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AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
DA PROLIFERAÇÃO DOS
QUERATINÓCITOS INDUZIDA PELOS
STAPHILOCOCCI EPIDERMIDIS NA
ACNEGÊNESE EXPERIMENTAL
Adaucto Hissa-Elian
Orientadores
Prof. Dr. Absalom Lima Filgueira
Prof
a
. Dr
a
. Christina Maeda Takiya
- 2004 -
Rio de Janeiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Medicina
Departamento de Clínica Médica
Pós-graduação em Dermatologia
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
F
ACULDADE DE MEDICINA
Departamento de Clínica Médica
Pós-graduação em Dermatologia
AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DA
PROLIFERAÇÃO DOS QUERATINÓCITOS INDUZIDA
PELOS STAPHILOCOCCI EPIDERMIDIS NA
ACNEGÊNESE EXPERIMENTAL
Adaucto Hissa-Elian
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso
de pós graduação em Medicina Mestrado e
Doutorado em Dermatologia da Faculdade de
Medicina, da Universidade Federal do Rio e
Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Medicina. Área de concentração:
Dermatologia
Banca Examinadora:
__________________________________________________________
Prof. Dr. Cezar Antonio Elias.
Presidente
__________________________________________________________
Prof. Dr
a
Maria de Fátima Scotelaro Alves.
__________________________________________________________
Prof. Dr. Célio Abdalla.
Professores Orientadores: Prof. Dr. Absalom Lima Filgueira
Prof
a
. Dr
a
. Christina Maeda Takiya
2004
Rio de Janeiro
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iii
Hissa-Elian, Adaucto
Avaliação imunohistoquímica da proliferação dos
queratinócitos induzida pelos Staphilococci epidermidis na
acnegênese experimental / Adaucto Hissa-Elian. Rio de
Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2004
xiii, 88 p.: 19 il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Faculdade de Medicina, 2004.
1. Acne. 2. Acnegênese experimental. 3. Coelhos.
4. Staphilococcus epidermidis. 5. Biofilme bacteriano.
6. Patogenia. 7. Proliferação dos queratinócitos.
8. Imunohistoquímica 9. p63 e PCNA 10. Dermatologia –
Tese.
I – Dissertação Acadêmica (Mestrado) – Faculdade de
Medicina. II. Título
iv
“Além de certo ponto não existe retorno.
Este é o ponto que precisa ser alcançado”
Franz Kafka
v
A Isaura e Abrahão
Pais,
Honório, Irmão
Minha memória fiel.
A Lucas, Elian,
Ethel e Muriel
Filhos,
Meu coração do amanhã...
vi
AGRADECIMENTOS E HOMENAGENS
Ao estimado Professor Absalom Lima Filgueira, Coordenador do
Curso de Pós-Gradução em Dermatologia da UFRJ, mestre e amigo, pela honra, o
privilégio e a alegria do convívio desde o tempo de graduação, e de quem recebi a maior
e melhor porção da minha formação docente e profissional.
A professora Christina Maeda Takyia a quem aprendi a respeitar e
admirar por sua generosidade e competência profissional.
A CAPES por proprcionar parte dos recursos necessários a
realização da tese.
A todos os Professores do Serviço de Dermatologia e
Dermatopatologia da UFRJ com os quais tive a satisfação de conviver e aprender.
Ao professor Roberto Maués de Paula, durante muito tempo
responsável pelo meu aprendizado docente e pela indispensável disciplina profissional.
A Faculdade de Medicina de Teresópolis da Fundação
Educacional Serra dos Órgãos por me oferecer às condições necessárias de tempo e
dedicação ao desenvolvimento da minha dissertação.
Ao Laboratório de Patologia Celular do Departamento de
Histologia e Embriologia do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ, onde realizei
toda a investigação imunohistoquímica, sob a orientação da Professora Christina Maeda
Takyia.
Aos estagiários, estudantes de Biologia, deste mesmo Laboratório
de Patologia Celular, Bernardo Miguel Pascarelli e Dóris Moura, pela dedicação e
carinho, decisivos em muitos momentos dessa trajetória.
A Gilsara Jaqccoud da Costa e Deise Pereira da Cunha pela
indispensável compreensão e ajuda durante todo o transcurso do mestrado.
Ao Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Escola da
Faculdade de Medicina de Teresópolis, muito especialmente a Jandel Santana Jardim
(Dinho), excelente técnico, sempre atencioso à minhas inúmeras solicitações.
Aos professores Rodrigo Siqueira Batista e Andréia Patrícia
Gomes, amigos e colegas da Faculdade de Medicina de Teresópolis, por sua
generosidade e ajuda prestimosa em momentos críticos do desenvolvimento da tese.
A Luiz Felipe Pinto, também professor da Faculdade de Medicina
de Teresópolis, por dedicar tanto do seu precioso tempo no auxílio às análises
estatísticas.
vii
Aos meus alunos e amigos Rodrigo Arana Meira e Rodrigo
Schwartz Pegado, pela paciência e atenção inestimável a todas e infinitas demandas
relativas à computação e digitação do texto, o meu obrigado muitíssimo especial.
A Helena Falcão a quem já devo tantos agradecimentos, mais este
por sua competente e criteriosa revisão do resumo em inglês e sua carinhosa amizade.
A João da Penha e seu Elogio a Heterodoxia, amigo, escritor e
livre pensador, de quem sou tributário de parte do que melhor tenho em minha formação
cultural e humana.
A Karen Aune, Françoise Deruelle e Galileu Resende, amigos,
artistas plásticos, e Alan Soares, ex-aluno, músico e parceiro, a quem minha imaginação
recorre nos momentos de aporia criativa, minha lembrança carinhosa.
A Mário Veloso e Jaqueline Combat, queridos amigos de além-
mar, Porto seguro das minhas ansiedades, meu abraço fraternal e minha saudade.
Ao epifânico e salvador Abraão da Loja do Seu Rui, no Edifício
Central do Largo da Carioca, meu agradecimento especial por sua ajuda diligente e
imprescindível.
A Suzana G. V. Muniz, pela indelével confiança mútua
construída ao longo de tantos anos, minha afetuosa lembrança.
A Roberto Luiz Carneiro Bosi, Administrador do Posto de Saúde
Municipal, Várzea, Teresópolis-RJ, por sua imediata e incondicional compreensão de
minha urgente necessidade de tempo, minha gratidão.
A Roberta Garcia Leal, por seu amor intransitivo a meus
fragmentos amorosos.
Aos meus alunos e pacientes, incondicionalmente.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AO - Ácido oléico
CT - Célula tronco
CTA - Célula trânsito-amplificada
EPU - Unidade proliferativa da epiderme
FESO - Fundação Educacional Serra dos Órgãos
FMT - Faculdade de Medicina de Teresópolis
HE - Hematoxilina-eosina
IgM - Imunoglobulina M
IgG - Imunoglobulina G
IL-1 - Interleucina 1
IL-1α - Interleucina 1 alfa
KGF - Fator de crescimento dos queratinócitos
OC - Orelha de coelho
P.acnes - Propionobacterium acnes
PAS – Ácido periódico de Schiff
PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen
SECN - Staphylococci epidermidis coagulase-negativos
S.epidermidis - Staphylococci epidermidis
ssp - espécies
VAO - Ácido oléico + vitamina A
ix
RESUMO
Hissa-Elian, A. Avaliação imunohistoquímica da proliferação dos queratinócitos induzida
pelos Staphilococciepidermidis na acnegênese experimental. Orientadores: Absa lom Lima
Filgueira, Cristhina Maeda Takiya. Rio de Janeiro: UFRJ/FM, 2004. 88p. Tese(Mestrado em
Dermatologia).
Fundamentos: hiperproliferação com hiperqueratinização defeituosa e presença de
microorganismos (cocci cogulase-negativos, Propionobacterium acnes e leveduras
Malassezia ssp) residentes no microambiente da unidade pilo-sebácea, destacam-se,
entre outros, como a hiperatividade androgênica e inflamação, como principais fatores
envolvidos na patogenia da acne. O mecanismo pelo qual a hiperproliferação ocorre
continuam indeterminados. PCNA e p63 são, ambas, proteínas expressas por células,
em proliferação ou com potencial proliferativo, da camada basal de diversos epitélios,
incluindo a epiderme, podendo ser imunodetectadas por anticorpos específicos.
Modelo Experimental e Objetivos: investigamos a proliferação dos queratinócitos, em
modelo experimental de acnegênese em orelha de coelho, desenvolvido com o objetivo
de avaliar o estatuto proliferativo do contexto epidérmico-infundíbulo folicular em
acnegênese induzida pelos Staphilococci epidermidis provenientes de lesões de
pacientes portadores de acne , com particular interesse na participação das linhagens
bacterianas produtoras de uma substância polissacarídica intercelular de adesão (
biofilme; lama; glicocálix ).
Material e Métodos: recorremos a análise morfológica e, em especial, a
imunohistoquímica utilizando dois anticorpos ( PCNA e P63 ), considerados
marcadores de núcleos de células nas fases iniciais do ciclo celular, comparando os
resultados obtidos no grupo dos animais infectados pelos S.epidermidis produtores de
biofilme bacteriano com o grupo infectado com os S.epidermidis não produtores de
biofilme e com os controles.
Resultados: verificamos haver estímulo proliferativo através do aumento do gradiente
de células tronco e hiperproliferação propriamente estabelecida, através da detecção de
núcleos imunorreativos na camada basal, via de regra, por ambos os marcadores e nos
dois grupos amostrais, isto é, dos animais biofilme positivos e biofilme negativos, com
predominância significativa do índice de células marcadas no grupo biofilme positivos.
Conclusões: o exame dos resultados nos possibilitou inferir que a presença do biofilme
de bacteriano constituiu-se no principal fator responsável pela hiperproliferação
verificada na epiderme e no ducto infundibular, no modelo de acnegênese experimental
induzida pelos Staphilococci epidermidis.
Palavras-Chaves: acne; hiperproliferação; Staphilococcus epidermidis; biofilme;
acnegênese
experimental; imunohistoquímica; PCNA; p63.
x
SUMMARY
Hissa-Elian, A. Immunohistochemical evaluation of keratinocyte proliferation Staphilococci
epidermidis induced in experimental acnegenesis. Advisors: Absalom Lima Filgueira, Cristhina
Maeda Takiya. Rio de Janeiro: UFRJ/FM, 2004. 88p. Thesis (Master´s Degree in Dermatology).
Background: hyperproliferation with abnormal hypercornification, and presence of
microorganisms (cocci coagulase-negatives, Propionobacterium acnes and Malassezia
ssp) residing in the pilosebaceous unit microenvironment, stand out, among others like
androgenic hyperactivity and the inflammatory process, as the main factors involved in
acne pathogenesis. The mechanism, by which the hyperproliferation occurs, is still
uncertain. PCNA and p63 are, both, proteins expressed by cells in proliferation or
containing proliferation potential, inside the basal layer of several ephitelia, including
epidermis, that can be immunodetect by specific antibodies.
Experimental model and goals: we have investigated keratinocyte proliferation based
on experimental model of acnegenesis in rabbit ear. This study aimed at evaluating the
proliferative status of the follicle infundubulus and epidermic context in the acnegenesis
induced by Staphilococci epidemidis proceeding from lesions of acne carrier patients,
with particular emphasis on the participation of bacterial lineage that produces a
polyssacharid intercellular adhesion substance (biofilm , slime, glicocalix ).
Material and Methods: We have used morphologic analysis and, in special,
immunohistochemical evaluation in the presence of two antibodies (PCNA and p63),
that are considered as cell nuclei markers in the initial phases of the cellular cycle.
Results obtained from the group of animals infected by S.epidermidis that produce
bacterial biofilm were compared with the outcomes from the group of animals infected
by S.epidermidis that do not produce bacterial biofilm, and also with controls.
Results: We could confirm that there is proliferative stimulus resulting from the
increase of stem cells pool, and from the hyperproliferation properly established, by
means of the detection of immunoreactive nuclei in the basal layer, as a rule for both
markers, and inside both groups, i. e., the one include positive biofilm and negative
biofilm animals, with meaningful predominance of cell index marked in the positive
biofilm group.
Conclusions: The analysis of the results enabled us to conclude that the presence of
bacterial biofilm was the main factor responsible for the hyperproliferation observed in
the epidermis and in the follicular infundibulum, in the model of experimental
acnegenesis induced by Staphilococci epidermidis.
Keywords: acne; hyperproliferation; Staphlicoccus epidermidis; biofilm; experimental
acnegenesis; immuno-histochemistry; PCNA; p63.
xi
SUMÁRIO
Dedicatória ................................................................................. v
Agradecimentos e Homenagens............................................ vi
Lista das Abreviaturas ............................................................... viii
Resumo ...................................................................................... ix
Summary ..................................................................................... x
Introdução.................................................................................... 1
I. REVISÃO DA LITERATURA..................................................... 3
1.ACNE E ACNEGÊNESE........................................................... 3
1.1. Considerações e Características gerais............................... 3
1.2. Unidade Pilo-sebácea e Produção, Aumento e Composição
do Sebo................................................................................. 3
1.3. Comedogênese – Hiperproliferação, Hiperqueratinização e
Oclusão Óstio-Folicular.................................................... 7
1.4. Ativação dos Queratinócitos; Eventos Inflamatórios Iniciais. 8
1.5. Microflora Cutânea-Folicular................................................. 12
1.5.1. Considerações e Características Gerais..................... 12
1.5.2. Participação na Patogênese....................................... 13
1.5.3. Considerações acerca da Inflamação e Resposta
Imune......................................................................................... 14
1.6. Os Staphilococci epidermidis................................................ 15
1.6.1. Staphilococci epidermidis produtores de
biofilme...................................................................................... 18
1.6.2. Produção, Composição e Antigenicidade do
Biofilme...................................................................................... 18
xii
1.6.3. Staphilococi epidermidis produtor de biofilme e a
Dermatologia.............................................................................. 19
2. Proliferação e Diferenciação dos Queratinócitos.................... 22
3. .Marcadores de Células Tronco e Proliferação Celular
na Epiderme ......................................................................... 27
3.1. PCNA e p63.................................................................... 32
4. Introdução ao Modelo Experimental........................................ 36
II. OBJETIVOS............................................................................. 40
III. MATERIAL E MÉTODOS........................................................ 41
1. Modelo Animal......................................................................... 41
1.1. Experimento.......................................................................... 41
1.2 Coleta das Amostras de S. epidermidis a Partir de Lesões
Humanas...............................................................................42
1.1.3. Preparação para Aplicação no Modelo Animal..................42
1.1.4 Avaliação Clínica das Lesões e Obtenção do Material...... 43
2. Processamento do Material..................................................... 43
2.1. Estudo Morfológico............................................................... 44
2.3. Estudo Imunohistoquímico................................................... 44
2.3. Procedimento Técnico.......................................................... 44
3. Análise Histomorfométrica....................................................... 44
4. Análise Estatística.................................................................... 45
IV. RESULTADOS....................................................................... 46
1. Descrição Morfológica.......................................................... 46
1.1. Animais Controle e Animais Infectados.............................. 46
2. Imunoshistoquímica............................................................... 46
2.1. Animais Controle................................................................ 46
2.2. Animais Infectados Marcados com PCNA......................... 47
2.3. Animais Infectados Marcados com p63.............................. 47
xiii
3. Figuras.................................................................................. 49
V. DISCUSSÃO......................................................................... 60
VI. CONCLUSÕES..................................................................... 66
VII. PERSPECTIVAS FUTURAS............................................... 67
VIII.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................... 68
IX. ANEXOS............................................................................... 83
1
INTRODUÇÃO
A aparente quiescência ostrutiva do comedão, considerado muitas vezes
como lesão inaugural, pré ou não inflamatória, é o resultado provisório e
interdependente de complexo processo etiopatogênico (acnegênese) que encerra os
fenômenos de oclusão (comedogênese), desorganização e resposta imunológica na
unidade pilo-sebácea.
Manifestações inflamatórias podem ser observadas acompanhando todo o
processo de desenvolvimento da acne, desde suas mais iniciais manifestações clínicas
ou sub-clínicas (microcomedões, comedões e pápulas).
A comedogênese, sob os auspícios da hiperatividade androgênica, inicia
e altera a produção e composição do sebo. Promove mudanças estruturais na arquitetura
pilo-glandular e no padrão de queratinização no interior do folículo, com conseqüente
tamponamento óstio-folicular, estabelecendo ambiência ótima de instalação e residência
à microflora composta, principalmente, pelo difteróide anaeróbio Propionobacterium
acnes, pelos cocci coagulase-negativos, os Staphyloccoci epidermidis, como também
por leveduras do gênero Malassezia sp, em especial, a Malassezia symp odialis (Toyoda
M & Morohashi M, 2001; Leeming JP et al, 1984; Assis TI et al, 1983; Sidrin JJC &
Moreira JBL, 1999).
Acreditando na participação dos Staphilococci epidermidis
(S.epidermidis) no fenômeno da comedogênese, Professor Absasom L. Filgueira foi o
responsável pela idéia e concepção gestora que orienta o desenvolvimento de uma
original linha de investigação sobre a patogenia da acne. Estimulado pelo conhecimento
da implicação dos S.epidermidis na patogenia da Miliária e na colonização de
biomateriais, em particular, das cepas produtoras de uma substância intercelular
polissacarídica formadora de um biofilme bacteriano, produzindo inflama ção,
obstrução, infecção e resistência terapêutica, Prof. Absalom alcançou seus resultados
iniciais com Célio Abdalla in Acne Vulgar: Estudo da Participação do Staphilococcus
epidermidis. Tese de Doutorado- Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2001.
Abdalla C (2001) conseguiu, em modelo experimental, utilizando-se de
orelhas de coelho, resultados denunciadores de alterações microbiológicas e histológicas
na unidade pilo-sebácea, em especial, naquelas infectadas com S.epidermidis produtores
2
de biofilme de adesão, contribuindo com achados singulares para a comp reensão, ainda
que em modelo animal, da patogenia da acne vulgar.
Acreditamos, por nossa vez, prosseguir e poder investigar o potencial
proliferativo e a proliferação propriamente dita, através da observação dos índices de
expressão de dois marcadores - p63 e PCNA (proliferating cell nuclear antigen) –
aplicados aos fragmentos de tecido obtidos por biopsia no modelo de experimento de
Abdalla C, acima referido, com o objetivo definido de verificar a presença do fenômeno
proliferativo dos queratinócitos no conjunto pilo-sebáceo infectado pelos S.epdermidis
produtores de biofilme.
3
I—REVISÃO DA LITERATURA
1- Acne e Acnegênese.
1.1- Considerações e Características Gerais.
Acne (do latim científico acne, deduzido do grego acme por engano do
copista de um texto de Aécio-sec VI ; portanto, do grego ακμη: parte aguda de um
objeto, ponta, cume. Figurativo: muito mais alto, maior em força e poder; daí o adjetivo
ακμηνος: maduro, em pleno vigor (Liddel HG & Scott R, 1978: Skinner HE, 1970;
Goolamali SK & Andison AC, 1977).
Mesmo que da etimologia à etiologia sejam necessários percorrer muitos
itinerários ainda mal ou não sinalizados, talvez seja, a propósito, pertinente afirmar que
a acne incide, privilegiadamente, nos períodos de maior atividade androgênica (acme na
adolescência), constituindo-se, muitas vezes, num drama da população juvenil, pedágio
de alto tributo à vida adulta; e que seu mais evidente estigma semiológico é a
indefectível presença do comedão, com frequência, a mais prodrômica manifestação de
puberdade.
Do mundo subterrâneo e silencioso do infundíbulo folicular à expressão
vulcânica, eruptiva-inflamatória, com seu cortejo pleomórfico lesional, a acne vulgar
(acne) mantém ocupados, em permanente vigília investigativa, os pesquisadores
interessados no esclarecimento dos seus enigmas etiopatogênicos.
O desenho conceitual da patogênese da Acne, considerada como doença
multifatorial que se desenvolve na unidade pilo-sebácea relaciona, unanimemente, a
hiperplasia sebácea andrógeno-estimulada com aumento da produção de sebo; a
hiperqueratinização e obstrução folicular; a hipercolonização microbiota e a inflamação
como corolário e expressão de respostas imunológicas, que ocorrem s imultânea e/ou
consecutivamente em todos os estágios da acnegênese (Shalita AR, 1994; Toyoda &
Morohashi, 2001; Burkhart CN & Gottwald L, 2003; Gollnick H, 2003).
1.2-Unidade pilo-sebácea e Produção, Aumento e Composição do
Sebo.
4
A unidade pilo-sebácea consiste de um componente piloso e um
componente sebáceo. Cada uma delas possui a capacidade de se diferenciar em um
folículo piloso terminal ou em folículo sebáceo, conjunto, enfim, representado por
volumosa glândula sebácea e um pelo rudimentar. A glândula sebácea é composta por
múltiplos pequenos ácinos reunidos por ducto comum formado por epitélio estratificado
escamoso estendendo-se com a parede do ducto piloso e, indiretamente, com a
superfície da epiderme.
O infundíbulo (canal, ducto, lúmen) folicular compreende, na verdade,
duas regiões: 1- o acroinfundíbulo (distal) com epitélio estratificado, essencialmente
uma continuação ao da superfície cutânea com semelhante camada granulosa e estrato
córneo; 2- o infrainfundíbulo (proximal), situado entre o epitélio do ducto sebáceo e o
epitélio folicular. Suas células contêm número menor de desmossomas e
tonofilamentos. As camadas granulosa e córnea são finas com células pouco aderentes
que se destacam e se movimentam rapidamente em direção ao canal folicular e,
misturadas ao sebo, à superfície da pele (Kligmam AM & Katz AG, 1968; Shalita AR et
al, 1976).
O turn-over dos sebócitos (células sebáceas) inicia-se na periferia da
glândula, com a camada basal ativamente mitótica. À medida que se diferenciam,
acumulam grande quantidade de lipídios, migram para o infundíbulo e, maduras,
desintegram-se produzindo a extrusão dos lipídios que associados aos corneócitos se
dirigem ao óstio folicular.
Inicialmente, o sebo secretado consiste principalmente de triglicerídeos,
com grande quantidade de esqualeno, ésteres de cera e, em menor porção, de colesterol
e ésteres de colesterol. Enquanto a secreção flui através do ducto folicular, sua
composição vai se alterando pela ação de lipases que efetuam a hidrólise dos
triglicerídeos, resultando em ácidos graxos livres (em particular, ácidos oleico e
linoleico) e glicerol. Ambos, o Propionobacterium acnes (P.acnes) e o S.epidermidis
produzem lipases. No entanto, a atividade do P.acnes tem sido considerada, desde os
trabalhos de Freinkel RK (1968; 1969) e Marples RR (1971), a responsável pela maior
parte da quantidade de ácidos graxos livres originado. A produção de ácidos graxos
livres através do metabolismo do P. acnes contribui para formação do microcomedão
bem como por muitas das reações imunológicas observadas na acne (Toyoda &
Morohashi, 2001).
5
Na gênese da acne, a hipertrofia das glândulas sebáceas e o excesso de
produção de sebo são andrógeno-dependentes. Grande número de receptores de
androgênios localizam-se nas glândulas sebáceas e requerem estimulação androgênica
para produzir quantidades significativas de sebo. A interface dérmica do folículo
sebáceo converte a testosterona em 5α-di-hidrotestosterona mediada pela di-
hidroepiandrosrerona sulfato. A transformação em potentes androgênios é subordinada à
ação catalisadora de enzimas, presentes na glândula, inclui ndo a 3β-hidroxiesteroide
desidrogenase, a 17β- hidroxiesteroide desidrogenase e, em especial, a 5α-redutase, com
sua isoenzima tecido-específica predominante, a 1 5α-redutase ( Chen W et al, 2000).
Embora o princípio etiológico que desencadeia a hiperqueratose folicular
continue sendo objeto de intensas investigações, hormônios e composição do sebo
desempenham importante função no controle da hiperproliferação dos queratinócitos
foliculares. A partir dos estudos de Kligman & Katz (1968), reconhece-se que os ácidos
graxos livres, de algum modo, têm participação na comedogênese. Experimento, em
modelo animal (orelha de coelho), com ácidos graxos livres exógenos revelou seu
potencial de induzir à formação de comedões (Shalita AR, 1974) .Investigação sobre
ácidos graxos livres e a composição das ceramidas na camada córnea e nos comedões
(Downig DF, 1996; Wertz PW, 1985), determinaram que o desequilíbrio na composição
dos lipídeos sebáceos, com exacerbação dos esqualenos e, em contrapartida, a
diminuição dramática do ácido linoleico estimu lavam a hipercornificação infundibular.
Baixas concentrações de ácido linoleico, devido à elevada lipogênese das glândulas
sebáceas, acompanhada de altas taxas de secreção de sebo encontradas nos pacientes
portadores de acne, resultavam numa localizada síndrome de deficiência desse ácido
graxo essencial.
O esqualeno é fracamente comedogênico. Contudo, oxidado (esqualeno
peróxido), também produzido pelo P.acnes, ativa intensamente a comedogênese
promovendo hiperqueratinização folículo-infundibular (Motoyoshi, K,1983; Saint-
Leger D et al,1986 I: II).
Andrógenos podem ter importante participação na hiperproloferação
ductal dos folículos sebáceos. Thiboutot DM (1997), pesquisando a atividade da 1 5α-
redutase no infrainfundíbulo e na epiderme folicular, distinguiram diferentes níveis de
atividade enzimática. Os queratinócitos da região infrainfundibular continham
significativo aumento da atividade da 5α-redutase comparado aos queratinócitos da
epiderme folicular.
6
Nos últimos anos, pesquisadores têm reconhecido que os sebócitos,
analogamente aos queratinócitos, podem expressar diversas citocinas relacionadas à
inflamação e respostas imunes (Deplewski D & Rosenfield R, 2000). In vivo,
determinada por microscopia eletrônica e imunohistoquímica, sebócitos apresentaram
elevada expressão de fator de necrose tumoral alfa (Bohm M & Luger TA, 1998).
7
cutâneas por estímulo às principais citocinas pró- inflamatórias, induzindo proliferação e
diferenciação, e aumento da síntese de lipídeos das célul as sebáceas.
1.3- Comedogênese: Hiperproliferação, Hiperqueratinização e
Oclusão Óstio-Folicular.
A natureza exata e a ordenação e orquestração dos fenômenos
relacionados à iniciação da acne não ainda foram elucidados. Permanecem dúvidas em
relação à tônica de sua importância e à sua primazia.
Embora recentes estudos indiquem ativação de células vasculares
endoteliais e resposta inflamatória em estágios muito iniciais do desenvolvimento da
acne (Jeremy AHT et al, 2003), podemos dizer, em princípio, que sua mais precoce
lesão (dita sub-clínica e não inflamatória) é o microcomedão no qual hiperproliferação
do epitélio folicu lar é seu aspecto mais característico.
Hipercornificação da parede do folículo, observada na porção mais
inferior do infundíbulo folicular, altera seu padrão de queratinização e se configura
como uma das presenças iniciais mais características no sentido do desenvolvimento da
acne. Knutson DD (1974), em estudo ultraestrutural da porção infrainfundibular da
parede dos comedões, observou uma espessa camada cornificada composta de células
com densas membranas celulares justapostas e compactada a muitas outras camadas de
células, diferente do que era observado nos folículos normais, isto é, sem compactação e
com apenas pequenos agrupamentos celulares. Esta hipercornificação é responsável,
em última análise, pela formação das rolhas ou plugs córneos que se desenvolvem no
interior do lúmen folicular.
A coesão dos queratinócitos no desenvolvimento da comedogênese tem
sido objeto de especulação. Estudo experimental (Maeda T, 1991) de formação de
comedão em orelha de coelho tratada com: 1- ácido oleico (AO); 2- vitamina A e ácido
oleico (VAO), revelou que no material tratado com AO as alterações eram similares as
do comedão humano, isto é, indução tanto da hiperqueratinização do epitélio folicular
quanto da lentidão da cinética dos corneócitos devido a persistência da integridade do
aparato que determina a adesão intercelular. No material tratado com VAO, a
comedogênese experimental foi fortemente inibida, mostrando dois tipos de alteração:
hiperqueratinização sem aumento de coesão intercelular e a própria inibição da
queratinização. Na acne, o aumento da adesão intercelular é considerado fator
8
importante para retenção dos queratinócitos no interior do lúmen folicular durante a
comedogênese. Outro trabalho, interessado na coesão intercelular observada no
processo de queratinização, estudou os desmossomas, e vários dos seus constituintes,
em indivíduos normais e portadores de acne. O estudo, a rigor, não identificou
quaisquer alterações nos componentes dos desmossoma s que pudesse justificar o
aumento da adesão dos queratinócitos foliculares na comedogênese (Melnik B et al,
1988).
O fator inicial responsável pela formação do comedão não foi
definitivamente identificado. O mecanismo pelo qual a hipercornificação do ducto
folicular ocorre, demanda investigação e esclarecimento. No entanto, o aumento da
proliferação celular da parede do folículo é reconhecido como um dos principais
aspectos a ser considerado.
Knaggs et al (1994), confirmando achados anteriores (Plewig et al,
1971), através de estudo histoquímico utilizando o anticorpo monoclonal KI-67 (que
reage com antígeno nuclear expresso por células nas fases G1, S, M, e G2 do ciclo
celular) investigou a proliferação em folículos normais e acne-comprometidos, e
ratificou a ocorrência de hiperproliferação ductal.
Aldana OL (1998), acrescentou interessante contribuição ao estudo do
comedão, formulando um conceito de turn-over folicular. A hipótese propõe um ciclo
para cada unidade do conjunto pilo-sebáceo.O ciclo do folículo piloso (genotípico) e do
desenvolvimento do comedão (fenotípico) relacionado a glândula, ocorreriam da mesma
forma ciclo-símile. Marcando a proliferação e diferenciação com os anticorpos KI-67 e
K16, respectivamente, estabeleceram vários estágios de evolução do processo,
determinando que o estágio inicial do desenvolvimento da acne era o momento em que
ambas, a hiperproliferação e diferenciação anormal, ocorriam.
A partir do pressuposto de que a hiperqueratinização, via de regra,
precede à inflamação e constitui-se no mais inicial aspecto do desenvolvimento da acne,
Cunliffe WJ (2003), estudando aspectos clínico-etiólogicos da comedogênese e, apoiado
em revisão comentada do trabalho de Aldana, considerou que a queratinopoiese dos
folículos piloso e sebáceo poderia explicar a história natural da formação e resolução do
comedão, considerado um componente chave e integralizador nos eventos iniciais da
acnegênese.
1.4-Ativação dos Queratinócitos; Eventos Inflamatórios Iniciais.
9
Um dogma que acompanha a história da investigação da acnegênese, em
geral, e da comedogênese, em paticular, pode ser resumido por um trabalho intitulado
The Natural Evolution of Comedones into Inflammatory Papules and Pustules
(Orentreich N & Durr NP, 1974). Estabelecia uma hierarquia que ordenava as lesões
inflamatórias (pàpulas e pústulas) evoluídas necessariamente a partir de condições pré
ou não inflamatórias (aumento da produção de sebo, formação de microcomedões,
comedões abertos e fechados). Na verdade, inflamação, grosso modo, sempre foi
considerada um evento ulterior à formação do comedão e implicada, em especial, nas
imuno-reações pertinentes à ação do Propionobacterium acnes.
Comedões e microcomedões, como já destacamos, sob o ponto de vista
clínico-semiológico, são considerados lesões não inflamatórias e as mais precoces
manifestações da acne. Entretanto, a observação recente da presença, já nesses estágios
iniciais, de células inflamatórias na derme perifolicular e papilar, estimulou
especulações sobre a primazia dos fenômenos proliferativos em detrimento dos
inflamatórios. Incentivaram, na verdade, o desejo de investigar, afinal, quais os
mecanismos e mediações eram responsáveis pelo desencadeamento da hiperproliferação
e conseqüente hiperqueratinização folicular.
Integrinas fazem parte do grupo das moléculas de adesão. São proteínas
de superfície celular e têm como principais funções mediar as interações entre os
leucócitos, células endoteliais e proteínas da matriz extracelular. Na resposta imune,
desempenham papel fundamental no estímulo à migração e ativação celular. Holland et
al (1998) observaram expressão anormal de α2 e α3 integrinas em torno a comedões de
folículos pilo-sebáceos de pacientes portadores de acne. Colágeno IV e laminina são os
ligantes de α2 e α3 integrinas e são componentes da membrana basal, sugerindo que sua
anormal expressão poderia demonstrar algum papel nas alterações de proliferação e
diferenciação verificadas nos estágios iniciais do desenvolvimento da acne.
A idéia de que a pele e seus principais constituintes, os queratinócitos
serveriam tão somente de proteção, constituindo uma barreira entre o meio ambiente e a
economia do organismo, foi radicalmente transfor mada no final da década de 70 do
século passado. Descobriu-se que os queratinócitos eram capazes de produzir fatores de
ativação de células T, entre eles o que, atualmente, é identificado como interleucina-1.
Além disso, em seguida, foi demo nstrada expressão de HDL-DR e molécula-1 de
adesão intercelular pelos queratinócitos. A pele deixou de ser compreendida como
10
barreira com responsabilidade estrutural passiva, ganhando status de órgão dinâmico
que contribui, de forma relevante, na produção da inflamação e nas respostas imuno-
mediadas. Estas descobertas estabeleceram o conceito dos queratinócitos como
componentes fundamentais do sistema imune cutâneo, operando ativamente em vários
tipos de respostas biológicas (Bos JD et al, 1993; Nickoloff BJ & Naidu Y, 1994; Uchi
H et al, 2000).
. Os queratinócitos possuem um vasto repertório de citocinas, entre elas
fatores de crescimento e as interleucinas. Sob condições de equilíbrio, a maioria delas
não é sintetizada ou permanecem no interior do citoplasma . No entanto, estímulos
externos tais como trauma, infecções bacterianas, substâncias químicas ou irradiação
ultravioleta induzem sua produção e liberação pelos queratinócitos. As citocinas
queratinócito-derivadas mediam respostas imunes e inflamatórias através de receptores
nos queratinócitos, nas células de Langerhans, nos fibroblastos dérmicos e células
endoteliais (Hiroshi U et al, 2000).
A investigação dermatológica com a interleucina-1 (IL-1) só se tornou
inicialmente familiar aos pesquisa dores a partir dos trabalhos de Luger et al (1981),
Sauder et al (1982) e Kupper et al (1986). Desde então muito tem se aprendido sobre a
regulação, atividade e suas complexas interações (Murphy J-E et al, 2000; Dinarello
CA, 1996; 2002 ), tendo a IL-1 assumido um posto de extraordinária importância entre
as citocinas, contribuindo para o entendimento da homeostase cutânea e da pele como
órgão imune.
Inghan E et al (1992), interessados em compreender os fatores inaugurais
de promoção da resposta inflamatória na acne, demonstraram bioatividade da IL-1α em
76% de comedões estudados, extraídos de pacientes não tratados. Os comedões
continham quantidade suficiente de IL-1α para iniciar, se liberada na derme, resposta
inflamatória inespecífica, sugerindo sua participação nas etapas iniciais da acnegênese.
Anotação do estudo apontava níveis desprezíveis de citocinas, em particular a IL-1α ,
relacionadas à microflora comedoniana.
Em seguida, Guy R et al (1996) e Guy R & Kealey T (1998),
demonstraram in vitro que a citocina pró-inflamatória IL-1α poderia promover a
comedogênese. A adição de 1ng/ml de IL-1α produzia hipercornificação
infrainfundibular similar à observada in vivo nos comedões, podendo ser bloqueada por
100ng/ml do receptor antagonista da IL-1α . Além disso, observaram que em 20% dos
11
casos havia hipercornificação espontânea, o que sugeria capacidade do infundíbulo de
sintetizar IL-1α . Por sua vez, Aldana et al (1998) também observaram aumento de
imuno atividade de IL-1α em unidades pilo-sebáceas e comedões.
Considerando que a IL-1α constitui-se no estímulo da resposta
inflamatória inespecífica, Jeremy AHT (2003), após exaustiva investigação sobre os
fenômenos envolvidos na iniciação da acne, indagam o que seria, então, responsável
pelo seu próprio aumento de expressão e liberação. Pertinente explicação hipotética
considera, como já apontamos, a deficiência de ácido linoleico (Downing et al, 1986;
Perisho et al,1988) nos queratinócitos da parede folicular. Produzida pela intensa
produção de sebo e conseqüente alteração da barreira protetora funcional no interior de
cada folículo sebáceo (Elias et al,1980), induz, ao fim e ao cabo, liberação, pelos
queratinócitos, de citocinas pró-inflamatórias (IL-1α, fator de necrose tumoral alfa)
dentro da derme e conseqüente efeito cascata inflamatório.
Infiltrado linfocítico, predominantemente células CD4 positivas, havia
sido observado em trabalhos (Norris JFB & Cunliffe WJ, 1988; Layton et al,1998)
relativos à inflamação inicial na acne, realizados, entretanto, com material de lesões
ativas. Jeremy AHT (2003) confirmam esse resultado. Porém, o que, a rigor, o estudo
procura demonstrar é a existência prévia de fenômenos inflamatórios ainda mais
precoces. Inflamação, como evento secundário precedido de hiperqueratinização do
ducto folicular através da hiperproliferação, sempre foi o conceito predominante. No
entanto, os resultados da investigação sugerem fortemente a ocorrência de eventos
inflamatórios anteriores, e que se constituem como os possíveis fatores causais das
alterações hiperproliferativas e não como fenômenos secundários e consecutivos. A
propósito, convêm assinalar o estudo de Freedberg IM (2001), quando investigando a
ativação dos queratinócitos no processo de cicatrização de diversas condições
patológicas propõem um ´´ciclo de ativação dos queratinócitos`` no qual eles
primeiramente se tornam ativados pela liberação de IL 1α e, subseqüentemente, se
mantêm em estado de ativação através de produção autócrina de estímulos sinalizadores
pró-inflamatórios e proliferativos.
Nestas condições, ao que tudo indica, esta citocina influencia fortemente
a inflamação cutânea, a proliferação dos queratinócitos e, certamente, desempenha
importante papel na transformação da unidade pilo-sebácea acne-prone em unidade
folicular acne comprome tida, em estágios bastante iniciais da acnegênese.
12
1.5- Microflora Cutânea-Folicular.
1.5.1- Considerações e Características Gerais.
A microflora folicular é objeto de atenção e suspeita de participação na
patogenia da acne há mais de cem anos.Unna e Hodara descreveram o que chamaram de
bacilo da acne. Sabouraud, estudando o interior dos comedões, denominou-os de bacilos
seborreicos, observando também a presença de cocos na periferia do comedão. Gilchrist
entendia que a transformação da seborréia em acne devia- se a um processo infeccioso,
incriminando o Staphilococcus albus (Gilchrist TC, 1903; Sabouraud S, 1936; J
Darier,1936).
O papel da microflora, a despeito do extraordinário avanço do
instrumental e da metodologia de investigação, permanece ainda posto em discussão. O
interior da unidade pilo-sebácea com elevada concentração de sebo, hiperproliferação
com hiperqueratinização do infundibulo e oclusão óstio-folicular, estabelecem
ambiência ideal para hipercolonização da flora residente. Consistentemente, as
referências da literatura (Marples MJ, 1969; Marples RR et al, 1974; Marples RR, 1986;
Leeming JP et al,1983; Till AE et al, 2000) assinalam a predominância de três
microorganismos isolados no ducto folicular: o pleomórfico difteroide anaeróbio
Propionobacterim acnes (P.acnes); cocci gram positivos coagulase negativos, em
especial o Staphilococcus epidermidis (S. epidermidis) e o fungo lipofílico do gênero
Malassezia, concentrando notado interesse no P.acnes, associado ou não ao
S.epidermidis.
Investigações sobre o S. epidermidis produtor de biofilme de adesão, no
âmbito da dermatologia em geral, são raramente descritas na literatura. Na acne, em
particular, a única referência é o pioneiro estudo de Abdalla C (2001). Acne Vulgar:
Estudo da Participação do Staphylococcus epidermidis. Tese de Doutorado -
Universidade Federal do Rio de Janeiro-2001, ao qual nosso trabalho está vinculado e
13
desenvolve-se a partir do conceito de linha de pesquisa aplicado sobre o modelo de
experimento construído por Abdalla C (2001).
1.5.2- Participação na Patogênese.
O exame bacteriológico em lesões de acne e seu papel na infecção
(Shehadeh NH & Kligman AM, 1963; Kligman AM, 1965) demonstrou que a
associação do P.acnes e do S. epidermidis representavam a totalidade da flora em 100%
dos comedões estudados e, praticamente, não variava em relação às lesões
inflamatórias. Em 1970, Marples RR & Izumi AK estudando a bacteriologia das
pústulas encontraram colonização, com dominância quase absoluta, de P.acnes e
S.epidermidis. Imamura S (1975) interessado na localização e distribuição dos cocci
gram-positivos em pele normal e acne comprome tida, recorrendo à imunofluorescência,
verificou que a presença do S.epidermidis no folículo sebáceo não era relevante no
processo inflamatório Outro estudo, com Puhvel SM & Amirian DA (1979), analisando
trinta pacientes com acne em dorso e face, sugeriram que a flora bacteriana dos
comedões era a extensão da flora folicular residente e poderia não estar relacionada a
comedogênese. Por sua vez, Abdalla C (2001), no preparo do seu modelo de
experimentação, pesquisando a flora das lesões de acne em 50 pacientes, demonstrou
que os cocci coagulase-negativos representaram 75,37% dos microorganismos
aeróbicos isolados, com predominância absoluta dos S. epidermi dis, contribuindo com
70% desse total.
Investigação sobre o significado da colonização bacteriana e da
quantidade de bactérias viáveis, após tratamento com tetraciclina oral, não mostrou
associação entre a maior quantidade de microoranismos e a severidade da acne, e que a
eficácia da tetraciclina não poderia ser explicada unicamente por seu efeito antibiótico
na redução população bacteriana. Outro estudo sustentou o ponto de vista de que os
ácidos graxos livres eram produzidos como resultado da ação bacteriana. Os micrococci
e as propionobacteria não competiam em detrimento de suas respectivas populações e
que a quantidade de bactérias não era dependente da taxa de excreção de sebo. (Cove JH
et al, 1980;1980 ).
Till AE et al (2000), compreenderam que a relação entre a presença dos
microorganismos na unidade folicular e a inflamação era mais complexa. Notaram
14
aumento da microflora na proporção em que o folículo progredia de normal a
comedônico e, por fim, inflamado. Embora fosse significante a diferença de colonização
entre folículos normais e inflamados e que, de alguma forma e em algum momento,
devam estar envolvidos no processo inflamatório, admitiram que a hipercolonização,
por si só, não justificaria plenamente o início da inflamação nas lesões da acne. Holland
KT (1977), obteve conclusão semelhante ao realizar estudo quantitativo da microflora
bacteriana, em indivíduos com e sem acne, s ugerindo que o desenvolvimento da
inflamação não se subordinava apenas ao aumento do número de bactérias, e sim,
resultado de uma função interativa com microamb iente folicular.
1.5.3- Considerações Acerca da Inflamação e Resposta Imune.
O folículo pilo-sebáceo é considerado um sítio favorável ao crescimento
da maioria das bactérias saprofíticas encontradas na pele (Noble WC, 1981). Elas
podem não formar populações estáveis e homogêneas dentro do folículo, abrigando-se
em nichos diferentes no conjunto folicular (Noble WC, 1993). Não há evidência de
interatividade, seja antagonismo ou cooperação, entre os principais componentes da
flora (P.acnes e S.epidermidis), podendo, por certo, ocupar regiões distintas no ambiente
folicular, sem necessidade de competição.Além disso, um ambiente folicular favorável
ao crescimento de um mi croorganismo não é necessariamente favorável à coloni zação
de um outro.Existe grande diferença microbiológica entre os indivíduos bem como entre
folículos de um mesmo indivíduo e, provavelmente, entre regiões de um único folículo.
As prevalências distributivas da flora microbiana no interior do folículo podem,
possivelmente, justificar aspectos particulares no conjunto de fenômenos inflamatórios
observados na acnegênese. Till AE et al (2000) indicam que o P.acnes e o S.epidermidis
colonizam, em geral, as regiões mais profundas do infundíbulo folicular. Outros autores
referem predominância do P.acnes na porção intermediária do ducto e no
infrainfundíbulo enquanto o S.epidermidis distribui-se por toda extensão do anexo
folicular com preponderância no acroinfundíbulo (Kearney JN et al, 1984 ). O estudo de
Abdalla (2001), determina claramente o acroinfundíbulo como sítio eletivo do S.
epidermidis.
É necessário compreender a pele e a unidade folicular como um eco-
sistema dinâmico, disposto a mudanças e interferências, em que a combinação de vários
possíveis fatores (pH, oclusão, proliferação ductal, composição do sebo, hidratação
15
deficiente da pele, substâncias desinfetantes, respostas individuais inflamatórias,
imunológicas ou inespecíficas, à atividade antigênica da flora), e não apenas um fator
isolado ou preponderante, pode determinar a transfor mação, ou não, de um folículo num
ambiente ótimo de colonização e predisposto a acne (Leeming JP et al, 1985; Hartmann
AA, 1983; 1990).
Outra interessante hipótese apóia-se no conceito de ciclo folicular
proposto, como já referimos, por Aldana OL (1998). O momento crítico da inflamação
ocorreria num estágio específico do ciclo do ducto folicular coincidindo com o
momento de existência de condições apropriadas para a hipercolonização bacteriana. A
duração da doença poderia ser explicada pela quantidade de folículos potencialmente
capazes de desenvolver condições ideais de colonização bacteriana, assim como pelo
número de vezes que tais folículos oscilariam entre um estágio de quiescência e de
inflamação. Explicaria, talvez, algumas pioras paroxísticas da acne em um determinado
paciente, como também o grupo de pacientes portadores de acne persistente na
adolescência.
Os mecanismos pelos quais os componentes bacterianos estimulam ou
produzem inflamação não foram suficientemente estabelecidos, continuando, ainda,
como objeto de conjecturas. O P.acnes, considerado, regra geral, como o principal
organismo da microflora folicular, é estritamente anaeróbio produzindo acido acético e
propiônico. Encontra nos comedões condições ideais de multiplicação em anaerobiose e
substrato lipídico apropriado como gerador de nutrientes (Leyden JJ, 2001). Ácidos
graxos livres produzidos pelas lipases secretadas pelo P.acnes, como já referimos,
poderiam agir como fatores estimuladores da comedogêne se e acnegênese. Uma das
funções das lipases foi sugerida pelo estudo de Kearney JN (1984): mediar a interação
do P.acnes com os lipídeos da pele, provavelmente como auxílio para sua própria
colonização dentro do folículo sebáceo, promovendo aderência celular, através de um
sítio de ligação na superfície celular da bactéria, com os ácidos graxos livres, em
particular, o ácido oleico.
A intepretação clássica descrevia a inflamação como resultado da ação
dos ácidos graxos livres sobre a parede do ducto folicular considerando o P.acnes como
a principal fonte produtora de lipases (Marples RR et al, 1971; Puhvel SM & Reisner
RM, 1972). Outras enzimas extracelulares, como as proteases e hialuronidases, são
16
produzidas pelo P.acnes e capazes de influenciar no processo inflamatório. Além disso,
os S.epidermidis também hidrolizam lipídeos sebáceos através da produção de lipases
(Voss JG, 1970).
Seguramente, o P.acnes pode promover inflamação através de outras vias
e mecanismos. Coube a Dahl MGC & McGibbon DH (1979), estudando o complement o
e imunoglobulinas em lesões inflamatórias da acne, identificarem nas pápulas, depósito
de C3 e IgM nos vasos da derme e na junção dermo-epidérmica, o que significaria
aumento da permeabilidade vascular (Gigli I,1976: Scott DG et al,1979). Outros ensaios
demonstraram a existência de fatores quimi otáticos secretados pelo P.acnes e atividade
quimiotática nos comedões. Dializáveis, de baixo peso molecular, esses fatores não
requerem ativação do complemento para a sua atividade. Seu tamanho míni mo permite
sua saída do folículo, atraindo leucócitos polimorfonucleares. Estes, por sua vez, podem
fagocitar as bactérias produzindo liberação de enzimas hidrolíticas e provocando injúria
do epitélio folicular (Puhvel SM et Sakamoto M, 1978, 1980; Tucker SB et al,1980;
Webster GF et al, 1982).
O conhecido grupo de pesquisadore s da Universidade de Leeds – Grã-
Bretanha, dedicado por longo tempo à investigação da acne, em publicação atual,
estudou a produção de citocinas pró-inflamatórias produzidas pelos queratinócitos
quando estimulados pelos P.acne, concluindo por sua participação na patogenênese da
acne inflamatória. Ademais, sugerem um amplo espectro de implicações na
imunomodulação do sistema imune relaconado flora residente cutânea. A interação
entre os microorganismos comensais e as principais células da epiderme, ainda não foi
devidamente avaliada. A produção de citocinas é um dos sinais de alerta emitidos pelos
queratinócitos, considerados como a primeira linha de defesa da pele (Graham GM et al,
2004).
Diferentemente, Lee WL (1982) considerarou como o agente mais
importante na inflamação da acne um fator quimiotático de alto peso molecular, com
estrutura química similar a da lipase. Outros estudos demonstraram que o P.acnes
poderia ainda estimular o complemento, através das vias clássica e alternativa,
provavelmente contribuindo para a inflamação (Massey A et al 1978; Webster GF et al,
1978, 1981; 1982). Estudo recente (Jain A et al, 2002) verificou que a eritromicina e as
tetraciclinas, utilizadas sistemicamente no tratamento da acne, tinham poder de inibir a
17
produção pelos neutrófilos de fatores quimiotáticos e de outros mediadores da
inflamação.
As respostas imunológicas induzidas pelo P.acnes parecem também ter
importância. Foram encontrados elevados títulos de anticorpos circulantes em pacientes
portadores de acne grave. A possibilidade de representar um efeito direto não foi
comprovada. No entanto, demonstrou-se que a indução de hidrolases lipossômi cas
provocadas pelo P.acnes, através dos polimorfonucleares, era anticorpo anti-P.acnes
dependente (Puhvel SM et al,1974; Webster GF et al, 1979;1980 ).
Avaliação imunológica realizada por Kersey P et al (1980) em pacientes
com acne inflamatória grave, após sensibilização intra-dérmica com P.acnes, apresent ou
importante aumento da resposta imune. Outras evidências do comprometimento
imunológico humoral e celular foram às observações de migração leucocitária e
transformação linfocitária em portadores de acne grave e nódulo-cística quando
expostos a atividade antigênica do P.acnes e do S. epidermidis (Puhvel SM et al, 1977;
Gowland G et al, 1978). White A et al (2000) em experimento com pele de porco,
demonstraram migração de neutrófilos e linfócitos CD3 e CD2 positivos e forte
marcação de E-selectina, após administração intradérmica de P.acnes. Recente trabalho
de investigação (Jappe U et al, 2002) sobre a inflamação na acne e os mecanismos de
ativação linfocitária induzida pelo P.acnes, concluiu sugerindo que a bactéria possui
atividade mitogênica T-celular.
Há evidências sugestivas de que a imunidade humoral esteja presente nos
eventos iniciais inflamatórios e a imunidade celular na fase mais tardia do
desenvolvimento da acne. Entretanto, há que se referir a qual momento inflamatório
estamos examinando. Talvez, seja mais apropriado compreender que ambas participem
dialogicamente durante todo o processo da acnegênese.
1.6- Os Staphylococci epidermidis.
Os Staphylococci epidermidis coagulase negativos (SECN) constituem-
se na maior parte da microflora residente da pele humana e estão entre as mais
freqüentes bactérias isoladas nos laboratórios de microbiologia clínica. Predominam nas
regiões ricas em lipídeos como o tronco, face e axilas.
18
Até há, relativamente, pouco tempo eram considerados comensais quase
que destituídos de virulência e relacionados, na maioria das vezes, à imunossupressão.
Entretanto, com o avanço das tecnologias na área médica, os SECN tornaram-se
constantemente implicados nas infecções hospitalares e emergiram como um patógeno
oportunista importante, associado, com freqüência, à presença de corpo estranho na
corrente sanguínea, como por exemplo, na manipulação genito-urinária com catéteres e
na colocação de próteses.
1.6.1- S. epidermidis Produtores de Biofilme.
A patogênese dessas infecções tem sido correlacionada a capacidade de
certas cepas SECN de produzir grande quantidade de material extracelular denominado
de lama ou biofilme, responsável por sua própria proteção contra a imunidade inata
durante a colonização e infecção, como também pela resistência oferecida a
antibioticoterapia utilizada. A natureza da sua constituição e modo de operar
antigenicamente tem sido objeto de investigação em muitos centros de p esquisa.
1.6.2- Produção, Composição e Antigenicidade do Biofilme.
O biofilme tem sido considerado o elemento chave para o aumento de
sua virulência e, ao que tudo indica, requer para sua formação a presença de uma
adesina polissacarídica extracelular. Investigação recente (Vuong C et al, 2004) sobre a
proteção oferecida ao SECN pela lama identificou, por microscopia eletrônica de alta
resolução, que a adesina polissacarídica intercelular localizava-se numa faixa fibrosa da
superfície celular da bactéria. Verificou, ainda, que sua falta resultava em completa
perda de capacidade da matriz produtora do material extracelular (biofilme), tornando o
SECN imunogicamente vulnerável. Os autores concluem que a adesina polissacarídica
intercelular representa o primeiro fator definido, encontrado na matriz produtora do
biofilme, de proteção contra componentes da imunidade humana inata.
Diversos componentes polissacarídicos foram descritos como marcadores
químicos da lama (Tojo M et al, 1988; Drewry D et al,1990) produzida pelos SECN.
Em particular, Mack D et al (1994) e Baldassari L et al (1996) determinaram que, a
maioria das cepas de origem clínica, produtoras de biofilme, elabora um polissacarídeo
cujo principal constituinte é uma hexosamina, a N-acetil-glucosamina. O estudo de
19
Abdalla (2001), em lesões de acne, através da imunohistoquímica das lectinas,
identificou a glucose, a manose e a galactose como os principais monossacarídeos
encontrados no biofilme produzido pelos SECN. Resultados semelhantes obtidos por
outros autores, através de diversas técnicas de verificação, conforme revisão de Abdalla
(2001), utilizaram material de outras origens, não relacionadas à especulação sobre a
patogenia da acne.
A idendificação de um antígeno associado a lama (slime associated-
antigen-SSA) realizada por Christesen GD (1990) e revista por investigação
microbiológica e bioquímica criteriosa (Baldassari L et al, 1996) forneceu informação
segura de que o SSA é um dos principais determinantes antigênicos do biofilme de
adesão.
Outros trabalhos, com o objetivo de elucidar características do
comportamento antigênico do SECN e a resposta imune , devem ser referidos. Estudo
experimental (Fey PD et al, 1990) demonstrou marcada associação entre formação de
biofilme, relacionado a algumas linhagens de SECN produtoras de adesina
polissacarídica intercelular e hemoaglutinação. Kotilainen P et al (1990) determinaram
inibição da proliferação celular com intensa redução de linfócitos-T e linfocinas, em
cultura de linfócitos na presença de extratos de biofilme. Conclusão aproximada (Plaunt
MR & Patrick EC, 1991; Stout RD et al, 1992) reportou a ação do biofilme como
estimuladora de prostaglandina E2, IL-1 e fator de necrose tumoral alfa inibindo
proliferação celular sem, contudo, influenciar diretamente o linfócito-T.
Além disso, muitos SECN também são capazes de produzir lipases,
proteases e outras exoenzimas contribuindo, provavelmente, para sua permanência no
organismo, sua participação na aderência e formação do biofilme e no aumento da
virulência (Longshaw CM et al, 2000; Otto M, 2004).
1.6.3- Staphilococci epidermis Produtores de Biofilme e a
Dermatologia.
Coube a Bayston R & Penny SR (1972) o primeiro estudo
correlacionando a existência de uma´´substância mucoide`` a alto índice de colonização
por SECN em pacientes portadores de shunts interventricular. Desde então a literatura
médica noticia e discute continuadamente sobre as infecções biofilme-associadas
produzidas pelos SECN, antigenicamente ativados por procedimentos médicos
20
invasivos, diagnósticos ou terapêuticos, em especial, com biomateriais de implante a
base de polímeros (cateteres, válvulas, próteses permanentes ou provisórias, lentes de
contato, etc), produzindo um largo espectro de graves condições clínicas: conjuntivite e
endoftalmia, osteomielite, artrite, prostatite, endocardite e septicemias (Baddour LM et
al,1986; Christensen GD et al, 1982; 1983; 1986; Needham CA & Stempsey W 1984;
Males BM et al, 1985; Galdbart J-O et al, 2000; Kodjikian L et al, 2003).
Importante na patogênese destas infecções é a curiosa habilidade dos
SECN em colonizar a superfície de polímeros e outros materiais, formando espessas
camadas de lama. Citação significativa é a de um estudo brasileiro testando o potencial
de aderência do biofilme, produzido por SECN isolados em nosso ambiente clínico,
utilizando-se de diversos meios de agregação bacteriana e relacionando-os à afinidade
com diferentes superfícies de materiais (Krepsky N et al, 2003).
O processo de adesão à superfície e desenvolvimento de biofilme, na
realidade, é uma estratégia de sobrevivência empregada, virtualmente, por todas as
bactérias, continuamente adaptando-se, através de milhões de anos. Este fenômeno
designa-se por ancoragem microbiana num ambiente nutricionalmente vantajoso,
permitindo ao microorganismo escapar para um meio fértil quando os fatores essenciais
de crescimento estão exauridos (Dunne WM Jr, 2002). A formação do biofilme pode ser
dividida em, pelo menos, duas fases distintas: 1-de fixação da bactéria na superfície do
material e início do revestimento a partir da matriz de proteínas celulares; e 2- de
proliferação e acumulação dentro da espessa camada de células agrupadas e embebidas
no material extracelular, como que gerando seu próprio meio de cultura (von Eiff C et
al, 2002).
No que tange ao interesse da Dermatologia, a literatura é, ainda, bastante
econômica. Mowad CM (1995), em consistente e estimulante ensaio clínco-laboratorial,
sobre o papel do que denominaram de substância extracelular polissacarídica (biofilme),
produzida por cepas de SECN, observada na miliária, demonstraram que, apenas os
SECN poderiam induzir o desenvolvimento da Miliária, como também a lama era
fundamental na sua patogenia. Além disso, os autores, respaldados em estudo prévio
(Cormia FE et Kuikendall V, 1954) sobre a retenção de suor e observação da presença
de SECN e material PAS positivo nos ductos écrinos, identificaram que o biofilme
produzido pelos SECN na Miliária era, na verdade, a mesma substância PAS positiva
observada na obstrução do ducto da glândula sudorípara. Pertinente é a lembrança da
21
Periporite. A clínica dermatológica a descreve como uma estafilococcia das glândulas
sudoríparas écrinas, freqüentemente como complicação da miliária, caracterizada por
pequenos nódulos inflamatórios, supurativos, eliminando um pus cremoso.
Dois diferentes trabalhos, estudando o comprometimento das fibras
elásticas na Elastólise Folicular e em lesões reliquat-cicatriciais da acne, tentaram
relacioná-lo a uma possível atividade enzimática dos SECN, através da verificação de
uma elastase depositada no infundíbulo folicular (Varadi DP & Saqueton AC, 1970;
Dick GF et al, 1976).
Recentemente, interessante comunicação (Knobloch JK et al, 2002) sobre
o efeito de três desinfetantes alcoólicos, de uso dermatológico, a base de etanol, n-
propanol e isopropanol na formação de biofilme produzido por SECN, demonstrou que
em 18 de 37 cepas, cultivadas em meio suplementado por álcool, havia aumento da
expressão do biofilme, e em 03, particularmente, esse aumento relacionava-se ao
aumento da síntese da adesina polissacarídica intercelular. Recordando que esses
desinfetantes têm ampla utilização em assepsia cutânea, é plausível que as cepas de
SECN álcool-estimuladas possam contribuir para as infecções ou no desenvolvimento
de reações associadas à formação de biofilme.
O estudo de Abdalla (2001) é único no seu objetivo em investigar a
participação dos SECN produtores de biofilme de adesão na patogenia da acne.
Descreveu, a partir de um modelo experimental de acnegênese, em orelha de coelho,
níveis de colonização pelo SECN, produtores de biofilme, de 40% e 70%,
respectivamente, em comedões e pápula. Demonstrou a presença desses cocci e da
lama, eletivamente localizados no acroinfundíbulo e no ducto folicular dos folículos
sebáceos, concluindo pela importância dos SECN produtores de biofilme na
comedogênese e no início do desenvolvimento das lesões inflamatórias.
Seus achados são conclusivos e singulares, não havendo na literatura
quaisquer referências sobre o papel dos SECN produtores de biofilme na etiopatogenia
da acne.
O percurso até ao final dessa revisão de conhecimentos, nos permitiu
certezas e impressões. Em algum momento pudemos reconhecer a acne como desordem
etiológica e fisiologicamente hormônio-dependente, geneticamente determinada. Outras
circunstâncias nos fizeram encará-la como doença obstrutiva anexial. O aspecto
22
infeccioso predominou em muitas outras ocasiões e, em algum outro momento
importante, tivemos argumentos consistent es para classificar a acne como doença
infamatória em oposição a uma condição clínica queratinócito-hiperproliferativa da
unidade pilo-sebácea.
Tomando consciência da extensão e complexidade dos caminhos
etioimunopatogênios da acnegênese e da comedogênese, em especial, talvez seja
recomendável, não formular conceitos de primazia, gerando pontos de partida para uma
falsa linha reta, seguramente o itinerário mais curto entre a compreensão e o labirin to.
Nosso trabalho, desenvolvido sobre um modelo de experimento
consolidado, tem objetivos precípuos, os quais serão determinados a seguir.
2.- Proliferação e Diferenciação dos Queratinócitos
As principais descobertas no campo da cinética celular dos queratinócitos
aconteceram nas últimas três décadas. A epiderme é um conjunto experimentalmente
acessível e sua capacidade de ser cultivado oferece a oportunidade de estudar as
propriedades e os múltiplos aspectos da proliferação e diferenciação epidérmica. Na
realidade, a investigação da diferenciação epidérmi ca pertence, hoje, ao domínio da
genética e da biologia molecular, mas sem o conhecimento gerado e acumulado pelas
ciências básicas em geral, a pesquisa aplicada às áreas clínicas torna-se, em grande
parte, inviável. Pretendemos, aqui, poder oferecer um painel restrito, mas minimamente
necessário, do fenômeno proliferativo e do processo de diferenciação terminal, para
nossos propósitos mais imediatos.
A epiderme é um dos paradigmas de epitélio estratificado, em constante
renovação, com o objetivo de manter uma apropriada cobertura da pele.
Subordinado a estímulos ainda não muito bem compreendidos, o trânsito
dos queratinócitos começa na camada basal. Na medida em que sofrem uma série de
transformações morfológicas, metabólicas e bioquímicas, os queratinócitos vão
migrando e constituindo as camadas suprabasais, até se tornarem em achatadas e
anucleares escamas mortas, continuamente renovadas pelo processo de proliferação e
diferenciação celular (processo de queratinização; turn-over celular da epiderme;
queratopoiese; epidermopoiese).
A proliferação e diferenciação terminal da epiderme não devem ser
compreendidas, apenas, pelo movimento contínuo e progressivo dos queratinócitos
23
desde a camada basal (Fuchs E,1990). Ele é insuficiente, ainda que possa contribuir,
para a ativação da cascata de reações e alterações bioquímicas, moleculares e estruturais
que promovem, por fim, a chancela irreversível da morte do queratinócito. Para que a
via de diferenciação seja ativada, é necessário aos queratinócitos à demanda de precoces
sinais e estímulos para sua atividade proliferativa. Diminuição ou inibição, ou
necessidade de aceleração da síntese de DNA e atividade mitótica, são influenciadas,
desde cedo e sucessivamente, por diversos fatores controladores, transitórios ou não,
tanto na homeostasia, como em resposta à agressão e injúria, de qualquer natureza.
Controles moleculares, entre outros, de genes de expressão epidérmica; de fatores de
crescimento dos queratinócitos; da ação dos retinóides; da expressão de integrinas e
queratinas; da regulação da atividade do cálcio, estão, todo o tempo, acionados de forma
sincrônica ou diacrônica. Por outro lado, a sucessão de eventos que se desenvolvem nas
camadas suprabasais pode, por sua vez, repercutir na atividade germinativa e
proliferativa, tornando a epidermopoiese um fenômeno dialético, tecido
complexamente.
A epiderme, mais precisamente, as células da camada basal possuem dois
tipos de células proliferativas. A célula tronco (CT) e as células trânsito-amplificadas
(CTA). Somente a camada basal, por meio dessas células, tem a habilidade de síntese de
DNA e mitose. A CT tem alto potencial proliferativo e uma capacidade permanente de
se autorenovar. Produzem uma geração de células filhas que podem se tornar, elas
mesmas, CT ou, o que ocorre frenquentemente, se constituírem nas CTA.
As CT têm um ciclo celular lento, mantendo-se, durante muitos períodos
sem atividade proliferativa, sob condições homeostáticas. Talvez, um atributo biológico,
particularmente importante, para conservar sua natureza proliferativa e para minimizar
as chances de erro relacionadas à reparação do DNA. Entretanto, são responsáveis pela
integridade, formação e manutenção do conjunto arquitetu ral da epiderme. Comportam-
se, na verdade, como uma cisterna celular autogeradora e provedora da unidade
funcional epidérmica.
As CTA são muito menos aptas a autorenovação, portanto, com me nor
potencial proliferativo, apresentando, contudo, um ciclo celular rápido, responsável,
afinal, como seu próprio nome sugere, por amplificar o número de células (produzidas a
partir de cada divisão de uma CT), compromissadas com a diferenciação terminal. Em
contraste com as CTA, as CT, embora possuindo aptidão para se autorenovarem quase
que indefinidamente, não têm necessidade de se dividir com freqüência, permanecendo,
24
por vezes, como já nos referimos, quiescentes por longos períodos de tempo. Suas
células filhas, as CTA, estão repetidamente se dividindo para, após alguns ciclos,
entrarem em exaustão, perdendo sua capacidade proliferativa, tornando-se não
mitóticas, passando, então, a sofrer as transformações relacionadas à diferenciaçã o
terminal. A maior parte da rotina da atividade proliferativa fica a cargo das CTA
responsáveis, enfim, pela grande expansão da população celular da epiderme (Fuchs E,
1990; Watt FM, 2001; Janes SM et al, 2002; Potten CS & Booth C, 2002).
Este conjunto pode ser denominado de Unidade Proliferativa da
Epiderme (EPU). Vários estudos sugerem que cada EPU contem uma única CT situada
em meio a um grupo de 10 células basais (Potten CS, 1974; 1981). Considerando uma
única EPU e 03 rounds de CTA teremos uma geração de 08 células filhas
comprometidas com a diferenciação celular. Quaisquer mínimas alterações no número
de divisão das CT podem provocar efeitos dramáticos na população celular final.
Hiperproliferação pode ser resultado da ação de diversos mecanis mos etipatológicos,
em algum estágio do funcionamento da EPU. Por outro lado, o epitélio estimulado ao
seu reparo, por alguma circunstância, pode adotar pelo menos 03 estratégias para
expandir sua população: 1- recrutamento de CTs para produzir maiores quantidades de
CTAs; 2- aumento do número de vezes que uma CTA pode replicar (aumento do
número de rounds mitóticos das CTA ); e/ou 3- aument o da eficiência da replicação das
CTA através do encurtamento do tempo do ciclo celular ( Lehrer MS et al,1998).
Há um relativo consenso em localizar as CT na epideme interfolicular; na
região mais superior da bainha externa do folículo piloso, conhecida como bulge
(situada abaixo da abertura do ducto sebáceo e junto a inserção do músculo eretor do
pelo ); e na matriz germinativa do folículo piloso ( Potten CP et al, 2002). AS CT são
relativamente pequenas, possuindo poucas organelas e fortemente aderidas à membrana
basal.
Não está, ainda, completamente claro se as CT são pluripotenciais (ou,
no mínimo, bipotenciais) responsáveis tanto pela formação da epiderme como das suas
estruturas anexiais especializadas, os folículos piloso e sebáceo (Taylor G et al, 2000);
ou, possuem cada uma, mesmo com atividade interdependente, seus nichos reservados.
Estudos mais avançados sobre a plasticidade das CT reportam possível e fascinante
capacidade de pluri e totipotência. Dois trabalhos experimentais relataram, depois de
investigação com células dérmicas e epidérmicas, marcadores neurais (Toma JC et al,
25
2001), e formação de embriões de ratos e ratos adultos, incluindo epiderme, vértebras,
fígado e cérebro, a partir de CT de epitélio interfolicular (Liang L et al, 2002).
Os queratinócitos representam mais de 80% das células epidérmicas e
desempenham um papel central no sistema estrutural da epiderme. Organizam-se em 04
camadas e, como vimos, migram continuamente a partir da camada basal em direção à
superfície, obedecendo a um padrão clássico de polarização e maturação até se
transformarem em corneócitos anucleados e ceratinizados.
As células basais são colunares e mantêm seu eixo longitudinal
perpendicular à linha divisória entre a derme e a epiderme. Conectam-se umas as outras
e com as células escamosas através dos desmossomas, cálcio dependentes, e fixam-se na
membrana basal subepidérmicas por estruturas conhecidas como hemidesmossomas. As
células basais apresentam vários elementos do citoesqueleto como os microfilamentos,
entre eles os filamentos intermediários de queratina, expressando, em particular, as
queratinas 5 e 14. Os microfilamentos mantem conexão com estruturas vizinhas graças
à existência de vários receptores. Há evidências de que a laminina-5 da matriz
extracelular induza o recrutamento de α6β4 integrina heterodímero, queratinas e de
proteínas queratina-associadas para a superfície celular, originando adesão ao complexo
do hemidesmossoma. Além disso, a laminina-5 induz foforilação e desfosforilação da
α6β4 integrina permitindo a modulação da proliferação celular, da diferenciação,
migração e da própria morfogênese do tecido ( Jones PH & Watt FM, 1993; Jones JC et
al, 1998).
As células espinhosas compõem-se de células poligonais configuradas
em mosaico. Regra geral, possuem entre 05 a 10 camadas de células com seu eixo
longitudinal disposto em paralelo à superfície da pele. Estão unidas por pontes
intercelulares (comunicações desmossômicas) com aspecto de´´espinhos`` (daí o termo
acantose referido ao aumento da camada espinhosa; do grego άκανθος: espinho. As
transmembranas das placas desmossômicas abrangem as desmogleínas e desmocolinas,
na verdade, moléculas de adesão cálcio-dependentes, ou seja, caderinas (Cserhalmi-
Friedman et al, 2001).
Os queratinócitos ao deixar a camada basal, tornam-se não mitóticos,
ainda que algumas células mantenham a capacidade de divisão, e muito mais
metabolicamente ativos do que a maioria das células basais. A síntese de proteínas está
voltada, principalmente, para a produção das queratinas 1 e 10 ao mesmo tempo que as
queratinas 5 e 14 vão deixando de ser produzidas. Ascendendo na camada espinhosa, os
26
queratinócitos vão paulatinamente acumulando grandes quantidades de proteínas
(loricrina, involucrina, profilagrinas, tricohialina, peptídeos ricos em prolina e S 100A
que são proteínas de ligação do cálcio) codificadas por um grupo de gens localizados no
cromossoma 1q21 (complexo de diferenciação epidérmico) essenciais para o processo
de queratinização final do estrato córneo (Mischke D et al, 1996). As conexinas vão
alterando seu padrão de expressão no decorrer do processo de diferenciação da
epiderme. Perturbações na expressão das conexinas influem nos estímulos iônicos
intercelulares afetando a homeostase do cálcio. Algumas genodermatoses estão
subordinadas a mutações nas conexinas, produzindo queratinização anormal
(Eritroqueratodemia Variabilis); outras, à mutação nas cálcio-ATPases, seqüestrando
cálcio dentro das organelas, resultando nas doenças de Darier e Hailey-Hailey
(Willecke K et al,1999).
As células da camada granulosa podem ser planas ou romboidais. Na
pele normal, sua espessura é proporcional à da camada córnea, possuindo em torno de
uma a três camadas de células nas regiões de pele delicada e até 10 camadas nas áreas
hiperqueratinizadas, como palmas e plantas. Na medida em que os queratinócitos
alcançam a camada granulosa, sua aparência muda completamente, com a síntese dos
grânulos de queratohialina contendo profilagrina. Assim que os conteúdos dos grânulos
são liberados no citoplasma, a profilagrina é desfoforilada e clivada em várias frações
de filagrina que tem a função de agregar a queratina formando macrofi lamentos (Hohl
D et al, 1991; Presland RB et al, 1995). A filagrina, em seguida, é degradada em várias
moléculas, incluindo os ácidos urocânico e carboxílico pirrolidônico que hidratam o
estrato córneo e filtram a radiação ultravioleta. A loricrina, outro constituinte dos
grânulos, começa a ser liberada próxima a membrana plasmática, ligando-se,
inicialmente, às placas de proteínas dos desmossomas (Ishida-Yamamoto A et al, 1999;
Morrison H et al, 1985).
Os grânulos lamelares, inicialmente identificados nas camadas mais
superiores da espinhosa, tornam-se mais abundantes na camada granulosa. Também
conhecidos como corpúsculos de Odland, ou queratinossomos, visíveis à mi croscopia
ótica comum, contêm lipídeos que promovem a permeabilidade da epiderme e enzimas
lipossômicas. Coincidindo com o aparecimento dos grânulos de Odland, surgem os
precursores das ceramidas da camada córnea. São fabricados no aparelho de Golgi pela
ação enzimática da glucosiltransferase, estimulada durante o processo diferenciação.
27
Elevadas concentrações de ceramidas intracelulares, no entanto, inibem a proliferação
celular, acelerando a diferenciação e a morte programada dos queratinócitos.
No limite superior da camada granulosa, os corpúsculos de Odland se
orientam para a região apical das células, ligam-se às me mbranas plasmáticas,
secretando seus conteúdos nos espaços intercelulares. Os queratinócitos são, assim,
envolvidos por espessas lamelas ricas de lipídeos que, subseqüentemente, farão parte do
envoltório da célula queratinizada.
A morte do queratinócito é a função da sua vida. A perda do núcleo e de
outras organelas muda radicalmente sua arquitetura no estrato córneo. Nasce, enfim, a
chamada barreira protetora da pele. Ela é formada por células revestidas de queratina,
uma proteína durável e insolúvel, correspondendo a 90% da massa total do manto
protetor, enquanto os lipídeos respondem pelo restante (Nemes Z & Steinert PM, 1999).
A queratinização celular final é uma operação complexa processada em múltiplas
etapas. Envolve um pool de enzimas e proteínas (envoplaquina e periplaquina,
involucrina, glutamina, loricrina, transglutamases 1 e 3, catepsina D) e suas inúmeras
reações interdependentes e em cadeia, com o objetivo de formar um componente
proteico, altamente insolúvel, na lâmina mais interna da membrana plasmática do
invólucro celular queratinizado.
Os corneócitos, assim revestidos, são mantidos unidos através dos
corneodesmossomas, até que haja atividade das proteases do estrato córneo,
armazenadas pelos grânulos lamelares em forma de enzimas lisossômicas, resultando na
separação dos corneócitos e, por fim, em escamas livres.
3.- Marcadores de Células Tronco e Proliferação Celular na Epiderme.
Na epiderme, a proliferação está confinada, em sua maior parte, as
células aderidas à membrana basal e aos queratinócitos que migram em direção as
camadas suprabasais (CT e CTA). Apesar de uma pequena sub-população de
queratinócitos manter um estado proliferativo, via de regra, a partir dos primeiros
estratos da camada espinhosa, estão estreitamente vinculados com a diferenciação
celular terminal.
Os anticorpos poli e monoclonais vem sendo utilizados largamente na
área diagnóstica e na pesquisa científica. Procedimentos imunohistoquímicos fazem
28
parte da rotina do instrumental de investigação, permitindo melhor compreensão
etiopatogênica e apresentando um grande potencial na obtenção de informações e
conhecimentos, pois uma grande quantidade de antígenos tem sido identificada e,
respectivos anticorpos, constantemente avaliados e disponibilizados comercialm ente.
A investigação dermatológica muito tem se beneficiado com a
imunolocalizaçao antigênica. A diferenciação celular epidérmica tem sido
exaustivamente estudada na psoríase e nas condições neoplásicas. Também no estudo de
doenças epidérmicas que primária ou secundariamente determinam distúrbios da
queratinização, e outras condições clínicas dermo-epidérmicas com expressão
inflamatória/proliferativa como, por exemplo, a acne, que confiamos poder investigar
sob o espéculo da observação imunohistoquímica.
A detecção dos queratinócitos com base na expressão das queratinas no
decurso do processo de proliferação e diferenciação da epiderme normal está,
relativamente, bem estabelecido. Os queratinócitos exibem certas propriedades de
marcação das queratinas do citoesqueleto. Estes filamentos intermediários são bastante
específicos da população celular epitelial, presentes no citoplasma, com sua clássica
apresentação em pares de moléculas (ácidas / básicas). As CT e CTA, com sua intensa
atividade mitótica, expressam tipicamente as Queratinas 5 e 14 . As Queratinas 1 e 10
são expressas por células suprabasais, metabolicamente ativadas, em especial, nas
camadas espinhosa e granulosa, sendo consideradas marcadores de queratinização. Nas
células da camada granulosa, a filagrina e precursores do invólucro do corneócito
queratinizado (loricrina e involucrina ) têm sua expressão máxima. A Queratina 19 pode
ser detectada, principalmente, na região do bulge, mas não na epiderme interfolicular
(Fuchs E, 1990 Michel M et al, 1996). Queratinócitos ativados expressam Queratinas 6,
16 e 17 e são tidas como marcadoras de doenças inflamatórias (em especial Queratina 6
e 16 ) e proliferativas ( Komine M et al,2000).
KI 67 é um anticorpo monoclonal marcador de células proliferativas em
tecidos neoplásicos.Tem sido empregado, com freqüência, na investigação da atividade
proliferativa da epiderme, com diversos propósitos. Knaggs HE (1994), como já foi
mencionado, utilizando o KI67 demonstrou proliferação no ducto folicular. Andreadis
ST (2001) estudando a influência dos fatores de crescimento dos queratinócitos (KGF)
na morfogênese da epiderme, demonstrou, através de imunohistoquímica qualitativa
para o KI 67, hiperproliferação da camada basal e estímulo proliferativo às camadas
29
suprabasais. KGF também induziu expressão de α5β1 integrina e diminuição da
queratina 10 e transglutaminase, sem contudo, afetar a formação da barreira protetora da
epiderme.
As β1 integrinas são onipresentes receptores de expressão que mediam a
regulação célula-célula e célula-matriz extracelular ( Brakenbusch C et al, 2000). Todos
os receptores de superfície celular dos queratinócitos relacionam-se à expressão da
família das integrinas. Não só mediando a adesão a matriz extracelular, mas também
regulando o início do processo de diferenciação celular epidérmica. Além disso,
desempenham um papel na mi gração dos queratinócitos desde a camada basal (Adams
JC & Watt FM, 1990). A pele e o folículo piloso são fundamentalmente dependentes de
β1 integrina expressa nos queratinócitos.
Estudos anteriores já haviam sugerido que a β1 integrina poderia ser
considerada como um marcador de CT na camada basal da epiderme e que a
diferenciação era associada a sua progressiva menor expressão (Adams J C & Watt FM,
1991). Os mesmos pesquisadores, em seguida, propuseram um modelo de relação,
baseada na expressão das integrinas, entre queratinócitos e capacidade de adesão,
capacidade proliferativa e potencial de diferenciação terminal. A seqüência de eventos
demonstrou alto nível de expressão das β1 integrinas nas CT, expressão diminuída nas
CTA em proliferação, menor ainda nas células já comp romi ssada s com a difer enciaçã o
terminal e perda da expressão das integrinas nos estratos superiores da epiderme (Jones
PH & Watt FM, 1993). Na mesma linha de pesquisa, levantaram outra questão ao
investigar se as integrinas seriam simplesmente marcadoras de CT ou se tamb ém
poderiam permitir sua localização e determinar o status proliferativo dos queratinócitos.
Tendo em vista que as caderinas podem, por seu turno, regular a expressão das
integrinas nos queratinócitos, consideraram sedutor especular sobre a possibilidade das
moléculas de adesão desempenharem funções especiais para o estabelecime nto de um
padrão no desenvolvimento final na epiderme humana (Jones PH et al, 1995). Variações
nos níveis de E-caderina, β catenina e placoglobina na camada basal sugerem que as CT
também podem ser diferenciadas das CTA por sua habilidade de adesão (Watt
FM,1998).
Um grupo de moléculas propostas como marcadoras de CT incluem uma
combinação de forte expressão de α6 integrina com baixa expressão da transferrina
receptor, reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 10G7. Integrina α6 é um componente
do hemidesmossomas das células basais aderidas a membrana basal. De qualquer forma,
30
o estudo com a α integrina na identificação das CT permanece controverso. Esperava-se
que as CT, como todas as células basais, expressassem α6β4, porém Jones PH & Watt
FM (1993) e Jones PH et al(1995) não encontraram relação entre níveis de expressão
isolada da α6β4 e potencial proliferativo.
A basonuclina é uma zinco-proteína encontrada nos epitélios
estratificados e queratinizados, presente na cama da basal e nos folículos pilosos.
Comporta-se como um marcador de CT e admite-se que seja um fator de transcrição,
localizado no cromossoma 15, com a função de manter a capacidade proliferativa,
podendo inibir a diferenciação terminal do queratinócito (Vanhouttghem A & Djian P,
2004; Iuchi S et al, 2000; Weiner L & Green H, 1998).
Pesquisas mais recentes têm descrito novas e auspiciosas possibilidades
de marcação dos estados proliferativos, das CT e sua notável capacidade de influenciar
no comportamento das células vizinhas (Lowell S et al, 2000; Arnold I et al, 2001).
Representação diagramática da histologia epidérmica.
31
Representação diagramática da cinética dos queratinócitos
Diagrama da unidade pilo-sebácea e seu provimento de células tronco.
32
Diagramas ilustrativos do processo de multiplicação celular a partir
das células tronco e células trânsito-amplificadas.
3.1- P63 e PCNA.
A identificação de proteínas das células que são reguladas durante o ciclo
celular das células normais é, portanto, essencial para a compreensão dos mecanismos
de controle da proliferação celular.
33
Um interessante marcador associado à expressão de CT, recentemente
identificado é o fator de transcrição p63, pertencente a uma família que inclui proteínas
estruturalmente relacionadas como a p53 e p73, mapeado no cromossoma 3q27 (Reis-
Filho et al, 2002).
Sua utilização tem sido admitida como muito útil para o diagnóstico
diferencial entre lesões benignas e malignas da próstata e na identificação dos
carcinomas de células escamosas (Signoretti S et al, 2000)
Muitos trabalhos publicados nos últimos anos consideram que a
expressão de p63 é um marcador de queratinócitos basais em atividade proliferativa ou
habilitados a proliferar, e ausente nas células já em processo de diferenciação (Parsa R
et al, 1999; Watt FM, 2001; Potten C et al, 2002; Janes SM et al, 2002; Pellegrini G et
al, 2001).
Investigação orientada por Michele de Lucca (2001) identificou que o
p63 parece possuir especificidade para as CT dos queratinócitos. As CT e CTA estão
dispostas de forma intermitente na camada basal. Células expressando p63 nuclear
localizam-se em intervalos, algumas vezes constituindo grupos, separadas por faixas de
células p63 negativas. Em objetiva de grande aumento é comum observar essas células
com abundante p63, envolvidas por células com pouca ou nenhuma marcação. Esse
padrão de expressão do p63 é muito semelhante à organização colunar da epiderme
onde cada coluna representaria a geração epitelial (EPU) de cada uma CT (Pellegrini G
et al, 2001).
Parsa R et al (1999) estudando a associação do p63 e KI67 com o
potencial proliferativo em queratinócitos normais e neoplásicos, observaram diferentes
expressões no núcleo (p63) e organelas (KI67 em nucléolo). Verificaram, ainda, que
apenas uma pequena proporção de queratinócitos contendo p63, também continham
KI67. Todavia, todas as células que expressavam KI67, igualmente apresentavam
marcação do p63.
Um estudo experimental sobre o controle da expressão do p63, em
cultura de células, durante o processo de diferenciação celular, sob ação do ácido
retinóico, sugeriu que a expessão do p63 nos queratinócitos humanos era afetada por
todos os ácidos trans-retinóicos, influenciando no delicado equilíbrio da proliferação e
diferenciação celular da epiderme. Publicação atual investigando a embriogênese do
tecido epidérmico, concluiu que o p63 possui dupla função. Promove o início da
34
estratificação epitelial durante o desenvolvimento embrionário e mantem o potencial
proliferativo dos queratinócitos na epiderme madura (Koster MI et al, 2004).
PCNA ( Proliferating cell nuclear antigen ) é uma molécula proteica,
também conhecida como ciclina (Waseem NH & Lane DP, 1990) e, por vezes,
identificada como polimerase proteína δ-associada (Bravo R et al,1987). PCNA não é
uma proteína exclusiva dos animais, podendo també m ser observada em fito-células.
Nor malmente, não é utilizada para fins de diagnóstico, sendo restrita à
pesquisa científica. É sintetizada precocemente nas fases G1 e S do ciclo celular.
Portanto, sua síntese correlaciona-se com o estado de proliferação celular. As taxas de
ciclina, em células quiescentes, são muito reduzidas, multiplicando-se, quando
estimuladas, bem próximo ao mo mento do início da síntese de DNA. Estudos com
imunofluorescência mostram um padrão ordenado de marcação nuclear durante a fase S
do ciclo celular, havendo uma clara relação entre síntese de DNA e células PCNA
positivas. No início da fase S apresenta distribuição granular e está ausente no nucléolo.
Diferentemente, na fase S mais tardia é o nucléolo que a expressa melhor. As células
fixadas com solventes orgânicos, o núcleo é observado com intensidade, enquanto nas
células fixadas com aldeído a marcação é mais difusa, porém intensa e ocorre em todas
as fases do ciclo celular. O anticorpo monoclonal PCNA expressa fortemente
proliferação celular (Bravo R & Bravo-MacDonald H, 1987; Bravo R et al, 1987;
Woods AL, 1991).
O tamanho das células pode ser considerado como um dos principais
aspectos da clogenicidade (célula em multiplicação) e da diferenciação terminal.
Células com potencial clonogênico são as menores células do epitélio (constituem uma
das pistas para o reconhecimento das CT), e expressam PCNA. Após o
comprometimento com a diferenciação terminal, os queratinócitos aumentam de
tamanho e iniciam (como antes referido) a expressão da involucrina (Dellambra E et al,
2000).
Estudo com fator de crescimento do queratinócito (KGF) obteve boa
correlação entre diversos níveis de concentração aplicados na síntese de PCNA e a
proliferação celular. Os autores consideraram a hipótese das ciclinas estarem envolvidas
no processo proliferativo (Bravo R, 1984). Considerando a importância da investigação
da proliferação epidérmica nas patologias com queratinização anormal (Psoríase,
Hiperqueratose Epidermolítica, Dermatite Crônica e Ictiose Vulgar), utilizando o PCNA
35
como anticorpo marcador, Kanitakis J et al (1993) concluíram que, embora havendo
expressão, não era suficiente para estabelecer estrita correlação De qualquer modo,
consideraram o PCNA útil como marcador de proliferação do queratinócito.
Publicação da Universidade do Texas, Austin-EUA, sobre os efeitos da
radiação ultavioleta-B no ciclo celular da epiderme de camundongos revelou resultados
interessantes. A radiação UV-B na pele das cobaias produz hiperplasia epidérmica,
inflamação e desenvolvimento de tumor. Determinando qual a magnitude dos efeitos,
após irradiação com UV-B, durante a proliferação epidérmica, verificou-se que uma
dose eritematosa mínima (90 mJ/cm2) aumentou a expressão das ciclinas por 12 horas,
dose suficiente para provocar dano ao DNA, demonstrado pelo aumento de expressão
da proteína p53 (Berton TR et al,2001).
Pellegrini G (2001) no seu ensaio de investigação p63 Identifies
Keratinocyte Stem Cells, discute o p63 e o PCNA em relação ao potencial de expresssão
na célula proliferativa. Pondera sobre as referências de Parsa e Bravo acerca do p63 e
PCNA, ou seja, que em epiderme humana, no folículo piloso e em cultura de epiderme
estratificada, o p63 é expresso no núcleo das células em atividade proliferativa ou que
possuem capacidade de multiplicação (Parsa R et al, 1999); e o PCNA, sintetizado nas
fases G1 e S do ciclo celular, é portanto um marcador específico para células em
proliferação (Bravo R et al,1987).
Pellegrini marca, então, células basais com p63 e PCNA. Observa que,
embora a maioria das células marcasse PCNA, mas também p63, foi possível identificar
células expressando PCNA, mas não p63. Essas células marcadas apenas com PCNA,
freqüentemente eram rodeadas por células p63 positivas. Além disso, as células que
expressavam altos níveis de p63, não possuíam expressão de PCNA. Como já havia
demonstrado em experimento com p63 isolado (referência acima), o autor reitera que
essa observação sugere que o p63 é expresso por queratinócitos que possuem aptidão
proliferativa e não simplesmente por queratinócitos que estão duplicando seu DNA,
concluindo que a proteína p63 é restrita, principalmente, a identificação de CT. A
observação de que as células p63 positivas não expressam necessariamente PCNA in
vivo, mas que em toda cultura de células p63 positivas também são PCNA positivas, é
consistente com a noção de que as CT estão em ciclo lento de divisão celular in vivo,
mas ativamente proliferativas em cultura. (Pellegrini G et al, 2001).
Tomados em seu conjunto, estes dados relacionados ao p63 e PCNA,
com suas importantes e sutis diferenças de marcação e expressão, nos fez admitir poder
36
utilizá-los como instrumentos úteis de investigação sobre a proliferação celular no
desenvolvimento da acne, aplicados ao nosso modelo de experimentação.
4.- Introdução ao Modelo Experimental.
Is Acne really a disease ?
A pergunta é a primeira frase do título de uma publicação norte-
americana (Bloom DF, 2004) e contem ar madilhas de toda natureza. Conceituar
doença? Conceituar saúde? Por limites ao sofrimento do outro, isto é, definir até onde,
quando, por quê e como um incômodo pode incomodar? Dizer que é uma dermatose?
Mas o quê é propriamente uma dermatose? A dermatose pode ser alguma coisa boa? A
doença é sempre ruim? Relativizar e responder que algumas culturas ainda celebram o
aparecimento da acne, um rito bem vindo de passagem á vida adulta? E outras padecem
e adoecem com o preço dessa duplicata endócrina inexorável?
Muitas vezes, ao iniciar nossa aula de acne, diante de 80 alunos quase
ainda adolescentes, hesitamos por um instante, e declaramos não muito convictos: acne
é uma condição clinica...Mas isto é uma outra história!! Nosso compromisso é recordar
que a acne é própria do Homem, não existindo na natureza, de forma espontânea, em
nenhuma outra espécie animal.
Entretanto, alguns animais prestam-se, inequivocamente, à
experimentação científica. No que se refere à inve stigação dermatológica, em particular
na acnêgese, a orelha de coelho albino (OC) parece consensual entre os pesquisadores
como sendo o melhor ma terial e modelo para bioensaios experimentais.
A microanatomia da unidade pilo-sebácea da OC é bastante similar à
humana. A epiderme é formada por 03 a 05 camadas celulares, sobre membrana basal
fortemente PAS positiva, e aproximadamente 15% dos animais podem apresentar
hiperceratose folicular. A unidade pilo-sebácea não se aprofunda na derme e as
glândulas sebáceas, como as da pele humana, são multiacinares, com ductos curtos
reunidos no infundíbulo central, comunicando-se com a superfície cutânea. O bulbo
piloso dispõe-se lateralmente à glândula sebácea. O panículo adiposo e as glândulas
sudoríparas são inexistentes. As alterações histológicas, mais frequententemente,
observadas na acnegênese, em modelo de experimento animal com OC, são hiperplasia
epidérmica e folicular; acantose com hiperqueratose do infundíbulo e óstio folicular;
dilatação dos ductos dos ácinos glandulares e discreto infiltrado dérmico folicular e
37
perifolicular de linfócitos e polimorfonucleares (Hambrick GW & Blank HA,1956;
Abdalla C, 2001).
Não encontramos na literatura, assim como Célio Abdalla em sua tese de
doutorado, quaisquer referências ao S.epidermidis em OC, no estudo da acne. A
experimentação dermatológica, no entanto, utilizando-se de OC na investigação de
vários aspectos de sua patogenia é extensa, com destaque para algumas publicações que
possam contribuir e enriquecer nossa revisã o bibliográfica.
O interesse pela natureza e composição dos lipídeos, levou Nicolaides N
& Rice GR, 1968 a examinar e comparar as gorduras da pele humana com os da
superfície cutânea de 18 espécies diferentes de animais, encontrando no coelho tão
somente lanolina.
Weirich EG & Longauer J (1974) estudaram, em modelo de OC, o efeito
da aplicação tópica de estrogênios e antiandrogênicos, verificando razoável inibição da
atividade das glândulas sebáceas.
A coesão dos corneócitos durante a formação dos comedões foi estudada
experimentalmente em OC através da mic roscopia eletrônica. Observou-se a
persistência dos desmossomas até as camadas mais superiores da epiderme e lenta
diminuição dos grânulos de queratohialina (Woo-Sam PC, 1977).
A capacidade de induzir acnegênese experimental tem sido objeto de
investigação em diferentes centros de pesquisa através da avaliação de compostos
químicos e produtos finais farmacêuticos e cosmetológicos para uso tópico (Hofs W &
Gerlarch KD, 1957; Powers MB et al, 1975; Kligman AM & Kwong T, 1979; Zatulove
A & Kornnerth NA, 1987). Uma advertência de Frank SB (1982) considerava que os
métodos de teste em OC fossem cuidadosamente bem definidos e os resultados nem sub
ou super avaliados, em função de vários fatores, entre eles , muitas vezes, a ausência de
correlação clínica.
O potencial comedogênico e a capacidade comedolítica de inúmeras
substâncias, de qualquer forma, foram objeto de especulação de muitos trabalhos
científicos experimentais. Weary PE (1970) estudou o papel de estratos lipídicos de
Mallassezia sp (Pytirosporum ovale). Kligman AM (1970), testaram o sebo humano em
OC, observando que produzia a formação de come dão tanto no Homem quanto nos
animais, com presença, ainda de lesões inflamatórias.
Mills OH & Kligman AM (1982) testando diversas substâncias em
epiderme humana e em OC, concluíram que o modelo animal era mais sensível. As
38
substâncias intensamente comedogênicas na OC também o eram no Homem. No
entanto, as substâncias fraca ou moderadamente comedogênicas em OC, em geral, não
afetavam a pele humana.
Mais recentemente, Oh CW & Myung KB (1996) avaliaram a adesão das
células queratinizadas no comedão produzidas com uma mistura de ácido oleico e
parafina em OC, frente a três substâncias comedolíticas: peróxido de benzoíla a 5%;
ácido azelaico a 20% e tretinoína a 0,1%. Os resultados demonstraram que todas as
substâncias, após duas semanas de tratamento, aumentavam a quantidade dos
corpúsculos de Odland tornando os corneócitos menos coesos, mas apenas a tretinoína
normalizava o processo de queratinização.
Estudo histoquímico da atividade das transglutamases (envolvidas nas
etapas finais queratinização das células epidérmicas), na formação de comedões,
induzidos por coaltar em OC, foi investigada por De Young L(1984). Comparando os
resultados com os observados na diferenciação termi nal da epiderme humana,
observaram que o padrão de alterações era semelhante, sugerindo a utilidade dos
inibidores das transglutamases no tratamento da acne.
A literatura dispõe de poucas referências sobre a inflamação e produção
de resposta imune pelo P.acnes, em modelo de experimento utilizando coelhos.
Destacamos dois trabalhos: Smith MA et al (1996) observaram a sensibilidade de vários
antibióticos em coelhos infectados por P.acnes provenientes de endoftalmia humana; e
de Ichiyasu H et al (2001) que, interessados na indução de hipersensibilidade celular
produzida pelo P.acnes, verificada na sarcoidose, construíram um modelo experimental
em coelhos. Concluíram, após o estudo, que as alterações provocadas (granulomatose
angiocêntrica) eram similares a do Homem, e que o modelo animal utilizado poderia ser
útil na investigação de outras granulomatoses pulmonares.
As respostas a se a acne é realmente uma doença podem ser tão ardilosas
quanto a própria pergunta. Ao pesquisador cabe espanto e estranhamento. O
conhecimento é tributário de um comportamento, em princípio, exclamativo diante do
aparentemente insondável; e uma seqüência interrogatória: todos os possíveis e
imaginários porquês, obsessivamente, tal qual a perplexidade infantil frente a tantas
incertezas geradas pelo desconhecimento dos fenômenos do mundo natural.
Nosso propósito de investigar alguns aspectos especiais do
desenvolvimento da acne recebe, da copiosa literatura relacionada ao fenômeno da
acnegênese e, muito especialmente, do estudo de Abdalla C ( 2001), um conjunto de
39
questões estimuladoras da nossa inquietação. Esperamos, com nosso trabalho, poder
acrescentar alguma contribuição pertinente a tantas conjecturas e, por nossa vez, ter o
privilégio de transmitir a um próximo, o mesmo estímulo, inquietação, espanto e
curiosidade, constituintes do desejo humano, e razão de todas as perguntas e muitas
respostas.
Nestas condições, traçamos nossos objetivos e o desenho de investigação,
apresentados em seguida.
40
II— OBJETIVOS
A-Principal
Avaliar a imunoexpressão do p63 e do PCNA na acnegênese
induzida pelo S. epidermidis.
B- Secundários
1.- Comparar a atividade proliferativa na epiderme e
na unidade pilo-sebácea dos animais infectados pelos
S. epidermidis produtores de biofilme bacteriano e
dos animais infectados por S.epidermidis não
produtores de biofilme, através da imunodetecção do
PCNA.
2.- Comparar a atividade proliferativa na epiderme e
na unidade pilo-sebácea dos animais infectados pelo
S epidermidis produtores de biofilme bacteriano e
dos animais infectados por S.epidermidis não
produtores de biofilme, através da imunodetecçao do
p63.
41
III— MATERIAL E MÉTODOS.
1— MODELO ANIMAL
O material utilizado obtido anteriormente consistiu da tese de doutorado
de Abdalla C (2001). Blocos de parafina já processados foram reutilizados para este
novo estudo, obtendo-se novos cortes.
O desenvolvimento da pesquisa em modelo animal foi realizada no
Serviço de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia e os estudos
imunohistoquímicos e análise morfométrica no Departamento de Histologia e
Embriologia do Instituto de Ciências Biomédicas (Laboratório de Patologia Celular),
ambos da UFRJ.
1.1-Experimento:
Foram utilizados 10 coelhos albinos (Oryctolagus cermiculus), machos,
com 12 semanas de vida. Culturas de S. epidermidis produtores de biofilme bacteriano e
de S. epidermidis não produtores de biofilme bacteriano obtidas de pacientes com acne
foram processadas no Instituto de Microbiologia no Laboratório de Cocos Patogênicos
do Departamento de Microbiologia Médica do Instituto Prof. Paulo de Góes da UFRJ e
aplicadas em oito animais, conforme descrição abaixo. Dois animais foram utilizados
aplicando-se apenas meio de cultura estéril (casos controle). A área de aplicação
representava um quadrilátero de 4cm
2
contíguo ao orifício externo do canal auditivo,
conforme descrição de Hambrick & Blank,1956.
As etapas de aplicação consistiram no desengorduramento do local de teste com
álcool a 70% e massagem por aproximada mente 1 minuto com swab embebido nas
amostras assim definidas: na orelha direita- 0,15ml de do meio de cultura contendo os
S.epidermidis produtores de biofilme bacteriano; na orelha esquerda- 0,15 ml com o
meio de cultura com S.epidermidis não produtores do biofilme; Nos dois animais
controle foram aplicadas 0,15 ml de solução salina estéril. A aplicação foi realizada
uma vez ao dia, por 05 dias consecutivos, durante duas semanas, acompanhada de
42
observação clínica durante 28 dias, quando então foram realizadas avaliação das lesões
produzidas e, por fim, as biopsias.
1.1.2- Coleta das amostras de S epidermidis a partir de lesões humanas:
Os pacientes ou seus responsáveis fo ram esclarecidos sobre a natureza da
pesquisa e, com os seus livres consentimentos, iniciou-se a realização do estudo
obedecendo aos critérios da Resolução 196 de 10 de outubro de 1996 do Conselho
Nacional de Saúde.
Amostras das lesões clínicas mais exuberantes, comedões, pápulas e
pústulas (três amostras por paciente e total de 150 amostras) foram coletadas de 50
pacientes portadores de acne vulgar, independente da idade, sexo, cor e forma clínica.
Certificou-se de que tais pacientes não estavam em uso de medicação antibacteriana ou
quimioterápica de quaisquer naturezas e vias de administração há, no mínimo, trinta
dias. Foram descartados do estudo aqueles com infecções concomitantes.
.
Foi realizada: (1) a semeadura primária do material obtido em meio de
cultura apropriado; tendo sido feita (2) a identificação e (3) seleção das colônias das
sugestivas de S.epidermidis coagulase-negativos; 4- identificação bioquímica dos
S.epidermidis; 5- evidenciação de produção de biofilme bacteriano submetendo as
amostras de S.epidermidis ao teste de produção de biofilme; 6- separação das amostras
em produtoras e não produtoras de biofilme; 7- aumento da produção de biofilme
submetendo as amostras produtoras à semeadura em caldo de cultura especial; 8- da
purificação do biofilme; 9- e estocagem do material e posterior adequação objetivando a
infecção no modelo animal.
1.1.3- Preparação para aplicação no modelo animal
As duas amostras de S.epidermidis (produtora e não produtora de
biofilme) foram, então, processadas até a obtenção de extratos de suspensão bacteriana
em meio de cultura apropriado e aplicados nos animais:
— Orelha direita: amostra com S.epidermidis produtores de biofilme;
43
— Orelha esquerda: amostra com S.epidermidis não produtores de
biofilme.
1.1.4- Avaliação Clínica das Lesões e Obtenção do Material.
Foi efetuada a olho nu, anotando-se as seguintes características:
(-) = ausência de lesões cutâneas;
(+) = presença de lesões cutâneas (comedão, eritema, pápula, pústula e
crosta).
A infecção das orelhas dos animais infectados com os S.epidermidis
produziram evidentes diferenças, qualitativas e quantitativas, quando comparadas entre
àquelas tratadas com S.epidermidis produtores de biofilme e as não produtoras de
biofilme( Anexo IV Quadro 1; Tabelas 22 e 24 e Figuras Prancha C in Abdalla C, 2001)
Para a realização das biopsias, foi utilizada a recomendação de Hambrick
& Blank (1956): retirada do fragmento de pele através de punch de 06 mm, acima de
cartilagem horizontal, com o cuidado de se aprofundar o corte para inclusão da
cartilagem. A biopsia foi realizada depois de cuidados antissépticos e obtenção de
analgesia local.
2 — PROCESSAMENTO DO MATERIAL.
Na nova etapa do experimento, foram realizados novos cortes
histológicos no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Escola da Faculdade de
Medicina de Teresópolis da Fundação Educacional Serra dos Órgãos (FESO).
Cortes de 6 μm de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo sendo
corados em hematoxilina-eosina (HE) e outros, recolhidos em lâminas previamente
preparadas com poli L-lisina para sua aderência e destinados ao estudo
imunohistoquímico.
44
2.1- Estudo Morfológico
Os novos cortes histológicos, corados pela HE, foram visualizados em
microscópio ótico e efetuada análise descritiva dos resultados.
2.2-Estudo Imunohistoquímico
Utilizou-se os seguintes anticorpos:
p63 – anticorpo monoclonal obtido de camundongo dirigido contra a
proteína p63 humana (Dako, Carpinteria, CA, USA, clone 4A4).
PCNA – (Proliferating cell nuclear antigen) (Santa Cruz Biotechnology,
Inc, CA, USA , clone PC10): anticorpo monoclonal obtido em camundongo, dirigido
contra a proteína PCNA.
2.3- Procedimento Técnico:
Após desparafinização, os cortes foram submetidos à inibição da
peroxidase endógena (H2O2 a 3% em metanol) e bloquueio das ligações inespecíficas
das imunoglobulinas com constituintes celulares e incubados com o anticorpo primário,
nas diluições adequadas (obtidas após teste) – p63 e PCNA (1:100, diluição em PBS-
BSA 3%), por 16 horas, a 4°C em câmara úmida.
Os anticorpos foram revelados pelo Kit Extrativina-Peroxidase (Sigma,
St Louis, USA), sendo utilizado a diaminobenzidina como substrato cromógeno (FAST
DAB, Sigma). Foi realizada a contracoloração dos cortes pela hematoxilina de Harris e
montadas com resina sintética (ENTELLAN, Merck, Alemanha).
3— Análise Histomorfométrica.
Para a histomorfometria foi utilizado um sistema de análise de imagem computadorizado,
constituído por uma câmara digital (Coolpix 990, NIKON, Japan) acoplada a um microscópio
45
óptico (Eclipse 400, NIKON, Japan). Foram capturadas o máximo de campos e m cada lâmina, que
continham a epiderme, com a objetiva de 400x. As imagens digitalizadas foram vi sualizadas em
monitor de alta resolução (2048 x 1536 pixels buffer) sendo então contadas por meio do programa
de análise de imagens Image Pro Plus 4.5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA),
considerando-se o total de células na epiderme e o número de células imunorreativas. Resultados
foram expressos como o percentual médio das células marcadas em relação às células não
marcadas. Diferenças entre os grupos foram verificadas através de testes estatísticos.
4— Análise Estatística
Os resultados foram submetidos ao teste One way analysis of variance on ranks para se
verificar se os grupos eram diferentes entre si, sendo posteriormente submetidos ao teste de
comparações múltiplas pareadas (All pairwise multiple comparison) (Método de Dunn) para se
isolar os grupos que diferiam entre si. Significância estatística foi definida com p<0,05.
46
IV— RESULTADOS.
1— Descrição Morfológica:
1.1— Animais controle e animais infectados
A pele da orelha do coelho constituía-se de epiderme contendo de 2 a 4
camadas celulares e derme fina delimitada internamente pela cartilagem. Na camada
basal, observaram-se células colunares com núcleos alongados. As glândulas sebáceas,
a semelhança da pele humana, apresentavam óstio de abertura no folículo piloso que ,
por sua vez, ao penetrar na epiderme configuravam o infundíbulo folicular (Prancha 1,
Figuras 1e 2).
Nos animais infectados com os S.epdermidis com biofilme bacteriano e
sem biofilme, os aspectos histopatológicos foram semelhantes, porém mais evidentes
nos coelhos infectados com biofilme: consistiram em proliferação da epiderme,
dilatação do óstio infundibular, por vezes dilatação das glândulas sebáceas e discreto
infiltrado mononuclear em torno dos anexos (Prancha 2, Figuras 3, 4, 5, 6; Prancha 4,
Figuras 11 e 12; Prancha 5, Figura 15; Prancha 7, Figura 23).
2— Imunohistoquímica
2.1— Animais Controle:
Imunorreatividade para o PCNA nos animais controle, restringiu-se ao
núcleo celular e foi verificada somente na camada basal da epiderme, em raras
células (Prancha 3, Figuras 7, 8). O índice de proliferação médio do PCNA foi de
1,44 % (Prancha 8, Figura 29) e mediana de 1,45 ( Tabelas 1 e 2, respectivamente,
das médias e medianas).
O marcador p63, também i munodectado somente no núcleo celular, foi
observado em um maior número de células da camada basal, raramente em células
das camadas suprabasais (Prancha 3, Figuras 9 e 10) e células da camada externa
do folículo piloso e sebócitos ( Prancha 3, Figura 9). O índice de p63 médio foi de
47
7,05% (Prancha 10, Figura 33), e valor da mediana de 7,04 (Tabelas 1 e 2 das
médias e medianas).
2.2— Animais Infectados Marcados com o PCNA:
Nos dois grupos de animais verificou-se que a imunoreatividade para o
PCNA se mostrou aumentada, estando presente nas células basais e suprabasais da
epiderme e no infundíbulo (Prancha 4, Figuras 13 e 14; Prancha 5, Figuras 16, 17,
18).
Nos animais biofilme positivos, o índice médio de proliferação foi de
11,00% com mediana de 6,52; nos animais biofilme negativos, de 4,37% e
mediana de 4,00 (Prancha 8, Figuras 27 e 28 e expressão comparada com o
controle na Prancha 9, Figura 30).
Comparando os três grupos, verificamos significativo aumento da
proliferação nos animais biofilme positivos quando comparados aos biofilme
negativos (p<0,05) e, ambos, em relação ao controle (p<0,05). (Anexo1, Figura 2;
dados no Anexo 2, Quadro 2).
2.3— Animais Infectados Marcados com o p63:
O índice médio de imunoexpressão para o p63 foi de 15,27% nos animais
biofilme positivos e 10,09% para os biofilme negativos (Prancha 10, Figuras 31 e
32 e expressão comparada com o controle na Prancha 11, Figura 34), com
medianas respectivas de 12,39 e 3,85( Tabelas 1 e 2 das médias e me dianas )
Verificou-se que houve aumento, em ambos os grupos, do número de
células marcadas (Prancha 6, Figuras 19, 20, 21 e 22), em particular, na epiderme,
no infundíbulo, folículos pilosos e sebócitos dos animais infectados com
S.epidermidis produtor de biofilme ( Prancha 7, Figuras 24,25 e 26).
Da mesma forma, em relação ao p63, houve incremento relevante da
imunodetecção nos animais do grupo infectado com o biofilme comparado aos não
infectados e ao controle (p<0,05). No entanto, apesar da diferença ente os índices
médios de proliferação, não houve, de acordo com a avaliação estatística, diferença
significativa entre o grupo biofilme negativo e o controle (p>0,05) (Anexo 1,
Figura 1; dados no Anexo 2, Quadro 1).
48
TABELA 1 Valores Médios dos Índices de Proliferação.
NÃO
. BIOFILME BIOFILME. CONTROLE
PCNA
11,00%
4,38%
1,44%
p63
15,28%
10,09%
7,11%
TABELA 2 Valores das Medianas.
NÃO
BIOFILME. BIOFILME. CONTROLE.
PCNA
6,52
4,00
1,45
p63
12,39
3,85
7,04
49
PRANCHA 1
Animal Controle
— HE
FIG. 1— Microfotografia óptica evidenciando aspectos
panorâmicos da pele normal de coelho corada
pela HE X 40.
FIG 2— Microfotografia ópt ica da pele normal de oelho
mostrando epiderme fina com aparelho pilo-
sebáceo constituído de ácinos glandulares
observados na derme, HE X 100.
50
1
2
51
PRANCHA 2
Animal Infectado com S.epidermidis Produtor de Biofilme
— HE
FIG. 3— Microfotografia óptica evidenciando epiderme
hiperplasiada, observando-se dilatação da região
infundibular( ↑ ). Podemos notar, ainda, nesta área,
presença de material amorfo eosinofílico( HE X 200 ).
FIG. 4— Infiltado inflamatório na derme ao redor de glândulas
sebáceas e folículos pilosos ( HE X 400 ).
Animal Infectado com S.epidermis NÃO Produtor de Biofilme
— HE
FIG. 5 e FIG. 6— Panorâmica de microf otografia óptica
evidenciando dilatação menos pronunciada da
região infundibular, assim como do material
amorfo eosinofílico ( HE X 100 ).
52
3
5
3
4
5
6
53
PRANCHA 3
ANIMAIS CONTROLE — PCNA
FIG. 7 e FIG. 8 — Imunodetecção do PCNA evidencia
núcleos reativos localizados na camada
basal da epiderme ( X 400 ).
ANIMAIS CONTROLE — p63
FIG. 9 e FIG. 10 —Imunodetecção do p63 também
revela reatividade nuclear das células
da camada basal, apresentando ainda
núcleos reativos das células da
camada externa do folículo ( X 400 ).
54
55
PRANCHA 4
Animal infectado com S. epidermis Produtor de Biofilme.
HE e PCNA
FIG. 11 e 12—
Microfotografia ótica evidenciando
infundíbulos dilatados e imunodetecção
de núcleos na camada basal (HE X100 e
imunohistoquímica X 100 ).
FIG. 13 e 14 —
Lâminas coradas para o PCNA com
intensa imunorreatividade nuclear em
camada basal da epiderme e em
torno dos folículos ( X 400 ).
56
1413
12
11
57
PRANCHA 5
Animal Infectado com S.epider midis NÃO Produtor de Biofilme
— HE e PCNA
FIG. 15 — Microfotografia óptica revelando epiderme
com região infundibular dilatada ( ↑ ) ( HE x 40 ).
FIG. 16; FIG. 17 e FIG. 18 — A imunohistoquímica
evidencia núcleos reativos encontrados
em células das camadas basais da epiderme
( X 400 ; X200 ; X100 ).
58
15 16
17
18
59
PRANCHA 6
Animal Infectado com S.epidermidis não Produtor de Biofilme
— p63
FIG. 19; FIG. 20;
FIG. 21e FIG 22— A histoquími ca revela
imunodetecção intervalada de núcleos na camada
basal da epiderme ( X 400 ).
60
20
21 22
19
61
PRANCHA 7
Animal Infectado com S.epider midis Produtor de Biofilme
— HE e p63
FIG. 23 — Microfotografia óptica mostrando óstio
folicular pronunciadamente dilatatado, preenchido
com grande quantidade de material amorfo
eosinifílico ( HE X 300 ).
Fig.24; FIG. 25 e FIG.26— Imunohistoquímica para o
p63 revela grande número de núcleos reativos na
região basal e supra basal da epiderme, região
infundibular e em sebócitos ( X350; X400; X400).
62
23
24
25 26
63
PRANCHA 8
FIG 27
FIG 28
FIG 29
PCNA -Índice de proliferação médio nas
amostras controle.
98, 5 5%
1, 45%
PCNA - Índice de Proliferação Médio nas
Amostras com S. epidermidis Produtor de
Biofilme
biofilme
11,00%
não biofilme
89,00%
64
PRANCHA 9
FIG 30
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Freqüência
relativa
123
biofilme não biofilme controle
PCNA - Índices Comparados de
S.
epidermidis
com biofilme, sem
biofilme e controle.
65
PRANCHA 10
FIG 31
FIG 32
FIG 33
p63 - Índice de proliferação médio nas amostras
controle.
92,95%
7,05%
p63 - Índice de Proliferação Médio
nas amostras com
S. epidermidis
produtor de biofilme.
biofilm e
15,27%
não biofilm e
84,73%
p63 Índice de Proliferação Médio nas amostras com S. epidermidis
não produtor de biofilme.
biof ilme
10,09%
não biofil me
89,91%
66
PRANCHA 11
FIG 34
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Freqüência
relativa
123
p63 - Índices Comparados do S.
epidermidis com biofilme, sem
biofilme e controle.
biofilme não biofilme controle
Não biofilme biofilme controle
67
V— DISCUSSÃO
A patogenia da acne é multifatorial, constituindo-se num evento
sindrômico. Não podemos, a rigor, após dedicar boa parte do nosso trabalho a revisão
do tema, acreditar na existência de uma chave mestra cognitiva reveladora da totalidade
da conjuntura etiopatogênica envolvida na acnegênese. Contudo, o desafio em
compreender a complexa interdependência dos diversos fatores responsabilizados pelo
processo de formação da acne, e o micro ambiente onde se desenvolvem, continua a
renovar as expectativas dos que se mantêm interessados em investigá-la.
A análise dos nossos resultados demonstra que a proliferação dos
queratinócitos, no modelo de experimento em orelha de coelho, possui forte correlação
com a presença dos S.epidermidis produtores de biofilme de adesão, imunodectada
através dos índices alcançados de expressão celular, quando aplicados os anticorpos
PCNA e p63.
A hiperproliferação do infundíbulo folicular está, repetidamente,
relacionada no elenco dos principais fatores envolvidos na patogenia da acne. Porém, os
mecanismos desencadeadores do fenômeno proliferativo, a despeito do esforço de
muitos pesquisadores, ainda não foram esclarecidos Os motivos pelos quais verifica-se
hiperqueratinização anormal, no lúmen do folículo, decorrente da atividade
proliferativa, continuam incertos.
Os micrococci coagulase-negativos, com realce para o S.epidermidis,
são, por sua vez, identificados como habitantes residentes da microbiota folicular em
todos os estudos sobre a participação de microorganismos relacionados à acne. A
literatura, no entanto, oferece um limitado conteúdo de conhecimento sobre a
participação dos S.epidermidis como fator importante no processo da acnegênese,
enfatizando nitidamente a participação do Propiono bacterium acnes.
São conhecidos os estudos de Puhvel SM et al (1965), sobre os níveis de
anticorpos anti-S.epidermidis e sua possível relação com a patogenia da acne; e a
determinação de sub-classes de IGG específicas e suas frações, referentes ao P.acnes e
ao S.epidermidis (Ahsbee HR et al, 1997). Assim como trabalhos correlacionando a
resistência ou susceptibilidade dos microorganismos habituais da unidade pilo-sebácea
frente à quimioterapia antibiótica utilizada rotineiramente no tratamento da acne
(Marples RR & Kligman AM, 1971; Nishijima S et al, 1994; 2000).
68
Pode mos ainda apontar as investigações que tiveram o objetivo de
determinar, genericamente, a população microbiota residente no infundíbulo folicular,
em indivíduos com e sem acne (Marples RR, 1974; Leeming JP et al, 1984; Till et al,
2000), ou o ensaio de Holland KT (1977) quantificando o número de micrococci e dos
difteróides anaeróbios em pele acneica e pele normal, sugerindo que apenas a presença
ou a quantidade de bactérias, sem interatividade com o microambiente, não poderia ser
considerado o bastante para a predisposição à acne. Entre não muitos outros que, em
algum momento, pensaram na possível relevância dos S.epidermidis, podemos destacar
os estudos sobre a produção de citotaxinas e outros compostos inflamatórios, induzidos
por várias cepas de P.acnes e S.epidermidis (Puhvel SM & Sakamoto M, 1970; Allaker
RP et al, 1985; 1987), e a avaliação do papel dos ácidos graxos livres e das lipases no
comprometimento da pa rede do ducto folicular (Pablo G et al, 1974; Cunliffe WJ et al,
1975; Fulton JF Jr, 1976; Puhvel SM & Sakamoto M, 1977).
A observação da hiperqueratinização ductal observada por Plewig G
(1971) em trabalhosa investigação da dinâmica celular da for mação comedão, foi
comfirmada por Knaggs HE et al (1994), com desenho de estudo similar ao nosso.
Folículos normais e acne-comprometidos de pacientes com acne foram comparados aos
de voluntários normais (controles), usando o anticorpo monoclonal Ki-67, que como
vimos, expressam núcleos de células em proliferação nas fases G1, S, M e G2 do ciclo
celular. Os núcleos marcados na camada basal foram contados e expressos em
porcentagem do total de todos os núcleos quantificados. Seus resultados confirmaram os
achados de Plewig, demonstrando que nos infundíbulos acne-comprometidos ocorria
hiperproliferação dos ductos foliculares comparados aos folículos normais dos pacientes
com acne e com os controles.
Apesar do trabalho de Knaggs constatar a presença de hiperproliferação,
não fazia referência a uma variável etipatogênica. Da mesma forma, Aldana OL (1998)
e seu estudo da proliferação dos queratinócitos nos ductos dos folículos piloso e
sebáceo, utilizando o Ki-67 e a queratina 17, marcando hiperproliferação e início de
diferenciação anormal, também não relacionava seus resultados a possíveis causas
determinadas, mas sim, postulava o momento em que a inflamação ocorreria.
Regra geral, todos esses trabalhos de investigação, pouco ou nenhum
impacto produziram sobre a compreensão do papel dos S.epidermidis na patogenia da
acne, ou ratificaram a importância predominante da participação do P.acnes.
69
Ao que tudo indica, apenas com Abdalla C (2001) e seu estudo pioneiro
demonstrando a presença de biofilme produzido por cepas de S.epidemidis provenientes
de lesões humanas, em acnegênese experimental em orelha de coelho, resgatou-se a
relevância dos cocci coagulase-negativos, restabelecendo novos caminhos e diferentes
perspectivas de investigação orientadas às pesquisas envolvendo a patogenia da acne,
sobretudo se consideramos a natureza e as propriedades antigênicas imanentes à lama
bacteriana.
A proliferação celular, lato sensu, pode ser detectada por diferentes
métodos. Nos tecidos preparados para estudo histológico, têm sido utilizados
marcadores que expressam proteínas presentes no ciclo celular, como o Ki-67, PCNA e
recentemente o p63, com diversas finalidades, sejam elas destinadas a procedimentos
diagósticos e/ou a investigação científica.
A pesquisa científica recorre ao PCNA como marcador de células em
proliferação, há mais de uma década. No campo da dermatologia, investigação com o
PCNA, combinado ou não com outros marcadores de proliferação celular, vem sendo
considerada como bastante útil na avaliação de condições malignas e pré-malignas
(Ceratoses actínicas, Doença de Bowen, Verrugas genitais, Carcinoma espino-celular,
Micose fungoide e Melanomas), e na tentativa de compreensão de doenças
hiperproliferativas, tais como Psoríase, Ictiose Vulgar, Pitiríase Rubra Pilar, Prurigo
Nodular e Ceratoacantoma. Nas patologias da boca, destacamos um estudo brasileiro
sobre o Líquen plano oral (Da Silva-Fonseca LM & Do Carmo LA, 2001; Ramzi ST et
al, 2002; Mitsuishi T et al, 2003; Kawahira K, 1999; Kanitakis J et al,1993 Geary WA
& Cooper PH, 1992: Furukawa F et al, 1992).
O p63, membro recentemente identificado da família do p53, é expresso
nas células da camada basal de diferentes órgãos. Foi determinado que possui um papel
essencial na morfogênese da epiderme e, possivelmente, em tumores com orige m nos
queratinócitos e anexos epidérmicos. Seu estudo em queratinócitos normais e
neoplásicos o apontam como possível marcador de células com capacidade proliferativa
podendo, talvez, ser utilizado no prognóstico, ou como preditor diagnóstico, na
investigação de tumores queratinócito-originados.
Baseado em suas propriedades como proteína relacionada ao ciclo
celular, do mesmo modo, o p63 tem sido aplicado em estudos sobre cicatrização de
ferimentos e no comportamento regenerativo de úlceras de perna venosas e úlceras de
pé diabéticas (Noszczyk BH & Majewski ST, 2000; Parsa R et al, 1999; Galkowsk H et al,
70
2003; Tsujita-Kyutoku M et al, 2003; Reis-Filho JS et al, 2002; Dellavalle RP et
al,2002).
Nosso principal interesse foi estudar a participação do Staphylococcus
epidermidis, muito em particular, os mes mos produtores de biofilme bacteriano no
modelo de experimento de Abdalla (2001), e sua efetiva implicação na atividade
proliferativa dos queratinócitos da unidade pilo-sebácea.
A utilização do PCNA e do p63 no estudo da proliferação na acne nã o
encontra paralelo na literatura. A decisão por sua escolha considerou a possibilidade de
avaliar, em primeiro lugar, o processo proliferativo dos queratinócitos não
comprometidos com a diferenciação terminal. Como vimos, a proteína PCNA é
sintetizada no início das fases G1 e S do ciclo celular e, portanto, expressa por células
em proliferação (Bravo & MacDonald-Bravo, 1987).
O p63 tem sido advogado como marcador de células tronco da camada
basal de epitélios estratificados e de transição (Pellegrini G et al, 2001) ou expresso no
núcleo de células que estão se proliferando ou habilitadas a se multiplicar (Parsa R et al,
1999); e, em complemento, como uma oportunidade, ao que parece, inédita, de avaliar o
comportamento das células tronco, em um modelo de acnegêse experimental, na
presença de um componente (infecção pelos S.epidermidis) definido.
Os modelos de investigação da proliferação celular na unidade pilo-
sebácea acne-comprometida sofrem certa limitação pela falta de um modelo de
experimento animal ideal. De qualquer forma tem sido, como nos referimos
anteriormente, preconizado a orelha de coelho como a mais apropriada ao estudo da
acnegênese, dada sua semelhança com a pele humana.
Os resultados de Abdalla (2001) demonstraram que a infecção através da
aplicação de extratos de S. epidermidis em orelha de coelho produzem lesões
acneiformes, do mesmo modo que a inoculação intradérmica de P.anes em ratos (De
Young et al, 1984), com a vantagem da utilização de um modelo mais adequado.
As diferenças histopatológicas encontradas nos animais infectados por
S.epidermidis produtores e não produtores de biofilme foram discretas. Porém o estudo
imunohistoqímico revelou haver importante aumento e desrregulação da proliferação
dos queratinócitos e do conteúdo das células tronco na epiderme dos animais infectados.
Atribuímos à observação desse descontrole proliferativo ao aume nto do
pool de células tronco, em particular, nos animais infectados com o biofilme de adesão
expresso nas amostras marcadas com o p63. Atenção especial deve ser dada a essa
71
observação. Ainda que consideremos pouco provável, não podemos, contudo, descartar
a possibilidade de haver em algum momento, após o estímulo antigênico, uma
diminuição ou inibição da diferenciação terminal destas células, o que as levariam a
permanecer mais temp o nas etapas progenitoras, mesmo com aumento não só das
células tronco, como também das células de amplificação transitórias.
Nossos resultados adquirem significativa relevância, na proporção em
que sabemos que a proteína p63 é considerada a chave molecular desencadeadora e
mantenedora do programa de estratificação e organização da arquitetura dos
queratinócitos na epiderme (Koster et al, 2004). O aume nto da sua expressão, se não é
uma garantia de hiperproliferação, é indicativo de forte sinalização à atividade
proliferativa e ao comprometimento da diferenciação terminal.
Outra importante contribuição, que nos permite uma compreensão mais
pontuada de nossos resultados, advém do conhecimento de que a isoforma ΔNp63α
tende, em condições de equilíbrio, a diminuição progressiva de expressão quando os
queratinócitos iniciam seu compromisso com a diferenciação terminal. Todos os ácidos
trans-retinóicos atuam de forma a inibir ou prevenir o aumento de expressão dessa
isoforma, promovendo o êxito do processo de arranjo espacial e cinético da
epidermopoiese (Bamberger C et al, 2002). Torna-se razoável supor, como uma das
justificativas, com base nessa informação, o sucesso terapêutico das tretinoínas num
ambiente estimulado e hiperproliferativo. Informação pertinente é a especificação de
que o anticorpo utilizado em nossa investigação marca um epítopo comum a todas as
isoformas do p63 (Yang A, et al, 1998), depreendendo-se, portanto, que a expressão da
ΔNp63α esteja elevada, contida na expressão global do aumento do pool de células
tronco observado.
Além disso, recordamos que as células tronco, nos sítios de localização a
elas atribuídos, na interface dermo-epidémica, estão intimamente relacionadas à lâmina
basal e a matriz extracelular com suas conexões de filamentos e fibrilas de ancoragem,
numa área muito bem protegida, ricamente atendida tanto por uma hidráulica capilar
como por inervação altamente especializadas (Cotsarellis G et al, 1990). É um local
crítico onde ocorrem as trocas de sinalização entre as células tronco e a matriz
extracelular mediada pelas moléculas de adesão, e do me smo modo, entre as células
tronco e demais queratinócitos, ao quais sob condições de estímulo secretam
citocinas/fatores de crescimento, o que, certamente, induzem estímulos inflamatórios e
72
alteração no processo de proliferação e diferenciação dos queratinócitos da epiderme
(Uitto J & Pulkkinen L, 1996).
Todo esforço em compreender a patogenia da acne de forma
integralizadora é um desejo e um direito inalienável do pesquisador. Reconhecemos, no
entanto, que nosso ensaio experimental realizou-se numa circunscrição bastante
definida. Por outro lado e, paradoxalmente, pelos mes mos motivos, nos enseja
entusiasmo e otimismo, na medida que verificamos uma importante diferença no padrão
proliferativo com significativo aumento do gradiente de células tronco, subordinados a
uma variável controlada, mensurados por dois marcadores de proliferação.
Nestas condições, parece-nos evidentemente indicativo, a luz dos
resultados observados, que a presença do biofilme constituíu-se num fator importante na
alteração do status de proliferação infundibular, ou seja: o cenário
inflamatório/hiperproliferativo observado na unidade pilo-sebácea foi, seguramente,
caudatário da presença do Staphilococcus epidermidis produtores de biofilme
bacteriano, em nosso estudo de acnegênese experimental.
73
VI— CONCLUSÔES.
A avaliação imunohistoquími ca da proliferação dos queratinócitos
induzida pelo Staphilococcus epidermidis em nosso modelo de acnegêse experimental,
nos permitiu:
1 — Comprovar a ocorrência de hiperproliferação ductal, em modelo de
experimento em orelha de coelho, através da imunoexpressão elevada das proteínas
PCNA e p63 induzidas pelo S.epidermidis, em imunodetecção efetuada por ambos os
marcadores utilizados.
2 — Demonstrar que a proliferação dos queratinócitos imunodetectada pelo
PCNA foi expressa pelos núcleos das células da camada basal da epiderme e do
infundíbulo folicular em ambos os grupos de animais infectados pelos S.epdermidis
(produtores e não produtores de biofilme), apresentando maior e significativa expressão
no grupo dos animais infectados com o biofilme quando comparados com o grupo não
produtor de biofilme e com o controle.
3 — Verificar, do mesmo modo, que a imunorreatividade do p63 foi
relevantemente elevada nos núcleos dos queratinócitos da camada basal da epiderme e
da unidade pilo-sebácea das células biofilme positivas quando comparada com as
células biofilme negativas e as do controle.
4 — Observar que a imunodetecção do aumento pool de células tronco e células
trânsito-amplificadas expressas, notadamente pelo p63, encontraram repercussão no
índice dos queratinócitos em atividade proliferativa, igualmente verificado pelo
aumento de expressão da proteína PCNA.
5 — Concluir que a presença do biofilme bacteriano, em nosso experimento, foi,
de fato, a principal responsável pela hiperproliferação observada na epiderme e no
infundíbulo folicular, durante o processo da acnegênese induzida pelo Staphilococcus
epidermidis.
74
VII— PERSPECTIVAS FUTURAS.
O privilégio de poder trabalhar ao lado da Professora Christina Maeda
Takyia e do Dr. Célio Abdalla, sob a regência orientadora do Professor Absalom Lima
Filgueira, nos entusiasma e nos permite, em nome do grupo que inaugurou e vem
desenvolvendo criativa e sistemática investigação sobre a acne, imaginar possibilidades
e desdobramentos futuros a nossas pesquisas:
1- Ainda que no modelo de experimentação em orelha de coelho, o aparelho
pilo-sebáceo apresente notável isomorfismo comparado ao do Homem, continuamos
considerando a necessidade de reproduzir nosso ensaio em lesões hum anas;
2- Investigar possíveis mecanismos metabólicos e biomoleculares, determinados
pela presença do biofilme bacteriano, sobre os queratinócitos já compromissados com a
via de diferenciação terminal;
3- Verificar a possibilidade de aumento de coesão entre os corneócitos, no
desenvolvimento da comedogênese, a partir da melhor compreensão das propriedades
do biofilme bacteriano e sua possível habilidade em promover maior adesão entre os
queratinócitos terminais;
4- Desenhar um modelo de investigação que permita investigar a influência da
ação antigênica do biofilme sobre as células tronco da epiderme e suas conseqüências
em relação a martriz extracelular, no fenômeno da acnegênese.
5- Avaliar, sob condições de rigor metodológico, a ação das substâncias de uso
tópico e sistêmico na rotina do tratamento da acne, sobre as cepas de Staphilococcus
epidermidis produtores de biofilme.
75
VIII— REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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90
IX — ANEXOS
ANEXO I
FIG 1 – GRÁFICO DEMONSTRATIVO DA ANÁLISE ESTATÍSTICA
(p63) Método de Dunn
Grupos
Lama
Não Lama Controle
0
10
20
30
40
50
60
70
91
ANEXO I
FIG 2 – GRÁFICO DEMONSTRATIVO DA ANÁLISE ESTATÍSTICA
(PCNA) Método de Dunn
Grupos
Lama Não-lama Controle
0
10
20
30
40
50
60
92
ANEXO II
DADOS RELATIVOS A QUANTI FICAÇÃO DE CÉLULAS MARCAD AS E NÃO MARCA DAS.
Quadro 1
P63 Biofilme
ã
Não Biofilme
o
Controle
9 35 20,45% 0 39 0,00% 4 60 6,25%
5 57 8,06% 0 41 0,00% 6 66 8,33%
14 56 20,00% 0 42 0,00% 4 77 4,94%
19 49 27,94% 0 37 0,00% 8 73 9,88%
29 30 49,15% 0 39 0,00% 3 87 3,33%
12 42 22,22% 0 43 0,00% 8 73 9,88%
10 43 18,87% 3 45 6,25% 11 75 12,79%
5 39 11,36% 3 39 7,14% 6 80 6,98%
8 43 15,69% 4 43 8,51% 5 66 7,04%
8 40 16,67% 5 45 10,00% 7 68 9,33%
9 40 18,37% 2 49 3,92% 4 63 5,97%
8 42 16,00% 21 45 31,82% 4 61 6,15%
7 49 12,50% 19 41 31,67% 6 71 7,79%
14 33 29,79% 31 47 39,74% 6 66 8,33%
22 29 43,14% 25 49 33,78% 6 69 8,00%
29 20 59,18% 28 47 37,33% 5 62 7,46%
34 21 61,82% 31 53 36,90% 8 59 11,94%
23 29 44,23% 29 48 37,66% 6 61 8,96%
19 29 39,58% 27 67 28,72% 3 54 5,26%
15 29 34,09% 29 70 29,29% 6 66 8,33%
6 40 13,04% 19 48 28,36% 6 53 10,17%
6 46 11,54% 5 58 7,94% 7 59 10,61%
12 71 14,46% 3 68 4,23% 8 61 11,59%
11 55 16,67% 2 55 3,51% 4 74 5,13%
8 66 10,81% 4 67 5,63% 4 68 5,56%
9 78 10,34% 4 55 6,78% 0 81 0,00%
7 43 14,00% 0 54 0,00% 0 92 0,00%
6 41 12,77% 2 50 3,85% 5 57 8,06%
10 53 15,87% 2 64 3,03% 5 58 7,94%
7 46 13,21% 2 55 3,51% 8 78 9,30%
7 51 12,07% 5 55 8,33% 5 57 8,06%
6 43 12,24% 4 52 7,14% 6 58 9,38%
7 50 12,28% 4 43 8,51% 3 51 5,56%
18 57 24,00% 6 47 11,32% 3 50 5,66%
11 41 21,15% 18 65 21,69% 3 55 5,17%
2 44 4,35% 11 40 21,57% 4 58 6,45%
0 34 0,00% 1 33 2,94% 6 64 8,57%
0 50 0,00% 13 41 24,07% 4 62 6,06%
0 48 0,00% 5 34 12,82% 3 49 5,77%
0 45 0,00% 7 37 15,91% 5 67 6,94%
0 41 0,00% 3 78 3,70% 5 66 7,04%
8 41 16,33% 11 39 22,00% 2 49 3,92%
6 68 8,11% 11 68 13,92% 5 54 8,47%
93
23 49 31,94% 9 57 13,64% 3 49 5,77%
23 40 36,51% 14 51 21,54% 5 58 7,94%
9 43 17,31% 2 73 2,67% 4 50 7,41%
9 45 16,67% 2 58 3,33% 3 58 4,92%
10 50 16,67% 1 49 2,00% 5 46 9,80%
1 50 1,96% 0 64 0,00% 4 52 7,14%
0 54 0,00% 0 50 0,00% 3 51 5,56%
4 56 6,67% 0 44 0,00% 2 61 3,17%
9 83 9,78% 0 56 0,00% 3 55 5,17%
24 53 31,17% 0 58 0,00% 1 49 2,00%
0 62 0,00% 8 66 10,81% 2 43 4,44%
8 48 14,29% 0 75 0,00% 1 34 2,86%
9 38 19,15% 0 53 0,00% 1 49 2,00%
12 42 22,22% 0 54 0,00% 5 60 7,69%
4 27 12,90% 1 44 2,22% 2 45 4,26%
0 52 0,00% 0 54 0,00% 3 41 6,82%
9 44 16,98% 1 52 1,89% 4 48 7,69%
10 40 20,00% 0 52 0,00% 6 71 7,79%
5 34 12,82% 0 47 0,00% 8 69 10,39%
3 59 4,84% 0 40 0,00% 5 53 8,62%
6 45 11,76% 3 57 5,00% 4 55 6,78%
6 55 9,84% 0 72 0,00% 8 74 9,76%
4 36 10,00% 3 47 6,00% 3 51 5,56%
2 55 3,51% 8 42 16,00% 10 91 9,90%
1 59 1,67% 6 30 16,67% 4 59 6,35%
5 51 8,93% 0 66 0,00% 10 81 10,99%
3 49 5,77% 0 44 0,00% 7 82 7,87%
1 46 2,13% 0 45 0,00% 15 111 11,90%
1 43 2,27% 2 41 4,65% 7 87 7,45%
0 42 0,00% 1 45 2,17% 6 71 7,79%
0 55 0,00% 0 37 0,00% 5 59 7,81%
0 50 0,00% 0 51 0,00% 3 67 4,29%
0 47 0,00% 4 48 7,69% 5 66 7,04%
0 45 0,00% 3 61 4,69% 6 81 6,90%
0 55 0,00% 1 76 1,30% 4 84 4,55%
0 64 0,00% 2 66 2,94% 6 69 8,00%
6 58 9,38% 0 59 0,00% 3 70 4,11%
4 45 8,16% 0 67 0,00% 1 68 1,45%
3 42 6,67%
14 38 26,92%
10 49 16,95%
20 39 33,90%
6 45 11,76%
5 46 9,80%
0 52 0,00%
4 49 7,55%
7 54 11,48%
15 44 25,42%
2 44 4,35%
21 41 33,87%
15 29 34,09%
11 36 23,40%
9 44 16,98%
9490 -63.1.845D( )Tj34(900 0 12 900 297.72 756.23 Tm0 )Tj0 -631.146TD( )Tj34-631.1498D( )Tj34T*
95
23 28 45,10% 6 44 12,00% 0,0 47,0 0,00%
2 46 4,17% 4 44 8,33% 0,0 71,0 0,00%
2 51 3,77% 4 45 8,16% 0,0 78,0 0,00%
0 48 0,00% 2 54 3,57% 1,0 68,0 1,45%
6 47 11,32% 5 55 8,33% 2,0 76,0 2,56%
32 32 50,00% 1 61 1,61% 0,0 73,0 0,00%
16 54 22,86% 3 42 6,67% 0,0 71,0 0,00%
0 47 0,00% 2 40 4,76% 1,0 72,0 1,37%
0 50 0,00% 4 115 3,36% 1,0 77,0 1,28%
2 56 3,45% 3 63 4,55% 1,0 70,0 1,41%
0 51 0,00% 0 54 0,00% 3,0 59,0 4,84%
5 32 13,51% 7 54 11,48% 0,0 59,0 0,00%
1 34 2,86% 6 71 7,79% 0,0 49,0 0,00%
0 39 0,00% 0 79 0,00% 0,0 66,0 0,00%
0 41 0,00% 3 51 5,56% 0,0 63,0 0,00%
0 47 0,00% 0 61 0,00% 0,0 42,0 0,00%
5 33 13,16% 3 67 4,29% 1,0 53,0 1,85%
3 35 7,89% 2 47 4,08% 1,0 63,0 1,56%
5 46 9,80% 0 51 0,00% 1,0 56,0 1,75%
13 89 12,75% 0 63 0,00% 1,0 65,0 1,52%
8 95 7,77% 3 71 4,05% 0,0 51,0 0,00%
22 81 21,36% 2 66 2,94% 2,0 59,0 3,28%
22 82 21,15% 3 67 4,29% 0,0 76,0 0,00%
23 100 18,70% 2 61 3,17% 2,0 60,0 3,23%
26 99 20,80% 7 57 10,94% 1,0 45,0 2,17%
15 98 13,27% 5 67 6,94% 0,0 53,0 0,00%
14 86 14,00% 0 58 0,00% 2,0 73,0 2,67%
6 65 8,45% 0 68 0,00% 3,0 59,0 4,84%
6 78 7,14% 1 81 1,22% 1,0 57,0 1,72%
8 43 15,69% 0 47 0,00% 1,0 66,0 1,49%
4 51 7,27% 2 53 3,64% 2,0 67,0 2,90%
3 43 6,52% 0 57 0,00% 2,0 55,0 3,51%
7 72 8,86% 3 49 5,77% 0,0 54,0 0,00%
4 56 6,67% 1 54 1,82% 4,0 89,0 4,30%
3 55 5,17% 1 51 1,92% 1,0 53,0 1,85%
9 52 14,75% 0 69 0,00% 1,0 77,0 1,28%
6 101 5,61% 1 57 1,72% 0,0 71,0 0,00%
10 99 9,17% 2 83 2,35% 2,0 82,0 2,38%
0 54 0,00% 2 56 3,45%
0 34 0,00% 1 80 1,23%
0 37 0,00% 1 66 1,49%
0 34 0,00% 2 56 3,45%
2 32 5,88% 2 56 3,45%
1 32 3,03% 2 62 3,13%
2 42 4,55% 4 73 5,19%
3 32 8,57% 1 56 1,75%
1 42 2,33% 6 56 9,68%
0 45 0,00% 0 55 0,00%
1 37 2,63% 5 87 5,43%
4 46 8,00% 3 58 4,92%
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