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Bettina Tomio Heckert
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, Centro de Ciências
Biológicas, Universidade Federal
de Santa Catarina, como requisito
parcial para obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
CURSO TEMPORAL DE ALTERAÇÕES FISIOPATOLÓGICAS EM
UM MODELO DE SEPSE EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS:
PERFIL DE EXPRESSÃO DAS ENZIMAS ÓXIDO NÍTRICO
SINTASES.
FLORIANÓPOLIS
–
SC
2008
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Livros Grátis
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Dr. Jamil Assreuy pela confiança em mim depositada,
pelos muitos ensinamentos e pela agradável relação de amizade que mantivemos
durante esses dois anos de convivência.
À coordenação do Programa de Pós Graduação em Farmacologia, pela
dedicação em atender às necessidades dos alunos.
Ao Prof. Tadeu Lemos, pelo grande auxílio desde o início do curso.
Ao Prof. Dr. João Batista Calixto, pela disponibilização de equipamentos
importantes para este trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Farmacologia, pela ajuda prestada.
A todos os colegas e amigos do NOLAB, pelo companheirismo e espírito de
equipe, mas principalmente pelas boas conversas, risadas, cervejas, almoços e
cafés da tarde, que deixam muitas saudades.
Em especial à Letícia K. Pacheco, por participar de todos os experimentos
sempre com disposição, principalmente durante as cirurgias e coletas de material.
À Elaine Anton, pelo valioso auxílio técnico, fundamental à realização dos
experimentos de Western blotting.
Às demais pessoas diretamente envolvidas na prática deste trabalho,
Gustavo, Regina, Daniel, Ângela e Edir, por seu envolvimento em muitos
experimentos.
À Adriane Madeira, pelo suporte técnico essencial à rotina do laboratório.
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Aos colegas da turma de mestrado, mas principalmente à Fernanda Basei,
pelas inúmeras conversas de corredor sempre muito produtivas a respeito da
técnica Western blotting.
À minha família, pelo grande apoio e incentivo em todos os momentos.
Ao meu namorado Guilherme pelo companheirismo e muito incentivo desde
o meu ingresso no curso de mestrado, além da grande ajuda prestada e
especialmente na reta final deste trabalho.
À Cristália produtos Farmacêuticos (São Paulo, Brasil), pela doação da
heparina utilizada em nossos experimentos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelo
apoio financeiro.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Curva de sobrevivência de animais submetidos à CLP....................... 21
Figura 02 - Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NO
x
) em animais naive, sham e
submetidos à CLP................................................................................. 22
Figura 03 - Níveis plasmáticos de uréia e creatinina em animais naive, sham e
submetidos à CLP...................................................................................23
Figura 04 - Níveis plasmáticos da enzima transaminase hepática (TGP) em
animais naive, sham e submetidos a CLP..............................................24
Figura 05 - Níveis de glicose plasmática em animais naive, sham e submetidos à
CLP.........................................................................................................25
Figura 06 - Temperatura corporal de animais sham e submetidos a CLP...............26
Figura 07 - Pressão arterial média em animais sham e submetidos a CLP.............27
Figura 08 - Dosagem da atividade da enzima MPO em pulmão de animais
naive, sham e submetidos à CLP.............................................................28
Figura 09 - Extravasamento plasmático, medido pela exsudação de azul de Evans,
em animais naive, sham e CLP..............................................................29
Figura 10 - Quantificação da expressão de NOS-1 em pulmão de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................31
Figura 11 - Quantificação da expressão de NOS-2 em pulmão de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................32
Figura 12 - Quantificação da expressão de NOS-3 em pulmão de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................33
Figura 13 - Comparação da expressão de três isoformas da NOS em pulmão de
animais sham e submetidos à CLP........................................................34
Figura 14 - Quantificação da expressão de NOS-1 em coração de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................35
Figura 15 - Quantificação da expressão de NOS-2 em coração de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................36
Figura 16 - Quantificação da expressão de NOS-3 em coração de animais naive,
sham e submetidos à CLP......................................................................37
Figura 17 - Comparação da expressão de três isoformas da NOS em coração de
animais sham e submetidos à CLP.........................................................38
LISTA DE ABREVIATURAS
CASP - Introdução de cateter no cólon ascendente
CLP - Ligadura e perfuração do ceco
EDRF - Fator relaxante derivado do endotélio
EPM - Erro padrão da média
HSP - Proteína de choque térmico
i.p. - Intraperitoneal
i.v. - Intravenoso
s.c. - Subcutâneo
IL-1 - Interleucina-1
IL-6 - Interleucina-6
LPS - Lipopolissacarídeo
LTA - Ácido lipoteicóico
MPO - Mieloperoxidase
NO - Óxido nítrico
NO
2
- Nitrito
NO
3
- Nitrato
NOS - Óxido nítrico sintase
TNF - Fator de necrose tumoral
PAF - Fator de ativação plaquetária
PBS - Solução salina tamponada com fosfato
TGP - Transaminase pirúvica
RESUMO
A sepse é uma condição de resposta inflamatória sistêmica secundária à infecção,
podendo evoluir para falência de múltiplos órgãos, hipotensão arterial refratária a
vasoconstritores e finalmente morte. Neste trabalho foi caracterizado o curso
temporal do perfil de expressão das três isoformas da óxido nítrico (NO) sintase
simultaneamente com diversos parâmetros bioquímicos e fisiológicos em um
modelo de sepse experimental (ligadura e perfuração do ceco; CLP) em
camundongos. Os níveis plasmáticos de NO
x
elevaram-se a partir de 6 horas e
marcadores de lesão orgânica a partir de 12 horas após a CLP. Os níveis de glicose
no plasma aumentaram inicialmente (2 horas) seguidos de hipoglicemia profunda e
persistente. O recrutamento de neutrófilos para o pulmão ocorreu a partir de 24. Foi
detectada uma hipotensão muito precoce (30 minutos) e retorno aos valores
normais por volta de 16 horas. Nenhum aumento de permeabilidade vascular foi
detectado em pulmão e coração, enquanto que no coração houve redução e no rim
e baço aumento progressivo. A expressão das três isoformas da NOS foi estudada
no tecido pulmonar e cardíaco. A NOS-2 mostrou um pico de expressão em 6-12
horas após a cirurgia. A NOS-3 elevou-se 6 horas após a cirurgia e permaneceu
elevada até o fim do experimento. Já a NOS-1 só começou a elevar-se 12 horas
após a cirurgia. Em conjunto, os resultados encontrados caracterizam o decurso
temporal do modelo CLP em camundongos e mostram que a NOS-2 é responsável
pela grande produção de NO no início da sepse, mas que as isoformas constitutivas
podem desempenhar papel importante nos estágios mais tardios. A correlação da
quantidade das três isoformas com os demais parâmetros sugere que o NO da
NOS-2 está temporalmente associado com várias alterações da sepse, mas não
com outras como a hiperglicemia.
ABSTRACT
Sepsis is a systemic inflammatory response secondary to infection, which can evolve
to multiple organ failure, hypotension refractory to vasoconstrictors and death. In this
work we characterized the time course of the three isorforms of nitric oxide (NO)
synthase, simultaneous to biochemical and physiological parameters using an
experimental sepsis model (cecal ligation and puncture, CLP) in mice. Plasma NO
x
levels rose within 6 hours and organ damage markers within 12 hours after CLP.
Glucose plasma levels early raised (2 hours) followed by deep and persistent
hypoglycemia. Neutrophil recruitment to lung started at 24 hours. Hypotension
started early (30 minutes) and blood pressure returned to normal levels around 16
hours. No increase in vascular permeability was detected in lung and heart; it
decreased in the heart, and increased progressively in kidney and spleen.
Expression of NOS isoforms was studied on lung and heart. NOS-2 expression
peaked at 6-12 hours after surgery. NOS-3 levels raised 6 hours after surgery and
stayed high until the end of the experiment. NOS-1 began to rise only 12 hours after
surgery. Together, these results characterize the time-course of CLP model in mice
and show that NOS-2 is responsible for great NO production in early sepsis, but NO
from the constitutive isoforms may have an important role on the late stages of
sepsis. Correlation of NOS isoforms expression pattern with the other parameters
suggests that NO from NOS-2 is temporally associated with many sepsis alterations,
but not with others like hyperglycemia.
SUMÁRIO
Lista de Figuras............................................................................................................i
Lista de Abreviaturas...................................................................................................iii
Resumo.......................................................................................................................iv
Abstract......................................................................................................................v
I – INTRODUÇÃO.......................................................................................................1
1.1. Sepse................................................................................................................1
1.1.1. Definição e epidemiologia.................................................................................1
1.1.2. Fisiopatologia....................................................................................................2
1.1.3. Sepse e óxido nítrico.........................................................................................4
1.2. Modelos experimentais de sepse......................................................................6
1.3. Óxido nítrico sintases (NOS)............................................................................8
II – OBJETIVOS.........................................................................................................11
2.1. Objetivo geral..................................................................................................11
2.2. Objetivos específicos......................................................................................11
III – METODOLOGIA.................................................................................................12
3.1. Animais...........................................................................................................12
3.2. Modelo de septicemia por ligadura e perfuração do ceco (CLP)....................12
3.3. Avaliação da sobrevida...................................................................................13
3.4. Coleta de sangue e de órgãos........................................................................13
3.5. Dosagens bioquímicas no plasma..................................................................13
3.5.1. Dosagem de glicose......................................................................................13
3.5.2. Dosagem de uréia...........................................................................................14
3.5.3. Dosagem de creatinina...................................................................................14
3.5.4. Determinação dos níveis de nitrato e nitrito (NO
x
)..........................................15
3.5.5. Dosagem da enzima Transaminase Pirúvica (TGP) plasmática.....................15
3.6. Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) em pulmão..............................16
3.7. Avaliação do extravasamento plasmático.......................................................16
3.8. Avaliação da pressão arterial..........................................................................17
3.9. Imunoeletroforese...........................................................................................18
3.9.1. Preparação de amostras................................................................................18
3.9.2. Separação de proteínas e imunodetecção.....................................................18
3.9.3. Stripping de membrana............................................................................20
3.10. Desenho experimental....................................................................................20
3.11. Análise estatística..........................................................................................20
3.12. Compostos e reagentes..................................................................................20
IV – RESULTADOS..................................................................................................22
4.1. Avaliação da sobrevivência de animais submetidos à cirurgia de
ligadura e perfuração do ceco...................................................................................22
4.2. Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NO
x
)...................................................23
4.3. Níveis plasmáticos de uréia e creatinina.........................................................24
4.4. Níveis plasmáticos da enzima transaminase pirúvica (TGP)..........................25
4.5. Concentração plasmática de glicose..............................................................26
4.6. Medida da temperatura corporal...................................................................27
4.7. Pressão arterial média (PAM).......................................................................28
4.8. Atividade da mieloperoxidase no pulmão......................................................29
4.9. Extravasamento plasmático...........................................................................30
4.10. Expressão das isoformas da NOS em pulmão...............................................31
4.11. Expressão das isoformas da NOS em coração.............................................35
V – DISCUSSÃO......................................................................................................40
VI – CONCLUSÕES.................................................................................................53
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................54
I. INTRODUÇÃO
1.1. Sepse
1.1.1. Definição e epidemiologia
Um grave problema de saúde pública mundial, a sepse é uma condição
caracterizada por infecção grave associada à reação inflamatória sistêmica. No ano
de 1991, na Conferência de Consenso feita pelo American College of Chest
Physicians and the Society of Critical Care Medicine, foram estabelecidos critérios
para a classificação de sepse e doenças similares (Bone et al., 1992). Foi a partir de
então que a sepse ficou definida como a situação em que o paciente apresenta
resposta inflamatória sistêmica (SIRS) associada a um quadro infeccioso (ver
Quadro 1). Esta padronização foi muito importante na clínica, para detecção da fase
de evolução da doença em que o paciente se encontra e possibilidade de
intervenção terapêutica adequada.
SIRS:
Conjunto de manifestações clínicas à agressão orgânica grave,
necessariamente na ausência de infecção. Presença de dois ou mais dos seguintes
sintomas: temperatura >38ºC ou <36ºC; freqüência cardíaca >90 bpm; freqüência
respiratória >20 movimentos/minuto; leucometria >12.000/mm
3
ou <4.000/mm
3
, ou
ainda, presença de >10% de bastões.
Sepse:
Situação em que há presença dos sinais e sintomas descritos acima (SIRS)
secundários a um processo infeccioso.
Sepse Grave:
Quadro de sepse associada à disfunção orgânica, hipotensão e
hipoperfusão tecidual.
Choque sé
ptico:
Sepse grave com hipotensão arterial e alteração perfusional
persistentes à reposição volêmica adequada.
Quadro 1 – Definição de sepse e condições similares, conforme estabelecido na
Conferência de Consenso feita pelo American College of Chest Physicians and the Society
of Critical Care Medicine, no ano de 1991.
Apesar dos grandes avanços na Medicina Intensiva, a incidência de sepse
vem aumentando nos últimos anos, sendo considerada a principal causa de morte
em unidades de tratamento intensivo não-coronarianas. Anualmente, em todo o
mundo, ocorrem cerca de 18 milhões de casos de sepse grave. No Brasil, a sepse é
a doença geradora de maiores custos aos setores públicos e privados. Em 2003 os
gastos com pacientes de UTI somaram 17,34 bilhões de reais, o que representa
cerca de 30 a 35% dos gastos totais com saúde no país (Andrade et al., 2006).
As mais freqüentes fontes de infecção que podem desencadear o
desenvolvimento da sepse são de origem pulmonar, abdominal, urinária, cutânea e
cateteres vasculares. Os microorganismos causadores são na maioria bactérias,
embora uma parcela dos casos seja originada por infecções virais ou fúngicas. O
choque séptico é uma complicação em pelo menos 50-60% de bacteremias gram-
negativas e de 5-10% bactérias gram-positivas ou fungos. Acredita-se que o
aumento na incidência da síndrome seja devido ao crescente número de pacientes
imunodeprimidos, uso freqüente de procedimentos invasivos, freqüência no uso de
antibióticos (geração de mais microrganismos resistentes), além do aumento da
expectativa de vida, que aumenta o número de pacientes idosos (Rangel Frausto,
2005).
1.1.2. Fisiopatologia
Componentes dos microorganismos estimulam algumas células do sistema
imune, desencadeando a reação sistêmica. Os principais são o ácido lipoteicóico
(LTA) e peptideoglicanas, derivados de bactérias gram-positivas, e o
lipopolissacarídeo (LPS), no caso de bactérias gram-negativas (endotoxinas). As
toxinas bacterianas são liberadas normalmente quando ocorre um evento de lise da
parede celular, como na replicação e na morte celular da bactéria (Opal, 2007).
O principal receptor para LPS presente na membrana das células
fagocíticas é o TLR-4, da família dos receptores Toll-like. O reconhecimento do LPS
pelo TLR-4 é bastante complexo e depende de moléculas acessórias, como a
proteína ligadora de LPS (LBP) e CD14 (receptor de alta afinidade pelo LPS). Após
a ativação dos receptores ocorre o recrutamento de proteínas acessórias do
citoplasma, como a proteína adaptadora Myd88. O recrutamento dessas proteínas
acessórias inicia uma série de reações de fosforilação protéica que culmina na
liberação do fator nuclear kappa B (NF-kB) e ativação das proteínas quinases
ativadas por mitógeno (MAPK). O resultado é a indução da transcrição de vários
genes inflamatórios e produção de diversos mediadores, como o fator de necrose
tumoral (TNF), interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), fator de ativação
plaquetária (PAF) e óxido nítrico (NO), entre outros. Paralelamente, ocorre a
ativação de várias cascatas de proteínas plasmáticas, como o complemento, a
coagulação e o sistema fibrinolítico (Jean-Baptiste, 2007).
Além da liberação de diversas moléculas pró-inflamatórias, alterações
hemodinâmicas substanciais participam do agravamento do quadro de sepse. A
incapacidade de fornecimento de oxigênio aos tecidos, associado a uma
vasodilatação periférica exacerbada, mesmo com manutenção do débito cardíaco,
são características do quadro de choque séptico (Parrillo et al., 1990). Com avanço
das complicações da doença, essas alterações hemodinâmicas evoluem
gradualmente para um estado hipodinâmico, caracterizado por baixa resistência
vascular periférica e hiporeatividade a vasoconstritores (Matsuda e Hattori, 2007).
A complexa interação entre a resposta inflamatória exacerbada e as
alterações hemodinâmicas tem como conseqüência o comprometimento da
funcionalidade de muitos órgãos e a evolução para o quadro de choque,
acompanhado de alta mortalidade. As disfunções orgânicas mais comuns são
cardiovascular, pulmonar, renal, neurológica, da coagulação e do aparelho
digestivo. Para diagnóstico médico, essas alterações são deduzidas, por exemplo,
pelo aumento de creatinina e uréia no sangue (falência renal), queda na pressão
arterial (cardiovascular), necessidade de ventilação mecânica (pulmonar), e estado
de coma na ausência de sedação. Mais tardiamente ocorrem disfunções hepáticas e
hematológicas, visto pela alteração na contagem de plaquetas e leucócitos no
sangue, e aumento na bilirrubina. Além disso, alterações metabólicas acompanham
o desenvolvimento da doença, como diagnosticado por necessidade de
insulinoterapia e aumento nos níveis de lactato (David e Faria Neto, 2007, p.9).
A possibilidade de evolução para quadros clínicos que diferem muito entre
os pacientes é o motivo pelo qual o tratamento da sepse permanece difícil. A terapia
farmacológica vigente busca a manutenção da pressão arterial e do débito cardíaco
através de reposição de líquido e utilização de agentes inotrópicos e vasopressores.
Aliado a isso, o uso de antibióticos é empregado para eliminação do foco infeccioso,
após sua identificação (Hollenberg et al., 2004).
1.1.3. Sepse e óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, altamente hidrofóbica e
facilmente difusível através de membranas biológicas. É sintetizado a partir de
oxigênio molecular e do aminoácido L-arginina por um grupo de enzimas
conhecidas como óxido nítrico sintases (NOS). Após sua síntese e liberação, possui
um tempo de meia-vida muito curto (5-10 s), rapidamente originando nitrito (NO
2
) e
subseqüentemente nitrato (NO
3
), ambos os metabólitos estáveis do NO. Trata-se de
um gás bastante reativo, cuja liberação resulta em imediatas e variadas reações
químicas, produzindo efeitos diretos ou indiretos nos sistemas biológicos (Vincent et
al., 2000).
Uma das ações diretas do NO é sua reação com metais. Diversas
proteínas contêm metais em sua estrutura e são, portanto, alvos de interação para o
NO, como é o caso da guanilato-ciclase e das NO-sintases. Os efeitos indiretos do
NO podem ocorrer através de sua reação com espécies reativas de oxigênio, como
o ânion superóxido. Essa reação forma um produto oxidante, o peroxinitrito,
responsável por muitas ações originalmente atribuídas ao NO. O NO também possui
uma elevada capacidade de interação com grupamentos tióis (R-SH), muito
freqüentes em proteínas que contenham resíduos de cisteína. A reação forma S-
nitrosotióis, considerados estoques endógenos de NO, presentes no plasma e nos
tecidos (Assreuy, 2006).
As primeiras evidências de que o NO teria um envolvimento na
fisiopatologia da sepse vieram com a descoberta de elevados níveis de nitrato e
nitrito em pacientes sépticos (Ochoa et al., 1991; Evans et al., 1993). Aliado a isso,
a redução no tônus vascular vista após a administração de endotoxinas ou citocinas
pró-inflamatórias, e a identificação do fator relaxante derivado do endotélio (EDRF)
como NO, levaram às sugestões de que a molécula estaria envolvida em alterações
cardiovasculares no choque séptico (Vincent et al., 2000). Nas duas últimas
décadas, tornou-se evidente que, na patogênese da sepse, o NO pode atuar de
maneira deletéria ou benéfica. Embora conhecidas as suas propriedades
vasodilatadoras, seus efeitos pró- e antiinflamatórios, bem como oxidantes e
antioxidantes, entre outros, têm sido motivo de discussões e controvérsias (Hauser
et al., 2005).
Muitas evidências do papel do NO na sepse vieram de observações de
que vários sintomas da síndrome são atenuados pelo uso de inibidores das NOS.
Estes normalizam a queda da pressão arterial (Kilbourn et al., 1990), aumentam a
sobrevivência (Wu et al., 1995) e atenuam os danos em múltiplos órgãos e a
falência circulatória na sepse experimental em ratos (Wu et al., 1996). Foi
demonstrado que camundongos knockout para o gene da NOS-2 (uma das
isoformas da NOS) respondem melhor a vasoconstritores e sobrevivem melhor em
modelos relevantes de sepse (Hollenberg et al., 2000). Há uma grande quantidade
de dados indicando o NO como um mediador-chave em alterações cardíacas,
vasculares, renais e pulmonares da sepse e do choque séptico (por exemplo,
Vincent et al., 2000; Feihl et al., 2001; Iskit e Guc, 2003; Cauwels, 2007).
1.2. Modelos experimentais de sepse
A diversidade de características pré-existentes em cada paciente torna o
desenvolvimento da sepse um processo bastante complexo e heterogêneo entre os
indivíduos afetados. Dada a existência de muitas variáveis para os estudos clínicos,
modelos animais são considerados de suma importância para o entendimento dos
mecanismos fisiopatológicos envolvidos na sepse. Os experimentos em animais têm
contribuído significativamente para a compreensão de muitos aspectos da sepse e
do choque séptico, além de servirem como testes preliminares para novas terapias,
antes das tentativas clínicas (Rittirsch et al., 2007).
O propósito é o emprego de um modelo animal de sepse que reproduza
da maneira mais fiel possível o que acontece com os pacientes afetados, com
redução nas variáveis experimentais intrínsecas. Por questões práticas, a maioria
dos experimentos é realizada em roedores, embora existam pesquisas em cães,
coelhos, primatas e inclusive humanos. Os modelos mais freqüentemente utilizados
são: injeção endovenosa ou intraperitoneal de endotoxinas (LPS) ou patógenos
viáveis (bactérias); ligadura e perfuração do ceco (CLP); e introdução de cateter no
colon ascendente (CASP). Cada um possui características e aplicabilidades
distintas e, obviamente, considerações acerca do modelo escolhido são cruciais à
interpretação dos resultados obtidos.
As injeções de LPS ou de bactérias viáveis são modelos há muito
utilizados devido à simplicidade e alta reprodutibilidade, mimetizando vários efeitos
observados em pacientes sépticos. Porém, esses modelos são muito questionáveis
pelo fato de produzirem respostas muito rapidamente, e não de maneira gradativa,
como ocorre em pacientes (Benjamim, 2001). Apesar de reproduzirem algumas
características reais da sepse humana, esses procedimentos não geram o perfil de
citocinas característico de pacientes afetados pela síndrome (Remick et al., 2000).
Os modelos CLP e CASP envolvem o rompimento de barreiras protetoras
do próprio organismo, criando uma situação de sepse polimicrobial, assemelhando-
se muito ao que acontece na sepse em humanos. No CASP, faz-se a inserção de
um cateter no cólon ascendente do intestino do animal, o que leva a um persistente
extravasamento do conteúdo fecal para a cavidade peritoneal e conseqüente
infecção por bactérias (Maier et al., 2004). A técnica da CLP consiste em
laparotomia seguida de exteriorização do ceco, ligadura não obstrutiva da válvula
ileocecal e então perfuração da porção cecal obstruída. O processo gera
extravasamento do conteúdo cecal para o interior da cavidade peritoneal, o que
estabelece infecção pela flora bacteriana e resposta inflamatória do tecido (Ayala et
al., 2000).
A CLP é um dos modelos de sepse e choque séptico mais amplamente
utilizado. Em relação ao modelo CASP, possui a vantagem de requisitar
procedimentos cirúrgicos bastante simples. Uma característica importante da CLP é
a possibilidade da reprodução de diferentes estágios de complexidade da sepse
(através da variação do número de perfurações no ceco), o que o torna útil para
diferentes fins experimentais (Hubbard et al., 2005).
1.3. Óxido nítrico sintases (NOS)
São conhecidas três principais isoformas de NOS: NOS-1, também
chamada neuronal (nNOS); NOS-2, conhecida como NO-sintase induzida (iNOS); e
NOS-3, ou endotelial (eNOS). As isoformas NOS-1 e NOS-3 são comumente
designadas constitutivas, ao passo que a NOS-2 é considerada a isoforma induzível
da NOS (isto é, somente expressa após estimulação das células). Há discordâncias
em relação a essa nomenclatura, uma vez que o RNA mensageiro da NOS-2 foi
encontrado constitutivamente nos tecidos cardíaco (Cohen et al., 2003) e pulmonar
(Kan et al., 2004). Além disso, NOS-1 e NOS-3 podem ter sua expressão
aumentada em algumas respostas inflamatórias (Boissel et al., 2004; Dekker et al.,
2002). Sugere-se que as três isoformas podem apresentar características induzíveis
ou constitutivas, conforme os diferentes tecidos em que estão expressas (ver
Dudzinki et al, 2006).
A isoforma NOS-1 foi primeiramente descoberta em tecidos neurais, porém
é também encontrada em músculo esquelético, na camada adventícia de alguns
vasos sanguíneos, no epitélio pulmonar, e nos sistemas gastrointestinal e
geniturinário. A NOS-2 foi inicialmente caracterizada em macrófagos ativados, mas
já foi descrita em inúmeros tipos celulares ativados, inclusive monócitos, neutrófilos,
eosinófilos, hepatócitos, células do músculo liso vascular, miócitos, epitélio e células
endoteliais. A NOS-3 foi a enzima originalmente encontrada como responsável pela
produção do fator relaxante derivado do endotélio (Furchgott e Zwadzki, 1980).
Além de expressa em endotélio vascular, encontra-se em plaquetas e
cardiomiócitos (Dudzinki et al, 2006).
Cada uma das três isoformas é produto de um gene distinto, embora
compartilhem cerca de 50 a 60% de seqüência idêntica. A despeito de muitas
similaridades em propriedades químicas e enzimáticas, diferentes propriedades
catalíticas são características que as diferenciam. NOS-1 e NOS-3 são ativadas
pela calmodulina, requerendo concentrações micromolares de cálcio para exercer
atividade catalítica. A NOS-2 é classificada como independente de cálcio, por
necessitar níveis da ordem de nanomolar (100 nM, equivalente ao nível basal
intracelular). Outra diferença é que as enzimas NOS-1 e NOS-3 produzem e liberam
NO em quantidade nanomolar por curto período de tempo (segundos a minutos),
enquanto a NOS-2 o faz em maiores quantidades, em micromolar, durante períodos
mais longos (Alderton et al., 2001).
Quanto ao papel das diferentes isoformas da NOS na sepse, há muitos
estudos abordando a expressão diferencial de NOS-2 em modelos animais (Cunha
et al., 1994; Borutaite et al., 2005; Barth et al., 2006). Até o momento pouco se sabe
da regulação das isoformas constitutivas durante o desenvolvimento da síndrome.
Já foi demonstrado aumento de expressão de NOS-1 e NOS-3 em músculo
esquelético após a injeção de LPS em ratos (El-Dwairi et al., 1998). Animais
knockout para NOS-3 que receberam LPS, em comparação a animais normais
submetidos ao mesmo modelo, tiveram melhora na pressão arterial e menor
mortalidade, além de redução na expressão da NOS-2 em alguns órgãos (Connelly
et al., 2005). Em relação a NOS-1, a inibição ou deleção da enzima causa piora na
mortalidade em animais submetidos ao modelo CLP (Chui et al., 2003).
Apesar de demonstrado que as isoformas constitutivas da NOS possuem
algum papel no desenvolvimento da sepse, ainda há muito para ser esclarecido a
esse respeito. Especialmente no modelo CLP em camundongos, muito utilizado
para estudos pontuais, há carência trabalhos que mostrem o comportamento das
principais isoformas da NOS durante a sepse simultaneamente com a avaliação de
parâmetros de gravidade.
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar, num decurso temporal,
diversos parâmetros bioquímicos e fisiológicos simultaneamente com o perfil de
expressão das três isoformas da enzima óxido nítrico sintase durante a sepse, em
um modelo de ligadura e perfuração do ceco em camundongos.
2.2. Objetivos específicos
Como objetivos específicos, este trabalho propõe-se a avaliar os seguintes
parâmetros em animais sépticos, em diferentes tempos após a realização da CLP:
a) Geração de óxido nítrico e surgimento de alterações hemodinâmicas
b) Ocorrência de lesão orgânica e alterações metabólicas
c) Alterações na permeabilidade vascular em diferentes leitos
d) Perfil de expressão das isoformas da enzima óxido nítrico sintase,
nos tecidos cardíaco e pulmonar.
III. METODOLOGIA
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas com idade entre 3 e 4 meses
(30 - 40 g), fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa
Catarina e mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Farmacologia até o
momento da realização dos experimentos. Os animais foram mantidos em local com
temperatura ambiente controlada (22 ± 2ºC) e ciclo claro/escuro (12/12 h) com livre
acesso a ração e água. Todos os procedimentos realizados foram aprovados pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFSC) e estão de acordo com as
Diretrizes de Cuidados com Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de
Saúde, dos Estados Unidos da América (NIH; EUA).
3.2. Modelo de septicemia por ligadura e perfuração do ceco (CLP)
Os animais foram anestesiados com uma mistura de cetamina/
tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.). Em seguida foram submetidos a uma
laparoscopia com incisão de aproximadamente 1 cm, através da qual o ceco foi
localizado e completamente exposto. Abaixo da válvula íleo-cecal foi feita uma
ligadura não-obstrutiva e, a seguir, o ceco foi perfurado uma única vez de maneira
transfixante com agulha 18G. Após a perfuração, o ceco foi levemente pressionado
para assegurar a saída do conteúdo cecal, e então recolocado na cavidade
abdominal. A musculatura e a pele foram suturadas em uma única camada, com
linha de seda estéril. Imediatamente após a cirurgia, os animais receberam 1 ml de
solução salina (s.c.) para reposição fluídica (Benjamim et al., 2000) e foram
mantidos em ambiente aquecido até a completa recuperação da anestesia (1 a 2
horas). Os animais controle (falso-operados; sham) passaram pelos mesmos
procedimentos, não sofrendo, contudo, ligadura e perfuração no ceco. Os animais
naive não passaram por nenhum procedimento cirúrgico.
3.3. Avaliação da sobrevida
A observação da sobrevida após a cirurgia foi feita por 4 dias. No decorrer
desse período os animais foram mantidos em local com temperatura ambiente
controlada (22 ± 2ºC) e ciclo claro/escuro (12/12 h) com livre acesso a ração e água.
Ao final do período de 4 dias os animais ainda vivos foram sacrificados por inalação
de CO
2
.
3.4. Coleta de sangue e de órgãos
Para coleta das amostras de sangue e órgãos os animais foram
anestesiados com uma mistura de cetamina/tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.).
Adicionalmente, cada animal recebeu 15 UI de heparina por via i.p. Após abertura
da cavidade torácica, aproximadamente 1 ml de sangue foi coletado por punção
cardíaca em tubo contendo fluoreto de sódio, 3 mg/ml de sangue. O sangue
coletado foi então centrifugado por 15 minutos a 3.000 g para separação do plasma.
O plasma e os diferentes órgãos coletados foram imediatamente congelados e
armazenados em freezer -70º C até o momento das análises.
3.5. Dosagens bioquímicas no plasma
3.5.1 Dosagem de glicose
A concentração de glicose no plasma foi determinada através do kit Bioclin
(K082; Belo Horizonte, MG). O kit utiliza uma metodologia na qual a glicose é
oxidada pela enzima glicose-oxidase, com geração de ácido glucônico e peróxido de
hidrogênio. Este último, em presença da enzima peroxidase, reage com 4-
aminoantiprina e fenol, formando um cromógeno avermelhado cuja intensidade de
cor é proporcional à concentração de glicose. Utilizou-se 2 µl de amostra para um
volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas em placas de 96
poços para leitura da absorbância a 550 nm em um leitor de placas. Os valores
foram calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de
glicose.
3.5.2. Dosagem de uréia
A dosagem de uréia no plasma foi determinada através do kit Bioclin (K047,
Belo Horizonte, MG). Basicamente, a uréia é hidrolisada pela enzima urease, com
formação de íons amônio (NH
4
+
) e dióxido de carbono (CO
2
). Em pH alcalino, a
amônia origina um composto esverdeado, cuja intensidade de cor é proporcional à
concentração de uréia na amostra analisada. . Utilizou-se 1 µl de amostra para um
volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas em placas de 96
poços para leitura da absorbância a 630 nm em um leitor de placas. Os valores
foram calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de
uréia.
3.5.3. Dosagem de creatinina
A determinação da concentração de creatinina nas amostras de plasma foi
realizada através do kit Bioclin (K016, Belo Horizonte, MG). Em meio alcalino, a
creatinina reage com o ácido pícrico, formando um complexo de cor amarelo-
avermelhada, que é medido fotometricamente (absorbância a 490 nm). Com adição
de um reagente ácido o pH é diminuído e a cor referente à creatinina é desfeita,
permanecendo apenas a cor devida aos cromogênios, também registrada por
absorbância a 490 nm . Por diferença entre as leituras obtidas no pH alcalino e no
pH ácido obtém-se o valor real da concentração de creatinina nas amostras.
Utilizou-se 20 µl de amostra para um volume final de reação de 200 µl. Os valores
são calculados com base em um fator de calibração e expressos em mg/dl de
creatinina.
3.5.4. Determinação dos níveis de nitrato e nitrito (NO
x
)
A determinação da concentração plasmática de NO
x
foi feita pela redução
enzimática de nitrato para nitrito pela enzima nitrato redutase, conforme descrito
por Granger et al. (1990). Para o ensaio, as amostras de plasma foram diluídas
1:2,5 em água de Milli-Q e desproteinizadas pela adição de sulfato de zinco (20%).
Para conversão de nitrato a nitrito, as amostras foram incubadas a 37ºC durante 2
horas, em presença da enzima nitrato redutase expressa em Escherichia coli
cultivada em meio anaeróbico. Após o período de incubação as amostras foram
centrifugadas para a remoção da bactéria, sendo 100 µl do sobrenadante
misturados com o mesmo volume de reagente de Griess (1% sulfanilamida em 10 %
de ácido fosfórico/0,1% de alfa-naftil-etilenodiamina em água de Milli-Q) em placas
de 96 poços. Foi realizada a leitura da absorbância a 540 nm num leitor de placas.
Nestas condições a conversão de nitrato para nitrito foi maior que 90% e, portanto,
não foi realizada nenhuma correção dos resultados. Os valores foram obtidos por
regressão linear a partir de uma curva-padrão de nitrito e expressos como µM de
NO
x
.
3.5.5. Dosagem da enzima Transaminase Pirúvica (TGP) plasmática
A atividade da TGP plasmática foi mensurada pelo uso do kit Bioclin (K035,
Belo Horizonte, MG). A reação da enzima com seu substrato tem como resultado a
geração de piruvato, que reage formando um composto de cor. Em pH alcalino, a
aintensidade de coloração formada é diretamente proporcional à quantidade de
piruvato, que por sua vez é em função da atividade enzimática. Utilizou-se 5 µl de
amostra para um volume final de reação de 200 µl. As dosagens foram realizadas
em placas de 96 poços para leitura da absorbância a 490 nm em um leitor de
placas. Os valores foram calculados com base em um fator de calibração e
expressos em U/ml de TGP.
3.6. Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) em pulmão
O recrutamento de neutrófilos para o pulmão foi quantificado indiretamente,
através da medida da atividade enzimática da MPO. Os órgãos foram
homogeneizados em solução de tampão fosfato de sódio (80 mM; pH 5,4) contendo
brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB; 0,5 %, p/v). O homogenato resultante foi
então centrifugado (20 min, 10.000 g, 4°C) e o sobrenadante foi utilizado para o
ensaio de determinação da atividade da enzima MPO.
Para o ensaio enzimático foi utilizada uma alíquota de 25 µL do
sobrenadante. A reação enzimática foi desenvolvida na presença de
tetrametilbenzidina (1,6 mM) e H
2
O
2
0,5 mM (em solução tampão fosfato 80 mM; pH
5,4) por 3 minutos em um volume final de 200 µL. A absorbância foi medida em um
leitor de placa a 630 nm (Ultra microplate reader EL 808, Biot-Tek Instruments, INC.,
EUA). A quantidade de proteína total foi estimada pelo método de Bradford e os
valores foram apresentados na forma de unidades de densidade óptica (D.O.) / mg
de proteína.
3.7. Avaliação do extravasamento plasmático
Cada animal recebeu uma injeção intravenosa do corante Azul de Evans
(60 mg/kg) 2 horas antes da coleta dos órgãos de interesse. Nos horários de coleta,
os animais foram previamente exsanguinados através de perfusão. Para isso, uma
agulha de escalpe conectada a um reservatório contendo solução salina (NaCl
0,9%) a 37ºC, mantido a aproximadamente 1 metro de altura, foi inserida no
ventrículo esquerdo do animal. Para possibilitar o escoamento de sangue um
pequeno corte foi feito no átrio direito, de maneira a possibilitar a perfusão completa
do animal. Os órgãos coletados foram cortados em pequenos pedaços e incubados
em solução aquosa de formamida (1/1, v/v) por 48 h a 37°C. A densidade óptica do
sobrenadante foi medida a 630 nm em um espectrofotômetro (modelo U-2001,
Hitachi, Japão) e a concentração de Azul de Evans foi determinada através de
regressão linear, a partir de uma curva com concentrações conhecidas do corante.
Os resultados foram expressos em Azul de Evans (µg/ml) / mg de tecido úmido.
3.8. Avaliação da pressão arterial
Para a medida da pressão arterial, os animais foram anestesiados com uma
mistura de cetamina/ tribromoetanol (25/375 mg/kg; i.p.). Após anestesia, os
camundongos foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica
aquecida (37º C). Em seguida, a artéria carótida esquerda foi localizada e
cuidadosamente separada do nervo vago e dos tecidos adjacentes. O fluxo
sanguíneo da carótida foi interrompido na extremidade distal através de ligadura
com fio de sutura, enquanto que o fluxo da extremidade proximal foi
temporariamente interrompido através de compressão com uma pinça curva. Um
pequeno corte foi realizado na região medial da porção da artéria carótida
clampeada, servindo como via de inserção de um cateter de polietileno (Angiocath,
nº 19), devidamente heparinizado. O catéter foi firmemente amarrado na artéria e
conectado ao transdutor de pressão (Mikro-Tip®, Millar Instruments, Inc., Huston,
Texas, EUA) acoplado a um Powerlab 8/30 (AD Instruments Pty Ltd., Castle Hill,
Austrália). Os valores de pressão arterial média (PAM) foram registrados em um
computador (sistema operacional Windows XP
TM
, Microsoft Corporation, EUA) por
um software de integração Chart5
TM
.
3.9. Imunoeletroforese
3.9.1. Preparação de amostras
Os tecidos foram homogeneizados em tampão mantido a 4ºC, composto
por Hepes 50 mM, MgCl
2
1 mM, EDTA 10 mM e Triton X-100 1% , pH 6,4. No
momento da homogeneização foram adicionados ao tampão os seguintes inibidores
de proteases: aprotinina 2 µg/ml, leupeptina 10 µg/ml, inibidor de tripsina do feijão
de soja (SBTI) 10 µg/ml e PMSF 1 mM. Os homogenatos foram centrifugados a 4ºC
por 40 minutos, 14.000 g. Após a centrifugação, foi coletado o sobrenadante de
cada amostra e deste foi separada uma alíquota para dosagem de proteínas. Ao
restante do sobrenadante, foi adicionado tampão de amostra 5X concentrado
(glicerol 3 M, mercaptoetanol 2 M, SDS 13 mM, NaOH e azul de bromofenol). As
amostras foram fervidas por 5 minutos e permaneceram armazenadas a -20ºC até o
momento do uso. A concentração de proteínas de cada amostra foi determinada
através do método de Bradford (Bradford, 1976).
3.9.2. Separação de proteínas e imunodetecção
As proteínas (75 µg/poço) foram separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Foram utilizados um
gel de separação (acrilamida 8%, bis-acrilamida 0,2%, Tris 375 mM, SDS 0,1%,
TEMED 0,06% e persulfato de amônia 0,04%; pH 8,8) e um gel de entrada
(acrilamida 4%, bis-acrilamida 0,09%, Tris 125 mM, SDS 0,1%, TEMED 0,08% e
persulfato de amônia 0,03%; pH 6,8). A eletroforese foi realizada a 4ºC com corrente
máxima de 25 mA por placa e voltagem fixa de 140 V, por aproximadamente 2
horas e trinta minutos, utilizando-se tampão de corrida composto de glicina 192
mM, Tris 12,5 mM e SDS 1%, numa cuba (Amersham, Buckinghamshire, UK). Após
a eletroforese, os géis foram equilibrados por 15 minutos sob agitação em tampão
de eletrotransferência (tris 48 mM, glicina 39 mM, pH 8,3). Membranas de
polifluoreto de vinilideno (PVDF) foram imersas em metanol 100%, lavadas com
água destilada e também mantidas em tampão de transferência. As proteínas foram
transferidas do gel para a membrana num aparato de eletrotransferência (sistema
semi-dry, Amersham, Buckinghamshire, UK), no sentido do pólo negativo para o
positivo, a uma corrente constante de 0,8 mA/cm
2
de membrana e voltagem máxima
de 15 V. Em seguida as membranas foram coradas (vermelho de Ponceau 0,2%,
ácido tricloroacético 3%) para visualização das proteínas e verificação do conteúdo
total (loading) dos poços. Após lavagens em PBS/Tween (NaCl 137 mM, KCl 2,7
mM, KH
2
PO
4
1,5 mM, Na
2
HPO
4
2H
2
O 20 mM, Tween-20 0,05%) para a retirada do
excesso do corante, iniciou-se o bloqueio de sítios não-ocupados nas membranas.
Para tanto, foi feita uma incubação com PBS contendo leite desnatado 5% por 1
hora a temperatura ambiente e, após lavagens em PBS/Tween, outra incubação de
1 hora em PBS contendo gelatina 2%. Em seguida as membranas foram novamente
lavadas e então incubadas com anticorpos específicos anti-NOS1 (diluído 1:1000
em PBS/Tween), anti-NOS2 (1:500 em PBS/Tween) ou anti-NOS3 (1:1000 em
PBS/Tween) durante a noite a 4ºC. Após lavagens em PBS/Tween as membranas
foram incubadas com anticorpo anti-IgG conjugado com peroxidase (diluído 1:3000
em PBS/Tween) por 1 hora em temperatura ambiente. O excesso de anticorpo foi
retirado através de lavagens em PBS/Tween e PBS para então realizar-se a
revelação através de kit de quimiluminescência (ECL-Amersham®,
Buckinghamshire, UK). As medidas de imunoconteúdo das proteínas de interesse
foram determinadas pela densitometria das bandas, através do programa Scion
Image®.
3.9.3. Stripping de membrana
Para remoção de anticorpos primários as membranas foram incubadas por
30 minutos sob agitação, em temperatura ambiente em uma solução contendo Tris
65 mM, SDS 2% e mercaptoetanol 100 mM, pH 6,8. Posteriormente as membranas
foram lavadas em PBS e seguiram para o bloqueio e imunodetecção com anticorpos
específicos.
3.10. Desenho experimental
A coleta de material para análises foi feita nos seguintes tempos, após a
cirurgia: 6, 12, 24 e 36 horas. Esse protocolo foi o mesmo para animais sham e
sépticos em todos os experimentos realizados, com exceção das medidas de
glicemia e de extravasamento plasmático (onde foram acrescentadas as coletas em
2 e 4 horas após a CLP).
3.11. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA) de uma ou duas
vias, seguida, quando apropriado, pelo teste de Dunnet (comparações com o grupo
controle). Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.
3.12. Compostos e reagentes
As seguintes substâncias foram utilizadas neste estudo: cetamina (Parke
Davis, São Paulo, SP, Brasil); tribromoetanol (Sigma Chemical Co. St Louis, MO,
EUA); heparina sódica (gentilmente cedida por Cristália Produtos Farmacêuticos,
São Paulo, SP, Brasil); fluoreto de sódio (Merck, São Paulo, SP, Brasil); PMSF
(fenilmetanosulfonilfluoreto, Sigma), aprotinina, leupeptina, SBTI, Tween-20, alfa-
naftil-etilenodiamina (Sigma); anticorpos policlonais anti-NOS1, anti-NOS2 e anti-
NOS3 (todos 200 µg/ml, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anticorpo anti-
IgG de coelho (Amersham Biosciences, UK).
IV. RESULTADOS
4.1. Avaliação da sobrevivência de animais submetidos à cirurgia de ligadura e
perfuração do ceco
Os resultados mostrando a sobrevivência dos grupos CLP e sham estão
mostrados na Figura 1. Para a obtenção dos resultados, a observação dos animais
foi feita a cada 12 horas, durante três dias. A morte de 50% dos animais sépticos
aconteceu no tempo médio de dois dias. Ao final do terceiro dia, menos de 25% do
total de animais operados ainda estavam vivos. Nenhum dos animais do grupo
sham morreu durante o período. Além disso, sinais clínicos da instalação do quadro
de sepse (piloereção, sangramento ocular, prostração e atonia muscular) foram
observados apenas em animais CLP.
Figura 1 – Curva de sobrevivência de animais submetidos à CLP. Após a cirurgia e
recuperação da anestesia, os animais foram mantidos com livre acesso a água e ração. Os
animais do grupo sham foram submetidos à anestesia e laparotomia, mas sem ligadura e
perfuração do ceco. Os dois grupos foram observados a cada 12 horas, durante três dias.
Esta é uma curva representativa, construída através da observação de 10 animais por
grupo experimental.
0 12 24 36 48 60 72
0
25
50
75
100
Sham
CLP
Tempo (horas)
Sobrevivência (%)
4.2. Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NO
x
)
Os animais sépticos, já a partir do tempo de 6 horas após a CLP,
apresentaram níveis plasmáticos de NOx bastante elevados em comparação aos
grupos sham e naive. O aumento foi cerca de 4 a 5 vezes os valores basais e essa
condição persistiu até o tempo de 36 horas após a cirurgia. Como os valores obtidos
para animais sham não apresentaram variação entre os diferentes períodos de
tempo, os resultados desses animais foram agregados em um único grupo. O
mesmo foi repetido para os subseqüentes parâmetros analisados. Nenhuma
alteração foi observada nas dosagens plasmáticas de Nox do grupo sham em
relação ao naive (Figura 2).
Figura 2 – Níveis plasmáticos de nitrato + nitrito (NO
x
) em animais naive, sham e
submetidos à CLP. Nos tempos mostrados após a cirurgia, amostras de sangue foram
coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A concentração
plasmática de NO
x
foi determinada por conversão de nitrato a nitrito, seguida da reação de
Griess. Os resultados representam a média ± EPM de 5-8 animais por grupo experimental.
A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via,
seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.
4
.3. Níveis plasmáticos de uréia e creatinina
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
20
40
60
80
100
120
*
*
* *
CLP
NO
x
(
µ
M)
Com o objetivo de avaliar a possível ocorrência de dano renal após a
indução de sepse, foram dosadas as concentrações de creatinina e uréia presentes
no plasma dos animais em estudo. Camundongos submetidos à CLP apresentaram
aumento nos níveis de uréia (Figura 3A) e creatinina (Figura 3B), em comparação
ao grupo de animais naive. Uma elevação significativa nas concentrações
plasmáticas de ambos os metabólitos ocorreu a partir de 12 horas após a realização
da cirurgia. Os níveis de uréia e creatinina permaneceram elevados nos tempos
posteriores, representando, respectivamente, cerca de 3 e 2 vezes os níveis
encontrados em animais naive. O grupo sham não apresentou alterações
significativas.
Figura 3 – Níveis plasmáticos de uréia (A) e creatinina (B) em animais naive, sham e
submetidos a CLP. Nos tempos mostrados após a cirurgia, amostras de sangue foram
coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. As concentrações
plasmáticas de uréia e creatinina foram determinadas por ensaio enzimático colorimétrico.
Os resultados representam a média ± EPM de 5-9 animais por grupo experimental. A
comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via,
seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
25
50
75
100
CLP
*
*
*
Uréia (mg/dl)
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CLP
*
*
*
Creatinina (mg/dl)
B
4.4. Níveis plasmáticos da enzima transaminase pirúvica (TGP)
Em relação ao grupo naive, animais CLP apresentaram aumento nos níveis
plasmáticos da enzima nos tempos de 12 e 24 horas após a cirurgia, retornando aos
níveis basais no tempo de 36 horas (Figura 4).
Figura 4 – Níveis plasmáticos da enzima transaminase hepática (TGP) em animais
naive, sham e submetidos a CLP. Nos tempos mostrados amostras de sangue foram
coletadas por punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A atividade da
TGP plasmática foi determinada por ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados
representam a média ± EPM de 6-7 animais por grupo experimental. A comparação
estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste
de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.
4.5. Concentração plasmática de glicose
Animais sépticos desenvolvem uma profunda hipoglicemia observada a
partir de 6 horas após a cirurgia. Com o objetivo de detectar em que momento
ocorriam alterações da glicemia, foram feitos experimentos com o intuito de avaliar
esse parâmetro em momentos ainda mais iniciais após a indução de sepse.
Conforme mostrado na Figura 5, inicialmente de forma muito precoce há uma
hiperglicemia nos animais operados, seguida de uma queda muito acentuada dos
níveis glicêmicos.
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
50
75
100
125
150
175
200
CLP
*
*
TGP (U/ml)
Figura 5 – Níveis de glicose plasmática em animais naive (N), sham (Sh) e
submetidos à CLP. Nos tempos mostrados, amostras de sangue foram coletadas por
punção cardíaca e centrifugadas para obtenção do plasma. A concentração plasmática
de glicose foi determinada por ensaio enzimático colorimétrico. Os resultados
representam a média ± EPM de 3-8 animais por grupo experimental. A comparação
estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste
de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.
4.6. Medida da temperatura corporal
Através da medida da temperatura em animais sépticos e sham (Figura 6),
pôde-se observar a ocorrência de um período de hipotermia (~34ºC) em animais
CLP, se comparados ao grupo sham (~36ºC). A queda de temperatura ocorreu no
tempo de 24 horas após a realização da cirurgia, sendo que em 36 horas os valores
de temperatura encontrados foram próximos aos normais.
N Sh 2 4 6 12 24 36
0
100
200
300
400
CLP (horas)
*
*
*
* *
*
Glicose (mg/dl)
Figura 6 – Temperatura corporal de animais sham e submetidos a CLP. Após a cirurgia
Figura 7 – Pressão arterial média em animais sham e submetidos a CLP. Após
anestesia, os camundongos foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa
cirúrgica aquecida (35–36º C). A artéria carótida esquerda foi localizada e nela foi inserido
um catéter acoplado a um transdutor de pressão conectado a um equipamento de análise
de pressão arterial. Os resultados representam a média ± EPM de 3-6 animais por grupo
experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância (ANOVA) de
uma via. * p < 0,05, em relação ao grupo sham.
4.8. Atividade de mieloperoxidase no pulmão
O influxo de neutrófilos para o pulmão de animais sépticos foi bastante
elevado, conforme indica a dosagem da atividade da enzima mieloperoxidase
(MPO). Em animais CLP, a atividade da enzima encontra-se aproximadamente 2
vezes maior do que o encontrado em animais naive, nos tempos de 24 e 36 horas
após a cirurgia. Os animais falso-operados não apresentaram aumento signifiativo
na atividade da enzima (Figura 8).
Sham 0,5 h 8 h 16 h
35
45
55
65
75
85
*
CLP
*
PAM (mmHg)
Figura 8 – Dosagem da atividade da enzima MPO em pulmão de animais naive, sham
e submetidos à CLP. Nos tempos mostrados, amostras de pulmão foram coletadas e
imediatamente congeladas. Após homogeneização e centrifugação, foi realizado o ensaio
enzimático colorimétrico. Os resultados representam a média ± EPM de 4-6 animais por
grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da análise de variância
(ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em relação ao grupo naive.
4.9. Extravasamento plasmático
Através do extravasamento do corante Azul de Evans, inferiu-se a
ocorrência de exsudação plasmática em diferentes órgãos (Figura 9). No coração
de animais CLP (Figura 9A) houve uma redução no extravasamento plasmático, em
relação aos animais naive, apenas no tempo de 2 horas após a cirurgia. No pulmão
(Figura 9B) não foram observadas alterações deste parâmetro em nenhum dos
tempos estudados. No baço (Figura 9E) e no rim (Figura 9D) o extravasamento foi
maior em animais operados a partir de 4 horas depois da cirurgia, enquanto que no
fígado (Figura 9C) houve aumento apenas no tempo de 12 horas. No fígado e no
rim, animais sham apresentaram aumento em relação ao grupo naive.
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
CLP
*
*
MPO (D.O./ mg proteína)
Figura 9 – Extravasamento plasmático, medido pela exsudação de Azul de Evans, em
animais naive (N), sham (Sh) e CLP. Azul de Evans foi injetado duas horas antes de cada
4.10. Expressão das isoformas da NOS em pulmão
A quantificação da expressão de NOS-1, NOS-2 e NOS-3, em pulmão está
mostrada nas Figuras 10, 11 e 12, respectivamente. A NOS-1 teve sua expressão
aumentada em animais CLP, em quase duas vezes quando comparada ao grupo
naive, somente nos tempos de 24 e 36 horas após a cirurgia. A expressão de NOS-
2 foi extremamente aumentada em animais CLP, em comparação ao grupo naive. A
quantificação indicou aumento que chega a cerca de 5 vezes, no tempo de 12
horas, diminuindo nos tempos posteriores e retornando aos níveis normais em 36
horas. A expressão de NOS-3 foi significativamente maior em animais CLP, em
relação ao naive, a partir de 6 horas, persistindo esse aumento até 36 horas depois
da cirurgia. O aumento na expressão de NOS-3 foi cerca de 1,5 vezes o valor
encontrado no grupo naive. Os animais sham não apresentaram aumento
significativo na expressão das enzimas. Para melhor comparação, a Figura 13
mostra as variações na expressão das três isoformas da NOS, em mesma escala,
em animais sham e CLP.
Figura 10 – Quantificação da expressão de NOS-1 em pulmão de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
Naive
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
CLP
* *
B
Unidades arbitrárias
Figura 11 – Quantificação da expressão de NOS-2 em pulmão de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-4 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
Naiv
e
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
A
Naive Sham 6h 12h 24h 36h
0
1
2
3
4
5
6
7
CLP
*
*
*
B
Unidades Arbitrárias
Figura 12 – Quantificação da expressão de NOS-3 em pulmão de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
Naive
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0.5
1.0
1.5
2.0
CLP
*
*
*
*
B
Unidades Arbitrárias
Figura 13 – Comparação da expressão de três isoformas da NOS em pulmão de
animais sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de
acrilamida/bis-acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de
PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em
seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por
quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion
Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive,
e representam a média ± EPM de 3-5 animais por grupo experimental.
4.11. Expressão das isoformas da NOS no coração
A NOS-1 (Figura 14) teve sua expressão aumentada em animais CLP, em
cerca de três vezes os valores basais (naive), no tempo de 36 horas após a cirurgia.
A expressão de NOS-2 (Figura 15) no coração de animais CLP aumentou em
aproximadamente 8 vezes no tempo de 6 horas. O nível de expressão de NOS-2
reduz-se nos tempos subseqüentes, chegando a valores próximos aos normais no
tempo de 36 horas. A expressão de NOS-3 (Figura 16) foi também maior em
animais CLP, em relação ao naive, embora em proporções bem menores. Um
aumento significativo na expressão da enzima foi visto em 36 horas, representando
pouco menos de duas vezes o valor encontrado em animais naive. O grupo sham
Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
1
2
3
4
5
6
7
NOS 1
NOS 2
NOS 3
CLP
Unidades Arbitrárias
não apresentou aumento significativo nos níveis de expressão de nenhuma das
isoformas. A Figura 17 mostra a expressão das três isoenzimas em mesma escala,
em animais sham e CLP.
Figura 14 – Quantificação da expressão de NOS-1 em coração de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
1
2
3
4
5
CLP
*
B
Unidades Arbitrárias
Naive
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
Figura 15 – Quantificação da expressão de NOS-2 em coração de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
Naive
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
2
4
6
8
10
12
CLP
*
*
B
Unidades Arbitrárias
Figura 16 – Quantificação da expressão de NOS-3 em coração de animais naive, sham
e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de acrilamida/bis-
acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de PVDF. Após o
bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em seguida com
anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por quimioluminescência
e a densitometria das bandas medida através do programa Scion Image®. Os resultados
estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive, e representam a média
± EPM de 3-5 animais por grupo experimental. A comparação estatística foi feita através da
análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida do teste de Dunnet. *p < 0,05, em
relação ao grupo naive.
Naive
Sham
6 h
12 h
24 h
36 h
CLP
A
Naive Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
CLP
*
B
Unidades arbitrárias
Figura 17 – Comparação da expressão de três isoformas da NOS em coração de
animais sham e submetidos à CLP. As proteínas (75 µg) foram separadas em gel de
acrilamida/bis-acrilamida 8% (SDS-PAGE) e eletrotransferidas para uma membrana de
PVDF. Após o bloqueio as membranas foram incubadas com anticorpos específicos e em
seguida com anticorpo secundário conjugado à peroxidase. A revelação foi feita por
quimioluminescência e a densitometria das bandas medida através do programa Scion
Image®. Os resultados estão expressos em vezes de aumento em relação ao grupo naive,
e representam a média ± EPM de 3-5 animais por grupo experimental.
Sham 6 h 12 h 24 h 36 h
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NOS1
NOS2
NOS3
CLP
Unidades Arbitrárias
V. DISCUSSÃO
A descrição original do modelo CLP data do ano de 1980, por Wichterman
e colaboradores, que observaram que ratos submetidos a esta cirurgia mostravam
presença de progressiva bacteremia, febre, metabolismo acelerado e alterações no
fluxo sanguíneo, comparáveis às características encontradas em humanos sépticos
(Wichterman
et al.,
1980). Desde então este modelo vem sendo extensamente
utilizado e atualmente representa a melhor simulação experimental do quadro de
sepse humana (Parker e Watkins, 2001;
Hubbard et al., 2005
).
O número de variáveis intrínsecas desse modelo é consideravelmente
grande. Embora o resultado final da condição possa ser idêntico, é muito difícil a
comparação entre resultados experimentais de diferentes laboratórios. Isso é
evidenciado pelas variáveis taxas de mortalidade em experimentos realizados em
por experimentadores diferentes, mesmo seguindo as mesmas técnicas. Por
exemplo, a quantidade de conteúdo cecal extravasada é muito difícil de ser
controlada e padronizada entre diferentes estudos, contribuindo para a variabilidade
na severidade da sepse (Buras
et al.,
2005).
Uma crítica óbvia ao desenho experimental aqui desenvolvido é o fato de
que os diversos parâmetros não podem ser avaliados no mesmo animal. Como é
visível a partir da curva de sobrevivência, com 24 horas começam a aparecer os
primeiros óbitos. Portanto, a partir desse tempo de análise, começa a ocorrer um
processo de seleção dos sobreviventes, ainda que sutil. Isso deve ser considerado
para interpretação de todos os resultados.
A observação da mortalidade e dos elevados níveis plasmáticos de NO
x
em animais submetidos à CLP foram os primeiros indícios do estabelecimento de
um quadro de sepse experimental no modelo aqui escolhido. É importante a
observação de que os altos níveis de NO
x
medidos em 12 horas após a cirurgia, são
aproximadamente os mesmos em 24 e 36 horas, quando já há cerca de 25% de
mortalidade entre os animais. Mesmo que estejamos realizando uma seleção, os
sobreviventes até esse momento estão com alta produção de NO. Esse fato foi a
principal razão para a escolha destes momentos mais tardios para a análise dos
demais parâmetros.
Clinicamente, a disfunção orgânica ocorre nos pacientes em estado grave,
onde a homeostasia não pode mais ser mantida sem intervenções. Quanto maior o
número de órgãos afetados, maior a probabilidade de morte, sendo que a presença
de quatro ou mais disfunções associa-se a 100% de óbito (Andrade
et al.,
2006).
Em camundongos CLP, a dosagem de parâmetros bioquímicos no plasma revelou
indícios da ocorrência de disfunção orgânica no quadro séptico induzido nesses
animais. O aumento das concentrações de uréia e creatinina é sinal de
comprometimento da função renal, enquanto que os maiores níveis de TGP indicam
deterioração na função hepática. É importante observar que os níveis aumentados
de uréia e creatinina persistem até o tempo de 36 h
sistema imunológico, os neutrófilos têm importância crucial na defesa do hospedeiro
contra os agentes infecciosos durante a sepse. Entretanto, uma ativação
exacerbada dessas células, com liberação de enzimas proteolíticas, espécies
reativas de oxigênio e citocinas pró-inflamatórias em grande quantidade, causa
dano aos tecidos locais e pode culminar na disfunção orgânica. Durante a sepse, a
ativação sistêmica de neutrófilos e acúmulo dessas células aderidas à parede dos
microvasos pode ser um elemento-chave para a hipoperfusão e hipóxia teciduais,
com conseqüente lesão orgânica (Brown
et al.,
2006).
A mieloperoxidase (MPO) é a proteína mais abundante presente no interior
dos neutrófilos, representando cerca de 5% do conteúdo protéico total dessas
células (Klebanoff, 2005). Possui atividade catalítica fundamental ao combate a
microrganismos invasores. Sua liberação a partir dos grânulos intracelulares para o
exterior da célula é muito nociva aos tecidos, por produzir grandes quantidades de
produtos oxidantes e altamente reativos (Haegens
et al.,
2008). A dosagem da
enzima MPO em pulmão representa uma medida indireta do recrutamento de
neutrófilos para o órgão. Os níveis da enzima em animais CLP apresentaram
discreto aumento em relação ao grupo
naive
, indicando resposta inflamatória
neutrofílica e lesão tecidual no pulmão em conseqüência à indução de sepse.
Pacientes em sepse severa geralmente apresentam hiperglicemia em
comparação a indivíduos saudáveis (Revelly
et al.,
2005). Na prática clínica é
observado que pacientes sépticos são resistentes à insulina, exibindo aumento de
produção de glicose pelo fígado e reduzida utilização pelos tecidos (Rusavy
et al.,
2004). Estudos utilizando o modelo CLP em ratos demonstraram a ocorrência de
duas fases na resposta glicêmica do organismo em conseqüência à cirurgia, um
período inicial hiperglicêmico, seguido de hipoglicemia em momentos mais tardios
(Maitra
et al.,
2000). Outros trabalhos reportaram apenas hipoglicemia em ratos
submetidos à CLP, embora não descartando a possibilidade de ocorrência de fase
hiperglicêmica inicial não detectada (Heuer
et al.
2004; Brooks
et al.,
2007).
Experimentos realizados em camundongos em choque séptico ou endotóxico são
geralmente estudos pontuais, não havendo ainda trabalhos mostrando o curso
temporal da resposta glicêmica durante a sepse nesses animais. Mesmo assim, há
demonstrações de hipoglicemia em camundongos após 6 horas da injeção de LPS
(Kane
et al.,
2006).
Nossos experimentos revelaram a ocorrência de duas fases glicêmicas
bem definidas. Primeiramente houve rápido período hiperglicêmico, logo após a
CLP, seguido de profunda hipoglicemia, persistente até o tempo de 36 horas. Esse
resultado evidencia a velocidade com que as alterações bioquímicas acontecem no
modelo CLP em camundongos realizado em nosso estudo. Até o momento da
realização das dosagens de glicose os resultados encontrados sugeriram um curso
de tempo relativamente lento, conforme freqüentemente suposto para ratos
submetidos a esse modelo (Buras
et al.,
2005). Porém, com uma elevação tão
grande nos níveis de glicose em momentos ainda muito iniciais da sepse, passamos
a considerar que o estabelecimento da doença parece estar ocorrendo de maneira
bastante rápida.
As características bioquímicas até aqui analisadas permitem um primeiro
vislumbre de como está o cenário de sepse experimental induzido neste estudo.
Numa linha temporal, a primeira alteração observada é o aumento nos níveis de
glicose sanguíneos. Em 6 horas, juntamente com uma profunda queda na glicemia,
as concentrações plasmáticas de NO
x
estão elevadas. Além disso, aumentam os
níveis de uréia, creatinina e TGP plasmáticos, indí
falência orgânica. De maneira um pouco mais tardia, verifica-se o aumento na
dosagem de MPO no pulmão, provavelmente um indício de lesão orgânica
conseqüente à resposta inflamatória exagerada. O Esquema 1 resume os principais
acontecimentos encontrados até esse momento da nossa investigação.
NO
x
L es ão orgânica
MPO (pulmão)
G licemia
T E MP O AP ÓS A C LP (H OR AS )
INT E NS IDA D E S R E L A T IVAS
(Unidades A rbitrárias )
2
4
6
12
24
36
0
NO
x
L es ão orgânica
MPO (pulmão)
G licemia
T E MP O AP ÓS A C LP (H OR AS )
INT E NS IDA D E S R E L A T IVAS
(Unidades A rbitrárias )
2
4
6
12
24
36
0
2
4
6
12
24
36
0
Esquema
1. Decurso temporal das alterações fisiológicas durante a sepse
induzida pela CLP em camundongos (especulativo).
A linha pontilhada indica os níveis
de animais normais, isto é, sem nenhuma manipulação. Logo após o estímulo ocorre
elevação na concentração de glicose no sangue. Em 6 horas, juntamente com uma
profunda queda na glicemia, elevam-se os níveis plasmáticos de NO
x
. Em seguida surgem
indícios de lesão orgânica e, por último, aumento na dosagem de MPO em pulmão. Juntas,
essas informações caracterizam parcialmente o cenário de sepse experimental em
camundongos criado através do modelo de CLP.
Cerca de 13 a 25% dos pacientes com sepse apresentam hipotermia, e
isso está associado a aumento na mortalidade (Arons
et al.,
1999; Bernard
et al.,
1997; Peres-Bota
et al.,
2004). A queda de temperatura dos animais sépticos
detectada no tempo de 24 horas após a CLP é possivelmente um reflexo do estado
hipodinâmico dos camundongos. Além de sugerir um grave colapso cardiovascular,
vários autores mostraram que a hipotermia reduz a resposta imune e aumenta a
incidência de complicações relacionadas à infecção (Remick e Xioa, 2006). Além
disso, o aumento da temperatura corporal é importante para induzir a expressão de
heat shock proteins
(HSP), que por sua vez previnem algumas disfunções durante a
sepse (Ribeiro
et al.,
1994). A reversão da hipotermia para uma temperatura normal
em 36 horas pode ser outro reflexo da evolução da doença para quadros diferentes
em cada indivíduo. Provavelmente os animais com temperatura muito baixa não
sobreviveram, restando uma maioria de animais com temperatura corpórea normal.
A diminuição na resistência vascular sistêmica é característica típica do
choque séptico, e um grande fator causador de hipotensão nessa condição. A
persistente perda no tônus vascular periférico seguida da hiporeatividade a agentes
vasoconstritores é uma característica determinante da mortalidade em pacientes
sépticos (O`Brien
et al.,
2007). A observação de queda na PAM dos animais CLP já
em 30 minutos após realização da cirurgia mostra que alterações hemodinâmicas
ocorreram muito precocemente nesse modelo. Por não sabermos a respeito da
reatividade vascular desses animais, não podemos seguramente classificá-los
quanto ao estágio de desenvolvimento da doença, porém os dados de PAM
sugerem uma grande severidade do modelo aqui utilizado. Os registros obtidos em
16 horas podem ser um reflexo da instalação muito rápida das alterações
cardiovasculares em camundongos pelo modelo CLP. Uma situação de grande
severidade logo no início de seu desenvolvimento faz com que os animais com
piores condições cardiovasculares tenham uma morte mais precoce, sobrevivendo
um grupo de animais cuja maioria tem valores normais de PAM.
Uma das principais características da sepse que é responsável por levar à
falência de múltiplos órgãos é a disfunção microvascular, na qual o dano endotelial
parece ter papel central. Componentes dos microorganismos invasores interagem
diretamente com receptores na superfície endotelial, ativando padrões de
reconhecimento (Henneke e Golenbock, 2002) que induzem a liberação de muitos
mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas e fatores do complemento) que
também ativam as células endoteliais. O endotélio responde a estes estímulos com
modificações estruturais e funcionais, que têm
como uma das principais
conseqüências
o aumento na permeabilidade vascular. Este é um evento muito
importante durante a sepse, por resultar no extravasamento de líquidos e proteínas
plasmáticas, com conseqüente formação de edema tecidual. Mais ainda, a
passagem de fluidos para o espaço extravascular contribui para a hipovolemia e
hipotensão, características desta síndrome (Bateman
et al.,
2003; Schouten
et al.,
2007).
Os dados obtidos neste estudo através da medida do extravasamento do
corante Azul de Evans em diferentes órgãos foram bastante intrigantes. No pulmão,
embora evidenciado a ocorrência de processo inflamatório através da maior
migração de neutrófilos para o local, nenhum aumento de permeabilidade vascular
foi observado. Entretanto, o extravasamento de líquido vascular no pulmão é algo
bem descrito na literatura e evidenciado na clínica pela relação direta com o
aumento na taxa de mortalidade dos pacientes sépticos afetados (Martin
et al.,
2005). A explicação para essa diferença pode ser o fato de somente termos
avaliado o extravasamento de corante para o tecido pulmonar, e não à cavidade
broncoalveolar. Mesmo havendo aumento de permeabilidade vascular no pulmão
dos camundongos sépticos, as proteínas extravasadas podem cair na cavidade, o
que explicaria a falta de detecção pela metodologia aqui utilizada. Uma resposta a
essa questão seria obtida através da realização de um lavado broncoalveolar, onde
poderia ser detectada ou não a presença do corante.
No coração também não foi observado aumento de extravasamento
plasmático, embora esteja demonstrada a ocorrência de reação inflamatória
relevante nesse órgão, bem como a existência de edema miocárdico durante a
sepse (Iwase
et al.,
2001; Chagnon
et al.,
2005). Possivelmente o quadro séptico
induzido em camundongos neste trabalho não foi capaz de provocar esse efeito, ou
apenas não houve detecção pela metodologia empregada. Porém, a redução na
quantidade de corante extravasado ocorrida 2 horas após a CLP pode ser o reflexo
de uma hipoperfusão cardíaca, devido à vasoconstrição das artérias coronárias.
Menor quantidade de sangue circulante significa menos corante extravasado. Kane
e colaboradores (2006) evidenciaram a importância de adequada perfusão
miocárdica para manutenção da atividade cardíaca durante o choque séptico. A má
perfusão cardíaca leva à lesão isquêmica do coração, em última instância
resultando em maior susceptibilidade à falência de órgãos e maior mortalidade
(Kane
et al.,
2006).
Além dos motivos já expostos, devemos considerar que o fato de não
termos encontrado aumento de extravasamento nesses dois órgãos pode ser devido
à ocorrência de um aumento de permeabilidade vascular em períodos diferentes
daqueles avaliados. Além disso, existe a possibilidade do extravasamento ocorrido
nesses leitos ser relativamente pequeno, e por isso compensado por uma drenagem
linfática rápida. De qualquer forma, a escassez de estudos feitos com sepse em
camundongos limita a comparação de resultados, e por isso não encontramos uma
explicação satisfatória.
Dos cinco órgãos avaliados, o rim apresentou o maior aumento de
extravasamento vascular em animais sépticos. Mais ainda, esse aumento persistiu
até o tempo de 36 horas após a CLP, o que é absolutamente comparável à
elevação persistente nos níveis plasmáticos de uréia e creatinina. O dano vascular
renal provavelmente é responsável por prejudicar o funcionamento desse órgão.
Esse resultado tem enorme significância para a caracterização fisiopatológica de um
quadro de sepse, dada a importância da manutenção da função renal para a
sobrevivência dos indivíduos sépticos (Schrier
et al.,
2004).
Do mesmo modo, houve progressivo aumento de extravasamento vascular
no baço ao longo do tempo após realização da CLP, porém em proporções menores
do que o observado no leito vascular renal. Embora a investigação do curso
temporal desse evento seja inédita, já está demonstrado o extravasamento
plasmático no baço em resposta ao LPS, com a sugestão de que seria esse um dos
principais motivos da queda inicial do volume de sangue circulante no choque
endotóxico (Andrew
et al.,
2000).
No fígado foi detectado aumento de extravasamento plasmático em
animais sépticos apenas em 12 horas após a cirurgia, havendo retorno aos valores
basais nos tempos posteriores. De maneira coerente com as dosagens de TGP, há
sinais de dano hepático reversível em camundongos submetidos à CLP. De fato,
acredita-se que a falência na micro-circulação hepática seja um importante
componente responsável pelo prejuízo na função desse órgão (Hwang e Han,
2003).
Animais falso-operados (
sham
) apresentaram aumento de extravasamento
plasmático no rim e no fígado. Isso mostra que embora não ocorra aumento na
produção de NO, esses animais apresentam uma considerável resposta inflamatória
induzida pelo procedimento “falso-operado”. Esses resultados também mostram a
importância de um grupo controle adequado às diferentes situações de sepse
experimental. Por exemplo, o grupo
sham
não seria um bom controle para alguns
parâmetros avaliados neste estudo, certamente havendo diferentes interpretações
nos resultados no caso desse grupo ter sido considerado como referência.
Uma análise geral dos dados de extravasamento plasmático revela um
comportamento diferente para cada órgão ao longo do desenvolvimento do quadro
de sepse. Isso pode ser interpretado como uma evidência da complexidade da
condição e conseqüente dificuldade do tratamento. O mesmo parâmetro é diferente
em cada órgão durante o mesmo intervalo de tempo. Isso significa que uma
intervenção farmacológica pode melhorar o funcionamento de um sistema orgânico
e ao mesmo tempo comprometer a atividade de outro.
Geralmente as reações inflamatórias estão associadas ao aumento de
expressão da NOS-2 e conseqüentemente elevada produção de NO (Lirk
et al.,
2002). Está bem estabelecido que a indução da expressão dessa enzima ocorre de
maneira transitória, tendo um pico de expressão e sendo então degradada (El-
Dwairi
et al.,
1998). Nesse sentido, há sugestões e algumas evidências de que em
modelos animais de sepse a enzima pode ter papel importante apenas no início do
curso da doença, e não em estágios mais avançados (Gocan
et al
., 2000; McKinnon
et al.,
2006).
O perfil de expressão da NOS-2 em pulmão de camundongos ao longo do
tempo na sepse está concordante ao que já foi demonstrado em ratos submetidos
ao modelo CLP (Okamoto
et al.,
2000), a não ser pelo curso temporal um pouco
mais acelerado. O resultado em coração é inédito e mostra ocorrência antecipada
do pico de expressão da enzima, se comparado ao que ocorre no pulmão. Pode-se
observar ainda que o decaimento na quantidade de proteína em coração ocorre de
maneira mais lenta, quando em comparação ao observado em pulmão. De qualquer
forma, em ambos os órgãos o nível máximo de expressão da NOS-2 acontece em
tempos bastante iniciais (6h – 12h), momentos estes em que se iniciam eventos
fisiológicos importantes, como dano tecidual e hipoglicemia profunda. De maneira
muito interessante, essas alterações orgânicas são mantidas mesmo após a
diminuição nos níveis da enzima. Esse resultado é compatível com as sugestões de
que a NOS-2 teria um papel importante para desencadear o início da resposta
inflamatória na sepse, mas não uma participação relevante durante o posterior
desenvolvimento da doença.
Os altos níveis plasmáticos de NO
x
mantidos mesmo após diminuição no
nível de expressão da NOS-2 deram origem a uma importante questão: seriam as
isoformas constitutivas da NOS as responsáveis pela produção de NO em
momentos mais tardios no curso da sepse? Apesar de alguns estudos, pouco se
pode afirmar a respeito da regulação na expressão de NOS-1 e NOS-3 durante a
síndrome. Já foi demonstrado aumento de expressão de NOS-1 e NOS-3 em
músculo esquelético após a injeção de LPS em ratos (El-Dwairi
et al.,
1998). Além
disso, foi descrito que em modelo CLP a NOS-3 tem sua expressão diminuída em
aorta torácica de ratos (Scott
et al.,
2002). Mais recentemente, Lidington e
colaboradores (2006) mostraram que, em músculo esquelético de camundongos 24
horas após a CLP, não havia modificações nos níveis de expressão de nenhuma
das isoformas constitutivas da NOS (Lidington
et al.,
2006). Ou seja, os resultados
são diferentes conforme o modelo empregado e os tecidos estudados, sendo ainda
necessários muitos estudos para que se encontre uma resposta satisfatória a essa
questão.
Neste trabalho, tanto no tecido pulmonar como no músculo cardíaco a
expressão de NOS-1 e NOS-3 aumentou após a CLP. A elevação sustentada dos
níveis das isoformas constitutivas mesmo após a queda na quantidade protéica de
NOS-2 é um resultado inédito e extremamente relevante para a caracterização do
modelo de CLP em camundongos. Esse aumento pode parecer pequeno quando
em comparação à indução da NOS-2, porém representa um novo caminho para a
compreensão da origem das alterações fisiológicas mediadas pelo NO ocorridas
tardiamente após a indução de sepse.
Considerando que esses resultados respondam à questão a respeito da
geração de NO em momentos mais tardios após a indução de sepse, abrem-se
novos questionamentos acerca do assunto. Por exemplo, qual será o papel
desempenhado pelo NO gerado por essas isoformas tardiamente expressas na
sepse? A expressão aumentada dessas enzimas pode representar uma tentativa de
proteção, assim como também pode significar a proximidade da morte desses
animais. Isto é, o NO gerado nesses tempos tardios pode ser benéfico ou maléfico
ao destino dos animais sépticos. Mais estudos serão necessários a respeito de
quais as implicações do aumento dos níveis protéicos dessas duas isoformas de
NOS na sepse, para que se responda a essa pergunta.
Por fim, temos parcialmente caracterizado um cenário de sepse
experimental em camundongos, criado através do modelo CLP, com alterações
fisiopatológicas registradas em diferentes períodos de tempo após a realização da
cirurgia. A grande aplicabilidade de um estudo deste tipo é o conhecimento, ainda
que parcial, da condição fisiológica do animal séptico em um determinado tempo
durante o desenvolvimento da sepse. A escolha de um estágio de tempo específico
para intervenções farmacológicas deve considerar os diferentes momentos em que
ocorrem os principais eventos fisiopatológicos, e para isso torna-se imprescindível a
caracterização do curso temporal de evolução da sepse no modelo experimental
escolhido.
VI. CONCLUSÕES
Os resultados aqui apresentados conduzem às seguintes conclusões, a
respeito do modelo de CLP em camundongos:
•
Há rápido estabelecimento de alterações hemodinâmicas e metabólicas após
a CLP.
•
Surgem lesões em diferentes sistemas orgânicos, indicando falência de
múltiplos órgãos.
•
Há danos à microcirculação em diferentes leitos vasculares.
•
Aumenta a expressão das isoformas NOS-1 e NOS-3, mantendo-se em
níveis elevados até momentos mais tardios após a indução de sepse.
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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