

Substratos

máx

-1

)

(mg L

-1

)

x/s

(mg mg

-1

)

Tolueno 0,17 0,10 0,66 - - Inibição

Competitiva

Fenol 0,13 15,00 0,62 - -

Tolueno 0,55 1,75 0,54 - - Inibição

Acompetitiva

Fenol 0,21 66,00 0,66 - -

Tolueno 0,65 1,00 0,55 - -

Inibição

Não-Competitiva

Fenol 0,20 58,50 0,66 - -

Tolueno 0,24 1,00 0,75 0,047

SKIP

Fenol 0,13 20,00 0,60 - 55

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

111

Os valores dos parâmetros estimados mostram-se coerentes:

máx

no tolueno

apresenta-se maior que no fenol, podendo indicar que tolueno foi primeiramente

utilizado; e o baixo valor de Ks mostra uma maior afinidade de Pseudomonas putida

F1 com o tolueno. Durante a busca, verificou-se uma grande dificuldade em estimar

os valores ótimos, devido a uma instabilidade produzida durante a evolução da

função objetivo. O tempo requerido na estimativa dos seis parâmetros de cada

modelo de inibição variou entre 30 a 35 minutos. Os parâmetros do modelo SKIP

necessitaram de 27 minutos para serem estimados.

Seguindo a mesma estratégia utilizada nas simulações anteriores para a

modelagem da cinética microbiana, confirmou-se que modificações nos diferentes

modelos não resultaram melhorias nas simulações e, portanto, os modelos foram

avaliados em sua forma original. No entanto, outros modelos que incorporem os

mecanismos internos de regulação gênica deveriam ser investigados para corrigir

algumas falhas que estes modelos não-estruturadas apresentaram ao descrever a

biodegradação da mistura tolueno-fenol, como podem ser visualizados a seguir.

Nas Figuras 5.54 e 5.55 são apresentadas as simulações da utilização da

mistura tolueno-fenol e do crescimento da biomassa, respectivamente, aplicando o

modelo de inibição competitiva, juntamente com os dados experimentais.

Figura 5. 54 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura tolueno-

fenol.

Figura 5. 55 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.

Na biodegradação do tolueno e fenol também se confirmou uma utilização

seqüencial dos substratos, na qual o tolueno foi primeiramente consumido e a

degradação do fenol não começou até que a concentração do tolueno esgotasse

completamente. Neste caso, os dados experimentais da biomassa mostram a

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

112

existência de duas fases de crescimento exponencial caracterizando o crescimento

diáuxico. Portanto, neste caso, o tolueno estaria reprimindo a expressão de genes

que codificam enzimas necessárias ao metabolismo do fenol, caracterizando o

mecanismo de repressão catabólica. Mas, este pode não ser um caso de repressão

catabólica, visto que Pseudomonas putida F1 utiliza a mesma enzima (tolueno

dioxigenase) para metabolizar ambos os substratos tolueno e fenol. Portanto, o

ajuste adequado do modelo de inibição competitiva sugere que o tolueno e o fenol

competem pelo mesmo sítio ativo da enzima.

Apesar de todos os modelos resultarem em valores da função objetivo

bastante próximos, conforme apresentado na Tabela 5.28, admite-se que o modelo

de inibição competitiva descreve melhor os dados experimentais.

Tabela 5. 28 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de

múltiplos substratos na biodegradação da mistura tolueno-fenol

Modelos Função Objetivo (equações 4.25 e 4.26)

Inibição Competitiva 0,059

Inibição Acompetitiva 0,062

Inibição Não-Competitiva 0,063

SKIP

0,075

As Figuras 5.56 e 5.57 apresentam as simulações do modelo de inibição

acompetitiva, para a utilização da mistura tolueno-fenol e para o crescimento da

biomassa, respectivamente, juntamente com os dados experimentais.

Figura 5. 56 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura tolueno-

fenol.

Figura 5. 57 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

113

Entretanto, nenhum modelo foi capaz de descrever o crescimento da

biomassa, que aparentemente caracteriza-se como um fenômeno diáuxico, isto é,

aparecimento de duas fases de crescimento exponencial separados por uma fase de

adaptação, chamada de adaptação diáuxico. Assim, o consumo do primeiro

substrato, o tolueno, é seguido por um período de adaptação dos microorganismos

ao segundo substrato, o fenol. O fenômeno diáuxico, que ocorre quando dois ou

mais substratos estão sendo consumidos, é caracterizada pela utilização seqüencial,

mas também pode envolver a utilização simultânea dos substratos presentes. Neste

caso, analisando o sistema com relação a utilização dos substratos tolueno e fenol,

verifica-se que ocorreu utilização seqüencial das rotas metabólicas, e portanto um

dos substratos pode estar inibindo a degradação de outro por toxicidade, repressão

catabólica ou inibição enzimática. Teoricamente, o aparecimento de duas fases de

crescimento exponencial pode comprovar a repressão catabólica do tolueno. Além

disso, a utilização do fenol inicia-se somente quando a concentração do tolueno

encontra-se nula.

As simulações do modelo de inibição não-competitiva e do modelo SKIP, para

a utilização da mistura tolueno-fenol e para o crescimento da biomassa, são

apresentadas nas Figuras 5.58 e 5.59 e nas Figuras 5.60 e 5.61, respectivamente.

Figura 5. 58 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

mistura tolueno-fenol.

Figura 5. 59 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

Apesar de não predizer exatamente o crescimento da biomassa, observa-se

que os modelos descreveram adequadamente o processo de biodegradação da

mistura tolueno-fenol.

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

114

Figura 5. 60 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a mistura tolueno-fenol.

Figura 5. 61 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa.

Os modelos avaliados neste trabalho, para os sistemas com múltiplos

substratos, não incorporam os mecanismos de regulação interna envolvidos no

crescimento microbiano. Tais modelos, apresentados em diversos trabalhos

(BRANDT et al., 2004; HAMILTON et al., 2005; NARANG, 2006), avaliam a

regulação genética dos sistemas, especialmente os que apresentam crescimento

diáuxico, considerando os microorganismos como “optimal strategists”, além de

simular a fase de adaptação diáuxico.

Os mecanismos regulatórios, que causam as preferências microbianas por

determinado substrato e consumo destes sequencialmente e/ou simultaneamente,

são bastante complexos. Logo, assume-se que a biodegradação da mistura tolueno-

fenol ocorre devido à inibição enzimática, visto que a utilização de ambos os

substratos tolueno e fenol foram adequadamente descrita aplicando os modelos de

inibição. Provavelmente, tolueno e fenol competem pelo mesmo sítio ativo da

enzima responsável pelo catabolismo destes substratos, por meio de inibição

competitiva. Sugere-se que o grau de inibição do tolueno sobre a biodegradação do

fenol seja bastante elevado. Em contrapartida, a influência do fenol sobre a

biodegradação tolueno não é significativa.

Este comportamento pode ser comprovado pelos valores dos parâmetros de

interação quando aplicado o modelo SKIP no ajuste aos dados experimentais. Este

modelo foi utilizado com sucesso por REARDON et al. (2000, 2002) e ABUHAMED

et al. (2004) na representação da biodegradação da mistura tolueno-fenol. Apesar

de não constatarem inibição competitiva entre o tolueno e o fenol, REARDON et al.

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

115

(2000, 2002) estimaram 555I

±= , 002,001,0I

±= e 66,80I

±= , 03,06,0I

±= ,

respectivamente, sugerindo que o tolueno inibe a biodegradação do fenol, muito

mais do que o fenol inibe a biodegradação do tolueno. Neste trabalho, na tentativa

de ajustar o modelo SKIP aos dados experimentais, estimaram-se os parâmetros

55,23I

= e 067,0I

= . Por outro lado ABUHAMED et al. (2004) encontraram

resultados opostos, isto é, 14,0I

= e 03,1I

= .

Pode-se afirmar que tolueno inibe o consumo do fenol e os resultados são: a

prolongada fase de adaptação, antes que a degradação do fenol comece, e a rápida

taxa de biodegradação do tolueno. Este resultado também foi encontrado por

REARDON et al. (2002). Estes autores acreditam que a inibição da biodegradação

do fenol na presença do tolueno pode ser atribuída ao seu vagaroso transporte para

dentro das células, quando a membrana está adaptada em ambiente mais

hidrofóbico. Então, quando o tolueno é completamente consumido do meio, a

composição da membrana muda para uma forma na qual a difusão do fenol possa

ocorrer mais rapidamente.

Nas Figuras 5.62 e 5.63 são apresentadas as análises de superfície aplicando

o modelo de inibição competitiva, nas quais as taxas específicas de crescimento no

tolueno e no fenol são representadas em função de suas concentrações.

Figura 5. 62 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva para o

tolueno.

Figura 5. 63 – Simulação da taxa específica

de crescimento na mistura aplicando o

modelo de inibição competitiva para o fenol.

Analisando a Figura 5.62 verifica-se uma insignificante diminuição na taxa de

crescimento específico no tolueno à medida que a concentração do fenol aumenta.

Por outro lado, verifica-se pela Figura 5.63 que a taxa de crescimento específico no

fenol decresce muito quando a concentração do tolueno aumenta.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

116

A taxa máxima de crescimento específico no tolueno diminuiu na presença do

fenol, passando de 0,33 para 0,21 h

-1

. Isto significa que o fenol pode estar

retardando o crescimento da biomassa no tolueno, provavelmente pela elevada

concentração, além da sua toxicidade e formação de intermediários metabólicos. O

tempo que o fenol levou para ser completamente esgotado passou de 35 horas,

individualmente, para 15 horas quando o tolueno esteve presente; comportamento

similar ao observado durante a biodegradação da mistura benzeno-fenol. O tolueno

também foi utilizado mais rapidamente (7 para 5 horas).

5.2.5. Avaliação dos modelos cinéticos na biodegradação da mistura benzeno-

tolueno-fenol

Neste caso, também não houve a necessidade de alterações nos modelos

cinéticos para descrever os dados experimentais de HAMED et al. (2003). Na Tabela

5.29 são apresentados os valores dos parâmetros cinéticos estimados para a

biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol.

Tabela 5. 29 – Valores dos parâmetros estimados para a cinética de biodegradação

da mistura benzeno-tolueno-fenol aplicando os modelos de múltiplos substratos

Parâmetros Modelos Substratos

máx

-1

)

(mg L

-1

)

x/s

(mg mg

-1

)

Benzeno 0,25 0,14 2,35

Tolueno 0,20 0,08 1,55

Inibição

Competitiva

Fenol 0,05 155 0,15

Benzeno 0,75 14,00 2,00

Tolueno 0,73 6,00 1,65

Inibição

Acompetitiva

Fenol 0,06 155 0,29

Benzeno 0,70 15,34 1,50

Tolueno 0,70 8,75 1,50

Inibição

Não-Competitiva

Fenol 0,12 175 0,40

Benzeno 0,35 10,00 1,70

Tolueno 0,41 5,00 1,24

SKIP

Fenol 0,18 185 0,47

Os nove parâmetros dos modelos de inibição necessitaram de 36 a 50

minutos e os quinze parâmetros do modelo SKIP necessitaram, em média de 50

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

117

minutos para serem estimados através do método PSO. Todos apresentaram

coerência com o processo, sendo a taxa de crescimento específico no benzeno e

tolueno similares e maiores que no fenol, o qual foi consumido mais tarde. Os baixos

valores de Ks mostram que Pseudomonas putida F1 apresentam maior afinidade

com o benzeno e com o tolueno, resultando em elevados valores do coeficiente de

rendimento

s/x

Υ .

Na Tabela 5.30 são apresentados os valores dos parâmetros de interação

estimados aplicando o modelo SKIP. Os parâmetros iterativos mostram que o

tolueno inibe a biodegradação do benzeno; o fenol apresenta uma inibição muito

pequena na biodegradação de ambos, benzeno e tolueno, e o grau de inibição do

benzeno e do tolueno é bastante elevado sobre a biodegradação do fenol.

Tabela 5. 30 – Valores dos parâmetros interativos estimados para a cinética de

biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol aplicando o modelo SKIP

2,820 0,008 2,300 0,0001 58 180

Os valores do resíduo mínimo estimados para os modelos cinéticos são

apresentados na Tabela 5.31. Verifica-se que o modelo de inibição competitiva

proporcionou o melhor resultado e portanto, pode representar a cinética de

biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol.

Tabela 5. 31 – Valores da função objetivo estimados aplicando os modelos de

múltiplos substratos na biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol

Modelos Função Objetivo (equações 4.25 e 4.26)

Inibição Competitiva 0,085

Inibição Acompetitiva 0,135

Inibição Não-Competitiva 0,170

SKIP

0,164

As simulações do modelo de inibição competitiva, para a biodegradação da

mistura benzeno-tolueno-fenol e para o crescimento da biomassa, juntamente com

os dados experimentais, são apresentadas nas Figuras 5.64 e 5.65,

respectivamente.

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

118

Figura 5. 64 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-tolueno-fenol.

Figura 5. 65 – Simulação do modelo de

inibição competitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a biomassa.

Observa-se que ocorreu uma utilização simultânea do benzeno e tolueno, ao

passo que o fenol foi utilizado sequencialmente ao consumo de ambos. Logo, as

taxas de crescimento específico e os coeficientes de rendimento no benzeno e no

tolueno devem ser similares, e maiores se comparados aos valores para o fenol,

conforme pode ser verificado na Tabela 5.29.

A biodegradação do fenol não ocorreu até que ambos os substratos, benzeno

e tolueno foram esgotados. Este comportamento também mostra que complexos

mecanismos de regulação interna estão presentes na utilização dos substratos,

sendo a repressão catabólica o mecanismo mais provável. No entanto, apesar deste

comportamento, a biodegradação da mistura ternária, neste caso, pode seguir a

cinética de inibição competitiva, visto que os três compostos tóxicos são conhecidos

por serem metabolizados pela mesma enzima da Pseudomonas putida F1 (tolueno

dioxigenase - TOD).

Analisando o sistema com relação ao crescimento da biomassa, nota-se que

o crescimento foi bastante elevado até às 8 horas. Após o consumo completo do

benzeno e tolueno, que ocorreu às 8 horas, a concentração inicial de 200 mg L

-1

fenol começou a ser utilizada pelos microorganismos. Isto significa que, após este

momento, o crescimento da biomassa é exclusivamente baseado na utilização do

fenol, que resultou baixo coeficiente de rendimento. Verifica-se na Tabela 5.29, que

para todos os modelos, foram estimados valores baixos para o coeficiente de

rendimento no fenol (

), o que concorda com os resultados esperados.

Benzeno

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

119

Baseado neste entendimento, a capacidade de avaliação das diferenças,

entre os dados experimentais e os modelos, torna-se mais precisa. As Figuras 5.66

e 5.67 apresentam, respectivamente, as simulações do modelo de inibição

acompetitiva, para a biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol e para o

crescimento da biomassa, juntamente com os dados experimentais.

Figura 5. 66 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados experimentais

(HAMED et al., 2003) para a mistura

benzeno-tolueno-fenol.

Figura 5. 67 – Simulação do modelo de

inibição acompetitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

As simulações do modelo de inibição não-competitiva, para a biodegradação

da mistura benzeno-tolueno-fenol e para o crescimento da biomassa, são

apresentadas nas Figuras 5.68 e 5.69, respectivamente.

Figura 5. 68 – Simulação do Modelo de

Inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

mistura benzeno-tolueno-fenol.

Figura 5. 69 – Simulação do modelo de

inibição não-competitiva e dados

experimentais (HAMED et al., 2003) para a

biomassa.

Benzeno

Tolueno

Fenol

Benzeno

Tolueno

Fen

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

120

As simulações do modelo SKIP, para a biodegradação da mistura ternária e

para o crescimento da biomassa, são apresentadas nas Figuras 5.70 e 5.71,

respectivamente.

Figura 5. 70 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a mistura benzeno-tolueno-fenol.

Figura 5. 71 – Simulação do modelo SKIP e

dados experimentais (HAMED et al., 2003)

para a biomassa.

Pseudomonas putida F1 é conhecida por utilizar compostos tóxicos, como o

benzeno, tolueno e fenol, além de outros aromáticos. A enzima TOD, além de

catabolizar a biodegradação do benzeno e tolueno, também tem sido caracterizada

por catabolizar a oxidação do fenol (SPAIN et al., 1989 apud REARDON et al.,

2002). Na biodegradação do tolueno a oxidação do anel aromático pela enzima TOD

leva à formação do intermediário 3-metilcatecol. Durante a biodegradação do

benzeno, a oxidação do anel aromático leva a formação do intermediário catecol,

que posteriormente é clivado pela via meta para formar semialdeído 2-

hidroximucônico (2HSM). Estas rotas metabólicas são apresentadas na Figura 5.41,

onde se pode visualizar que o fenol também pode ser utilizado pela enzima TOD,

formando catecol e 2HSM como intermediários (SPAIN & GIBSON, 1988 apud

HAMED et al., 2003).

Portanto, Pseudomonas putida F1 utiliza a mesma rota metabólica para

metabolizar os compostos benzeno, tolueno e fenol (REARDON et al., 2000;

REARDON et al., 2002). Isto justifica os resultados obtidos nas simulações, neste

trabalho, para os quais o modelo cinético de inibição competitiva alcançou os

melhores ajustes.

Pode-se afirmar que devido à complexidade do processo de biodegradação

quando múltiplos substratos estão envolvidos, a metodologia adotada neste trabalho

apresentou ótimos resultados no desenvolvimento da modelagem cinética. Os

Benzeno

Tolueno

Fenol

Capítulo 5 – Resultados e Discussão

121

resultados mostram claramente que a cinética de biodegradação de misturas de

compostos tóxicos pode ser complexa e difícil de ser descrita matematicamente,

especialmente o perfil de crescimento da biomassa, mesmo quando os compostos

são substratos “homologous” para a cultura microbiana, isto é, substratos que são

catabolizados pela mesma rota metabólica, como o benzeno, tolueno e fenol.

Na Tabela 5.32 são apresentados alguns estudos sobre a cinética de

biodegradação de múltiplos substratos BTEX e BTF selecionados na literatura.

Verifica-se que a modelagem dos processos foram realizadas aplicando modelos

não-estruturados, tais como o modelo de inibição competitiva e SKIP.

Tabela 5. 32 – Cinética de biodegradação de múltiplos substratos BTEX e BTF

selecionados na literatura

Múltiplos Substratos Cultura Modelagem

Benzeno-Tolueno

Tolueno-Xileno

P. sp B1

P. sp X1

Inibição

Competitiva

(a)

Benzeno-Tolueno

P. putida O1

Parâmetros de

Interação

(b)

Benzeno-Tolueno-Etilbenzeno-Xileno

Mistura de

culturas

Inibição

Competitiva

(c)

Benzeno-Tolueno

Benzeno-Fenol

Tolueno-Fenol

Benzeno-Tolueno-Fenol

P. putida F1 SKIP

(d)

Benzeno-Tolueno

Benzeno-Fenol

Tolueno-Fenol

P. putida F1 SKIP

(e)

(a)

CHANG et al. (1993),

(b)

OH et al. (1994),

(c)

BIELEFELDT & STENSEL. (1999b),

(d)

REARDON et al.

(2000),

(e)

ABUHAMED et al. (2004).

Embora a aplicação de modelos não-estruturados seja uma vantagem, devido

à simplicidade de manipulação matemática e facilidade de verificação experimental,

existe um grande número de aplicações nas quais estes modelos falham. Isso

ocorre quando a composição do sistema muda drasticamente, como em alguns

processos batelada, fases de adaptação, fenômeno diáuxico e em situações onde

um constituinte específico deve ser modelado. Portanto, as falhas obtidas pelos

modelos não-estruturados avaliados deste trabalho, durante o ajuste do crescimento

da biomassa, podem ser corrigidas avaliando-se modelos estruturados.

Capítulo 6 – Conclusões e Sugestões

122

Capítulo 6

6.1. Conclusões

Os resultados apresentados neste trabalho podem contribuir para uma melhor

aproximação da modelagem matemática de processos de biodegradação de mistura

de compostos tóxicos, nos quais fenômenos de interações entre os substratos e

mecanismos de controle, representando a fisiologia microbiana, estão envolvidos.

Neste trabalho foi avaliado o desempenho de modelos cinéticos de

crescimento microbiano na descrição de dados experimentais da biodegradação de

compostos tóxicos BTEX e BTF. Para a avaliação dos modelos foram utilizados

dados experimentais obtidos na literatura. Estes dados foram obtidos por DEEB &

ALVAREZ-COHEN (1999) e por HAMED et al. (2003), os quais investigaram a

biodegradação dos compostos BTEX e BTF, respectivamente, em operação

batelada. DEEB & ALVAREZ-COHEN (1999) avaliaram o efeito da temperatura e

interações entre os substratos BTEX utilizando uma associação microbiana e

Rhodococcus rhodochrous como microorganismos degradadores. HAMED et al.

(2003) investigaram as interações entre os substratos benzeno, tolueno e fenol

durante a biodegradação aeróbia utilizando Pseudomonas putida F1.

Verificou-se, durante a modelagem matemática, que uma das tarefas mais

complexas no desenvolvimento de processos biotecnológicos consiste na

identificação não-linear dos parâmetros dos modelos. Para este procedimento foi

implementado no software Maple

um método de otimização global, conhecido como

Enxame de Partículas ou Particle Swarm Optimization (PSO), o qual se mostrou

muito eficiente na identificação dos parâmetros. Para todos os casos avaliados, o

método foi programado utilizando um microcomputador AMD Sempron 2800 Hz, 512

MB de memória RAM, onde as buscas foram realizadas adotando-se 300 partículas

e 25 iterações. Verificou-se que o número de iterações foi suficiente, na maioria dos

casos. Observou-se que a convergência para os valores ótimos globais ocorreu

rapidamente, independentemente do número de iterações, quando a estimativa do

intervalo de busca apresentaram os valores ótimos. Também se observou que a

complexidade desta tarefa aumentou com o aumento do número de parâmetros dos

modelos. A busca pelos parâmetros dos modelos simples mostrou-se fácil, pois

Capítulo 6 – Conclusões e Sugestões

123

envolvia apenas três (modelo de Monod) e quatro parâmetros (modelo de Andrews),

necessitando em média 3 minutos para serem estimados para a biodegradação do

BTEX, e 10 a 15 minutos para a biodegradação do BTF. Por outro lado, a estimativa

dos parâmetros dos modelos para múltiplos substratos, necessitou de um elevado

esforço computacional e apresentou grande dificuldade em estimar os valores

ótimos globais, devido a dificuldade em correlacionar cada parâmetro de maneira a

obter o significado microbiológico coerente com o processo. Os modelos aplicados a

biodegradação do BTEX apresentaram doze (modelos de inibição) e vinte e quatro

parâmetros (modelo SKIP) a serem estimados, necessitando em média do tempo de

37 e 55 minutos, respectivamente. A dificuldade em estimar os valores ótimos dos

parâmetros para a biodegradação da mistura benzeno-tolueno e tolueno-fenol foi

diminuída, levando em média 25 a 28 minutos e 30 a 35 minutos, respectivamente,

utilizando os modelos de inibição (seis parâmetros) e 27 minutos, em ambos os

casos, utilizando o modelo SKIP (oito parâmetros). Para a mistura benzeno-tolueno-

fenol, os nove parâmetros dos modelos de inibição necessitaram de 36 a 50 minutos

e os quinze parâmetros do modelo SKIP necessitaram, em média de 50 minutos

para serem estimados. As modificações propostas nos modelos para descrever a

biodegradação da mistura benzeno-tolueno e benzeno-fenol resultaram aumento em

apenas dois parâmetros, mas que, no entanto implicaram em maiores dificuldades

na estimativa dos ótimos globais, pois uma instabilidade durante a busca foi

encontrada. Os parâmetros do modelo de inibição competitiva modificado para a

biodegradação da mistura benzeno-tolueno necessitaram de um tempo médio de 34

minutos. Os modelos de inibição e o modelo SKIP aplicados à biodegradação da

mistura benzeno-fenol, necessitaram um tempo médio de 32 a 47 minutos e 40

minutos, respectivamente. Os parâmetros obtidos no presente trabalho mostraram-

se coerentes com valores relatados na literatura, apresentando coerência

microbiológica. A biodegradação individual dos substratos foi adequadamente

descrita pelos modelos de Andrews e Monod para os compostos, benzeno, tolueno,

etilbenzeno e xileno. Apesar da biodegradação do fenol estar bem definida por

seguir o modelo de Andrews, neste trabalho este comportamento não foi observado,

sugerindo que intermediários metabólicos estiveram presentes juntamente com o

fenol durante a biodegradação. O crescimento diáuxico verificado a partir dos dados

experimentais de crescimento da biomassa intensifica a presença de repressão

catabólica entre o substrato fenol e seus intermediários.

Capítulo 6 – Conclusões e Sugestões

124

Apesar dos poucos relatos encontrados na literatura descreverem a cinética

de biodegradação da mistura BTEX por meio dos modelos de inibição, este trabalho

demonstra que nas condições experimentais estudadas por DEEB & ALVAREZ-

COHEN (1999), isso não ocorreu. Neste trabalho, um novo modelo, conhecido como

modelo SKIP, apresentou uma ótima performance em descrever os dados

experimentais da biodegradação da mistura BTEX. Contudo, os demais modelos

avaliados não puderam ser descartados, pois uma metodologia estatística,

necessária para assegurar a qualidade dos resultados obtidos, não pôde ser

realizada por falta de informações importantes para este fim. O modelo SKIP sugere

a existência de interações não específicas entre os substratos BTEX, e inferências

sobre o comportamento dos demais modelos apontam para uma mistura de inibição

competitiva e não-competitiva. Isto concorda com o fato de que, a mistura de

culturas microbianas utilizada na biodegradação, pode apresentar múltiplos

caminhos metabólicos para a biodegradação dos compostos BTEX. Por meio do

modelo SKIP estimou-se as interações entre os substratos BTEX, onde o

etilbenzeno apresentou o maior efeito de inibição sobre os demais compostos, ao

passo que o xileno mostrou o menor efeito. Verifica-se, portanto que as interações

entre os compostos BTEX são bastante complicadas devido, tanto à similaridade

nas propriedades e estruturas dos mesmos, quanto aos complexos sistemas

enzimáticos requeridos para metabolização destes substratos. A partir disto, propôs-

se também avaliar os modelos cinéticos na descrição dos dados experimentais da

biodegradação dos compostos BTF.

As modificações propostas para o modelo de inibição competitiva, na

modelagem da biodegradação da mistura benzeno-tolueno, mostraram-se

adequadas para confirmar os efeitos de inibição pela concentração de ambos os

substratos. O modelo de inibição competitiva também foi utilizado com sucesso para

descrever a biodegradação da mistura benzeno-fenol. Neste caso, propôs-se

adicionar o termo de inibição pelo substrato na equação da taxa de crescimento

específico no benzeno, e o termo de inibição por intermediários metabólicos na

equação da taxa de crescimento específico no fenol. A biodegradação da mistura

tolueno-fenol foi bem descrita pelo modelo de inibição competitiva, e modificações

não foram necessárias. Entretanto, os dados experimentais de crescimento da

biomassa, neste caso, apresentaram um comportamento diáuxico e, portanto,

investigações de outros modelos, que incorporem mecanismos complexos de

Capítulo 6 – Conclusões e Sugestões

125

regulação interna, como a repressão catabólica, podem corrigir as falhas

apresentadas com relação ao perfil da biomassa. Finalmente, a cinética de

biodegradação da mistura benzeno-tolueno-fenol mostrou-se adequadamente

descrita pelo modelo de inibição competitiva, suportando a hipótese de que os três

compostos são metabolizados pelo mesmo caminho enzimático da Pseudomonas

putida F1 utilizada na biodegradação, conhecido como rota metabólica TOD.

Os resultados alcançados neste trabalho mostram que os melhores modelos

podem ser aplicados com sucesso na otimização dos processos de biodegradação

de compostos tóxicos em diferentes tipos de biorreatores e condições operacionais.

6.2. Sugestões

Com o objetivo de prosseguir com as investigações e resultados encontrados

neste trabalho seguem algumas sugestões.

Com relação ao método PSO sugerem-se alguns ajustes de modo que o

algoritmo apresente um desempenho ainda melhor:

• Verificar a influência da velocidade inicial no desempenho do algoritmo.

Durante a implementação neste trabalho adotou-se que as partículas

partiriam do repouso;

• Procurar utilizar outras funções para discretizar as posições das partículas.

Com relação à biodegradação de compostos tóxicos sugerem-se prosseguir

na investigação a partir dos seguintes estudos:

• Obter dados experimentais para testar os modelos cinéticos avaliados;

• Seguir no estudo dos demais níveis hierárquicos do conhecimento,

apresentados no capítulo quatro;

• Desenvolver a modelagem matemática de biorreatores para biodegradação

de compostos tóxicos utilizando a cinética de biodegradação descrita pelo

modelo SKIP para os compostos BTEX;

• Aplicar modelos cinéticos que incorporam complexos mecanismos de

regulação gênica, como a repressão catabólica, para descrever o processo de

biodegradação dos compostos que, aparentemente, apresentaram um

fenômeno diáuxico.

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Anexos

147

Anexos

Os caminhos metabólicos de utilização dos compostos BTEX e de outros

compostos tóxicos estão incluidos atualmente na base de dados da universidade de

Minesota (http://umbbd.msi.umn.edu). A seguir, são apresentados os caminhos

completos de biodegradação aeróbica e anaeróbica dos compostos BTEX.

Benzeno

Tolueno

Etilbenzeno

o-Xileno

m-Xileno

p-Xileno

Benzeno: R = H

catecol

Tolueno: R = CH

3-metilcatecol

Etilbenzeno: R = CH

3-etilcatecol

o-Xileno: R = CH

3-metilcatecol

m-Xileno: R = CH

3-metilcatecol

p-Xileno: R = CH

4-metilcatecol

Mineralização

Benzoil-CoA

Mineralização

Degradação

Anaeróbica

Degradação

Aeróbica

Ilustração 1 – Esquema da degradação aeróbica e anaeróbica dos compostos BTEX.

Anexos

148

(a) (b)

Anexos

149

(a) (b) (c)

Ilustração 3 – Caminhos metabólicos da biodegradação aeróbica do tolueno utilizando-se

(a) Burkholderia G4, (b) Pseudomonas pickettii PKO1 e (c) Pseudomonas putida F1.

Anexos

150

Anexos

151

Ilustração 5 – Caminho metabólico da biodegradação aeróbica do o-xileno utilizando-se

Burkholderia cepacia MB2.

Anexos

152

Anexos

153

Ilustração 7 – Caminho metabólico da biodegradação aeróbica do m-xileno utilizando-se

Pseudomonas putida mt-2.

Anexos

154

Anexos

155

Ilustração 9 – Caminho metabólico da biodegradação anaeróbica do etilbenzeno utilizando-

se Azoarcus sp. EBN1 ou EB1.

Anexos

156

Tabela 1 – Sumário da cinética de crescimento obtida em vários estudos de biodegradação de compostos tóxicos

Parâmetros

Referência Composto

Intervalo de

Concentração [mg L

-1

]

máx

-1

] K

[mg L

-1

]

x/s

[mg mg

-1

]

[mg L

-1

]

Microorganismo

Abuhamed et al. (2004)

3,00 - 187, 70

2,76 - 160,30

10 - 200

0,620

0,610

0,051

1,65

6,47

18,00

0,75

0,58

0,44

180

430

P. putida F1

ATCC700007

Reardon et al. (2000)

≤

0,73 ± 0,03

0,86 ± 0,01

0,11 ± 0,01

0,12 ± 0,02

13,80 ± 0,90

32,00 ± 2,40

1,20 ± 0,05

1,28 ± 0,13

0,80 ± 0,07

P. putida F1

Chang et al. (1993)

p-X

≤

0,335 ± 0,129

0,543 ± 0,076

0,452 ± 0,115

0,130

3,17 ± 0,82

1,96 ± 0,91

1,88 ± 1,26

16,00

1,04 ± 0,09

1,22 ± 0,10

0,99 ± 0,25

P. fragi B1

P. sp. X1

Nakhla (2003)

o-X

10 - 50

0,0058-0,0144

0,0052-0,0127

0,0052-0,0114

5,54 - 10,16

6,32 - 10,47

6,78 - 10,81

0,50 - 1,02

0,48 - 1,02

0,52 - 1,02

mistura de culturas

Oh et al. (1994)

≤

0,44

0,72

3,36

15,07

0,65

0,64

44,43

P. putida O1

Lin et al. (2007)

0,0194

0,0064

0,0340

0,0060

8,349

9,851

211,791

1,427

0,53

0,34

0,32

0,75

191,89

48,48

310,56

153,55

P. aeruginosa

B – benzeno; T – tolueno; E – etilbenzeno, o-X – orto-xileno; p-X – para-xileno; m-X – meta-xileno; F – fenol

* - valores não encontrados

Anexos

157

Tabela 1 (Continuação) – Sumário da cinética de crescimento obtida em vários estudos de biodegradação de compostos tóxicos

Parâmetros

Referência Composto

Intervalo de

Concentração [mg L

-1

]

máx

-1

] K

[mg L

-1

] Y

x/s

[mg mg

-1

]

[mg L

-1

]

Microorganismo

Bielefeldt & Stensel

(1999b)

o-X

p-X

1,40 - 15,60

0,0475

0,0827

0,0200

0,0058

0,0097

0,51

0,47

0,23

0,16

0,23

0,95

0,62

0,23

0,32

mistura de culturas

Reardon et al. (2002)

0,39 ± 0,01

0,31 ± 0,03

1,01 ± 0,28

0,51 ± 0,38

1,030 ± 0,090

0,880 ± 0,005

Burkholderia sp. JS150

Mirpuri et al. (1997)

≤

50 0,42 ± 0,05

3,98 ± 0,78

0,90 ± 0,13 42,78

P. putida 54G

Kermanshahi et al. (2006)

p-X 13,60 - 67,50 0,0047 10 0,05 - mistura de culturas

Kelly et al. (1996)

X * 0,3830 13,2725 * - mistura de culturas

Schirmer et al. (1999)

m-X 4,70 - 37,30 0,172 0,790 0,520 91,700 mistura de culturas

Seker et al. (1997)

≤

400 0,569 18,539 0,521 99,374

P. putida NRRL β14875

Kotturi et al. (1991)

≤

200 0,119 5,270 0,550 377

P. putida Q5

Wang & Loh (1999) F 25 - 800 0,90 6,93 0,43 284,30

P. putida ATTC49451

Jiang et al. (2007)

≤

1600 0,15 2,22 * 245,37

Alcaligenes faecalis

Nuhoglu & Yalcin (2005) F

25 - 100

100 - 1450

0,143

0,145

87,450

88,500

0,600

107,060

145,000

mistura de culturas

Kumar et al. (2005)

F 10 - 1000

0,305

0,216

36,330

20,590

0,650

129,790

P. putida MTCC1194

B – benzeno; T – tolueno; E – etilbenzeno, o-X – orto-xileno; p-X – para-xileno; m-X – meta-xileno; F – fenol

* - valores não encontrados

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