( PDF ) Expressão de Cyanovirin-N, um Microbicida Anti-HIV, em plantas

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Universidade de Brasília

Departamento de Biologia Celular

Pós Graduação em Biologia Molecular

Expressão de Cyanovirin-N, um Microbicida Anti-

HIV, em plantas

Dissertação de mestrado apresentada à

banca examinadora do Programa de

Pós-Graduação em Biologia Molecular

da Universidade de Brasília (UnB).

Luisa de Moraes Madeira

Orientador: Elíbio Leopoldo Rech Filho, PhD

Co-orientador: Cristiano Lacorte, PhD

Brasília

2008

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Dedicatória

Dedico este trabalho às mulheres e crianças da África Subsaariana, que são as

principais vítimas da epidemia da AIDS no mundo. Que ele venha a ter algum

significado para essas vidas no futuro.

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Agradecimentos

Agradeço aos meus pais, Maria Ormy e Eduardo, por serem os responsáveis pela minha

educação, por todo amor e carinho, pelo companheirismo e amizade. Por serem a minha base

nas horas mais difíceis e por sorrirem comigo nos momentos felizes, pela admiração e apoio e

pelo crédito que sempre tiveram em mim. Amo muito vocês.

Ao meu irmão, Felipe, pela amizade e apoio.

A toda minha família, de Vitória e de Porto Alegre, pela amizade, pela força e por estarem

sempre torcendo por mim.

Ao meu orientador, Dr. Elíbio Rech, pela oportunidade de trabalhar em um grupo de tamanha

importância e por ter me presenteado com o projeto desta dissertação. Pelos ensinamentos,

pelos conselhos, pelo apoio e incentivo, por acreditar em mim e pelo entusiasmo.

Ao meu co-orientador, Dr. Cristiano Lacorte, por todo o acompanhamento e direcionamento,

pelas discussões, pelas idéias, pelas conversas, pela amizade, pelo estímulo e por me ajudar

com a dissertação lá do Laos, quando devia estar passeando.

Ao Dr. Francisco Aragão, por ter sido meu primeiro orientador e por ter me recebido no

mundo da biologia molecular. Por participar da minha banca de qualificação e por todos os

ensinamentos, conselhos sempre disponíveis, idéias e discussões sobre resultados.

Ao Dr. Julian Ma, do St. George´s University of London, pela cooperação, por ter me

recebido em seu laboratório e me ensinado técnicas valiosas para realização deste trabalho.

Ao Dr. Giovanni Vianna por toda a disponibilidade de ajuda com experimentos, pelas dicas,

pelos planejamentos do projeto e pela amizade.

Ao Dr. Bergmann Morais Ribeiro, por participar da minha banca de qualificação e contribuir

com comentários valiosos.

Aos técnicos de laboratório Luís, pelos experimentos de biobalística, Warley, pelo cuidado

com as plantas, e Elsa, pela amizade e pela organização, que tornaram o laboratório um lugar

melhor de se trabalhar.

A todos os amigos do Laboratório de Transferência de Genes, em especial a Paula, a Natália,

o Nicolau e o Gustavo, pela amizade e pelos momentos de alegria no laboratório, pela ajuda

com experimentos e pelas dicas. E também Emanuel, Sharon, Maria Laine, Kenny, Andréa,

Bárbara, Aisy, Érica, Thaís, Sérgio, Fábio, Welcimar, Hugo, Angélica, Lívia, Daniela,

Agradecimentos

iii

Gabriela, Aline, Nayche, Cristina, Renata, Raquel e André, por fazerem do laboratório um

lugar tão agradável.

Às minhas amigas da Biologia, Larissa, Betúlia e Nadinni, por toda a amizade ao longo

desses anos, pela força e estímulo nos momentos difíceis e pelas alegrias dos momentos de

diversão.

Aos Drs. Marcelo de Macedo Brígido e Luciano Paulino da Silva e à Dra. Andrea Queiroz

Maranhão por aceitarem o convite para participação na minha banca examinadora.

À Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia por prover o local e materiais para realização

deste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília pela

oportunidade de fazer o mestrado.

Ao CNPq pela bolsa de estudos.

Resumo

O Vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um vírus envelopado e as proteínas do

seu envelope, em especial a gp120, controlam os eventos necessários para a sua entrada em

células suscetíveis. A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é a manifestação

clínica da infecção por HIV. Apesar dos esforços globais de combate à AIDS, o número de

portadores de HIV no mundo continua crescendo. O contato heterossexual é a principal forma

de transmissão e tem acarretado no aumento alarmante do número de mulheres infectadas. Os

microbicidas são medicações antimicrobianas capazes de prevenir a transmissão do HIV

quando aplicadas na vagina ou reto antes da relação sexual, e surgiram como uma ferramenta

adicional de combate à AIDS direcionada às mulheres. Cyanovirin-N (CV-N) é uma proteína

candidata à microbicida capaz de inativar várias linhagens do HIV se ligando

irreversivelmente à gp120 viral. A produção de CV-N, assim como de qualquer microbicida,

para ser economicamente viável e suprir a demanda mundial deve ser alcançada em níveis

muito altos. Dessa forma, plantas geneticamente modificadas oferecem um sistema adequado

para a produção de CV-N. Neste trabalho, plantas de soja transgênicas para a expressão de

CV-N sob o controle do promotor da β-conglicinina α` foram produzidas e a análise das

sementes R

mostrou que CV-N está acumulando a 6% do total de proteínas solúveis da

semente, um nível significativamente alto quando comparado a outros trabalhos semelhantes.

Adicionalmente, foi testado o sistema de expressão transiente de CV-N e CV-N mutada

(Asn30Gln/Pro51Gly) em folhas de Nicotiana benthamiana, com três diferentes tipos de

endereçamento celular. Os resultados demonstraram que todas as construções produziram

CV-N capaz de se ligar à gp120, com níveis de expressão de aproximadamente 0,1%, sendo

assim bastante inferiores aos observados em soja. Este trabalho é um exemplo das vantagens

de produção de proteínas recombinantes em sementes quando comparada a folhas.

Abstract

The Human immunodeficiency virus (HIV) is covered by an envelope from which

proteins, specially the gp120, control its entering into susceptible cells. The HIV infection

results in the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), and in spite of the global

efforts against its pandemic, the number of people with HIV increases every year.

Heterosexual intercourse is currently the main way of transmission, which implicates on the

growing number of infected women. Topical microbicides are products that can be applied to

the vagina or rectum prior to intercourse to prevent the sexual transmission of HIV, and

emerged as an additional tool directed for women to prevent AIDS. Cyanovirin-N (CV-N) is

a microbicide candidate that can inactivate a wide range of HIV strains by binding

irreversibly to gp120. Production of CV-N, or any microbicide, needs to be at extremely high

levels to supply the demand, and genetically modified plants offer a suitable system.

Transgenic soybean plants to express CV-N in seeds under the control of β-conglicinin

α`promoter were produced. Analyses of R

seeds showed that CV-N is expressed at 6% of

total soluble seed protein, which is considerable high when compared to other similar

publications. Additionally, transient expression of CV-N and mutated CV-N

(Asn30Gln/Pro51Gly) in Nicotiana benthamiana leaves was tested with three different

sorting signals. All tested constructions produced CV-N capable of binding to gp120,

although the expression levels were about 0,1%. This work illustrates the advantage of

producing recombinant proteins in seeds rather than in leaves.

Lista de Figuras

Figura 1. Representação esquemática do vírus HIV.

Figura 2. Ilustração esquemática dos passos para entrada do HIV na célula CD4

. A gp120

se liga primeiro ao CD4 e depois ao co-receptor quimiocina, o que permite então que a gp41

promova a fusão do envelope viral à membrana celular.

Figura 3. Processo de transformação de plantas por Agrobacterium. As proteínas de

virulência VIR processam o T-DNA do plasmídeo Ti, produzindo uma fita-T. Após a ligação

da bactéria à célula da planta, a fita-T e diversas proteínas VIR são transferidas para a planta

atravé s de um cana l de tra nsporte . Dentro da cé lula, as proteínas VIR se associam à fita-T

formando o complexo-T, o qual vai para o núcleo e promove a integração do T-DNA ao

genoma da planta.

Figura 4. Representação esquemática do cassete de expressão utilizado para transformação

de soja.

Figura 5. Representação esquemática da seqüência sintetizada, CVNPSV.

Figura 6. Representação esquemática das clonagens realizadas na construção dos vetores

para agroinfiltração. A seqüência CVNPSV foi clonada no vetor pCam35SNos digerido com

as enzimas NcoI e SacI, resultando no vetor pCamCVNPSV (a), o qual foi então digerido

com as enzimas SalI e SacI (b), para que as outras seqüências amplificadas por PCR

pudessem ser clonadas para obtenção dos vetores finais (c). Para simplificação, as seqüências

mutadas não estão representadas em c, mas também foram utilizadas.

Figura 7. Representação esquemática da recombinação utilizada para a construção do vetor

para expressão em E. coli, pDESTCVNm.

Figura 8. A. Membrana revelada com NBT/BCIP do Western blot dos extratos protéicos de

bactéria BL21 DE3 expressando CV-N e GFP. 1) marcador Kaleidoscope

(Bio-Rad); 2,3,4

e 5) extratos protéicos após 0, 2, 3 e 4 horas, respectivamente, de indução com IPTG; 8)

extrato protéico lisado após 2 horas de indução; 9) extrato protéico lisado após 4 horas de

indução; 10) extrato protéico contendo GFP. B. Gel utilizado no Western blot após a

transferência para a membrana de nitrocelulose, corado com Coomassie blue.

Figura 9. Resultado do PCR das plantas de soja bombardeadas. 1) marcador 1kb ladder; 2)

branco; 3) controle negativo; 4) controle positivo; 5 a 20) amostras de folhas.

Figura 10. Resultado do PCR das sementes βCongICVN R

a) Primeiro PCR realizado com

10 sementes de cada planta-mãe. b) Segundo PCR realizado em mais algumas sementes de 5

plantas-mãe. Cada planta-mãe está indicada por chaves e os números das sementes estão

indicados nas figuras. B: amostra em branco; C+: controle positivo (resultado da

amplificação do plasmídeo pET30bCVN).

Figura 11. Ligação dos extratos protéicos de sementes transgênicas à gp120 medida por

ELISA. Como controle positivo foi utilizada CV-N recombinante purificada de E. coli, na

concentração inicial de 125 ng/ml.

Lista de Figuras

vii

Figura 12. Ligação dos extratos protéicos de sementes da planta 10 à gp120 medida por

ELISA (sobrenadante e pellet dos extratos protéicos).

Figura 13. Ligação dos extratos protéicos de sementes da planta 10 à gp120 medida por

ELISA (sobrenadante e pellet dos extratos protéicos).

Figura 14. Ligação do extrato protéico da semente 10/17 à gp120 medida por ELISA. Os

resultados estão representados em gráfico de dispersão (esquerda), e de colunas (direita).

Figura 15. Western blot dos extratos totais de sementes βCongICVN. 1) CV-N purificada

produzida em E. coli; 2) Semente não transformada; 3) Semente 10/11; 4) Semente 10/13, 5)

Semente 10/17, 6) Semente 10/22 e 7) Semente 10/25.

Figura 16. Ligação dos extratos de folhas de N. benthamiana agroinfiltradas à gp120 medida

por ELISA.

Figura 17. Ligação dos extratos de folhas de N. benthamiana agroinfiltradas à gp120 medida

por ELISA. A concentração inicial dos extratos é de 0,2 µg/µl, e do controle positivo, de 125

ng/ml.

Figura 18. Western blot dos extratos totais de folhas agroinfiltradas de N. benthamiana. 1)

CV-N purificada produzida em E. coli.; 2) Extrato de folha não-infiltrada; 3) Extrato de folha

infiltrada com a construção pCamCVN; 4) Extrato de folha infiltrada com a construção

pCamCVNm; 5) Extrato de folha infiltrada com a construção pCamCVNKdel; 6) Extrato de

folha infiltrada com a construção pCamCVNmKdel; 7) Extrato de folha infiltrada com a

construção pCamCVNPSV; 8) Extrato de folha infiltrada com a construção

pCamCVNmPSV.

Lista de Tabelas

viii

Lista de tabelas

Tabela 1. Análise de segregação de 8 plantas transgênicas da geração R

Tabela 2. Percentagem de CV-N nos extratos de proteínas totais de folhas agroinfiltradas

com Agrobacterium contendo as construções especificadas.

Índice Geral

Agradecimentos ......................................................................................................................... ii

Resumo ..................................................................................................................................... iv

Abstract ...................................................................................................................................... v

Lista de Figuras ......................................................................................................................... vi

Lista de tabelas ....................................................................................................................... viii

1. Introdução .......................................................................................................................... 1

1.1. O vírus HIV e a epidemia da AIDS ............................................................................. 1

1.2. Cyanovirin-N como um microbicida ........................................................................... 4

1.3. Plantas como biorreatores ........................................................................................... 8

1.3.1. Espécies de plantas utilizadas .............................................................................. 8

1.3.2. Tipos de transformação ...................................................................................... 10

2. Justificativas ..................................................................................................................... 15

3. Objetivos .......................................................................................................................... 15

4. Materiais e Métodos ......................................................................................................... 16

4.1. Construção dos vetores de expressão ........................................................................ 16

4.1.1. Vetor para expressão em soja ............................................................................ 16

4.1.2. Vetores para expressão em N. benthamiana ...................................................... 16

4.1.3. Vetor para expressão em E. coli ........................................................................ 19

4.2. Expressão de CV-N em E. coli e Western blot ......................................................... 20

4.3. Transformação de soja .............................................................................................. 21

4.3.1. Bombardeamento dos explantes de soja ............................................................ 21

4.3.2. Análises por PCR das plantas regeneradas ........................................................ 22

4.3.3. Análise da progênie por PCR ............................................................................. 23

4.3.4. Análise da progênie por Western Blot ............................................................... 23

4.3.5. Análise da ligação dos extratos de sementes à gp120 por Enzyme Linked

Immuno Sorbent Assay (ELISA) ...................................................................................... 24

4.4. Transformação transiente de folhas de N. benthamiana ........................................... 24

4.4.1. Transformação de células de A. tumefasciens .................................................... 24

4.4.2. Preparação da suspensão bacteriana e agroinfiltração ....................................... 25

4.4.3. Detecção da expressão de GFP por microscopia de fluorescência .................... 25

4.4.4. Análise da ligação à gp120 de CV-N produzido em N. benthamiana por ELISA



4.4.5. Análise da expressão de CV-N em N. benthamiana por Western blot .............. 26

5. Resultados ........................................................................................................................ 27

5.1. Expressão de CV-N em E.coli ................................................................................... 27

5.2. Expressão de CV-N em soja ...................................................................................... 28

5.2.1. PCR das plantas de soja transformadas ............................................................. 28

5.2.2. PCR das sementes βCongICVN ........................................................................ 28

5.2.3. ELISA gp120 das sementes βCongICVN .......................................................... 30

5.2.4. Western blot das sementes βCongICVN ........................................................... 32

5.3. Expressão transiente de CV-N em folhas de N. benthamiana .................................. 33

5.3.1. ELISA gp120 das folhas agroinfiltradas ............................................................ 33

5.3.2. Western blot das folhas agroinfiltradas.............................................................. 34

6. Discussão ......................................................................................................................... 36

7. Conclusões e Perspectivas ............................................................................................... 4. 33

Introdução

1. Introdução

1.1. O vírus HIV e a epidemia da AIDS

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é um vírus envelopado e as proteínas do

seu envelope controlam os eventos necessários para a sua entrada em células suscetíveis,

sendo assim responsáveis pelo tropismo viral. O complexo de proteínas do envelope do HIV

é inicialmente produzido como o precursor gp160, o qual é extensivamente glicosilado e

proteoliticamente clivado em duas subunidades por uma convertase celular (The gender and

the development group, 2004; Chan e Kim, 1998). Da clivagem resultam uma subunidade de

superfície (gp120) e uma subunidade transmembrânica (gp41) (Chan e Kim, 1998). Um

trímero de gp120 então associa-se não-covalentemente a um trímero de gp41 na superfície do

vírion (figura 1), formando a estrutura responsável

para sua entrada na célula hospedeira (Poignard et

al., 2001). Para isso, a gp120 deve se ligar à

proteína de superfície CD4 das células-T CD4

macrófagos ou à proteína DC-SIGN das células

dendríticas (DCs) (Balzarini e Van Damme, 2007.

A ligação da gp120 ao CD4 faz com que ela sofra

alterações conformacionais que promovem sua

ligação a receptores quimiocina específicos (CCR5

nos macrófagos, e CXCR4 nas células T) (Chan e

Kim, 1998; Greene e Peterlin, 2002). Subseqüentemente, a gp41 altera-se

conformacionalmente provocando a fusão do envelope viral à membrana celular, o que

resulta na liberação do vírion no citoplasma (figura 2) (Chan e Kim, 1998).

Figura 1. Representação esquemática do vírus

HIV. Fonte: http://www.web-

books.com/eLibrary/Medicine/Infectious/AID

S_HIV.htm

Figura 2. Ilustração esquemática dos

passos para entrada do HIV na célula

CD4

. A gp120 se liga primeir o ao CD4 e

depois ao co-receptor quimiocina, o que

permite então que a gp41 promova a fusão

do envelope viral à membrana celular.

Fonte:

http://www.aidsreagent.org /program_info.

cfm.

Introdução

A ligação da gp120 ao DC-SIGN é de alta afinidade, no entanto, não provoca as

alterações conformacionais necessárias para a fusão do vírus com a célula dendrítica, mas faz

com que as partículas virais ligadas sejam internalizadas para um compartimento ácido, e

então apresentadas na superfície celular após a maturação e a migração das células

dendríticas para os nódulos linfáticos, onde elas encontram as células T (Kwon et al., 2002).

Dessa forma, as células dendríticas agem na dispersão da infecção viral das superfícies

mucosas para os órgãos linfáticos (Greene e Peterlin, 2002).

As células de Langerhans (LCs) são um subtipo de células dendríticas, que não

expressam DC-SIGN, mas Langerinas, às quais a gp120 do HIV também é capaz de se ligar

(de Witte et al., 2007). Estas células estão presentes na epiderme e na maioria das mucosas

epiteliais, como os tecidos ectocervicais, da vagina e do prepúcio, enquanto as células DC-

SIGN

residem na camada subepitelial (de Witte et al., 2007). Dessa forma, as LCs são as

primeiras células às quais o HIV se liga quando atinge a muc osa epitelial, e por algum tempo,

assumiu-se que elas mediavam o espalhamento do HIV pelo corpo após a transmissão sexual,

assim com as DCs, só que mais precocemente na infecção (Kawamura et al., 2005; Schwartz,

2007). No entanto, foi recentemente demonstrado que a captura do vírus pela Langerina

promove sua internalização para os grânulos de Birbeck das LCs e subseqüente degradação

(de Witte et al., 2007). Os autores concluíram então que, ao invés de mediar a infecção do

HIV, as LCs funcionam como uma barreira natural ao vírus.

As proteínas do envelope também podem promover a fusão de células infectadas com

células vizinhas não-infectadas, um fenômeno de nominado formação de sincício, o que pode

ser observado em cultura de células (Chan e Kim, 1998) e é um dos primeiros sinais da

infecção por HIV in vitro.

Possíveis fontes de infecção de HIV por contato sexual são partículas virais livres e

células linfóides infectadas presentes no sêmen, nas secreções cervicovaginais, sangue ou

outros fluidos resultantes de trauma físico ou infecções genitais (Stone, 2002). Após a

exposição sexual ao HIV, o vírus pode entrar pelo epitélio estratifutr]]TJ-25.6tcecçelas

células da camada únutr do epitélio col unar cervical (Balzarini e Van Da mme, 2007)

atingindo a lâmina própria e estabelecendo a infecção.

Uma vez dentro da célula, o vírus dá inicio ao seu ciclo de replicação, podendo seguir

dois caminhos diferentes:cçermanecer latente com o seu genoma integrado ao genoma do

hospedeiro,tcecçrosseguir com a transcrição de seu genoma para a produção de novos vírions.

A segunda opção resulta na Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), pois destrói

Introdução

grande parte das células linfóides do hospedeiro deixando-o imunologicamente suscetível a

infecções oportunistas, que podem então levá-lo a morte.

Um esforço global tem sido aplicado para a diminuição da epidemia da AIDS,

incluindo o aumento do acesso a tratamentos efetivos e programas de prevenção. No entanto,

o número de portadores de HIV continua a crescer, assim como o número de óbitos em razão

da AIDS. Em 2006, um total de 39,5 milhões de pessoas eram portadoras do vírus da AIDS,

um número 2,6 milhões maior que em 2004 (UNAIDS/WHO, 2006). Já em 2007, foram

registradas 33,2 milhões de pessoas infectadas pelo HIV, um número 16% menor que em

2006 (UNAIDS/WHO, 2007). Entretanto as diferenças entre as estimativas publicadas em

2006 e 2007 resultam muito mais dos refinamentos da metodologia aplicada para a

estimação, do que da diminuição da pandemia (UNAIDS/WHO, 2007). Todos os dias mais

de 6800 pessoas são infectadas pelo HIV no mundo e mais de 5700 morrem de AIDS,

principalmente devido ao acesso inadequado à prevenção da doença e aos tratamentos

disponíveis (UNAIDS/WHO, 2007).

É na África Subsaariana que está o epicentro da pandemia, com a AIDS sendo a

principal causa de morte. Mais de dois terços dos adultos (68%) e quase 90% das crianças

infectados com HIV estão na África Subsaariana. O núme ro estimado de mortes causadas

pela AIDS no mundo em 2007 foi de 2,1 milhões, das quais 76% ocorreram nessa região

(UNAIDS/WHO, 2007).

A relação heterossexual continua a ser o principal modo de transmissão do vírus,

sendo responsável por 85% de todas as infecções por HIV no mundo (Simon et al., 2006).

Esse tipo de transmissão é particularmente preocupante devido ao número crescente de

mulheres com AIDS, o que tem implicações adicionais na transmissão mãe-filho, e

conseqüentemente, no número de crianças infectadas (Quinn e Overbaugh, 2005).

Em 2007 foram estimadas 15,4 milhões de mulheres vivendo com HIV no mundo, 1,6

milhões a mais do que em 2001 (UNAIDS/WHO, 2006). Em 2006, 49% dos infectados eram

mulheres, hoje são 50% (UNAIDS/WHO, 2006; UNAIDS/WHO, 2007). Esse fenômeno tem

sido denominado “feminização da pandemia do HIV” e reflete a vulnerabilidade biológica e

social da mulher ao vírus da AIDS (The gender and the development group, 2004). A

vulnerabilidade biológica está relacionada a alterações hormonais que têm efeito no

afinamento da mucosa vaginal devido ao estágio reprodutivo e/ou ao uso de contraceptivos

hormonais (Quinn e Overbaugh, 2005). A vulnerabilidade social envolve a submissão sexual

da mulher, o que ainda ocorre em várias regiões do mundo, principalmente na África

Introdução

Subsaariana, onde 61% dos adultos vivendo com HIV são mulheres (UNAIDS/WHO, 2007).

Nesta região, mulheres jovens na idade de 15 a 24 anos têm três vezes mais chances de

contrair o vírus do que homens da mesma idade (Quinn e Overbaugh, 2005).

Mesmo que o uso apropriado de preservativos represente uma alta taxa de proteção

(80-90%) contra a transmissão do HIV, muitas mulheres não estão em posição de persuadir

seus parceiros a usá-los. Nesse contexto, o desenvolvimento de tecnologias que coloquem a

prevenção da AIDS nas mãos das mulheres é crucial (Lancet Editorial, 2007).

1.2. Cyanovirin-N como um microbicida

Medicações vaginais contendo o espermicida surfactante nonoxynol-9 têm sido

usadas por mais de 50 anos para reduzir o risco de uma gravidez não-desejada (Stone, 2002).

A demonstração de que o nonoxynol-9, além de destruir o esperma, podia também destruir o

HIV, forneceu o estímulo inicial para a pesquisa dos microbicidas – medicações

antimicrobianas capazes de prevenir a transmissão do HIV e de outras doenças sexualmente

transmissíveis quando aplicadas na vagina ou reto antes da relação sexual (Stone, 2002). É

importante ressaltar que a maioria dos agentes microbicidas mais promissores não são

microbicidas no sentido literal, isto é, não matam microorganismos, ma s bloqueiam a

infecção.

O desenvolvimento de um microbicida efetivo contra o HIV é de especial interesse

devido ao aspecto pandêmico da doença e a dificuldade de se desenvolver uma vacina efetiva

contra o HIV, principalmente porque o vírus tem alta mutabilidade (Lancet Editorial, 2007).

No momento não existem vacinas em vista que sejam capazes de induzir imunidade

esterilizadora e de proteger contra a infecção (Lederman et al., 2006). Maiores expectativas

se baseiam em vacinas capazes apenas de atenuar a replicação do vírus em pessoas

“imunizadas” (Lederman et al., 2006). De acordo com Lederman e colegas (2006), um

microbicida bem-sucedido diminuiria o aume nto da epidemia, principalmente entre as

mulheres, enquanto uma vacina efetiva não é encontrada. Diferentemente do preservativo

sexual, os microbicidas não criarão uma barreira física ao contato íntimo, sendo mais aceitos

por homens e mulheres. Além disso, as mulheres poderão aplicá-lo anteriormente à relação

sexual, sem a necessidade do consentimento do parceiro.

Atualmente existem diversos candidatos a microbicidas que já foram testados ou em

modelos de explantes cervicais ou em modelos de desafio vaginal contra SHIV em macacos,

Introdução

ou já estão em fases de testes clínicos. Eles podem ser inespecíficos, moderadamente

específicos e altamente específicos.

Entre os inespecíficos estão os detergentes, que destroem a me mbrana do vírus

(Nonoxynol-9 - falhou nos testes clínicos; Savvy da Cellegy Pharmaceuticals, testes clínicos

descontinuados na fase III em 2006) e os diminuidores de pH, uma vez que o vírus é

inativado em pH menor que 4,5 (BufferGel, da ReProtect – fase III de testes clínicos)

(Balzarini e Van Damme, 2007; Lederman et al., 2006).

Os moderadamente específicos englobam uma variedade de polímeros aniônicos, que

se ligam ao envelope viral por meio das cargas negativas e bloqueiam a entrada do vírus nas

células hospedeiras (Balzarini e Van Damme, 2007). Entre eles estão o Ushercell (sulfato de

celulose), da CONRAD, que teve os testes de fase III descontinuados em 2007 após a

verificação de que a sua utilização aumentou discretamente a susceptibilidade das mulheres

ao HIV; o carrageenan (polissacarídeo ligado a galactose), utilizado na composição do gel

Carraguard, do Population Council, que falhou nos testes clínicos no início de 2008; e o

PRO-2000, polímero sintético de sulfonato de naftaleno, da Indevus Pharmaceuticals, que

continua em fase III de testes clínicos (Balzarini e Van Damme, 2007; Klasse et al., 2008;

Sanderson, 2008).

Os microbicidas altamente específicos podem ter como alvo qualquer um dos passos

que leve a incorporação do genoma viral nas células hospedeiras como um DNA pró-viral

(adsorção ou fusão, transcrição reversa e integração) (Balzarini e Van Damme, 2007). Entre

os inibidores da transcrição reversa, o Tenofovir, da CONRAD, composto de um nucleosídeo

terminador da transcrição reversa, encontra-se em fase II de testes clínicos (Klasse et al.,

2008). Os inibidores de fusão ou entrada especificamente impedem o vírus de entrar nas

células, eles são particularmente atrativos porque inibem a infecção no primeiro passo. Cada

estágio do processo de fusão pode ser bloqueado por compostos específicos que se ligam às

proteínas Env ou aos receptores celulares (Klasse et al., 2008). Os glicanos ricos em manose

das proteínas do envelope do HIV são alvo de várias lectinas com atividade anti-HIV, assim

como do anticorpo monoclonal humano 2G12, que neutraliza várias linhagens do vírus

(Klasse et al., 2008).

A mais conhecida entre essas lectinas é Cyanovirin-N (CV-N), que foi descoberta e

isolada a partir de um extrato da alga azul Nostoc ellipsosporum pertencente ao U.S. National

Cancer Institute´s Natural Products Repository, em um programa de prospecção de moléculas

com atividade anti-HIV (Boyd et al., 1997; Lederman et al., 2006). CV-N é uma proteína de

Introdução

11 kDa capaz de inativar irreversivelmente uma grande variedade de HIVs, além de prevenir

a fusão e a transmissão do vírus entre células infectadas e não-infectadas (Boyd et al., 1997).

Ela age se ligando com alta afinidade aos oligossacarídeos ricos em manose da glicoproteína

de envelope gp120, interferindo nas interações essenciais para a fusão e entrada do vírus nas

células suscetíveis (Shenoy et al., 2001).

Além de suas propriedades antivirais, CV-N apresenta alta estabilidade. Mesmo fora

de solução de tamponação, a proteína é capaz de resistir a ciclos de congelamento e

derretimento e a dissolução em solventes orgânicos, como CH

CN, MeOH e dimetil

sulfóxido (Shenoy et al., 2001). Nem o tratamento de CV-N com alta concentração de sal

(8M HCl guanidina), detergente (SDS 0,5%), solução de H

0,5% ou alta temperatura

(água fervente por 15 minutos) provoca perda significante de sua atividade (Boyd et al.,

1997). A baixa toxicidade da proteína também foi constatada por meio da incubação com

células controle não-infectadas (Boyd et al., 1997).

As propriedades físicas e antivirais de CV-N revelam uma proteína com grande

potencial para o desenvolvimento de um microbicida tópico para prevenir a transmissão do

HIV. Tsai et al. (2004; 2003) demonstraram a eficácia in vivo de CV-N formulado como um

gel e usado como um microbicida tópico vaginal ou retal, expondo macacas (Macaca

fascicularis) tratadas com o microbicida ao vírus quimérico SHIV89.6P (Simian

immunodeficiency virus com envelope de HIV). Adicionalmente, os mes mos autores

mostraram que CV-N bloqueia a infecção de HIV-1

Ba-L

em explantes ectocervicais humanos.

A dificuldade de se produzir uma vacina contra o vírus da AIDS resulta da alta

mutabilidade do mesmo, por ser um vírus de RNA. Dessa forma, a utilização de qualquer

medicamento contra o HIV, incluindo os microbicidas, pode resultar no surgimento de

variedades resistentes do vírus, e assim, na falha do medicamento.

Estudos da mutabilidade do vírus sob pressão seletiva de CV-N mostraram que o vírus

eliminou oligossacarídeos N-ligados da gp120 por meio de mutações nos sítios de

glicosilação, ficando assim resistentes a CV-N (Hu et al., 2007; Witvrouw et al., 2005). No

entanto os oligossacarídeos presentes na gp120, que representam 50% do total de sua massa,

têm sido vistos como barreiras que escondem os epítopos altamente imunogênicos da gp120,

e dessa forma são utilizados como estratégia de evasão do sistema imune do hospedeiro, uma

vez que os oligossacarídeos são pouco imunogênicos (Karlsson Hedestam et al., 2008;

Kwong et al., 2002; Kwong et al., 1998; Wyatt et al., 1998; Wyatt e Sodroski, 1998).

Portanto é de se esperar que a perda dos oligossacarídeos da gp120 resulte em uma maior

Introdução

vulnerabilidade do vírus à neutralização mediada por anticorpos do hospedeiro. E foi

exatamente isso que Hu e colaboradores (2007) observaram após a geração de linhagens de

HIV-1 resistentes a CV-N. Os autores demonstraram que o HIV mutante resistente a CV-N

ficou mais suscetível a imunoglobulinas e ao soro de pacientes de HIV. Esse fato soma mais

uma vantagem para a utilização de microbicidas que têm como alvo as glicoproteínas do

envelope viral.

A possibilidade de produção de CV-N recombinante com atividade biológica foi

inicialmente demonstrada por Boyd et al. (1997), com a expressão em Escherichia coli. Mais

tarde, vários sistemas de expressão em procariotos foram testados, incluindo a expressão em

E. coli (Colleluori et al., 2005; Mori et al., 2002; Mori et al., 1998), na superfície da bactéria

comensal Streptococcus gordonii (Giomarelli et al., 2002), assim como nas linhagens de

Lactobacillus colonizadoras da mucosa vaginal (Liu et al., 2006; Pusch et al., 2005). O

primeiro sistema eucariótico usado para a expressão de CV-N foi Pichia pastoris (Mori et al.,

2002). Por meio deste sistema de expressão, os autores verificaram que CV-N foi glicosilada

na posição Asn30, perdendo assim a capacidade de se ligar à gp120. Por esse motivo, foram

produzidos mutantes nos quais foram substituídas a Asn30 para remover o sítio de N-

glicosilação, assim como a Prolina na posição 51 para impedir a dimerização por mal-

dobramento mediado por prolina (Mori et al., 2002). Segundo Barrientos et al. (2004), a

substituição da Prolina51 estabiliza CV-N em sua for ma monomérica, mas a dimerização não

compromete a atividade antiviral da proteína.

De acordo com Shattock e Moore (2003), a quantidade de proteína necessária para a

produção de um gel microbicida em quantidades suficientes para suprir a demanda mundial é

muito além da capacidade de qualquer sistema de cultura celular atualmente disponível.

Apenas plantas geneticamente modificadas, cultivadas em uma área de no mínimo 5000

acres, poderiam suprir tais necessidades (Shattock e Moore, 2003). Nesse contexto, Sexton et

al. (2006), num trabalho pioneiro, produziram plantas transgênicas de fumo expressando o

mutante Asn30Gln/Pro51Gly de CV-N na concentração de 0,85% de proteína solúvel total.

Este e o único estudo da expressão de CV-N em plantas disponível na literatura.

Introdução

1.3. Plantas como biorreatores

As plantas sempre foram uma importante fonte de várias moléculas com propriedades

medicinais e nutritivas para o homem, mas apenas nas duas ultimas décadas se tornou

possível a sua utilização para a produção de proteínas recombinantes.

Tradicionalmente, a produção de proteínas recombinantes se baseia na utilização de

fermentadores microbianos ou de linhagens de células de mamíferos, mas esses sistemas

apresentam grandes desvantagens, como elevados custos, capacidade limitada e perigo de

contaminação por patógenos (Fischer et al., 2004). Por outro lado, as plantas apresentam

pequeno perigo de contaminação, custos reduzidos e grande capacidade de produção, mesmo

quando há a necessidade de confinamento em casas de vegetação (Ma et al., 2005). Estima-se

que proteínas recombinantes podem ser produzidas em plantas por 2 a 10% do custo da

fermentação microbiana e 0,1% do custo da cultura de células de mamíferos (Giddings et al.,

2000).

A primeira proteína recombinante de interesse farmacêutico a ser produzida em planta

transgênica, foi o hormônio do crescimento humano em tabaco, em 1986 (Barta et al., 1986).

Hoje, diversas proteínas produzidas em plantas já estão sendo comercializadas, como

anticorpos, fatores sangüíneos, citocinas, fatores de crescimento, hormônios, enzimas e

vacinas, o que demonstra a viabilidade desse sistema de expr essão e a capacidade de produzir

moléculas heterólogas corretamente montadas (Twyma n et al., 2005).

Um dos principais determinantes da viabilidade comercial de uma molécula produzida

em plantas é o alcance de adequadas taxas de produção, o que depende da espécie da planta,

da construção do cassete de expressão e do tipo de transformação aplicado (Twyman et al.,

2003).

1.3.1. Espécies de plantas utilizadas

O fumo (Nicotiana tabacum) tem uma longa história como sistema bem-sucedido de

expressão de moléculas recombinantes, e, por esse motivo, sempre foi um forte candidato

quando o objetivo é produção comercial (Fischer et al., 2004; Twyman et al., 2003). Esse fato

se deve à tecnologia bem estabelecida de transferência e expressão de genes, alta produção de

biomassa, potencial de aumento da massa devido à produção de sementes férteis e

Introdução

disponibilidade de infra-estrutura de processamento em larga escala (Ma et al., 2003;

Twyman et al., 2003).

Algumas desvantagens estão relacionadas com a alta concentração de alcalóides; no

entanto, existem cultivares com baixa produção de alcalóides que podem ser utilizadas para a

produção de proteínas de interesse farmacêutico (Twyman et al., 2003). Outra desvantagem é

a instabilidade do produto recombinante produzido em folhas, que apresenta um ambiente

celular com alta concentração de água. Isso significa que o tecido deve ser congelado ou

liofilizado para o transporte (Fischer et al., 2004; Ma et al., 2003; Twyman et al., 2003). Em

contraste, a expressão de proteínas recombinantes em sementes como a soja (Glycine max),

feijão (Phaseolus vulgaris) e milho (Zea mayz), permite o armazenamento a longo prazo, pois

apresentam o ambiente bioquímico apropriado para o acúmulo estável de proteínas (Ma et al.,

2003). Tem sido demonstrado que anticorpos produzidos em sementes permanecem estáveis

por pelo menos três anos à temperatura ambiente sem perda de atividade detectável (Stoger et

al., 2000).

Diferentes tipos de culturas têm sido investigados para a produção de proteínas em

sementes, como cereais (arroz, trigo e milho) e legumes (ervilha e soja) (Hood et al., 2002;

Ma et al., 2003; Stoger et al., 2002). Sementes de arroz (Oryza sativa) já foram demonstradas

como o melhor sistema de expressão para um anticorpo de cadeia única quando comparados

com fumo, trigo ( Triticum aestivum) e ervilha (Pisum sativum), apresentando as maiores

concentrações do recombinante por unidade de biomassa, muito embora o fumo tenha

Introdução

de 1 a 2% (Moravec et al., 2007). Apesar disso e do domínio das técnicas de transformação

de soja, demonstrado pela produção de diversas linhagens transgênicas resistentes a

herbicidas e pragas, essa cultura quase não tem sido explorada para a produção de

biofarmacêuticos. No entanto, em duas recentes publicações, a semente de soja foi utilizada

como um eficiente sistema de expressão para a produção destas moléculas. No primeiro, o

fator de crescimento do fibroblasto (bFGF), acumulou em 2,3% do total de proteína da

semente, utilizando-se o promotor e o peptídeo-sinal da glicinina (Ding et al., 2006). E, mais

recentemente, a semente de soja foi utilizada para a produção da toxina termo-lábil de

Escherichia coli enterotoxicogênica (LTB), acumulando em 2,4% do total de proteínas da

semente (Moravec et al., 2007). Para isso, também foi utilizado o promotor da glicinina, com

o peptídeo sinal da quitinase e a seqüência de retenção no retículo endoplasmástico C-

terminal, KDEL. Outros trabalhos também demonstram a viabilidade da soja para a produção

de proteínas recombinantes, como o anticorpo monoclonal contra a herpes genital (Zeitlin et

al., 1998) e a fitase de Aspergillus (Denbow et al., 1998).

A planta de soja apresenta diversas vantagens para a produção de moléculas de

interesse farmacêutico quando comparada a outras culturas, como a de milho. Primeiramente,

ela é uma planta autógama, e a freqüência de polinização cruzada não ultrapassa 1%, uma vez

que o seu grão de pólen alcança a distância de apenas 6,5 metros (Abud et al., 2003; Abud et

al., 2007). Isso implica no baixo risco de contaminação de culturas não-transgênicas por

pólen de culturas transgênicas. O milho, por sua vez, é uma planta alógama e como sua

polinização é feita pelo vento, o pólen atinge distâncias superiores a 500 metros (Iowa State

University, 1993). Outra vantagem da soja é a sua capacidade de simbiose com bactérias

fixadoras de nitrogênio, como Rhizobium e Bradyrhizobium, por meio de seu sistema

radicular (de Castro et al., 1993). Essa característica diminui os custos da cultura de soja uma

vez que quase não há necessidade de utilização de fertilizantes nitrogenados. Além disso, por

ser extremamente sensível ao fotoperíodo, o número de ramos e folhas, e, conseqüentemente,

o de vagens, pode ser bastante aumentado em casa de vegetação em condições de fotoperíodo

prolongado (Kantolic e Slafer, 2007).

1.3.2. Tipos de transformação

A maioria dos biofarmacêuticos recomb inantes derivados de plantas foram

produzidos por transformação nuclear e regeneração das linhagens transgênicas, seguidas de

Introdução

extração e purificação da proteína recombinante (Fischer et al., 2004). A transformação

nuclear acarreta na integração do gene heterólogo no genoma da planta e na transmissão do

mesmo para a progênie, o que caracteriza uma expressão estável (Lacorte, 2006; Sharma et

al., 2005). Esse tipo de expressão também pode ser alcançado por meio da transformação de

cloroplastos, que apresenta algumas vantagens quando comparada à transformação nuclear, e

tem demonstrado marcantes níveis de expressão em trabalhos recentes (Fernandez-San

Millan et al., 2003; Molina et al., 2004; Staub et al., 2000; Tregoning et al., 2003).

Os principais métodos utilizados para a transformação estável de plantas são a

transformação mediada por Agrobacterium, a qual utiliza o mecanismo natural de

transferência de genes para plantas de Agrobacterium tumefasciens, e o bombardeamento de

partículas, no qual microprojéteis cobertos de DNA são acelerados sobre o tecido vegetal

(Brasileiro e Carneiro, 1998; Rech et al., 2008).

A base molecular da transformação genética de plantas por Agrobacterium reside na

transferência para a planta de uma região de um plasmídeo indutor de tumor (Ti) (Gelvin,

2003). Essa região é denominada T-DNA e é definida por seqüências de borda, de 25 pb,

onde atuam endonucleases produzidas pela região vir do plasmídeo Ti (Gelvin, 2003; Yadav

et al., 1982). O processamento do T-DNA e a sua transferência da bactéria para o genoma da

célula da planta hospedeira resultam em grande parte da atividade dos produtos dos genes de

virulência (vir) contidos no plasmídeo Ti (Gelvin, 2003; Gelvin, 2005), os quais têm

expressão ótima sob pH ácido e na presença de indutores fenólicos, como acetoseringona,

que são liberados por ferimentos do tecido vegetal (Hansen e Wright, 1999). O T-DNA é

manipulado para conter os genes de seleção e os genes de interesse, e então o plasmídeo Ti é

inserido em A. tumefasciens e utilizado para transformação de plantas (Hansen e Wright,

1999). A figura 3 ilustra o processo de transferência do T-DNA da bactéria para o genoma da

célula vegetal.

Introdução

Os protocolos de transformação estável de plantas por Agrobacterium geralmente

envolvem a co-cultura da bactéria contendo o plasmídeo Ti recombinante com pedaços do

tecido vegetal in vitro (e.g. pedaços de folha estéreis, cotilédones, segmentos do caule,

culturas de suspensão de células e sementes germinando), e posterior regeneração do tecido

em meio de seleção (Hansen e Wright, 1999). A transformação por esse método depende da

integração do T-DNA ao genoma das células vegetais. As células transformadas são

selecionadas e se multiplicam, podendo se diferenciar e dar origem à planta transgênica. Na

maioria das células infectadas, as cópias de T-DNA não são integradas e permanecem no

núcleo por um curto período de tempo antes de serem degradadas pela maquinaria de defesa

do hospedeiro, podendo ser transcritas, o que leva à expressão transiente dos genes do T-

DNA (Kapila et al., 1997).

Baseado nesse fenômeno, foi desenvolvido um sistema de transformação transiente

denominado “Agrobacterium tumefasciens transient assay” (ATTA), no qual uma suspensão

de Agrobacterium contendo um vetor é infiltrada em folhas intactas de uma planta por meio

de uma seringa ou vácuo. Toda a parte aérea da planta pode ser infiltrada e o tecido pode ser

coletado para análise após 3-6 dias (Lacorte, 2006). Por meio desse método, um grande

número de células é transformado podendo expressar o gene de interesse, o que o faz viável

para a produção de proteínas recombinantes em pequena ou média escala. Além disso, devido

à vantagem de ser extremamente rápido comparado à produção de plantas transgênicas, esse

sistema é geralmente utilizado para a verificação da funcionalidade de cassetes de expressão

assim como para a validação funcional de proteínas recombinantes (Fischer et al., 2004;

Figura 3. Processo de transformação de

plantas por Agrobacterium. As proteínas de

virulência VIR processam o T-DNA do

plasmídeo Ti, produzindo uma fita-T. Após

a ligação da bactéria à célula da planta, a

fita-T e diversas proteínas VIR são

transferidas para a planta através de um

canal de transporte. Dentro da célula, as

proteínas VIR se associam à fita-T

formando o complexo-T, o qual vai para o

núcleo e promove a integração do T-DNA

ao genoma da planta. Fo nt e: Gel vi n , 20 0 5

Introdução

Lacorte, 2006). No entanto, o alto nível de expressão é alcançado apenas por um curto

período de tempo.

Em 2001 foi sugerido que o silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) poderia

ser um dos fatores responsáveis pela queda de expressão dos transgenes (Johansen e

Carrington, 2001), e mais tarde, o PTGS foi confirmado como o principal responsável pela

limitação da eficiência de ATTA (Voinnet et al., 2003). Em plantas, esse mecanismo opera

como um sistema imune adaptativo contra vírus (Ratcliff et al., 1999; Voinnet, 2001); e como

estratégia de contra-ataque, os vírus evoluíram para suprimir vários passos desse mecanismo

(Kasschau e Carrington, 1998; Voinnet, 2001; Voinnet, 2005; Voinnet et al., 1999).

Por meio da co-expressão de proteínas recombinantes com proteínas virais com

potencial atividade de supressão de silenciamento, Voinnet e colaboradores (2003)

observaram que a proteína p19 do Tomato bushy stunt virus foi o mais efetivo, aumentando

os níveis de expressão em mais de 50 vezes, seguido do HcPro, do Potato virus Y. Assim, a

utilização dessas proteínas representa uma importante ferramenta para o aumento da

eficiência do ATTA.

Outra tecnologia emergente de expressão transiente se baseia na utilização de vírus de

plantas como vetores de transformação (Fischer et al., 2004). Esse mecanismo é bastante

semelhante ao ATTA, com a diferença de que uma suspensão de Agrobacterium carregando

T-DNAs que codificam replicons virais contendo o gene heterólogo é usada para a infiltração

das folhas. A bactéria assume as funções da infecção primária das células vegetais e fornece

as condições para que o replicon viral seja traduzido para a geração de partículas virais, que

podem então se mover célula a célula espalhando-se sistemicamente, amplificando os níveis

de expressão da proteína de interesse (Gleba et al., 2005). Segundo Gleba e colaboradores

(2005), esse sistema pode ser utilizado para a produção de proteínas recombinantes em escala

industrial se for utilizado um aparato de infiltração a vácuo de alta eficiência que possa ser

aplicado em plantas inteiras.

O método de transformação mediada por Agrobacterium é utilizado mais comumente

para espécies dicotiledôneas, como tabaco, alfafa, ervilha, tomate e batata, embora possa

também ser utilizado para espécies monocotiledôneas para as quais a tecnologia foi otimizada

(Ma et al., 2003; Sharma et al., 2005). A transformação por bombardeamento de partículas é

menos dependente do genótipo, e, portanto, é o método mais comum para a transformação de

cereais como arroz, trigo e milho, bem como soja e outras leguminosas (Aragão et al., 2000;

Rech et al., 2008). Este é também o método utilizado para a transformação de plastídeos, uma

Introdução

vez que o T-DNA de Agrobacterium é direcionado exclusivamente ao núcleo, sendo assim

inadequado para a transferência de genes para o genoma do cloroplasto (Gelvin, 2003).

O processo de biobalística é baseado na aceleração de microprojéteis, de 0,2 a 4

micrômetros de diâmetro, recobertos por seqüências especificas de DNA, a u ma velocidade

final de 1500 km/h, promovida por gás hélio sob alta pressão, sobre os explantes ou células

em suspensão. Os microprojéteis ultrapassam a parede e a me mbrana celulares e penetram na

célula de maneira não-letal. Então se dissociam do DNA pela ação citosólica e são integrados

ao genoma vegetal por recombinação homóloga (Sanford et al., 1987). Assim, a

transformação genética da planta bombardeada ocorre em dois estágios: transferência do

DNA para dentro da célula e sua integração ao genoma. A integração é muito menos eficiente

do que a transferência do DNA, e conseqüentemente, apenas algumas células que recebem o

DNA são efetivamente transformadas (Altpeter et al., 2005). Dessa forma é necessária a

utilização de um gene de seleção para que apenas as células transformadas se regenerem em

uma nova planta.

No protocolo de transformação de soja descrito por Rech e colaboradores (2008), o

bombardeamento das micropartículas é direcionado para o meristema apical exposto de eixos

embrionários de sementes. Utiliza-se como gene de seleção o ahas, isolado de Arabidopsis

thaliana, o qual codifica para uma forma mutada da enzima ácido-aceto-hidróxi sintase, que é

essencial para os primeiros passos da síntese dos aminoácidos isoleucina, leucina e valina

(Sathasivan et al., 1991). Essa enzima, em sua forma nativa, é inibida pela ação do herbicida

Imazapyr

, levando o tecido vegetal à morte. Mas a enzima codificada pelo gene ahas é

tolerante a esta ação, o que faz com que as células transformadas permaneçam ilesas.

Neste trabalho foram aplicadas tanto a técnica de biobalistica para a transformação

estável de soja, como a ATTA para transformação transiente de folhas de Nicotiana

benthamiana.

Justificativas e Objetivos

2. Justificativas

Os índices crescentes da epidemia da AIDS, principalmente entre mulheres,

ocasionados em sua maioria pelo contato heterossexual, exigem que medidas urgentes sejam

tomadas para a prevenção da infecção por HIV. Os microbicidas representam uma ferramenta

adicional no combate a AIDS, com a vantagem de poderem ser utilizados pelas mulheres

como preventivos. No entanto, a demanda mundial por um creme microbicida exige um

volume de produção e custeio que somente podem ser alcançados com a utilização de um

sistema baseado na expressão heteróloga em plantas.

CV-N é uma proteína que tem se mostrado efetiva como um microbicida e sua

expressão em plantas é possível, como já foi demonstrado. Porém, espera-se alcançar maiores

taxas de expressão do que foi alcançado até o momento, para que sua produção seja capaz de

suprir a demanda a custos reduzidos.

Esse trabalho constitui parte de um acordo entre a Embrapa, a BioSyn e o NIH, US,

para a produção de microbicidas em plantas.

3. Objetivos

O objetivo deste trabalho é expressar a proteína CV-N recombinante em plantas por

meio de dois diferentes sistemas:

1. Produção de CV-N em sementes de soja (Glycine max

) transgênicas

Pretende-se expressar CV-N em sementes de soja, por meio da utilização do promotor

semente-específico do gene da β-conglicinina, subunidade α e do peptídeo sinal da

subunidade β, o qual direciona para os corpos protéicos.

2. Expressão transiente de CV-N em folhas de Nicotiana benthamiana

Pretende-se avaliar a expressão de CV-N mutante (Asn30Gln/Pro51Gly) e nativa sob

o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (35S CaMV) em construções

que direcionam para diferentes compartimentos sub-celulares (i.e. citoplasma, retículo

endoplasmático, vacúolo e apoplasto) através de ATTA, utilizando-se vetores binários e

vetores virais baseados no Potato virus X (PVX).

Materiais e Métodos

4. Materiais e Métodos

4.1. Construção dos vetores de expressão

4.1.1. Vetor para expressão em soja

O fragmento de 306 pb referente à região codificante de CV-N foi amplificado pela

Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) a partir dos primers SoyCVNHind

(5’AAAGCTTCTTGGTAAATTCTCCC3’), o qual adicionou um sítio de restrição HindIII à

extremidade 5’ da fragmento, e SoyCVNEco (5’AGAATTCTTATTCGTATTTCAGG3’), o

qual adicionou um sítio de EcoRI à extremidade 3’da fragmento. Foi usado como molde o

vetor pET30b-CVN (BioSyn). A seqüência resultante foi subseqüentemente clonada nos

sítios EcoRI e HindIII do vetor pβCongI, o qual é resultado da clonagem do promotor da

subunidade α da β-conglicinina de soja seguido do peptídeo sinal completo da subunidade β

da β-conglicinina de soja e do terminador 35S de CaMV nos sítios de restrição XhoI e

BamHI do vetor pUC 19. O vetor resultante foi denominado pβCongICVN (figura 4).

Cassete betaCong1CV N

1703 bp

CVN

Promotor Beta-Cong

T 35S

Bam

HI (1699

)

Eco

RI (1464)

Hin

dIII (1152)

Xho

I (2)

Figura 4. Representação esquemática do cassete de expressão utilizado para transformação de soja.

4.1.2. Vetores para expressão em N. benthamiana

A seqüência referente ao peptídeo sinal da cadeia leve Kappa do anticorpo de

camundongo CEA66-E3, seguida da seqüência codificante de CV-N e da seqüência PSV

[sinal C-terminal da faseolina de Phaseolus vulgaris capaz de direcionar proteínas para o

vacúolo de folhas sementes, em conjunto com um peptídeo sinal N-terminal (Frigerio et al.,

2001)] foram sintetizadas pela companhia DNA 2.0 (Califórnia, EUA) (figura 5).

Materiais e Métodos

CVNPSV

400 bp

CVN

Kappa

PSV

Nco

I (2)

Sac

I (400)

Figura 5. Representação esquemática da seqüência sintetizada, CVNPSV.

O primer Sal-CVN-5’(5’ggTGTCGACTCCCAGCTTGGTAAATTCT 3’) em

conjunto com os primers CVN-SacI-3’(5’ggGAGCTCTATTCGTATTTCAGGGTACC3’),

CVN-KDEL-SacI-3’(5’ggGAGCTCTAGAGTTCATCCTTTTCGTATTTCAGGGTACC3’)

e CVN-PSV-SacI-3’ (’ggGAGCTCTAATAAACAAAAGCTTCGTATTTCAGGGTACC 3’)

foram utilizados para a amplificação das seqüências de CV-N e CV-N mutada (CV-Nm)

seguidas, respectivamente, de um sítio de SacI, de uma seqüência de retenção no retículo

endoplasmático KDEL e um sítio de SacI, e de uma seqüência PSV e um sítio de SacI. Foram

usados como molde para o PCR, o vetor pET30b-CVN e o vetor pUCCVNm (sintetizado

pela Epoch Biolabs, Sugar Land, EUA), para CV-N e CV-Nm, respectivamente.

Posteriormente, os fragmentos obtidos foram clonados no vetor pGEM T-Easy® (Invitrogen)

e digeridos com SalI e SacI.

O cassete de expressão do vetor pBI426 (Datla et al., 1991) foi clonado nos sítios de

HindIII e EcoRI do vetor pCambia

1300, resultando no vetor pCam35STNos. Esse vetor foi

digerido com as enzimas de restrição NcoI e SacI, liberando as seqüências gus e nptII (figura

3). Então, a seqüência CVNPSV foi clonada nos sítios de NcoI e SacI do vetor

pCam35STNos digerido, gerando o vetor pCamCVNPSV. Esse vetor foi digerido com as

enzimas SalI e SacI, onde então foram clonadas todas as seqüências amplificadas conforme

descrito anteriormente, gerando assim os vetores finais pCamCVN e pCamCVNm (para

direcionar para o apoplasto), pCamCVNKdel e pCamCVNmKdel (para direcionamento para

o RE) e pCamCVNPSV e pCamCVNmPSV (para direcionamento para o vacúolo) (figura 6).

Para controle positivo da agroinfiltração foi utilizado o vetor pCambiaSGFP, o qual é

resultado da clonagem de um cassete de expressão de sGFP (Chiu et al., 1996) (promotor 35S

CaMV – seqüência codificante para GFP – tNOS) no pCambia

2300. Além disso, foi

utilizado o vetor pBINp19, o qual contém um cassete de expressão com o inibidor de

silenciamento p19 (Voinnet et al., 2003), para co-infiltração com os outros vetores, de forma

a evitar a inibição da expressão induzida por silenciamento gênico.

Materiais e Métodos

pCamCVNPSV

10252 bp

hygromycin (R)

LacZ alpha

kanamycin (R)

pBR322 bom

pVS1 sta

T-Border (right)

T-Border (left)

CVN

CaMV35S polyA

35Sd CaMV

CaMV35S promoter

pBR322 ori

pVS1 rep

NOS T

Kappa

EcoRI

NcoI

SacI

SalI

Figura 6. Representação esquemática das clonagens realizadas na construção dos vetores para agroinfiltração. A

seqüência CVNPSV foi clonada no vetor pCam35SNos digerido com as enzimas NcoI e SacI, resultando no

vetor pCamCVNPSV (a), o qual foi então digerido com as enzima s SalI e SacI (b), para que as outras

seqüências amplificadas por PCR pudessem ser clonadas para obtenção dos vetores finais (c). Para

simplificação, as seqüências mutadas não estão representadas em c, mas também foram utilizadas.

CVN

Kappa

PSV

Nco

I (2)

Sac

I (400)



CVN

323 bp

CVN

Sac

I (323

)

Sal

I (2)



CVNKdel

336 bp

CVN

KDEL

Sac

I (336

)

Sal

I (3)



CVNPSV

336 bp

CVN

PSV

Sac

I (336

)

Sal

I (3)



Materiais e Métodos

Foram construídos ainda vetores virais baseados no PVX (Lacorte, 2006), de forma a

obter maiores níveis de expressão transiente em folhas de N. benthamiana. Para isso, os

vetores pCamCVNm, pCamCVNmKdel e pCamCVNmPSV foram digeridos com NcoI e

SacI, e os fragmentos resultantes (Kappa-CVNm; Kappa-CVNm-Kdel; Kappa-CVNm-PSV)

foram clonados no vetor pDONCVNm digerido com NcoI e SacI. Os três vetores resultantes

foram então recombinados com o vetor PVX-GW [vetor PVX com sistema de recombinação

Gateway

(Lacorte, 2006)], para obtenção dos vetores finais PVXCVNm, PVXCVNmKdel

e PVXCVNmPSV.

O sistema Gateway®, da Invitrogen, se baseia nas propriedades de recombinação

sítio-específica do bacteriófago lambda, que leva à integração de seu DNA ao cromossomo

da E.coli. Nesse sistema são utilizadas as seqüências de recombinação att e as enzimas que

promovem a recombinação (i.e. mix de enzimas Clonase

). A recombinação do Lambda

ocorre entre seqüências específicas denominadas attachment (att): attB no cromossomo da E.

coli e attP no cromossomo lambda. As proteínas de recombinação se ligam às duas

seqüências, alinham-nas, trocam as fitas de DNA, clivam-nas e religam-nas, dando origem às

seqüências attL e attR. A recombinação também pode ocorrer entre as seqüências attL e attR

para dar origem a attB e attP. No entanto as enzimas envolvidas são diferentes.

4.1.3. Vetor para expressão em E. coli

Foi construído um vetor para expressão de CV-Nm e m E.coli para a produção de

anticorpos policlonais anti-CVN em coelho para serem utilizados em experime ntos de

Western blot e ELISA.

O vetor pUCCVNm artificialmente sintetizado, contém as seqüências attB1 e attB2

necessárias para a recombinação pelo sistema Gateway

com as seqüências attP1 e attP2 dos

vetores pDONR

(Invitrogen). Para a recombinação foi utilizado o pDONR

207 e o mix

de enzimas Clonase

PB (Invitrogen), e o vetor resultante foi denominado pDONCVNm

(figura 7). A recombinação das seqüências attB co m attP resulta nas seqüências attL, as quais

puderam então ser recombinadas com as seqüências attR do vetor de expressão em E. coli

pDEST

17, utilizando-se o mix de enzimas Clonase

LR (Invitrogen). O vetor resultante

foi denominado pDestCVN (figura 7).

Materiais e Métodos

pDONCVNm

3708 bp

Gm(R)

attL1

attL2

CVNm

pDONR™207 forward primer

pDONR™207 reverse prime

Pc promoter

rrnB T1 transcription terminator

rrnB T2 transcription terminator

pDESTCVNm

5037 bp

Amp(R)

ROP

6xHis

initiation ATG

attB1

attB2

CVNm

T7 primer

T7 reverse primer

bla promoterT7 promoter

RBS

pBR322 origin

T7 transcription terminator

Figura 7. Representação esquemática da recombinação utilizada para a construção do vetor para expressão em

E. coli, pDESTCVNm.

4.2. Expressão de CV-N em E. coli e Western blot

Células BL21 (DE3) pLys-S competentes foram transformadas com o plasmídeo

pDESTCVNm por choque térmico, conforme Chung et al. (1989). Uma colônia recombinante

foi inoculada em meio LB e cultivada à 37º C com agitação de 150 rpm até atingir a OD

600

aproximadamente 0.7, e então adicionou-se IPTG para a concentração final de 1 mM para

induzir a expressão de CV-N. A cultura permaneceu a 37º C e agitação de 150 rpm por 4

horas. Alíquotas de 1 ml foram retiradas após 0, 2, 3 e 4 horas da indução, centrifugadas por

1 minuto a 20000g, e o pellet resultante foi resuspendido em 100 µl de PBS (Tampão fosfato

de sódio 50 mM; NaCl 10 mM), dos quais 10 µl foram utilizados para eletroforese em SDS-

PAGE 12% e Western blot. Após duas horas, metade da cultura foi retirada e submetida à lise

para produção do extrato protéico da cultura bacteriana, conforme o protocolo The

pDEST17

6354 bp

Amp(R)

ccdB

Cm(R)

ROP

6xHis

initiation ATG

T7 primer

T7 reverse primer

bla promoter

T7 promoter

RBS

pBR322 origin

T7 transcription terminato

attR1

attR2



Recombina

ão



Materiais e Métodos

QIAexpressionist

, (QIAGEN, Alemanha), e após 4 horas o mesmo foi feito com o restante

da cultura. Os extratos protéicos resultantes (10 µl) foram submetidos à eletroforese em SDS-

PAGE 12%. Para controle positivo, também foram submetidos à eletroforese 10 µl de um

extrato protéico de bactéria expressando GFP com cauda de histidina (His-Tag).

Após a eletroforese em SDS-PAGE 12%, as proteínas do gel de poliacrilamida foram

transferidas eletricamente para uma me mbrana de nitrocelulose Hybond

ECL

por meio

de um Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) e a membrana

foi então bloqueada por 16 horas a 4º C em PBS contendo 0,1% de Tween 20 e 5% de leite

desnatado (PBST). Após a transferência, o gel foi corado em Coomassie blue [metanol 45%

(v/v); acido acetico 10% (v/v); azul-coomassie R250 0,25% (p/v)]. Após o bloqueio, a

membrana foi incubada por 2 horas em PBST contendo anticorpo policlonal anti-HisTag

diluído 5000 vezes e então lavada três vezes de 5 minutos com PBST. A membrana foi

incubada por mais duas horas em PBST contendo anticorpo anti-mouse conjugado à fosfatase

alcalina diluído 2500 vezes e lavada novamente por três vezes de 10 minutos. A revelação da

membrana foi feita em tampão fosfatase alcalina (200 μL de NaCl 5 M; 1 mL de Tris 3 M,

pH 9,5; 50 μL de MgCl2 1 M) acrescido dos substratos cromogênicos NBT, 50 mg/mL (Nitro

blue tetrazolium em dime til formamida 70%), e BCIP 25, mg/mL (5-bromo-4-cloro-3-

indolilfosfato em dimetil formamida 70%).

Após a confirmação da expressão de CV-N em E. coli foi feita outra eletroforese em

SDS-PAGE com extratos protéicos de bactéria. O gel de poliacrilamida foi corado em

Coomassie blue e a banda correspondente a CV-N foi cortada do gel, macerada em nitrogênio

líquido a ressuspendida em PBS. A solução resultante foi então misturada na proporção 3:1

com Adjuvante de Freund completo (Sigma, St. Louis) e injetada em coelho para a produção

de soro policlonal anti-CV-N.

4.3. Transformação de soja

4.3.1. Bombardeamento dos explantes de soja

Foram realizados cinco experimentos, em cada um dos quais, aproximadamente 144

sementes da cultivar brasileira de soja BR-16 foram esterilizadas conforme o protocolo

descrito por Aragão et al. (2000). Os eixos embrionários foram isolados das sementes e o

meristema apical foi exposto por meio da remoção das folhas primárias. Os eixos foram então

posicionados em placas de cultura de cinco centímetros de diâmetro contendo 12 mL de meio

Materiais e Métodos

BM (Aragão et al., 2000) com as regiões apicais direcionadas para cima. O bombardeamento

foi realizado com o vetor pβCongICVN, juntamente com o vetor pAC 321

(proporção 1:1),

que contém o gene ahas, conforme descrito em Rech et al. (2008).

Imediatamente após o bombardeamento, a multi-brotação dos explantes foi induzido

pela completa imersão em meio de indução [meio MS (Murashige e Skoog, 1962)

suplementado com 22,2 µM de benzylaminopurina, 3% de sacarose, 0,6% de ágar, pH 5,7]

em placas de 10 cm de diâmetro, nas quais foram incubados no escuro por 16 horas à 28

Depois, os mesmos foram transferidos para frascos (baby food jars) contendo 20 mL de meio

de seleção (meio MS, 3% de sacarose, 500 nM de imazapyr, 0,7% de ágar e pH 5,7) e

cultivados à 28º C com fotoperíodo de 16 horas com intensidade luminosa de 50 µmols m

-2

Os explantes que atingiram um alongamento de 4-5 cm após um período aproximado

de 3 semanas foram transferidos individualmente para copos plásticos contendo solo:

vermiculita (1:1) fertilizada e autoclavada. Os copos foram cobertos com saco plástico,

selados com uma liga de borracha e mantidos em casa de vegetação. As ligas de borracha

foram retiradas após uma semana, os sacos plásticos foram retirados após duas semanas.

Neste estágio, o DNA genômico das plantas foi extraído e submetido à análise de PCR para a

verificação da presença do transgene.

As plantas positivas segundo a análise de PCR, ao atingirem aproximadamente 10 cm

de altura, foram transferidas para vasos contendo 5 dm

de solo autoclavado para desenvolver

sementes.

4.3.2. Análises por PCR das plantas regeneradas

Para a análise de PCR das plantas transformadas, o DNA foi isolado de discos de

folhas de acordo com (Doyle e Doyle, 1987) com CTAB 2X. Cada reação de PCR foi feita

em alíquotas de 25µl contendo 2 mM de MgCl

, 160 µM de cada dNTP, 200 nM de cada

primer, 2 U de Taq polimerase (Invitrogen) e por volta de 20 ng de DNA genômi co. Como

controle negativo foi utilizado o DNA de uma planta não-transgênica, e como controle

positivo foi utilizado o plasmídeo pET30b. Os primers SoyCVNHind e SoyCVNEco foram

utilizados para amplificar a seqüência de 306 pb referente à região codificante de CV-N. O

PCR foi realizado em um termociclador MJ Research programado da seguinte forma: 2

minutos a 94º C para desnaturação, 34 ciclos de 94º C por 30 segundos, 60º C por 1 minuto

para anelamento dos primers e 68º C por 30 segundos para amplificação do fragmento, e um

Materiais e Métodos

ciclo final de 10 min a 68º C. As reações foram então submetidas a eletroforese em gel de

agarose 1% com brom eto de etídeo e visualizadas sob luz UV.

4.3.3. Análise da progênie por PCR

O DNA das sementes foi isolado de um pequeno pedaço de um dos cotilédones

conforme (Doyle e Doyle, 1987) com CTAB 2X. Aproximadamente 10 sementes de cada

planta-mãe foram analisadas. As reações de PCR foram realizadas conforme item anterior.

Análises de qui-quadrado (χ

) foram realizadas para determinar se a taxa de segregação

observada era consistente com a taxa Mendeliana na geração R

4.3.4. Análise da progênie por Western Blot

O extrato de proteínas totais de sementes transgênicas confirmadas por PCR foi

preparado da seguinte forma: um pedaço de um cotilédone da semente foi macerado em

nitrogênio líquido, pesado e dissolvido em tampão de extração [50 mM de NaH

20 mM

de NaCl, 2 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) e 10 mM de DTT (ditiotreitol)] na

proporção de 3 µl para cada mg, vortexado por alguns segundos para homogeinizar e

centrifugado a 13000 rpm à 4º C por 10 minutos; o sobrenadante foi transferido para um tubo

novo e o pellet foi ressuspendido na mesma quantidade de tampão de extração inicial. Os

extratos (sobrenadante e pellet) foram quantificados pelo método Bradford (Bradford, 1976) e

depois mantidos em freezer -80º C.

Dez microgramas de cada extrato, incluindo uma semente selvagem como controle

negativo, foram submetidos à eletroforese em gel SDS-PAGE 15%. Como controle positivo,

foram utilizados de 50 a 200 ng de CV-N purificada produzida em E. coli (NIH, EUA). A

transferência para membrana de nitrocelulose, o bloqueio e a hibridização com os anticorpos

foram feitas de acordo com o item 4.2. Como anticorpo primário, foi utilizado o anti-CVN

policlonal produzido em coelho (NIH, EUA) na concentração de 1:1000, e como anticorpo

secundário, goat anti-rabbit IgG-AP-conjugated (BioRad), na concentração de 1:2500. A

revelação dos blots foi feita com o substrato quimioluminescente CSPD® (Applied

Biosystems), conforme instruções do fabricante, em filmes fotográficos Kodak BioMax

RAR® (Kodak).

Materiais e Métodos

4.3.5. Análise da ligação dos extratos de sementes à gp120 por Enzyme

Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

A habilidade da CV-N produzida nas sementes de soja de se ligar à gp120 de HIV-1

foi testada por meio de uma ELISA convencional, conforme Boyd et al. (1997). Cem

nanogramas de gp120 recombinante (HIV-1

IIIB

; EVA607, MRC Centralised Facility for

AIDS Reagents, Potters Bar, UK) foram adicionadas a cada poço de uma placa de 96 poços

(Nunc Maxisorp Immuno

plates, Rochester, USA) e incubados à 37º C por 2 horas. Após

a lavagem com PBS adicionado de Tween 0,1% e bloqueio com PBS adicionado de BSA

2.5%, diluições seriadas de 2 vezes dos extratos de proteína de sementes foram adicionadas

ao longo da placa, e como controle positivo foi utilizada CV-N purificada produzida em E.

coli (NIH, EUA) na concentração inicial de 125 ng/mL. A CV-N ligada à gp120 foi

detectado com soro policlonal anti-CV-N diluído 1000 vezes. Como anticorpo secundário, foi

utilizado o goat anti-rabbit IgG-HRP-conjugated (Santa Cruz Biotechnology). O substrato

3’,5,5’-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado

e a absorbância lida a 450 nm.

4.4. Transformação transiente de folhas de N. benthamiana

4.4.1. Transformação de células de A. tumefasciens

Células competentes de A. tumefasciens, linhagem LBA4404, foram transformadas

por eletroporação com os plasmídeos pCamCVN, pCamCVNm, pCamCVNKdel,

pCamCVNmKdel, pCamCVNPSV, pCamCVNmPSV e pBINp19 conforme o Manual de

Transformação Genética de Plantas (Brasileiro e Carneiro, 1998). A linhagem de A.

tumefasciens PMP90 foi transformada com o vetor pCambiaSGFP e a linhagem PMP90

pSoup, com os vetores PVXCVNm, PVXCVNmKdel e PVXCVNmPSV sob as mesmas

condições. As células transformadas foram selecionadas em placas de Petri em meio LB

contendo antibióticos específicos. As colônias transformadas foram cultivadas em 3 mL de

meio LB por aproximadamente 16 horas à 28º C antes de serem utilizadas para a

agroinfiltração.

Materiais e Métodos

4.4.2. Preparação da suspensão bacteriana e agroinfiltração

As culturas bacterianas obtidas conforme item 4.4.1 foram centrifugadas por 1 minuto

a 5000 rpm para a separação das células do meio de cultura. Os pellets resultantes foram

então ressuspendidos em meio de infiltração [10 mM de MgSO

; 10 mM de ácido

morpholineethanesulfônico (MES), pH 5.6 e 150 µM de acetoseringona]. A suspensão

contendo o plasmídeo pBINp19 foi misturada na proporção de 1:2 a cada uma das suspensões

contendo os outros plasmídeos. As suspensões finais foram ajustadas para a OD

600

de 0,7.

Plantas de N. benthamiana com 4 semanas de idade (estágio de 4 folhas) foram

utilizadas. As folhas foram infiltradas no lado abaxial com as suspensões bacterianas por

meio de seringas de 2 mL sem agulha. Para cada construção foi infiltrada uma planta. As

plantas inoculadas foram mantidas em casa de vegetação por 3 dias até a análise de

expressão.

4.4.3. Detecção da expressão de GFP por microscopia de fluorescência

Com o objetivo de avaliar a eficiência do experimento de agroinfiltração, discos

foliares de aproximadamente 10 mm de diâmetro foram coletados das plantas infiltradas com

Agrobacterium contendo a construção pCambiaSGFP para análise da expressão de GFP no

microscópio de fluorescência. A fluorescência de GFP foi detectada por meio da excitação

com luz azul, com comprimento de onda de 488 nm, e emissão através de um filtro de

barreira de 505-530 nm.

4.4.4. Análise da ligação à gp120 de CV-N produzido em N. benthamiana

por ELISA

As folhas de N. benthamiana infiltradas foram maceradas em nitrogênio líquido,

pesadas e dissolvidas em tampão PBS na razão de 2 µl para 1 mg do macerado. A suspensão

foi centrifugada a 14000 rpm à 4º C por 10 minutos e o sobrenadante transferido para um

tubo novo. Os extratos foram quantificados pelo método de Bradford e então mantidos em

freezer -80º C até a realização das análises. Os extratos foram analisados por ELISA

conforme o item 4.3.5. As amostras não foram diluídas para aplicação no primeiro poço.

Materiais e Métodos

4.4.5. Análise da expressão de CV-N em N. benthamiana por Western

blot

O Western blot foi realizado conforme item 4.3.4. Extratos das folhas infiltradas com

Agrobacterium contendo as construções pCamCVN, pCamCVNm, pCamCVNKdel,

pCamCVNmKdel, pCamCVNPSV, pCamCVNmPSV e um controle negativo (folha não-

infiltrada) foram liofilizados e ressuspendidos em 15 µl de H

0 destilada e misturadas a 5 µl

de tampão de amostra 4X para aplicação no gel SDS-PAGE 15%. Para controle positivo

foram utilizados 150 ng de CV-N produzida em E. coli.

Resultados

5. Resultados

5.1. Expressão de CV-N em E.coli

A expressão de CV-N em E. coli foi detectada por Western blot, por meio de um

anticorpo anti-HisTag. Tanto o GFP, usado como controle positivo, como CV-N foram

detectados nos tamanhos esperados de ~25 kDa e 12 kDa, respectivamente. A expressão de

CV-N se mostrou mais acentuada após 4 horas da indução com IPTG. Ocorreu a formação de

dímeros de CV-N, evidenciados pela banda de aproximadamente 25 kDa (figura 8A).

O gel usado para a o Western blot foi corado com Coomassie blue após a

transferência, mostrando grande quantidade de proteína remanescente (figura 8B). As bandas

correspondentes à CV-N foram cortadas do gel e utilizadas para a produção de anticorpo em

coelho.

Figura 8. A. Membrana revelada com NBT/BCIP do Western blot dos extratos protéicos de bactéria BL21 DE3

expressando CV-N e GFP. 1) marcador Kaleidoscope

(Bio-Rad); 2,3,4 e 5) extratos protéicos após 0, 2, 3 e 4

horas, respectivamente, de indução com IPTG; 8) extrato protéico lisado após 2 horas de indução; 9) extrato

protéico lisado após 4 horas de

indução; 10) extrato protéico contendo GFP. B. Gel utilizado no Western blot

após a transferência para a membrana de nitrocelulose, corado com Coomassie blue.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CV-

GFP

7.6 kDa

18.4 kDa

32.5 kDa

Resultados

5.2. Expressão de CV-N em soja

5.2.1. PCR das plantas de soja transformadas

A presença do transgene cv-n nas plantas de soja regeneradas após o bombardeamento

com o vetor pβCongICVN foi detectada por PCR utilizando-se os primers SoyCVNHind e

SoyCVNEco. Do total de plantas analisadas, 8 plantas apresentaram o transgene (amostras 5,

7 a 10, 15, 18 e 20 - figura 9).

Figura 9. Resultado do PCR das plantas de soja bombardeadas. 1) marcador 1kb ladder; 2) branco; 3) controle

negativo; 4) controle positivo ; 5 a 20) amostras de folhas.

5.2.2. PCR das sementes βCongICVN

A progênie das 8 plantas transgênicas foi analisada para a presença do transgene cv-n

por PCR. Inicialmente, 10 sementes de cada planta-mãe foram analisadas (exceto planta 6,

das quais somente 6 sementes foram analisadas) . O resultado revelou que eram positivas três

sementes da planta 1, uma semente da planta 3, quatro sementes da planta 4, uma semente da

planta 5, uma semente da planta 6, duas sementes da planta 10 (figura 10a) e nenhuma

semente das plantas 12 e 14 (dados não mostrados). Como poucas sementes deram resultado

positivo, mais sementes da plantas 3, 5, 10, 12 e 14 foram analisadas, o que revelou então que

eram positivas uma semente em nove da planta 3, oito sementes em dez da planta 5, sete

sementes em sete da planta 10, duas sementes em onze da planta 12 e dez sementes em dez

da planta 14 (figura 10b). Considerando os resultados dos dois PCRs, foram feitas análises de

para verificar as probabilidades de estar ocorrendo segregação mendeliana na progênie

(tabela 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

100

1 kb

500

Resultados

Tabela 1. Análise de segregação de 8 plantas transgênicas da geração R

Linhagens R

Geração R

Positivas Negativas

2 8 14,8 0,01

2 17 40,5 0,00

6 4 0,9 27,33

9 11 8,9 0,19

1 5 9,5 0,10

9 8 3,9 3,57

2 17 40,5 0,00

8 10 8,2 0,28

Dados baseados na análise por PCR do gene cv-n

P é a probabilidade em porcentagem de a taxa observada refletir a segregação esperada

de 3:1

Figura 10. Resultado do PCR das sementes βCongICVN R

a) Primeiro PCR realizado com 10 sementes de

cada planta-mãe. b) Segundo PCR realizado em mais algumas se mentes de 5 plantas-mãe. Cada planta-mãe está

indicada por chaves e os números das sementes estão indicados nas figuras. B: amostra em branco; C+: controle

positivo (resultado da amplificação do plasmídeo pET30bCVN).

10 12

B C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

11 12 13 14 15 16 17 B C+ 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

11 12 13 14 15 16 17 18

Resultados

5.2.3. ELISA gp120 das sementes βCongICVN

A capacidade de CV-N produzida em sementes de soja de se ligar à gp120 viral foi

testada por ELISA.

O primeiro experimento foi feito com as doze sementes positivas analisadas no

primeiro PCR e teve caráter qualitativo (a concentração de proteína dos extratos não foi

determinada). Os extratos de cada semente (sobrenadante e pellet) foram diluídos 10 vezes

para aplicação no primeiro poço, a partir do qual foram feitas diluições seriadas de 2X ao

longo da placa. Apenas duas sementes apresentaram um sinal maior que o controle negativo

(10/4 e 10/7), sendo as duas da mesma planta-mãe (figura 11).

Figura 11. Ligação dos extratos protéicos de sementes transgênicas à gp120 medida por ELISA. Co mo controle

positivo foi utilizada CV-N reco mbinante purificada de E. coli, na concentração inicial de 125 ng/ml.

Tendo em vista que apenas sementes da planta 10 apresentaram sinal na ELISA, as

outras sete sementes PCR-positivas da planta 10 foram analisadas. Os extratos foram diluídos

5 vezes para a aplicação no primeiro poço. Quatro sementes (10/11, 10/12, 10/13 e 10/17)

apresentaram sinal maior ou igual ao controle positivo e não foi observado acúmulo

diferencial considerável entre os extratos do sobrenadante e do pellet (figura 12).

Figura 12. Ligação dos extratos protéicos de sementes da planta 10 à gp120 medida por ELISA (sobrenadante e

pellet dos extratos protéicos).



Resultados

As dez sementes PCR-positivas da planta 14 foram também analisadas, mas nenhuma

apresentou sinal maior que o controle negativo (dados não mostrados). Posteriormente, mais

16 sementes da planta 10 foram analisadas por ELISA sem que tivessem sido analisadas por

PCR antes. Os extratos foram diluídos 50 vezes para aplicação no primeiro poço. Seis

apresentaram sinal maior que o controle negativo, sendo duas com sinal elevado,

relativamente ao controle (10/22 e 10/25) (figura 13).

Figura 13. Ligação dos extratos protéicos de sementes da planta 10 à gp120 medida por ELISA (sobrenadante e

pellet dos extratos protéicos).

Por fim, foi feito um experimento quantitativo com a amostra da semente 10/17 para

estimar a percentagem de CV-N em relação à quantidade de proteínas solúveis totais da

semente. Para isto, o extrato do sobrenadante foi aplicado no primeiro poço na concentração

de 2 ng/µl. A partir da equação da reta do controle positivo, foi calculada a quantidade de

aproximadamente 0,12 ng/µl de CV-N no extrato, o que equivale a ~6% das proteínas

solúveis totais (figura 14).

Resultados

Figura 14. Ligação do extrato protéico da semente 10/17 à gp120 medida por ELISA. Os resultados estão

representados em gráfico de dispersão (esquerda), e de colunas (direita).

5.2.4. Western blot das sementes βCongICVN

A expressão de CV-N nas sementes de soja foi detectada por Western blot dos

extratos de proteínas totais por meio de um anticorpo policlonal anti-CVN produzido em

coelho. Foram analisadas as sementes que apresentaram o maior sinal no teste ELISA. Dez

microgramas de cada extrato, incluindo o controle negativo, foram aplicados no gel. Todas

apresentaram a banda de 11 kDa correspondente a CV-N, e bandas com maiores pesos

moleculares, provavelmente resultantes da oligomerização de CV-N, pois não foram

observadas no extrato da semente selvagem (figura 15). Como controle positivo foram

utilizados 100 ng de CV-N recombinante purificada de E. coli. A banda de aproximadamente

22 kDa observada no controle positivo, se refere ao dímero de CV-N.

Figura 15. Western blot dos extratos totais de sementes βCongICVN . 1) CV-N purif icada pro duzid a em E. coli;

2) Semente não transformada; 3) Semente 10/11; 4) Semente 10/13, 5) Semente 10/17, 6) Semente 10/22 e 7)

Semente 10/25.

1 2 3 4 5 6 7



75 kDa

Resultados

5.3. Expressão transiente de CV-N em folhas de N. benthamiana

5.3.1. ELISA gp120 das folhas agroinfiltradas

Inicialmente, foi feita uma ELISA com caráter qualitativo. Foram analisados extratos

de folhas agroinfiltradas com todas as construções do item 4.1.2, e estes não foram diluídos

para aplicação no primeiro poço. Como controle negativo foi utilizado um extrato de folhas

não-infiltradas e como controle positivo, CV-N recombinante purificada de E. coli na

concentração inicial de 125 ng/ml (figura 16).

Após a verificação de que todas as construções são capazes de produzir CV-N que se

liga à gp120, foi feito um experimento quantitativo com o objetivo de comparar as

construções e verificar se havia diferença de expressão e acúmulo de CV-N entre os vetores

binários testados e os vetores virais. Três dias após a infiltração das plantas, os extratos foram

preparados e quantificados pelo método de Bradford, e diluídos para a concentração de 0,2

µg/µl para análise por ELISA gp120. A partir da equação da reta das absorbâncias obtidas

para o controle positivo, e dos valores obtidos para os extratos (figura 17) foi estimada a

concentração de CV-N nos extratos (tabela 2).

Figura 16. Ligação dos extratos de folhas de N. benthamiana agroinfiltradas à gp120 medida por ELISA.

Resultados

Figura 17. Ligação dos extratos de folhas de N. benthamiana agroinfiltradas à gp120 medida por ELISA. A

concentração inicial dos ex tratos é de 0,2 µg/µl, e do controle positivo, de 125 ng/ml.

Tabela 2. Percentag em de CV-N nos extratos de proteínas totais d e folhas agroinfiltradas com as construções

especificadas.

Absorbância (450 nm) [CVN] ng/ml [CVN] ng/µl %CVN

CVN

0,278 20,3 0,0203 0,06

CVNm

0,405 33 0,033 0,09

CVNKdel

0,427 35,2 0,0352 0,10

CVNmKdel

0,397 32,2 0,0322 0,09

CVNPSV

0,398 32,3 0,0323 0,09

CVNmPSV

0,344 26,9 0,0269 0,08

PVXCVNmKdel

0,422 34,7 0,0347 0,10

5.3.2. Western blot das folhas agroinfiltradas

Após a verificação da expressão de CV-N em folhas pela ELISA gp120, foi feito um

western blot para confirmar o tamanho da proteína expressa e verificar o padrão das bandas.

Como o nível de expressão observado por meio da ELISA gp120 foi muito baixo, as amostras

foram concentradas por meio de liofilização. Cem microlitros de cada extrato, inclusive do

controle negativo, foram utilizados, de forma que aproximadamente 200 µg de proteína

pudessem ser aplicadas no gel. O resultado mostra que foi possível detectar CV-N do

tamanho esperado em todos os extratos (figura 18). É possível observar uma banda fraca no

controle negativo (folha não transformada), que provavelmente se refere à ligação

inespecífica do anticorpo com proteínas da folha, uma vez que na ELISA gp120 o controle

negativo não apresentou nenhuma diferença de sinal em relação ao branco (amostra sem

extrato). Ou ainda é possível que tenha vazado um pouco da amostra de proteína dos poços

adjacentes. As amostras aplicadas eram muito viscosas, devido à grande concentração de

Resultados

proteínas, dificultando em alguns casos a aplicação nos poços. A grande concentração de

proteínas também é a explicação provável para o padrão um pouco distorcido das bandas.

Figura 18. Western blot dos extratos totais de fo lhas agroinfiltradas de N. benthamiana. 1) CV-N purificada

produzida em E. coli.; 2) Extrato de folha não-infiltrada; 3) Extrato d e folha infiltrada com a con strução

pCamCVN; 4) Extrato de folha infiltrada com a construção pCamCVNm; 5) Extrato de folha infiltrada co m a

construção pCamCVNKdel; 6) Extrato de folha infiltr ada com a construção pCamCVNmKdel; 7) Extrato de

folha infiltrada com a construção pCamCVNPSV; 8) Extrato de folha infiltrad a com a construção

pCamCVNmPSV

1 2 3 4 5 6 7 8

75 kDa

Discussão

6. Discussão

A procura por sistemas de expressão de proteínas com alta eficiência e custos

reduzidos tem voltado a atenção de cientistas e de indústrias para o uso de plantas como uma

opção viável. A utilização de plantas como biorreatores vem sendo ilustrada por diversos

produtos recombinantes já em fase de testes clínicos (Gleba et al., 2005). Existem diversas

vantagens oferecidas pelas plantas para a produção de proteínas recombinantes como o

potencial para alta capacidade de produção a um custo reduzido e a ausência de patógenos

capazes de infectar o homem ou animais e que poderiam contaminar o produto final. Além

disso, as plantas são capazes de processamento pós-traducional, o que permite a produção de

proteínas glicosiladas (Horn et al., 2004).

Para a produção de CV-N, uma proteína candidata a microbicida cuja finalidade seria

compor um gel vaginal anti-HIV para prevenção da AIDS, uma enorme quantidade de

proteína seria necessária, a qual, segundo, Shattock e Moore (2003), só poderia ser produzida

em plantas transgênicas. Desta forma, a grande capacidade de produção a custos reduzidos

foi a característica pela qual foi escolhido esse sistema.

Levando em consideração as vantagens e desvantagens da produção de proteínas

recombinantes em folhas e em sementes, foi proposta neste trabalho a utilização de ambos os

sistemas para a produção de CV-N. Como em folhas o direcionamento da proteína pode ser

crucial para a estabilidade e conseqüente acúmulo da mesma, foram elaboradas três

estratégias: direcionamento para o RE, por ser um ambiente rico em chaperonas, porém pobre

em proteases (Bruyns et al., 1996; Fischer et al., 2004); para o apoplasto, do qual a

purificação é bastante simples se bons níveis de acúmulo são alcançados (Sexton et al.,

2006); e para o vacúolo, para verificar o comportamento de CV-N sob pH ácido. Já que o

objetivo era a comparação de diferentes construções, foi escolhido o sistema de expressão

transiente em folhas de N. benthamiana por agroinfiltração. Para transformação estável de

soja, foi utilizada uma única construção com o peptídeo sinal da β-conglicinina α’ para

direcionar para os corpos protéicos de sementes, local considerado ideal para o acúmulo de

proteínas.

O sistema de expressão de proteínas recombinantes em E. coli é relativamente rápido

e já foi utilizado para a produção de CV-N em diversos trabalhos (Colleluori et al., 2005;

Mori et al., 2002; Mori et al., 1998). Por esse motivo, ele foi escolhido para expressão de CV-

N para produção de soro policlonal anti-CV-N em coelho. A expressão foi bem-sucedida,

Discussão

como demonstrado nas figuras 5 e 6, mas o soro obtido após a imunização do coelho

apresentou baixa especificidade.

Para a expressão em sementes de soja, foi utilizado o gene cv-n em sua forma nativa,

isto é, sem mutação, fusionado ao peptídeo-sinal da β-conglicinina α’, sob o controle

transcricional do promotor semente-específico da β-conglicinina, com o objetivo de acumular

CV-N nos corpos protéicos da semente. A planta de soja foi escolhida por apresentar diversas

vantagens em relação a outros cereais, como o milho, por exemplo. De acordo com Abud et

al. (2003), a disseminação do pólen da soja não ultrapassa 6,5 metros, e portanto apresenta

baixo risco de polinização cruzada entre plantas transgênicas e não-transgênicas, diminuindo

assim as possibilidades de fluxo gênico, o que representa uma vantagem em termos de

biosegurança. Em contraste, o pólen do milho alcança distâncias superiores a 500 metros,

uma vez que a polinização é feita pelo vento (Iowa State University, 1993). Porém, por

questões de biosegurança, como opção inicial, a produção de plantas transgênicas

expressando proteínas de interesse farmacêutico ficará restrita a casas de vegetação. E nesse

ponto a soja apresenta mais uma vantagem em relação ao milho: ela se desenvolve muito bem

em casa de vegetação e a produção de sementes pode chegar a 1000 sementes por planta com

o aumento do fotoperíodo.

Após 5 experimentos de bombardeamento de embriões de soja (com 144

embriões/experimento), 8 plantas regeneradas foram confirmadas por PCR como sendo

transgênicas para o gene cv-n. Aproximadamente 20 sementes de cada planta foram testadas,

e após a análise das taxas observadas por teste de qui-quadrado constatou-se que nenhuma

planta apresentou probabilidade alta de estar segregando na taxa mendeliana, de 3:1. No

entanto, o padrão de integração do transgene e a possibilidade de as plantas transgênicas

serem quimeras, principalmente quando se utiliza métodos diretos de transformação, implica

que a análise da segregação pode ser bastante complexa (Aragão et al., 1996). Os dados

obtidos pela analise por PCR, portanto, não são suficientes para confirmação da taxa de

segregação. Uma análise mais detalhada deve levar em consideração a posição das vagens na

planta R

, ao invés de considerar uma amostragem de todas as sementes, devido à

possibilidade de as plantas serem quimeras. Também é importante que sejam feitas análises

de Southern blot do DNA genômico das plantas e das sementes para determinação do número

de cópias do transgene. A identificação de genótipos com baixo número de cópias e padrões

de herança mais simples é importante por questões de biosegurança, porque, de modo geral,

Discussão

apresentam níveis de expressão mais estáveis ao longo de sucessivas gerações (Sharma et al.,

2005).

As análises das sementes R

por Western blot e ELISA gp120 demonstraram a

expressão bem-sucedida, apenas em uma linhagem transgênica aparentemente, do total de

oito obtidas. Esse fato pode ser explicado pelo local de integração do transgene nos diferentes

eventos de transformação, além de silenciamento ocasionado por aberrações do transgene

integrado. De acordo com Kohli e colaboradores (2003), a posição de integração e a estrutura

do lócus do transgene podem variar consideravelmente entre transformantes independentes, e

cada um desses fatores pode ter um forte efeito no nível e na estabilidade da expressão do

transgene. Quando uma ou múltiplas copias são integradas em um lócus localizado dentro ou

próximo de uma área hipermetilada do genoma, por exemplo, o transgene pode sofrer

silenciamento transcricional (Vaucheret et al., 1998). Mehlo et al. (2000), investigando sete

linhagens de milho transgênico com múltiplas cópias, encontraram uma forma de rearranjo

do transgene em pelo menos uma cópia em todas as linhagens. Eles concluíram que pequenos

rearranjos não-detectáveis devem ser muito comuns e podem ser responsáveis pela perda da

expressão de transgenes aparentemente intactos. Além disso, RNAs aberrantes originados

desses transgenes recombinados poderiam contribuir para o silenciamento de transgenes

intactos (Mehlo et al., 2000).

Segundo Kohli et al. (2003), a utilização de plasmídeos inteiros no bombardeamento

resulta na inevitável integração do esqueleto do vetor junto com o transgene de interesse, o

que inclui seqüências procarióticas para resistência a antibióticos. Foi demonstrado que tais

seqüências fornecem sítios de recombinação que estimulam rearranjos do transgene (Kohli et

al., 1999). Conforme Fu et al. (2000), a utilização de “cassetes mínimos”, contendo apenas o

gene de interesse (promotor, região codificadora e terminador), resulta no aumento de loci

transgênicos estruturalmente intactos e em menor número de cópias, e, conseqüentemente,

em uma maior estabilidade da expressão.

Levando em consideração que foram utilizados dois plasmídeos inteiros para o

bombardeamento das plantas de soja, a baixa percentagem de transformantes expressando a

molécula de interesse poderia ser explicada pelos fenômenos acima descritos, e a utilização

de “cassetes mínimos” poderia solucionar esse problema. De qualquer forma, uma única

linhagem expressando CV-N pode ser considerada suficiente para a análise preliminar da

expressão de CV-N em soja, desde que o transgene seja transmitido para as próximas

Discussão

gerações. A grande variação no nível de expressão também indica que níveis ainda maiores

podem ser obtidos.

Sementes da linhagem 10 apresentaram acúmulo de CV-N, segundo as análises de

ELISA gp120 e Western blot, indicando que a construção utilizada foi eficiente para a

expressão semente-específica da proteína de interesse. Como foi utilizado o peptídeo sinal da

β-conglicinina, é provável que CV-N esteja acumulando nos corpos protéicos das sementes.

Ensaios imunocitoquímicos das sementes poderão confirmar a localização sub-celular de CV-

Os resultados dos testes ELISA gp120 da geração R

da linhagem 10 indicaram que

nem todas as sementes transgênicas apresentam o mesmo nível de expressão de CV-N. Um

alto número de cópias do transgene na planta 10 pode ser a causa desse fenômeno. Uma vez

que as cópias, se não inseridas no mesmo lócus, estariam segregando na progênie, o que

resultaria na expressão diferencial de CV-N nas sementes R

De acordo com as análises preliminares, o nível de expressão de algumas sementes R

é de ~6%, o que é bastante alto quando comparado a outros trabalhos recentes de expressão

de biofármacos em sementes de soja [e.g. 2,3% em Ding et al. (2006) e 2,4% em Moravec at

al. (2007)], e muito superiores aos níveis abaixo de 1%, considerados típicos para expressão

de proteínas em plantas (Hood et al., 2002). Interessantemente, como a quantificação foi feita

por meio da ELISA gp120, o resultado obtido fornece a percentagem de CV-N

biologicamente ativo (pois a atividade antiviral da proteína está diretamente relacionada com

a sua capacidade de se ligar à gp120), e não somente a percentagem de CV-N expresso na

semente. Esse resultado é em parte surpreendente, porque de acordo com Mori et al. (2002),

CV-N possui um sitio de N-glicosilação na Asn30, que quando glicosilada, perde a

capacidade de ligação à gp120, conforme demonstrado pela expressão em P. pastoris e pela

glicosilação in vitro. Como foi utilizado um peptídeo-sinal, que transporta a proteína para o

RE, local onde são adicionados os N-glicanos, era de se esperar que a CV-N expressa fosse

inativa. Entretanto isso não ocorreu, gerando assim duas hipóteses: i) de que o sítio de

glicosilação não é reconhecido pelas células da semente ou ii) a glicosilação de semente é

estruturalmente diferente de P. pastoris ao ponto de não inativar a proteína. A análise de

western corrobora a primeira hipótese, conforme discutido a seguir.

Com a análise dos extratos protéicos das sementes ELISA-positivas por Western blot,

foi confirmada a presença de CV-N no tamanho de ~11 kDa, que corresponde ao tamanho

correto para a proteína em sua forma monomérica e não-glicosilada. No entanto é também

Discussão

possível observar a presença de uma banda de aproximadamente 13 kDa, imediatamente

acima da banda correspondente ao monômero de CV-N (figura 13). O tamanho de ~13kDa

para a proteína N-glicosilada estaria de acordo com o observado por Mori e colegas (2002),

de que a massa da proteína aumenta em aproximadamente 3 kDa quando glicosilada. Outra

hipótese para a presença desta banda seria uma porção de CV-N ainda não processada pelo

RE, ou seja, com o peptídeo sinal não-clivado. Todavia o tamanho esperado seria de

aproximadamente 18 kDa (já que a previsão da massa molecular do peptídeo sinal é de 7

kDa), e portanto tal hipótese pode ser descartada. Dessa forma pretende-se verificar a

composição desta banda por meio de espectrometria de massa.

No Western blot, é possível ainda verificar a presença de bandas de tamanhos maiores

do que o esperado para o monômero ou mesmo para o dímero de CV-N (figura 13), o que

sugere que está ocorrendo a oligomerização da proteína ou a interação entre CV-N e alguma

proteína da semente, já que as mesmas não são detectadas no controle negativo e, portanto,

não se trata de interação não-específica entre o anticorpo anti-CVN e proteínas da semente.

Segundo Barrientos et al. (2004), a dimerização da proteína não compromete a sua atividade,

mas nada se sabe sobre a oligomerização da mesma. Como não há na literatura informação

sobre a oligomerização de CVN, é provável que as bandas maiores correspondam à interação

de uma proteína da semente com CV-N. Tal observação estaria de acordo com os achados de

Shenoy et al. (2001), de que CV-N se liga com alta afinidade tanto ao monômero quanto ao

tetrâmero da aglutinina de soja, por meio do oligossacarídeo Man-9 desta proteína. Análises

de espectrometria de massa poderão esclarecer melhor a composição dessas bandas. Com

relação à funcionalidade das mesmas, isto é, se elas têm ou não a capacidade de se ligar à

gp120, pode-se fazer um Western blot a partir de um gel não-desnaturante, utilizando gp120

para hibridização primária e um anti-gp120 conjugado a peroxidase ou fosfatase alcalina para

detecção.

A expressão transiente de CV-N em folhas de N. benthamiana teve como objetivo

principal a comparação entre três diferentes tipos de endereçamento celular (RE, apoplasto e

vacúolo), de forma a comparar o local de maior acúmulo da proteína. Além disso, a fim de

verificar se ocorre ou não a glicosilação de CV-N, e se esse fato interfere na ligação ao

gp120, foram utilizadas construções tanto com a forma nativa, quanto com a forma mutada,

Asn30Gln/Pro51Gly.

As análises de folhas agroinfiltradas por teste ELISA preliminares mostraram que

todas as construções estavam produzindo CV-N capaz de se ligar à gp120, isto é, não houve

Discussão

diferença significativa entre CV-N nativa e mutada, indicando que a primeira não estava

sendo glicosilada, ou que a glicosilação não era capaz de interferir na ligação da proteína

recombinante à gp120. Assim como os resultados obtidos com a semente, esse fato foi

surpreendente, pois era esperado que a forma nativa resultante das três construções (i.e. RE,

vacúolo e apoplasto) fosse glicosilada, já que nos três casos, CV-N passaria pelo RE.

Subseqüentemente foi feita uma ELISA gp120 para quantificar CV-N expressa em

folhas com cada uma das construções e verificar se havia diferença considerável entre elas. O

resultado mostrou que a expressão foi realmente baixa, entre 0,06 e 0,1% TSP (tabela 1) para

todas as construções. Devido a esse fato, não foi possível uma quantificação precisa, o que

prejudicou a comparação entre elas.

Com o objetivo de confirmar o tamanho de CV-N produzida em folhas, foi realizado

o Western blot dos extratos totais. Tendo em vista a quantificação de CV-N nas folhas por

ELISA gp120, decidiu-se liofilizar o extrato de forma a possibilitar a detecção de CV-N por

Western blot. Por isso, foram liofilizados 100 µl de cada extrato (aproximadamente 200 µg

de proteína total) para aplicação no gel. O resultado do Western revelou uma banda do

tamanho esperado para CV-N, de ~11 kDa, para todas as construções, e não foram detectadas

outras bandas que sugerissem a formação de dímeros ou oligômeros de CV-N, nem a

glicosilação da mesma. Entretanto esses fenômenos não podem ser descartados uma vez que

a expressão é baixa e tais moléculas poderiam estar presentes a níveis indetectáveis.

O silenciamento pós-transcricional poderia ser um dos motivos para a baixa expressão

observada. No entanto, como foi utilizado o supressor de silenciamento p19, era esperado que

tal efeito fosse bastante amenizado produzindo bons níveis de expressão. Além disso, como a

expressão de CV-N foi descrita em fumo alcançando o nível de 0,85% TSP (Sexton et al.,

2006), pretendia-se obter níveis maiores equivalentes a esse, principalmente utilizando-se o

PVX como replicon.

Uma possível explicação para esse resultado é a condição das plantas agroinfiltradas.

Devido, provavelmente, a uma mudança do substrato normalmente utilizado, as plantas

apresentaram algumas alterações, como clorose e desenvolvimento precoce das flores. Dessa

forma, é razoável afirmar que a expressão foi baixa devido ao estado fisiológico das plantas.

Plantas inoculadas com Agrobacterium contendo a construção com GFP também

apresentaram baixa fluorescência, da mesma forma que plantas agroinfiltradas com PVX,

também contendo o gene da GFP. Os resultados aqui descritos, portanto, são insuficientes

Discussão

para fazer uma comparação mais precisa entre as construções. Novos experimentos devem

ser realizados a fim de atingir os objetivos desse trabalho.

Apesar do nível de transcrição das diferentes construções não ter sido avaliado,

provavelmente a CV-N produzida em folhas é rapidamente degradada, não permitindo seu

acúmulo e inviabilizando este sistema como uma alternativa para a produção de CV-N. O uso

de proteínas de fusão que estabilizem CV-N nas células da folha pode ser uma alternativa

para o seu maio acúmulo (Lacorte et al., 2007).

Mesmo que a expressão em folhas de N. benthamiana tenha sido deficiente devido às

condições das plantas, já é possível fazer uma comparação preliminar entre a expressão em

folhas e em sementes. A expressão em semente chegou a 6% TSP, enquanto que o observado

para folhas foi de 0,1%, portanto, cerca de 60 vezes menor. Em Sexton et al. (2005), CV-N

foi expressa na taxa de 0,85% TSP em tabaco, que equivale a sete vezes menos que os

valores obtidos em sementes de soja. Essa diferença reflete, provavelmente, a maior

estabilidade do ambiente da semente quando comparado ao da folha. As células da folha são

abundantes em água, sendo favoráveis à ação de proteases, enquanto que, em sementes, as

proteínas ficam protegidas da degradação proteolítica (Fischer et al., 2004; Ma et al., 2003;

Twyman et al., 2003). Isso implica em que as folhas devem ser processadas imediatamente

após a colheita para a purificação da proteína recombinante, enquanto que as sementes podem

ser armazenadas por um longo período, desconectando assim os processos de expressão e

purificação (Gleba et al., 2005). De acordo com Larrick e Thomas (2001), sementes

transgênicas expressando enzimas ou anticorpos podem ser armazenadas por até três anos à

temperatura ambiente, e por pelo menos três anos sob refrigeração, sem que haja perda da

atividade enzimática ou capacidade de ligação das proteínas recombinantes. Essa propriedade

das sementes é ilustrada no trabalho de da Cunha (2008), onde foram detectadas proteínas

recombinantes estáveis em sementes de soja transgênicas armazenadas há seis anos.

Uma importante questão que ainda precisa ser respondida é sobre a purificação de

CV-N. Esta etapa é crucial para a conclusão sobre a viabilidade de sua produção em plantas a

baixos custos, que é o objetivo em longo prazo deste trabalho.

Conclusões

7. Conclusões e Perspectivas

O uso de plantas como biorreatores apresenta algumas vantagens em relação a

sistemas convencionais de produção de proteínas heterólogas. O custo reduzido e a

capacidade de aumento da produção são alguns destes fatores que fazem este sistema

particularmente atrativo. No entanto, algumas limitações ainda precisam ser contornadas

para que este sistema venha a ser viabilizado para a produção de qualquer proteína.

Este trabalho mostrou que a produção de CV-N funcional em sementes de soja é

possível. A expressão transiente em folhas de N. benthamiana demonstrou que esse sistema

ainda precisa ser aprimorado. Para que a viabilidade da produção de CV-N seja confirmada,

são necessários ensaios de inativação viral in vitro com a proteína recombinante. A etapa de

purificação também é de grande importância para essa confirmação. Para que os custos de

produção do microbicida em sementes sejam reduzidos, as etapas de purificação devem ser

simples, e há indícios de que isso ocorra com a extração de CV-N, uma vez que a proteína

apresenta grande estabilidade. Além disso, análises da segregação das cópias do transgene ao

longo das gerações também são de grande importância, uma vez que se pretende obter uma

linhagem homozigota para utilização comercial. Com a obtenção da linhagem homozigota, é

possível então a produção de grandes quantidades de sementes expressando CV-N, que pode

ser purificada e utilizada para testes clínicos. É importante ressaltar que CV-N ainda não foi

submetida a testes clínicos, e sua produção em sementes de soja pode viabilizar esse

processo, uma vez que as etapas de purificação estejam bem estabelecidas.

Desta forma, para que o uso de uma molécula como CV-N venha a ser viável, é

importante que sejam considerados, além dos aspectos técnicos abordados em parte neste

trabalho, os aspectos farmacológicos e testes clínicos. Este processo pode ser extremamente

caro e demorado. No caso especifico de CV-N, como a finalidade é que a proteína venha a

ser utilizada como constituinte de um gel de uso tópico, é provável que o processo de

liberação seja relativamente mais simples, se houver sucesso nos testes clínicos. Isso é

particularmente esperado devido à urgência de se fazer disponível um agente capaz de

contribuir para a contenção da epidemia de AIDS, principalmente na África.

Referências Bibliográficas

8. Referências Bibliográficas

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