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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
ASPIRAÇÃO DE OÓCITOS E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN
VITRO
DE VACAS JERSEY SUPLEMENTADAS COM SELÊNIO
Autor: Jefferson Ruela de Azevedo
Orientador: Prof. Dr. Gentil Vanini de Moraes
MARINGÁ
Estado do Paraná
Janeiro – 2008
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
ASPIRAÇÃO DE OÓCITOS E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN
VITRO
DE VACAS JERSEY SUPLEMENTADAS COM SELÊNIO
Autor: Jefferson Ruela de Azevedo
Orientador: Prof. Dr. Gentil Vanini de Moraes
Dissertação apresentada como parte das
exigências para a obtenção do título de
MESTRE EM ZOOTECNIA no Programa
de Pós-Graduação em Zootecnia da
Universidade Estadual de Maringá - Área de
concentração Produção Animal.
MARINGÁ
Estado do Paraná
janeiro – 2008
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ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por estar presente em todos os momentos de minha vida;
Aos meus pais e irmãos, João Nelson, Rita, Marjorie e João Nelson Jr.;
Ao meu Orientador, Prof. Dr. Gentil Vanini de Moraes;
Ao meu Co-orientador, Prof. Dr. Luis Paulo Rigolon;
Ao Prof. Dr. Fabio Luis Bim Cavalieri;
Ao Biotec e ao Cesumar, por ter contribuído com o Laboratório de Produção in vitro de
Embriões;
Aos colegas Marcio Tiburcio, Isabele, Milena, Thaís e Marcela;
Ao Programa de Pós-Graduação em Zootecnia e CCA;
À Fazenda Experimental de Iguatemi, em especial ao Coordenador Amauri e ao Vicente
Faleiros, que viabilizou o experimento;
À Thais, que esteve presente em todos os momentos, ajudando, aprendendo, ensinando;
Ao amigo Gustavo de Arruda Bezerra;
Ao amigo e Prof. Dr. Selwin Arlington Headley;
À Potensal, por ter cedido o sal mineral com diferentes teores de Se;
Aos professores que contribuíram para meu crescimento acadêmico.
iii
BIOGRAFIA
Jefferson Ruela de Azevedo, filho de João Nelson de Azevedo e Rita de Cássia Ruela de
Azevedo, nascido na cidade de Londrina – PR, em 26 de agosto de 1978. Graduou-se em
Medicina Veterinária em 2004, pelo Centro Universitário de Maringá (Cesumar).
Atualmente, é aluno do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da Universidade
Estadual de Maringá e trabalha na área de Biotecnologia da Reprodução.
iv
ÍNDICE
Página
LISTA DE TABELAS .................................................................................... v
RESUMO .......................................................................................................... vi
ABSTRACT ...................................................................................................... viii
I - INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1
1.1. Introdução Geral .................................................................................. 1
II – ASPIRAÇÃO DE OÓCITOS E PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN
VITRO DE VACAS JERSEY SUPLEMENTADAS COM SELÊNIO
NA DIETA...............................................................................................
8
Resumo ....................................................................................................... 8
Abstract ...................................................................................................... 9
Introdução .................................................................................................. 10
Material e Métodos .................................................................................... 12
Locais e animais ...................................................................................... 12
Tratamentos e alimentação ........................................................................ 12
Colheita de oócitos e produção in vitro ................................................... 14
Amostragens de sangue, líquido folicular e alimentos para análise de
Selênio ......................................................................................................
15
Delineamento ............................................................................................ 15
Resultados e Discussão ................................................................................. 17
Conclusões .................................................................................................... 21
Referências .................................................................................................... 22
v
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1. Alimentos fornecidos diariamente, em kg, durante o período
experimental ................................................................................ 13
TABELA 2. Composição bromatológica do concentrado utilizado ................ 13
TABELA 3. Composição química do sal mineral utilizado ............................ 13
TABELA 4. Resultado médio estimado por aspiração folicular de vacas
Jersey (n=5) suplementadas com 3,2 mg / dia / animal e 9,6 mg
/ dia / animal de selênio e o desvio-padrão ................................. 17
TABELA 5. Resultado médio estimado da produção in vitro de embriões,
por aspiração folicular de vacas Jersey (n=5) suplementadas
com 3,2 mg / dia / animal e 9,6 mg / dia / animal de selênio e o
desvio-padrão .............................................................................. 19
TABELA 6. Resultado médio da análise de concentração de selênio no
plasma no início e no final do experimento e no líquido
folicular de vacas Jersey suplementadas com 3,2 mg / dia /
animal e 9,6 mg / dia / animal de selênio, durante 119 dias
..................................................................................................... 20
TABELA 7. Concentração inicial e final média de selênio no soro de vacas
Jersey suplementadas com 9,6 mg / dia / animal de selênio
durante 119 dias........................................................................... 20
RESUMO
O trabalho foi realizado com o objetivo de verificar a influência do selênio (Se)
adicional na dieta de doadoras de oócitos e na produção de embriões in vitro. Dez vacas
Jersey foram divididas, aleatoriamente, em grupos controle (GC) e tratamento (GT),
recebendo a mesma dieta, diferindo apenas na concentração de Se contida no sal
mineral. O GC recebeu 3,2 mg de Se / vaca / dia e o GT 9,6 mg de Se / vaca / dia.
Decorridos 20 dias do início do tratamento, foi realizada a primeira aspiração folicular
guiada por ultra-sonografia (AF), que foi desprezada. Em continuidade a esta, foram
realizadas mais cinco AFs, com intervalo médio de 15 dias. Os oócitos foram
classificados em qualidade I, II, III, expandido, desnudo, atrésico ou degenerado. A
produção in vitro de embriões foi realizada no laboratório Biotec – Cesumar, conforme
rotina padrão e avaliados no sétimo dia após a fecundação in vitro. Durante os 119 dias
de experimento, os animais apresentaram ganho de peso médio de 49,9 ± 13,47 kg /
vaca. A média de oócitos totais (35,11 ± 2,65) e a média de oócitos qualidade I (11,61 ±
1,58) colhidos foram maiores no GT (P<0,05) em comparação com o GC (23,10 ± 2,16
e 4,75 ± 0,97, respectivamente). A quantidade de oócitos desnudo foi inferior (3,24 ±
0,87) no GT (P<0,05), mas o número de estruturas atrésicas (10,68 ± 1,62) e inviáveis
totais (11,23 ± 1,65) foi superior no GT (P<0,05). A produção in vitro de embriões
totais e blastocistos expandidos foi superior (21,98 ± 2,37
e 10,95 ± 1,64,
respectivamente) no GT (P<0,05) em relação ao GC (13,12 ± 1,59
e 6,64 ± 1,15). A
quantidade de blastocisto inicial e blastocisto não diferiu entre os dois grupos (P>0,05).
Assim, conclui-se que a maior adição de Se à dieta resultou em maior produção de
oócitos, maior quantidade de oócitos de grau I e maior produção de embriões no
vii
processo de fecundação in vitro, recomendando a utilização de 9,6 mg de Se / dia / vaca
doadoras de oócitos.
Palavras-chave: biotecnologia, glutationa, radicais livres, reprodução, ultra-som
ABSTRACT
The study was carried out to evaluate the influence of the additional selenium
(Se) in oocytes donors' diet and in the in vitro embryos production. Ten Jersey cows
were divided, randomly, in control groups (CG) and treatment (TR), receiving the same
diet that only differed by the Se concentration in mineral salt. The CG received 3.2 mg
of Se/cow/day and TR received 9.6 mg/cow/day. After 20 days from the treatment
beginning, it was done the first follicular aspiration driven by ultrasound (US) that was
discarded. Following this, it was done more five US with an average of 15 days. The
oocytes where then classified in I, II and III quality, expanded, naked, atresic or
degenerated. The in vitro embryos production was done in the BIOTEC – CESUMAR
laboratory, according to standard routine and then evaluated in the seventh day after in
vitro fertilization. During the experimental period (119 days) the animals had an
average weight gain of 49.9 ± 13.47 kg/cow. The average of total oocytes (35.11 ± 2.65)
and quality I oocytes (11.61 ± 1.58) were higher in the TR (P<0.05) than CG (23.10 ±
2.16 and 4.75 ± 0.97, respectively). The amount of naked oocytes was lower (3.24 ±
0.87) in the TR (P<0.05) while the atresic structure number (10.68 ± 1.62) and total
unviable (11.23 ± 1.65) were higher (P<0.05). The total production of in vitro embryos
and expanded blastocyst were higher (21.98 ± 2.37 and 10.95 ± 1.64, respectively) in
TR (P<0.05), when compared with CG (13.12 ± 1.59 and 6.64 ± 1.15). The amount of
initial blastocyst and blastocyst did not differ between the two groups (P>0.05).In
accordance to the conditions in which the study was developed it is possible to conclude
that the higher Se addition to diet resulted in higher oocytes production, higher quantity
ix
of degree I oocytes I and higher embryos production in the process of in vitro
fertilization, recommending the use of 9.6 mg of Se/ day per cows donor of oocytes.
key words: biotechnology, glutathione, reproduction, free radicals, ultrasound
I - INTRODUÇÃO
O Selênio (Se) foi descoberto em 1817 por John Jacob Berzelius e, por analogia
ao telúrio, que deriva tellus, que quer dizer terra, o Se recebeu esse nome que deriva de
selene (grego), que quer dizer lua (ORTOLANI, 2002). No entanto, FRANK (1934),
citado por ORTOLANI (2002), foi quem relacionou o Se com função biológica, ao
constatar um tipo de claudicação, em eqüinos, resultante da intoxicação por Se.
SCHWARZ & FOLTZ (1957) descreveram, pela primeira vez, a necrose hepática, em
ratos, e a miopatia, em ovinos, causada pela deficiência de Se.
Atualmente, muitos estudos têm sido realizados para avaliar o comportamento
de Se em sistemas biológicos, como GILARDI et al. (2004), que testaram o Se em meio
de cultivo de embriões produzidos in vitro, PASCHOAL et al. (2005), que pesquisaram
a incidência de mastite em vacas suplementadas com Se e vitamina E, e ALVAREZ &
MORAES (2006), que avaliaram a morfologia espermática, em coelhos, suplementados
com Se e vitamina C.
O Se é um elemento que apresenta estreita margem entre os níveis de exigência
e tóxicos (UNDERWOOD & SUTTLE, 1999). As exigências para vacas leiteiras
variam de 0,1 a 0,3 mg.kg
-1
de matéria seca (MS) (ARC, 1980; NRC, 2001) e para
bovinos de corte 0,1 mg.kg
-1
de MS (NRC, 1983). Teores acima de 2 mg.kg
-1
na MS
podem ser tóxicos, porém, em ruminantes, a atividade microbiana do rúmen influencia
a forma com que o Se chega ao intestino delgado para absorção, diminuindo o risco de
intoxicação (FISHER et al., 1980; MAUS et al., 1980; CRISTALDI et al., 2005).
Em ruminantes, a suplementação de Se pode ser feita na forma orgânica ou
inorgânica, porém, dependendo da fonte, o Se apresenta diferenças (GIERUS, 2007).
Esse autor atribuiu essa diferença ao metabolismo inicial das fontes, destacando o
2
selenato (SeO4
-2
) e selenito (SeO3
-2
) como formas inorgânicas, e selêniometetionna ou
selêniocisteina como formas orgânicas análogas dos aminoácidos sulfurados.
A forma orgânica de Se está presente como um produto direto da incorporação
de Se em proteínas em substituição ao enxofre, o que difere das metaloproteínas ou
quelatos, nos quais ocorre simplesmente uma complexação com grupos funcionais das
proteínas (SUZUKI, 2005).
De acordo com o NRC (2001), vários estudos mostraram redução na prevalência
de retenção de placenta, metrite, ovários císticos e edema de úbere quando vacas
leiteiras foram suplementadas com Se durante a gestação ou a manifestação de
fragilidade de sustentação das pernas, tremores musculares e decúbito em casos de
deficiência. A deficiência de Se na dieta também interfere no metabolismo dos
hormônios da tireóide, elevando a proporção T
4
:T
3
, pois ocorre diminuição da enzima
deiodotironina-5-deiodinase, que é responsável pela deiodinação da tiroxina
(UNDERWOOD & SUTTLE, 1999).
FOUCRAS et al. (1996) relacionaram a deficiência de Se com a doença do
músculo branco, enfermidades metabólicas, infertilidade e imunossupressão. Os sinais
clínicos da deficiência de Se não são específicos, dificultando o diagnóstico clínico da
doença, exceto no caso da doença do músculo branco (UNDERWOOD & SUTTLE,
1999).
Na ausência de Se, além da diminuição da atividade da glutationa, o perfil
sangüíneo mostra aumento da atividade das enzimas indicadoras de dano muscular,
principalmente a creatina quinase (CPK) e a alanina aminotransferase (AST)
(GONZÁLES, 2000).
A restrição grave de Se, em ruminantes, manifesta-se por meio da diminuição do
crescimento e distrofia muscular nutricional em cordeiros e bezerros de crescimento
rápido (GONZÁLES, 2000). Esse autor, destacou que tais ocorrências, levam à
ocorrência de morte súbita causada por lesões no miocárdio e pode ser observado
edema, principalmente no mesentério, pulmão e tecido subcutâneo.
SANTIAGO (1986a) observou diminuição de retenção de placenta em vacas da
raça Charolesa que receberam, com 240/260 dias de gestação, 1 mL de selênio-tocoferol
/ 100 kg. Santiago (1986b), em outro trabalho, observou no Rio Grande do Sul aumento
no índice de fecundação, diminuição do número de inseminações por concepção e do
intervalo de parto e fecundação, em que um dos grupos de vacas da raça Charolesa
3
recebeu selênio-tocoferol (1 mL / 100kg) 30 dias pré-parto e outro que recebeu 30 dias
pré-parto e 60 dias pós-parto.
ZANETTI et al. (1998) concluíram que a suplementação oral com 5 mg de Se no
último mês de gestação aumentou significativamente o nível sérico do mineral em vacas
leiteiras, reduzindo a incidência de mastite subclínica diagnosticada pelo California
Mastite Teste (CMT), além dos bezerros, filhos de vacas suplementadas, apresentarem
níveis séricos de Se 66% superiores aos de bezerros filhos de vacas não suplementadas.
PASCHOAL et al. (2003a; 2003b) verificaram que a suplementação diária com
5 mg de selênio, iniciada 30 dias antes do parto, diminuiu em 38% a prevalência de
mastite clínica nas primeiras 12 semanas de lactação. Em contrapartida, COSTA et al.
(1997) não observaram diferença significativa entre o grupo tratado com 0,1 mg de Se /
kg de MS e o grupo-controle (sem suplementação) quanto à incidência de mastite
clínica (diagnosticada pela prova de Tamis), mastite subclínica (diagnosticada pelo
CMT) e infecções intramamárias.
HURLEY & DOANE (1989) afirmaram que o Se pode estar associado à
produção de prostaglandinas e que existe acúmulo de Se nos placentomas, ovários,
pituitária e glândulas adrenais, sugerindo que haja exigências específicas nestes tecidos.
Afirmaram também que pode reduzir a retenção de placenta e incrementar a
performance reprodutiva, visto que há indícios que a glutationa peroxidase protege a
membrana dos oócitos contra danos oxidativos.
O Se faz parte da enzima glutationa peroxidase, que tem a função de inativar os
radicais livres derivados do oxigênio, em conseqüência do metabolismo (CEBALLOS
et al., 1999), evitando o dano oxidativo celular (UNDERWOOD & SUTTLE, 1999).
A presença de Se na estrutura da enzima permite que exista uma alta relação
entre a concentração sangüínea e tissular de Se com a atividade da glutationa peroxidase
(GSH-Px), pois a função metabólica conhecida do Se é formar parte da estrutura da
enzima (CEBALLOS et al., 1999; LUBERDA et al., 2005). Em bovinos, a correlação
da atividade enzimática nos eritrócitos e a concentração sangüínea de Se é alta (VAM
SAUN et al., 1989). De acordo com HAFEMAN et al. (1974), a atividade da GSH-Px,
nos tecidos de ratos, cai drasticamente em animais recebendo dietas deficientes em Se e
aumenta quando ocorre reposição de Se. No entanto, os componentes celulares do
sangue contêm a maior proporção de Se e, desta forma, a correlação entre a atividade da
enzima e a concentração plasmática de Se é baixa (SCHOLZ & HUTCHINSON, 1979).
4
A GSH-Px tem importante papel na maturação de oócitos (LUBERDA, 2005). O
processo de maturação citoplasmática de oócitos envolve muitos eventos moleculares,
incluindo a síntese de componentes bioquímicos, fosforilação de proteínas e ativação de
vias metabólicas específicas (EPPIG, 1996; KRISHER & BAVISTER, 1998), eventos
que são pré-requisitos para a fertilização normal e desenvolvimento embrionário. A
síntese intracelular de glutationa é um ponto crítico para a maturação citoplasmática do
oócito (EPPIG, 1996). A função da GSH-Px no oócito é relatada como propriedades
antioxidantes e protetora contra radicais livres com atividade tóxica (LUBERDA,
2005).
A produção de embriões in vitro (PIV) vêm se estabelecendo em estudos da
fisiologia da maturação e fecundação de oócitos, capacitação espermática, cultivo de
embriões, clonagem, transferência de genes, microinjeção, sexagem, congelação e
descongelação de oócitos e embriões (COELHO et al., 1998).
Oócitos de boa qualidade, com boas características morfológicas e de
desenvolvimento, são os primeiros requisitos para o sucesso da produção in vitro de
embriões (SENEDA et al., 2001). Assim, realizou-se o presente estudo com o objetivo
de verificar a influência da adição de selênio na dieta de vacas Jersey sobre a aspiração
de ovócitos e produção de embriões in vitro.
5
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6
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ZANETTI, M. A. et al. Efeito da suplementação de selênio e vitamina E em bovinos
leiteiros. Revista Brasileira de Zootecnia, Brasília, v. 27, p. 405-408 ,1998.
II – Aspiração de oócitos e produção de embriões in vitro de vacas Jersey
suplementadas com selênio na dieta
RESUMO
O estudo foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos do selênio (Se)
adicional na dieta de vacas Jersey na aspiração de oócitos e produção de embriões in
vitro. Dez vacas da raça Jersey foram divididas, aleatoriamente, em dois grupos, em que
um deles recebeu 3,2 e o outro 9,6 mg de Se por vaca por dia adicionado ao
concentrado. Foram realizadas seis aspirações foliculares, com intervalo médio de 15
dias, aproveitando apenas as 5 últimas. Os oócitos foram transportados para o
laboratório, classificados e realizados os procedimentos padrões de maturação,
fertilização e cultivo in vitro. A quantidade de oócitos viáveis totais e qualidade I foi
superior no grupo que recebeu 9,6 mg de Se (P<0,05) e a quantidade de oócitos
desnudos foi inferior neste grupo (P<0,05). No entanto, a quantidade de estruturas
inviáveis foi superior nesse grupo. Não se observou diferença significativa (P>0,05) na
concentração de Se no soro e no líquido folicular entre os grupos. Assim, recomenda-se
o fornecimento de 100 g de sal mineralizado, contendo 96 mg de Se / kg, adicionados à
dieta, pois resultou em maior produção de oócitos, maior quantidade de oócitos de grau
I e maior produção de embriões no processo de fecundação in vitro.
Palavras-chave: biotecnologia, glutationa, radicais livres, reprodução, ultra-som
9
II- Oocytes aspiration and in vitro embryos production of Jersey cows
supplemented with selenium in the diet
ABSTRACT
The study was carried out to evaluate the effects of the additional selenium (Se) in
Jersey cows' diet in the oocytes aspiration and production of embryos in vitro. Ten
Jersey cows were divided, randomly, in two groups, where one of them received 3.2 and
the other 9.6 mg of Se per cows per day added to the concentrate. Six follicular
aspirations were carried out, with an average of 15 days, using only the last 5 ones. The
oocytes were transported to the laboratory, classified, and then they were submitted to
the standards proceedings of maturing, fecundation and in vitro cultivation. The total
quantity of viable oocytes and quality I were higher in the group that received 9.6 mg of
Se (P <0.05) and the quantity of naked oocytes was lower in this group (P <0.05).
However, the quantity of unviables structures were superior in this group. There was not
observed significant difference (P> 0.05) of Se concentration in the serum and in the
follicular liquid between the two groups. In accordance to the conditions in which the
study was developed it is possible to recommend the supply of 100 g of mineralized
salt, containing 96 mg of Se/ kg added to diet, since it turned in higher oocytes
production, higher quantity of degree I oocytes I and higher embryos production in the
process of in vitro fertilization.
key words: biotechnology, free radicals, glutathione, reproduction, ultrasound
10
Introdução
O Selênio (Se) foi descoberto em 1817 por John Jacob Berzelius e por analogia
ao telúrio, que deriva tellus, que quer dizer terra, o Se recebeu esse nome que deriva de
selene (grego) que quer dizer lua (ORTOLANI, 2002; PDR HEALTH, 2005). No
entanto, somente FRANK (1934), citado por ORTOLANI (2002), relacionou o Se com
função biológica ao constatar que um tipo de claudicação, em eqüinos, resultante da
intoxicação por Se. SHWARZ & FOLTZ (1957) descreveram, pela primeira vez, a
necrose hepática em ratos e a miopatia em ovinos, causada pela deficiência de Se.
Os microminerais são importantes para as diferentes funções do organismo e,
assim, a produção (MCDOWELL, 1992; BOLAND, 2003), incluindo-se a atividade
reprodutiva (BOLAND, 2003), devendo o Se estar nas dietas de animais domésticos em
concentrações de 0,1 a 0,3 ppm (NRC, 1983).
O Se faz parte da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px), que tem a função de
inativar os radicais livres derivados do oxigênio, em conseqüência do metabolismo
(CEBALLOS et al., 1999; LUBERDA, 2005) e a concentração sangüínea de Se
apresenta relação de 0,74 a 0,97 com a atividade da GSH-Px (WITTWER et al., 2002).
A GSH-Px atua na proteção das células contra os danos causados por espécies
de oxigênio reativo e pela redução de peróxidos de hidrogênio, bem como favorece a
síntese de hormônios derivados do ácido araquidônico, do metabolismo de compostos
estranhos ao organismo e no transporte de alguns aminoácidos nos rins (SANDHOLM,
1980; PDRHEALPH, 2007; BARBOSA et al., 2005).
Os radicais livres causam danos à membrana celular, reduzindo a qualidade dos
gametas (LUBERDA, 2005). Oócitos de boa qualidade, com boas características
morfológicas e de desenvolvimento, são os primeiros requisitos para o sucesso da
produção in vitro de embriões (SENEDA et al., 2001; PASCHOAL & GRADELA,
2007).
As células estão continuamente produzindo radicais livres e espécies reativas de
oxigênio como parte do processo metabólico. Tais espécies são capazes de gerar
estresse oxidativo em conseqüência de suas propriedades oxidantes (PUNTEL, 2006).
De acordo com NORDBERG & ARNER (2001), em condições fisiológicas, o O
2
sofre
uma redução tetravalente com aceitação de quatro elétrons, resultando em formação de
água. Durante esta reação, são formados reativos intermediários como os radicais
11
superóxido (O
2
-), hidroperoxila (HO
2
) e hidroxila (OH) e o não radical peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
).
O radical superóxido é um radical livre formado a partir do oxigênio molecular
pela adição de um elétron. Sua formação ocorre espontaneamente, especialmente na
membrana mitocondrial através da cadeia respiratória. É um radical pouco reativo e não
tem a habilidade de penetrar em membranas lipídicas, agindo apenas no compartimento
onde é produzido.
O radical hidroxila é considerado o mais reativo em sistemas biológicos e é
formado a partir do peróxido de hidrogênio em uma reação catalisada por íons metais
(Fe
++
ou Cu
++
), denominada de reação de Fenton. O peróxido de hidrogênio (H2O2) é
extremamente nocivo, pois tem vida longa e é capaz de atravessar membranas
biológicas (NORDBERG & ARNER, 2001). Estes são neutralizados por um sistema de
defesa antioxidante que pode ser enzimático (a catalase, a superóxido dismutase, a
glutationa peroxidase) ou não-enzimático (as vitaminas A, E e C, flavonóides,
ubiquinonas e a glutationa reduzida - GSH) (ALEXI et al., 1998; GIANNI et al., 2004).
HURLEY & DOANE (1989) afirmaram que o Se pode estar associado à
produção de prostaglandinas e que existe acúmulo de Se nos placentomas, ovários,
pituitária e glândulas adrenais, sugerindo que haja exigências específicas nestes tecidos.
Salientaram também que pode reduzir a retenção de placenta e incrementar a
performance reprodutiva visto que há indícios de que a GSH-Px protege a membrana
dos oócitos contra danos oxidativos, o que coincide, em parte, com as observações de
LUBERDA (2005).
SANTIAGO (1986a) observou diminuição de retenção de placenta em vacas da
raça charolesa que receberam, com 240/260 dias de gestação, 1 mL de selênio-tocoferol
/ 100 kg. SANTIAGO (1986b), em outro trabalho, observou, no Rio Grande do Sul,
aumento no índice de fecundação, diminuição do número de inseminações por
concepção e do intervalo de parto e fecundação, em que um dos grupos de vacas da raça
charolesa recebeu selênio-tocoferol (1 mL / 100kg) 30 dias pré-parto e outro que
recebeu 30 dias pré-parto e 60 dias pós-parto
Já foram identificadas 10 selenoproteínas, dentre as quais a GSH-Px, cujas
funções ainda não são claras (ARTHUR et al., 1990). Dentre as selonoproteínas, a
diodinase, que converte tiroxina (T
4
) em triidotironina (T
3
) e, em um caso de deficiência
de Se, pode elevar o TSH e, por conseqüência, a deficiência de T
4
e T
3
(ARTHUR,
12
1993; OMS, 1998), o que poderia prejudicar o desenvolvimento animal (OBLITAS et
al., 2000).
De acordo com EPPIG (1996) e KRISHER & BAVISTER (1998), a GSH-Px
tem se revelado importante no processo de maturação de oócitos, envolvendo a síntese
de componentes bioquímicos, fosforilação de proteínas e a ativação de caminhos
metabólicos específicos.
Apesar dos avanços ocorridos nos últimos anos na produção de embriões in
vitro, vários aspectos precisam ser esclarecidos e, dentre eles, está a competência dos
gametas (PASCHOAL & GRADELA, 2007). Assim, para tentar contribuir neste
processo, realizou-se este estudo com o objetivo de verificar a influência da adição
dietética de Se, além daquela prevista para a produção animal, na produção e qualidade
de oócitos, bem como na produção de embriões in vitro.
Material e Métodos
Locais e animais
O experimento foi realizado na Fazenda Experimental Iguatemi da Universidade
Estadual de Maringá, Maringá-PR, localizada na latitude de 23º 25' S; 51º 57' O e 550
metros de altitude e no Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal (BIOTEC) do
Centro Universitário de Maringá (CESUMAR), na mesma cidade. Dez vacas da raça
Jersey, primíparas, idade média de 3 anos, com peso inicial médio de 240,6 kg, oriundas
do mesmo grupo genético, foram divididas, aleatoriamente, em grupos controle (GC) e
tratamento (GT).
Tratamentos e alimentação
Os animais receberam silagem de milho de planta inteira (Tabela 1),
concentrado (Tabelas 1 e 2), 100 g de sal mineralizado (Potensal®) / vaca / dia e
tiveram acesso à pastagem de grama estrela (Cynodon spp.). O tratamento dos dois
grupos diferiu apenas na concentração de selênio contida no sal mineral (Tabelas 1 e 3),
em que GC recebeu o sal que continha 32 mg de Se / Kg (3,2 mg de Se / vaca / dia) e o
GT, 96 mg de Se / Kg (9,6 mg Se / vaca / dia).
13
Tabela 1. Alimentos fornecidos diariamente, em kg, durante o período experimental.
Parâmetro GC GT
Silagem de Milho (MS) 2,684 2,684
Concentrado (MS) 2,251 2,251
Sal Mineralizado contendo 32 mg de Se / kg 0,100 -
Sal Mineralizado contendo 96 mg de Se / kg - 0,100
1
MS - Matéria Seca; GC - Grupo Controle; GT - Grupo Tratamento
Foi considerado dia zero (D-0) quando os animais começaram a receber os
tratamentos e, nesta data, os animais foram vermifugados com Ivermectina 1%
(Supramec®, Schering-Plough).
Tabela 2. Composição bromatológica do concentrado utilizado.
Matéria Seca (%) 90,05
Proteína Bruta (%) 16,00
Proteína Degradável no Rúmen (%) 13,80
Fibra Bruta (%) 9,80
Extrato Etéreo (%) 2,00
Fibra em Detergente Neutro (%) 30,00
Nitrogênio Não Protéico (%) 3,90
Nutrientes Digestíveis Totais (%) 70,00
Matéria Mineral (%) 10,00
Cálcio (%) 1,00
Fósforo (%) 0,45
Os animais foram pesados no D-0 (início) e no D-119 (final), além de mais
quatro pesagens intermediárias, conforme a rotina da fazenda, tendo as mesmas sido
realizadas pela manhã, antes que os animais recebessem alimentação.
Tabela 3. Composição química do sal mineral
1
utilizado.
Elementos GC GT
Cálcio (g / kg) 184 184
Fósforo (g / kg) 85 85
Enxofre (g / kg) 24 24
Magnésio (g / kg) 24 24
Sódio (g / kg) 103 103
Cobalto (mg / kg) 100 100
Cobre (mg / kg) 1300 1300
Ferro (mg / kg) 3500 3500
Iodo (mg / kg) 100 100
Manganês (mg / kg) 1800 1800
Selênio (mg / kg) 32 96
Zinco (mg / kg) 5000 5000
Cromo (mg / kg) 20 20
Flúor (mg / kg) 850 850
1
Sal mineral pr oduzido por POTENSAL
®
14
Colheita de oócitos e produção de embriões in vitro
Decorridos 20 dias de tratamento, foi realizada a primeira aspiração folicular
(AF) guiado por ultra-sonografia transvaginal, a qual foi desprezada. Em continuidade,
foram realizadas mais cinco aspirações, com intervalo médio de 15 dias, visando avaliar
os oócitos. As aspirações foliculares foram realizadas utilizando ultrasson Aloka SSD-
500, equipado com transdutor setorial intravaginal de 5 MHz e dispositivo-guia com
agulha WTA 20G para punção folicular conectado a bomba de vácuo Cook, com
pressão de 40 a 50 mm de Hg. Foram aspirados os folículos que apresentavam tamanho
de 3 a 9 mm de diâmetro (PERRY, 2007).
Uma vez colhidos, os oócitos foram transportados para o BIOTEC, dentro de
garrafa térmica, em meio de maturação (MIV-T Nutricell®) a 36°C. No Biotec, os
oócitos foram classificados de acordo com Lonergan (1992) em grau I, II, III,
expandido, desnudo e atrésico, sendo considerados viáveis os graus I, II, III, desnudo e
expandido ou inviáveis, degenerados ou atrésicos.
Os oócitos classificados como viáveis foram lavados em meio de maturação
(MIV-T Nutricell®) e transferidos para duas placas de Petri de 35 x 15 mm, uma
contendo 7 gotas e outra contendo 3 gotas de 90 µL de meio de maturação, em que cada
gota recebeu os oócitos de uma vaca, os quais foram cobertos por óleo mineral
(Sigma®), testados para cultivo de embriões e, então, foram incubados por 22 a 24
horas a 38ºC, com 5% de CO
2
em ar e umidade saturada. Após a maturação, os oócitos
foram lavados e transferidos para placa de fecundação contendo meio de Fecundação
(Nutricell®), acrescido de Heparina (Sigma Chemical®) e PHE (penicilina, hipotaurina
e epinefrina).
Na fecundação in vitro (FIV) foi utilizado sêmen de touro Jersey, previamente
testado na FIV. Os espermatozóides foram selecionados por meio de gradiente Percoll,
num tubo cônico de 15 mL com dois gradientes, sendo 90% e 45%. O sêmen foi
descongelado em banho-maria a 36ºC por um minuto e depositado sobre o tubo
contendo os dois gradientes Percoll e centrifugado a 600 g força por 10 minutos. Após a
centrifugação, o pellet formado foi retirado e diluído para atingir uma concentração de 2
x 10
6
espermatozóides / mL, utilizando-se 10 µL desta diluição, por gota, para efetuar a
FIV.
15
Após a adição do sêmen, a placa de FIV permaneceu a 38ºC, em atmosfera com
5% de CO
2,
em ar e umidade saturada por 18 a 22 horas. Concluído a FIV, as estruturas
foram novamente lavadas e transferidas para a placa de cultivo, contendo o meio de
cultivo (SOF Nutricell®) e incubados a 38ºC, em atmosfera com 5% de CO
2,
em ar e
umidade saturada.
A primeira avaliação foi realizada 48 horas após a fecundação (dia 2) e a
segunda, no dia 7, e os embriões classificados em mórula, blastocisto inicial, blastocisto
e blastocisto expandido, segundo LEIBFRIED & FIRST (1979).
Amostragens de sangue, líquido folicular e alimentos para análise de Selênio
Foram colhidos 10 mL de sangue, com agulhas de 40 x 12 mm da veia jugular
(10mL), no D-0 e outra no D-119, para avaliar selênio no soro. As amostras de
pastagem, silagem e concentrado também foram obtidas nas mesmas datas da colheita
de sangue. Uma semana após a última AF, foi obtida amostragem de líquido folicular
para avaliar Se, tendo os animais recebidos os tratamentos até esta data. O sangue foi
centrifugado a 3.000 rpm (1.600 g força) por 15 minutos e o soro foi colocado em
Eppendorf de 2 mL e congelado a menos 18
o
C até a realização das análises pelo
Laboratório Green Lab de Porto Alegre – RS. As amostras de líquido folicular também
foram congeladas a menos 18
o
C em tubos Eppendorf e as amostras de alimentos foram
embaladas e mantidas em freezer a menos 18
o
C até serem enviadas ao laboratório.
Delineamento
O delineamento adotado foi inteiramente casualisado, com análise de variância e
teste de médias para comparação dos tratamentos, utilizando-se o Modelo Bayesiano
para variáveis discretas. Preservando as características e pressuposições clássicas,
considerou-se que as variáveis aleatórias discretas (qualidade e tipo de oócitos e
embriões) do grupo controle(Y
iC
) e grupo tratamento (Y
jT
) apresentam distribuição
Poisson com parâmetro θ, onde:
Y
iC
~ Poisson (θ
C
), i =1, 2, ..., n
C
;
Y
jT
~ Poisson (θ
T
), j = 1, 2, ..., n
T
.
Distribuições a priori para os parâmetros θ
Para θ
C
e θ
T
, considerou-se como distribuição a priori a distribuição Gamma
não-informativa, com parâmetros “a” e “b”, onde:
16
θ
C
≡ θ
T
~ Gamma (a, b), sendo a = b = 10
+3
.
Modelo Bayesiano para variáveis contínuas
Preservando as características e pressuposições clássicas, considerou-se que as
variáveis aleatórias contínuas (quantidade de selênio no soro sangüíneo e no líquido
folicular) do grupo controle(Y
iC
) e grupo tratamento (Y
jT
) tem distribuição Normal com
médi a μ e variância σ
2
, onde:
Y
iC
~ Normal (μ
C
, σ
2
C
), i = 1, 2, ..., n
C
;
Y
jT
~ Normal (μ
T
, σ
2
T
), j = 1, 2, ..., n
T
.
Estrutura hierárquica - Distribuições a priori para os parâmetros μ e σ
2
Para cada μ
C
e μ
T
, considerou-se como distribuição a priori a distribuição
Normal não-informativa com parâmetros “c” e “d”, enquanto para cada σ
2
C
e σ
2
T
,
considerou-se como distribuição a priori a distribuição Gamma não-informativa com
parâmetros “e” e “f”, onde:
μ
C
≡ μ
T
~ Normal (c, d), sendo os hiperparâmetros c = 0 e d = 10
+6
;
σ
2
C
≡ σ
2
T
~ Gamma (e, f), sendo os hiperparâmetros e = f = 10
+3
.
As distribuições a posteriori para os parâmetros de interesse foram obtidas por
meio do software WinBUGS (SPIEGLHALTER et al., 1996), utilizado para a obtenção
das estimativas amostrais.
Foram geradas 10.000 amostras, sendo descartadas as primeiras 1.000 amostras.
As amostras finais foram tomadas em saltos iguais a 10, produzindo amostras de
tamanho 900 para cada parâmetro de interesse.
A monitoração da convergência das cadeias geradas pelo amostrador de Gibbs
foi feita por meio de análise gráfica e por meio da utilização dos testes de diagnóstico
de Geweke (1992) e de HEIDELBERGER & WELCH (1983), disponíveis no CODA
(Convergence Diagnosis and Output Analysis) ( SPIEGELHALTER et al., 1996),
implementado no programa R (R Development Core Team, 2007).
O sumário a posteriori das estimativas (média, desvio-padrão e mediana a
posteriori) dos parâmetros de interesse e para a diferença entre os parâmetros dos
grupos comparados, com seus respectivos intervalos de credibilidade (percentís P
2.5%
-
P
97.5%
) em nível de 95%, é apresentado nas Tabelas do texto. Para intervalos onde o
“zero” não pertence ao ICr(95%) = [P
2,5%
; P
97,5%
], há diferença significativa entre os
grupos analisados.
17
Resultados e Discussão
Durante os 119 dias de experimento, os animais apresentaram ganho de peso
médio de 49,9±13,47 kg, com peso final médio de 298±18,2 kg para os animais do GC e
283±8,57 kg para o GT. Os animais receberam as mesmas quantidades diárias de
silagem, concentrado e sal mineralizado durante o experimento.
Os resultados sobre a produção de oócitos totais e a classificação de acordo com
a qualidade são apresentados na Tabela 4. O número total de oócitos colhidos e o
número de estruturas graus I e III foram maiores nas fêmeas que receberam 9,6 mg
diárias de Se (P<0,05), mas o número de oócitos desnudos foi inferior (P<0,05). Por
outro lado, o número total de oócitos inviáveis e o número de oócitos atrésicos foram
mais elevados nos animais tratados com 9,6 mg diários de Se (P<0,05), assim como o
número de oócitos atrésicos (P<0,05).
Tabela 4. Resultado médio estimado por aspiração folicular de vacas Jersey (n=5)
suplementadas com 3,2 mg / dia / animal e 9,6 mg / dia / animal de selênio e o desvio-
padrão.
Parâmetro 3,2 mg Se / dia / animal 9,6 mg Se / dia / animal
Total de Oócitos Viáveis 23,10 ± 2,16 35,11± 2,65*
Grau I 4,75 ± 0,97 11,61 ± 1,58*
Grau II 4,57 ± 0,98 7,17 ± 1,32
Grau III 8,90 ± 1,32 16,40 ± 2,10*
Desnudos 6,22 ± 1,18* 3,24 ± 0,87*
Expandidos 2,33 ± 0,89 3,69 ± 1,16
Total de Oócitos Inviáveis 5,48 ± 1,16 11,23 ± 1,65*
Atrésicos 4,49 ± 1,08 10,68 ± 1,62*
Degenerados 1,32 ± 0,66 0,99 ± 0,71
* (P<0,05), comparando-se os resultados na mesma linha.
Pelas observações obtidas, notou-se que os animais apresentaram ganho de peso
compatível com a atividade de fornecer oócitos, pois houve ganho de peso, destacando
que o desempenho dos animais não deve ter interferido na produção de oócitos, como
mencionou BOLAND (2003), em que vacas que perdem peso no pós-parto não
apresentam boa ovulogênese. Então, os efeitos observados podem ser atribuídos aos
tratamentos.
De acordo com os dados contidos na Tabela 4, verificou-se que os animais que
receberam 9,6 mg de Se/dia apresentaram considerável melhora na produção de oócitos
quando comparados com os animais que receberam 3,2 mg de Se/dia (P<0,05), sendo
18
este último valor considerado normal para a produção animal (NRC, 1983). Isto pode
permitir levantar a hipótese de que a atividade reprodutiva requer teores de Se mais
elevados a fim de que os animais possam expressar o potencial máximo, o que está de
acordo com as observações de WITTWER et al. (2002), ao encontrarem correlação de
0,74 a 0,97 do nível de Se com enzima Glutatione Peroxidase (GSH-Px).
Algumas hipóteses podem ser atribuídas em favor do tratamento com maior teor
de Se, como a possibilidade da manutenção constante de níveis sangüíneos percentuais
elevados de Se (Tabelas 6 e 7) contribuindo para melhorar o crescimento, a maturação e
a competência dos oócitos. Fatores assim foram destacados por PAVLOK et al. (2005),
Gosden et al. (1997) e Perry (2007), em que observaram melhor competência dos
oócitos obtidos dos folículos com mais de 2 mm de diâmetro, pois os obtidos de
folículos com diâmetro inferior não foram capazes de sobreviver além do estádio de
clivagem de oito células. Assim, a formação de mais GSH-Px (WITTWER et al., 2002)
pode ter favorecido a foliculogênese e ter crescido folículos mais homogêneos e
maiores do que os animais tratados com 3,2 mg de Se. Outra hipótese que pode ser
abordada é a propriedade antioxidante do Se, combatendo os radicais livres resultantes
de átomos ou de moléculas que apresentam um ou mais elétrons despareados
(STRYER, 1996), elementos altamente tóxicos e deletérios às células e tecidos em geral
(RODRIGUEZ et al., 2004; LUBERDA, 2005).
Então, quando há desequilíbrio entre radicais livres (oxidantes) e os
antioxidantes (defensores) que favorecem os oxidantes, surge o estresse oxidativo,
havendo o ataque dos oxidantes às células, produzindo resíduos celulares ou a morte das
células (RODRIGUEZ et al., 2004). Diante disso, como o tratamento dos animais com
9,6 mg de Se por dia, manteve-se teores percentuais sangüíneos elevados de Se (Tabelas
6 e 7) e, como ele faz parte do processo de síntese das peroxidases como a GSH-Px, que
se localiza no citosol e nas mitocôndrias, certamente tais animais continham valores
elevados de GSH-Px (WITTWER et al., 2002) em comparação com aqueles que
receberam 3,2 mg de Se. Este fato pode ter gerado maior proteção dos oócitos contra os
oxidantes, em especial o radical hidróxido (OH
-
), acrescentando que foram observados
bons valores de Se no líquido folicular, o que pode indicar a importância do Se na
foliculogênese. Destaca-se também a predominância de oócitos de grau I, os quais
contêm as estruturas que os envolvem perfeitas, fator que proporciona maior
competência aos oócitos, devendo-se esperar maior índice de produção de embriões in
vitro, pois de acordo com GOLSDEN et al. (1997) e SENEDA et al. (2001), as camadas
19
que envolvem os oócitos são importantes para a nutrição e a regulação das atividades
dos oócitos.
É possível notar que os oócitos inviáveis, em especial os degenerados e
atrésicos, foram maiores (P<0,05) no tratamento com 9,6 mg de Se em relação aos
tratados com 3,2 mg, fato esperado, pois houve maior produção total de oócitos e maior
produção de grau I.
Na nutrição de vacas doadoras de oócitos ou destinadas à reprodução, uma parte
importante, em ruminantes, se deve aos microminerais como o Se, que é responsável
pela formação de proteínas enzimáticas, formando metaloproteínas fundamentais à vida
e que se houver deficiências causa severos distúrbios metabólicos e severas
conseqüências patológicas (McDOWELL, 1992; UNDEERWOOD & SUTTLE, 1999).
O teor considerado normal de Se no organismo de animais domésticos varia de
0,1 a 0,3 ppm (NRC, 2001), o qual participa da formação das enzimas glutationas,
destacando-se a GSH-Px, a mais importante (RODRIGUEZ et al., 2004), encarregada
de catalizar a redução dos peróxidos para proteger as células dos prejuízos oxidativos
(CEBALLOS et al., 1998; OBLITAS et al., 2000; BOLAND, 2003; RODRIGUEZ et
al., 2004; LUBERDA, 2005).
De acordo com Rodriguez et al. (2004), quando o equilíbrio entre radicais livres
(oxidantes) e os defensores antioxidantes encontram-se com desbalanço favorável aos
oxidantes, ocorre o estresse oxidativo, havendo ataque às células, levando-as à morte.
Também podem ocorrer alterações na atividade das organelas intracelulares, como
mitocôndrias, lisossomos, paredes e estruturas celulares (COMBS et al., 1975).
A produção total de embriões e o de blastocisto expandido, in vitro, foi superior
no GT (P<0,05). A quantidade de Blastocisto inicial e blastocisto não diferiu entre os
dois grupos (P>0,05). Os resultados são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5. Resultado médio estimado da produção in vitro de embriões, por aspiração
folicular de vacas Jersey (n=5) suplementadas com 3,2 mg / dia / animal e 9,6 mg / dia
/ animal de selênio e o desvio-padrão.
Parâmetro 3,2 mg Se / dia / animal 9,6 mg Se / dia / animal
Embriões totais (D-7) 13,12 ± 1,59 21,98 ± 2,37*
Blastocisto inicial (D-7) 2,78 ± 0,77 4,49 ± 1,05
Blastocisto (D-7) 3,01 ± 0,89 5,27 ± 1,16
Blastocisto expandido (D-7) 6,64 ± 1,15 10,95 ± 1,64*
* (P<0,05) , comparando-se os resultados na mesma linha.
20
As análises revelaram que submeter os oócitos ao processo de maturação e
fecundação in vitro obtêm-se a média estimada de 21,98±2,37 blastocistos totais nos
animais que foram tratados com 9,6 mg de Se/dia em comparação aos 13,12±1,58,
sendo significativa (P<0,05) esta diferença. Isto é o resultado, provavelmente, da
produção de oócitos de melhor qualidade (grau I) nos animais que receberam 9,6 mg/dia
de Se, o que pode ser justificado pelas observações de UHM et al. (2007), ao
trabalharem com embriões de suínos e terem constado que os oócitos cultivados e
fecundados em meio contendo 25 mg de Selenito de sódio por mL de meio
apresentaram melhor desenvolvimento e melhor qualidade aos sete dias de pós-
fecundação em relação aos cultivados em meios sem Selenito de sódio. De acordo com
UHM et al. (2007), o Se garantiu adequada biossíntese de selenoproteína, protegendo as
células dos embriões de ações oxidantes e apoptose. Em relação à selenoproteína, pode
ser destacado os estudos de WITTWER et al. (2002), ao observarem uma correlação de
0,74 dos teores de Se ingeridos pelo animal e a GSH-Px.
A concentração média de Se no soro e no líquido folicular apresentaram
variações numéricas entre os dois grupos, porém não se observou diferença estatística
(P>0,05). Os dados encontram-se na Tabela 6.
Tabela 6. Resultado médio da análise de concentração de selênio no plasma no início e
no final do experimento e no líquido folicular de vacas Jersey suplementadas com 3,2
mg / dia / animal e 9,6 mg / dia / animal de selênio durante 119 dias.
Parâmetro
3,2 mg Se / dia / animal
(mg / L)
9,6 mg Se / dia / animal
(mg / L)
Selênio no Soro (D-0) 0,057 ± 0,017 0,064 ± 0,017
Selênio no Soro (D-119) 0,087 ± 0,025 0,102 ± 0,026
Selênio no Líquido folicular (D-119) 0,139 ± 0,036 0,122 ± 0,036
* (P>0,05); n=5.
Não foi observada diferença estatística nas análises da concentração de Se no
soro, comparando as análises do primeiro e do último dia de experimento no GT
(Tabela 7).
Tabela 7. Concentração inicial e final média de selênio no soro de vacas Jersey
suplementadas com 9,6 mg / dia / animal de selênio durante 119 dias.
Parâmetro n D-0 n D-119
Selênio no Soro D-0 x D-119 (GT) 5 0,063 ± 0,016 5 0,102 ± 0,016
*(P>0,05); n = número de observações.
21
Com relação aos teores de Se no soro, apesar de não ter havido diferença
(P>0,05), notou-se um aumento de 52,63% comparando o início do experimento com o
final, nos animais tratados com 3,2 mg de Se/dia. Neste mesmo grupo, o aumento no
líquido folicular aos 119 dias foi de 143,86% em relação ao Se observado no soro no
início do tratamento. Já naqueles que receberam 9,6 mg de Se / dia, verificou-se
aumento de 59,38% de Se no soro comparado o início do experimento com o final, mas
no líquido folicular o aumento foi de 90,63% ao comparar o Se no líquido folicular aos
119 dias com aquele existente no soro, no início do experimento.
Estes valores permitem justificar a importância do Se no processo de produção
de oócitos com melhor competência para gerarem embriões ao serem fecundados in
vitro, tendo entre outros fatores o aumento da síntese de GSH-Px. Entre outros fatores,
poder-se-ia destacar o aumento da imunidade e melhor crescimento dos animais
(CEBALLOS & WITTWER, 1996).
Conclusões
De acordo com as condições em que o trabalho foi desenvolvido, pode-se
concluir que a maior adição de Se à dieta resultou em maior produção de oócitos, maior
quantidade de oócitos de grau I e maior produção de embriões no processo de
fecundação in vitro.
22
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