ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
Rafael Mariano de Bitencourt
ADMINISTRAÇÃO DE CANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
FACILITA A EXTINÇÃO DE MEMÓRIAS AVERSIVAS EM RATOS
Florianópolis – SC
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA
Rafael Mariano de Bitencourt
ADMINISTRAÇÃO DE CANABINÓIDES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL
FACILITA A EXTINÇÃO DE MEMÓRIAS AVERSIVAS EM RATOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Farmacologia do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Santa Catarina como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Naoto Takahashi
Florianópolis – SC
2008
ads:
III
“I still haven’t found what I’m looking for”
U2
IV
Dedico este trabalho
ao grande Arquiteto da vida, seja ele quem for, por tê-la feito de
uma forma perfeitamente imperfeita, nos permitindo algumas
dúvidas que nos impulsionam atrás de respostas.
Aos meus pais que muitas vezes abdicaram de seus próprios
sonhos para que fossem possíveis os meus.
V
AGRADECIMENTOS
Aquele a quem a maioria das pessoas se refere como Deus, porém prefiro chamá-lo de o
grande “Arquiteto” da vida, visto a trivialidade que o primeiro nome ganhou, muitas vezes se
desviando do verdadeiro sentido no qual eu acredito. Obrigado pela energia, força e luz que
guia meu caminho, sempre dispensadas quando preciso;
Aos meus pais, Pedro Paulo e Maria da Conceição (Nina), por me conceberem a vida, que não
se trata apenas da fecundação de um óvulo pelo espermatozóide, e sim todo amor, carinho,
apoio incondicional e ensinamentos exemplares que nunca me faltaram;
Aos meus irmãos, os quais me orgulham muito e que desde cedo aprenderam as virtudes do
respeito e da paciência, entendendo que cada um tem sua vez e sabendo esperar quando
necessário;
Aos meus avós. Aqueles que já foram, deixando a lembrança e o exemplo de pessoas
batalhadoras e humildes; e aos presentes, pelo apoio e demonstração de que o tempo não é
necessariamente um inimigo;
A minha namorada Raquel, pela paciência, dedicação, apoio e companheirismo,
principalmente nos momentos mais difíceis, dos quais mais precisei dela;
A família da minha namorada que nesses tempos tem se portado como uma segunda família
me dando apoio inquestionável sobre cada uma de minhas decisões;
VI
Ao professor Reinaldo, o qual os ensinamentos ultrapassaram os limites da ciência,
permitindo-me aprender muito mais do que como ser um bom pesquisador;
A professora Gina e todos os seus alunos da época, Inácio, Maristela, Léo e Fabi, cuja
receptividade e apoio foram fundamentais no inicio da minha empreitada científica;
Ao demais professores do Departamento de Farmacologia os quais, sempre que precisei,
mostraram-se bastante dispostos e eficientes, além de servirem como exemplos incentivadores
cujos reflexos procuro me espelhar;
Ao colega de laboratório, parceiro deste trabalho e amigo Fabrício A. Pamplona pela
colaboração, sugestões e críticas sempre bastante pertinentes e que certamente contribuíram (e
continuam contribuindo) de forma perspicaz para o desenvolvimento deste estudo;
Aos colegas de laboratório e amigos Pablo, Daniel, Pamplona, Assini, Aderbal, Meigy,
Vanessa e Cris e aos ex-colegas Rui, Leandro e Luciano pela amizade, companheirismo e
momentos de descontração imprescindíveis para uma boa convivência no laboratório e,
conseqüentemente, para que o trabalho pudesse fluir da melhor maneira possível.
Ao colega do Departamento Filipe S. Duarte pelas várias ajudas nos cálculos de diluição de
drogas bem como no fornecimento da dose exata do diazepam utilizado nos experimentos do
LCE potencializado pelo medo;
Aos demais colegas do Departamento e também colegas de “futeba” Rimenez, Gilliard,
Fabrício, Pamplona, Daniel, Geison, Jarbas, Eduardo, Rodrigo, Rui e Francisney pelos bons
VII
momentos de “cerva” que sucedem os não tão bons jogos de “futeba” os quais serviram,
principalmente, para não deixar dúvidas sobre a carreira escolhida e mostrar a todos que são
ótimos pesquisadores quando vistos jogando futebol;
A “família” do Juriti 301, aos integrantes atuais Gilliard “gillidói”, Murilo “morcego”,
Gustavo “Finarde” e aos que já passaram Rimenez “careca”, Fabrício “calvício”, Leonardo
“espaguete”, Guilherme “blush”, por todos os momentos até aqui compartilhados, bons e
ruins, por se portarem como família nos momentos difíceis e como grande amigos nos
momentos felizes;
Aos funcionários do Departamento Pedro, Redna, Rita e Diana sempre prestativos e sem
medir esforços para atender-me nos momentos que precisei;
Enfim, a todas as pessoas e amigos, muitos não citados, que de uma maneira ou de outra
acabam contribuindo para que eu vá cada vez mais adiante;
A Sanofi-Aventis, por ter gentilmente doado uma das drogas utilizadas neste estudo;
A CAPES pelo apoio financeiro, fundamental para que eu pudesse desenvolver este trabalho.
VIII
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIAÇÕES XI
LISTA DE FIGURAS XIII
RESUMO XV
ABSTRACT XVI
1 - INTRODUÇÃO 01
1.1 - Aspectos históricos e uso da Cannabis Sativa 01
1.2 - A descoberta do sistema endocanabinóide 03
1.3 - Desenvolvimento e caracterização farmacológica de ligantes para os
receptores canabinóides 07
1.4 - O sistema endocanabinóide como alvo terapêutico em condições
fisiopatológicas 08
1.5 - Comportamento defensivo, memórias aversivas e o modelo animal de
extinção do condicionamento aversivo 10
2 - OBJETIVOS 15
2.1 - Objetivo geral 15
2.2 - Objetivos específicos 15
3 - MATERIAIS E MÉTODOS 16
3.1 - Animais 16
3.2 - Drogas 16
3.3 - Cirurgia estereotáxica
17
IX
3.4 - Procedimento de infusão 18
3.5 - Procedimentos comportamentais 19
3.5.1 - Condicionamento aversivo contextual 19
3.5.1.1 - Experimento 1: Efeitos da administração i.c.v. de
AM404 na extinção do CA contextual 20
3.5.1.2 - Experimento 2: Efeitos da administração i.c.v.
de CBD na extinção do CA contextual 21
3.5.1.3 - Experimento 3: Participação dos receptores canabinóides
CB
1
nos efeitos do AM404 21
3.5.1.4 - Experimento 4: Participação dos receptores CB
1
nos efeitos do CBD 22
3.5.1.5 - Experimento 5: Participação dos receptores vanilóides
TRPV
1
nos efeitos do AM404 22
3.5.1.6 - Experimento 6: Participação dos receptores TRPV
1
nos efeitos do CBD 23
3.5.2 - Labirinto em cruz elevado 24
3.5.2.1 - Experimento 7: Efeitos do AM404, CBD e DZP no
LCE potencializado pelo medo 24
3.6 - Perfusão e histologia 25
3.7 - Análise gráfica e estatística 26
4 - RESULTADOS 28
4.1 - Condicionamento aversivo contextual 28
4.1.1 - Experimento 1: Efeitos da administração i.c.v. de AM404
na extinção do CA contextual
28
X
4.1.2 - Experimento 2: Efeitos da administração i.c.v. de CBD
na extinção do CA contextual 30
4.1.3. - Experimento 3: Participação dos receptores canabinóides
CB
1
nos efeitos facilitatórios do AM404 32
4.1.4 - Experimento 4: Participação dos receptores CB
1
nos efeitos facilitatórios do CBD 34
4.1.5 - Experimento 5: Participação dos receptores vanilóides TRPV
1
nos efeitos facilitatórios do 36
4.1.6 - Experimento 6: Participação dos receptores TRPV
1
nos efeitos facilitatórios do CBD 38
4.2 - Labirinto em cruz levado 40
4.2.1 - Experimento 7: Efeitos do AM404, CBD e DZP no LCE
potencializado pelo medo 41
5 - DISCUSSÃO 44
6 - CONCLUSÕES 56
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 57
XI
LISTA DE ABREVIAÇÕES
∆
9
-THC - ∆
9
- tetrahidrocanabinol
2-AG - 2araquidonilglicerol
a.C - antes de Cristo
AMPc - adenosina monofasfato cíclica
ANOVA - análise de variância
AP - anteroposterior
BLA - amígdala basolateral
CA - condicionamento aversivo
CBD - canabidiol
CEUA - Comitê de Ética Para o Uso de Animais
CPZ - capsazepina
DV - dorso ventral
E.P.M. - erro padrão da média
EC - estímulo condicionado
eCB - endocanabinóide
EI - estímulo incondicionado aversivo
EUA - Estados Unidos da América
FAAH - amido hidrolase de ácidos graxos
GABA - ácido δ-amino-butírico
i.c.v. - intracerebroventricular
i.p. - intraperitoneal
LCE - labirinto em cruz levado
LTD - depressão de longa duração
XII
LTP - potenciação de longa duração
ML - médio lateral
RNAm - ácido ribonucléico
SNC - sistema nervoso central
UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina
XIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Breve histórico dos registros de uso da Cannabis em todo o mundo 02
Figura 2 - Breve histórico dos avanços na investigação sobre os mecanismos de ação dos
canabinóides 04
Figura 3 - Representação esquemática do sistema endocanabinóide nos neurônios pré- e pós-
sinápticos 06
Figura 4 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 1 20
Figura 5 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 2 21
Figura 6 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 3 22
Figura 7 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 4 22
Figura 8 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 5 23
Figura 9 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 6 23
Figura 10 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 7 25
Figura 11 – Efeitos da administração i.c.v. de AM404 (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) na extinção do CA
contextual 30
Figura 12 – Efeitos da administração i.c.v. de CBD (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) na extinção do CA
contextual 32
Figura 13 – Efeitos do antagonista dos receptores canabinóides CB
1
SR141716A (0,2 mg/kg;
i.p.) nos efeitos facilitatórios do AM404 (1,0 µg/µl; i.c.v.)
XIV
Figura 14 - Efeitos do antagonista SR141716A (0,2 mg/kg; i.p.) nos efeitos facilitatórios do
CBD (2,0 µg/µl; i.c.v) 36
Figura 15 - Efeitos do antagonista dos receptores vanilóides TRPV
1
CPZ (5,0 µg/µl; i.c.v.)
nos efeitos facilitatórios do AM404 (1,0 µg/µl; i.c.v) 38
Figura 16 - Efeitos do antagonista CPZ (5,0 µg/µl; i.c.v.) nos efeitos facilitatórios do CBD
(2,0 µg/µl; i.c.v) 40
Figura 17 – Efeitos da administração i.c.v. de AM404 (1,0 µg/µl), CBD (2,0 µg/µl) e DZP
(2,85 µg/µl) no LCE potencializado pelo medo 43
XV
RESUMO
Recentemente, estudos têm demonstrado a capacidade do sistema endocanabinóide (eCB) em
modular estados emocionais e a extinção de memórias aversivas em animais. Em um estudo
pioneiro foi demonstrada a liberação de eCB no cérebro de camundongos durante a extinção
do condicionamento aversivo (CA), destacando a influência que manipulações farmacológicas
do sistema eCB poderiam exercer sobre as memórias aversivas. Sendo assim, o aumento da
transmissão eCB, por inibição da sua recaptação e/ou metabolismo, parece ser uma alternativa
farmacológica bastante interessante. Além do mais, acredita-se que o canabidiol (CBD), um
fitocanabinóide não-psicotomimético, possa agir inibindo a recaptação e degradação de
anandamida, aumentando seus níveis endógenos em áreas específicas do cérebro. Portanto, o
objetivo deste trabalho foi comparar os efeitos da administração intracerebroventricular
(i.c.v.) de AM 404, um inibidor da recaptação de anandamida, e CBD, na extinção do CA.
Ratos Wistar machos adultos foram condicionados e 24 h após o condicionamento foram
injetados i.c.v. com AM404 (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) ou CBD (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) e submetidos a
três sessões de extinção. Cada sessão constituiu de uma exposição de 9 min à gaiola de
condicionamento (total de 3 exposições com intervalo de 24 h). Um teste adicional de 3 min,
na ausência de drogas, foi realizado 24 h após a última sessão de extinção no intuito de
verificar a persistência de um possível efeito das drogas sobre a extinção do CA. A
administração i.c.v. de AM404 (1,0 µg/µl) e CBD (2,0 µg/µl) facilitou a extinção do CA
contextual, sendo que estes efeitos prevaleceram mesmo nos testes sem droga realizados após
a última sessão de extinção. Estes efeitos foram revertidos pela administração prévia do
antagonista dos receptores CB
1
, SR141716A (0.2 mg/kg, i.p.), mas não pelo antagonista dos
receptores VR
1
, capsazepina (CPZ) (5,0 µg/µl, i.c.v.), sugerindo então o envolvimento dos
receptores canabinóides CB
1
nos efeitos facilitatórios destas drogas sobre a extinção do CA
contextual. Efeitos do tipo ansiolítico não parecem ter contribuído de forma direta para os
efeitos facilitatórios do AM404 e do CBD sobre a extinção do CA contextual, visto a ausência
de efeitos nos animais “naïve” expostos ao LCE, porém, podem ter contribuído de uma forma
indireta, como sugerida pelos efeitos anti-ansiogênicos destas drogas observados no teste do
LCE potencializado pelo medo. Visto que o CBD e AM404 podem estar interferindo com a
recaptação de eCB, este trabalho sugere que o aumento dos níveis de endocanabinóides por
inibidores da recaptação pode constituir uma estratégia original para o tratamento de
transtornos emocionais relacionados à recordação de eventos traumáticos.
XVI
ABSTRACT
Fear conditioning models are useful to study aversive memories, which play a role in anxiety
disorders such as the posttraumatic stress. In contextual fear conditioning, the animal is
shocked in a conditioning chamber, so that context re-exposure elicits freezing behavior.
Repeated non-reinforced context re-exposures results in progressive decrease of freezing (i.e.
conditioned-fear extinction). Recently, studies have suggested an important role of the
endocannabinoids (eCB) system in modulation of emotional states and extinction of aversive
memories in animals. More specifically, it was reported that knockout mice for the CB
1
cannabinoid receptor showed impaired extinction of fear memories, highlighting the influence
of the pharmacological manipulation of the endocannabinoid system on the aversive
memories. Particularly, the enhancement of eCB transmission by inhibition of
uptake/metabolism seems to be an interesting pharmacological approach. Moreover, it is
believed that the cannabidiol (CBD), a non psychomimetic phytocannabinoid, might inhibit
the eCB uptake, increasing their endogenous levels in specific brains areas. Hence, the aim of
the present study was to investigate the central effects of the inhibitor of eCB
uptake/metabolism, AM404, and the putative inhibitor of eCB uptake, CBD, on extinction of
contextual fear memories in rats. Male Wistar rats were conditioned and 24h after injected
i.c.v. with AM404 (0.2, 1.0, 2.0 µg/µl) or CBD (0.2, 1.0, 2.0 µg/µl) and subjected to 3
consecutive 9-min non-reinforced exposures to the conditioning context (extinction sessions).
A 3-min drug-free test of contextual memory was performed 24h after the last extinction
session to investigate long-lasting effects. The i.c.v. injection of AM404 (1.0 µg/µl) and CBD
(2.0 µg/µl) facilitated the extinction of contextual fear memory, with long-lasting effects. This
response was antagonized by the CB
1
-selective antagonist SR141716A (0.2 mg/kg, i.p.), but
not by the VR
1
-selective antagonist capsazepine (CPZ) (5.0 µg/µl, i.c.v.), therefore suggesting
the involvement of CB
1
cannabinoid receptors in the facilitation of extinction by these drugs.
Anxiolytic-like effects might have contributed by indirect pathway to the facilitation of
extinction, as suggested by an anti-anxiogenic effect in the fear-potentiated plus-maze test.
Since CBD and AM404 are thought to interfere with eCB uptake, this work suggest that
increasing levels of eCB might constitute new strategy to facilitate extinction of fear
memories, thus contributing to reduce behavioral symptoms of anxiety disorders related to
unpleasant fear memories.
1
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - ASPECTOS HISTÓRICOS E USO DA CANNABIS SATIVA
A Cannabis sativa pode ser a primeira planta não alimentícia cultivada pelo homem.
Os primeiros indícios arqueológicos que evidenciam o uso da Cannabis datam cerca de 10000
anos atrás, quando fibras do pedúnculo eram utilizadas para a fabricação de cordas e
vestuário. Os primeiros registros do uso da Cannabis datam cerca de 2700 a.C, quando o “pai
da medicina chinesa”, Shen Nung, descreveu o uso da Cannabis para tratar várias condições
patológicas. Na Índia antiga, o consumo de Cannabis desempenhou um papel importante na
religião, como descrito no Veda escrito por volta de 2000 a.C. Já o haxixe, preparado a partir
da resina da Cannabis, é conhecido no mundo árabe desde o século X (para revisão histórica
ver Abel, 1980).
Embora a Cannabis seja mais conhecida em sociedades ocidentais pelo uso recreativo
de suas preparações populares, do tipo maconha e haxixe, seu potencial terapêutico vem
sendo cientificamente avaliado desde o século XIX (Childers e Breivogel, 1998; Di Marzo e
Petrocellis, 2006). No entanto, no início do século XX, o uso e a pesquisa com Cannabis
sofreram um considerável declínio, principalmente nos Estados Unidos da América (EUA),
devido a questões sócio-políticas. Esta situação ficou ainda mais drástica quando, em 1937, o
Congresso Americano criou o decreto de proibição da maconha (Marijuana Tax Act) que
baniu o cultivo, comercialização e uso dos derivados desta planta (Chalsma, Boyum et al.,
1994). Estas questões sócio-políticas dificultaram ainda mais os estudos a cerca desta planta e,
principalmente, em relação ao seu potencial terapêutico (Di Marzo e Petrocellis, 2006) (figura
1).
2
Figura 1 - Breve histórico dos registros de uso da Cannabis em todo o mundo (modificado de Childers e
Breivogel, 1998). (a.C.) antes de Cristo.
Mesmo com todos os problemas sócio-políticos envolvendo a planta Cannabis sativa
ao longo destes anos, os estudos químicos desta planta vêm sendo realizados desde o início do
século XIX. Mais de um século de tentativas e erros levaram, primeiramente, a identificação
de dois constituintes não psicoativos, canabinol e canabidiol (CBD) e, finalmente, a
identificação do maior constituinte psicoativo da Cannabis, o ∆
9
-tetrahidrocanabinol (∆
9
-
THC), em 1964 pelo pesquisador Mechoulam (Mechoulam e Hanus, 2000; Di Marzo e
Petrocellis, 2006). Embora o CBD tenha sido considerado, à primeira vista, como um
constituinte não psicoativo, existem evidências experimentais sugerindo o oposto em ambos,
tanto em seres humanos (Zuardi, Morais et al., 1995; Crippa, Zuardi et al., 2004) como
também em animais (Carlini, Leite et al., 1973; Izquierdo, Orsingher et al., 1973; Consroe e
Wolkin, 1977; Leite, Carlini et al., 1982; Moreira, Aguiar et al., 2006; Resstel, Joca et al.,
2006). Hoje em dia sabe-se que a Cannabis é constituída por pelo menos 66 compostos
conhecidos como canabinóides ou fitocanabinóides, sendo destes, geralmente, o ∆
9
-THC e o
CDB os mais abundantes na planta (Mechoulam, Shani et al., 1970).
3
1.2 - A DESCOBERTA DO SISTEMA ENDOCANABINÓIDE (eCB)
Embora vários estudos sugerissem que as ações do ∆
9
-THC estariam relacionadas
apenas às alterações de fluidez de membrana biológicas (Hillard, Harris et al., 1985), um
grande número de dados farmacológicos indicava uma relação estrutura-atividade específica
para os canabinóides, implicando em um possível mecanismo baseado na interação com
proteínas receptoras (Dewey, 1986; Childers e Breivogel, 1998).
Evidências da existência de receptores canabinóides só foram confirmadas em meados
dos anos 80 quando Howlett demonstrou que os canabinóides inibem a produção de AMPc
(adenosina monofasfato cíclica) em cultura de células (Howlett, 1984), sugerindo um sistema
de transdução mediado pela ativação de receptores acoplados a proteínas G
i
(Howlett e
Fleming, 1984; Howlett, 1985; Howlett, Qualy et al., 1986). Este achado foi seguido pelo
ensaio de ligação com radioativos (binding) para receptores canabinóides (Devane, Dysarz et
al., 1988), localização destes receptores (Herkenham, Lynn et al., 1990) e, finalmente,
clonagem e seqüenciamento do primeiro receptor canabinóide, denominado CB
1
(Matsuda,
Lolait et al., 1990).
Estes receptores são pertencentes à grande família de receptores acoplados a proteína
G
i/o
e parecem controlar de forma negativa a atividade da adenilato ciclase, com conseqüente
diminuição dos níveis intracelulares de AMPc (Felder, Briley et al., 1993; Vogel, Barg et al.,
1993).
Os receptores CB
1
são expressos predominantemente em tecidos nervosos da periferia
e do sistema nervoso central (SNC) e podem ser encontrados em maiores concentrações em
fibras axonais, especialmente localizadas em botões terminais de neurônios pré-sinápticos
(Katona, Sperlagh et al., 2000). Devido a esta localização, aliado ao fato de atuarem inibindo
a adenilato ciclase, estes receptores podem mediar à inibição da liberação de outros
neurotransmissores (Pertwee, 2006). A ampla distribuição dos receptores CB
1
lhes confere a
4
característica de serem os principais mediadores dos efeitos centrais conhecidos dos
canabinóides (Howlett, Barth et al., 2002). Estudos mais detalhados mostram que os
receptores CB
1
são amplamente encontrados na região da amígdala, principalmente em
terminais pré-sinápticos de neurônios GABAérgicos, podendo atuar inibindo esta
neurotransmissão nesta região (Marsicano e Lutz, 1999; Azad, Eder et al., 2003). Além do
mais, os receptores CB
1
encontrados nesta região parecem estar crucialmente envolvidos no
controle de diversos estados emocionais como na extinção de memórias aversivas (Marsicano,
Wotjak et al., 2002) (Ver avanços científicos na figura 2).
Figura 2 - Breve histórico dos avanços na investigação sobre os mecanismos de ação dos canabinóides
(modificado de Childers e Breivogel, 1998).
A descoberta dos receptores canabinóides levou ao desenvolvimento de uma série de
bioensaios in vitro que podem ser usados para monitorar a ativação ou bloqueio destes
receptores, ou seja, auxiliar no desenvolvimento de agonistas ou antagonistas (Pertwee, 1997;
Howlett, Barth et al., 2002; Pertwee, 2005). Mas antes que se desenvolvessem tais compostos,
os pesquisadores queriam estabelecer se existiria algum ligante endógeno para os receptores
canabinóides, visto ser pouco provável que estes fossem alvos apenas dos canabinóides
derivados da planta (revisado em Pertwee, 2006).
5
Usando da lógica de que uma substância canabinóide endógena exibiria as mesmas
propriedades lipofílicas dos já conhecidos canabinóides (oriundos da Cannabis), Devane e
colaboradores (1992) utilizaram extratos de cérebro de suínos e isolaram compostos
endógenos que se ligavam aos receptores canabinóides CB
1
(Devane, Hanus et al., 1992).
Surgiam então os primeiros endocanabinóides (eCB), nome dado aos compostos endógenos
que possuem a capacidade de ativar receptores canabinóides. O primeiro destes compostos foi
a etanolamina do ácido araquidônico, o qual recebeu o nome de anandamida, uma palavra
derivada do sânscrito, que significa “êxtase” (Childers e Breivogel, 1998).
A anandamida exibe uma afinidade moderada pelos receptores CB
1
(aproximadamente
100 nM) e é extremamente instável, sendo rapidamente metabolizada por amidases (Deutsch e
Chin, 1993). Este eCB pode ser considerado um agonista parcial ou total dos receptores CB
1
,
o que dependeria do tecido e das respostas biológicas avaliadas (Pacher, Batkai et al., 2006).
Esta característica é conferida conforme sua habilidade de ativar proteínas G (Breivogel,
Selley et al., 1998), inibir adenilato ciclase (Childers, Sexton et al., 1994) e afetar as funções
dos canais de íons (Mackie, Devane et al., 1993; Shen, Piser et al., 1996). Além dos
receptores canabinóides, existem relatos de que a anandamida possa ativar também os
receptores vanilóides TRPV
1
(Ross, 2003), os quais têm mostrado possuir funcionalidade
cruzada com os receptores canabinóides quando estes são encontrados nas mesmas células
(Cristino, De Petrocellis et al., 2006). Após a descoberta da anandamida diversos eCB vêm
sendo identificados (ex. 2-araquidonilglicerol/2-AG), no entanto, a anandamida continua
sendo o eCB mais estudado (Pacher, Batkai et al., 2006).
Há indícios de que os eCB, ao contrário dos neurotransmissores clássicos, sejam
sintetizados sob demanda, e rapidamente liberados pelos neurônios em decorrência de
atividade elétrica induzida por despolarização e conseqüente influxo de íons cálcio (Di Marzo,
Melck et al., 1998). Uma vez sintetizada, a anandamida pode agir como mensageiro
6
retrógrado, sendo liberada pela pós-sinapse, difundindo-se para a pré-sinapse até alcançar os
receptores canabinóides. Ao ligar-se nestes receptores, a anandamida atua diminuindo a
liberação de outros neurotransmissores por interferir em uma etapa dependente de cálcio no
processo de liberação de vesículas sinápticas (Hoffman e Lupica, 2000). A inativação da
anandamida ocorre por dois processos cooperativos, a recaptação e a degradação. Ainda que
um transportador específico não tenha sido identificado, a recaptação da anandamida da fenda
sináptica é saturável, dependente de energia e sensível a ação de inibidores, típico de um
processo mediado por carreadores protéicos (Di Marzo, Fontana et al., 1994; Beltramo, Di
Tomaso et al., 1997; Hillard e Campbell, 1997). Depois de recaptada, a anandamida sofre a
ação de uma enzima de degradação específica, a amido hidrolase de ácidos graxos (FAAH, do
inglês fatty acid amid hydrolase), que é responsável pela hidrólise da anandamida em
etanolamina e ácido araquidônico (Pacher, Batkai et al., 2006) (Ver figura 3).
Figura 3 - Representação esquemática do sistema endocanabinóide nos neurônios pré- e pós-sinápticos. O
terminal pré-sináptico está localizado no topo, enquanto que o terminal pós-sináptico está localizado na
parte inferior da página. (EMT) transportador membranar de endocanabinóide; (MAGL) lipase de
monoacilglicerol; (DAGL) lipase de diacilglicerol; (AEA) anandamida; (NArPE) N-araquidonil-
fosfatidiletanolamina; (NAT) N-aciltransferase (adaptado de Pacher et al, 2006).
7
1.3 - DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FARMACOLÓGICA DE
LIGANTES PARA OS RECEPTORES CANABINÓIDES
Além dos compostos naturalmente encontrados na Cannabis (∆
9
-THC e CBD) e dos já
descritos eCB, a indústria farmacêutica tem desenvolvido diversos compostos que agem no
sistema canabinóide. Uma classe bastante importante de agonistas canabinóides que surgiram
recentemente foram os aminoalquilindóis, que foram as primeiras moléculas desenvolvidas
com atividade canabiméticas e sem similaridade estrutural com o ∆
9
-THC (ex. WIN55212)
(Pertwee, 2006).
Outro grande avanço que sucedeu a descoberta dos receptores canabinóides foi o
desenvolvimento de antagonistas seletivos para estes receptores. O primeiro antagonista dos
receptores canabinóides tipo CB
1
de que se tem notícia foi o SR141716A (rimonabanto),
desenvolvido em 1994 por Rinaldi-Carmona e colaboradores (Rinaldi-Carmona, Barth et al.,
1994).
Existe também uma terceira classe de ferramentas farmacológicas que atuam,
diferentemente dos agonistas e antagonistas dos receptores canabinóides, ao interferirem com
o metabolismo dos eCB. O primeiro e mais bem estudado entre os inibidores da
recaptação/degradação de endocanabinóides é o AM404, um derivado estrutural da
anandamida que age como substrato falso para o suposto transportador e para a enzima de
degradação da anandamida. Como resultado tem-se a elevação dos níveis deste eCB e
conseqüente potencialização dos seus efeitos in vivo (Beltramo, Stella et al., 1997).
8
1.4 - O SISTEMA ENDOCANABINÓIDE COMO ALVO TERAPÊUTICO EM
CONDIÇÕES FISIOPATOLÓGICAS
Os canabinóides endógenos, geralmente referidos como eCB, e suas respectivas
enzimas de síntese e degradação, juntamente com o conjunto de receptores canabinóides,
constituem o sistema eCB. A descoberta deste sistema tem sido de grande impacto, não
apenas sobre a farmacologia dos fitocanabinóides e seus análogos sintéticos, mas também
sobre a farmacologia dos eCB nos eventos fisiológicos e patológicos que estes podem estar
envolvidos (Pertwee, 2006).
Evidências têm sugerido que alterações no sistema eCB podem estar relacionadas a
vários distúrbios. Em alguns destes distúrbios como, esclerose múltipla, alguns tipos de dor,
câncer, esquizofrenia, transtorno de estresse pós-traumático, excitotoxicidade, algumas
doenças cardiovasculares e intestinais, este aumento na eficiência do sistema eCB pode causar
uma redução da gravidade dos sintomas ou até mesmo uma desaceleração na progressão da
doença. No entanto, existem outros distúrbios como, diminuição da fertilidade, obesidade,
cistite, ileíte e íleo paralítico, no qual os efeitos indesejáveis parecem resultar desta supra-
regulação do sistema eCB, sugerindo que este sistema tem suas próprias patologias e algumas
vezes é capaz de mediar seus próprios efeitos indesejáveis. Estas evidências têm instigado a
procura por estratégias clínicas melhores que irão, por um lado, imitar ou aumentar a “auto-
proteção” mediada pelos eCB e, por outro lado, evitar o “auto-prejuízo” mediado por este
sistema (revisado em Pertwee, 2006).
Tendo em vista as várias ações exercidas pelos canabinóides exógenos no cérebro e as
recentes descobertas da relevância dos eCB em uma s
9
regiões cerebrais conhecidas por desempenhar um importante papel nos comportamentos de
ansiedade e nos processos de aprendizado de memórias aversivas, incluindo amígdala e
hipocampo (Herkenham, Lynn et al., 1990; Di Marzo, Breivogel et al., 2000). Está bastante
aceito que agonistas dos receptores canabinóides freqüentemente prejudicam a aquisição e
consolidação de memórias aversivas (Ferrari, Ottani et al., 1999; Mishima, Egashira et al.,
2001; Varvel, Hamm et al., 2001; Pamplona e Takahashi, 2006), enquanto que a
administração sistêmica de antagonistas dos receptores CB
1
freqüentemente melhoram a
aquisição e consolidação das memórias. A maioria dos estudos realizados em camundongos
com deleção gênica para os receptores CB
1
mostrou respostas normais por parte destes
animais para aquisição e consolidação de memórias aversivas (Marsicano, Wotjak et al.,
2002; Varvel e Lichtman, 2002; Varvel, Anum et al., 2005; Kamprath, Marsicano et al.,
2006), mas estes resultados podem depender da linhagem empregada (Mikics, Dombi et al.,
2006).
Além dos processos de aquisição e consolidação, existe outro, igualmente importante e
pouco compreendido, que é o processo de extinção da memória. No intuito de compreender
melhor o papel dos eCB e dos receptores CB
1
na extinção de memórias aversivas, intensos
esforços têm sido feitos nesse sentido. Dadas as semelhanças entre os procedimentos d
10
1.5 - COMPORTAMENTO DEFENSIVO, MEMÓRIAS AVERSIVAS E O MODELO
ANIMAL DE EXTINÇÃO DO CONDICIONAMENTO AVERSIVO
O aprendizado emocional é extremamente necessário para que o indivíduo possa
sobreviver e até mesmo prosperar. Contudo, uma vez adquiridas, as associações emocionais
nem sempre são manifestadas. Na verdade, a regulação das respostas emocionais sob
diferentes condições ambientais é essencial para a saúde mental. Sendo assim, a forma mais
simples de regulação das respostas emocionais é a extinção, na qual a resposta condicionada a
um estímulo diminui quando o reforço (estímulo) é omitido. No entanto, em certos momentos
este mecanismo de extinção pode não ocorrer de forma satisfatória e as respostas emocionais
podem se tornar exageradas ou começarem a ocorrer em situações inapropriadas,
caracterizando um distúrbio de ansiedade. Neste caso, agentes farmacológicos que viessem a
promover a facilitação da extinção destas memórias poderiam ser úteis se somados a terapias
cognitivo-comportamentais (Quirk e Mueller, 2008). Para isso, os modelos animais têm
contribuído de forma bastante importante na triagem deste tipo de composto farmacológico.
Isso se torna viável porque diversas similaridades relacionam os sintomas de ansiedade em
seres humanos à expressão de comportamentos defensivos em animais, já que assim como os
humanos, os animais tendem a apresentar comportamentos defensivos evidentes em situações
potencialmente ameaçadoras (Borsini, Podhorna et al., 2002). Esta similaridade de resposta
comportamental tem sido utilizada na tentativa de se desenvolver modelos refinados de
comportamento animal que possam ser utilizados no estudo de potenciais fármacos para as
patologias ligadas à ansiedade. Neste sentido, dois dos modelos animais mais populares no
estudo de comportamentos defensivos condicionados e inatos são, respectivamente, o modelo
de condicionamento aversivo (CA) e o labirinto em cruz elevado (LCE).
O modelo animal de CA tem sido utilizado para o estudo de memórias aversivas e da
expressão de comportamentos defensivos que sucedem a recordação destas memórias, uma
11
vez que a aquisição de comportamentos defensivos condicionados pode estar envolvida no
desenvolvimento de patologias de ansiedade deflagradas pela exposição a experiências
traumáticas (Brewin e Holmes, 2003). Estas similaridades entre os mecanismos de aquisição e
expressão do medo condicionado e as patologias de ansiedade tornam o estudo dos modelos
animais de CA de grande importância para o entendimento dos mecanismos biológicos
inerentes às memórias emocionais e para o desenvolvimento de terapias farmacológicas para
estas patologias (Pare, Quirk et al., 2004).
Basicamente, um modelo animal de CA implica no aprendizado de que certos
estímulos ambientais (pistas cognitivas) estão relacionados a eventos aversivos. Um estímulo
condicionado (EC), inicialmente neutro e incapaz de provocar reação comportamental
explícita, adquire a capacidade de provocar reações comportamentais após a associação a um
estímulo incondicionado (EI) aversivo. Assim que a associação EC-EI é aprendida e os
animais são re-expostos ao EC, uma série de respostas comportamentais de medo
condicionado ocorre, incluindo o comportamento de congelamento (Blanchard e Blanchard,
1969). Este tipo de resposta comportamental pode ser estabelecida com apenas um
pareamento EC-EI formando invariavelmente uma memória de longa duração (Yaniv,
Desmedt et al., 2004). Um tipo de CA bastante utilizado é o condicionamento aversivo
contextual que é realizado com a associação do EI a estímulos variados, de múltiplas
modalidades sensoriais e que requerem a sua integração em uma representação única do
ambiente, denominada de contexto, o que confere um EC bastante complexo (Yaniv, Desmedt
et al., 2004). Um modelo de CA, como qualquer modelo animal de aprendizado e memória,
possui diversas etapas relacionadas aos processos mnemônicos de aquisição, consolidação,
evocação e extinção ou reconsolidação, todas passíveis de manipulação farmacológica e com
grande importância biológica. A etapa de extinção de uma memória aversiva, enfoque deste
trabalho, pode ser estudada através da submissão do animal a várias exposições prolongadas e
12
não-reforçadoras do EC, o que tende a enfraquecer as respostas de medo (Suzuki, Josselyn et
al., 2004). Neste caso, a associação do EC-EI deixa de ser biologicamente relevante para o
animal (em geral pela perda do componente aversivo - EI) e este passa a deixar de expressar
comportamentos defensivos em resposta à apresentação do EC. Esta perda da relevância
caracteriza o fenômeno de extinção, ou seja, é formada uma nova associação EC-“ausência de
EI” que se sobrepõe a associação EC-EI inicialmente realizada (Cammarota, Bevilaqua et al.,
2005). Em um sentido mais amplo pode-se dizer que a extinção de uma memória não se trata
apenas de um evento simples como um “esquecimento” ou uma “rasura”, e sim um conjunto
de flexibilidades comportamentais, adaptação às alterações ambientais ou até mesmo uma
forma de inibição, o que caracterizaria um novo aprendizado (Suzuki, Josselyn et al., 2004;
Hill, Froese et al., 2006; Kamprath, Marsicano et al., 2006; Quirk e Mueller, 2008). Diversos
fatores devem estar em equilíbrio para que uma memória seja extinta, sendo de crucial
importância o tempo de exposição ao EC na ausência do EI (Suzuki, Josselyn et al., 2004).
Embora as pesquisas neurocientíficas acerca da extinção tenham evoluído muito nos últimos
anos, ainda não se sabe ao certo quais mecanismos neurais regulam esta forma de
aprendizado. Dificilmente uma única estrutura seja responsável por este fenômeno e,
provavelmente, uma série de estruturas chave, incluindo amígdala basolateral (BLA), córtex
pré-frontal e hipocampo devem estar interagindo para que esse processo ocorra. No entanto, é
bem provável que a plasticidade relacionada à extinção em cada uma destas estruturas deva
exercer funções diferenciadas como, por exemplo, a plasticidade na amígdala pode servir para
inibir a expressão do medo, enquanto que a plasticidade ocorrida no hipocampo ou córtex pré-
frontal pode possibilitar a modulação contextual desta inibição (revisado em Quirk e Mueller,
2008).
O modelo do LCE, anteriormente mencionado, consiste num aparelho com áreas
abertas (expostas) e fechadas (protegidas) que pode ser explorado livremente pelo animal.
13
Consistente com a idéia de que lugares abertos provocam reações comportamentais
semelhantes à ansiedade em animais, ratos expostos ao LCE tendem a entrar menos vezes e
permanecer menos tempo nas áreas expostas do labirinto em comparação às áreas protegidas.
Estas medidas comportamentais no LCE foram validadas farmacologicamente,
etologicamente e fisiologicamente. Primeiro, a administração de benzodiazepínicos,
ansiolíticos clássicos, aumenta o número de entradas e o tempo de permanência nas áreas
abertas do LCE, enquanto manipulações ansiogênicas tendem a reduzir este parâmetros
(Pellow, Chopin et al., 1985; Pellow e File, 1986). Segundo, a análise etológica de uma
sessão experimental demonstra que os animais expostos ao LCE tendem a expressar
comportamentos defensivos principalmente nas áreas expostas do labirinto (Pellow, Chopin et
al., 1985; Pellow e File, 1986; Cruz, Frei et al., 1994). Por último, animais confinados às
áreas abertas do LCE produzem maiores concentrações de corticosterona (resposta emocional
endócrina) e bolos fecais (resposta emocional autonômica) comparados aos animais
confinados às áreas protegidas do labirinto (Pellow, Chopin et al., 1985). O LCE também
pode ser utilizado para se avaliar a ansiogênese causada pela recordação de experiências
aversivas em uma modificação experimental conhecida como LCE potencializado pelo medo
(Mechiel Korte e De Boer, 2003).
A densa expressão dos receptores canabinóides CB
1
e a presença de endocanabinóides
nas regiões cerebrais as quais se acredita desempenhar funções nos processos de extinção de
memórias aversivas levaram a crer na participação deste sistema como possível modulador
destas respostas. De fato, estudos recentes têm mostrado a participação indispensável dos
receptores CB
1
nos processos de extinção de memórias aversivas (Marsicano, Wotjak et al.,
2002), e sugerido que o aumento dos níveis de eCB possa levar a efeitos tipo ansiolíticos e a
facilitação da extinção do CA em animais (Kathuria, Gaetani et al., 2003; Chhatwal, Davis et
al., 2005; Bortolato, Campolongo et al., 2006). No entanto, pouco se sabe a respeito da
14
influência da administração de canabinóides exógenos, como os fitocanabinóides, sobre a
extinção deste tipo de memória. Neste sentido, o presente trabalho propõe avaliar os efeitos
do tratamento com o fitocanabinóide CBD, um hipotético inibidor da recaptação e/ou
degradação de anandamida, sobre a extinção do CA contextual em ratos. A fim de melhor
compreender o mecanismo de ação do CBD, comparações serão feitas com o já bem descrito
inibidor da recaptação de anandamida, AM404. Além disso, serão analisados os efeitos destes
compostos no modelo do LCE potencializado pelo medo, visando investigar possíveis efeitos
ansiolíticos dos mesmos.
15
2 - OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAL
Investigar os efeitos da administração i.c.v. do CBD comparando com os efeitos
induzidos pelo AM404, inibidor da recaptação de anandamida, na extinção de
memórias aversivas em ratos utilizando o modelo animal de CA contextual.
2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a participação dos receptores canabinóides CB
1
nos efeitos do AM404 e do
CBD sobre a extinção do CA contextual em ratos;
Avaliar a participação dos receptores vanilóides TRPV
1
nos efeitos do AM404 e do
CBD sobre a extinção do CA contextual em ratos;
Verificar a sustentabilidade destes efeitos, persistentes ou agudos (dependente de
droga), em uma sessão adicional, na ausência de tratamento farmacológico, realizado
24 h após a última sessão de extinção;
Investigar possíveis efeitos ansiolíticos de doses selecionadas de AM404 e CBD
através do modelo do LCE potencializado pelo medo.
16
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos com peso aproximado de 350 g e com cerca de
3 meses de idade na data de experimentação. Os animais foram fornecidos pelo Biotério
Central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) e mantidos por pelo menos uma
semana antes dos experimentos no Biotério Setorial do Laboratório de Psicofarmacologia,
para devida aclimatização. Os animais foram agrupados em caixas de polipropileno (42 x 34 x
17 cm), contendo 4 ou 5 animais por caixa e mantidos em condições controladas de umidade e
temperatura (23 ± 2 °C), com ciclo claro-escuro de 12 horas (fase clara das 7:00 às 19:00 h),
com água e ração ad libitum. Todos os procedimentos experimentais utilizados no presente
estudo foram conduzidos de acordo com as normas do Comitê de Ética para o Uso de
Animais da Universidade Federal de Santa Catarina (CEUA/UFSC).
3.2 – DROGAS
AM404, um inibidor da recaptação de anandamida (Tocris, USA), (-)Canabidiol
(CBD), o maior constituinte da planta Cannabis Sativa (Tocris, USA), Capsazepina (CPZ),
um antagonista dos receptores vanilóides do tipo TRPV
1
(Tocris, USA), e Diazepam (DZP),
um modulador alostérico positivo dos receptores GABA (Sanofi Winthrop, Brasil) foram
dissolvidos em PBS 0,1M contendo 10% de dimetilsufóxido (DMSO) e 0,1% de Tween 80.
SR141716A (SR), um antagonista dos receptores canabinóides do tipo CB
1
(Sanofi-Aventis,
França) foi dissolvido em solução fisiológica (NaCl 0,9%) contendo 10% de DMSO e 0,1%
de Tween 80. O veículo de dissolução foi utilizado como solução controle. AM404, CBD e
17
Diazepam foram injetados intracerebroventricularmente (i.c.v.) 5 min antes dos testes
comportamentais. CPZ foi injetado i.c.v. 5 min antes da administração de AM404, CBD ou
Controle. SR foi injetado intraperitonealmente (i.p.) 20 min antes da administração de
AM404, CBD ou Controle. As drogas de administração i.c.v. foram injetadas em um volume
de 1,0 µl por animal, e a droga de administração i.p. foi injetada em um volume de 0,2 ml/100
g de peso corporal. As doses das drogas utilizadas foram selecionadas baseadas em trabalhos
prévios e estudos pilotos (Chhatwal, Davis et al., 2005; Murillo-Rodriguez, Millan-Aldaco et
al., 2006; Pamplona, Prediger et al., 2006).
3.3 – CIRURGIA ESTEREOTÁXICA
Os animais foram anestesiados com uma mistura de 1:1 de Ketamina (75 mg/kg) e
xilazina (15 mg/kg) administradas num volume de 1,5 ml/kg via i.p. Após perda total dos
reflexos os animais foram colocados em um aparelho estereotáxico (Kopf, modelo 957),
mantendo o bregma e lâmbda no mesmo plano horizontal. Em seguida fez-se a tricotomia na
cabeça seguida da administração via subcutânea de 0,2 ml de uma solução anestésica e
vasoconstritora local (cloridrato de lidocaína 2% com norepinefrina 1:200.000, Lidocaína
Geyer 2%, Brasil) e exposição da calota craniana por meio de uma incisão na pele, de
aproximadamente 1,5 cm de diâmetro. O periósteo foi retirado e a calota craniana secada com
H
2
O
2
a 10%. Com o auxilio de uma broca ortodôntica (n° 6) foram feitos dois furos na calota
craniana para fixação de parafusos. Posteriormente, um terceiro furo foi feito para
implantação de uma cânula guia no ventrículo lateral direito, sendo o posicionamento da
mesma, calculado por meios de estimativas em relação ao bregma (ponto de encontro entre as
suturas sagital e lambdóide utilizado como referencial anatômico). As coordenadas utilizadas
18
(AP= -0,8 mm; ML= -1,6 mm; e DV= -3,6 mm) tiveram como referências parâmetros do
Atlas de ratos (Paxinos e Watson, 2002).
Cânulas de aço inoxidável de 10 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro externo,
previamente confeccionadas a partir de agulhas 0,7 x 25 mm (Becton Dickinson - BD, Brasil),
foram introduzidas no ventrículo cerebral direito. Após implantação, a cânula e os parafusos
foram fixados ao crânio com resina acrílica autopolimerisável. Mandris de aço inox n° 26 de
0,35 mm de diâmetro (Comercial Rio Verde, Brasil) foram introduzidos nas cânulas para
evitar a obstrução das mesmas durante o período da recuperação dos animais. Após o
procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos em local aquecido até a recuperação da
anestesia, sendo posteriormente alojados em caixas moradias com água e comida ad libitum e
acompanhados diariamente até a realização dos experimentos que ocorreu de 5 a 7 dias após a
cirurgia estereotáxica.
3.4 – PROCEDIMENTO DE INFUSÃO
Uma agulha injetora de 11 mm de comprimento e 0,3 mm de diâmetro foi fixada a
cânula guia e a administração i.c.v. foi realizada através de uma microseringa de 10 µl
(Hamilton
®
, USA) conectada a agulha injetora por um tubo de polietileno P10 (10 mm de
diâmetro). As drogas foram injetadas com o auxílio de uma bomba de infusão automática
(Insight, Brasil) num volume de 1µl, a uma taxa de 2µl/min. Após a retirada do mandril e
introdução da agulha, o rato era alojado em uma caixa plástica (30 x 21 x 15 cm),
permanecendo livre durante todo o processo de infusão. Um período de 30 segundos foi
adotado como tempo necessário para a completa difusão da solução dentro do tecido cerebral
e posterior retirada da agulha injetora. Por fim, um tempo de 5 min foi adotado entre a
administração da solução e a exposição ao protocolo experimental.
19
3.5 – PROCEDIMENTOS COMPORTAMENTAIS
Todos os experimentos comportamentais descritos a seguir foram registrados com a
utilização de um sistema de vídeo-câmera, permitindo ao experimentador observar os animais
por um monitor de vídeo posicionado em uma sala adjacente à sala do experimento.
3.5.1 – Condicionamento aversivo contextual
Os experimentos de CA contextual foram realizados em uma caixa de esquiva ativa
modificada (Automatic Reflex Conditioner modelo 7531, Ugo Basile, Itália) dotada de chão
gradeado conectado a um gerador de choques elétricos, devidamente configurado às
condições experimentais. O mesmo compartimento da gaiola de condicionamento (22 x 22 x
25 cm) foi utilizado em todos os procedimentos experimentais. A sala de experimentação foi
suavemente iluminada por uma luz vermelha, resultando em uma luminosidade ambiental de
cerca de 10 Lux. O modelo de CA contextual utilizado neste trabalho foi baseado no método
previamente descrito por Pamplona et al (2006). Neste modelo os animais foram colocados na
gaiola de condicionamento e após 3 min receberam um choque elétrico nas patas de curta
duração e intensidade moderada (1 s, 1,5 mA). Os animais permaneceram por mais um
minuto na gaiola de condicionamento antes de serem retirados e levados novamente ao
biotério. O teste comportamental neste modelo consistiu em re-expor o animal à gaiola de
condicionamento durante 3 sessões de 9 min com um intervalo de 24 h entre cada sessão,
sendo as drogas, administradas antes de cada sessão. Um teste adicional de 3 min, na ausência
de drogas, foi realizado 24 h após a última sessão de extinção no intuito de verificar a
persistência de um possível efeito sobre a extinção do CA. Quando re-expostos, os animais
expressam respostas autonômicas e comportamentos defensivos, como congelamento, pilo-
ereção, aumento da freqüência cardíaca e liberação corticotrofina (Blanchard e Blanchard,
20
1969; Fanselow, 1980). No presente estudo, o congelamento, definido por Blanchard e
Blanchard (1969) como imobilidade em uma posição estereotipada de agachamento, com
exceção dos movimentos necessários para a respiração, e caracterizado como um
comportamento condicionado por Fanselow (1980), foi registrado e utilizado como índice de
memória durante as sessões de re-exposição ao contexto na ausência do EI (choque).
3.5.1.1 – Experimento 1: Efeitos da administração i.c.v. de AM404 na extinção do CA
contextual.
Sucessivas exposições à caixa de condicionamento foram usadas para testar os efeitos
do AM404 na extinção do CA contextual. Para este propósito, 24 h após o CA contextual os
animais foram submetidos a 3 sessões consecutivas de extinção do CA, com 24 h de intervalo
entre as sessões. Em cada sessão, os animais foram expostos à gaiola de condicionamento por
9 min e o comportamento de congelamento foi avaliado e registrado ao longo deste tempo. Os
animais foram tratados com AM404 (0,2; 1,0 ou 2,0 µg/µl, i.c.v.) ou solução controle 5 min
antes de cada sessão de extinção. Um teste de 3 min, na ausência de tratamento
farmacológico, foi realizado 24 h após a última sessão de extinção para investigar se os
efeitos das drogas na extinção de memórias aversivas foram agudos (ex. dependente da droga)
ou persistentes (Fig. 4).
Figura 4 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 1.
21
3.5.1.2 – Experimento 2: Efeitos da administração i.c.v. de CBD na extinção do CA
contextual.
De maneira similar ao experimento anterior, sucessivas exposições à caixa de
condicionamento foram desta vez usadas para testar os efeitos do CBD na extinção do CA
contextual. O procedimento foi o mesmo utilizado no Experimento 1, com a diferença de que
neste experimento os animais foram tratados com o CBD (0,2; 1,0 ou 2,0 µg/µl, i.c.v.) ou
solução controle 5 min antes de cada sessão de extinção (Fig. 5).
Figura 5 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 2.
3.5.1.3 – Experimento 3: Participação dos receptores canabinóides CB
1
nos efeitos do
AM404.
Este experimento foi realizado para investigar se os efeitos do AM404 na extinção do
CA contextual estavam relacionados à ativação dos receptores canabinóides CB
1
. Neste
procedimento, os animais foram pré-tratados i.p. com um antagonista dos receptores CB
1
SR141716A (0,2 mg/kg) ou solução controle 20 min antes de cada injeção de AM404 (1,0
µg/µl) que, por sua vez, foi administrado i.c.v. 5 min antes de cada sessão de extinção. O
procedimento utilizado para a extinção do CA contextual, foi o mesmo visto no experimento 1
(Fig. 6).
22
Figura 6 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 3.
3.5.1.4 – Experimento 4: Participação dos receptores CB
1
nos efeitos do CBD.
De maneira similar ao experimento anterior, o envolvimento dos receptores CB
1
foi
desta vez investigado nos efeitos do CBD sobre a extinção do CA contextual
.
Neste
procedimento, os animais foram pré-tratados i.p. com SR (0,2 mg/kg) ou solução controle 20
min antes de cada injeção de CBD (2,0 µg/µl; i.c.v.). Passados 5 min deste tratamento, os
animais foram submetidos às respectivas sessões de extinção. O procedimento utilizado para a
extinção do CA contextual, foi o mesmo visto no Experimento 1 (Fig. 7).
Figura 7 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 4.
3.5.1.5 – Experimento 5: Participação dos receptores vanilóides VR
1
nos efeitos do AM404.
Este experimento foi realizado para investigar se os efeitos do AM404 na extinção do
CA contextual estavam relacionados à ativação dos receptores vanilóides TRPV
1
. Neste
23
procedimento, os animais foram pré-tratados i.c.v. com um antagonista dos receptores
TRPV
1
, a CPZ (5,0 µg/µl), ou solução controle 5 min antes de cada injeção de AM404 (1,0
µg/µl) que, por sua vez, foi da mesma forma administrado 5 min antes de cada sessão de
extinção. O procedimento utilizado para a extinção do CA contextual, foi o mesmo visto no
Experimento 1 (Fig. 8).
Figura 8 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 5.
3.5.1.6 – Experimento 6: Participação dos receptores TRPV
1
nos efeitos do CBD.
Da mesma forma que no experimento anterior, o envolvimento dos receptores TRPV
1
foi desta vez investigado nos efeitos do CBD. Neste procedimento os animais foram pré-
tratados i.c.v. com a CPZ (5,0 µg/µl), ou solução controle e, 5 min após, foram da mesma
forma administrados com CBD (2,0 µg/µl). Cada sessão de extinção foi conduzida 5 min após
este tratamento. O procedimento utilizado para a extinção do CA contextual, foi o mesmo
visto no Experimento 1 (Fig. 9).
Figura 9 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 6.
24
3.5.2 – Labirinto em Cruz Elevado
O teste do LCE foi usado em função de sua capacidade de detectar ambos, tanto
efeitos do tipo ansiolítico como também efeitos do tipo ansiogênico em ratos (Pellow, Chopin
et al., 1985). O LCE foi confeccionado em madeira e coberto por uma camada de fórmica
preta. O aparelho é constituído por quatro braços com 50 cm de comprimento, 10 cm de
largura e posicionados a 50 cm de altura. Dois braços opostos são protegidos por paredes de
40 cm de altura e são chamados de braços fechados, os outros dois possuem apenas uma
pequena proteção de 2,5 cm e são chamados de braços abertos. Os quatros braços são
conectados por 558(.)250]TJ/R10 12 Tf2ê997( )--259.713 -27.6 Td2.80439(60.3(c)3.12E)0.639872( )-210.272(f)0.295585(o120.219(558(.)250]TJ/0.219(O(n)-0.2-2.16436(m)-2.45995(e)3.74(n)-)-260.3(b)-0.295574( )-60.180.295585(e)-1.23269( )0.147792( )-170.247(5)-0.2955585(e)xa)3.74(d)-0.295585(o)0.1477926(r)170.247(5)-0.2955585(e)0.294363( )-260.30.2955859( ).ç)3.7465.837295585(s)]T55585(e)A.146571( )]T55585(e)(s)-1.2312-0.295574( )-60.18(.)250]TJ/R10 1m rad aprimente 160.244(d)-0.295585(o)-0.295585(e)74( )-60.18(a)3.74(p)v-1.2312( )-270.3042( )-170.247(c(a)3.74(p)-0..2312( )-(d)-0.295585(e)3.72(m)-12.4683(a)65.83729( )250]TJ7(i)-2.1655-259.713 -2(e)3.74(q)-04( )-160.24)-2.16558(r)2.805694974(e)3.74d-260.3(q)-0.2955857( )-70.189 po 558(.)250]TJe
25
Korte e De Boer, 2003). Os animais foram colocados na gaiola de condicionamento e
submetidos ao CA contextual, como descrito no Experimento 1, e re-expostos a gaiola de
condicionamento 24 h depois. Cinco dias após a re-exposição ao contexto, estes animais
foram testados no LCE. O período de 5 dias entre a re-exposição ao contexto e o teste no
LCE foi definido em um estudo piloto, no qual mostrou que períodos menores que 24 h
induziram uma diminuição na exploração do LCE, fato este que poderia influenciar de
maneira errônea a interpretação dos resultados. Um grupo de animais não condicionado
constituído por ratos “naïve” foi adicionado ao teste do LCE como grupo controle. Animais
de ambos os grupos foram injetados i.c.v. com AM404 (1,0 µg/µl), CBD (2,0 µg/µl) ou
solução controle 5 min antes do teste no LCE potencializado pelo medo. Um grupo adicional
tratado i.c.v. com DZP (2,85µg/µl), droga conhecida por seus efeitos ansiolíticos, foi utilizado
como controle positivo (Fig. 10).
Figura 10 - Representação esquemática do procedimento realizado no experimento 7.
3.6 – PERFUSÃO E HISTOLOGIA
Após a realização dos experimentos que fizeram uso de microinjeções cerebrais, os
animais foram profundamente anestesiados com hidrato de cloral e perfundidos
transcardiacamente com solução fisiológica (NaCl 0,9%) seguida de formaldeído a 10% para
fixação dos tecidos. Ao término da perfusão, 5 µl de corante azul de Evans (0,1%) foram
injetados pelas cânulas guias. Posteriormente a injeção do corante, os cérebros foram
26
removidos e fixados em formaldeído 10% por 24 h. Passadas as 24 h, com o auxílio de uma
lâmina de bisturi, foram feitos cortes coronais nos locais de implante das cânulas para
verificar o posicionamento correto das mesmas. Os acertos foram visualizados, sem o auxílio
de qualquer equipamento de aumento, como um preenchimento completo do ventrículo lateral
direito pelo corante administrado. Eventuais erros no posicionamento das cânulas implicaram
em desconsideração dos resultados obtidos.
3.7 – ANÁLISE GRÁFICA E ESTATÍSTICA
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.). A confecção
dos gráficos foi feita utilizando-se o programa Graph Pad Prism
®
4.0 (Graph Pad Software,
San Diego, CA, EUA). As análises estatísticas foram feitas no programa Statistica
®
para
Windows 6.0 (Statsoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA).
Nos experimentos realizados para demonstrar os efeitos facilitatórios do AM404 e
CBD sobre a extinção do condicionamento aversivo contextual (Exp. 1 e 2) foi usada análise
de variância (ANOVA) de duas vias, tendo os fatores tratamento e sessões como variáveis
independentes.
Nos experimentos realizados para demonstrar a participação dos receptores
canabinóides CB
1
e vanilóides TRPV
1
nos efeitos facilitatórios do AM404 e CBD sobre a
extinção do condicionamento aversivo contextual (Exp. 3, 4, 5 e 6) foi usada ANOVA de três
vias, tendo os fatores pré-tratamento, tratamento e sessões como variáveis independentes.
Nos resultados referentes aos experimentos do teste sem droga (sessão 4) realizados
para demonstrar os efeitos persistentes do AM404 e CBD sobre a extinção do
condicionamento aversivo contextual foi usada ANOVA de uma ou duas vias, com pré-
27
tratamento e tratamento como variáveis independentes. Em alguns casos foi utilizado o teste t
de student no intuito de fazer comparações diretas entre grupos.
Por fim, nos resultados referentes ao teste do LCE potencializado pelo medo (Exp. 7)
foi usada ANOVA de duas vias, com tratamento e condição (condicionado x não-
condicionado) como variáveis independentes.
Posteriormente à ANOVA, os grupos foram comparados entre si utilizando o teste de
post hoc LSD de Fisher. O nível de significância considerado para todos os testes foi p<0,05.
28
4 – REULTADOS
4.1 – CONDICIONAMENTO AVERSIVO CONTEXTUAL
Como descrito previamente na introdução, o princípio do CA contextual é a
associação de um estímulo aversivo incondicionado (EI), geralmente doloroso, a um estímulo
inócuo, chamado de estímulo condicionado (EC). A apresentação do EC após a associação
com o EI provoca reações comportamentais defensivas no animal, similares às provocadas
originalmente pela apresentação do EI. No modelo do CA contextual utilizado neste trabalho,
o EC foi o ambiente onde o animal foi condicionado (a gaiola de condicionamento), com suas
pistas cognitivas de múltiplas características sensoriais, e o EI foi um choque elétrico nas
patas, gerado no chão gradeado da gaiola de condicionamento.
4.1.1 - Experimento 1: Efeitos da administração i.c.v. de AM404 na extinção do CA
contextual.
A representação esquemática do procedimento experimental utilizada neste
experimento encontra-se ilustrado na figura 11A. Os efeitos do AM404 (0,2; 1,0 ou 2,0 µg/µl
i.c.v.) sobre extinção do CA contextual estão representados nas figuras 11B e 11C. A
ANOVA de duas vias para os resultados da administração de AM404 nas três sessões de
extinção, revelou efeito significativo para os fatores tratamento [F(3,141)=3,94; p<0,01] e
sessões [F(2,141)=12,78; p<0,01], mas não para a interação entre estes dois fatores
[F(6,141)=0,25; p=0,95]. A análise post-hoc destes dados demonstrou que o protocolo de
extinção utilizado com três re-exposições (sessões) causou uma diminuição na % do tempo de
congelamento através das sucessivas exposições do grupo controle à gaiola de
29
condicionamento (p<0,05 3ª sessão comparada a 1ª). O grupo tratado com a dose
intermediária de AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.) obteve uma extinção parcial já na 2ª sessão
(p<0,05 comparada à 1ª sessão do mesmo grupo) e exibiu uma diminuição na % do tempo de
congelamento durante a 2ª e 3ª sessões comparadas às respectivas sessões do grupo controle
(p<0,05), sugerindo um efeito facilitatório sobre a extinção do CA contextual. O grupo tratado
com a menor dose de AM404 (0,2 µg/µl, i.c.v.) també
30
Figura 11 – Efeitos da administração i.c.v. de AM404 (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) na extinção do CA contextual.
(A) Representação esquemática do procedimento utilizado no experimento 1. (B) Média ± E.P.M. da % de
tempo de congelamento expressa pelos animais tratados com AM404 e submetidos a 3 exposições de 9 min
à gaiola de condicionamento, com intervalo de 24 h (cada barra representa os dados de uma sessão). (C)
Média e E.P.M. da % do tempo de congelamento expressa pelos mesmos grupos de animais durante uma
única exposição de 3 min à gaiola de condicionamento, na ausência de tratamento farmacológico, 24 h
após a última sessão de extinção. *p<0,05 comparado à primeira sessão do respectivo grupo. #p<0,05
comparado à respectiva sessão do grupo controle (teste LSD de Fisher). (Controle/n=16, AM404 0,2/n=11,
AM404 1,0/n=12, AM404 2,0/n=12).
4.1.2 - Experimento 2: Efeitos da administração i.c.v. de CBD na extinção do CA contextual.
Os efeitos do CBD sobre a extinção de memórias aversivas foram investigados
utilizando o modelo do CA contextual da mesma forma como visto no Experimento 1. A
representação esquemática do procedimento experimental utilizado no Experimento 2
encontra-se ilustrado na figura 12A. Os efeitos do CBD (0,2; 1,0 ou 2,0 µg/µl i.c.v.) sobre
extinção do CA contextual estão representados nas figuras 12B e 12C. A ANOVA de duas
31
vias para os resultados da administração de CBD nas três sessões de extinção, revelou efeito
significativo para os fatores tratamento [F(3,126)=3,74; p≤0,01] e sessões [F(2,126)=19,18;
p<0,01], mas não para a interação entre estes dois fatores [F(6,126)=0,59; p=0,73]. A análise
post-hoc destes dados demonstrou, de forma consistente com o Experimento 1, que na 3ª
sessão o grupo controle obteve uma extinção parcial do comportamento condicionado de
congelamento quando comparada à 1ª sessão (p<0,05). O tratamento com a menor dose de
CBD (0,2 µg/µl i.c.v.) não interferiu na % do tempo de congelamento apresentada pelos
animais em relação ao grupo controle. O grupo tratado com a dose intermediária de CBD (1,0
µg/µl i.c.v.) obteve uma extinção parcial já na segunda sessão (p<0,05 comparada a 1ª sessão
do mesmo grupo), porém, não exibiu diferenças estatísticas na % do tempo de congelamento
durante a 2ª e 3ª sessões quando comparadas as respectivas sessões do grupo controle. Já o
grupo tratado com a maior dose de CBD (2,0 µg/µl i.c.v.), além de exibir uma extinção
parcial na 2ª sessão (p<0,05 comparada a 1ª sessão do mesmo grupo), exibiu também uma
diminuição na % do tempo de congelamento durante a 2ª e 3ª sessões comparadas às
respectivas sessões do grupo controle (p<0,05). Este efeito dose dependente do CBD sugere,
assim como o AM404, uma facilitação sobre a extinção do CA contextual (Fig. 12B).
A ANOVA de uma via para os dados do teste sem droga (sessão 4) revelou apenas
uma tendência para o fator tratamento [F(3,42)=2,33; p=0,08]. Porém, se comparados
diretamente através de teste t, o grupo tratado com CBD (2,0 µg/µl i.c.v.) apresentou uma
diminuição na % do tempo de congelamento em relação à respectiva sessão do grupo controle
(t=2,66; p<0,05) (Fig. 12C).
32
Figura 12 – Efeitos da administração i.c.v. de CBD (0,2; 1,0; 2,0 µg/µl) na extinção do CA contextual. (A)
Representação esquemática do procedimento utilizado no experimento 2. (B) Média ± E.P.M. da % de
tempo de congelamento expressa pelos animais tratados com CBD e submetidos a 3 exposições de 9 min à
gaiola de condicionamento, com intervalo de 24 h (cada barra representa os dados de uma sessão). (C)
Média e E.P.M. da % do tempo de congelamento expressa pelos mesmos grupos de animais durante uma
única exposição de 3 min à gaiola de condicionamento, na ausência de tratamento farmacológico, 24 h
após a última sessão de extinção. *p<0,05 comparado à primeira sessão do respectivo grupo. #p<0,05
comparado à respectiva sessão do grupo controle (teste LSD de Fisher). (Controle/n=13, CBD 0,2/n=10,
CBD 1,0/n=11, CBD 2,0/n=12).
4.1.3 - Experimento 3: Participação dos receptores canabinóides CB
1
nos efeitos
facilitatórios do AM404.
A representação esquemática do procedimento experimental utilizado no Experimento
3 encontra-se ilustrado na figura 13A. Os efeitos do pré-tratamento com SR (0,2 mg/kg, i.p.) e
do tratamento com AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.) sobre extinção do CA contextual estão
33
representados nas figuras 13B e 13C. A ANOVA de três vias para os resultados da extinção
do CA contextual revelou efeitos significativos para os fatores tratamento [F(1,117)=5,61;
p<0,05], sessões [F(2,117)=17,27; p<0,001] e para a interação entre os fatores pré-tratamento
x tratamento [F(1,117)=4,84; p<0,05]. A análise post-hoc destes dados demonstrou que o
tratamento com AM404 facilitou a extinção do CA contextual, reforçando os dados do
Experimento 1. Por outro lado, o tratamento com SR previamente à administração de AM404
preveniu a ocorrência deste fenômeno (p<0,05; 2ª e 3ª sessões comparadas ao grupo tratado
com AM404) em uma dose que per se não exerceu influência sobre a extinção do CA
contextual. Estes resultados evidenciam que o AM404 facilita a extinção do CA contextual
através da ativação dos receptores canabinóides CB
1
(Fig. 13B).
A ANOVA de duas vias para o teste sem droga (sessão 4) revelou efeitos
significativos para os fatores tratamento [F(1,39)=4,52; p<0,05] e para a interação entre os
fatores pré-tratamento x tratamento [F(1,39)=5,03; p<0,05]. O grupo tratado com AM404 (1,0
µg/µl i.c.v.) apresentou uma diminuição na % do tempo de congelamento se comparado ao
grupo controle (p<0,05), confirmando a tendência observada no experimento 1. Além do
mais, o SR antagonizou o efeito da administração de AM404, que por sua vez passou a não
mais apresentar uma diminuição na % do tempo de congelamento se comparada ao grupo
controle (P>0,05) (Fig. 13C).
34
Figura 13 – Efeitos do antagonista dos receptores canabinóides CB
1
SR141716A (0,2 mg/kg; i.p.) nos
efeitos facilitatórios do AM404 (1,0 µg/µl; i.c.v.). (A) Representação esquemática do procedimento
utilizado no experimento 3. (B) Média ± E.P.M. da % de tempo de congelamento expressa pelos animais
pré-tratados com SR e tratados com AM404 e submetidos a 3 exposições de 9 min à gaiola de
condicionamento, com intervalo de 24 h (cada barra representa os dados de uma sessão). (C) Média e
E.P.M. da % do tempo de congelamento expressa pelos mesmos grupos de animais durante uma única
exposição de 3 min à gaiola de condicionamento, na ausência de tratamento farmacológico, 24 h após a
última sessão de extinção. *p<0,05 comparado à primeira sessão do respectivo grupo. #p<0,05 comparado
35
Os resultados deste experimento estão representados nas figuras 14B e 14C. A ANOVA de
três vias para estes resultados revelou efeitos significativos para os fatores tratamento
[F(1,105)=7,66; p<0,01], sessões [F(2,105)=16,32; p<0,001] e para interação entre os fatores
pré-tratamento x tratamento [F(1,105)=3,87; p<0,05]. A análise post-hoc destes dados
demonstrou que o tratamento com CBD mais uma vez foi capaz de facilitar a extinção do CA
contextual. De maneira interessante, o pré-tratamento com SR, em uma dose que per se
mostrou-se ineficaz, foi capaz de prevenir a ocorrência deste fenômeno (p<0,05; 2ª e 3ª
sessões comparadas ao grupo tratado com CBD). Estes resultados evidenciam a ativação dos
receptores canabinóides CB
1
nos efeitos facilitatórios promovidos pelo CBD (Fig. 14B).
A ANOVA de duas vias para o teste sem droga (sessão 4) revelou efeito significativo
para a interação entre os fatores pré-tratamento x tratamento [F(1,35)=4,72; p<0,05]. O grupo
tratado com CBD (2,0 µg/µl i.c.v.) apresentou uma diminuição na % do tempo de
congelamento se comparado ao grupo controle (p<0,05). Este resultado vem a reforçar as
evidências sugeridas pela comparação direta (através de teste T) realizada no experimento 2.
O efeito observado foi antagonizado pelo pré-tratamento com o SR (p<0,05) (Fig. 14C).
36
Figura 14 - Efeitos do antagonista SR141716A (0,2 mg/kg; i.p.) nos efeitos facilitatórios do CBD (2,0 µg/µl;
i.c.v.). (A) Representação esquemática do procedimento utilizado no experimento 4. (B) Média ± E.P.M.
da % de tempo de congelamento expressa pelos animais pré-tratados com SR e tratados com CBD e
submetidos a 3 exposições de 9 min à gaiola de condicionamento, com intervalo de 24 h (cada barra
representa os dados de uma sessão). (C) Média e E.P.M. da % do tempo de congelamento expressa pelos
mesmos grupos de animais durante uma única exposição de 3 min à gaiola de condicionamento, na
ausência de tratamento farmacológico, 24 h após a última sessão de extinção. *p<0,05 comparado à
primeira sessão do respectivo grupo. #p<0,05 comparado à respectiva sessão do grupo controle. +p<0,05
comparado a respectiva sessão do grupo Ctrl+CBD (teste LSD de Fisher). (Ctrl+Ctrl/n=9, SR+Ctrl/n=10,
Ctrl+CBD/n=11, SR+CBD/n=9).
4.1.5 - Experimento 5: Participação dos receptores vanilóides TRPV
1
nos efeitos
facilitatórios do AM404.
A representação esquemática do procedimento experimental utilizado no Experimento
5 encontra-se ilustrado na figura 15A. Os efeitos do pré-tratamento com CPZ (5,0 µg/µl,
i.c.v.) e do tratamento com AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.) sobre a extinção do CA contextual estão
37
representados nas figuras 15B e 15C. A ANOVA de três vias para estes resultados revelou
efeitos significativos para os fatores tratamento [F(1,90)=16,97; p<0,001], sessões
[F(2,90)=39,22; p<0,001] e para interação entre estes fatores [F(2,90)=7,02; p<0,01]. A
análise post-hoc destes dados demonstrou que o tratamento com AM404 mais uma vez foi
capaz de facilitar a extinção do CA contextual. O pré-tratamento com CPZ, em uma dose que
per se não exerceu nenhum efeito, não antagonizou este efeito. Ao que parecem, os efeitos
facilitatórios do AM404 sobre a extinção do CA, não estão relacionados à ativação dos
receptores vanilóides TRPV
1
(Fig. 15B).
A ANOVA de duas vias para o teste sem droga (sessão 4) revelou efeito significativo
para o fator tratamento [F(1,30)=14,23; p<0,001]. Os animais tratados com AM404 (1,0
µg/µl, i.c.v.), mesmo aqueles que receberam o pré-tratamento com CPZ, continuaram
apresentando uma diminuição na % do tempo de congelamento quando comparado ao grupo
controle (p<0,05) (Fig. 15C).
38
Figura 15 - Efeitos do antagonista dos receptores vanilóides VR
1
CPZ (5,0 µg/µl; i.c.v.) nos efeitos
facilitatórios do AM404 (1,0 µg/µl; i.c.v.). (A) Representação esquemática do procedimento utilizado no
experimento 5. (B) Média ± E.P.M. da % de tempo de congelamento expressa pelos animais pré-tratados
com CPZ e tratados com AM404 e submetidos a 3 exposições de 9 min à gaiola de condicionamento, com
intervalo de 24 h (cada barra representa os dados de uma sessão). (C) Média e E.P.M. da % do tempo de
congelamento expressa pelos mesmos grupos de animais durante uma única exposição de 3 min à gaiola de
condicionamento, na ausência de tratamento farmacológico, 24 h após a última sessão de extinção.
*p<0,05 comparado à primeira sessão do respectivo grupo. #p<0,05 comparado à respectiva sessão do
grupo controle (teste LSD de Fisher). (Ctrl+Ctrl/n=8, CPZ+Ctrl/n=9, Ctrl+AM404/n=8,
CPZ+AM404/n=9).
4.1.6 - Experimento 6: Participação dos receptores TRPV
1
nos efeitos facilitatórios do CBD.
A representação esquemática do procedimento experimental utilizado no Experimento
6 encontra-se ilustrado na figura 16A. Os efeitos do pré-tratamento com CPZ (5,0 µg/µl,
i.c.v.) e do tratamento com CBD (2,0 µg/µl, i.c.v.) sobre a extinção do CA contextual estão
representados nas figuras 16B e 16C. A ANOVA de três vias para estes resultados revelou
39
efeitos significativos para os fatores tratamento [F(1,99)=23,00; p<0,001], sessões
[F(2,99)=30,01; p<0,001] e para interação entre estes fatores [F(2,99)=3,56; p<0,05]. A
análise post-hoc destes dados mostrou que ambos os grupos tratados com CBD, que
receberam o pré-tratamento com CPZ e os que não receberam, mostraram uma diminuição na
% do tempo de congelamento (p<0,05; 2ª e 3ª sessões comparadas ao grupo controle). Isso
implica em dizer que os efeitos facilitatórios do CBD sobre a extinção do CA não parecem
estar relacionado à ativação dos receptores vanilóides TRPV
1
(Fig. 16B).
A ANOVA de duas vias para o teste sem droga (sessão 4) revelou efeito significativo
para o fator tratamento [F(1,33)=27,80; p<0,001]. A análise post-hoc destes dados mostrou
que os efeitos facilitatórios do CBD, anteriormente observados em ambos os grupos,
permaneceram mesmo no teste sem droga (Fig. 16C).
40
Figura 16 - Efeitos do antagonista CPZ (5,0 µg/µl; i.c.v.) nos efeitos facilitatórios do CBD (2,0 µg/µl; i.c.v.).
(A) Representação esquemática do procedimento utilizado no experimento 6. (B) Média ± E.P.M. da % de
tempo de congelamento expressa pelos animais pré-tratados com CPZ e tratados com CBD e submetidos a
3 exposições de 9 min à gaiola de condicionamento, com intervalo de 24 h (cada barra representa os dados
de uma sessão). (C) Média e E.P.M. da % do tempo de congelamento expressa pelos mesmos grupos de
animais durante uma única exposição de 3 min à gaiola de condicionamento, na ausência de tratamento
farmacológico, 24 h após a última sessão de extinção. *p<0,05 comparado à primeira sessão do respectivo
grupo. #p<0,05 comparado à respectiva sessão do grupo controle (teste LSD de Fisher). (Ctrl+Ctrl/n=8,
CPZ+Ctrl/n=9, Ctrl+CBD/n=10, CPZ+CBD/n=10).
41
avaliados no modelo do LCE potencializado pelo medo, previamente proposto por Mechiel
Korte e De Boer (Mechiel Korte e De Boer, 2003).
4.2.1 - Experimento 7: Efeitos do AM404, CBD e DZP no LCE potencializado pelo medo.
Os efeitos do AM404, CBD e do DZP sobre a ansiedade provocada pela recordação de
memórias aversivas foram investigados utilizando o modelo do LCE potencializado pelo
medo. A representação esquemática do procedimento experimental utilizado no Experimento
7 encontra-se ilustrado na figura 17A. Os efeitos do AM404, CBD e DZP no teste do LCE
potencializado pelo medo estão representados nas figuras 17B, 17C e 17D. A ANOVA de
duas vias para o parâmetro % de tempo de permanência nos braços abertos revelou efeito
significativo para o fator condição (submetidos e não submetidos ao CA) [F(1,42)=5,74;
p<0,05] e para interação entre os fatores tratamento x condição [F(2,42)=3,50; p<0,05]. A
análise post-hoc demonstrou que o grupo controle condicionado exibiu uma menor % de
tempo nos braços abertos quando comparado ao grupo controle não condicionado (p<0,05),
sugerindo um efeito tipo ansiogênico como resultado do procedimento do CA contextual. O
grupo tratado com AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.), previamente submetido ao condicionamento,
mostrou um aumento na % de tempo nos braços abertos quando comparados ao grupo
controle condicionado (p<0,05). Já o grupo tratado com CBD (2,0 µg/µl, i.c.v.), previamente
submetido ao condicionamento, demonstrou apenas uma tendência para este aumento
(p=0,09). O tratamento com AM404 ou CBD não afetou a % de tempo nos braços abertos dos
animais não condicionados. A ANOVA de duas vias para os efeitos do tratamento com o
controle positivo DZP (2,85 µg/µl, i.c.v.) revelou efeito significativo para o fator tratamento
[F(1,31)=11,38; p<0,01] no parâmetro % de tempo nos braços abertos. A análise post-hoc
42
indicou que o diazepam (2,85 µg/µl, i.c.v.) aumentou a % de tempo nos braços abertos em
ambos os grupos, condicionado e não condicionado (p<0,05) (Fig. 17B).
A ANOVA de duas vias para o parâmetro número de entradas nos braços abertos
revelou efeito significativo para os fatores tratamento [F(2,42)=5,20; p<0,01], condição
[F(1,42)=5,65; p<0,05] e interação entre estes dois fatores [F(2,42)=5,04; p<0,05]. A análise
post-hoc demonstrou que o grupo controle condicionado exibiu reduzida % de entradas nos
braços abertos quando comparados ao grupo controle não condicionado (p<0,05), reforçando
o efeito tipo ansiogênico observado no parâmetro % de tempo nos braços abertos. O
tratamento com AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.) ou CBD (2,0 µg/µl, i.c.v.) aumentou a % de entrada
nos braços abertos dos animais submetidos ao condicionamento (p<0,05) sem afetar a % de
entrada nos braços abertos dos animais não condicionados. A ANOVA de duas vias para os
efeitos do tratamento com o controle positivo DZP (2,85 µg/µl, i.c.v.) revelou efeitos
significativos para os fatores tratamento [F(1,31)=34,35; p<0,001], condição [F(1,31)=9,46;
p<0,01] e interação entre estes dois fatores [F(1,31)=5,81; p<0,05] no parâmetro % de entrada
nos braços abertos. A análise post-hoc indicou que o diazepam (2,85 µg/µl, i.c.v.) aumentou a
% de entrada nos braços abertos em ambos os grupos, condicionado e não condicionado
(p<0,05) (Fig. 17C).
Não houve efeitos significantes para os fatores tratamento ou condição no parâmetro
número de entradas nos braços fechados (Fig. 17D).
43
Figura 17 – Efeitos da administração i.c.v. de AM404 (1,0 µg/µl), CBD (2,0 µg/µl) e DZP (2,85 µg/µl) no
LCE potencializado pelo medo. (A) Representação esquemática do procedimento utilizado no experimento
7. (B) Média ± E.P.M. da % de tempo nos braços abertos expressa pelos animais tratados com AM404,
CBD ou DZP e expostos por 5 min ao teste do LCE potencializado pelo medo. (C) Média ± E.P.M. da %
de entradas nos braços abertos expressa pelos mesmos grupos de animais durante a mesma exposição ao
teste do LCE potencializado pelo medo. (D) Média ± E.P.M. do número de entradas nos braços fechados
expressa pelos mesmos grupos de animais durante a mesma exposição ao teste do LCE potencializado pelo
medo. *p<0,05 comparado a respectiva condição do grupo controle. #p<0,05 comparado ao grupo controle
não submetido ao CA (teste LSD de Fisher). (submetidos ao CA: Ctrl/n=7, AM404/n=8, CBD/n=8,
DZP/n=11; não submetidos ao CA: Ctrl/n=8, AM404/n=9, CBD/n=8, DZP/n=9).
44
5 - DISCUSSÃO
O presente estudo demonstra que a apresentação de um estímulo condicionado, neste
caso o contexto, concomitante a um componente aversivo, o choque, induz a formação de
uma memória aversiva associativa, em um processo denominado CA contextual. A
administração i.c.v. do inibidor da recaptação de anandamida, o AM404, facilitou a extinção
do CA contextual em ratos, reforçando a idéia de outros estudos os quais mostram que o
aumento dos níveis de eCB pode levar a facilitação da extinção do CA em animais. De forma
mais interessante, a administração i.c.v. do fitocanabinóide CBD também foi capaz de
facilitar a extinção do CA contextual em ratos de maneira dose dependente. Estes resultados
mostram de forma pioneira a facilitação da extinção do CA contextual sendo promovida pelo
AM404 e por um fitocanabinóide (CBD). Ambos os efeitos encontrados para o AM404 e o
CBD sobre a extinção do CA contextual foram revertidos pela administração prévia do
antagonista dos receptores canabinóides CB
1
, o SR141716A, mas não pelo antagonista
seletivo dos receptores vanilóides TRPV
1
, a CPZ. O efeito antagônico apenas por parte do SR
nos permite sugerir farmacologicamente que os efeitos facilitatórios aqui encontrados estão
relacionados à ativação dos receptores canabinóides CB
1
. Além do mais, estes efeitos
facilitatórios do AM404 e do CBD parecem ser persistentes, visto que os mesmos
permaneceram inalterados quando avaliado em um teste livre de droga, realizado 24 h após a
última sessão de extinção. Efeitos do tipo ansiolítico não parecem ter contribuído de forma
direta para os efeitos facilitatórios destas drogas sobre a extinção do CA contextual, visto a
ausência de efeitos sobre os animais “naïve” expostos ao modelo do LCE. De qualquer forma,
é importante ressaltar que estes efeitos podem ter contribuído de uma forma indireta, como
45
sugerida pelos efeitos anti-ansiogênicos do AM404 e do CBD observados no teste do LCE
potencializado pelo medo.
A facilitação da extinção do CA contextual promovida pela administração i.c.v. de
AM404 (1,0 µg/µl) (Figura 11) evidencia a participa
46
dos eCB no processo de extinção de memórias aversivas. Através de experimentos de
microdiálise, estes pesquisadores puderam perceber a liberação de ambos, anandamida e 2-
AG na amígdala basolateral (BLA) durante o protocolo de extinção do CA. Esta região está
intensamente envolvida com o processamento de informações emocionais neste modelo
comportamental e estima-se que alterações de plasticidade sináptica na BLA estejam
envolvidas com os processos de extinção de memórias aversivas (Quirk e Mueller, 2008).
Seguindo este pensamento, é bastante provável que o AM404, mesmo que administrado i.c.v.,
tenha exercido grande parte dos seus efeitos facilitatórios através da inibição da recaptação de
anandamida na região da BLA. Os possíveis mecanismos celulares que viriam a sustentar
estes efeitos nesta estrutura serão discutidos mais adiante.
Ainda que o presente estudo esteja mais voltado para a extinção de memórias
aversivas, é importante salientar que os efeitos da manipulação do sistema canabinóide sobre
a extinção de memórias não se restringem apenas a este tipo de memória. Resultados
semelhantes também foram observados na tarefa reversa do labirinto aquático (Varvel e
Lichtman, 2002; Varvel, Anum et al., 2005; Pamplona, Prediger et al., 2006) e na preferência
condicionada de lugar (Parker, Burton et al., 2004), mas não em tarefas de condicionamento
operante como, por exemplo, a obtenção de alimentos (Holter, Kallnik et al., 2005; Niyuhire,
Varvel et al., 2007).
Como objetivo principal, investigamos os efeitos do fitocanabinóide CBD sobre a
extinção do CA e comparamos estes efeitos aos efeitos anteriormente obtidos com o já
conhecido inibidor da recaptação de anandamida AM404. De forma bastante interessante o
CBD (2,0 µg/µl, i.c.v) facilitou a extinção do CA contextual em ratos (Figura 12) de maneira
similar aos animais tratados com AM404 (1,0 µg/µl, i.c.v.). Embora, até então, não existisse
nenhum trabalho mostrando os efeitos do CBD sobre a extinção de memórias aversivas, um
trabalho feito por Parker e colaboradores (2004) mostrou que o CBD, assim como o
∆
9
-THC,
47
facilita a extinção da preferência condicionada de lugar para cocaína e anfetamina. Este
trabalho, mesmo que não tenha abordando especificamente memórias aversivas, nos forneceu
os primeiros indícios da possibilidade de facilitação da extinção de memórias através da
utilização do CBD.
De forma ainda mais interessante, o efeito facilitatório do CBD, assim como os efeitos
do AM404, foi prevenido pela administração prévia de um antagonista seletivo para os
receptores canabinóides CB
1
, SR141716A (0,2 mg/kg, i.p.), em uma dose que per se provou-
se ineficaz (Figura 14). Curiosamente, a facilitação da extinção em curto prazo (já na primeira
sessão), observado após a administração de baixas doses do agonista canabinóide WIN55212-
2 em um protocolo comportamental semelhante (Pamplona, Prediger et al., 2006), não foi
observada após a administração de AM404 ou CBD. Os efeitos mais a longo prazo (apenas na
2ª sessão) do AM404 e do CBD, sugerem que estas drogas podem estar atuando de forma
indireta sobre os receptores CB
1
. Considerando estudos prévios in vitro, os quais indicam que
o CBD tem apenas uma baixa afinidade pelos receptores CB
1
(Petitet, Jeantaud et al., 1998;
Thomas, Gilliam et al., 1998) mas podem atuar inibindo a recaptação e degradação da
anandamida (Watanabe, Kayano et al., 1996; Bisogno, Hanus et al., 2001), nós sugerimos que
o aumento dos níveis endógenos de anandamida poderia ser um mecanismo de ação em
comum para o AM404 e CBD sobre o sistema eCB (Beltramo, Stella et al., 1997; Giuffrida,
Rodriguez De Fonseca et al., 2000; Freund, Katona et al., 2003). Este possível mecanismo de
ação viria em parte explicar o motivo pelo qual o AM404 e o CBD, ao contrário do
WIN55212-2, não promovem uma extinção a curto prazo. O WIN55212-2, como agonista
canabinóide, age diretamente nos receptores CB
1
, ao contrário do AM404 e do CBD, que
necessitariam de um tempo para que a anandamida fosse produzida, liberada e só então, após
este período de tempo, passariam a exercer suas ações sobre a recaptação e degradação deste
eCB. Estudos realizados em nosso laboratório, num protocolo de extinção do CA com uma
48
única sessão de 30 minutos onde o comportamento de congelamento foi analisado a cada 3
minutos, mostram que o AM404 passa a exercer seus efeitos facilitatórios sobre a extinção
apenas no 12° minuto, enquanto que o WIN55212-2 passa a exercer este efeito já no 6°
minuto (Pamplona, Bitencourt et al., 2008). Considerando estes resultados, uma única sessão
de 9 minutos não teria tempo o suficiente (12 minutos) para que a anandamida fosse
produzida, liberada e, conseqüentemente, sofresse a ação do AM404 e supostamente do CBD.
Entretanto, estudos adicionais seriam necessários para se confirmar tal hipótese.
Considerando a discussão anterior, uma pergunta que nos vem em mente é a seguinte:
o que estaria acontecendo neste período que antecede a liberação dos eCB? Uma idéia
inovadora, que tem surgido na tentativa de responder esta pergunta e até mesmo explicar o
envolvimento do sistema eCB na extinção de memórias aversivas, é a idéia da participação do
estresse no processo de extinção deste tipo de memória. Esta idéia parte do principio de que a
primeira exposição ao EC (neste caso contexto, previamente pareado com o choque)
desencadeie uma situação de estresse que, por conseqüência, aumentaria a liberação de
hormônios do estresse como a corticosterona (Cordero, Merino et al., 1998; Cordero e Sandi,
1998) e estes, por sua vez, estariam promovendo o aumento da produção e liberação de
endocanabinóides na amígdala (Hill, Ho et al., 2005). Se assim for, a situação de estresse,
neste caso caracterizada principalmente pela primeira exposição, torna-se imprescindível para
que haja a extinção de uma memória aversiva. Prova disto é que ansiolíticos clássicos como
os benzodiazepínicos, os quais são capazes de bloquear esta situação de estresse, podem
prejudicar a extinção de memórias de medo quando utilizados clinicamente (Otto, Bruce et
al., 2005). Outros estudos, por sua vez, têm mostrado que a administração sistêmica ou intra-
amígdala de glicocorticóides é capaz de facilitar a extinção do medo condicionado (Yang,
Chao et al., 2006; Yang, Chao et al., 2007), porém estes estudos não deixam claro de que
forma os glicocorticóides estariam desempenhando esta função. Pensando nisso, podemos
49
supor que no período que antecede os efeitos facilitatórios do AM404 e do CBD ocorra uma
situação de estresse que leve ao aumento da produção de corticosteróides. Consecutivamente,
tem-se o aumento na produção e liberação de anandamida que, por sua vez, será passível da
ação do AM404 e supostamente do CBD.
Outra possível explicação farmacológica para os efeitos do AM404 e do CBD poderia
ser uma interação com os receptores vanilóides TRPV
1
(Bisogno, Hanus et al., 2001). Isto
porque se sabe, que assim como o CBD (Bisogno, Hanus et al., 2001), o próprio AM404 ou
até mesmo a anandamida podem atuar ligando-se de forma direta a este tipo de receptor
(Zygmunt, Petersson et al., 1999; Rawls, Ding et al., 2006). Portanto, o AM404 e o CBD
poderiam estar exercendo seus efeitos de forma direta, ao se ligarem a estes receptores, ou de
forma indireta, através da inibição da liberação de anandamida. Além do mais, estudos têm
mostrado uma densa expressão destes receptores em regiões cerebrais conhecidas por
desempenhar um importante papel nos processos de aprendizado e memória, como
hipocampo e amígdala (Cortright, Crandall et al., 2001; Szabo, Biro et al., 2002; Roberts,
Davis et al., 2004; Toth, Boczan et al., 2005). Outro estudo mostrou também a co-expressão
de receptores vanilóides TRPV1 e canabinóides CB1 no SNC, sugerindo uma possível
interação entre estes receptores nesta região (Cristino, De Petrocellis et al., 2006). No entanto,
esta possível interação parece improvável nos resultados aqui observados visto que o
antagonista dos receptores TRPV
1
, CPZ (5,0 µg/µl, i.c.v.), não foi capaz de antagonizar os
efeitos do AM404 (Figura 15) e do CBD (Figura 16) sobre a extinção do medo condicionado.
Contudo, o papel dos receptores vanilóides TRPV
1
no medo condicionado está apenas
começando a ser esclarecido, e muitas outras implicações importantes do sistema vanilóide na
formação de memórias poderão ainda ser reveladas (Marsch, Foeller et al., 2007).
Até o momento, discutiram-se basicamente os possíveis mecanismos que antecedem a
liberação dos eCB, momento no qual o AM404 e o CBD passam a exercer seus efeitos.
50
Discutimos também como estas drogas estariam, supostamente, exercendo seus efeitos através
de uma ação em comum sobre a inibição da recaptação de anandamida. Porém, tão importante
quanto esta discussão, é a discussão acerca dos eventos posteriores a estes efeitos, ou seja, o
que estaria acontecendo após a potencialização do sistema eCB. A nível celular, evidências
têm sugerido de que a liberação de eCB e a indução de LTD (depressão de longa duração) nos
interneurônios GABAérgicos, localizados na BLA e que co-expressam receptores CB
1
, estão
evolvidos na extinção do medo condicionado (Marsicano, Wotjak et al., 2002; Azad, Monory
et al., 2004). Sabe-se que ao aumentar a atividade da BLA através da administração de um
antagonista GABA-A, bicuculina, tem-se uma facilitação na extinção de memórias. Este
efeito sugere que a atividade na amígdala está envolvida no processo de extinção de uma
memória (revisado em Quirk e Mueller, 2008). Como exposto na introdução, os eCB quando
liberados de seus sítios pós-sinápticos ligam-se em seus respectivos receptores a nível pré-
sináptico e estes, ao atuarem de forma negativa sobre a adenilato ciclase, podem mediar à
inibição da liberação de outros neurotransmissores. Dadas estas informações e considerando
que o AM404 e o CBD possuem mecanismos de ação em comum, estas drogas poderiam
inibir a neurotransmissão GABAérgica amígdalar através da potencialização do sistema eCB
e, de forma indireta, promover o aumento da atividade nesta estrutura. Como conseqüência,
teríamos a facilitação na extinção de memórias aversivas, similarmente ao aumento da
atividade observado com a administração de bicuculina. No entanto no hipocampo, o sistema
eCB pode desempenhar um papel na consolidação de memória, como mostrado pelo bloqueio
farmacológico dos receptores CB
1
in vitro que culminou no bloqueio da LTP (potenciação de
longa duração) nesta estrutura cerebral (De Oliveira Alvares, Genro et al., 2006). De nosso
conhecimento, a única evidência da participação do sistema vanilóide em memórias aversivas
publicada recentemente, sugere que os receptores TRPV
1
também são importantes para a
consolidação destas memórias no hipocampo (Marsch, Foeller et al., 2007). De toda forma,
51
apesar de diversas evidências terem sido apresentadas sobre a participação do sistema eCB no
processo de extinção de memórias, é importante salientar que diferentes mecanismos celulares
e moleculares devem estar envolvidos na extinção de memórias de naturezas distintas.
No intuito de investigar se os efeitos até então discutidos do AM404 e do CBD sobre a
extinção de memórias aversivas foram agudos (dependente de droga) ou persistentes, uma
sessão adicional (sessão 4), na ausência de tratamento farmacológico, foi realizada 24 h após
a ultima sessão de extinção. De forma interessante, mas não surpreendente, pois existem
outros trabalhos mostrando os efeitos persistentes dos canabinóides sobre a extinção de
memórias aversivas (Chhatwal, Davis et al., 2005; Pamplona, Prediger et al., 2006;
Pamplona, Bitencourt et al., 2008), os efeitos do AM404 e do CBD persistiram mesmo
quando testados na ausência destas drogas 24 h após as sessões de extinção (Figuras 11C a
16C). Ao considerar que a extinção de uma memóriaR1 Tm[(5)-0.297393(1)-0.2.45995(e)3.745995(a)3.74( )-140.229(m)-2.453.745995(a).74(s)-1.2312(e)3.74(no558(a)3.74( )-100.2(õ)-0.295585(e)3.74(s)-1.2-0.295585(e)3.74( )-1400.2955887295585(r)2.80561(i)-e792( )-400.3877.16558(w)1.57442(a)3.3.74( )-160.241(d)-10.3015(e)3.74(( )-1400.206(1)-0.293142(e)-6.264( )-140.229(u))3.74(n)-0.( )250]45995(a)3.74( )( )250]TJ-274.8d[(s)-1.229-0.2.4266(u)-0.294974(l)294974(c)3.74(e)3.74(o)-0.295585(u187( )-100.207(t)3.74(ã)3.74585(a)3.74( )-50.1761(2)-0.29)-7.20151(F)-0.295585(0)-0.2956(e9(a)3.74(b)-0.29b229(u)-0.29555(a)3.67(-( )-140.2n761(2)-0.29)-7.2015(e)3.74(f)-7.20151(956(e9((x)-10.299 )-100.2(õ)-0..74(n)-0.295585(c)3.7437(s)-1.22997(e)3.74(956(e9()3.74( )-140.23(a)3.74( )-140.23(e(956(e8.2(õ)-0.295585(e)3995(e)]TJ247.586 -0.295585d( )e(956(e8.95585(s)-1.22997(i)-1.22997(t)-2.16558(r)2 )e(956(e8.-1.2312( )-240.288(d)-01761(2)-0.298027(4)-0.(956(e8.f7393(1)9740.1525( )2.16436(a)3.74(n)-0.29265(i)-2.16436(n)-0.29956(e8..272(e)3.74(x)-10.3015(956(e8.439(e)3.74(s)-1.2312(e)3.74(n)-0.295n40.288(d)-01761(2)-0.2974(d)-0.2955851-1071.295585(s)-1.22997( )-100.207(n)--0.295585(s)-1.2956(e8.)2.80439(t)-2.16436(a)3.d-7.20151(F)(n)-0.( )274(R1( )250]T956(e8.2(õ)-01)-0.293142(1)995(e)]TJ247.586( )274 Tf156.452 0 Td[-1)9740.266(48t)-2.16436(e)3.74( )07(t)v.74( )07(t)3.74(c)3.74(u)-0.295585v.74( )07(t))-0.295n40.288(d)-01761(2)-0.29)-7.20151(F)5.674 )-10.1537(i)-2.16555873(e)3.74(m)-2.45f22997(e)32.16436(a)3.74(n)-(e)3o)-0.295585(l)-2.15.674 )-10.1537(i)-2.162.16558( )250]7( )-0.1495585(s)-1.22997( )-100.207(n)-2.16558( )250]TJ/R26 (l)-2.15.674 )-10.61(s)-1.229á.206(d)-074(-10.1525(a)3.74(t)-2.16436(é)3.74(.2659(e)3.74(n)-10.30o558(a)3.74( )-100.2(õ)-0.295585(e)3.74(s)-1.2-0.295585(e)586 -27.6 Td.295585( )-20.1584(s)5585(o)-0.295585( p295585(o)19.45995(e)80439(e)3.74244(s2.16436(r)2.80439(a)3.74(m)-2.462 )-50.1761(d)-10.31761(2)-0.298027(4)1537(i)-2.16555873(e)3.74(m)-2b)-0.293142(r-0.295585(i)-2.16436(d)á39(e)3.74(s)-1.231.80439(a)3.74(m)-2.462 )-50.1a55(a)3.67(d.295585( 0.295580.30T)00.2-0.(a)3.74(,)-0.146571( )-40074(m)-2.462-0.293142(m)-2.4m)-2b)-0.288(p)-0u7 -27.6 Tc7.586( )23.74244(p)-0s)389Td[(e)3.74(t)-2632446(s)-1.2312( ))-0.295585(o( )26571(s)-11.436(é)3.74( )74244(p)-080439(e)3.7.7 0 Td[(e-0.147792(7.3736( )-400.-0.293142(m)-2[(q)-0.2950.866)-0.294974(C)-3.39556()9-3.39556()9-3.39556()9-3.39556();.295585(l)2785(s)-11.S56(p)-0.295585(o)312( )-100.206(2)-0l.295585(l)2785(s)-11.5585(o)-0.80396(,)140.23(c)3n40.288(d)-01761(2)-0.2997(i)-2.16558(v)-0.29585(c)3)-0.295n40.288(d)-0,.674 )-10.2785(s)-11.)-100.2585( )-0.295187())2.80439(,)))2.80439(,);.295585(l)2785(s)-11.-0.2955678206(2)-0l.295585(t)-2.16436(a)3.74(s)-1.23)3.74(,)-0.1w295585(e)2.80439(o)-0.295585(i)-)-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)3)2.80439(,);.29558e)3.74(a)3.74(T)00.2-0.(a47.586( )2k12( )-100.206(2)-06558(w)1.57442393(1)r)2.8( )-400.0.293142(rh6571( )-40074(m)-2.462-0.293142(m)-2.5585(i)-S2659(d)-0.)-2.16558(v)-0.295585(i)b-2.16558(v)-0.295585(i)1761(2)-0.2980444Td[(e)3.74(t)-62.7971(s)-1.2312(5585(i)-383(a)-0.293142(l)2783142(ó)-10659(e)3.780439(e)3.7.7 0 Td[(e-0.147792(.04 2( )-20.152.80439(o)-0.295585(i)-)-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)3)2.80439(,);.29558e)3.74(a)3.74(L)100.25400.206(1)-00]TJ-274.8)-2.16436(s)295585(i)-2.16436.6 Tc7.586( )23.74244(p)-0t4(m)-2.462-0.293142(m)-2[(q)-0.2349744()-0.294974(C71032(5347792(e)3.74(n)i)b-50 Td[(e)3.74(t)-21.85295995(a)3.74(295278-383(a)-0.293145(l)278]295278- 12 Tf23.774 293145(l).7 0 Td[(e-0.147792327.6 6( )-400.-0.293185(0)-0.2295278-)-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)6)2.80439(,)-140.23(A)1.57442(o)-0.2952295278-S95(p)-0.295585(l)b229(u)-0.29550.295n40.288(d)-01761(2)-0.29)-7.20151(F)-16558(v)-0.295585(a)e.206(d)-02952295278-)3.74( )-140.23(a)3.74( )-140.23(e(2952750036(m)-12.4659(e)12( )-0.150036(m)-12.4659(e)3.7(2952750.74(s)-1.2312(e)3.74(no558(a)3.74( )-100.2(õ)-0.2955-27.6 T.74(s)-1.2-0.295585(e)586 659(e)3.7(2952750.74(s)-1.231-0.295585(i)1761(2)-0.29584(s)-1.2312(i)-2.16429527502(s)-1.2312(õ)-0.0.295585(u)-142952750m2393(1).2904.1525( )2.16436(a)3.d-7.20151(F)3.74(r)-7.20029(e)3)3.74244(s2d0439(a)3.-0.295585(e)586 659(e)-0.295585(s)-1.229527500.3015(r)2.80439(a)3.742( )-100.206(2)-0l.295585(o)-0.295m)-2.46239(o)-1n.74244(p)-0t4(m)-2.462.26346( )250]T2952750250]TJ-260.314 -27.6 Td[(m)-2.4)-0.85()-0.294974(Cf2997( )-260.301(t)-.74(n)i)266(s)-1.22997(e)3.74155820.31761(2)-0.292.16558( )250]TJ/R26 (l)-2.1)-1.22997( )-100.207(n)-2.159(e)3.74(n)-1R26 (l)-2.1-0.293185(0)-0.155820.3439(s)-1.2312(i)-2.029(e)3.74(s)-1.22-0.1m)-2.45995(ó)-811.2371(ê)46571( )-40074(m)-2.74(p761(2)-0.292.16558( )25029(e)3.74(s)-1.22( )-140.229(d)-0.295585(e)3.7455820( )-10.1525(C)6.61035(B)6.610355820( .2312(t)-2.16436(e)3.74(m)-2.46239(a)3.74244( )-20.1584-2.16435873(e)3.74(55820( e.206(d)-00.1584(n)-0.293142(o)-0.(55820( 0.295580.30S2393(1)5 )-0.1525( )3.74(r)-7.20029(e)3)3.7l.295585(t)-2.16436(a)3025( )-410.39(()2n40.288(d)-0,.6293142(m)-2.455820( )-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)))2.80439(,);.29558e)3.74(455820( K295585(e)0.295585(o)-0.295585(r.74(55820( e.206(r.74(55820( T)00.2-0.(a6558(w)1.574425873(e)3y)1439((F)(n4 -27.6 T0.295585(u,.6293142(m)-2.455820( )-0.295142(6)-0.293142(;)-12.1703( )-100.206(a)-;.29558e)3.74 0 Td[-1)5 )-0.-0.294974(C0.1584(n)-094974(o)-0.295187( )-0.295187( 558(o)-0.295585(n)h40.288(d)-0,.6293185(0)-0.90 )-09(Wn4 -56-2.16.61035(B)6.0.293145(l)j29(e)3.74(s)-1.22k-50 Td[(e)3.74(t)-82958875995(a)3.7490 )-09(383(a)-0.293145(l)27890 )-09( 12 Tf23.774 293145(l).7 0 Td[(e-0.14779229s)-12( )-400.-0.293185(0)-0.4(s)-1.2)-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)4)2.80439(,);.295585(l)27890 )-09(-0.295585(a)3.74(t)-2.1(m)-2.45995( )-0.1406(2)-0l.295585(o)e851-1071.2y)1439(64(l)-2.16192(i)-2.16,.6293142(m)-2.9o)19(a)T)00.2-0.(a47.5862k125(i)-2.1645873(e)36558(w)1.57442(a)3.0.293142(rh6571( )-400740 Td[(.))3.74(t)-24974485995(a)3.7490 11.22997(ã)30.293142(l)27890 11.22 12 Tf23.774 29314)3.7.7 0 Td[(e-0.147792(9s)-12( )-400.-0.293142(m)-2.9o)19(a))-0.295585(8)-0.295187())2.80439(,)6)2.80439(,);.293142(l)27890 11.22M955-25301537(s)-1.22997s)-1.2312(t)-2.161(s)-11.(i)-2.16436(s)-1.2312(m)-26.61035(B)6.610350-261.5585(o)-0.290-261.L)100.25403.74( )( )250.293142(l)zn4 -27.6 T-0.293142(m)-2.9o)19(a))-0.295142(6)-0.293142(;)-12.1703( )250]TJ-412.-140.23(A)10.293142(0)-0 0 Td[-19o)6 6(2.805(o)-0.294974(c)3.7-260.301(t)-)-100.207(t)4974(r)2.805(i)-2.-100.207(n)-0.295585(a)3.7455820.342(a)3.74(l)-2.16574(s)-1.22997( )-160.b229(u)-0.29-2.1653(o)-0.295585( )-295585(u)-0.2955820.3425873(e)3.74(5582050036(m)-12.465-0.295585(o)-0.295585(d)-0.295585(c)3.74(5582050-1.22997(t)-2.16558(r)21761(2)-0.292.16558( )25029(e)3.74(s)-1.22( )-140312( )-100.206(d)-0.2955852.16436(55820( 160.241(()-7.20151(d)-0.293142(e)-2.16436(t)-2.16436(o)-0.295585(s)-1.2312( )-240.288(d)-0.295585(o)-0.4(r)2.80439(s)-1.2312(i)-2.16436(s)-1.2.206(a)3174(s)-1.23.16436(e)3.74(n)-0.295187(t)-2.16436(e)3.74244(.231.80439(a)3.06(d)-0.295585(e)3.7455820( )-10.1525(C)6.61035(B)6.610355820( .295585(0)-0.295585(4)-0.295585( )-230.283(e)3.795585(e)3.7293142(e)-2.1643.7455820( )-10.1525(C)6.61035(B)6.610355820( 0.1584(n)-0.21584(n)-0.2312(o)-0.29355820( .2312(t)-2)2.80439(e)3.74244( )-20.1584(a)-6.24 -27.6 Td9355820( 754 -27.6 Td[(1)-0.294971(6)-0.294974(C558(i)-2.16558(n)-0.294974(ç)3.74(ã)3.74(o)-0.295585( )-160.242(d)-0.295585(e)3.774(v)-0.295585(e)3.74-0.295585(e)3.774(v)5d(0.1584(n)-0140.23(9.295585(v)-0.295585(s)-1.22997(i)-2.16558(d)-997(t)-2.16558(a)32.16558(n)-0.295585(ç)u( )-10.1537(s)-1029(e)3.31.57442(o)-0.29393(1)2949LT*-0.295585( )-140.23(c)3439(s)-1.2312(i)-2.12.465-0.2937(s)-1.22997(e)3.7490 )-09(761(t)-2.16436(r)-7.290 )-09(383(a)-2.16558(n)-3.74(ã)3.742.16558(g)9.71032(a)3.74(r)2.805695( )-20.1584(s)-1.23129049-7.290 )-09(383(a)--0.295585(ê)-6.2659(n)-0.295585(c)3.736(e)3.74244(.231 )-50.1761(d)-10.3015(e)3.2955852.164369o)19(a)6558(h)-0.295585(o)295585(e)3995(e)]TJ247.586 3.74( )-0.146571(s)-11.2371(a)3.79o)19(a)95585(s)-1.22997(i)-2.16558(d)-997(t)-(e)-6.2659(z)-6.n40.288(d)-0176(t)-2.16436(r)--2.16558(d)-996239(e9.256( )-400.383(a)-.2955852.164369o)19(a))-20.1584(s)5585(o)-0.9o)19(a))3.74( )-140.23(a)3.74( )-140.23(e9o)19(a)10.1525(d)-0.295585(o)-0.290-261.5585(o)36(t)-2.16436(o)-0.295585(s)-1.23025( )-10.1525(a)3.74(t)-2.164369o)19(a))-2(t)-2.16-0.295585(e)3.79o)19(a)A2312(o)-0-0.295585(4)-0.295142(;)-12.1703( )-0.293142( )-5090 11.22997(ã).6 Td[(s)-1.22e9.256(-0.294974(C)-100.207(t)-2.1655-0.295582295278-57564( )-240.288(p)-0.29558(9.2955]295278- 1(a)3.74(l)-2.165n)-0.29558]295278- 1(a)3.)3.74( )-140.23(a)3.74( -6.2659(n)-558]295278--0.295585(i)b-2.16558(v)997(s)-1.22997(ã)30]7( )-0.145995( )-0.1406(2)-0)-1.22997( )-100.207(n)-0.295585(a)3.7]29527.1525(o)-0.295585(s)j95(e)]TJ247.586 1.2312(i)-2.1642952750.272(e)3.74(x)-10.3015(29527509(m)-12.4659(a)3.-50.1761(f)2.80439(a)3.74(429527502(s)-1.231)2.80439(e)3.74( )-20.1584(a)3.74( )-20.1584(2952750a)-10.3015(29527509(m)-12.46596239(e0.0045995(a)3 )-50.1761(d)-10.3l.295585(t)-2.16436(a)995(e)]TJ247.586 15( )-20.1584(d)-0.20439(a)3.74(429527501761(2)-0.298027(4)-0.(2952750036(m)-2.16436(n)9.71032(ç)3.744(ã)1(64(o)-0.295585( )-140.229(d)-0.295585(e)3.742952750.272(e)3.74(x)-10.( )250]T29528)-0.295m)-2.46239(o)-1-0.295m)-2.ó74244( )-20.1584(a)-6R1( )2586 -27.6 Td[(a)3.74(e0.0045266(u)-0.294974(l)v.74( )07(t))-0.295.74(n)i)0.295585(a)3.74(s)-1.23025( ))-0.294974(o0.295585(a)3.74731428.95585(s)-1.22997(i)-1.22997(t)-2.16558(r)2-0.293185(0)-0.4731428.)2.80439(t)-2.16436(a)3.74(n)-(e)3.74(731428.036(m)-2.16436(n)944( )-20.1584-811.-0.295585(n)-0.295555(a)3.74(l)-2.1-0.293185(0)-0.4731428.(o)-0.295585.229(d)-0.295585(e)3.7473142736558(w)1.57442(a)3.561(s)-1.22997(a)3.74(s)-(u)-0.295585( )2.80439(e)-6.2659(r)2.80439(e)3.74(7(ã)30]7( )-192(i)-2.165585(i)-2.1293142( )-s)-1.22-0.17314273i)-2.1655.206(a9.5.8( )-400..74(t)-2.16435585(i)-2.16436(g)0.295585( )10.1525(d)-0.295585(o)-0.2731427380439(a)3.435585(i)-.23(a)3.74( )2.80439(t)-2.16436(a)3.586 -27.6 Td.95585( ).207(a)3.74(u)16436(g)0.295585( ).2659(e)3.74(n)-10.300.295585(o)-0.295585(r436(o)-0.295585(s)39( )]TJ282.046 0.295585( )586 -27.6 T2(õ)-01)-0.293142(1).293142(1)260.3(d)-0.293142(e)-6.2617314273i)-2.1( )250]4731427342 -27.6 Td[(s)-1.22a9.5.8(2.805(o)-0.294974(c)3.7)-0.295.74(n)i)266(s)-1.22997(e)3(o)-0.295585ê)-2.165585(i)-2.1 )-100.207(d)-0.295585(e)3.75(s)-11..272(e)3.74(x)-10.30155(s)-11.5585(o)f5( )-20.1584(s)-.74(n)-0.295585(c)3.742.80439(a)3.74(r)2.811.-0.295585(r436(o)1.220.295585(a)-1.22997(t)-2.16558(r)2 )e4( )-50.1773(a)3.74(3.74( )-140.229(m)-2.453.70151(a)3.74(t)-2.16036(m)-12.4659(e)12( )-0.150036(m)- 0.29s)-127l.295585(t)-2.16436(a)3025( )-410.84(a)3.74( )-20.1584( )-50.17612(e)3.74(x)-10.301529s)-12710.3015(g)-0.29558-0.2-2.16558(r)2g2.206(a)37.6 )-20.1584(s)-1.2312(o)-02.80439(o)-0.295585(i)-é)-20.1584( )-50.1439(s)-1.2312(i)-2.16436(s)-10.295585(t)-2.16436(a)3.74(s)-1.236436(e)3.74244(.231.80439(a)3.06(d)-0584( )-50.12.80439(a)3.74(r)2.8043)3.74( )-140.23(a)3.74( )-140.2.16436(r)2.80439(a)3.74(m)-2.462)3.74(,)-0.146571( )-400.383(P)-0.295585(r436(o385(1n.74244(p)-0t4(m)-2.462.293142(e)-6.26r)2.8043.2312(t)-2)2.80439(e)3.74244( )-20.1584(a)-6.24 -27.6 Td[(1)-0.294977.6 266(u)-0.294974(l)-2.(t)-2.3)3.74(ã)3.74(o)-0.295585f2997( )-0.295555(auo)-0.295585ê)-2.165584244(.231 )-50.1761(d)-0.295585(e)3.7(t)-2.3ext mta silo snca5(ó)-0.295585(s-2.16558(d)-0.2955t)-2.16436(e)3.-10.3015(g)9.71032(i)-2í2.16436(a)995(e)]TJ25585(,)-0.146571( )-50.1761(F)5.67(ó)-0.2tats ãostd ó so.
52
tentativa de investigar se um possível efeito ansiolítico estaria contribuindo para os efeitos
facilitatórios das doses selecionadas de AM404 (1,0 µg/µl i.c.v.) e CBD (2,0 µg/µl i.c.v.)
sobre a extinção das memórias aversivas, o teste do LCE potencializado pelo medo foi
realizado. Este modelo permite, além de observar possíveis efeitos ansiolíticos ou
ansiogênicos das drogas em questão, a observação de um possível efeito destas drogas nos
níveis de comportamento tipo ansiedade provocada pela evocação de uma memória aversiva.
A despeito de evidências anteriores descreverem um efeito ansiolítico para baixas doses de
agonistas canabinóides (Berrendero e Maldonado, 2002; Marco, Perez-Alvarez et al., 2004),
bem como para o AM404 (Bortolato, Campolongo et al., 2006) e o CBD (Moreira, Aguiar et
al., 2006; Resstel, Joca et al., 2006), este experimento indica que o efeito facilitatório destas
duas ultimas drogas não está diretamente relacionado a um efeito ansiolítico. Como pode ser
visto nos resultados, o tratamento com estas doses não alterou o número de entradas e o
tempo de permanência nos braços abertos para os animais “naïve” (Figura 17). Já os animais
que passaram pelo procedimento do CA, claramente mostraram um aumento do estado tipo
ansiogênico. Este estado ficou evidente pela diminuição no número de entradas, bem como no
tempo de permanência nos braços abertos por parte destes animais quando comparados aos
animais “naïve” (Figura 17). O presente resultado deixa claro também a eficácia de um
estresse agudo, como o protocolo de CA, em induzir um estado tipo ansiogênico nos animais.
Inclusive, vai de acordo com uma série de estudos os quais mostraram que a indução de
estresse agudo ou crônico é capaz de desencadear tal estado em diferentes modelos
comportamentais tanto em animais como também em humanos (Vyas e Chattarji, 2004;
Goyal e Anil, 2007; Grillon, Duncko et al., 2007; Bondi, Rodriguez et al., 2008). Contudo,
curiosamente, ambas as drogas (AM404 e CBD) reverteram os estado tipo ansiogênico dos
ratos previamente submetidos ao procedimento de CA sem afetar o comportamento dos
animais “naïve” (Figura 17). Dentre os vários fatores que poderiam estar propiciando este
53
efeito seletivo do AM404 e do CBD, talvez o mais plausível seja a possibilidade de o estresse
agudo (CA) proporcionar o aumento da síntese de eCB no sistema límbico, o que, inclusive,
sugeriria que a atividade eCB possa desempenhar um papel importante na modulação do
estresse e ansiedade (Hill e Gorzalka, 2004). Desta forma, as doses selecionadas de AM404 e
CBD, que em níveis normais de anandamida não foram o suficiente para exercer algum efeito,
passariam a exercer seus efeitos quando estes níveis estivessem supostamente aumentados, o
que implicaria nos efeitos tipo anti-ansiogênicos observados pelo uso destas drogas no teste
do LCE potencializado pelo medo. Em adição, esta seria mais uma evidência comportamental
de que ambas as drogas, AM404 e CBD, estariam desempenhando um mecanismo de ação em
comum. Em contraste, o DZP (2,85 µg/µl, i.c.v.), droga utilizada como controle positivo,
exerceu efeitos tipo-ansiolíticos em ambos os animais, “naïve” e condicionados (Figura 17).
Somados aos resultados obtidos com o DZP, poderíamos até dizer que drogas capazes de
aumentarem os níveis de eCB no cérebro, como o AM404 e supostamente o CBD,
representariam uma classe original de drogas ansiolíticas. A vantagem estaria na capacidade
que estas drogas têm de agirem de forma discriminada apenas em indivíduos com níveis de
ansiedade aumentados, ao contrário de ansiolíticos padrões, como o DZP, que agem de forma
indiscriminada em qualquer individuo, esteja este com alterações nas respostas tipo ansiedade
ou não. Além do mais, a capacidade do AM404 e do CBD promoverem a extinção de
memórias aversivas sem causarem efeitos tipo ansiogênicos está em desacordo com um
estudo (Cain, Blouin et al., 2004) que diz serem potencialmente ansiogênicas as drogas
capazes de facilitarem a extinção de memórias aversivas. Lembrando da necessidade de um
estado de ansiedade para que se tenha a extinção de uma memória aversiva, é plausível pensar
que drogas com a característica de facilitar a extinção destas memórias sejam realmente
ansiogênicas. No entanto, o AM404 e o CBD foram capazes de desempenhar esta função mais
uma vez de forma diferenciada, sem elevar a ansiedade a níveis ansiogênicos. Finalizando, ao
54
analisarmos o parâmetro número de entradas nos braços fechados não foram observadas
nenhuma diferença entre os tratamentos e suas respectivas condições, submetidos e não
submetidos ao condicionamento (Figura 17). Sendo este um parâmetro locomotor (Cruz, Frei
et al., 1994), podemos dizer que os tratamentos utilizados, principalmente as doses
selecionadas de AM404 e CBD, não afetaram a locomoção dos animais, ou seja, a
permanência dos animais em uma posição de imobilidade devido à expressão de
comportamento de congelamento não estava relacionada a uma redução da locomoção.
Revisando, temos dois compostos (AM404 e CBD) capazes de facilitar a extinção de
memórias aversivas, além de reverterem o estado tipo ansiogênico de animais previamente
submetidos a uma forma de estresse sem afetar as respostas tipo ansiedade dos animais
“naïve”.
Concluindo, o presente trabalho evidencia o papel da manipulação farmacológica do
sistema eCB através do AM404 e do CBD sobre a extinção do CA em ratos, utilizado como
um modelo animal para o estudo de memórias com motivação aversiva. Juntos, nossos
resultados complementam outras linhas de evidências as quais sugerem uma função do
sistema eCB na modulação de estados emocionais. Neste sentido, o aumento dos níveis de
eCB pela inibição de sua recaptação pode constituir uma abordagem farmacológica
interessante para reduzir os efeitos ansiogênicos causados pelo estresse, e ainda promover a
extinção de memórias aversivas. Como se sabe, a extinção de memórias aversivas em animais
constitui um procedimento experimental análogo ao realizado durante a terapia cognitivo-
comportamental, utilizado com sucesso em seres humanos. Estas terapias visam reduzir
gradualmente as respostas de ansiedade frente ao motivo gerador de um trauma; contribuindo,
por exemplo, para o tratamento de fobias e do estresse pós-traumático (Rothbaum e Schwartz,
2002). Além disso, existem evidências de que uma terapia farmacológica que facilite a
extinção do CA em animais pode ser utilizada com sucesso para o tratamento das
55
mencionadas patologias em seres humanos (Walker e Huang, 2002; Ressler, Rothbaum et al.,
56
6 - CONCLUSÕES
A extinção de memórias aversivas no modelo do CA contextual foi facilitada pelo
tratamento i.c.v. do fitocanabinóide CBD de forma dose dependente (2,0 µg/µl);
De forma semelhante ao CBD, a extinção do CA contextual foi facilitada pelo
tratamento i.c.v. do inibidor da recaptação de anandamida, o AM404, na dose de (1,0
µg/µl);
Ambos os efeitos facilitatórios descritos anteriormente foram revertidos pela
administração prévia de um antagonista dos receptores canabinóides CB
1
, o
SR141716A, mas não pelo antagonista dos receptores vanilóides TRPV
1
, a CPZ,
sugerindo farmacologicamente a participação destes receptores canabinóides como
mediadores destes efeitos;
Os efeitos observados do AM404 e do CBD durante as sessões de extinção
permaneceram mesmo quando analisados em um teste sem droga, realizado 24 h após
a última sessão de extinção, sugerindo que estes foram efeitos persistentes e não
apenas efeitos agudos (dependente de drogas);
Testes realizados no modelo do LCE potencializado pelo medo mostraram que as
doses selecionadas de AM404 e CBD foram capazes de reverter o estado tipo
ansiogênico de animais previamente submetidos ao modelo do condicionamento
aversivo sem afetar as respostas tipo ansiedade dos animais “naïve”.
57
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abel, E. L. Marihuana, the first twelve thousand years. New York: Plenum Press. 1980. xi,
289 p. p.
Azad, S. C., M. Eder, et al. Activation of the cannabinoid receptor type 1 decreases
glutamatergic and GABAergic synaptic transmission in the lateral amygdala of the mouse.
Learn Mem, v.10, n.2, Mar-Apr, p.116-28. 2003.
Azad, S. C., K. Monory, et al. Circuitry for associative plasticity in the amygdala involves
endocannabinoid signaling. J Neurosci, v.24, n.44, Nov 3, p.9953-61. 2004.
Beltramo, M., E. Di Tomaso, et al. Inhibition of anandamide hydrolysis in rat brain tissue by
(E)-6-(bromomethylene) tetrahydro-3-(1-naphthalenyl)-2H-pyran-2-one. FEBS Lett, v.403,
n.3, Feb 24, p.263-7. 1997.
Beltramo, M., N. Stella, et al. Functional role of high-affinity anandamide transport, as
revealed by selective inhibition. Science, v.277, n.5329, Aug 22, p.1094-7. 1997.
Berrendero, F. e R. Maldonado. Involvement of the opioid system in the anxiolytic-like
effects induced by Delta(9)-tetrahydrocannabinol. Psychopharmacology (Berl), v.163, n.1,
Aug, p.111-7. 2002.
Bisogno, T., L. Hanus, et al. Molecular targets for cannabidiol and its synthetic analogues:
effect on vanilloid VR1 receptors and on the cellular uptake and enzymatic hydrolysis of
anandamide. Br J Pharmacol, v.134, n.4, Oct, p.845-52. 2001.
Blanchard, R. J. e D. C. Blanchard. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psychol,
v.67, n.3, Mar, p.370-5. 1969.
Bondi, C. O., G. Rodriguez, et al. Chronic unpredictable stress induces a cognitive deficit and
anxiety-like behavior in rats that is prevented by chronic antidepressant drug treatment.
Neuropsychopharmacology, v.33, n.2, Jan, p.320-31. 2008.
Borsini, F., J. Podhorna, et al. Do animal models of anxiety predict anxiolytic-like effects of
antidepressants? Psychopharmacology (Berl), v.163, n.2, Sep, p.121-41. 2002.
Bortolato, M., P. Campolongo, et al. Anxiolytic-like properties of the anandamide transport
inhibitor AM404. Neuropsychopharmacology, v.31, n.12, Dec, p.2652-9. 2006.
Breivogel, C. S., D. E. Selley, et al. Cannabinoid receptor agonist efficacy for stimulating
[35S]GTPgammaS binding to rat cerebellar membranes correlates with agonist-induced
decreases in GDP affinity. J Biol Chem, v.273, n.27, Jul 3, p.16865-73. 1998.
Brewin, C. R. e E. A. Holmes. Psychological theories of posttraumatic stress disorder. Clin
Psychol Rev, v.23, n.3, May, p.339-76. 2003.
58
Cain, C. K., A. M. Blouin, et al. Adrenergic transmission facilitates extinction of conditional
fear in mice. Learn Mem, v.11, n.2, Mar-Apr, p.179-87. 2004.
Cammarota, M., L. R. Bevilaqua, et al. Retrieval and the extinction of memory. Cell Mol
Neurobiol, v.25, n.3-4, Jun, p.465-74. 2005.
Cannich, A., C. T. Wotjak, et al. CB1 cannabinoid receptors modulate kinase and phosphatase
activity during extinction of conditioned fear in mice. Learn Mem, v.11, n.5, Sep-Oct, p.625-
32. 2004.
Carlini, E. A., J. R. Leite, et al. Letter: Cannabidiol and Cannabis sativa extract protect mice
and rats against convulsive agents. J Pharm Pharmacol, v.25, n.8, Aug, p.664-5. 1973.
Chalsma, A. L., D. Boyum, et al. Marijuana situation assessment. [Washington, D.C.: Office
of National Drug Control Policy. 1994. 71 p. p. (ONDCP paper.)
Chevaleyre, V., K. A. Takahashi, et al. Endocannabinoid-Mediated Synaptic Plasticity in the
CNS. Annu Rev Neurosci, Mar 15. 2006.
Chhatwal, J. P., M. Davis, et al. Enhancing cannabinoid neurotransmission augments the
extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology, v.30, n.3, Mar, p.516-24. 2005.
Childers, S. R. e C. S. Breivogel. Cannabis and endogenous cannabinoid systems. Drug
Alcohol Depend, v.51, n.1-2, Jun-Jul, p.173-87. 1998.
Childers, S. R., T. Sexton, et al. Effects of anandamide on cannabinoid receptors in rat brain
membranes. Biochem Pharmacol, v.47, n.4, Feb 11, p.711-5. 1994.
Consroe, P. e A. Wolkin. Cannabidiol--antiepileptic drug comparisons and interactions in
experimentally induced seizures in rats. J Pharmacol Exp Ther, v.201, n.1, Apr, p.26-32.
1977.
Cordero, M. I., J. J. Merino, et al. Correlational relationship between shock intensity and
corticosterone secretion on the establishment and subsequent expression of contextual fear
conditioning. Behav Neurosci, v.112, n.4, Aug, p.885-91. 1998.
Cordero, M. I. e C. Sandi. A role for brain glucocorticoid receptors in contextual fear
conditioning: dependence upon training intensity. Brain Res, v.786, n.1-2, Mar 9, p.11-7.
1998.
Cortright, D. N., M. Crandall, et al. The tissue distribution and functional characterization of
human VR1. Biochem Biophys Res Commun, v.281, n.5, Mar, p.1183-9. 2001.
Crippa, J. A., A. W. Zuardi, et al. Effects of cannabidiol (CBD) on regional cerebral blood
flow. Neuropsychopharmacology, v.29, n.2, Feb, p.417-26. 2004.
Cristino, L., L. De Petrocellis, et al. Immunohistochemical localization of cannabinoid type 1
and vanilloid transient receptor potential vanilloid type 1 receptors in the mouse brain.
Neuroscience
, v.139, n.4, p.1405-15. 2006.
59
Cruz, A. P., F. Frei, et al. Ethopharmacological analysis of rat behavior on the elevated plus-
maze. Pharmacol Biochem Behav, v.49, n.1, Sep, p.171-6. 1994.
De Oliveira Alvares, L., B. P. Genro, et al. AM251, a selective antagonist of the CB1
receptor, inhibits the induction of long-term potentiation and induces retrograde amnesia in
rats. Brain Res, v.1075, n.1, Feb 23, p.60-7. 2006.
Deutsch, D. G. e S. A. Chin. Enzymatic synthesis and degradation of anandamide, a
cannabinoid receptor agonist. Biochem Pharmacol, v.46, n.5, Sep 1, p.791-6. 1993.
Devane, W. A., F. A. Dysarz, 3rd, et al. Determination and characterization of a cannabinoid
receptor in rat brain. Mol Pharmacol, v.34, n.5, Nov, p.605-13. 1988.
Devane, W. A., L. Hanus, et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the
cannabinoid receptor. Science, v.258, n.5090, Dec 18, p.1946-9. 1992.
Dewey, W. L. Cannabinoid pharmacology. Pharmacol Rev, v.38, n.2, Jun, p.151-78. 1986.
Di Marzo, V., C. S. Breivogel, et al. Levels, metabolism, and pharmacological activity of
anandamide in CB(1) cannabinoid receptor knockout mice: evidence for non-CB(1), non-
CB(2) receptor-mediated actions of anandamide in mouse brain. J Neurochem, v.75, n.6, Dec,
p.2434-44. 2000.
Di Marzo, V., A. Fontana, et al. Formation and inactivation of endogenous cannabinoid
anandamide in central neurons. Nature, v.372, n.6507, Dec 15, p.686-91. 1994.
Di Marzo, V., D. Melck, et al. Endocannabinoids: endogenous cannabinoid receptor ligands
with neuromodulatory action. Trends Neurosci, v.21, n.12, Dec, p.521-8. 1998.
Di Marzo, V. e L. D. Petrocellis. Plant, synthetic, and endogenous cannabinoids in medicine.
Annu Rev Med, v.57, p.553-74. 2006.
Fanselow, M. S. Conditioned and unconditional components of post-shock freezing. Pavlov J
Biol Sci, v.15, n.4, Oct-Dec, p.177-82. 1980.
Felder, C. C., E. M. Briley, et al. Anandamide, an endogenous cannabimimetic eicosanoid,
binds to the cloned human cannabinoid receptor and stimulates receptor-mediated signal
transduction. Proc Natl Acad Sci U S A, v.90, n.16, Aug 15, p.7656-60. 1993.
Ferrari, F., A. Ottani, et al. Learning impairment produced in rats by the cannabinoid agonist
HU 210 in a water-maze task. Pharmacol Biochem Behav, v.64, n.3, Nov, p.555-61. 1999.
Freund, T. F., I. Katona, et al. Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling. Physiol
Rev, v.83, n.3, Jul, p.1017-66. 2003.
Giuffrida, A., F. Rodriguez De Fonseca, et al. Elevated circulating levels of anandamide after
administration of the transport inhibitor, AM404. Eur J Pharmacol, v.408, n.2, Nov 17, p.161-
8. 2000.
60
Goyal, R. e K. Anil. Protective effect of alprazolam in acute immobilization stress-induced
certain behavioral and biochemical alterations in mice. Pharmacol Rep, v.59, n.3, May-Jun,
p.284-90. 2007.
Grillon, C., R. Duncko, et al. Acute stress potentiates anxiety in humans. Biol Psychiatry,
v.62, n.10, Nov 15, p.1183-6. 2007.
Haller, J., B. Varga, et al. CB1 cannabinoid receptors mediate anxiolytic effects: convergent
genetic and pharmacological evidence with CB1-specific agents. Behav Pharmacol, v.15, n.4,
Jul, p.299-304. 2004.
Herkenham, M., A. B. Lynn, et al. Cannabinoid receptor localization in brain. Proc Natl Acad
Sci U S A, v.87, n.5, Mar, p.1932-6. 1990.
Hill, M. N., L. M. Froese, et al. Alterations in behavioral flexibility by cannabinoid CB1
receptor agonists and antagonists. Psychopharmacology (Berl), v.187, n.2, Aug, p.245-59.
2006.
Hill, M. N. e B. B. Gorzalka. Enhancement of anxiety-like responsiveness to the cannabinoid
CB(1) receptor agonist HU-210 following chronic stress. Eur J Pharmacol, v.499, n.3, Sep 24,
p.291-5. 2004.
Hill, M. N., W. S. Ho, et al. Chronic corticosterone treatment increases the endocannabinoid
2-arachidonylglycerol in the rat amygdala. Eur J Pharmacol, v.528, n.1-3, Dec 28, p.99-102.
2005.
Hillard, C. J. e W. B. Campbell. Biochemistry and pharmacology of
arachidonylethanolamide, a putative endogenous cannabinoid. J Lipid Res, v.38, n.12, Dec,
p.2383-98. 1997.
Hillard, C. J., R. A. Harris, et al. Effects of the cannabinoids on physical properties of brain
membranes and phospholipid vesicles: fluorescence studies. J Pharmacol Exp Ther, v.232,
n.3, Mar, p.579-88. 1985.
Hoffman, A. F. e C. R. Lupica. Mechanisms of cannabinoid inhibition of GABA(A) synaptic
transmission in the hippocampus. J Neurosci, v.20, n.7, Apr 1, p.2470-9. 2000.
Holter, S. M., M. Kallnik, et al. Cannabinoid CB1 receptor is dispensable for memory
extinction in an appetitively-motivated learning task. Eur J Pharmacol, v.510, n.1-2, Mar 7,
p.69-74. 2005.
Howlett, A. C. Inhibition of neuroblastoma adenylate cyclase by cannabinoid and nantradol
compounds. Life Sci, v.35, n.17, Oct 22, p.1803-10. 1984.
______. Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase. Biochemistry of the response in
neuroblastoma cell membranes. Mol Pharmacol, v.27, n.4, Apr, p.429-36. 1985.
Howlett, A. C., F. Barth, et al. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of
cannabinoid receptors. Pharmacol Rev
, v.54, n.2, Jun, p.161-202. 2002.
61
Howlett, A. C. e R. M. Fleming. Cannabinoid inhibition of adenylate cyclase. Pharmacology
of the response in neuroblastoma cell membranes. Mol Pharmacol, v.26, n.3, Nov, p.532-8.
1984.
Howlett, A. C., J. M. Qualy, et al. Involvement of Gi in the inhibition of adenylate cyclase by
cannabimimetic drugs. Mol Pharmacol, v.29, n.3, Mar, p.307-13. 1986.
Izquierdo, I., O. A. Orsingher, et al. Effect of cannabidiol and of other cannabis sativa
compounds on hippocampal seizure discharges. Psychopharmacologia, v.28, n.1, p.95-102.
1973.
Kamprath, K., G. Marsicano, et al. Cannabinoid CB1 receptor mediates fear extinction via
habituation-like processes. J Neurosci, v.26, n.25, Jun 21, p.6677-86. 2006.
Kathuria, S., S. Gaetani, et al. Modulation of anxiety through blockade of anandamide
hydrolysis. Nat Med, v.9, n.1, Jan, p.76-81. 2003.
Katona, I., B. Sperlagh, et al. GABAergic interneurons are the targets of cannabinoid actions
in the human hippocampus. Neuroscience, v.100, n.4, p.797-804. 2000.
Kim, D. e S. A. Thayer. Cannabinoids inhibit the formation of new synapses between
hippocampal neurons in culture. J Neurosci, v.21, n.10, May 15, p.RC146. 2001.
Lamprecht, R., C. R. Farb, et al. Fear conditioning drives profilin into amygdala dendritic
spines. Nat Neurosci, v.9, n.4, Apr, p.481-3. 2006.
Leite, J. R., E. A. Carlini, et al. Anticonvulsant effects of the (-) and (+)isomers of
cannabidiol and their dimethylheptyl homologs. Pharmacology, v.24, n.3, p.141-6. 1982.
Mackie, K., W. A. Devane, et al. Anandamide, an endogenous cannabinoid, inhibits calcium
currents as a partial agonist in N18 neuroblastoma cells. Mol Pharmacol, v.44, n.3, Sep,
p.498-503. 1993.
Malinow, R. AMPA receptor trafficking and long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond
B Biol Sci, v.358, n.1432, Apr 29, p.707-14. 2003.
Marco, E. M., L. Perez-Alvarez, et al. Involvement of 5-HT1A receptors in behavioural
effects of the cannabinoid receptor agonist CP 55,940 in male rats. Behav Pharmacol, v.15,
n.1, Feb, p.21-7. 2004.
Marsch, R., E. Foeller, et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term
potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. J
Neurosci, v.27, n.4, Jan 24, p.832-9. 2007.
Marsicano, G. e B. Lutz. Expression of the cannabinoid receptor CB1 in distinct neuronal
subpopulations in the adult mouse forebrain. Eur J Neurosci, v.11, n.12, Dec, p.4213-25.
1999.
______. Neuromodulatory functions of the endocannabinoid system. J Endocrinol Invest
,
v.29, n.3 Suppl, p.27-46. 2006.
62
Marsicano, G., C. T. Wotjak, et al. The endogenous cannabinoid system controls extinction of
aversive memories. Nature
63
Pamplona, F. A. e R. N. Takahashi. WIN 55212-2 impairs contextual fear conditioning
through the activation of CB1 cannabinoid receptors. Neurosci Lett, v.397, n.1-2, Apr 10-17,
p.88-92. 2006.
Pare, D., G. J. Quirk, et al. New vistas on amygdala networks in conditioned fear. J
Neurophysiol, v.92, n.1, Jul, p.1-9. 2004.
Parker, L. A., P. Burton, et al. Effect of low doses of delta9-tetrahydrocannabinol and
cannabidiol on the extinction of cocaine-induced and amphetamine-induced conditioned place
preference learning in rats. Psychopharmacology (Berl), v.175, n.3, Sep, p.360-6. 2004.
Paxinos, G. e C. Watson. The ¤rat brain in stereotaxic coordinates. San Diego, Calif.:
Academic Press. 2002. 256 s. p.
Pellow, S., P. Chopin, et al. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as
a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods, v.14, n.3, Aug, p.149-67. 1985.
Pellow, S. e S. E. File. Anxiolytic and anxiogenic drug effects on exploratory activity in an
elevated plus-maze: a novel test of anxiety in the rat. Pharmacol Biochem Behav, v.24, n.3,
Mar, p.525-9. 1986.
Pertwee, R. G. Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors. Pharmacol Ther, v.74,
n.2, p.129-80. 1997.
______. Pharmacological actions of cannabinoids. Handb Exp Pharmacol, n.168, p.1-51.
2005.
______. Cannabinoid pharmacology: the first 66 years. Br J Pharmacol, v.147 Suppl 1, Jan,
p.S163-71. 2006.
Petitet, F., B. Jeantaud, et al. Complex pharmacology of natural cannabinoids: evidence for
partial agonist activity of delta9-tetrahydrocannabinol and antagonist activity of cannabidiol
on rat brain cannabinoid receptors. Life Sci, v.63, n.1, p.PL1-6. 1998.
Quirk, G. J. e D. Mueller. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.
Neuropsychopharmacology, v.33, n.1, Jan, p.56-72. 2008.
Rawls, S. M., Z. Ding, et al. Role of TRPV1 and cannabinoid CB1 receptors in AM 404-
evoked hypothermia in rats. Pharmacol Biochem Behav, v.83, n.4, Apr, p.508-16. 2006.
Ressler, K. J., B. O. Rothbaum, et al. Cognitive enhancers as adjuncts to psychotherapy: use
of D-cycloserine in phobic individuals to facilitate extinction of fear. Arch Gen Psychiatry,
v.61, n.11, Nov, p.1136-44. 2004.
Resstel, L. B., S. R. Joca, et al. Effects of cannabidiol and diazepam on behavioral and
cardiovascular responses induced by contextual conditioned fear in rats. Behav Brain Res,
v.172, n.2, Sep 25, p.294-8. 2006.
Rinaldi-Carmona, M., F. Barth, et al. SR141716A, a potent and selective antagonist of the
brain cannabinoid receptor. FEBS Lett
, v.350, n.2-3, Aug 22, p.240-4. 1994.
64
Roberts, J. C., J. B. Davis, et al. [3H]Resiniferatoxin autoradiography in the CNS of wild-type
and TRPV1 null mice defines TRPV1 (VR-1) protein distribution. Brain Res, v.995, n.2, Jan
9, p.176-83. 2004.
Ross, R. A. Anandamide and vanilloid TRPV1 receptors. Br J Pharmacol, v.140, n.5, Nov,
p.790-801. 2003.
Rothbaum, B. O. e A. C. Schwartz. Exposure therapy for posttraumatic stress disorder. Am J
Psychother, v.56, n.1, p.59-75. 2002.
Segal, M. e P. Andersen. Dendritic spines shaped by synaptic activity. Curr Opin Neurobiol,
v.10, n.5, Oct, p.582-6. 2000.
Shen, M., T. M. Piser, et al. Cannabinoid receptor agonists inhibit glutamatergic synaptic
transmission in rat hippocampal cultures. J Neurosci, v.16, n.14, Jul 15, p.4322-34. 1996.
Sullivan, J. M. Cellular and molecular mechanisms underlying learning and memory
impairments produced by cannabinoids. Learn Mem, v.7, n.3, May-Jun, p.132-9. 2000.
Suzuki, A., S. A. Josselyn, et al. Memory reconsolidation and extinction have distinct
temporal and biochemical signatures. J Neurosci, v.24, n.20, May 19, p.4787-95. 2004.
Szabo, T., T. Biro, et al. Pharmacological characterization of vanilloid receptor located in the
brain. Brain Res Mol Brain Res, v.98, n.1-2, Jan 31, p.51-7. 2002.
Takahashi, T., K. Svoboda, et al. Experience strengthening transmission by driving AMPA
receptors into synapses. Science, v.299, n.5612, Mar 7, p.1585-8. 2003.
Thomas, B. F., A. F. Gilliam, et al. Comparative receptor binding analyses of cannabinoid
agonists and antagonists. J Pharmacol Exp Ther, v.285, n.1, Apr, p.285-92. 1998.
Toni, N., P. A. Buchs, et al. LTP promotes formation of multiple spine synapses between a
single axon terminal and a dendrite. Nature, v.402, n.6760, Nov 25, p.421-5. 1999.
Toth, A., J. Boczan, et al. Expression and distribution of vanilloid receptor 1 (TRPV1) in the
adult rat brain. Brain Res Mol Brain Res, v.135, n.1-2, Apr 27, p.162-8. 2005.
Varvel, S. A., E. A. Anum, et al. Disruption of CB(1) receptor signaling impairs extinction of
spatial memory in mice. Psychopharmacology (Berl), v.179, n.4, Jun, p.863-72. 2005.
Varvel, S. A., R. J. Hamm, et al. Differential effects of delta 9-THC on spatial reference and
working memory in mice. Psychopharmacology (Berl), v.157, n.2, Sep, p.142-50. 2001.
Varvel, S. A. e A. H. Lichtman. Evaluation of CB1 receptor knockout mice in the Morris
water maze. J Pharmacol Exp Ther, v.301, n.3, Jun, p.915-24. 2002.
Viveros, M. P., E. M. Marco, et al. Endocannabinoid system and stress and anxiety responses.
Pharmacol Biochem Behav
, v.81, n.2, Jun, p.331-42. 2005.
65
Vogel, Z., J. Barg, et al. Anandamide, a brain endogenous compound, interacts specifically
with cannabinoid receptors and inhibits adenylate cyclase. J Neurochem, v.61, n.1, Jul, p.352-
5. 1993.
Vyas, A. e S. Chattarji. Modulation of different states of anxiety-like behavior by chronic
stress. Behav Neurosci, v.118, n.6, Dec, p.1450-4. 2004.
Walker, J. M. e S. M. Huang. Cannabinoid analgesia. Pharmacol Ther, v.95, n.2, Aug, p.127-
35. 2002.
Watanabe, K., Y. Kayano, et al. Inhibition of anandamide amidase activity in mouse brain
microsomes by cannabinoids. Biol Pharm Bull, v.19, n.8, Aug, p.1109-11. 1996.
Yang, Y. L., P. K. Chao, et al. Systemic and intra-amygdala administration of glucocorticoid
agonist and antagonist modulate extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology,
v.31, n.5, May, p.912-24. 2006.
______. Glutamate NMDA receptors within the amygdala participate in the modulatory effect
of glucocorticoids on extinction of conditioned fear in rats. Neuropsychopharmacology, v.32,
n.5, May, p.1042-51. 2007.
Yaniv, D., A. Desmedt, et al. The amygdala and appraisal processes: stimulus and response
complexity as an organizing factor. Brain Res Brain Res Rev, v.44, n.2-3, Mar, p.179-86.
2004.
Zuardi, A. W., S. L. Morais, et al. Antipsychotic effect of cannabidiol. J Clin Psychiatry,
v.56, n.10, Oct, p.485-6. 1995.
Zuardi, A. W., I. Shirakawa, et al. Action of cannabidiol on the anxiety and other effects
produced by delta 9-THC in normal subjects. Psychopharmacology (Berl), v.76, n.3, p.245-
50. 1982.
Zygmunt, P. M., J. Petersson, et al. Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the
vasodilator action of anandamide. Nature, v.400, n.6743, Jul 29, p.452-7. 1999.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
