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Estudos fotofísicos, fotoquímicos e fotobiológicos de porfirinas e ftalocianinas
derivadas de éter de coroa
Alessandra Caramori Pelegrino
RIBEIRÃO PRETO - SP
2007
Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo, como parte das
exigências para a obtenção do título de Doutor
em Ciências, Área: Química
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2
Estudos fotofísicos, fotoquímicos e fotobiológicos de porfirinas e ftalocianinas
derivadas de éter de coroa
Alessandra Caramori Pelegrino
Orientada
Prof. Dr. Antônio Claudio Tedesco
Orientador
RIBEIRÃO PRETO -SP
2007
Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo, como parte das
exigências para a obtenção do título de Doutor
em Ciências, Área: Química
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3
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo
de Ribeirão Preto/USP
Pelegrino, Alessandra Caramori
Estudos fotofísicos, fotoquímicos e fotobiológicos de
porfirinas e ftalocianinas derivadas de éter de coroa.
179 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área de
concentração: Química.
Orientador: Tedesco, Antônio Cláudio.
1. Terapia Fotodinâmica. 2. Porfirina. 3. Ftalocianina. 4.
Éter de coroa.
4
Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Folha de Aprovação
Membros da Comissão Julgadora da Tese de Doutorado de Alessandra Caramori
Pelegrino, apresentada ao Departamento de Química, da Faculdade de Filosofia, Ciências
e Letras de Ribeirão Preto, __/__/__.
Comissão Julgadora:
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
5
Agradeço a Deus por tudo que alcancei, e por Ele sempre
ter me abençoado,
ao meu Santo Expedito pelas realizações julgadas
impossíveis e também
aos ensinamentos de Dalai Lama, que me tornaram muito
mais feliz.
6
Agradecimentos Especiais
Ao meu marido, amigo e amor
Denilson
Que nesses 19 anos de união sempre esteve me incentivando, acreditando e
sonhando comigo.
Que me mostrou que a felicidade é uma trajetória e cada dia tem que ser especial.
À minha filha
Carolina
Que sempre me ensinou a ser mais tolerante, a acreditar em pessoas e na vida.
À minha filha
Júlia
Que enche nosso lar de alegria, amor e também de teimosia.
Ao Pub (in memorian), menino da casa que amou muito a família.
A Sophie, Fofinha e Snowbela pelo carinho.
Às minhas irmãs Arteti e Elina, que sempre estão ao meu lado; e aos meus
cunhados Léo e Serginho, que cuidam delas.
À minha mãe Alice e meu pai Máximo pelo carinho.
À minha sogra Dila, que é uma segunda mãe, e ao meu sogro Otávio, que sempre
está ao nosso lado.
Aos cunhados Daniel e Wanderson pela amizade e carinho.
E finalmente à toda família que amo muito.
7
Gostaria principalmente de agradecer nesta oportunidade a todos aqueles que com
sua colaboração tornaram possível a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Antônio Cláudio Tedesco, pela orientação, incentivo, paciência e
amizade durante este trabalho de doutorado.
À Fapesp, pelo apoio financeiro.
À Professora Dra. Marilda das Dores Assis, pelas valiosas contribuições e
amizade; e ao seu grupo de pesquisa pela síntese dos fármacos
fotossensibilizadores, em especial a Maria Carolina.
Às minhas colegas de trabalho Patrícia e Daniela, que se tornaram amigas
inesquecíveis, e que me mostraram que a mais pura amizade pode existir mesmo
no ambiente de trabalho.
A Olímpia, Daniela Manfrim, Fernando, Andreza, Vânia, Cristina, Mariana,
Jacques, Renata, Kátia, Ângelo, Gilson, Yara e Abílio, que no decorrer desse
trabalho fizeram inúmeras e valiosas contribuições.
A todos com quem convivi no laboratório, alunos de Iniciação Científica,
Mestrado, Doutorado e Pós-Doc, que de uma forma ou de outra contribuíram em
minhas escolhas.
Aos professores D
r
. Pietro Ciancaglini, D
ra
. Rosa do Prazeres M. F. Inocentes, D
ra
.
Maria Vitória Lopes Badra.Bentley e D
ra
. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli, que
cederam não só equipamentos, mas também atenção em seus laboratórios. Aos
alunos dos correspondentes grupos de pesquisas.
8
Ao pessoal da Biblioteca, da Secretaria do Departamento, da Secretaria de Pós-
Graduação, em especial a Lâmia, pela enorme paciência e cooperação.
Ao Prof Dr. Milton Beltrame Júnior, do Grupo de Síntese Orgânica da
Universidade do Vale do Paraíba, pelas tentativas de preparação da ftalocianina
ligada ao éter de coroa.
Aos meus amigos do Circo, em especial ao Dola, Claudinho, Felipe e João, que
me ajudaram a superar meus limites e me ensinaram que estes não existem, a não
ser na nossa cabeça. A inesquecível frase: “Eu ainda não consigo, mas vou
conseguir” ouvida tantas vezes.
Aos amigos Mamutes pela enorme amizade, pelas inesquecíveis reuniões lúdicas e
por mostrar que existe mais alguém preocupado em ser feliz.
Finalmente, a todos meus amigos, e pensando bem, aos que não foram tão amigos
também, pois cada qual à sua maneira, contribuiram na realização deste trabalho.
i
Sumário
I.Introdução.......................................................................................................... 1
I.1. Terapia Fotodinâmica..................................................................................... 7
I.2. A atuação da Terapia Fotodinâmica no tratamento de células tumorais...... 10
I.3. Mecanismos de ação fotoquímicos e fotofísicos.......................................... 12
I.4. Os fármacos fotossensibilizadores já utilizados na Terapia Fotodinâmica.. 16
I.5. Ftalocianinas como fármacos fotossensibilizadores em estudo na Terapia
Fotodinâmica....................................................................................................... 19
I.6. Éteres de coroa.............................................................................................. 24
I.7. Porfirinas ligadas a éteres de coroa. ............................................................. 26
I.8. Uso da sonda fluorescente para monitorar a diferença de potencial de
membrana............................................................................................................ 29
I.9. Sistemas de liberação de fármacos. .............................................................. 32
II.Objetivos ........................................................................................................... 34
III.Parte Experimental ........................................................................................ 36
III.1.Materiais ..................................................................................................... 36
III.2. Preparações ................................................................................................ 38
III.3. Aparelhagem.............................................................................................. 40
III.4. Métodos...................................................................................................... 44
III.4.1 Estudos espectroscópicos......................................................................... 44
III.4.1.1 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnC
4
P, H
2
C
4
P, TPP
e da ZnPc em meio orgânico............................................................................... 44
III.4.1.2 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (ΦF) da ZnC
4
P
e da H
2
C
4
P em etanol.......................................................................................... 44
III.4.1.3 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnC
4
P e para
H
2
C
4
P em meio orgânico. ................................................................................... 46
III.4.1.4 Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser................ 47
III.4.1.5 Estudos para a determinação do rendimento quântico de produção do
oxigênio singlete (Φ
∆
) da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em meio orgânico. ...................... 48
III.4.1.6 Determinação do Rendimento Quântico de Formação do Estado
Triplete dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P............................... 50
III.4.1.7 Preparação da ZnC
4
P, da H
2
C
4
P e da ZnPc concomitante ao éter de
coroa em meio lipossomal. ................................................................................. 52
III.4.1.8 Estudos do tamanho de partícula e Potencial Zeta da ZnC
4
P, H
2
C
4
P e
ZnPc e 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 em meio lipossomal............................ 54
III.4.2 Estudos envolvendo células neoplásicas.................................................. 59
III.4.2.1.a Crescimento e manutenção da cultura de células neoplásicas J774-A.1
............................................................................................................................. 59
III.4.2.1.b Congelamento das células J774-A.1.................................................. 60
III.4.2.1.c Diagrama de crescimento da cultura celular...................................... 60
III.4.2.1.d Controle da integridade da membrana celular. .................................. 61
III.4.2.2 Definição de parâmetros para os estudos de fototoxicidade................. 63
ii
III.4.2.2.1 Toxicidade dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio homogêneo e
micro heterogêneo na linhagem de células J774-A.1 em meio fisiológico Hank’s.
............................................................................................................................. 63
III.4.2.2.1.a Avaliação do tempo de incubação para o fármaco
fotossensibilizador ZnC
4
P em meio lipossomal e na presença de tampão Hank’s,
(estudo preliminar).............................................................................................. 64
III.4.2.2.2 Viabilidade celular dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e
H
2
C
4
P nos diferentes meios fisiológicos............................................................. 65
III.4.2.2.3 Efeito do SBF na incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas J774-A.1. .................................... 66
III.4.2.2.4 Desenvolvimento de método analítico para quantificação dos
fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP por espectrofluorimetria. 67
III.4.2.2.5 Cinética de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P,
H
2
C
4
P e TPP no meio de cultura ideal (DMEM com 10% de serum)................ 68
III.4.2.3 Estudos Fotobiológicos......................................................................... 68
III.4.2.3.1 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas da linhagem J774-A.1................. 68
III.4.2.3.2 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores em
meio lipossomal. ................................................................................................. 70
III.4.2.4. Estudos da influência do éter de coroa na membrana plasmática. ...... 71
III.4.2.4.1 Estudos com a sonda fluorescente bis(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C2, durante processo de hiperpolarização. ................ 71
III.4.2.4.2.a Calibração da sonda de resposta lenta bis(ácido 1,3-
dietiltiobarbitúrico) trimetina oxonol, diSBA-C
2
. .............................................. 75
IV.Resultados e Discussões: ................................................................................ 77
IV.1. Estudos espectroscópicos........................................................................... 78
IV.1.1. Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P
em meio orgânico................................................................................................ 78
IV.1.2. Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
F
) da ZnC
4
P e
da H
2
C
4
P em etanol............................................................................................. 85
IV.1.3 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnC
4
P e para H
2
C
4
P
em meio orgânico................................................................................................ 88
IV.1.4. Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser.................. 90
IV.1.5 Estudos para a determinação do rendimento quântico de produção do
oxigênio singlete (Φ
∆
) dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P em
meio orgânico...................................................................................................... 95
IV.1.6. Determinação do Rendimento Quântico de Formação do Estado Triplete
dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P........................................... 97
IV.1.7a Preparação da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em meio lipossomal......................... 99
IV.1.7.b Preparação da ZnPc e o éter de coroa em meio lipossomal. .............. 102
IV.1.8 Estudos do potencial zeta e tamanho de partículas da Zinco Ftalocianina
(ZnPC) na ausência e na presença do éter de coroa 2-(Hydroxymethyl)-18-
crown-6. ............................................................................................................ 106
iii
IV.2 Estudos envolvendo linhagem de células J774-A.1. ................................ 112
IV.2.1 Diagrama de crescimento da cultura celular.......................................... 112
IV.2.2 Definição de parâmetros para os estudos de fototoxicidade. ................ 116
IV.2.2.1 Toxicidade dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio homogêneo e micro
heterogêneo sobre a linhagem de células J774-A.1 em meio Hank’s .............. 117
IV.2.2.2 Viabilidade celular dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P
nos diferentes meios fisiológicos...................................................................... 119
IV.2.2.3 Efeito do SBF na incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas J774-A.1. .................................. 120
IV.2.2.4 Desenvolvimento de método analítico para quantificação dos fármacos
fotossensibilizadores ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP por espectrofluorometria. ............ 129
IV.2.2.5 Cinética de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P,
ZnC
4
P e TPP no meio de cultura (DMEM com 10% de SBF)......................... 132
IV.2.3 Estudos fotobiológicos........................................................................... 135
IV.2.3.1Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P,
ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas da linhagem J774-A.1. .......................... 135
IV.2.3.2 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores em
meio lipossomal. ............................................................................................... 138
IV.2.4. Estudo da influência do éter de coroa na membrana plasmática.......... 144
IV.2.4.1 Estudos com a sonda fluorescente bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, durante processo de hiperpolarização da membrana
plasmáica das células J774-A.1. ....................................................................... 148
IV.2.4.2 Estudos com a sonda fluorescente bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, durante processo de despolarização da membrana
plasmática das células J774-A.1. ...................................................................... 154
V.Conclusões: ..................................................................................................... 159
VI.Referências Bibliográficas ........................................................................... 164
iv
Índice de Figuras
Figura 1. Representação das etapas de como as células defeituosas dão origem
a metástase (Extraído do site da Sociedade Brasileira de Oncologia –
www.inca.gov.br).................................................................................................... 2
Figura 2. Figura representando onde os agentes iniciadores agem (Extraído
do site da Sociedade Brasileira de Oncologia – www.inca.gov.br).................... 3
Figura 3. Figura representativa da transformação das células iniciadas em
malignas. (Extraído do site da Sociedade Brasileira de Oncologia –
www.inca.gov.br).................................................................................................... 4
Figura 4. Diagrama esquemático representando como as células defeituosas
dão origem aos tumores (Extraído do site da Sociedade Brasileira de
Oncologia – www.inca.gov.br). ............................................................................. 4
Figura 5. Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilização........ 13
Figura 6. Estrutura de fotossensibilizadores aprovados para aplicação clínica.
(A) Visudyne
, (B) Foscan
, (C) Levulan
e (D) Metvix
........................... 18
Figura 7. Estrutura química das metalo ftalocianinas. .................................... 21
Figura 8. Estrutura de éteres de coroa............................................................... 26
Figura 9. Figura esquemática da formação de um canal na bicamada. ......... 28
Figura10. Estrutura da Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-
pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)- 2,3, 5,6-(tetrafluoro)fenil]-
porfirinato (ZnC
4
P).............................................................................................. 35
Figura 11. Figura esquemática da preparação dos lipossomas. ...................... 53
Figura 12. Espectro de absorção normalizado da H
2
C
4
P ( 6 µ
µµ
µM em etanol -----
) e ZnC
4
P ( 6 µ
µµ
µM em etanol
______
). O inserto apresenta a expanção da região
espectral que representa as bandas Q (500 a 800 nm) para uma solução 15
µ
µµ
µM em etanol de ambos os compostos ............................................................... 79
Figura 13. Espectro de absorção das bandas Q para a porfirina H
2
C
4
P em
etanol (), e espectro de emissão para a porfirina H
2
C
4
P em etanol (------).
Excitação fixa em 424 nm.................................................................................... 81
Figura 14. Espectro de absorção das bandas Q para a porfirina ZnC
4
P em
etanol (
), e espectro de emissão para a porfirina ZnC
4
P em etanol (------).
Excitação fixa em 422 nm.................................................................................... 83
Figura 15. Espectro de absorção da TFPP ( 6 µ
µµ
µM em etanol
______
). O inserto
apresenta a expanção da região espectral que representa as bandas Q (500 a
800 nm).................................................................................................................. 85
Figura 16. Espectro de absorção normalizado para H
2
C
4
P ( 6 µ
µµ
µM em meio
lipossomal -----) e ZnC
4
P ( 6 µ
µµ
µM em meio lipossomal
______
) .......................... 101
Figura 17. Figura demonstrativa da formação de canais de íons.................. 102
Figura 18. Espectro de absorção normalizado da ZnPC (5,0µ
µµ
µM) em etanol.
.............................................................................................................................. 103
v
Figura 19: Espectro de absorção normalizado da ZnPC (5,0µ
µµ
µM) em meio
lipossomal na ausência (−
−−
−) e na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6
(16µM) (−
−−
−). .......................................................................................................... 104
Figura 20 Espectro de emissão de fluorescência normalizado da ZnPC
(5,0µ
µµ
µM) em etanol. (λ
λλ
λ
exc
= 610 nm).................................................................. 105
Figura 21. Espectro de emissão de fluorescência normalizado da ZnPC
(5,0µ
µµ
µM) incorporada aos fosfolipídios na ausência (−
−−
−) e na presença de 2-
(Hydroxymethyl)-18-crown-6 (16µM) (−
−−
−). (λ
λλ
λ
exc
= 610 nm) ............................ 106
Figura 22. Curva de crescimento da linhagem J774-A.1 até 67 horas.......... 115
Figura 23. Variação da intensidade de fluorescência para a ZnC
4
P em DMEN
com diferentes porcentagem de SBF, com λ
λλ
λ de excitação fixa em 428 nm.
(curva □ para 0% de SBF, curva □ para 3% de SBF e curva □ para 10% de
SBF)..................................................................................................................... 122
Figura 24. Variação da intensidade de fluorescência para a H
2
C
4
P em DMEN
com diferentes porcentagens de SBF, com λ
λλ
λ de excitação fixa em 424 nm
(curva □ para 0% de SBF, curva □ para 3% de SBF e curva □ para 10% de
SBF)..................................................................................................................... 122
Figura 25. Variação da intensidade de fluorescência para a TPP em DMEM
com diferentes porcentagens de SBF com λ
λλ
λ de excitação fixa em 418 nm,
(curva □ para 0% de SBF e curva □ para 10% de SBF)................................ 124
Figura 26. Variação da intensidade de fluorescência para a ZnC
4
P em
diferentes porcentagens do SBF no meio de cultura celular, onde o SBF
variou de 0, 3 e 10%, com λ
λλ
λ de excitação fixa em 428 nm. ............................ 126
Figura 27. Variação da intensidade de fluorescência da H
2
C
4
P em meio
lipossomal em diferentes porcentagens de SBF no meio de cultura celular,
onde o SBF variou de 0, 3% e 10%, com λ
λλ
λ de excitação fixa em 424 nm..... 126
Figura 28. Variação da Intensidade de Fluorescência para a TPP em DMEM
com diferentes porcentagens de SBF (curva □ para 0% de SBF, curva □ para
3% de SBF curva □ para 10% de SBF), com λ
λλ
λ de excitação fixa em 418 nm
.............................................................................................................................. 128
Figura 29. Curva de calibração da ZnC
4
P em etanol. Inserto: espectros de
emissão de fluorescência da ZnC
4
P em etanol, com excitação fixa em 428 nm,
fenda de excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y = 7,0737e
10
x +4104,9,
R
2
= 0,995 ............................................................................................................ 130
Figura 30. Curva de calibração da H
2
C
4
P em etanol. Inserto: espectros de
emissão de fluorescência da H
2
C
4
P em etanol, com excitação fixa em 424 nm,
fenda de excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y= 1,8 e
10
x + 807,0, R
2
= 0,995. ................................................................................................................ 131
Figura 31. Curva de calibração da TPP em etanol. Inserto: espectros de
emissão de fluorescência da TPP em etanol, com excitação fixa em 418 nm,
fenda de excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y = 4,49e
10
x + 1197,6
.............................................................................................................................. 132
vi
Figura 32. Porcentagem de incorporação, por tempo de incubação, a partir de
uma solução 4 µ
µµ
µM de
ZnC
4
P,
H
2
C
4
P e
TPP em meio de cultura DMEN
com 10 % de SBF pela linhagem celular J774-A.1. ........................................ 133
Figura 33. Porcentagem de viabilidade celular por dose de luz irradiada, onde
as células J774-A.1 foram pré-incubadas com 4 µ
µµ
µM de
ZnC
4
P,
H
2
C
4
P e
TPP em meio de cultura DMEN. Os experimentos foram realizados em
triplicatas independentes. A análise da significância estatística entre o
controle e os outros grupos irradiados foi determinada por one-way ANOVA,
seguido pelo teste-t Newman-Keuls para comparações múltiplas. Os
resultados obtidos representam as médias ±
± ±
± SEM (n=3). Valores de P.
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001, p com relação ao controle. ........................ 136
Figura 34. Porcentagem de células viáveis após serem incubadas por uma
solução 4 µ
µµ
µM
H
2
C
4
P em meio de cultura DMEN, e 1 µ
µµ
µM
H
2
C
4
P
lipossomal em meio de cultura DMEN com 10 % de soro bovino fetal pela
linhagem celular J774-A.1, e posteriormente irradiadas. .............................. 139
Figura 35. Porcentagem de células vivas após serem incubadas por uma
solução 4 µ
µµ
µM
ZnC
4
P em meio de cultura DMEN, e 1 µ
µµ
µM
ZnC
4
P
lipossomal em meio de cultura DMEN com 10 % de soro bovino fetal pela
linhagem celular J774-A.1, e posteriormente irradiadas. .............................. 140
Figura 36. Porcentagem de células vivas após serem incubadas por uma
solução 1 µ
µµ
µM
H
2
C
4
P lipossomal e
ZnC4P lipossomal em meio de cultura
DMEN com 10 % de soro bovino fetal pela linhagem celular J774-A.1, e
posteriormente irradiadas................................................................................. 142
Figura 37. Figura esquemática da membrana plasmática............................. 145
Figura 38. Figura esquemática do transporte passivo através da membrana.
.............................................................................................................................. 146
Figura 41. Representação da sonda incorporada à bicama fosfolipídica..... 148
Figura 39. Concentração de íons sódio e potássio intra e extracelular......... 149
Figura 40. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação em 500 nm) pelo acréscimo de íons sódio, na ausência do fármaco,
medida através da sonda di-SBA-C
2
. A curva (-) refere-se à intensidade de
fluorescência na ausência do sal e a curva (-) refere-se à emissão de
fluorescência após a adição de íons sódio, até a concentração de 160 mM, à
suspensão celular, ocorrendo assim hiperpolarização nas células J774-A.1 150
Figura 41. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação em 500 nm) pelo acréscimo de íons sódio, na presença do fármaco
ZnC
4
P, medida através da sonda di-SBA-C
2
. A curva (-) refere-se à
intensidade de fluorescência na ausência do sal e a curva (-) refere-se à
emissão de fluorescência após a adição de íons sódio, até a concentração de
160 mM, à suspensão celular, ocorrendo assim hiperpolarização nas células
J774-A.1 .............................................................................................................. 151
vii
Figura 42. Forma esquemática da incorporação do fotossensibilizador na
bicamada lipídica. Formam-se nano-poros que afetam o transporte íons sódio
através da mesma............................................................................................... 152
Figura 43. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação em 500 nm) pelo acréscimo de monesin até a concentração de 48
µ
µµ
µM. A curva (-) refere-se à intensidade de fluorescência na ausência do
monesin e a curva (-) refere-se à emissão de fluorescência após a adição do
antibiótico monesin, até a concentração de 48 µ
µµ
µM, à suspensão celular,
ocorrendo assim despolarização nas células J774-A.1 ................................... 153
Figura 44. Curva de calibração do potencial de membrana para as células
J774-A.1 na ausência do éter de coroa............................................................. 155
Figura 45. Curva do potencial de membrana para células J774-A.1
previamente incubadas com éter de coroa....................................................... 156
viii
Índice de Tabelas
Tabela 1. Parâmetros Fotofísicos da ZnC
4
P e H
2
C
4
P (6 µ
µµ
µM em meio etanólico ). τ
ττ
τ
T
= tempo de vida triplete, τ
ττ
τ
S
= tempo de vida singlete, Φf = rendimento quântico
de fluorescência e Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
= rendimento quântico de oxigênio singlete..................94
Tabela 2: Tamanho das partículas e potencial zeta das preparações lipossomais
..............................................................................................................................109
Tabela 3- Cálculo do diâmetro médio do lipossoma com base em medidas de
espalhamento de luz. ..........................................................................................110
Tabela 4- Toxicidade dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P e ZnC
4
P em meio
Hank’s e lipossomal, na ausência de luz na linhagem de células J774-A.1...117
Tabela 5- Porcentagem de células mortas após a incubação das células J774-A.1,
por 7 e 24 horas, com os diferentes meios de cultura......................................120
Tabela 7- Porcentagem da variação de fluorescência e porcentagem da variação
da diferença de potencial. ..................................................................................157
ix
Lista de Símbolos.
TFD Terapia Fotodinâmica
HpD Hematoporfirina
FS Fármaco fotossensibilizador
1
O
2
Oxigênio singlete
O
2
-*
Ânion superóxido
*OH Radical Hidroxila
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
S
0
Estado singlete fundamental
T
1
Baixo estado triplete
hν
Absorção de luz
Sn Estado excitado singlete superior
IC Conversão interna
k
P
Fosforescência
k
f
Fluorescência
Tn Estado excitado triplete superior
ISC Cruzamento intersistema
S
1
Estado eletrônico singlete excitado
EROs Espécies reativas de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
EMEA European Medical Agency
CPHA Canadian Public Health Agency
Pc Ftalocianinas
ε
Coeficiente de absorvidade molar (mol
-1
Lcm
-1
)
φ
Rendimento quântico (mol einstein-1)
λmax
Comprimento de onda de absorção máxima(nm)
λem
Comprimento de onda de emissão
λexc
Comprimento de onda de excitação
τ
T
Tempo de vida do estado excitado triplete
x
τ
S
Tempo de vida do estado excitado singlete
ZnTSPC Zinco ftalocianina tetrasulfonada
ZnPc Zinco ftalocianina
ATP Adenosina Trifosfato
ADP Adenosina Difosfato
ZnC
4
P Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclo
pentadecane-2-aminometil)- 2,3, 5,6-(tetrafluoro)fenil]-
porfirinato
H
2
C
4
P 5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-
2-aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro)fenil]porfirina
TPP Tetrafenilporfirina
diSBA-C
2
bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbiturico) trimetina oxonol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
ATCC American Type Culture Collection
DMEM Meio de cultura dulbelcco mem
MTT 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium
DPPC
L-α- dipalmitoil fosfatidilcolina
SBF Soro bovino fetal
TMPyPH
2
5,10,15,20-tetrakis(4-N-Metilpyridil)porfirina
Φ
F
Rendimentos quânticos de fluorescência
Φ
∆
rendimento quântico de produção do oxigênio singlete
DO Densidade óptica
τ
∆
Tempo de vida do oxigênio singlete
Abs Absorção
I
ref
Intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido
pelo composto padrão
I Intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido
pela amostra
Φ
∆ref
Rendimento quântico de produção de
1
O
2
produzido pela
xi
referência
τ
∆ref
Tempo de vida do
1
O
2
produzido pela referência
τ
∆
Tempo de vida do
1
O
2
produzido pela amostra
Φ
T
Rendimento quântico de produção do estado excitado triplete
Φ
∆
Rendimento quântico de produção de oxigênio singlete
∆F Variação de fluorescência
S
0
Estado fundamental
Sn Estados excitados singletes mais energéticos
Tn Estados excitados tripletes de maior energia
3F Fotossensibilizador no estado excitado triplete
F Fotossensibilizador
1F Fotossensibilizador no estado excitado singlete
Ψ Potencial de membrana
χ2
Função chi-quadrado
3
O
2
Oxigênio molecular
xii
Resumo
A Terapia Fotodinâmica (TFD) está baseada no uso de um fármaco
fotossensível que, uma vez ativado por luz visível e na presença do oxigênio,
induz a produção de espécies reativas de oxigênio tais como o radical peroxila, o
ânion radical superóxido e o radical hidroxila (Tipo I) ou oxigênio singlete (Tipo
II), que atuam diretamente sobre os sistemas biológicos induzindo a morte da
célula, por processo necrótico ou apoptótico.
A maioria dos tipos de tumores responde ao tratamento e os resultados são
promissores. Entretanto, órgãos altamente pigmentados e vísceras maciças (fígado,
baço, rins e medula óssea) impedem a penetração da luz visível para o tratamento,
o que representa um tipo de resistência aos protocolos da Terapia Fotodinâmica.
Torna-se necessário, portanto, procurar por novos agentes
fotossensibilizadores. Estudos mostraram que a ação fotodinâmica induz
mudanças diretas na membrana celular que levam a um desequilíbrio na
homeostase iônica celular (íons sódio, potássio e cálcio), o que certamente leva a
um dano no transporte de proteínas da membrana plasmática, e em última análise,
a um stress osmótico irreversível.
Neste trabalho, procurou-se determinar a potencialidade do uso da
5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)2,3,-
5,6-(tetrafluoro)fenil]porfirina (H
2
C
4
P), e do Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-
(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro)fenil]-
xiii
porfirinato (ZnC
4
P) como fármaco fotossensível. Avaliou-se também a zinco
ftalocianina associada ao éter de coroa onde, graças à presença do éter de coroa,
pode-se observar uma potencialização da ação fotodinâmica.
Nos estudos fotofísicos e fotoquímicos, observou-se que os fármacos
porfirínicos apresentam importantes propriedades espectroscópicas para o
protocolo da TFD. O rendimento quântico de produção de oxigênio singlete foi
medido e o valor encontrado para H
2
C
4
P (Φ
∆
= 0,62) foi maior que o valor
encontrado para ZnC
4
P (Φ
∆
= 0,46).
Os valores de rendimento quântico de produção dos estados excitado
tripletes (Φ
T
) para ZnC
4
P
foi da ordem de 0,73 e para H
2
C
4
P foi da ordem de 0,63,
mostrando que o mecanismo Tipo II para a porfirina base livre H
2
C
4
P é o efeito
dominante, e para o fotossensibilizador metalado ZnC
4
P, o processo Tipo I é o
dominante. Ambos os sistemas apresentaram uma eficiente ação fotodinâmica nos
estudos com a linhagem de células J774-A.1.
Fez-se uso de sondas fluorescentes para monitorar a distribuição e alteração
na homeostase de íons através da membrana plasmática celular. Esses estudos
mostraram que a presença dos ligantes éter de coroa na estrutura da porfirina,
atuando concomitantemente à ftalocianina, potencializam a ação fotodinâmica.
Observou-se que o 18-crow-6 éter de coroa minimiza a diferença de potencial da
mesma ordem de magnitude de quando está associado à ZnPC em uma formulação
xiv
lipossomal, (da ordem de 50%), o que mostra que a ZnPc não interfere na
formação dos canais de íons potássio formados.
Estes resultados indicaram um grande potencial de aplicação do ligante éter
de coroa associado ou ligado covalentemente ao fármaco no uso da TFD, visto que
o éter de coroa não modificou as características fotofísicas e fotoquímicas dos
fotossensibilizadores, uma nova perspectiva no que chamamos de Terapia
Fotodinâmica Sinérgica.
xv
Abstract
Photodynamic Therapy (PDT) is based on the use of a photosensitive drug
which, once activated by visible light and in the presence of oxygen, induces the
production of several reactive species of oxygen, such as the peroxyl radical,
superoxide anion and hydroxyl radical (Type I) or singlet oxygen (Type II), which
act directly over the biological systems inducing the cell death, through a necrotic
or apoptotic process.
Most of the types of tumor respond to the treatment and the results are
prosperous. However, highly pigmented organs and massive viscera (kidneys,
spleen, liver and bone marrow) block the penetration of the visible light for the
treatment, what represents a kind of resistance towards the Photodynamic Therapy
protocols.
Hence, it is necessary to look for new phosensitizing agents. Studies have
shown that the photodynamic action induces direct changes in the cell membrane
that lead to an unbalance in the cell ionic homeostasis (sodium, potassium and
calcium ions), what certainly causes damage to the plasmatic membrane protein
transport, and in a final analysis, irreversible osmotic stress.
In this work, we aimed at determining the potentiality of the use of the
5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxacyclopentadecane-2-aminometil)2,3,-
5,6-(tetrafluoro)phenyl] porphyrin (H
2
C
4
P), and the Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-
(1,4,7,10,13-pentaoxacyclopentadecane-2-aminomethyl)2,3,5,6-(tetrafluoro)-
xvi
phenyl]-porphyrinate (ZnC
4
P) as a photosensitive drug. We evaluated also the
phytalocianine zinc associated to the crown ether where, due to the presence of
the crown ether, we could observe a potentialization of the photodynamic action.
In the photophysical and photochemical studies, we observed that the
porphyirinic drugs present important spectroscopic properties to PDT protocol.
The singlet oxygen production quantum yield was measured and the value found
for H
2
C
4
P (Φ
∆
= 0.62) was higher than that one found for ZnC
4
P (Φ
∆
= 0.46).
The value of the quantum yield of the production of the triplet excited
states (Φ
T
) for ZnC
4
P
was 0.73, and for H
2
C
4
P it was 0.63, showing that the
mechanism Type II for the free-base porphyrin H
2
C
4
P is the dominant effect, and
for the ZnC
4
P metallated photosensitizer, Type I process is the dominant one.
Both systems present an efficient photodynamic action in the studies with the
J774-A.1 cell strain.
We used fluorescent probes to monitor the distribution and alteration of the
ionic homeostasis through the plasmatic cell membrane. These studies showed that
the presence of the crowned-ether ligants in the structure of the porphyrine, acting
together with the dye structure, potentializes the photodynamic action. We
observed that the 18-crow-6 crown ether decrease the difference in the
transmembrane electrical potential in the same order of magnitude when it is
associated to the ZnPC in a liposome formulation, (around 50%), what shows that
the ZnPC does not interfere in the action of the potassium ion channels.
xvii
These results indicated a great potential of application of the crowned-ether
ligant associated or covalently connected to the drug in the use of PDT, protocol
once the crown ether structure did not modify the photophysical and
photochemical characteristics of the photosensitizers, a new perspective in what
we call Synergic Photodynamic Therapy.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
1
I. Introdução
“Câncer” é um termo que abrange um grande número de doenças com
padrões clínicos muito diferentes, e ocorre quando uma célula normal sofre
alterações no DNA dos genes, o que se chama mutação genética. As células cujo
material genético foi alterado passam a receber instruções erradas para as suas
atividades. As alterações podem ocorrer em genes especiais, denominados
protooncogenes, que a princípio são inativos em células normais por um eficiente
sistema de reparo. Quando ativados, os protooncogenes transformam-se em
oncogenes, responsáveis pela malignização (cancerização) das células normais.
Essas células diferentes são denominadas, então, células cancerosas.
As células alteradas passam então a se comportar de forma anormal.
• Multiplicam-se de maneira descontrolada, mais rapidamente que as células
normais do tecido à sua volta, invadindo-o. Geralmente, têm capacidade para
formar novos vasos sanguíneos, que as nutrirão e manterão as atividades de
crescimento descontrolado. O acúmulo dessas células forma os tumores malignos;
• Adquirem a capacidade de se desprender do tumor e de migrar. Invadem
inicialmente os tecidos vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sangüíneo
ou linfático e, através desses, disseminar-se, chegando a órgãos distantes do local
onde o tumor se iniciou, formando as metástases. Dependendo do tipo da célula do
tumor, algumas dão metástases mais rapidamente e mais precocemente, outras o
fazem bem lentamente, ou até não o fazem;
Introdução
_____________________________________________________________________________________
2
• As células cancerosas são, geralmente, menos especializadas nas suas funções do
que as suas correspondentes normais. Conforme as células cancerosas vão
substituindo as normais, os tecidos invadidos vão perdendo suas funções (figura
1). Por exemplo: a invasão dos pulmões gera alterações respiratórias, a invasão do
cérebro pode gerar dores de cabeça, convulsões, alterações da consciência etc.
Figura 1. Representação das etapas de como as células defeituosas dão origem à
metástase (Extraído do site da Sociedade Brasileira de Oncologia –
www.inca.gov.br).
Além disso, estas células perdem uma de suas características mais vitais: a
de entrarem em um processo de morte programado quando envelhecem -
conhecido como apoptose, o que permite sua replicação por tempo indefinido.
O processo de carcinogênese, ou seja, de formação de câncer, em geral se
dá lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa prolifere
e dê origem a um tumor visível. Esse processo passa por vários estágios antes de
chegar ao tumor.
Estágio de iniciação
Introdução
_____________________________________________________________________________________
3
É o primeiro estágio da carcinogênese. Nele, as células sofrem o efeito dos
agentes cancerígenos ou carcinógenos, que provocam modificações em alguns de
seus genes (figura 2). Nesta fase, as células encontram-se geneticamente alteradas,
porém ainda não é possível detectar um tumor clinicamente. Encontram-se
'preparadas', ou seja, 'iniciadas' para a ação de um segundo grupo de agentes que
atuará no próximo estágio.
Figura 2. Figura representando onde os agentes iniciadores agem (Extraído do site
da Sociedade Brasileira de Oncologia – www.inca.gov.br).
Estágio de promoção
É o segundo estágio da carcinogênese. Nele, as células geneticamente
alteradas, ou seja, 'iniciadas', sofrem o efeito dos agentes cancerígenos
classificados como oncopromotores. A célula iniciada é transformada em célula
maligna, de forma lenta e gradual. Para que ocorra essa transformação, é
necessário um longo e continuado contato com o agente cancerígeno promotor. A
suspensão do contato com agentes promotores muitas vezes interrompe o processo
nesse estágio. Alguns componentes da alimentação e a exposição excessiva e
prolongada a hormônios são exemplos de fatores que promovem a transformação
de células iniciadas em malignas (figura 3).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
4
Introdução
_____________________________________________________________________________________
5
As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao
organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao
meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e
cultural. As causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-
determinadas: estão ligadas à capacidade do organismo de se defender das
agressões externas.
O tratamento do câncer pode ser feito através de cirurgia, radioterapia,
quimioterapia ou transplante de medula óssea. Em muitos casos, é necessário
combinar essas modalidades.
Radioterapia - É um tratamento no qual se utilizam radiações para destruir um
tumor ou impedir que suas células aumentem. A radioterapia induz a morte celular
pelo efeito da localização da radiação ionizante, que pode ser eletromagnética
(raios X ou gama) e particulada (radiação de partículas α e β, prótons e nêutrons).
Os principais efeitos colaterais são: cansaço, perda de apetite e dificuldade para
ingerir alimentos, reações na pele (a área afetada poderá coçar, ficar vermelha,
irritada, queimada, tornando-se seca e escamosa), além de poder atingir outros
tecidos e causar doenças como cistite, dermatite e retinite.
Quimioterapia - A quimioterapia é um tratamento à base de fármacos que impede
a reprodução celular e, consequentemente, mata as células malignas. No entanto,
atua também sobre as células normais com inúmeros efeitos colaterais. Os
medicamentos são aplicados, em sua maioria, de forma intravenosa, podendo
Introdução
_____________________________________________________________________________________
6
também ser administrados por via oral, intramuscular, subcutânea, tópica e
intratecal. Os principais efeitos colaterais são: fraqueza, diarréia, perda ou
aumento de peso, feridas na boca, queda de cabelos e outros pêlos do corpo, enjôo,
vômitos, tonteiras.
Transplante de medula óssea - É um tipo de tratamento proposto para algumas
doenças malignas que afetam as células do sangue. Ele consiste na substituição de
uma medula óssea doente, ou deficitária, por células normais de medula óssea,
com o objetivo de reconstituição de uma nova medula.
Para que se realize um transplante de medula é necessário que haja uma total
compatibilidade tecidual entre doador e receptor. Caso contrário, a medula será
rejeitada. Esta compatibilidade tecidual é determinada por um conjunto de genes
localizados no cromossoma 6. Por isso, devem ser iguais entre doador e receptor.
Esta análise é realizada em testes laboratoriais específicos, a partir de amostras de
sangue do doador e receptor, chamados de exames de histocompatibilidade. Com
base nas leis de genética, as chances de um indivíduo encontrar um doador ideal
entre irmãos (mesmo pai e mesma mãe) é de 35%.
Cirurgia - (remoção do tecido lesado e seus arredores). Esse tratamento apresenta
inúmeras desvantagens, como por exemplo a desfiguração do paciente, com
prejuízos à sua auto-estima.
Podemos ver que os tratamentos convencionais normalmente resultam em
sério efeito causado pela perda de função da célula saudável vizinha ao tecido
tumoral, e por ter propriedades citotóxicas relativamente indiscriminadas. O
Introdução
_____________________________________________________________________________________
7
desenvolvimento de novas terapias de câncer, com seletividade melhorada, é sem
dúvida uma necessidade. Em virtude disso, tratamentos alternativos têm sido
desenvolvidos, dentre os quais se destaca a Terapia Fotodinâmica (TFD), que por
sua vez é uma técnica pouco invasiva e que pode ser aplicada repetidamente no
mesmo local, além de apresentar mínimos efeitos colaterais (Kübler, 2005;
Pandey, 1992).
I.1. Terapia Fotodinâmica.
A terapia que usa a luz visível ou visível próximo (infravermelho) como
agente terapêutico - também definida como fototerapia - foi aplicada no Egito,
Índia e China há mais de 4000 anos para o tratamento de psoriasis, vitiligo,
raquitismo, cancer (Spikes, 1985). Há 2500 anos atrás, um médico grego
chamado Herodotus recomendou a fototerapia através da luz solar para a
restauração da saúde(Juzeniene , Nielsen e Moan, 2006).
Embora se considere o marco inicial da fototerapia o trabalho desenvolvido
por Finsen em 1890 para tratamento de tuberculose cutânea (lupus vulgaris),
utilizando-se uma lâmpada de arco-carbono e um filtro para radiação
infravermelha (trabalho este que concedeu a Finsen o prêmio Nobel de 1903), os
pesquisadores franceses já utilizavam radiação solar para o tratamento da
tuberculose, escorbuto, reumatismo, edemas e fraqueza nos músculos mesmo
antes de FinsenCauvin, J. F., (1815).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
8
Muitos consideram o grupo de pesquisa de von Tappeiner como o
fundador da terapia fotodinâmica (TFD). Dentre os trabalhos desenvolvidos neste
grupo, destaca-se o realizado por Raab em 1900(Raab, 1900), o qual estudou o
efeito do alaranjado de acridina e luz sobre o paramécio, bem como o trabalho de
Jesionek em 1903(Tappeiner e Jesionek, 1903), que fez a primeira aplicação
clínica da terapia fotodinâmica como o uso tópico de eosina e luz no tratamento
de carcinoma basocelular antes do período de irradiação. Em 1907, von Tappeiner
e Jodlbauer definiram a TFD como a interação dinâmica entre luz, um agente
fotossensibilizador e moléculas de oxigênio, resultando na destruição de
tecidos(Tappeiner e Jodlbauer, 1907).
Muitos trabalhos foram realizados até a terapia fotodinâmica moderna,
como a demonstração do efeito fotossensibilizante da hematoporfirina em ratos
por Hausmann (1911)(Hausmann, 1911) e em humanos por Meyer-Betz )(Meyer-
Betz, 1913); a observação da fluorescência da porfirina em sarcomas de ratos por
Policard (1924) e em carcinomas de mama humana por Körbler (1931); a
primeira aplicação da TFD usando porfirinas no tratamento de tumores de
animais por Auler e Banzer (1942); a aplicação de derivados de hematoporfirina
no tratamento de câncer de mama e metástase na região torácica por Richard
Lipson (1966) e por Kelly e Snell para tratamento de câncer de bexiga(Kelly e
Snell, 1976) usando luz branca. Em 1975, Dougherty et al registraram que o
derivado de hematoporfirina (HpD), em combinação com luz vermelha, poderia
erradicar completamente o crescimento de tumores de mama em ratos.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
9
Purificação do HpD realizado por Dougherty levou à produção do Photofrin II
,
que foi aplicado em vários testes de cânceres de bexiga e pele, conduzindo à
pesquisas modernas de TFD.
A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica que além de ser utilizada no
tratamento do câncer, bem como em outras doenças não oncológicas (Qiang ,
Zhang e Ichikawa, 2006; Triesscheijin et al., 2006), tem sido utilizada no
tratamento de efluentes(Clennan, 2000), em sínteses químicas (Esser , Pohlmann e
Scharf, 1994; Gerdes et al., 2001), na esterilização de sangue(Sharman , Allen e
Lier, 1999) e na exterminação de pragas agrícolas(BenAmor e Jori, 2000).
No Brasil, a técnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de
Pesquisa em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP, na pesquisa de novos
sistemas de liberação de fármacos (Nunes , Sguilla e Tedesco, 2004a) e FSs
aplicados à TFD (Rotta , Lunardi e Tedesco, 2003a; Tedesco et al., 2003; Tedesco
, Rotta e Lunardi, 2003a).
Este procedimento vem sendo aplicado em estudos clínicos desde 1999 pela
equipe do Dr. Guilherme Cestari Filho, com a implementação desta técnica no
Hospital Amaral de Carvalho em Jaú-SP, onde pacientes com câncer nas cordas
vocais, estômago, garganta e pulmão vêm sendo tratados. Além das aplicações
clínicas, têm sido realizadas pesquisas científicas para o desenvolvimento de
novas fontes de luz laser. Em 2000, no Departamento de Dermatologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, foram iniciados tratamentos de
doenças de pele utilizando TFD, com a participação de um grupo composto por
Introdução
_____________________________________________________________________________________
10
farmacêuticos, químicos, médicos e físicos (Costa et al., 2005; Tedesco et al.,
2003; Turchiello et al., 2003).
I.2. A atuação da Terapia Fotodinâmica no tratamento de células tumorais.
Na oncologia, a TFD baseia-se na administração sistêmica de um fármaco
fotossensibilizador (FS) que pode ser injetado de forma intravenosa, seletivamente
retido pelas áreas neoplásicas e após alguns dias expelido pelo tecido normal.
O tumor é então irradiado, após algum tempo da administração do fármaco,
utilizando-se uma fonte de luz na região do vermelho ou infravermelho próximo
(Machado, 2000) a fim de que a irradiação penetre efetivamente nos tecidos
tumorais, uma vez que radiações de alta energia são absorvidas por cromóforos
bioendogênicos e/ou espalhadas pelos tecidos, o que torna a fotoxidação apenas
superficial(Ostler et al., 2000). Lâmpadas convencionais, diodos emissores de luz
(LED) e lasers tem sido usados como fonte de irradiação na TFD. Devido à
elevada potência do feixe de radiação, o laser possibilita que os períodos de
irradiação sejam curtos. Também são facilmente acoplados às fibras óticas
permitindo que as irradiações possam ser realizadas em órgãos internos (Juzeniene
, Nielsen e Moan, 2006b; Qiang , Zhang e Ichikawa, 2006). No entanto, no
tratamento de grandes lesões da pele, fontes como os LED’s são superiores aos
lasers, devido ao seu largo campo de irradiação (Juzeniene , Nielsen e Moan,
2006b; Qiang , Zhang e Ichikawa, 2006).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
11
A irradiação do tumor provoca a excitação do fármaco fotossensibilizador
a um estado eletrônico de maior energia, o qual pode retornar ao estado
fundamental via processos radioativos (como fluorescência ou fosforescência) ou
não-radioativos (como conversão interna, cruzamento intersistema ou relaxações
vibracionais)(Juzeniene , Nielsen e Moan, 2006b). É o cruzamento intersistema,
que na presença de oxigênio, e do estado triplete excitado gerado, acaba por
induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (
1
O
2
, O
2
-*
,*OH , H
2
O
2
,
definidas como EROs) que atacam centros específicos dentro dos sistemas
celulares, desencadeando a morte de tais tecidos por apoptose ou necrose celular.
O fármaco fotossensibilizador ou a luz, sozinhas, não apresentam
citotoxicidade para o organismo. Entretanto, a combinação dos dois agentes em
presença de oxigênio induz a morte das células tumorais(Mironov , Grin e
Tsiprovskii, 2003).
Depois do primeiro trabalho em humanos publicado por Dougherty em
1975(Dougherty et al., 1975), milhares de pacientes têm sido tratados por esta
técnica. Os casos publicados incluem neoplasias originárias de diferentes órgãos,
como carcinoma de células escamosas; adenocarcinoma; carcinoma de células
basais; tumores malígnos de origem não-epitelial como glioma, melanoma,
retinoblastoma; cromosarcoma e sarcoma de Kaposi. A maioria dos tipos de tumor
responde ao tratamento e os resultados são promissores(Akita et al., 2007; Brown
et al., 2007; Donnelly et al., 2007; Kaiserman et al., 2007; Moore et al., 2007;
Selman, 2007; van der Maulen et al., 2007). Entretanto, órgãos altamente
Introdução
_____________________________________________________________________________________
12
pigmentados e vísceras maciças (fígado, baço, rins e medula óssea) impedem a
penetração da luz para o tratamento, o que os torna resistentes à Terapia
Fotodinâmica.
Sendo assim, nos últimos anos ocorreu um aumento da procura por novos
agentes fotossensibilizadores, bem como a avaliação da potencialidade no
tratamento fotoquímio-terápico de tecidos tumorais(Hamblin e Hasan, 1996;
Henderson et al., 2000; Henderson e Dougherty, 1992; Pandey, 2000).
I.3. Mecanismos de ação fotoquímicos e fotofísicos
O mecanismo pode ser descrito de forma global pelo diagrama de
Jablonski (figura 5), onde observa-se que o fármaco fotossensibilizador no estado
fundamental ( S
0
) é excitado a um estado eletrônico de maior energia, o qual
pode fluorescer e retornar ao estado fundamental, ou realizar um cruzamento
intersistema para o mais baixo estado triplete (T
1
).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
13
Figura 5. Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilização.
h
ν
-
absorção de luz
S
0
–
estado singlete fundamental
Sn
-
estado excitado singlete superior
k
f
–
fluorescência
IC
-
conversão interna
Tn
–
estado excitado triplete superior
k
P
–
fosforescência
ISC
–
cr
uzamento intersistema
Dentre estes processos de decaimento energético, o cruzamento
intersistema é fundamental para a terapia fotodinâmica, pois consiste numa
transição proibida por spin, onde o fotossensibilizador no estado eletrônico
singlete excitado (S
1
) sofre uma transição para o estado triplete excitado (T
1
). A
substância fotossensível localizada no estado triplete excitado apresenta um
tempo de vida maior do que no estado singlete excitado, em razão da transição T
1
→S
0
ser proibida por spin (Sharman , Allen e vanLier, 2000). Dessa forma o
fotossensibilizador no estado T
1
pode interagir fotoquimicamente com moléculas
de oxigênio, ou biomoléculas localizadas próximas a região irradiada, gerando
Introdução
_____________________________________________________________________________________
14
espécies reativas que danificam o tecido irradiado (Gorman et al., 2004; Oleinick
, Morris e Belichenko, 2002; van Nostrum, 2004).
A fotodestruição dos tecidos pode ocorrer através da geração de radicais
livres extremamente reativos (mecanismo tipo I) ou de oxigênio singlete
(mecanismo tipo II)(Bonnett, 1995; Ochsner, 1997; Sibata et al., 2000). O
mecanismo tipo I envolve reações de transferência de elétrons e/ou extração de
átomos de hidrogênio entre o fotossensibilizador e um substrato (biológico,
solvente ou outro fotossensibilizador) produzindo radicais e/ou íons radicais.
Estas espécies radicalares, por serem altamente reativas, podem causar
destruições aos tecidos irradiados, mas também podem interagir facilmente com o
oxigênio molecular gerando espécies reativas de oxigênio como ânion superóxido
ou hidroxila, os quais também são citotóxicos (Sharman , Allen e vanLier, 2000).
Este tipo de fotossensibilização é conhecido como sendo do Tipo I.
Outro caminho possível para o estado excitado triplete gerado é o de
transferência de energia para o oxigênio molecular com formação de oxigênio
singlete, o qual reage rapidamente com vários materiais biológicos eletrofílicos,
como lipídios insaturados, proteínas, ácidos nuclêicos etc., generalizando assim a
produção dos EROs. Este tipo de fotossensibilização é conhecido como
sensibilização do Tipo II.
Existem dois estados singletes do oxigênio. O estado
1
∆
g
tem energia de 94
kJ/mol acima do estado fundamental e o estado
1
Σ
g
+
tem 156,7 kJ/mol. Como o
Introdução
_____________________________________________________________________________________
15
singlete de maior energia (
1
Σ
g
+
) tem um tempo de vida muito curto (20ps em
metanol) (Schimidt e Dodescheim, 1994), acaba decaindo ao estado
1
∆
g
. Então, o
oxigênio singlete no estado
1
∆
g
é considerado como a principal espécie envolvida
no mecanismo tipo II. Neste mecanismo, a energia transferida do
fotossensibilizador ao oxigênio molecular no estado fundamental (
3
Σ
g
-
ou
3
O
2
)
leva um dos dois elétrons do
3
O
2
(localizados separadamente em orbitais
moleculares degenerados antiligantes π*) a ocupar o mesmo orbital degenerado
do outro elétron decorrendo inversão do spin. O fato de um dos orbitais
degenerados estar vazio é o fato que confere ao oxigênio singlete um caráter
eletrofílico, favorecendo sua participação em reações onde há presença de
substratos ricos em elétrons(Machado, 2000).
Atualmente, alguns grupos estão trabalhando nos estudos envolvendo a
absorção de um segundo fóton a partir do estado excitado triplete (T
1
), gerando
estados tripletes de maior energia (T
n
) que resultam na degradação do
fotossensibilizador em outras espécies radicalares, independente da presença de
oxigênio.
Embora boa parte da TFD em desenvolvimento nos diferentes centros de
pesquisa pelo globo se baseia na utilização do oxigênio singlete como espécie
reativa (DePaoli , DePaoli e Borissevitch, 2002; Kochevar et al., 1996;
Yamamoto , Nagano e Okura, 2003), tem sido grande a procura por outras
espécies úteis, como radicais livres derivados dos corantes utilizados, outras
Introdução
_____________________________________________________________________________________
16
espécies radicalares independentes de oxigênio (Niziolek , Korytowski e Girotti,
2003), ou as espécies reativas de nitrogênio(Lima et al., 2006; Oliveira et al.,
2006; Tedesco et al., 2007).
I.4. Os fármacos fotossensibilizadores já utilizados na Terapia Fotodinâmica.
O primeiro composto aprovado pela Food and Drug Administration (FDA)
para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
, um derivado da hematoporfirina
que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
, Photogem
,
Photocarcinorin
e Haematodrex
)(Brown , Brown e Walker, 2004); (Nyman e
Hynninen, 2004). A habilidade fotodinâmica deste composto se deve
principalmente aos seus componentes oligoméricos, sendo caracterizado por uma
proporção de monômeros, dímeros e oligômeros estimada em 14:19:67,
respectivamente(Nyman e Hynninen, 2004). Em razão dos bons resultados obtidos
em estudos clínicos, o Photofrin
já foi aprovado pelos órgãos de saúde de mais de
40 países para tratamento de diversos tipos de câncer(Nyman e Hynninen, 2004).
Atualmente, mais três compostos aprovados pela FDA vem sendo utilizados
na TFD: o Visudyne (verteporfirina ou monoácido derivado de benzoporfirina) no
tratamento da degeneração macular, o Levulan (ácido aminolevulínico) no
tratamento de ceratose actínica e o Metvix (aminolevulinato de metila) no
tratamento de ceratose actínica e carcinoma basocelular(Dickson , Goyan e Pottier,
2003; Nyman e Hynninen, 2004; Oleinick , Morris e Belichenko, 2002; Simplicio ,
Introdução
_____________________________________________________________________________________
17
Maionchi e Hioka, 2002). O Visudyne também foi recentemente aprovado pela
EMEA (European Medical Agency) e a CPHA (Canadian Public Health Agency)
para o tratamento da degeneração macular(Nyman e Hynninen, 2004). Mais
recentemente, um novo fotossensibilizador (Foscan, m-tetrahidroxifenilclorina) foi
aprovado pela EMEA para uso no tratamento de carcinomas celulares da cabeça e
do pescoço(Banfi et al., 2004). Além disso, outros compostos estão sendo
estudados em testes clínicos de fase I, II e III para aplicações em diversos tipos de
câncer, como ftalocianinas de alumínio sulfonadas, ftalocianinas de zinco,
etiopurpurinato de estanho (IV), texafirinato de lutécio (III) e hexoxyfitoclorina
(Nyman e Hynninen, 2004).
No intuito de aumentar a seletividade tumoral e a absorção na região do
vermelho, reduzir a fotossensibilidade da pele depois do período de irradiação e
facilitar a solubilidade em meios fisiológicos, vários compostos vêm sendo
sintetizados para a aplicação em TFD(Chen , Li e Pandey, 2004; Nyman e
Hynninen, 2004; Pandey et al., 1996). Dentre estes compostos destacam-se os
derivados de pirofeoforbide, com diferentes tamanhos de grupos alcóxi (RO-, onde
R refere-se a grupos alquil). Estes compostos têm demonstrado que o aumento da
anfifilicidade pela adição do grupo alcóxi elevou a eficiência fotodinâmica do
pirofeoforbide, sendo os heptoxi derivados os mais eficientes. Grupos alcóxi
maiores reduziram a eficiência em razão do aumento do caráter hidrofóbico.
Wiehe et al. (Wiehe et al., 2002), ao sintetizarem uma série de derivados
tetrapirrólicos com estruturas similares ao Foscan
, mostraram que a substituição
Introdução
_____________________________________________________________________________________
18
de um grupo hidroxifenil por grupos alquílicos (hexa ou heptil) levou à localização
preferencial destes derivados na interface hidrofóbica/hidrofílica de lipossomas,
sugerindo que o aumento da anfifilicidade pode favorecer o acúmulo específico
dos fotossensibilizadores in vivo. Resultados semelhantes foram obtidos por
Rancan et al.(Rancan et al., 2005), os quais mostraram que as dihidroxiclorinas
sintetizadas a partir do Foscan
foram retidas diferentemente pelas células
linfoblastóides humanas da linhagem Jukart devido à variação da anfifilicidade.
N
N
N
N
O
OH
O
OCH
3
H
3
COOC
H
3
COOC
H
H
H
H
O
H
N
N
N
N
O
H
HO
H
O
(A) (B)
H
2
N O
H
O
O
H
2
N OCH
3
O
O
(C) (D)
Figura 6. Estrutura de fotossensibilizadores aprovados para aplicação clínica. (A)
Visudyne, (B) Foscan, (C) Levulan e (D) Metvix.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
19
I.5. Ftalocianinas como fármacos fotossensibilizadores em estudo na Terapia
Fotodinâmica.
Um dos problemas geralmente encontrados no uso dos derivados
porfirínicos diz respeito à sua absorção máxima de luz em comprimento de onda
na região de 600 nm, usualmente de baixa penetração nos tecidos
humanos(Anderson, 1983). Para solucionar tais problemas, têm surgido nos
últimos anos várias novas classes de agentes fotossensibilizadores. Entre eles
destacam-se os derivados de ftalocianinas(Brasseur , Quellet e LaMadeleine,
1999; Chan , Brasseur e LaMadeleine, 1997; Hu , Brasseur e Yildiz, 1998).
As ftalocianinas têm sido alvo de intensos estudos como
fotossensibilizadores de segunda geração desde meados da década de 80, uma vez
que apresentam uma alta seletividade, uma alta absorção nos comprimentos de
onda de 600 a 800 nm e uma baixa fototoxicidade. Estes compostos representam
uma extensão do sistema porfirínico, podendo ser facilmente preparados por
métodos sintéticos clássicos (embora nem sempre sejam fáceis de se purificar).
Elas são ainda eficientes geradoras de oxigênio singlete, apresentando bandas de
absorção ligeiramente deslocadas em direção ao infravermelho (ftalocianinas
monoméricas – banda de absorção no vermelho, banda Q), com maiores
coeficientes de extinção molar (λ ≅ 670 nm, ε ≅ 10
5
M
-1
cm
-1
).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
20
Algumas ftalocianinas são seletivamente retidas nos tecidos tumorais e são
resistentes à degradação química e fotoquímica. Produzem estados excitados
triplete de vida longa (na ordem de µs), com razoável eficiência sob iluminação.
As ftalocianinas mimetizam as porfirinas em seu macrociclo central, que
consiste em uma unidade cíclica tetrapirrólica (Figura 7). Contudo, nas
ftalocianinas, as subunidades pirrólicas são unidas por átomos de Nitrogênio,
enquanto nas porfirinas as subunidades são unidas via pontes de metileno. Além
disso, nas ftalocianinas, a conjugação do macrociclo é estendida por anéis
benzênicos sobre quatro unidades pirrólicas, resultando em uma forte banda de
absorção na região do vermelho do espectro visível, que como já mencionado
anteriormente, é a região do espectro mais útil no tratamento de tumores. Sendo
assim sua absorção máxima localiza-se em comprimentos de onda maiores que o
das porfirinas (aproximadamente 670 nm). A emissão de fluorescência das
ftalocianinas também se encontra na região do vermelho por volta de 670 nm.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
21
Figura 7. Estrutura química das metalo ftalocianinas.
As propriedades fotofísicas das ftalocianinas são fortemente influenciadas
pela presença e natureza do íon metálico central (Figura 7), o que é refletido nas
grandes variações no rendimento quântico do estado excitado triplete (φ
T
) e tempo
de vida do estado excitado triplete (τ
T
) das metalo ftalocianinas(Bonnet, 2000).
Podem ser encontrados vários relatos na literatura(Darwent et al., 1982) a respeito
da influência do íon metálico central das ftalocianinas sobre suas propriedades
fotofísicas. Os efeitos fotossensibilizadores nos sistemas biológicos envolvem
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T
1
) do fotossensibilizador, que
é formado via cruzamento intersistema do estado excitado singlete de vida curta
produzido inicialmente pela excitação do fármaco (Spikes, 1984b). Assim, um
bom fotossensibilizador deve ter um alto rendimento quântico do estado excitado
triplete e um tempo de vida apropriado desse estado(Phillips e O'Connor, 1984). A
Introdução
_____________________________________________________________________________________
22
complexação das ftalocianinas com íons metálicos diamagnéticos, tais como Zn
2+
,
Al
3+
e Ga
3+
, dá origem a complexos ftalocianínicos com alto rendimento quântico
do estado excitado triplete (φ
T
> 0,4) e com tempos de vida longos(Darwent et al.,
1982), e consequentemente, os complexos ftalocianínicos de alumínio e zinco (d
0
e d
10
, respectivamente) apresentam um apreciável rendimento quântico de
oxigênio singlete (Allen, 2001). Um fotossensibilizador ftalocianínico contendo
um metal diamagnético é mais adequado para uma fotossensibilização eficiente do
que um composto análogo contendo um metal paramagnético, pois este último
diminui o tempo de vida do estado excitado triplete, tornando o fotossensibilizador
inativo, como por exemplo o Cu(II), que é d
9
(Bonnet, 2000). Sendo assim, um
bom fotossensibilizador apresenta um estado excitado singlete de vida
relativamente curta (cerca de 3 à 8 ns), e um estado excitado triplete de vida longa,
que são produzidos em alto rendimento quântico(Daraio et al., 1991; Daraio ,
Aramendía e San Román, 1993; Foley et al., 1997; Xu et al., 1992; Xu et al.,
1999).
Portanto, as ftalocianinas e seus derivados encontram uma vasta aplicação
em medicina como fotossensibilizadores para a TFD. Estudos para aumentar sua
eficiência, aumentando o acúmulo preferencial e seletivo nos tecidos tumorais e
proporcionando intensa absorção na região do infravermelho próximo, estão em
estudo(Lukyanets, 1998; Lukyanets, 1999). Atualmente, há dois grupos principais
de ftalocianinas sob investigação na TFD: as ftalocianinas solúveis em água e as
ftalocianinas hidrofóbicas ou lipofílicas.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
23
Dentre as ftalocianinas solúveis em água, destacamos a Zinco ftalocianina
Introdução
_____________________________________________________________________________________
24
coroa, com potencial ação fotodinâmica, uma vez que a presença de tais grupos
aumenta a hidrofilicidade destes compostos. Além disso, tais ligantes formam
canais na membrana celular que alteram o equilíbrio homeostático da membrana
plasmática, permitindo com que outros processos de resposta celular sejam
alterados - o que chamamos de TFD sinérgica, um novo conceito em TFD
(Lunardi e Tedesco, 2006; Pelegrino et al., 2005; Rotta , Lunardi e Tedesco,
2003b).
I.6. Éteres de coroa.
Éteres de coroa são sistemas macrociclos conhecidos por mimetizarem
facilmente processos de reconhecimento biológico, mediando vários processos
químicos (Tsukube, 1990; Tsukube, 1992; Tsukube , Yamada e Shinoda, 2001).
Uma vez que os éteres de coroa apresentam a propriedade de atrair para a
proximidade da estrutura cíclicas muitos íons ou moléculas, estes sistemas atuam
usualmente como catalisadores, mimetizando vários sistemas
enzimáticos(Yamada et al., 1999). Esse fato tem tornado viável a sua investigação
nos fenômenos de transportes iônicos, uma vez que tais compostos apresentam
propriedades similares aos antibióticos macrociclos (Pedersen e Frensdorff,
1972).
Muitos antibióticos, tais como valinomicina (McMurray e Begg, 1959) e
nonctina (Prestegard e ChanSunney, 1970), exercem efeito biológico interessante,
pois influenciam o transporte de íons Na
+
e K
+
através da membrana celular, o
Introdução
_____________________________________________________________________________________
25
que é extremamente importante para a vida celular (Lehninger; Nelson e Cox,
1995). Praticamente cada célula animal mantém um equilíbrio homeostático dos
íons Na
+
e K
+
em relação ao seu meio circundante.
Este equilíbrio é estabelecido e mantido por um sistema de transporte
ativo na membrana plasmática, envolvendo enzimas do tipo Na
+
K
+
ATPase, que
acopla a quebra do ATP à movimentação simultânea dos íons contra seus
gradientes de concentração. Para cada molécula do ATP convertida em ADP e
fostato inorgânico, este transportador move dois íons K
+
para dentro e três íons
Na
+
para fora, através da membrana plasmática (Lehninger; Nelson e Cox, 1995).
Complexos desses cátions, como o macrociclo presente na valinomicina,
são responsáveis pela morte de células microbianas através do rompimento dos
processos de transporte secundário e as reações conservadoras de energia
(Lehninger; Nelson e Cox, 1995). A valinomicina (McMurray e Begg, 1959) é
um peptídio cíclico pequeno, que se dobra em volta dos íons K
+
e neutraliza sua
carga positiva. O peptídio age então como um vetor, transportando os íons K
+
através da membrana no sentido do gradiente de concentração.
Os éteres de coroa apresentam diferenças de especificidade para os
diferentes cátions de metais alcalinos. Os complexos sal-poliéter são formados
pela interação íon-dipolo entre o cátion e a carga negativa dos átomos de
oxigênio, que são simetricamente arranjados no anel do poliéter (Pedersen, 1968).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
26
Figura 8. Estrutura de éteres de coroa.
A estabilidade do complexo não é alcançada se o cátion for muito grande
para se ajustar à cavidade do éter de coroa. A seletividade indica que o poliéter de
quatro oxigênios é específico para os íons lítio, o poliéter de cinco oxigênios é
específico para o sódio e o de seis oxigênios, específico para o potássio (figura
8)(Pedersen e Frensdorff, 1972).
I.7. Porfirinas ligadas a éteres de coroa.
A síntese de derivados porfirínicos e de ftalocianínicos com éteres de
coroa tem sido estudada durante as últimas décadas (Michaudet , Richard e
Boitrel, 2000). O principal objetivo desenvolvido até o momento tem sido o de
construir ligantes de porfirinas ou ftalocianinas com os éteres de coroa, pois estas
estruturas exibiam interessantes propriedades eletroquímicas, elétricas e óticas
(vanVeggel , Verboom e Reinhout, 1994).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
27
A idéia de preparar éteres de coroa com funcionalização lateral tem
merecido atenção especial em vários segmentos da ciência (Nickon e Silversmith,
1987; Tsukube , Yamada e Shinoda, 2001).
Os sistemas vesiculares naturais ou artificiais, ordenados naturalmente
segundo o modelo do fluido mosaico, compostos por fosfolipídios e glicolipídos,
presentes na maioria das células animais, e sistemas biológicos, podem incorporar
facilmente proteínas, receptores, ionóforos, bem como inúmeras outras estruturas
supramoleculares, tanto na superfície como no interior das bicamadas lipídicas.
Quando estruturas análogas a éteres de coroas são associadas à dupla
camada lipídica em sistemas vesiculares, um canal molecular é espontaneamente
formado através da vesícula (figura 9) atuando diretamente no equilíbrio
homeostático iônico.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
28
Figura 9. Figura esquemática da formação de um canal na bicamada.
Interações entre tais agregados lipídicos e sistemas proteínas ou ionóforos
têm sido investigadas(Cristian, 1996; Lopes , Stark e Hong, 2001) e são
responsáveis por controlar a permeabilidade da membrana celular a vários
elementos e íons metálicos, alterando o metabolismo celular diretamente.
De acordo com modelos de ionóforos de Fyles (Fyles et al., 1993) e Lehn
(Pregel , Jullien e Lehn, 1992), que estudaram canais de cátions derivados de 18-
crown-6, os éteres de coroa são incorporados à vesículas de fosfolipídios, e
formam canais espontaneamente através da vesícula após sua incorporação.
Introdução
_____________________________________________________________________________________
29
Existem também numerosos estudos de canais de íons formados por
derivados de éteres de coroa, quando incorporados à peptídios(Otto , Osifchin e
Regen, 1999; Voyer e Robitaille, 1995). Estes autores relataram que os éteres de
coroa encontram-se incorporados aos poros do tubo. Nesta incorporação, os
lipídios ficam em uma linha perpendicular ao plano do éter. A estrutura do
nanotubo tem um extraordinário potencial, pois é capaz de formar os canais pela
associação de moléculas idênticas. Além disso, foi descrito que esta estrutura pode
adaptar-se à qualquer espessura de membrana (Hartgerink , Clark e Ghadiri,
1998).
Sendo assim, a ação destes éteres de coroa, associada aos sistemas
biológicos, em especial membranas celulares, fornece uma ferramenta adicional
do controle do metabolismo celular.
A incorporação do agente sensibilizador (fotoativo) em membrana
biológica parece ser bastante favorecida quando se utiliza o veículo adequado
como sistemas carregadores de drogas.
I.8. Uso da sonda fluorescente para monitorar a diferença de potencial de
membrana.
Na célula, a membrana biológica mantém uma diferença de potencial
entre as fases aquosas que ela separa. Essa diferença de potencial está envolvida
em uma série de funções da membrana, por exemplo: transporte ativo de
solutos(Wilson, 1978) e regulação do volume da célula(Jakobsson, 1980).
Introdução
_____________________________________________________________________________________
30
Estudos mostraram que a ação fotodinâmica provoca mudanças na
membrana e indicaram que as células sofreram um desequilíbrio da homeostase
dos íons sódio, potássio e cálcio, o que possivelmente leva a um dano no
transporte de proteínas da membrana plasmática, e por último a um stress
osmótico(Specht e Rodgers, 1990a; Specht e Rodgers, 1991b).
Sendo assim, uma parte dos estudos da presente tese de doutorado está
diretamente relacionada ao uso de sondas fluorescentes para monitorar a
distribuição de íons através da membrana plasmática(Cheung , Solonenko e
Busch, 2003; Yamamoto , Nagano e Okura, 2003). Esses estudos tornam-se
Introdução
_____________________________________________________________________________________
31
ou sondas de resposta rápida, dependendo do mecanismo de resposta e estrutura
química da mesma(Plásek e Sigler, 1996).
Existe uma diferença fundamental entre essas duas famílias distintas de
sondas, sendo que cada tipo possui características específicas para os mecanismos
de resposta à variação do potencial elétrico trans-membrana, atuando diretamente
sobre a resposta, medida espectrofluorimetricamente.
Sondas de resposta rápida são adequadas para respostas mais rápidas de
variação de potencial que ocorrem em nervos e músculos(Cohen e Salzberg,
1978); as sondas fluorescentes de resposta lenta podem atravessar a membrana em
segundos. Isso permite com que as mesmas se acumulem de uma forma
relativamente rápida em várias células (Waggoner, 1976; Waggoner , Sirkin e
Tolles, 1975), e assim como outros íons permeáveis presentes na membrana,
podem se deslocar através da mesma até alcançarem um equilíbrio eletroquímico.
Sob tais condições, seu gradiente de concentração entre a fase aquosa dos
dois lados da membrana celular obedece à equação de Nernst (Rottenberg, 1979).
As células hiperpolarizadas apresentam um aumento intracelular na concentração
da sonda, o que leva a um acúmulo da mesma no interior da célula, ao passo que
um efeito oposto, ou seja, a despolarização, leva ao decréscimo da concentração
da sonda no interior da célula.
Devido à variação na quantidade da sonda no interior da célula pode-se
monitorar a variação de potencial elétrico trans-membrana. A intensidade de
fluorescência da sonda é, em geral, afetada por dois fenômenos físicos: i)
Introdução
_____________________________________________________________________________________
32
formação de dímeros não fluorescentes, que ocorre devido ao aumento da sonda
no citossol, e ii) mudança no espectro de emissão e absorção devido à ligação da
sonda à macromoléculas do citossol e às membranas de organelas celulares.
Nos estudos referentes à influência dos ligantes éter de coroa no potencial
elétrico trans-membrana, foi escolhida a sonda bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, que é uma sonda que não se acumula na mitocôndria,
e é seletiva para o monitoramento do potencial elétrico trans-membrana da
membrana plasmática (Plásek e Sigler, 1996).
I.9. Sistemas de liberação de fármacos.
Uma outra grande linha de estudo na área de TFD se concentra nos
estudos relacionados à administração e biodistribuição dos corantes
fotossensibilizadores nos diferentes sistemas biológicos(Dougherty, 1995;
Dougherty e Potter, 1991; Henderson e Dougherty, 1992; Nunes, S. M. T., 2003;
Nunes , Sguilla e Tedesco, 2004b) com o intuito de torná-los mais específicos na
retenção e distribuição pelos tecidos carcinogênicos, baseada no uso do sistema
de liberação do fármaco.
Tecidos tumorais são altamente heterogêneos e compartimentalizados,
onde o fotossensibilizador pode possuir diferentes propriedades (Jori, 1996).
Portanto, parece importante que a abordagem destes problemas se inicie através
do uso de sistemas mais simples que os biológicos, sistemas estes que mimetizam
Introdução
_____________________________________________________________________________________
33
ao máximo as situações específicas que ocorrem in vivo, com a finalidade de
definir a influência de parâmetros específicos na determinação da eficiência
fotossensibilizadora total.
Dentre os sistemas sintéticos que mimetizam sistemas biológicos e que
Introdução
_____________________________________________________________________________________
34
fotodinâmica. A produção conjunta de espécies reativas de oxigênio (oxigênio
singlete e ânion radical superóxido), com concomitante alteração na homeostase
intracelular de íons como sódio, potássio e cálcio, deve sem dúvida induzir uma
resposta mais agressiva do sistema biológico, facilitando o processo apoptótico.
Objetivos
_____________________________________________________________________________________
34
II. Objetivos
Tendo em vista a possibilidade do éter de coroa alterar o sistema
homeostático e assim maximizar a ação fotodinâmica e facilitar o processo
apoptótico, idealizamos como objetivos deste Doutorado:
• Realizar estudos fotoquímicos e fotofísicos no estado estacionário e
resolvido no tempo, para os derivados porfirínicos de éteres de coroa em meio
homogêneo orgânico e em meio micro heterogêneo lipossomal;
• Determinar a taxa de incorporação destes fármacos em linhagem de
macrófagos neoplásicos J774-A1;
• Realizar experimentos de toxicidade na ausência e presença de luz com os
diferentes fármacos fotossensibilizadores (ZnC
4
P, H
2
C
4
P TPP) em meio
lipossomal e em meio de cultura celular de macrófagos neoplásicos J774-A1;
• Avaliar a alteração da homeostase intracelular de íons Na
+
durante
processo de hiperpolarização na presença dos fármacos fotossensibilizadores
ZnC
4
P, H
2
C
4
P;
•Analisar o efeito do éter de coroa 6-crown-18 no processo de
despolarização da membrana plasmática, utilizando a sonda de resposta lenta
diSBA-C
2
;
• Realizar estudos com a zinco ftalocianina (ZnPc) e o éter de coroa 6-
crown-18, em suspensão lipossomal;
Objetivos
_____________________________________________________________________________________
35
• Quantificação da diferença de potencial elétrico transmembrana,
utilizando a sonda de resposta lenta bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbiturico) trimetina
oxonol, diSBA-C
2
, in vitro.
Os seguintes fármacos foram estudados: 5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-
pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro)fenil]porfirina
(H
2
C
4
P), Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-2-
aminometil)- 2,3, 5,6-(tetrafluoro)fenil]-porfirinato (ZnC
4
P) (figura 10). Esses
fármacos foram preparados pelo grupo da Prof
a
. Marilda das Dores Assis,
desenvolvendo trabalho de colaboração. E Zinco Ftalocianica (ZnPc) da Aldrich.
Figura 10. Estrutura da Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-
pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)- 2,3, 5,6-(tetrafluoro)fenil]-porfirinato
(ZnC
4
P).
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
36
III. Parte Experimental
III.1.Materiais
Todas as soluções aquosas foram preparadas com água ultra pura, obtida
através de filtragem sequêncial com colunas de troca iônica em um sistemas E-
Pure da Barnestead D 3750, com filtragem final em membrana de 0,2 µm de
diâmetro, pressão máxima de operação em 50 psi (3,4 Kg/cm
2
) e resistividade de
18 mΩ.
O fármaco 5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-2-
aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro)fenil]porfirina (H
2
C
4
P), e o Zn(II)5,10,15,20-
tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)2,3,5,6-
(tetrafluoro)fenil]-porfirinato (ZnC
4
P) foram preparados pelo grupo de bio-
inorgânica coordenado pela professora Marilda das Dores Assis do Departamento
de Química da FFCLRP-USP, que conta com o apoio da FAPESP, e desenvolve
trabalho de colaboração com nosso grupo de pesquisa.
Os materiais relacionados abaixo foram utilizados sem tratamento prévio:
L-α- dipalmitoil fosfatidilcolina-DPPC (Sigma Chemical Company),
lisofosfatidilcolina (Aldrich), zinco ftalocianina-ZnPC (Aldrich), bis-(ácido 1,3-
dietiltiobarbitúrico) trimetina, diSBA-C
2
, (Molecular Probe), 2-(Hidroximetil)-18-
crown-6 (Aldrich), Tetrafenilporfirina (TPP, Aldrich). Os solventes de grau
analítico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento prévio:
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
37
dimetilformamida-DMF (Sigma), dimetilsulfóxido-DMSO (Sigma), etanol
(Merck), isopropanol (Merck).
Além destes materiais, encontram-se à disposição diferentes solventes
orgânicos, bem como outros sais inorgânicos normalmente usados em laboratório.
Os estudos envolvendo culturas de células foram realizados com a
linhagem neoplásica de macrófagos J774-A1 (American Type Culture Collection,
ATCC). Essas células plasmáticas linfáticas foram obtidas originalmente de ratos
DBA/2. A indução deste tipo de neoplasma (câncer linfótico) foi feita,
normalmente, pela injeção de metilcolantreno na cavidade toráxica de ratos. A
remoção do fluido, presente na cavidade após dois dias e a transfusão para outros
animais garante a proliferação deste tipo de células. Os estoques primários
cultivados em laboratório, a partir das matrizes animais, foram analisados e
comercializados pela American ATCC.
Os materiais referentes às culturas celulares foram: meio de cultura
dulbelcco mem (DMEM) (Cultilab), antibiótico (Antibiotic/Antimycotic-Gibco
BRL), L-glutamina (200 mM-Gibco BRL), bicarbonato de sódio (Nuclear),
Hank´s (Gibco BRL), 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium
(MTT, Sigma), corante azul de tripan (Gibco BRL), glicose (Sigma), cloreto de
sódio (NaCl, Nuclear), cloreto de potássio (KCl, Nuclear).
O soro bovino fetal (SBF) adquirido junto a Gibco BRL apresenta em sua
composição básica insulina, hormônios e vários outros fatores de crescimento.
Essa solução estoque foi pré-aquecida a 56°C para inativação das enzimas e, em
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
38
seguida, dividida em alíquotas de volumes fixos de 10,0 mL, conservados no
freezer a -20°C.
Além destes materiais, estão à disposição diferentes solventes orgânicos,
bem como outros sais inorgânicos comumente utilizados em laboratório.
III.2. Preparações
As soluções de tampão Hank´s foram rotineiramente preparadas pela
diluição 10 vezes em água ultrapura, seguida de filtração com membrana estéril de
poro de 0,22 µm.
As soluções estoques de ZnC
4
P, H
2
C
4
P, TPP, em solução de DMSO, foram
armazenadas na ausência de luz a - 20
o
C por um período não superior à duas
semanas.
Para os experimentos em meio homogêneo, foram realizadas soluções no
meio em estudo a partir de uma solução estoque inicial do fármaco
fotossensibilizador em DMSO com concentração 3 mM.
As soluções estoques de zinco ftalocianina (ZnPc) preparadas em uma
mistura de DMSO/DMF (1:1) (absoluto) foram armazenadas por um período não
superior à duas semanas, na ausência de luz a - 20
o
C.
Todas as formulações lipossomais de DPPC foram preparadas pelo método
de injeção, conforme descritos na seção Métodos III.4.1.7, e armazenadas na
ausência total de luz à temperatura ambiente, por até duas semanas.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
39
As concentrações finais da ZnPc, nas soluções utilizadas nos estudos, foram
determinadas espectrofotometricamente, utilizando-se os coeficientes de extinção
molar em 674 nm (ε = 2,41 x 10
5
M
-1
cm
-1
) em DMSO/DMF e em suspensões
lipossomais e em 666 nm (ε = 2,42 x 10
5
M
-1
cm
-1
) em etanolOliveira, D. M.,
(2006). Para as porfirinas, utilizaram-se os seguintes coeficientes de extinção
molar para ZnC
4
P em 422 nm (ε = 1.23 × 10
5
M
-1
) e para H
2
C
4
P em 420 nm (ε =
1,5 × 10
5
M
-1
) em etanol (Pelegrino et al., 2005).
Para o cultivo da linhagem J774-A.1, foi utilizado o meio DMEM,
constituído de uma mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e
outros componentes essenciais para o crescimento celular, atuando como uma
solução nutritiva. Esse meio foi destinado à cultura de células humanas e de outros
animais. O meio DMEM foi adquirido na forma desidratada. Esse meio foi
preparado em 1,0 L de água ultrapura, pela adição do conteúdo do envelope,
acrescido de 2,0 g de bicarbonato de sódio.
Ao final da adição de todos os componentes, esse meio foi filtrado,
utilizando-se uma membrana de 0,22 µm em capela de fluxo e um sistema de
filtragem autoclavável da Corning. Posteriormente, esta solução foi distribuída em
11 garrafas de vidro estéreis, contendo cada uma 90,0 mL de DMEM, sendo que
antes da sua utilização, foram adicionados às mesmas 10,0 mL de soro bovino
fetal para obtenção do meio completo, 1,0 mL de antibiótico.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
40
A solução de azul de tripan foi preparada na concentração estoque de 0,4%,
utilizando-se como solvente o tampão Hank’s (pH = 7,4); tal solução foi filtrada,
utilizando-se membrana de 0,22 µm. A seguir, alíquotas de 1,0 mL foram
transferidas para um ependorff e conservadas sob refrigeração em temperatura de
2-8° C.
III.3. Aparelhagem
Nos estudos espectrofotométricos foram utilizados os espectrofotômetros
de absorção modelo Lambda 20 da Perkin Elmer e U300 da Hitachi, e os
espectrofluorímetros modelo Fluorog 3 da Spex e F4500 da Hitachi, todos com
controle de temperatura e agitação magnética.
Para as medidas de decaimento de fluorescência, foi utilizado o método de
contagem simples de fótons.O sistema utilizado para excitação consiste em um
conjunto de lasers. No início do processo, um laser de diodos, com dois feixes
emitindo em 809 nm, cada qual com 24 W de potência, bombeia um laser de
estado sólido (Nd:YVO
4
- Millenia Xs - Spectra Physics) que emite em 1064 nm.
O feixe passa então por um cristal dobrador de freqüências e o feixe final, com
potência podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm, bombeia
um laser de titânio-safira (Tsunami - Spectra Physics); o cristal de titânio-safira
gera pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 até 1080
nm, com freqüência máxima de repetição dos pulsos igual a 82 MHz. Um filtro bi-
refringente seleciona o comprimento de onda desejado.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
41
Após o selecionador de pulsos, o feixe passa por um gerador de segundos e
terceiros harmônicos, cujos comprimentos de onda do feixe na saída estão na faixa
utilizada para excitação de nossas amostras, que vai de 280 até 330 nm. O sinal
detectado como pulso de excitação, chamado IRF (instrument response function),
tem largura total a meia altura de 60 ps.
A fonte de irradiação utilizada nos experimentos de determinação do
espectro de absorção do transiente e tempo de vida triplete dos fármacos
fotossensíveis foi um sistema laser Nd-YAG da Continuun, modelo SURELIT I-
10. Como fonte de excitação, utilizou-se o terceiro harmônico do laser (355 nm).
A energia média utilizada foi da ordem de 30 mJ por pulso, através de uma fenda
de 8,0 mm de diâmetro. À uma distância de 10 cm da fenda do laser, foi
posicionado um suporte para celas termostatizável com agitação magnética
(Hellman CUV-O-Stir).
A intensidade da luz foi determinada antes e após o conjunto de pulsos por
um “Power Meter” (Field Master da Coherent), usando uma cabeça de detecção
LM-30 V, posicionado a partir do suporte para celas. Os sinais dos transientes
gerados foram detectados pela fotomultiplicadora e transferidos para um
osciloscópio digital (Tektronix modelo TDS 340A), sendo armazenados em um
computador. A análise final dos dados obtidos foi realizada utilizando-se o
software fornecido pela Edinburg Instruments.
A mesma fonte de irradiação foi utilizada para a determinação do
rendimento quântico de produção de oxigênio singlete. Neste caso, a energia
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
42
média utilizada foi da ordem de 50 mJ por pulso. O sinal de emissão de
fosforescência do oxigênio singlete foi identificado em 1270 nm utilizando-se um
detector de germânio da North Coast Scientific Corporation, modelo 823A, e
transferido para o osciloscópio digital. Um filtro de silicone foi usado para evitar
qualquer sinal de fluorescência interferindo com as medidas de oxigênio singlete.
Os dados obtidos foram processados e analisados utilizando-se o software
operacional do próprio equipamento.
Nos estudos envolvendo preparações lipossomais pelo método de injeção,
foi utilizada uma bomba de injeção peristáltica da World Precision Instruments
(WPI) (modelo SP 100i).
Nos estudos do potencial zeta e de tamanho das partículas, foi utilizado o
equipamento Zetasizer Nano system ZS da Malvern-UK, o qual possui um laser de
He-Ne de 4 mW que opera no comprimento de onda de 633 nm, permitindo
realizar medidas não invasivas por “backscatter optics” (NIBS) e possuindo a
capacidade de determinar tamanho de partículas no intervalo de 2 nm a 3 µm. As
medidas foram realizadas num ângulo de detecção de 173º e a posição da medida
na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento. O
equipamento realiza em média 12 determinações para cada análise.
Os trabalhos em cultura de células foram realizados em capela de fluxo
laminar, modelo A152 da Veco, esterilizada com luz germicida e fluxo contínuo
de ar. Foram também utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e
crescimento celular: microscópio invertido CK2 da Olympus (para análise da
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
43
forma, tamanho e crescimento de cultura), microscópio convencional e de
fluorescência, modelo BX-50 da Olympus, centrífuga refrigerada, modelo 5810 R
da Eppendorf e banhos termostatizáveis Fischer Scientific, modelo 801.
Nos estudos de fototoxicidade, empregou-se como fonte de luz um sistema
do tipo foto-polimerizador (Dabi-Atlante) de uso rotineiro em procedimentos
odontológicos. O sistema foto-polimerizador foi acoplado a um filtro óptico
(Eikonal Instrumentos) que permite a transmissão de uma faixa selecionada de
comprimento de onda. Para os estudos envolvendo os fotossensibilizadores TPP,
ZnC
4
P e H
2
C
4
P, o filtro utilizado permite a passagem de radiação com
comprimento de onda entre 400 e 500 nm, que é a faixa de comprimento de onda
em que ocorre a máxima absorção de radiação por estes fotossensibilizadores. A
intensidade de luz foi determinada por um “Power Meter”(Field Master da
Coherent), usando uma cabeça de detecção LM-3. A intensidade da luz utilizada
foi de 1, 3 e 5 Jcm
-2
.
Além destes equipamentos foram utilizados: balança eletrônica Libror
(modelo AEL 200), sistema vortex Genie 2, ultrason Branson (modelo 2210), pH-
metro (modelo accument
®
50 da Fisher Scientific).
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
44
III.4. Métodos
III.4.1 Estudos espectroscópicos.
III.4.1.1 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnC
4
P, H
2
C
4
P,
TPP e da ZnPc em meio orgânico.
A investigação das propriedades espectroscópicas no estado estacionário da
ZnC
4
P, H
2
C
4
P e ZnPc em meio orgânico foi baseada em medidas diretas dos
espectros de absorção e de emissão de fluorescência.
Os espectros de absorção foram registrados em uma cela de quartzo de 1cm
de caminho ótico, utilizando-se como referência o meio em estudo, na ausência
das ZnC
4
P, da H
2
C
4
P e da ZnPc. Tais espectros foram registrados para os
fotossensibilizadores ZnC
4
P, da H
2
C
4
P e da ZnPc em meio orgânico.
Os espectros de emissão de fluorescência fotoestacionária foram
registrados na faixa de 630 a 750 nm, com excitação fixa em 428nm para ZnC
4
P,
424 para H
2
C
4
P nm, 418 nm para TPP e 610 nm para ZnPc em cela de quartzo de
1 cm de caminho óptico.
III.4.1.2 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
ΦΦ
ΦF) da
ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em etanol.
Uma solução de 5,10,15,20-tetrakis(4-N-Metilpyridil)porfirina (TMPyPH
2
)
e de tetrafenilporfirina (TPP) em meio orgânico foi preparada inicialmente, de
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
45
modo a obter uma absorbância constante na faixa de 0,03, utilizada como padrão.
As soluções contendo os fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P em etanol foram
preparadas de modo a obter absorbâncias da ordem de 0,04, evitando assim que o
efeito de filtro interno interfirisse no resultado.
Os rendimentos quânticos de fluorescência (Φ
F
) foram obtidos através do
cálculo da área do espectro de emissão de fluorescência corrigido da solução de
TPP (Φ
F
= 0,13, λ
exc
= 425 nm) e TMPyPH
2
(Φ
F
= 0,07, λ
exc
= 420 nm) em
benzeno e metanol respectivamente, na faixa de 630 – 750 nm (Eaton, 1988;
Magde, 1979).
Assim, foram obtidos os valores de Φ
F
, registrando-se os espectros de
absorção do padrão (TMPyPH e TPP em meio orgânico), bem como os espectros
de emissão de fluorescência corrigidos, tanto para o padrão como das soluções
preparadas nos meios considerados, utilizando-se o método relativo. Este método
relaciona o rendimento quântico de fluorescência de cada composto com o
rendimento quântico de fluorescência do padrão, de acordo com o formalismo
descrito por Demas e Crosby (Demas e Crosby, 1971a).
Φ
ΦΦ
ΦF = (Ax/A(p)).(DO(p)/DOx).(n(p)2/n x2). Φ
ΦΦ
ΦF (p) Equação 1
onde os subscritos x e p são referentes à amostra e ao padrão, respectivamente. A é
a área do espectro de emissão de fluorescência corrigido, DO é a densidade óptica
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
46
no comprimento de onda de excitação, n é o índice de refração do meio e Φ
F
é o
rendimento quântico de fluorescência.
III.4.1.3 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnC
4
P e para
H
2
C
4
P em meio orgânico.
Os tempos de vida de fluorescência da ZnC
4
P (5,0 µM) e da H
2
C
4
P (5,0
µM) em meio orgânico (etanol) foram obtidos pela técnica de contagem de fótons.
À cada cela de quartzo de 1 cm, foram adicionadas alíquotas 3,0 mL das
soluções de estudo contendo o fotossensibilizador.
O comprimento de onda de excitação e de emissão utilizado para a ZnC
4
P
foi de 434 nm e 652 nm respectivamente, e para H
2
C
4
P foi de 428nm e 713nm
respectivamente. Para cada medida de decaimento foram coletadas em média 8000
contagens.
As medidas foram realizadas utilizando-se como fonte de excitação um
diodo laser que bombeia um laser de estado sólido (Nd:YVO
4
- Millenia Xs -
Spectra Physics), passando depois por um cristal dobrador de freqüência. Assim,
feixe final, com potência podendo chegar a 10 W e comprimento de onda 532nm,
bombeia um laser de titânio-safira (Tsunami - Spectra Physics); o cristal de
titânio-safira gera pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de
840 até 1080 nm, com freqüência máxima de repetição dos pulsos igual a 82 MHz,
com agitação e termostatização contínua. As curvas de decaimento de
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
47
fluorescência foram analisadas utilizando-se o software operacional do próprio
instrumento. Os ajustes foram validados através do valor mínimo na função chi-
quadrado (χ
2
).
III.4.1.4 Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes dos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P em
meio orgânico (etanol) foram estudados e gerados por fotólise por pulso de laser.
As soluções de trabalho foram preparadas de maneira a apresentarem uma
absorção igual a 0,3 no comprimento de onda de excitação da amostra (355nm).
Os experimentos foram realizados utilizando-se como fonte de excitação o
terceiro harmônico (355 nm) do laser de Nd-YAG modelo SURELITE I-10 da
Continuum., como descrito anteriormente na sessão III.3.
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorção máxima
do transiente gerado e para a determinação do tempo de vida triplete do mesmo foi
de 460 nm. A escala de tempo foi ajustada de modo a registrar o decaimento de
espécies com tempos de vida entre 2 µs e 5 µs.
Como resposta do sistema de laser computadorizado, foi obtido um gráfico
de decaimento experimental, ou seja, da variação da densidade óptica em função
do tempo, bem como a curva teórica que melhor simulava o decaimento
observado.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
48
III.4.1.5 Estudos para a determinação do rendimento quântico de produção
do oxigênio singlete (Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
) da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em meio orgânico.
A determinação do rendimento quântico de produção do oxigênio singlete
(Φ
∆
) pode ser realizada por 2 métodos, diretos e indiretos. Os métodos diretos
envolvem as medidas resolvidas no tempo. Por outro lado, os métodos indiretos se
baseiam em medidas de consumo de um substrato oxidável, realizadas no estado
estacionário (Corey , Mehrotra e Khan, 1987). Embora a fosforescência do
oxigênio singlete (
1
O
2
) seja muito baixa na maioria dos solventes, o emprego de
detectores de alta sensibilidade, algumas vezes resfriados a 77K, tem tornado
possível a sua detecção direta. Um exemplo disso é a utilização de fotodiodos de
germânio, de alta resolução, acoplados a amplificadores operacionais capazes de
captar sinais da ordem de microsegundos ou menos. Isso permite com que o tempo
de vida do
1
O
2
(τ
∆
) em muitos solventes seja medido com precisão através do seu
decaimento na região do infravermelho próximo.
Analisou-se a eficiência quântica de geração de
1
O
2
para os FS em meio
orgânico (etanol). As soluções possuíam a mesma intensidade de absorção em 355
nm (Abs = 0,3) sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigênio por
30 minutos. Uma solução de feoforbide-a, com as mesmas características das
soluções que continham as amostras, foi utilizada como amostra padrão (Φ
∆
=
0,59)(Arbogast, 1991). Na detecção do φ
∆
utilizou-se o método fotofísico, que
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
49
1270nm , empregando-se o sistema resolvido no tempo (E.A.I. – LP 900, pulsado
com um laser Nd:YAG a 355 nm, com um detector de germânio da North Coast
Scientific Corporation, modelo 823 A), item III.3. A potência do laser de Nd:YAG
utilizado na detecção do φ
∆
produzido pela ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio orgânico foi
de 30 mJ por pulso. A intensidade máxima de fosforescência no tempo t=0 foi
determinada pelo método relativo com base na equação 4, conforme descrito por
Arbogast (Arbogast, 1991).
∆
∆
∆∆
Φ=Φ
τ
τ
Ref
Ref
Ref
I
I
**
Equação 2
na qual I
ref
é a intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido pelo
composto padrão, I é a intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido
pela amostra, Φ
∆ref
é o rendimento quântico de produção de
1
O
2
produzido pela
referência, τ
∆ref
é o tempo de vida do
1
O
2
produzido pela referência e τ
∆
é o tempo
de vida do
1
O
2
produzido pela amostra.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
50
III.4.1.6 Determinação do Rendimento Quântico de Formação do Estado
Triplete dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P.
O rendimento quântico do estado triplete (Φ
T
) foi estudado por flash
fotólise(Ermolenko , Delaire e Giannotti, 1997) para os fármacos
fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P em solução etanólica. Os experimentos foram
realizados utilizando-se como fonte de excitação no terceiro harmônico (355 nm)
do laser de Nd-YAG modelo SURELITE I-10 da Continuum, descrito no item
III.3.
Para ambos os fármacos fotossensibilizadores, o Φ
T
foi determinado
relativamente ao padrão TPP (Φ
T
= 0,8, ∆ε
Т
= 35000 Lmol
-1
cm
-1
a 450 nm em
tolueno)(Dupuis et al., 1999); (Ermolenko , Delaire e Giannotti, 1997).
No procedimento experimental, as concentrações das amostras e do padrão
foram ajustadas de modo que a absorbância fosse de 0,3 no comprimento de onda
de excitação (355 nm), e as soluções dos fármacos foram desaeradas pelo
borbulhamento de nitrogênio durante 30 minutos. O borbulhamento do nitrogênio
é necessário porque o oxigênio molecular pode atuar como um supressor do estado
excitado triplete. Então, os espectros de absorção do transiente foram
determinados ponto a ponto no intervalo entre 300 e 800 nm. O espectro de
absorção do transiente obtido para cada fármaco foi, então, corrigido para a
obtenção do espectro real do transiente, através da equação 3:
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
51
FT
A
A
)
t
(
A
α
+
=
∆
Equação 3
em que A
T
é a absorção triplete, A
F
é a absorção no estado fundamental e α refere-
se à fração de espécies excitadas no estado triplete. O valor de α é tal que, quando
introduzido na Equação 2, observa-se a supressão das absorbâncias negativas
observadas nas faixas de comprimento de onda equivalentes às bandas de absorção
no estado fundamental do fármaco. O novo espectro de absorção obtido é
conhecido como espectro de absorção real do transiente. O conhecimento do α é
fundamental para o cálculo da absortividade molar do estado triplete (ε
T
) do
fármaco (utilizado no cálculo de Φ
T
), que faz uso da equação 4:
)(A
)
(
A
)(
)
(
F
T
F
T
λα
λ
=
λε
λ
ε
Equação 4
em que ε
F
é o coeficiente de absortividade molar no estado fundamental num
comprimento de onda (λ).
O rendimento quântico de formação do estado triplete para os fármacos foi
estimado registrando-se os decaimentos das espécies triplete geradas como uma
função da energia de excitação (5, 7, 10, 15 e 50 mJ) e determinando-se a
intensidade máxima de absorção do transiente. O comprimento de onda utilizado
para monitoramento da absorção máxima do transiente gerado e para a
determinação do tempo de vida triplete do mesmo foi de 460 nm. A escala de
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
52
tempo foi ajustada de modo a registrar o decaimento de espécies com tempos de
vida entre 2 µs e 5 µs.
O gráfico de absorbância triplete como função da energia é linear e a
inclinação da reta obtida (∆A) é uma função do produto entre o ε
T
e o Φ
T
:
T
T
x
A
Φ
ε
=
∆
Equação 5
Então, o rendimento quântico de formação do estado triplete para as
amostras pode ser estimado relacionando-se o seu valor obtido de ∆A com aquele
obtido para o padrão(Dupuis et al., 1999). O rendimento quântico triplete foi então
determinado através da seguinte equação 6(Amand e Bensasson, 1975):
padrão
FT
padrão_T
amostraFTamostra_T
padrão
amostra
)(
)
(
A
A
ε−εΦ
ε
−
ε
Φ
=
∆
∆
Equação 6
III.4.1.7 Preparação da ZnC
4
P, da H
2
C
4
P e da ZnPc concomitante ao éter de
coroa em meio lipossomal.
Os fármacos ZnC
4
P, H
2
C
4
P e ZnPc foram incorporados aos lipossomas L-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina ( DPPC 0,70 mM) e foram preparados pelo método
de injeção conforme descrito por Nunes e colaboradores(Nunes , Sguilla e
Tedesco, 2004b).
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
53
Uma solução etanólica de 0,300 mL contendo 93.3 mM de L-α-
fosfatidilcolina, 0.19 mM lisofosfatidilcolina e 80 µM do fármaco em estudo foi
injetada por uma bomba peristáltica de adição controlada sobre uma solução
tampão Hank’s pH 7,4 contida numa jaqueta termostatizada (volume final de 4,0
mL).
A solução tampão estava contida em um recipiente cilíndrico de 2,0 cm de
diâmetro e a injeção foi realizada à aproximadamente 2,5 cm abaixo da superfície
líquida. A injeção foi realizada a 57
o
C sob agitação magnética na ausência de luz e
com uma velocidade de 1,0 µL/s (360 µL/h).
Figura 11. Figura esquemática da preparação dos lipossomas.
A concentração das porfirinas em meio lipossomal foi estimada
espectroscopicamente usando os respectivos coeficientes de absortividade ε = 1.23
× 10
5
M
-1
para ZnC
4
P, ε = 1,5 × 10
5
M
-1
para H
2
C
4
P em meio etanólico, de ε =
2,41 x 105 M-1cm-1 para ZnPc em DMSO/DMF. O espectro de absorbância e o
espectro de fluorescência foram obtidos através do espectrofotômetro Hitachi U-
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
54
3000 e do Spex Fluorog 3 (Jobin-Ivon) respectivamente, a 25°C e sob agitação
magnética.
Paralelamente, foram preparados lipossomas vazios (sem adição de corante)
com o objetivo de usá-los como referência nos estudos espectroscópicos. Após
cada preparação lipossomal, foi registrado o espectro de absorção do fármaco
fotossensibilizador incorporado ao lipossoma a fim de se verificar a eficiência da
incorporação e a ausência de formação de agregados superiores. Além da
determinação de seus parâmetros fotofísicos, a ZnC
4
P, H
2
C
4
P e ZnPc incorporadas
aos lipossomas também foram caracterizadas de acordo com o tamanho das
vesículas. O diâmetro médio das partículas foi calculado com base em medidas de
espalhamento de luz.
III.4.1.8 Estudos do tamanho de partícula e Potencial Zeta da ZnC
4
P, H
2
C
4
P
e ZnPc e 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 em meio lipossomal.
Realizamos um estudo do tamanho das partículas lipossomais formadas e
do potencial Zeta, com o intuito de averiguar a estabilidade fisico-química e a
viabilidade destas preparações quanto à homogeneidade no tamanho das
partículas, bem como a influências dos agentes formadores dos sistemas (ZnPc, 2-
(Hydroxymethyl)-18-crown-6, DPPC, lisofosfatidilcolina); (ZnC
4
P, DPPC,
lisofosfatidilcolina); (H
2
C
4
P, DPPC e lisofosfatidilcolina) em suas propriedades
físico-químicas.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
55
A intensidade, a polarização e a distribuição angular da luz espalhada por
uma dispersão coloidal dependem do tamanho e da forma das partículas que
provocam o espalhamento, das interações entre essas partículas e das diferenças
entre os índices de refração das partículas e do meio. Assim, medidas de
espalhamento de luz podem ser de grande valor na determinação do tamanho e da
forma das partículas.
A amplitude total da luz espalhada por uma partícula é proporcional ao
número de fontes individuais de espalhamento existentes na partícula, isto é,
proporcional ao seu volume (tamanho) e também à massa. Assim, através de
medidas de espalhamento de luz pode-se determinar o tamanho das partículas e a
distribuição de tamanhos na solução lipossomal.
Também determinamos o tamanho das partículas coloidais para os sistemas
com presença do fármaco fotossensibilizador H
2
C
4
P e ZnC
4
P.
A técnica de determinação do tamanho a partir do diâmetro hidrodinâmico
de partículas por espalhamento de luz se baseia na análise do movimento
Browniano de partículas, que é representado por uma função de correlação (G)
com decaimento exponencial, conforme descrito pela equação 7.
G(τ) = A [1+B exp (-2Γτ)] Equação 7
Onde A é a linha de base, B é o intercepto para a função de correlação, Γ
ΓΓ
Γ =
Dq
2
, sendo D o coeficiente de difusão translacional, q = (4 π n / λ
o
) sin (θ / 2),
sendo n o índice de refração da solução, λ
λλ
λ
o
,
o comprimento de onda do laser, θ
θθ
θ, o
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
56
ângulo da luz espalhada e τ
ττ
τ, o tempo em segundos gasto para se determinar a
curva de correlação.
O tamanho médio é então calculado a partir da função de correlação
utilizando-se vários algoritmos presentes no software do equipamento. Em nosso
trabalho utilizamos o algoritmo CONTIN, mais satisfatório para distribuições
dentro do intervalo de tamanho esperado.
As partículas que compõem uma solução adquirem uma carga em contato
com um líquido que adquire uma carga elétrica em sua superfície. Essa carga pode
aparecer de várias maneiras - a dissociação de grupos iônicos na superfície da
partícula e a adsorção diferencial de íons da solução na superfície da partícula.
A carga líquida na superfície da partícula afeta a distribuição de íons na sua
vizinhança, aumentando a concentração de contra-íons junto à superfície. Assim,
forma-se uma dupla camada elétrica na interface da partícula com o líquido.
Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região interna que inclui
íons fortemente ligados à superfície e uma região exterior onde a distribuição dos
íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico.
Dessa forma, o potencial nessa região decai com o aumento da distância da
superfície até uma distância suficientemente grande atingir o potencial da solução.
Esse potencial é convencionado como potencial zero.
Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons
mais fortemente ligados à mesma se movem como uma unidade, e o potencial no
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
57
plano de cizalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado de
potencial zeta.
O potencial zeta se dá em função da carga superficial da partícula de
qualquer camada adsorvida na interface com o meio, e da natureza e composição
do meio que a circunda.
Esse potencial pode ser determinado experimentalmente e, como reflete a
carga efetiva nas partículas, ele se correlaciona com a repulsão eletrostática entre
elas e com a estabilidade da suspensão.
O potencial zeta é um indicador útil dessa carga e pode ser usado para
prever e controlar a estabilidade de soluções, suspensões ou emulsões. Quanto
maior o potencial zeta, mais provável que a suspensão seja estável, pois as
partículas carregadas se repelem umas às outras e essa força supera a tendência
natural à agregação.
O potencial zeta foi medido pelo mesmo equipamento utilizado no
experimento de espalhamento dinâmico da luz. O Zetasizer Nano Series utiliza
uma combinação de velocimetria de laser Doppler e análise de fase do
espalhamento de luz (PALS), ou seja, utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento doppler na luz espalhada pelas partículas. Esta técnica está
patenteada como M3-PALS, a qual mede a mobilidade eletroforética da partícula.
O equipamento realiza em média vinte e duas medidas para cada amostra
analisada.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
58
Como o potencial zeta não pode ser medido diretamente, usa-se algum tipo
de medida indireta, a partir da qual se calcula o potencial zeta. A técnica mais
usada e mais aceita é através da mobilidade eletroforética, na qual introduz-se uma
suspensão coloidal diluída em uma cuba com dois eletrodos e aplica-se um
potencial elétrico à suspensão. As partículas com carga elétrica líquida se
movimentarão em direção ao eletrodo de carga contrária, tão mais rapidamente
quanto maior a sua carga elétrica e maior o campo elétrico aplicado.
O quociente da velocidade de deslocamento pelo campo elétrico chama-se
mobilidade eletroforética, a qual pode ser expressa por em m
2
/V.s .
Esse valor entra na equação (as equações mais usadas são as aproximações
de Smoluchowski ou a de Debye) para calcular o potencial zeta.
Para constatar a influência do sal na estabilidade do lipossoma, foram
realizados estudos onde pequenas alíquotas de NaCl foram adicionadas à solução
lipossomal, resultando em uma variação da concentração de sal de 0 à 180 mM.
Após cada adição, foram calculados novamente o diâmetro médio das partículas
com base em medidas de espalhamento de luz. Posteriormente, repetimos o
mesmo procedimento para o sal KCl.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
59
III.4.2 Estudos envolvendo células neoplásicas
III.4.2.1.a Crescimento e manutenção da cultura de células neoplásicas J774-
A.1
As matrizes de células J774-A.1 (0,5 x 10
6
células/mL) estocadas em
nitrogênio líquido foram descongeladas a 37°C e adicionadas em placas de cultura
(Corning Incorporated, estéril, 100 mm x 20 mm) contendo 20,0 mL do meio
completo (DMEM). As placas de cultura foram colocadas em uma incubadora a
37°C com 5,0 % de CO
2
durante 48 horas.
Após este período, as células ficaram confluentes. Realizou-se então a
primeira repicagem de células. Como as células crescem aderidas nas placas de
cultura, foi necessária a utilização de rodilhos para soltá-las. Assim, o meio
contendo as células foi adicionado em um tubo falcon e centrifugado a 25°C com
rotação constante de 5000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e
o pellet suspenso com 10,0 mL de meio completo; as células foram, então,
distribuídas em duas placas de cultura.
A troca de meio destas células foi realizada sempre que necessário. Quando o
número médio de células atingia 1,5 x 10
6
células/mL, ou preparava-se uma nova
subcultura de células (0,5 x 10
6
células/mL) ou congelavam-se as mesmas.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
60
III.4.2.1.b Congelamento das células J774-A.1
No processo de congelamento, as células foram lavadas com Hank´s e
soltas com o rodilho. O meio contendo as células foi transferido para um tubo
falcon, o qual foi centrifugado com rotação de 5000 rpm, durante 5 minutos. O
sobrenadante foi descartado e as células foram suspensas em 500 µL de soro
bovino fetal, sendo transferidas para um tubo criogênico previamente resfriado em
uma caixa de congelamento contendo isopropanol. Em seguida foram adicionados
ao tubo criogênico 500 µL de uma solução de soro bovino fetal e DMSO (80/20)
numa proporção final de 1:1v/v.
O tubo criogênico foi levado imediatamente ao freezer a -80 °C por 24
horas e então armazenado em nitrogênio líquido.
III.4.2.1.c Diagrama de crescimento da cultura celular
Quando se inicia um trabalho com cultura de células, é usual que se
determine o diagrama de crescimento das mesmas, pois este procedimento é um
controle básico que permite a detecção do tempo ideal para que a cultura de
células alcance a fase logarítmica de crescimento, considerada ideal para a
execução da maioria dos experimentos, uma vez que nesta fase, as células estão
em plena atividade, salvo contaminação externa.
Dez placas de cultura celular de J774-A1 foram preparadas com
concentrações iniciais iguais, de 0,5 x 10
6
células/mL e incubadas a 37
o
C, 5%
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
61
CO
2
. A cada 12 horas, a concentração celular de uma das placas foi determinada,
através da câmara de Neubauer (0,0025 mm
2
e 0,100 mm de profundidade).
III.4.2.1.d Controle da integridade da membrana celular.
Quando se trabalha com cultura de células, costuma-se analisar a
integridade da membrana celular e o controle da mesma. Este controle é feito tanto
para avaliar o número médio de células presente na cultura, como também para
avaliar o número de células com rompimento de membrana plasmática. Para tal,
utiliza-se o teste de exclusão do azul de tripan.
Assim, com base no número total de células contadas tem-se uma
amostragem estatística de toda a cultura celular. Este teste foi aplicado
rotineiramente para controle do crescimento e sanidade das culturas celulares
(Freshney, 1986).
O azul de tripan é uma molécula colorida de grande peso molecular que só
é capaz de entrar em células que tenham a membrana alterada ou rompida.
Portanto, a célula viva em perfeito estado será observada incolor ao microscópio,
ao passo que uma célula morta terá a coloração azul. Deste modo, pode-se
determinar a viabilidade celular através da câmara de Neubauer.
Sendo assim, em um tubo de 1,5 mL foram colocados 90 µL de tampão
Hank's, 90 µL de solução de azul de tripan (0,4% m/v) e 20 µL da suspensão de
células. A mistura foi agitada, e após dois minutos com a ajuda da câmara de
Neubauer, fez-se a contagem das células e calculou-se a viabilidade celular.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
62
Um outro método para avaliar a atividade celular é o método do uso do
corante (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium) ou MTT. Este
ensaio é apropriado para se determinar espectrofotometricamente o número total
de células com função da atividade mitocondrial intacta, ou seja, células vivas.
O método do MTT é simples, confiável e reprodutível. Soluções de MTT
dissolvidas em meio de cultura ou em soluções salinas, balanceadas na ausência de
indicador vermelho de fenol, são de cor amarelada. A dehidrogenase mitocondrial
das células viáveis atuam sobre o anel tetrazolium, produzindo cristais de
formazam de cor púrpura, os quais são insolúveis em solução aquosa. Os cristais
são dissolvidos em isopropanol acidificado. O produto obtido é monitorado
espectrofotometricamente. Um aumento ou diminuição no número de células
resulta em uma mudança concomitante na quantidade do formazan formado,
indicando assim o grau de citotoxicidade (Mosmann, 1983; Vistica et al., 1991).
O método do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro é bem
estabelecido para o uso com placas de poços múltiplos. Para melhores resultados,
devem ser empregadas as células na sua fase logarítmica de crescimento e o
número final de células não deve exceder 1,0 x 10
6
células/mL. Cada teste deve
incluir um branco contendo meio completo sem nenhum fármaco.
Inicialmente, as células foram removidas da incubadora, sendo levadas à
capela de fluxo laminar e distribuídas nas placas de poços múltiplos (96 poços). À
estas células, foi adicionada uma solução de MTT 1,0 mg/mL. A cultura foi
conduzida à incubadora por 4 horas. Após o período de incubação, as células
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
63
foram removidas da estufa de CO
2
e os cristais de formazam resultantes foram
dissolvidos pela adição de isopropanol.
O teste é finalizado através de medidas espectrofotométricas da absorbância
no comprimento de onda de 570 nm, descontando-se a absorbância de fundo a 690
nm (Freshney, 1986; Mosmann, 1983). Estas medidas foram obtidas por um
sistema de leitura de microplacas (ELISA) da Molecular Device modelo Versa
Max.
III.4.2.2 Definição de parâmetros para os estudos de fototoxicidade.
III.4.2.2.1 Toxicidade dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio homogêneo e
micro heterogêneo na linhagem de células J774-A.1 em meio fisiológico
Hank’s.
Uma suspensão de 0,5 x 10
6
células/mL da linhagem J774-A.1 foi preparada
a partir da re-suspensão das células das placas de petri em tampão Hank's para o
experimento de toxicidade no escuro.
Após essa etapa, as células foram incubadas em placas de poços múltiplos
(96 poços) com 200µL por poço de meio completo. Depois de 24 horas o meio foi
retirado, as células foram lavadas com 200 µL de tampão Hank's e logo em
seguida à retirada do tampão, foram adicionados 100 µL da solução do fármaco
nas concentrações desejadas. Depois de meia hora de incubação, com ausência
total de luz, retirou-se a solução do fármaco, lavou-se novamente com 200 µL de
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
64
Hank's, adicionou-se meio DMEM completo e deixou-se por 24 horas. Após este
período o meio foi retirado, as células foram lavadas com 200 µL de Hank's e
foram adicionados 50 µL da solução de MTT 1mg/mL. As células foram
incubadas por mais 4 horas e 200 µL de isopropanol foram acrescentados para
completa solubilização do formazan.
O experimento na ausência de irradiação foi realizado utilizando-se o
fármaco fotossensibilizador ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio homogêneo (descrito no item
III.2) e micro heterogêneo (suspensão lipossomal).
III.4.2.2.1.a Avaliação do tempo de incubação para o fármaco
fotossensibilizador ZnC
4
P em meio lipossomal e na presença de tampão
Hank’s, (estudo preliminar).
Uma suspensão de 0,5 x 10
6
células/mL da linhagem J774-A.1 foi
preparada a partir da suspensão das células das placas de petri em meio de cultura
completo, como descrito anteriormente na sessão III.4.2.1. Essas suspensões
foram, então, transferidas para placas de petri de 60 mm x 15 mm e incubadas até
atingirem confluência. Este procedimento foi adotado como padrão para a
preparação da cultura celular utilizada em todos os experimentos in vitro. Em
seguida, as células foram incubadas com uma solução 4 µM de ZnC
4
P em meio
homogêneo em Hank’s, e em meio micro heterogêneo (lipossomal) por 0,5; 1; 3;
5; 7; 21 e 24 horas.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
65
Após cada tempo de incubação, este meio contendo o fotossensibilizador
em estudo foi retirado, as células foram lavadas duas vezes com 2 mL de Hank´s e
soltas das placas. Estas suspensões foram transferidas para tubos falcon e
centrifugadas com velocidade de 5000 rpm por 5 minutos. Em seguida, o
sobrenadante foi descartado e o pelet foi re-suspenso em etanol, submetido a uma
agitação vigorosa em um sistema vortex e novamente centrifugado.
A solução sobrenadante foi colocada em uma cubeta de quartzo e foram
realizadas medidas de emissão de fluorescência e de absorção da ZnC
4
P que
estava contida no interior das células. A determinação do espectro de emissão de
fluorescência da ZnC
4
P foi registrada de 550 a 750 nm, utilizando-se o
comprimento de excitação em 428 nm.
III.4.2.2.2 Viabilidade celular dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e
H
2
C
4
P nos diferentes meios fisiológicos.
Nos estudos de citotoxicidade, foram avaliados os seguintes meios
fisiológicos: meio de cultura DMEM sem soro bovino fetal (SBF), e na presença
do SBF a 3% e 10% . Depois de 7 e 24 horas de incubação, as soluções foram
retiradas, lavadas novamente com Hank´s e soltas com rodilho.
Estas suspensões de células foram, então, transferidas para um tubo falcon e
centrifugadas a 5000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi retirado e as células
foram suspensas em meio DMEM com 10% de soro. As suspensões foram, em
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
66
seguida, transferidas para as placas de poços múltiplos (96 poços) com 200 µL por
poço de meio completo. Depois de 24 horas foi realizado o teste do MTT.
III.4.2.2.3 Efeito do SBF na incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas J774-A.1.
Seguindo o protocolo padrão, descrito na sessão III.4.9.1, as células J774-
A-1 foram então incubadas com os fármacos fotossensibilizadores TPP, ZnC
4
P,
H
2
C
4
P a 4 µM em meio homogêneo e micro heterogêneo do fotossensibilizador
em estudo por 7 horas em DMEM na ausência e presença do soro bovino fetal a
3% e 10%.
Após esse período, o meio contendo os fármacos fotossensibilizadores,
foram retirados, as células foram lavadas duas vezes com 2 mL de Hank´s e soltas
das placas com a ajuda do rodilho. Estas suspensões foram transferidas para tubos
falcon e centrifugadas com velocidade de 5000 rpm por 5 minutos. Em seguida, o
sobrenadante foi descartado e o pelet foi resuspenso em etanol, submetido a uma
agitação vigorosa em um sistema vortex e novamente centrifugado.
A determinação do espectro de emissão de fluorescência dos fármacos
fotossensibilizadores foi registrada de 550 a 750 nm, utilizando-se os seguintes
comprimentos de excitação: 424 nm para H
2
C
4
P, 428 nm para ZnC
4
P, e 418 nm
para TPP.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
67
III.4.2.2.4 Desenvolvimento de método analítico para quantificação dos
fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP por
espectrofluorimetria.
Com a necessidade de se desenvolver uma metodologia para quantificação
dos fármacos fotossensibilizadores incorporados pelas células, foi desenvolvido
um protocolo experimental para determinação de uma curva padrão de calibração.
Inicialmente preparou-se uma solução estoque da ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP em
DMSO (conforme descrita no item III.2). Em uma cubeta de quartzo preparou-se
por diluições infinitas um conjunto de amostras no intervalo de concentração de
0,01 a 2,00 µM do fármaco em solução etanólica para construção da curva padrão
de calibração. Traçaram-se, então, os espectros de emissão na faixa de
concentração com excitação fixa em 428 nm para ZnC
4
P, 424 nm para H
2
C
4
P e
418 nm para TPP.
Foram utilizados os conjuntos de fendas de excitação e emissão mais
adequados, traçando-se uma curva de calibração adequada para cada condição
experimental.
As concentrações do fotossensibilizador foram determinadas por
extrapolação, utilizando-se a equação obtida por regressão linear da curva padrão
de calibração.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
68
III.4.2.2.5 Cinética de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP no meio de cultura ideal (DMEM com 10% de serum).
No estudo de cinética de incorporação dos fármacos, a linhagem de célula
J774-A.1, após atingir confluência, foi incubada com uma solução 4 µM de
H2C4P, ZnC4P e TPP (meio homogêneo) em meio de cultura com 10% de soro
bovino fetal, por 1; 3; 5; 7; 9; 21 e 24 horas.
Após cada tempo de incubação, o fármaco fotossensibilizador foi liberado
das células pelo mesmo método descrito no item III.4.2.2.3.
A solução sobrenadante foi colocada em uma cubeta de quartzo para ser
realizada a medida de emissão de fluorescência da H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP que
estava contida no interior das células. A determinação do espectro de emissão de
fluorescência foi registrada de 550 a 750 nm, utilizando-se os seguintes
comprimentos de excitação: 424 para H
2
C
4
P, 428 para ZnC
4
P, e 418 para TPP.
III.4.2.3 Estudos Fotobiológicos.
III.4.2.3.1 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas da linhagem J774-A.1.
No estudo de fototoxicidade, foi avaliado o efeito da luz sob a linhagem de
células J774-A1 na presença da solução do fármaco fotossensível H
2
C
4
P, ZnC
4
P e
TPP, estoque em DMSO. Neste experimento, uma suspensão de 0,5 x 10
6
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
69
células/mL da linhagem J774-A.1 foi preparada a partir da suspensão das células
das placas de petri em meio de cultura completo, método descrito no item
III.4.2.1.a. Estas suspensões foram, então, transferidas para placas multi-poços e
incubadas até atingirem confluência. Este procedimento foi adotado como padrão
para a preparação da cultura celular utilizada em todos os experimentos in vitro.
A concentração do composto fotossensível foi mantida fixa em 4 µM e as
células com aproximadamente 1x10
6
células/mL foram incubadas em meio
DMEM com 10% de soro bovino fetal, por um intervalo de tempo de 7 horas a
37
o
C e uma estufa de CO
2
. Em seguida, foi descartado o meio de cultura contendo
os fotossensibilizadores e as células foram lavadas duas vezes com 0,5 mL de
tampão Hank’s. Adicionou-se então 2 mL de meio Hank’s e as células foram
irradiadas.
A cultura celular foi submetida a diferentes intensidades de irradiação, 1
J/cm
-2
, 3 J/cm
-2
e 5 J/cm
-2
. Como fonte de irradiação, utilizou-se um sistema foto-
polimerizador da Dabi-Atlante acoplado a um filtro óptico específico que permite
a transmissão de uma faixa selecionada de comprimento de onda, 400 a 500 nm.
Após a irradiação, a solução Hank’s foi removida, sendo adicionado meio
DMEM completo, e as células foram levadas à estufa de CO
2
por um período de
24 horas.
Após este intervalo, foi realizado o ensaio do MTT para a avaliação da
viabilidade celular. Os dados encontrados através do teste de MTT foram
analisados utilizando-se o teste t de Students (ANOVA, P < 0,05).
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
70
III.4.2.3.2 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores em
meio lipossomal.
Neste estudo de fototoxicidade, foi avaliado o efeito da luz sob a linhagem
de células J774-A1 na presença da solução do fármaco fotossensível H
2
C
4
P,
ZnC
4
P em meio lipossomal.
As células J774-A-1 foram incubadas com os fármacos
fotossensibilizadores ZnC
4
P, H
2
C
4
P em meio lipossomal em DMEM com SBF a
10%, por 7 horas, a 37
o
C e em uma estufa de CO
2
. A concentração final atingida
do fotossensibilizador em meio lipossomal nesta solução foi de 1µM.
Após o período de incubação, o meio contendo os fármacos
fotossensibilizadores, foi retirado e as células foram lavadas duas vezes com 0,5
mL de Hank´s. Adicionou-se então 2 mL de meio Hank’s e as células foram
irradiadas. A cultura celular foi então submetida a diferentes intensidades de
irradiação, 1 J/cm
-2
, 3 J/cm
-2
e 5 J/cm
-2
. Como fonte de irradiação, utilizou-se
novamente um sistema foto-polimerizador da Dabi-Atlante acoplado a um filtro
óptico específico que permite a transmissão de uma faixa selecionada de
comprimento de onda, 400 a 500 nm.
A solução Hank’s foi então removida, sendo adicionado meio DMEM
completo, e as células foram levadas à estufa de CO
2
por um período de 24 horas.
Após este período, foi realizado o ensaio do MTT para a avaliação da
viabilidade celular.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
71
Os resultados encontrados através da leitura do MTT pela leitura multi-
placa Safira Tecan foram analisados através do Students t-test (ANOVA), com o
programa GraphPad Prism. Para indicar a diferença significativa entre os grupos,
foi considerado o intervalo de confiança de 95% (P < 0,05).
III.4.2.4. Estudos da influência do éter de coroa na membrana plasmática.
III.4.2.4.1 Estudos com a sonda fluorescente bis(ácido 1,3-
dietiltiobarbitúrico) trimetina oxonol, diSBA-C2, durante processo de
hiperpolarização.
O procedimento seguido para a medida do potencial de membrana foi
similar ao protocolo usado por Rink(Rink et al., 2005), onde nós observamos o
comportamento da sonda na presença de íons sódio, potássio e monesin sobre as
células J774-A.1 previamente incubadas ou não com o fármaco fotossensibilizador
ZnC
4
P. Três mililitros de uma suspensão de células em Hank’s (10
6
células/ml)
foram adicionados a uma cubeta de quartzo de fluorescência com 1.0 cm com
agitação magnética. A concentração final de 1µM de di-SBA-C
2
foi alcançada pela
adição de 1 µL de uma solução estoque de 3 mM em DMSO na cubeta.
A cubeta foi colocada no espectrofluorímetro SPEX Fluorog, equipado com
um controlador de temperatura, mantida a 37
o
C.
As células ficaram incubadas na cubeta por vinte minutos e mantidas no
fluorímetro com agitação ocasional. O espectro de fluorescência da sonda em
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
72
solução foi registrado com excitação fixa em 500 nm e a emissão inicial de
fluorescência registrada na faixa de 530 a 640 nm.
As células foram então tratadas como descrito abaixo e a mudança no sinal
foi registrada quando o sinal de fluorescência estacionário foi obtido.
Para os experimentos com NaCl, as células foram utilizadas, inicialmente,
sem tratamento prévio com o fotossensibilizador ZnC
4
P e foram incubadas com
di-SBA-C
2
, como descrito acima. Em seguida, alíquotas de NaCl de concentração
3 M foram adicionadas às células em suspensão para a hiperpolarização.
Nos estudos do efeito do fotossensibilizador ZnC
4
P sobre as células, estas
foram incubadas com o fotossensibilizador ZnC
4
P (4 µM) por 4 horas e em
seguida incubadas com di-SBA-C
2
, como descrito acima. Então, alíquotas de NaCl
de concentração 3 M foram adicionadas à suspensão de células para a
hiperpolarização, e novamente o espectro de fluorescência foi registrado após a
adição.
Nos estudos com o antibiótico Monesin, foi adicionado 1 µL do antibiótico
(3mM em DMSO) na suspensão celular incubada com di-SBA-C
2
, para
despolarização das células.
Nos estudos com KCl, foi realizado o mesmo procedimento para os estudos
com NaCl sem tratamento prévio das células com o fármaco fotossensibilizador
ZnC
4
P.
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
73
III.4.2.4.2 Estudos com a sonda fluorescente bis(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, durante processo de despolarização.
O procedimento seguido para a medida do potencial de membrana foi
similar ao protocolo usado por Rink et al(Rink et al., 2005), onde nós observamos
o comportamento da sonda na presença de NaCl, KCl e o antibiótico monesin
sobre as células J774-A.1 previamente incubadas ou não com o fármaco
fotossensibilizador ZnPC e éter de coroa em meio lipossomal. Três mililitros de
uma suspensão de células em Hank’s (10
6
células/ml) foram adicionados a uma
cubeta de quartzo de fluorescência com 1.0 cm com agitação magnética. A
concentração final de 0,5 µM de di-SBA-C
2
foi alcançada pela adição de 1,5 µL de
uma solução estoque de 1 mM em DMSO na cubeta.
A cubeta foi colocada no espectrofluorímetro modelo 4500 da Hitach,
equipado com um controlador de temperatura e mantida a 37
o
C.
As células ficaram incubadas na cubeta por vinte minutos e foram mantidas
no fluorímetro com agitação ocasional. O espectro de fluorescência da sonda em
solução foi registrado com excitação fixa em 500 nm e a emissão inicial de
fluorescência registrada na faixa de 530 a 640 nm.
As células foram então tratadas como descrito abaixo e a mudança no sinal
foi registrada quando o sinal de fluorescência estacionário foi obtido para cada
experimento descrito abaixo.
Para os experimentos com KCl, as células foram utilizadas, inicialmente,
sem tratamento prévio com o éter de coroa e o fotossensibilizador ZnPC e foram
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
74
incubadas com di-SBA-C
2
, como descrito acima. Em seguida alíquotas de 30 µL
de KCl de concentração 3 M foram adicionadas às células em suspensão para a
despolarização.
Nos estudos do efeito do éter de coroa sobre as células, estas foram
incubadas com o éter de coroa em meio lipossomal de forma que a concentração
final alcançada fosse de 16 µM, por um período de 4 horas, em seguida foram
incubadas com di-SBA-C
2
, como descrito acima. Então, alíquotas de KCl de
concentração 3 molar foram adicionadas à suspensão de células para a
despolarização, e novamente o espectro de fluorescência foi registrado após cada
adição.
Em um terceiro estudo verificamos o efeito do fotossensibilizador ZnPc e
éter de coroa em meio lipossomal sobre as células. Estas foram incubadas com o
fotossensibilizador ZnPc (4 µM), mais o éter de coroa (16 µM), por um período de
4 horas e em seguida incubadas com di-SBA-C
2
, como descrito acima. Então,
alíquotas de KCl de concentração 3 M foram adicionadas à suspensão de ce
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
75
em DMSO) na suspensão celular incubada com di-SBA-C
2
, para despolarização
das células, e novamente foi registrado o sinal de fluorescência.
III.4.2.4.2.a Calibração da sonda de resposta lenta bis(ácido 1,3-
dietiltiobarbitúrico) trimetina oxonol, diSBA-C
2
.
Uma vez conhecido o mecanismo de resposta da sonda fluorescente que
promove um simples caminho para monitorar o potencial de membrana
qualitativamente, torna-se necessário calibrar sua resposta em unidades de
milivolts.
Um método de referência seguro é requerido para a avaliação do potencial
de membrana. No entanto, não existe uma curva de calibração universal, pois a
resposta da sonda é fortemente dependente do protocolo experimental.
A porcentagem da variação de fluorescência para cada experimento foi
determinada pela seguinte equação 8 (Specht e Rodgers, 1990b):
%∆F = (F
tratado
– F
inicial
.100 )/ F
inicial
Equação 8
Os resultados foram então normalizados, onde a maior variação de
fluorescência (∆F) foi para a despolarização final, alcançada por adição de
alíquotas crescentes de KCl (3 mM) até alcançar a concentração final de 140 mM.
Após a normalização, a porcentagem de mudança no potencial de membrana foi
dado pela equação 9(Specht e Rodgers, 1990b):
Parte Experimental
_____________________________________________________________________________________
76
%∆Ψ = (F
tratado
–F
inicial
. 100)/ (F
final
– F
inicial
) Equação 9
Células previamente incubadas com éter de coroa (16 µM) em meio
lipossomal, e incubadas com éter de coroa na presença do fármaco
fotossensibilizador ZnPc (4µM) em meio lipossomal, seguiram o mesmo
protocolo descrito acima para a avaliação da influência do éter de coroa no
processo de despolarização da membrana plasmática pelos íons potássio.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
77
IV. Resultados e Discussões:
Este trabalho se baseia na utilização combinada da Terapia Fotodinâmica
(TFD) com a ação sinérgica do éter de coroa que, por sua vez, pode alterar o
sistema homeostático pela formação de nanotubos na membrana plasmática. Esse
sinergismo pode potencializar o efeito terapêutico no tratamento de células
neoplásicas.
Para estudar a influência do éter de coroa, foi necessário observar sua ação
no processo de hiperpolarização e despolarização, utilizando para isso uma sonda
de resposta lenta, específica para membrana plasmática.
Para realizar este estudo utilizamos porfirinas ligadas covalentemente ao
éter de coroa específico para íons sódio. Sendo assim, pode-se observar a
influência do éter de coroa no processo de hiperpolarização.
No entanto, dentro da proposta inicial, não foi possível obter um fármaco
fotossensibilizador ligado covalentemente ao éter de coroa específico para íons
potássio por problemas sintéticos. Este estudo foi desenvolvido com o auxílio de
um sistema de liberação combinado do tipo lipossomal contendo agentes ativos na
TFD e o éter de coroa específico para íons potássio.
O agente ativo na TFD escolhido foi a zinco ftalocianina (ZnPc),
considerada como um FS clássico de segunda geração. Este fármaco
fotossensibilizador apresenta alta estabilidade e pureza, além de possuir suas
propriedades espectrais diferenciadas, com uma intensa absorção de luz na região
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
78
do vermelho do espectro eletromagnético. Já o éter de coroa escolhido foi o 18-
crown-6, que é específico para íons potássio. Pelo fato do éter de coroa conferir
aos fotossensibilizadores um maior caráter anfifílico, e por estes apresentarem
uma boa afinidade pelos tecidos tumorais, foram realizados estudos comparativos
aos sistemas anteriormente descritos com a TPP, avaliando-se cinética de
incorporação em linhagem de células J774-A.1. A TPP é uma porfirina
hidrofóbica e clássica nos estudos desta natureza. Também foram realizados
estudos comparativos de fototoxicidade.
Sendo assim, foi realizada inicialmente a caracterização espectroscópica da
ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio orgânico. Em seguida, foram preparadas soluções
lipossomais destas porfirinas e também da TPP e da ftalocianina da ZnPC, para os
estudos comparativos de incorporação, fototoxicidade e os estudos referentes à
alteração da homeostase pela presença dos ligantes éter de coroa.
IV.1. Estudos espectroscópicos
IV.1.1. Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnC
4
P e da
H
2
C
4
P em meio orgânico.
A escolha adequada do FS deve ser baseada na investigação dos parâmetros
fotofísicos em solução homogênea e nos referidos sistemas micro-heterogêneos. A
emissão de fluorescência do FS é um parâmetro fundamental nas determinações da
ação fotodinâmica deste, uma vez que um FS eficiente deve apresentar um tempo
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
79
de vida singlete pequeno (da ordem de 100 ps a 10 ns), porém suficientemente
longo para permitir a visualização, localização e delineação da lesão maligna.
Na primeira etapa do trabalho, foram realizados estudos espectroscópicos
no estado fundamental (espectroscopia de absorção e de emissão de fluorescência
no estado estacionário) da ZnC
4
P, H
2
C
4
P, TFPP em etanol, procedimento descrito
no item III.4.1.1.
O espectro de absorção da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em meio etanólico é
característico de espécies não agregadas (de 5 a 20 µM) (Figura 12). Os espectros
foram interpretados nos termos da nomenclatura de Gouterman (Gouterman,
1978).
Figura 12. Espectro de absorção normalizado da H
2
C
4
P ( 6 µM em etanol -----) e
ZnC
4
P ( 6 µM em etanol
______
). O inserto apresenta a expansão da região espectral
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
80
que representa as bandas Q (500 a 800 nm) para uma solução 15 µM em etanol de
ambos os compostos
Uma considerável variação nas propriedades óptica e vibracional é resultado
tanto do substituinte central, ou melhor, do átomo ou grupo de átomos que ocupam
o anel central porfirínico, como dos substituintes ao anel pirrólico, pois estes
substituintes também podem provocar uma variação na estrutura eletrônica.
Com relação ao substituinte central, quando há dois átomos de hidrogênio nos
nitrogênios pirrólicos, o composto é chamado de porfirina base livre (H
2
C
4
P), e
apresenta cinco bandas de absorção no espectro visível, distintamente diferente
das três bandas de absorção apresentadas quando os dois hidrogênios são
substituídos por íons metálicos, as chamadas metaloporfirinas (ZnC
4
P).
Essa diferença vem do fato de que os dois hidrogênios do anel da base livre
fortemente conjugada reduzem a simetria do anel da metaloporfirina (ZnC
4
P), de
D4h (onde observamos um eixo principal C
4
e um plano de simetria σ
h
), para D2h
(onde o eixo principal é C
2
e também possui um plano de simetria σ
h)
, para a base
livre.
Para a simetria D2h da porfirina base livre (H
2
C
4
P) observamos 4 bandas entre
500 e 660 nm, que são normalmente atribuídas ao nível (0,0) e (1,0) para as
bandas denominadas Qx e Qy. No espectro de absorção da base livre (H
2
C
4
P) na
figura 12, foram observadas as seguintes posições de bandas Qx(0,0) em 649 nm,
Qx(1,0) em 589 nm, Qy(0,0) em 552 nm e Qy(1,0) em 510 nm. Observa-se ainda
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
81
uma banda de forte intensidade chamada de Banda Soret (ou Banda B) em 420
nm.
Na Figura 13
um_an S5(n)-9.2592p( )-129.63(Sc )-129.63(S)-8.81393(oda)-0.445331oiadaFbe ãFoia S5(n)-9.2592i Bn
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
82
Para a porfirina metalada (ZnC
4
P), a simetria observada é D4h. Como
esperado para metaloporfirinas, observamos 2 bandas de absorção entre 550 e 620
nm. A banda de menor energia é de origem eletrônica Q(0,0), relacionada ao
estado excitado singlete de mais baixa energia (Platt, 1956) e possui máxima
intensidade de absorção em 618 nm. A banda de maior energia inclui um modo de
excitação vibracional e é denominada de Q (1,0) (Platt, 1956), possui máxima
intensidade de absorção em 554 nm.
Observamos uma banda de maior intensidade (Banda Soret) em 425 nm que
possui um coeficiente de extinção molar de 1,23 x 10
5
M
-1
cm
-1
, a banda Q(1,0)
tem coeficiente de extinção molar de 1,2 x 10
4
M
-1
cm
-1
(Falk, 1964). Todos esses
resultados estão de acordo com os estudos de Gouterman (Gouterman, 1978).
A inserção do Zn na porfirina faz com que haja uma mudança de simetria
de D2h para D4h, apresentando um deslocamento batocrômico de 40 nm da banda
Q(1,0), o que é normalmente esperado para este tipo de composto com a mudança
de simetria (Gouterman, 1978). Este fato é interessante para a proposta de
utilização dos mesmos em TFD. Embora este deslocamento não seja intenso o
suficiente para trazer a absorção desta classe de composto para uma região central
da janela terapêutica, isto faz com que fármacos desta natureza tenham absorção
mais deslocada para regiões onde já é possível o uso de diferentes tipos de fontes
de luz, provenientes de sistemas Laser ou luzes não coerentes (como Laser de
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
83
Embora estas bandas não sejam ainda as ideais para TFD, sabe-se que as
bandas na região Q de compostos porfirínicos têm sido utilizada com sucesso na
TFD, a exemplo do Photofrin II (Merrill, 2002; Sharman , Allen e van Lier, 1999),
um dos compostos mais usados clinicamente na TFD para vários tipos de tumores
em vários países do mundo, inclusive no Brasil.
O espectro de emissão de fluorescência para ZnC
4
P é apresentado na figura
14. Podemos observar que a fluorescência apresenta 2 picos de emissão
denominados Q(0,0) e Q(0,1), que são na verdade imagem especular dos picos de
absorção denominados Q(0,0) e Q(1,0), apresentados na Figura 10.
Figura 14. Espectro de absorção das bandas Q para a porfirina ZnC
4
P em etanol
(), e espectro de emissão para a porfirina ZnC
4
P em etanol (------). Excitação
fixa em 422 nm.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
84
O mesmo comportamento foi observado por Gouterman (Gouterman, 1978)
em seus estudos de fluorescência para metaloporfirinas regulares como
(OEP)SnCl2, (OEP)Zr
(IV)
etc. Em todos os casos, a fluorescência apresenta 2 picos
de emissão denominados Q(0,0) e Q(0,1), que são imagem especular dos picos de
absorção Q(0,0) e Q(1,0). Freqüentemente, observa-se a presença de mais um
pico, que embora seja de menor intensidade, denomina-se Q(2,0) referente à banda
de absorção Q(0,2).
Espectros de excitação de fluorescência obtidos estão em excelente
concordância com os espectros de absorção.
Com relação à influência do ligante éter de coroa, pode-se observar um
deslocamento de bandas para a região do vermelho, visto que no espectro de
absorção da porfirina TFPP (porfirina usada como produto de partida para a
síntese da base livre (H
2
C
4
P), Figura 15), foram observados as seguintes posições
de bandas Qx(0,0) em 644 nm, Qx(1,0) em 584 nm, Qy(0,0) em 538 nm e Qy(1,0)
em 502 nm. Observou-se ainda uma banda de forte intensidade chamada de Banda
Soret (ou Banda B) em 412 nm. Sendo assim, um deslocamento da banda Soret de
8 nm para a região do vermelho é observado após a incorporação do éter de coroa.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
85
Figura 15. Espectro de absorção da TFPP ( 6 µM em etanol
______
). O inserto
apresenta a expansão da região espectral que representa as bandas Q (500 a 800
nm).
IV.1.2. Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
ΦΦ
Φ
F
) da
ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em etanol.
As medidas das propriedades de fluorescência de uma molécula (espectro
de fluorescência, espectro de excitação, rendimento quântico e tempo de vida de
fluorescência) são importantes para o entendimento da fotoquímica e fotofísica das
espécies no estado excitado singlete.
A absorção de um fóton de luz por uma molécula no estado fundamental
(So) promove seus elétrons aos estados excitados singletes mais energéticos (Sn),
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
86
de onde os mesmos podem retornar para o estado fundamental por vários
processos radioativos e não radioativos. A razão entre os números de fótons
emitidos a partir do estado excitado singlete por processo radioativo (denominado
fluorescência) e o número total de fótons absorvidos define um parâmetro
fotofísico denominado rendimento quântico de fluorescência (Φ
f
) (Turro, 1978).
Os Φ
F
geralmente são determinados de forma relativa às propriedades
previamente definidas para um composto padrão (Demas e Crosby, 1971a; Demas
e Crosby, 1971b), conforme descrito na parte experimental (item III.4.1.2).
O rendimento quântico de fluorescência da ZnC
4
P e H
2
C
4
P foi determinado
utilizando como padrão uma solução de TMPyPH
2
em metanol como solvente, φ
f
= 0,07 ± 0,01 e confirmado com a TPP em benzeno como solvente, φ
f
= 0,13 ±
0,01.
Uma vez que a TFD é altamente dependente da produção de oxigênio
singlete (
1
O
2
), o Φ
F
é uma propriedade fotofísica de grande importância para os
fármacos fotossensibilizadores (FS). Compostos altamente fluorescentes
usualmente são pouco eficientes como agentes fotodinâmicos, uma vez que é
baixa a produção de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas, o que resulta em baixos processos de transferência de
energia entre o estado excitado triplete e o oxigênio, produzindo
1
O
2
. Assim, os
baixos valores de Φ
F
encontrados contribuem para a formação dos estados
excitados tripletes e, portanto, para a produção do
1
O
2
.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
87
Todas as soluções utilizadas para a determinação do Φ
F
foram preparadas
de modo a obter uma absorbância constante na faixa de 0,04 no comprimento de
onda de 418 nm para a TPP.
O espectro de emissão de fluorescência corrigido foi obtido em um
espectrofluorímetro Fluorog 3 da Spex de 500 à 800 nm. O método utilizado foi
baseado no formalismo descrito por Demas)(Demas e Crosby, 1971a), onde o
rendimento quântico de uma amostra desconhecida é dado em relação a um
padrão, como demonstrado na Equação 1.
ΦF = (Ax/A(p)).(DO(p)/DOx).(n(p)2/n x2). ΦF (p) Equação 1
onde os subscritos x e p são referentes à amostra e ao padrão, respectivamente; A é
a área do espectro de emissão de fluorescência corrigido; DO é a densidade óptica
no comprimento de onda de excitação; n é o índice de refração do meio e Φ
F
é o
rendimento quântico de fluorescência.
Os valores encontrados foram: φ
f
= 0,04 ± 0,01 para ZnC
4
P e φ
f
= 0,06 ±
0,01 para H
2
C
4
P e são da mesma ordem e estão de acordo com esta classe de
compostos e de suas propriedades fotofísicas(Schneider et al., 2005). Esses
resultados nos indicam que o fármaco, quando no estado excitado singlete (S
1
),
não retorna para o estado fundamental por emissão de luz (fluorescência) de uma
forma efetiva. Sendo assim, ocorre um cruzamento intersistema para o mais baixo
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
88
estado triplete (T
1
), resultado este confirmado pela determinação do rendimento
quântico triplete.
IV.1.3 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnC
4
P e para
H
2
C
4
P em meio orgânico.
Outro parâmetro que é influenciado pela simetria e estrutura das moléculas
é o tempo de vida do estado excitado singlete (τs). O tempo de vida de uma
substância fluorescente representa o tempo médio em que esta molécula
permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental.
A espectroscopia de fluorescência pode fornecer informações detalhadas
sobre o comportamento das macromoléculas, bem como a freqüência de colisões
com agentes supressores e a velocidade de transferência de energia envolvendo
reações dos estados excitados. Estas informações estão contidas no espectro de
emissão resolvido no tempo e são reveladas numa escala de tempo da ordem de
nanosegundos.
Dentre os métodos disponíveis para se medir os decaimentos de
fluorescência, um dos mais usados é o método de contagem simples de fótons.
Neste método a amostra é excitada por um flash de luz e, em seguida, um sistema
de detecção mede o tempo entre este pulso e a chegada do primeiro fóton à
fotomultiplicadora (Phillips e O'Connor, 1984).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
89
A intensidade da luz deve ser ajustada de modo que este pulso seja devido a
um único fóton incidente, ou seja, deve ser assegurado que somente um fóton
chegue ao detector a cada pulso para o qual um fóton é contado. Se mais de um
fóton chegar por pulso, então o decaimento resolvido no tempo é deslocado para
tempos mais curtos. Isto ocorre porque somente a chegada do primeiro fóton é
contada. Se somente um fóton chega, então seu tempo de chegada reflete o
decaimento resolvido no tempo verdadeiro. O tempo entre o pulso de excitação e a
chegada do primeiro fóton é medido para um grande número de fótons. A
distribuição dos tempos de chegada é representada por um histograma que traduz a
curva de decaimento.
A técnica de contagem simples de fótons foi utilizada para se determinar os
tempos de vida singlete do fámaco fotossensibilizador metalado ZnC
4
P e da base
livre H
2
C
4
P em etanol, procedimento descrito no ítem III.4.1.3, e os valores
encontrados foram τs = 1.31 ns e τs = 7.83 ns respectivamente.
Estes resultados
mostram que o fármaco metalado (ZnC
4
P) tem um menor tempo de vida singlete.
Normalmente, este comportamento é observado para derivados porfirínicos e
ftalocianínicos metalados em relação à sua forma de base livre(Owens et al.,
1998). Esses resultados indicaram que deve estar ocorrendo um cruzamento
intersistemas eficiente, o que sem dúvida é de grande valia para o uso dos mesmos
nos estudos de TFD, uma vez que existe a possibilidade de uma alta população dos
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
90
estados excitados triplete, que podem levar a produção do oxigênio singlete e de
espécies reativas ativas na TFD.
IV.1.4. Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser
Após a absorção de energia radiante, o fármaco fotossensibilizador passa a
popular um estado excitado singlete de maior energia, o qual pode dar origem ao
estado excitado triplete, através de um processo conhecido como cruzamento
intersistema. A fotossensibilização celular ocorre devido à reação do oxigênio
molecular, usualmente presente no meio, com o FS excitado (T
1
) gerando oxigênio
singlete (Spikes, 1984a). É por esse motivo que podemos afirmar que a ação
fotodinâmica do FS nos sistemas biológicos é dependente da formação do
primeiro estado excitado triplete (T
1
) do FS.
No entanto, a fototoxicidade do FS não produz apenas o oxigênio singlete
(
1
O
2
) como espécies reativas de oxigênio. A absorção de elétrons foto-induzida
por biomoléculas apropriadas levam às reações de transferência de elétrons, ou
abstração de hidrogênio de moléculas biológicas que resultam na produção de
radicais livres, que por sua vez podem atuar sozinhos (EROS, processos do Tipo I)
ou simultaneamente à produção de oxigênio singlete (processo do Tipo II) (Foote,
1991; Viola et al., 1998). Sendo assim o FS que atua na produção de mais de um
tipo de espécies excitadas se torna interessante para a TFD.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
91
A técnica de fotólise por pulso de laser é uma das mais utilizadas dentre as
técnicas resolvidas no tempo que são baseadas no monitoramento direto da
absorção ou emissão de um intermediário reacional de vida curta, e é utilizada
para gerar e estudar a reatividade dos transientes presentes nos estados excitados
eletronicamente.
Após uma grande população de moléculas do estado fundamental ser
promovida para os estados excitados singletes superiores através de um pulso
rápido de luz de alta intensidade, as moléculas que se encontram no estado
excitado singlete sofrem cruzamento intersistema para um estado excitado triplete.
O rendimento quântico de cruzamento intersistema mede a conversão do
estados excitados singletes a tripletes e é representado pelo símbolo Φ
isc
. A
diferença básica entre os processos envolvendo o estado excitado singlete e o
estado excitado triplete é que no estado excitado triplete, as moléculas apresentam
uma vida média mais longa (da ordem de µs a ms), podendo interagir com outras
espécies, ou retornar ao estado fundamental por emissão de luz, por um processo
conhecido como fosforescência.
Em solução homogênea, a probabilidade e a eficiência do processo de
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
92
Os estados excitados para ZnC
4
P como para a H
2
C
4
P em meio etanólico
foram gerados e estudados por fotólise por pulso de laser como descrito no item
III.4.1.4. Os experimentos foram realizados na concentração de 5,0 µM para
ambos os FS ZnC
4
P e H
2
C
4
P e estão ilustrados na figura 15.
Figura 15. Espectro de absorção do transiente obtido através do método de
fotólise por pulso de laser da ZnC
4
P(▼) e H
2
C
4
P (●) (5 µM) em etanol 30 mJ por
pulso após excitação por pulso de laser em 355 nm, mostrando a absorção máxima
do triplete centrada no comprimento de onda de 420 nm para ZnC
4
P e 450 nm
para H
2
C
4
P, e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 410 nm.
Espectro de absorção do transiente obtido através do método de fotólise por
pulso de laser da ZnC
4
P(▼) e H
2
C
4
P (●) (5 µM) em etanol 12 µs após excitação
por pulso de laser em 355nm, mostrando a absorção máxima do triplete centrada
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
93
no comprimento de onda de 420 nm para ZnC
4
P e 450 nm para H
2
C
4
P e o
fotobranqueamento do estado fundamental centrado a aproximadamente 410 nm.
O estado excitado triplete dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P apresenta absorção
na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm com o máximo da absorção do
transiente em 420 nm para ZnC
4
P e 450 nm para H
2
C
4
P, e está de acordo com o
estado excitado triplete de muitas outras porfirinas (Foley et al., 1997b).
Para a ZnC
4
P observamos, segundo a figura 15, que na absorção máxima, a
variação da densidade ótica no estado triplete é de 0,10 enquanto que para H
2
C
4
P é
de aproximadamente 0,025. Isto é em torno de uma ordem de grandeza maior no
sinal do triplete, o que indica um maior rendimento quântico de produção de
triplete para ZnC
4
P em comparação à H
2
C
4
P, uma vez que a eficiência
fotodinâmica é criteriosamente dependente do tempo de vida e do rendimento
quântido do estado triplete.
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τ
T
) da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P
foram calculados através da análise cinética das curvas de decaimento dos
transientes no máximo da absorção triplete (420 e 450 nm, respectivamente)
usando-se um programa de ajuste do próprio aparelho.
Os resultados obtidos através dos experimentos de fotólise por pulso de
laser mostraram a presença de espécies simples, que decaem
monoexponencialmente com tempos de vida da ordem de µs, para a ZnC
4
P e para
a H
2
C
4
P em etanol.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
94
Os valores dos tempos de vida do triplete obtidos para a ZnC
4
P e H
2
C
4
P
outros parâmetros fotofísicos, tais como tempo de vida singlete, rendimento
quântico fluorescência e produção oxigênio singlete, estão sumarizados na tabela
1.
Tabela 1. Parâmetros Fotofísicos da ZnC
4
P e H
2
C
4
P (6 µM em meio etanólico ).
τ
T
= tempo de vida triplete, τ
S
= tempo de vida singlete, Φf = rendimento quântico
de fluorescência e Φ
∆
= rendimento quântico de oxigênio singlete.
Fotossensibilizador
τ
T
(µs)
solução
desaerada
τ
S
(µs)
solução
aerada.
Φ
f
Φ
∆
H
2
C
4
P
0,42 ± 0,02 7,83 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,62 ± 0,01
ZnC
4
P
0,73 ± 0,02 1,31 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,46 ± 0,01
A duração do tempo de vida triplete depende de uma série de fatores, tais
como solvente, concentração no estado fundamental, concentração no estado
triplete e presença de supressores. Em nossos estudos, as medidas foram realizadas
em solução etanólica desaerada.
Podemos verificar, de acordo com a tabela 1, que o fármaco
fotossensibilizador metalado ZnC
4
P possui o tempo de vida triplete maior, o
tempo de vida singlete menor e o rendimento quântico de fluorescência menor que
para o fármaco fotossensibilizador H
2
C
4
P, o que é esperado pois a presença do
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
95
metal diamagnético é mais adequada para que ocorra uma fotossensibilização
eficiente. Se houvesse a presença de um composto análogo contendo um metal
paramagnético, este último diminuiria o tempo de vida do estado excitado triplete,
tornando o fotossensibilizador inativo(Bonnet, 2000).
O valor do tempo de vida triplete encontrado para ZnC
4
P foi 0.73 µs, maior
que o da porfirina não metalada H
2
C
4
P (0.42 µs), o que está de acordo com a
literatura(Bonnet, 2000). Este tempo mostrou-se ser suficiente para que os estados
tripletes excitados produzidos reajam com o oxigênio molecular presente no meio,
produzindo oxigênio singlete ou outras espécies reativas de oxigênio (EROs).
IV.1.5 Estudos para a determinação do rendimento quântico de produção do
oxigênio singlete (Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
) dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P em
meio orgânico.
O oxigênio singlete (
1
O
2
) desempenha um papel chave em muitos processos
oxidativos fotoinduzidos em sistemas químicos e biológicos. Acredita-se que ele é
um dos principais agentes responsáveis pela inativação da célula tumoral. Assim,
um grande número de investigações tem sido realizado(Spiller, 1998).
O aniquilamento do estado excitado triplete pelo oxigênio molecular pode
ocorrer pelo processo Tipo I (transferência eletrônica) ou Tipo II (transferência de
energia) como descrito na introdução.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
96
Para porfirinas base livre, o processo Tipo II é frequentemente
dominante(Bonnett et al., 1988). Para confirmar, foram realizadas medidas de
emissão resolvidas no tempo, onde determinamos a produção de oxigênio singlete.
O sinal de emissão do O
2
(
1
∆
g
) formado depois da excitação das soluções de
porfirina em meio etanólico mostraram que o decaimento é de primeira ordem. O
rendimento quântico de produção de oxigênio singlete foi medido pela emissão de
luminescências das porfirinas ZnC
4
P e H
2
C
4
P em 1270 nm, conforme descrito no
item III.4.1.5.
Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 1, onde podemos
verificar que o valor encontrado para H
2
C
4
P (Φ
∆
= 0.62) é maior que o valor
encontrado para ZnC
4
P (Φ
∆
= 0.46). Estes resultados indicaram que H
2
C
4
P
apresenta uma eficiência um pouco maior na produção de oxigênio singlete que a
equivalente metalada ZnC
4
P. Embora a porfirina metalada tenha um tempo de vida
do estado excitado triplete maior, sua produção final de oxigênio singlete é menor
comparada à base livre. Porém, este valor é da mesma ordem de grandeza que de
outras porfirinas metaladas, o que garante sua utilização na TFD(Bonnet, 2000).
Para entendermos se está ocorrendo o cruzamento intersistema de uma forma
eficiente para a porfirina metalada e base livre, realizamos o estudo da
determinação do rendimento quântico de formação do estado triplete.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
97
IV.1.6. Determinação do Rendimento Quântico de Formação do Estado
Triplete dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P.
Entre todos os estudos fotofísicos e fotoquímicos envolvendo FS ativos no
processo fotodinâmico, o mais importante é o da detecção e quantificação da
formação do estado triplete, pois a ação fotodinâmica é diretamente dependente da
interação dos fármacos fotossensibilizadores neste estado excitado com substratos
biológicos ou com o oxigênio molecular (Mecanismos I e II de
fotossensibilização). É importante que o estado triplete seja produzido em alta
concentração; portanto, o Φ
T
é um importante parâmetro fotofísico a ser
determinado.
Vários são os métodos disponíveis para a determinação do rendimento
quântico de formação do estado triplete (Amand e Bensasson, 1975). Neste
trabalho, o Φ
T
foi determinado utilizando-se a técnica de flash fotólise a laser. A
determinação do Φ
T
para a ZnC
4
P e para a H
2
C
4
P foi feita empregando-se a TPP
como composto de referência (Φ
T
= 0,8 em tolueno) (Dupuis et al., 1999).
O cálculo do Φ
T
inicia-se com a determinação do espectro real do estado
triplete e o coeficiente de absorvidade molar no estado triplete excitado (ε
T
) para
os fármacos fotossensibilizadores no comprimento de onda de máxima absorção
de seus transientes (430 nm para ambos os fármacos, ZnC
4
P
e H
2
C
4
P). As leituras
de absorção do transiente foram determinadas 8 ns, após o pulso de excitação do
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
98
laser para a TPP e para os demais fármacos fotossensibilizadores, procedimento
descrito no item III.4.1.6.
As medidas de rendimento quântico do estado excitado triplete para os
fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P
e H
2
C
4
P foram determinadas para a
absorção inicial do triplete em várias intensidades do laser, comparadas com os
valores do padrão TPP em tolueno e calculadas usando o rendimento da literatura
e o coeficiente diferencial de absorção molar para o estado triplete da TPP.
O valor encontrado de rendimento quântico do estado excitado triplete (Φ
T
)
para ZnC
4
P
foi de 0,73 ± 0,06, e para H
2
C
4
P foi de 0,63 ± 0,05.
O aniquilamento do estado excitado triplete pode ocorrer por dois
mecanismos: Tipo I (transferência de elétron) e Tipo II (transferência de energia).
Para a porfirina base livre H
2
C
4
P, o Tipo II parece ser dominante, assim como para
outras porfirinas (Sobolev , Jans e Rosenkranz, 2000), visto o maior rendimento
quântico de produção de oxigênio singlete da porfirina base livre H
2
C
4
P (Φ
∆
=
0,62).
No entanto, para o fotossensibilizador metalado ZnC
4
P, a presença do Zn
e/ou do éter de coroa impede uma eficiência completa na transferência de energia
do fotossensibilizador excitado para o oxigênio molecular, pois o rendimento
quântico de produção de oxigênio singlete foi menor que o da base livre, Φ
∆
=
0,46. Sendo assim, concluímos que o processo Tipo I, neste caso, é o mecanismo
de desativação dominante, o que leva à produção de outros ROS.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
99
Os estudos espectroscópicos foram realizados no laboratório de
Fotoquímica e Fotomedicina da FFCL-RP e sua publicação está anexada junta a
esta Tese de doutorado, PELEGRINO, A.C. e col. Photophysical properties of
crowned ether porphyrins. Photochemistry and Photobiology. v.81, p.771-76,
2005.
Ambos os fármacos fotossensibilizadores parecem ser potencialmente
eficientes para Terapia Fotodinâmica, o que justifica e respalda nossos estudos in
vitro.
IV.1.7a Preparação da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P em meio lipossomal.
O efeito dos FS em sistemas biológicos não é governado apenas pelas suas
propriedades fotofísicas, mas também pela especificidade de suas interações com
biosistemas. Contudo, a localização preferencial do FS no tecido tumoral é fator
determinante que afeta não só a terapia, mas também o mecanismo que leva a
destruição do tumor.
Um dos principais objetivos dentro da TFD é o aumento da seletividade dos
FS pelos tecidos tumorais. Na tentativa de aumentarmos esta seletividade,
preparamos soluções lipossomais com nossos fármacos fotossensibilizadores,
conforme descrito no item III.4.1.7.
Assim como descrito por Kremer(Kremer et al., 1977), observamos a
formação de uma solução lipídica límpida quando alcançamos a concentração
ideal de DPPC e lisofosfatidilcolina, para a incorporação da ZnC
4
P e da H
2
C
4
P.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
100
Observamos também que a velocidade de injeção e agitação influenciam
diretamente no tamanho das vesículas formadas(Nunes , Sguilla e Tedesco,
2004b).
Foram realizados estudos para controle da estabilidade da formulação
através de medidas de absorbância, nos quais observamos que não houve alteração
significativa no espectro de absorção das suspensões lipossomais, o que indica a
estabilidade do fármaco no meio em estudo por até duas semanas. Não obtivemos
incorporação dos fármacos quando utilizamos colesterol na composição lipídica.
Após a incorporação dos fármacos nos lipossomas, houve mudança nos
comprimentos de onda de absorção máximos de 8 nm para ambos os fármacos
estudados. Assim o espectro de absorção da ZnC
4
P (6 µM) e da H
2
C
4
P (6 µM) em
meio lipossomal, figura 16, mostra uma absorção máxima a 432 nm (Soret-band)
para ZnC
4
P, e a 428 nm (Soret-band) para H
2
C
4
P, não ocorrendo mudanças em
seus perfis espectrais em comparação aos espectros de meio orgânico, o que é
freqüentemente observado para derivados porfirínicos(Wiehe et al., 2001).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
101
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Absorbance
800700600500400300
Wavelenght, nm
Figura 16. Espectro de absorção normalizado para H
2
C
4
P (6 µM em meio
lipossomal -----) e ZnC
4
P (6 µM em meio lipossomal
______
)
Levando em consideração os estudos realizados anteriormente, onde autores
relataram que os éteres de coroa encontram-se incorporados aos poros do tubo e
que os lipídios ficam em posição perpendicular ao plano do éter(Hartgerink , Clark
e Ghadiri, 1998); (Otto , Osifchin e Regen, 1999); (Voyer e Robitaille, 1995),
podemos considerar que nossos fármacos encontram-se incorporados aos
lipossomas e que, possivelmente, a associação dos éteres de coroa está induzindo a
formação de nanotubos, formando os canais necessários para a alteração da
homeostase celular como esperado (figura 17).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
102
Figura 17. Figura demonstrativa da formação de canais de íons.
IV.1.7.b Preparação da ZnPc e o éter de coroa em meio lipossomal.
Uma das propostas de estudo do projeto para esta tese de doutorado foi o
estudo de ftalocianinas ligadas covalentemente a éteres de coroa, com o objetivo de
se estudar o sinergismo na ação da ftalocianina e o éter de coroa, visto que, como
já escrito na introdução, as ftalocianinas mimetizam as porfirinas e também
absorvem luz dentro da “janela terapêutica” onde a transparência do tecido
biológico é elevada e a absorção desta irradiação por moléculas endógenas do
sistema biológico é praticamente nula.
Contudo, por problemas na síntese, as ftalocinainas derivadas de éter de
coroa não foram fornecidas pelo Grupo de Síntese Orgânica da Universidade do
Vale do Paraíba, coordenado pelo Prof. Dr. Milton Beltrame Junior. Sendo assim,
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
103
foram realizados estudos em sistemas mistos contendo a zinco ftalocianina (ZnPc)
e o éter de coroa. Estes estudos foram feitos em um sistema lipossomal no qual os
compostos estão associados na formulação, conforme descrito no item III.4.1.7
Estes estudos permitiram com que esses sistemas fossem também avaliados
in vitro quanto à alteração na homeostase intracelular de íons Na
+
e K
+
, o que
permitiu uma análise geral da ação sinérgica dos mesmos, no processo apoptótico
da célula tumoral.
Nas Figuras 18 e 19, respectivamente, estão apresentados os espectros de
absorção para a ZnPc (5µM) em etanol, a partir de uma solução estoque de ZnPc
em (DMF/DMSO), e os espectros da absorção para a ZnPc (5µM) em meio
lipossomal e na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6.
Figura 18. Espectro de absorção normalizado da ZnPC (5,0µM) em etanol.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
104
Figura 19: Espectro de absorção normalizado da ZnPC (5,0µM) em meio
lipossomal na ausência (−) e na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6
(16µM) (−).
O perfil do espectro de absorção para a ZnPC tanto em etanol quanto em
meio lipossomal na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 foi idêntico ao
observado para ZnPC na ausência de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 (Figuras 15
16). Entretanto, a incorporação da ZnPC aos DPPC e lysofosfatidilcolina leva a
um deslocamento nas bandas (de 666 em etanol para 672 nm em DPPC). Este fato
foi observado para a absorção nas bandas Q do espectro (600 a 700 nm), análogo
ao descrito para outros compostos porfirínicos (Chatterjee e Srivastava, 2000).
Além disto, um aumento do espalhamento foi encontrado no espectro de absorção,
na região abaixo de 600 nm, para a ZnPC incorporada aos fosfolipídios.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
105
A espectroscopia de emissão de fluorescência no estado estacionário para a
ZnPC (5 µM) em etanol e incorporada aos fosfolipídios na ausência e na presença
de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 (16 µM) está apresentada nas Figuras 20 e 21,
respectivamente.
Figura 20 Espectro de emissão de fluorescência normalizado da ZnPC (5,0µM)
em etanol. (λ
exc
= 610 nm)
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
106
Figura 21. Espectro de emissão de fluorescência normalizado da ZnPC (5,0µM)
incorporada aos fosfolipídios na ausência (−) e na presença de 2-
(Hydroxymethyl)-18-crown-6 (16µM) (−). (λ
exc
= 610 nm)
A incorporação da ZnPC aos fosfolipídios resultou em um deslocamento
para o vermelho na emissão máxima de fluorescência da ZnPC. Os máximos de
fluorescência passaram de 678 nm para a ZnPC em meio orgânico a 682 nm para a
ZnPC em meio lipossomal na ausência de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6, e a 685
nm para ZnPC em meio lipossomal na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-
6 (Figura 21).
Os resultados obtidos indicaram que a incorporação no sistema lipossomal
e a presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 não alteram significativamente as
propriedades do fármaco fotossensibilizador ZnPC no estado estacionário. Estes
são dados muito importantes para o desenvolvimento do lipossomo ZnPC/2-
(Hydroxymethyl)-18-crown-6, pois assim pode-se estudar a influência do éter de
coroa no processo de despolarização da membrana plasmática das células J774-
A.1.
IV.1.8 Estudos do potencial zeta e tamanho de partículas da Zinco
Ftalocianina (ZnPC) na ausência e na presença do éter de coroa 2-
(Hydroxymethyl)-18-crown-6.
A análise da distribuição do tamanho da ZnC
4
P, H
2
C
4
P e ZnPC lipossomal
na ausência e na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-crown-6 foi realizada no
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
107
Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da FCFRP/USP da Profª D
ra
. Maria
Vitória Lopes Badra.Bentley, em um equipamento adquirido junto ao grupo
Multiusuário (Processo Fapesp n
o
04/09465-7).
A técnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na
caracterização dos lipossomas, os quais devem apresentar dimensões
nanométricas.
As amostras foram submetidas sem diluições a medidas de espalhamento
dinâmico de luz utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS (Malvern-
UK). Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
óptico e as medições foram feitas à temperatura ambiente (25ºC). O equipamento
possui um laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633
nm e realiza as medições não invasivas por “backscatter optics” (NIBS). As
medições foram feitas num ângulo de detecção de 173º e a posição da medição na
cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento. O
equipamento realiza em média 12 determinações para cada análise, conforme
descrito no item III.4.1.8. Foram realizadas medidas de tamanho para as amostras
dos lipossomas de ZnPC
na ausência e na presença de 2-(Hydroxymethyl)-18-
crown-6 e para ZnC
4
P e H
2
C
4
P.
O potencial zeta é um indicador útil da carga superficial líquida da
partícula, e assim pode ser usado para prever e controlar a estabilidade de
suspensões e emulsões coloidais. Tanto o potencial zeta quanto o tamanho das
partículas foram medidos pelo mesmo equipamento de espalhamento dinâmico da
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
108
luz. Neste experimento, o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partículas e realiza em média vinte e
duas medidas para cada amostra analisada.
A tabela 2 mostra os valores de tamanho das partículas e o potencial zeta
encontrados nas amostras analisadas.
Os sistemas lipossomais preparados nesta etapa apresentaram estabilidade
por um tempo aceitável (15 dias). Sendo assim, conclui-se que as partículas
formadas possuem força suficiente para suprir a tendência natural à agregação.
A incorporação do complexo na formulação propiciou um aumento de
carga na camada de repulsão eletrostática, o que ocasiona um aumento na
estabilidade. Este fato pode ser observado nos resultados demonstrados na tabela 2
abaixo.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
109
Tabela 2: Tamanho das partículas e potencial zeta das preparações lipossomais
Lipossomos Tamanho de partícula (nm) Potencial Zeta (mV)
Vazio
70,1 ± 0,3
-25,5
Éter de coroa
88,6 ± 0,4
-28,2
ZnPC
81,1 ± 0,1
-24,8
ZnPC e éter
de coroa
90,3 ± 0,2
-22,3
ZnC
4
P
150 ± 0,2
H
2
C
4
P
148 ± 0,01
De acordo com os resultados mostrados na tabela 2, podemos observar que
o lipossomo contendo a ZnPc e o éter de coroa apresentaram características
semelhantes às do lipossomo sem o fármaco. Dessa forma, a associação destes
dois fármacos em lipossomo não ocasionou mudanças significativas no que tange
o tamanho das partículas e o potencial zeta.
Também foi realizado um estudo do tamanho de partícula e Potencial Zeta
da ZnC4P e H2C4P em meio lipossomal, onde as medidas do diâmetro médio das
partículas com base em medidas de espalhamento de luz nos mostram que o
tamanho médio das vesículas foi de 150 nm.
Essas soluções lipossomais de fármacos foram imprescindíveis para
auxiliarem o processo de incorporação da ZnC
4
P e H
2
C
4
P lipossomal nas culturas
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
110
celulares, pois a capacidade de interação das células com vesículas lipossomais de
pequeno tamanho, como o lipossoma preparado neste trabalho, deve ser muito
maior quando comparada aos lipossomas de tamanho próximo à dimensão celular.
Um estudo paralelo para avaliar a influência da concentração salina na
estabilidade das formulações lipossomais foi realizado. Neste estudo pequenas
alíquotas de NaCl (estoque) foram adicionadas à solução lipossomal resultando em
uma variação da concentração de sal, como mostra a tabela 3. Após cada adição, o
diâmetro médio do lipossoma foi novamente determinado com base em medidas
de espalhamento de luz. Posteriormente, repetimos o mesmo procedimento para o
sal KCl, utilizando-se as mesmas concentrações.
Tabela 3- Cálculo do diâmetro médio do lipossoma com base em medidas de
espalhamento de luz.
Concentração
sal
Lipos.ZnC
4
P +
NaCl (nm)
Lipos. ZnC
4
P +
KCl (nm)
0 mM 144,6 ± 0,3 152,6 ± 0,3
12 mM 145,2 ± 0,1 149,3 ± 0,2
50 mM 149,8 ± 0,2 153,9 ± 0,2
150 mM 147,3 ± 0,1 152,2 ± 0,3
180 mM 143,8 ± 0,2 153,6 ± 0,4
Esses estudos mostraram que tanto NaCl como o KCl não interferem no
tamanho médio das vesículas lipossomais preparadas na presença do fármaco, e
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
111
estão de acordo com os estudos de Echegoyen(Echegoyen et al., 1988). No
trabalho realizado por estes autores, foram preparados lipossomas formados por
éteres de coroa ligados covalentemente ao colesterol, onde o éter de coroa se
apresenta com um forte caráter hidrofílico e a cadeia de colesterol com um forte
caráter lipofílico. Uma análise dos lipossomas aos quais o mesmo foi incorporado
indicou que os éteres de coroa se situaram junto à cabeça polar dos fosfolipídios
do lipossoma e que a parte pertencente ao colesterol se localizou
preferencialmente na bicamada lipídica, isto é, junto à parte apolar dos
fosfolipídios.
O mesmo tipo de comportamento é esperado para nossos fármacos, visto
que a estrutura porfirínica da molécula apresenta um forte caráter apolar e deve
permanecer entre a bicamada dos agregados lipossomais, ao passo que o ligante
éter de coroa deve se localizar junto à cabeça polar dos fosfolipídios.
Os compostos descritos no trabalho de Echegoyen também foram avaliados
frente à associação dos mesmos a íons Na
+
e K
+
por meio de uma solução
homogênea dos respectivos sais, onde foi observado que esses íons de Na
+
e K
+
influenciaram muito pouco no tamanho final das suspensões
lipossomais(Echegoyen et al., 1988). O mesmo comportamento foi observado em
nosso trabalho para nossos compostos, o que reforça a idéia da localização dos
mesmos nos lipossomas.
Essas análises foram primordiais para os futuros estudos em cultura celular,
nos quais se propõe uma alteração na homeostase intracelular de íons Na
+
e K
+
,
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
112
avaliando, assim, seu efeito no processo apoptótico das células tumorais quando
associado ao processo fotodinâmico.
IV.2 Estudos envolvendo linhagem de células J774-A.1.
IV.2.1 Diagrama de crescimento da cultura celular
Para assegurar um crescimento fisiológico sadio e reprodutível da cultura
de células, é necessário seguir uma metodologia especial. Basicamente, esta
metodologia envolve tópicos como: local de trabalho adequado, técnicas
assépticas para crescimento e manutenção de cultura, assepsia de materiais,
controle bacteriológico de reagentes e meio de cultura etc(Filho e et al, 1994).
As maiorias dos estoques primários de culturas celulares são fornecidas por
diferentes companhias existentes no mercado. Estes estoques primários de células
são fornecidos na forma congelada ou na forma de células recém cultivadas. Além
disso, juntamente com o lote de células, são fornecidas todas as informações
necessárias referentes ao meio de cultura mais apropriado para crescimento, tempo
de vida média das culturas, forma de estocagem, etc.
Entretanto, todo trabalho inicial com uma nova cultura de células deve ser
acompanhado de controles básicos, sendo o mais importante deles o que nos
fornece a relação de crescimento da cultura celular em função do tempo.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
113
Embora existam diferentes tipos de cultura celular, em geral todas
apresentam um diagrama de crescimento básico, onde é possível identificar ao
menos três fases distintas de crescimento.
A primeira fase, conhecida como fase preparatória, consiste no período no
qual não se observa um crescimento apreciável da cultura celular (0 a 5 %). Nesta
fase as células se adaptam metabolicamente ao sistema de cultura, ou seja, meio,
temperatura, recipiente, etc.
A segunda fase, conhecida como fase logarítmica ou fase de crescimento,
representa a parte mais importante da cultura, onde usualmente encontra-se uma
porcentagem de crescimento de 90 a 100%. Esta é sem dúvida a melhor fase para
execução dos estudos em sistemas celulares, uma vez que a cultura encontra-se em
plena atividade metabólica com número máximo de células saudáveis.
A terceira fase, conhecida como platô, é caracterizada por apresentar uma
população elevada de células, onde geralmente existe uma redução drástica na
porcentagem de crescimento (0 a 10 %). Geralmente, nesta última fase, as células
não se apresentam fisiologicamente sadias e muitas estão mortas, sendo, portanto,
desfavorável o desenvolvimento de estudos relacionados à atividade celular nesta
fase.
Entretanto, para cada tipo diferente de cultura celular deve-se determinar
precisamente seu diagrama de crescimento característico. Com o crescimento
desta cultura, atinge-se a fase ideal, para preparo de outras subculturas, e assim
sucessivamente.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
114
A periodicidade na qual a cultura deve ser alimentada, o tempo ideal para
troca de meio de cultura, ou mesmo a preparação de uma nova subcultura é
determinada por fatores, como:
1) Variações bruscas no pH do meio, detectados visualmente pela mudança na
cor do indicador presente no meio de cultura;
2) Altas concentrações celulares (observadas através do microscópio inverso),
caracterizado por aglomeração celular. Em geral ocorre quando a cultura atingiu a
fase de platô no diagrama celular;
3) Mudanças morfológicas, ou seja, tamanho, geometria das células, granulação ao
redor dos núcleos etc.
As culturas celulares foram desenvolvidas em incubadora, termostatizadas a
37 °C e aeradas continuamente com 5.0 % de CO
2
, controlando-se sempre o
volume, profundidade e superfície de área ocupada pela cultura nos respectivos
frascos.
A seguir, na Figura 22, apresentamos um exemplo típico de curva de
crescimento para cultura celular de células J774A.1, realizado conforme
metodologia descrita anteriormente.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
115
Figura 22. Curva de crescimento da linhagem J774-A.1 até 67 horas
A curva de crescimento para a linhagem neoplásica J774-A.1 mostra que a
partir de uma concentração celular de 0,13 x 10
6
células/mL, as células atingiram
sua fase logarítmica de crescimento depois de 25 horas e o platô foi atingido após
45 horas com concentração celular de 1,4 x 10
6
células/mL.
Com base nos resultados obtidos para a curva de crescimento de cultura
J774-A.1, e considerando-se a melhor fase para desenvolvimento dos estudos,
como a fase logarítmica de crescimento (fase de plena atividade fisiológica),
decidiu-se trabalhar sempre com culturas situadas entre 0,5 a 1,3 x 10
6
células/mL, (ponto médio da fase logarítmica), respeitando-se o índice de 1 a 5 %
de células, marcadas com azul de Tripan, (valor aceito como normal para estes
tipos de cultura celular).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
116
IV.2.2 Definição de parâmetros para os estudos de fototoxicidade.
Antes dos estudos de fototoxicidade, foi realizada uma série de
experimentos com o intuito de definir parâmetros para se obter a melhor resposta
dos fotossensibilizadores frente aos experimentos de fototoxicidade, in vitro.
1- Estudou-se a toxicidade dos fármacos em diferentes concentrações em meio
homogêneo e micro heterogêneo (lipossomal) para se determinar a maior
concentração não citotóxica;
2- Checou-se a viabilidade celular dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e
H
2
C
4
P nos diferentes meios fisiológicos em diferentes tempos de incubação
(7 e 24 horas), para se determinar o meio no qual seria possível realizar um
estudo de cinética de incorporação;
3- Analisou-se o efeito do soro bovino fetal (SBF) na incorporação dos
fármacos ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP em meio homogêneo e micro heterogêneo
em células neoplásicas J774-A.1, com o intuito de verificar a influência da
porcentagem de SBF na incorporação dos fármacos;
4- Desenvolveu-se método analítico para quantificação dos fármacos ZnC
4
P,
H
2
C
4
P e TPP por espectrofluorometria;
5- Avaliou-se a cinética de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP no meio fisiológico de cultura (DMEM com 10% de
SBF).
Com esses estudos, definiu-se a concentração dos fármacos, o tempo de
incubação ideal e a porcentagem de soro bovino fetal (SBF) a ser utilizada nos
estudos in vitro, meio fisiológico, além de ter sido avaliada a cinética de
incorporação dos mesmos.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
117
IV.2.2.1 Toxicidade dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio homogêneo e
micro heterogêneo sobre a linhagem de células J774-A.1 em meio Hank’s
Antes da realização dos estudos de citotoxicidade, foram realizados estudos
preliminares de toxicidade dos fármacos ZnC
4
P e H
2
C
4
P em diferentes
concentrações na linhagem de células J774-A1 em meio Hank’s, como descrito na
seção III.4.2.2.1. Estes estudos permitiram não só o aprendizado das técnicas
fotobiológicas de manipulação e trabalho in vitro, como também forneceram uma
visão geral do comporto e f0.111333(ã)-0.4444[(vi)0.22()8333 0 0 cm459(m)9.480742(nt)0.89(c)-0.4442(o)-9.(r)-9.5926(c)-0.4442(o)-9.(hop9.9995 486.919(ge)-.89(c)-0t1(s)0.1178(e)-0.445330t1(s)0.1178(e)-0.4453)-0.4442(o)96 Tf221.527.7778(do)-9.25926(s).7778(J)0.110768(774-221535(z)-0.445331(a)-9.70)-0.4453 Tf331(l)7de2(nt)0.89(c.8148(t)0.26.84 Tm741(t)]TJ39( )-231.481( )-27.777)-0.4453 .445331(o)-0.221535(t)0. uma
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
118
meio lipossomal a 2, 4 e 6 µM apresenta uma porcentagem de morte da ordem de
2,5 %, 4,9% e 15,6 % respectivamente, enquanto que a base livre H
2
C
4
P em meio
lipossomal a 2, 4 e 6 µM apresentou uma porcentagem de morte da ordem 1,3 %,
4,2 % e 9,4%, respectivamente, para as células macróficas J774 A-1.
Já para os estudos in vitro, onde os fármacos fotossensibilizadores foram
administrados inicialmente em meio homogêneo, observou-se uma maior
toxiciadade para ZnC
4
P (2, 4 e 6 µM), que foi da ordem de 3,2 %, 5,4% e 19,8 %,
respectivamente, em relação à base livre H
2
C
4
P (2, 4 e 6 µM), que foi da ordem de
1,6 %, 4,9 % e 12,4, respectivamente, na presença de células macrofágicas J774
A-1.
Estes resultados indicaram que ZnC
4
P apresenta uma toxicidade no escuro
um pouco maior quando comparada com a H
2
C
4
P, porém os valores de toxicidade
até a concentração de 4µM estão dentro do valor basal, normalmente encontrado
para este tipo de linhagem celular (<5%). Também foi observado que para os
experimentos onde os fármacos fotossensibilizadores foram estudados em meio
fisiológico Hank’s (meio homogêneo), a toxicidade foi maior comparada à mesma
concentração em meio lipossomal.
Sendo assim, adotamos a concentração de 4µM para nossos fármacos, tanto
em meio heterogêneo quanto em homogêneo, pois esta foi a maior concentração
encontrada que não ultrapassou o nível basal de 5%.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
119
IV.2.2.2 Viabilidade celular dos fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e
H
2
C
4
P nos diferentes meios fisiológicos.
Com o objetivo de se determinar qual o melhor ambiente para a realização
dos estudos in vitro, a citotoxicidade das células J774-A.1 foi avaliada através da
incubação dos fármacos com os diferentes meios: tampão fosfato (pH 7,4), tampão
Hank´s, meio de cultura (DMEM) sem soro fetal bovino (SBF) e com 1, 3 e 10 %
de SBF, com tempos fixos de 7 e 24 horas. Foram adotados estes tempos de
incubação porque estudos preliminares em meio fisiológico Hank’s, descritos no
item III..4.2.2.1.a, haviam mostrado que para a ZnC
4
P, tanto em meio homogêneo
quanto em meio heterogêneo, a maior taxa de incorporação ocorre com 7 horas de
incubação.
Nestes experimentos, a citotoxicidade dos fármacos foi avaliada através do
teste de MTT (descrito no item III.4.2.1.d), que monitora a atividade mitocondrial
das células, em relação à viabilidade celular das células controle. Os resultados
estão apresentados na Tabela 5.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
120
Tabela 5- Porcentagem de células mortas após a incubação das células J774-A.1,
por 7 e 24 horas, com os diferentes meios de cultura.
% de células mortas Meios
7 horas 24 horas
Tampão fosfato 32,3 55,0
Hank´s 16,0 45,0
Meio de cultura sem soro 18,0 40,0
DMEN c/ 1 % de serum 8.0 16,0
DMEN c/ 3 % de serum 7.0 15,0
DMEN c/ 10 % de serum 0.0 0.0
Os resultados obtidos indicaram que o melhor meio de cultura a ser
utilizado foi o que contém 10 % de soro bovino fetal. A influência da porcentagem
de soro bovino fetal na taxa de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
foi avaliada, uma vez que está estabelecido que a porcentagem de SBF pode
interferir na taxa de incorporação e viabilidade celular(Richter et al., 1993).
IV.2.2.3 Efeito do SBF na incorporação dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas J774-A.1.
Um dos maiores problemas presentes nos estudos in vitro e in vivo na TFD
relaciona-se diretamente à habilidade do fármaco fotossensibilizador de acumular-
se preferencialmente no tecido tumoral. A taxa de incorporação do fármaco na
célula tumoral é altamente dependente de sua propriedade lipofílica. Os fármacos
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
121
fotossensibilizantes podem interagir com lipoproteínas e soro albuminas presentes
no sangue. Para fármacos hidrofóbicos, prevalece a ligação à lipoproteína e para
fármacos hidrofílicos, a interação com as soro albuminas (Richter et al., 1993).
Com o intuito de analisar o efeito do SBF sobre a taxa de incorporação dos
fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P, realizou-se estudos na ausência e na
presença de soro bovino fetal a 3% e 10%, conforme descrito no item III.4.2.2.2.
Os fotossensibilizadores foram pré-incubados em meio completo DMEM
contendo soro bovino fetal por 2 horas antes de sua utilização nos estudos in vitro
com as células J774-A.1.
Um estudo comparativo com a TPP foi realizado por ser uma porfirina
hidrofóbica e já descrita em muitos trabalhos na literatura como padrão para
estudo de incorporação(Benoît , Didelon e Barberi-Heyob, 2006). Os demais
fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P, devido à presença do éter de coroa
em sua estrutura, apresentam uma maior anfifilicidade, sendo esses estudos,
portanto, essenciais ao trabalho. Dados descritos na literatura demonstram que
para os diferentes tipos de fármacos fotossensibibizadores, existem diferentes
mecanismos de incorporação e associação às células neoplásicas (Ball et al.,
1999). Os resultados obtidos neste trabalho são apresentados nas figuras 23 a 25.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
122
Figura 23. Variação da intensidade de Fluorescência para a ZnC
4
P em DMEN
com diferentes porcentagens de SBF, com λ de excitação fixa em 428 nm. (curva
□ para 0% de SBF, curva □ para 3% de SBF e curva □ para 10% de SBF).
Figura 24. Variação da intensidade de Fluorescência para a H
2
C
4
P em DMEN
com diferentes porcentagens de SBF, com λ de excitação fixa em 424 nm (curva □
para 0% de SBF, curva □ para 3% de SBF e curva □ para 10% de SBF).
Aumento da porcentagem
de soro bovino fetal
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
123
De acordo com os resultados obtidos, apresentados nas figuras 23 e 24,
observou-se que para os fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P, ZnC
4
P ocorreu um
aumento na taxa de incorporação decorrente do aumento da porcentagem do SBF
no meio DMEM. Esse comportamento foi diferente do observado normalmente
para porfirinas lipofílicas administradas intra-venosamente, onde o mecanismo de
incorporação ocorre por um processo de difusão passiva, e onde não se observa
um aumento na taxa de incorporação com o aumento da concentração do
SBF(Alberts et al., 2002).
Nos estudos com a TPP, os resultados foram análogos aos encontrados nos
estudos de Alberts e col., que trabalharam com porfirinas lipofílicas onde não
ocorreu um aumento na taxa de incorporação com o aumento da porcentagem do
soro bovino fetal, o que era esperado considerando-se a estrutura da TPP (figura
25).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
124
Figura 25. Variação da intensidade de Fluorescência para a TPP em DMEM com
diferentes porcentagens de SBF com λ de excitação fixa em 418 nm, (curva □ para
0% de SBF e curva □ para 10% de SBF).
Tanto em meio DMEM na ausência do soro bovino fetal, quanto em sua
presença, a taxa de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores anfifílicos
H
2
C
4
P e ZnC
4
P foi maior que do fármaco fotossensibilizador lipofílico TPP,
(Figura 25).
O comportamento observado para os derivados éteres de coroa pode ser
explicado considerando-se a mudança estrutural da porfirina ligada ao éter de
coroa. O ligante axial provoca uma mudança em seu caráter lipofílico, tornando-a
mais anfifílica, observando assim um aumento na taxa de incorporação do mesmo
com o aumento da porcentagem de SBF. Este fato repercute diretamente na
Aumento da
porcentagem
de soro bovino fetal
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
125
resposta celular induzindo um aumento da atividade metabólica do sistema e,
portanto, uma maior taxa de incorporação. Um aumento na atividade celular
endocitótica explica o aumento na taxa de incorporação. Resultado análogo foi
também observado nos estudos de Taylor e col., onde foi observado um aumento
na atividade metabólica com o aumento do pH do meio de 7,4 para 8,0 (Taylor,
1962).
Com o intuito de estudar a influência do meio lipossomal na incorporação
das células J774-A.1, adotou-se o mesmo protocolo descrito acima. No entanto, os
fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP foram previamente
incorporados a sistemas lipossomais. Porfirinas incorporadas a lipossomos
unilamelares interagem facilmente com as lipoproteínas presentes no SBF,
podendo as mesmas estar associadas aos três maiores componentes lipoprotéicos
presentes no sangue (VLDL, HDL e LDL)(Richter et al., 1993).
A taxa de incorporação dos fotossensibilizadores pelas células J774-A.1 foi
avaliada após a incubação dos mesmos em meio DMEM, na ausência e na
presença do SBF a 3% e 10%. Os resultados estão apresentados nas figuras 26, 27.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
126
Figura 26. Variação da intensidade de fluorescência para a ZnC
4
P em diferentes
porcentagens do SBF no meio de cultura celular, onde o SBF variou de 0, 3 e
10%, com λ de excitação fixa em 428 nm.
Figura 27. Variação da intensidade de fluorescência da H
2
C
4
P em meio
lipossomal em diferentes porcentagens de SBF no meio de cultura celular, onde o
SBF variou de 0, 3% e 10%, com λ de excitação fixa em 424 nm.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
127
De acordo com a figura 23 e 24, pode-se observar que para os fármacos
fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P em meio lipossomal, não ocorreu uma
variação na taxa de incorporação com o aumento da percentagem do soro bovino
fetal, o que reforça a idéia da influência do ligante éter de coroa na taxa de
incorporação. Como em meio lipossomal todos os fármacos em estudo apresentam
forte caráter lipofílico (devido à incorporação do mesmo na dupla camada
lipídica), não se observa o efeito detectado nos estudos em meio homogêneo.
No entanto, para os estudos realizados com a TPP em meio lipossomal
(figura 28), observou-se que ocorreu uma variação na taxa de incorporação
decorrente do aumento da porcentagem do SBF presente no meio de cultura
celular, o que está de acordo com estudos descritos em literatura, onde diferentes
fármacos fotossensibilizadores em diferentes meio de cultura celular apresentam
diferentes mecanismos de incorporação(Siboni et al., 2002).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
128
Figura 28. Variação da Intensidade de Fluorescência para a TPP em DMEM com
diferentes porcentagens de SBF (curva □ para 0% de SBF, curva □ para 3% de
SBF curva □ para 10% de SBF), com λ de excitação fixa em 418 nm
Esses estudos comprovam que a variação de mecanismo de incorporação
depende do veículo de administração utilizado, visto que quando os fármacos
fotossensibilizadores anfifílicos H
2
C
4
P e ZnC
4
P foram incorporados em
lipossomos, não foi observada uma variação na taxa de incorporação em função da
porcentagem de SBF. Porém, para o fotossensibilizador lipofílico TPP, foi
observado um aumento na taxa de incorporação com o aumento da porcentagem
de soro bovino fetal.
Aumento da porcentagem
de soro bovino fetal
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
129
IV.2.2.4 Desenvolvimento de método analítico para quantificação dos
fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP por
espectrofluorometria.
Com o intuito de quantificar a porcentagem de incorporação dos fármacos
fotossensibilizadores nos estudos de incorporação em linhagem neoplásica J774-
A.1, desenvolvemos um método analítico baseado em técnicas
espectrofluorimétricas, conforme descrito no item III.4.2.2.4.
Inicialmente, foi preparada uma solução estoque de cada
fotossensibilizador em estudo (ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP, em meio homogêneo), sendo
as mesmas armazenadas sob proteção da luz e em freezer por no máximo 30 dias.
Em uma cubeta de quartzo prepararam-se por diluições sucessivas, com
auxílio de microseringas, soluções do fármaco dentro do intervalo de concentração
de 0,01 a 2 µM para o meio em estudo.
Traçaram-se, então, os espectros de emissão na faixa de 550 nm a 750 nm
para cada concentração com excitação fixa em 428 nm para ZnC
4
P, 424 nm para
H
2
C
4
P e 418 nm para TPP, variando-se as fendas de emissão e excitação a fim de
se adequar à melhor resolução espectral para ambos os meios estudados, sendo
estabelecidos 10 nm para a abertura da fenda de excitação e 5 nm para a de
emissão como padrões.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
130
O gráfico de emissão vs concentração permitiu estabelecer uma curva de
calibração para o meio em estudo, obtendo por regressão linear a equação da reta
correspondente à curva experimental apresentada a seguir nas figuras 29, 30 e 31.
A partir da equação da reta, calculou-se para cada amostra sua
concentração, sempre mantendo a mesma condição do protocolo experimental
utilizado na obtenção da curva de calibração.
Figura 29. Curva de calibração da ZnC
4
P em etanol. Inserto: espectros de emissão
de fluorescência da ZnC
4
P em etanol, com excitação fixa em 428 nm, fenda de
excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y = 7,0737e
10
x +4104,9, R
2
= 0,995
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
131
Figura 30. Curva de calibração da H
2
C
4
P em etanol. Inserto: espectros de emissão
de fluorescência da H
2
C
4
P em etanol, com excitação fixa em 424 nm, fenda de
excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y= 1,8 e
10
x + 807,0, R
2
= 0,995.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
132
Figura 31. Curva de calibração da TPP em etanol. Inserto: espectros de emissão
de fluorescência da TPP em etanol, com excitação fixa em 418 nm, fenda de
excitação de 10 nm e emissão 5 nm. Equação: y = 4,49e
10
x + 1197,6
IV.2.2.5 Cinética de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P,
ZnC
4
P e TPP no meio de cultura (DMEM com 10% de SBF).
A porcentagem de incorporação da TPP, H
2
C
4
P e ZnC
4
P em função do
tempo de incubação foi avaliada para uma concentração fixa não citotóxica dos
fármacos fotossensibilizadores (4 µM).
Esses estudos foram realizados com os fármacos em meio homogêneo, pois
graças a experimentos comparativos preliminares de cinética de incorporação com
o fármaco ZnC
4
P em meio homogêneo e micro heterogêneo, conforme descrito no
item III.4.2.2.1.a, ficou demonstrado que a taxa de incorporação em meio
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
133
homogêneo foi 3 vezes maior que a taxa de incorporação do mesmo em meio
lipossomal, isso para 7 horas de incubação onde também foi observado a melhor
relação de incorporação com viabilidade celular, o que está de acordo com os
estudos de Richter e col, que demonstraram que derivados de benzoporfirina em
solução lipossomal apresentam uma menor taxa de incorporação quando
comparado com a solução aquosa do fotossensibilizador livre(Richter et al., 1993).
Figura 32. Porcentagem de incorporação, por tempo de incubação, a partir de uma
solução 4 µM de ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP em meio de cultura DMEN com 10
% de SBF pela linhagem celular J774-A.1.
De acordo com a figura 32, podemos verificar que durante as primeiras 7
horas, os fármacos fotossensibilizadores anfifílicos ZnC
4
P e H
2
C
4
P apresentaram
um aumento na porcentagem de incorporação de forma linear decorrente do
aumento do tempo de incubação na presença das células J774-A.1, caracterizado
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
134
por uma diferença significativa na intensidade de fluorescência do
fotossensibilizador, após extração do mesmo em meio orgânico, a partir das
diferentes culturas de células, e quantificada através do uso de uma curva de
calibração para cada fármaco.
O platô foi alcançado com 7 horas de incubação para os fármacos
fotossensibilizantes ZnC
4
P e H
2
C
4
P, onde observamos uma taxa de incorporação
de 31% para H
2
C
4
P e 34% para ZnC
4
P para meio DMEM com 10% de SBF.
Também observamos que a incorporação dos fármacos
fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P foi significativamente maior que a
incorporação do fármaco TPP, o que está de acordo com o aumento do caráter
anfifílico desses fármacos devido à presença do ligante éter de coroa. A baixa
incorporação do fotossensibilizador TPP foi semelhante àquela observada por
Benoit (Stasio et al., 2005), que estudou a taxa de incorporação da TPP usando
microscopia de fluorescência em células HT29.
Porém, a alta taxa de incorporação não é o único fator determinante para a
atividade fotodinâmica. A localização subcelular dos fármacos nos sistemas in
vitro é também muito importante. Na etapa seguinte, realizamos estudos de
fototoxicidade na presença de luz, dentro dos parâmetros estabelecidos nos
experimentos anteriores.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
135
IV.2.3 Estudos fotobiológicos.
IV.2.3.1Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores
H
2
C
4
P, ZnC
4
P e TPP em células neoplásicas da linhagem J774-A.1.
No estudo de fototoxicidade, foi avaliado o efeito da luz monocromática,
provinda de um sistema foto-polimerizador com filtro específico para selecionar a
banda de 400 a 500 nm, sobre os fármacos fotossensibilizantes TPP, H
2
C
4
P e
ZnC
4
P na cultura celular (Células J774-A1), conforme descrito no item III.4.2.3.1.
Neste experimento, as concentrações dos fotossensibilizadores foram fixadas em
4µM, sendo os mesmos incubados com aproximadamente 1x10
6
células/mL, por
um intervalo de tempo de 7 horas a 37
o
C em uma estufa de CO
2
em meio DMEM
contendo 10% de serum. Após o período de incubação, o meio foi descartado e as
células lavadas com tampão Hank’s. A cultura celular em meio tampão Hank’s foi
submetida a 3 diferentes intensidades de irradiação (1, 3 e 5 J/cm
2
). Após a
irradiação, as linhagens foram deixadas na estufa de CO
2
por um período de 24
horas, e então foi realizado o ensaio de MTT para a avaliação da viabilidade
celular. Os dados encontrados por este teste foram tratados estatisticamente pelo
método Students T-Test ANOVA com N=3 e P<0,05.
A figura 33 apresenta a fototoxicidade do ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP na presença
de luz laser.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
136
Figura 33. Porcentagem de viabilidade celular por dose de luz irradiada, onde as
células J774-A.1 foram pré-incubadas com 4 µM de ZnC
4
P, H
2
C
4
P e TPP
em meio de cultura DMEN. Os experimentos foram realizados em triplicatas
independentes. A análise da significância estatística entre o controle e os outros
grupos irradiados foi determinada por one-way ANOVA, seguida pelo teste-t
Newman-Keuls para comparações múltiplas. Os resultados obtidos representam as
médias ± SEM (n=3). Valores de P. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001, p com
relação ao controle.
Durante os experimentos, o controle celular foi incubado com DMEM com
10% de SBF e foi irradiado com foto polimerizador nas três diferentes potências.
Os resultados obtidos indicaram que a luz não afeta a viabilidade celular,
pois não foi observada alteração na atividade basal da linhagem celular em estudo.
Por outro lado, o uso da luz do foto polimerizador apresentou uma diminuição da
porcentagem de células viáveis em relação ao aumento da dose irradiada, resultado
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
137
este também observado em outros estudos de fotossensibilizadores (Stasio et al.,
2005).
Para os experimentos onde TPP foi utilizada, observou-se uma maior
porcentagem de células viáveis em relação aos demais fármacos (95,33 ± 4 % de
células viáveis para uma dose de 1 Jcm
2
; 90,5 ± 4 % de células viáveis para uma
dose de 3 Jcm
2
; 89,1 ± 2 % de células viáveis para uma dose de 5 Jcm
2
). Já para os
experimentos com a H
2
C
4
P, observamos um efeito maior causado pela irradiação
(81,5 ± 7,0 % de células viáveis para uma dose de 1 Jcm
2
; 73,5 ± 1,5 % de células
viáveis para uma dose de 3 Jcm
2
; 50,0 ± 8,5 % de células viáveis para uma dose de
5 Jcm
2
) e para os experimentos com a ZnC
4
P o efeito da irradiação foi ainda mais
pronunciado (67,5 ± 3 % de células viáveis para uma dose de 1 Jcm
2
; 56,9 ± 4 %
de células viáveis para uma dose de 3 Jcm
2
e 44,1 ± 3 % de células viáveis para
uma dose de 5 Jcm
2
).
Estes resultados estão de acordo com nossos estudos, pois
fotossensibilizadores com maior caráter anfifílico apresentaram uma maior taxa de
incorporação em relação ao fotossensibilizador hidrofóbico TPP.
Os experimentos de fotoinativação dos macrófagos (J774A-1) mostraram
que o ZnC
4
P foi o mais efetivo na inativação das células quando comparado com a
H
2
C
4
P. Estes resultados estão de acordo com os estudos fotoquímicos e fotofísicos
desses fármacos, onde observou-se um maior rendimento quântico triplete para
fotossensibilizador ZnC
4
P do que o encontrado para o fotossensibilizador H
2
C
4
P.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
138
Tal comportamento é esperado para metaloporfirinas, em geral com metais de
transição, como, Zn, Cu, Ga, Si.
IV.2.3.2 Avaliação da fototoxicidade dos fármacos fotossensibilizadores em
meio lipossomal.
Também realizamos estudos onde o efeito da luz foi avaliado sobre os
fármacos fotossensibilizantes H
2
C
4
P e ZnC
4
P em meio lipossomal na cultura
celular (células J774-A.1). Neste experimento, as concentrações dos
fotossensibilizadores em meio lipossomal foram fixadas em 4µM, sendo os
mesmos incubados com aproximadamente 1x10
6
células/mL, por um intervalo de
tempo de 7 horas a 37
o
C em uma estufa de CO
2
. Após o período de incubação, o
meio foi descartado e as células lavadas com tampão Hank’s. A cultura celular em
meio tampão Hank’s foi submetida a 3 diferentes intensidades de irradiação (1, 3 e
5 J/cm
2
). Após a irradiação, as linhagens foram deixadas na estufa de CO
2
por um
período de 24 horas, e então foi realizado o ensaio de MTT para a avaliação da
viabilidade celular.
Os resultados de fototoxicidade do H
2
C
4
P em meio lipossomal na ausência
e na presença de diferentes intensidades de luz estão na figura 34 e foram
comparados aos resultados de fototoxicidade do mesmo fotossensibilizador em
meio homogêneo.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
139
Figura 34. Porcentagem de células viáveis após serem incubadas por uma solução
4 µM H
2
C
4
P em meio de cultura DMEN, e 1 µM H
2
C
4
P lipossomal em meio
de cultura DMEN com 10 % de soro bovino fetal pela linhagem celular J774-A.1 e
posteriormente irradiadas. Os experimentos foram realizados em triplicatas
independentes. A análise da significância estatística entre o controle e os outros
grupos irradiados foi determinada por one-way ANOVA, seguida pelo teste-t
Newman-Keuls para comparações múltiplas. Os resultados obtidos representam as
médias ± SEM (n=3). Valores de P. *p<0,05 e **p<0,01, p com relação ao
controle.
Com base nos resultados encontrados, pode-se observar que embora a
concentração do fármaco fotossensibilizador H
2
C
4
P em meio lipossomal seja
menor (1µM) que a dos estudos onde o fotossensibilizador em meio homogêneo (4
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
140
µM), estes apresentaram efeito fototóxico muito próximos. Estes resultados
reforçam a idéia de que a localização subcelular dos fármacos em organelas
aumenta a eficiência fotodinâmica(Ricchelli et al., 1991).
Para os estudos de fototoxicidade do fármaco fotossensibilizador ZnC
4
P em
meio lipossomal, também observou-se uma eficiência fotodinâmica, pois
novamente, com uma menor concentração (1µM) do fármaco fotossensibilizador,
observamos um efeito fototóxico da mesma ordem do fármaco fotossensibilizador
provindo do estoque em DMSO de concentração final de 4 µM para a intensidade
de 5 Jcm
2
.
Figura 35. Porcentagem de células vivas após serem incubadas por uma solução 4
µM ZnC
4
P em meio de cultura DMEN, e 1 µM ZnC
4
P lipossomal em meio de
cultura DMEN com 10 % de soro bovino fetal pela linhagem celular J774-A.1 e
posteriormente irradiadas. Os experimentos foram realizados em triplicatas
independentes. A análise da significância estatística entre o controle e os outros
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
141
grupos irradiados foi determinada por one-way ANOVA, seguida pelo teste-t
Newman-Keuls para comparações múltiplas. Os resultados obtidos representam as
médias ± SEM (n=3). Valores de P. *p<0,05 e **p<0,01, p com relação ao
controle.
Todos os resultados apresentados possuem significado estatístico (P<0,05)
em relação ao controle, isso é, as 3 diferentes doses de luz testadas e aplicadas à
células na presença dos fármacos H
2
C
4
P e ZnC
4
P provocam morte celular.
Como os tecidos tumorais apresentam uma atividade metabólica acelerada,
torna-se vantajoso o uso de sistemas lipossomais que oferecem a possibilidade de
se controlar a biodistribuição do fármaco fotossensibilizador entre os tecidos
tumorais e peritumorais. Sendo assim, com base em nossos resultados obtidos,
torna-se viável também o estudo de nossos fármacos em meio lipossomal
Os experimentos de fotoinativação com os macrófagos (J774A-1)
mostraram que o ZnC
4
P em meio lipossomal foi mais efetivo na inativação das
células quando comparado com o H
2
C
4
P em meio lipossomal (Figura 36).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
142
Figura 36. Porcentagem de células vivas após serem incubadas por uma solução 1
µM H
2
C
4
P lipossomal e ZnC4P lipossomal em meio de cultura DMEN com
10 % de soro bovino fetal pela linhagem celular J774-A.1 e posteriormente
irradiadas. Os experimentos foram realizados em triplicatas independentes. A
análise da significância estatística entre o controle e os outros grupos irradiados foi
determinada por one-way ANOVA, seguida pelo teste-t Newman-Keuls para
comparações múltiplas. Os resultados obtidos representam as médias ± SEM
(n=3). Valores de P. *p<0,05 e **p<0,01, p com relação ao controle.
Frente aos resultados encontrados e aos já conhecidos, como: que os
lipossomos são facilmente incorporados por diferentes tipos de células de
mamíferos; que uma vez suspensos em meio fisiológico, podem ser facilmente
injetados em animais e que o transporte de fármacos fotossensibilizadores na
corrente sangüínea via vesículas lipossomais apresenta uma maior retenção e
seletividade da droga nos tecidos tumorais (Ricchelli et al., 1991), podemos
concluir como um ponto favorável a incorporação de nossos fotossensibilizadores
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
143
em sistemas lipossomais antes de sua administração in vivo para maior eficiência
do processo fotodinâmico.
Em todos os experimentos, tanto em meio DMEM quanto em meio
lipossomal, os resultados estão de acordo com os estudos fotoquímicos e
fotofísicos desses fármacos, onde a produção de oxigênio singlete do
fotossensibilizador ZnC
4
P foi maior que a do fotossensibilizador H
2
C
4
P,
apresentando assim um maior efeito fototóxico.
Estes estudos preliminares para os compostos ZnC
4
P e H
2
C
4
P,
primeiramente realizados por nós (características fotofísicas e fotobiológicas),
indicam importante potencial de aplicação deste derivado éter de coroa no uso da
TFD.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
144
IV.2.4. Estudo da influência do éter de coroa na membrana plasmática.
A membrana plasmática cumpre uma vasta gama de funções. A primeira,
considerando-se a própria célula, é a estrutura que confere ao sistema
individualidade, definindo meios intra e extracelular. Sua presença forma
ambientes únicos e especializados, cuja composição e concentração molecular de
íons são conseqüência de uma permeabilidade seletiva da mesma e dos diversos
meios de comunicação através da membrana com o meio extra-celular.
Além de delimitar o ambiente celular, compartimentalizando moléculas, a
membrana plasmática representa o primeiro elo de contato entre os meios intra e
extracelular, viabilizando informações para o interior da célula, permitindo com
que a mesma responda a inúmeros estímulos externos que podem, inclusive,
influenciar em sua atividade e funções biológicas. Nas interações célula-célula e
célula-matriz extracelular a membrana plasmática participa de forma decisiva. É,
por exemplo, através de componentes da membrana que células semelhantes
podem se reconhecer levando ao processo de agregação e formação de tecidos.
As membranas celulares consistem em uma dupla camada contínua de
lipídios com diferentes proteínas, onde carboidratos e nutrientes das mais diversas
naturezas interagem das mais diversas maneiras. É justamente a dupla camada
lipídica (figura 37) que confere estabilidade e flexibilidade, ao mesmo tempo, à
membrana. Pode-se dizer, portanto, que os lipídios são os componentes que
compõem a estrutura básica da membrana.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
145
Figura 37. Figura esquemática da membrana plasmática
Como a membrana celular delimita o meio intra e extracelular, é necessário
que formas de transporte e de comunicação sejam constantemente estabelecidas.
Os transportes através da membrana podem ou não envolver gasto de energia,
sendo classificados como ativo ou passivo, respectivamente. Exemplos de
transporte passivo são as difusões simples (figura 38). As bombas de íons são
exemplos de transportes ativos.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
146
Figura 38. Figura esquemática do transporte passivo através da membrana.
Um dos objetivos de nosso trabalho nessa tese de doutorado foi a
incorporação de éteres de coroa na membrana plasmática, pois estudos têm
demonstrado que ao se incorporar éter de coroa na membrana plasmática, ocorre a
formação de nanotubos ou nano poros. Os éteres de coroa possuem a capacidade
de formar canais pela associação de moléculas idênticas, além de poderem
adaptar-se à espessura da membrana plasmática, formando assim um novo canal
iônico, específico para íons dependendo do tamanho da cavidade do éter de
coroa(Otto , Osifchin e Regen, 1999; Voyer e Robitaille, 1995). Por exemplo: para
o 18-crow-6 éter de coroa, forma-se um canal específico para íons potássio, e para
o 15-crow-5 éter de coroa, um canal específico para íons sódio.
Quando presentes na membrana plasmática, esses canais são responsáveis
pelas alterações na distribuição de íons entre a região interna e externa do sistema
celular. Essa capacidade de transporte do éter de coroa através da membrana
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
147
plasmática pode ser muito útil no processo de ação fotodinâmica. Estudos de
Specht sobre o mecanismo que desencadeia a morte da célula após a ação
fotodinâmica demonstraram que a resposta celular é fruto de um dano nas
proteínas que transportam íons sódio, potássio e cálcio na membrana plasmática,
gerando um stress osmótico, que desencadeia uma seqüência de outros eventos
celulares(Specht e Rodgers, 1990b).
Sendo assim, a presença do éter de coroa na estrutura do fotossensibilizador
ou concomitante ao fotossensibilizador, em associaosse s cv(i)0.221535(l)-0.445331(t)445331(qüt)-0.445331(t)44531535(a)-110768(( )-333.333(u)-166.3E)]TJ380.28 0 Td[cts (u)-9.25926(m)9.44307r350]TJ-399.6 vre42(l)0.22665(t)0.22266 apo(n)-9.25926(t)c(s)0.11076(t)0.222662(l)0.226656(m)9.48193z(i)-9.0366(c)-0.4448(e)-0.4442(rr)-0.332303(a(i)0.221535(a)-0.4422665(os)0.110768(so )-231.481(f)-9.59156(ot)0.221535(odi)0.221535(nâ)0.110768(t)0.221535(i)0.223773(c)-0.445331(a))-0.332301(. )]TJ36 J.28 0 Td[áte157.4307(5(e157.4307de)-9.70375)-0.445331((u)-9.25926(i)0.222665(3(a)-0.4442(r)-0.333433(a)-9.7034(t))-0.4442((i)0.222665(5(e157.4307d)-0.445331( )175.926(de)-0.445331or)-9.59156(t)0.221535(e)-157.4307(s)0.110768(eui)0.221535(bi)0.221535ís)0.110768(t)0.221535(uc)-0.445331(i)0.57.4307hs)0.110768( )-166.667(u)-9.2592(s)0.110768(o(e)-9.70459(s)-9.14849á(m)9.44307(á)-9.70233(t)0.221535(i)0.22(s)0.1107.57.46(é)-0.445331(t))-37.037(e)-9.70459(m.57.43070.28 0 Td[c)-0.445331doe s0.28 0 Td[(s)0.110768()-0.445331(c)-0.445331(o)-0.3327pl
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
148
Figura 41. Representação da sonda incorporada à bicama fosfolipídica.
A formação de dímeros não fluorescentes da sonda diSBA-C
2
tem sido
considerada como a principal causa na mudança de fluorescência, pois quando
ocorre um aumento da concentração da sonda no citossol, diminui a fluorescência,
fenômeno este observado quando ocorre hiperpolarização; quando ocorre uma
diminuição da concentração da sonda no citossol, aumenta a fluorescência,
fenômeno este observado na despolarização. Este comportamento celular frente às
alterações na homeostase iônica é o fato principal que irá potencializar a TFD
clássica nesta nova categoria de TFD dita Terapia Fotodinâmica Sinérgica.
IV.2.4.1 Estudos com a sonda fluorescente bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, durante processo de hiperpolarização da
membrana plasmáica das células J774-A.1.
Nos estudos sobre o monitoramento da influênica dos ligantes éter de
coroa sobre a homeostase celular, utilizou-se o bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, conforme descrito no item III.4.2.4.1, que é uma
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
149
sonda que não se acumula na mitocôndria, e é seletiva para o monitoramento do
potencial elétrico trans-membrana(Plásek e Sigler, 1996).
A membrana celular de células eucarióticas possui um potencial de
membrana da ordem de 50 a 70 mV, sendo que a concentração de potássio
intracelular é de 140 mM, e de sódio é de 12 mM, e a concentração extracelular
dos respectivos íons é de 4 mM para o potássio e 145 mM para o sódio, conforme
demonstrado no esquema da Figura 39.
Sendo assim, ao adicionarmos alíquotas crescentes de íons sódio, o efeito
que observamos é o de hiperpolarização da membran, e ao adicionarmos alíquotas
crescentes de potássio, observa-se o efeito contrário, ou seja: o processo de
despolarização da membrana plasmática.
Figura 39. Concentração de íons sódio e potássio intra e extracelular.
A Figura 40 mostra o efeito do aumento da concentração externa de sódio,
[Na
+
], na intensidade de fluorescência da linhagem de células J774-A.1 suspensas
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
150
em meio tamponado (Hank’s), contendo 1 µM de di-SBA-C
2
. Observou-se uma
diminuição sucessiva da intensidade de fluorescência, a medida em que se
adicionou alíquotas de sódio, atingido uma máxima na supressão da fluorescência
de 60% quando a concentração extracelular de sódio chegou a 180 mM, o que
indicou que as células estavam em hiperpolarização.
3.0x10
6
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Intensidade de Fluorescência
640620600580560540520
Comprimento de Onda, nm
Figura 40. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação
em 500 nm) pelo acréscimo de íons sódio, na ausência do fármaco, medido através
da sonda di-SBA-C
2
. A curva (-) refere-se à intensidade de fluorescência na
ausência do sal e a curva (-) refere-se à emissão de fluorescência após a adição de
íons sódio, até a concentração de 160 mM, à suspensão celular, ocorrendo assim
hiperpolarização nas células J774-A.1
No entanto, quando as células foram pré-incubadas com ZnC
4
P por 4
horas e em seguida incubadas com di-SBA-C
2
, conforme descrito no item
III.4.2.4.1, e posteriormente tratadas com concentração variadas e crescentes de
íons sódio, a intensidade de emissão de fluorescência foi reduzida com uma
supressão máxima de 37%, (figura 41).
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
151
1.2x10
6
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Intensidade de Fluorescência
640620600580560540
Comprimento de Onda, nm
Figura 41. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação
em 500 nm) pelo acréscimo de íons sódio, na presença do fármaco ZnC
4
P, medido
através da sonda di-SBA-C
2
. A curva (-) refere-se à intensidade de fluorescência
na ausência do sal e a curva (-) refere-se à emissão de fluorescência após a adição
de íons sódio, até a concentração de 160 mM, à suspensão celular, ocorrendo
assim hiperpolarização nas células J774-A.1
Este comportamento observado foi devido à presença dos ligantes éteres
de coroa ligados covalentemente ao fármaco fotossensibilizador ZnC
4
P. Os nano
canais criados permitiram um fluxo de íons sódio através da membrana
plasmática, minimizando a diferença de potencial trans-membrana, com
concomitante inibição da emissão de fluorescência. Estes resultados foram
idênticos aos observados nos estudos realizados com monesin, um ionóforo
clássico e específico para íons sódio. Nestes estudos, a adição crescente de NaCl
(na faixa de 145 a 160 mM) levou à uma redução na intensidade de fluorescência
da mesma ordem de magnitude da observada na presença do fármaco
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
152
fotossensibilizador, indicando claramente um efeito na hiperpolarização e
comprovando a proposta de que o fármaco contendo os grupos éter de coroa
podem atuar como fotossensibilizador e como ionóforo sinergicamente. O mesmo
comportamento observado para o ionóforo monesin foi observado em outros
estudos realizados por Fyles com ionóforos e canais trans-membrana(Fyles et al.,
1993).
A Figura 42 apresenta de forma esquemática uma explicação para o efeito
observado no qual o fármaco fotossensibilizador atua como um ionóforo indicado
por um processo de hiperpolarização decorrente da adição de cloreto de sódio no
meio celular. Este efeito ocorre diretamente sobre a bicamada lipídica da
membrana plasmática.
Figura 42. Forma esquemática da incorporação do fotossensibilizador na
bicamada lipídica. Formam-se nano-poros que afetam o transporte de íons sódio
através da mesma.
Nos experimentos “in vitro” (na ausência do fármaco ZnC
4
P) onde se
variou a concentração de íons potássio extracelular, foi observado um aumento da
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
153
intensidade de emissão de fluorescência da sonda di-SBA-C
2
em resposta a um
processo de despolarização (figura 42). Resultados similares a estes foram
observados pela adição do ionóforo monesin, também específico para íons
potássio.
4x10
6
3
2
1
Intensidade de Fluorescência
640620600580560540
comprimento de onda, nm
Figura 43. Efeito na intensidade de fluorescência da sonda diSBA-C
2
(excitação
em 500 nm) pelo acréscimo de monesin até a concentração de 48 µM. A curva (-)
refere-se à intensidade de fluorescência na ausência do monesin e a curva (-)
refere-se à emissão de fluorescência após a adição do antibiótico monesin, até a
concentração de 48 µM, à suspensão celular, ocorre a despolarização nas células
J774-A.1
No entanto, para experimentos onde as células foram incubadas como
fármaco fotossensibilizador ZnC
4
P, a variação na concentração de KCl na faixa de
4 mM a 150 mM não demonstrou efeito do fármaco, o que mostra a especificidade
do 15-crow-5 para íons sódio.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
154
Infelizmente, por problemas sintéticos, não foi possível a obtenção de uma
porfirina ou uma ftalocianina ligada covalentemente à uma molécula de 18-crown-
6 éter de coroa, a qual possibilitaria estudar a influência do éter de coroa nas
medidas do potencial de membrana frente à alteração na homeostase de íons
potássio comprovando, assim, a especificidade por íons potássio decorrente do
tamanho da cavidade deste éter de coroa. Estudou-se, então, a influência do 18-
crown-6 éter de coroa no processo de despolarização pela preparação de um
complexo de associação em um sistema de liberação biomimético (lipossomal)
contendo a ftalocianina e o 18-crown-6 éter de coroa. Embora esse sistema seja
um sistema dinâmico, vários trabalhos na literatura comprovam e suportam a idéia
do uso de sistemas lipossomais como sistema de veiculação
compartilhado(Moghimi e Patel, 1989; New, 1990; Nunes, S. M., 1999).
IV.2.4.2 Estudos com a sonda fluorescente bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)
trimetina oxonol, diSBA-C
2
, durante processo de despolarização da
membrana plasmática das células J774-A.1.
Uma vez conhecido o mecanismo de resposta da sonda diSBA-C
2
,
utilizamos o protocolo de Rodgers (Specht e Rodgers, 1990b) para quantificar a
diferença de potencial de membrana das células J774.A1. O procedimento de
calibração utilizado baseou-se na despolarização das células, sendo que para a
despolarização foi usado um ionóforo conhecido chamado monesin, que é um
ionóforo para íons sódio e potássio, até a concentação de 48 µM.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
155
Alternativamente, também adicionamos alíquotas de KCl (3mM) até alcançarmos
a total despolarização (4,0 a 140,0 mM)(Specht e Rodgers, 1990b).
Assim como em estudos anteriores com a sonda diSBA-C
2
(Seligmann e
Chused, 1985; Specht e Rodgers, 1990b), observou-se um aumento linear na
mudança de intensidade de fluorescência (∆F) versus o log da concentração na
faixa de concentração de 4,0 a 100,0 mM de íons potássio ao meio extracelular,
registrado e apresentado na figura 46.
Figura 44. Curva de calibração do potencial de membrana para as células J774-
A.1 na ausência do éter de coroa.
A figura 44 indica o efeito do aumento da concentração de potássio
extracelular, [K
+
]
o
, na intensidade de fluorescência das células J774-A.1 em
solução Hank’s contendo di-SBA-C
2
(0,5 µM ). A concentração máxima
alcançada [K
+
]
o
foi de 140 mM. No entanto, para concentrações acima de 100
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
156
mM, foi observado um efeito do sal na resposta celular indicando a completa
despolarização nesta concentração. Resultados análogos foram observados pela
adição de monesin para a despolarização das células J774-A.1.
A figura 45 apresenta o efeito do 18-crow-6 éter de coroa na porcentagem
de variação da diferença de potencial elétrico, para células tratadas previamente
incubadas com o 18-crow-6 éter de coroa (16µM) em meio lipossomal.
Figura 45. Curva do potencial de membrana para células J774-A.1 previamente
incubadas com éter de coroa.
O efeito do éter de coroa na mudança do potencial de membrana foi
determinado seguindo protocolo descrito no item III.4.2.4. Observou-se um
comportamento análogo ao anterior, onde a %∆F aumenta de forma linear o log da
concentração dos íons potássio até a concentração máxima de 100 mM.
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
157
Realizou-se o mesmo experimento, sendo que incubamos as células com
ZnPc concomitantemente com o 18-crow-6 éter de coroa (16 µM) em meio
lipossomal, e pôde-se observar que a porcentagem de variação de fluorescência foi
da mesma ordem. Na tabela 7 estão apresentados os valores da porcentagem de
variação de fluorescência e a porcentagem de mudança do potencial de membrana.
Tabela 7- Porcentagem da variação de fluorescência e porcentagem da variação
da diferença de potencial.
%∆F %∆Ψ
Estudo com antibiótico
(monesin)
18 81
Estudo com variação da
concentração de K
+
.
22 100
Estudo com éter de coroa
lipossomal.
8 53
Estudo com éter de coroa e
ftalocianina lipossomal.
7 47
De acordo com estes resultados, pôde-se observar que nos estudos com o
antibiótico monesin, não foi observada uma total despolarização. Esse
comportamento já havia sido observado em estudos similares, onde concluiu-se
que para ocorrer a despolarização total, foi necessária a presença de gramicidina
Resultados e Discussões
_____________________________________________________________________________________
158
observou-se que a formação de canais de íons potássio diminui a diferença de
potencial elétrico trans-membrana, comprovando assim que o éter de coroa
interfere de certa forma na homeostase celular, como esperado para um agente
extra-celular.
Esses resultados indicaram que os ligantes éter de coroa, na estrutura do
fármaco ou utilizados concomitantemente, corroboram com a ação fotodinâmica
dos fotossensibilizadores. Em estudos sobre a ação dos fotossensibilizadores na
terapia fotodinâmica, observou-se um aumento da permeabilidade da membrana
celular para íons potássio. Este fato é tido como um evento imediato da ação
fotodinâmica. Portanto, os ligantes éter de coroa específicos para potássio podem e
devem estar potencializando a ação fotodinâmica (Specht e Rodgers, 1990b;
Specht e Rodgers, 1991a).
Conclusões
_____________________________________________________________________________________
159
V. Conclusões:
Dentro da proposta do trabalho, podemos destacar as seguintes conclusões:
A análise das propriedades espectroscópicas no estado estacionário e
também resolvido no tempo da 5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-
pentaoxaciclopentadecane-2-aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro) fenil]porfirina
(H
2
C
4
P), e da Zn(II)5,10,15,20-tetrakis[4-(1,4,7,10,13-pentaoxaciclo-pentadecane-
2-aminometil)2,3,5,6-(tetrafluoro)fenil]-porfirinato (ZnC
4
P), indicou que essas
porfirinas possuem excelentes propriedades para a TFD.
Os resultados mostraram que as propriedades espectroscópicas destes
compostos não diferem muito das dos compostos porfirínicos normalmente usados
nos estudos clínicos da TFD(Batlle, 1993; Dougherty, 1984; Gouterman, 1978).
Os mesmos indicaram estar ocorrendo, como esperado, um cruzamento inter-
sistemas eficiente e concomitante à produção de estados excitados tripletes ativos
na TFD. Na presença de oxigênio molecular, tem-se a produção de oxigênio
singlete e outras espécies reativas de oxigênio.
Os valores encontrados de rendimento quântico de produção do estado
excitado triplete (Φ
T
) para ZnC
4
P
foi de 0,73 ± 0,06 e para H
2
C
4
P foi de 0,62 ±
0,05. Para esta última, o processo de fotooxidação do Tipo II foi dominante, como
observado para outras porfirinas(Sobolev , Jans e Rosenkranz, 2000), visto que
Conclusões
_____________________________________________________________________________________
160
este comportamento leva à uma maior produção de oxigênio singlete da porfirina
base livre H
2
C
4
P (Φ
∆
= 0,62).
No entanto, para o fotossensibilizador metalado ZnC
4
P, os resultados
mostraram que a presença do Zn impede uma eficiência completa na transferência
de energia do fotossensibilizador excitado para o oxigênio molecular, pois o
rendimento quântico de produção de oxigênio singlete foi menor, Φ
∆
= 0,46.
Sendo assim, o processo Tipo I, neste caso, foi o mecanismo de desativação
dominante, o que leva à produção de outros ROS. Ambos os valores foram altos o
suficiente para causar dano nas células tumorais.
Nos estudos de citotoxicidade para diferentes concentrações dos fármacos
fotossensibilizadores na ausência de luz, concluiu-se que a concentração ideal foi a
de 4µM, e nos estudos de viabilidade celular nos diferentes meios fisiológicos,
observou-se que o meio DMEM com 10% de soro bovino fetal (SBF) foi o mais
indicado para realizar o estudo de cinética de incorporação em relação ao tempo
de incubação.
Nos estudos de cinética de incorporação do fotossensibilizador ZnC
4
P em
meio homogêneo e em meio micro heterogêneo, observou-se que o ápice de
incorporação foi alcançado em 7 horas de incubação.
A estrutura química e a lipofilicidade dos fotossensibilizadores são os
fatores que afetam o mecanismo responsável pela taxa de incorporação do
fotossensibilizador. Observou-se que na presença de SBF (10%) no meio de
Conclusões
_____________________________________________________________________________________
161
incubação, a taxa de incorporação dos fármacos fotossensibilizadores H
2
C
4
P e
ZnC
4
P é diferente do padrão descrito para transporte passivo (difusão passiva).
O mesmo comportamento não foi observado para TPP (meio homogêneo),
que apresentou um comportamento padrão de difusão passiva (Alberts et al.,
2002).
Os estudos de incorporação, com os fármacos fotossensibilizadores em
meio lipossomal, indicaram que para H
2
C
4
P e ZnC
4
P não houve uma influência da
concentração do SBF e que para estes fármacos, o mecanismo operante é do tipo
mediado por receptores que ativam o processo de endocitose.
Nos estudos de toxicidade na presença de luz, os resultados mostraram que
os fármacos fotossensibilizadores ZnC
4
P e H
2
C
4
P, que apresentaram uma maior
taxa de incorporação graças ao seu caráter anfifílico, apresentaram também uma
maior eficiência fotodinâmica em comparação ao fotossensibilizador hidrofóbico
TPP.
Estes estudos nos indicaram o importante potencial de aplicação dos
derivados éter de coroa, ZnC
4
P e H
2
C
4
P no uso da TFD.
Nos estudos que permitiram avaliar o efeito do ligante éter de coroa quanto
à alteração na homeostase intracelular de íons Na
+
e K
+
, utilizou-se a sonda
fluorescente de resposta lenta bis-(ácido1,3-dietiltiobarbitúrico) trimetina oxonol,
diSBA-C
2
.
Devido à presença dos ligantes éteres de coroa no fármaco
fotossensibilizador ZnC
4
P, observou-se que houve uma minimização da diferença
Conclusões
_____________________________________________________________________________________
162
de potencial trans-membrana no efeito de hiperpolarização causado pela adição de
NaCl. Esses resultados foram confirmados nos estudos com o ionóforo monesin,
que comprovou a proposta de que o fármaco contendo os grupos éter de coroa
pode atuar como fotossensibilizador e como ionóforo sinergicamente, modulando
a atividade iônica celular.
Nos experimentos onde se variou a concentração de potássio extracelular,
foi observado um aumento da intensidade de emissão de fluorescência da sonda
di-SBA-C
2
em resposta a um processo de despolarização.
Na última etapa do trabalho, foram definidos parâmetros para quantificar a
influência do 18-crown-6 éter de coroa, que é específico para íons potássio, no
processo de despolarização. Concluiu-se que o éter de coroa minimiza a diferença
de potencial da mesma ordem de magnitude de quando está associado à ZnPC na
formulação lipossomal, da ordem de 50%, o que mostrou que a ZnPc não interfere
na formação dos canais de potássio formados pelos 18-crow-6 éter de coroa.
Os resultados indicaram um importante potencial de aplicação do ligante
éter de coroa associado à ZnPc no uso da TFD, visto que o éter de coroa não
modificou as características fotofísicas e fotoquímicas dos fotossensibilizadores.
Por problemas encontrados na síntese, não foi possível isolar a ftalocianina
conjugada ao éter de coroa. No entanto, os estudos realizados nesse trabalho com
o éter de coroa associado à ftalocianina em sistemas heterogêneos demonstraram
que esses sistemas influenciam no equilíbrio homeostático da membrana
Conclusões
_____________________________________________________________________________________
163
plasmática, o que pode potencializar a ação fotodinâmica, comprovando assim a
importância desses derivados.
Referências Bibliográficas
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