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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
FATOR σ DE Mycoplasma hyopneumoniae:
M
UTAGÊNESE, CLONAGEM E EXPRESSÃO
Dissertação de Mestrado
Shana de Souto Weber
Porto Alegre, outubro de 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
FATOR σ DE Mycoplasma hyopneumoniae:
M
UTAGÊNESE, CLONAGEM E EXPRESSÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e Molecular
do Centro de Biotecnologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul como requisito
parcial para a obtenção do grau de Mestre
Shana de Souto Weber
Orientadora: Profª Drª Irene Silveira Schrank
Porto Alegre, outubro de 2007
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III
Este trabalho foi desenvolvido no
Laboratório de Fixação Biológica de
Nitrogênio, situado no Centro de
Biotecnologia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul. Financiamento:
FAPERGS, CNPq/MCT – Proc.: 680220/00-
5 (A.T.R.V.) e CAPES.
IV
AGRADECIMENTOS
À professora Irene Silveira Schrank, por ser uma orientadora tão paciente, dedicada e
generosa, por ter me ajudado neste projeto e por ter sido fundamental para que esta
dissertação chegasse ao fim;
Ao professor Sérgio Ceroni da Silva, pela disposição em tirar minhas dúvidas de
bioinformática, e por, entre outras coisas, ter me ensinado a projetar os primers;
Aos professores Arnaldo Zaha, Augusto Schrank, Henrique Ferreira e Marilene
Vainstein, pela motivação e pelos ensinamentos;
À comissão de acompanhamento, composta pelos professores Augusto Schrank e
Henrique Ferreira, pelas sugestões e críticas importantes;
À banca examinadora, formada pelos professores, Itabajara Vaz, Marilene Vainstein
e Patrícia Valente, por terem aceitado avaliar este trabalho;
Aos meus colegas e ex-colegas de laboratório: Beatriz – minha companheirinha de
bancada e de reciclagem de lixo; Clarissa – minha primeira colega de laboratório, Débora –
colega querida, parceira de limpeza e sempre minha companhia para ficar no laboratório até
tarde; Luciano – meu estagiário, por ter suportado bem a minha felicidade futebolística em
2006; Karyne e Maicon – tão animados que contagiam qualquer um, inclusive eu; e Ricardo –
o otimista, quem me ensinou as primeiras técnicas, agradeço pela amizade e cooperação;
Ao pessoal dos laboratórios 210, 217 e 220, em especial à Desiree, pelos protocolos
de clonagem; Broetto, por ter me acompanhado nos primeiros géis de proteína; Juliano Boldo,
por ter me cedido as células para expressão; e Bianca, pelos cultivos de M. hyopneumoniae;
Ao Fabiano, pelos seqüenciamentos;
Aos laboratoristas, Paulo e Milton, por facilitarem muito o nosso dia-a-dia;
Aos meus tão queridos companheiros de faculdade, pela amizade e carinho;
Aos meus pais por me proporcionarem o conforto de um lar feliz, por serem tão
especiais e amorosos;
À minha irmã querida, que é um exemplo de determinação para mim;
Ao meu Ferdi, por ser o melhor companheiro, amigo, colega, que eu jamais imaginei
ter; por sempre estar ao meu lado, mesmo quando não sou a melhor companhia;
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul pelo ensino gratuito e de qualidade e
ao apoio financeiro da FAPERGS, CAPES e CNPq.
V
ÍNDICE
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES IX
LISTA DE FIGURAS XI
LISTA DE TABELAS XI
RESUMO XII
ABSTRACT XI
1. INTRODUÇÃO 12
1.1 O Gênero Mycoplasma 12
1.2 Mycoplasma hyopneumoniae 14
1.3 Transcrição em Mycoplasma 15
1.3.1 Os Promotores 16
1.4 Ferramentas Utilizadas no Estudo de Promotores 18
1.4.1 In silico 18
1.4.2 In vivo 19
1.4.3 In vitro 20
1.5 RNA Polimerase Holoenzima 21
1.5.1 O Núcleo 22
1.5.2 O Fator σ 22
1.6 Expressão Heteróloga de Genes de Mycoplasma contendo Códons UGA 24
2. OBJETIVOS 26
2.1 Objetivos Gerais 26
2.2 Objetivos Específicos 26
3. MATERIAIS & MÉTODOS 27
3.1 Linhagens bacterianas, meios de cultura e condições de crescimento 27
VI
3.2 Clivagens e enzimas de restrição 27
3.3 Extração de DNA genômico e DNA plasmidial 27
3.4 Primers e condições de termociclagem 28
3.5 Purificação dos fragmentos, clonagem e transformação 29
3.6 Eletroforese em gel de agarose 29
3.7 Seqüenciamento automático e análise dos dados 29
3.8 Amplificação do gene rpoD de M. hyopneumoniae 30
3.9 Mutagênese sítio-dirigida do gene rpoD 30
3.10 Expressão do fator σ recombinante 33
4. RESULTADOS 35
4.1 Amplificação do gene rpoD de Mycoplasma hyopneumoniae 35
4.2 Substituição dos códons TGA por TGG no gene rpoD 35
4.3 Construção de σABCD (rpoD contendo as mutações) 36
4.4 Expressão do fator σ recombinante 38
5. DISCUSSÃO 40
6. REFERÊNCIAS 47
7.
ANEXOS 57
7.1 Mapa do vetor de expressão pET-23a-d(+) 57
7.2 Protocolo de Extração de DNA genômico de M. hyopneumoniae 58
7.3 Seqüência de nucleotídeos do gene rpoD de M. hyopneumoniae 7448 59
8.
CURRICULUM VITAE 60
IX
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
α subunidade alfa da RNA polimerase
β subunidade beta da RNA polimerase
β’ subunidade beta’ da RNA polimerase
°C graus Celsius
CDS seqüência de DNA codificante
CO
2
dióxido de carbono
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTPs trifosfato de desoxirribonucleosídeo
fmol fentomol
IPTG β-D-isopropil-tiogalactopiranosídeo
g gravidade
HCl ácido clorídrico
kb quilobase
kDa quilodalton
μg micrograma
MgCl
2
cloreto de magnésio
MH Mycoplasma hyopneumoniae
μl microlitro
ml mililitro
mM milimolar
tRNA RNA transportador
rRNA RNA ribossomal
X
NCBI Nacional Center for Biotechnology Information
ng nanograma
OD densidade ótica
ω subunidade ômega da RNA polimerase
pb par de bases
PCR reação em cadeia da polimerase
PES pneumonia enzoótica suína
RBS sítio de ligação dos ribossomos
RNA ácido ribonucléico
RNAP RNA polimerase
rpm revoluções por minuto
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
σ subunidade σ da RNA polimerase holoenzima
Tm temperatura de anelamento
U unidade
UTR região não traduzida
XI
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 3.1 Metodologia utilizada para obtenção dos fragmentos parciais mutados a partir
do gene rpoD. 32
FIGURA 3.2 Obtenção do plasmídeo pUC18σABCD contendo o gene rpoD com as 3
substituições A→G. 33
FIGURA 4.1 Amplificação do gene rpoD de M. hyopneumoniae. 35
FIGURA 4.2 Mutagênese sítio-dirigida do gene rpoD de M. hyopneumoniae. 36
FIGURA 4.3 Construções parciais para obtenção do gene rpoD mutado. 37
FIGURA 4.4 Gene rpoD com os três códons TGA substituídos (σABCD). 38
FIGURA 4.5 Expressão do fator σ recombinante. 39
FIGURA 5.1 Metodologias utilizadas para inserir mutações presentes no meio de um
fragmento de DNA. 43
FIGURA 5.2 Estratégia utilizada na amplificação e mutagênese do gene glpK de M.
pneumoniae. 44
LISTA DE TABELAS
T
ABELA 3.1 Primers utilizados neste trabalho. 28
TABELA 3.2 Condições de termociclagem. 28
XII
RESUMO
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza,
apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o
agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial
causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma
tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da
grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que
controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies
deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão
gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto,
aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem
diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de
promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o
reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências
promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima
reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão
heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três
códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma
técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A
metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência
relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi
subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de
que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou
uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da
seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi
produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes
protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados.
XI
ABSTRACT
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting
a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the
world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species
of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH.
Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription
initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major
regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ
factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may
differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of
experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the
controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the
aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD
gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase
holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in
mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was
used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative
good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was
subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine
tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the
expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa
that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble
under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different
protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.
12
1. INTRODUÇÃO
1.1 O Gênero Mycoplasma
Este táxon é composto por alguns dos mais simples e menores organismos a se
auto-replicarem. As bactérias desse gênero distinguem-se fenotipicamente de outros
procariotos, principalmente, por possuírem citoesqueleto e pela ausência de parede celular,
característica que as faz pertencer à classe Mollicutes – do Latim: mollis, mole; cutis, pele
(RAZIN et al., 1998). As primeiras espécies foram descritas há aproximadamente 70 anos,
totalizando até o momento 123 espécies conhecidas (LPSN
<http://www.bacterio.cict.fr/m/mycoplasma.html>).
Não existem micoplasmas de vida livre (RAZIN, 1992), estando amplamente
distribuídos no reino animal como parasitas de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes
(PITCHER & NICHOLAS, 2005). Normalmente, estão aderidos à superfície extracelular de
células e tecidos do hospedeiro, embora já tenham sido descritas algumas espécies ocupando
o interior de células eucarióticas (LO et al., 1993; BASEMAN et al., 1995). Podem ser
patogênicos ou apenas fazerem parte da microbiota natural do trato respiratório e urogenital
(RAZIN, 2006). Nos homens, estão relacionados a doenças como asma, câncer, doenças auto-
imunes, artrite e pneumonia (BASEMAN & TULLY, 1997).
Morfologicamente, são considerados bactérias gram-negativas, uma vez que
possuem apenas uma membrana plasmática, sem a proteção adicional de uma parede celular
(RAZIN, 2006). Entretanto, filogeneticamente, os micoplasmas estão relacionados às
bactérias gram-positivas, compartilhando, deste modo, um ancestral em comum com os
gêneros Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus e Clostridium (WOLF et al., 2004).
Especificamente, a evolução teria ocorrido através de eventos de degeneração ou redução do
13
genoma a partir de bactérias gram-positivas portadoras de genomas com baixo conteúdo de
G+C (WOESE, 1987).
De acordo com os eventos evolutivos propostos, os genomas destes
microrganismos são altamente reduzidos, variando entre 580 e 1350 kb (FRASER et al.,
1995; SASAKI et al., 2002), e apresentam baixo conteúdo de G+C, variando entre 23 e 40%
(WOESE, 1987). Além disso, as regiões intergênicas têm um maior conteúdo de A+T em
relação às regiões codificantes – chegando a valores tão altos quanto 90% (DYBVIG &
VOELKER, 1996), sendo ainda a distribuição de guanina e citosina, entre os genes, também
irregular, ocorrendo em maior concentração nos genes que codificam para rRNAs e tRNAs
(FRASER et al., 1995). Como resultado desta composição atípica dos genomas, há o
favorecimento da utilização de códons que contém adenina e timina (MUTO & OSAWA,
1987 apud BOVE, 1993); conseqüentemente, micoplasmas possuem pouquíssimos códons
GGN, CCN, GCN e CGN (RAZIN, 2006). Outra particularidade, que parece estar ligada a
essa questão, é a utilização do códon UGA (OSAWA et al., 1992), que ao invés de servir
como códon de terminação, conforme ao código genético universal, codifica para triptofano
(YAMAO et al., 1985), característica que é igualmente encontrada no genoma das
mitocôndrias.
Devido ao seu genoma reduzido, esses microrganismos não possuem muitas das
vias enzimáticas características da maioria das bactérias. Por exemplo, eles não apresentam
vias de novo da biossíntese de purinas, um ciclo do ácido tricarboxílico completo, e um
sistema de cadeia transportadora de elétrons mediada por citocromo (MANOLUKAS et al.,
1988; POLLACK, 1992; FINCH & MITCHELL, 1992; FRASER et al., 1995). Isso estaria
relacionado ao fato da maioria dos micoplasmas serem parasitas, estritamente, hospedeiro e
tecido específicos (RAZIN et al., 1998; ROTTEM & YOGEV, 2000).
14
1.2 Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é conhecido como o agente etiológico da
pneumonia enzoótica suína (PES) – doença respiratória crônica, caracterizada por causar alta
morbidade e baixa mortalidade (SOBESTIANSKY et al., 1999). A PES apresenta distribuição
mundial, estando presente em quase todos os rebanhos suínos (MINION et al., 2004). Por
determinar significante redução no ganho de peso, gastos com tratamento, e
consequentemente, menores preços de venda das carcaças, a pneumonia enzoótica é a maior
causa de perdas econômicas na produção intensiva de suínos (THACKER, 2006).
Esta bactéria é um patógeno extracelular que coloniza o trato respiratório através
da aderência às células do epitélio ciliar (DEBEY & ROSS, 1994). Como demonstrado por
Zielinski et al. (1990), essa aderência é essencial para que ocorra a colonização do organismo.
O estabelecimento da infecção por M. hyopneumoniae resulta em ciliostase, perda dos cílios,
morte das células epiteliais e inflamação aguda na traquéia, brônquios e bronquíolos, além de
predispor o hospedeiro a infecções mais severas ocasionadas por patógenos secundários
(CIPRIAN et al., 1988; DJORDJEVIC et al., 2004).
Graças ao impacto econômico causado pela pneumonia enzoótica suína, há um
grande empenho da comunidade científica em estudar MH. Prova disso é que três cepas (232,
J e 7448) já tiveram seus genomas seqüenciados, fazendo desta, a espécie de micoplasma
mais vezes seqüenciada (MINION et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2005). As pesquisas
têm dedicado atenção principalmente à identificação de adesinas, com a finalidade de
desenvolver uma vacina efetiva que previna a fixação de M. hyopneumoniae aos cílios
pulmonares.
15
1.3 Transcrição em Mycoplasma
Além da importância atribuída aos micoplasmas por apresentarem relevância
médica ou veterinária, estes microrganismos também têm despertado interesse por possuírem
o genoma extremamente reduzido, fazendo com que sejam objetos de estudo bastante
convenientes na determinação do conjunto mínimo de genes necessários para o
estabelecimento de vida independente (GIL et al., 2004). Sendo assim, a partir da década de
90, onze espécies diferentes desse gênero tiveram seus genomas seqüenciados (NCBI
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/eub.html>).
O número de genes anotados, envolvidos com a transcrição, varia entre as
seqüências genômicas analisadas. Na cepa 232 de M. hyopneumoniae são 11 genes e em M.
penetrans chegam a ser 23, correspondendo, respectivamente, a 1,6% e 2,2% do total de
CDSs (SASAKI et al., 2002; MINION et al., 2004). Entretanto, em Bacillus subtilis –
bactéria gram-positiva que compartilha ancestral comum com os molicutes –, são encontrados
276 genes relacionados a este processo, equivalendo a 6,7% das seqüências codificadoras
(SASAKI et al., 2002).
A RNA polimerase dos micoplasmas se parece com a das eubactérias, sendo
codificada pelos genes conservados rpoA (subunidade α), rpoB (subunidade β) e rpoC
(subunidade β’). Porém, somente um fator σ foi identificado (NCBI
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/eub.html>), diferentemente de Escherichia
coli, que tem no mínimo 6 fatores σ (BLATTNER et al., 1997), e de B. subtilis, que contém
no mínimo 18 deles (KUNST et al., 1997).
Durante a evolução redutiva, pela qual estes organismos provavelmente passaram,
vários mecanismos regulatórios, presentes nas bactérias superiores, foram perdidos
(HALBEDEL et al., 2007). Conseqüentemente, não possuem diversos genes codificando
16
ortólogos bacterianos convencionais, tais como: múltiplos fatores σ, sistemas de dois
componentes (two-component system) e fator de terminação de transcrição Rho (FRASER et
al., 1995). Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nos
micoplasmas, devem diferir significativamente de outras bactérias (WEINER III et al., 2000).
1.3.1 Os Promotores
As seqüências nucleotídicas que controlam o início e a regulação da transcrição
nos micoplasmas são pouco entendidas (HALBEDEL et al., 2007), uma vez que, até agora,
apenas alguns promotores foram identificados e analisados (WALDO III et al., 1999;
WEINER III et al., 2000; MUSATOVOVA et al., 2003; HALBEDEL et al., 2007). Esta
carência de informação prejudica muito a interpretação dos dados obtidos com o
seqüenciamento dos genomas. A anotação de regiões promotoras nestes microrganismos é
especialmente dificultosa, pois, como fora observado em M. hyopneumoniae, o conteúdo de
A+T nas seqüências codificantes (~70%) é tão alto quanto nas regiões intergênicas (~80%).
(VASCONCELOS et al., 2005).
Em 2000, Weiner III et al., com o intuito de aumentar a quantidade de
informações disponíveis sobre os promotores de micoplasmas, determinaram os sítios de
início de transcrição de 22 genes de M. pneumoniae. Estes sítios identificados e outros 10
sítios de início de transcrição previamente descritos foram alinhados e, através da análise das
50 bases localizadas imediatamente à montante destes foi possível encontrar um forte
consenso na região -10, enquanto que, na região -35 foi obtido apenas um consenso fraco.
Várias possíveis regiões -10 foram identificadas: TA(AGT)AAT, TAA(GT)AT, TACTAT e
TATTAA; e, considerando o conteúdo de G+C presente no genoma de M. pneumoniae,
consensos similares aos das regiões -35 de E. coli foram detectados entre 15 e 20 bases de
17
distância da 5’ da região -10, apresentando uma seqüência TTGA relativamente conservada.
Recentemente, a região promotora do gene ldh de M. pneumoniae foi estudada in
vivo (HALBEDEL et al., 2007). Fragmentos contendo as prováveis regiões -10 e -35 do gene,
de acordo com os consensos sugeridos anteriormente (WEINER III et al., 2000), foram
capazes de transcrever o gene lacZ no próprio M. pneumoniae, confirmando a sua atividade
promotora e comprovando as predições feitas in silico por Weiner III et al. (2000). A análise
deste promotor, feita por meio da inserção de mutações pontuais, indica que, neste organismo,
a região -10 é muito importante para transcrição, enquanto a região -35 proposta não
apresenta a mesma relevância.
Foi demonstrado, também, que uma alta proporção de transcritos tem
extremidades 5’ heterogêneas, ocorrendo, em menor freqüência, entre as bases 1 e 4 a 5’ do
sítio de início de transcrição principal (WEINER III et al., 2000). Ainda, grande parte dos
RNAs mensageiros mostrou não possuir a região 5’-UTR que poderia conter o sítio RBS,
resultado diferente do encontrado em outras bactérias (WEINER III et al., 2000; HALBEDEL
et al., 2007). A seqüência RBS (que é uma seqüência complementar à extremidade 3’ do
rRNA 16S) apenas pode ser encontrada em cerca de 80 genes de M. pneumoniae (WEINER
III et al., 2000).
Diferentes mecanismos de regulação envolvendo alterações reversíveis nas
seqüências promotoras têm sido descritos em algumas espécies de Mycoplasma, sendo
responsáveis por controlar a expressão de várias famílias gênicas de lipoproteínas. Dentre
estes eventos, podemos citar: expansão e contração de segmentos contíguos de resíduos de
adeninas entre as regiões -10 e -35 (YOGEV et al., 1991), expansão e contração de repetições
de trinucleotídeos a 5’ da região promotora (GLEW et al., 1998), e inversões de DNA sítio-
específicas envolvendo o promotor e a região RBS do gene (BHUGRA et al., 1995;
NOORMOHAMMADI et al., 2000). Portanto, a identificação de promotores é fundamental
18
para que o controle da expressão gênica nesses microrganismos seja bem entendido.
1.4 Ferramentas Utilizadas no Estudo de Promotores
1.4.1 In silico
A grande quantidade de genomas microbianos seqüenciados tem resultado em um
rápido acúmulo de enormes quantidades de dados. Em vista disso, a detecção de regiões
promotoras, através de métodos computacionais, tem atraído a atenção de pesquisadores nos
últimos anos (KIM & SIM, 2005).
Vários programas desenvolvidos para fazer o reconhecimento de promotores estão
disponíveis. No entanto, estes têm sido predominantemente baseados na grande quantidade de
informações disponíveis para E. coli (WEINER III et al., 2000), e não levam em consideração
o contexto biológico das seqüências analisadas (KIM & SIM, 2005). Este fato dificulta a
identificação de promotores em micoplasmas, tendo em vista que possuem um conteúdo de
G+C menor do que o apresentado pela E. coli. Nestes casos tem sido sugerida a adaptação dos
algoritmos através de ajustes que levem em consideração o conteúdo de guanina/citosina do
genoma em questão, visando, assim, possibilitar a utilização destes em diferentes espécies
bacterianas (HERTZ & STORMO, 1996).
Poucos trabalhos têm se dedicado a produzir ferramentas de bioinformática
destinadas especificamente a encontrar seqüências promotoras em micoplasmas. Além de uma
matriz de peso gerada por Weiner III et al. (2000) a partir de matrizes baseadas em dados
sobre promotores de E. coli (HERTZ & STORMO, 1996), recentemente, foi desenvolvido um
sistema utilizando inteligência artificial (VALIATI, 2006). Porém, neste foi obtida apenas
uma baixa capacidade preditiva, não identificando com a certeza desejada novos possíveis
19
promotores. Portanto, embora existam ferramentas de bioinformática que auxiliam na
determinação de seqüências regulatórias, estas são limitadas pela falta de promotores
experimentalmente caracterizados nesse gênero. (WEINER III et al., 2000; VALIATI, 2006).
1.4.2 In vivo
O estudo in vivo de seqüências controladoras permite caracterizá-las
funcionalmente. Com o emprego de sistemas-repórter, os promotores podem ser mapeados
por meio de ensaios de deleção e mutagênese sítio-dirigida.
As primeiras tentativas de identificação e análise de regiões promotoras de
micoplasmas in vivo foram feitas em E. coli (KNUDTSON & MINION, 1994;
DHANDAYUTHAPANI et al., 1998). Porém, provavelmente devido ao DNA genômico rico
em AT dos micoplasmas, foi constatado que seqüências não reconhecidas como promotores
nestas bactérias apresentavam falsa atividade promotora em E. coli, evidenciando, assim, a
importância de se investigar a regulação gênica no próprio organismo de origem
(KNUDTSON & MINION, 1994).
Halbedel & Stulke (2006), com o propósito de analisar as seqüências envolvidas
no início da transcrição de M. pneumoniae, construíram o vetor pGP353. Este plasmídeo
permite a clonagem de fragmentos contendo prováveis seqüências promotoras em frente à
CDS do gene lacZ, o qual codifica a galactosidade, uma das mais populares enzimas-repórter.
Esse sistema-repórter foi escolhido por gerar resultados rápidos, tanto qualitativos, através da
visualização da atividade enzimática em colônias, quanto quantitativos, em ensaios usando
como substrato cromatogênico o ο-nitrofenil-D-galactopiranosídeo (MILLER, 1972 apud
HALBEDEL & STULKE, 2006). Além disso, sistemas-repórter baseados no gene lacZ já
foram estabelecidos em outros molicutes, tais como Acholeplasma oculi, Mycoplasma
20
pulmonis, Mycoplasma arthritidis e Mycoplasma capricolum (KNUDTSON & MINION,
1994; DYBVIG et al., 2000; JANIS et al., 2005).
A análise molecular dos mecanismos envolvidos na regulação da transcrição em
M. hyopneumoniae ainda não é possível devido à carência de sistemas-repórter adequados que
possam ser utilizados para o estudo de suas regiões promotoras in vivo. Visando suprir essa
deficiência é que, recentemente, em nosso laboratório, foi desenvolvido o plasmídeo pOSTM,
o qual possui origem de replicação de M. hyopneumoniae, e tem o gene de resistência à
tetraciclina como gene-repórter (LOPES, 2007). Além disso, a utilização de pGP353 também
foi avaliada com este objetivo (REOLON, 2007). Através da resistência aos antibióticos foi
possível observar que ambos plasmídeos são capazes de ser transformados nessa espécie, no
entanto, nenhum deles se manteve estável nas células hospedeiras.
1.4.3 In vitro
A RNA polimerase holoenzima ao reconhecer um promotor liga-se a ele. Logo,
gel mobility shift assay (retardação em gel) e footprinting são exemplos de técnicas capazes
de revelar a localização do sítio onde esteja ocorrendo a interação entre a proteína, no caso a
RNA polimerase, e o DNA.
As duas técnicas baseiam-se na ligação da proteína ao DNA. Porém, enquanto no
gel mobility shift assay essa ligação é detectada por causar redução da mobilidade
eletroforética do fragmento de DNA (LANE et al., 1992), no footprinting, ela é constatada
pela habilidade do ligante em proteger o DNA da clivagem, preservando o sítio de ligação
(HAMPSHIRE et al., 2007). Esta última é normalmente utilizada para posicionar a região
controladora dentro de um fragmento de restrição previamente identificado pela retardação
em gel. A aplicação destas metodologias é ampla, sendo bastante utilizadas no
21
desenvolvimento de estudos sobre regulação transcricional em bactérias (PELCHAT &
PERREAULT, 2004; HOOK-BARNARD et al., 2006; WILSON & LAMONT, 2006).
Outro método empregado na caracterização de promotores é a transcrição in vitro.
Diferentemente das demais técnicas citadas, esta já fora utilizada para analisar promotores de
micoplasmas (GAFNY et al., 1988; HYMAN et al., 1988). Nestes dois trabalhos, onde foram
pesquisadas as regiões 5’ dos operons de rRNA de M. capricolum e M. pneumoniae, a
transcrição in vitro foi feita com a RNA polimerase de E. coli. Entretanto, como mencionado
anteriormente, os resultados obtidos por Knudtson & Minion (1994) sugerem que a RNA
polimerase de E. coli pode reconhecer seqüências que não possuam atividade promotora nos
micoplasmas. Deste modo, fica clara a necessidade de utilização da RNA polimerase
holoenzima de Mycoplasma em experimentos in vitro que pretendam definir as verdadeiras
regiões envolvidas com o início da transcrição nestes organismos.
1.5 RNA Polimerase Holoenzima
O componente central na regulação da transcrição bacteriana é a RNA polimerase
(RNAP). Quando composta pelo núcleo da enzima e pelo fator σ, é chamada de holoenzima,
sendo responsável pelo início da transcrição (BROWNING & BUSBY, 2004).
O processo de transcrição, bastante estudado em E. coli, consiste em 3 estágios:
iniciação, alongamento e terminação. Durante a iniciação, a RNA polimerase holoenzima
liga-se especificamente aos dois hexâmeros conservados do promotor, nas posições -35 e -10
relativas ao sítio de início de transcrição, para formar o complexo fechado. A subseqüente
desnaturação das fitas do DNA, nas proximidades da região -10, resulta no complexo aberto e
no início da transcrição. Depois de cerca de 9-12 nucleotídeos de RNA terem sido
sintetizados, o complexo de iniciação entra no estágio de alongamento. Esta transição é
22
marcada por uma mudança conformacional significante, que leva simultaneamente à perda do
contado com o promotor, liberação do fator σ e formação de um complexo de alongamento
(GROSS et al., 1998).
1.5.1 O Núcleo
Trabalhos com RNA polimerase de E. coli demonstraram que o núcleo da enzima
é composto por cinco polipeptídios: αI e αII, β, β’, e ω, cujas estruturas e funções são
evolutivamente conservadas (DARST, 2001). O sítio ativo da polimerase é formado a partir
das grandes subunidades β e β’ (KORZHEVA et al., 2000). A união destas é mantida por um
dímero composto pelas duas subunidades α, sendo, portanto, responsável pela montagem do
núcleo da enzima. A pequena subunidade ω, não tem participação direta na transcrição, mas
aparentemente funciona como uma chaperona para auxiliar no dobramento de β’
(HAMPSEY, 2001).
A síntese de RNA a partir de um DNA molde é catalisada pelo núcleo da RNA
polimerase na presença de nucleosídeos trifosfatados. Apesar disso, ela é incapaz de iniciar a
transcrição nos sítios apropriados (BORUKHOV & SEVERINOV, 2002). Para tanto, nas
bactérias, é necessária a participação de um único polipeptídeo, o fator σ, que se liga ao
núcleo da RNAP resultando na formação da RNA polimerase holoenzima, a qual consegue
reconhecer as seqüências promotoras e iniciar a transcrição (DARST, 2001).
1.5.2 O Fator σ
O primeiro fator σ bacteriano foi descoberto em 1969, como sendo uma
23
subunidade da RNA polimerase de E. coli (BURGESS et al., 1969). Ele está envolvido com
três funções principais: garantir o reconhecimento de seqüências promotoras específicas,
posicionar a RNA polimerase holoenzima no promotor alvo, e facilitar o relaxamento do
DNA dupla-fita próximo ao sítio de início de transcrição (WOSTEN, 1998).
Embora esteja claro que σ é responsável pelo reconhecimento das seqüências
promotoras pela RNAP, no fator σ livre, a distância entre os domínios que a ligam ao DNA é
inapropriada para que haja interação simultânea com os elementos -10 e -35. O
reconhecimento simultâneo dos elementos promotores alvo somente torna-se possível após
ocorrerem mudanças conformacionais em σ que são provocadas pela formação da holoenzima
(BORUKHOV & SEVERINOV, 2002).
A participação de σ no processo de transcrição é objeto de diversos estudos.
Novos resultados obtidos têm sugerido que estes fatores não estariam envolvidos somente no
processo de início de transcrição. Um número crescente de evidências bioquímicas sustenta a
possibilidade de que σ seria mantida no complexo de alongamento, e não liberada, como se
acredita (e.g. BAR-NAHUM & NUDLER, 2001). Portanto, alternativamente, o fator σ
poderia influenciar etapas durante o alongamento através de sua associação temporária (e.g.
KAPANIDIS et al., 2005) ou permanente (BAR-NAHUM & NUDLER, 2001;
MUKHOPADHYAY et al., 2001) ao complexo de alongamento, ou potencialmente através
do imprinting conformacional que permanece no complexo de alongamento após a liberação
de σ (BERGHOFER-HOCHHEIMER et al., 2005). Tais efeitos permitiriam ao fator σ
auxiliar na regulação de fases diferentes da transcrição.
A maioria das bactérias contém múltiplos fatores σ, os quais, quando combinados
com a RNAP, formam holoenzimas que são capazes de reconhecer diferentes tipos de
promotores, ativando conjuntos de genes específicos. Em E. coli, por exemplo, existem os
fatores σ32, que direcionam a síntese de genes, cujos produtos estabilizam ou renaturam
24
proteínas; σ54, que mobilizam genes envolvidos com a assimilação de componentes
nitrogenados; σS, que aciona genes requeridos durante a fase estacionária ou em casos de
estresse. Logo, a associação de fatores σ alternativos apropriados com o núcleo da RNA
polimerase permite às células ajustarem, rapidamente, o padrão de transcrição, de modo a
otimizar o metabolismo celular em resposta às mudanças nas condições ambientais e nos
sinais celulares (MOONEY et al., 2005).
O número genes que codificam fatores σ varia bastante de um organismo para
outro: de apenas um nas espécies de Mycoplasma (e.g. FRASER et al., 1995), até mais de 60
em Streptomyces coelicolor (BENTLEY et al., 2002). Bactérias simbiontes e parasitas
aparentemente requerem um número menor de fatores de transcrição próprios
(MITTENHUBER, 2002), havendo, portanto, uma grande correlação entre o número de genes
que codificam fatores σ e a diversidade de ambientes em que os organismos podem viver
(BROWNING & BUSBY, 2004).
1.6 Expressão Heteróloga de Genes de Mycoplasma contendo
Códons UGA
Até o final da década de 70, acreditava-se que o código genético era universal,
todavia, com a descoberta de que o códon de parada UGA (códon opal) era utilizado para
incorporar triptofano nas mitocôndrias e nos micoplasmas, este dogma foi abandonado
(MACINO et al., 1979; YAMAO et al., 1985). Esta modificação peculiar do código genético
foi considerada ser resultado de um processo de otimização em resposta ao baixo conteúdo
genômico de G+C apresentado por estes organismos (JUKES et al., 1987).
Pressupõe-se que, inicialmente, o códon UGA não era muito utilizado como
códon de terminação, sendo, então, UAA, o códon de parada preferencial, uma vez que UAG
também ocorria em menor freqüência. Subsequentemente, o códon para triptofano UGG foi
25
seqüencialmente substituído pelos códons UGA disponíveis, complementando a otimização
do conteúdo de G+C (JUKES et al., 1987).
Esta ocorrência de códons UGA nos genes de micoplasma tem freqüentemente
impedido a expressão heteróloga destes, uma vez que, em E. coli e outros hospedeiros, UGA é
utilizado como códon de terminação. Para contornar este problema, uma variedade de
diferentes estratégias tem sido empregada.
A expressão dos genes de micoplasma, contendo códons de parada, foi descrita
em três hospedeiros diferentes, porém sem muito sucesso. Spiroplasma citri, que utiliza o
mesmo código genético do gênero Mycoplasma, foi a primeira espécie a ser aplicada na
clonagem e expressão de genes exógenos (STAMBURSKI et al., 1991). Outras tentativas
foram feitas com B. subtilis e cepas de E. coli supressoras do códon opal, entretanto, ambos os
organismos apresentaram baixa eficiência de expressão (SMILEY & MINION, 1993;
KANNAN & BASEMAN, 2000).
Sendo assim, estratégias que proporcionem a introdução de mutações A→G para
substituir os códons UGA por UGG (codifica triptofano no código genético universal),
possibilitam que os genes portadores de códons de terminação sejam expressos normalmente
em E. coli. Em casos onde ocorram somente alguns códons opal, sucessivas mutações podem
ser feitas através de mutagênese sítio-dirigida (ROBINO et al., 2005). Recentemente, foi
desenvolvida uma técnica, chamada MMR (multiple mutation reaction), que permite a
substituição simultânea de múltiplos códons UGA (HAMES et al., 2005). Ainda, com a
mesma finalidade, os genes de Mycoplasma podem ser sintetizados in vitro a partir de
oligonucleotídeos, contudo esta estratégia é bastante cara.
26
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Tendo em vista a necessidade de identificar as seqüências nucleotídicas que
controlam o início da transcrição em Mycoplasma spp., e a inexistência de ferramentas que
possibilitem este estudo em Mycoplasma hyopneumoniae, a caracterização de promotores in
vitro é uma opção. Deste modo, este trabalho tem como objetivo expressar o fator σ de M.
hyopneumoniae, visando, posteriormente, reconstituir a RNA polimerase holoenzima, a qual,
então, poderá ser aplicada em experimentos de análise funcional de promotores desta bactéria.
2.2 Objetivos Específicos
Amplificação e clonagem do gene rpoD de M. hyopneumoniae;
Mutagênese sítio-dirigida dos três códons TGA presentes no gene rpoD;
Expressão do fator σ em Escherichia coli;
27
3. MATERIAIS & MÉTODOS
3.1 Linhagens bacterianas, meios de cultura e condições de
crescimento
E. coli XL1-Blue e E. coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) foram mantidas em
meio sólido Luria-Bertani contendo 20 μg/ml de tetraciclina (SAMBROOK & RUSSELL,
2001). Quando transformadas com os plasmídeos pUC18, pET23a-d(+) (Novagen) [ANEXO
7.1], ou seus recombinantes, foram cultivadas em meio Luria-Bertani (sólido e líquido)
contendo 100 μg/ml de ampicilina. O cultivo foi feito a 37°C por 16 horas, com agitação de
150 rpm (quando em meio líquido).
Mycoplasma hyopneumoniae 7448, procedente da Embrapa Suínos e Aves
(Concórdia, SC), foi isolada de um suíno infectado em Lindóia do Sul, SC, Brasil. O cultivo
foi feito em meio Friis líquido (FRIIS, 1975) a 37°C, sob leve agitação até que o indicador de
ph, presente no meio, mudasse de cor.
3.2 Clivagens e enzimas de restrição
As enzimas de restrição SmaI, EcoRI, XhoI, NcoI, SacII, SacI e KpnI foram
adquiridas da empresa Amersham Pharmacia Biotech, sendo as clivagens feitas de acordo
com as especificações do fabricante.
3.3 Extração de DNA genômico e DNA plasmidial
O DNA genômico de M. hyopneumoniae cepa 7448 foi extraído a partir de 5 ml
28
de cultivo conforme protocolo em anexo [ANEXO 7.2].
A extração de DNA plasmidial a partir de E. coli XL1-Blue foi feita de acordo
com o descrito por Sambrook & Russell (2001).
3.4 Primers e condições de termociclagem
Os primers [TAB. 3.1] foram projetados a partir da seqüência nucleotídica da cepa
7448 de M. hyopneumoniae (número de acesso no GenBank: NC_007332) [ANEXO 7.3]. As
PCRs [TAB. 3.2] foram feitas no termociclador Mastercycler (Eppendorf).
TABELA 3.1 Primers utilizados neste trabalho.
Primer Seqüência (5’-3’) Tamanho (pb) Tm (°C)
Aup
CCATGGCAGAAAATAAAGAACTTTTCCCCC
30 65,4
Ado
TCAATTGCAAGATTCCACTTTTCAATATAT
30 58,6
Bup
ATATATTGAAAAGTGGAATCTTGCAATTGA
30 58,6
Bdo
AACTTCATCACTATAAACTTTTGGTTTGTG
30 61,2
Cup
ATTATATAACAGAAAATAGTCCAAATCAAT
30 55,8
Cdo
CGCTTGGCGGATCCACCAGGTTGCATAAGT
30 70,9
Dup
ACTTATGCAACCTGGTGGATCCGCCAAGCG
30 70,9
Ddo
CTCGAGATTAAAATCCCTTAATGATAGGCG
30 68,6
Seqüência sublinhada de Aup – sítio para enzima de restrição NcoI
Seqüência sublinhada de Ddo – sítio para enzima de restrição XhoI
Realce em preto – nucleotídeos substituídos da seqüência original (mutados)
T
ABELA 3.2 Condições de termociclagem.
SigmaMh1 SigmaMh2 SigmaMh3 SigmaMh4
Desnaturação inicial
94ºC por 5’ 94ºC por 5’ 94ºC por 5’ 94ºC por 5’
60°C por 30’’ 62°C por 30’’ 62°C por 30’’ 62°C por 30’’
35 ciclos
68°C por 1’30’’ 68°C por 30’’ 68°C por 1’ 68°C por 1’30’’
94°C por 30’’ 94°C por 30’’ 94°C por 30’’ 94°C por 30’’
29
3.5 Purificação dos fragmentos, clonagem e transformação
A purificação de todos os fragmentos de DNA foi feita utilizando o kit GFX PCR
DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante.
Os produtos de PCR do gene rpoD e os fragmentos parciais σAB, σCD, σABC
σBCD foram tratados com Klenow DNA polimerase (Fermentas) e com cinase de
polinucleotídeos (Polynucleotide kinase, PNK, Fermentas) e clonados no vetor pUC18
clivado com SmaI e defosforilado com fosfatase alcalina de camarão (Shrimp Alkaline
Phosphatase, SAP, USB), seguindo as orientações dos fabricantes.
Os fragmentos SacI-5’-σABC-3’-SacII e SacII-5’-σCD-3’-KpnI foram clonados no
vetor pUC18 clivado com SacI e KpnI.
As clonagens e as transformações – todas feitas por eletroporação, foram
executadas de acordo com Sambrook & Russell (2001).
3.6 Eletroforese em gel de agarose
Todos os produtos de PCR e todas as reações de clivagem foram analisados em
gel de agarose 0,8% com 0,5 μg/ml de brometo de etídio, conforme descrito por Sambrook &
Russell (2001).
3.7 Seqüenciamento automático e análise dos dados
Os clones foram submetidos à reação de seqüenciamento, utilizando o kit
Dyenamic et dye terminator cycle sequencing (Amersham Biosciences), desenvolvido para o
seqüenciador automático MEGABACE, conforme o manual do fabricante. Além dos primers
30
M13 foward e reverse (Invitrogen), também foram utilizados os primers que constam na
Tabela 3.1, conforme a necessidade.
Os resultados de seqüenciamento foram processados no pacote de programas
Staden e analisados no banco de dados nucleotide collection a partir do algoritmo Blastn do
programa BLAST (NCBI <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>) (ALTSCHUL et al.,
1997).
3.8 Amplificação do gene rpoD de M. hyopneumoniae
O gene rpoD foi amplificado por PCR utilizando primers específicos Aup e Ddo
que continham, respectivamente, os sítios de restrição de NcoI e XhoI [TAB. 3.1]. As reações
foram realizadas em volume final de 25 μl contendo 2,5 mM de MgCl
2
, 10 mM de Tris-HCl,
0,2 mM de dNTPs, 30 pmol de cada primer, 1U de Platinum Taq DNA Polymerase High
Fidelity (Invitrogen) e 50 ng de DNA genômico de M. hyopneumoniae cepa 7448. Foram
feitos 35 ciclos de acordo com o programa SigmaMh1
[TAB. 3.2]. O fragmento gerado, depois
de purificado, foi clonado no sítio SmaI do vetor pUC18, gerando pUC18σMH. Este foi
transformado em E. coli XL-1 Blue. Para confirmar a clonagem, os clones foram clivados
com EcoRI e, após, seqüenciados.
3.9 Mutagênese sítio-dirigida do gene rpoD
Inicialmente, os três códons TGA presentes no gene rpoD foram substituídos por
3 códons TGG. As mutações A→G foram inseridas através da amplificação do gene rpoD em
4 fragmentos diferentes, utilizando primers mutagênicos: fragmento σA (Aup e Ado),
fragmento σB (Bup e Bdo), fragmento σC (Cup e Cdo) e fragmento σD (Dup e Ddo) [FIG. 3.1
31
A e TAB. 3.1]. As reações de amplificação foram realizadas em volume final de 25 μl contendo
2,5 μl de 10X Pfx50 PCR Mix (Invitrogen), 0,2 mM de dNTPs, 30 pmol de cada primer, 1U
de Pfx50 DNA Polymerase (Invitrogen) e 50 ng do plasmídeo pUC18σMH. Foram feitos 35
ciclos de acordo com o programa SigmaMh2 [TAB. 3.2]. Os fragmentos gerados foram
purificados a partir de gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio.
σAB, σBC e σCD foram gerados, respectivamente, a partir da união dos seguintes
fragmentos: σA e σB, σB e σC, σC e σD [FIG. 3.1 B]. Esta união dos fragmentos foi realizada
por PCR. Cada reação foi realizada em volume de 25 μl contendo 2,5 μl de 10X Pfx50 PCR
Mix (Invitrogen), 0,2 mM de dNTPs, 30 pmol de cada primer, 1U de Pfx50 DNA Polymerase
(Invitrogen) e 40 fmoles de cada fragmento. Para gerar σAB foram utilizados os fragmentos
σA e σB, e os primers Aup e Bdo; para gerar σBC foram usados os fragmentos σB e σC, e os
primers Bup e Cdo; e para gerar σCD foram usados os fragmentos σC e σD, e os primers Cup
e Ddo [FIG. 3.1 B]. Foram feitos 35 ciclos de acordo com o programa SigmaMh3 [TAB. 3.2]. Os
fragmentos obtidos foram purificados a partir de gel de agarose 0,8% , sendo σAB, e σCD
clonados no sítio SmaI do vetor pUC18, gerando os plasmídeos pUC18σAB e pUC18σCD.
Estes foram transformados em E. coli XL-1 Blue, e os clones, depois de confirmados por
PCR, foram seqüenciados para verificar a presença das substituições A→G.
σABC e σBCD foram gerados, respectivamente, a partir da união dos seguintes
fragmentos: σAB e σBC, σBC e σCD
[FIG. 3.1 C]. Esta união dos fragmentos foi realizada por
PCR. Cada reação foi realizada em volume de 25 μl contendo 2,5 μl de 10X Pfx50 PCR Mix
(Invitrogen), 0,2 mM de dNTPs, 30 pmol de cada primer, 1U de Pfx50 DNA Polymerase
(Invitrogen) e 40 fmoles de cada fragmento. Para gerar σABC foram utilizados os fragmentos
σAB e σBC, e os primers Aup e Cdo; para gerar σBCD foram usados os fragmentos σBC e
σCD, e os primers Bup e Ddo. Foram feitos 35 ciclos de acordo com o programa SigmaMh4
[TAB. 3.2]. Os fragmentos σABC e σBCD foram purificados a partir de gel de agarose 0,8% e
32
clonados no sítio SmaI do vetor pUC18, gerando os plasmídeos pUC18σABC e
pUC18σBCD. Estes foram transformados em E. coli XL-1 Blue e os clones, depois de
confirmados por PCR, foram seqüenciados para verificar a presença das substituições A→G.
FIGURA 3.1 Metodologia utilizada para obtenção dos fragmentos parciais mutados a partir do gene rpoD.
Esquema mostrando as diferentes etapas do processo. [A] 1ª etapa: amplificação, a partir do plasmídeo
pUC18σMH, dos 4 fragmentos σA, σB, σC e σD. [B] 2ª etapa: amplificação de σAB a partir dos fragmentos σA
e σB, utilizando os primers A-up e B-do; amplificação de σBC a partir dos fragmentos σB e σC utilizando os
primers B-up e C-do; amplificação de σCD a partir dos fragmentos σC e σD utilizando os primers C-up e D-do.
[C] 3ª etapa: amplificação de σABC a partir dos fragmentos σAB e σBC utilizando os primers A-up e C-do;
amplificação de σBCD a partir dos fragmentos σBC e σCD utilizando os primers B-up e D-do. A-do*, B-up*, B-
do*, C-up*, C-do*, D-up* - primers contendo mutações (TGA→TGG). * - fragmentos com as substituições.
[A]
[B]
[C]
33
O plasmídeo pUC18σABC foi clivado com SacI e SacII, e pUC18σCD foi clivado
com SacII e KpnI. Os fragmentos liberados foram purificados, a partir do gel de agarose
0,8%, e ligados ao vetor pUC18 clivado com SacI e KpnI, gerando o plasmídeo
pUC18σABCD [FIG. 3.2]. Este foi transformado em E. coli XL-1 Blue. Para confirmar a
clonagem, os clones foram clivados com EcoRI e, após, seqüenciados.
FIGURA 3.2 Obtenção do plasmídeo pUC18σABCD contendo o gene rpoD com as 3 substituições A→G.
O plasmídeo pUC18σABC foi clivado com SacI e SacII, e pUC18σCD foi clivado com SacII e KpnI. Os
fragmentos liberados foram ligados ao vetor pUC18 clivado com SacI e KpnI, gerando o plasmídeo
pUC18σABCD.
3.10 Expressão do fator σ recombinante
O fragmento σABCD foi liberado do vetor pUC18 através de clivagem com as
enzimas de restrição NcoI e XhoI. Este fragmento, depois de purificado, foi subclonado no
vetor de expressão pET23a-d(+) clivado com as mesmas enzimas, gerando o plasmídeo
34
pETσABCD. Este plasmídeo foi transformado em E. coli XL-1 Blue. Os clones foram
confirmados por PCR e clivagem com NcoI e XhoI.
Para expressão do fator σ recombinante, inicialmente, o plasmídeo pETσABCD
foi transformado em E. coli BL21 (DE3) pLysS. Desta transformação foi selecionada uma
colônia, a qual foi pré-inoculada em 1ml de meio líquido Luria-Bertani contendo 100 μg/ml
de ampicilina e 1% de glicose, sendo cultivada a 37°C, sob agitação de 150 rpm, durante 16
horas. Após, 400 μl do pré-inóculo foram inoculados em 200 ml do mesmo meio contendo as
mesmas concentrações de antibiótico e glicose, e incubado a 37°C, a 200 rpm. Quando a
OD
600
atingiu o valor de 0,4 foi realizada a indução por 3 horas com 1 mM de IPTG, nas
mesmas condições. Depois da indução, a cultura foi recuperada por centrifugação a 5000 g a
4°C por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi estocado a -20°C.
Para análise da expressão da proteína recombinante, uma alíquota de 1 ml foi
retirada antes da indução e outras três foram retiradas a cada hora após a adição de IPTG.
Estas alíquotas foram centrifugadas a 16000 xg por 1 minuto em microcentrífuga (Eppendorff
5415 C). O precipitado das amostras foi ressuspendido em 100 μl de tampão de migração
SDS-PAGE 1X e fervido por 10 minutos em banho-maria. O precipitado (fração insolúvel)
foi separado do sobrenadante (fração solúvel), e ressuspendido em outros 100 μl de tampão de
migração SDS-PAGE 1X. Um volume de 20 μl de cada fração foi analisado em gel SDS-
PAGE 12,5%, corado com Coomassie Coloidal G250 (NEUHOFF et al., 1985).
35
4. RESULTADOS
4.1 Amplificação do gene rpoD de Mycoplasma hyopneumoniae
Com o objetivo de clonar o gene rpoD para realização de experimentos
posteriores, este foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico da cepa 7448 de M.
hyopneumoniae. A amplificação desta CDS, a qual originalmente possui 1470 pb, gerou um
produto de 1475 pb [FIG. 4.1], devido à utilização de primers que adicionaram as suas
extremidades os sítios de restrição XhoI e NcoI. Este fragmento foi ligado ao plasmídeo
pUC18, sendo denominado pUC18σMH. A seqüência foi confirmada por seqüenciamento.
FIGURA 4.1 Amplificação do gene rpoD de M. hyopneumoniae.
Gel de agarose 0,8% / brometo de etídeo mostrando o produto da amplificação do gene rpoD obtido por PCR a
partir do DNA genômico da cepa 7448 de M. hyopneumoniae. M – marcador de tamanho molecular; rpoD –
produto da PCR.
4.2 Substituição dos códons TGA por TGG no gene rpoD
O fator σ de M. hyopneumoniae é composto por 490 aminoácidos, possuindo três
triptofanos. No gene rpoD estes são codificados por três códons TGA,
36
localizados nas posições 221, 904 e 907 em relação a adenina do códon de início de tradução.
Para possibilitar a expressão heteróloga do gene rpoD em E. coli, os três códons
TGA existentes tiveram de ser substituídos por três códons TGG. Utilizando o plasmídeo
pUC18σMH e primers contendo as mutações (A→G) necessárias, o gene foi amplificado em
4 partes diferentes: fragmento σA (229 pb), fragmento σB (391 pb), fragmento σC (395 pb) e
fragmento σD (582 pb) [FIG. 4.2].
FIGURA 4.2 Mutagênese sítio-dirigida do gene rpoD de M. hyopneumoniae.
Os códons TGA existentes no gene rpoD foram substituídos por TGG através de sua amplificação em 4
fragmentos diferentes utilizando primers contendo as mutações necessárias (A→G). [A] Gel de agarose 0,8% /
brometo de etídeo mostrando a amplificação dos fragmentos mutados σA e σB. M – marcador de massa
molecular; σA e σB – produtos da PCR. [B] Gel de agarose 0,8% / brometo de etídeo mostrando a amplificação
dos fragmentos mutados σC e σD. M – marcador de tamanho molecular; σC e σD – produtos da PCR.
4.3 Construção de σABCD (rpoD contendo as mutações)
Depois de inseridas as mutações nos fragmentos σA, σB, σC e σD, estes foram
empregados na construção de um gene rpoD íntegro passível de ser expresso em E. coli.
Primeiramente foram feitas duas PCRs, uma utilizando como DNA molde σA e σB para
amplificação do fragmento σAB (590 pb)
[FIG. 4.3 A], e outra utilizando σC e σD como molde
para obtenção do fragmento σCD (947 pb)
[FIG. 4.3 B]. Isto foi possível, pois os fragmentos
[A] [B]
37
compartilham entre si uma região de 30 pb que permitiu o anelamento entre eles durante a
reação. Utilizando a mesma metodologia, pretendia-se gerar o fragmento completo σABCD a
partir dos fragmentos parciais σAB e σCD, porém, não foi possível amplificar produtos que
correspondessem ao tamanho esperado de 1475 pb.
Ainda, com o objetivo de se obter o fragmento σABCD através da mesma
estratégia, foram produzidos fragmentos parciais maiores, σABC e σBCD [FIG. 4.3 C], com
respectivamente, 923 e 1276 pares de bases. Estes fragmentos, agora contendo uma região de
sobreposição de 680 pb a mais do que os 62 pb existentes entre σAB e σCD, foram utilizados
na amplificação de σABCD, porém, novamente, sem sucesso.
FIGURA 4.3 Construções parciais para obtenção do gene rpoD mutado.
As seqüências parciais do gene rpoD - σAB, σBC, σABC e σBCD -, foram obtidas a partir da união dos
fragmentos mutados σA, σB, σC e σD através de PCR. Géis de agarose 0,8% / brometo de etídeo mostrando [A]
amplificação do fragmento mutado σAB. M – marcador de tamanho molecular; σAB – produto da PCR. [B]
amplificação do fragmento mutado σCD. M – marcador de tamanho molecular; σCD – produto da PCR. [C]
amplificação dos fragmentos mutados σABC e σBCD. M – marcador de tamanho molecular; σABC e σBCD –
produtos da PCR.
Para confirmar a inserção das mutações nos fragmentos amplificados, σAB, σCD,
σABC e σBCD, estes foram clonados e seqüenciados. Foram analisados onze clones, destes,
sete possuíam as substituições A→G requeridas. Um clone pUC18σABC e um pUC18σCD,
cujas mutações haviam sido confirmadas, foram usados para gerar o fragmento σABCD. Para
tanto, inicialmente, foi realizado um mapa de restrição do gene rpoD com o objetivo de
[A] [B] [C]
38
identificar sítios de restrição únicos e que estivessem presentes na região de sobreposição
entre os fragmentos σABC e σCD. Dentre os sítios de restrição que atendiam às condições
estabelecidas, foi escolhido o reconhecido por SacII. Esta enzima além de gerar extremidades
coesivas que possibilitam a clonagem direcionada, também não reconhece nenhuma seqüência
do vetor pUC18. A seqüência correspondente a região 5´ do gene (nucleotídeos 1-800) foi
purificada a partir da clivagem do plasmídeo pUC18σABC com as enzimas de restrição SacI
e SacII, e a região 3´ (nucleotídeos 801-1475) foi obtida a partir da clivagem do plasmídeo
pUC18σCD com SacII e KpnI. Estes fragmentos foram ligados simultaneamente ao vetor
pUC18 digerido com SacI-KpnI. Esta metodologia possibilitou gerar o plasmídeo
pUC18σABCD, o qual, após seqüenciado, mostrou conter o gene rpoD completo com os 3
códons TGA substituídos [FIG. 4.4]. Todos os 9 clones seqüenciados apresentavam as três
mutações.
FIGURA 4.4 Gene rpoD com os três códons TGA substituídos (σABCD).
O plasmídeo pUC18σABCD foi seqüenciado mostrando conter o gene rpoD completo, contendo as três
mutações. A figura mostra o alinhamento dos segmentos 156-231 e 848-925 entre o gene rpoD selvagem e o
consenso gerado a partir do seqüenciamento de σABCD (rpoD mutado
). rpoD – gene rpoD selvagem; ABCD –
gene rpoD contendo as 3 mutações A→G; em vermelho – códons mutados.
4.4 Expressão do fator σ recombinante
Para expressar o fator σ em E. coli, o fragmento σABCD, obtido através da
clivagem de pUC18σABCD com XhoI e NcoI foi purificado e ligado ao vetor de expressão
39
pET23a-d(+). Esta clonagem gerou o plasmídeo pETσABCD. A expressão do fator σ foi
realizada na cepa E. coli BL21 (DE3) pLysS transformada com pETσABCD.
A indução do gene clonado pôde ser observada após 1 hora de indução com 1 mM
IPTG. O experimento de SDS-PAGE demonstrou que a proteína heteróloga está na fração
insolúvel do extrato protéico, e que diferentemente dos 58 kDa estimados para o fator σ
fusionado à calda de polihistidina, a proteína expressada apresentou massa molecular de
aproximadamente 64 kDa [FIG. 4.5].
FIGURA 4.5 Expressão do fator σ recombinante.
A expressão do fator σ foi induzida com a adição de 1mM de IPTG durante 3 horas. Foram coletadas amostras
de 1ml, antes e após a indução. Gel de SDS-PAGE 12,5% / coomassie coloidal blue G250 mostrando a provável
indução do fator σ. M – marcador de massa molecular; s/ ind – antes da indução; 1h – após 1 hora de indução;
2h – após 2 horas de indução; 3h – após 3 horas de indução.
40
5. DISCUSSÃO
Com a conclusão do seqüenciamento do genoma de várias espécies de
Mycoplasma, tem crescido o interesse pela identificação das seqüências envolvidas no início
da transcrição, pois estas são fundamentais para a compreensão dos mecanismos que regulam
a expressão gênica destes microrganismos. Entretanto, o estudo das regiões promotoras de
micoplasmas é dificultoso, uma vez que as atuais ferramentas de bioinformática têm sido
ineficientes em fazer a predição, e que são escassas as metodologias que possibilitam a
caracterização experimental.
Diferentemente de outros molicutes como M. pulmonis, M. arthritidis, M.
capricolum e M. pneumoniae, M. hyopneumoniae não possui um sistema-repórter
estabelecido que permita o estudo de promotores in vivo (DYBVIG et al., 2000; JANIS et al.,
2005; HALBEDEL & STULKE, 2006). Apesar das vantagens de se estudar seqüências
controladoras no próprio organismo, existem alguns inconvenientes que prejudicam a
aplicação desta prática nas espécies que compõe esta classe. Como demonstrado por Lartigue
et al. (2003), os vetores replicativos de micoplasmas, geralmente, são espécie-específicos,
podendo haver incompatibilidade com vetores portadores de origens de replicação
heterólogas. Além disso, plasmídeos contendo oriC homólogas podem se integrar na oriC do
cromossomo do hospedeiro através de recombinação homóloga (RENAUDIN et al., 1995).
Outra dificuldade em se trabalhar com micoplasmas é a sua manipulação
fastidiosa. M. hyopneumoniae representa um exemplo típico deste fator. Esta bactéria
apresenta crescimento lento, sendo que as colônias tornam-se visíveis somente após 10 dias
de incubação, quando estão com aproximadamente 0,25 a 1 mm de diâmetro (ROSS, 1999). O
crescimento é feito em meio Friis, o qual é oneroso, e quando cultivado em meio sólido, os
níveis de CO
2
devem ficar entre 5-10% (FRIIS, 1974).
41
O trabalho desenvolvido por Lopes (2007) teve como objetivos construir um vetor
contendo a oriC de M. hyopneumoniae que fosse replicativo e estável, e estabelecer um
protocolo de eletrotransformação para este organismo. O plasmídeo gerado, pOSTM,
contendo tetM como gene-repórter, foi utilizado em experimentos de transformação. Como já
era esperado para molicutes, foi obtida baixa freqüência de transformantes. Não foi possível,
ainda, estabelecer transformantes estáveis, pois não apresentaram multiplicação após o
segundo repique. A ocorrência de integração do plasmídeo no cromossomo, a instabilidade do
vetor devido à presença em duplicata da região oriC ou a morte das células transformadas
após um período prolongado de cultivo, podem ser explicações para a perda precoce dos
transformantes (LOPES, 2007).
Tendo em vista que a análise in silico de promotores de micoplasmas é limitada
pela falta de promotores experimentalmente caracterizados (WEINER III et al., 2000;
VALIATI, 2006), e que M. hyopneumoniae não possui um sistema de transformação estável,
o estudo in vitro de promotores deste patógeno se apresenta como uma alternativa. Para
viabilizar essa proposta, é que este trabalho tem como finalidade expressar e purificar o fator
σ de M. hyopneumoniae, possibilitando assim, posteriormente, reconstituir a RNA polimerase
holoenzima deste organismo, a qual poderá, então, ser utilizada em experimentos que
permitam identificar os sítios de interação entre a holoenzima e o promotor.
Para fazer a clonagem e a expressão de σ, optou-se pela utilização do sistema
pET. Este sistema permite a expressão do gene de interesse por meio da enzima T7 RNA
polimerase, que atua sob o controle do promotor lacUV5. As cepas de E. coli, utilizadas neste
sistema como células hospedeiras, possuem uma cópia do gene da T7 RNA polimerase,
permitindo, deste modo, a transcrição do fragmento heterólogo pela indução do promotor
lacUV5 com IPTG (DUBENDORFF & STUDIER, 1991). Além da capacidade de produzir
grandes quantidades da proteína alvo, outro atrativo desta metodologia é que, através dos
plasmídeos da série pET-23a, é possível expressar a proteína fusionada a uma cauda de
42
polihistidinas, o que torna mais fácil a purificação, uma vez que esta pode ser feita por
cromatografia de afinidade à níquel.
A expressão heteróloga de genes de micoplasma em E. coli encontra também
dificuldades, pois estes organismos utilizam códons genéticos diferentes. Enquanto nos
micoplasmas TGA codifica triptofano, em E. coli, que utiliza o código genético universal, esta
trinca serve como códon de parada. Desta forma, para expressar rpoD, gene responsável por
codificar o fator σ em M. hyopneumoniae, foi preciso fazer a substituição de 3 códons TGA
por 3 códons TGG, os quais codificam triptofano pelo código genético universal.
Assim como em outros trabalhos, onde os genes de micoplasmas a serem
expressos também possuíam apenas alguns códons TGA (KNUDTSON et al., 1997; ROSATI
et al., 2000; NOH et al., 2002), as mutações A→G, inseridas no gene rpoD, também foram
feitas por mutagênese sítio-dirigida. A metodologia de mutagênese, utilizada neste trabalho, é
conhecida pelo nome de overlap extension PCR. Por meio desta técnica, foram gerados quatro
fragmentos parciais do gene rpoD: σAB, σCD, σABC e σBCD. Estes deveriam conter as
devidas substituições A→G, entretanto, apenas 63% dos fragmentos seqüenciados possuíam
as mutações correspondentes. Ainda, por esta metodologia, a obtenção do fragmento final
σABCD, consistindo no gene rpoD íntegro contendo as 3 mutações, não foi possível. Esta
baixa eficiência e a não obtenção de σABCD, concordam com o observado por Ho et. al.
(1989), onde discutem que o rendimento desta técnica de mutagênese sítio-dirigida cai
drasticamente quando o fragmento de DNA mutado a ser gerado é maior de 600 pb.
A introdução de mutações sítio-específicas no meio dos genes pode ser feita,
basicamente, por 3 métodos, os quais diferem entre si apenas pela maneira de obter o produto
final. Em todos, incluindo overlap extension PCR, a primeira etapa consiste na amplificação
do gene em fragmentos parciais, quando são inseridas as mutações através da utilização de
primers mutagênicos. Os fragmentos parciais gerados, contendo as alterações, correspondem
a diferentes segmentos do gene, que então devem ser unidos para dar origem ao gene
43
completo e mutado. Esta segunda etapa pode ser feita de diferentes formas de acordo com a
metodologia empregada. overlap extension PCR permite a fusão dos fragmentos através do
anelamento de extremidades 3’ comuns entre eles, seguida de extensão e PCR [FIG. 5.1 C]. Nas
outras duas metodologias esta união pode ser feita através da ligação dos fragmentos [FIG. 5.1
A], ou in vivo por meio de recombinação [FIG. 5.1 B].
FIGURA 5.1 Metodologias utilizadas para inserir mutações presentes no meio de um fragmento de DNA.
[A] Introdução de mutações pela ligação in vitro de dois produtos de PCR. Dois PCRs são feitos separadamente
para obter duas metades de um gene completo. Os produtos de PCR resultantes são, depois, ligados para formar
o gene completo carregando as mutações que foram inseridas pelos primers. [B] Introdução de mutações por
recombinação homóloga in vivo. Dois PCRs são feitos para gerar dois fragmentos que possuem seqüências de
sobreposição que foram introduzidas por dois primers. As extremidades que não possuem sobreposição são
ligadas a um vetor e transformadas em bactérias. Como resultado da recombinação homóloga in vivo da bactéria,
uma das duas seqüências de sobreposição é removida e os dois fragmentos são unidos. [C] Introdução de
mutações in vitro por overlap extension PCR. Dois PCRs são feitos para produzir dois fragmentos que possuem
seqüências sobrepostas. Estes dois fragmentos são, então, misturados, desnaturados e anelados para obter
fragmentos mutantes em PCR posterior. Modificado de Ling & Robinson, 1997.
44
Recentemente, Hames et al. (2005), desenvolveram uma técnica aparentemente
promissora, tendo conseguido inserir 9 mutações A→G no gene glpK de M. pneumoniae em
uma única PCR [FIG. 5.2]. MMR (multiple mutation reaction) tem como princípio o uso de
primers mutagênicos que hibridizam mais fortemente ao DNA molde do que os primers
externos. Os primers mutagênicos são fosforilados na suas extremidades 5’, o que permite
que sejam ligados, pela ação de uma DNA ligase termoestável, aos grupos 3’ OH dos primers
anelados à montante. A mutagênese sítio-dirigida de rpoD através desta metodologia está
sendo testada em nosso laboratório, porém os resultados ainda são preliminares.
FIGURA 5.2 Estratégia utilizada na amplificação e mutagênese do gene glpK de M. pneumoniae.
As posições dos códons TGA presentes no gene glpK selvagem, e as posições e orientações dos primers externos
e mutagênicos são mostradas. O sítio de anelamento de cada oligonucleotídeo está indicado por setas.
Oligonucleotídeos que portam as mutações A→G estão indicados como setas cruzadas. Modificado de Hames et
al., 2005.
Como não foi possível gerar o fragmento σABCD através da técnica de overlap
extension PCR, outra alternativa teve de ser utilizada. A ligação simultânea dos fragmentos
SacI-5’-σABC-3’-SacII e SacII-5’-σCD-3’-KpnI – obtidos a partir da clivagem dos plasmídeos
pUC18σABC e pUC18σCD –, ao vetor de clonagem pUC18, originou o plasmídeo
pUC18σABCD. Essa ligação concomitante de três fragmentos de DNA teve uma eficiência de
clonagem de 86%, resultado que pode ser atribuído à escolha das enzimas de restrição, as
quais, por gerarem extremidades coesivas e não compatíveis, possibilitaram a clonagem
direcionada. Conforme o esperado, devido à utilização dos fragmentos σABC e σCD cujas
45
alterações A→G já haviam sido confirmadas, todos os clones pUC18σABCD seqüenciados
apresentaram as três substituições.
Células de E. coli BL21(DE3) pLysS transformadas com o plasmídeo
recombinante pETσABCD, após 1 hora de indução com 1 mM de IPTG, passaram a expressar
uma proteína com 64 kDa. Este valor de massa molecular, observado no gel SDS-PAGE,
difere dos 58 kDa estimados para o fator σ de M. hyopneumoniae fusionado à cauda de
polihistidina. No entanto, este resultado é consistente com o fato de que os fatores σ fazem
parte de um grupo de proteínas que apresentam migração anormal em géis de SDS-PAGE,
apresentando menor mobilidade do que prevê sua massa molecular (BURTON et al., 1981;
LIU & MATSUMURA, 1995; FUJITA et al., 2000).
Ainda, a proteína expressa mostrou estar em bem maior concentração na fração
insolúvel. A superprodução de proteínas heterólogas no citoplasma de E. coli freqüentemente
resulta na formação de corpos de inclusão compostos por agregados insolúveis da proteína
expressa (SINGH & PANDA, 2005). Em alguns casos, proteínas presentes nos corpos de
inclusão podem ser usadas diretamente na preparação de anticorpos contra a proteína alvo,
porém, em situações onde a atividade biológica é necessária, não podem ser aplicadas por
estarem na forma inativa. Entretanto, as proteínas presentes em corpos de inclusão podem ser
solubilizadas. Em geral, isso é feito através do uso de altas concentrações de reagentes
caotrópicos (VALLEJO & RINAS, 2004), o que resulta na perda da estrutura secundária, uma
das principais razões da ausência de recuperação de proteínas bioativas (DILL & SHORTLE,
1991). Portanto, metodologias de solubilização mais brandas, contendo baixas concentrações
de agentes caotrópicos deverão ser testadas para obtenção do fator σ na sua forma ativa.
O fator σ, uma vez purificado, será utilizado para reconstituir a RNA polimerase
holoenzima. Diferentemente de σ, as subunidades α, β e β’, que compõem o núcleo da
holoenzima, não serão obtidas pela mesma estratégia empregada neste trabalho, pois apesar
do gene rpoA possuir apenas 999 pb e nenhum códon TGA a ser mutado, rpoB e rpoC
46
possuem, respectivamente, 3663 pb contendo 5 TGAs e 4239 pb contendo 7 TGAs. Para este
isolamento, pretende-se utilizar metodologias que apliquem etapas de precipitação e
cromatografias de troca iônica, de acordo com o descrito na literatura (e.g. FUJITA et al.,
2000; MANI et al., 2006). Além disso, outra possibilidade a ser estudada é utilização da
metodologia de pull down, que serviria como uma cromatografia de afinidade, onde σ estaria
na fase estacionária, atuando como ligante para RNA polimerase. No entanto, se não for
possível a purificação do fator σ na sua forma solúvel a partir dos corpos de inclusão, outras
condições de expressão serão testadas, ou, ainda, essa subunidade deverá ser purificada
juntamente com o núcleo da RNA polimerase.
47
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VES-FILHO, L.; ASSUNCAO, E. N.; AZEVEDO, V. A.; BOGO, M. R.; BRIGIDO, M. M.;
BROCCHI, M.; BURITY, H. A.; CAMARGO, A. A.; CAMARGO, S. S.; CAREPO, M. S.;
CARRARO, D. M.; DE MATTOS CASCARDO, J. C.; CASTRO, L. A.; CAVALCANTI, G.;
CHEMALE, G.; COLLEVATTI, R. G.; CUNHA, C. W.; DALLAGIOVANNA, B.;
DAMBROS, B. P.; DELLAGOSTIN, O. A.; FALCAO, C.; FANTINATTI-GARBOGGINI,
F.; FELIPE, M. S.; FIORENTIN, L.; FRANCO, G. R.; FREITAS, N. S.; FRIAS, D.;
GRANGEIRO, T. B.; GRISARD, E. C.; GUIMARAES, C. T.; HUNGRIA, M.; JARDIM, S.
N.; KRIEGER, M. A.; LAURINO, J. P.; LIMA, L. F.; LOPES, M. I.; LORETO, E. L.;
MADEIRA, H. M.; MANFIO, G. P.; MARANHAO, A. Q.; MARTINKOVICS, C. T.;
MEDEIROS, S. R.; MOREIRA, M. A.; NEIVA, M.; RAMALHO-NETO, C. E.; NICOLAS,
M. F.; OLIVEIRA, S. C.; PAIXAO, R. F.; PEDROSA, F. O.; PENA, S. D.; PEREIRA, M.;
PEREIRA-FERRARI, L.; PIFFER, I.; PINTO, L. S.; POTRICH, D. P.; SALIM, A. C.;
SANTOS, F. R.; SCHMITT, R.; SCHNEIDER, M. P.; SCHRANK, A.; SCHRANK, I. S.;
SCHUCK, A. F.; SEUANEZ, H. N.; SILVA, D. W.; SILVA, R.; SILVA, S. C.; SOARES, C.
M.; SOUZA, K. R.; SOUZA, R. C.; STAATS, C. C.; STEFFENS, M. B.; TEIXEIRA, S. M.;
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57
7. ANEXOS
7.1 Mapa do vetor de expressão pET-23a-d(+)
58
7.2 Protocolo de Extração de DNA genômico de M.
hyopneumoniae
0. Centrifugar 5 ml de cultura por 30 min a 3360 g
1. Ressuspender as células em 1 mL de tampão TE;
2. Homogeneizar em Vórtex;
3. Dividir em 2 tubos grandes (1,7 ou 2,0 mL);
4. Adicionar para cada tubo:
15µL SDS 10%;
1,5µL proteinase K (20m/mL);
5. Misturar invertendo gentilmente o tubo;
6. Incubar por 1h a 37ºC;
7. Adicionar:
100 µL NaCl 5M;
80 µL de CTAB 1%;
8. Incubar 10 min à 65ºC;
9. Adicionar 1 vol. de fenol:clorofórmio
10. Inverter gentilmente o tubo;
11. Centrifugar 5 min 13.000 rpm;
12. Transferir o sobrenadante para outro tubo;
13. Adicionar 800µL de clorofórmio;
10. Inverter gentilmente o tubo;
11. Centrifugar 5 min 13.000 rpm;
12. Transferir o sobrenadante para outro tubo;
13. Adicionar 600 µL de isopropanol gelado, misturar invertendo gentilmente o tubo;
14. Deixar a -20ºC por pelo menos overnight ou 1h à -80ºC:
15. Centrifugar 13.000 rpm, 5 min;
16. Lavar com etanol 70% gelado; (Adicionar 500µL de etanol 70% sem agitar e centrifugar a
13.000rpm por 2 min; depois descartar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar mais
500µL de Etanol 70%) Repetir 2X;
17. Secar (pode ser em estufa até 37ºC);
18. Ressuspender o pellet em 10-30 µL de água autoclavada e colocar na geladeira por 3hs;
19. Adicionar 3µL de RNAse (10 mg/ml) e incubar a 37ºC por 1h
20. Checar 10% do volume em gel de agarose 0,8% - 60V
59
7.3 Seqüência de nucleotídeos do gene rpoD de Mycoplasma
hyopneumoniae 7448
1 ATGACAGAAA ATAAAGAACT TTTCCCCCAA AAAGAGGATT TTATTCCAAT TTCTAATATT
61 AATCAAAATA GTTCTGAATA TGAGTTTATT ATCGAGAAAT TAGAACAAAA ATTAGAACAA
121 AAACACCAAA AGATAGGAAA AAATAGCTCT AATTTAGATA ATTTTTCTAT TTTTTTAAGT
181 CACGATGAAA TTTATAAATA TATTGA
AAAG TGAAATCTTG CAATTGAAGA AGAAAAACTT
241 GATGATTTTT TTCAAACTTT AATACAAAGA AAAATAATTG CTGACGAAGT CGATAAAGAG
301 GATCTTGAAA ATGTTTCAAG TTTTGATTTT GCCGAGCAAA TTAATAATAA AAAATCTGTT
361 AGAGATAAAA AAAATAAAAA ATATAGTCAA GATTTTGATC AGTCACTAAT AAACTTAGAT
421 GATCAAAATT TCGATATTAA TCATAACGAG GAAGATGATA ATTCTGACCT AAATCTAGGA
481 CAATCAGTCG ATGATTCCTT AAAAATTCAG GAAATTGACG ACCTGGATTA TATAACAGAA
541 AATAGTCCAA ATCAATACCA CAAACCAAAA GTTTATAGTG ATGAAGTTTA CCTTAACAAA
601 CTGACCGATA CAAGTGATAT GATAAAATGG TATATGCGTT GGATCGGAAA ATATGGAAAA
661 CTTTTAACGG CTGAAGAAGA AAGAGAACTT GCAAAAAAAA TGAAAATCAA AGGCCGGATT
721 GGAAAAAAAG CGCGTGATAC CTTAATAAAA CGGAATTTAC GTCTGGTGGT TAACAGTGCA
781 AAACGCTATA AAAACCGCGG TCTTGGATTT ATCGATCTAA TCTCAGAGGG TAACCTCGGT
841 ATTATTAAAG CAGTTGCAAA ATATGACTAT ACCCGTGGAT TTAAATTCTC AACTTATGCA
901 ACCTGATGA
A TCCGCCAAGC GATTACAAGG GCGGTTGCCG ACCAGGCCCG GCTCATTCGA
961 ATTCCGGTTC ACATGGTCGA GACAATCAAT AAAATTAATA AGGTAGAAAG GGAATTACAA
1021 CAAGAAAAAG GACTTAATCC AACAGCCGAA GAAATTTCAG AACGTTTAGG TGGCGAATTT
1081 AGCCCTGATA AAATACGGTA TATTAAAAAA ATCAATATCG ATCCAATTTC ACTAGATAAA
1141 GCAATTGGGA AAGAGGAAGA TAGTTCATTT TCTGATTTTA TCAAGGATGA GAATATGATT
1201 TCCCCAGTAG ATTATGCAAT TCGTGAGGAA AAAGCGAAAG TTTTGCTTGA AATGATCGAT
1261 TCAACACTTG ATTATGATGA AAGAGATTTT ATCAAAAGAC GTTATGGGGT CGGAACAAAC
1321 GATGAAGGAA TTCCTTATCA GGCACATAGT TTTGAAGAGC TTGCGGCGAT GCGCCGAGTA
1381 ACAAAAGAGA GGGTTAGGCA AATTGAGGCA AAAATTCTAA AAAAATTAAG AACCCCACAC
1441 CGCCGCCTAT CATTAAGGGA TTTTAATTAA
Sublinhado: códons de terminação TGA.
60
8. CURRICULUM VITAE
Dados Pessoais
Nome
E-mail
Shana de Souto Weber
shana@cbiot.ufrgs.br
Formação Acadêmica/Titulação
2006
Mestrado em Biologia Celular e Molecular.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil
Título: Fator σ de Mycoplasma hyopneumoniae: Mutagênese, Clonagem e
Expressão
Orientador: Irene Silveira Schrank
Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
2001 - 2005
Graduação em Ciências Biológicas.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil
Título: Caracterização da região promotora do gene vlhA em diferentes isolados de
Mycoplasma synoviae
Orientador: Sérgio Ceroni da Silva
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Formação complementar
2004 - 2004
Curso de curta duração em RDA em Microorganismos.
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS, Porto Alegre, Brasil
2006 - 2006
Curso de curta duração em Clonagem e expressão em bactérias gram-positivas.
Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte, Brasil
Atuação profissional
1. Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde - FEPPS
Vínculo
institucional
2005 - 2005
Vínculo: Estagiário , Enquadramento funcional: Estágiario , Carga horária: 20,
Regime: Parcial
Atividades
02/2005 - 06/2005 Projetos de pesquisa, Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnologico
Participação em projetos:
Detecção de Chlamydia trachomatis em amostras de urina masculina por reação
em cadeia da polimerase
02/2005 - 07/2005 Estágio, Lacen
Estágio:
Desenvolvimento de método de detecção de Chlamydia trachomatis e Diagnóstico
de Mycobacterium em amostras clínicas
61
2. Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS
Vínculo
institucional
2002 - 2006
Vínculo: Bolsista iniciação científica , Enquadramento funcional: Estagiária , Carga
horária: 20, Regime: Parcial
Atividades
09/2002 - 09/2004 Pesquisa e Desenvolvimento, Centro de Biotecnologia
Linhas de Pesquisa:
Métodos moleculares aplicados ao diagnóstico de Actinobacillus pleuropneumoniae
09/2002 - 04/2006 Estágio, Centro de Biotecnologia
Estágio:
Iniciação Científica
09/2002 - 09/2004 Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
Clonagem e expressão do gene apxIV de Actinobacillus pleuropneumoniae
11/2004 - 12/2005 Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
Análise da região controladora do gene vlha de Mycoplasma synoviae
04/2005 - 12/2006 Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
Resistência aos antimicrobianos e presença de plasmídeos em isolados clínicos e
ambientais de Escherichia coli
04/2006 - Atual Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
Clonagem e expressão do fator σ de Mycoplasma hyopneumoniae em Escherichia
coli
04/2006 - Atual Projetos de pesquisa, Centro de Biotecnologia
Participação em projetos:
Caracterização funcional de promotores de Mycoplasma hyopneumoniae
Linhas de pesquisa
1.
Métodos moleculares aplicados ao diagnóstico de Actinobacillus pleuropneumoniae
62
Projetos
2006 - Atual
Clonagem e expressão do fator σ de Mycoplasma hyopneumoniae em Escherichia
coli
Situação: Em Andamento Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Irene Silveira Schrank (Responsável)
2006 - Atual Caracterização funcional de promotores de Mycoplasma hyopneumoniae
Situação: Em Andamento Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (1); Mestrado acadêmico (1);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Irene Silveira Schrank (Responsável); Luciano
Reolon
2005 - 2005
Detecção de Chlamydia trachomatis em amostras de urina masculina por reação em
cadeia da polimerase
Situação: Concluído Natureza: Desenvolvimento
Alunos envolvidos: Graduação (2); Especialização (0); Mestrado acadêmico (1);
Mestrado profissionalizante (0); Doutorado (0);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Fernando Hayashi Sant'Anna; Daniela Becker;
Alzira Resende do Carmo Aquino; Marilene Henning Vainstein (Responsável)
2005 - 2006
Resistência aos antimicrobianos e presença de plasmídeos em isolados clínicos e
ambientais de Escherichia coli
Situação: Concluído Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (4); Especialização (0); Mestrado acadêmico (0);
Mestrado profissionalizante (0); Doutorado (1);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Mateus Matiuzzi da Costa; Irene Silveira
Schrank (Responsável); Franciele Maboni; Lilian Kolling; Guilherme Drescher;
Agueda Castagna de Vargas
Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-
CNPq
2004 - 2005 Análise da região controladora do gene vlha de Mycoplasma synoviae
Situação: Desativado Natureza: Pesquisa
Alunos envolvidos: Graduação (1); Especialização (0); Mestrado acadêmico (0);
Mestrado profissionalizante (0); Doutorado (0);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Sérgio Ceroni da Silva (Responsável); Irene
Silveira Schrank
Financiador(es): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-
CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq
2002 - 2004 Clonagem e expressão do gene apxIV de Actinobacillus pleuropneumoniae
Situação: Desativado Natureza: Desenvolvimento
Alunos envolvidos: Graduação (1); Especialização (0); Mestrado acadêmico (0);
Mestrado profissionalizante (0); Doutorado (1);
Integrantes: Shana de Souto Weber; Mateus Matiuzzi da Costa; Sérgio Ceroni da
Silva; Irene Silveira Schrank (Responsável)
Financiador(es): Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS, Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq
63
Produção em C, T & A
Produção bibliográfica
Artigos completos publicados em periódicos
1.
BROETTO, L., CECAGNO, R., SANT'ANNA, F. H., WEBER, S.S., SCHRANK, I. S.
Stable transformation of Chromobacterium violaceum with a broad-host range plasmid.. Applied
Microbiology and Biotechnology. , v.71, p.450 - 454, 2006.
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos (resumo)
1.
REOLON, L., WEBER, S.S., LOPES, B. M. T., SILVA, S. C., SCHRANK, I. S.
In vivo promoter activities in Mycoplasma hyopneumoniae: evaluation of a reporter system. In: XI
Congreso Argentino de Microbiologia, 2007, Córdoba.
XI Congreso Argentino de Microbiologia, 2007.
2.
WEBER, S.S., SCHRANK, I. S., SILVA, S. C.
Caracterização da região promotora do gene vlhA em diferentes isolados de Mycoplasma synoviae In:
25ª Reunião de Genética de Microrganismos, 2006, São Pedro - SP.
Resumos da 25ª Reunião de Genética de Microrganismos, 2006. p.103 -
3.
REOLON, L., WEBER, S.S., SILVA, S. C., SCHRANK, I. S.
Caracterização funcional de promotores de Mycoplasma hyopneumoniae In: XVIII Salão e XV Feira
de Iniciação Científica, 2006, Porto Alegre - RS.
Livro de Resumos XVIII Salão de Iniciação Científica e XV Feira de Iniciação Científica, 2006.
4.
WEBER, S.S., SCHRANK, I. S.
Clonagem e expressão do fator σ de Mycoplasma hyopneumoniae em Escherichia coli In: VIII
Reunião Anual do Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de
Biotecnologia da UFRGS, 2006, Porto Alegre - RS.
Livro de Resumos PPGBCM, 2006. p.133 -
5.
WEBER, S.S., SCHRANK, I. S., SILVA, S. C.
Clonagem e expressão do fator σ de Mycoplasma hyopneumoniae em Escherichia coli In: XVIII Salão
e XIV Feira de Iniciação Científica, 2006, Porto Alegre - RS.
Livro de Resumos XVIII Salão de Iniciação Científica e XV Feira de Iniciação Científica, 2006.
6.
WEBER, S.S., COSTA, M. M., SILVA, M. S., MABONI, F., FERRONATTO, A. I., DRESCHER,
G., VARGAS, A. C., SCHRANK, I. S.
Resistência aos antimicrobianos e presença de plasmídeos em isolados clínicos e ambientais de
Escherichia coli In: 25ª Reunião de Genética de Microrganismos, 2006, São Pedro - SP.
Resumos da 25ª Reunião de Genética de Microrganismos, 2006. p.102 -
7.
WEBER, S.S., SCHRANK, I. S., SILVA, S. C.
Análise da região controladora do gene vlhA de Mycoplasma synoviae In: XVII Salão e XIV Feira de
Iniciação Científica, Porto Alegre, 2005.
8.
WEBER, S.S., SCHRANK, I. S., SILVA, S. C.
Análise da região controladora do gene vlhA de Mycoplasma synoviae In: 51º Congresso Brasileiro de
Genética, Águas de Lindóia, 2005.
9.
BECKER, D., JARDIM, A. F. M., WEBER, S.S., SANT'ANNA, F. H., SANTOS, S., RIBEIRO, M.
O., SCHERER, L.
Contribuição da PCR in house no diagnóstico da tuberculose: a experiência em rotina de um
laboratório de saúde pública In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2005, Santos - SP.
XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia., 2005.
64
10.
WEBER, S.S., COSTA, M. M., SILVA, S. C., SCHRANK, I. S.
Clonagem e expressão em E. coli do gene apxIVA de Actinobacillus pleuropneumoniae In: XXIV
Reunião de Genética de Microorganismos, Gramado, 2004.
11.
WEBER, S.S., COSTA, M. M., SILVA, S. C., SCHRANK, I. S.
O gene apxIV de Actinobacillus pleuropneumoniae: expressão e purificação da proteína em E. coli
In: XVI Salão e XIII Feira de Iniciação Científica, 2004, Porto Alegre.
Livro de Resumos XVI Salão de Iniciação Científica e XIII Feira de Iniciação Científica, 2004.
12.
WEBER, S.S., COSTA, M. M., SILVA, S. C., SCHRANK, I. S.
Clonagem e expressão do gene apxIV de Actinobacillus pleuropneumoniae em E. coli. In: XV Salão
e XII Feira de Iniciação Científica, 2003, Porto Alegre.
Comunicações e Resumos Publicados em Anais de Congressos ou Periódicos (resumo expandido)
1.
COSTA, M. M., SILVA, M. S., MABONI, F., WEBER, S.S., KOLLING, L., DRESCHER, G.,
VARGAS, A. C., SCHRANK, I. S.
Resistência ao antimicrobianos e presença de plasmídeos em isolados clínicos e ambientais de
Escherichia coli In: XII Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos, 2005,
Fortaleza.
Anais do XII congresso brasileiro da ABRAVES, 2005. v.2. p.7 - 8
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