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NEGIN MOHAMMAD HUSSEINI
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES QUE CODIFICAM A PROTEÍNA
MITOCONDRIAL DESACOPLADORA EM Arabidopsis thaliana (AtUCP1-6),
ESTUDOS IN VIVO EMPREGANDO PLANTAS TRANSGÊNICAS E MAPEAMENTO
DO SINAL DE ENDEREÇAMENTO DA PROTEÍNA AtUCP1
BOTUCATU-SP
2008
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NEGIN MOHAMMAD HUSSEINI
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES QUE CODIFICAM A PROTEÍNA
MITOCONDRIAL DESACOPLADORA EM Arabidopsis thaliana (AtUCP1-6),
ESTUDOS IN VIVO EMPREGANDO PLANTAS TRANSGÊNICAS E MAPEAMENTO
DO SINAL DE ENDEREÇAMENTO DA PROTEÍNA AtUCP1
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências, Universidade Estadual
Paulista Júlio de Mesquita Filho para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas (Genética)
Orientador: Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia
Botucatu-SP
2008
2
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Agradecimentos
Para a realização desse trabalho, devo meus sinceros agradecimentos,
em primeiro lugar, ao meu orientador professor Ivan de Godoy Maia por toda
atenção, orientação e dedicação, os quais foram fundamentais para o meu processo
de aprendizagem.
Um agradecimento especial a Regiane Degan Fávaro pela colaboração
no trabalho, apoio, ensinamentos e pela amizade.
Aos companheiros do departamento Akemi, Ana Teresa, Antônio, Bonsai,
Bruno, Carla, Débora, Edmárcia, Fábio, Roberto e Rodrigo, obrigada pelos
momentos de camaradagem, aprendizagem, troca de idéias e experiências.
Às amigas Tamara, Jacqueline e Bianca pela convivência em todos esses
anos, pela amizade, pelos momentos de alegria e companheirismo.
À professora Marta Mischan pelas análises estatísticas, ao Valdir pelas
informações e materiais concedidos, e a todos aqueles que de alguma forma
contribuíram para a realização desse trabalho.
Por fim, agradeço aos meus pais por todo esforço, amor e dedicação.
3
RESUMO
Inicialmente descrita no tecido adiposo marrom de mamíferos, a proteína
mitocondrial desacopladora (uncoupling protein; UCP) permite a dissipação do
gradiente de prótons criado pelas bombas redox da cadeia respiratória. A presença
de uma UCP em plantas (pUCP) foi recentemente demonstrada. O presente projeto
visou determinar a influência de diferentes estresses abióticos na expressão dos
genes que codificam pUCP (AtUCP1-6) em Arabidopsis thaliana, bem como
procurou estudar os aspectos funcionais desta proteína in vivo. Para tal, sementes
de plantas transgênicas capazes de super expressar o gene AtUCP1 foram
utilizadas e germinadas em meios adicionados ou não de NaCl e Manitol.
Parâmetros analisados, como índice de velocidade de germinação (IVG), revelaram
um maior IVG para as sementes transgênicas em relação às do tipo selvagem, e
que o estresse salino é mais bem tolerado pelas plantas transgênicas. Quanto à
expressão dos genes AtUCP1-6, nenhuma alteração na expressão dos mesmos em
resposta ao estresse salino induzido pelo tratamento com NaCl foi observada,
exceção feita ao gene AtUCP2. Já em tratamento com Manitol, um aumento
significativo da expressão relativa de três genes, AtUCP2, AtUCP5 e AtUCP6, foi
constatado, sugerindo que estes genes estão envolvidos na resposta adaptativa ao
estresse osmótico e sujeitos a regulação transcricional, já que foram rapidamente
induzidos pelo tratamento. Esses genes foram induzidos também pela aplicação de
acido abiscísico no meio. Paralelamente, um estudo empregando a proteína
fluorescente verde (GFP) como repórter foi empreendido a fim de investigar o
domínio responsável pelo endereçamento mitocondrial da AtUCP1. Análises
preliminares revelaram a participação da segunda unidade de repetição no
transporte da AtUCP1 à mitocôndria.
4
Palavras-chave: Arabidopsis thaliana, expressão gênica, plantas, proteínas
desacopladoras e sinal de endereçamento.
5
ABSTRACT
Initially described in the mammalian brown adipose tissue, the uncoupling
mitochondrial protein (UCP) permits the dissipation of proton gradient created by the
electron transport via the respiratory chain. The presence of a UCP in plants (pUCP)
was recently shown. The present project aimed to determine the influence of different
abiotic stresses on the expression profiles of the genes coding for pUCP (At UCP1-6)
in Arabidopsis thaliana, and sought to study the functional aspects of this protein in
vivo. For such, we used seeds of transgenic plants capable to overexpress the
AtUCP1 gene, germinated on medium containing NaCl and Mannitol. Parameters
analyzed, as the germination speed, revealed a greater rate for transgenic seeds
compared to wild type, and that salt stress is better tolerated by the transgenic
plants. Considering the expression of the AtUCP1-6 genes, no changes in the
expression profiles of the investigated genes in response to salt stress were
observed, except for AtUCP2. On the other hand, a significant increase in the relative
expression of three genes, AtUCP2, AtUCP5 and AtUCP6, in response to mannitol
was observed, suggesting that these genes are involved in the adaptive response to
osmotic stress and subjected to transcriptional regulation, as they were rapidly
induced by treatment. These genes were also induced by treatment with abscisic
acid. Additionally, a study employing the green fluorescent protein (GFP) as a
reporter was carried out to investigate the domain of AtUCP1 responsible for
mitochondrial targeting. Our preliminary analysis indicates that the second repetition
unit is involved in the transport of AtUCP1 to the mitochondria.
Key words: Arabidopsis thaliana, gene expression, plant, uncoupling proteins and
target signal.
6
Sumário
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO GERAL ..................................................................................09
1.1. A mitocôndria e seu papel........................................................................09
1.2. As proteínas mitocondriais desacopladoras (UCPs) ...............................13
1.3. As UCPs em plantas................................................................................15
1.4. Papel das pUCPs em resposta a situações de estresse.........................17
1.5. A família gênica da UCP em Arabidopsis thaliana...................................21
1.6. Endereçamento mitocondrial das pUCPs................................................22
2. OBJETIVOS....................................................................................................25
Capítulo I. Análise de germinação de sementes de tabaco
que superexpressam o gene AtUCP1..........................................26
I.1. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................26
I.1.1. Esterilização e cultivo das sementes empregadas..........................26
I.1.2. Obtenção dos dados e análise estatística.......................................28
I.2. RESULTADOS..........................................................................................30
Capítulo II. Estudos de expressão gênica em A. thaliana..............................34
II.1. MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................34
II.1.1. Cultivo das sementes de A. thaliana...............................................34
II.1.2. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por
qPCR (q
uantitative Polymerase Chain Reaction)..........................35
II.2. RESULTADOS.........................................................................................40
7
II.2.1. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por
qPCR..............................................................................................40
Capitulo III. Estudo do sinal de endereçamento mitocondrial da
proteína AtUCP1 com o emprego de GFP................................43
III.1. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................43
III.1.1. Preparação do material vegetal....................................................43
III.1.2. Preparação do vetor contendo o cassete para
transformação................................................................................44
III.1.3. Transformação de discos foliares de tabaco via
Agrobacterium tumefaciens...........................................................45
III.1.4. Análises moleculares....................................................................49
III.1.5. Análise em microscopia................................................................52
III.2. RESULTADOS.......................................................................................53
III.2.1. Confirmação da transformação das plantas obtidas.....................53
III.2.2. Análise da localização...................................................................55
3. DISCUSSÃO GERAL.....................................................................................57
3.1. Análise de germinação de sementes de tabaco que super
expressam o gene AtUCP1.................................................................57
3.2. Estudos de expressão gênica em A. thaliana......................................61
3.3. Estudo do sinal de endereçamento mitocondrial da proteína
AtUCP1 com o emprego de GFP........................................................65
4. PERSPECTIVAS...........................................................................................68
5. CONCLUSÕES.............................................................................................69
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................70
8
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. A mitocôndria e seu papel
A mitocôndria é uma das mais importantes organelas celulares, sendo
responsável por muitos processos catabólicos fundamentais para a obtenção de
energia para a célula. Seu número varia entre as células, sendo proporcional à
atividade metabólica de cada uma.
As mitocôndrias apresentam duas membranas fosfolipídicas, uma externa
lisa e outra interna que se dobra formando vilosidades, chamadas cristas (Figura 1)
(revisto em Logan, 2006). A região limitada pela membrana mitocondrial externa e
interna é chamada de espaço intermembranas, cuja concentração em metabólitos e
íons é semelhante a do citosol, devido à permeabilidade da membrana mitocondrial
externa. Já na região delimitada pela membrana mitocondrial interna, conhecida
como matriz mitocondrial, estão localizadas as enzimas responsáveis pelo
metabolismo oxidativo, bem como substratos, co-fatores, nucleotídeos, íons
inorgânicos, e a maquinaria genética mitocondrial (DNA, RNA e ribossomos). A
permeabilidade da membrana mitocondrial interna está restrita a O
2,
ao CO
2
, e a
H
2
O, sendo que o transporte de metabólitos se dá pelas proteínas transportadoras
presentes na membrana.
9
Figura 1 - Representação esquemática da mitocôndria. Fonte: Junqueira & Carneiro, 2000.
O processo de formação de energia inicia-se no compartimento citosólico,
onde ocorre o catabolismo de carboidratos, lipídeos e às vezes de aminoácidos. O
piruvato, proveniente da glicólise, e o ácido graxo, derivado dos lipídeos, são
transportados pela membrana mitocondrial interna e são convertidos em acetil-CoA
(acetil coenzima A) por um complexo enzimático localizado na matriz mitocondrial.
Em condições anaeróbias, o piruvato é utilizado em outras vias metabólicas no
processo de fermentação.
O acetil-CoA formado é oxidado pelo ciclo de Krebs, o qual corresponde a
uma série de reações químicas. Dessa oxidação, há produção de CO
2
, que é
liberado pela célula como subproduto, e geração de elétrons de alta energia que são
transportados pelas moléculas carreadoras reduzidas: NADH (nicotinamida-adenina-
dinucleotídeo) e FADH2 (flavina-adenina-dinucleotídeo).
10
Esses elétrons de alta energia são, então, transferidos para a membrana
mitocondrial interna, onde entram na cadeia transportadora de elétrons. Nessa
doação de elétrons NADH é oxidado a NAD
+
e FADH
2
a FADH.
A cadeia transportadora de elétrons está presente em muitas cópias na
membrana mitocondrial interna. Também conhecida por cadeia respiratória, ela
contém mais de 40 proteínas, das quais cerca de 15 estão diretamente envolvidas
no transporte de elétrons. A maioria das proteínas envolvidas na cadeia
transportadora de elétrons está agrupada em três grandes complexos enzimáticos
respiratórios: complexo I ou NADH desidrogenase, complexo III ou citocromo bc
1
e
complexo IV ou citocromo c oxidase.
O movimento dos elétrons entre os componentes da cadeia
transportadora de elétrons é dirigido pelo potencial de oxidação/redução. Em
organismos aeróbicos, o destino final dos elétrons é o oxigênio molecular, o qual é
reduzido para H
2
O no último passo da cadeia transportadora de elétrons. Desta
forma, o processo de oxidação dos substratos e redução do oxigênio é denominado
de respiração celular.
O movimento dos elétrons ao longo da cadeia respiratória gera, pelos
complexos, um bombeamento de um número fixo de prótons (H
+
) da matriz
mitocondrial (região com baixa concentração de H
+
) para o espaço intermembrana
da mitocôndria (região com alta concentração de H
+
). Esse bombeamento
estabelece um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna.
Os prótons acumulados no espaço intermembranas tendem a retornar
para a matriz através do complexo V, que funciona como um canal de prótons. Ao
atravessar esse complexo, também chamado de ATP-sintetase, F
1
F
0
-ATPase ou
ATPase, a energia conservada no gradiente de prótons através da membrana
11
mitocondrial interna é usada para a síntese de ATP, a partir da adição de um fosfato
inorgânico (P
i
) ao ADP, num processo chamado fosforilação oxidativa. Dessa forma,
a síntese de ATP está acoplada ao gradiente de prótons, que por sua vez, depende
da impermeabilidade da membrana mitocondrial interna aos prótons, a qual
estabelece um gradiente eletroquímico.
O acoplamento entre o transporte de elétrons na cadeia respiratória, o
potencial de membrana e a fosforilação do ADP pode vir a ser rompido por
intermédio de proteínas específicas da membrana mitocondrial interna, que podem
funcionar como sistemas dissipadores de energia (Figura 2). Em plantas, duas
importantes vias dissipadoras de energia são a oxidase alternativa (AOx) e as
proteínas desacopladoras (uncoupling protein; UCP) (Mackenzie e McIntosh, 1999).
As UCPs, objeto do presente estudo, serão descritas com maior detalhamento
adiante.
Figura 2 - Representação esquemática da cadeia transportadora de elétrons. A UCP está
representada promovendo a entrada de prótons para a matriz. Fonte: Krauss et al. (2005).
12
1.2. As proteínas mitocondriais desacopladoras (UCPs)
A membrana mitocondrial interna, devido a sua permeabilidade restrita, é
rica em proteínas carreadores que permitem o transporte de metabólitos como, ATP,
ADP, piruvato, Ca
+2
e fosfato. A família dos carreadores mitocondriais (MCF) (revista
em Palmieri, 1994) é composta por proteínas com peso molecular entre 28 -34 kDa
codificadas exclusivamente por gen81.6cleaores(Bdorcký.
Em adição a UCP1, quatro outros membros da subfamília foram
identificados em diferentes órgãos/tecidos de mamíferos: UCP2 com distribuição
ubíqua; UCP3 em tecido adiposo marrom, tecidos cardíacos e músculo esquelético e
UCP 4 e 5 em cérebro (Borecký et al., 2001).
Devido à similaridade de suas seqüências com a UCP1 e semelhanças na
atividade bioquímica, as UCPs 2 e 3 foram inicialmente relacionadas com a
termogênese (Boss et al., 1997a; Fleury et al., 1997; Gimeno et al., 1997). A função
termogênica foi definitivamente abolida quando se demonstrou que camundongos
nocautes para os genes UCP2 e UCP3, quando expostos ao frio, apresentaram as
mesmas respostas que camundongos selvagens (Arsenijevic et al., 2000; Gong et
al., 2000; Vidal-Puig et al., 2000; Zhang et al., 20001).
Cabe ressaltar que além dos mamíferos, as UCPs estão presentes em
vários organismos. A ampla distribuição dessas proteínas nos eucariontes foi
evidenciada pela sua identificação em plantas (Vercesi et al., 1995; Maia et al.,
1998), pássaros (Raimbauld et al., 2001; Talbot et al., 2003; Vianna et al., 2001),
vertebrados exotérmicos, como sapos (Klein et al., 2002) e peixes (Stuart et al.,
1999), Drosophila (Fridell et al., 2004), e em eucariontes primitivos como
Caenorbabditis elegans (Sokolova e Sokolov, 2005), Acanthamoeba castellanii
(Jarmuszkiewicz et al., 1999), Dictyostelium discoideum (Jarmuszkiewicz et al.,
2002), fungos (Cavalheiro et al., 2004; Jarmuszkiewicz et al., 2000), e no parasita
Plasmodium bergbei (Uemura et al., 2000). Essa ampla distribuição sugere
diferentes papéis fisiológicos para as UCPs que extrapolam a função termogênica
descrita inicialmente para a UCP1.
14
1.3. As UCPs em plantas
A existência de um condutor de H
+
em mitocôndrias de plantas
desempenhando funções similares a UCP só foi evidenciada em mitocôndrias
isoladas de tubérculos de batata (Solanum tuberosum) por Vercesi e colaboradores
em 1995, sendo a mesma denominada PUMP (p
lant uncoupling mitochondrial
protein), sendo a abreviação pUCP empregada atualmente. Estudos posteriores
revelaram alto grau de homologia funcional e estrutural dessa para com a UCP1
(Jezek et al., 1996, 1997). Foi atribuída a pUCP, a mesma função desempenhada
pelas UCPs de mamíferos, ou seja, a de promover o transporte de prótons através
da membrana mitocondrial interna dissipando o gradiente eletroquímico.
Experimentos em lipossomos da proteína purificada vieram a confirmar tal função
(Jezek et al., 1997), sendo a sua atividade desacopladora ativada pela adição de
ácido graxo e inibida na presença de ATP (Jaburek et al., 1999; Borecký et al.,
2001).
Desde então, diversos cDNAs que codificam para proteínas
desacopladoras em plantas foram identificados e isolados em diferentes espécies. O
primeiro cDNA foi isolado por Laloi e colaboradores em 1997 a partir de uma
biblioteca de cDNA de batata, e denominado StUCP. Verificou-se que a expressão
deste gene é fortemente induzida em baixas temperaturas, sendo esta indução
presente na maioria dos órgãos/tecidos da planta.
Posteriormente, dois homólogos da StUCP foram clonados e
caracterizados em Arabidopsis thaliana, sendo denominados AtUCP1 (Maia et al.,
1998) e AtUCP2 (Watanabe et al., 1999). A análise da expressão do gene AtUCP1
15
demonstrou que o mesmo é induzido pela exposição das plantas à baixa
temperatura (4
o
C) e é ubíquo.
Genes que codificam proteínas desacopladoras foram subseqüentemente
identificados tanto em plantas dicotiledôneas [SfUCP em repolho (Ito et al., 1999) e
HmUCPa em Helicodiceros muscivorus (Ito et al., 2003)] como em
monocotiledôneas [WhUCP em trigo (Murayama et al., 2000), OsUCP em arroz
(Watanabe et al., 2002) e ZmUCP em milho (Brandalise et al., 2003a)].
O desacoplamento promovido pelas UCPs é altamente regulado, embora
seu mecanismo de ação ainda não seja totalmente claro. De maneira geral, se
aceita que a inibição de sua atividade ocorra por nucleotídeos de purina di ou
trifosfatos como ATP, ADP e GTP (Garlid et al., 1996), e que sua ativação se dê pela
presença de ácidos graxos livres. Dois diferentes modelos têm sido propostos para
explicar o modus operandi dessa proteína: o modelo tamponante (Winkler e
Klingenberg, 1994) e o modelo protonoforético (Garlid et al., 1998; 2000).
No modelo tamponante, a UCP seria um canal de prótons, onde os ânions
de ácidos graxos livres estariam inseridos na parede do canal e disponibilizariam
seus grupos carboxila ao longo do trajeto dos prótons para a matriz (Figura 3A). Já
no modelo protonoforético, os autores sugerem que as UCPs não transportam
diretamente os prótons H
+
, mas sim ânions de ácidos graxos. Essa proposta teve
como base estudos em que foi demonstrado que os ácidos graxos protonados
penetram rapidamente através da membrana mitocondrial, sem a ajuda de um
transportador (Skulachev, 1991). Após dissociação do H
+
na matriz alcalina, os
ânions (que, por ter carga, não passam diretamente pela membrana) retornam ao
meio externo pela ação das UCPs. Ao fazer o transporte indireto de H
+
para o
interior da mitocôndria, através do movimento denominado “flip-flop” de ácidos
16
graxos, a UCP estaria promovendo o desacoplamento entre a respiração e a
fosforilação oxidativa (Figura 3B).
AB
Figura 3 - A) Modelo do retorno de prótons (H
+
) para a matriz mitocondrial com a ajuda de
ácidos graxos (wCOO-) que se ligariam à proteína desacopladora (UCP), representada
como um retângulo na membrana interna da mitocôndria. B) Modelo do transporte de
prótons em que o ácido graxo ligado ao próton (wCOOH) atravessa livremente a membrana
da mitocôndria para a matriz, onde perde o próton e retorna ao espaço intermembranas na
forma aniônica (wCOO-) através da UCP. Fonte: Vercesi, 2003.
1.4. Papel das pUCPs em resposta a situações de estresse
Dentre os vários papéis fisiológicos, ainda não muito claros, atribuídos às
proteínas desacopladoras em plantas está o controle da produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs). Há evidências de que a ativação da pUCP promove
uma diminuição da geração de EROs pela cadeia respiratória em mitocôndrias
isoladas de plantas (Kowaltowski et al., 1998), o que pode resultar em implicações
fisiológicas importantes como, por exemplo, a resposta a estresses.
Existem várias fontes de geração de espécies reativas de oxigênio celular
em plantas, sendo algumas destas associadas a eventos fisiológicos do
17
metabolismo vegetal, como por exemplo, a fotossíntese e a respiração (Asada e
Takahashi, 1987). As EROs podem promover lesões oxidativas em praticamente
qualquer biomolécula. As mitocôndrias são particularmente propensas a tais lesões,
já que as EROs são continuamente geradas pela cadeia respiratória (em dois sítios
principais, os complexos I e III) ou produzidas pelo metabolismo de compostos
endógenos na organela. São consideradas como as principais formas de EROs o
superóxido (O
2
.-
), o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), o radical hidroxil (OH
.
) e o óxido
nítrico (NO) (Mittler, 2002).
Níveis toleráveis de EROs são produzidos continuamente pelas células
podendo alcançar taxas máximas de produção de 240 µM s-1 O
2
.-
e, um nível
estável de H
2
O
2
ao redor de 0,5 µM nos cloroplastos (Polle, 2001). Todavia, estas
concentrações são compatíveis com a capacidade detoxificante do sistema
antioxidante celular (Polle, 2001). Entretanto, situações adversas como patologias
ou condições de estresses como, por exemplo, estresse hídrico, salino, baixa/alta
temperatura, excesso de luminosidade, deficiência de nutrientes, metais pesados e
radiação ultravioleta, estimulam a produção celular de EROs pelos aparatos
fotossintéticos e pela respiração mitocondrial. Sob tais condições desfavoráveis,
ocorre maior exigência quanto à capacidade do sistema antioxidante celular (Vercesi
et al., 1997). Na maioria das vezes, a célula é incapaz de suprir tal demanda tendo
como resposta intolerância/impotência funcional do sistema, o que pode causar uma
disfunção mitocondrial (Vercesi e Hoffmann, 1993).
Estudos recentes demonstraram que as pUCPs desempenham um papel
indireto na regulação da formação desses radicais tóxicos, pois o desacoplamento
entre a respiração e a fosforilação oxidativa, mediado pelas pUCPs, aumentaria a
velocidade respiratória, levando a uma significativa redução na geração mitocondrial
18
de EROs (Kowaltowski et al., 1998; Skulachev, 1996; Boveris e Chance, 1973;
Nègre-Slavayre et al., 1997; Popov et al., 1997; Houron-Cabassa et al., 2002). A
atividade dissipativa, nesse caso, ajudaria a prevenir o estresse oxidativo (Maxwell
et al., 1999). O fato das UCPs serem ativadas pelas EROs sugere que um dos
papéis fisiológicos dessas proteínas seja o de moderar a produção desses radicais
durante o estresse abiótico (Vercesi et al., 2006; Fernie et al., 2004; revisto em
Pastore et al., 2007).
Nesse contexto, observou-se que a ativação da pUCP promoveu uma
diminuição na geração de EROs pela cadeia respiratória em mitocôndrias isoladas
de batata (Kowaltowski et al., 1998). Resultados semelhantes foram observados
quando proteínas desacopladoras de plantas foram expressas em levedura (Houron-
Cabassa et al., 2002). Pastore e colaboradores (2000; 2004) observaram que em
trigo a atividade da pUCP é modulada por EROs através de um mecanismo de
feedback. Deve-se ressaltar que a geração de EROs é aumentada em plantas
submetidas a diferentes situações de estresse, e que a expressão de algumas
pUCPs também é estimulada nestas condições (Laloi et al., 1997; Maia et al., 1998;
Nantes et al., 1999). Num estudo recente em trigo, foi sugerido que a pUCP deve
atuar como um sistema antioxidante de defesa precoce em resposta ao estresse
osmótico (Pastore et al., 2004). Uma evidência adicional sobre o envolvimento das
pUCPs na regulação do estresse oxidativo foi encontrada por Brandalise et al .
(2003b). Nesse caso, os autores demonstraram que plantas transgênicas de tabaco
que super expressam o gene AtUCP1 apresentam alta tolerância ao estresse
oxidativo induzido por H
2
O
2
exógeno.
Em outro trabalho relacionando a atuação da pUCP e o estresse
osmótico, Trono e colaboradores não constataram um aumento na expressão de
19
dois genes relacionados a pUCP em plântulas de trigo submetidas a condições de
estresse osmótico e salino, muito embora análises bioquímicas usando mitocôndrias
isoladas tenham revelado um aumento da atividade desacopladora das proteínas
relacionadas. Uma ressalva que se deve fazer a tais resultados é que como
diferentes isoformas podem estar relacionadas com o aumento da atividade
desacopladora nas mitocôndrias, uma análise de expressão de todos os genes que
codificam pUCP em trigo deveria ter sido empreendida. Já no trabalho de Dlasková
et al. (2006) observou-se um aumento na transcrição do gene Z mUCP1 em
cotilédones de milho submetidos a estresse salino, sendo que os altos níveis da
proteína correlacionada estariam contendo o aumento da produção de EROs sob
condições de estresse. Recentemente, Sweetlove et al. (2006) utilizando um
mutante nocaute de A. thaliana para o gene AtUCP1 verificaram que a ausência
dessa proteína resultou em estresse oxidativo localizado e afetou a taxa de
assimilação de CO
2
, sugerindo um forte papel da pUCP no metabolismo
fotossintético dessa espécie.
Adicionalmente, verificou-se que a expressão dos genes que codificam
pUCPs pode ser modulada em diferentes situações ambientais. Em estudos de
expressão gênica em larga escala, esses genes aparecem como induzidos em
condições de estresse biótico e abiótico tais como ferimento (Cheong et al., 2002),
ataque de patógenos (Van Wees et al., 2003; Whitham et al., 2003), morte celular
induzida por calor (Swidzinski et al., 2002) bem como em resposta a determinados
fitohormônios como, por exemplo, o ácido abscísico (ABA) (Seki et al., 2002). O fato
de tais genes serem induzidos em situações de estresse pode ser uma
conseqüência direta da maior acumulação celular de EROs durante tais eventos,
sendo esse o elemento indutor como discutido anteriormente. Corroborando tal
20
possibilidade, dentre os genes altamente induzidos por estresse oxidativo em
Arabidopsis encontra-se um dos genes que codificam pUCP nessa espécie (Desikan
et al., 2001).
1.5. A família gênica da UCP em Arabidopsis thaliana
O primeiro gene caracterizado codificando UCP em A. thaliana, AtUCP1,
apresenta em seu cDNA uma fase aberta de leitura de 921 nucleotídeos que codifica
uma proteína de 306 aminoácidos, com peso molecular estimado de 32 kDa (Maia et
al., 1998). Após sua caracterização, outros estudos levaram à identificação de uma
família gênica codificando UCPs nessa planta: AtUCP1-6 (At3g54110; At5g58970;
At1g14140; At4g24570; At2g22500; At5g09470). A disponibilidade da seqüência
completa do genoma de A. thaliana permitiu também a localização desses genes
nos diferentes cromossomos dessa espécie.
Os seis genes que codificam UCP em A. thaliana estão dispersos em
cinco cromossomos: AtUCP1 no cromossomo 3, AtUCP2 e AtUCP6 no cromossomo
5, AtUCP3 no cromossomo 1, AtUCP4 no cromossomo 4 e AtUCP5 no cromossomo
2 (Nogueira et al., 2005; Borecký et al., 2006). A análise do genoma de A. thaliana
revelou não existir uma estrutura genômica conservada entre os diferentes membros
(Nogueira et al., 2005). As sequências codificadoras dos genes AtUCP1 e 2 estão
distribuídas por nove éxons, já as dos genes AtUCP3 e 6 estão concentradas em
apenas dois éxons. A posição e tamanho dos íntrons também são variáveis (Borecký
et al., 2001), sendo que os genes AtUCP4 e 5 são desprovidos de íntrons. Em
função de tais genes estarem localizados próximos às regiões duplicadas do
21
genoma de A. thaliana, foi sugerido que os mesmos tenham surgido por eventos de
duplicação (Borecký, et al., 2006).
No estudo conduzido por Borecký e colaboradores (2006), o perfil de
expressão desses genes em diferentes órgãos/tecidos de A. thaliana foi investigado.
Dos seis genes descritos, três (AtUCP1, AtUCP4 e AtUCP5) apresentaram
expressão ubíqua, um (AtUCP2) foi expresso exclusivamente em sílica verde e outro
(AtUCP3) detectado exclusivamente em raiz. Por outro lado, não foi possível
detectar os transcritos da AtUCP6. Em contrapartida, os transcritos correspondentes
aos genes AtUCP4 e AtUCP5 foram os mais abundantes. Nesse mesmo trabalho foi
constatado que os genes AtUCP4 e AtUCP5 são induzidos por baixa temperatura
como anteriormente observado para o gene AtUCP1 (Maia et al., 1998).
1.6. Endereçamento mitocondrial das pUCPs
O aspecto fundamental do endereçamento de proteínas para a
mitocôndria trata da maneira pela qual as proteínas codificadas nuclearmente e
sintetizadas no citoplasma atravessam as membranas mitocôndriais. Muitos estudos
neste sentido foram realizados em mitocôndrias de levedura e Neurospor a crassa
(Neupert, 1997), sendo que diferentes análises indicam que o transporte em
mamíferos ocorre por mecanismos muito similares (Komiya et al., 1996).
Nos compartimentos da mitocôndria (membranas interna e externa, matriz
e espaço intermembrana) foram identificados quatro complexos protéicos de
translocação, chamados “translocon”, com os quais as proteínas transportadas
acabam interagindo de diferentes formas (Neupert, 1997; Agarraberes et al., 2001.
22
Duby et al., 2002)s. Dois estão presentes na membrana mitocondrial externa (Tom)
e dois, na membrana mitocondrial interna (Tim). Porém, algumas proteínas podem
ser importadas de maneira independente, provavelmente devido às suas habilidades
para uma associação espontânea com a membrana mitocondrial ou com o
“translocon”, sem ajuda dos receptores dos complexos (Rassow et al., 2000).
Sinais de endereçamento são definidos como seqüências em pré-
proteínas que são necessárias e suficientes para direcionar as proteínas para a
mitocôndria. A maioria dos sinais de endereçamento está situada em segmentos N-
terminais (pré-seqüências), e muitos desses sinais são processados após ocorrer a
importação para a mitocôndria. Por outro lado, muitas proteínas contêm seqüências
de endereçamento que não residem nas terminações N-terminais, mas internamente
à seqüência primária de aminoácidos. A análise de sinais internos, especialmente
por manipulação genética, é inerentemente difícil uma vez que alterações na
seqüência de aminoácidos podem modificar a conformação geral da proteína e
desse modo afetar a acessibilidade desses sinais (Neupert, 1997).
As UCPs são codificadas por genes nucleares e, após a tradução no
citosol, são endereçadas para a mitocôndria. Embora endereçadas para a
mitocôndria, as UCPs não apresentam sinais típicos de localização mitocondrial em
sua seqüência de aminoácidos. Scheleiff e Mcbride (2000) procurando mapear os
possíveis sinais internos de endereçamento presentes nas unidades repetitivas da
UCP1, demonstraram que a primeira repetição, contendo dois segmentos de
transmembrana e um loop hidrofóbico, era responsável pelo reconhecimento e
inserção da UCP1, e de um marcador (Dihydrofolate redutase – DHFR) fusionado a
esse sinal, na membrana externa mitocondrial. Tal sinal, porém, não era suficiente
para promover a translocação da proteína através da mesma. Verificou-se, então,
23
que a região transmembrana central da referida proteína era responsável pela sua
correta localização na mitocôndria. Em trabalho visando mapear a região
responsável pelo endereçamento mitocondrial de uma UCP de trigo, Murayama &
Handa (2005) realizaram a sua expressão em levedura e observaram que a região
central age como a maior responsável pelo direcionamento da proteína, embora as
outras regiões apresentem um fraco sinal de endereçamento. Em estudo recente,
Sassaki (2003) demonstrou que a AtUCP1 possui um sinal de endereçamento
associado à sua região central, mas uma evidência experimental definitiva in planta
da participação desse domínio no endereçamento ainda não foi obtida.
24
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve por objetivos:
- investigar, in vivo, o comportamento de plantas de tabaco transgênicas que
super expressam o gene AtUCP1 (Brandalise et al., 2003b) frente ao estresse
osmótico e salino.
- Investigar a expressão dos genes que codificam pUCP em Arabidopsis
thaliana em resposta ao estresse osmótico e salino e a determinados
fitohormônios.
- Investigar o papel do domínio central da proteína mitocondrial desacopladora
de Arabidopsis thaliana (AtUCP1) envolvido no seu direcionamento para as
mitocôndrias, usando-se de metodologias que permitam acompanhar a
dinâmica e a localização de proteínas fusionadas a repórteres em tabaco
transgênico.
25
Capítulo I: Análise de germinação de sementes de tabaco que super
expressam o gene AtUCP1
Os resultados disponíveis na literatura evidenciam a participação da
pUCP em importantes eventos fisiológicos, especialmente na resposta ao estresse
oxidativo. Grande parte desses resultados, entretanto, foi obtida empregando
mitocôndrias isoladas ou órgãos/tecidos destacados (folhas), não existindo, exceção
feita ao trabalho de Sweetlove et al. (2006), dados funcionais de sua atividade in
planta. A fim de fornecer subsídios para melhor compreender a funcionalidade desta
proteína in planta, o comportamento de plantas de tabaco transgênicas capazes de
super expressar o gene AtUCP1 (Brandalise et al., 2003b) frente a estresses
geradores de EROs foi investigado. Nesse caso, a germinalidade e a velocidade de
germinação de sementes obtidas de tais plantas em situações de estresse salino e
osmótico foi analisada.
I.1. MATERIAL E MÉTODOS
I.1.1. Esterilização e cultivo das sementes empregadas
Foram utilizadas sementes de Nicotiana tabacum SR1 selvagem e de
uma linhagem transgênica, P07, que expressa de maneira constitutiva o gene
AtUCP1 (Brandalise et al., 2003b).
26
Todas as sementes passaram por um processo de esterilização antes de
sua utilização. Primeiramente, as sementes foram embebidas em água Milli-Q por 1
hora. Em seguida, as sementes foram esterilizadas em etanol 70% por 1 minuto,
lavadas com água Milli-Q autoclavada (2x), incubadas em solução de hipoclorito de
sódio 1% por 20 minutos, e lavadas novamente com água Milli-Q autoclavada (5x).
Após a esterilização, as sementes de tabaco selvagem (não transgênico),
bem como as de tabaco transgênico, foram dispostas em placas de Petri contendo
meio Murashige e Skoog (MS; Murashige & Skoog, 1962) e 0,23% de Phytagel
(Sigma), com ou sem tratamento. As placas de Petri utilizadas continham uma
divisão central permitindo a germinação simultânea das sementes transgênicas e
selvagens, utilizadas como controle.
Para a indução de estresse salino e osmótico foram adicionados ao meio
MS, cloreto de sódio (NaCl) na concentração de 125 mM e Manitol na concentração
de 250 mM, respectivamente. Além disso, como controle positivo, foram usados os
fitohormônios, ácido abiscísico (ABA) na concentração de 0,1 mM e,
aminocliclopropano 1-ácido carboxílico (ACC) na concentração de 0,1 mM. As
referidas concentrações foram definidas em testes preliminares de germinação
empregando soluções com diferentes concentrações desses agentes, sendo as
concentrações empregadas consideradas moderadas.
O teste de germinação foi realizado dispondo 25 sementes selvagens e 25
sementes transgênicas por placa de Petri, com três repetições (placas) por
tratamento (controle sem estresse, NaCl 125 mM, Manitol 250 mM, ABA 0,1 mM e
ACC 0,1 mM) (Figura 4). Após a semeadura, as placas permaneceram no escuro a
4
o
C por 24 h e posteriormente dispostas em câmara aclimatizada com fotoperíodo
de 16 horas/dia de luz artificial e temperatura de 22 ± 2ºC.
27
W
P0 7
Álcool 70% Hipocloritode sódio 1%
W
P0 7
WP07
%G=(Sn
i
.N
-1
).100
Em que:
%G= germinalidade
Sn
i=
número total de sementes germinadas
N
-1=
número total de sementes semeadas (25)
O índice de velocidade de germinação (IVG) foi calculado pela somatória
do número de plântulas normais germinadas a cada dia, dividido pelo número de
dias decorridos entre a semeadura e a germinação, de acordo com a fórmula
descrita por Maguirre (1962):
IVG=G
1
/N
1
+G
2
/N
2
+G
n
/N
n
Em que:
IVG = Índice de velocidade de germinação.
G
1
, G
2
e G
n
= número de sementes germinadas na primeira, segunda e última
contagem.
N
1
, N
2
e N
n
= número de dias após a semeadura.
Foi realizada análise de variância dos dados de germinalidade e IVG,
conforme um esquema fatorial com 2 fatores:
Fator A: tipo de sementes (W e P07);
Fator B: tratamento (controle, NaCl, Monitol, ABA e ACC).
29
O teste de análise foi o teste de Tukey e o nível de significância adotado
foi = 0,05. Para verificar homogeneidade de variâncias foi aplicado o teste de
Levene.
I.2. RESULTADOS
Os números obtidos com as contagens foram plotados em gráficos tanto
para comparação entre os tratamentos (Figura 5) quanto para comparação entre as
sementes selvagens e transgênicas nos diferentes tratamentos (Figura 6).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Nº de sementes germinadas
Dias após 1º germinação
Controle
NaCL
Monitol
ABA
ACC
W
A
Controle
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
Dias após 1º germinação
Nº de sementes
germinadas
W
P07
NaCl
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415 16 17 181920
Dias após 1º germinação
Nº de sementes
germinadas
W
P07
ABA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131415 16 17 181920
Dias após 1º germinação
Nº de sementes
germinadas
W
P07
ACC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1234567891011121314151617181920
Dias após 1º germinação
Nº de sementes
germinadas
W
P07
Manitol
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1234567891011121314151617181920
Dias após 1º germinação
Nº de sementes
germinadas
W
P07
A
ED
BC
Figura 6 - Comparação do número de sementes selvagens germinadas em relação às
transgênicas em placas sem tratamento (A) ou tratadas com NaCl (B), Manitol (C), ABA (D)
e ACC (E).
A análise de variância dos dados de IVG mostrou efeitos principais
significativos dos fatorl5aTm(i), ABA e43o à-fic)T0.0005 Tc 3.0127 Tw 52 0 0 12 366.3038 520.6603 Tm(o)Tjj12 0 0 12 121.7349 959.6603 Tm(s dos12 0 0 12 128.4303 850.6603 Tm(tiv)Tj12 0 0 12 140.4363 Tm7.6603 Tm(o)Tj12 0 0 12 147.1376176 0.603 Tm(s dos faa iselrão às(Are eles. P47-0.0005 Tc 0.0494 T5282 0 0 12 85.0801 239.66 54Tm( )Tj )Tjde )Tj0nadas elijdee, a41lise de variânc
não ocorreu variação significativa nem entre o tipo de sementes nem entre os
tratamentos.
Tabela 1 - Valores do teste F da análise de variância para germinalidade e IVG.
CAUSA DE VARIAÇÃO GERMINALIDADE IVG
A
1,67
ns
8,04 *
B
1,49
ns
11,90 *
A * B
0,62
ns
0,39 *
ns= não-significativo *= significativo
O teste Tukey para comparar tratamentos revelou as diferenças
apresentadas na Tabela 2 para IVG e na Tabela 3 para germinalidade. É possível
perceber, quanto ao IVG, que os tratamentos com manitol e ABA apresentaram
diferença significativa em relação ao controle. Já nos tratamentos com NaCl e com o
fitohormônio ACC não foram detectadas diferenças significativas em relação ao
controle. Quanto a germinalidade, as médias são seguidas de mesma letra, o que
revela a não existência de variação significativa em nenhum fator empregado.
Tabela 2 - Médias de IVG conforme A e B e comparação entre elas.
W P07
MÉDIAS DE
TRATAMENTO
Controle
2,023 0,486 2,360 a
NaCl
1,36 1,956 1,658 ab
Manitol
1,163 1,713 1,438 bc
ABA
0,606 0,966 0,786 c
ACC
2,11 2,223 2,166 ab
Médias de W e P07
1,452 B 1,911 A
CV
26,33%
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5%.
32
Tabela 3 - Médias de germinalidade conforme A e B e comparação entre elas.
W P07
MÉDIAS DE
TRATAMENTO
Controle
17,67 18,67 18,17 a
NaCl
16,00 17,33 16,67 a
Manitol
14,00 16,67 15,33 a
ABA
10,33 15,67 13,00 a
ACC
16,33 15,00 15,67 a
Médias de W e P07
14.867 A 16.667 A
CV
24.179%
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey a 5%.
33
Capítulo II. Estudos de expressão gênica em A. thaliana
Poucos são os trabalhos da literatura que têm procurado desvendar o
perfil de expressão e a regulação dos genes que codificam UCPs em plantas.
Estudos com tal enfoque são imprescindíveis, pois tendem a revelar padrões de
expressão específicos que podem estar diretamente relacionados com as funções
desempenhadas pelos diferentes genes que compõe as famílias multigênicas
presentes em plantas, bem como evidenciar a existência ou não de redundância
funcional entre eles.
Levando em consideração as observações acima, um estudo visando
analisar de forma detalhada a expressão dos genes que codificam as seis isoformas
de pUCP em A. thaliana, AtUCP-1, 2, 3, 4, 5 e 6 (Borecký et al., 2006), em resposta
a estímulos externos [estresse salino (NaCl) e osmótico (Manitol)] e endógenos
[fitohormônios (ácido abiscísico - ABA e aminocliclopropano 1-ácido carboxílico -
ACC)] foi iniciado. Para tal foram empregados os mesmos tratamentos/doses
utilizados nos ensaios de germinação relatados no Capítulo I: NaCl 125 mM, Manitol
250 mM, ABA (0,1 mM) e ACC (0,1 MM).
II.1. MATERIAL E MÉTODOS
II.1.1. Cultivo das sementes de A. thaliana
Sementes de A. thaliana (ecótipo Columbia) foram embebidas em água
34
Milli-Q por 1 hora, e em seguida esterilizadas segundo protocolo descrito no capítulo
anterior. Após esterilização, as sementes foram dispostas em placas de Petri
contendo meio MS (Murashige e Skoog, 1962) e 0,23% de Phytagel (Sigma). As
placas permaneceram no escuro a 4
o
C por 24 h, sendo posteriormente mantidas em
câmara climatizada com fotoperíodo de 16 horas/dia de luz artificial e temperatura
entre 20-22ºC. Três semanas após a germinação, as plântulas foram submetidas
aos diferentes tratamentos: NaCl 125 mM; Manitol 250 mM; ABA 0,1 mM e ACC 0,1
mM e amostradas em diferentes tempos (0, 12, 24 e 48 h) para posterior extração de
RNA total.
II.1.2. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR
(q
uantitative Polymerase Chain Reaction).
Para a extração de RNA total utilizou-se o reagente Trizol (Invitrogen)
segundo protocolo descrito pelo fabricante, mas com pequenas modificações.
Plântulas de A. thaliana submetidas aos diferentes tratamentos foram maceradas em
nitrogênio líquido. Um ml de Trizol foi então adicionado à cerca de 100-200 mg do
tecido macerado e procedeu-se a homogeneização em agitador. Após incubação por
5 minutos a temperatura ambiente as amostras foram centrifugadas a 12000xg por
15 min a 4°C e o sobrenadante foi coletado seguido da adição de 200 µl de
clorofórmio. A mistura foi homogeneizada em agitador e, após incubação por mais 3
minutos a temperatura ambiente, centrifugada a 12000xg por 15 minutos a 4ºC. A
fase aquosa foi transferida para um novo tubo ao qual foram adicionados 500 µl de
isopropanol. Após incubação por 60 minutos a -20°C e centrifugação por 10 minutos
a 4ºC, o sobrenadante foi removido e o sedimento lavado com 1 ml de etanol 70 %.
35
Após uma nova centrifugação a 7500xg por 5 min a 4°C, o sedimento foi seco e
ressuspenso em 30 µl de H
2
O tratada com dietilpirocarbonato (DEPC).
A integridade do RNA total extraído foi determinada por eletroforese em
gel desnaturante (1,85% de formaldeído) de agarose 1% corado com brometo de
etídeo.
Amostras de RNA total (~2 µg) tratadas com DNAse I (Fermentas) foram
submetidas a transcrição reversa utilizando-se oligo dT17VN
(2 µM) e SuperScript
TM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen), segundo as informações do fabricante. O
produto da transcrição reversa foi quantificado utilizando-se o ND-1000
Spectrophotometer (NanoDrop Technologies).
Para a quantificação da expressão gênica por qPCR, amostras de cDNA
na concentração de 60 ng/µl foram diluídas 10x. Os oligonucleotídeos gene-
específicos listados na Tabela 4 foram desenhados no programa “Primer Express”.
Considerando a alta identidade existente entre as isoformas analisadas, os
oligonucleotídeos gene-específicos foram posicionados na região 5’UTR (região não
traduzida). Os componentes da reação de amplificação estão listados na Tabela 4. A
reação composta por um ciclo prévio a 50°C por 2 min e 95°C por 10 min, seguido
de um ciclo de desnaturação a 95°C por 15 s, anelamento e extensão a 62°C por 1
min, repetido por quarenta vezes. Após a amplificação foi adicionado um passo de
dissociação pela elevação da temperatura de 60°C para 95°C, subindo 1°C por
minuto. Este procedimento serviu para verificar a especificidade dos
oligonucleotídeos utilizados ou a formação de “primers-dimers”. A eficiência de
reação (E) foi calculada para cada par de oligonucleotídeos utilizando-se o programa
LingRegPCR (Ramakers et al., 2003), considerando um intervalo ótimo de eficiência
entre 1,8-2,2. O modelo matemático (1) utilizado para a análise da expressão
36
relativa foi baseado em Pfaffl (2001). Para a utilização deste modelo é necessária a
determinação do “crossing point” (CP) para cada transcrito. O CP é definido como o
ponto no qual a emissão da fluorescência é superior ao “background”.
R = (E
alvo
)
CPalvo (controle – amostra)
(1)
(E
referência
)
CPreferência (controle – amostra)
Em que:
R= razão de expressão relativa
E
alvo
= eficiência de reação de gene alvo
E
referência
= eficiência de reação de gene referência
CPalvo= CP controle (tempo zero) – CP tratamento (12, 24 ou 48 horas)
CPreferência= CP controle (tempo zero) – CP tratamento (12, 24 ou 48 horas)
Tabela 4 – Componentes da reação de qPCR.
REAGENTES QUANTIDADE/CONCENTRAÇÃO
cDNA
0,48 ng/ µl
Sybr Green Master Mix*
50% da reação
Oligo “forward”
0,4 µM
Oligo “reverse”
0,4 µM
H
2
O tratada com DEPC
cpv 12,5 µl
* Produto da Applied Biosystems.
37
Tabela 5 - Oligonucleotídeos empregados nas análises de expressão relativa.
GENE NÚMERO DE ACESSO* SEQUÊNCIA DOS
OLIGONUCLEOTÍDEOS (5`-3`)
TAMANHO DO
FRAGMENTO (pb)
AtUCP1 TC271062 GATGGTGGCGGCTGGTA
CGCCGACGCAAGCAG
77
AtUCP2 TC264719 CATAACAATGGCGGATTTCAAA
CGCTGCAAATGAAGGTTTCA
65
AtUCP3 TC273718 GGAGCCGAGTGACCAGAGAA
CGCAGAGAGTGAAGCAAGCA
62
AtUCP4 TC251734 TCGTTGAAGGTGGGATTGC
CTTGATTAGATCGAGAGGGTGAGT
65
AtUCP5 TC270882 CGACCCACCCGCTTGAT
GCTGGTCGGAGATTGGTTTG
82
AtUCP6 TC269710 AATCTTCCCGTGAAACCTTACC
AAGGAAATGCTGCCGATGAG
65
FDH AT5G43940
ATTGATCCTACTGCTCCTTTGG
CCAAGGCCAGTGGGAACA
67
40S AT2G09990 CGACTCTCTGCGTTAGGTTTCA
GGGTTTCTCCTTGCTTTTGCT
62
AtS1A X13611 CATCAGTTTCGTTGCCTACAAG
GGTTTACACAAAAGCAAAGGGAA
67
RD29A AT5G52310 TCACTTGGCTCCACTGTTGTTC
TCCAAAGTGAAACTTGAAAATCTC
79
PDF1.2 At5g44420
TCTTCGCTGCTCTTGTTCTCTTT
TTCTGTGCTTCCACCATTGC
61
AtbZip39 AT2G36270 CAGCAACAGCTTTATGGTGTGTT
GCTTGACCCGGGAATGAA
59
* O número de acesso é referente às seqüências depositadas nos bancos de dados
GenBank, Tair ou Tigr.
38
A fim de verificar a efetividade dos diferentes tratamentos aos quais as
plântulas foram submetidas, uma busca por genes induzidos pelos tratamentos em
estudo foi realizada. Os genes AtS1A, que codifica a pequena subunidade da
rubisco (small subunits of the rubisco; Charrier et al., 2002), RD29A (desiccation-
responsive gene; Nakashima et al., 2006), PDF1.2, que codifica uma proteína
antifúngica (Arroyo et al., 2003), e AtbZip39, que codifica um fator de transcrição do
tipo bZip (Lorenzo et al., 2003; Anderson et al., 2004), são descritos na literatura
como induzidos por manitol, NaCl, ACC e ABA, respectivamente. Oligos para
amplificação dos transcritos correspondentes foram usados como controle positivo
de indução (Tabela 5).
Para as análises de expressão relativa foram selecionados genes de
referência que não fossem influenciados pelos tratamentos. O gene FDH que
codifica uma formaldeído desidrogenase (Dolferus et al., 1997) foi utilizado como
normalizador nos tratamentos com ABA e ACC, enquanto que o gene 40S que
codifica a subunidade S16 da proteína ribossomal 40S (Kreps et al., 2002) foi
utilizado nos tratamentos com NaCl e Manitol.
A fim de verifica3 Tm22 0 0 1befe5.676198v
II.2. RESULTADOS
II.2.1. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR
Para a análise da expressão dos genes AtUCP1-6 em resposta a
diferentes tratamentos (NaCl, Manitol, ABA e ACC) foram extraídas amostras de
RNA total de plântulas de A. thaliana submetidas aos mesmos. A integridade do
RNA total foi verificada em gel desnaturante de agarose corado com brometo de
etídeo (Figura 7). Após a síntese de cDNA, as amostras foram quantificadas
utilizando-se um aparelho Nanodrop, visando às análises de qPCR.
Figura 7- Gel desnaturante de agarose 1% corado com brometo de etídeo contendo o RNA
total extraído das plântulas submetidas aos diferentes tratamentos (ABA, ACC, NaCl e
Manitol) após 12, 24 e 48 horas. Os experimentos foram feitos em duplicatas biológicas
denominadas A e B. Na figura, L e 1 µg representam o Ladder de RNA e uma amostra de
concentração conhecida previamente, respectivamente. As bandas detectadas representam
as subunidades ribossomais. Imagem invertida.
As análises de expressão relativa revelaram que todas as isoformas
investigadas (AtUCP1, 2, 3, 4, 5 e 6) foram amplificadas nas amostras de cDNA
provenientes dos tratamentos com NaCl, manitol e ABA. Foram consideradas
40
significativas as variações na expressão relativa maiores que dois e não relevantes
àquelas situadas abaixo de dois.
Na Figura 8 estão apresentados os resultados de quantificação da
expressão relativa dos seis genes investigados em resposta aos diferentes
tratamentos. Nas análises relativas ao tratamento com ACC não foi possível
observar uma variação significativa no perfil de expressão de cinco dos seis genes
investigados (Figura 8.1), sendo que um deles (AtUCP6) não foi detectado. No
tratamento com ABA foi possível observar um aumento na expressão relativa, 12
horas após o tratamento, dos genes AtUCP2 (2,33x), AtUCP5 (2,02x) e AtUCP6
(3,14x) (Figura 8.2). Por outro lado, nenhuma alteração no perfil de expressão dos
referidos genes em resposta ao tratamento com NaCl foi observada, exceção feita
ao gene AtUCP2 cuja expressão foi aumentada após 12 horas com subseqüente
queda (Figura 8.3). Já para o tratamento com manitol foram observadas mudanças
significativas na expressão relativa de três genes (AtUCP2, AtUCP5 e AtUCP6;
Figura 8.4), o que demonstra que os mesmos são responsivos ao estresse osmótico.
Para os genes AtUCP2 e AtUCP5, o maior aumento foi observado 12 horas após o
tratamento (2,3x e 2,36x, respectivamente), enquanto que para o gene AtUCP6 ,
esse aumento só foi perceptível após 24 horas (2,06x) atingindo um pico após 48
horas (2,62x).
Os genes endógenos FDH1 e 40S apresentaram um perfil inalterado face
aos tratamentos, podendo portanto ser utilizados como normalizadores nas análises
de expressão relativa. A confirmação dos efeitos dos tratamentos realizados foi
validada pela indução observada para os genes AtS1A, RD29A (9,4x após 12h),
PDF1.2 (14,47x após 24h) e AtbZip39.
41
Tratamento ACC
0
1
2
3
4
A
t
U
C
P
1
.
A
A
t
U
C
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1
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B
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t
U
C
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1
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C
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5
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C
Expressão Relativa
1
Tratamento ABA
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C
Expressão Relativa
2
Tratam ento NaCl
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6.
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Expressão Relativa
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Tratam ento Manitol
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6
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B
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C
P
6
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C
Expressão Relativa
4
Figura 8 - Análise da expressão relativa dos genes AtUCP1-6 após 12 (A), 24 (B) e 48 (C)
horas de tratamento. As análises da expressão relativa foram feitas usando como
normalizadores, o gene endógeno FDH1 para os tratamentos com ACC e ABA, e o gene
40S para os tratamentos com NaCl e Manitol.
42
Capitulo III. Estudo do sinal de endereçamento mitocondrial da proteína
AtUCP1 com o emprego de GFP
Esse trabalho foi desenvolvido a fim de se obter uma evidência
experimental definitiva sobre a participação do domínio central da proteína AtUCP1
no seu endereçamento à mitocôndria, uma vez que experimentos anteriores
evidenciaram que a AtUCP1 possui um sinal de endereçamento associado a essa
região (Sassaki, 2002).
III.1. MATERIAL E MÉTODOS
III.1.1. Preparação do material vegetal
Foram utilizadas plantas de tabaco - Nicotiana tabacum SR1 – cujas
sementes passaram por um processo de esterilização antes de sua utilização.
Primeiramente, as sementes foram embebidas em água Milli-Q por 1 hora, e em
seguida esterilizadas segundo protocolo descrito no capítulo I.
Após a esterilização, as sementes foram dispostas em placas de Petri
contendo meio MS (Murashige & Skoog, 1962) adicionado de Phytogel (0,23 %) e
vitaminas. Três semanas após a germinação, as plântulas foram transferidas para
placas com meio MS fresco e, assim que atingiram aproximadamente 1 cm, foram
transferidas para um suporte de cultivo in vitro contendo meio MS sólido e vitaminas.
Quando as plântulas atingiram aproximadamente 10 cm, a região contendo o
meristema apical foi cortada e transferida para novo suporte contendo meio MS
43
sólido, e suas folhas foram usadas para a obtenção dos discos foliares para
transformação. Durante todo esse processo, as sementes e as plântulas foram
mantidas em câmara climatizada sob condições controladas (fotoperíodo de 16
horas/dia de luz artificial e temperatura entre 22 ± 2ºC).
III.1.2. Preparação do vetor contendo o cassete para transformação
Um cassete de expressão contendo a região codificadora do domínio
central da proteína AtUCP1 (aminoácidos de 105 a 205; 303 nucleotídeos) fusionada
a mGFP4 (Green Fluorescent Protein; 714 nucleotídeos; n
o
de acesso U87624) sob
controle de um duplo promotor constitutivo 35S do vírus do mosaico da couve flor
(CaMV) e do terminador da nopalina sintetase (NOS) foi utilizado para a
transformação estável de tabaco. Esse cassete, previamente construído (Sassaki,
2002) e inserido no plasmídeo pBIGFP, foi isolado por digestão com enzimas de
restrição (HindIII e EcoRI) e após purificação em gel de agarose, subclonado no
vetor de transformação de plantas pBI121 (Clontech) igualmente digerido (Sambrook
et al., 1989) (Figura 9).
44
35S 35S AMV
Região Central AtUCP1
GFP
NOS
Cassete de expressão
pBI121
HindI I I Ec oRI
Figura 9 - Representação esquemática do cassete de expressão contendo a região central
da AtUCP1 inserido no vetor de transformação de plantas pBI121 (Clontech). As regiões
apresentadas não estão em escala.
O produto de ligação foi transformado em Escherichia coli tornadas
competentes utilizando uma solução de CaCl
2
0,1 M (Sambrook et.al., 1989). A fim
de verificar a real inserção do fragmento desejado foi realizada a digestão do DNA
plasmidial isolado dos clones transformados com as enzimas de restrição HindIII e
EcoRI. A correta inserção do fragmento clonado em relação ao gene repórter
(mGFP4) foi confirmada por sequenciamento empregando um sequenciador
automático ABI-PRISMA 3100 (Perkin-Elmer).
45
III.1.3. Transformação de discos foliares de tabaco via Agrobacteriu m
tumefaciens
Após a obtenção dos recombinantes em Escherichia coli, o vetor
resultante foi inserido em Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404). As bactérias
transformadas foram selecionadas em placas de Petri contendo meio LB sólido e os
antibióticos rifampicina (100mg/l), estreptomicina (25mg/l) e canamicina (100mg/l).
Para verificação da real transformação da agrobactéria, as colônias resultantes
tiveram os seus plasmídeos purificados por miniprep (Sambrook et al., 1989) e a
presença do cassete de interesse foi confirmada por reação de PCR, usando oligos
específicos para a GFP e para a região central da AtUCP1.
Para a transformação dos discos de folha, uma colônia isolada de
agrobactéria foi inoculada em meio LB líquido contendo os antibióticos descritos e
então crescidas a 28°C sob agitação de 200 rpm até alcançar uma A
600
de 0,1 a 1,5.
Em seguida, 1 ml desse meio foi diluído com LB líquido até atingir uma A
600
de 0,1.
Esse volume foi então completado com LB para 10 ml num tubo Falcon, e o
processo de transformação de discos foliares iniciado segundo protocolo descrito
por Horsch (1985) (Figura 10).
Os discos foliares foram extraídos a partir de folhas jovens de tabaco
cujas plantas foram mantidas in vitro, livres de qualquer contaminação. Os discos
foram mergulhados no meio líquido contendo as agrobactérias transformadas com o
vetor de interesse e aí permaneceram por 5 minutos. Logo após, os discos foram
secos em papel de filtro e transferidos para placas com meio MS sólido contendo
vitaminas e os hormônios BAP - 6-benzilaminopurina - (2mg/l) e ANA – ácido
naftalenoacético – (0,1mg/l). Foram colocados de 8 a 9 discos em cada placa,
46
dispostos com a face adaxial da folha em contato com o meio. Essas placas
permaneceram em câmera climatizada, envoltas por alumínio, durante 48 horas.
Após esse tempo, os discos foram transferidos para placas com meio MS, vitaminas,
hormônios BAP e ANA, o bacteriostático cefotaxima (300mg/l), para evitar
crescimento das agrobactérias remanescentes, e o antibiótico canamicina (100mg/l),
para selecionar as células transformadas. Os discos permaneceram nessas placas
por 20 dias até o surgimento de calos. Os calos foram então cortados e transferidos
para novas placas contendo o agente de seleção e a partir dos mesmos foram
obtidos os brotos. Esses foram então transferidos para vidros com meio MS sólido
contendo antibióticos e o hormônio ANA visando a indução de enraizamento.
As plântulas, uma vez enraizadas, foram transferidas para copos
descartáveis de 300 ml contendo terra vegetal e vermiculita, na proporção de 2:1,
sendo os mesmos dispostos em bandejas. Essas bandejas foram mantidas em
câmara aclimatizada até que as plantas atingissem um certo crescimento (~30 cm),
e então, as mesmas foram transferidas para vasos com terra e areia e mantidas em
casa de vegetação.
47
Explante inicial
(folha)
Disco foliar
Co-cultura com a
bactéria desarmada
em meio líquido
Co-cultura em meio
sólido sem antibióticos
Planta transgênica
aclimatada em casa
de vegetação
Meio de indução de brotos
com agente de seleção
Meio de enraizamento
com ou sem agente de
seleção
Figura 10 - Representação esquemática da metodologia utilizada para transformação de
discos foliares de tabaco, mediado por A. tumefaciens e, a completa regeneração das
plantas transgênicas. FONTE: Manual de transformação genética de plantas, 1998.
48
III.1.4. Análises moleculares
Análises moleculares (Sambrook et al., 1989) foram realizadas para
verificar a inserção do cassete de insi3se no genoma d(alinhagens trans) fmad(ar)Tj12 0 0 12 8.522798 651.0801 Tm(a )Tj-0.0302 Tc 0.2027 Tw 12 0 0 12 85.07982387.0801 Tmear corsi3ponde in expsi3s47ão dtransgene.( )TjETEMC/P <</MCI3 2 >>BDCBT/TT3 1 Tf-0.0002 Tc 162499 Tw 12 0 0 12 141.779589.8.0801 TmPara (verificar a inserção dtransa )Tj-0.0302 Tc 163369 Tw 12 0 0 122720.539589.8.0801 Tmgene) iam realidaar extraerçãoe DNA(a )Tj-0.0602 Tc 064427 Tw 12 0 0 12 85.07956712801 Tmgenômico usano do procedorinta
fabricante. Para tal, foram utilizados 50 ng de DNA genômico; 1 µl de
oligonucleotídeo senso para a região central da AtUCP1 a 10 µM
(GCATGCCATGGGAAAAGACTTTGTAG) e 1 µl de oligonucleotídeo reverso GFP a
10 µM (GTGCCCATTAACATCACC); 5 µl de tampão 10x; 1,5 µl mM MgCl 50 mM; 1
µl de dNTPmix 10 mM; 0,2 µl de Taq Polimerase 5u/ µl, e água Milli-Q autoclavada
para completar a reação num volume final de 50 µl. Foram realizados 35 ciclos de
amplificação sendo que a temperatura de anelamento utilizada na reação foi de
50
o
C. O ciclo completo consistiu em:
Passo Temperatura Tempo
1 94
o
C 2 min
2 94
o
C 45 seg
3 55
o
C 30 seg
4 72
o
C 1 min 30 seg
5 72
o
C 7 min
6 4
o
C indeterminado
Junto a essas reações foram realizados controles negativo e positivo.
Como controle negativo foi usado DNA genômico extraído de tabaco selvagem para
testar a especificidade dos oligos bem como uma reação com ausência de qualquer
DNA para verificar a possível contaminação dos reagentes ou dos oligonucleotídeos.
Como controle positivo usou-se o DNA do vetor purificado a partir da agrobactéria
com a qual transformamos as plantas.
Amostras de RNA total foram extraídas das linhagens que apresentaram
50
inserção do fragmento no genoma visando a análise de expressão via RT-PCR.
Para extração de RNA total, discos foliares foram macerados em
nitrogênio líquido. Um ml de Trizol foi então adicionado à cerca de 100-200 mg do
tecido macerado e procedeu-se a homogeneização em agitador. Após incubação por
5 minutos a temperatura ambiente as amostras foram centrifugadas a 12000xg por
15 min a 4°C e o sobrenadante foi coletado seguido da adição de 200 µl de
clorofórmio. A mistura foi homogeneizada em agitador e, após incubação por mais 3
minutos a temperatura ambiente, centrifugada a 12000xg por 15 minutos a 4ºC. A
fase aquosa foi transferida para um novo tubo ao qual foram adicionados 500 µl de
isopropanol. Após incubação por 60 minutos a -20°C e centrifugação por 10 minutos
a 4ºC, o sobrenadante foi removido e o sedimento lavado com 1 ml de etanol 70 %.
Após uma nova centrifugação a 7500xg por 5 min a 4°C, o sedimento foi seco e
ressuspenso em 30 µl de H
2
O tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). A integridade
do RNA total extraído foi determinada por eletroforese em gel desnaturante (1,85%
de formaldeído) de agarose 1% corado com brometo de etídeo.
Amostras de RNA total (~2 µg) tratadas com DNAseI (Fermentas) foram
submetidas a transcrição reversa utilizando-se oligo dT17VN
(2 µM) e SuperScript
TM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen), segundo as informações do fabricante.
O cDNA obtido foi submetido à reação de PCR usando-se para tal os
reagentes do kit Taq DNA Polymerase recombinant (Invitrogen) seguindo as
recomendações do fabricante. Para tal, foram utilizados 50 ng de cDNA; 0,6 µl de
oligonucleotídeo senso para a região central da AtUCP1 a 10 µM
(GCATGCCATGGGAAAAGACTTTGTAG) e 0,6 µl de oligonucleotídeo reverso GFP
a 10 µM (GTGCCCATTAACATCACC); 3 µl de tampão 10x; 0,9 µl mM MgCl 50 mM;
0,6 µl de dNTPmix 10 mM; 0,2 µl de Taq Polimerase 5u/ µl, e água Milli-Q
51
autoclavada para completar a reação num volume final de 30 µl. Foram realizados
35 ciclos de amplificação sendo que a temperatura de anelamento utilizada na
reação foi de 50
o
C. O ciclo completo consistiu em:
Passo Temperatura Tempo
1 95
o
C 5 min
2 95
o
C 20 seg
3 50
o
C 20 seg
4 72
o
C 40 seg
5 72
o
C 7 min
6 4
o
C indeterminado
A amplificação de parte da região codificadora da alfa-tubulina de tabaco
nas amostras de cDNA provenientes das linhagens transgênicas foi usada como
controle positivo da reação de PCR. Como controle negativo foi usada uma alíquota
de cDNA obtido a partir de RNA total isolado de tabaco selvagem não transformado
empregando, na PCR, os oligos descritos acima.
III.1.5. Análise em microscopia
A expressão do transgene nas linhagens transformadas foi também
confirmada pela emissão de fluorescência correspondente ao repórter GFP. Para tal
foram realizados cortes de 0,1 mm na face abaxial do epitélio foliar com lâminas
cortantes, sendo os mesmos dispostos em lâminas umedecidas com água destilada
52
e cobertas com lamínolas. Para detecção da fluorescência emitida pela GFP foi
usado um fotomicroscópio de fluorescência Olympus BX 61 e os filtros FTC e filtro
de Rodamina - comprimento de 510-550. As imagens foram capturadas através de
uma câmera digital (Olympus DP70) e do programa Image-Pro MC 6.0 e
processadas através do programa Adobe Photoshop 7.0.
III.2. RESULTADOS
III.2.1. Confirmação da transformação das plantas obtidas
Após a confirmação por sequenciamento da correta inserção do
fragmento desejado no cassete de expressão contendo o gene repórter GFP e da
introdução do vetor contendo tal cassete em A. tumefaciens (dados não
apresentados), os experimentos de transformação de discos foliares de tabaco
foram iniciados. Várias plantas foram obtidas a partir do referido processo de
transformação e regeneração, as quais foram mantidas em casa de vegetação. O
DNA genômico extraído de algumas dessas linhagens foi submetido à reação de
PCR como descrito e, após eletroforese em gel de agarose 1%, foi constatada a
inserção do fragmento de interesse no genoma de duas plantas (Linhagens 3 e 4;
Figura 11).
53
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 w1 w2 Cn Cp
500bp
400bp
Figura 11 – Confirmação da inserção do fragmento de 400 bp contendo a região central da
AtUCP1 nas linhagens de tabaco transformadas. Para tal, amostras de DNA genômico das
diferentes linhagens foram submetidas à reação de PCR. L) Marcador de peso molecular
(Ladder GeneRuller
TM
100bp; Fermentas); 1 a 9) Diferentes linhagens de plantas
transformadas; w1 e w2) Tabaco não transformado; Cn) Controle com ausência de DNA;
Cp) Controle com DNA plasmidial (pCAMBIA 1381z contendo o inserto de interesse). Os
produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1% corado com brometo de
etídeo.
A expressão do transgene na linhagem 4 foi confirmada em um experimento
de RT-PCR (Figura 12) que revelou a presença de um produto de amplificação de
tamanho esperado nessa linhagem (~400 pb; canaleta 4), o qual estava ausente na
reação correspondente a planta não transformada (canaleta W). Produtos
correspondentes à parte da região codificadora da alfa-tubulina de tabaco foram
amplificados nas amostras de cDNA provenientes de ambas as plantas (canaletas
CpT4 e CpTW), demonstrando a qualidade do cDNA obtido. Infelizmente, por
motivos alheios a nossa vontade, a linhagem 3 foi contaminada em vaso e a planta
regenerada perdida.
54
L 4 CpT4 CpTW W CnT Cn
400 bp
300 bp
200 bp
Figura 12 – Confirmação via RT-PCR da expressão do transgene na linhagem 4 obtida. L)
Marcador de peso molecular (Ladder GeneRuller
TM
100bp; Fermentas); 4) Amplificação do
transgene usando cDNA da linhagem 4; CpT4 e CpTW) Amplificação da alfa-tubulina
empregando cDNA da linhagem 4 e de tabaco selvagem, respectivamente; W) Amplificação
do transgene em cDNA de tabaco selvagem; CnT e Cn) Controles negativos de amplificação
com ausência de DNA. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose
1% corado com brometo de etídeo.
III.2.2. Análise da localização
A linhagem transformada de n
o
4 que revelou possuir em seu genoma o
cassete de expressão contendo a região central da proteína AtUCP1 fusionada a
GFP cuja expressão foi confirmada por RT-PCR, foi usada para verificar, ao
fotomicroscópio de fluorescência, a localização celular da proteína de fusão
resultante. Quando foi utilizado o filtro FTC foi possível observar pontos com
fluorescência verde relacionados à expressão da GFP (Figuras 13a, c), sendo que
55
ao se usar o filtro de rodamina
na mesma região nenhuma fluorescência pôde ser
detectada (Figura 13b e d), dado que demonstra que a fluorescência emitida está
relacionada à presença da GFP. Os pontos verdes observados evidenciam a
provável localização mitocondrial da proteína de fusão, mas análises adicionais em
microscopia confocal serão necessárias para confirmação de tal resultado.
1:100 µm
Figura 13 – Detecção da fluorescência associada a GFP em epitélio foliar da linhagem 4
contendo a região central da proteína AtUCP1 fusionada a GFP. As análises foram
realizadas em fotomicroscópio de fluorescência. Painéis a e c) Filtro FTC. Painéis b e d)
filtro rodamina. Imagens ampliadas 1000x.
56
3. DISCUSSÃO GERAL
3.1. Análise de germinação de sementes de tabaco que super
expressam o gene AtUCP1
As proteínas desacopladoras, responsáveis por processos altamente
regulados de desacoplamento mitocondrial para fins específicos, tais como geração
de calor e/ou regulação da concentração celular de EROs, têm sido objeto de muitos
estudos bioquímicos, de bioenergética e mais recentemente de biologia molecular.
Nesse contexto, a investigação da função dessas proteínas em plantas de
tabaco transgênicas capazes de expressar de forma constitutiva uma proteína
desacopladora de A. thaliana (AtUCP1) (Brandalise et al., 2003b), trouxe uma
confirmação sobre sua participação na modulação do estresse oxidativo e no
controle da geração de EROs mitocondrial.
Por mecanismos distintos, o desacoplamento mitocondrial e/ou a ativação
das vias dissipadoras de energia respiratória, como UCPs e AOx, diminuem a
produção de EROs devido ao aumento da taxa respiratória. Uma vez acelerada a
respiração celular, ocorre diminuição tanto da tensão do oxigênio nos tecidos como
da meia vida da semiubiquinona. Esse estado fisiológico reduz significativamente a
doação do elétron da semiubiquinona (UQ
-
) ao O2 celular. Nas plantas transgênicas
obtidas por Brandalise et al. (2003b), e empregadas no presente estudo, acredita-se
que a produção endógena de EROs pela cadeia respiratória possa estar diminuída
devido ao desacoplamento exacerbado provocado pela super expressão da
AtUCP1. Nestas condições, o sistema antioxidante de tais plantas transgênicas
estaria mais disponível para promover a inativação de EROs de origem exógena.
57
Para melhor investigar o comportamento dessas plantas, empregou-se
um estudo de germinação em condições de estresse osmótico e salino, estresses
ambientais que têm conseqüências severas na função mitocondrial. A germinação
compreende uma sequência ordenada de atividades metabólicas iniciadas a partir
da embebição. Durante esse processo, ocorre captação de água, reativação do
metabolismo - marcada pela atividade respiratória, síntese e atividade de enzimas -
digestão das reservas de nutrientes, formação de novos tecidos e ruptura do
tegumento com a protusão da raiz primária.
Daley et al. (2003) desenvolveram um trabalho em que examinaram a
expressão de vários componentes da cadeia respiratória mitocondrial, tanto em
níveis de mRNA quanto de proteína, em cotilédones de soja durante a germinação.
Para a maioria dos componentes estudados, incluindo a pUCP, a quantidade de
proteína expressa segue um modelo parecido - um aumento é registrado a partir de
baixos níveis logo após a embebição das sementes, atingindo um pico no 15º dia e
declinando com a senescência. Uma relação entre o aumento de proteína e a
abundância dos transcritos correspondentes pôde ser constatada, sugerindo um
controle transcricional da expressão gênica. Os autores sugerem ainda que, nessa
espécie, a expressão dos vários componentes da cadeia respiratória está
harmonizada com a atividade respiratória dos mesmos.
Uma vez que a atividade respiratória é alta durante a germinação, o
presente estudo procurou correlacionar a atividade da proteína desacopladora com o
aumento da tolerância aos referidos estresses in planta exatamente nesse período.
Para tal, realizou-se um ensaio que consistiu no emprego de sementes de tabaco
selvagem e transgênico (linhagens que expressam de forma constitutiva do gene
AtUCP1) germinadas em meios adicionados ou não de NaCl 125 mM e Manitol 250
58
mM. Como controles adicionais foram usados tratamentos com os fitohormônios
ABA 0,1 mM e ACC 0,1 mM. Cabe ressaltar que tais hormônios têm efeitos
antagônicos na germinação das sementes, sendo o ABA um inibidor desse processo
(promove a indução e manutenção da dormência; Finkelstein et al., 2008) e o ACC
um estimulador (atua como um regulador negativo da ação do ABA durante a
germinação) (Beaudoin et al., 2000; Finkelstein et al., 2002). Para realizar as
análises de germinação usou-se a medida de germinalidade e o índice de
velocidade de germinação (IVG).
Os resultados de germinalidade, que representa a porcentagem de
sementes germinadas em relação ao número de sementes dispostas sob mesma
condição experimental, não evidenciaram variação significativa entre as sementes
selvagens e transgênicas, e nem entre os diferentes tratamentos empregados. Isso
significa que a não germinação de 100% das sementes não foi ocasionada pelos
fatores, tipo de semente e tratamento empregado. Possivelmente, havia sementes
inviáveis em nosso lote. Embora não significativo, um efeito inibitório do ABA foi
observado já que não foram constatadas sementes germinadas até o oitavo dia de
amostragem (Figura 6D).
Os resultados de IVG evidenciaram uma variação significativa na
velocidade de germinação. Em todos os tratamentos empregados, as sementes
transgênicas apresentaram uma velocidade de germinação maior que as sementes
do tipo selvagem. Já quanto ao efeito dos tratamentos na velocidade de germinação
das sementes, foi possível notar que as sementes submetidas ao estresse causado
por manitol, ou tratadas com ABA, tiveram valores de IVG significativamente
menores do que os registrados para sementes germinadas na ausência de estresse
ou do fitohormônio (controles). O efeito significativo do ABA sobre o IVG era
59
esperado já que concentrações de 3 µM de ABA exógeno são consideradas
inibitórias (suprimem a emergência da radícula), podendo a mesma ser melhor
tolerada (até 100 µM) caso haja a adição de algum açúcar no meio (Finkelstein et
al., 2002). Os dados de IVG parecem indicar também que o estresse salino é mais
bem tolerado pelas plantas transgênicas que o estresse osmótico gerado pelo
manitol, cujos valores de IVG diferem significativamente do controle.
Ainda como reflexo da velocidade de germinação, pelos gráficos
apresentados na Figura 6, é possível perceber um maior afastamento das curvas
relativas ao número de sementes transgênicas germinadas em relação às selvagens
nos primeiros dias da contagem, período que se refere ao início da germinação. Em
contrapartida, no tratamento com ACC (Figura 6E) existe uma aproximação das
curvas revelando um efeito estimulatório.
Os resultados de IVG sugerem uma efetiva participação da pUCP durante
a germinação das sementes e nas fases iniciais de desenvolvimento das plântulas,
sendo sua atividade provavelmente necessária durante a transição do metabolismo
de mobilização de reserva para o metabolismo fotossintético. Tal observação
corrobora a hipótese de que a pUCP desempenha funções fisiológicas essenciais
em processos onde a sua regulação conduz a alta atividade, como na fase de
germinação, a qual é marcada pela alta atividade metabólica.
A expressão constitutiva da pUCP em plantas transgênicas parece
conferir maior tolerância ao estresse salino, especialmente nas fases iniciais do
desenvolvimento. A observada correlação entre maior acúmulo de pUCP nas plantas
transgênicas e menor sensibilidade a determinados estresses torna evidente a
participação dessa proteína na resposta de defesa das plantas contra estresses
ambientais. Estudos recentes relatam que a pUCP é ativada em plântulas de trigo
60
submetidas a estresse salino e osmótico (Trono et al., 2004), e demonstram que tal
ativação é promovida pelas espécies reativas de oxigênio geradas durante os
estresses.
3.2. Estudos de expressão gênica em A. thaliana
As mitocôndrias estão envolvidas em diversos processos metabólicos
relacionados com a adaptação celular em reposta aos estresses ambientais e em
função disso, representam a maior fonte de geração de EROs em células
submetidas a condições adversas. Em plantas, a função mitocondrial é essencial
para a modulação do balanço redox e ativação do sistema oxidante durante a
ocorrência de estresses ambientais além de estar diretamente envolvida com a
morte celular programada. Nesse contexto, diversos estudos têm correlacionado a
função fisiológica das pUCPs com a proteção celular contra o dano oxidativo
(Jarmuszkiewicz et al., 1998; Almeida et al., 1999; Brandalise et al., 2003), sendo a
sua atividade importante para diminuir a geração mitocondrial de EROs. O
mecanismo de ação mais aceito é que o desacoplamento promovido pelas pUCPs
determina uma aceleração da cadeia transportadora de elétrons fazendo com que a
mesma seja mantida devidamente oxidada, o que resultaria em menor geração de
EROs (Pastore et al., 2007).
No presente trabalho, os efeitos do estresse oxidativo na transcrição dos
genes que codificam UCPs em A. thaliana foram avaliados. Para tal, plântulas de
Arabidopsis foram submetidas a tratamentos que promovem estresse salino e
osmótico, os quais sabidamente afetam a função mitocondrial e acentuam o
61
estresse oxidativo nessa organela. Além disso, o efeito de determinados
fitohormônios na expressão dos referidos genes também foi avaliado.
Os resultados obtidos não revelaram uma variação significativa do perfil
de expressão de cinco dos seis genes analisados em resposta ao tratamento com
ACC, um precursor do etileno (Figura 8.1). Nesse caso, não foram observados
produtos de amplificação para o gene AtUCP6. A efetividade do tratamento com
ACC foi confirmada pela indução do gene PDF1.2 que é responsivo ao etileno (após
24h de tratamento observou-se um aumento da expressão de ~14x). O etileno é um
hormônio vegetal que atua em concentrações muito baixas e participa da regulação
de praticamente todos os processos de crescimento, desenvolvimento e
senescência das plantas. Ele é sintetizado em muitos órgãos dos vegetais
superiores, sendo que tecidos senescentes e frutos em amadurecimento produzem
mais etileno que tecidos jovens (Taiz e Zeiger, 2006). Embora os nossos resultados
não tenham demonstrado alterações no perfil de expressão de tais genes em
resposta ao ACC, a indução da expressão de algumas pUCPs durante a maturação
de frutos climatéricos é relatada na literatura. Segundo Considine e colaboradores
(2001), a expressão dos genes que codificam pUCPs é fortemente aumentada nos
estágios finais da maturação (senescência) de frutos de manga. Resultados
semelhantes foram observados em estágios tardios da maturação de frutos de
tomate mantidos na própria planta (Holtzapffel et al., 2002). Estes dados corroboram
o maior acoplamento observado em mitocôndrias isoladas de tomates verdes
quando comparado com o obtido com mitocôndrias de tomates vermelhos (Costa et
al., 1999).
Além do etileno, existem evidências na literatura de que a expressão dos
genes que codificam pUCPs é induzida por um outro fitohormônio, o ácido abscisíco
62
(ABA). Análises empregando microarranjos demonstraram a indução dos genes
AtUCP4 e AtUCP5 mediante tratamento com ABA (Seki et al., 2002). O ABA
desempenha um papel importante na dormência de sementes e gemas, bem como
na resposta aos estresses ambientais (Taiz e Zeiger, 2006). Na Figura 8.2
encontram-se os perfis de expressão dos seis genes investigados em resposta ao
tratamento com ABA. Um aumento significativo da expressão relativa, 12h após o
tratamento, foi observado para três dos seis genes investigados: AtUCP2 (2,33 x),
AtUCP5 (2,02 x) e AtUCP6 (3,14 x). Dentre os genes cuja expressão foi majorada
encontra-se o AtUCP5 que já havia sido relacionado por Seki e colaboradores
(2002) como induzido por ABA. A efetividade do tratamento com ABA foi confirmada
pela indução observada para o gene AtbZip39 que é responsivo a este hormônio.
Segundo Trono e colaboradores (2006), plântulas jovens de trigo quando
submetidas a estresse salino ou osmótico não demonstraram um relevante aumento
no nível de expressão gênica das duas isoformas de pUCPs presentes no trigo.
Entretanto, um aumento na atividade desacopladora dos produtos gênicos
correspondentes foi observado, indicando que o estresse em questão deve modular
a atividade e não a expressão dos genes relacionados. Já no trabalho de Dlasková e
colaboradores (2006) observou-se, em sementes de milho germinadas e submetidas
a estresse salino, um aumento na transcrição do gene ZmUCP1, cujos níveis de
proteína estariam contendo o aumento da produção de ROS sob condições de
estresse.
Nenhuma alteração na expressão dos genes investigados em resposta ao
estresse salino induzido pelo tratamento com NaCl foi observada, exceção feita ao
gene AtUCP2 (Figura 8.3). Diferentemente dos demais, para esse tratamento foram
analisadas duplicatas biológicas. Esses resultados corroboram os obtidos por Trono
63
e colaboradores (2006) e sugerem a existência de um mecanismo de regulação pós-
transcricional para a maioria dos genes analisados. Em contrapartida, quando as
plântulas foram tratadas com Manitol, um aumento significativo da expressão relativa
de três genes, AtUCP2, AtUCP5 e AtUCP6 (Figura 8.4), foi constatado. O maior
aumento na expressão relativa foi observado 12 horas após o tratamento para os
genes AtUCP2 (2,.Rbs
A
AtU5P6
outros mecanismos de regulação, especialmente em nível protéico como sugerido
por Pastore et al. (2007).
3.3. Estudo do sinal de endereçamento mitocondrial da proteína
AtUCP1 com o emprego de GFP
A maioria das proteínas mitocondriais é codificada pelo genoma nuclear e
traduzidas no citoplasma como pré-proteínas, cujas regiões N-terminais contêm um
peptídeo sinal que possui um importante papel no transporte das mesmas para a
mitocôndria (Schatz e Dobberstein, 1996; Voos et al., 1999).
A proteína desacopladora (UCP) é uma proteína mitocondrial codificada
nuclearmente que não conta com um peptídeo sinal em sua seqüência primária de
aminoácidos. Num estudo desenvolvido em nosso laboratório, Sassaki (2003) criou
três versões da proteína AtUCP1 fusionadas a GFP e utilizou um sistema de
eletroporação em protoplastos de tabaco para averiguar a localização dos mutantes
resultantes. Todas as versões estudadas (AtUCP13-6 com ausência da unidade de
repetição central e final, AtUCP15-6 com ausência da unidade de repetição final e
AtUCP11-2 com ausência da unidade de repetição inicial) foram detectadas mas
mitocôndrias, indicando que a primeira unidade de repetição e a repetição central
devem conter os sinais de endereçamento para a mitocôndria. A primeira unidade de
repetição, entretanto, parece não ser essencial, já que a versão onde tal região foi
deletada continuou sendo direcionada para a organela.
Já no presente trabalho, uma linhagem transgênica de tabaco
transformada com um cassete de expressão contendo a região central da proteína
AtUCP1 fusionada a GFP foi obtida. Análises preliminares realizadas empregando
65
cortes foliares de tal linhagem, e microscopia de fluorescência, indicam que a
fluorescência observada está correlacionada a GFP e encontra-se associada à
mitocôndria. Os pontos de pequenas dimensões observados refletem
adequadamente o tamanho da organela.
Como salientado na introdução, Scheleiff e Mcbride (2000) demonstraram
que na UCP1 de mamíferos a unidade de repetição central é a responsável pelo
endereçamento para a membrana mitocondrial interna, enquanto que a primeira
unidade de repetição possui um sinal suficiente para o endereçamento para a
membrana mitocondrial externa. Em contrapartida, estudos anteriores realizados por
dois grupos distintos concluíram que a primeira unidade de repetição é importante
para o transporte de alguns carreadores mitocondriais como o carreador de
ADP/ATP (Liu et al., 1988; Smagula e Douglas, 1988), mas outros relatam que a
segunda ou terceira unidade são requeridas para o transporte de tal proteína
(Endres et al., 1999).
Em plantas, Murayama e Handa (2005) realizaram um estudo
empregando três diferentes versões da proteína WhUCP1b fusionadas a GFP e
inseridas em levedura. Observou-se que as três fusões (D1::GFP, D2::GFP,
D3::GFP contendo a primeira, segunda e terceira unidade de repetição,
respectivamente) foram transportadas para a mitocôndria. A fusão contendo a região
central mostrou a maior eficiência no transporte à mitocôndria, mas as outras
unidades repetidas da WhUCP1b puderam também direcionar o transporte à
organela, dado que não determina qual a região efetivamente responsável pela
localização na mitocôndria.
Experimentos adicionais empregando as plantas obtidas no presente
trabalho são necessários para confirmar em definitivo a participação da segunda
66
unidade de repetição no transporte da pUCP à mitocôndria. Uma possibilidade
interessante refere-se ao uso de um microscópio confocal e de plantas controle
expressando somente a GFP.
67
4. PERSPECTIVAS
O trabalho desenvolvido deu-nos a oportunidade de melhor compreender
as proteínas desacopladoras mitocondriais de planta, bem como permitiu vislumbrar
novas perspectivas de investigação de seu papel biológico.
Em relação ao estudo de expressão relativa das seis isoformas da
AtUCP, faz-se necessária uma investigação que leve em consideração a possível
repressão da expressão de alguns dos genes analisados sob determinados
tratamentos, uma vez que pudemos observar em nossos resultados, não somente o
aumento de expressão, mas também uma diminuição na expressão relativa de
alguns dos membros da família.
Com a disponibilidade de uma planta transgênica de tabaco expressando
a região central da AtUCP fusionada a uma proteína repórter será possível
determinar em definitivo se o domínio central dessa proteína é responsável pela
localização mitocondrial, o que, segundo nossos resultados, parece ser correto.
68
5. CONCLUSÕES
1) Sementes de plantas transgênicas de tabaco que super expressam a
proteína desacopladora de A. thaliana (AtUCP1) apresentaram uma
velocidade de germinação maior que as sementes não transgênicas.
2) Plântulas de A. thaliana submetidas a tratamento com ACC não
revelaram variação significativa no perfil de expressão dos genes
AtUCP1-6. Três dos seis genes investigados, AtUCP2 , AtUCP5 e
AtUCP6, apresentaram aumento significativo na expressão relativa
nos tratamentos com ABA e Manitol, respectivamente. Apenas o gene
AtUCP2 apresentou variação de expressão no tratamento com NaCl.
3) Indícios foram obtidos de que a segunda unidade de repetição da
proteína mitocondrial desacopladora de A. thaliana, AtUCP1, tem
participação no transporte da pUCP à mitocôndria.
69
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