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FICHA CATALOGRÁFICA
Melo, Lidervan de Paula
Avaliação da fase extratora polidimetilsiloxano/polipirrol nas
análises de antidepressivos em amostras de plasma, através das técnicas:
extração sortiva em barra de agitação e cromatografia líquida.
Ribeirão Preto, 2007.
140 p.30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área:
Química
Orientadora: Queiroz, Maria Eugênia Costa
1. extração sortiva em barra de agitação 2. PDMS/PPY 3.
cromatografia líquida 4.antidepressivos
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Avaliação da fase extratora polidimetilsiloxano/polipirrol nas análises de
antidepressivos em amostras de plasma, através das técnicas: extração
sortiva em barra de agitação e cromatografia líquida.
Lidervan de Paula Melo
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Maria Eugênia Costa Queiroz
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para a obtenção do
título de Mestre em Ciências, Área: Química
RIBEIRÃO PRETO - SP
2007
ads:
Quero dedicar este trabalho a duas pessoas
maravilhosas, amigas e que são tudo na minha vida, os
quais sempre me incentivaram a seguir o caminho dos
estudos.
Lúcia de Fátima Melo (minha mãe)
e
José do Nascimento de Melo (meu pai)
“O senhor é meu pastor
e nada me faltará”
Salmo; 91.
AGRADECIMENTOS
¾ À Prof
a
. Dr
a
. Maria Eugênia Queiroz Nassur, por me
conceder a oportunidade de realizar este trabalho,
pelos seus valiosos ensinamentos e orientação.
¾ Ao Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças do Instituto
de Química de São Carlos/USP, por sua colaboração no
desenvolvimento da barra SBSE.
¾ À Prof
a
. Dr
a
. Regina Helena Costa Queiroz da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
USP, pela doação das amostras de plasma.
¾ Aos amigos do laboratório de cromatografia:
Andréa, Bruno, Fernanda e Ariane. Pela amizade durante
todos os momentos e trocas de conhecimentos.
¾ Aos estimados e valiosos amigos: Denis Renato de
Oliveira, Francisco Ferrarini e Adriana de Oliveira
pelo apoio e amizade.
¾ Aos amigos da casa de Pós-graduação da USP:
Ricardo (Ric), Ricardo (Bahia), Grace Kelly, Vânia,
Fabrício, Camilo, Fernando, Jaqueline, Silvania,
Douglas, Gláucia, Juliana.
¾ Às agências de fomento: CAPES E FAPESP, pelo
suporte financeiro.
RESUMO
A monitorização terapêutica tem sido descrita como valioso recurso
clínico, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a
concentração do fármaco e/ou de seus produtos de biotransformação, em
amostras de plasma ou soro, coletadas com base no contexto clínico e nos
princípios da farmacocinética. Em razão da complexidade dos fluidos biológicos
e da baixa concentração dos fármacos nestas matrizes, a etapa de preparo de
amostra, extração, pré-concentração dos analitos e eliminação dos
interferentes, têm sido requerida para o desenvolvimento de métodos
cromatográficos com alta sensibilidade e seletividade analítica.
A extração sortiva em barra de agitação (SBSE), recente técnica de
preparo de amostra, baseia-se no de equilíbrio de sorção do analito entre as
fases: extratora (polidimetilsiloxano) e amostra aquosa. A fase extratora PDMS
é a única disponível no mercado, o que tem limitado a sensibilidade e a
seletividade analítica da técnica SBSE. O uso de polipirrol (PPY) como fase
extratora está relacionado às diferentes interações de seus grupos funcionais
(hidrofóbica, π-π, com o grupo funcional polar, troca iônica, ácido-básica,
dipolo-dipolo e dipolo induzido-dipolo.) com os analitos. Neste trabalho, uma
nova fase extratora SBSE, com o revestimento misto PDMS/PPY foi avaliada
para análises de antidepressivos em amostras de plasma, por cromatografia
líquida de alta eficiência.
A otimização das variáveis SBSE: tempo e temperatura de extração,
tempo de dessorção e pH da matriz biológica, baseada no equilíbrio de sorção
dos analitos entre as fases: polimérica (PDMS/PPY) e fluido biológico, permitiu
a determinação dos analitos em concentrações plasmáticas que contemplam o
intervalo terapêutico.
A presença de estrutura porosa (PPY) e não porosa (PDMS) na
superfície polimérica da barra extratora SBSE-PDMS/PPY foi confirmada
através de análises por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). De acordo,
com os resultados obtidos nas análises de MEV e nas análises (individuais e
simultâneas) de amostras de plasma enriquecidas com os analitos, os
mecanismos de retenção dos fármacos junto à superfície PDMS/PPY
ocorreram através dos processos de adsorção (PPY) e absorção (PDMS).
A validação analítica foi realizada segundo as normas da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária. O método padronizado apresentou linearidade
no intervalo de concentração plasmática que variou dos limites de quantificação
a 500 ng mL
-1
, coeficientes de determinação maiores que 0,994, precisão inter
ensaios com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão de 96% a
106%. Os valores de limites de quantificação obtidos são congruentes com a
menor concentração plasmática do intervalo terapêutico preconizado.
O método SBSE-PDMS/PPY padronizado e validado foi utilizado para
determinações dos antidepressivos, sertralina, duloxetina e fluoxetina em
amostras de plasma de pacientes, em terapia com estes fármacos. Desta
forma, o método SBSE-PDMS/PPY poderá ser empregado para fins de
monitorização terapêutica.
SUMMARY
Therapeutic drug monitoring has been described a valuable clinical
resource for the customization of the dosage regimen, in accordance with the
drug concentration and/or its biotransformation products, in of plasma or serum
samples, collected on the basis of clinical context and pharmacokinetics
principles. Due the complexity of biological fluids and the low concentration of
the drug in to these matrices, the stage of sample preparation, extraction, pre-
concentration of the analytes and elimination of the interferents has been
required for the development of chromatographic methods with high sensitivity
and analytical selectivity.
The stir bar sorptive extraction (SBSE), a recent sample preparation
technique, is based on the sorption equilibrium of the analytes between the:
polydimethylsiloxane (PDMS) and aqueous phases. PDMS is the only
commercially available extraction phase (SBSE), which has limited the
analytical sensitivity and the selectivity of the technique SBSE. The use of
polypyrrole (PPY) as extraction phase is related to the different interactions of
its functional groups (π-π interactions, interactions from polar groups, acid-base,
dipole-dipole, dipole-induced-dipole) and the analytes. In this work, a new
SBSE extraction phase, with a PDMS/PPY coating was evaluated for the
analysis of antidepressants in plasma samples by High Performance Liquid
Chromatography.
The optimization of the SBSE variables extraction time and temperature,
dessorption time and pH of the biological matrix based on the sorption
equilibrium of the analytes between the polymeric (PDMS/PPY) and biological
fluid phases, allowed determination of the analytes in plasmatic concentrations
that correspond to the therapeutic interval.
The presence of a porous structure (PPY), and not porous (PDMS), on
the polymeric surface of SBSE-PDMS/PPY was confirmed by Scanning
Electron Microscopy (SEM) analyses. In agreement with the results obtained by
SEM analyses and individual and simultaneous analyses of the plasma samples
spiked with the analytes, the mechanisms of drugs retention on the surface of
PDMS/PPY occur through adsorption (PPY) and absorption (PDMS).
Analytical validation was carried through according to the norms of the
National Agency of Sanitary Vigilance. The standardized method presented
linearity in the plasmatic interval concentrations that varied from the limits of
quantification to 500 ng mL
-1
, the determination coefficients were higher than
0.994, inter precision assays with coefficients of variation lower than 15%, and
accuracy from 96% to 106%. The quantification value limits were in agreement
with the lowest plasmatic concentration of the established therapeutical interval.
The d standardized and validated SBSE-PDMS/PPY method was used
for determination of sertraline, duloxetine and fluoxetine in plasma patient
samples under therapy with these drugs. Thus, the SBSE-PDMS/PPY method
could be used for therapeutic drug monitoring.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Mecanismo de ação dos antidepressivos.................................................
3
Figura 2:
Estruturas química dos antidepressivos ISRSs: (a) citalopram, (b)
sertralina, (c) fluoxetina e (d) paroxetina..................................................
5
Figura 3:
Estrutura química da mirtazapina.............................................................
6
Figura 4:
Estrutura química da duloxetina................................................................
7
Figura 5:
Etapas de extração líquido-líquido............................................................
10
Figura 6:
Cartuchos de extração em fase sólida....................................................
12
Figura 7:
Representação esquemática do aparato SPME. .................................
13
Figura 8:
(a) Extração SPME, (b) dessorção térmica SPME para análise por GC,
(c) dessorção utilizando a interface do LC.........................................
14
Figura 9:
Interface SPME-LC: a) modo estático e b) modo dinâmico. ...............
15
Figura 10:
Processo de dessorção “off line” SPME...................................................
16
Figura 11:
Barra de extração sortiva com revestimento PDMS.................................
19
Figura 12:
Estrutura química do polidimetilsiloxano (PDMS).....................................
20
Figura 13:
Processo de extração SBSE.....................................................................
21
Figura 14:
(a) dessorção térmica, (b) dessorção líquida............................................
22
Figura 15:
Taxa de recuperação dos analitos em função do coeficiente de partição
octanol-água (K
o/w
) para as técnicas, SPME (10 mL amostra, fibra
PDMS, 100 µm de espessura) e SBSE (10 mL amostra, camada de
PDMS 10 mm x 0,5 mm)..........................................................................
25
Figura 16:
Partículas RAM.........................................................................................
33
Figura 17:
Cadeia polimérica de Polipirrol..................................................................
35
Figura 18:
Mecanismo de extração, absorção e adsorção.......................................
37
Figura 19:
Estrutura química das fases estacionárias: (a) monomérica e (b)
polimérica..................................................................................................
42
Figura 20:
Célula do detector de ultravioleta.............................................................
44
Figura 21:
Detector de UV de comprimento de onda variável....................................
45
Figura 22:
Esquema de um detector de rede de diodos............................................
46
Figura 23:
Barra SBSE revestida com PDMS/PPY....................................................
55
Figura 24:
Cromatograma referente à análise da solução padrão dos
antidepressivos (500 ng mL
-1
): 1- mirtazapina, 2 - citalopram, 3 -
paroxetina, 4 - duloxetina, 5 - fluoxetina, 6 - sertralina e 7 –
clomipramina (P.I.). (a) fase móvel: solução tampão acetato (0,25 molL
-
1
, pH 4,5): acetonitrila:metanol (60:37:3, v/v/v). (b) fase móvel: solução
tampão fosfato 0,05 mol L
-1
, pH = 3,8 e acetonitrila (53:47 v/v) ..............
66
Figura 25:
Estrutura química da clomipramina..........................................................
69
Figura 26:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
mirtazapina.............................................................................................
71
Figura 27:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
citalopram................................................................................................
71
Figura 28:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
paroxetina..............................................................................................
72
Figura 29:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
duloxetina................................................................................................
72
Figura 30:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
fluoxetina.................................................................................................
73
Figura 31:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
sertralina...............................................................................................
73
Figura 32:
Otimização do tempo e temperatura de extração para o antidepressivo
clomipramina............................................................................................
74
Figura 33:
Otimização do pH da amostra para as análises SBSE/LC.......................
75
Figura 34:
Otimização do tempo de dessorção SBSE...............................................
77
Figura 35:
Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (a) barra de
PDMS/PPY (b) barra de PDMS.................................................................
78
Figura 36:
Análise individual e simultânea para o antidepressivo (a) citalopram e
(b) duloxetina, com a barra de PDMS/PPY e
PDMS.......................................................................................................
80
Figura 37:
(a) cromatograma da amostra de plasma branco de referência .(b)
cromatograma da análise dos antidepressivos extraídos da amostra de
plasma branco de referência enriquecida com os antidepressivos (1-
mirtazapina, 2 - citalopram, 3 - paroxetina, 4 - duloxetina, 5 - fluoxetina,
6 -sertralina e 7-clomipramina), concentração de 500 ng mL
-
1
........................................................................................................
83
Figura 38:
Curva analítica para o antidepressivo mirtazapina.................................
85
Figura 39:
Curva analítica para o antidepressivo citalopram...................................
86
Figura 40:
Curva analítica para o antidepressivo paroxetina..................................
86
Figura 41:
Curva analítica para o antidepressivo duloxetina...................................
87
Figura 42:
Curva analítica para o antidepressivo fluoxetina...................................
87
Figura 43:
Curva analítica para o antidepressivo sertralina.....................................
88
Figura 44:
Cromatogramas referentes as análise SBSE/LC de amostras de plasma
de pacientes depressivos (a) duloxetina (434.8 ng mL
-1
), (b) fluoxetina
(398.7 ng mL
-1
) e (c) sertralina (554,0 ng mL
-1
).......................................
95
Figura 45:
Curva de regressão linear para o antidepressivo fluoxetina. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%.............................
98
Figura 46:
Curva de regressão linear para o antidepressivo citalopram. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%..............................
98
Figura 47:
Curva de regressão linear para o antidepressivo mirtazapina. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%..............................
99
Figura 48:
Curva de regressão linear para o antidepressivo sertralina. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%..............................
99
Figura 49:
Curva de regressão linear para o antidepressivo paroxetina. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%..............................
100
LISTA DE TABELA
Tabela 1:
Aplicação SBSE em amostras ambientais............................................
30
Tabela 2:
Aplicação SBSE em amostras de alimentos.........................................
31
Tabela 3:
Composição das fases móveis avaliadas..............................................
53
Tabela 4:
Ordem de eluição dos fármacos e seus respectivos tempos de
retenção, com a fase móvel selecionada.............................................
65
Tabela 5:
Cálculo do fator de retenção e resolução cromtagráfica para os
cromatogramas A e B...........................................................................
68
Tabela 6:
Tempo de retenção dos fármacos analisados......................................
84
Tabela 7:
Regressão linear, LQ e LD para o método SBSE/LC............................
89
Tabela 8:
Precisão inter ensaios e exatidão para o método SBSE/LC em
amostras de plasma..............................................................................
91
Tabela 9:
Valores das taxas de recuperação relativos e absolutos obtidas..........
93
Tabela 10:
Comparação dos valores de recuperação relativa e limite de
quantificação para os métodos SBSE-PDMS/PPY e SBSE-PDMS......
96
Tabela 11:
Equação de regressão linear, coeficiente de correlação (r) no limite
de confiança de 95% para as amostras de plasma enriquecidas com
os antidepressivos (50 a 500 ng mL
-1
)..................................................
101
LISTA DE SIGLAS
ADTs
Antidepressivos tricíclicos
ISRSs
Antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina
LC-FD
Cromatografia líquida com detector de fluorescência
LC-UV
Cromatografia líquida com detector de ultravioleta
LC-MS
Cromatografia líquida com espectrômetro de massas
LC/DAD
Cromtografia líquida com arranjo de diodos
SPME
Microextração em fase sólida
GC - FID
Cromatografia Gasosa com detector de ionização de chamas
CG
Cromatografia gasosa
PDMS
Polidimetilsiloxano
PA
Poliacrilato
PDMS-DVB
Polidimetilsiloxano – divinilbenzeno
CW–DVB
Carbowax – divinilbenzeno
CW-TPR
Carbowax – resina “templated”
SBSE
Extração sortiva em barra de agitação
TD-GC-MS
Dessorção térmica e cromatografia gasosa acoplada com detector de
massas
HIV
Vírus da Imunodeficiência Adquirida
ADS
Alquil-diol sílica
RAM
Material de Acesso Restrito
PPY
Polipirrol
RPLC
Cromatografia líquida em fase reversa
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
LQ
Limite de quantificação
LD
Limite de quantificação
PDMS/PPY
Polidiemtilsiloxano/polipirrol
TGP
Transaminase glutâmico pirúvica
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
SUMÁRIO
1
1
2
3
6
7
8
9
9
12
19
22
25
25
26
27
27
32
34
35
37
40
43
43
46
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................
1.1 Depressão.................................................................................
1.2 Antidepressivos........................................................................
1.2.1 Antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de
serotonina (ISRSs).........................................................................
1.2.2 Antidepressivo noradrenérgico e específico
serotoninérgico............................................................................
1.2.3 Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina e da
Noradrenalina...............................................................................
1.3 Monitorização terapêutica....................................................
1.4 Métodos analíticos................................................................
1.4.1 Métodos de preparo de amostras.....................................
1.4.2 Microextração em fase sólida (SPME)............................
1.4.3 Extração sortiva em barra de agitação (SBSE)............
1.4.3.1 Princípios teóricos..........................................................
1.4.3.2 Otimização das variáveis SBSE.....................................
1.4.3.2.1 Tempo e temperatura de extração.............................
1.4.3.2.2 pH da matriz biológica..................................................
1.4.3.2.3 Otimização do processo de dessorção.....................
1.4.3.3 Aplicações do método SBSE..........................................
1.4.3.4 Desenvolvimento de novas fases extratoras para SBSE
1.4.4 Polipirrol como fase extratora........................................
1.4.5 Mecanismos de extração................................................
1.5 Cromatografia líquida em fase reversa............................
1.5.1 Fases estacionárias quimicamente ligadas...................
1.5.2 Cromatografia por supressão iônica............................
1.5.3 Detectores de ultravioleta................................................
46
47
48
48
49
49
49
51
52
52
53
54
55
56
57
58
58
62
64
64
64
68
70
70
78
1.6 Validação analítica..............................................................
1.6.1 Especificidade/Seletividade.............................................
1.6.2 Linearidade.......................................................................
1.6.3 Precisão..............................................................................
1.6.4 Exatidão.............................................................................
1.6.5 Limite de quantificação (LQ)............................................
1.6.6 Limite de detecção (LD)....................................................
1.6.7 Recuperação...................................................................
2 OBJETIVOS.......................................................................................
3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................
3.1 Padrões analíticos e reagentes.....................................
3.2 Otimização das condições cromatográficas LC-UV...
3.3 Desenvolvimento da barra SBSE com revestimento de
PDMS/PPY..................................................................................
3.4 Amostras de plasma........................................................
3.5 Otimização das variáveis SBSE para análise dos
antidepressivos..........................................................................
3.6 Estudo do mecanismo adsorção/absorção de extração
3.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)....................
3.8 Validação analítica.................................................................
3.9 Comparação das metodologias SBSE utilizando as barras
de PDMS e PDMS/PPY..................................................................
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................
4.1 Análise cromatográfica LC-UV/DAD.....................................
4.1.1 Otimização da fase móvel..................................................
4.1.2 Identificação e quantificação dos fármacos....................
4.2 Padronização do método SBSE/LC-UV para análise
simultânea de antidepressivos...........................................
4.2.1 Otimização das variáveis SBSE.......................................
4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura.................................
82
82
85
88
90
92
93
96
102
103
4.4 Validação analítica do método SBSE/LC padronizado
4.4.1 Especificidade/seletividade........................................
4.4.2 Linearidade...................................................................
4.4.3 Limite de quantificação (LQ) e limite de detecção (LD)
4.4.4 Precisão inter ensaios e exatidão................................
4.4.5 Recuperação absoluta e relativa..................................
4.5 Análise de amostras de plasma de pacientes: aplicação
do método SBSE/LC..................................................................
4.6 Comparação das metodologias SBSE-PDMS/PPY e SBSE-
PDMS com a barra comercial ...................................................
5 PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS.........................................................
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................
105
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Depressão
Cerca de 6% da população tem apresentado depressão, sendo três
vezes mais freqüente em mulheres. A depressão tem sido manifestada em
todas as idades, mas na adolescência e nos primeiros anos da juventude são
os períodos de maior prevalência. Nos homens a depressão tem sido
manifestada, geralmente, na faixa etária de 35 a 44 anos. Segundo a
Organização Mundial da Saúde, em 2020, as doenças coronárias e a
depressão serão as principais causas mundiais de mortalidade. A depressão é
o resultado de uma modificação da ação de neurotransmissores no cérebro.
A sinapse (comunicação entre os neurônios) é a base do funcionamento
do sistema nervoso central. No seu estado normal, os neurônios (células
nervosas) liberam neurotransmissores, que são capturados por outros
neurônios por meio de seus receptores. Dentro da célula nervosa, uma bomba
de recaptação retira parte destes neurotransmissores da sinapse e uma enzima
específica metaboliza estas substâncias. Quando há depressão, ocorre uma
diminuição na quantidade de neurotransmissores liberados, porém a bomba de
recaptação e a enzima específica continuam trabalhando normalmente. Logo o
neurônio receptor captura menos neurotransmissores e passa a funcionar mais
lentamente.
1- 3
Os sintomas mais comuns relacionados à depressão, têm sido os
emocionais: desânimo, ansiedade, perda de interesse ou prazer, sentimentos
de culpa, comportamento suícidas e transtornos cognitivos e físicos: agitação,
2
alterações de peso, dores musculares, perda de energía e alterações do
sono.
2,3
1.2 Antidepressivos
4
O desenvolvimento dos antidepressivos no final da década de 50 tornou
a depressão plausível de tratamento, semelhante a outras doenças como o
diabetes e a hipertensão arterial. Os antidepressivos aumentam a
concentração de neurotransmissores na fenda sináptica por meio da inibição
do metabolismo, bloqueio de recaptura neuronal ou atuação em autoreceptores
pré-sinápticos (Figura 1).
Os antidepressivos podem ser classificados de acordo com a estrutura
química ou propriedades farmacológicas. A estrutura cíclica caracteriza os
antidepressivos heterocíclicos (tricíclicos e tetracíclicos). Os antidepressivos
tricíclicos (ADTs) se dividem em dois grandes grupos: as aminas terciárias
(imipramina, amitriptilina, trimipramina e doxepina) e as aminas secundárias
(desmetilimipramina, nortriptilina e protriptilina).
Os ADTs, embora eficazes e ainda muito utilizados, apresentavam
vários efeitos adversos, tais como: anticolinérgicos, cardiovasculares,
neurológicos e gastrintestinais, causados em decorrência de sua ação
farmacológica, podendo ser potencialmente letais em casos de superdosagem.
Nas últimas duas décadas surgiram novas classes de antidepressivos a partir
da pesquisa de moléculas desprovidas dos efeitos colaterais dos
heterocíclicos, os quais têm sido classificados em função de ação
farmacológica, pois não compartilham estruturas comuns.
3
Entre os antidepressivos da nova geração, podemos destacar os
inibidores seletivos da recaptação de serotonina (citalopram, paroxetina,
fluoxetina e sertralina), noradrenérgico e específico serotoninérgico
(mirtazapina) e inibidores seletivos da recaptação da serotonina e da
noradrenalina (duloxetina).
Figura 1: Mecanismo de ação dos antidepressivos.
1.2.1 Antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina
(ISRSs)
Os ISRSs: citalopram, sertralina, fluoxetina e paroxetina (Figura 2)
apresentam eficácia clínica comparável aos clássicos ADTs, mas porém
destituídos dos efeitos anticolinérgicos e cardiovasculares. Embora todos os
ISRSs apresentem o mesmo mecanismo de ação, as diferenças entre as
4
estruturas moleculares fazem com que os diferentes fármacos possuam
distintos perfis farmacocinéticos.
4,5
Todos os ISRSs apresentam alta ligação protéica. A fluoxetina apresenta
metabólito com atividade clínica significativa, inibição da recaptação de
serotonina e inibição de isoenzimas do citocromo P 450, a norfluoxetina. A
paroxetina e a fluoxetina apresentam perfil farmacocinético não linear, são
rapidamente absorvidos, ligam-se fortemente às proteínas plasmáticas,
deslocam outros fármacos da ligação protéica, aumentando seu nível
plasmático. O citalopram e a sertralina têm sido eficazes no tratamento de
transtornos de ansiedade social e desordem do pânico. A sertralina é pouco
absorvida através da administração oral e a taxa de absorção não é
proporcional à dose administrada. O citalopram é rapidamente absorvido após
administração oral, atingindo a concentração plasmática máxima em
aproximadamente três horas (1-6 horas).
4
As concentrações plasmáticas terapêuticas recomendadas têm sido de
15 a 1000 ng mL
-1
para a fluoxetina, 50 a 500 ng mL
-1
para a sertralina, 20 a
500 ng mL
-1
para a paroxetina e 25 a 550 ng mL
-1
para o citalopram.
6
5
N
N
O
CH
3
CH
3
F
NH
Cl
Cl
CH
3
(a) (b)
O
NH
CH
3
F
F
F
NH
O
F
O
O
(c) (d)
Figura 2: Estruturas química dos antidepressivos ISRSs: (a) citalopram, (b)
sertralina, (c) fluoxetina e (d) paroxetina.
6
1.2.2 Antidepressivo noradrenérgico e específico serotoninérgico
O mecanismo de ação da mirtazapina (Figura 3) ocorre através do
aumento da atividade noradrenérgico e serotonérgica central. Apresenta alta
ligação às proteínas plasmáticas (85%). Os picos plasmáticos são atingidos em
cerca de duas horas, e o estado de equilíbrio em cinco dias. Este fármaco
apresenta relação linear com a dose administrada. A mirtazapina sofre
metabolização hepática, principalmente desmetilação e hidroxilação, seguida
de conjugação ao ácido glucurônico. Seus metabólitos são ativos, encontrados
em níveis baixos, os quais são eliminados na urina (75%) e nas fezes (15%). A
meia vida de eliminação é de 20 a 40 horas.
4,7
N
N
N
CH
3
Figura 3: Estrutura química da mirtazapina.
7
1.2.3 Inibidores Seletivos da Recaptação da Serotonina e da
Noradrenalina
8
O mecanismo de ação da duloxetina (Figura 4) no tratamento da
depressão maior está ligado à inibição da recaptação neuronal de serotonina e
de noradrenalina, assim como ao aumento na neurotransmissão serotonérgica
e noradrenégica no sistema nervoso central. A duloxetina bloqueia fortemente
a recaptação de serotonina e de noradrenalina, e fracamente a captação de
dopamina, com baixa ou nenhuma afinidade com os receptores
dopaminérgicos, histaminérgicos, colinérgicos e adrenégicos.
A duloxetina atinge as concentrações plasmáticas máximas em cerca de
seis horas, é altamente ligada às proteínas e, depois de metabolizada, é
excretada principalmente na urina, junto com seus metabólitos, após
aproximadamente 12 horas.
S
O
NH
CH
3
Figura 4: Estrutura química da duloxetina.
8
1.3 Monitorização terapêutica
9,10
A monitorização terapêutica tem sido descrita como valioso recurso
clínico, na individualização do regime de dosagem, de acordo com a
concentração do fármaco e/ou de seus produtos de biotransformação em
amostras de plasma ou soro, coletadas com base no contexto clínico e nos
princípios da farmacocinética.
O objetivo da monitorização terapêutica é
assegurar a eficácia e minimizar os efeitos adversos dos fármacos, prescritos
na clínica. Os fármacos monitorados têm sido aqueles que apresentam
intervalos terapêuticos bem estabelecidos, ou seja, a maioria dos pacientes,
que apresentam concentrações plasmáticas dentro deste intervalo fixo, tem as
desordens psiquiátricas mantidas sob controle e efeitos adversos aceitáveis. A
monitorização terapêutica também tem sido aplicada a fármacos de baixo
índice terapêutico, alta variabilidade interindividual na farmacocinética e em
casos de resposta clínica que não sejam facilmente ou imediatamente
mensuráveis.
A aplicação clínica da monitorização terapêutica tem sido indicada em
situações onde a eficácia do medicamento é questionada, quando o paciente
exibe toxicidade provavelmente relacionada ao fármaco, quando há suspeita de
não aderência do paciente ao regime de dosagem estabelecido, nas situações
de interações de fármacos com outras drogas administradas, nos casos do
paciente apresentar patologias associadas capazes de alterar a disposição do
fármaco, ou ainda nas situações de mudanças na formulação.
9
1.4 Métodos analíticos
1.4.1 Métodos de preparo de amostras
Em razão da complexidade dos fluidos biológicos e da baixa
concentração dos fármacos nestas matrizes, a etapa de preparo de amostra:
extração, pré-concentração dos analitos e eliminação dos interferentes, têm
sido requeridas para o desenvolvimento de métodos cromatográficos com alta
sensibilidade e seletividade analítica.
11
Os métodos convencionais, empregados no preparo de amostras
biológicas para análises de antidepressivos por técnicas cromatográficas, tem
sido a extração líquido-líquido e a extração em fase sólida.
11
Na extração líquido-líquido ocorre a partição dos analitos entre duas
fases imiscíveis (orgânica e aquosa) (Figura 5). A eficiência da extração
depende da afinidade do analito pelo solvente orgânico, ou seja, do coeficiente
de partição, do volume de solvente, assim como do número de extrações. Esta
técnica apesar de sua simplicidade e altas taxas de recuperação apresenta
algumas desvantagens, tais como: os analitos com alta afinidade pela fase
aquosa são parcialmente extraídos pelo solvente orgânico, formação de
emulsão entre as fases resultando em perda do analito, consumo de solvente
orgânico e exposição dos analistas a compostos tóxicos.
12,13
Para análise simultânea de mirtazapina e seu metabólito, N-
desmetilmirtazapina, 1 mL de plasma foi enriquecido com 25 µL da solução do
padrão interno metropolol, 500 mg de cloreto de sódio (NaCl) e alcalinizadas
com 25 µL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 mol/L. Após agitação, as
10
amostras foram extraídas em 4 mL de tolueno e as análises realizadas em um
cromatógrafo líquido com detector de fluorescência (LC-FD). O intervalo de
linearidade variou de 2,5 a 500 ng/mL, os valores de recuperações médias
foram 77% e 66% para a mirtazapina e demetilmirtazapina, respectivamente.
Os limites de quantificação obtidos foram de 2,5 ng/mL e coeficientes de
variação inferior a 15%.
14
Queiroz et al.
15
analisaram antidepressivos tricíclicos e não tricíclicos em
amostras de plasma por cromatografia líquida com detector de ultravioleta (LC-
UV). 1mL de plasma foi enriquecido com 25 mL da solução padrão de
etildocaina, 200 mg de NaCl 1,5 mol L
-1
e 5 mL de álcool hexanoisoamil (99:1,
v/v). Os valores de recuperação média variaram de 59% a 86%. Os
coeficientes de variação foram menores que 10% e o limite de quantificação
variou de 2,5 a 10 ng mL
-1
para todos os antidepressivos analisados.
Figura 5: Etapas de extração líquido-líquido.
11
A extração em fase sólida é uma técnica de separação liquido - sólido, a
qual utiliza cartuchos de extração que contêm a fase sólida (Figura 6). Após
uma etapa de condicionamento, a solução contendo o analito é colocada no
topo do cartucho e depois de drenada a fase líquida, o analito retido no
cartucho é eluído com pequeno volume de solvente com aplicação de vácuo.
Se houver contaminantes que possam interferir na análise, uma lavagem para
eliminação dos interferentes precede a eluição. As desvantagens desta técnica
estão relacionadas com o bloqueio dos poros da fase extratora pelos
componentes da matriz, variações analíticas entre cartuchos extratores e
necessidade de várias etapas operacionais para sua execução.
16
Juan et al.
17
analisaram fluoxetina, citalopram, paroxetina e venlafaxina
em amostra de plasma utilizando cromatografia líquida com espectrometria de
massas (LC-MS). 0,5 mL de plasma foi enriquecido com 50 µL da solução do
padrão interno (fluvoxamina) e 100 µL de hidróxido de sódio 0,1 mol L
-1
para
extração em cartuchos SPE. A recuperação média obtida foi maior ou igual a
73,2% para todos os antidepressivos analisados. O coeficiente de variação foi
menor que 15% e o limite de detecção variou de 0,1 a 0,5 ng/mL.
Raggi et al
18
desenvolveram um método para análise de fluoxetina e
seu principal metabólito, norfluoxetina, em amostras de plasma por
cromtografia líquida com arranjo de diodos (LC/DAD). Alíquotas de 100µL de
plasma foram diluídas com 500 µL de água e carregadas em cartuchos SPE,
em seguida, foram eluídos com 500 µL de metanol. Os valores de recuperação
absoluta foram de 94% e 93% e os valores de coeficientes de variação de 2,1 e
3,2%, respectivamente.
12
Figura 6: Cartuchos de extração em fase sólida.
Uma tendência predominante na área de química analítica são as
técnicas miniaturizadas, pois não requerem instrumentação analítica
sofisticada, utiliza pequenas quantidades de solvente orgânico, rápido processo
operacional, permite automação das análises, a reutilização das fases
extratoras, e integra em um único sistema, a extração, concentração e
introdução da amostra no sistema cromatográfico.
19
1.4.2 Microextração em fase sólida (SPME)
No final da década de 90, Pawliszyn e colaboradores desenvolveram a
técnica de microextração em fase sólida (SPME).
20 -22
O dispositivo de SPME consiste de um amostrador (uma espécie de
seringa) com uma fibra de sílica fundida revestida com um fino filme de um
polímero ou de um adsorvente sólido (fase extratora), Figura 7.
20 -22
13
Figura 7: Representação esquemática do aparato SPME.
19
A SPME é um processo baseado no equilíbrio de partição entre as
fases: aquosa (amostra homogênea), polimérica extratora (fibra) e gasosa.
Durante a extração em um sistema trifásico considerado ideal (Figura 8a), os
analitos migram entre as três fases até que o equilíbrio de partição seja
atingido. Desta forma, a massa extraída do analito pela fibra está relacionada
ao equilíbrio de massas nas fases do sistema.
20 -22
A seleção do modo de extração depende da composição da amostra e da
volatilidade do analito. Os dois principais modos em SPME têm sido a extração
direta e a extração na fase gasosa. No modo direto, a fibra revestida é inserida
14
diretamente à amostra e os analitos através da difusão são transportados da
amostra para a fase extratora, já na extração em fase gasosa, ou no
headspace do frasco ocorre partição dos analitos voláteis entre a fase gasosa e
a matriz da amostra
21,22
. Após o processo SPME, os analitos sorvidos na fase
polimérica da fibra têm sido determinados por diferentes técnicas analíticas.
Em análises realizadas por cromatografia gasosa (SPME-CG), a fibra é
inserida no injetor aquecido e os analitos são dessorvidos termicamente para a
coluna cromatográfica (Figura 8b).
21,22
Figura 8: (a) Extração SPME, (b) dessorção térmica SPME para análise por
GC, (c) dessorção utilizando a interface do LC.
23
15
O acoplamento SPME com a cromatografia líquida requer uma interface
apropriada, em forma de um T, onde a fibra é inserida na extremidade superior
e as demais extremidades, lateral e inferior, são conectadas à válvula 6
pórticos do LC (Figura 8c). A dessorção dos analitos poderá ser realizada no
modo dinâmico, com a fase móvel, ou no modo estático, quando os analitos
são fortemente sorvidos pela fibra (Figura 9). Neste último modo, a fibra,
anterior a eluição dos analitos para a coluna cromatográfica, permanece na
interface em contato com um volume de fase móvel ou de solvente orgânico
durante um intervalo de tempo, para dessorção dos analitos.
24,25
Figura 9: Interface SPME-LC: a) modo estático e b) modo dinâmico.
26
16
Queiroz e colaboradores
27
descreveram um simples sistema SPME/LC
com dessorção “off line”, o qual não requer a utilização de interface, para a
determinação simultânea de lamotrigina, carbamazepina e 10, 11 epóxido
carbamazepina em amostras de plasma (Figura 10).
Figura 10: Processo de dessorção “off line” SPME.
As fases extratoras polidimetilsiloxano (PDMS), com filmes de diferentes
espessuras (7, 30 e 100 µm), poliacrilato (PA) com 85 µm, polidimetilsiloxano –
divinilbenzeno (PDMS-DVB) com 60 e 65 µm, carboxen – polidimetilsiloxano
com 75 µm, carbowax – divinilbenzeno (CW–DVB) com 65 µm e carbowax –
17
resina “templated” (CW-TPR), compõem as principais fibras disponíveis
comercialmente.
A espessura da fase extratora e a constante de partição determinam à
sensibilidade do método e o tempo de extração. A fase com maior espessura
oferece aumento de sensibilidade, no entanto, requer maior tempo para atingir
o equilíbrio de partição. Quanto maior a afinidade do analito com a fibra, maior
será o coeficiente de partição, com isto maior a sensibilidade do método.
28
As fibras, CW-DVB, PDMS, PDMS-DVB e PA foram avaliadas para a
análise de “carphedon” (composto por grupos polares como cetona e amina)
em amostras de urina. A fibra CW-DVB apresentou maior eficiência de
extração, no entanto, quando utilizadas as fibras PDMS-DVB e PA, o fármaco
não foi detectado, e apresentou baixos valores de recuperação com a fibra
PDMS.
29
As anfetaminas em amostras de urina, quando extraídas com a fibra
PDMS (100 µm), obteve-se maiores taxas de recuperação, quando
comparados com os valores obtidos usando as fibras PDMS (7 µm) e PA (85
µm), demonstrando desta forma, a influência da polaridade e espessura da
fase na eficiência de extração.
30
As fases das fibras não são trocadores de íons; SPME extrai somente
espécies quimicamente neutras presentes na amostra. Os ácidos fracos e
bases poderão ser convertidos a sua forma neutra, na qual poderão ser
extraídos através da fibra SPME. Lord e Pawliszn
31
compararam a
concentração de metanfetamina extraída de amostras de urina em pH alcalino,
ajustado com solução de hidróxido de potássio e com tampão fosfato. Foram
observados significativos desvios na linearidade do método em sistema não
18
tamponado. O efeito do pH da amostra (urina) na eficiência do processo de
extração de benzodiazepínicos foi avaliado usando três diferentes valores
(tampão fosfato de sódio com pH 2,1; 6,8 e tampão borato de sódio pH 9,1). A
maior parte dos benzodiazepínicos (bases fracas) apresentam-se na forma não
dissociada em pH neutro e alcalino como 6,8 e 9,1, resultando em maior
eficiência de extração.
31
O diazepan (pKa 3,5) foi extraído de amostras de plasma após
precipitação protéica com ácido tricloro acético e ajuste do pH a 5,5 com
tampão acetato (5 M, pH 7).
32
A fibra SPME revestida com polidimetilsiloxano (PDMS), devido sua
estabilidade, tem sido a mais utilizada. Esta, quando revestida com 100 µm
PDMS resulta em aproximadamente 0,5 µL de fase extratora.
Conseqüentemente, a eficiência da extração para fármacos parcialmente
solúveis em água pode ser bem baixa. Para compostos muito apolares
ocorrerá à distribuição dos analitos entre a fase aquosa, a fibra SPME, a
parede de vidro do tubo de extração, e a superfície do politetrafluoroetileno da
barra magnética usada para agitar as amostras.
21,22
19
1.4.3 Extração sortiva em barra de agitação (SBSE)
Baseando-se nas observações descritas, Pat Sandra e colaboradores
33
desenvolveram uma nova técnica de preparo de amostra denominada de
extração sortiva em barra de agitação (SBSE), para extração de compostos
orgânicos de matrizes aquosas. A barra de extração sortiva apresenta uma
haste magnética, necessária para agitar a solução da amostra, a qual é
inserida no interior de um tubo de vidro de pequeno diâmetro, este é recoberto
por uma camada de polidimetilsiloxano de 1 mm de espessura, para sorção
dos analitos (Figura 11).
Figura 11: Barra de extração sortiva com revestimento PDMS.
O polidimetilsiloxano (Figura 12) tem sido muito utilizado como fase
extratora ou como fase estacionária em colunas de cromatografia gasosa, em
razão da estabilidade térmica (-20 a 320ºC), baixo ruído instrumental e não
promove a decomposição dos analitos presentes na análise.
34
20
Si
CH
3
CH
3
CH
3
OSi
CH
3
O
CH
3
Si
CH
3
CH
3
CH
3
Figura 12: Estrutura química do polidimetilsiloxano (PDMS).
As variáveis da técnica da SBSE, tais como: temperatura de extração,
tempo de extração, pH e força iônica da amostra e processo de dessorção
devem ser otimizados para obtenção de adequada sensibilidade analítica em
menor tempo de análise. A extração sortiva em barra de agitação é realizada
através da introdução da barra SBSE em frasco de vidro ou em tubo de
extração contendo a amostra (Figura 13). A amostra é agitada durante um
intervalo de tempo de 30 a 40 minutos. Após a extração, a barra de agitação é
removida da amostra aquosa e seca em papel seco, para remover as gotas da
água.
33
n
21
Figura 13: Processo de extração SBSE.
Para o processo de dessorção de compostos voláteis, a barra SBSE é
inserida em um tubo de vidro para dessorção térmica no injetor do
cromatógrafo a gás (Figura 14a), onde os analitos são termicamente
dessorvidos, sendo posteriormente concentrados a baixas temperaturas e
transportados para a coluna com aumento gradual da temperatura do injetor.
Para as análises de compostos não voláteis, a barra SBSE é colocada num
frasco contendo pequeno volume de solvente orgânico ou fase móvel,
compatível com a fase polimérica extratora, para dessorção líquida
(Figura
14b).
35
22
(a)
(b)
Figura 14: (a) dessorção térmica, (b) dessorção líquida.
1.4.3.1 Princípios teóricos
A extração sortiva em barra de agitação baseia-se no de equilíbrio
partição dos analitos entre as fases: extratora (PDMS) e amostra aquosa
(K
PDMS/W
). O equilíbrio de partição tem sido correlacionado com o coeficiente de
distribuição octanol-água (K
O/W
), o qual estima a medida da polaridade dos
23
compostos orgânicos e fornece uma boa indicação da eficiência de extração
para cada analito.
33
O coeficiente de partição do analito entre as fases PDMS e aquosa
(K
PDMS/w
) é definido como sendo a razão entre a concentração do analito na
fase de PDMS (C
PDMS
) e a concentração do analito na amostra aquosa (C
w
), no
equilíbrio. Esta razão é igual ao produto entre razão das massas do soluto na
fase PDMS (m
PDMS
) e na fase aquosa (m
w
) e β, onde β é igual à razão entre o
volume da amostra e volume da fase extratora
(β = V
w
/ V
PDMS
), equação 1.
33
//
PDMS PDMS w PDMS
ow PDMSw
wwPDMSw
CmVm
KK
CmV m
β
≈ ==⋅=⋅
A taxa de recuperação do processo de extração, equação 2, é expresso
pela razão entre a quantidade de analito extraído (m
PDMS
) e a quantidade inicial
de analito na amostra aquosa (m
o
=m
PDMS
+ m
w
) que corresponde às
correlações entre K
PDMS/w
e β, como ilustra a equação 2:
33
/
/
1( /)
PDMS PDMS w
oPDMSw
mK
mK
β
β
=
+
24
Segundo a equação 2, quanto maior a quantidade de PDMS, menor o β,
maior será a eficiência de extração. Uma vez que o valor de K
PDMS/w
é similar
ao valor de K
o/w
, a eficiência da extração em PDMS, em geral diminui com o
aumento da polaridade do analito.
33
A fase extratora PDMS é a mesma fase usada nas fibras SPME, no
entanto a quantidade de revestimento utilizada é 50 a 250 vezes maior, o que
resulta em taxas de recuperação mais elevadas e maior capacidade de
amostra.
Para SPME, o volume do PDMS é de aproximadamente 0,5 µL. Isso
resulta em recuperações não eficientes para solutos com baixos valores de
coeficiente de distribuição octanol/água (K
o/w
). Na extração sortiva em barra de
agitação, são usados revestimentos de PDMS de 25 a 125 µL. A eficiência da
extração, teoricamente alcança 100% para solutos com valores de K
o/w
maiores
que 500.
33,36
Segundo a Figura 15, a taxa de recuperação da técnica SBSE aproxima-
se a 100% para solutos com valores de K
o/w
maiores que 500, enquanto que a
técnica SPME apresenta satisfatória taxa de recuperação para analitos com
valores de K
o/w
maior que 10
5
.
33,36
25
Figura 15: Taxa de recuperação dos analitos em função do coeficiente de
partição octanol-água (K
o/w
) para as técnicas, SPME (10 mL amostra, fibra
PDMS, 100 µm de espessura) e SBSE (10 mL amostra, camada de PDMS 10
mm x 0,5 mm).
33
1.4.3.2 Otimização das variáveis SBSE
1.4.3.2.1 Tempo e temperatura de extração
37-39
A mudança de temperatura influência no processo de extração SBSE.
Com o aumento da temperatura, o coeficiente de difusão aumenta e o
coeficiente de partição do analito entre as fases aquosa e extratora diminui.
Estas variações nos coeficientes de difusão e de partição terão influências
opostas sobre a extração: em decorrência do aumento do coeficiente de
difusão, o tempo requerido para que o analito atinja o equilíbrio de sorção
26
deverá ser menor. Por outro lado, devido à diminuição do coeficiente de
partição, a quantidade de massa extraída no equilíbrio de sorção será menor,
acarretando em perda da eficiência do processo.
O tempo de extração é otimizado considerando o equilíbrio de sorção. O
equilíbrio de sorção será atingido quando não houver aumento na quantidade
de massa extraída, com o aumento do tempo de extração. Este é dependente
do processo de agitação, assim como da constante de distribuição do analito
entre a fase extratora PDMS e a amostra.
1.4.3.2.2 pH da matriz biológica
37-39
O pH da amostra é importante para a extração de analitos que possuem
grupos dissociáveis, dependentes do pH do meio. Somente as formas não-
dissociadas dos analitos são extraídas pela fase extratora PDMS. O pH da
amostra tem sido ajustado com uma solução tampão, onde a maioria dos
analitos dissociados passará à forma não-dissociada, favorecendo o processo
de extração. Em uma mistura tamponada, o processo SBSE apresenta maior
eficiência de extração e linearidade quando comparada a uma mistura não
tamponada, pois a razão entre as formas não-dissociadas e dissociadas
permanece constante. Os analitos básicos, como os antidepressivos, têm sido
analisados em pH básico e analitos ácidos, como os clorofenóis, têm sido
extraídos em pH ácido.
27
1.4.3.2.3 Otimização do processo de dessorção
Durante a dessorção os analitos difundem-se da fase extratora para o
fluido de arraste. Portanto, as variáveis como tempo e temperatura de
dessorção deverão ser otimizadas para eliminar o efeito memória.
33
1.4.3.3 Aplicações do método SBSE
A extração sortiva em barra de agitação tem sido aplicada com êxito na
análise de diferentes compostos em matrizes biológicas, tais como: urina,
plasma, sangue, saliva e soro.
34
Queiroz et al.
40
padronizaram e validaram um método para análise de
antidepressivos não tricíclicos em amostras de plasma para fins de
monitorização terapêutica. O limite de quantificação do método SBSE variou de
10 a 40 ng mL
-1
com coeficiente de variação inferior a 15 % e valores de
recuperação superiores a 80%.
Lanças et al.
41
analisaram fluoxetina e desipramina (padrão interno) em
amostras de plasma por LC-MS. O método desenvolvido apresentou
sensibilidade analítica adequada quando comparado com a extração em fase
sólida. Os coeficientes de variação foram 4,7% e 5,0%, respectivamente.
As amostras de urina têm sido extraídas diretamente ou após hidrólise
enzimática. Amostras de sangue, incluindo soro, plasma, fluido de bile e
esperma devem ser diluídas com a água ou uma solução tampão antes do
processo de extração.
42
28
A análise de 4-nonilfenol e 4-ter-octilfenol, produtos de degradação de
surfactantes não iônicos, foi realizada com a diluição de 1 mL de amostras de
plasma ou urina em um mililitro de água e extraídos com uma barra SBSE de
24 µL de PDMS em temperatura ambiente a 60 minutos, sob agitação
magnética, após realizado o processo de dessorção térmica, as amostras
foram analisadas por cromatografia gasosa com detector de massas (GC-MS).
O estudo revelou a presença dos analitos nas amostras de plasma nas
concentrações de 0,2 e 0,3 ng mL
-1
, respectivamente, porém não foram
encontradas presentes nas amostras de urina, pois estas substâncias são
metabolizadas no fígado e excretadas na forma de glucoronídeos.
43
Nakazawa et al
44
desenvolveram um método para análise de traços de
2,2-bis(4-hidroxifenol)propano em amostras de plasma, urina e saliva,
utilizando derivatização in situ e análises por GC-MS. Os valores de limite de
detecção encontrados foram de 20, 100 e 20 pg mL
-1
, respectivamente.
Uma importante classe de compostos analisados tem sido os hormônios
estereóides, com o intuito de monitorar a ação e funcionamento das glândulas
endócrinas, pois estas podem estar associadas com várias doenças como
câncer de mama e anorexia nervosa.
45
Almeida et al, utilizaram uma barra
SBSE revestida com 126 µL de PDMS na análise de seis hormônios
estereóides em amostras de urina. As concentrações encontradas nas
amostras de urina foram aproximadamente 10 µg L
-1
, estes níveis de
concentração são aceitáveis para o corpo humano.
45
A testosterona e epitestosterona foram analisadas em amostra de urina
de pacientes HIV positivos através da técnica TD/GC-MS. Segundo os autores,
os pacientes HIV positivos apresentam menor excreção destes hormônios. A
29
análise dos hormônios foi realizada por derivatização com ácido acético anidro,
durante 30 minutos a 90°C. O método desenvolvido mostrou-se adequado com
limite de detecção 0,3 e 0,9 ng mL
-1
, respectivamente.
46
A análise de ácido tubérculo em escarro demonstra a aplicabilidade da
técnica SBSE para análises de rotina. As análises foram realizadas em menor
tempo (60 minutos) com precisão e exatidão equivalentes ao método padrão de
diagnóstico convencional, o qual requer 8 semanas para obtenção do
resultado.
47
A aplicação da técnica SBSE se estende ainda para áreas ambientais
e alimentícias, como pode ser observado nas Tabelas 1 e 2.
30
Tabela 1: Aplicação SBSE em amostras ambientais.
ANALITO MATRIZ PROCESSO
DE
EXTRAÇÃO
DETECÇÃO LIMITE DE
DETECÇÃO
OBS.
Difeniléteres
48
Água 240 min,
1250 rpm
1
GC-MS
0.3 a
203,4 ng L
-1
2
DL
sob banho
de ultrasom,
em 15
minutos.
Pesticidas
49
Água de
rio
60 min, 750
rpm
GC-MS
1.0 a
2.5 ng L
-1
DL em ACN,
sob banho de
ultra-som, 15
min.
Pesticidas
50
Água de
rio
60 min, 100
rpm
GC-MS
0.2 a
2,5 ng L
-1
3
DT
Adição de 30
% de NaCl.
Fenóis
51
Água 120 min,
60 min
GC-MS 0.1 a
0.4 ng mL
-1
DT
Hidrocarbonetos
policiclicos
aromáticos
52
Água 80 min, 1000
rpm
4
LC-ED
0.2 a
2,0 ng L
−1
DL
Xenoestrogenos
fenólicos
53
Água 180 min GC-MS 0,5 a
2,0 pg mL
-1
Derivatização
com ácido
anidrido
acético
Clorofenóis
54
Água 120 min GC-MS 1,0 a
2,0 ng L
−1
Derivatização
com ácido
anidrido
acético
Estradiol
55
Água 120 min GC-MS 0,5 ng L
−1
Derivatização
com ácido
anidrido
acético e
5
BSTFA.
Fitalatos
56
Água 60 min, 750
rpm
SGC-MS
3,0 a
40,0 ng L
−1
DL
Banho de
ultra-som, 15
min.
Pesticidas
57
Solo 180 min GC-MS 0,002 a
5,0 ng g
-1
A extração foi
realizada sob
controle de
pressão.
1
GC-MS: cromatografia gasosa,
2
DL: dessorção líquida,
3
DT: dessorção
térmica,
4
LC-ED: cromatografia líquida com detector de fluorescência,
5
BSTFA
:
N, O-bis(trimetilsilil)trifluoracetamida.
31
Tabela 2: Aplicação SBSE em amostras de alimentos.
ANALITO MATRIZ CONDIÇÕES
DE
EXTRAÇÃO
DETECÇÃO LIMITE DE
DETECÇÃO
OBS.
Aldeídos
58
Vinho 90 min,
700 rpm
GC-MS
0.61 e
0.69 ng L
-1
1
DT
Pesticidas
59
Àgua 600 rpm
30 min
GC-TDS ≤ 0.15 ng g
-1
DT
Pesticidas
60
Laranja 1250 rpm,
30 min
GC- FID 0.17 a
0.05g mL
-1
Incorporação
de sol – gel
entrecruzado
com o
revetimento
de PDMS.
Fenóis
61
Vinho 60 min,
900 rpm
GC–MS
0,006 a
0,159 mg L
-1
DT
2
COVs
62
Bebidas
30 ou
60 min, 800
rpm
GC–MS
- DT
A barra
SBSE foi
lavada em
água a 60
°C para
remoção de
açúcares.
COVs
63
Vinagre 120 min,
1250 rpm
GC–MS
0,03 a
8,60 g L
-1
DT
Metabólitos
voláteis
de fungos
64
Fungos 30 min GC–MS
- DT
Foi realizada
extração em
headspace.
Fungicidas
65
Vinhos 40 min,
1440 rpm
GC–MS
0.2 e
2,0 mg L
-1
DT
1
DT: dessorçaõ térmica,
2
COVs: compostos orgânicos voláteis.
32
1.4.3.4 Desenvolvimento de novas fases extratoras para SBSE
A fase extratora PDMS é a única disponível atualmente no mercado, o
que tem limitado a sensibilidade e a seletividade analítica da técnica SBSE. A
extração de analitos por SBSE utilizando a fase extratora de PDMS é limitada
para compostos com alto coeficiente de partição octanol/água (log Ko/w > 2,7),
frequentemente, processos de derivatização têm sido utilizados para análise de
analitos polares
66
. Recentemente, outras fases extratoras têm sido
desenvolvidas com o objetivo de aumentar a seletividade da técnica SBSE.
Bicchi et al.
67
desenvolveram uma barra SBSE mista, os autores
utilizaram um tubo de PDMS empacotado com carbono ativado, cujas
extremidades foram fechadas com material magnético para promover a
agitação. A combinação destas duas fases resultou em diferentes mecanismos
de extração, absorção através do revestimento PDMS e adsorção pelo
revestimento de carbono. A fase extratora mista foi avaliada para análises de
compostos voláteis e/ou polares em amostras de café, folhas de sálvia e
uísque. O método padronizado apresentou coeficiente de variação inferior a
16,9% e taxas de recuperação próximas a 80%, as quais foram superiores aos
valores encontrados com as barras SBSE comerciais.
Liu et al.
68
prepararam um revestimento de PDMS sol-gel, entrecruzado
parcialmente, para extração de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e
pesticidas organofosforados em água. Devido a maior adesão do revestimento
de PDMS sol-gel a superfície de sílica fundida da barra SBSE, a fase extratora
mostrou menor sangria, maior repetitividade e maior tempo de uso. O método
padronizado apresentou limites de detecção de 0,18-20 pg mL
-1
.
33
Lambert et al.
66
desenvolveram uma barra SBSE revestida com alquil-
diol sílica (ADS), material de acesso restrito (RAM), para solucionar o problema
das interferências das proteínas presentes nos fluidos biológicos. As partículas
ADS (Figura 16) possuem superfície exterior hidrofílica e eletricamente-neutra
(diol) dificultando a adsorção das proteínas e a superfície interna (fase ligada,
alquil hidrofóbica, C
18
) responsável pela extração dos analitos. Dessa forma, as
partículas ADS são capazes de fracionar a amostra em matriz protéica e
analito, através do controle do tamanho de seus poros, os quais formam uma
barreira excluindo as macromoléculas. Simultaneamente ao processo de
exclusão pelo tamanho, compostos com moléculas de baixa massa molar são
extraídos e enriquecidos, via partição, na fase interior (C
18
). A SBSE-RAM foi
utilizada nas análises de cafeína e seus metabólitos em fluidos biológicos,
resultando em limite de detecção de 25 ng mL
-1
.
Figura 16: Partículas RAM
34
Estas novas fases extratoras mostraram-se mais eficientes e/ou mais
seletivas quando comparadas à fase SBSE de PDMS (comercial).
1.4.4 Polipirrol como fase extratora
O polipirrol (Figura 17) é um polímero condutor que vêem sendo
amplamente estudado, em razão da alta condutividade, facilidade de síntese e
boa estabilidade no estado oxidado. O uso de polipirrol (PPY) como fase
extratora está relacionado às diferentes interações de seus grupos funcionais
(hidrofóbica, π-π, com o grupo funcional polar, troca iônica, ácido-básica,
dipolo-dipolo e dipolo induzido-dipolo.) com os analitos. O polipirrol tem-se
mostrado estável em fases móveis utilizadas em cromatografia líquida e em
soluções de diferentes valores de pH (1,5 a 10,0), permitindo a utilização de
solução tampão em pH adequado, segundo o equilíbrio ácido-base dos analitos
em solução.
69
Pawliszyn et al
69
revestiram a superfície interna de um capilar de sílica
fundida com polipirrol e poli-N-fenilpirrol para análises “in tube” SPME. A
morfologia da superfície do revestimento polimérico do capilar de sílica foi
avaliada por Microscopia Eletrônica de Varredura, as quais revelaram a
presença de estruturas porosas. A presença de poros propicia um aumento da
área ativa da superfície extratora, o que resultou em maior seletividade e
sensibilidade analítica para análise de compostos polares, aromáticos, básicos
e aniônicos em relação às fases extratoras comerciais.
35
Figura 17: Cadeia polimérica de Polipirrol.
Na literatura são encontrados alguns trabalhos utilizando PPY como fase
extratora para análises de fármacos em fluidos biológicos, e pesticidas em
amostras ambientais através das técnicas SPME “in tube” /LC-MS ou
SPME/GC-MS
70-75
, porém o polipirrol ainda não foi avaliado como fase
extratora para SBSE.
1.4.5 Mecanismos de extração
A adsorção e absorção têm sido os principais mecanismos de interação
do analito com a fase extratora polimérica. O mecanismo de adsorção é um
processo característico de revestimentos porosos como polipirrol. Segundo a
teoria baseada nas isotermas de adsorção de Langmuir, o número de sítios
ativos na superfície da fase extratora é limitado, quando todos os sítios
estiverem ocupados, iniciará o processo de competição entre os analitos pelos
sítios ativos na superfície, os analitos de maior afinidade pela fase extratora
irão deslocar os de menor afinidade, ou seja, analitos com menor coeficiente de
sorção.
76
36
Para filmes líquidos como PDMS, um polímero homogêneo, o
mecanismo de extração ocorre por absorção, este processo é não competitivo
(em comparação com o de adsorção) onde cada analito tem seu coeficiente de
partição com a fase extratora. A interação do analito na superfície é mais fraca
em relação ao processo de adsorção e a degradação de analitos instáveis é
significativamente menor.
76
Cho et al.
77
estudaram o mecanismo de extração na superfície
polimérica das fibras SPME: Carboxen-PDMS e PDMS, para análises de
compostos orgânicos em amostras ambientais. Os autores observaram o
processo de competição (adsorção) para a fibra mista Carboxen-PDMS,
enquanto para a fibra de PDMS foi observado o processo de absorção, pois as
análises SPME (PDMS) apresentaram ampla faixa linear, ou seja, correlação
linear entre as concentrações de analito extraído e a concentração inicial de
analito na amostra.
Tuduri et al
78
analisaram traços de compostos orgânicos voláteis em
amostras de ar, utilizando cinco diferentes fibras SPME: PDMS, PDMS–DVB,
CWAX–DVB, PDMS-CAR e PDMS–DVB–CAR. Os autores observaram um
menor tempo de equilíbrio de extração (5 minutos) para o revestimento de
PDMS (processo de absorção) em comparação com as demais fibras (20 a 150
minutos) onde predominou o processo de adsorção.
A Figura 18 ilustra os estágios inicial e final dos processos de extração
por absorção e adsorção.
37
Figura 18: Mecanismo de extração, absorção e adsorção.
76
1.5 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM FASE REVERSA
79,80
A cromatografia em fase reversa é a modalidade da cromatografia
líquida mais utilizada, cerca de 75% das análises empregam esta técnica. Esta
modalidade da cromatografia líquida apresenta várias vantagens, tais como, o
uso de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água,
38
fases estacionárias estáveis com diferentes grupos químicos ligados à sílica,
equilíbrio rápido da coluna, após a mudança da fase móvel, maior rapidez das
análises em decorrência do pequeno diâmetro das partículas que recheiam a
coluna e repetitividade dos tempos de retenção. No entanto, a fase móvel
deverá apresentar intervalo de pH de 2 a 8, para evitar hidrólise dos grupos
silanóis em pH ácido e sangria da fase estacionária em pH maior que 8.
As separações cromatográficas são realizadas em fase estacionária
apolar quimicamente ligada aos grupos silanóis da superfície da sílica,
processo reverso à cromatografia líquida em fase normal.
Os mecanismos de partição e/ou adsorção e a teoria solvofóbica têm
sido utilizados para explicar as interações dos analitos com a fase estacionária.
A fase estacionária apresenta grupos apolares, tais como os grupos C
18
,
C
8
, fenil, C
6
, C
4
, C
2
, CN, diol, NH
2
e NO
2
, os quais são ligados, através de
ligações covalentes aos grupos silanóis da superfície da sílica.
O processo de partição, ou equilíbrio de partição do analito entre as
fases: móvel e fino filme de fase líquida apolar revestindo o suporte sólido, a
sílica, tem sido observado. O processo de partição baseia-se na solubilidade do
analito entre as fases. A seletividade/especificidade da retenção do analito
poderá ser mudada variando o grupo apolar quimicamente ligado à superfície
da sílica. Várias colunas, em fase reversa, encontram-se disponíveis no
mercado.
As fases estacionárias, quimicamente ligadas, devido às ligações
covalentes são bem estáveis, possibilitando o uso de maiores valores de vazão
e temperatura, assim como o emprego da eluição por gradiente. No entanto,
apenas 50% ou menos dos grupos silanóis participam da reação de sililação.
39
Desta forma, retenções indesejáveis, principalmente com analitos polares,
40
ligada. Em RPLC, a força das interações junto à fase estacionária apolar,
particularmente para misturas contendo compostos polares ou básicos,
depende da reatividade da sílica usada como suporte. Por exemplo, a retenção
de compostos fortemente básicos varia com a acidez dos grupos silanóis,
presentes na superfície da sílica. Quando os silanóis forem fortemente ácidos,
a retenção será maior e os picos dos compostos básicos serão largos e com
caudas.
Em RPLC, quanto maior o comprimento da cadeia alquila, maior o fator
de retenção, k. Quando empregadas nas mesmas condições, as colunas com
cadeias alquilas mais longas (por exemplo, C
18
e C
8
) são mais estáveis do que
aquelas com cadeias mais curtas (C
4
). A retenção também aumenta em função
da maior densidade da cadeia alquila, em grupos por m
2
de superfície, da
maior espessura da camada orgânica (fases poliméricas são mais retentivas
que as monoméricas) e do maior grau de capeamento. Retenções fortes
implicam tempos de análise longos, ou o uso de maior percentual do
modificador orgânico na fase móvel.
1.5.1 Fases estacionárias quimicamente ligadas
79,80
As fases estacionárias quimicamente ligadas podem ser obtidas
através de diversas reações químicas a partir da sílica ou outros suportes. A
reação mais utilizada é a formação da ligação siloxano por reação do grupo
silanol com um agente sililante, como organoclorossilano. Nestas reações,
primeiramente, faz-se necessário ativar os grupos hidroxilas da superfície
da sílica através de aquecimento, removendo as moléculas de água ligadas
41
à sua superfície. Em seguida, promove-se a reação entre um organossilano
e os grupos hidroxilas superficiais.
Dependendo da escolha do agente sililante e das condições de
reação, podem obter sílicas modificadas com a mesma composição
química, porém com propriedades cromatográficas diferentes,
principalmente na retenção dos compostos e na seletividade, denominadas
de fases monoméricas e poliméricas (Figura 19).
42
(a)
(b)
Figura 19: Estrutura química das fases estacionárias: (a) monomérica e (b)
polimérica.
79
43
1.5.2 CROMATOGRAFIA POR SUPRESSÃO IÔNICA
80
Este tipo de cromatografia utiliza fase estacionária reversa e separa os
compostos ionizáveis pela redução de sua ionização em solução, através do
controle de pH da fase móvel. Para compostos ácidos, podem-se adicionar os
ácidos acético, fosfórico ou tampão, como acetato ou fosfato, na fase móvel, e
ajustar o pH para 2-5. Para bases, utilizam-se hidróxido de amônio, trietilamina,
ou fosfatos alcalinos na fase móvel, e ajusta-se o pH em 7-8.
Quando um ácido, ou uma base, sofrem ionização, passando de
espécies neutras para espécies carregadas, tornam-se menos hidrofóbicos,
diminuindo significativamente sua retenção nas fases estacionárias reversas.
Os ácidos perdem um próton e tornam-se ionizados à medida que o pH
aumenta; as bases ganham um próton e tornam-se ionizadas à medida que o
pH diminui. Portanto, à medida que o pH aumenta, a retenção de compostos
básicos aumenta e a retenção de compostos ácidos diminui. Usa-se o controle
do pH da fase móvel para promover a separação de solutos iônicos, onde a
retenção será maior quando o composto estiver na sua forma não iônica.
1.5.3 DETECTORES DE ULTRAVIOLETA
80
Os detectores mais freqüentemente utilizados em cromatografia líquida
de alta eficiência são os espectrofotométricos. Estes detectores consistem de
uma célula de fluxo localizada no término da coluna cromatográfica. A radiação
ultravioleta passa, constantemente, pela célula de fluxo e é recebida no
detector (Figura 20). Com o sistema em funcionamento, as substâncias são
44
eluídas da coluna, passam pela célula de fluxo e absorvem a radiação,
resultando em alterações mensuráveis no nível de energia. Estes detectores
podem apresentar comprimento de onda fixo, variável ou múltiplo.
Figura 20: Célula do detector de ultravioleta.
Detectores de comprimento de onda fixo (Figura 21) operam em um
único comprimento de onda, geralmente 254 nm, emitido por uma lâmpada de
mercúrio de baixa pressão. Os detectores de comprimentos de onda variável
UV-VIS, cobrindo a faixa de 190-800 nm, através de monocromador que
seleciona o comprimento de onda desejado do feixe de luz emitido pelas
lâmpadas de deutério (UV) ou tungstênio (VIS), oferecem várias vantagens
sobre os instrumentos de comprimento de onda fixo:
45
a) Apresenta alta absorbância para vários componentes devido à
escolha de comprimento de onda e, conseqüentemente, tem maior
sensibilidade.
b) Promove eficiência em eluição por gradiente através da habilidade de
selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase móvel não
apresentam uma variação de absorbância para diferentes concentrações.
c) Permitir obter o espectro de absorbância de cada componente em
separado após parar a vazão da fase móvel.
Figura 21: Detector de UV de comprimento de onda variável.
81
Análises em diferentes comprimentos de onda também são possíveis
com os detectores espectrofotométricos através de um conjunto de fotodiodos.
Esses fotodiodos, seletivos a determinados comprimentos de onda, em grande
número, cerca de 250, permitem levantar o espectro da substância durante a
eluição. Este detector é denominado detector de rede de diodos (Figura 22).
46
Figura 22: Esquema de um detector de rede de diodos.
81
1.6 Validação analítica
82,83
Segundo as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), a validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o
método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade,
exatidão, linearidade, precisão, limite de quantificação, limite de detecção e
recuperação adequadas à análise.
1.6.1 Especificidade/Seletividade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto
em presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de
degradação e componentes da matriz. Em geral uma forma simples de verificar
47
a seletividade de um método é observar a presença de picos na região do
tempo de retenção de interesse injetando-se um branco obtido com a mesma
matriz a ser analisada.
1.6.2 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade
seja determinada pela análise de, no mínimo, 5 (cinco) concentrações
diferentes.
A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou
concentração da espécie a ser quantificada deve ser determinada
empiricamente, a partir de sinais medidos para massas ou concentrações
conhecidas dessa espécie. Essa relação matemática, muitas vezes, pode ser
expressa como uma equação de reta chamada de curva analítica.
Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a partir
de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuada usando o
método matemático conhecido como regressão linear. Além dos coeficientes
de regressão a e b, também é possível calcular, a partir dos pontos
experimentais, o coeficiente de correlação r, Este parâmetro permite uma
estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0,
menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza
dos coeficientes de regressão estimados. Pela ANVISA o coeficiente de
determinação ou regressão (r
2
) deve ser maior ou igual a 0,99.
48
1.6.3 Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma
série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A
precisão pode, também, ser expressa como precisão intra-ensaios, quando
medida em um mesmo dia e inter ensaios quando medida ao longo de vários
dias. Esse parâmetro deve ser avaliado em três níveis de concentração (baixo,
médio e alto), realizando-se no mínimo 5 (cinco) determinações em cada
concentração. A precisão é avaliada pelo cálculo do desvio padrão (RSD) ou
coeficiente de variação (CV%), e segundo a ANVISA em se tratando de
amostras biológicas deve apresentar coeficientes de variação superiores a
15%, exceto no limite de quantificação, para o qual se admite valores até 20%.
1.6.4 Exatidão
A exatidão do método deve ser determinada utilizando-se, no mínimo, 3
(três) concentrações (baixa, média e alta), contemplando a faixa de variação do
procedimento, realizando-se, no mínimo, 5 (cinco) determinações por
concentração. Sendo expressa pela relação entre a concentração média
determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente, e de
acordo com a ANVISA deve apresentar valores entre 80 a 120 % (oitenta a
cento e vinte por cento), através da análise de, no mínimo, 5 (cinco) amostras
de padrões.
49
1.6.5 Limite de quantificação (LQ)
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser
determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas. Também pode ser determinado por meio do
ruído. Neste caso, determina-se o ruído da linha de base e considera-se como
limite de quantificação aquela concentração que produza relação sinal-ruído
igual ou superior a 10:1 com coeficiente de variação inferior a 20%.
1.6.6 Limite de detecção (LD)
È a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode
ser detectada, porém não necessariamente quantificado, sob as condições
experimentais estabelecidas. O limite de detecção é estabelecido por meio da
análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analito,
até o menor nível detectável; a estimativa do limite de detecção pode ser feito
com base na relação de três vezes o ruído da linha de base.
1.6.7 Recuperação
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um
método analítico dentro de um limite de variação. Porcentagens de
recuperação do analito e do padrão interno próximos a 100% são desejáveis,
porém, admitem-se valores menores, desde que a recuperação seja precisa e
exatos.
50
A recuperação relativa representa a razão entre o quociente das áreas,
do analito e do padrão interno extraídos de uma amostra enriquecida, e o
quociente das áreas dos mesmos quando não submetidos ao processo de
extração.
A recuperação absoluta é uma relação entre a resposta do analito
extraído da matriz fortificada e a resposta do padrão analítico puro que não
tenha sido submetido ao processo de extração. A recuperação gerada pelo
analito não extraído representa uma recuperação de 100%.
51
2 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivos:
¾ O desenvolvimento da barra de extração sortiva (SBSE) com
revestimento de PDMS/PPY;
¾ Otimização das variáveis do método SBSE para análise simultânea dos
antidepressivos (mirtazapina, citalopram, paroxetina, duloxetina,
fluoxetina, sertralina) em amostras de plasma, para fins de
monitorização terapêutica;
¾ Otimização das condições cromatográficas LC-UV;
¾ Validação analítica do método SBSE/LC-UV, segundo normas da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA);
¾ Análise das amostras de plasma de pacientes em terapia com os
antidepressivos em estudo.
52
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Padrões analíticos e reagentes
Os padrões primários dos antidepressivos: fluoxetina e paroxetina foram
gentilmente doados pelos laboratórios, Lilly (São Paulo, Brasil) e Libbs (São
Paulo, Brasil), respectivamente. Citalopram, mirtazapina, sertralina, foram
doados pela Roche (São Paulo, Brasil) e clomipramina (padrão interno) pela
Pfizer (São Paulo, Brasil). O Polidimetilsiloxano foi adquirido do fornecedor
Dow Corning Corporation (Midland, EUA), e o pirrol da Sigma-Aldrich (Steinheim,
Alemanha).
As soluções padrão diluídas dos antidepressivos foram preparadas em
metanol considerando o intervalo terapêutico, a partir da diluição de suas
respectivas soluções estoques de 1mg/mL
em metanol. Estas soluções
apresentaram estabilidade de 45 dias, quando permanecidas a -20°C. O
metanol e a acetonitrila, grau cromatográfico foram adquiridos do fornecedor
J.T. Baker (Phillipsburg USA); ácido clorídrico, fosfato de potássico monobásico
e dibásico, borato de sódio, acetato de sódio e ácido acético da Mallinckrodt
Baker (Xalostoc, México). A água utilizada nos ensaios foi purificada pelo
sistema Milli-Q, Millipore (São Paulo, Brasil).
53
3.2 Otimização das condições cromatográficas LC-UV
As análises dos antidepressivos foram realizadas por cromatografia
líquida em fase reversa (C
18
).
Tabela 3: Composição das fases móveis avaliadas.
Fases Tampão acetato
0,25 mol L
-1
pH 4,5
Acetonitrila Metanol
1 60 % 37% 3%
2 55% 40% 5%
3 52% 43% 5%
4 50% 47% 3%
Fases Tampão fosfato
0,05 mol L
-1
pH 3,8
Acetonitrila
5 50% 50% -
6 53% 47% -
Para a obtenção de satisfatória resolução cromatográfica dos fármacos,
em menor tempo de análise, diferentes composições de fases móveis foram
avaliadas (Tabela 3).
54
Após a otimização da composição da fase móvel, as análises
cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo líquido da Varian, modelo
Prostar 230, equipado com detector Ultravioleta (Varian, modelo Prostar 310) e
detector de arranjo de iodo (Varian, modelo Prostar 330), comprimento de onda
selecionado em λ = 230 nm. Os fármacos foram separados em coluna
Lichrospher
®
60 RP-Select B (5 µm, 250 x 4 mm) (Merk - Darmstadt,
Alemanha), e pré-coluna RP-Select B (Merk - Darmstadt, Alemanha),
LiChroCART
®
4-4. A fase móvel selecionada para análise dos antidepressivos
foi: solução tampão fosfato 0,05 mol L
-1
, pH = 3,8 e acetonitrila (53:47 v/v),
com fluxo de 1 mL/min, no modo isocrático. O volume de amostra injetado foi
de 50 µL.
3.3 Desenvolvimento da barra SBSE com revestimento de PDMS/PPY
A barra de extração sortiva PDMS/PPY (Figura 23) foi desenvolvida em
parceria com o Prof. Dr. Fernando Mauro Lanças, Laboratório de Cromatografia
do Instituto de Química de São Carlos, USP.
Para o preparo da barra “home-made”, uma mistura de PDMS com
agente de cura na proporção 10:1 (m/m), respectivamente, e 10% (m/m) de
polipirrol foi colocada em um molde, desenvolvido para o preparo da barra,
contendo em seu interior, um tubo de aço inoxidável (2,5 cm), o qual foi
revestido com o polímero, sob vácuo para retirar as bolhas formadas. O molde
foi aquecido em forno nas seguintes condições: temperatura inicial 60°C,
durante 1 hora, rampa de aquecimento de 10°C/minuto até 220°C, mantendo
55
nesta temperatura por 2 horas. O volume total de revestimento foi de 22 µL
(10% PPY e 90% PDMS).
Figura 23: Barra SBSE revestida com PDMS/PPY.
3.4 Amostras de plasma
As amostras de plasma, branco de referência, livres de antidepressivos,
sorologia negativa para hepatite B e C, chagas, HIV, HTLV-I/II, TGP e sífilis
foram cedidas pelo Hemocentro do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto-
USP. Estas amostras foram enriquecidas com soluções padrão dos
antidepressivos em diferentes concentrações e com o padrão interno
(clomipramina, 50 µL, 10 µg mL
-1
), as quais resultaram em concentrações
plasmáticas que incluem os níveis terapêuticos. Estas amostras de plasma
foram utilizadas na validação analítica do método SBSE-LC/UV.
1,40 cm
57
agitação magnética constante durante 40 min. As variáveis: tempo de extração
(20, 30, 40 e 50 min) e temperatura (25, 40, 60 e 70°C) de extração foram
também otimizadas, simultaneamente, para cada fármaco.
Após a extração a barra SBSE foi retirada do frasco de extração e seca
com papel. Em seguida, para o processo de dessorção dos fármacos, a barra
SBSE foi inserida em um frasco de vidro pyrex cônico com tampa de rosca,
contendo 200 µL de fase móvel, e colocada em banho de ultra-som. Diferentes
tempos de dessorção foram avaliados (5, 10, 15, 20, 25, 30 min) à temperatura
ambiente (25°C). Após o processo de dessorção SBSE, uma alíquota de 50 µL
da solução foi injetada no cromatógrafo líquido.
Entre as extrações, a barra PDMS/PPY foi submetida a um processo de
limpeza, com água Milli-Q e metanol (70:30 v/v) por 20 min, à temperatura de
40°C, sob agitação magnética.
3.6 Estudo do mecanismo adsorção/absorção de extração
Para avaliação dos mecanismos de extração dos fármacos com a barra
de PDMS/PPY, análises individuais de amostras de plasma enriquecidas com
os antidepressivos, citalopram ou duloxetina na concentração plasmática de
500 ng mL
-1
, foram realizadas em replicatas ( n = 3), com diferentes tempos de
extração (30, 40 e 50 min). Os resultados obtidos, ou seja, análises
quantitativas individuais de citalopram e duloxetina, foram comparadas com os
obtidos nas análises de amostras de plasma enriquecidas com todos os
antidepressivos (mirtazapina, citalopram, paroxetina, duloxetina, fluoxetina e
sertralina) na concentração plasmática de 500 ng mL
-1
nas mesmas condições
58
de extração, em replicatas ( n = 3). Este procedimento, análise individual e
simultânea dos fármacos, foi também realizado com a barra de PDMS
desenvolvida no laboratório, segundo o procedimento descrito no item 3.3. No
entanto, somente o polímero PDMS foi utilizado para o preparo da barra.
3.7 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As morfologias das superfícies das barras de PDMS/PPY e PDMS
desenvolvidas foram avaliadas e comparadas por Microscopia Eletrônica de
Varredura. As barra de PDMS/PPY e PDMS foram cortadas e 1 cm destas,
foram recobertas com uma camada de ouro e analisadas no Microscópio
Eletrônico de Varredura (Zeiss EVO5O) do Departamento de Química,
FFCLRP da Universidade de São Paulo. As medidas foram feitas sob tensão
de 20.00KV, magnitude 30.00 KX e resolução nominal de 2 µm.
3.8 Validação analítica
Para a validação analítica do método SBSE/LC-UV padronizado,
amostras de plasma (branco de referência) foram enriquecidas com soluções
padrão dos antidepressivos, que resultaram em concentrações plasmáticas que
contemplam o intervalo terapêutico. Segundo as normas da ANVISA foram
avaliados os seguintes parâmetros: especificidade/seletividade, linearidade,
precisão, exatidão, limite de quantificação, limite de detecção e recuperação
relativa e absoluta.
59
3.8.1 Especificidade/ seletividade
Para determinar a especificidade do método SBSE, amostras de plasma
branco de referência foram enriquecidas com a solução do padrão interno
(clomipramina, 50 µL, 10 µg mL
-1
) e solução dos antidepressivos, que
resultaram em concentração plasmática de 500 ng mL
-1
, estas foram diluídas
com 3 mL de solução tampão pH = 9,0. O processo de extração foi realizado
em temperatura de 40°C durante 40 minutos sob agitação magnética
constante. Em seguida o processo de dessorção foi realizado em 200 µL de
fase móvel sob banho de ultra som, durante 15 minutos a temperatura
ambiente, após a dessorção dos analitos, uma alíquota de 50 µL foi injetada no
cromatógrafo líquido e analisadas em fluxo de 1 mL por minuto, fase móvel
tampão fosfato pH 3,8 0,05 mol L
-1
e acetonitrila (53:47 v/v), comprimento de
onda selecionado 256 nm.
Para a obtenção do cromatograma da amostra de plasma branco de
referência, livre dos antidepressivos, 1 mL de amostras de plasma foi diluído
com 3 mL de solução tampão pH = 9,0, em seguida submetido ao processo de
extração SBSE e as análises descritas no parágrafo anterior.
Os cromatogramas, de amostras de plasma enriquecido com os analitos
e amostras de plasma branco de referência foram comparados para verificar os
tempos de retenção dos analitos e dos compostos endógenos da matriz
biológica.
Outros fármacos, tais como: cafeína, moclobemida, diazepam,
carbamazepina, nortriptilina, imipramina e amitriptilina que os pacientes
60
depressivos podem administrar concomitantemente com os antidepressivos em
estudo foram também avaliados. As soluções padrões dos fármacos na
concentração de 500 ng mL
-1
foram analisados nas mesmas condições
cromatográficas estabelecidas para os antidepressivos em estudo.
Os tempos de retenção dos fármacos foram comparados com os tempos
de retenção dos analitos.
3.8.2 Linearidade
A linearidade do método foi avaliada segundo as normas da ANVISA, a
qual preconiza que esta seja determinada pela análise de, no mínimo, 5
concentrações diferentes. O procedimento foi realizado com amostras de
plasma branco de referência enriquecidas com a solução do padrão interno
(clomipramina, 50 µL, 10 µg mL
-1
) e solução padrão dos antidepressivos nas
concentrações que variaram do limite de quantificação a 500 ng mL
-1
e
submetidas ao processo de extração SBSE de acordo com metodologia citada
no item 3.5, sendo que cada concentração foi avaliada em replicatas (n = 5). As
curvas analíticas ou de calibração foram traçadas com os valores médios das
razões entre as áreas dos analitos extraídos e as áreas do padrão interno (eixo
y) e no eixo x as concentrações plasmáticas correspondentes.
61
3.8.3 Precisão inter ensaios
A precisão foi realizada em dias diferentes, com amostras de plasma
branco de referência enriquecidas com a solução padrão dos antidepressivos
nas concentrações 100, 300 e 500 ng mL
-1
em replicatas (n = 5) com adição do
padrão interno (clomipramina, 50 µL, 10 µg mL
-1
), e submetidas ao processo de
extração SBSE de acordo com metodologia citada no item 3.5. A precisão foi
avaliada pelo coeficiente de variação (CV%) calculada a partir do desvio
padrão absoluto e pelas médias das áreas das concentrações obtidas.
3.8.4 Exatidão
A exatidão do método foi verificada a partir de, 9 (nove) determinações,
contemplando o intervalo terapêutico, ou seja, três concentrações, 100, 300 e
500 ng mL
-1
, com três réplicas cada, e analisadas segundo os itens 3.5 e 3.2.
Os valores de exatidão foram determinados pela razão entre a concentração
média determinada experimentalmente e a concentração teórica
correspondente.
3.8.5 Limite de quantificação
Os limites de quantificação foram determinados através das extrações
de amostras de plasma enriquecidas com soluções padrão dos
antidepressivos, em concentrações decrescentes, até a obtenção da razão
sinal/ruído igual ou superior a 10, de acordo com as normas da ANVISA.
62
3.8.6 Limite de detecção
O limite de detecção foi avaliado com amostras de plasma enriquecidas
com as soluções padrão dos antidepressivos em concentrações decrescentes
até estabelecer uma razão sinal ruído igual ou superior a três vezes a linha de
base.
3.8.7 Recuperação relativa
A recuperação foi avaliada a partir de duas concentrações, uma baixa
(50 ng mL
-1
) e uma alta ( 500 ng mL
-1
) em replicatas (n = 5) com amostras de
plasma enriquecidas com a solução do padrão interno (clomipramina, 50 µL,
10 µg mL
-1
) e solução padrão dos antidepressivos e analisadas nas mesmas
condições descritas nos itens 3.5 e 3.2. O cálculo da recuperação foi realizado
pela comparação entre as razões das áreas dos analitos extraídos (razão entre
as médias das áreas do analito extraído e do padrão interno) e não extraídos
(razão entre as médias das áreas do padrão analítico injetado sem passar pelo
processo de extração e as médias das áreas do padrão interno também não
extraído).
3.9 Comparação das metodologias SBSE utilizando as barras de PDMS e
PDMS/PPY
A exatidão do método SBSE-PDMS/PPY foi também comprovada
através da comparação deste, com o método SBSE/PDMS
40
utilizando a barra
63
comercial de PDMS. Os resultados quantitativos dos diferentes métodos,
provenientes de amostras de plasma, enriquecidas com os analitos na faixa de
concentração de 50 a 500 ng mL
-1
, foram plotados em um gráfico. No eixo x, os
valores de concentração referentes ao método SBSE/PDMS e no eixo y, os
valores de concentração correspondentes ao método SBSE-PDMS/PPY.
64
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise cromatográfica LC-UV/DAD
4.1.1 Otimização da fase móvel
Em razão da interação do analito com a fase móvel, a seleção se seus
componentes são de extrema importância, para a obtenção de eficiente
separação dos analitos em menor tempo de análise. A fase móvel não deverá
apresentar leitura de absorbância, ou seja, totalmente transparente no
comprimento de onda selecionado para análise, caso o detector de ultravioleta
seja utilizado. Para a cromatografia líquida em fase reversa com supressão da
ionização, a solução tampão adicionada à fase orgânica deverá manter a
capacidade tamponante no decorrer das análises, para estabilizar as espécies
iônicas em solução.
Para otimização da fase móvel, na determinação simultânea dos
antidepressivos: mirtazapina, citalopram, paroxetina, duloxetina, fluoxetina e
sertralina, a fase: solução tampão acetato (0,25 molL
-1
, pH 4,5):
acetonitrila:metanol 60:37:3, v/v/v foi inicialmente avaliada. Nesta condição, os
fármacos apresentaram longos tempos de retenção (Figura 24a), o que tornou
inviável o tempo de análise. As proporções dos constituintes foram variadas, no
entanto, não se obteve bons resultados.
Outra fase móvel foi então avaliada: solução tampão fosfato (pH 3,8,
0,05 mol L
-1
) e acetonitrila, 50:50 v/v, respectivamente. Nesta condição, os
fármacos apresentaram satisfatória resolução cromatográfica, em menor tempo
65
de análise, porém variando-se a proporção da solução tampão fosfato para
53% e acetonitrila para 47% foi observado decréscimo no tempo de análise e
simetria dos picos (Figura 24b).
A ordem de eluição dos fármacos com seus respectivos tempos de
retenção são ilustrados na Tabela 4, o cromatograma dos fármacos referente à
análise da solução padrão dos antidepressivos (500 ng mL
-1
) com a fase móvel
selecionada é ilustrado na Figura 24b.
Tabela 4: Ordem de eluição dos fármacos e seus respectivos tempos de
retenção, com a fase móvel selecionada.
Antidepressivos Tempo de
retenção (min)
pKa
Mirtazapina 4,3 7,1
Citalopram 5,4 9,5
Paroxetina 6,3 9,9
Duloxetina 7,3 9,3
Fluoxetina 8,7 8,7
Sertralina 9,5 9,5
Clomipramina 10,5 9,0
66
(a)
(b)
Figura 24: Cromatograma referente à análise da solução padrão dos
antidepressivos (500 ng mL
-1
): 1- mirtazapina, 2 - citalopram, 3 - paroxetina, 4 -
duloxetina, 5 - fluoxetina, 6 - sertralina e 7 – clomipramina (P.I.). (a) fase móvel:
solução tampão acetato (0,25 molL
-1
, pH 4,5): acetonitrila:metanol (60:37:3,
v/v/v); (b) fase móvel: solução tampão fosfato 0,05 mol L
-1
, pH = 3,8 e
acetonitrila (53:47 v/v) .
67
Os fármacos mais apolares apresentaram maior retenção na fase
estacionária C
18
. Segundo os valores de pKa dos analitos, na condição de
análise, os analitos encontram-se ionizados não ocorrendo a supressão de
ionização. Como a fase estacionária utilizada C
18
select B é específica para
análise de compostos básicos, o mecanismo de interação predominante é a
partição.
A resolução cromtográfica mede a eficiência de separação entre dois
picos adjacentes, uma resolução cromatográfica satisfatória deverá apresentar
valores no intervalo de 1 a 1,5. De acordo com a Tabela 5, o cromatograma B
apresentou uma melhor resolução cromatográfica em relação ao cromatograma
A, ou seja, uma melhor separação entre os picos em menor tempo de análise.
O fator de retenção (k) mede a capacidade de retenção do analito pela
fase estacionária, quanto mais retido for o composto pela fase estacionária
maior será o valor de k. Valores de k entre 0,5 a 10 são desejáveis.
Observando a Tabela 5, no cromatograma A os valores de k variaram de 5,0 a
18, resultando em longo tempo de retenção dos fármacos e maior tempo de
análise. Já no cromatograma B (Tabela 5) os valores de k variaram de 1,2 a
4,3, resultando em menor tempo de retenção dos fármacos e menor tempo de
análise, além disso o cromatograma B apresentou sinal analítico mais intenso,
picos mais estreitos e simétricos permitindo uma melhor integração das áreas.
68
Tabela 5: Cálculo do fator de retenção e resolução cromtagráfica para os
cromatogramas A e B.
Fator de retenção (k) Resolução cromatográfica (R
s
)
Fármaco
Cromatogramas
A B
Cromatogramas
A B
Mirtazapina 5,0 1,2
Citalopram 5,5 1,7
Paroxetina 8,5 2,2
Duloxetina 10,0 2,7
Fluoxetina 13,0 3,4
Sertralina 17,0 3,8
Clomipramina 18,0 4,3
0,8
5,0
1,8
3,0
3,6
0,8
4,4
3,0
2,9
3,1
1,6
2,0
Cromatograma A: fase móvel: solução tampão acetato (0,25 molL
-1
, pH 4,5):
acetonitrila:metanol (60:37:3, v/v/v).
Cromatograma B: fase móvel: solução tampão fosfato 0,05 mol L
-1
, pH = 3,8 e
acetonitrila (53:47 v/v).
4.1.2 Identificação e quantificação dos fármacos
A identificação dos fármacos nas amostras de plasma foi realizada pela
comparação dos tempos de retenção dos antidepressivos obtidos, com os das
soluções padrão dos mesmos, injetadas individualmente nas mesmas
condições cromatográficas. Os espectros (absorbância versus comprimento de
onda) na região do ultravioleta (UV) também foram considerados.
69
Para a quantificação, utilizou-se o método do padrão interno. A
clomipramina (Figura 25) foi selecionada como padrão interno, pois atualmente,
este antidepressivo tem sido pouco utilizado no tratamento da depressão,
apresentou boa resolução cromatográfica, tem estrutura química similar aos
antidepressivos em estudo, estável na fase móvel utilizada e pôde ser
adicionada em concentrações similares aos dos analitos. Este método é
extremamente vantajoso, pois minimiza erros que poderiam ser gerados por
variações da matriz biológica, nas variáveis experimentais ou mesmo na barra
SBSE.
83
N
Cl
N
CH
3
CH
3
Figura 25: Estrutura química da clomipramina.
O comprimento de onda selecionado, λ = 230 nm, corresponde à região
de absorção UV máxima para a os fármacos analisados. Vários fármacos e
compostos endógenos também apresentam absorção (UV) no λ selecionado.
No entanto, no tempo de retenção dos analitos (tr) não foram observados picos
interferentes. No comprimento de onda selecionado a acetonitrila e o tampão
70
fosfato são transparente. Os limites de absorbância no UV (nm) para a
acetonitrila e tampão fosfato, são de 190 nm e menores que 200 nm,
respectivamente.
4.2 Padronização do método SBSE/LC-UV para análise simultânea de
antidepressivos
4.2.1 Otimização das variáveis SBSE
As variáveis tempo e temperatura de extração, pH da amostra e
condições de dessorção foram otimizadas para atingir o equilíbrio de sorção
em menor tempo de análise. A velocidade de agitação da barra SBSE e a
espessura do revestimento polimérico PDMS/PPY foram mantidas constantes
durante a otimização.
A velocidade de agitação da barra magnética SBSE influência no
processo de difusão do analito da matriz para a fase extratora polimérica, uma
alta velocidade de agitação pode aumentar a velocidade de transferência de
massa para a fase extratora em menor tempo de extração.
33
A velocidade de
agitação do agitador magnético foi mantida constante e em média velocidade.
A influência da variação do tempo de extração (20, 30, 40 e 50 min), em
diferentes temperaturas (25, 40, 60, e 70°C) no processo SBSE, é ilustrada nas
Figuras 26 a 32. Estas análises foram realizadas em triplicatas, para amostras
aquosas enriquecidas com os antidepressivos. Os valores apresentados no
gráfico são os valores médios com seus respectivos desvios.
71
20 30 40 50
12000
15000
18000
21000
24000
27000
30000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
25
0
C
40
0
C
60
0
C
70
0
C
Mirtazapina
Figura 26: Otimização do tempo e temperatura de extração para o
antidepressivo mirtazapina.
20 30 40 50
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
25
0
C
40
0
C
50
0
C
60
0
C
Citalopram
Figura 27: Otimização do tempo e temperatura de extração para o
antidepressivo citalopram.
72
20 30 40 50
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
25
0
C
40
0
C
60
0
C
70
0
C
Paroxetina
Figura 28: Otimização do tempo e temperatura de extração para o
antidepressivo paroxetina.
20 25 30 35 40 45 50
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
Média da área do pico
Tempo de extração (min)
25°C
40°C
60°C
70°C
Duloxetina
Figura 29: Otimização do tempo e temperatura de extração para o
antidepressivo duloxetina.
73
20 25 30 35 40 45 50
74
20 30 40 50
45000
54000
63000
72000
81000
90000
99000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
25
0
C
40
0
C
60
0
C
70
0
C
Clomipramina
Figura 32: Otimização do tempo e temperatura de extração para o
antidepressivo clomipramina.
De acordo com os gráficos das Figuras de 26 a 32, observamos que o
aumento da temperatura de extração SBSE de 25°C para 40°C resultou em
maiores taxas de extração, pois o aumento da temperatura favoreceu a difusão
dos analitos para a fase extratora. Com o aumento da temperatura acima de
40°C ocorreu perda da eficiência de extração, devido à diminuição do
coeficiente de distribuição dos analitos entre a fase extratora e a amostra. O
equilíbrio de sorção foi alcançado em 40 minutos para a maioria dos fármacos.
Quando se trabalha com fármacos que apresentam grupos ionizáveis, o
pH da amostra deverá ser considerado na otimização do processo SBSE. O
revestimento de polidimetilsioxano (PDMS) extrai somente analitos não
iônicos
37-39
, no entanto, o revestimento de polipirrol é capaz de extrair
compostos na sua forma iônica. O ajuste do pH da matriz biológica em valores,
75
nos quais, os fármacos encontram-se, na sua maior parte, na forma não
dissociada, aumentará a eficiência de extração pelo revestimento de PDMS.
O efeito do pH da matriz biológica na eficiência de extração pode ser
observado na Figura 33.
56789
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Média área do pico
pH
Mirtazapina
Citalopram
Paroxetina
Duloxetina
Fluoxetina
Sertarlina
Clomipramina
Figura 33: Otimização do pH da amostra para as análises SBSE/LC.
Segundo os resultados obtidos, o aumento no valor de pH, resultou em
uma maior quantidade de fármaco extraído. Desta forma, as demais extrações
foram realizadas com a diluição da amostra de plasma com solução tampão em
pH 9,0. Este resultado está de acordo com o esperado, pois segundo os
valores de pKa dos antidepressivos estudados (Tabela 4), neste valor de pH
estes fármacos encontram parcialmente dissociados ou não dissociados,
76
resultando em uma maior quantidade de fármaco extraído. A diluição com
solução tampão também diminui a viscosidade da matriz biológica, favorecendo
o processo de difusão dos analitos para a fase extratora, pois diminui a
interferência das proteínas no processo SBSE. Valores extremos de pH podem
danificar o revestimento polimérico da barra de PDMS/PPY, portanto, com o
intuito de preservar a barra SBSE, não foram avaliados valores de pH acima de
9,0.
O processo de dessorção dos fármacos (Figura 34) foi realizado a
temperatura ambiente (25°C), em um frasco cônico contendo 200 µL de fase
móvel, sob banho de ultra-som. O equilíbrio de dessorção foi alcançado em 25
minutos. No entanto, o tempo de dessorção de 15 minutos foi escolhido para
análises subseqüentes, para diminuir o tempo de análise, pois nestas
condições o processo SBSE apresentou sensibilidade analítica adequada para
a análise dos fármacos. Após a limpeza da barra SBSE, entre as extrações,
não foi observado a presença de interferentes, ou seja, efeito memória.
A robustez da barra SBSE é influenciada pela matriz analisada e pelos
critérios ou cuidados do analista, como a lavagem das barras entre as
extrações. O pH da fase móvel, tampão fosfato pH 3,8 e acetonitrila 53:47 (v/v)
favoreceu o processo de dessorção, pois neste pH os analitos encontram-se na
forma não iônica. A barra PDMS/PPY foi reutilizada mais de 60 extrações sem
perda da eficiência do processo SBSE. Desta forma, comprovamos a robustez
da barra SBSE de PDMS/PPY desenvolvida.
77
5 1015202530
0
20000
40000
60000
80000
100000
Média área do pico
Tempo de dessorção (min)
Mirtazapina
Citalopram
Paroxetina
Duloxetina
Fluoxetina
Sertralina
Clomipramina
Figura 34: Otimização do tempo de dessorção SBSE.
As melhores condições SBSE, entre as avaliadas, foram: 1 mL de
amostra diluída em solução tampão borato pH 9,0, tempo de extração de 40
min a temperatura de 40°C, sob agitação magnética. O processo de dessorção
foi realizado com a inserção da barra em um frasco cônico contendo 200µL de
fase móvel a temperatura ambiente (25°C) durante 15 min, em banho de ultra-
som.
78
4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
As morfologias das superfícies das barras de PDMS/PPY foram
avaliadas por Microscopia Eletrônica de Varredura, Figura 35. A presença de
poros na superfície do revestimento polimérico deverá aumentar a área ativa
da superfície extratora.
69
(a)
(b)
Figura 35: Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura (a) barra de
PDMS/PPY (b) barra de PDMS.
79
Na superfície do revestimento da barra de PDMS/PPY (Figura 35a)
observou-se a presença de estrutura porosa (PPY) e não-porosa (PDMS), já na
barra de PDMS (Figura 35b), observou-se somente a estrutura não porosa.
Quanto maior a área da superfície ativa polimérica, maior o número de sítios
ativos disponíveis e, portanto uma maior seletividade e sensibilidade analítica.
A interação dos fármacos, através do processo de adsorção junto à
superfície PDMS/PPY foi confirmada pelas análises de amostras de plasma
enriquecidas somente com um fármaco (citalopram ou duloxetina), análise
individual, e análises de amostras de plasma enriquecidas com todos os
antidepressivos em estudo, análise simultânea (Figura 36).
80
30 35 40 45 50
4000
8000
12000
16000
20000
24000
28000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
Barra de PDMS/PPY
Análise contendo somente duloxetina
Análise contendo todos os antidepressivos
Barra de PDMS
Análise contendo somente duloxetina
Análise contendo todos os antidepressivos
(a)
30 35 40 45 50
100000
120000
140000
160000
180000
Média área do pico
Tempo de extração (min)
Barra de PDMS/PPY
Análise contendo somente duloxetina
Análise contendo todos os antidepressivos
Barra de PDMS
Análise contendo somente duloxetina
Análise contendo todos os antidepressivos
(b)
Figura 36: Análise individual e simultânea para o antidepressivo (a) citalopram
e (b) duloxetina, com a barra de PDMS/PPY e PDMS.
81
Segundo a Figura 36, nas amostras enriquecidas somente com
citalopram ou duloxetina, a quantidade do fármaco extraído com a barra SBSE
de PDMS/PPY foi maior, quando comparada à quantidade de extraída nas
amostras contendo todos os antidepressivos em estudo. Pois, nas análises
individuais não há competição pelos sítios
82
4.4 Validação analítica do método SBSE/LC padronizado
4.4.1 Especificidade/seletividade
A especificidade/seletividade do método padronizado é demonstrada
pelos cromatogramas das análises de amostras de plasma branco de
referência (Figura 37a), e amostras de plasma enriquecida com os
antidepressivos, na concentração de 500 ng mL
-1
(Figura 37b). Nestes
cromatogramas não foram observados picos interferentes de compostos
endógenos nos tempos de retenção dos analitos. A interferência de outros
fármacos que os pacientes poderiam administrar concomitantemente com os
antidepressivos analisados foram também avaliados. Segundo a Tabela 6, os
fármacos analisados não co-eluiram com os analitos.
83
(a)
(b)
Figura 37: (a) cromatograma da amostra de plasma branco de referência (b)
cromatograma da análise dos antidepressivos extraídos da amostra de plasma
branco de referência enriquecida com os antidepressivos (1- mirtazapina, 2 -
citalopram, 3 - paroxetina, 4 - duloxetina, 5 - fluoxetina, 6 - sertralina e 7 -
clomipramina), na concentração de 500 ng mL
-1
.
84
Tabela 6: Tempo de retenção dos fármacos analisados.
Drogas Tempo de retenção (min)
Cafeína 2.00
Moclobemida 2.60
Diazepam 2.70
Carbamazepina 4,00
Mirtazapina 4,40
Citalopram 5.40
Nortriptilina 5.80
Paroxetina 6.30
Imipramina 6.80
Amitriptilina 6.80
Duloxetina 7.30
Fluoxetina 8.70
Sertralina 9,50
Clomipramina 10,5
Como pode ser observado nos cromatogramas das Figuras 37b e 24b,
ocorreu uma pequena variação no tempo de retenção dos fármacos, isto foi
devido à perda de eficiência na separação dos compostos pela coluna C
18
select B com o tempo de uso, ou adsorção irreversível de proteínas.
85
4.4.2 Linearidade
A linearidade do método SBSE/LC foi avaliada com amostras de plasma
enriquecidas com padrões analíticos no intervalo de concentração
correspondente ao limite de quantificação (LQ) a 500 ng mL
−1
(Tabela 7). A
equação de regressão linear e o coeficiente de correlação linear para os
fármacos são apresentados na Tabela 7. Os intervalos avaliados foram lineares
com coeficientes de determinação maiores que 0,993 (Tabela 7). As Figuras
de 38 a 43 ilustram as curvas analíticas, utilizadas nas análises quantitativas
dos antidepressivos nas concentrações (LQ, 50, 100, 300 e 500 ng mL
-1
) com
seus respectivos desvios padrão .
Figura 38: Curva analítica para o antidepressivo mirtazapina.
0 100 200 300 400 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
A
p
/A
pi
Concentração (ng mL
-1
)
86
0 100 200 300 400 500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
A
p
/A
pi
Concentração (ng mL
-1
)
Figura 39: Curva analítica para o antidepressivo citalopram.
0 100 200 300 400 500
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
A
p
/A
pi
Concentração (ng ml
-1
)
Figura 40: Curva analítica para o antidepressivo paroxetina.
87
0 100 200 300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
A
p
/A
pi
Concentração (ng mL
-1
)
Figura 41: Curva analítica para o antidepressivo duloxetina.
0 100 200 300 400 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
A
p
/A
pi
Concentração (ng mL
-1
)
Figura 42: Curva analítica para o antidepressivo fluoxetina.
88
0 100 200 300 400 500
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
A
p
/A
pi
Concentração (ng mL
-1
)
Figura 43: Curva analítica para o antidepressivo sertralina.
4.4.3 Limite de quantificação (LQ) e limite de detecção (LD)
Os valores de limites de quantificação (LQ) do método SBSE/LC para
todos os fármacos foram determinados como a menor concentração na curva
de calibração e razão sinal/ruído maior ou igual 10. De acordo com a Tabela 7,
o coeficiente de variação no LQ foi inferior a 15%, para todas as concentrações
avaliadas, de acordo com as normas da ANVISA. Os resultados obtidos de LQ
apresentaram-se dentro do intervalo terapêutico (15 a 1000 ng mL
-1
para a
fluoxetina, 50 a 500 ng mL
-1
para a sertralina, 20 a 500 ng mL
-1
para a
paroxetina e 25 a 550 ng mL
-1
para o citalopram) recomendado para os
antidepressivos analisados
6
, mostrando que o método SBSE/LC padronizado
pode ser aplicado para análise dos antidepressivos neste intervalo de
concentração.
89
O limite de detecção (LD), correspondente o sinal analítico igual ou
superior a três vezes o ruído da linha de base, o qual variou no intervalo de 5 a
20 ng mL
−1
para os antidepressivos analisados (Tabela 7).
Tabela 7: Regressão linear, LQ e LD para o método SBSE/LC.
Antidepressivos
Regressão linear
(y =a + bx)
LQ a 500 ng mL
-1
r
2
LQ
1
(ng mL
-1
)
CV (%)
no LQ
(n = 5)
LD
2
(ng mL
-1
)
Mirtazapina
y = 0,109 + 0,0014 x
0,993 20,0
9,2 5,0
Citalopram
y = 0,018 + 0,0013 x
0,997 20,0
6,6
5,0
Paroxetina
y = 0,047 + 5,3. 10
-4
x
0,994 30,0
8,9
10,0
Duloxetina
Y = 0,120 + 0,0023 x
0,994 20,0
13,2
5,0
Fluoxetina
y = 0,024 + 0,0022 x
0,998 30,0
3,6
10,0
Sertralina
y = 0,119 + 9,1. 10
-4
x
0,998 50,0
2,8
20,0
1
LQ: limite de quantificação,
2
LD: limite de detecção.
90
4.4.4 Precisão inter ensaios e exatidão
A precisão inter ensaios do método SBSE/LC foi realizada em dias
diferentes e avaliada utilizando-se amostras de plasma branco de referência,
enriquecidas com padrões analíticos dos antidepressivos nas concentrações de
100, 300 e 500 ng mL
-
1. A precisão foi expressa pelo cálculo do coeficiente de
variação (CV%) (Tabela 8), cujos valores obtidos foram menores que 14%
para todos os fármacos analisados. Estes resultados mostraram que o método
SBSE/LC apresenta precisão analítica adequado, para as análises de
antidepressivos nas concentrações plasmáticas estudadas.
A exatidão foi determinada utilizando-se, 3 (três) concentrações (baixa,
média e alta), as quais contemplaram o intervalo terapêutico, sendo realizadas
5 (cinco) determinações por concentração. Os valores obtidos variaram de 96
a 106%, os quais estão de acordo com as normas da ANVISA (Tabela 8).
91
Tabela 8: Precisão inter ensaios e exatidão para o método SBSE/LC em
amostras de plasma.
Antidepressivos Concentração
Adicionada
(ng mL
-1
)
Concentração
Obtida
(ng mL
-1
) ± DP
CV (%)
(n = 5)
Exatidão
(%)
(n = 5)
Mirtazapina
100,0
300,0
500,0
102,1 ± 0,24
295,3 ± 0,52
506,8 ± 0,80
4,5
2,6
12,0
102
98
101
Citalopram
100,0
300,0
500,0
98,3 ± 0,14
300,6 ± 0,40
497,8 ± 0,66
13,3
2,5
4,0
98
100
99
Paroxetina
100,0
300,0
500,0
105,8 ± 0,01
293,0 ± 0,20
506,8 ± 0,31
14,0
3,8
2,2
105
97
101
Duloxetina
100,0
300,0
500,0
112,0 ± 0,35
318,0 ± 0,81
494,0 ± 1,27
6,8
2,8
1,4
112
106
98
Fluoxetina
100,0
300,0
500,0
103,0 ± 0,24
289,0 ± 0,98
495,0 ± 1,11
4,6
6,4
2,0
103
96
99
Sertralina
100,0
300,0
500,0
101,0 ± 0,21
298,1 ± 0,39
502,0 ± 0,57
6,3
2,2
2,2
101
99
100
92
4.4.5 Recuperação absoluta e relativa
As taxas de recuperação relativas e absolutas foram avaliadas em
replicatas (n = 5), a partir das amostras de plasma (branco de referência)
enriquecidas com padrões analíticos que resultou nas concentrações de 50 e
500 ng mL
-1
(Tabela 9). Os valores de recuperação absoluta e relativa obtidos
foram satisfatórios nas concentrações analisadas, entre as quais a mirtazapina
e a fluoxetina apresentaram valores acima de 60% para a concentração
avaliada de 500 ng mL
-1
. A ANVISA também preconiza que também serão
aceitos valores de recuperação próximos a 50%, desde que estes apresentem
valores de precisão e exatidão analítica adequados. Também pode ser
observado que as taxas de recuperação, para a maioria dos antidepressivos,
aumentaram nas baixas concentrações, pois em menores concentrações,
observa-se menor competição (substituição) entre os analitos pelos sítios
ativos na superfície polimérica do polipirrol.
93
Tabela 9: Valores das taxas de recuperação relativos e absolutos obtidas.
Recuperação (%)
Concentração adicionada
50 ng mL
-1
500 ng mL
-1
Antidepressivos
Relativa Absoluta
Relativa Absoluta
Mirtazapina 53 56 83 71
Citalopram 44 46 43 31
Paroxetina 57 59 30 25
Duloxetina 39 40 50 36
Fluoxetina 49 50 76 65
Sertralina 51 52 52 45
4.5 Análise de amostras de plasma de pacientes: aplicação do método
SBSE/LC
Para avaliação do método SBSE/LC-UV, padronizado e validado de
acordo com as normas da ANVISA, para o uso clínico, foram utilizadas as
amostras de plasmas de quatro pacientes em terapia com os antidepressivos
duloxetina (Cymbalta
®
- 60 mg/dia), fluoxetina (Prozac
®
– 20 mg/dia) e
sertralina (Zoloft
®
- 150 mg/dia).
O perfil dos picos cromatográficos dos analitos e suas resoluções são
similares àquelas obtidas em amostras de plasma branco de referência
enriquecido com os antidepressivos. Também não foi observado nenhum pico
interferente nos tempos de retenção dos antidepressivos analisados. As
94
concentrações plasmáticas determinadas nas amostras dos pacientes foram as
seguintes: 434,8 ng mL
-1
para duloxetina (Figura 44a), 398,7 ng mL
-1
para
fluoxetina (Figura 44b) e 554,0 ng mL
-1
para sertralina (Figura 44c).
95
(a)
(b)
(c)
Figura 44: Cromatogramas referentes as análise SBSE/LC de amostras de
plasma de pacientes depressivos (a) duloxetina (434,8 ng mL
-1
), (b) fluoxetina
(398,7 ng mL
-1
) e (c) sertralina (554,0 ng mL
-1
).
96
4.6 Comparação das metodologias SBSE-PDMS/PPY e SBSE-PDMS com a
barra comercial
Com o intuito de demonstrar a equivalência entre as concentrações
plasmáticas determinadas através dos métodos SBSE-PDMS/PPY e SBSE-
PDMS
40
padronizados, seus parâmetros de validação analítica foram
comparados. Os resultados encontram-se nas Tabela 10 e 11 e nas Figuras 45
a 49.
Tabela 10: Comparação dos valores de recuperação relativa e limite de
quantificação para os métodos SBSE-PDMS/PPY e SBSE-PDMS.
Recuperação relativa (%)
50 ng mL
-1
Limite de quantificação
Antidepressivos
SBSE-PDMS SBSE-
PDMS/PPY
SBSE-
PDMS
SBSE-
PDMS/PPY
Mirtazapina 57 53 40 20
Citalopram 92 44 10 20
Paroxetina 52 57 40 30
Fluoxetina 77 49 25 30
Sertralina 95 51 35 50
97
A competição dos analitos e dos compostos endógenos pelos sítios
ativos da superfície da fase PDMS/PPY, através do processo de adsorção,
influenciaram nas taxas de recuperação.
Os valores de LQ obtidos no método SBSE-PDMS/PPY foram próximo
aos obtidos no método SBSE-PDMS, ambos os métodos apresentaram
sensibilidade analítica adequada para análise de antidepressivos em amostras
de plasma.
A equivalência entre as concentrações plasmáticas determinadas
através dos métodos SBSE-PDMS/PPY e SBSE-PDMS
40
padronizados foi
comprovada através das equações de regressão linear e seus respectivos
coeficientes de correlação (Figura 45 a 49).
98
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE(PDMS-PPY)
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS)
Fluoxetina
y = 16,04 ± 6,36 + 0,97 ± 0,02 x
r= 0,999
Limite de confiança = 95%
Figura 45: Curva de regressão linear para o antidepressivo fluoxetina. As
linhas tracejadas representam o limite de confiança de 95%.
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS-PPY)
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS)
Figura 46: Curva de regressão linear para o antidepressivo citalopram. As
linhas tracejadas representam o limite de confiança de 95%.
99
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS-PPY)
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS)
Figura 47: Curva de regressão linear para o antidepressivo mirtazapina. As
linhas tracejadas representam o limite de confiança de 95%.
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS-PPY)
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS)
Figura 48: Curva de regressão linear para o antidepressivo sertralina. As linhas
tracejadas representam o limite de confiança de 95%.
100
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS-PPY)
Concentração plasmática (ng mL
-1
)
SBSE (PDMS)
Figura 49: Curva de regressão linear para o antidepressivo paroxetina. As
linhas tracejadas representam o limite de confiança de 95%.
Para as equações de regressão linear os valores de a = 0 e b = r = 1 são
desejáveis, porém devidos aos erros sistemáticos, esta condição na realidade
não ocorre. Empregando o limite de confiança assumimos a ausência de
qualquer erro sistemático.
84
De acordo com as curvas de regressão linear (Figuras 45 a 49), as quais
foram plotadas dentro do limite de confiança de 95%, os valores de r foram
próximos de 1, assim como os valores de b (Tabela 11), demonstrando que
ambos os métodos SBSE são equivalentes no intervalo de concentração
plasmática de 50 a 500 ng mL
-1
.
101
Tabela 11: Equação de regressão linear, coeficiente de correlação (r) no limite
de confiança de 95% para as amostras de plasma enriquecidas com os
antidepressivos (50 a 500 ng mL
-1
).
Fármacos Equação de regressão
linear
y = a + bx
Coeficiente de correlação
(r)
Mirtazapina -0,64 ± 9,74 + 0,99 ± 0,03 x 0,9987
Citalopram 10,88 ± 8,39 + 1,04 ± 0,03 x 0,9984
Paroxetina 4,38 ± 11,06 + 0,99 ± 0,03 x 0,9984
Fluoxetina 16,04 ± 6,36 + 0,97 ± 0,02 x 0,9979
Sertralina 0,56 ± 2,14 + 1,06 ± 0,007 x 0,9998
102
5 PERSPECTIVAS FUTURAS
A avaliação de novas fases extratoras SBSE mais hidrofílicas, com
grupos iônicos ou imunosorventes ligadas à superfície extratora permearão a
padronização de métodos cromatográficos mais seletivos/específicos e de alta
sensibilidade analítica para a análise de fármacos em fluido biológicos.
A influência das proteínas e suas ligações aos fármacos, também
deverão ser avaliadas no processo SBSE, visando aumentar as taxas de
recuperação.
103
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A otimização das variáveis SBSE: tempo e temperatura de extração,
tempo de dessorção e pH da matriz biológica, baseada no equilíbrio de sorção
dos analitos entre as fases: polimérica (PDMS/PPY) e fluido biológico, permitiu
a determinação dos analitos em concentrações plasmáticas que contemplam o
intervalo terapêutico.
A presença de estrutura porosa (PPY) e não porosa (PDMS) na
superfície polimérica da barra extratora SBSE-PDMS/PPY foi confirmada
através das análises por Microscopia Eletrônica de Varredura. De acordo, com
os resultados obtidos nas análises de MEV e nas análises (individuais e
simultâneas) de amostras de plasma enriquecidas com os analitos, os
mecanismos de retenção dos fármacos junto à superfície PDMS/PPY
ocorreram através dos processos de adsorção (PPY) e absorção (PDMS).
A validação analítica foi realizada segundo as normas da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária. O método padronizado apresentou linearidade
no intervalo de concentração plasmática que variou dos limites de quantificação
a 500 ng mL
-1
, com coeficientes de determinação maiores que 0,994, precisão
inter ensaios com coeficientes de variação menores que 15% e exatidão de
96% a 106%. Os valores de limites de quantificação obtidos são congruentes
com a menor concentração plasmática do intervalo terapêutico preconizado.
Segundo os parâmetros de validação analítica investigados, o método
SBSE-PDMS/PPY apresentou sensibilidade, linearidade, especificidade,
precisão, exatidão e robustez adequados para análise dos antidepressivos
104
(mirtazapina, citaloporam, paroxetina, duloxetina, fluoxetina e sertralina) em
amostras de plasma, para fins de monitorização terapêutica.
O método SBSE - PDMS/PPY padronizado e validado foi utilizado para
determinações dos antidepressivos sertralina, duloxetina e fluoxetina em
amostras de plasma de pacientes, em terapia com estes fármacos. Desta
forma, o método SBSE-PDMS/PPY poderá ser empregado para fins de
monitorização terapêutica.
105
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