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Universidade Estadual do Ceará
Erika Helena Salles de Brito
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PERFIL DE
SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE CEPAS DE CANDIDA SPP
E MALASSEZIA PACHYDERMATIS, ORIUNDAS DE CÃES
Fortaleza-Ceará
2005
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Universidade Estadual do Ceará
Erika Helena Salles de Brito
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PERFIL DE
SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE CEPAS DE CANDIDA SPP
E MALASSEZIA PACHYDERMATIS, ORIUNDAS DE CÃES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial, para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração:
Reprodução e Sanidade
Animal
Orientador:
Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Fortaleza - Ceará
2005
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2
B862c Brito, Erika Helena Salles de
Caracterização fenotípica e perfil de sensibilidade
antifúngica de cepas de Candida spp e Malassezia pachydermatis,
oriundas de cães / Erika Helena Salles de Brito – Fortaleza, 2005.
140 p.; il.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Microbiologia. 2. Candida. 3. Malassezia. 4.
Fenotipagem. 5. Cães. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade
de Veterinária. II. Título.
CDD: 636.7
3
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PERFIL DE
SENSIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE CEPAS DE
CANDIDA
SPP
E
MALASSEZIA PACHYDERMATIS
, ORIUNDAS DE CÃES
Autora:
Erika Helena Salles de Brito
Defesa em _____/____/________ Conceito:
Nota:
Banca Examinadora
___________________________________________
Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.
Orientador (UECE)
José Júlio Costa Sidrim, Prof. Dr.
Examinador (UFC)
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, Dra.
Co-Orientadora/Examinadora (UFC)
______________________________________
______________________________________
Francisco Marlon Carneiro Feijó, Prof. Dr.
Examinador (UFRSA)
______________________________________
4
À minha mãe Rosa Helena Salles de Brito, ao meu
futuro esposo João Glaumo Cruz Mota, aos meus irmãos
e ao meu orientador Marcos Fábio Gadelha Rocha,
Dedico
5
“Somos o que fazemos, mas somos, principalmente, o que fazemos para mudar o que somos.”
Eduardo Galeano
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vontade e coragem de querer ir sempre adiante.
Ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, não só pelo constante apoio na execução
deste trabalho, mas, também, pelas diversas vezes em que mostrou a sabedoria da boa
convivência, da tolerância e da amizade. Obrigada pela paciência, carinho e orientação
maravilhosa, mas, principalmente, por todas as oportunidades que tem me dado até aqui.
À minha mãe, Rosa Helena Salles de Brito, pelo amor, amizade e apoio
incondicional. A ela, que devo tudo, não só minha formação profissional, mas principalmente, a
formação do meu caráter. Minha querida, essa conquista também é sua!
Ao meu pai, Eurico Salvador de Brito, pelo amor, apoio e incentivo que me ajudaram
a chegar até aqui.
Aos meus irmãos Eurico Júnior, Edla e Eveline. Meus queridos, a amizade e o apoio
de vocês foram fundamentais nessa minha jornada.
Ao meu noivo, Glaumo Mota, cujo incentivo e admiração me fazem acreditar que
posso sempre mais. Obrigada meu amor! A sua existência faz minha vida “valer a pena”.
Aos meus avós, Quitéria e Pedro Salles, pontos de apoio importantíssimos em minha
vida. Sem a dedicação, boa vontade e bondade dos dois jamais teria tido condições para me
profissionalizar.
Às minhas tias Rosa Maria Salles, Rosa Ângela Viana e Rosa Patrícia Salles, que
exercem um papel de segunda mãe em minha vida. Obrigada por poder contar sempre com vocês.
A Sâmia Brilhante e Rossana Cordeiro, além de excelentes orientadoras, são pessoas
maravilhosas, sempre dispostas a ajudar e dividir seus conhecimentos. Sem a ajuda de vocês esta
dissertação não existiria.
7
Ao Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim, pelo acolhimento no Centro Especializado em
Micologia Médica (CEMM), por todas as dúvidas esclarecidas e conhecimentos transmitidos.
Aos meus queridos amigos da Pós-Graduação, Raquel Fontenelle, Carolina Sidrim,
Francisco Atualpa e Marilena Prado, que facilitaram bastante a minha caminhada. A amizade de
vocês irei levar para sempre.
Ao Olavo, Terezinha e Monalisa, pela paciência, disponibilidade, simpatia e ajuda na
realização das tarefas.
Às minhas primas, amigas e irmãs de coração Maria Tereza e Lia Frota, pelos
ouvidos emprestados tantas vezes e pela amizade incondicional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
importante ajuda financeira ao longo destes dois anos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual
do Ceará.
8
RESUMO
Leveduras dos gêneros Malassezia e Candida podem ser encontradas como comensais em
animais, sendo a M. pachydermatis e C. albicans as principais espécies relatadas na Medicina
veterinária. O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo fenotípico, bem como avaliar a
sensibilidade antifúngica in vitro de cepas de C. albicans (n=5), C. tropicalis (n=3)
9
ABSTRACT
Yeasts of the genus Candida and Malassezia pachydermatis can be found as a commensal
microorganisms in animals. The main species mentioned in veterinary medicine are M.
pachydermatis and C. albicans. The objective of this research was to perform a phenotypical
study, in addition to evaluating the in vitro antifungal sensitivity of C. albicans (n=5), C.
tropicalis (n=3) and M. pachydermatis strains (n=32) isolated from dogs. The phenotyping was
based on macro and micromorphological features as well as biochemical analysis. The techniques
of microdilution in broth and dilution in agar were used to evaluate the in vitro antifungal
sensitivity of Candida spp and M. pachydermatis, respectively. The tested drugs were
ketoconazole (KTC), itraconazole (ITC), fluconazole (FLC) and amphotericin B (AMB). The
morphological analysis of Candida spp and M. pachydermatis strains did not show any
noteworthy alterations. On the other hand, in the biochemical tests, 34.4 % of the strains of M.
pachydermatis were negative for the urease test. Four strains of C. albicans were resistant to FLC
(MIC > 64 µg/mL) and all to KTC and ITC (MIC >16 µg/mL). Regarding to C. tropicalis, two
strains had a MIC > 16 µg/mL for KTC and ITC, as well as MIC > 64 µg/mL for FLC. It is worth
highlighting that all Candida strains were sensitive to AMB with the MIC varying from 0.25 –
1.0 µg/mL. Concerning to M. pachydermatis, all strains were sensitive to ITC with a Minimum
Fungicide Concentration (MFC) JP/ 7ZHQW\-nine strains had the same MFC
0.0075 µg/mL for KTC. The MFCs for FLC varied from WRJP/)RU$0%WKH0)&
interval was 0.125 – 8 µg/mL. The data from this study do not show alterations in the classic
phenotypical features of strains of Candida spp and M. pachydermatis isolated from dogs.
However, it was demonstrated that, unlike M. pachydermatis, the stains of Candida spp had a
high degree of resistance to azole antifungal agents.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Colônias de Candida spp. 08
Figura 2: Blastoconídios de levedura. 08
Figura 3: Microcultivo de levedura em placa de Petri. 09
Figura 4: Teste de fermentação de carboidratos, com resultado positivo para glicose,
maltose e galactose. 12
Figura 5: Colônia característica de Malassezia spp. 16
Figura 6: Blastoconídios de Malassezia pachydermatis. 17
Figura 7: Distribuição da suspensão fúngica. 38
Figura 7. A: Pipetagem do inóculo. 38
Figura 7. B: Repicagem de inóculo em placas de Petri contendo meio de cultura e
antifúngico. 38
Figura 7. C: Distribuição do inóculo na superfície do meio com auxílio de alça. 38
Figura 8: Placa da Petri em estufa a temperatura de 37°C. 38
Figura 9: Placa de 96 micropoços com fundo em forma de U. 40
Figura 10: Distribuição do meio RPMI em placa de 96 micropoços. 41
11
Figura 11: Diluição seriada do antifúngico. 41
Figura 12: Distribuição da suspensão fúngica na placa de 96 micropoços. 41
Figura 13: Placas de 96 micropoços, com teste de sensibilidade antifúngica, incubadas
em estufa a 37°C. 42
Figura 14. A: Blastoconídios com colarete. 43
Figura 14. B: Colônias de Malassezia pachydermatis. 43
Figura 15. A: Teste da urease positivo (+) e negativo (-). 44
Figura 15. B: Teste da esculina positivo (+) e negativo (-). 44
Figura 16: Teste de sensibilidade de Malassezia pachydermatis com anfotericina B:
cepas que apresentaram alta sensibilidade. 46
Figura 17: Teste de sensibilidade de Malassezia pachydermatis com anfotericina B:
cepas que apresentaram baixa sensibilidade. 47
Figura 18: Micromorfologia Candida albicans. 49
Figura 18. A: Blastoconídios dispostos em cachos. 49
Figura 18. B / 18. C: Clamidoconídios terminais. 49
Figura 19. A: Teste de fermentação positiva para glicose (Gli), maltose (Mal) e
galactose (Gal). 50
Figura 19. B: Bolha de gás carbônico no interior do tubo de Durhan. 50
12
Figura 20: Micromorfologia de Candida tropicalis. 50
13
LISTA DE TABELAS, QUADROS E FLUXOGRAMAS
Tabela 1: Resultados das cepas de Malassezia pachydermatis referentes aos testes
fisiológicos. 45
Tabela 2: Concentração inibitória mínima (CIM) dos derivados azólicos e
anfotericina B perante as cepas de Malassezia pachydermatis. 48
Tabela 3: Resultados das cepas de Candida spp referentes aos testes de assimilação
e fermentação de carboidratos, bem como assimilação de nitrato. 49
Tabela 4: CIM (µg/mL) do cetoconazol, itraconazol, fluconazol e anfotericina B
perante as cepas de Candida spp
.
51
Quadro 1: Cepas analisadas na pesquisa: espécie, origem e método de estocagem. 33
Fluxograma 1: Identificação e análise fenotípica das cepas de Malassezia
pachydermatis. 34
Fluxograma 2: Identificação e análise fenotípica das cepas de Candida albicans
e Candida tropicalis. 35
14
LISTA DE ANEXOS
Anexo I: Artigo - Phenotypical characterization and in vitro antifungal sensitivity
of Candida spp and Malassezia pachydermatis strains from dogs. 73
Anexo II: Ficha de identificação para leveduras. 91
Anexo III: Meios de cultura. 93
Anexo IV: Quadro para identificação bioquímica de Candida spp. 100
Anexo V: Esquemas de rotinas micológicas. 101
15
LISTA DE ABREVIATURAS
ABD Ágar batata a -20°C com DMSO (10%)
ATCC Americal Type Culture Collection
Cel Celobiose
CIM Concentração Inibitória Mínima
CFM Concentração Fungicida Mínima
DMSO Dimetil-sulfóxido
Gal Galactose
Gli Glicose
°C Graus Celsius
Lac Lactose
µg Micrograma
mL Mililitro
Mal Maltose
Mel Melibiose
MOPS Ácido 3 (N-morfolino) propanossulfônico
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
nm Nanômetro
N° Número
O
2
Oxigênio
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
pH Potencial Hidrogeniônico
Raf Rafinose
Rib Ribose
RPMI Roswell Park Memorial Institute
Sac Sacarose
S/A Ágar Sabouraud
Tre Trealose
TW Tween
16
UFC/mL Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
Xil Xilose
17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO DE LITERATURA 3
2.1 Micologia Médica: visão geral 3
2.2 Microbiota fúngica em animais 5
2.2.1 Principais leveduras que fazem parte da microbiota de animais 6
2.3 Candida spp 7
2.3.1 Morfologia 7
2.3.2 Características fisiológicas 9
a) Tubo germinativo 10
b) Assimilação de carboidratos 10
c) Assimilação de nitrogênio 11
d) Fermentação de carboidratos 11
2.3.3 Doenças associadas a Candida spp em animais 12
2.4 Malassezia spp 14
2.4.1 Morfologia 16
18
2.4.2 Características fisiológicas 17
a) Capacidade de crescer em meio de cultura sem adição de lipídios 18
b) Assimilação de Tweens 18
c) Reação da catalase 18
d) Teste da urease 19
e) Hidrólise da esculina 19
2.4.3 Doenças associadas a Malassezia spp em animais 20
2.5 Drogas Antifúngicas e Sensibilidade Antimicrobiana in vitro 22
3 JUSTIFICATIVA 26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA 27
5 OBJETIVOS 28
5.1 Objetivo Geral 28
5.2 Objetivos Específicos 28
6 MATERIAL E MÉTODOS 29
6.1 Cepas analisadas 29
6.1.1 M. pachydermatis 29
19
6.1.2 Candida spp 29
6.1.3 Cepas-controle 30
6.2 Identificação 30
6.2.1 M. pachydermatis 30
6.2.2 Candida spp 31
6.3 Recuperação das cepas após estocagem 31
6.4 Análise fenotípica 32
6.4.1 M. pachydermatis 32
6.4.2 Candida spp 32
6.5 Teste de Sensibilidade Antifúngica in vitro 36
6.5.1 Antifúngicos testados 36
6.5.2 Sensibilidade das cepas de M. pachydermatis 36
6.5.2.1 Diluição dos antifúngicos 36
6.5.2.2 Preparo e semeada do inóculo 37
6.5.3 Sensibilidade das cepas de Candida spp 37
6.5.3.1 Diluição dos antifúngicos 39
20
6.5.3.2 Preparo do inóculo 39
6.5.3.3 Microdiluição em caldo 40
7 RESULTADOS 43
7.1 M. pachydermatis 43
7.1.1 Análise fenotípica 43
7.1.2 Sensibilidade antifúngica in vitro 46
7.2 Candida spp 48
7.2.1 Análise fenotípica 48
7.2.2 Sensibilidade antifúngica in vitro 50
8 DISCUSSÃO 52
9 CONCLUSÕES 59
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
ANEXOS 73
1 INTRODUÇÃO
Os fungos são microrganismos que constituem grupo diversificado e abundante na
natureza, fazendo parte de vários nichos no ambiente, incluindo a microbiota de homens e
animais. Em condições especiais, no entanto, algumas espécies sapróbias podem se tornar
patógenos. Exemplos comuns, que acometem homens e animais, são leveduras dos gêneros
Candida e Malassezia.
Diferentes espécies do gênero Malassezia já foram descritas, causando infecções em
animais, no entanto, a M. pachydermatis é a mais freqüentemente associada a quadros de
dermatites e otites em cães e gatos. Processos mórbidos em animais causados por Candida spp
são pouco freqüentes, no entanto, nos últimos anos, houve aumento considerável de infecções,
como dermatomicoses, otites, septicemia, infecção urinária, entre outros, causadas por estas
leveduras, principalmente C. albicans.
Apesar do aumento da importância das leveduroses em pequenos animais, poucos
estudos revelam informações sobre as características fenotípicas e moleculares, bem como o
perfil de sensibilidade a drogas antifúngicas contra esses agentes. A tipificação de cepas mediante
a fenotipagem pode fornecer informações importantes, que podem ser relacionadas com a
patogenicidade, resistência antifúngica e caráter epidemiológico.
Drogas como cetocoazol, itraconazol e fluconazol são utilizadas de forma eficiente na
rotina da clínica veterinária para o tratamento de infecções fúngicas. A anfotericina B é
conhecida por sua eficiente atividade, in vivo e in vitro, contra diferentes fungos patogênicos, no
entanto, pouco se sabe acerca de sua atividade, in vitro, frente a espécies de Malassezia, em
especial M. pachydermatis, e espécies de Candida isoladas de animais.
A padronização e realização de testes de sensibilidade antifúngica em laboratório
possibilitam o conhecimento do comportamento, in vitro, da cepa fúngica frente a diferentes
agentes antifúngicos, e estes dados podem vir a auxiliar o médico veterinário na escolha de um
2
tratamento mais adequado e eficiente em casos de enfermidades fúngicas. Desta forma, o
presente trabalho buscou avaliar a sensibilidade antifúngica de cepas de M. pachydermatis, C.
albicans e C. tropicalis, isoladas de cães, frente a anfotericina B e aos principais azólicos
utilizados na clínica veterinária, bem como conhecer melhor o perfil fenotípico das referidas
espécies.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Micologia Médica: visão geral
O estudo dos microrganismos conhecidos como fungos teve seu início na década de
1660, quando o físico inglês Robert Hooke publicou os primeiros desenhos de estruturas fúngicas
presentes na capa de couro de um livro, bem como de células fúngicas, obtidas a partir de um
fragmento de cortiça do mesmo livro, que foram observadas ao microscópio. Daí então, diversos
estudiosos começaram a descrever estruturas e propriedades típicas destes pequenos seres. Foi em
meados do século XIX, porém, que o pesquisador Agostino Bassi, procurando a causa de uma
grave enfermidade que atacava os bichos-da-seda, estabeleceu experimentalmente a conexão
casual entre um fungo microscópico e uma doença. Nascia, então, a “Micologia Médica”
(SIDRIM & ROCHA, 2004).
Os fungos, seres eucarióticos e heterotróficos, constituem um grupo diversificado e
abundante na natureza. Estes microorganismos ocupam vários nichos no ambiente, incluindo a
microbiota de homens e animais, vivendo como comensais. Dependendo, entretanto, de alguns
fatores, podem adquirir potencial patogênico e ser responsáveis por inúmeras enfermidades
(GARCÍA & BLANCO, 2000).
A reprodução deste grupo de microrganismos pode acontecer de forma assexuada
(anamorfa) e sexuada (teleomorfa), sendo que nem sempre são manifestadas as duas formas de
reprodução, como nos países tropicais e subtropicais, onde poucos fungos manifestam sua
reprodução sexuada e a grande maioria apresenta apenas a forma assexuada, sendo esta a base
para sua classificação taxonômica (RIPPON, 1998).
Os fungos, patogênicos ou não, se dividem em dois grandes grupos, os filamentosos e
as leveduras. A forma filamentosa é caracterizada por uma estrutura complexa, dotada de longas
cadeias de células interligadas que formam as chamadas hifas, forma que é a mais abundante na
4
natureza. As leveduras apresentam-se como estruturas unicelulares, com único núcleo por célula,
cuja unidade estrutural é denominada de blastoconídio. Existe ainda o terceiro grupo, os fungos
dimórficos, que podem assumir a forma filamentosa quando expostos à temperatura de 28°C e
forma leveduriforme na temperatura de 37°C (SIDRIM & ROCHA, 2004).
Mais de 250 mil espécies fúngicas são conhecidas atualmente, mas dentre estas
apenas duas centenas são capazes de causar doença, ou melhor, foram identificadas pelo menos
uma vez em processo patológico humano ou animal (LOPES et al., 2004).
Os fungos patogênicos, objeto de estudo na Micologia médica humana e veterinária,
são agentes de processos infecciosos, denominados micoses, bem como agentes de quadros de
hipersensibilidade imediata e tardia, micotoxicoses e micetismo (GAR
5
acometendo cães e gatos. Os fungos, agentes de tais infecções vivem no solo na forma
filamentosa e podem infectar os animais por meio da inalação, por estes, de conídios de
reprodução assexuada (SANO & MIYAJI, 2003; FOUREMAN et al., 2005; SHURLEY et al.,
2005).
Existe ainda outra classificação para micoses, que são as chamadas oportunistas.
Estas infecções são causadas por fungos sapróbios ou anemófilos que podem adquirir papel
patogênico em virtude de uma série de alterações no organismo, ou seja, quando há um
desequilíbrio no binômio parasita-hospedeiro. Fatores que favorecem a infecção por estes fungos,
considerados oportunistas, são a utilização de terapêutica imunossupressora e a presença de
doenças imunocomprometedoras (SIDRIM & ROCHA, 2004). Essas micoses podem apresentar-
se como dermatomicoses, infecções subcutâneas e septicemia. Exemplos de fungos oportunistas
são: Candida spp; Malassezia spp, entre outros (GUILLOT & BOND, 1999; MACHADO et al.,
2003; BROWN et al., 2005).
Na Medicina veterinária, as dermatomicoses, que são infecções fúngicas superficiais,
em especial as dermatofitoses, são as micoses mais comumente encontradas, sendo as mais
diagnosticadas, tanto clínica como laboratorialmente. Quando se trata de micoses subcutâneas,
profundas e oportunistas, os dados na literatura são extremamente escassos e provavelmente não
traduzem a real incidência destas enfermidades. Micoses oportunistas, como candidíases e
malassezioses, no entanto, são bastante relatadas em animais domésticos (RAPOSO et al., 1996;
HESELTINE et al., 2003; CRESPO et al., 2002a).
2.2 Microbiota fúngica em animais
O termo microbiota é utilizado para definir o grupo de microrganismos que
colonizam uma ou várias regiões anatômicas de um hospedeiro sem produzir doenças. Há, no
entanto, microrganismos que podem habitar o hospedeiro apenas por certo período, que pode
6
variar de horas a semanas, caso em que se define como microbiota transitória (SIDRIM &
ROCHA, 2004).
As leveduras vivem em organismos vivos fazendo parte da microbiota, colonizando,
principalmente, a superfície da pele e algumas mucosas de homens e animais, em quantidades
que variam de acordo com o sítio anatômico (SIDRIM & ROCHA, 2004).
Diversos estudos têm sido realizados no intuito de determinar a freqüência de
isolamento de leveduras a partir de animais saudáveis, desta forma, percentuais que variam de 2 a
75% são descritos e as regiões de isolamento são: pele, cavidade oral, vagina, região anorretal e
conjuntiva (GUILLOT & BOND, 1999; PRADO et al., 2004). Dessa forma, é fundamental
diferenciar se a levedura isolada faz parte da microbiota ou é agente de infecção. Vale salientar
que, quando isoladas de sítios anatômicos ou líquidos biológicos que deveriam ser estéreis, como,
por exemplo, o sangue, depois de descartada hipótese de contaminação da amostra, é sinônimo de
infecção (SIDRIM & ROCHA, 2004).
2.2.1 Principais leveduras que fazem parte da microbiota de animais
É importante conhecer os microrganismos que vivem como sapróbios em homens e
animais, visto que, havendo um desequilíbrio no binômio parasita-hospedeiro, eles podem tornar-
se agentes responsáveis por infecções e, nestes casos, faz-se necessária a diferenciação entre um
ser patogênico ou apenas constituinte da microbiota.
Organismos leveduriformes, em geral, fazem parte da microbiota da pele e mucosas
da maioria dos vertebrados homeotérmicos, sendo que a M. pachydermatis é relatada como a
espécie fúngica mais presente (GUILLOT & BOND, 1999; CRESPO et al., 2002a). Há, porém,
relatos também da presença de Candida spp como constituinte da microbiota de várias espécies
animais (HESELTINE et al., 2003; SOUSA & SIQUEIRA, 2003; MORRETI et al., 2004).
7
2.3 Candida spp
O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes hialinos, que apresentam
duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou teleomorfa. Taxonomicamente
são enquadradas no grupo dos ascomicetos, visto que a reprodução sexuada é caracterizada pela
produção de ascos (SIDRIM & ROCHA, 2004).
O isolamento de Candida spp a partir da microbiota de animais saudáveis é pouco
relatado, no entanto sabe-se que são leveduras sapróbias de homens e animais. Espécies do
gênero estão presentes em diferentes sítios, como tubo digestivo, mucosas e pele de várias
espécies animais, incluindo muitos pássaros. C. albicans e C. parapsilosis são tidas como as
espécies mais isoladas e normalmente habitam os sistemas gastrintestinal e respiratório, além da
mucosa genital de animais (RINALDI, 1993; HESELTINE et al., 2003).
Paixão et al. (2001), pesquisando fungos sapróbios em cães e gatos, relataram o
isolamento de Candida spp em 6,8% dos animais analisados. Sousa & Siqueira (2003) detectaram
a presença de C. albicans no intestino de bovinos e, segundo esses autores, a presença desta
levedura como sapróbio está condicionada a vários fatores, sendo o principal a presença de fontes
de nutrientes Segundo Morreti et al. (2004), a espécie C. albicans tem predileção pela superfície
de mucosas e áreas de junções mucocutâneas de animais de sangue quente, onde residem como
comensais.
2.3.1 Morfologia
Todas as espécies pertencentes ao gênero Candida possuem algumas características
morfológicas em comum. À microscopia direta só é possível visualizar blastoconídios soltos de
forma que, as diversas espécies não podem ser diferenciadas somente por esta técnica. Da mesma
forma, a análise macroscópica isolada não permite a identificação, sendo imprescindíveis a
8
utilização de microcultivo e o empreg e critérios6120 10.5598 0 Td(b)Tj0.024 Tc6 0 Td(i)Tj0 Tc3.35977 0 Td(oqu)Tj0.024 Tc18 0 Td(ími)Tj-0.048 Tc16.0797 0 Td(c)Tj0 Tc5.27969 0 Td(o)Tj0.012 Tw6 0 Td(s6120 10.5598 0 Td(p)Tj-0.048 Tc6 0 Td(a)Tj0.084 Tc5.27969 0 Td(r)Tj-0.048 Tc4.07969 0 Td3.048 Tw(a )Tj0.024 Tc11.2797 0 Td(i)Tj0 Tc3.36600 lhW 1)Tj-0.048 Tc6 0 Td(e)Tj0 Tc5.27969 0 Td(n)Tj0.024 Tc6 0 Td(ti)Tj-0.036 Tc6.71992 0 Td(f)Tj0.024 Tc3.95977 0 Td(i)Tj-0.048 Tc3.35977 0 Td(caçã)Tj0.12 Tw21.1199 0 Td(o)Tj0 Tc6.12188 0 Td2.88 Tw( )Tj-0.036 Tc5.88008 0 Td(f)Tj0.024 Tc3.95977 0 Td(i)Tj0 Tc3.35977 0 Td(n)Tj-0.048 Tc6 0 Td(a)Tj0.024 Tc5.27969 0 Td2.85l6120 9.23984 lhW 1
microrganismo (D
9
As características micromorfológicas visualizadas em microcultivo de C. albicans e
C. tropicalis, espécies de interesse no presente estudo, são as seguintes:
C. albicans - presença de pseudo-hifa e hifa verdadeira; blastoconídios formando cachos ao
longo das hifas; hifas com clamidoconídios terminais (RAPOSO et al., 1996).
C. tropicalis - presença de pseudomicélio com blastoconídios distribuídos em cadeias simples ou
ramificadas (SIDRIM & ROCHA, 2004).
2.3.2 Características fisiológicas
Muitas vezes, a realização do microcultivo de determinada Candida sp é suficiente
para identificar sua espécie, no entanto, por possuírem características morfológicas muito
semelhantes, essa identificação, às vezes, torna-se duvidosa, de forma que se faz necessária a
união entre morfologia e características bioquímicas do isolado para melhor caracterização do
microrganismo.
Figura 3: Microcultivo de levedura em placa de Petri.
(Fonte: CEMM, 2005)
10
Para identificação e fenotipagem de uma espécie do gênero Candida, muitos aspectos
são levados em consideração, como morfologia, capacidade de formar tubo germinativo,
assimilação de carboidratos, assimilação de nitrogênio e fermentação de carboidratos (DEL
CASTILLO et al., 1997; SIDRIM & ROCHA, 2004).
a) Tubo germinativo
Apenas C. albicans e C. dubliniensis formam tubo germinativo, uma projeção
alongada que emerge do blastoconídio. Para isso, precisam ser postas em contato com soro
humano ou de animais, em temperatura de 37°C, por um período de duas a três horas (RAPOSO
et al., 1996; MORETTI et al., 2004; SIDRIM & ROCHA, 2004).
b) Assimilação de carboidratos
Essa prova é denominada também de auxonograma e consiste na capacidade que uma
levedura apresenta de crescer aerobiamente na presença de determinado carboidrato, fornecido
como única fonte de energia. O teste é realizado em meio sólido acrescido da suspensão do
microrganismo a ser testado. Os seguintes carboidratos são fornecidos ao meio: inulina, ramnose,
L-arabinose, celobiose, dextrose, sacarose, rafinose, dulcitol, melibiose, trealose, galactose,
maltose, xilose, inositol e lactose.
Cada espécie do gênero Candida apresenta um perfil de assimilação de carboidratos
diferente e a leitura é feita, durante 24 a 96 horas, mediante visualização de halos de crescimento
que se formam em volta do carboidrato assimilado. Dessa forma, cepas de C. albicans
apresentam resultado positivo para glicose, galactose, xilose, trealose e maltose e resultado
variável para L-arabinose e sacarose. A C. tropicalis é capaz de assimilar glicose, galactose,
11
xilose, trealose e maltose, podendo assimilar ou não sacarose (HOOG et al., 2000; SIDRIM &
ROCHA, 2004).
c) Assimilação de nitrogênio
As espécies de Candida podem assimilar ou não nitrogênio, de forma que este teste
verifica a capacidade que a levedura tem de crescer aerobiamente na presença de um composto
nitrogenado, fornecido como única fonte energética. Para isso, em meio sólido, acrescido da
suspensão fúngica e destituído de qualquer fonte de nitrogênio, são colocadas alíquotas de
peptona, que é utilizada como controle positivo, e nitrato de potássio.
A positividade é dada quando há um halo de crescimento, após 96 horas de
incubação, em volta do nitrato de potássio. Geralmente as espécies de Candida, isoladas de
amostras clínicas, assimilam peptona por esta ser uma fonte orgânica de nitrogênio, no entanto, a
capacidade de assimilar ou não nitrato de potássio, fonte de nitrogênio inorgânica, varia de cepa
para cepa (SIDRIM & ROCHA, 2004).
d) Fermentação de carboidratos
Na fermentação de carboidratos é avaliada a capacidade da levedura de crescer na
presença de único açúcar, fornecido como fonte exclusiva de energia. A suspensão da levedura é
colocada em um tudo de ensaio contendo meio de cultura líquido e um tubo de Durhan invertido.
A positividade é dada pela produção de gás carbônico, que fica contido no interior do tubo de
Durhan, formando bolhas visíveis (Figura 4). Quando se utiliza um indicador de pH, é possível
observar a mudança de coloração, em virtude da acidificação no citado meio.
12
Geralmente, os carboidratos utilizados neste teste são dextrose, maltose, sacarose,
galactose, lactose e trealose, mas outros podem ser empregados. Sabe-se que, de forma geral, a
espécie C. albicans é capaz de fermentar glicose e maltose, e apresenta resultado variável para
galactose e trealose; já cepas de C. tropicalis são positivas para glicose, galactose, trealose e
maltose, podendo fermentar ou não sacarose. Vale salientar que o açúcar fermentado pela cepa de
determinada espécie é obrigatoriamente assimilado por esta, no entanto, o inverso não é
verdadeiro (HOOG et al., 2000; SIDRIM & ROCHA, 2004).
2.3.3 Doenças associadas a Candida spp em animais
Espécies de Candida que vivem como comensais podem se tornar patógenas e causar
enfermidades, denominadas candidíases, em decorrência de distúrbios nas proteções física,
química e imunológica do hospedeiro associados à virulência da cepa (MUELLER et al., 2002;
MORETTI et al., 2004). São fatores predisponentes a esse tipo de infecção: presença de doenças
auto-imunes, Diabetes mellitus, uso de corticosteróide e antimicrobianos de largo espectro,
cateterismo venoso e urinário e administração de nutrição parenteral (HESELTINE et al., 2003;
Figura 4: Teste de fermentação de carboidratos, com resultado
positivo para glicose, maltose e galactose.
(Fonte: CEMM, 2005)
13
MORETTI et al., 2004). Os sítios anatômicos mais acometidos são: pele e unhas, trato urinário,
ouvido e trato gastrintestinal (HESELTINE et al., 2003).
Vale salientar que, apesar de serem tidas como oportunistas, Kozak et al. (2003)
isolaram espécies de Candida spp a partir de animais jovens, livres de desordens imunológicas e,
dentre as espécies observadas, estão C. albicans e C. krusei. Brown et al. (2005) descreveram a
presença de candidíase sistêmica em um cão que não portava nenhuma deficiência imunológica
aparente.
As infecções causadas por leveduras do gênero Candida em animais não são muito
descritas, no entanto, há relatos de sua ocorrência em diferentes partes do mundo, como Estados
Unidos, Austrália, Japão, África, Inglaterra, Espanha e Brasil, acometendo diversas espécies
animais e com quadros clínicos variados (MILNER et al., 1997; DUARTE et al., 1999; OCHIAI
et al., 2000; DUARTE et al., 2001; MUELLER et al., 2002; PRESSLER et al., 2003; LINEK,
2004; OROS et al., 2004).
O primeiro relato de candidíase, em cães, data de 1949, e se tratou de um caso de
dermatomicose por C. albicans (REICH & NECHTOW, 1949). No Brasil, há relatos da presença
de espécies do gênero em bovinos acometidos com quadros de otite (DUARTE et al., 2001),
causando mastite em bovinos leiteiros (SOUSA & SIQUEIRA, 2003) e dermatomicose em cães
(RAPOSO et al., 1996). Paixão et al. (2001), na cidade de Fortaleza – Ceará, isolaram, a partir de
cães com micoses superficiais, Candida spp, no entanto, seu papel patogênico não foi conclusivo.
Diversas espécies do gênero são citadas como agentes de enfermidades diferentes em
animais, tais como: C. guilliermondii, responsáveis por quadros de dermatomicoses em cães
(MUELLER et al., 2002); C. famata, envolvida em infecção intestinal em cães (MILNER et al.,
1997); C. tropicalis, C. glabrata, e C. krusei, causando quadros diarréicos em bezerros (ELAD et
al., 1998) e C. parapsilosis, agente de dermatomicose em cães e responsável por lesões na
mucosa de um galo (DALE, 1972; KANO et al., 2001). Pressler et al. (2003) isolaram espécies de
Candida causando infecção urinária em treze cães e sete gatos, entre as quais estavam:
C. tropicalis, C. rugosa, C. krusei, C. parapsilosis e C. glabrata. Kozak et al. (2003) isolaram
14
cepas de Candida sp e C. krusei, a partir de lesões superficiais na pele, em 5% de 100 cães
analisados. Mais recentemente, Ozawa et al. (2005) isolaram C. tropicalis da urina de um cão
com cistite. Em experimentos realizados in vivo com camundongos, Arendrup et al. (2002)
destacaram a C. albicans e C. tropicalis como as duas espécies mais virulentas do gênero.
Especificamente em relação a C. albicans, esta é a espécie mais freqüentemente
envolvida em casos de infecções em animais, tais como: otite, infecção intestinal, septicemia,
dermatomicose, entre outras (OCHIAI et al., 2000; DUARTE et al., 2001; HESELTINE et al.,
2003; KOZAK et al., 2003; MORETTI et al., 2004). Casos de endoftalmite causada por C.
albicans são ocasionalmente relatados em animais domésticos, e resultam da difusão
hematogênica ou são secundários a uma inflamação primária da córnea pela levedura, com
inoculação diretamente dentro do olho (MILLER & ALBERT, 1988; GERDING et al., 1994;
LINEK, 2004). Ademais, mesmo com a ocorrência de outras espécies, a C. albicans foi a
levedura mais isolada, por Presller et al. (2003), em cães e gatos portadores de infecçãado
15
entanto, a M. pachydermatis é a que tem maior importância na Medicina veterinária, já tendo sido
isolada de várias espécies animais como cães, gatos, ursos, raposas, rinocerontes, suínos,
primatas, eqüinos, pássaros, bovinos, elefantes, leões-marinhos, entre outros (GUILLOT &
BOND, 1999; NAKAGAKI et al., 2000; DUARTE et al., 2002; COUTINHO, 2003).
De acordo com Kennis et al. (1996), a M. pachydermatis é a levedura mais isolada da
pele, junções mucocutâneas e conduto auditivo de cães, gatos, além de outras espécies de animais
domésticos e selvagens, podendo ainda estar presente em pêlos, cavidade oral, reto, ânus, mucosa
vaginal e sacos anais (RAABE et al., 1998; GUILLOT & BOND, 1999; CRESPO et al., 2002a;
MACHADO et al., 2003; NARDONI et al., 2005). Vale salientar que regiões com dobras
cutâneas, ricas em glândulas sebáceas, são favoráveis à sobrevivência e multiplicação de
leveduras lipofílicas (MACHADO et al., 2003). Sua presença tem sido descrita em diferentes
sítios anatômicos de cães saudáveis, sendo que a maior incidência ocorreu no ouvido, lábio
inferior e espaço interdigital dorsal (BOND et al., 1995). A proporção de sua ocorrência em
ouvidos de cães saudáveis varia de 45 a 50% dos animais (KUMAR et al., 2002; CRESPO et al.,
2002a).
Raabe et al. (1998), investigando amostras de pele, ouvido e fezes de carnívoros
domésticos, observaram que em 83% das amostras havia M. pachydermatis, isolada e em culturas
mistas. Crespo et al. (2002b) isolaram a espécie em eqüinos e pequenos ruminantes a partir de
sítios anatômicos diferentes, como virilha, dorso, ânus e ouvido. Ademais, a espécie foi isolada
do conduto auditivo externo de cães e bovinos (DUARTE et al., 2002; GIRÃO et al., 2005) e
Prado et al. (2004) constataram a presença da levedura em olhos de cães isentos de enfermidades.
Não só a M. pachydermatis é isolada a partir da microbiota de animais saudáveis.
Raabe et al. (1998) relataram a presença de M. furfur e M. sympodilais, na pele e ouvido, em 45 e
75% dos cães analisados em seus experimentos, respectivamente. A ocorrência de M.
sympodialis, M. globosa, M. obtusa e M. furfur é relatada na pele, mucosa e conduto auditivo de
cães e gatos sadios (BOND et al., 1997; CRESPO et al., 1999; CRESPO et al., 2000a; CRESPO
et al., 2000b; NARDONI et al., 2005). No Brasil, Duarte et al. (2002) relataram o isolamento de
M. sympodialis, M. slooffiae, M. furfur, M. globosa e M. obtusa a partir do conduto auditivo
16
externo de bovinos saudáveis. As seis espécies lipodependentes do gênero foram isoladas, por
Crespo et al. (2002b), em diferentes sítios anatômicos de eqüinos e pequenos ruminantes.
2.4.1 Morfologia
As espécies de Malassezia, em geral, apresentam colônias com textura cremosa,
coloração de creme a marron-clara (Figura 5) e propriedades micromorfológicas semelhantes,
caracterizadas pela presença de blastoconídios globosos, ovais e com presença de uma constrição
denominada colarete (Figura 6), que podem ser visualizados em lâminas confeccionadas a partir
de um fragmento da própria colônia ou a partir do exame direto de uma amostra clínica positiva.
Na microscopia, podem, também, ser visualizados filamentos curtos de parede grossa, com um ou
dois septos (SIDRIM & ROCHA, 2004; CHEN & HILL, 2005).
Figura 5: Colônia característica de Malassezia spp.
(Fonte: CEMM, 2005)
17
2.4.2 Características fisiológicas
As características macro e micromorfológicas não são suficientes para identificar as
espécies de Malassezia, apenas sugerem o gênero, de forma que é necessária a união entre
morfologia e critérios bioquímicos para identificação (GUILLOT et al., 1996). A M.
pachydermatis, no entanto, possui algo que a diferencia das demais espécies do gênero: apesar de
lipofílica, não é lipodependente, ou seja, é capaz de crescer em meios de cultura isentos de
lipídios. A confirmação desta capacidade é suficiente para sua identificação, sendo outros testes
fisiológicos utilizados apenas para caracterização fenotípica das cepas da espécie (CRESPO et
al., 2000b; GARAU et al., 2003).
Alguns testes são utilizados para identificação e caracterização fisiológica de M.
pachydermatis e das demais espécies do gênero como: capacidade de crescer em meio de cultura
isento de lipídios e nas temperaturas de 37 e 40°C; assimilação de Tween 20, 40, 60 e 80; reação
da catalase; teste da urease e hidrólise da esculina (GUÉHO et al., 1996; GUILLOT et al., 1996;
HOOG et al., 2000).
Figura 6: Blastoconídios de Malassezia pachydermatis.
(Fonte: CEMM, 2005)
18
a) Capacidade de crescer em meio de cultura sem adição de lipídios
Todas as espécies do gênero Malassezia são lipodependentes, ou seja, necessitam da
presença de lipídios para crescer, no entanto, a M. pachydermatis é uma exceção, pois é um
fungo lipofílico, porém não lipodependente, sendo, assim, capaz de crescer em ágar Sabouraud
sem a necessidade da adição de fonte de ácidos graxos de cadeia longa, o que a diferencia das
outras espécies. Com efeito, se o isolado de um espécime clínico suspeito de malasseziose crescer
em ágar Sabourad simples, já pode ser identificado como M. pachydermatis (GUILLOT et al.,
1996).
b) Assimilação de Tweens
Esse teste é utilizado para verificar se a cepa de Malassezia sp apresenta a capacidade
de crescer em ágar Sabouraud simples enriquecido com diferentes óleos, que são os Tweens. Para
realização do teste são utilizados os Tweens 80, 60, 40 e 20, em concentrações diferentes, ou seja,
o Tween 80 é diluído para 1%, Tween 60 é testado na concentração de 100% e os Tweens 40 e 20
nas concentrações de 0,5% e 10%, respectivamente. A M. pachydermatis é capaz de crescer na
presença dos Tweens 80, 60 e 40, no entanto, seu crescimento é fortemente diminuído ou até
mesmo inibido na presença do Tween 20 (GUÉHO et al., 1996; GUILLOT et al., 1996; HOOG et
al., 2000).
c) Reação da catalase
Algumas espécies possuem a enzima catalase, que é capaz de quebrar peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) em moléculas de oxigênio (O
2
) e água (H
2
O), de forma que este teste consiste
na adição de uma gota de H
2
O
2
diretamente sobre a cultura. O resultado positivo, ou seja, a cepa
19
produz catalase, é observado pela produção de bolhas de gás. A capacidade da M. pachydermatis
de produzir catalase varia de cepa para cepa (HOOG et al., 2000; SIDRIM & ROCHA, 2004).
d) Teste da urease
Este teste verifica se o fungo é capaz ou não de produzir a enzima urease. Para sua
realização, um fragmento da colônia fúngica é repicado para o meio uréia de Christensen, que
possui um indicador de pH, e incubado em estufa a 37°C durante duas a quatro horas. Após este
período, quando o fungo é positivo, a enzima urease, produzida pelo fungo, entra em contato com
o meio e hidrolisa a uréia com liberação de amônia, de forma que ocorre uma mudança no pH,
daí então, o indicador vira para uma coloração rósea intensa. Para cepas de M. pachydermatis,
esta prova é considerada positiva (SIDRIM & MOREIRA, 1999; GUILLOT & BOND, 1999;
GIRÃO et al., 2004).
e) Hidrólise da esculina
Outro teste que contribui para diferenciar espécies de Malassezia é a atividade -
glicosidase, determinada em ágar esculina. Quando o fungo possui a -glicosidase, o meio passa
a ter uma coloração negra, pois a esculina é reduzida a esculetina e glicose, com liberação de sal
férrico solúvel, após cinco dias de incubação a 32°C. As cepas de M. pachydermatis podem ou
não ser positivas neste teste (GUILLOT et al., 1996; HOOG et al., 2000; SIDRIM & ROCHA,
2004)
20
2.4.3 Doenças associadas a Malassezia spp em animais
Leveduras do gênero Malassezia são comumente relatadas como causa de
enfermidades, denominadas malassezioses, em várias espécies animais e acometendo diferentes
sítios anatômicos. Sua manifestação patogênica pode estar associada a modificações no
ecossistema cutâneo ou a distúrbios nas barreiras química, física e imunológica do hospedeiro
(GUILLOT & BOND, 1999).
A primeira descrição de malasseziose por M. pachydermatis em animais, data de
1925, quando Weidman isolou leveduras em forma de garrafa, não lipodependentes, de lesões na
pele de rinoceronte indiano, as quais denominou de Pityrosporum pachydermatis (apud SLOOF,
1974). Gustafson, em 1975, isolou leveduras em forma de garrafa de um cão com otite externa e
passou a denominá-las de Pityrosporum canis. Por fim, em 1979, Gordon mudou essa
nomenclatura para Malassezia pachydermatis (GUILLOT & BOND, 1999).
A M. pachydermatis é a espécie do gênero que está mais relacionada aos animais,
fazendo parte da microbiota e como agente de infecções, sendo freqüentemente associada a
quadros de otites externas e, mais recentemente, a diversas formas de dermatites, que acometem
cães e gatos (COUTINHO, 2003; MACHADO et al., 2003; CAFARCHIA et al., 2005). Em
ambas as enfermidades, pode ser o agente primário ou estar associada com bactérias e outras
espécies de Malassezia (BOND et al., 2000; CRESPO et al., 2002a; NARDONI et al., 2005).
No Brasil, a espécie foi isolada a partir de cães acometidos com otite externa e teve
maior ocorrência em animais com idade em torno de 1-3 anos e em raças que possuíam orelha
pendular, mas o sexo não foi detectado como fator predisponente para ocorrência de otite externa
associada a M. pachydermatis (LEITE et al., 2003; GIRÃO et al., 2005), estes dados foram
confirmados por Cafarchia et al. (2005).
Nardoni et al. (2005), utilizando gatos acometidos com otite externa, isolaram M.
pachydermatis em 63,6% dos animais. Vale salientar o fato de que quadros de otite externa
21
causados por M. pachydermatis em gatos não ocorrem com a mesma freqüência que em cães
(CRESPO et al., 2000a). De acordo com Mauldin et al. (2002), o mesmo é válido para dermatites
por M. pachydermatis, bem mais freqüentes em cães e bastante raras em gatos.
Girão et al. (2005) e Cafarchia et al. (2005) alertam para o fato de que as altas
porcentagens de isolamento de M. pachydermatis a partir de animais portadores de otite externa,
comparadas a de animais saudáveis, apontam para um importante papel da levedura na
patogenicidade da enfermidade.
Com relação a quadros de dermatomicose, Nardoni et al. (2004) isolaram M.
pachydermatis a partir da pele de cães saudáveis e acometidos. De acordo com os autores, 63,4%
das amostras foram positivas para Malassezia spp, e, dentre os isolados, 97 % eram M.
pachydermatis. A maior parte dos animais positivos tinham idade entre 1 a 5 anos e não foram
evidenciadas diferenças com relação ao sexo.
Apesar de mais freqüente, não só a M. pachydermatis é agente de infecções em
animais. Diversas outras espécies do gênero já foram associadas a pelo menos um tipo de
enfermidade. A ocorrência de M. sympodialis é relatada em dois gatos acometidos de otite
externa e em eqüino com dermatomicose (SENCZEK et al., 1999; CRESPO et al., 2000a). M.
furfur, M. globosa e M. nana também já foram isoladas a partir de gatos com otite (HIRAI et al.,
2004; NARDONI et al., 2005). Crespo et al. (2002a) descreveram M. furfur, M. obtusa e M.
sympodialis como agentes de otite em cães e gatos. Duarte et al. (2002) relataram a presença de
M. sympodialis, M. globosa, M. furfur e M. slooffiae em bovinos com otite, no Estado de Minas
Gerais (Brasil). Nardoni et al. (2004) isolaram uma cepa de M. furfur como agente isolado de
dermatomicose em um cão.
22
2.5 Drogas Antifúngicas e Sensibilidade Antimicrobiana in vitro
Nos últimos anos, em decorrência de uma demanda crescente na Micologia médica,
houve grande aumento no arsenal terapêutico antifúngico. Em decorrência, porém, de serem os
fungos seres eucarióticos aliado a outros fatores, as drogas antifúngicas surgiram tadiamente.
Dessa forma, em 1903, a terapêutica antifúngica se restringia à utilização do iodeto de potássio,
fármaco ministrado até os dias atuais (SIDRIM & ROCHA, 2004).
A busca por drogas mais efetivas e menos tóxicas para o hospedeiro continuou e, em
1939, surgiu a griseofulvina. Os derivados poliênicos foram sendo descobertos a partir de 1950 e,
durante a década de 1960, surgiram a fluocitosina e os primeiros derivados azólicos, que
resultaram em um grande impulso para a terapêutica antifúngica. A partir da década de 1990, os
derivados morfolínicos foram descobertos, bem como as alilaminas. A caspofungina, membro
das equinocandinas, surgiu em 2001 e tem mostrado importante papel no tratamento da
aspergilose invasiva (SIDRIM & ROCHA, 2004).
As principais drogas antifúngicas utilizadas na terapêutica atual podem ser divididas
nas seguintes categorias: 1. agentes originados de microrganismos, como, por exemplo, a
griseofulvina e os derivados poliênicos (nistatina e anfotericina B); 2. agentes químicos, tais
como iodeto de potássio, fluocitosina, derivados azólicos, alilaminas (naftifina e terbinafina),
derivados morfolínicos (amorolfina) e equinocandinas (caspofungina) (SIDRIM & ROCHA,
2004).
A anfotericina B é muito utilizada na terapêutica de micoses profundas, tendo sido a
primeira droga eficaz para tratamento de tais infecções. Sua administração pode ser feita em
associação com outros antifúngicos, o que resulta em uma diminuição na icidência de seus efeitos
colaterais, sem, no entanto, acarretar prejuízos na reposta terapêutica. Pode apresentar uma ação
fungicida ou fungistática, na dependência da concentração utilizada (VANDEN BOSSCHE et al.,
2003; SIDRIM & ROCHA, 2004).
23
O seu espectro de atividade se mostra especialmente eficaz contra Candida spp, em
especial C. albicans, além de outras espécies de fungos (SIDRIM & ROCHA, 2004). Com
relação a infecções causadas por Candida spp, sua utilização na clínica veterinária é descrita para
tratamento de candidíases em cães e gatos, cistite por Candida spp em cães, artrites e infecção
sistêmica por Candida spp em eqüinos, candidíase sistêmica e tópica em pássaros e aves
domésticas, bem como apresenta eficiente atividade, in vitro, para cepas de Candida spp isoladas
de bovinos com mastite (ROCHETTE et al., 2003; OZAWA et al., 2005).
A sensibilidade, in vitro, de cepas de Candida spp frente a anfotericina B é bastante
alta. Alguns valores de concentração inibitória mínima (CIM) conhecidos variam de 0,25 – 0,5
µg/mL, podendo chegar a 2 µg/mL (VANDEN BOSSCHE et al., 2003; VELEGRAKI et al.,
2004). Para cepas de Malassezia spp, incluindo M. pachydermatis, existem valores de CIM
descritos que variam de 0,06 – 32 µg/mL (VELEGRAKI et al., 2004).
Os azólicos, antifúngicos bastante empregados na Micologia médica, formam um
grupo de compostos sintéticos, com estruturas químicas semelhantes e com amplo espectro de
atividade antifúngica. Este grupo de fármacos apresenta duas divisões: os derivados imidazólicos
e triazólicos. Dentre os imidazólicos, apenas o cetoconazol e miconazol podem ser administrados
por via tópica e parenteral. Os derivados triazólicos, especialmente representados pelo
fluconazol, itraconazol e voriconazol, podem ser administrados pelas vias oral e intravenosa
(VANDEN BOSSCHE et al., 2003; SIDRIM & ROCHA, 2004).
O cetoconazol apresenta espectro de atividade semelhante ao da anfotericina B, com
várias espécies de Candida e dermatófitos sensíveis a esta droga. Os mecanismos de resistência
ao cetoconazol são pouco compreendidos, tendo sido evidenciadas algumas cepas de C. tropicalis
e C. albicans resistentes a essa droga. O fluconazol pode ser utilizado no tratamento de
candidíases, no entanto se mostrado impotente contra C. krusei e C. glabrata. O itraconazol, por
sua vez, é utilizado com suscesso para o tratamento de infecções sistêmicas, incluindo
candidíases, bem como em micoses superficiais (SIDRIM & ROCHA, 2004).
24
Na clínica veterinária, cetoconazol, itraconazol e fluconazol são bastante utilizados.
Em se tratando de leveduroses, estes fármacos são citados para o tratamento de infecções por
Candida spp em cães, como cistite e dermatomicoses, e dermatites por Malassezia em cães e
gatos (MUELLER et al., 2002; ROCHETTE et al., 2003; OZAWA et al., 2005).
A atividade, in vitro, de tais drogas contra cepas de Candida spp, apresenta valores de
CIM que variam de: – 16 µg/mL para cetoconazol; 0,03 - JP/SDUDLWUDFRQD]ROH
0,25 - JP/SDUDIOXFRQD]ROVANDEN BOSSCHE et al., 2003). Há relatos de valores de
CIM bastante elevados, como > 32 µg/mL para itraconazol; 128 e > 256 µg/mL referentes ao
fluconazol (LÖFFLER et al., 1997). Com relação a cepas de Malassezia spp, o cetoconazol
apresenta CIMs variando de – 0,125 µg/mL; o intervalo para o itraconazol é de –
0,125 µg/mL e 0,25 – 32 µg/mL para fluconazol (GUPTA et al., 2000; EICHENBERG et al.,
2003; GARAU et al., 2003).
Por muito tempo apenas estudos de sensibilidade a antibacterianos foram
desenvolvidos e nenhuma atenção era voltada para a resistência a antifúngicos, entretanto, nos
últimos anos, por dificuldades no tratamento de pacientes imunodeficientes (pelo uso
indiscriminado de antibióticos, de drogas imunossupressoras e citostáticas, que favorecem o uso
prolongado de antifúngicos, acarretando em uma seleção de cepas resistentes a diferentes drogas)
cresce o interesse pela busca do perfil de sensibilidade in vitro de cepas fúngicas (PEREA et al.,
2001).
Apesar de uma correlação não muito direta entre sensibilidade in vitro com in vivo,
com o aumento da prevalência das micoses e da variabilidade de drogas para o tratamento destas
enfermidades, a padronização de métodos de testes de sensibilidade in vitro se faz cada vez mais
necessária, o que poderá tornar a escolha da terapêutica cada vez mais adequada e eficiente
(ODDS et al., 1998).
Em 1997, o National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)
aprovou os testes de micro e macrodiluição em caldo para testar a sensibilidade in vitro de fungos
leveduriformes, com o documento M27-A. Desta forma, parâmetros foram determinados para
25
variáveis como: tamanho do inóculo, temperatura, duração de incubação, meio de cultura e
critério de leitura. Este documento foi revisto em 2002 (M27-A2), entretanto, apesar de ideal para
cepas de Candida spp, não se aplica a outra espécie de Malassezia que não seja a M.
pachydermatis. Isto decorre do fato que esta é a única, dentre todas as espécies de Malassezia,
que não necessita de meios ricos em lipídeo para crescer (GARAU et al., 2003). Dificuldades,
porém, são encontradas no emprego de tal técnica para testar a sensibilidade de cepas de M.
pachydermatis, como a padronização do inóculo.
Apesar da metodologia já estabelecida, poucos são os trabalhos que testam a
sensibilidade, in vitro, de cepas de Candida spp isoladas de animais. Ozawa et al. (2005)
utilizaram a técnica de microdiluição em caldo para testar a sensibilidade, in vitro, de uma cepa
de C. tropicalis, isolada da urina de um cão com cistite, a drogas como itraconazol e fluconazol.
A cepa foi sensível ao itraconazol, no entanto, apresentou valores elevados de sensibilidade para
fluconazol.
Buscando a padronização de uma metodologia, diversos autores empregaram
diferentes técnicas para testar a sensibilidade, in vitro, de cepas de Malassezia spp, incluindo M.
pachydermatis. Nakamura et al. (2000) e Garau et al. (2003), testando a sensibilidade de cepas de
Malassezia spp, utilizaram a técnica de microdiluição em caldo com adição de indicadores
colorimétricos, como uréia e azul de Alamar, respectivamente.
Gupta et al. (2000) utilizaram a técnica de difusão em ágar com diferentes meios
sólidos, na dependência da espécie de Malassezia testada. Uchida et al. (2003) testaram a
sensibilidade das cepas em ágar Dixon. A técnica de microdiluição em caldo foi empregada por
Eichenberg et al. (2003), cujo meio de escolha para cepas de M. pachydermatis foi Sabouraud
líquido acrescido de 1% de Tween 80, e, mais recentemente, por Velegraki et al. (2004), que
utilizaram o meio RPMI 1640 enriquecido com óleo, sendo obtida uma boa reprodutibilidade.
26
3 JUSTIFICATIVA
Nos últimos anos vem ocorrendo um aumento no isolamento de fungos
leveduriformes, em especial Malassezia e Candida, como agentes de processos mórbidos em
animais. Este fato, aliado à escassez de dados que revelem detalhes acerca da morfologia e
fisiologia destas leveduras de origem animal, na cidade de Fortaleza - Ceará, estimulou a
execução deste estudo, enfocando os aspectos fenotípicos e perfil de sensibilidade antimicrobiano
de cepas de Candida spp e Malassezia pachydermatis, oriundas de cães.
27
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
As cepas de Candida spp e M. pachydermatis isoladas de cães, apresentam um perfil
fenotípico semelhante aquele apresentado por cepas de origem humana, podendo haver variação
na sensibilidade antifúngica.
28
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
O objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e determinar o perfil
de sensibilidade antifúngica, in vitro, de cepas de Malassezia pachydermatis e Candida spp,
isoladas de cães, em Fortaleza-Ceará, perante a anfotericina B e aos principais derivados azólicos
utilizados na clínica veterinária.
5.2 Objetivos Específicos
1 Estabelecer o perfil fenotípico de cepas de M. pachydermatis isoladas de cães;
2 realizar a fenotipagem de C. tropicalis e C. albicans oriundas de cães; e
3 avaliar o perfil de sensibilidade, in vitro, de C. tropicalis, C. albicans e M. pachydermatis
frente ao fluconazol, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B.
29
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Cepas analisadas
6.1.1 M. pachydermatis
O total de 32 cepas de M. pachydermatis, isoladas de cães, em Fortaleza-Ceará, foram
avaliadas neste estudo. Todos os isolados foram identificados e posteriormente estocados no
Centro Especializado em Micologia Médica (CEMM), da Universidade Federal do Ceará. As
cepas de M. pachydermatis foram isoladas de dermatites, otites ou ouvidos saudáveis, sendo
estocadas, antes da realização dos experimentos e após isolamento e identificação, em ágar Dixon
a -20°C (Quadro 1).
6.1.2 Candida spp
Cinco cepas de C. albicans e três de C. tropicalis, isoladas de cães, em Fortaleza-
Ceará, foram testadas. As cepas foram obtidas de dermatites, otites ou ouvidos saudáveis. Todas
as cepas de Candida spp, após identificação realizada no CEMM e antes da realização dos
experimentos, foram estocadas em ágar batata acrescido de DMSO (10%) a temperatura de -20°C
(Quadro 1).
30
6.1.3 Cepas-controle
A cepa C. parapsilosis, ATCC 22019, foi utilizada como controle, bem como
algumas cepas isoladas de humanos portadores de candidíase sistêmica, como uma cepa de C.
guilliermondii (CEMM 01-4-044) e três C. parapsilosis (CEMM 01-2-073; CEMM 01-2-092;
CEMM 01-4-043). Todas estas cepas se encontram estocadas no banco de microrganismos do
CEMM. Vale salientar que para cada cepa de origem humana foi testada apenas uma droga, com
exceção da cepa CEMM 01-2-073, para a qual foram testados o fluconazol e itraconazol.
6.2 Identificação
6.2.1 M. pachydermatis
A identificação das cepas de M. pachydermatis foi realizada de acordo com Guého et
al. (1996), Guillot et al. (1996) e Hoog et al. (2000), com base nas características macro e
micromorfológicas, bem como na capacidade de crescer em meio não rico em lipídios (ágar
Sabouraud).
Após a observação da presença de colônias com macromorfologia característica do
gênero Malassezia, lâminas eram confeccionadas e coradas pela técnica de Gram, tornando
possível a visualização de blastoconídios típicos de Malassezia spp. Esse material era, então,
repicado em meio ágar Sabouraud simples e, quando detectada a presença de crescimento neste
meio, o microorganismo era identificado como M. pachydermatis (Fluxograma 1).
31
6.2.2 Candida spp
A identificação das espécies de Candida baseou-se em características fenotípicas, tais
como: descrição da macromorfologia, mediante observação das colônias, micromorfologia,
obtida a partir da realização de microcultivo, que permite melhor visualização das estruturas
fúngicas, bem como por meio de zimograma e auxonograma, de acordo com Hoog et al. (2000)
(Fluxograma 2).
6.3 Recuperação das cepas após estocagem
Para os experimentos, as cepas de M. pachydermatis, mantidas a temperatura de
- 20ºC em ágar Dixon modificado por um ano, foram descongeladas e um pequeno fragmento da
colônia repicado para um tubo de ensaio contendo, também, ágar Dixon modificado. Os tubos
com os inóculos foram incubados a 37°C e observados diariamente por um período de até 10
dias, a fim de verificar o crescimento e a manutenção da viabilidade das cepas.
Da mesma forma, as cepas de C. tropicalis e C. albicans, bem como as cepas-
controle - C. guilliermondii e C. parapsilosis - estocadas em ágar batata acrescido de DMSO
(10%) a -20 °C, foram retiradas da micoteca e repicadas para um tubo contendo ágar batata,
sendo incubadas a temperatura ambiente e ao fim de quatro dias era observada a presença de
crescimento.
32
6.4 Análise fenotípica
6.4.1 M. pachydermatis
A fenotipagem de M. pachydermatis foi feita a partir da junção de características
morfológicas e bioquímicas de cada cepa
. Para isso foram levadas em consideração
características morfológicas e provas complementares, descritas por Guého et al. (1996), Guillot
et al. (1996) e Hoog et al. (2000), como: hidrólise da esculina, reação da catalase, produção de
enzima urease, assimilação dos Tweens 40 (0,5%), 80 (1%), 20 (10%) e 60 (100%), bem como
capacidade de crescer em ágar Sabouraud simples (S/A) nas temperaturas de 37° C e 40° C
(Fluxograma 1).
6.4.2 Candida spp
As cepas de C. albicans e C. tropicalis foram caracterizadas fenotipicamente por
meio da macro, micromorfologia e características bioquímicas, de acordo com Hoog et al. (2000).
Desta forma, foram levados em consideração testes como assimilação e fermentação de
carboidratos, assimilação de nitrogênio e teste do tubo germinativo (Fluxograma 2).
33
Quadro 1: Cepas analisadas na pesquisa: espécie, origem e método de estocagem.
Número da cepa
Espécie
Origem
Estoque
CEMM 01-2-059
M. pachydermatis
Dermatomicose
Ágar dixon (-20
)
CEMM 01-2-067
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-2-069
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-2-071
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-2-074
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-007
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-008
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-010
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-012
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-031
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-044
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
CEMM 01-3-062
M. pachydermatis
Otite
Ágar dixon (-20 )
34
Fluxograma 1: Identificação e análise fenotípica das cepas de Malassezia pachydermatis.
Crescimento (+)
Macroscopia
Microscopia
Gênero Malassezia
Semear em Sabouraud simples
F
E
N
O
T
I
P
A
G
E
M
Catalase
Esculina
Colônia crescida em
ágar Dixon
(+)
(+) ou (-)
Teste da urease
(+)
S/A 37° e 40°C
(+)
Tweens 40 (0,5%), 80 (1%), 60
(100%)
(+)
Tween 20 (10%)
(-)
I
D
E
N
T
I
F
I
C
A
Ç
Ã
O
M. pachydermatis
35
Fluxograma 2: Identificação e análise fenotípica das cepas de Candida albicans e Candida
tropicalis.
Colônia crescida em ágar
Sabouraud simples
Assimilação de
Carboidratos
Assimilação
de Nitrogênio
Fermentação de
Carboidratos
Tubo
Germinativo
Repique em ágar batata
Macromorfologia
Micromorfologia
C. albicans
C. tropicalis
36
6.5 Teste de Sensibilidade Antifúngica in vitro
6.5.1 Antifúngicos testados
Quatro antifúngicos foram utilizados na presente pesquisa: cetoconazol, itraconazol
(Jansen Research Foundation, Beerse), fluconazol (Pfizer, Madrid, Spain) e anfotericina B
(Sigma, St. Louis, Mo.). Cetoconazol, itraconazol e anfotericina B foram diluídos em DMSO
(100%) (Merck, Darmstadt, Germany) e o fluconazol foi preparado em água destilada.
6.5.2 Sensibilidade das cepas de M. pachydermatis
A sensibilidade das cepas de M. pachydermatis foi obtida a partir da realização da
técnica de difusão em ágar descrita por Gupta et al. (2000). Estes autores utilizaram diferentes
meios sólidos para testar a sensibilidade antifúngica de variadas espécies de Malassezia. Dessa
forma, na presente pesquisa, utilizou-se o meio ágar Sabouraud simples, visto que as cepas de M.
pachydermatis apresentam bom crescimento nesse meio não rico em lipídios, com o objetivo de
obter a concentração inibitória mínima (CIM) para cada cepa.
6.5.2.1 Diluição dos antifúngicos
Para testar a sensibilidade das cepas de M. pachydermatis, as drogas foram diluídas
em 1 mL de Sabouraud, em caldo, e em cada uma das diluições, 9 mL de ágar Sabouraud foram
acrescidas, resultando em uma concentração final 10 vezes mais diluída. Em seguida, o volume
de 10 mL contendo ágar Sabouraud com a droga foi distribuído em uma placa de Petri. O
37
intervalo das concentrações testadas foi de 0,0075 – 0,25 µg/mL para cetoconazol e itraconazol;
0,5 – 16 µg/mL para fluconazol e 0,015 – 16 µg/mL para anfotericina B.
6.5.2.2 Preparo e semeada do inóculo
A suspensão fúngica foi preparada a partir de culturas, com quatro dias de
crescimento, em ágar Dixon modificado a 37°C. O meio Sabouraud em caldo era colocado nos
tubos de ensaio contendo as colônias de M. pachydermatis. Estas colônias eram gentilmente
agitadas com o objetivo de liberar blastoconídios. A suspensão de blastoconídios em Sabouraud
em caldo era posteriormente transferida do tubo de ensaio para um tubo estéril e o volume
ajustado para 2 mL acrescentando Sabouraud em caldo. As suspensões eram então plaqueadas em
ágar Dixon modificado, com o intuito de obter um inóculo com concentração aproximadamente
igual a 1 x 10
4
UFC/mL, como utilizado por Gupta et al. (2000).
Cem microlitros da suspensão do fungo foram inoculados na superfície de placas de
Petri contendo ágar Sabouraud acrescido de antifúngico em uma determinada concentração
(Figura 7). As placas foram, então, incubadas no escuro a uma temperatura de 37°C (Figura 8),
por sete dias, e as leituras eram realizadas diariamente. Uma placa contendo ágar Sabouraud
simples, sem acréscimo de antifúngico, foi utilizada como controle negativo. Após sete dias de
incubação, a menor concentração que foi capaz de inibir o crescimento fúngico no meio de
cultura foi considerada como a CFM. Todos os isolados foram testados em duplicata.
6.5.3 Sensibilidade das cepas de Candida spp
A concentração inibitória mínima (CIM) para as cepas de Candida spp foi
determinada pelo método de microdiluição em caldo, preconizado pelo National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS), descrita no documento M27-A2 (NCCLS, 2002), com
38
algumas modificações. O meio utilizado foi o RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute;
Sigma Chemical Co., St Louis, MO) com L-glutamina, 2,0 g/L de glicose sem bicarbonato de
sódio, tamponado com MOPS (ácido 2-[N-morfolino]- propoanossulfônico) 0,165M, a pH 7,0.
Este meio foi diluído em água destilada esterilizada, na concentração de 46,5 g/L e filtrado em
filtro biológico.
Figura 8: Placa da Petri em estufa a temperatura de 37°C.
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 7: Distribuição da suspensão fúngica: A. Pipetagem do inóculo; B. Repicagem de
inóculo em placas de Petri contendo meio de cultura e antifúngico; C. Distribuição do inóculo
na superfície do meio com auxílio de alça.
(Fonte: CEMM, 2005)
$
%
&
39
6.5.3.1 Diluição dos antifúngicos
Para a análise da sensibilidade das cepas de Candida spp, as drogas foram diluídas
em RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), e testadas com intervalo de concentrações
entre 0,01-16 µg/mL para cetoconazol, itraconazol e anfotericina B. Para fluconazol o intervalo
foi 0,06-64 µg/mL.
6.5.3.2 Preparo do inóculo
O inóculo das Candidas, com a concentração igual a 2,5 – 5 x 10
3
UFC/mL, foi
ajustado por turbimetria. Para preparo do inóculo, foram utilizadas culturas com dois dias de
crescimento, em ágar batata a temperatura ambiente. Após este período de crescimento, solução
salina (0,9%) esterilizada foi colocada nos tubos, contendo as colônias de Candida spp, que
foram gentilmente agitadas para liberação de blastoconídios, muitas vezes, não sendo necessário
tal ato pela facilidade de liberação dos blastoconídios a partir das colônias.
A suspensão de blastoconídios foi, então, transferida para um tubo esterilizado e o
volume ajustado para 4 mL, acrescentando salina esterilizada (0,9%). Em espectofotômetro, com
comprimento de onda de 530 nm e transmitância ajustada para 95%, foi determinada e ajustada a
concentração final do inóculo. Posteriormente, a suspensão final passou por duas diluições, a
primeira de 1:100 e depois 1:20. Para isto foi utilizado o meio RPMI 1640, cujo pH foi ajustado
com 0,165M ácido morpholinepropanesulfonic (MOPS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)
para pH 7. Após todas as diluições, a concentração final do inóculo foi aproximadamente igual a
2,5 – 5 x 10
3
UFC/mL.
40
6.5.3.3 Microdiluição em caldo
O método de microdiluição em caldo, empregado para testar a sensibilidade das cepas
de Candida spp, foi realizado em placas de 96 micropoços com fundo em forma de U (Figura 9).
Cem microlitros do meio RPMI 1640 foram colocados em cada um dos 96 micropoços (Figura
10), em seguida, 100 µL do antifúngico foram adicionados na primeira coluna. A partir daí este
antifúngico foi diluído de forma seriada até a coluna 11 (Figura 11). Por fim, 100 µL da
suspensão do fungo foram distribuídos em cada poço (Figura 12). Controles positivos de
crescimento e esterilidade foram incluídos para cada isolado testado. As placas eram colocadas
em estufa na temperatura de 37°C (Figura 13) e lidas após 48 horas de incubação. Todos os
isolados foram testados em duplicata e os experimentos eram repetidos, no mínimo, duas vezes.
Para os azólicos, a CIM foi determinada pela última concentração da droga capaz de
inibir 80% do crescimento fúngico, comparado ao controle. Para anfotericina B, a concentração
capaz de inibir 100% do crescimento fúngico foi tida como a CIM.
Figura 9: Placa de 96 micropoços com fundo em forma de U.
(Fonte: CEMM, 2005)
41
Figura 10: Distribuição do meio RPMI em placa de 96 micropoços.
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 12: Distribuição da suspensão fúngica na placa de 96 micropoços.
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 11: Diluição seriada do antifúngico.
(Fonte: CEMM, 2005)
42
Figura 13: Placas de 96 micropoços, com teste de sensibilidade antifúngica,
incubadas em estufa a 37°C.
(Fonte: CEMM, 2005)
43
7 RESULTADOS
7.1 M. pachydermatis
7.1.1 Análise fenotípica
As 32 cepas de M. pachydermatis analisadas apresentaram micromorfologia
caracterizada por blastoconídios ovais com presença de colarete (Figura 14.A), e
macromorfologia caracterizada pela presença de colônias com a coloração amarelo-creme e
textura glabrosa seca (Figura 14.B). Ademais, todas as cepas foram capazes de crescer em meio
ágar Sabouraud simples e nas temperaturas de 37ºC e 40ºC (Tabela 1).
Nos testes bioquímicos realizados, das 32 cepas testadas, 34,4% foram negativas para
produção da enzima urease (Figura 15.A). No teste da catalase, 20 (62,5%) tiveram seu resultado
negativo e 12 (37,5%) foram positivas. As trinta e duas cepas foram positivas no teste da esculina
(Figura 15.B) e assimilaram bem os Tweens 80, 60 e 40, nas concentrações de 1%, 100% e 0,5%,
respectivamente, mas assimilaram fracamente o Tween 20 na concentração de 10%. Os resultados
referentes aos testes bioquímicos estão descritos na tabela 1.
Figura 14: A. Blastoconídios com colarete; B. Colônias de Malassezia pachydermatis.
(Fonte: CEMM, 2005)
(Fonte: CEMM, 2005)
%
$
44
Figura 15: A. Teste da urease positivo (+) e negativo (-); B. Teste da esculina positivo (+)
e negativo (-).
(Fonte: CEMM, 2005)
(Fonte: CEMM, 2005)
$
%
45
(+) resultado positivo; (-) resultado negativo; *
Tween
80 na concentração de 1%;
Tween
60 a 100%;
Tween
40 a 0,5%;
Tween
20
a 10%.
Cepas
S/A
37°C
40°C
Esculina
Urease
Catalase
Tween
80*
Tween
60*
Tween
40*
Tween
20*
CEMM 01-2-059
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CEMM 01-2-061
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CEMM 01-2-067
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CEMM 01-2-069
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CEMM 01-2-071
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CEMM 01-2-074
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CEMM 01-3-007
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CEMM 01-3-008
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CEMM 01-3-010
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CEMM 01-3-012
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CEMM 01-3-031
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CEMM 01-3-044
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CEMM 01-3-062
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CEMM 01-3-072
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CEMM 01-3-183
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CEMM 01-3-185
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CEMM 01-3-189
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CEMM 01-3-191
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CEMM 01-4-008
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CEMM 01-4-010
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CEMM 01-4-012
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CEMM 01-4-189
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CEMM 01-5-171
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CEMM 01-5-173
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CEMM 01-5-174
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CEMM 01-5-177
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CEMM 02-2-279
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CEMM 02-2-280
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CEMM 02-2-284
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CEMM 02-2-294
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CEMM 02-6-050
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CEMM 02-5-062
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(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
Tabela 1: Resultados das cepas de
Malassezia pachydermatis
referentes aos testes fisiológicos.
46
7.1.2 Sensibilidade antifúngica in vitro
Ao final de sete dias, após incubação das placas de Petri contendo meio de cultura,
droga e o inóculo, o que pôde ser observado foi uma diminuição no tamanho das colônias à
medida que a concentração do antifúngico aumentava, até que determinada concentração era
capaz de inibir o crescimento do microrganismo (Figura 16 e Figura 17). Desta forma, a partir da
técnica da difusão em ágar, empregada para testar a sensibilidade antifúngica das cepas de M.
pachydermatis, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) para cada cepa, conforme
apresentado a seguir.
Figura 16: Teste de sensibilidade de Malassezia pachydermatis com
anfotericina B: cepas que apresentaram alta sensibilidade.
(Fonte: CEMM, 2005)
47
A CIM das cepas de M. pachydermatis testadas encontra-se na tabela 2. As 32 cepas
de M. pachydermatis utilizadas apresentaram CIM ≤ 0,0075 µg/mL para itraconazol. Vinte e
nove cepas tiveram CIM ≤ 0,0075 µg/mL para cetoconazol e apenas 3 cepas de M.
pachydermatis apresentaram CIM = 0,015 µg/mL para esta droga. Para o fluconazol, os
resultados foram os seguintes: CIM JP/ , CIM = 4 µg/mL, CIM = 8 µg/mL e CIM = 16
µg/mL, para quatro, dez, onze e sete cepas, respectivamente. Para a anfotericina B, 4 cepas
apresentaram CIM = 0,125 µg/mL, 3 CIM = 0,25 µg/mL, 11 CIM = 0,5 µg/mL, 4 CIM = 1
µg/mL, 1 CIM = 2 µg/mL, 1 CIM = 4 µg/mL e 8 CIM = 8 µg/mL.
Figura 17: Teste de sensibilidade de Malassezia pachydermatis
com anfotericina B: cepas que apresentaram baixa sensibilidade.
(Fonte: CEMM, 2005)
48
Tabela 2: Concentração inibitória mínima (CiM) dos derivados azólicos e anfotericina B
perante as cepas de Malassezia pachydermatis.
CIM µg/mL
M. pachydermatis
Cetoconazol
Itraconazol
Fluconazol
Anfotericina B
n=32
≤
0,0075 (29)
a
≤
0,0075 (32)
= 0,125 (4)
= 0,015 (3)
= 4 (10)
= 0,25 (3)
= 8 (11)
= 0,5 (11)
= 16 (7)
=1 (4)
=2 (1)
=4 (1)
=8 (8)
a
número de cepas de M. pachydermatis relacionadas a CIM correspondente.
7.2 Candida spp
7.2.1 Análise fenotípica
As cinco cepas de C. albicans apresentaram, em sua micromorfologia,
clamidoconídios terminais, hifas verdadeiras, pseudo-hifas e blatoconídios formando cachos após
três dias de incubação a temperatura de 28 °C (Figura 18). Nos testes bioquímicos, foram capazes
de fermentar os carboidratos: glicose, maltose e galactose (Figura 19), além de assimilar glicose,
sacarose, galactose, trealose, maltose e xilose (Tabela 3). No teste para verificar a formação de
tubo germinativo, mostraram resultado positivo.
As três cepas de C. tropicalis apresentaram, em sua microscopia, pseudo-hifas e
blastoconídios distribuídos em cadeias simples e ramificadas (Figura 20). Demonstraram-se
capazes de fermentar glicose, galactose, trealose e maltose. No auxonograma, foram positivas
para glicose, galactose, xilose, trealose e maltose (Tabela 3). Nenhuma das cepas foi capaz de
formar tubo germinativo.
49
Todas as cepas, de ambas as espécies, demonstraram macromorfologia semelhante,
com colônias glabras brancas. Foram semelhantes também quando à assimilação de nitrato, já
que nenhuma delas demonstrou essa capacidade (Tabela 3).
Gli: glicose; Sac: sacarose; Lac: lactose; Gal: galactose; Raf: rafinose; Xil: xilose; Cel: celobiose; Ter: trealose; Rib:
ribose; Mal: maltose; Mel: melobiose; (+) resultado positivo; (-) resultado negativo
Assimilação
Fermentação
Espécie
Cepa
(CEMM)
Gli
Sac
Lac
Gal
Raf
Xil
Cel
Tre
Rib
Mal
Mel
Nitrato
Gli
Sac
Gal
Tre
Mal
C. tropicalis
01-2-063
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
C. tropicalis
01-2-078
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
C. tropicalis
01-2-081
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
C. albicans
01-3-068
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
C. albicans
01-3-069
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
C. albicans
01-3-074
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
C. albicans
01-3-075
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
C. albicans
01-3-077
(+)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
Tabela 3: Resultados das cepas de Candida spp referentes aos testes de assimilação e fermentação
de carboidratos, bem como assimilação de nitrato.
(Fonte: CEMM, 2005)
Figura 18: Micromorfologia Candida albicans: A. Blastoconídios dispostos em cachos; B/C.
Clamidoconídios terminais.
$
%
&
50
7.2.2 Sensibilidade antifúngica in vitro
As CIMs encontradas para as espécies de Candida estão descritos na tabela 4. As
cinco cepas de C. albicans utilizadas apresentaram CIM > 16 µg/mL para o cetoconazol e
itraconazol. Quatro cepas apresentaram CIM superior a 64 µg/mL frente ao fluconazol e somente
uma apresentou CIM= 2 µg/mL para esta droga (Tabela 4).
Figura 19: A. Teste de fermentação positiva para glicose (Gli),
maltose (Mal) e galactose (Gal); B. Bolha de gás carbônico no
interior do tubo de Durhan.
(Fonte: CEMM, 2005)
$
%
*OL
0DO
*DO
Figura 20: Micromorfologia de Candida tropicalis.
(Fonte: CEMM, 2005)
51
No tocante às três cepas de C. tropicalis, duas apresentaram CIM > 16 µg/mL para
cetoconazol e itraconazol e CIM > 64 para fluconazol. Apenas uma cepa de C. tropicalis teve
CIM= 2 µg/mL para fluconazol, CIM= 0,25 µg/mL para itraconazol e CIM = 0,03 µg/mL para o
cetoconazol (Tabela 4).
Perante a anfotericina B, três cepas de C.albicans mostraram CIM = 0,25 µg/mL e
duas CIM= 0,5 µg/mL. Para as C. tropicalis as CIMs de anfotericina B foram de 0,5 µg/mL para
uma das cepas e 1 µg/mL para as duas cepas restantes (Tabela 4).
Com relação às cepas de humanos, as C. parapsilosis tiveram CIM µg/mL e
CIM = 0,25 µg/mL para cetoconazol e CIM = 2 µg/mL para fluconazol e itraconazol. Já a cepa
de C. guilliermondii apresentou CIM = 0,5 µg/mL para fluconazol. A cepa C. parapsilosis ATCC
22019 apresentou CIM = 1 µg/mL para anfotericina B e CIM = 4 µg/mL para fluconazol (Tabela
4).
Tabela 4: CIM (µg/mL) do cetoconazol, itraconazol, fluconazol e anfotericina B
perante as cepas de Candida spp
.
CIM (µg/mL)
Candida spp
N° de cepas
Cetoconazol
Itraconazol
Fluconazol
Anfotericina B
C. tropicalis
3
>16 (2)
a
>16 (2)
>64 (2)
= 1 (2)
= 0,03 (1)
= 0,25 (1)
= 2 (1)
= 0,5 (1)
C. albicans
5
>16 (5)
>16 (5)
>64 (4)
= 0,25 (3)
= 2 (1)
= 0,5 (2)
C. guilliermondii
1
= 0,5 (1)
C. parapsilosis
3
≤
0,03 (1)
= 2(1)
b
= 2 (1)
b
= 0,25 (1)
ATCC 22019
= 4
= 1
a
Representa o número de cepas de uma espécie em particular com CIM indicada.
b
Cepa CEMM 01-2-073, que foi utilizada para controle do itraconazol e fluconazol.
52
8 DISCUSSÃO
A ocorrência de infecções por leveduras, em especial Malassezias e Candidas, em
animais vem aumentando nestes últimos anos. O gênero Malassezia, mais especificamente a
espécie M. pachydermatis, é descrita como agente patológico de lesões cutâneas, otites e úlcera
de córnea (MORRETI et al., 2004; GIRÃO et al., 2005; PRADO et al., 2004).
Muitos relatos revelam que espécies de Candida são importantes patógenos em
pequenos animais. Pressler et al. (2003) isolaram seis espécies de Candida, causando infecção
urinária em treze cães e sete gatos, onde a C. albicans foi o isolado mais comum. Há relatos do
envolvimento da espécie C. albicans em quadros de otite em bovinos (DUARTE et al., 2001),
infecção intestinal em répteis (OROS et al., 2004), endoftalmite, septicemia e dermatomicose em
cães (OCHIAI et al., 2000; HESELTINE et al., 2003; LINEK, 2004; MORETTI et al., 2004).
O diagnóstico de candidíase em pequenos animais, apesar do aumento de sua
ocorrência, ainda é raro. De acordo com Raposo et al. (1996), quando se trata de candidíase
cutânea, este fato se justifica porque as lesões, na maioria dos casos, são atribuídas a fungos
filamentosos, bactérias e parasitas, de forma que Moretti et al. (2004) chamam a atenção para a
realização de um diagnóstico diferencial, além do que, geralmente, as Candidas acometem
animais imunossuprimidos. Corroborando esta informação, Pressler et al. (2003) e Heseltine et al.
(2003) isolaram espécies de Candida apenas em animais com sistema imune comprometido ou
portadores de outros processos infecciosos. Há relatos da ocorrência destas infecções, no entanto,
em animais aparentemente livres de desordens imunológicas (KOZAK et al., 2003; BROWN et
al., 2005).
Apesar da importância das leveduroses em pequenos animais, poucos estudos
revelam informações sobre as características fenotípicas, moleculares, bem como o perfil de
sensibilidade a drogas antifúngicas contra esses agentes de origem animal (PRADO et al., 2004;
GIRÃO et al., 2005).
53
De acordo com Guillot et al. (1996), a espécie M. pachydermatis tem sua
micromorfologia caracterizada pela presença de blastoconídios ovais dotados de colarete. Com
relação as suas características bioquímicas, os autores descrevem reação de catalase negativa ou
fracamente positiva, capacidade de assimilar os Tweens 80, 60 e 40, nas concentrações de 1%,
100% e 0,5%, respectivamente, no entanto, seu crescimento é significativamente inibido na
presença de Tween 20 (10%), bem como são capazes de crescer em meios não ricos em lipídios
(como ágar Sabouraud) em altas temperaturas (até 41°C).
Os resultados descritos por Guillot et al. (1996) corroboram os encontrados na
presente pesquisa, onde as cepas de M. pachydermatis utilizadas foram capazes de crescer em
ágar Sabouraud simples nas temperaturas de 37 e 40°C e na presença dos Tweens 80 (1%), 60
(100%) e 40 (0,5%), mas tiveram seu crescimento praticamente inibido na presença do Tween 20
na concentração de 10%. Guillot et al. (1996) atribuem essa inibição à elevada toxicidade que o
Tween 20 promove no meio. Vinte cepas (62,5%) foram negativas no teste da catalase e doze
(37,5%) obtiveram resultado positivo, fato este que concorda também com Hoog et al. (2000).
A produção da enzima urease é descrita por diferentes autores como importante
característica da espécie M. pachydermatis. De acordo com Guého et al. (1996), Nakamura et al.
(2000) e Girão et al. (2004), todas as cepas pertencentes a esta espécie são capazes de
metabolizar a uréia. Nas condições testadas, porém, onze (34,4%) das 32 cepas utilizadas na
presente pesquisa não produziram a enzima urease. De acordo com Girão et al. (2004), a
produção da urease pode ser muito afetada pelo período e condições de manutenção do
microrganismo. Girão et al. (2004) descreveram que 50% das cepas de M. pachydermatis
utilizadas por eles tornaram-se negativas no teste da urease, após seis meses de estocagem em
ágar Dixon na temperatura de -20°C. Este fato sugere que o estoque de cepas nestas condições
pode não ser ideal para manutenção das características bioquímicas de cepas de M.
pachydermatis.
A análise fenotípica das cepas de Candida spp englobou os aspectos macro e
micromorfológicos, bem como o perfil bioquímico baseado na fermentação de carboidratos e
assimilação de nitrogênio e de açúcares diferentes. Neste estudo, as cepas de C. albicans e C.
54
tropicalis apresentaram características fenotípicas com o mesmo perfil descrito por Hoog et al.
(2000) e
55
em seus experimentos, lograram avaliar a sensibilidade de vaalia8 Tcs.71992 0 0 T824292 Tw( )Tj0.132 Tc9 0 Td(li0 Td(s)Tj-0.e 1286 0 Td((a)Tj0.0s.71992 0 0 T(a)Tj0.0048 Tc6 0 Td(e)Tj-0.éc4 Tc11.0449 00.559804 Tc5.27969 0 Td(li)Tj-0.048 Tce2 Tc7.91992 0 Td4.836 Tw(78)Tj-0.048 T0199 0 Td(e)Tj0 (mTjETdo32 Tc9 00 Td(25.39804 Tc5g27969 0 Td(li0 Td(r)Tj-0.ê Tc5.27969 0 Td(x)Tj0 Tn48 Tc6.71992 0 1d(s)Tj-0.e 128c5.27969 0 Td(r)Tj0.024 Tc327969 a)Tj0.04 Tc0jETo32 Tc9 0.27969 Tf9 0 0 1 -4555157 -256402j0.0M48 T0199 9 Td(a)Tj0.024 Tc5.27969 e)Tj-0.c3.35977 0 Td(o)Tj-0.2 1286 0 Td(s)Tj0.02048 Tc4.79961 9Tj-0.048 Tce2 Tc7 0 Td((a)Tj0.0z4 Tc4.67969 0 Td(i)Tj0 Tc3.35977 0 Td(b)Tj0.02 128Tf1 0 0 1 6.00234)Tj0.0, 48 Tc6 0 Td(e)Tj-0.24 Tc5.27969 0 Td(li)Tj-0.27969 0 Td(li)Tj-0.048 Tcé4 Tc5.27969 0 Td(li)Tj--5.27960.012 Tc199 0 T359804 Tc5048 Tc6 0 Td(e )Tj06 0 Td0 Tc13.17 0 Td(8(a)Tj0.0s.719c4.67969 0 Td(e)Tj0 Tc5.2c5.27969 0 Td(r)Tj0.325)Tj-0.048 T0(li0 0d(u)Tj0.012 Tc6 27969 e)Tj-0.m48 Tc4.79961 9Tj-0.048 Tc6 0 Td0 a24 Tc11.0449 8(a)Tj0.0t27969 0 Td(li)Tj-0.048 Tcéc10.0797 0 T559804 Tc524 Tc6 0 Td(t)Tj0 T.27969 0 Td(li)Tj-0.048 Tcca24 Tc1.2797 03T559804 Tc5048 Tc6 0 Td(e 1d(s)Tj-0.e32 Tc9 0.27969 8(a)Tj0.0f04a)Tj0.04 Tc5á27969 0 Td(li0 8 Tcc4 Tc5.27969 0 Td(li)Tj--5.27960.il 48 Tc4.79961 9T7d(s)Tj-0.e 128627969 0 Td(x)Tj0 Tc6.1c6.71992 0 1d(s)Tj-0.e 128040 Td(x)Tj0 Tc10.0797 0 8 Tcu48 Tc6 0 Td(e)Tj-0.çã10.0797 0 T559804 Tc0jETo32 Tc9 0.79961 9)Tj0.32 )Tj0 Tcc10.0797 03 Tdo)Tj0.012 Tc6 0 Td(t)Tj0 -5.27960.012 Tc199 0 T359804 Tc5bo2 Tc9 0.79961 0 T009804 Tc06 0 Td0 a24 Tc9 0.27969 8(a)Tj0.0048 Tc3.95977 0 Td(a)Tj0.0e 128627969 0 Td(x)Tj0 Tp4 Tc9 0.27969 0 1d(s)Tj-0.r3.35977 0 Td(a)Tj0.0od12 Tc6 27969 1804 Tc5tc3.35977 0 Td(a)Tj0.024 Tc6 0 Td(ili)Tj0 Tc10.0797 0 Td(d)Tj-0.048 Tc6 0 Td(a)Tj0 Tc5.27969 0 Td(d)Tj-0.048 Tc6 0 Td4.968 TwTc5.27969 0 Td(n)Tj0.0.5.23T0035.4 Tw( )TjETQQq-32.4 4 -25759800.024 Tc9 0.0 Td(W 6402jTQAq517 0 Td(863984)Tj0.0 T4)Tj-0.048 T0199 016398)Tj0.0 T
56
isoladas de homens e animais, encontraram valores de sensibilidade bastante elevados (8 a 32
µg/mL). No entanto, apesar de semelhantes, os maiores valores de CIM descritos neste estudo
ficaram abaixo dos valores mais altos observados por Velegraki et al. (2004).
Por intermédio dos testes de sensibilidade, in vitro, realizados no presente estudo,
diferente do observado com M. pachydermatis, podem-se observar algumas cepas de Candida
spp resistentes a fluconazol, itraconazol e cetoconazol. Diferentes artigos relatam a existência de
cepas de C. albicans, isoladas de humanos, apresentando resistência mútua a derivados azólicos,
como Löffler et al. (1997), Sanglard et al. (1998) e López-Ribot et al. (1999), que observaram
cepas resistentes a fluconazol e itraconazol. Os autores atribuiram a ocorrência da resistência a
modificações em aminoácidos das cepas.
Apesar de não terem sido testadas neste trabalho, em virtude de limitações técnico-
operacionais, vários são os relatos de outras alterações em cepas fúngicas que as podem tornar
resistentes a derivados azólicos, como: pontos de mutação no gen ERG11, que codifica a enzima-
alvo dos azólicos, 14-.-demethylase (LÖEFFLER et al., 2000) e redução da permeabilidade da
membrana a azólicos (VAN BELKUM et al., 1994). A falha no acúmulo de antifúngicos azólicos
tem sido identificada como uma das principais causas de resistência em isolados fúngicos pouco
sensíveis a derivados azólicos, tais como: cepas de C. albicans, C. krusei (PINA-VAZ et al.,
2005) e C. glabrata (SANGLARD et al., 2001). Barchiesi et al. (2000) detectaram a
superexpressão de gens responsáveis pelas bombas de efluxo em cepas de C. tropicalis, e,
segundo os autores, a
57
como fluconazol, mas podem resultar em uma inibição da atividade catalítica da enzima 14-.-
demetilase (KELLY et al., 1999; LAMB et al., 2000).
Perea et al. (2001) investigaram mecanismos moleculares, que resultam na resistência
a azólicos, em cepas de C. albicans resistentes a fluconazol. Sua análise confirmou uma natureza
multifatorial na resistência a fluconazol, com a predominância de mecanismos como a
“superexpressão” de gens que codificam as bombas de efluxo, detectada em 85% das cepas
resistentes analisadas. Mutações como a substituição do aminoácido funcional e a superexpressão
do gen, que codifica a enzima-alvo da droga, foram detectadas em 65 e 35% dos isolados,
respectivamente. Em 75% dos isolados havia múltiplos mecanismos combinados.
Outro fator que pode interferir na sensibilidade antifúngica é a estocagem do
microrganismo a baixas temperaturas, que pode levar a uma diminuição na eficiência da
produção de proteínas, baixa fluidez da membrana celular, estabilização da dupla hélice ou da
estrutura secundária da molécula de DNA ou RNA, lento arranjo estrutural das proteínas e
decréscimo da atividade enzimática (GRAUMANN & MARAHIEL et al., 1996; PANOFF et al.,
1998). Apesar das cepas de Candida spp utilizadas neste estudo terem passado por um processo
de estocagem a -20°C, antes de serem utilizadas nos experimentos, é pouco provável, no entanto,
que a estocagem tenha resultado na resistência das cepas aos azólicos testados, visto que as cepas
de Candida ATCC existem há anos, já foram estocadas das mais diversas formas, sem, no
entanto, serem alvo de qualquer alteração em suas características fenotípicas e morfológicas,
incluindo valores de sensibilidade antifúngica.
Com relação a anfotericina B, Ming-Fang Cheng, et al. (2004) relataram CIMs de
0,25 a 2 µg/mL para cepas de C. tropicalis e C. albicans, sendo tais dados semelhantes aos
encontrados na presente pesquisa, onde todas as cepas de Candida foram sensíveis com CIMs de
0,5 e 1,0 µg/mL.
58
As cepas de origem humana, citadas no presente estudo, foram testadas somente com
antifúngicos predeterminados, apenas com o intuito de validar o método empregado, visto que
todas as cepas já foram utilizadas em experimentos anteriores. Vale salientar que as CIMs
descritas foram as mesmos encontradas anteriormente em trabalhos realizados no mesmo Centro,
indicando boa reprodutibilidade do método intralaboratorialmente (MEDRANO, 2004).
Os resultados dos testes de sensibilidade in vitro são, muitas vezes, difíceis ou
impossíveis de correlacionar com os resultados obtidos no tratamento clínico. A realização de
testes de sensibilidade a drogas antifúngicas, entretanto é importante para vigilância e
monitoramento de cepas resistentes. Ainda que cepas resistentes in vitro tenham sido detectadas
neste estudo, as mesmas drogas antifúngicas têm mostrado eficiente atividade in vivo no
tratamento de infecções fúngicas em animais (ROCHETTE et al., 2003; VANDEN BOSSCHE et
al., 2003).
Por fim, de acordo com os resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que
nenhuma alteração nas características fenotípicas clássicas das cepas de Candida spp e M.
pachydermatis isoladas de cães foi detectada, excetuando-se a atividade da enzima urease em
algumas cepas desta última levedura. Os dados demonstraram que, ao contrário das cepas de M.
pachydermatis, que foram todas sensíveis, as cepas de Candida spp apresentaram resistência
frente aos derivados azólicos.
59
9 CONCLUSÕES
1 As cepas de Malassezia pachydermatis isoladas de cães apresentaram o perfil fenotípico,
incluindo morfologia e provas bioquímicas, esperado para a espécie, no entanto, algumas
cepas apresentaram resultado negativo para produção da enzima urease;
2 as cepas de Candida albicans e Candida tropicalis, isoladas de cães, não apresentaram
nenhuma diferença significativa referente a morfologia e características bioquímicas;
3 as cepas de M. pachydermatis analisadas apresentaram alta sensibilidade, in vitro, aos
derivados azólicos, sendo os resultados de sensibilidade diante da anfotericina B bastante
variáveis; e
4 as cepas de C. albicans e C. tropicalis apresentaram resistência, in vitro, aos derivados
azólicos, no entanto, todas as cepas foram sensíveis a anfotericina B.
60
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73
PHENOTYPICAL CHARACTERIZATION AND IN VITRO ANTIFUNGAL
SENSITIVITY OF CANDIDA SPP AND MALASSEZIA PACHYDERMATIS
STRAINS FROM DOGS
Periódico: The Veterinary Journal (Submetido)
Erika H. S. Brito
a,
*, Raquel O. S. Fontenelle
a
, Raimunda S. N. Brilhante
b
, Rossana A.
Cordeiro
b, c
, Franciso A. Soares Júnior
a
, André J. Monteiro
d
, José J. C. Sidrim
b
, Marcos F. G.
Rocha
a, b
a
Faculty of Veterinary, Post-Graduation Program in Veterinary Science, State University of
Ceará. Fortaleza – CE, Brazil.
b
Department of Pathology and Legal Medicine, Faculty of Medicine, Medical Mycology
Specialized Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
c
Department of Biology, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
d
Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE,
Brazil.
* Corresponding author:
E. H. S. Brito.
Rua Monsenhor Bruno, 2630; Joaquim Távora.
CEP:
60.115-191. Fortaleza, CE, Brazil.
Phone:
55 (85) 3246-0163.
Fax:
55 (85) 3246-1536.
E. mail:
erikahelenavet@hotmail.com
74
Abstract
Yeasts of the genus Candida and Malassezia pachydermatis can be found as a commensal
microorganism in animals. The main species mentioned in veterinary medicine are M.
pachydermatis and C. albicans. The objective of this study was to carry out a phenotypical study,
in addition to evaluating the in vitro antifungal sensitivity of strains of C. albicans (n=5), C.
tropicalis (n=3) and M. pachydermatis (n=32) isolated from dogs. The phenotyping was based on
macro and micromorphological features as well as biochemical analysis. The techniques of
microdilution in broth and dilution in agar were used to evaluate the in vitro sensitivity of
Candida spp and M. pachydermatis, respectively. The tested drugs were ketoconazole (KTC),
itraconazole (ITC), fluconazole (FLC) and amphotericin B (AMB). The morphological analysis
of the strains of Candida spp and M. pachydermatis did not show any noteworthy alterations. On
the other hand, in the biochemical tests, 34,4 % of the strains of M. pachydermatis were negative
for the urease test. Four strains of C. albicans were resistant to FLC (MIC > 64 µg/mL) and all to
KTC and ITC (MIC >16 µg/mL). Regarding C. tropicalis, two strains had a MIC > 16 µg/mL for
KTC and ITC, as well as MIC > 64 µg/mL for FLC. It is worth highlighting that all of the strains
tested were sensitive to AMB with the MIC varying from 0.25 – 1.0 µg/mL. All of the strains of
M. pachydermatis were sensitive to ITC with a Minimum Fungicide Concentration (MFC)
0.0075 µg/mL. Twenty-nine strains had the same MFC JP/IRU.7&7KH0)&VIRU
FLC varied from WR JP/ )RU $0% WKH 0)& LQWHUYDO ZDV 25 – 8 µg/mL. The
results of this study do not show alterations in the classic phenotypical features of strains of
Candida spp and M. pachydermatis isolated in dogs. However, it was demonstrated that, unlike
M. pachydermatis, the stains of Candida spp had a greater degree of resistance to azole antifungal
agents.
Keywords: Candida, Malassezia, susceptibility, phenotypical analysis, dog
75
1. Introduction
The yeast of the genus Candida and Malassezia are part of animal’s microbiota.
However, despite being saprobes, there are many accounts of infections caused by these
microorganisms, which have different clinical manifestations (Milner et al., 1997; Machado et al.,
2003; Brown et al., 2005).
The yeasts of the genus Malassezia are commonly associated with otitis in dogs, and
more recently they have been correlated with several forms of dermatitis in dogs and cats. M.
pachydermatis is the most commonly isolated yeast on dermatitis and otitis in animals. In Brazil,
there are accounts of M. pachydermatis being isolated in the auricular canal of dogs and cats with
otitis and dermatitis (Machado et al., 2003). In the state of Ceará (Northeast, Brazil), Prado et al
(2004) related the presence of this yeast in the eyes of healthy dogs and those with corneal ulcer.
In addition, other species of the genus, such as: M. furfur, M. obtusa and M. sympodialis have
already been described as agents of otitis in cats and dogs (Crespo et al., 2002).
Infections in animals caused by Candida spp are infrequent (Mueller et al., 2002),
however, in Brazil, the presence of C. albicans was detected in bovines with otitis (Duarte et al.,
2001) and has caused dermatomycosis in dogs (Raposo et al.,1996). In addition to C. albicans,
the most prevalent species, other species have been related causing candidiasis in animals. C.
guilliermondi and C. parapsilosis, have been responsible for dermatomycosis in dogs (Dale et al.,
1972; Mueller et al., 2002); and C. famata has been involved in intestinal infections in dogs
(Milner et al., 1997).
Due to the increasing involvement of yeasts in various illnesses in cats and dogs, the
objective of this study was to evaluate the phenotypical features and determine the in vitro
antifungal sensitivity of M. pachydermatis and Candida spp strains, isolated in dogs, to
amphotecin B and the main azole antifungal agents used in our region.
76
2. Materials and Methods
2.1. Isolates
A total of 32 strains of M. pachydermatis, five strains of C. albicans and three strains
of C. tropicalis from dogs were evaluated in this study. In addition, three strains of C.
parapsilosis and one of C. guilliermondii from humans were tested as a control. All the isolates
were identified and stored at the Specialized Medical Mycology Center (CEMM-Federal
University of Ceará, Brazil). The strains of M. pachydermatis were isolated from dermatitis, otitis
or healthy ears; after being isolated and identified they were stored in Dixon agar at -20°C. The
strains of C. albicans and C. tropicalis were obtained from dermatitis, otitis or from ears of
healthy dogs. The strains of C. guilliermondii and C. parapsilosis were isolated from human
blood. All the strains of Candida spp used in the present study were stored in potato agar with
DMSO (10%) at -20°C.
2.2. Identification and Phenotypical analysis
The identification of the strains of M. pachydermatis was done on the basis of macro-
and microscopic features as well as by physiological features, as described by Hoog et al. (2000),
Guéro et al. (1996) and Guillot et al. (1996). For the phenotypical characterization of the strains,
the esculine and catalase tests were taken into account as well as the production of the enzyme
urease, Tweens 40 (0,5% W/V), 80 (1% W/V), 20 (10% W/V), 60 (100% W/V) assimilation and
the capacity to grow in simple Sabourand agar at temperatures of 37° C and 40° C.
The identification of the Candida species was based on phenotypical features, such
as: a description of the macro and micromorphology, as well as through fermentation of
carbohydrates and auxanographic, in accordance with Hoog et al. (2000).
77
2.3. Susceptibility testing
Inoculum preparation for antifungal susceptibility tests
The susceptibility test for strains of M. pachydermatis was based in Gupta et al.
(2000). Stock inocula were prepared from four-day cultures grown on modified Dixon agar at 37º
C. Sabouraud broth (Micromed, Rio de Janeiro, Brazil) was added to the agar slant, and cultures
were gently swabbed to dislodge the blastoconidia. The blastoconidia suspension was transferred
to a sterile tube, and the volume adjusted to 2 mL with Sabouraud broth (Micromed, Rio de
Janeiro, Brazil). The suspensions were plated in modified Dixon agar to obtain the inoculum size
of approximately 1 x 10
4
CFU/mL in accordance to Gupat et al. (2000).
The minimum inhibitory concentrations (MIC) for Candida spp were determined by a
broth microdilution method according to the recommendations of the National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS; M27-A2) (NCCLS, 2002). C. parapsilosis ATCC 22019
was included as a quality control, in addition to some strains isolated from human (C.
guilliermondii-CEMM 01-4-044) and C. parapsilosis-CEMM 01-2-073; CEMM 01-2-092;
CEMM 01-4-043) were used. Only one drug was tested for each human strain, except to strain
CEMM 01-2-073, for which FLC and ITR were tested. A standardized inoculum (2.5 – 5 x 10
3
CFU/mL) was prepared by turbidimetry. Stock inocula were prepared from 2-day cultures grown
on potato dextrose agar at 28º C. Sterile normal saline (0.9%) was added to the agar slant, and
cultures were gently swabbed to dislodge the blastoconidia. The blastoconidia suspension was
transferred to a sterile tube, and the volume adjusted to 4 mL with sterile normal saline. The
resulting suspension was allowed to settle for 5 min at 28º C, and its density was read at 530nm
and adjusted to 95% transmittance. The suspensions were diluted to 1:100, and then for 1:20 with
RPMI 1640 medium with L-glutamine, without sodium bicarbonate (Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo.), buffered at pH 7.0 with 0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Mo), to obtain the inoculum size of approximately 2.5 – 5 x 10
3
CFU/mL.
78
Antifungal agents
Ketoconazole (KTC) and itraconazole (ITC) (Janssen Research Foundation, Beerse)
and amphotericin B (AMB) (Sigma, St. Louis, Mo.) were prepared in 100% dimethyl sulfoxide
(Merck, Darmstadt, Germany). Fluconazole (FLC) (Pfizer, Madrid, Spain) was prepared in
distilled water.
For the M. pachydermatis susceptibility test, the drugs were diluted in 1 mL of
Sabouraud broth (Micromed, Rio de Janeiro, Brazil) and 9 mL of melted Sabouraud agar
(Micromed, Rio de Janeiro, Brazil) was added to each diluted drug solution. Then, this medium
was poured into Petri dishes, resulting in the final test concentrations being ten times more
diluted. The concentrations ranges tested were from 0.0075 – 0.25 µg/mL for KTC and ITR;
0.015 – 16 µg/mL for AMB and 0.5 – 16 µg/mL for FLC.
For the Candida spp susceptibility analysis, the drugs were diluted in RPMI 1640
(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), and tested in a concentration range between 0.01 - 16
µg/mL for KTC, ITC and AMB. For FLC the range was 0.06 - 64 µg/mL.
In vitro susceptibility tests
Following the methodology used by Gupta et al. (2000), a hundred microlitres of the
M. pachydermatis suspension were inoculated on the surface of each plate with Sabouraud agar
medium plus the antifungal (Micromed, Rio de Janeiro, Brazil). Incubation was carried out in the
dark at 37 °C for seven days. A drug free positive growth control was set up for each strain. All
isolates were repeated at least twice. After seven days of incubation, the lowest drug
concentration of the plate showing no colony formation was recorded as the minimal fungicide
concentration (MFC).
The microdilution assay for Candida spp was performed in 96-well microdilution
plates. Growth and sterile control wells were included for each isolate tested. The microplates
were incubated at 37º C and were read visually after 2 days. All isolates were run in duplicate and
repeated at least twice. For azoles, MIC was determined as the lowest drug concentration,
showing 80% inhibition of control fungal growth. For AMB, MIC was considered to be the
79
lowest concentration of the drug at which there is no fungal growth, as recommended by
NCCLS-M27A2 (2002).
3. Results
All the 32 strains of M. pachydermatis analyzed had a micromorphology
characterized by oval blastoconidia with the presence of collarette (Figure 1.A), and a
macromorphology characterized by the presence of colonies with a yellow-cream coloration and
a dry glabose texture (Figure 1.B). Furthermore, all the strains were capable of growing in the
simple Sabourand agar at the temperatures of 37º C and 40º C. In the biochemical tests carried
out, of the 32 strains tested, 11 (34.4%) were negative for the production of the urease enzyme
(Figure 1.C). In the catalase test, 20 (62.5%) had negative results, whilst the rest were positive.
All the thirty-two stains were positive for the esculine test and assimilated the Tweens 80, 60 e
40, but they assimilated the Tween 20 weakly (Figure 1.D).
In terms of micromorphology, the five C. albicans presented terminal clamiconidia,
true hyphae, pseudohyphae and the blastoconidia with clusters along of the hyphae (Figure 2.A).
In biochemical tests, they were capable of fermenting the following carbohydrates: glucose,
maltose and galactose (Figure 2.B), in addition to assimilating glucose, sucrose, galactose,
trehalose, maltose and xylose. The test to check germ tube formation showed a positive result.
Three C. tropicalis strains showed in their microscopy analysis, pseudohyphae and blastoconidia
arranged in simple and ramified chains (Figure 2.C). They were capable of fermenting glucose,
galactose, trehalose and maltose. In the auxanographic, they were positive for glucose, galactose,
xylose, trehalose and maltose. None of the strains was capable of forming a germ tube. Strains of
both species had a similar macromorphology, with white glabose colonies (Figure 2.D); they
were also similar regarding nitrate assimilation, as none of them showed this capacity.
The minimal fungicide concentration (MFC) for the strains of M. pachydermatis
tested is shown on Table 1. All 32 strains of M. pachydermatis used had a MFC ≤ 0.0075 µg/mL
for ITR. Twenty-nine strains had the same MFC ≤ 0.0075 µg/mL for KTC and only 3 strains of
M. pachydermatis had MFC = 0.015 µg/mL for this drug. For FLC the results were as follows:
MFC JP/0)& JP/0)& JP/DQG0)& JP/IRUIRXUWHQHOHYHQ
and seven strains, respectively. For AMB, 4 strains had MFC = 0.125 µg/mL, 3 strains had MFC
80
= 0.25 µg/mL, 11 strains had MFC = 0.5 µg/mL, 4 strains had MFC = 1 µg/mL, 1 strain had
MFC = 2 µg/mL, 1 strain had MFC = 4 µg/mL and 8 strains had MFC = 8 µg/mL.
The MICs of the Candida species to drugs are shown in Table 2. The five strains of
C. albicans used had MIC > 16 µg/mL for KTC and ITC, and four of them had MIC over 64
µg/mL for FLC. Only one strain had MIC= 2 µg/mL for FLC. As for the three strains of C.
tropicalis, two had MIC > 16 µg/mL for KTC, ITC and MIC > 64 µg/mL for FLC. A single
strain of C. tropicalis had MIC= 2 µg/mL for FLC, MIC= 0.25 µg/mL for ITC and MIC = 0.03
µg/mL for KTC. Regarding AMB, three strains of C.albicans had MIC= 0.25 µg/mL and two
MIC= 0.5 µg/mL. For C. tropicalis the MICs of AMB were 0.5 µg/mL for one of the strains and
1 µg/mL for the remaining two. For the human strains, the C. parapsilosis had MIC DQG
MIC = 0.25 for KTC and MIC = 2 µg/mL for FLC and ITC. The strain of C. guilliermondii have
MIC = 0.5 for FLC.
4. Discussion
The most frequent fungal infections in animals are dermatophytosis, dermatomycosis
(caused by M. pachydermatis) and candidiasis (Machado et al., 2003; Moretti et al., 2004;
Brilhante et al., 2005). In addition to cutaneous lesions, Malassezia spp. has also been associated
with otitis (Girão et al., 2005) and corneal ulcers (Prado et al., 2004). Several reports have shown
that Candida spp are important pathogens in small animals, being related to urinary infections
(Ozawa et al., 2005), endophthalmitis (Linek, 2004), cutaneous lesions (Moretti et al., 2004) and
systemic infections (Brow et al., 2005)
Despite the importance of yeast infections in small animals, few studies give
information about their phenotypical and molecular features or the profile of their sensitivity to
antifungal drugs (Eichenberg et al., 2003; Moretti et al., 2004; Prado et al., 2004; Girão et al.,
2005).
The diagnosis of fungal infections in animals includes several strategies, such as
culture, cytopathology, histopathology and immunohistochemical staining (Brown et al., 2005).
In addition, strain characterization by phenotypical and molecular analysis adds important
information that may be related to pathogenicity, antifungal resistance and epidemiological
features.
81
According to Guillot et al. (1996), M. pachydermatis has been microscopy
characterized as small ovoid cells with a very broad base. Regarding the physiological and
biochemical properties, the catalase reaction is negative or very weak and in the Tweens
assimilation test, its growth is slightly inhibited by Tween 20. The species was able to grow at
high temperatures (up to 41°C).
Urease production is described as an important trait of M. pachydermatis strains by
different authors (Guého et al., 1996; Girão et al., 2004). In this study, the phenotypical features
of the M. pachydermatis strains agree with the species description given by Guillot et al. (1996),
except for the fact that 11 strains did not produce the urease enzyme under test conditions.
According to Girão et al. (2004), urease production is affected by the strain’s storage conditions.
The authors showed that 50% of M. pachydermatis strains tested became negative for the urease
test after 6 months storage in Dixon agar at -20°C. It is supposed that storing the strain in these
conditions may not be suitable to maintain M. pachydermatis phenotypical characteristics.
The phenotypical analysis of Candida spp. includes macro and micromorphological
features, as well as a biochemical profile based on the assimilation and fermentation of many
carbohydrate sources. In this study, the strains of C. albicans and C. tropicalis showed the
phenotypical characteristics that agree with those described by Hoog et al. (2000) and Sidrim &
Rocha (2004).
Over the last few years, effective antifungal drugs have been introduced into clinical
practice. Among them, azoles, such as itraconazole, fluconazole and more recently voriconazole,
albaconazole, sertaconazole and eberconazole, have been reported to have substantial, in vitro,
action against fungal pathogens (Brilhante et al., 2005). However, in Brazil, these new antifungal
drugs are not used routinely with small animals. In this study, only the most commonly used
drugs by veterinarians, like ketoconazole, itraconazole and fluconazole, were included for
susceptibility analysis. The amphotericin B was tested due to its known efficient action, in vitro
and in vivo, against several pathogenic fungi.
Since 1997, the NCCLS has standardized techniques for micro and macrodilution in
broth to test in vitro sensitivity of yeasts, so the technique of microdilution in broth has been used
efficiently to test in vitro sensitivity of yeasts from the Candida genus (Ming-Fang Cheng et al.,
2004). However, the aforementioned technique does not apply to the Malassezia species, and
despite the possibility of being used for M. pachydermatis, difficulties are found, such as the
82
standardization of the inoculum. Thus, various methodologies have been used to test the, in vitro,
sensibility of strains of Malassezia spp, as cited by Gupta et al. (2000), Eichenberg et al. (2003)
and Garau et al. (2003). The methodology adopted in the present study was described by Gupta et
al. (2000), who by using different solid mediums in their experiments, allowed the evaluation of
the sensitivity of different species of the genus Malassezia, in addition to being a technique that is
easy to carry out and reproduces well.
The 32 strains of M. pachydermatis used in this study were sensitive to the azole
antifungal agents tested; all the strains were more sensitive to KTC e ITC, with MFC
µg/mL and MFC = 0.015 µg/mL for KCT, and MFC µg/mL for ITC. This data
corroborates Gupta et al. (2000), who applied the same methodology to strains of Malassezia
isolated from humans, animals and ATCC strains, with MIC µg/mL for both drugs, in
95% of the 55 strains tested.
The MFC intervals found in this study for the azoles are within the values described
by Eichenberg et al. (2003), who found MICs varying from 0.015 to 0.25, 1.0 to 32.0, 0.007 to
0.125 µg/mL for KTC, FLC and ITC, respectively.
Other studies corroborate the results for sensitivity found in this study, such as Garau
et al. (2003) who described MIC = 4 µg/mL for FLC and MIC µg/mL for KTC and MIC
0.03 µg/mL for the majority of Malassezia strains tested for ITC. In addition, Velegraki et al.
(2004) cited MIC = 0.06 µg/mL, MIC = 16 µg/mL and MIC = 0.06 µg/mL for ITR, FLC and
KTC, respectively, against Malassezia spp.
Most strains (68.75%), used in this study, were sensitive to amphotericin B, with
MFC varying from 0.125 to 1 µg/mL. However, 31.25% of strains had quite high MFC values,
varying from 2 to 8 µg/mL. Similar results were described by Velegraki et al. (2004), who tested
strains of various species of Malassezia isolated from man and animal. They found high
sensitivity values (8 a 32 µg/mL).
In this study, in vitro analysis showed that some Candida spp. strains were resistant
to fluconazole, itraconazole and ketoconazole. Despite not being tested in this study, there a
several accounts of alterations in fungal strains that can make them more resistant to azoles
derivatives, such as mutation points in the gene ERG11, that codes the azole’s target enzyme, 14-
83
.-demethylase (Löeffler et al., 2000) and reduces the permeability of the membrane to azoles
(van Belkum et al., 1994). Another factor that can interfere with antifungal sensitivity is storing
the microorganism at low temperatures, which can lead to a reduced efficiency in protein
production, low fluidity of the cellular membrane, stabilization of the double helix or the
secondary structure of the DNA or RNA molecule, slow structural arrangement of proteins and a
decrease in enzyme activity (Graumann & Marahiel, 1996; Panoff et al., 1998). However, despite
the Candida spp strains being used in this study being stored at -20°C, before being used in the
experiments, it is unlikely that this storage resulted in the strain’s resistance to the azolic
derivatives used in the study, as the ATCC Candida strains have existed for years and have been
stored in various ways without suffering any alteration to their phenotypical or morphological
features, including antifungal sensitivity rates.
Ozawa et al. (2005) tested the sensitivity of a strain of C. tropicalis from a dog with
cystitis. The authors verified a low sensitivity of the strain to fluconazole, with MIC
50
and MIC
90
equal to 6.25 and 25 µg/mL, respectively.
Regarding AMB, Ming-Fang Cheng, et al. (2004), cite MICs of 0.25 to 2 µg/mL for
strains of C. tropicalis and C. albicans, this data is similar to that found in this study, where all
the strains of Candida were sensitive with MICs varying from 0.25 – 1.0 µg/mL.
Results of in vitro antifungal sensitivity tests are sometimes difficult or impossible to
correlate with
clinical treatment outcomes. However, the evaluation of susceptibility patterns to
antifungal drugs commonly used in clinics is important for surveillance and monitoring of
resistant strains. Although in vitro resistance had been detected in this study, the same antifungal
drugs showed excellent in vivo activity for the treatment of the infected dogs, as communicated
by the veterinarians.
5. Conclusion
The results obtained in this study did not evidence alterations in the classic
phenotypical features in Candida spp and M. pachydermatis strains isolated in dogs.
Nevertheless, it was demonstrated that unlike the stains of M. pachydermatis, which were all
sensitive, those of Candida spp had a high level of resistance to azoles antifungal agents.
84
Acknowledgements
The authors would like to thank the Specialized Medical Mycology Center (CEMM-
Federal University of Ceará, Brazil) for the material conditions to carry out this study and for the
excellence scientific guidance given.
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88
Tables
Table 1: Minimal Fungicide Concentration (MFC) of azoles and amphotericin B against M.
pachydermatis.
MFC µg/mL
M. pachydermatis
Ketoconazole
Itraconazole
Fluconazole
Amphotericin B
n=32
≤
0.0075 (29)
a
≤
0.0075 (32)
= 0.125 (4)
= 0.015 (3)
= 4 (10)
= 0.25 (3)
= 8 (11)
= 0.5 (11)
= 16 (7)
=1 (4)
=2 (1)
=4 (1)
=8 (8)
a
number of M. pachydermatis strains related to corresponding MFC.
Table 2: Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of ketoconazole, itraconazole,
fluconazole and amphotericin B against Candida spp
.
MIC (µg/mL)
Candida spp
n
Ketoconazole
Itraconazole
Fluconazole
Amphotericin B
C. tropicalis
3
>16 (2)
a
>16 (2)
>64 (2)
= 1 (2)
= 0.03 (1)
= 0.25 (1)
= 2 (1)
= 0.5 (1)
C. albicans
5
>16 (5)
>16 (5)
>64 (4)
= 0.25 (3)
= 2 (1)
= 0.5 (2)
C. guilliermondii
1
= 0.5 (1)
C. parapsilosis
3
≤
0.03 (1)
= 2(1)
b
= 2 (1)
b
= 0.25 (1)
a
Represents the number of strains of a species for the MIC indicated.
b
Strain CEMM 01-2-073, used as the control of ITC and FLC.
89
Figure legends
Figura 1: M. pachydermatis - A. oval blastoconidia with the presence of collarette; B. colonies;
C. positive and negative production of the enzyme urease; D. Tweens 40, 60, 80 positive
assimilation and Tween 20 negative a3598 0 Td(s)Tj0.024 Tc4.67969 0 Td(iti)Tj0 Tc10.0797 0 Td(v)Tj-0.168 Tc6 0 Td0.168 Tw(e )Tj-0.048 Tc5iTj0.024 Tc45.27969 0 Td(ti)Tj0 Tc6.71992 0 Td(v)Tj-0.048 Tc6835(ti0.072 Tc3.95977 0 T1992 0 Td(e-0.048 Tc5.3996110.6 0 Td(u)Tj-0.048 18.1199 0 T230 TTj0.05160 Td(r)Tj0 Tc5.27969 0 Td0.72 Tw(a 1)Tj-0.036 Tc15.7199 0 Td(:)Tj0 Tc/R22 12 Tf3.96133 0 Td( )Tj-0.036 Tc/R29 12 Tf3.7.Tc9.7192c6 0 Td3.288 2.048 Tc9.47)Tj-0.048 Tc18.7199 0 Td7j0 Tc8.63984 0 11992 0 Td(T)Tj10 100 Tc8Tc5.27969 0 Td0.696 Tw(l )Tj-0.12 Tc7.07969 0 Td Td(n)Tj0.048 Tc9.47m.024 Tc/R9 12 12d(e)Tj0.132 Tc2 0 Td(e)Tj8e-0.Tc4.67969 0 1(e)Tj0.024 Tc5.20.012 Tc5.2790.012 Tc6.110 Td( )Tj9 Td(d)Tj0.024 Tc6 06.71992 0 Td3.12 Tw(on o)Tj-0.036 Tph0.012 Tc5.271 Tc5.27969 0j-0.096 Tc4.68203 6 0 Td(r)Tjd0.048 Tw(e ac5.2790.012 Tc6.18s)Tj9.7y71992 0 Td(c)Tjh)Tj-0.0-0.56c4.680867969 0 Td(ij0 Tc3.357.Tc9.7. i)Tj0 Tc6.71.27048 Tc9.47969 0j-0.096 Tc4.68203969 0 Td(t)Tj0 Tc6.71992 0 Td0.72 Tw(h )Tj0.048 Tc3.35977 0 Td(e)Tja( 60, 80 po)T1024 Tc/R9 12 0 11992 0 1992 0 Td(A)Tf3 0 Td7.77
90
$
%
'
Figura 2: A.
micromorphology
C. albicans
;
B.
fermentation of
carbohydrates;
C.
micromorphology
C. tropicalis
;
D.
macromorphology
Candida
spp.
(Brito, 2005)
&
91
Ficha de Identificação de leveduras
N°_______/ID:_______
Identificação da amostra
Nome do paciente:__________________________________Idade:_______________
Espécime clínico:_______________________________Data da coleta:____________
Dados clínicos relevantes:________________________________________________
Aspectos macromorfológicos
- Textura da colônia:
( )glabrosa seca ( )glabrosa úmida ( ) glabrosa mucóide
- Relevo da colônia:
( ) sem relevo ( ) cerebriforme
- Presença de pigmento:
( ) pos ( ) neg ( )difusível ( ) não difusível
- Cor:_____________________________
Características fenotípicas gerais
- Produção de tubo germinativo: ( ) Pos ( )Neg
- Presença de cápsula: ( ) Pos ( )Neg
- Produção da enzima urease: ( ) Pos ( )Neg
- Assimilação de glicina: ( ) Pos ( )Neg
- Coloração no CHROMagar Candida:__________________________
Aspectos micromorfológicos
Estrutura
0
1 - 5
5 - 10
>10
Clamidoconídio terminal
Clamidoconédio intercalar
Pseudo-hifa
Hifa
Blastoconídio
Artroconídio
Célula gigante
Apressório
Sarcina
92
Auxonograma
Zimograma
Açúcar
24 h
48 h
5 dias
10 dias
14 dias
neg
Dextrose
Sacarose
Lactose
Galactose
Trealose
Maltose
Assimilação de Nitrato: ( ) Pos ( ) Neg
Produção de Ascos
- Morfologia dos ascos e ascosporos: ( ) Elipsóides a reniformes
( ) Subglobosos ou em chapéu
( ) Globosos
Estoque
Laudo final:____________________________Data do término da identificação:_____________
N° da coleção:__________________________Data de estoque:___________________________
Estocado por:___________________________
Formas de estoque: ( ) ágar batata a – 20°C com glicerol
( ) solução salina com óleo mineral em temperatura ambiente
( ) Outras:_______________________________________
Açúcar
após 24 horas
após 48 horas
Negativo
Dextrose
Sacarose
Lactose
Galactose
Trealose
Maltose
Xilose
Celobiose
Rafinose
Dulcitol
Inositol
Melibiose
Inulina
Ramnose
L - Arabnose
93
1. MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS
(Sidrim & Rocha, 2004)
1.1. Ágar batata
Objetivo:
Utilizado para microcultivo de fungos filamentosos e estocagem de cepas fúngicas.
Composição:
Infusão de batatas 500 mL
Dextrose 10g
Ágar bacteriológico 15g
Água destilada 1000 mL
Preparo:
Cozinhar 250g de batata inglesa descascadas em 500 mL de água destilada por 1 hora. Filtrar a
infusão de batatas através de gaze. Restituir o volume inicial de água (500 mL) e acrescentar 500
mL de água destilada. Adicionar o ágar e a dextrose. Autoclavar o meio por 15 minutos a 121°C.
Em seguida, distribuir alíquotas de 4 mL em tubos de ensaio. Deixar solidificar na posição
inclinada.
1.2. ÁGAR ESCULINA
Objetivo:
Possibilita diagnóstico diferencial entre várias espécies de Malassezia sp.
Composição:
Esculina 1g
Citrato férrico 0,5g
Ágar bacteriológico 16g
BHI caldo 25g
Água destilada 1000mL
94
Preparo:
Dissolver todos os componentes sob aquecimento. Esterilizar a 121 °C por 15 minutos. Distribuir
alíquotas de 1,5 mL em tubos de ensaio esterilizados. Deixar solidificar na posição inclinada.
Acondicionar sob refrigeração até o momento do uso.
1.3. ÁGAR FUBÁ (CONR-MEAL) COM TWEEN 80
Objetivo:
Utilizado para realização de microcultivo de levedura, pois estimula a formação de pseudo-hifas
nas diferentes espécies de Candida, além de estimular a produção de clamidoconídios,
característicos de C. albicans.
Composição:
Fubá de milho 40g
Ágar bacteriológico 20g
Tween 80 12 mL
Água destilada 1000 mL
Preparo:
Dissolver o fubá de milho em 500 mL de água, fervendo em banho-maria por 40 minutos;
restituir o volume de água inicial. Deixar esfriar e filtrar através de gaze e algodão. Em um
recipiente separado, dissolver o ágar nos 500 mL de água restantes. Juntar o ágar dissolvido com
o fubá e acrescentar o Tween 80. Homogeinizar. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Distribuir
em placas de Petri.
1.4. ÁGAR SABOURAUD
Objetivo:
Principal meio de cultura usado em micologia. Utiliza-se para cultivo primário geral dos fungos
(leveduras, filamentosos e alguns dimórficos). Pode ser utilizado para identificação da espécie
Malassezia pachydermatis, visto que é um meio não rico em lipídios.
95
Composição:
Peptona 10g
Dextrose 20g
Ágar bacteriológico 20g
Água destilada 1000mL
Preparo:
Dissolver ágar, peptona e dextrose em água destilada, aquecendo em banho-maria. Autoclavar a
121°C por 15 minutos. Distribuir alíquotas de 4 mL em tubos de ensaio. Deixar solidificar na
posição inclinada com o objetivo de obter uma superfície de 6 cm.
1.5. MEIO PARA ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS
Objetivo:
Analisar a capacidade da levedura de assimilar diferentes carboidratos.
Composição:
- Meio basal:
Ágar bacteriológico 20g
Água destilada 1000 mL
- Solução estoque de Yeast Nitrogen base:
Yeast Nitrogen base (Difco) 6,7g
Água destilada 100 mL
Preparo:
- Meio basal:
Dissolver o ágar em água destilada, aquecendo-o em banho-maria. Autoclavar a 121°C por 15
minutos. Distribuir alíquotas de 40 mL.
- Solução estoque de Yeast Nitrogen base (YNB):
96
Dissolver o YNB em 100 mL de água destilada e deionizada. Esterilizar por filtração. Distribuir
alíquotas de 10 mL e estocar na geladeira em frasco de cor âmbar.
Preparo final do meio:
Para cada alíquota do meio basal, acresce
i
97
Etanol a 95% 1,8 mL
Preparo:
Dissolver o extrato de levedura e a peptona em água destilada. Separadamente, dissolver
completamente o azul de bromotimol em etanol. Adicionar a solução de azul a mistura inicial e
homogeinizar. Distribuir 3 mL do meio em tubos de ensaio contendo um tubo de Durhan
invertido. Autoclavar a 121°C por 15 minutos. Deixar esfriar. Adicionar a cada tubo de ensaio,
contendo o meio para fermentação, 1,5 mL de uma das soluções de açucares utilizando pipetas
estéreis. Homogeinezar. Conservar em 4°C por até um mês.
1.8. MEIO DE DIXON MODIFICADO
Objetivo:
Utilizado para o isolamento primário de espécies de Malassezia sp.
Composição:
Extrato de malte 36g
Peptona 6g
Bile dessecada 20g
Tween 40 10 mL
Ácido oléico 2 mL
Glicerol 2 mL
Ágar bacteriológico 12g
Cloranfenicol 0,05g
Cicloeximida 0,05g
Água destilada 1000 mL
Preparo:
Dissolver o extrato de malte, a peptona, a bile dessecada, o ágar, o cloranfenicol e a cicloeximida
em água destilada sob aquecimento. Adicionar o Tween 40, o ácido oléico e o glicerol.
98
Homogeinizar e ajustar o pH final para 6.0. Autoclavar por 15 minutos a 121°C. Distribuir
alíquotas de 4 mL em tubos de ensaio. Deixar solidificar na posição inclinada.
1.9. URÉIA RÁPIDA EM CALDO
Objetivo:
É utilizada para diferenciar, rapidamente, as leveduras pertencentes aos filos Ascomycotina (por
ex. Candida spp) e Basidiomycotina (por ex. Malassezia spp).
Composição:
Extrato de levedura 0,1g
Fosfato de potássio monobásico 0,091g
Fosfato dissódico 0,095g
Uréia 20g
Vermelho fenol 0,01g
Água destilada 1000mL
Preparo:
Colocar o extrato de levedura em 5 mL de água destilada. Fazer o mesmo com o fosfato de
potássio monobásico e o vermelho fenol. Dissolver a uréia em água destilada. Misturar todas as
soluções e completar o volume com água destilada até 1000mL. Ajustar o pH para 6.9. Esterilizar
por filtração. Distribuir alíquotas de 0,5 mL em tubos de ensaio estéreis.
2. RPMI – MOPS (Sidrim & Rocha, 2004)
Objetivo:
Meio de cultura padronizado pelo NCCLS, para execução de testes de susceptibilidade a
antifúngicos, através da técnica de microdiluição em caldo.
Composição:
RPMI 1640 10,5g
(com glutamina e sem bicarbonato de sódio)
MOPS 34,5g
99
Cloranfenicol 0,5g
Água destilada 1000mL
Preparo:
Dissolver os componentes em água destilada. Ajustar o pH final para 7,0 (com solução de
hidróxido de sódio 10 N). Homogeinizar e esterilizar o meio por filtração. Manter até o momento
do uso sob refrigeração.
100
101
1. MAPA DE LEITURA DO TESTE DE ASSIMILAÇÃO DE CARBOIDRATOS:
Ponto de orientação da
placa
Celobiose
Sacarose
Trealose
Xilose
Lactose
Ramnose
Dextrose
Rafinose
Dulcitol
Melibiose
Maltose
L-Arabinose
Galactose
Inositol
Inulina
CEMM - Centro Especializado em Micologia Médica
102
2. MAPA DE LEITURA DO TESTE DE ASSIMILAÇÃO DE NITROGÊNIO
Ponto de orientação da
placa
KNO
3
Peptona
CEMM - Centro Especializado em Micologia Médica
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