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Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Edilson Soares Lopes Júnior
COLHEITA, CRIOPRESERVAÇÃO E
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES OVINOS DA
RAÇA MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA)
EM UM PROGRAMA DE PRESERVAÇÃO
Fortaleza – Ceará
Dezembro – 2005
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2
L864c Lopes Júnior, Edilson Soares
Colheita, criopreservação e transferência de embriões
ovinos da raça Morada Nova (variedade branca) em um
programa de preservação / Edilson Soares Lopes Júnior.__
Fortaleza, 2005.
142p.
Orientador: Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas
Tese (Doutorado Acadêmico em Ciências Veterinárias)
– Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Ovino. 2. Transferência de embriões. I. Universidade
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.3
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3
Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Edilson Soares Lopes Júnior
COLHEITA, CRIOPRESERVAÇÃO E
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES OVINOS DA
RAÇA MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA)
EM UM PROGRAMA DE PRESERVAÇÃO
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em
Ciências Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade
de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do grau de
Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo
Freitas.
Fortaleza – Ceará
Dezembro – 2005
4
Universidade Estadual do Ceará
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do trabalho:
Colheita, criopreservação e transferência de embriões ovinos da
raça Morada Nova (variedade branca) em um programa de
preservação
Autor:
Edilson Soares Lopes Júnior
Defesa em: 14/12/2005 Conceito obtido: _____________
Nota obtida: ________________
Banca Examinadora:
____________________________________
Vicente José de Figueirêdo Freitas, Prof. Dr.
Orientador
_____________________________________ _____________________________
Arturo Bernardo Selaive Villarroel, Prof. Dr. Davide Rondina, Prof. Dr.
Examinador / Co-orientador
Examinador / Co-orientador
_____________________________ _____________________________________
Aurino Alves Simplício, Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira, Prof. Dr.
Examinador Examinador
____________________________________
Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Profa. Dra.
Examinadora
5
Aos estudantes de iniciação científica,
minha razão de existir, enquanto
profissional de ensino e pesquisa,
Dedico.
6
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me dar força e perseverança para alcançar meus objetivos na
estrada difícil e tortuosa da vida.
À minha mãe, Maria de Lourdes Costa Lopes, por me manter
economicamente e sempre me mostrar que, embora na rua eu ainda tenha pessoas que
me queiram mal, eu sempre vou ter o seu colo pra chorar e recarregar as minhas
forças, me concedendo, ainda a oportunidade de ver meus desafetos tombarem na
minha frente, mesmo sem mover uma palha pra que isso aconteça.
A meu pai, Edilson Soares nha
7
Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira, pelas sugestões realizadas
durante o experimento e pela oportunidade de trabalhar com um de seus estudantes de
mestrado, por ocasião das ultra-sonografias das receptoras de embriões, visando o
diagnóstico de gestação das mesmas.
Ao Dr. Aurino Alves Simplício, pelas sugestões realizadas tanto durante o
experimento, como na tese, bem como pela constante orientação profissional, a qual
decorre de 1999, por ocasião de meu estágio supervisionado na EMBRAPA-CNPC, e
continua até hoje, indicando as possíveis possibilidades dentro do meio acadêmico-
científico.
À Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pelas sugestões realizadas na
tese.
À Dra. Alfa Maria Gurgel de Almeida do Laboratório Clementino Fraga,
pelas dosagens de progesterona realizadas de forma eficiente.
A todos os pesquisadores, professores e funcionários do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
execução do meu curso de doutorado.
Ao funcionário e amigo Selmar Alves da Silva, pelo rotineiro e importante
trabalho de manejo e observação dos animais experimentais.
Ao funcionário e amigo Antônio César Camelo, por ser, pra mim, um
exemplo de trabalhador, procurando, de forma incansável, algo pra colaborar, bem
como por me fazer sorrir, mesmo nos momentos mais tempestuosos.
Aos funcionários do Setor de Transportes da Universidade Estadual do
Ceará, pela concessão de veículos para transportar os animais experimentais.
Aos estudantes de graduação do curso de Zootecnia, bem comei2 0.8398 0 Td(c)T(c)Tj0 Tc5.51992 0 Td(o)Tj-0.04272 Tc6.11992 0 Td(m)Tj0 Tc9.47969 0 Td56 Tc6d(i2 0.8398 0 Td(c)T(c4 Tc4.67969 0 Td(s)Tj0.07728 Tc56 Tw(e )Tj-0.12 Tc9 0 8 Tc3.35977 0 Td(r)TC.08544 Tc1[969 0 Td(s)Tj0.6xã7969 0 e572 Tc4 Tw(o )Tj-0.03Tc-04(s)Tj0.0772Tc4.08008 0 Tdj0 Tc7.43983.47969 0 Td(c)Tj-0.1.83984 0 Td(e)Tj0.07728 Tc5.4 0 Td(t)Tj-0.12 T992 0 Td(í)Tj0.00408 Tc3.35977 0 Td(m)Tj0.08544 Tcd Tc4.8 0 Td(t)T0 Tc3.359776.11992 0 Td(e)Tj0.03864 Tc5.4 0 56 Tc6.1199Tc4.8 0 0 Td(s)T 0 Td0.702.06 Tw(o )Tj0.03456 Tc12.2398 0 Td(t)Tj-0.03456 Tc3.6 0 Td(u)Tj-0.04272 Tc6.11992 0 Td(f)Tj0 Tc3.95c6.47969 0 Td(o)Tj0.864 Tc5.4 0 Td0.02136 Tw(s )Tj0 Tc7.919924 Tw(o )Tj-0.0-992 0 Td(f04(s)Tj0.077C2 0 Td(í)Tj0.6 0 Td-0.09877 0 Td(m)Tj0.08544 Tc92 0 Td2.46 Tw(o )Tj0 Tc11.4 0 Td(Td(e)Tj0.00408 Tc5.4 0 Td(r)Tj-0.04272 Tc4.0767969 0 Td(s)Tj0.07.07969 0 Td(i)Tj0.12 Tc3.35977 0 Td0.54 Tw(o )Tj-0.0345)Tj-0.162 )Tj0 Tc11O( )Tj0.04272 Tc-322.58 Tc5.4 0 Td(r)Tj0 Tc4.07969 0 Td(r)Tj-0.04272 Tc408 Tc6 0 Td(r)j0 Tc3.95977 0 Td do )Tj-0.03456 Tc25.5977 0 Td(e)Tj0 Tc5l Tc5.4 0 Td(r))Tj0.07728 Tcc5.4 0 Td(s)Tj-0.0427256 Tw(a )Tj0.0d(c)Tj0 Tc5.4 0 Tdr ii
uda
8
Aos funcionários da Fazenda-Escola Vale do Curu, situada em Pentecoste,
pelo transporte, alojamento, refeições e ajuda nos centros de manejo.
Ao colega Maico Henrique Barbosa dos Santos, pela execução dos
diagnósticos de gestação da e
9
Suely Reanata Gaya Avelar, pelas, essenciais, lealdade e credibilidade. Estas pessoas
nunca deixaram de crer em mim, como profissional e, acima de tudo, como ser
humano, fechando os ouvidos pra todas as injúrias, difamações e calúnias declaradas
sobre mim.
Aos amigos Iracelma Julião de Arruda, Aline Lima de Sousa e Anderson
Pinto Almeida, pela ajuda no experimento, parceria e ensinamentos passados, me
mostrando que a gente sempre tem o que aprender um com o outro.
Ao amigo italiano Giaime Niccolai pela importante ajuda no experimento,
pela constante vontade de aprender, pelo bom humor ao trabalhar, pelo
companheirismo e por constituir-se num grande amigo nos momentos adversos.
À menina luz Janaína Bittencourt Loos, por me guiar nos momentos mais
difíceis.
Aos(às) colegas Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro, Roberto Maia Matos,
Daniel Holanda Soares, João Davi Araújo da Silva, Francisco Carlos de Sousa e
Isadora Machado Teixeira Lima, pelo apoio extremamente eficiente e importante
no desempenho das minhas funções como colaborador do Setor de Caprino e
Ovinocultura da Universidade Estadual do Ceará e como membro do Laboratório
de Fisiologia e Controle da Reprodução.
Ao amigo e caprinocultor Tufy Said, proprietário do Capril do Said, pela
credibilidade confiada ao Médico Veterinário Edilson Soares Lopes Júnior.
Aos amigos e colaboradores Marcílio e Maurício Chaves, proprietários do
Capril do Estácio, pela confiança e credibilidade confiada ao Médico Veterinário
Edilson Soares Lopes Júnior, consultando a nossa equipe, a cada passo dado, bem
como colaborando com o Setor de Caprino e Ovinocultura da UECE em diversos
aspectos, não esperando nada em troca.
10
RESUMO
A fim de verificar as variáveis envolvidas na produção in vivo de embriões de
ovinos Morada Nova (variedade branca) e posterior transferência dos embriões congelados-
descongelados, 25 ovelhas adultas foram utilizadas Td.08832 Tc4.Tw( )Tj0.03568 Tc5.51992 (a)Tj0Td(d)Tj2u
11
ABSTRACT
In order to verify the variables linked to in vivo embryo production and transfer of
frozen-thawed embryos in Morada Nova (variety white) sheep breed, twenty-five adult ewes
were used as embryo donors and 14 crossbred ewes as embryo recipients. After estrus
synchronization and superovulatory treatments, donors were subjected to embryo recovery by
laparotomy. Frozen embryos by classic freezing were thawed in ETG or in sucrose (SUC).
After estrus synchronization, embryo recipients were subjected to embryo transfer that it was
performed by semi-laparoscopy. Pregnancy was diagnosed 30 days after embryo transfer by
ultrasound. Considering ovulation rate, recovered and fertilized structures, it was verified that
young embryo donors (≤ 2 anos) presented better results than old ones (> 3 anos). Simple and
multifactor linear regression analysis showed that ovulation rate and number of recovered
embryos are the most important variables predicting the number of embryos to be frozen.
ETG group showed higher embryo survival and fertility rate than compared to SUC group. In
conclusion, preserving of Morada Nova (variety white) ewes can be performed using multiple
ovulation and embryo transfer with age of embryo donor, ovulation rate and the number of
recovered embryos influencing in the success of procedure. In addition, embryos might be
thawed in ETG before to be transferred to recipients.
12
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e/ou símbolos.............................................................................. 14
Lista de figuras e tabelas .............................................................................................. 17
Introdução .................................................................................................................... 20
Capítulo 1: Revisão de Literatura................................................................................. 22
1.1. Caracterização da raça Morada Nova ........................................................... 23
1.2. Uso de tecnologias reprodutivas na preservação de rebanhos nativos.......... 25
1.3. Produção
in vivo
de embriões........................................................................ 27
1.3.1. Sincronização do estro ........................................................................ 27
1.3.2. Superovulação ..................................................................................... 28
1.3.3. Fecundação ......................................................................................... 30
1.3.4. Colheita de embriões........................................................................... 31
1.3.5. Avaliação e classificação dos embriões............................................... 38
1.3.6. Criopreservação de embriões............................................................... 41
1.3.7. Inovulação............................................................................................ 49
Justificativa .................................................................................................................. 51
Hipótese Científica ....................................................................................................... 52
Objetivos....................................................................................................................... 53
Geral .................................................................................................................... 53
Específicos ........................................................................................................... 53
Capítulo 2: Efeito da idade da doadora sobre a produção embrionária em ovelhas
Morada Nova (variedade branca) participando de um programa de conservação
no Brasil............................................................................................................... 54
2.1. Material e métodos........................................................................................ 55
2.2. Resultados..................................................................................................... 57
2.3. Discussão....................................................................................................... 62
2.4. Conclusões..................................................................................................... 65
2.5. Referências bibliográficas............................................................................. 65
13
Capítulo 3: Perfis de progesterona, taxa de ovulação, produção de embriões e
sobrevivência, após inovulação em receptoras, de embriões da raça Morada
Nova (variedade branca)...................................................................................... 69
3.1. Material e métodos........................................................................................ 70
3.2. Resultados..................................................................................................... 74
3.3. Discussão....................................................................................................... 80
3.4. Conclusões..................................................................................................... 86
3.5. Referências bibliográficas............................................................................. 86
Discussão geral .............................................................................................................91
Conclusões gerais .........................................................................................................94
Perspectivas .................................................................................................................. 94
Referências bibliográficas............................................................................................. 95
Anexos........................................................................................................................ 111
14
LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SÍMBOLOS
•
ANOVA = Análise de Variância
•
ARCO = Associação Brasileira de Criadores de Ovinos
•
Be = Blastocisto eclodido
•
Bi = Blastocisto inicial
•
Bl = Blastocisto
•
Bn = Blastocisto em eclosão
•
BSA = Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina)
•
Bx = Blastocisto expandido
•
1 C = 1 célula
•
2 C = 2 células
•
4 C = 4 células
•
8 C = 8 células
•
CaCl
2
= Cloreto de cálcio
•
CENARGEN = Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e
Biotecnologia
•
CIDR = Controlled Internal Device Release (Dispositivo Interno de Liberação
Controlada)
•
CLs = Corpos lúteos
•
DMSO = Dimetil-sulfóxido
•
dp = desvio padrão
•
DPBS = Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Solução Salina Fosfato-
Tamponada de Dulbecco)
•
eCG = Equine Chorionic Gonadotrophin (Gonadotrofina Coriônica Eqüina)
•
EMBRAPA = Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
•
ep = erro padrão
•
EPV = espaço perivitelínico
•
et al.
= e outros (e colaboradores)
•
ETG = etilenoglicol
15
•
F = fecundação
•
FGA = fluorogestone acetate (acetato de fluorogestona)
•
FSH = Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)
•
G = gravidade
•
g = gramas
•
GnRH = Gonadotrophin Releasing Hormone (Hormônio Liberador de
Gonadotrofina)
•
h = hora
•
H
2
O = água
•
I = Implantação
•
IBGE = Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
•
IEP = Intervalo entre-partos
•
KCl = Cloreto de potássio
•
kg = kilograma
•
K
2
HPO
4
= Fosfato de Potássio Dibásico
•
LFCR = Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
•
LH = Luteinyzing hormone
•
MAP = Medroxiprogesterone acetate (acetato de medroxiprogesterona)
•
Mi = mórula inicial
•
min = minutos
•
Mc = mórula compacta
•
MgCl
2
= Cloreto de magnésio
•
MHz = megahertz
•
mm
= milímetro
•
mg = miligramas
•
mL = mililitro
•
M = Mórula
•
M = Molar
•
MOTE = Múltipla Ovulação e Transferência de Embriões
•
n = número
16
•
NaCl = cloreto de sódio
•
Na
2
HPO4 = Fosfato de sódio dibásico
•
ng = nanogramas
•
NRC = National Research Council (Conselho Nacional de Pesquisa)
•
O = oócito
•
OPS = Palheta Estreita e Aberta
•
Ov = ovário
•
P = probabilidade
•
PBS = Phosphate Buffered Saline (Solução Salina Fosfato-Tamponada)
•
pFSH = Porcine Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo-Estimulante
Suíno)
•
PGE
1
= Prostaglandina E
1
•
PGF
2
α
= Prostaglandina F
2
α
•
PN = pró-nuclear
•
PV = peso vivo
•
r = coeficiente de correlação
•
RE – IE = retirada da esponja e início do estro
•
RPCL = regressão prematura de corpo lúteo
•
rpm = rotações por minuto
•
SAC = sacarose
•
SAS = Statistical Analysis System
•
SE = sem estro
•
SEM = standard error mean (erro padrão da média)
•
TCM-199 = tissue culture medium 199 (meio de cultivo tecidual 199)
•
TRA = Tecnologias reprodutivas assistidas
•
U = útero
•
µ
g = microgramas
•
UI = unidades internacionais
•
µ
L = microlitros
•
vs = versus
17
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Lista de Figuras
•
Figura 1 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade vermelha)........ 24
•
Figura 2 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade branca)............ 25
•
Figura 3 – Diferentes estruturas encontradas no trato genital de cabras e ovelhas
entre a ovulação e a implantação. (Ov = ovário, O = oócito, F = fertilização,
PN = pré-nuclear, 1 C = 1 célula, 2 C = 2 células, 4 C = 4 células,
8 C = 8 células, M = Mórula, Bl = Blastocisto, I = Implantação,
U = útero)........................................................................................................... 34
•
Figura 4 – Disposição dos instrumentos para a colheita de embriões por
laparoscopia em pequenos ruminantes............................................................... 36
•
Figura 5 – Distribuição da ocorrência de estro em ovelhas Morada Nova
(variedade branca) submetidas a um tratamento superovulatório.
(SE: sem estro)................................................................................................... 59
•
Figura 6 – Estruturas recuperadas de ovelhas Morada Nova (variedade branca),
submetidas a tratamento superovulatório: (A) não-fecundadas, a um aumento
de 400 X; (B) zona pelúcida rompida, a um aumento de 200 X; (C) mórula, a
um aumento de 400 X; (D) vários embriões de boa qualidade recuperados de
uma única doadora a um aumento de 400 X. Fotografias realizadas em
microscópio invertido equipado com contraste de modulação de Hoffman...... 61
•
Figura 7 – Relação entre os perfis de progesterona (P
4
) de ovelhas
superovuladas e o número de corpos lúteos funcionais no dia da colheita de
embriões............................................................................................................. 77
•
Figura 8 – Relação entre número de bons embriões de ovelhas superovuladas
e o número de corpos lúteos funcionais no dia da colheita de embriões........... 77
•
Figura 9 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro
(RE-IE) de ovelhas superovuladas e o número de corpos lúteos funcionais
no dia da colheita de embriões........................................................................... 78
18
•
Figura 10 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro
(RE-IE) de ovelhas superovuladas e a concentração de progesterona (P
4
)
no dia da colheita de embriões........................................................................... 78
•
Figura 11 – Relação entre os perfis de progesterona (P
4
) de receptoras
ovinas e o número de corpos lúteos funcionais no dia da transferência de
embriões............................................................................................................. 80
Lista de Tabelas
•
Tabela 1 – Meio de colheita e conservação de embriões (solução Salina
Fosfato Tamponada – PBS)............................................................................... 33
•
Tabela 2 – Efeito da repetição da colheita de embriões por laparotomia
sobre a taxa de recuperação embrionária........................................................... 35
•
Tabela 3 – Taxa de recuperação embrionária após colheitas sucessivas de
embriões por laparoscopia................................................................................. 37
•
Tabela 4 – Estádios embrionários e suas respectivas características................. 39
•
Tabela 5 – Qualidade embrionária e suas respectivas características................ 40
•
Tabela 6 – Resposta estral e ovulatória de ovelhas Morada Nova
(variedade branca) submetidas a um tratamento superovulatório...................... 58
•
Tabela 7 – Taxas de ovulação e de regressão prematura de corpo lúteo
(RPCL) de ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento
superovulatório................................................................................................... 60
•
Tabela 8 – Taxas de recuperação e de fecundação de estruturas do lavado
uterino em ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento
superovulatório................................................................................................... 61
•
Tabela 9 – Resposta ovariana, concentração plasmática de progesterona (P
4
)
de ovelhas Morada Nova (variedade branca) sem RPCL, no dia da colheita de
embriões, bem como momento e duração do estro............................................ 75
•
Tabela 10 – Taxas de recuperação e de fecundação, em ovelhas
Morada Nova (variedade branca) superovuladas sem RPCL............................ 75
19
•
Tabela 11 – Qualidade de embriões colhidos de ovelhas Morada Nova
(variedade branca) superovuladas...................................................................... 76
•
Tabela 12 – Coeficientes de correlação múltipla, utilizando o número
de embriões colhidos (EMB) e a taxa de ovulação (TO) para
prever o número de bons embriões (BONS) em ovelhas superovuladas
da raça Morada Nova (variedade branca).......................................................... 79
•
Tabela 13 – Taxas de gestação e de parição, número de crias nascidas e
sobrevivência embrionária em ovelhas mestiças submetidas à transferência de
embriões............................................................................................................. 80
20
Introdução
A espécie ovina vem ganhando cada vez mais destaque na agropecuária
mundial, destacando-se, sobretudo, na produção de carne e pele, deixando, já algum
tempo, de constituir-se numa criação de subsistência.
No tocante ao rebanho ovino brasileiro, este consiste de, aproximadamente,
14 milhões de animais com, aproximadamente, 56% deles explorados na região
Nordeste (IBGE, 2002). Além de destacar-se pelo seu efetivo, o rebanho ovino
explorado no Nordeste assume grande importância como uma fonte alternativa de
produção de proteína de elevado valor biológico. O rebanho ovino explorado nesta
região é composto, em grande parte, por raças ovinas formadas a partir da adaptação e
seleção natural de raças européias que foram trazidas para o Brasil na época da
colonização.
Geralmente, os ovinos nativos do Nordeste do Brasil são de pequeno porte,
porém, eficientes em termos de adaptação, fertilidade, sobrevivência e resistência às
doenças infecciosas e parasitárias. Os mesmos, até o momento, receberam pouca
atenção no tocante ao melhoramento genético, não sendo, portanto, especializados na
produção de carne ou de leite.
Desta forma, raças prolíficas estão, gradativamente, substituindo raças
locais as quais estão sendo consideradas sob risco de extinção. Todavia, uma raça
utilizada em um sistema de baixa produção não é, necessariamente, menos
economicamente produtiva que outra, utilizada em um sistema de alta produtividade
(Gandini & Oldenbroek, 1999). Além disso, as condições de mercado e os sistemas de
preço podem mudar de forma, relativamente, tão rápida que características
consideradas de alto valor econômico hoje podem apresentar um baixo valor no futuro
(Ruane, 2000).
Uma das mais importantes raças ovinas exploradas no Nordeste do Brasil é
a Morada Nova, a qual pode ser encontrada nas variedades vermelha e branca. Esta
raça é caracterizada por apresentar uma alta prolificidade, quando comparada às
demais raças ovinas existentes nesta região brasileira (Rajab
et al
., 1992). Contudo,
assim como as demais raças locais, a Morada Nova (variedade branca) está em real
21
risco de extinção e o seu desaparecimento, provavelmente, acarretará na definitiva
perda de características relevantes associadas à adaptabilidade às condições adversas.
Em pequenos ruminantes, a múltipla ovulação e transferência de embriões
(MOTE) é uma ferramenta não somente para o aumento da taxa reprodutiva de
doadoras selecionadas (Cognié, 1999), no controle sanitário e no intercâmbio de
germoplasma (Thibier & Guérin, 2000), mas também para a preservação de raças
nativas em risco de extinção (Solti
et al.
, 2000).
Recentemente, na região Nordeste do Brasil, instituições governamentais de
pesquisa e de ensino iniciaram um programa de conservação da raça Morada Nova
(variedade branca) utilizando a MOTE. Contudo, a resposta das doadoras de embriões
de várias raças ovinas é extremamente variável e, desta forma, vários fatores, dentre
eles a idade das doadoras (Alabart
et al.
, 2003), parecem ser responsáveis por essa
variabilidade. Além disso, informações sobre a produção embrionária de raças ovinas
locais exploradas no Nordeste do Brasil são escassas (Cordeiro
et al.
, 2003).
22
CAPÍTULO 1
REVISÃO DE LITERATURA
23
1.1. Caracterização da raça Morada Nova
Os ovinos da raça Morada Nova constituem-se numa das principais raças
nativas de ovinos deslanados do Nordeste do Brasil, sendo explorados para carne e
pele, as quais são altamente apreciadas nos mercados nacional e internacional. Por
serem animais de pequeno porte e bem adaptados às condições climáticas do semi-
árido, são importantes, particularmente, nas pequenas e médias propriedades, onde
constituem fonte de proteína para alimentação da população rural (Fernandes
et al.
,
2001).
No que concerne à origem desta raça, as raças primitivas de arietinos
(ovinos descendentes do "
Ovis aries
") pareciam possuir genes para a produção de lã e
genes para a produção de pêlos ou fibras meduladas. Portanto, as raças de formação
mestiça, como a bordaleira de Portugal, apresentam a possibilidade de gerar ovinos
deslanados, quando os seus descendentes forem submetidos a uma seleção natural num
ambiente impróprio para o desenvolvimento da lã, como é o caso do Nordeste
brasileiro, onde o ambiente dificultou a disseminação dos ovinos portadores de uma
capa de lã (velo), enquanto que favoreceu aqueles despojados dela (os deslanados) e,
portanto, recobertos de pêlos (ARCO, 2005).
Segundo Otávio Domingues, que pesquisou a origem dos deslanados do
Nordeste, e que os denominou de deslanados de Morada Nova, estes formavam uma
população descendente do bordaleiro de Portugal, particularmente do bordaleiro
churro (ARCO, 2005).
Dessa maneira, tanto a variação genética como a ação seletiva do ambiente
quente e seco do Nordeste agiram no sentido desfavorável à formação de lã, e
favorável à multiplicação e sobrevivência dos indivíduos deslanados. Portanto, os
ovinos Morada Nova são deslanados, mochos, podendo ser encontrados na pelagem
vermelha ou branca. Além disso, os machos e as fêmeas têm peso variando de 40 kg a
60 kg e de 30 kg a 50 kg, respectivamente. A cabeça destes animais apresenta-se larga,
alongada, perfil sub-convexo, focinho curto bem proporcionado, orelhas bem inseridas
na base do crânio e terminando em ponta, além de olhos amendoados. O pescoço
apresenta-se bem inserido no tronco, com ou sem brincos. Já o corpo possui como
24
características uma linha dorso-lombar reta, admitindo-se ligeira proeminência de
cernelha nas fêmeas. A garupa destes animais apresenta-se curta com ligeira
inclinação, enquanto a cauda é fina e média, não passando dos jarretes. Com relação
aos membros, estes se apresentam finos, bem aprumados e com cascos pequenos e
escuros (ARCO, 2005).
Animais da variedade vermelha (Figura 1) apresentam pelagem vermelha
em suas diversas tonalidades, cor mais clara na região do períneo, bolsa escrotal, úbere
e cabeça, pele escura, espessa, elástica e recoberta de pêlos curtos, finos e ásperos
(ARCO, 2005).
Figura 1 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade vermelha).
Fonte: ARCO, 2005.
Já aqueles da variedade branca (Figura 2) apresentam pelagem branca,
sendo permissíveis mucosas e cascos claros. Apresentam, ainda, pele escura, espessa,
elástica e resistente (ARCO, 2005).
Com relação às sua eficiência reprodutiva, a ovelha Morada Nova,
apresenta uma ciclicidade regular, apresentando estros a cada 17 dias. No que diz
respeito à duração da gestação, esta apresenta duração de 150 dias, enquanto o
intervalo entre-partos é considerado reduzido, quando comparado a outras raças
deslanadas locais, como, por exemplo, a Santa Inês, a qual apresentou um intervalo
entre-partos de 325,02 ± 7,66 dias contra 284,81 ± 5,17 dias de ovelhas Morada Nova
25
(Fernandes
et al.
, 2001). Os autores atribuíram a aparente longa duração do intervalo
entre-partos, em ambas as raças, à alta variabilidade entre os animais e a quase
completa ausência do uso de práticas de manejo reprodutivo (Fernandes
et al.
, 2001).
Figura 2 – Machos e fêmeas da raça Morada Nova (variedade branca).
Fonte: LFCR, 2005.
1.2. Uso de tecnologias reprodutivas na preservação de rebanhos nativos
Os efeitos deletérios da homogeneidade genética que resultam da
diminuição dos tamanhos da população são bem conhecidos, sendo a alta mortalidade
pós-natal, o baixo desempenho reprodutivo e a maior susceptibilidade a doenças as
conseqüências mais documentadas (Ralls
et al.
, 1979; Brem
et al.
, 1989; Lasley
et al.
,
1994). Muitas das espécies e raças consideradas sob risco de extinção, possuem certas
características que as tornam bem adaptadas ao seu habitat, sejam fisiológicas,
evidenciando-se a alta tolerância ao estresse térmico e a resistência a patógenos
endêmicos específicos, bem como morfológicas, destacando-se os cascos de estrutura
sólida, o excesso de pele e chifres grandes. No entanto, estas características, em geral,
são encontradas em raças de baixa produtividade e não são, devidamente, valorizadas.
Todavia, mudanças climáticas, de mercado, dentre outras, podem tornar tais
características, atualmente, consideradas comuns e sem expressão, de extremo valor no
futuro. Por estas razões, a preservação destas raças é importante. Assim, diversas
26
tentativas estão sendo feitas para conservar genomas e / ou genes individuais através
do uso de tecnologias reprodutivas assistidas (TRA) aplicadas (inseminação artificial e
múltipla ovulação e transferência de embriões) e fundamentais (transferência nuclear e
clonagem). E o sucesso do uso das TRA no aumento da produtividade de animais de
produção sugere que estas tecnologias possam ser utilizadas, também de forma bem
sucedida, na preservação de raças em risco de extinção (Solti
et al.
, 2000).
Programas de conservação têm reconhecido a importância da preservação
do material genético oriundo de espécies raras ou em risco de extinção. Em 1991, a
Associação Americana de Animais Aquáticos e de Zoológico organizou um grupo
científico abordando o Banco de Recursos Genômicos, o qual é definido como “a
colheita organizada, estocagem e o uso de biomateriais” (Wildt, 1992). Programas de
crioarmazenamento de gametas e embriões têm, similarmente, sido realizados na
preservação de variedades valiosas de animais de laboratório, assim como de animais
transgênicos (Wildt
et al.
, 1992). Para este fim, programas de pesquisa têm sido
iniciados para elucidar vários aspectos da conservação de material genético através da
reprodução assistida em animais de produção nativos.
No início da década de 80, o Centro Nacional de Pesquisa de Recursos
Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN) da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA) decidiu incluir a conservação de recursos genéticos
animais no seu programa de pesquisa denominado Conservação e Utilização de
Recursos Genéticos o qual, até então, só havia enfocado a conservação vegetal. Uma
das razões para essa inclusão foi o fato de que todo o rebanho de bovinos de raças
mochas, na época, consistia de três touros e oito vacas, os quais se encontravam no
estados de São Paulo e Minas Gerais. A partir de então, iniciaram-se as colheitas de
sêmen e de embriões (Mariante & Egito, 2002).
A equipe de reprodução do CENARGEN, trabalhando na conservação de
recursos genéticos animais aumentou e iniciou o desenvolvimento de novas
tecnologias. Para tanto, dois laboratórios foram criados: uma para o desenvolvimento
de novas tecnologias, utilizando o camundongo como um modelo biológico e outro
para aplicar as técnicas desenvolvidas nos grandes animais da fazenda experimental do
CENARGEN. Foram trabalhadas técnicas referentes à colheita e a congelação de
27
sêmen a campo, a colheita, congelação, descongelação e transferência de embriões
para receptoras, além da micromanipulação de embriões. Esta levou a produção de
gêmeos idênticos a partir de um único embrião. Mais recentemente, a fecundação
in
vitro
e a clonagem foram também desenvolvidas nestes laboratórios, mostrando o grau
de maturidade profissional deste grupo de pesquisa (Mariante & Egito, 2002).
Um núcleo de conservação deve trabalhar, criopreservando sêmen,
embriões e oócitos de espécies ou raças domésticas em risco de extinção. Por esta
razão, ambas as formas de conservação,
in situ
e
ex situ
, são extremamente
importantes e complementares (Mariante & Egito, 2002).
1.3. Produção
In Vivo
de Embriões
1.3.1. Sincronização do Estro
A sincronização do estro tem por finalidade fazer com que um grupo de
fêmeas entre em estro em um curto período, favorecendo a execução da cobertura
natural ou inseminação artificial. De acordo com Baril
et al
. (1995), nas fêmeas
doadoras, a sincronização ou a indução do estro permite obter embriões no mesmo
estádio de desenvolvimento; já para as receptoras a finalidade seria fazer coincidir o
seu estado fisiológico com o das doadoras, condição esta que favorece aos embriões
uma melhor sobrevivência e desenvolvimento pós-transferência.
A sincronização do estro pode ser alcançada tanto através do uso de
prostaglandina F
2
α
(PGF
2
α
) como de progestágenos. Ao se aplicar a PGF
2
α
ou seus
análogos sintéticos, dentre eles o d-cloprostenol e o luprostiol, é possível sincronizar o
estro através da luteólise, utilizando, para tanto, um esquema de duas injeções
intramusculares, intervaladas por 11 dias, em fêmeas cíclicas (Deligiannis
et al.
,
2005).
No que concerne aos progestágenos, estes são utilizados por um período de
10 a 16 dias, utilizando-se dispositivos intravaginais impregnados com 300 mg de
progesterona (Iida
et al.
, 2004), 50 mg a 60 mg de acetato de medroxiprogesterona
(Boscos
et al
., 2002; Evans
et al.
, 2004) ou 30 mg a 40 mg de acetato de fluorogestona
28
(Zeleke
et al.
, 2005), além de implantes auriculares contendo 2 mg a 6 mg de
norgestomet (Stenbak
et al.
, 2003). Estes tratamentos têm sido efetivos na
sincronização do estro de ovelhas durante as estações sexual e não-sexual (Barrett
et
al.
, 2004). É importante ressaltar que o uso da gonadotrofina coriônica eqüina (eCG)
nos protocolos de sincronização do estro em ovinos também está bem estabelecido.
Uma única aplicação de eCG, após tratamento progestágeno, aumenta a resposta
ovariana, as taxas de fecundação e concepção e o percentual de nascimentos múltiplos
(Dias
et al
., 2001; Barrett
et al.
, 2004).
O método de sincronização mais utilizado no Brasil é o do tratamento por
12 dias, utilizando-se esponjas intravaginais impregnadas com progestágenos
sintéticos (MAP ou FGA) e aplicação de eCG no final do tratamento progestágeno, por
via intramuscular. O estro ocorre em torno de 36 a 48 horas após a retirada das
esponjas (Dias
et al.
, 2001).
1.3.2. Superovulação
A superovulação pode ser definida como o processo pelo qual um número
maior de folículos ao, geneticamente, estabelecido durante um ciclo estral natural, é
recrutado e selecionado para chegar à ovulação. Dois tipos de fatores têm sido
sugeridos como determinantes na resposta ovariana: (1) fatores exógenos, relacionados
especificamente com o tipo e forma de administração das gonadotrofinas; e, (2) fatores
endógenos, relacionados com o
"status"
ovariano do animal, isto é o número de
folículos susceptíveis de responder às gonadotrofinas no início de sua aplicação
(Alvarez, 1994).
Os princípios da indução da superovulação em caprinos e ovinos são
semelhantes àqueles conhecidos para bovinos. Aplica-se uma gonadotrofina folículo-
estimulante durante a parte final da fase luteal do ciclo estral, ou seja, entre os dias 11
e 13, ou em torno de 1 a 2 dias antes do fim do tratamento de sincronização do estro
(Ishwar & Memon, 1996).
As
29
administrada como uma única injeção intramuscular (1000 a 2000 UI), 1 dia antes do
fim do tratamento de sincronização do estro (Cognié, 1999). A eCG tem como
vantagens: aplicação simplificada, baixo custo e facilidade de obtenção. As suas
principais desvantagens são: resultados heterogêneos, variabilidade entre partidas,
possibilidade de reações anafiláticas, maior incidência de cistos foliculares, número
significativo de embriões degenerados, formação de anticorpos anti-eCG (Baril
et al.
,
1995) e uma meia-vida longa. Devido a esta última desvantagem, a ação prolongada
da eCG pode resultar em uma alta incidência de folículos não ovulatórios junto com
elevados níveis de estradiol produzidos por estes folículos (Blanco
et al.
, 2003).
Já o FSH é administrado em seis a oito doses decrescentes, intervaladas por
12 horas, durante três a quatro dias, iniciadas dois a três dias antes da remoção do
progestágeno, sendo, atualmente, o principal hormônio utilizado em programas de
superovulação (D’Alessandro
et al.
, 2005; Veiga-Lopez
et al.
, 2005). Em revisão
sobre o tema, Cognié (1999) cita que o FSH tem se comportado como sendo superior à
eCG em termos de taxas de ovulação e fecundação e em produção de embriões de boa
qualidade. Recentemente, as eficácias da eCG e do FSH foram comparadas quanto à
resposta superovulatória em ovelhas, nas quais foi verificada uma taxa de ovulação
média maior naquelas tratadas com FSH do que com eCG. Além disso, a incidência de
grandes folículos que falharam em ovular foi sutilmente maior nas fêmeas tratadas
com eCG do que com FSH, enquanto que, com relação ao número de embriões
transferíveis, os animais tratados com FSH apresentaram valores bem superiores
(Blanco
et al.
, 2003).
Ainda abordando a comparação entre eCG e FSH, observa-se a ocorrência
de múltiplos cistos foliculares nas doadoras de embriões submetidas ao tratamento
superovulatório com eCG, o que não se observa naquelas tratadas com FSH. Isto pode
ser devido a uma metabolização, consideravelmente, mais rápida do FSH do que da
eCG (Armstrong
et al.
, 1983; Blanco
et al.
, 2003), implicando numa maior resposta
estrogênica à eCG do que ao FSH.
Um importante problema, mais freqüentemente associado à superovulação
de cabras, porém também observado em ovelhas, é a regressão prematura de corpo
lúteo (Riesenberg
et al.
, 2001; Maia
et al.
, 2004), a qual foi relatada em mais de 27%
30
das fêmeas doadoras (Tervit
et al.
, 1986). Este fenômeno pode estar associado com o
retorno precoce ao estro, antes da época normal para a colheita de embriões. Nestes
casos, são observadas taxas de recuperação embrionárias reduzidas e esta característica
parece estar associada com uma alteração no transporte embrionário através das tubas
uterinas (Tervit, 1987; Riesenberg
et al.
, 2001).
Uma alta variabilidade na resposta superovulatória é observada em ovelhas,
prejudicando o processo de fecundação. Independente do tipo de tratamento
superovulatório, a falha de fecundação ocorre, particularmente, em ovelhas mostrando
uma alta resposta ovulatória (Armstrong & Evans, 1983; Hawk
et al.
, 1987). Esta falha
na fecundação parece ser devida ao transporte inadequado de espermatozóides através
da cérvice, podendo este problema ser sanado com a deposição do sêmen, diretamente,
no útero (Murray
et al.
, 1994).
1.3.3. Fecundação
Para que ocorra a fecundação, é necessária a presença, dentro do trato genital da
fêmea, de um número satisfatório de espermatozóides móveis no momento adequado.
Três técnicas podem ser utilizadas na tentativa de obter-se a fecundação das fêmeas: a
monta natural, a inseminação artificial (transcervical ou por laparoscopia) e a
fecundação
in vitro
. No entanto, em qualquer um dos casos, faz-se necessária a
utilização de machos de fertilidade comprovada. No caso de fecundação por monta
natural, os machos escolhidos deverão apresentar condições físicas e aptidão sexual
suficientes para realizar montas repetidas. Quando da inseminação artificial, as
qualidades particularmente consideradas, serão a aptidão do macho para ejacular em
vagina artificial e a qualidade do sêmen produzido (Baril
et al.
, 1995).
Ainda segundo os mesmos autores, a monta natural está limitada pelo fato de que
os melhores reprodutores, em geral, encontram-se nos grandes centros de inseminação
artificial. Em monta livre, machos e fêmeas ficam juntos na proporção de um macho
para três a quatro fêmeas; os machos podem, ainda, serem equipados com um
dispositivo marcador para identificar as fêmeas cobertas. Na monta controlada, os
machos só ficam com as fêmeas em tempos determinados de cobertura, pelo menos,
31
duas vezes, durante o período de estro, com intervalo de 12 horas. As montas mais
eficazes são aquelas realizadas 12 e 24 horas após o início do estro.
As falhas de fecundação são, igualmente, evidentes em ovelhas, naturalmente ou
artificialmente, inseminadas, parecendo ser devido ao processo de transporte
espermático através da cérvice (Murray
et al.
, 1994). Este problema pode ser
solucionado pela deposição de sêmen no lúmen uterino através de métodos cirúrgicos
(Trouson & Moore, 1974) ou por inseminação laparoscópica (Ehling
et al.
, 2003), em
ovelhas superovuladas. Em ovinos, a inseminação artificial por laparoscopia tem sido
utilizada (Lymberopoulos
et al.
, 2001) com sucesso, resultando em melhores taxas de
fecundação quando comparada à monta natural. Esta, em contrapartida, tem levado a
melhores resultados de fecundação do que a inseminação artificial transcervical (Baril
et al.
, 1995).
A fecundação bem sucedida de fêmeas doadoras de embriões é também
dependente da sincronia entre o momento da inseminação e as ovulações. Tanto a
redução na variabilidade da amplitude do período em que as ovulações ocorrem, como
um aumento na taxa de ovulação podem ser obtidos utilizando uma aplicação de
GnRH em um momento fixo após a retirada do progestágeno (Walker
et al.
, 1989).
Contudo, após as ovulações induzidas por GnRH, uma nova ocorrência de ovulações
tem sido observada 12 a 24 h após a primeira, em 60% das ovelhas tratadas (Cognié
et
al.
, 1987). Outra alternativa é o uso de um antagonista de GnRH, 12 horas após a
remoção da esponja, seguido por uma aplicação de LH, 24 horas depois. Este
procedimento mimetiza o pico pré-ovulatório de LH e permite a inseminação
programada em fêmeas superovuladas (Cognié, 1999).
1.3.4. Colheita de Embriões
Em geral, os procedimentos atuais de colheita de embriões utilizados em
ovelhas têm sido pouco aperfeiçoados, quando comparados àqueles descritos por
Hunter
et al
. (1955). A colheita de embriões pode ser realizada pelos métodos
cirúrgico, semi-cirúrgico e não-cirúrgico.
32
1.3.4.1. Colheita Cirúrgica – Laparotomia
Possivelmente, a técnica de colheita de embriões mais em uso em caprinos
e ovinos ainda é a laparotomia (Ishwar & Memon, 1996; Folch
et al.
, 2001; Naqvi
et
al.
, 2002; Selvaraju
et al.
, 2003).
Por este método, os embriões podem ser colhidos com sucesso tanto do
oviduto como do útero. Independente do local de colheita, as doadoras de embriões
devem ser, previamente, submetidas a jejuns hídrico, por 12 horas, e alimentar, por 24
horas, para, em seguida, serem submetidas à anestesia geral. As fêmeas são sedadas
com cloridrato de xilazina, na proporção de 0,11 mg/kg PV, recebendo ketamina, na
razão de 5,5 mg/kg PV, dez minutos depois, sendo ambas as aplicações por via
intramuscular (Pendleton
et al.
, 1992). O plano anestésico pode ser mantido pela
anestesia inalatória com metaphano após a aplicação da ketamina (Nuti
et al.
, 1987).
Deve-se ainda realizar uma aplicação local e subcutânea de cloridrato de lidocaína (0,1
g/animal) na linha alba, onde será realizada uma incisão de 15 a 20 cm de
comprimento, cranialmente à base do úbere (Ishwar & Memon, 1996). A
exteriorização dos cornos uterinos, tubas uterinas e dos ovários deve ser feita com a
fêmea em decúbito dorsal, em maca apropriada, com uma inclinação antero-posterior
de 30º a 45º. Com a exteriorização dos ovários, é realizada a contagem dos corpos
lúteos, a qual permitirá a avaliação da eficácia do método cirúrgico de colheita de
embriões através da obtenção da taxa de recuperação embrionária. A lavagem das
fêmeas, quer seja uterina ou tubária, é realizada com PBS a 37
o
C (Tabela 1).
A colheita tubária deve ser realizada dois a quatro dias após o início do
estro (Baril
et al.
, 1995), sendo os ovidutos cateterizados através do infundíbulo com
um cateter plástico. Em seguida, após a inserção de uma agulha 25 g acoplada a uma
seringa de 20 mL na junção útero-tubárica, o meio de lavagem é injetado em direção
ao infundíbulo (Ishwar & Memon, 1996).
33
Tabela 1 – Meio de colheita e conservaç
34
Figura 3 – Diferentes estruturas encontradas no trato genital de cabras e ovelhas entre
a ovulação e a implantação: Ov = ovário, O = oócito, F = fecundação, PN = pré-
nuclear, 1 C = 1 célula, 2 C = 2 células, 4 C = 4 células, 8 C = 8 células, M = Mórula,
Bl = Blastocisto, I = Implantação, U = útero.
Fonte: Sathananthan
et al.
, 1993.
A exteriorização do trato reprodutivo por laparotomia, com o objetivo de
colher embriões, envolve algum grau de trauma cirúrgico e, freqüentemente, leva a
formação de aderências pós-operatórias, as quais podem envolver o útero e os ovários.
A colheita cirúrgica de embriões, realizada de forma repetida na mesma doadora, afeta
negativamente a taxa de recuperação embrionária, o que a torna de uso limitado,
particularmente em animais de alto valor genético (Tabela 2). No entanto, é possível
minimizar os efeitos negativos deste método de colheita de embriões pela aspersão do
útero e dos ovários com soro fisiológico heparinizado (50 UI de heparina sódica/mL)
ou com solução de dextran 70 g a 6,0%. A sutura, por sua vez, pode ser realizada com
um padrão simples interrompido com fio de poliglactina 2-0 (Ishwar & Memon, 1996).
35
Tabela 2 – Efeito da repetição da colheita de embriões por laparotomia sobre a taxa de
recuperação embrionária.
Ordem de colheita
Espécie
1
2
3
Fonte
Ovina
Caprina
88,0% (18)
85,0% (10)
52,0% (17)
85,7% (10)
24,0% (15)
78,2% (9)
Torres & Sevellec, 1987
Andrioli
et al.
, 1999
( ) Número de animais.
1.3.4.2. Colheita Semi-cirúrgica – Laparoscopia
Este método foi, inicialmente, usado na ovelha (McKelvey
et al.
, 1986)
com o objetivo de ampliar as possibilidades da repetição da colheita de embriões, na
mesma fêmea, tornando, assim, possível usá-la por várias vezes.
Alimento e água são, geralmente, retirados 24 h antes da laparoscopia.
Aplica-se sulfato de atropina, na proporção de 0,048 mg/kg PV, por via subcutânea,
seguida, pela aplicação do miorrelaxante xilazina, na razão de 0,22 mg/kg PV, por via
intramuscular. Cinco minutos após a aplicação da xilazina, injeta-se cloridrato de
ketamina na proporção de 11 mg/kg PV, por via endovenosa. A combinação ketamina-
xilazina produz um plano anestésico, o qual é mantido com halotano e oxigênio, via
canulação endotraqueal. Após a contenção do animal em uma mesa cirúrgica em
decúbito dorsal, a cabeça é mantida para baixo a um ângulo de 45
o
e a região
abdominal cranial ao úbere é tricotomizada para a anti-sepsia cirúrgica.
Em seguida, é realizada uma primeira punção, quatro a cinco centímetros
cranialmente ao úbere e 10 a 15 cm à esquerda da linha alba para colocar uma cânula,
a qual deve ser conectada a um endoscópio. Depois de haver insuflado ar filtrado na
cavidade abdominal para separar as vísceras dos órgãos abdominais (criação de
pneumoperitônio), se coloca uma segunda cânula no lado oposto à primeira punção,
tomando como referência a linha alba, objetivando assim, introduzir uma pinça
atraumática para a manipulação do trato genital (Figura 4). Em seguida, posiciona-se
um dos cornos uterinos pela base para puncioná-lo com uma agulha de Mintz. Coloca-
se uma terceira cânula no nível da linha alba a 15 centímetros do úbere, para passar
36
uma sonda de três vias, introduzindo a extremidade da mesma pelo orifício da punção
dentro da luz uterina (Baril
et al.
, 1995).
O bulbo localizado na extremidade da sonda é, então, inflado com ar,
mediante uma seringa, visando obstruir a luz uterina na base do corno. Em seguida, se
introduz a extremidade de um cateter, inserido no corpo da sonda, o mais próximo
possível da junção útero-tubárica. Fixa-se a pinça sobre o istmo com o fim de evitar
que o líquido de colheita passe para a tuba uterina. O líquido de colheita (40 mL a 50
mL) é injetado através da sonda. A pressão criada no interior do corno uterino
possibilita a colheita do líquido pelo cateter (Figura 4).
A colheita de embriões por laparoscopia resulta em uma menor quantidade
de aderências (Baril
et al.
, 1989; Flores-Foxworth
et al.
, 1992; Bari
et al.
, 2003), mas
requer equipamento especial e pessoal altamente treinado (Baril
et al.
, 1995).
As taxas de recuperação embrionárias por laparoscopia são 10% a 15%
inferiores àquelas obtidas por laparotomia, mas a repetição da colheita por
laparoscopia não diminui a eficácia do método (McKelvey
et al.
, 1986; Andrioli
et al.
,
1999) (Tabela 3).
Figura 4 – Disposição dos instrumentos para a colheita de embriões por laparoscopia
em pequenos ruminantes.
Fonte: Freitas & Simplício, 2001.
37
Tabela 3 – Taxa de recuperação embrionária após colheitas sucessivas de embriões por
laparoscopia.
Ordem de colheita
Espécie
1
2
3
Fonte
Caprina
Ovina
87,2% (10)
35% (8)
64,5% (10)
76% (8)
62,1% (10)
66% (8)
Andrioli
et al.
, 1999
McKelvey
et al.
, 1986
( ) Número de animais.
1.3.4.3. Colheita Não Cirúrgica – Transcervical
Esse método foi desenvolvido com o objetivo de abolir os efeitos adversos
da colheita de embriões por laparotomia, maximizando a utilização de uma mesma
fêmea em colheitas sucessivas.
Visando minimizar os traumas e diminuir a relação custo-benefício da
técnica cirúrgica, procurou-se adaptar a ovelha, a técnica de colheita pela via cervical,
utilizada com êxito na vaca. Todavia, uma das dificuldades do uso desta técnica na
ovelha está no arranjo irregular dos anéis cervicais, restringindo a passagem do cateter.
Visando solucionar este problema, várias manobras auxiliares vêm sendo testadas tais
como a aplicação prévia de PGF
2
α
, o uso de cateter de calibre reduzido, dentre outras.
Para a realização desta técnica, os animais devem ser anestesiados pela via
epidural e contidos em brete de contenção apropriado. Através de um espéculo com
fonte luminosa, visualiza-se a cérvice e, após o tracionamento e fixação desta,
introduz-se uma sonda de três vias guiada por um cateter de aço inoxidável, infla-se o
balão, inicia-se a lavagem uterina com PBS por uma das vias e, o seu recolhimento em
filtro de colheita (Barry
et al
., 1990).
Soonen
et al.
(1991) compararam dois métodos de recuperação embrionária
em ovelhas: pela via transcervical e por laparotomia. As taxas de recuperação obtidas
foram de 36,5% e 51,0%, respectivamente.
Devido à complexidade da anatomia cervical, Mylne
et al
. (1992)
conseguiram ter sucesso com a técnica em somente 40% das fêmeas tratadas. Já
Wulster-Radcliffe
et al
. (1999) testaram o efeito da utilização de estrógeno seguido da
38
administração de ocitocina sobre a dilatação cervical e a taxa de recuperação
embrionária, encontrando que o tratamento estrógeno-ocitocina pode ser utilizado para
garantir o sucesso da transferência de embriões pela via transcervical em ovelhas, sem
afetar a função luteal.
Já Silva (2005), comparando duas formas de dilatação cervical para a
colheita de embriões em ovelhas da raça Santa Inês, verificou que a aplicação
intramuscular de 50
µ
g de prostaglandina F
2
α
(PGF
2
α
), 12 horas antes da colheita
resultou numa taxa de passagem transcervical de 58,8%. Enquanto que a aspersão no
fundo de saco vaginal com solução à base de um análogo sintético da prostaglandina
E
1
(PGE
1
) (misoprostol) resultou numa taxa de passagem transcervical de 63,1%. A
mesma autora, trabalhando com ovelhas da raça Dorper e utilizando o protocolo com
PGE
1
, conseguiu passar o cateter de colheita em 94,8% das ovelhas e obteve um total
(média ± dp) de 6,02 ± 3,6 estruturas. Almeida
et al
. (2002), por sua vez, utilizando o
mesmo protocolo com misoprostol, verificaram a total impossibilidade de passagem
transcervical do cateter de colheita de embriões em ovelhas da raça Morada Nova, bem
como um percentual de 80% de passagem transcervical do cateter de colheita em
ovelhas Santa Inês, evidenciando, assim, a influência da variabilidade racial sobre esta
técnica de colheita de embriões.
1.3.5. Avaliação e Classificação dos Embriões
A avaliação morfológica dos embriões estabelece padrões morfológicos que
julgam a forma, porém não a viabilidade do embrião. A classificação embrionária
proposta pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS)
para a
avaliação morfológica dos embriões é dividida em nove categorias (Robertson &
Nelson, 1999) (Tabela 4)
39
Tabela 4 – Estádios embrionários e suas respectivas características.
Estádio Embrionário
Características
1 célula
2-16 células
Mórula inicial (Mi)
Mórula compacta
(Mc)
Blastocisto inicial
(Bi)
Blastocisto (Bl)
Blastocisto expandido
(Bx)
Blastocisto em
eclosão (Bn)
Blastocisto eclodido
(Be)
zigoto recém formado, com apenas uma célula circundada pela
zona pelúcida e apresentando o 2
o
. corpúsculo polar no espaço
perivitelínico (EPV).
estádio onde ocorrem as clivagens iniciais, sendo possível
contabilizar o número de blastômeros.
massa de células com separação nítida entre os blastômeros
ocupando quase a totalidade do EPV.
blastômeros agregados entre si formando uma massa compacta,
ocupando 60% a 70% do EPV.
início da formação da blastocele e diferenciação entre o
trofoblasto e o botão embrionário; o embrião ocupando 70% a
80% do EPV.
evidente diferenciação entre as células do trofoblasto e do botão
embrionário; as células do botão embrionário estão
compactadas, a blastocele é predominante.
o embrião aumenta 1,2 a 1,5 vezes o seu diâmetro e a zona
pelúcida diminui em 1/3 a sua espessura; é evidente a pressão
do líquido da blastocele, que empurra o trofoblasto contra a
zona pelúcida.
o embrião está iniciando o processo de saída da zona pelúcida.
o embrião está completamente livre da zona pelúcida; ainda é
nítida a presença da blastocele
40
Na avaliação individual dos embriões são várias as características a serem
observadas tais como: tamanho, forma, cor, homogeneidade do citoplasma, forma e
integridade da zona pelúcida, tamanho e presença de células no EPV e presença de
vesículas (Rumpf
et al
., 1997).
Considerando os parâmetros descritos, os embriões recebem uma
identificação, que varia segundo os autores. A Tabela 5 mostra como a IETS classifica
os embriões.
Tabela 5 – Qualidade embrionária e suas respectivas características.
Qualidade
embrionária
Características
Embrião I
(excelente ou bom)
Embrião II (regular)
Embrião III (pobre)
Embrião IV (morto
ou degenerado)
massa embrionária simétrica e esférica; os blastômeros são
uniformes em tamanho, cor e densidade; irregularidades devem
ser relativamente menores e, ao menos, 85% do material celular
deve ser de massa embrionária viável intacta.
irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária
ou no tamanho, cor e densidade das células individuais; ao
menos 50% do material celular deve compor uma massa
embrionária viável, intacta.
irregularidades maiores na forma da massa embrionária ou no
tamanho, cor e densidade das células individuais; ao menos 25%
do material celular deve formar uma massa embrionária viável,
intacta.
embrião que não apresenta uma forma definida, sendo
impossível determinar o estádio de desenvolvimento; é evidente
a desorganização celular.
41
Os embriões classificados como I, II e III são passíveis de transferência. No
entanto, para a micromanipulação e a criopreservação, somente os embriões I e II são
utilizáveis (Rumpf
et al
, 1997).
1.3.6. Criopreservação de Embriões
O primeiro relato de crias nascidas de embriões congelados-descongelados
foi na espécie murina (Whittingham
et al.
, 1972). Desde então, a criopreservação de
embriões tem sido relatada em várias espécies mamíferas (Palasz & Mapletoft, 1996;
Guignot, 2005). Vários protocolos têm sido desenvolvidos durante os últimos 25 anos
os quais têm resultado em criopreservações de embriões bem sucedidas. Dentre os
fatores que podem influenciar a formação de danos celulares destacam-se a velocidade
de congelação e de descongelação, tamanho e estádio de desenvolvimento
embrionário, propriedades osmóticas e de permeabilidade celular, toxicidade dos
crioprotetores e o conteúdo lipídico intracelular (Palasz & Mapletoft, 1996).
Atualmente, diferentes protocolos, empregando uma variedade de crioprotetores, bem
como lentas e rápidas taxas de resfriamento e aquecimento, têm sido aplicadas em todo
o mundo (Datena
et al.
, 2000; Baril
et al.
, 2001; Cocero
et al
., 2002; Garcia-Garcia
et
al
., 2005). Todos estes protocolos têm sido desenvolvidos no sentido de proteger os
embriões da formação de cristais de gelo intracelulares durante o processo de
congelação e da recristalização por ocasião da descongelação. Visando inibir a
formação intracelular de cristalização de gelo, a água intracelular é comumente
substituída por crioprotetores e, desta forma, os embriões são desidratados numa
velocidade de resfriamento, relativamente baixa. A recristalização durante a
descongelação, tende a ser mínima quanto mais rápida for realizada a descongelação.
As atuais técnicas de congelação permitem a criopreservação bem sucedida de
embriões da maioria das espécies domésticas por, praticamente, períodos ilimitados de
tempo (Dufrain, 1976).
42
1.3.6.1. Crioprotetores e Soluções de Congelação
Os crioprotetores são necessários nas soluções de congelação para prevenir
os danos celulares durante a congelação e a descongelação. Os três principais grupos
de crioprotetores utilizados são (1) aqueles permeáveis e de baixo peso molecular, tais
como metanol (Papis & Dziuk, 1988), etilenoglicol (Cocero
et al.
, 2002), propanodiol
(Renard & Barbinet, 1984), dimetilsulfóxido (Wilmut & Rowson, 1973), butanodiol
(Boutron, 1990), glicerol (De paz
et al.
, 1994) e outros álcoois; (2) aqueles
impermeáveis e de baixo peso molecular, assim como a galactose (Leibo & Oda,
1993), glicose (Storey & Storey, 1988), sacarose (Renard
et al.
, 1982), trealose
(Rudolph & Crowe, 1985) e outros açúcares; e (3) aqueles impermeáveis e de alt1456 Tw(e )Tj0 Tc10.4398 0 Td(ou)Tj-0.
43
crioprotetor como o glicerol, etilenoglicol ou o propanodiol (Voelkel & Hu, 1992).
Enquanto que a congelação rápida ou ultra-rápida e a vitrificação envolvem o uso de
misturas de crioprotetores como glicerol e etilenoglicol, glicerol e propanodiol ou
etilenoglicol e propanodiol em combinação com sacarose, trealose ou galactose (Leibo
& Oda, 1993; Rall, 1987; Rayos
et al.
, 1992; Scheffen
et al.
, 1986; Shaw
et al.
, 1991;
Szell & Windsor, 1994; Valdez
et al.
, 1992). As variadas propriedades dos diferentes
crioprotetores sugerem que cada um deles protege os embriões contra a injúria da
congelação de uma forma específica e a solução crioprotetora mais eficaz seria a
mistura de crioprotetores a qual deve, ainda, ser estabelecida.
As soluções crioprotetoras são comumente preparadas em meio tamponado
com um pH estabilizado entre 7,2 e 7,4. Embora a solução salina fosfato-tamponada de
Dulbecco seja a mais freqüentemente utilizada, outros meios tamponados de cultivo
embrionário tais como o TCM-199 ou a simples solução salina fisiológica têm também
sido utilizados com sucesso (Palasz & Mapletoft, 1996).
A velocidade de congelação empregada é crítica para o sucesso desta
técnica, sendo documentadas três formas de criopreservação: (1) congelação lenta
controlada; (2) congelação rápida / ultra-rápida e (3) vitrificação.
1.3.6.2. Métodos de Criopreservação
Congelação Lenta Controlada e Descongelação
Apesar dos avanços obtidos na criobiologia desde a última década, poucos
protocolos de congelação embrionária têm sido postos em prática. A grande maioria
dos embriões mamíferos é congelada pelos métodos convencionais, utilizando
crioprotetores de permeabilidade, relativamente, lenta e taxas de resfriamento lenta e
controlada, além de taxas de aquecimento rápidas.
Os crioprotetores utilizados neste método são: glicerol, etilenoglicol,
DMSO e o propanodiol. Ressalte-se que, atualmente, existe uma tendência desses
crioprotetores serem adicionados de uma única vez, embora este procedimento
também possa ser realizado em algumas etapas. Para tanto, os crioprotetores são
44
adicionados em concentrações crescentes, intervaladas por alguns minutos, visando,
assim, evitar um significativo choque osmótico. Os embriões são envasados em
palhetas de 0,25 mL para serem submetidos à congelação, necessitando, para tanto, de
um aparelho de congelação programável para regular as diferentes quedas sucessivas
de temperatura (Guignot, 2005).
Inicialmente, a temperatura cai de 25
o
C a – 7
o
C a uma velocidade que
pode variar de 1 a 3 °C/min, permanecendo estável por cinco minutos até a indução da
cristalização (seeding). Esta consiste no resfriamento realizado, localmente, utilizando
uma pinça previamente imersa em nitrogênio líquido. A cristalização funciona
induzindo o resfriamento rápido das células embrionárias, a fim de evitar uma
congelação das células a uma temperatura muito baixa, provocando um choque forte
de temperatura dentro da palheta, provocando, conseqüentemente, danos celulares. A
temperatura para a realização do seeding depende do ponto de congelação da solução e
dos crioprotetores utilizados. Após o seeding, a temperatura cai de – 7
o
C a – 30
o
C a
uma velocidade que pode variar de 0,1 a 0,3 °C/min, provocando a desidratação dos
embriões. Dependendo do protocolo utilizado, a queda de temperatura pode ir de – 25
°C até – 35 °C. Então, as palhetas são imersas em nitrogênio líquido a – 196 °C,
evitando que ocorra uma desidratação muito intensa, a qual seria letal para o embrião
(Guignot, 2005).
No tocante à descongelação, este procedimento deve ser realizado de forma
rápida, evitando, assim, o fenômeno da recristalização. Para tanto, as palhetas devem
ser mergulhadas em banho-maria a uma temperatura variando de 22 °C a 37 °C, a uma
velocidade de 2 500 °C/min. Neste processo, os crioprotetores são removidos em uma
única ou em sucessivas etapas, em concentrações decrescentes do crioprotetor
utilizado na congelação, podendo ser utilizado sozinho ou associado à sacarose
(Guignot, 2005).
Como vantagens, nesta técnica os tempos dos banhos são, relativamente,
longos, permitindo maior tranqüilidade na execução da congelação. Além disso, neste
método, existe a possibilidade de se realizar a transferência direta (Baril
et al
.,
2001;
Martinez
et al
.,
2002).
45
Por outro lado, a congelação lenta requer, obrigatoriamente, a utilização de
um aparelho de congelação programável. Além disso, alguns dos crioprotetores
utilizados nesta técnica, por ocasião do último banho, em sua concentração máxima,
são muito tóxicos. Esta técnica não é conveniente a todas as espécies, sobretudo a
suína, nem a todos os estádios embrionários (estádios de desenvolvimento inicial,
embriões produzidos
in vitro
, embriões biopsados), devido à maior sensibilidade
destes estádios embrionários às temperaturas compreendidas entre + 15 °C e – 5 °C
(Pollard & Leibo, 1994).
Embora esta técnica esteja bem estabelecida, nos últimos 25 anos, a
pesquisa básica e aplicada relacionada à criopreservação de embriões mamíferos tem
sido direcionada, principalmente, para a simplificação dos procedimentos de
congelação e aquecimento. Neste contexto, a vitrificação e a congelação rápida e ultra-
rápida têm sido bastante estudadas, particularmente no tocante à viabilidade
embrionária pós-descongelação e desenvolvimento de soluções crioprotetoras eficazes,
especialmente aquelas que não necessitam do uso de substâncias de origem biológica
(Massip
et al
., 1993; Mahmoudzadeh
et al
., 1995; Van Wagtendonk-De Leeuw
et al
.,
1995).
Vitrificação
A definição física de vitrificação é a solidificação de uma solução a baixas
temperaturas sem formação de cristal de gelo. O processo pode ser considerado como
um aumento extremo de viscosidade e requer tanto taxas rápidas de resfriamento (107
°C/s) ou o uso de soluções crioprotetoras, as quais reduzem a formação de cristais de
gelo e aumentam a viscosidade em baixas temperaturas (Rall, 1987; Vajta, 2000). Até
recentemente, a taxa de resfriamento de procedimentos comuns de vitrificação foi
limitada àquela a qual poderia ser alcançada pela imersão de uma palheta de 0,25 mL
selada, diretamente em nitrogênio líquido, ou seja, aproximadamente, 2500 °C / min
(Palasz & Mapletoft, 1996). Por outro lado, para evitar fraturas de zona pelúcida e de
embriões nas palhetas seladas, tanto as taxas de resfriamento como de aquecimento
não podem ser completamente alcançadas (Kasai, 1997). Estas taxas de resfriamento
46
requerem o uso de crioprotetores em concentrações de, aproximadamente, 5 M a 7 M,
as quais são várias vezes maior que aquela necessária para a congelação convencional,
isto é, 1 M a 2 M (Massip
et al
., 1989). Fatores adicionais, assim como um pequeno
volume de solução ou um considerável aumento da pressão hidrostática, pode também
facilitar a vitrificação (Fahy
et al
., 1984).
Controversamente, algum grau de vitrificação ocorre em qualquer método,
resultando na criopreservação bem sucedida, mesmo na congelação convencional,
como uma conseqüência da concentração das soluções no interior ou em torno dos
embriões, causada pela formação gradual de gelo (Rall
et al
., 1984).
A estratégia da vitrificação é, basicamente, diferente daquela utilizada pela
congelação lenta. A lenta taxa de resfriamento objetiva manter um preciso balanço
entre os vários fatores, os quais podem resultar em danos, tais como a formação de
cristais de gelo, injúrias osmóticas, efeito tóxico dos crioprotetores, eletrólitos
intracelulares concentrados, injúrias de resfriamento, fraturas de zona pelúcida e de
embriões, alterações de organelas intracelulares e no citoesqueleto (Dobrinsky, 1996),
enquanto a vitrificação elimina, totalmente, a formação de cristais de gelo.
Uma conseqüência negativa desta técnica é a probabilidade aumentada de
ocorrer, aproximadamente, todas as formas de injúria, exceto aquelas causadas pela
formação de cristais de gelo. Diferentes procedimentos são utilizados para minimizar
as injúrias tóxicas e osmóticas. A aplicação de compostos menos tóxicos, a
combinação de dois ou três crioprotetores, adição por etapas e / ou exposição de
células a soluções concentradas pré-resfriadas (Palasz & Mapletoft, 1996).
Por outro lado, a estratégia radical da vitrificação tem resultado em algumas
conseqüências positivas independente da eliminação total da formação de cristais de
gelo. A alta taxa de resfriamento diminui as injúrias causadas pelo resfriamento, como,
por exemplo, danos de gotas lipídicas intracelulares, nas membranas lipídicas e no
cito-esqueleto, passando, rapidamente, pela faixa de temperatura de + 15 °C a – 5 °C
(Massip
et al
1995; Zeron
et al
., 1999). Além disso, a vitrificação não requer
congeladores programáveis de alto custo ou alguma habilidade especial, podendo ser
realizada muito rapidamente.
47
Como desvantagens, este método requer a utilização de crioprotetores em
três fortes concentrações, aumentando o risco de toxicidade aos embriões. A duração
de tempo das passagens nos banhos, portanto, é uma etapa crítica neste processo de
criopreservação, pois a desidratação embrionária deve ocorrer em um tempo preciso,
dependendo da velocidade de difusão do crioprotetor e de sua concentração (Guignot,
2005).
Comparada à congelação lenta, a vitrificação induz desidratação e retração
celulares mais pronunciadas. Para o aquecimento das palhetas, assim como na
congelação lenta, as palhetas são, rapidamente, imersas em banho-maria a uma
temperatura que varia de 25 °C a 30 °C. Então, o conteúdo da palheta é vertido e os
crioprotetores são eliminados dos embriões por difusão passiva, assim como na
congelação lenta, graças à presença de açúcares os quais aumentam a pressão osmótica
do meio extracelular (Vajta, 2000).
Vitrificação Rápida e Ultra-rápida
Embora os potenciais efeitos benéficos das taxas adicionais de resfriamento
e aquecimento, tais como a redução da concentração do crioprotetor e da toxicidade, a
diminuição adicional das injúrias de resfriamento, dentre outros, sejam, largamente,
conhecidos, até recentemente, poucos esforços foram feitos para se beneficiar desta
vantagem, por razões práticas. Os dispositivos tradicionais, assim como crio-tubos e
palhetas de inseminação, estão longe de serem os ideais para este propósito e sua
ampla utilização na vitrificação restringiu as opções disponíveis. Contudo, o
desenvolvimento de algumas formas alternativas de resfriamento e aquecimento foi
iniciado, aproximadamente, há uma década e, mais recentemente, algumas novas
oportunidades têm sido criadas. Atualmente, todas as novas técnicas de resfriamento
rápido são baseadas no contato direto entre a solução crioprotetora e o nitrogênio
líquido (Vajta, 2000).
A mais simples forma de estabelecer este contato é a imersão direta dos
embriões em nitrogênio líquido. Isto foi, inicialmente, sugerido por Landa e Tepla
(1990) em embriões murinos e, então, utilizado com sucesso para embriões bovinos
48
(Riha
et al
., 1991). Contudo, o tamanho necessário para a gota do meio de congelação h
49
1.3.7. Inovulação
Inovulação é um termo técnico proposto por Beatty (1951) e consiste na
deposição do embrião no útero da receptora, quer seja por ato cirúrgico (laparotomia),
semi-cirúrgico (laparoscopia) ou transcervical.
Na laparotomia, a receptora é anestesiada e faz-se uma incisão na linha
alba. Os cornos uterinos são expostos, puncionados para a introdução do capilar de
transplante e feita a deposição dos embriões na junção útero-tubárica, sem lesionar a
mucosa uterina.
Na inovulação por laparoscopia, a receptora é anestesiada e colocada em
decúbito dorsal em maca ou mesa própria. Segundo Baril
et al
. (1995), pratica-se uma
punção no abdômen para colocar a cânula do laparoscópio por onde se introduz ar para
facilitar a visualização do trato genital na cavidade abdominal; uma segunda cânula é
colocada no lado oposto da primeira, para se introduzir uma pinça atraumática de
manipulação, que permite avaliar a resposta ovulatória. Em uma terceira incisão,
introduz-se a agulha ou a sonda (
tom-cat
) para perfurar o corno uterino e depositar o
embrião na junção útero-tubárica. Os mesmos autores relatam ainda a possibilidade de
se tracionar os cornos uterinos para fora com o auxílio de uma pinça atraumática e
fazer-se a perfuração do corno uterino e deposição dos embriões.
O método de inovulação pela via transcervical consiste no tracionamento da
cérvice em direção crânio-caudal. A receptora é preparada como para uma colheita e
um cateter com os embriões é colocado, no óstio cervical, ultrapassando os anéis
cervicais (Wulster-Radcliffe
et al
., 1999).
A inovulação deve ser feita no corno uterino ipsilateral ao ovário portador
de, pelo menos, um corpo lúteo funcional. Brebion
et al
. (1989) descrevem que a
porcentagem de fêmeas prenhes é superior quando as inovulações são feitas por
laparoscopia em relação à laparotomia, independente dos embriões serem
criopreservados ou não. Este registro é reforçado por Stefani
et al
. (1990) que
demonstraram que o método laparoscópico pode favorecer a obtenção de altas taxas de
gestação. Já Lopes Júnior
et al
. (2005) citam a semi-laparoscopia como uma técnica
50
alternativa e eficaz para se fazer a inovulação em ovelhas. Lewalski
et al
. (1991), por
sua vez, obtiveram 13% de partos após a inovulação pela via transcervical.
A sobrevivência embrionária pós-inovulação é influenciada dentre outros
fatores, pela condição corporal e taxa de ovulação das receptoras; pelo número de
embriões inovulados por receptoras; pelo estádio de desenvolvimento dos embriões;
pelo local de inovulação e pelo sincronismo entre o estádio fisiológico da doadora com
o da receptora. Ressalta-se que a transferência de dois embriões por receptora resulta
em maior sobrevivência do que de um ou três embriões e que a assincronia entre o
estado fisiológico da doadora com o da receptora não deve ser superior a 24 horas
(Armstrong & Evans, 1983; Tervit
et al
., 1986; Ashworth, 1995).
51
Justificativa
A exploração de ovinos, na região Nordeste do Brasil, nas últimas duas
décadas vem assumindo importância econômica, quer seja pela comercialização dos
produtos de origem ovina, como carne, pele e esterco, ou mesmo de animais vivos em
grandes exposições e feiras agropecuárias nacionais, onde são movimentados negócios
milionários.
Dentre as diversas biotécnicas da reprodução utilizadas no sentido de
incrementar os lucros com a exploração de ovinos, a múltipla ovulação e transferência
de embriões (MOTE) vem ocupando seu espaço. Esta biotécnica promove o
incremento do número de descendentes por ovelha, viabiliza o desenvolvimento de
linhas genéticas, bem como a difusão do progresso genético. Também se constitui
numa barreira sanitária utilizada no controle da transmissão de agentes virais ou
bacterianos e de funcionar como uma importante ferramenta na conservação de
genótipos ameaçados de extinção, assim como os ovinos da raça Morada Nova,
variedade branca. Esta raça ovina, por sua vez, pode reunir características que, na
atualidade, não são, devidamente, valorizadas, mas que, num futuro não muito
distante, poderão ser muito importantes. Dentre essas características, destacam-se,
assim como na grande maioria das raças locais, a adaptação às condições adversas da
zona semi-árida do Nordeste brasileiro, a precocidade sexual, a fertilidade e a
produção de pele de boa qualidade.
Nesse contexto, a MOTE associada à criopreservação de embriões,
certamente, contribuirá para a conservação de tais características, favorecendo a
criação de um banco de germoplasma desta variedade da raça Morada Nova. Todavia,
os resultados satisfatórios com a MOTE a ser empregada na raça Morada Nova
(variedade branca) dependem do conhecimento das respostas das fêmeas desta raça
frente aos tratamentos hormonais, bem como às técnicas de colheita, criopreservação,
descongelação e transferência de embriões. Conhecer e manipular esses fatores
implicará numa maior eficiência dessa biotécnica e, conseqüentemente, no
estabelecimento de um protocolo eficaz de produção de embriões ovinos da raça
Morada Nova (variedade branca).
52
Hipótese Científica
Os processos de sincronização de estro, superovulação, bem como de
colheita, criopreservação, descongelação e transferência de embriões utilizados
eficazmente em raças exóticas e / ou produtivas podem ser utilizados na conservação
de material genético de ovinos da raça Morada Nova (variedade branca).
53
Objetivos
Geral
¾
Verificar a eficiência dos processos de múltipla ovulação e transferência
de embriões congelados-descongelados na preservação de ovinos
Morada Nova (variedade branca).
54
CAPÍTULO 2
EFEITO DA IDADE DA DOADORA SOBRE A
PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA EM OVELHAS
MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA)
PARTICIPANDO DE UM PROGRAMA DE
CONSERVAÇÃO NO BRASIL
Artigo submetido para publicação no periódico científico:
Tropical Animal Health and Production
55
Material e Métodos
Local e animais experimentais
O experimento foi realizado no Setor de Caprino e Ovinocultura da
Faculdade de Veterinária, pertencente à Universidade Estadual do Ceará, em
Fortaleza, a qual está situada a 3°43’47’’ Sul e 38°30’37’’ Oeste. A pluviosidade
média anual é de 1300 mm com uma distribuição irregular durante o ano. A
temperatura e umidade anuais são de 27
o
C e 77%, respectivamente (Funceme, 2003).
Ovelhas não-gestantes e cíclicas da raça Morada Nova (variedade branca)
(n = 20), apresentando, no início do experimento, (média ± ep) 2,7 ± 0,2 anos de idade,
31,2 ± 1,1 kg de peso corporal e 2,6 ± 0,1 de escore de condição corporal, numa escala
de 1 a 5, foram utilizadas como doadoras de embriões.
Estes animais foram mantidos em apriscos elevados e cobertos, recebendo,
como volumoso, capim elefante (
Pennisetum purpureum
)
ad libitum
, além de uma
suplementação com concentrado comercial, com 18% de proteína bruta, na proporção
de 400 g / cabeça / dia, o que lhes garantia 150 % dos requerimentos energéticos e
protéicos para manutenção (NRC, 1985). Os animais tinham, ainda, livre acesso à água
e a sal mineral. Inicialmente, as ovelhas foram distribuídas, aleatoriamente, em dois
grupos de acordo com a idade, onde ovelhas possuindo de 1 a 2 anos e de 3 a 4 anos
compuseram os grupos 1 (n = 9) e 2 (n = 11), respectivamente.
Sincronização de estro e tratamento superovulatório
A sincronização de estro foi realizada utilizando uma esponja vaginal
contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon
, Syntex, Argentina)
mantida na porção cranial da vagina por 14 dias. Quarenta e oito horas antes da
remoção da esponja, o tratamento superovulatório foi iniciado. Os animais foram
superovulados com 200 UI de pFSH (Pluset
, Calier, Espanha), as quais foram
administradas em seis doses decrescentes (50/50, 25/25 e 25/25) a cada 12 horas. As
esponjas foram removidas no momento da penúltima dose.
56
Detecção de estro e fecundação
O início do estro das ovelhas foi detectado utilizando, para isso, um
carneiro Morada Nova (variedade branca), de fertilidade comprovada, a partir de 12
horas após a remoção da esponja e, então, a cada quatro horas, sendo concluído este
procedimento quando a última fêmea não mais apresentasse comportamento de estro.
As ovelhas foram cobertas no início do estro e 24 horas depois. Devido à baixa
proporção entre carneiro e ovelhas de estro sincronizado, as fêmeas foram submetidas
a cinco cronogramas progressivos, os quais permitiram o uso de apenas duas ovelhas
por protocolo a fim de preservar ambos o vigor sexual e a qualidade do sêmen do
carneiro.
Resposta ovariana e recuperação embrionária
Seis dias após a primeira monta, as ovelhas foram submetidas a uma
laparoscopia (Oldham & Lindsay, 1980) para avaliação da resposta ovariana. Para
tanto, os animais foram submetidos a um jejum de 24 horas antes da laparoscopia,
durante a qual as ovelhas que apresentaram, pelo menos, um corpo lúteo, foram
submetidas à recuperação embrionária, seguindo o método de Baril
et al
. (1995).
Resumidamente, após uma laparotomia médio-ventral, o trato genital foi exposto e as
ovelhas com, pelo menos, cinco corpos lúteos, foram consideradas responder ao
tratamento superovulatório. Para a recuperação embrionária, um cateter 14GA x
1,88IN (Angiocath
, BD, Brasil), conectado a uma seringa estéril de 20 mL contendo
meio de lavagem (solução salina fosfato-tamponada de Dulbecco – DPBS), foi
inserido em cada corno uterino, próximo à bifurcação uterina. Foi injetado 40 mL de
DPBS em cada corno uterino. Outro cateter foi inserido em cada junção útero-tubárica,
onde o meio de lavagem foi colhido em um tubo plástico de 50 mL. O lavado
recuperado foi vertido em placas de Petri, plásticas, e submetido à procura de embriões
em estéreo-microscópio (SMZ-1B, Nikon, Japão), a um aumento de 10 a 20x. Após a
procura, os embriões encontrados foram observados em um microscópio invertido
(CSF-100, Nikon, Japão) e avaliados quanto ao estádio de desenvolvimento e
57
qualidade seguindo os critérios morfológicos da Sociedade Internacional de
Transferência de Embriões (Robertson & Nelson, 1999), como embriões de grau I
(excelente ou bom), II (regular), III (pobre) e IV (morto ou degenerado).
Análise estatística
Os parâmetros relacionados à resposta de estro, ou seja, o intervalo entre a
retirada da esponja e o início do estro (RE – IE) e a duração do estro, além da taxa de
ovulação, número de estruturas recuperadas e qualidade embrionária foram avaliados
utilizando a Análise de Variância (ANOVA). O teste PLSD foi utilizado para
determinar as possíveis diferenças entre duas médias após a ANOVA. Dados como
percentual de fêmeas em estro, exibindo resposta superovulatória e produção
embrionária em ambos os grupos foram avaliados utilizando o teste do Qui-quadrado.
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão ou em percentual. Os dados
foram considerados significativos, quando P < 0,05.
Resultados
Somente uma ovelha, submetida ao tratamento de sincronização do estro e
superovulação de cada grupo, não exibiu sinais de estro (Tabela 6), embora todas as
fêmeas restantes apresentassem estro dentro de dois dias (Figura 5). Embora nenhuma
diferença significativa (P > 0,05), com relação ao intervalo retirada da esponja e início
do estro, tenha sido verificada entre grupos (Tabela 6), o percentual total de ovelhas
apresentando estro foi maior entre 24 e 28 horas (55%) após o final do tratamento
progestágeno (P < 0,05). A duração média do estro de todas as ovelhas foi de 46,7 ±
2,1 horas e nenhuma diferença significativa (P > 0,05) foi verificada entre grupos.
Com relação à resposta ovulatória, todos os estros foram seguidos por, pelo menos,
uma ovulação (Tabela 6).
Dados relacionados à resposta superovulatória são apresentados na Tabela
7. Não foi observada diferença significativa entre os grupos experimentais, com
relação ao percentual de ovelhas superovulando (P > 0,05). A taxa de ovulação média
58
foi de 7,4 ± 0,9 e as ovelhas do grupo 1 apresentaram uma maior taxa de ovulação do
que aquelas do grupo 2 (P < 0,05).
Considerando a taxa de ovulação entre grupos experimentais, dentro de
cada ovário (direito e esquerdo), o ovário esquerdo das ovelhas do grupo 1 produziram
mais corpos lúteos que aquele das ovelhas do grupo 2 (P < 0,05). Nenhuma diferença
significativa foi verificada entre grupos, considerando o ovário direito (P > 0,05).
Tabela 6 – Resposta estral e ovulatória de ovelhas Morada Nova (variedade branca)
submetidas a um tratamento superovulatório.
Parâmetro
Grupo 1
Grupo 2
Ovelhas tratadas (n)
Ovelhas em estro (%)
Ovelhas ovulando (%)
Intervalo RE – IE (h)
Duração do estro (h)
9
8 (88,9)
9 (100,0)
26,0 ± 2,8
43,0 ± 1,8
11
10 (90,9)
10 (90,9)
25,2 ± 1,9
49,6 ± 3,3
59
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
% de ovelhas em estro
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Intervalo de tempo até o início do estro (h)
Grupo 1
Grupo 2
SE
Figura 5 – Distribuição da ocorrência de estro em ovelhas Morada Nova (variedade
branca) submetidas a um tratamento superovulatório. (SE: sem estro)
Dentre as ovelhas superovuladas, foi observada a ocorrência de regressão
prematura de corpo lúteo (RPCL). Considerando a comparação entre grupos
experimentais, nenhuma diferença significativa (P > 0,05) foi verificada com relação
ao grau de regressão (parcial e total).
A produção embrionária em ovelhas Morada Nova (variedade branca) é
mostrada na Tabela 8. A taxa de recuperação foi de 64,6% (5,0 ± 0,7 estruturas por
ovelha) e 86,3% das estruturas recuperadas estavam fecundadas. Com relação às taxas
de recuperação e de fecundação entre grupos, nenhuma diferença significativa (P >
0,05) foi observada. Contudo, o grupo 1 apresentou um maior número de estruturas
recuperadas e fecundadas por ovelha do que no grupo 2.
Durante a avaliação, foram verificados diferentes estádios de
desenvolvimento embrionário (Figura 6). Contudo, foi observado um maior percentual
(P < 0,05) de embriões em estádio de mórula (45,1%) do que mórula compacta
(19,6%), blastocisto inicial (7,3%), blastocisto (20,7%) e blastocisto expandido
(7,3%). O grupo 1 apresentou um maior (P < 0,05) número de blastocistos do que o
60
grupo 2 (2,1 ± 0,8 vs. 0,0 ± 0,0), embora nenhuma diferença significativa tenha sido
verificada entre grupos, considerando os outros estádios embrionários.
Tabela 7 – Taxas de ovulação e de regressão prematura de corpo lúteo (RPCL) de
ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento superovulatório.
Parâmetro
Grupo 1
Grupo 2
Ovelhas superovuladas (%)
Taxa de ovulação total
Ovário direito
Ovário esquerdo
Ovelhas com RPCL (%)
Regressão parcial
Regressão total
8 (88,9)
10,2 ± 1,2
a
4,0 ± 0,9
6,2 ± 0,6
a
3 (33,3)
1 (33,3)
2 (66,7)
7 (63,6)
5,0 ± 0,8
b
2,5 ± 0,4
2,5 ± 0,6
b
3 (30,0)
1 (33,3)
2 (66,7)
a, b – Valores dentro da mesma linha com letras diferentes, diferem (P < 0,05).
Considerando a qualidade embrionária, os embriões de grau I foram,
significativamente, predominantes (69,5 %; P < 0,05), considerando todas as ovelhas
tratadas, mas nenhuma diferença significativa foi observada entre grupos
experimentais para todos os graus de qualidade embrionária. Além disso, foi
observada que a ocorrência de RPCL não afetou a qualidade embrionária, pois, dentre
as ovelhas que apresentaram RPCL, somente 17,9% (5/28) de seus embriões
recuperados foram classificados como de graus III e IV.
61
Tabela 8 – Taxas de recuperação e de fecundação de estruturas do lavado uterino em
ovelhas Morada Nova (variedade branca) após tratamento superovulatório.
Parâmetro
Grupo 1
Grupo 2
Estruturas recuperadas
Taxa de recuperação (%)
Estruturas recuperadas por
ovelha
Taxa de fertilização (%)
Embriões por ovelha
59
59/92 (64,1)
6,6 ± 0,9
a
50/59 (84,7)
5,6 ± 1,1
a
36
36/55 (65,5)
3,6 ± 0,8
b
32/36 (88,9)
3,5 ± 0,7
b
a, b – Valores dentro da mesma linha com letras diferentes, diferem (P < 0,05).
Figura 6 – Estruturas recuperadas de ovelhas Morada Nova (variedade branca),
submetidas a tratamento superovulatório: (A) não-fecundadas a um aumento de 400 X;
(B) zona pelúcida rompida a um aumento de 200 X; (C) mórula a um aumento de 400
62
X; (D) vários embriões de boa qualidade recuperados de uma única doadora a um
aumento de 400 X. Fotografias realizadas em microscópio invertido equipado com
contraste de modulação de Hoffman.
Discussão
Os resultados do presente estudo demonstram que o tratamento hormonal
foi eficiente na indução de estro e múltipla ovulação em ovelhas Morada Nova
(variedade branca), já que um alto percentual de ovelhas mostrando estro e
superovulando foi observado nas diferentes idades.
Considerando o comportamento de estro, os dados do presente trabalho
estão de acordo com a maioria dos estudos, os quais empregaram tratamentos
similares. O tratamento de sincronização do estro foi eficiente, pois a maioria das
ovelhas mostrou estro em um curto espaço de tempo. Estes resultados estão de acordo
com outros estudos que utilizaram MAP associado ao tratamento superovulatório em
ovelhas (Mufti
et al.
, 1997; Boscos
et al.
, 2002; Blanco
et al.
, 2003). Contudo,
Cordeiro
et al.
(2003) observaram em ovelhas Santa Inês um maior intervalo entre a
retirada da esponja e o início do estro (36,0 ± 2,7 h) do que aquele observado em nosso
experimento.
Esta diferença pode ser explicada pela maior freqüência de detecção de
estro executada em nosso estudo ou, ainda, pelas diferenças entre raças. Outros
estudos (Torres
et al.
, 1987; Martemucci
et al.
, 1988) mostraram uma relação
significativa entre o início do estro e a taxa de ovulação, explicando porque quase
todos os comportamentos de estro foram associados a ovulações.
Os dados relacionados à resposta superovulatória mostraram que a
refratariedade dos ovários (< 5 ovulações) das ovelhas Morada Nova (variedade
branca) (25,0%) está de acordo com estudos anteriores realizados em outras raças
ovinas, os quais relataram que 20,0% das fêmeas tratadas não respondem ao
tratamento superovulatório (Brebion
et al.
, 1992; D’Alessandro
et al.
, 1996; Cordeiro
et al.
, 2003). Contudo, as ovelhas que responderam ao tratamento superovulatório com
pFSH apresentaram uma maior taxa de ovulação do que aquelas relatadas para ovelhas
63
Bharat Merino (5,6 ± 2,3) e Rambouillet (5,9 ± 1,9) mantidas sob condições semi-
áridas (Naqvi & Gulyani, 1996; 1999). Em ovinos, a influência da idade sobre a
resposta superovulatória é clara e comprovada pelo fato de que taxa de ovulação
espontânea e natural é afetada pela idade (Theriez
et al.
, 1971), sendo a melhor
produção embrionária observada em torno dos seis anos de idade (Torres
et al.
, 1987).
Os dados encontrados em nosso estudo são diferentes daqueles encontrados na maioria
dos resultados da literatura. As ovelhas utilizadas neste trabalho são oriundas de uma
criação extensiva, onde não são raros os casos de partos laboriosos não assistidos, bem
como de afecções do trato reprodutivo. Tais ocorrências reprodutivas são algumas das
principais causas de queda do desempenho reprodutivo subseqüente de matrizes de
produção, acarretando desde falhas no aparecimento do estro até infertilidade. Assim,
as ovelhas adultas estariam mais propensas a passarem por essas afecções, quando
comparadas àquelas jovens, justifcando, assim, a menor resposta superovulatória do
grupo 2 (Alabart
et al.
, 2003).
Com relação à maior taxa de ovulação observada no ovário esquerdo de
ovelhas mais jovens, achados similares têm sido relatados (Mufti
et al.
, 1997;
Scaramuzzi & Downing, 1997), possivelmente devido ao fato de que o controle
hormonal da foliculogênese e da taxa de ovulação devem ser modulados por fatores
locais desconhecidos dentro do ovário e de sua vascularização (Scaramuzzi &
Downing, 1997).
Os achados relacionados à RPCL no presente estudo estão de acordo com
outros relatos. A ocorrência deste fenômeno é um problema significativo,
freqüentemente, associado com a superovulação em cabras (Tervit
et al.
, 1986). Em
ovelhas, Schiewe
et al.
(1991) descrevem que, aproximadamente, 40% das ovelhas
doadoras de embriões apresentaram RPCL. Schiewe
et al.
(1990), trabalhando com
ovelhas superovuladas, encontraram que no dia 5 pós-inseminação, uma certa ovelha
teria corpos lúteos normais ou em regressão, mas não ambas as formas. Todavia, em
nosso estudo, corpos lúteos normais foram observados, por várias vezes, juntamente
com corpos lúteos em regressão. Sabe-se, comumente, que a co-existência de corpos
lúteos em regressão e outros normais está em função do momento da observação em
relação ao início da luteólise. Portanto, se a laparoscopia for realizada exatamente
64
quando o processo luteolítico está começando, é possível que alguns corpos lúteos já
apresentem mudança na aparência enquanto outros ainda pareçam normais, embora
todos eles possam ter iniciado o processo de regressão (Saharrea
et al.
, 1998).
No programa de múltipla ovulação e transferência de embriões (MOTE), a
taxa de sucesso não depende somente da resposta ovulatória à gonadotrofina exógena,
mas também da proporção de estruturas recuperadas e da taxa de fecundação (Naqvi
et
al.
, 1999). Assim, a MOTE pode ser uma ferramenta útil para preservar os animais da
raça Morada Nova (variedade branca), pois a recuperação embrionária e a taxa de
fecundação foram consideradas satisfatórias. A taxa de recuperação embrionária média
no presente estudo (64,6%) é comparável àqueles utilizando o mesmo método
cirúrgico de colheita (Torres & Sevellec, 1987; Baril
et al.
, 1995; Cordeiro
et al.
,
2003; Blanco
et al.
, 2003). Além disso, a taxa de fecundação em nosso experimento
foi maior do que em outros trabalhos que realizaram tratamentos superovulatórios em
ovinos (Moor
et al.
, 1985; D’Alessandro
et al.
, 1996). A dosagem de pFSH utilizada
em nosso experimento para superovular as doadoras de embriões parece não ter
alterado os perfis endócrinos, as funções bioquímicas dos oócitos e o transporte
espermático, sugerindo a ausência de uma influência negativa sobre o número de
estruturas fecundadas.
Os estádios dos embriões recuperados no presente estudo indicam que as
ovelhas Morada Nova (variedade branca) têm uma produção embrionária homogênea,
pois somente embriões variando de mórula a blastocisto expandido foram encontrados.
Nossos dados estão de acordo com os de Bari
et al.
(2003), os quais encontraram
estádios embrionários variando de mórula inicial até blastocisto em eclosão,
confirmando que cinco a seis dias após o início do estro é o melhor momento para
recuperar embriões nos estádios de mórula e blastocisto.
Em contraste, no mesmo período, ovelhas Santa Inês produziram embriões
variando de embriões jovens (4-6 células) a blastocistos eclodidos (Cordeiro
et al.
,
2003). Provavelmente, o tratamento superovulatório promoveu maiores perfis
gonadotróficos que induziram uma produção embrionária heterogênea nas ovelhas
Santa Inês, sugerindo a existência de diferença entre raças.
65
Neste trabalho, quase 70% das estruturas foram classificadas como de grau
I, o que está em consonância com os descritos para raças de ovinos lanados (Baril
et
al.
, 1995; Cognié, 1999). Estes dados, associados aos achados da presença de RPCL,
sugerem que a insuficiente função luteal não parece afetar a produção embrionária em
ovelhas Morada Nova (variedade branca) submetidas à MOTE.
Conclusões
A resposta ovariana frente ao desafio gonadotrófico, assim como a
produção embrionária em ovelhas Morada Nova (variedade branca), de diferentes
idades, submetidas a um tratamento padrão de superovulação são satisfatórias. O uso
da MOTE em ovelhas Morada Nova (variedade branca), na faixa etária de um a dois
anos é uma ferramenta útil para acelerar a multiplicação dos indivíduos desta raça,
contribuindo fortemente para a sua preservação.
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69
CAPÍTULO 3
PERFIS DE PROGESTERONA, TAXA DE
OVULAÇÃO, PRODUÇÃO DE EMBRIÕES E
SOBREVIVÊNCIA, APÓS INOVULAÇÃO EM
RECEPTORAS, DE EMBRIÕES DA RAÇA
MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA)
70
Material e Métodos
ETAPAS EXPERIMENTAIS
Este experimento foi realizado em duas etapas. Uma primeira etapa
consistiu na sincronização do estro, superovulação, fecundação e colheita de embriões
de doadoras ovinas da raça Morada Nova (variedade branca), no sentido de estudar as
variáveis que mais influenciam a produção embrionária desta raça. Uma segunda etapa
foi realizada para verificar a eficiência de dois protocolos de descongelação sobre a
sobrevivência, após inovulação em receptoras sem raça definida, de embriões
congelados de ovinos da raça Morada Nova (variedade branca).
Nas duas etapas, os experimentos foram realizados no mesmo local daquele
descrito no Capítulo 2, sendo os animais mantidos sob as mesmas condições de
alojamento e alimentação.
ETAPA I
Sincronização de estro e tratamento superovulatório das doadoras de embriões
Foram utilizadas, como doadoras de embriões, 25 ovelhas não-gestantes e
cíclicas da raça Morada Nova (variedade branca), apresentando, no início do
experimento, uma média (± ep) de 2,7 ± 0,2 anos, 31,9 ± 0,9 kg e 2,6 ± 0,1 para idade,
peso e condição corporal, respectivamente.
Os processos de sincronização do estro, tratamento superovulatório,
detecção de estro e fecundação foram realizados da mesma forma descrita no Capítulo
2.
Colheitas de sangue e dosagem de progesterona
Para mensurar as concentrações plasmáticas de progesterona, amostras de
sangue foram colhidas por venopunção da jugular em tubos vacutainer heparinizados,
71
imediatamente antes da recuperação embrionária. As amostras foram centrifugadas a
3500 rpm, por 15 minutos, sendo o plasma obtido, estocado a – 20
o
C para posterior
dosagem. Os níveis de progesterona foram dosados por Imunoensaio Enzimático
Quimioluminescente Competitivo Convencional (Immulite 2000 Progesterone;
Diagnostic Products Corporation, EUA). A sensibilidade do exame foi de 0,2 ng/mL
de progesterona. Já os coeficientes de variação intra e inter-ensaios, foram de 8,2% e
9,3%, respectivamente.
Resposta ovariana e recuperação embrionária
Com relação à resposta ovariana, os procedimentos utilizados foram os
mesmos executados para o experimento do Capítulo 2. Além disso, no momento da
avaliação da resposta ovariana, as doadoras foram alocadas em três grupos (A, B e C),
de acordo com o número de corpos lúteos (CLs) observados, em resposta ovariana
mínima (0-4 CLs), moderada (5-9 CLs) ou elevada (> 9 CLs) (adaptado de Amiridis
et
al.
, 2002). A colheita e a avaliação das estruturas foram realizadas, utilizando o
mesmo procedimento executado no experimento do Capítulo 2.
Criopreservação de embriões
Somente embriões classificados como de Graus I e II (n = 37) foram
selecionados para a congelação convencional com o método em três etapas, utilizando
o etilenoglicol como crioprotetor. Para tanto, os embriões selecionados foram imersos
em concentrações crescentes de etilenoglicol (0,5 M, 1,0 M e 1,5 M) a cada cinco
minutos. Dois a três embriões foram envasados em palhetas de 0,25 mL (IMV,
França), sendo colocados no meio de uma coluna de 1,5 M de etilenoglicol, separados
de outras duas colunas do mesmo crioprotetor por duas bolhas de ar. Após este
procedimento, as palhetas foram colocadas em um congelador programável
(Dominium K, BIOCOM, Brasil). O programa de congelação lenta utilizado foi
similar àquele descrito por Baril
et al.
(1995), onde, inicialmente, a temperatura cai de
10
o
C até – 7
o
C, a uma velocidade de 3
o
C/min, sendo realizado o seeding, logo em
72
seguida. A partir de então, foi induzida uma nova queda, a uma velocidade de – 0,3
o
C
/ min até – 35
o
C. As palhetas foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e
estocadas em botijão criogênico.
ETAPA II
Sincronização do estro das receptoras e transferência de embriões
Para a transferência de embriões, foram utilizadas 14 receptoras mestiças,
apresentando, no início do experimento, média (± ep) de 3,4 ± 0,2 anos de idade, 38,1
± 1,6 kg de peso corporal e 2,2 ± 0,1 de escore de condição corporal, numa escala de 1
a 5. Os estros dessas fêmeas foram sincronizados pelo uso de uma esponja vaginal
contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon
, Syntex, Argentina)
inserida na porção cranial da vagina por 14 dias, seguida da administração
intramuscular de 400 UI de eCG (Novormon
, Syntex, Argentina) no momento da
remoção da esponja. A detecção de estro das receptoras foi iniciada 12 horas após a
remoção da esponja, utilizando, para tanto, um carneiro mestiço e sendo repetida a
cada quatro horas.
Seis dias após o início do estro, as receptoras foram submetidas a uma
laparoscopia (Oldham & Lindsay, 1980) para avaliação ovariana, quando o número de
corpos lúteos foi registrado. Neste momento também foi realizada venopunção da
jugular para colheita de sangue e posterior dosagem de progesterona, conforme
descrito para as doadoras. As receptoras com, pelo menos, um corpo lúteo funcional,
foram alocadas ao acaso para receber de um a três embriões descongelados em dois
diferentes crioprotetores (grupo ETG; n = 7 ou grupo SAC; n = 7). Para tanto, a
descongelação das palhetas foi realizada por imersão em água a 37
o
C, por 30
segundos e, em seguida, os embriões foram transferidos para soluções contendo
etilenoglicol (ETG; n = 17) ou sacarose (SAC; n = 13). Os embriões no grupo ETG
foram imersos em concentrações decrescentes de etilenoglicol (1,5 M, 1,0 M e 0,5 M),
a cada cinco minutos, enquanto os embriões do grupo SAC foram imersos em duas
soluções de 0,25 M, seguidas por mais duas de DPBS com BSA e sem sacarose,
73
também a cada cinco minutos. Logo após este procedimento, os embriões congelados-
descongelados foram inovulados nas receptoras através do método de semi-
laparoscopia. Os embriões foram depositados na luz do corno uterino ipsilateral ao
ovário possuindo, pelo menos, um corpo lúteo e utilizando, para isso, um cateter tipo
tom cat. O diagnóstico de gestação foi realizado 30 dias após a transferência de
embriões, utilizando um aparelho de ultra-sonografia transretal (240 Parus, Pie
Medical, Holanda), munido de um transdutor transretal de 6 a 8 MHz de freqüência.
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± ep ou em percentual. O
intervalo entre a retirada da esponja e o início do estro (RE-IE), a duração do estro
(DE), bem como os níveis plasmáticos de progesterona foram comparados entre
grupos (A, B e C) pelo uso de Análise de Variância one-way combinada com o teste
de Duncan (SAS/STAT User’s Guide, 6.03 edition, SAS).
O teste do Qui-quadrado foi utilizado para análise dos dados expressos em
percentuais (número de ovelhas em cada grupo de resposta ovariana, taxas de
recuperação e de fecundação), taxa de ovulação, quantidade de estruturas recuperadas
e de embriões por doadora. Além disso, o mesmo teste foi utilizado para comparar os
graus de qualidade dos embriões recuperados entre grupos, bem como as taxas
fertilidade e de sobrevivência embrionária (ETG vs. SAC).
Comparações múltiplas foram calculadas utilizando o LSD. Já regressões
lineares simples e multifatorial foram utilizadas para verificar as possíveis correlações
entre os diversos parâmetros estudados. Os dados foram considerados significativos,
quando P < 0,05.
74
Resultados
ETAPA I
Uma variação considerável foi observada tanto no número de CLs, que
variou de zero a 15, como na concentração plasmática de progesterona (0,2 a 25,8
ng/mL). De acordo com o critério de resposta superovulatória utilizado em nosso
laboratório, 76,0% dos animais responderam ao tratamento de estimulação ovariana,
sendo verificada uma taxa de ovulação média total de 7,4 ± 0,8.
Dentre as ovelhas submetidas ao tratamento superovulatório que
apresentaram, pelo menos, uma ovulação, foi verificada a ocorrência de RPCL em
25,0% (6/24) delas, as quais foram excluídas das demais análises. Esta deca c5.87969 0 Td(d)Tj-0.03456 Tc6.1191199 0 Td(,)Tj-0.03457 0 Td(i)Tj-0.03456 Tc3.17 0 Td(ca)Tj0.12 .47969 0 Td(a)Tj-0.043.13Td(aTc6.11991992 0 Td(s0.02.991Tc6.11996 Tc4.2 7 0 Td(a)Tj0 Tc.35977 0 Td2.1 Tw(é)Tj0 Tc5.4 0 Td(d)Tj-0.04256 Tc6.11992 0 Td0.09456 Tw(.40391 0 Td2.58 Tw( )Tj0.07728 Tc5.63984 0391199 Td336 Twe)Tj0.03864 Tc1504272 Tc6.11992 0 Td(t)Tj0 Tc3v11991992 0 Td(sd0.21456 Tw(a )Tj 0 Td(a)Tj0.03864 08 Tc5.4 0 Td(r)TTj0.07728 Tc92 0 Td0.09456 Tw0.30 Td(,)Tj-0.03457 0 TTd(t)Tj-0.03f )Tj0 Tc10.5598 2.26272 Tw(m )Tjd(u)Tj-0.04272 Tc611992 0 Td((t)Tj-0.0d336 Tw e)Tj0.03864 Tc15.Tj0.07728 T)Tj0.18 Tc5.87960 0 Td(e)Tj-0.115272 Tc5.4 0 Td(i)Tj0.15864 Tce03456 Tc11.4(a)Tj0.0040n47969 0 Td(a)Tj(m)Tj-0.03456 Tc9.35977 0 Td(L)Tj0.00408 Tc7.439)Tj-0.04256 Tc6.11992 0 T(u)Tj-0.04272 Tc66 Tc5.53(t)Tj-0.0d392 0 Td(m)Tj0 Tc9.35977 0 Td2.1 Tw(o )Tj11.10.303864 Tc12.2398.03457 0 Td22272 Tw(8 Tc6.83984 0 Tds)Tj0.0772864 Tc8.15977 0 Td2.13864 Tw(L )Tj0.08544 Tc12.6 0 Td(e)
75
Considerando a produção embrionária, a taxa de recuperação total foi de
71,2% (5,2 ± 0,6 estruturas por ovelha), sendo que 86,2% das estruturas recuperadas
eram fecundadas. No tocante às taxas de recuperação e de fecundação, nenhuma
diferença significativa (P > 0,05) foi observada entre os grupos A, B e C. Contudo, o
número de estruturas recuperadas no grupo A foi inferior (P < 0,05) àqueles nos
demais grupos. Além disso, os números de estruturas e de embriões recuperados por
ovelha no grupo C foram superiores (P < 0,05), quando comparados àquele no grupo A
(Tabela 10).
Tabela 9 – Resposta ovariana, concentração plasmática de progesterona (P
4
) de
ovelhas Morada Nova (variedade branca) sem RPCL, no dia da colheita de embriões,
bem como momento e duração do estro.
Grupo
N
o
de ovelhas
(%)
Taxa de
ovulação
P
4
(ng/mL)
RE-IE (h)
DE (h)
A
B
C
5 (27,8)
8 (44,4)
5 (27,8)
3,2 ± 0,4
a
7,0 ± 0,7
b
12,0 ± 0,9
c
4,4 ± 0,6
a
11,2 ± 2,4
b
12,5 ± 1,9
b
35,2 ± 2,7
a
23,0 ± 2,2
b
26,0 ± 1,2
b
41,6 ± 6,5
47,0 ± 2,0
42,0 ± 2,6
a, b – Valores dentro da mesma coluna com letras diferentes, diferem (P < 0,05).
Tabela 10 – Taxas de recuperação e de fecundação, em ovelhas Morada Nova
(variedade branca) superovuladas sem RPCL.
Grupo
N
o
de
estruturas
recuperadas
Taxa de
recuperação
Estruturas
recuperadas por
ovelha
Taxa de
fecundação
N
o
de
embriões
por ovelha
A
B
C
10 (10,6)
a
42 (44,7)
b
42 (44,7)
b
58,3 ± 16,7
77,5 ± 6,3
71,4 ± 6,8
2,0 ± 0,5
a
4,5 ± 0,6
ab
8,0 ± 0,8
b
87,5 ± 12,5
93,4 ± 5,0
100,0 ± 0,0
2,3 ± 0,5
a
4,1 ± 0,5
ab
6,9 ± 1,3
b
a, b: Valores dentro da mesma coluna com letras diferentes, diferem (P < 0,05).
Durante a avaliação, estádios diferentes de desenvolvimento embrionário
foram detectados. Contudo, um maior (P < 0,05) percentual de embriões foi observado
76
no estádio de mórula (70,4%) do que nos demais estádios embrionários (mórula
compacta – 16,0%; blastocisto inicial – 4,9%; blastocisto – 6,2%; blastocisto
expandido – 2,5%).
Com relação à qualidade embrionária, os embriões de graus I (75,3%) e II
(22,2%), os quais foram classificados como bons embriões, foram predominantes (P <
0,05), considerando todas as ovelhas tratadas (Tabela 11). Além disso, a Tabela 11
mostra que o número de embriões de grau I foi inferior no grupo A, quando
comparado àqueles nos demais grupos.
Nas ovelhas que apresentaram RPCL, somente 7,9% (5/28) dos embriões
recuperados foram classificados como de graus III e IV.
Tabela 11 – Qualidade de embriões colhidos de ovelhas Morada Nova (variedade
branca) superovuladas.
Graus de qualidade embrionária (%)
Resposta ovariana
I
II
III
IV
Mínima
4 (6,6)
Aa
5
A
(27,8)
0
B
(0,0)
0
(0,0)
B
Moderada
33 (54,1)
Ab
4
B
(22,2)
0
C
(0,0)
2 (100,0)
B
Elevada
24 (39,3)
Ab
9
B
(50,0)
0
C
(0,0)
0
(0,0)
C
Total
61
A
18
B
0
C
2
C
a, b: Valores dentro da mesma coluna com letras minúsculas diferentes, diferem (P <
0,05).
A, B, C: Valores dentro da mesma linha com letras maiúsculas diferentes, diferem (P <
0,05).
Uma correlação positiva e significativa foi encontrada entre a concentração
de progesterona no dia da colheita de embriões e a taxa de ovulação (r = 73,9; P <
0,001) (Figura 7), o mesmo sendo observado entre a taxa de ovulação total e o número
de bons embriões (r = 86,5; P < 0,0001) (Figura 8). Além disso, correlações negativas
e significativas foram observadas entre o intervalo RE-IE e a taxa de ovulação (r =
49,5; P < 0,05) (Figura 9) e a concentração de progesterona no dia da colheita de
embriões (r = 52,6; P < 0,05) (Figura 10).
77
78
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Taxa de ovulação
RE-IE (h)
Figura 9 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro (RE-IE) de
ovelhas superovuladas e o número de corpos lúteos funcionais no dia da colheita de
embriões.
0
5
10
15
20
25
30
0
10
20
30
40
50
RE-IE (h)
Concentração de P4 (ng/mL)
Figura 10 – Relação entre o intervalo retirada da esponja e início do estro de ovelhas
superovuladas e a concentração de progesterona (P
4
) no dia da colheita de embriões.
79
A regressão múltipla demonstrou que a predição do número de bons
embriões deve levar em consideração o número de embriões colhidos (P < 0,0001),
assim como a taxa de ovulação (P < 0,0001) (Tabela 12).
Tabela 12 – Coeficientes de correlação múltipla, utilizando o número de embriões
colhidos (EMB) e a taxa de ovulação (TO) para prever número de bons embriões
(BONS) em ovelhas superovuladas da raça Morada Nova (variedade branca).
Correlações
R
2
P
BONS = EMB – RPCL
0,91
< 0,0001
BONS = TOT – RPCL
0,66
< 0,0001
ETAPA II
No tocante às receptoras, todas as ovelhas hormonalmente tratadas,
exibiram sinais de estro, o qual teve início em média (± ep) 33,7 ± 5,8 horas após a
remoção da esponja. Já com relação à resposta ovariana, foi verificada uma taxa média
de ovulação de 2,0 ± 0,3 CLs (2 a 4 CLs). Assim, como observado nas doadoras de
embriões, foi verificada também uma correlação significativa e positiva entre a
concentração de progesterona no dia da transferência de embriões e a taxa de ovulação
(r = 63,0; P < 0,001) (Figura 11).
Os embriões descongelados em etilenoglicol resultaram em maiores taxas de
gestação e sobrevivência embrionária (P < 0,05), como mostrado na Tabela13
80
0
1
2
3
4
5
6
0
1
2
3
4
5
Taxa de ovulação
Concentração de P4 (ng/mL)
Figura 11 – Relação entre os perfis de progesterona (P
4
) de receptoras ovinas e o
número de corpos lúteos funcionais no dia da transferência de embriões.
Tabela 13 – Taxas de gestação e de parição, número de crias nascidas e sobrevivência
embrionária em ovelhas mestiças submetidas à transferência de embriões.
% de receptoras
Grupo
N
o
de
receptoras
N
o
de embriões
transferidos
Prenhes
Parindo
N
o
de crias
nascidos
% de sobrevivência
embrionária
ETG
SAC
7
7
17
13
57,1
a
0,0
b
42,9
a
*
0,0
b
4
0
23,5
a
0,0
b
a, b – Valores dentro da mesma coluna com letras diferentes, diferem (P < 0,05).
* Uma receptora do grupo ETG não levou a gestação a termo.
Discussão
Os resultados do presente estudo confirmam que a variabilidade na resposta
ovariana é um dos principais fatores limitantes na superovulação em ovinos. Dentre as
diversas variáveis estudadas influenciando a produção de embriões em ovelhas
81
Morada Nova (variedade branca), a taxa de ovulação e o número de embriões colhidos
foram os parâmetros que mais influenciaram.
Dados relacionados à resposta superovulatória mostraram que a
refratariedade do ovário (< 5 ovulações) das ovelhas Morada Nova (variedade branca)
(25,0%) está de acordo com estudos anteriores realizados com outras raças ovinas, os
quais relataram que 20,0% das fêmeas tratadas não respondem ao tratamento
superovulatório (Brebion
et al.
, 1992; D’Alessandro
et al.
, 1996; Cordeiro
et al.
,
2003).
Com relação à resposta superovulatória, as ovelhas que responderam ao
tratamento com pFSH apresentaram uma maior taxa de ovulação do que aquelas
relatadas para ovelhas Bharat Merino (5,6 ± 2,3) e Rambouillet (5,9 ± 1,9) mantidas
sob condições semi-áridas (Naqvi & Gulyani, 1996; 1999). Em ovinos, a influência da
idade sobre a produção superovulatória é clara e comprovada pelo fato de que a taxa
de ovulação espontânea e natural é afetada pela idade (Theriez
et al.
, 1971), sendo a
melhor produção embrionária observada em torno dos seis anos de idade (Torres
et al.
,
1987). Os dados encontrados em nosso estudo são diferentes daqueles encontrados na
maioria dos resultados da literatura. As ovelhas utilizadas neste trabalho são oriundas
de uma criação extensiva, onde não são raros os casos de partos laboriosos não
assistidos, bem como de afecções do trato reprodutivo. Tais ocorrências reprodutivas
são algumas das principais causas de queda do desempenho reprodutivo subseqüente
de matrizes de produção, acarretando desde falhas no aparecimento do estro até
infertilidade. Assim, as ovelhas adultas estariam mais propensas a passarem por essas
afecções, quando comparadas àquelas jovens, justifcando, assim, a menor resposta
superovulatória do grupo 2 (Alabart
et al.
, 2003).
A RPCL encontrada neste trabalho está de acordo com o verificado em
outros relatos. Este fenômeno é um problema significativo, particularmente, na fêmea
caprina e está, freqüentemente, associado com a superovulação (Tervit
et al.
, 1986).
Este achado também é observado na fêmea ovina, como descrito em quase 40,0% das
doadoras de embriões (Schiewe
et al.
, 1991). Schiewe
et al.
(1990), trabalhando com
ovelhas superovuladas, encontraram que, no dia cinco pós-inseminação, a maioria das
ovelhas apresentava corpos lúteos funcionais, enquanto algumas delas portavam
82
corpos lúteos em regressão. Os mesmos autores ressaltam que os dois tipos de CLs não
são encontrados na mesma ovelha. Todavia, em nosso estudo, corpos lúteos funcionais
foram observados, por várias vezes, juntamente com corpos lúteos em regressão. Sabe-
se, comumente, que a co-existência de corpos lúteos em regressão e outros normais
está em função do momento da observação em relação ao início da luteólise. Portanto,
se a avaliação for realizada exatamente quando o processo luteolítico está iniciando, é
possível que alguns corpos lúteos já apresentem uma mudança na aparência enquanto
outros ainda pareçam funcionais, embora todos eles possam ter iniciado o processo de
regressão (Saharrea
et al.
, 1998).
Embora os animais do grupo B tenham apresentado uma maior
concentração de progesterona do que àqueles do grupo A, não foi verificada diferença
significativa entre os grupos B e C. Tem sido sugerido que o nível de concentração
plasmática de progesterona está mais relacionado à massa luteal do que ao número de
corpos lúteos (Plotka
et al.
, 1970). Portanto, é provável que um grande número de
ovulações apresente tanto uma atividade esteroidogênica como uma massa total
limitada, não diferindo daqueles resultantes de taxas de ovulações menores (Amiridis
et al.
, 2002). Além disso, o excesso de tecido conectivo observado nos corpos lúteos
de ovelhas superovuladas (McClelan
et al.
, 1970) pode ser paralelo com o número
crescente de ovulações.
Com relação ao estro das doadoras, os dados deste trabalho estão de acordo
com a maioria das pesquisas, as quais empregaram tratamentos similares. O tratamento
de sincronização do estro foi eficaz, pois a maioria das ovelhas mostrou estro de forma
concentrada, estando, portanto, de acordo com outros experimentos que utilizaram
MAP associado ao tratamento superovulatório em ovelhas (Mufti
et al.
, 1997; Boscos
et al.
, 2002; Blanco
et al.
, 2003). Todavia, Cordeiro
et al.
(2003) verificaram um
maior intervalo entre a retirada da esponja e o início do estro (36,0 ± 2,7 h) do que
aquele observado em nosso experimento, porém em ovelhas Santa Inês. Este contraste
pode ser explicado pela menor freqüência de detecção de estro realizada naquele
estudo ou, ainda, pelas diferenças entre raças.
Foi verificado que os valores inferiores no número de corpos lúteos e nas
concentrações de progesterona, observados nas ovelhas do grupo A, coincidiram com
83
longos intervalos entre a retirada da esponja e o início do estro. Outros estudos (Torres
et al.
, 1987; Martemucci
et al.
, 1988) mostraram uma relação significativa entre o
início do estro e a taxa de ovulação.
Num programa de múltipla ovulação e transferência de embriões (MOTE),
o sucesso não depende somente da resposta ovulatória à gonadotrofina exógena, mas
também das taxas de recuperação e de fecundação (Naqvi
et al.
, 1999). Nesse
contexto, a MOTE pode ser uma ferramenta útil para auxiliar na multiplicação e
preservação dos animais da raça Morada Nova (variedade branca), pois as taxas de
recuperação embrionária e de fecundação foram consideradas satisfatórias. A taxa de
recuperação embrionária média no presente estudo (71,2%) é comparável àquelas
utilizando o mesmo método cirúrgico para colheita (Torres & Sevellec, 1987; Baril
et
al.
, 1995; Cordeiro
et al.
, 2003; Blanco
et al.
, 2003). Já a taxa de fecundação, por sua
vez, foi maior do que o observado em outros trabalhos os quais utilizam tratamentos
superovulatórios em ovinos (Moor
et al.
, 1985; D’Alessandro
et al.
, 1996). A dosagem
de pFSH utilizada no presente trabalho parece não ter alterado os perfis endócrinos, as
funções bioquímicas dos oócitos e o transporte espermático, sugerindo a ausência de
um prejuízo sobre o número de estruturas fecundadas.
Os estádios embrionários observados no presente trabalho sugerem que as
ovelhas Morada Nova (variedade branca) devem apresentar homogeneidade no
momento das ovulações e, conseqüentemente, uma produção embrionária homogênea,
pois somente embriões variando de mórula a blastocisto expandido foram observados.
Bari
et al.
(2003) observaram resultados semelhantes, onde estádios embrionários
compreendidos entre mórula inicial e blastocisto em eclosão foram encontrados,
confirmando que cinco a seis dias após a monta é o melhor momento para colher
embriões nos estádios de mórula e blastocisto.
Cordeiro
et al
. (2003), contudo, produziram embriões variando de embriões
de 4 a 6 células até blastocistos eclodidos, porém em ovelhas Santa Inês.
Provavelmente, o tratamento superovulatório induziu elevados perfis gonadotróficos,
os quais promoveram uma produção embrionária heterogênea nas ovelhas Santa Inês,
sugerindo a existência de diferença entre raças.
84
Em nosso estudo, aproximadamente 76,0% das estruturas foram
classificadas como de grau I, sendo observados resultados similares em estudos
anteriores com diferentes raças de ovinos lanados (Baril
et al.
, 1995; Cognié, 1999).
Estes dados, associados aos achados da presença de RPCL, sugerem que a insuficiente
função luteal não parece afetar a produção embrionária em ovelhas Morada Nova
(variedade branca) submetidas à MOTE.
Foi constatado ainda, um menor número de embriões de grau I no grupo de
resposta ovariana mínima, o que está de acordo com o observado, em ovelhas
Aragonesa, por Abecia
et al.
(2001), os quais verificaram que a secreção total de
progesterona no grupo de doadoras de embriões transferíveis (1600,97 ng/mL) foi,
significativamente, maior (P < 0,05) do que aquela mensurada no grupo de fêmeas
apresentando embriões anormais (826,30 ng/mL).
A correlação positiva e significativa entre a concentração plasmática de
progesterona no dia da colheita de embriões e o número de corpos lúteos por ovelha,
observada em nosso experimento, está de acordo com os resultados de trabalhos
anteriores em ovinos (Bindon
et al.
, 1971; Eastwood
et al.
, 1976; Oyedipe
et al.
, 1989;
Samartzi
et al.
, 1995). Ressalta-se que a relação entre a concentração de progesterona
após a superovulação e o número de bons embriões, ainda, não tem sido estudada em
ovinos.
A correlação negativa observada entre o momento do início do estro em
relação ao fim do tratamento progestágeno e a taxa de ovulação está de acordo com o
encontrado na literatura (Torres
et al.
, 1987). Uma baixa resposta ao tratamento
superovulatório cursa com uma baixa secreção de 17
β
-estradiol por parte dos folículos
estimulados a maturar, o que, por sua vez, implica em um longo intervalo entre a
retirada da esponja e o início do estro (Martemucci
et al.
, 1988).
A habilidade de prever a resposta ovariana de ovelhas a um tratamento
superovulatório é de extrema importância para decidir se uma doadora deve ser
submetida à colheita de embriões, bem como na programação de procedimentos, tais
como a transferência de embriões ou outras manipulações embrionárias. Um dos
métodos que têm sido, largamente, testado para prever a resposta superovulatória é a
determinação da concentração plasmática de progesterona antes da colheita. Porém,
85
em nosso estudo, a regressão múltipla demonstrou que o número de embriões colhidos,
assim como a taxa de ovulação são parâmetros mais importantes na predição do
número de embriões transferíveis.
Em trabalhos com bovinos, os resultados de determinados estudos indicam
que a predição precisa do número de embriões antes da colheita não é possível (Greve
et al.
, 1983). Contudo, Mehmood
et al.
(1991) propuseram a mensuração simultânea
de 17
β
-estradiol e progesterona, a fim de obter uma predição mais precisa. Por outro
lado, Wubishet
et al.
(1991) demonstraram que é possível prever, com razoável
precisão, o número de estruturas recuperadas a partir de vacas Holandesas induzidas a
ovular com FSH.
A espécie ovina foi uma das primeiras espécies domésticas na qual a
congelação de embriões foi, experimentalmente, pesquisada (Willadsen
et al.
, 1976).
Pesquisas subseqüentes têm mostrado que as taxas de sobrevivência
in vivo
relatadas
para diferentes técnicas de criopreservação de embriões em diferentes raças têm
geralmente sido baixas e altamente variáveis (21,0 a 73,0%; McGinnis
et al.
, 1989;
Songsasen
et al.
, 1995). As taxas de fertilidade, verificadas em nosso experimento
estão de acordo com o encontrado por Cocero
et al.
(1996), os quais, trabalhando com
ovelhas Manchega, encontraram uma taxa de fertilidade de 62,2% após inovulação de
embriões congelados e descongelados em etilenoglicol, estando, portanto, consistentes
com as taxas de gestação de 35,0 a 55,0%, que podem ser esperadas utilizando um
protocolo padrão de congelação (Fahning & Garcia, 1992).
Em nosso estudo, não foi verificada nenhuma fêmea gestante após a
inovulação de embriões descongelados em uma solução de descongelação, contendo
sacarose. O procedimento de remoção o crioprotetor deve ter influenciado a baixa taxa
de fertilidade obtida com a solução de descongelação a base de sacarose. O método de
descongelação em sacarose parece não ser apropriado, uma vez que nenhum embrião
sobreviveu, diferentemente do etilenoglicol, no qual a sobrevivência embrionária após
descongelação não é afetada pelo procedimento de remoção do crioprotetor (McGinnis
et al.
, 1989; Songsasen
et al.
, 1995). Embora Merry
et al.
(1984) tenham verificado
que as taxas de sobrevivência
in vitro
são maiores com a diluição em etapas do que
com a remoção da sacarose a 0,25 M em uma só etapa, resultados posteriores de Ware
86
e Boland (1987) mostraram que estas diferenças sobre as taxas de desenvolvimento
in
vitro
desapareceram quando a concentração de sacarose utilizada superou 1,0 M.
Conclusões
O número de embriões congeláveis em ovelhas Morada Nova (variedade
branca) é influenciado pela taxa de ovulação e pelo número de embriões colhidos.
O etilenoglicol é o agente crioprotetor mais adequado para descongelar
embriões de ovinos Morada Nova (variedade branca), congelados neste mesmo
crioprotetor pelo método em três etapas.
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91
Discussão Geral
A Múltipla Ovulação e Transferência de Embriões (MOTE) é um processo
complexo e composto por diversas etapas inter-dependentes e de igual importância
para o processo, de forma geral. Tais etapas, por sua vez, são influenciadas por
diversas variáveis, as quais vem sendo investigadas de forma insuficiente e pouco
conclusiva. Em nosso trabalho, observamos um efeito importante da idade, bem como
da taxa de ovulação e do número de embriões recuperados, os quais são parâmetros
inerentes à doadora de embriões.
Efeito da idade sobre a produção embrionária
Os resultados do presente estudo demonstram que o tratamento hormonal
foi eficiente na indução de estro e múltipla ovulação em ovelhas Morada Nova
(variedade branca), já que um alto percentual de ovelhas mostrando estro e
superovulando foi observado nas diferentes idades.
Em ovinos, a influência da idade sobre a produção superovulatória é clara e
comprovada pelo fato de que taxa de ovulação espontânea é afetada pela idade
(Theriez
et al.
, 1971), sendo a melhor produção embrionária observada em torno dos
seis anos de idade (Torres
et al.
, 1987). Os dados encontrados em nosso estudo são
diferentes daqueles encontrados na maioria dos resultados da literatura e isto pode,
provavelmente, ser explicado pelo fato de que ovelhas jovens são, comumente, menos
submetidas a riscos de problemas de saúde (Alabart
et al.
, 2003).
Avaliação da influência de variáveis ligadas à doadora de embriões
Os resultados do presente estudo confirmam que a variabilidade da resposta
ovariana é um dos principais fatores limitantes na superovulação em ovinos. Dentre as
diversas variáveis estudadas influenciando a produção de embriões em ovelhas
Morada Nova (variedade branca), a taxa de ovulação total e o número de embriões
recuperados foram os parâmetros que mais influenciaram.
92
Com relação à resposta superovulatória, as ovelhas que responderam ao
tratamento com pFSH apresentaram uma maior taxa de ovulação do que aquelas
relatadas para ovelhas Bharat Merino (5,6 ± 2,3) e Rambouillet (5,9 ± 1,9) mantidas
sob condições semi-áridas (Naqvi & Gulyani, 1996; 1999). Em ovinos, a influência da
idade sobre a produção superovulatória é clara e comprovada pelo fato de que a taxa
de ovulação espontânea e natural é afetada pela idade (Theriez
et al.
, 1971), sendo a
melhor produção embrionária observada em torno dos seis anos de idade (Torres
et al.
,
1987). Os dados encontrados em nosso estudo são diferentes daqueles encontrados na
maioria dos resultados da literatura. As ovelhas utilizadas neste trabalho são oriundas
de uma criação extensiva, onde não são raros os casos de partos laboriosos não
assistidos, bem como de afecções do trato reprodutivo. Tais ocorrências reprodutivas
são algumas das principais causas de queda do desempenho reprodutivo subseqüente
de matrizes de produção, acarretando desde falhas no aparecimento do estro até
infertilidade. Assim, as ovelhas adultas estariam mais propensas a passarem por essas
afecções, quando comparadas àquelas jovens, justifcando, assim, a menor resposta
superovulatória do grupo 2 (Alabart
et al.
, 2003).
A correlação significativa entre a concentração plasmática de progesterona
no dia da colheita de embriões e o número de corpos lúteos por ovelha, observada em
nosso experimento, está de acordo com os resultados de trabalhos anteriores em ovinos
(Bindon et al., 1971; Eastwood et al., 1976; Oyedipe et al., 1989; Samartzi et al.,
1995). A relação entre a concentração de progesterona após a superovulação e o
número de bons embriões, ainda, não tem sido estudada em ovinos.
A habilidade de prever a resposta ovariana de ovelhas a um tratamento
superovulatório é de extrema importância para decidir se uma doadora deve ser
submetida à colheita de embriões, bem como na programação de procedimentos, tais
como a transferência de embriões ou outras manipulações embrionárias. Um dos
métodos que têm sido, largamente, testado para prever a resposta superovulatória é a
determinação da concentração plasmática de progesterona antes da colheita. Porém,
em nosso estudo, a regressão múltipla demonstrou que o número de embriões colhidos,
assim como a taxa de ovulação total são parâmetros mais importantes na predição do
número de embriões transferíveis.
93
Em trabalhos anteriores com bovinos, os resultados de determinados
estudos indicam que a predição precisa do número de embriões antes da colheita não é
possível (Greve
et al.
, 1983). Contudo, Mehmood
et al.
(1991) propuseram a
mensuração simultânea de 17
β
-estradiol e progesterona, a fim de obter uma predição
mais precisa. Além disso, Wubishet
et al.
(1991) demonstraram que é possível prever,
com razoável precisão, o número de estruturas recuperadas a partir de vacas
Holandesas induzidas a ovular com FSH.
Avaliação da influência da solução de descongelação sobre a sobrevivência
embrionária
As taxas de fertilidade, verificadas em nosso experimento estão de acordo
com o encontrado por Cocero
et al.
(1996), os quais, trabalhando com ovelhas
Manchega, encontraram uma taxa de fertilidade de 62,2% após inovulação de
embriões congelados e descongelados em etilenoglicol, estando, portanto, consistentes
com as taxas de gestação de 35-55%, que podem ser esperadas utilizando um
protocolo padrão de congelação (Fahning & Garcia, 1992).
Em nosso estudo, não foi verificada nenhuma fêmea gestante após a
inovulação de embriões descongelados em uma solução de descongelação, contendo
sacarose. O procedimento de remoção do crioprotetor deve ter influenciado a baixa
taxa de fertilidade obtida com a solução de descongelação a base de sacarose. O
método de descongelação com sacarose parece não ser apropriado, pois,
diferentemente do etilenoglicol, no qual a sobrevivência embrionária após
descongelação não é afetada pelo procedimento de remoção do crioprotetor (McGinnis
et al.
, 1989; Songsasen
et al.
, 1995), os dados disponíveis não são, ainda, conclusivos.
Embora Merry
et al.
(1984) tenham verificado que as taxas de sobrevivência
in vitro
são maiores com a diluição em etapas do que com a remoção da sacarose em uma só
etapa com 0,25 M de sacarose, resultados posteriores de Ware e Boland (1987)
mostraram que estas diferenças sobre as taxas de desenvolvimento
in vitro
desapareceram quando a concentração de sacarose utilizada supera 1,0 M.
94
Conclusões Gerais
Portanto, tanto a resposta ovariana como a produção embrionária de ovelhas
Morada Nova (variedade branca), em diferentes idades, submetidas a um tratamento
padrão de superovulação foram consideradas satisfatórias. O uso da MOTE em
ovelhas mais jovens (
DQRVGH LGDGH GHVWD UDoD RYLQD SDUHFH VHU XPD IHUUDPHQWD
útil para acelerar a preservação da raça Morada Nova (variedade branca).
Além disso, dentre as diversas variáveis que poderiam influenciar a
produção de embriões em ovelhas Morada Nova (variedade branca), a taxa de
ovulação total e o número de embriões colhidos são as mais importantes na predição
do número de embriões congeláveis.
O etilenoglicol é o agente mais adequado para descongelar embriões de
ovinos Morada Nova (variedade branca), congelados neste crioprotetor pelo método
em três etapas, já que apresenta melhores taxas de sobrevivência embrionária, quando
comparado à sacarose.
Perspectivas
Os resultados obtidos neste trabalho nos levam a vislumbrar as seguintes
perspectivas:
a) Concretizar a formação do banco de germoplasma e garantir a
preservação de ovinos Morada Nova (variedade branca) através do
aumento do número de embriões congelados. O conhecimento das
variáveis que influenciam a produção de embriões irá contribuir com a
concretização deste objetivo.
b) Utilizar o processo de MOTE em outras raças ovinas, as quais estejam
ou não em vias de extinção.
95
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111
ANEXOS
Artigo 1: COLHEITA DE EMBRIÕES EM
PEQUENOS RUMINANTES: PREMISSAS E
PROMESSAS (
Ciência Veterinária nos Trópicos 6: 96-
105, 2003
)
Artigo 2: EFEITO DA IDADE DA DOADORA SOBRE
A PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA EM OVELHAS
MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA)
PARTICIPANDO DE UM PROGRAMA DE
CONSERVAÇÃO NO BRASIL (
Artigo submetido para
publicação no periódico científico: Tropical Animal
Health and Production
)
112
113
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116
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119
120
121
122
Effect of age of donor on embryo production in Morada Nova (variety
white) ewes participating of a conservation program in Brazil
E.S. Lopes Júnior
1
, E.L.M.M. Maia
1
, N.R.O. Paula
1
, D.I.A. Teixeira
1
,
A.B.S. Villarroel
2
, D. Rondina
1
, V.J.F. Freitas
1
1
Laboratory of Physiology and Control of Reproduction,
State University of Ceará, Faculty of Veterinary, 60740-000, Fortaleza, CE, Brazil
2
Federal University of Ceará, Faculty of Animal Science, 60455-760, Fortaleza, CE, Brazil.
Corresponding author: Vicente José de Figueirêdo Freitas
Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução
Universidade Estadual do Ceará
Faculdade de Veterinária
Av. Paranjana, 1700 – Fortaleza, CE, 60.740-000
BRAZIL
E-mail: vjff@uece.br
Phone / Fax: 55-85-299-2750
Lopes Júnior, E.S., Maia, E.L.M.M., Paula, N.R.O., Teixeira, D.I.A., Villarroel, A.B.S.,
Rondina, D. and Freitas, V.J.F. Effect of age of donor on embryo production in Morada Nova
(variety white) ewes participating of a conservation program in Brazil. Tropical Animal
Health and Production.
123
ABSTRACT
In order to evaluate the embryo production in Morada Nova (variety white) ewes participating of a
superovulatory treatment with pFSH, twenty cycling ewes were used as embryo donors and allocated
into two groups according to age in group 1 (ewes aging 1 to 2 years old; n = 9) or group 2 (ewes
aging 3 to 4 years old; n = 11). Synchronization of estrus was performed using a vaginal sponge
impregnated with 60 mg of MAP inserted for 14 days. Forty-eight hours prior progestagen removal,
superovulatory treatment was started. Animals were superovulated with 200 IU (50/50, 25/25 and
25/25) of pFSH at 12 h intervals. Ewes were tested for estrus with one fertile ram of the same breed
from 12 h after sponge removal and every four hours as long as they exhibited standing estrus. The
hand mating was performed at estrus onset and 24 h later. Six days after first mating, ewes were
subjected to laparoscopy for ovarian examination, followed by embryo collection by laparotomy. The
superovulatory response was considered when five corpora lutea, at least, were observed. Recovered
embryos were searched and evaluated under stereomicroscope according to criteria of IETS. No
significant difference (P > 0.05) was verified between groups concerning time interval to onset to
estrus. However, the overall percentage of ewes presenting estrus was higher between 24 and 28 h
(55%) after the removal of sponge (P < 0.05). It was not observed significant difference between
experimental groups regarding percentage of ewes superovulating (P > 0.05). The overall mean (±
SEM) ovulation rate was 7.4 ± 0.9 and the ewes in group 1 presented a higher ovulation rate (P < 0.05)
than the ewes in Group 2 (10.2 ± 1.2 vs. 5.0 ± 0.8). The overall recovery rate was 64.6% (5.0 ± 0.7
structures per ewe) and 86.3% of recovered structures were fertilized. Group 1 was superior (P < 0.05)
than group 2 according to recovered (6.6 ± 0.9 vs. 3.6 ± 0.8) and fertilized structures (5.6 ± 1.1 vs. 3.5
± 0.7) per ewe. Grade I embryos were significantly predominant (P < 0.05) regarding all treated ewes.
In conclusion, the ovarian response and the embryo production, at different ages, in Morada Nova
(variety white) sheep submitted to a standard superovulation treatment were considered satisfactory. In
addition, the use of MOET in younger ewes (
124
efficient tool in order to accelerate the preserving the Morada Nova (variety white) breed since that
younger ewes are as responsive as older ones.
Key words:
conservation; embryo production; Morada Nova; sheep.
Abbreviations
: IU, international units; MAP, medroxyprogesterone acetate; MOET, multiple ovulation
and embryo transfer; pFSH, porcine follicle stimulating hormone; SEM, standard error mean; PRCL,
premature regression corpora lutea.
INTRODUCTION
The Brazilian sheep flock consists of 14 millions animals with approximately 56%
raised in the North-eastern region (IBGE, 2002). Sheep explored in this area represents an
important economical source for the breeders, being explored mainly for the meat and skin
production. However, productive efficiency of most of local animals raised in the North-
eastern Brazil is low due to management conditions, but, especially, because it does not have
a genetic improvement program a
125
extinction of this breed, probably, induces the definitive lost of relevant characteristics
associated to adaptability to harsh environment.
In small ruminants, embryo transfer is a relevant tool not only for increasing the
reproductive rate of selected donors (Cognié, 1999) and for health control in germplasm
exchanges (Thibier and Guérin, 2000), but also for the salvage of endangered native breeds
(Solti et al., 2000). Recently, in North-eastern Brazil, governmental institutes of research and
teaching started a conservation program of Morada Nova (variety white) breed using embryo
transfer. However, the response of embryo donors of several sheep breeds is extremely
variable and several factors as the age of donors (Alabart et al., 2003) appear to be responsible
by this variability. In addition, information about embryo production of local sheep breeds
raised in North-eastern Brazil is scarce (Cordeiro et al., 2003).
Thus, the objective of the current study was to evaluate the ovarian response and the
embryo production of Morada Nova (variety white) ewes at different ages receiving a
standard superovulation treatment.
MATERIALS AND METHODS
Location and experimental animals
The experiment was conducted at the Laboratory of Physiology and Control of
Reproduction located in Fortaleza, North-eastern Brazil, at 3°43’47’’ South and 38°30’37’’
West. The mean annual rainfall is 1300 mm with an erratic distribution throughout the year.
The mean annual temperature and humidity is 27
o
C and 77%, respectively (Funceme, 2003).
Twenty non-pregnant and cycling Morada Nova (variety white) ewes showing at start
of experiment (mean ± SEM) 2.7 ± 0.2 years of age, 31.2 ± 1.1 kg of body weight and 2.6 ±
0.1 of body condition score (range 1–5), were used as embryo donors. They were kept in
126
typical ground-level housing. The ewes received Pennisetum purpureum ad libitum and were
supplemented with 400 g of commercial concentrate per ewe daily (18% crude protein) to
provide 150 % of energy and protein requirement for maintenance of live weight (NRC,
1985). The ewes had free access to water and mineral salt. The ewes were allocated into two
groups according to age, but similar body weight and condition score. Thus, ewes aging 1 to 2
and 3 to 4 years old were allocated in groups 1 (n = 9) and 2 (n = 11), respectively.
Estrus synchronization and superovulation treatment
Synchronization of estrus was performed using a vaginal sponge containing 60 mg of
medroxyprogesterone acetate (Progespon
, Syntex, Argentine) inserted for 14 days. Forty-
eight hours prior progestagen removal, superovulatory treatment was started. Animals were
superovulated with 200 IU of pFSH (Pluset
, Calier, Spain) at 12 hours intervals (50/50,
25/25 and 25/25). Sponges were removed at the time of the fifth pFSH injection.
Estrus detection and fertilization
Ewes were tested for estrus with one fertile Morada Nova (variety white) ram from 12
hours after sponge removal and every four hours as long as they exhibited standing estrus.
Ewes were mated at estrus onset and 24 hours later. The ewes were subjected to five
schedules that permitted to use two ewes per time in order to preserve both the sexual vigor
and semen quality of the ram.
Ovarian response and embryo recovery
Six days after first mating, ewes were subjected to laparoscopy (Oldham and Lindsay,
1980) for ovarian examination, when the corpora lutea were counted. The animals were fasted
for at least 24 h prior to laparoscopy. During the laparoscopy, ewes that presented at least one
127
corpus luteum were indicated to embryo recovery which was performed following the
procedure employed by Baril et al. (1995). In brief, after a midventral laparotomy, the genital
tract was exposed and the ewes with at least five corpora lutea were registered and classified
as having a superovulatory response. For embryo recovery, a catheter 14GA x 1.88IN
(Angiocath
, BD, Brazil) connected to a sterile 20 ml syringe containing flushing media (40
ml of modified Dulbecco’s phosphate buffer saline - DPBS) was in a t
128
RESULTS
Only one ewe treated for estrus synchronization and superovulation of each group did
not exhibit signs of estrus (Table 1) although all remaining females presented estrus within
two days (Fig 2). Although no significant difference (P > 0.05) was verified between groups
concerning time interval to onset to estrus (Table 1), the overall percentage of ewes presenting
estrus was higher between 24 and 28 h (55%) after the removal of sponge (P < 0.05). The
estrus length of all ewes was 46.7 ± 2.1 h and no significant difference (P > 0.05) was verified
between groups. Concerning ovulatory response, all estrus were followed by, at least, one
ovulation (Table 1).
Data concerning superovulatory response of the ewes are presented in Table 2. It was
not observe Td2.(e)Tj0.17992 0 Td(s)Tj-0.01( Td2.8 Tc3.11992 0 Td0.86832 Tw(e )T1( Td2.8 T.91992(e)Tj0.01584 Tc4.9i)Tj-0.08Tc3.83984 0 Td(i)Tj0.03168 Tc3 0 Td(ca)Tj0 Tc10.0797 0 Td(3984 0 Td(l)Tj0.03168 Tc3.12416 Tc7.01992 0 Td(g)Tj09199 Td(D)Tj0.03168 Tc8.1590 Tc10.6797 0(9 0 Td(e)Tj0.01584.014j0.17208 3624 Tc5.03984 0 (h)Tj0.10416 Tc5.63984 0 Td51992 0 Td(e)Tj Td(f)Tj0.1012461(o)Tj0.08376 Tc5.51992168 Tc3.23984 0 T8 Tw(d )Tj0I)Tj0.10418284 0 Td0.1Tc5.03984 (b)Tj0.17208 c3.12416 Tc7.01992 0 Td(gx4 Tc5.03984 0 Td(r)Tj91992 0 Td(o)Tj-0.12 Tc5.63984 0 Td624 Tc11.2797 0 Td0.93624 Tw() )Tj0.01584 Tc7.2 0 Td(w84 0 Td(g)Tj0 Tc5.510 Tc3.7207 0 Td832 Tw(e )Tj-0. Td(l)Tj0.15168 Tc3.-0.12 Tc3.71992 j-0.12 Tc5.63984 0 Td(p)Tj0. Td(e)Tj0 Tc5.03984418303624 Tc9.11992 0 Td(Td(n)Tj0.03158 -25.9199 Td(b)Tj0.03168 Tc5.63984 0 Td(e)Tj0.10416 Tc.03168 Tc7Tj-0.03624 T)Tj Tw(n )Tj-0.01584 Tc-420)Tj-0.01584 Tc5.6390.05208 Tc5.03984 0 Td0.96790.03168 Tc5.63984 0 Td(e)97 0 Td2.71584 Tw(t ).15168 Tc5.51992 00.15168 Tc3.11992 0 Tdi)Tj0.08376 Tc3.23984 0 Td(f)Tj-0.01584 5.03984 0 Td(s)Tj-0.22416 Tc7.07969 0 Td(418284 0 a)Tj-0.12 (b)Tj0.17208 91992 0 Td(o)Tj-0.12 Tc5.63984 0 Td624 Tc11.2797 0 Td0.93624 3984 0 Td(l)Tj0.03168 Tc1992 0 Td(o)Tj- 0 Td0.93624 Tw(l)Tj0.15168 Tc3. Tw(g )Tj-0.01584 Tc8.4 0 Td(t)Tj0.10416 T984 0 Td(l)Tj0 0 Td0.9362 Td(e)Tj-0.15624 Tc5.039842.60.01584 Tc9.47969 0 Td)Tj5o)Tj0.10492 0 Td(e)Tj0.15168 Tc5.039842.9598 0 T5977 0 Td(n)Tj--0.063451992 0 Td(l)Td(t)Tj0 Tc3.11992 0 Td0.18 Tw(h o)Tj0.08376 Tc14.2797 0 Td-0.14376 Tw(f )Tj0.15168 Tc6.6 0 Td(a)Tj398 0 Td(3992 0 Td(a)Tj0. Td(s)Tj0.03168 Tj-0.03624 Tc5.15977 0 Td(r)Tj0 Tc3.71992 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj0 Tc3.11992 0 Td(n)Tj-v977 0 Td(s)Tj0 Tj-0.03624 Tcn)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj Tw(e )Tj0 Tc7.91992 0 Td(1)Tj Tc5.63984 0 Td(c)Tj0 Tc5.03984 0 Td(h)TTj-0.03624 Tc5.63984 0 Td(r(e)Tj0g-0.01584 Tc-4202 0 Td(h)Tj03.71992 0 Td(f)Tj0.03168 Tc3.8024 Tw(f )Tj0.17208 Tc7..08832 Tc10.68 Tc86.6 0 >.02832 Tw(eTd(u)Tj-0.11.2797 0 Td(ng)Tj0.03168 Tc11.0398 0 Td1.34832 Tw(e )Tj-0.03624 Tc9.23984 0 Td(()Tj-0.03168 Tc-8 Tc6.83984 0 68 Tc4.3199Tc11.2797 0 TT Tc11.03(n)Tj-0.01584Tj0.05208 Tc5.513984 0 Td(e)T3984 0 Td Td-0.09168 Tw(e )Tj0 Tc7.8 0 Td(1)Tj-0.03624 Tc5.6395.03984 0 Td(r)Tj-0.01584 Tc0 Td(t)Tj0.15168 Tc3.119990.05208 Tc5.03984 0 T7 0 Td(a)Tj0 Tc5.03984 0 Td(d(1)Tj Tc5.63984 0 Td(c)Te)T38j0.0316l68 Tc3.71992 0 T(a)Tj-0.0158.14 Tw(hough )Tj0.15168 Tc3ed(s)Tj-0.01-(r(e)Tj0Tj0 Tc3. 0 Td).15168 Tc4.9d(ce)Tj-0.15624 Tc10.0797 0 Td(r)Tj0 Tc3.6 0 Td(n)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(i)Tj0 Tc3.11992 0 Td(n)Tj-0.121992 0 Td(w)Tj0.03168 Tc1584 5.03984 0 Td(s)Tj-421.431 -25.9199 Td(5168 Tc4.93624 3984 0 Td(l)Tj0.03168 T(p)Tj0.03168 Tc5.51992 0 Td(e)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td084 Tc5.63984 0 Td( Tc3.11979 0 Td(o)Tj0.083c3.71992 0 Td1.46832 Tw Tc9.23984 0 Td(>)Tj0 Tc6.24 Tc6.6 0 Td(a)3. 0 Td(32736832 Tw7Td(()Tj-08 Tc4.91992 0 Td-0.23208 Tw(-(r(e)Tj04e)Tj-0.15624 TcTd(on)Tj68 Tc86.6 0 ±Tj0.01584 Tc4.91992 0 0Td(()Tj-08 ng)Tj0.03168 Tc11.0308 Tw(-(rj0 Tc9d0.1Tc5.03984 2 0 Td(h)Tj0.15160 Tc5.51992 0 Td-(r(e)Tj0T168 Tc3.71992 0 Td(5168 Tc4.984 0 Td(b)Tj-0.01584 Tc5.639208 Tc5.513984 0 Td(e)T3384 0 Td T3984 0 Td(t)Tj0Tj0.08376 Tc0.08376 Tc5.51992168 Tc3.2398(a)Tj398 0 Td92 0 Td(n)Tj-992 0 Td0.14832 Tw(e )Tj-421.416 Tc6.6 0 Td(u)Tj0.17208 Tc5.51992 0 Td1.0(b)Tj0.1041d(e)T03624 8 Tc6G-0.01584 Tc-4202 0.15168 Tc3.11992 0 Td0.74832 Tw)Tj-0.1203161 Td(w)Tj0.03168 39 Tc4.93624 39c5.63984 0 Td(l)Tj0.15168 Tc3.11992 0 Td(a)Tj-0.0158405208 Tc5.03984 0 Td0.00792 Tw(l)Tj0.15168 Tc3. 0 Td(a)Tj-0.01584 Tc5(s )Tj0 Tc8.63984 0 Td(p)Tj-0.15624 Tc5.63984 02.46-0.12 Tc5.639.3199 0 T0-0.03624 T)Tjd())Tj-0.06 T1584.014j0.17208 .11992 0 Td(r)Tj-0.12 Tc3.71992 0 Td(u)Tj0.17208 Tc51.20792 Tw(s )Tj-0.10416 Tc8.75977 0 Td(w)Tj0.03168 Tc8.03984 0 Td(a)Tj-0.06.06 Tc5.03984 0 Td(a)Tj0.05208 Tc5.03on)Tj0.03168 Tc11.2797 0 Td(ce)Tj-0.15624 Tc10.0797 56792 Tw(s )Tj0.01584 Tc9.1Tj0 Tc8.63984 0 Td(p)T(i)Tj Tw(e )Tj0 Tc7.91992 0 Td(1)Tj Tc5.63984 0 Td(c)Tj0 Tc5.03984 0 Td(h)T)Tj-0.120421.431 -25.9199 Td6)Tj-0.12 Tc3.119990.05208 Tc5.03984 0 T7 0 Td(4 Tc5.03984 0 Td(i)Tj8.4 0 Td(t)Tj0.10416 2.4 Tc5.63984 0 Td(i)Tj0 Tc)Tj5o)Tj0.10484 0 Td(b)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(l)Tj0.03168 992 0 Td(.)Tj0 Tc3 0 )Tj-0.12Td1.08792 Tw(s )(b)Tj0.17208 84 0 Td(b)Tj-0.01584 Tc5.63984 0 Td(l)Tj0.03168 )Tjd())Tj8 Td2.22 Tw( )T.014j0.17208 c7.4398422 Tw(s )8.15977 0 Td(n)Tj Tc3.11992 0 Td0.86838(a)Tj398 0 Td92 0 Td(n)Tj)Tj Tw(n )Tj-0.0
129
During evaluation, it was verified different stages of embryo development (Fig 3).
However, it was observed a higher (P < 0.05) percentage of embryos in morula stage (45.1%)
than the other ones (compact morula – 19.6%; early blastocyst – 7.3%; blastocyst – 20.7%;
expanded blatocyst – 7.3%). Group 1 presented a higher (P < 0.05) number of blastocysts than
Group 2 (2.1 ± 0.8 vs. 0.0 ± 0.0) although no significant difference was verified between
groups regarding the other stages of embryos. Considering embryo quality, grade I embryos
were significantly predominant (69.5%; P < 0.05) regarding all treated ewes, but no
significant difference was observed between experimental groups for all grades of embryo
quality. In addition, it was observed that the occurrence of PRCL did not affect the embryo
quality, because among ewes presenting luteal regression only 17.9% (5/28) of recovered
embryos were classified as grade III or IV.
DISCUSSION
The results from the current study demonstrate that the hormonal treatment was
efficient to induce estrus and multiple ovulations in Morada Nova (variety white) ewes, since
a high percentage of ewes showing estrus and superovulation were observed in different ages.
Regarding estrous behavior, the data in the current study are consistent with the most of
studies, which employed similar treatments. The estrus synchronization treatment was
efficient since the most of ewes showed estrus distributed in a short time period. These results
are in agreement with other studies that used MAP associated to superovulatory treatment in
ewes (Mufti et al., 1997; Boscos et al., 2002; Blanco et al., 2003). However, Cordeiro et al.
(2003) observed in Santa Inês ewes a larger interval to onset to estrus (36.0 ± 2.7 h) than that
observed in our experiment. This contrast can be explained by the higher frequency of estrus
detection performed in the present study or by individual differences between breeds. Other
130
studies (Torres et al., 1987; Martemucci et al., 1988) showed a significant relationship
between onset of estrus and ovulation rates explaining because almost all of estrous behaviors
were associated to ovulations.
Data concerning superovulatory response showed that the refractoriness of ovary (< 5
ovulations) of Morada Nova (variety white) ewes (25%) is in agreement with previous studies
which have related that 20% of treated females do not respond to superovulation treatment
(Brebion et al., 1992; D’Alessandro et al., 1996; Cordeiro et al., 2003). However, the ewes
that responded to superovulatory treatment with pFSH presented a higher ovulation rate than
those reported for Bharat Merino (5.6 ± 2.3) and Rambouillet (5.9 ± 1.9) ewes maintained
under semi-arid conditions (Naqvi and Gulyani, 1996, 1999). In sheep, the influence of age on
superovulatory yield is clear and determined by the fact that natural and spontaneous
ovulation rate is affected by age (Theriez et al., 1971), and the best embryo production will be
found at around 6 years old (Torres et al., 1987). The data found in our study is in contrast
with the most of results in the literature and it probably could be explained by the fact that
young ewes are likely to have experienced fewer diseases and health problems (Alabart et al.,
2003).
Concerning the best ovulation rate observed in left ovary of younger ewes, similar
findings have been reported (Mufti et al., 1997; Scaramuzzi and Downing, 1997), possibly
due to the fact that hormonal control of folliculogenesis and ovulation rate might be
modulated by unknown local factors within the ovary and its vasculature (Scaramuzzi and
Downing, 1997).
The findings concerning PRCL in the present study are in agreement with other reports.
The occurrence of this phenomenon is a significant problem often associated with
superovulation in goats (Tervit et al., 1986) and ewes since that it has been reported in almost
40% of embryo donor ewes (Schiewe et al., 1991). Schiewe et al. (1990), working with
131
superovulated ewes, found that at Day 5 after insemination, a given ewe would either have
all-normal or all-regressing corpora lutea, but not a combination. In our study, we found
several instances in which normal-looking corpora lutea were found together with regressing
corpora lutea. It is likely that the coexistence of normal-looking and regressing corpora lutea
is a function of the timing of observation in relation to the actual onset of luteolysis.
Therefore, if laparoscopy is performed just when the luteolytic process is starting it is possible
that some corpora lutea may already show a change in appearance while others still look
normal, even though all of them may have started to regress (Saharrea et al., 1998).
In the embryo transfer programme, the success rate not only depends on ovulatory
response to the exogenous gonadotrophin, but also to the proportion of ova/embryo reccon o
132
blastocyst stages. In contrast, Santa Inês ewes produced embryos ranging in development
from early embryos (4-6 cells) to hatched blastocysts (Cordeiro et al., 2003). Probably, the
superovulatory treatment promoted higher gonadotrophin profiles that induced a heterogenous
embryo production in Santa Inês ewes, suggesting the existence of a difference among breeds.
Here, almost 70% of recovered embryos were classified as excellent or good quality
(able to transfer or cryopreservation), similar to earlier studies with different breeds of wool
sheep (Baril et al., 1995; Cognié, 1999). These data associated to findings of presence of
PRCL suggest that the insufficient luteal function does not appear affect the embryo
production in Morada Nova (variety white) ewes submitted to MOET.
CONCLUSION
In summary, in Morada Nova (variety white) sheep, the ovarian response and the
embryo production at different ages submitted to a standard superovulation treatment was
considered satisfactory. The use of MOET in younger ewes (
appear to be an efficient tool in order to accelerate the preserving the Morada Nova (variety
white) breed since that younger ewes are as responsive as older ones.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors acknowledge the generous supply of Pluset® by Calier Laboratories (Brazil).
The study was partially financed by FUNCAP and FUNDECI (Brazil). V.J.F. Freitas and
A.B.S. Villarroel are senior investigators of CNPq (Brazil).
133
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137
Fig. 1. Ewes (A) and ram (B) of Morada Nova (variety white) breed.
A
B
138
Table 1
Estrus and ovulatory response of Morada Nova (variety white) ewes after superovulation
treatment.
Parameter
Group 1
Group 2
Treated ewes (n)
Ewes in estrus (%)
Ovulating ewes (%)
Time to estrus (h)
Estrus length (h)
9
8 (88.9)
9 (100.0)
26.0 ± 2.8
43.0 ± 1.8
11
10 (90.9)
10 (90.9)
25.2 ± 1.9
49.6 ± 3.3
139
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
% ewes in estrus
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Time interval to onset of estrus (h)
Group 1
Group 2
NE
Fig. 2. Distribution of occurrence of estrus in Morada Nova (variety white) ewes after
superovulation treatment. (NE: no estrus)
140
Table 2
Ovulation rate and premature regression of corpora lutea (PRCL) of Morada Nova (variety
white) ewes after superovulation treatment.
Parameter
Group 1
Group 2
Superovulated ewes (%)
Total ovulation rate
In right ovary
In left ovary
Ewes with PRCL (%)
Partial regression
Total regression
8 (88.9)
10.2 ± 1.2
a
4.0 ± 0.9
6.2 ± 0.6
a
3 (33.3)
1 (33.3)
2 (66.7)
7 (70.0)
5.0 ± 0.8
b
2.5 ± 0.4
2.5 ± 0.6
b
3 (30.0)
1 (33.3)
2 (66.7)
a, b - Values within a row with different letters differ (P < 0.05).
141
Table 3
Ova/embryo recovery and fertilization rate in Morada Nova (variety white) ewes after
superovulation treatment.
Parameter
Group 1
Group 2
Recovered structures
Recovery rate (%)
Recovered structures per ewe
Fertilization rate (%)
Embryos per ewe
59
59/92 (64.1)
6.6 ± 0.9
a
50/59 (84.7)
5.6 ± 1.1
a
36
36/55 (65.5)
3.6 ± 0.8
b
32/36 (88.9)
3.5 ± 0.7
b
a, b - Values within a row with different letters differ (P < 0.05).
142
Fig. 3: Recovered structures from Morada Nova (variety white) ewes after superovulation
treatment: unfertilized at 400 x (A), ruptured zona pellucida at 200 x (B), morula at 400 x (C),
several good quality embryos recovered from a single donor (D) at 400 x. Photographies
performed under inverted microscopy with Hoffman Modulation Contrast
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