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NADJA SANTOS DE SALES
BIODISPONIBILIDADE DE SELÊNIO EM FEIJÃO (Phaseolus vulgaris L.) E
CASTANHA-DO-PARÁ (Bertholletia excelsa H.B.K.) E SEU POTENCIAL
ANTICARCINOGÊNICO NA MUCOSA DO CÓLON DE RATOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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Milhares de livros grátis para download.
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Sales, Nadja Santos de, 1970-
613.28 Biodisponibilidade de selênio em feijão ( Phaseolus
2007 vulgaris L.) e castanha-do-Pará (Bertholletia excelsa
H.B.K) e seu potencial anticarcinogênico na mucosa do
cólon de ratos / Nadja Santos de Sales. – Viçosa,
MG, 2007.
xvii, 116f. : il.(algumas col.) ; 29cm.
Orientador: Neuza Maria Brunoro Costa.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de
Viçosa.
Inclui bibliografia.
1. Alimentos funcionais. 2. Selênio - Bioviabilidade.
3. Nutrologia. 4. Feijão - Aspectos da saúde.
5. Castanha-do-pará - Aspectos da saúde. 6. Cólon
(Anatomia) - Câncer. 7. Rato como animal de laboratório.
I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 613.28
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NADJA SANTOS DE SALES
BIODISPONIBILIDADE DE SELÊNIO EM FEIJÃO (Phaseolus vulgaris L.) E
CASTANHA-DO-PARÁ (Bertholletia excelsa H.B.K.) E SEU POTENCIAL
ANTICARCINOGÊNICO NA MUCOSA DO CÓLON DE RATOS
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
APROVADA: 21 de março de 2007.
Profa. Nilda de Fátima Ferreira
Soares
(Co-Orientadora)
Prof. Paulo Roberto Cecon
(Co-Orientador)
Prof. Sérgio Luis Pinto da Matta
Profa. Renata
Nascimento de
Freitas
Profa. Neuza Maria Bru
noro Costa
(Orientadora)
ii
Aos meus pais, Valdira e Raimundo
Aos meus irmãos, Robson, Ramon e Morgana
Ao meu esposo, Claudivan
Aos meus filhos, Marina, Gabriela, Luiza e
Claudivan Júnior
DEDICO
iii
A quem iremos nós, Senhor?
Só Tu tens palavras de vida eterna!
Simão Pedro
iv
AGRADECIMENTOS
Ao meu Senhor Jesus Cristo, fonte de toda a vida, por seu amor
incondicional;
À Escola Federal de Satuba-AL, pela liberação para realização do
curso de doutorado;
À Universidade Federal de Viçosa, que por meio do Departamento de
Tecnologia de Alimentos e do Departamento de Nutrição e Saúde propiciou as
condições necessárias para o desenvolvimento desta pesquisa;
À Universidad de Murcia (UM), Departamento de Tecnologia de
Alimentos, Nutrición y Bromatología, em Murcia, Espanha, pela disponibilização de
sua estrutura e recursos para realização de parte desta pesquisa;
À CAPES, pela concessão de bolsa de estágio de dourando fornecida
pelo Programa de Doutorado no País com Estágio no Exterior – PDEE.
À EMBRAPA - Arroz e Feijão, pela conceção de parte do material
experimental empregado na pesquisa;
À FAMINAS na pessoa da Prof. Eliane, pela conceção de material
para análise enzimática;
À minha orientadora, Prof. Neuza Maria Brunoro Costa, por sua
disposição em orientar-me e pela paciência e compreenção neste longo caminho
que me ajudou a trilhar;
Aos meus co-orientadores, Prof. Nilda de Fátima Ferreira Soares, pela
colaboração e amizade sempre constantes, e Prof. Paulo Cecon, pela
disponibilidade e valiosa ajuda na co-orientação;
Ao meu amigo Prof. Sérgio da Matta, pelos ensinamentos e doce
convívio durante a minha passagem pela Biologia Estrutural;
À Prof. Renata de Freitas da UFOP, por aceitar o convite para fezer
parte da banca e pela valiosa contribuição no aprimoramento da tese;
Ao Prof. Jorge Delena da UFOP, pela prestatividade na realização das
análises de selênio;
Ao Prof. Antônio Bellato, pela conceção do equipamento de
microondas para digestão de amostras;
v
A todos os professores do doutorado, em especial ao Prof. Nélio, pela
prestatividade e empenho no envio do material experimental necessário a realização
da pesquisa na Espanha;
A todos os funcionários do DTA e DNS, em especial aos laboratoristas
Cassiano e Ricardo, e as valorosas secretárias Geralda e Mimorina;
Às minhas cunhadas Cláudia e Claudete, pela dedicação e auxílio de
todas as horas;
Aos meus amigos de doutorado Lucía, Penha e Paulo, pelo
companheirismo e solidariedade durante a caminhada;
Aos meus compadres Dona Maninha e Seu Barbosa, pelo carinho e
atenção com a nossa família;
A todos do Departamento de Tecnologia, Nutricíon y Bromatología da
UM em especial a:
Prof. Gaspar Ros Berruezo, pela valiosa e indispensável orientação e
disponibilização de recursos para realização do segundo experimento desta tese,
mas principalmente pela confiança, amizade e consideração;
Prof. Carmem Martinez, pela delicadeza e trato maternal com que
tecia tanto as suas considerações científicas quanto a nossa amizade;
Prof. Maria Jesús, por sua atenção e disponibilidade constantes;
Ana Belém, Carmem, Dolo, Jorge, Patricia e Maitê, pela amizade e
acolhida;
Javier e Juanfran, pelo despreendimento com que sempre me
auxiliaram tanto nas atividades práticas quanto nas orientações científicas durante a
execução do segundo experimento;
Tony, por tornar os meus dias de Espanha mais coloridos com seu
sorriso e olhar acolhedor;
À Dra. Dolores Garcia Olmo e sua equipe de investigação do Hospital
Universitario de Albacete, pelo treinamento e orientações no trabalho com os
animais e a sua constante disponibilidade em ajudar-me;
À Prof. José Cerón da Facultad de Veterinaria (UM), por sua valiosa
ajuda nas análises dos parâmetros bioquímicos sanguíneos e disponibilização do
equipamento necessário à realização das análises enzimáticas;
À Maria José (SACE-UM), pela paciência, disponibilidade e
profissionalismo na realização das análises de selênio;
vi
À Assunción Roig, pela delicadeza e cuidado com que acolheu minha
família, em especial nossa Marina, e pela disponibilidade e prestatividade quando
da solicitação de seu auxílio;
À Fuensanta e sua linda família, pela acolhida e pelo carinho com que
sempre nos presentearam;
À Margarida e sua família, pela amizade e pelas dicas de
sobrevivência;
À Ester e seus preciosos filhos, pelos domingos ensolarados de missa;
Ao Padre Alfonso e a Marisol, pelo apoio espiritual e amor fraternal;
A todos os meus irmãos da Comunidade Presbiteriana de Viçosa
(CPV) em particular às famílias de Dilcimar e Henrique, Edna e Edgard, Beatriz e
Almir, pelo amor fraterno e preciosa amizade e comunhão;
À Tatiana, Ricardo e seus filhos, pela amizade, carinho e apoio que
com que sempre nos bribdaram;
Aos meus pais e irmãos pela ausência conveniente e presença
sempre marcante, eu os amo muito;
Ao meu companheiro Claudivan, por ter feito em mim morada e por
fortalecer-me com sua paciência regada de coragem e determinação;
Aos nossos filhos Marina, Gabriela, Luiza e Claudivan Júnior por
encantarem a minha vida;
E por fim, a todos os que em algum momento fracassaram, porque
não há alicerce mais forte do que a própria ruína.
vii
BIOGRAFIA
NADJA SANTOS DE SALES, filha de Raimundo Eleutério Sales e
Valdira Santos de Sales, nasceu em Campina Grande, PB, em 08 de fevereiro de
1970.
Em março de 1993, concluiu o curso de Agronomia no Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, na cidade de Areia, PB.
Iniciou em agosto do mesmo ano o Curso de Mestrado em Fitotecnia
na Universidade Federal de Viçosa, concluindo em fevereiro de 1996.
Foi professora visitante da Universidade Estadual da Paraíba de maio
de 1996 a setembro de 1998. Desde outubro de 1998 é professora da Escola
Agrotécnica Federal de Satuba, em Alagoas, onde ingressou mediante concurso
público.
Ingressou no Curso de Doutorado em Ciência e Tecnologia de
Alimentos em abril de 2002. Durante este curso desenvolveu parte da tese de
doutorado junto ao Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de
Alimentos da Facultad de Veterinária da Universidad de Murcia, Espanha, no
período de outubro de 2004 a novembro de 2005.
viii
SUMÁRIO
Página
LISTA DE QUADROS
xi
LISTA DE FIGURAS
xiii
RESUMO
xiv
ABSTRACT
xvi
CAPÍTULO 1
SELÊNIO NA NUTRIÇÃO HUMANA
RESUMO
1
ABSTRACT
2
1. Introdução
3
2. Funções e fontes
de selênio
5
2.1. Funções
5
2.2. Fontes
9
3. Biodisponibilidade
11
4. Interação com outros nutrientes
14
5. Sinais e sintomas de deficiência
15
6. Indicadores do estado nutricional
16
7. Bases para recomendação nutricional de selênio
1
9
8. Prevalên
cia da deficiência em nível populacional
22
9. Estratégias para elevar a ingestão de selênio
24
9.1 Aumento no consumo de alimentos
ricos
em
Se por meio da
educação nutricional
25
9.2. Suplementação individual
2
5
9.3. Suplementação de animais
26
9.4.
Adubação de culturas
27
9.5.
Melhoramento de
plantas
para favorecer
a
acumulação
de Se
(biofortificação)
28
10. Considerações finais
29
11.
Referências Bibliográficas
29
ix
CAPÍTULO 2
BIODISPONIBILIDADE DE SELÊNIO EM CULTIVARES DE FEIJÃO COMUM E
EM FEIJÃO SUBMETIDO À ADUBAÇÃO FOLIAR COM SELENITO DE SÓDIO
Página
RESUMO
40
ABSTRACT
41
1. Introdução
42
2. Material e Métodos
44
2.1. Obtenção e preparo do material experimental
44
2.2. Determinação da concentração de Se
45
2.3. Determinação da composiç
ão centesimal
46
2.4. Determinação do perfil de aminoácidos
46
2.5. Ensaio biológico
46
2.5.1. Constituição das Dietas Experimentais
47
2.5.2. Sacrifício dos animais e coleta de material para análise
48
2.5.3. Análise da atividade de GPx em plasma e f
ígado
48
2.5.4. Determinação da concentração de Se em eritrócitos
50
2.6. Delineamento Experimental e Análise Estatística
51
3. Resultados e Discussão
5
2
3.1. Composição
centesimal
e
concentração
de
Se
dos
cultivares de
feijão
52
3.2. Concentra
ção de Se
52
3.3. Perfil de aminoácidos
54
3.4. Biodisponibilidade
55
4. Conclusões
61
5.
Referências Bibliográficas
61
ANEXOS
6
5
x
CAPÍTULO 3
POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DE FEIJÃO E CASTANHA-DO-PARÁ
SOBRE O RISCO DE CÂNCER DE CÓLON INDUZIDO POR 1,2-
DIMETILHIDRAZINA EM RATOS F344
Página
RESUMO
66
ABSTRACT
68
1. Introdução
70
2. Material e Métodos
72
2.1.
Animais
73
2.2.
Dietas experimentais
73
2.3
. Preparo do material experimental
74
2.4. Composição centesimal do material experimental e das dietas
75
2.
5. Determinação
de Se
75
2.6.
Desenho experimental
76
2.7.
Sacrifício dos animais e coleta de material para análise
78
2.8.
Análise enzimática
78
2.8.1.
Preparo das amostras
78
2.8.2. Análise da atividade de
g
lutationa
p
eroxidase (GPx) e
g
lutationa
S-transferase (GST)
79
2.9.
Análise da concentração de Se em plasma sangüíneo
79
2.10. Análises histológicas do cólon
80
2.11. Análise e
statística
81
3. Resultados e Discussão
81
3.1. Composição centesimal e concentração de Se
81
3.2. Ensaio Biológico
82
3.2.1. Consumo,
ganho de peso e CEA
82
3.2
.2. Atividade enzimática de GPx e
GST e concentração plasmática de
Se
84
3.2.4. Análises histoquímicas e morfométricas
93
3
.2.4.1.
Diferenciação
celular:
determinação
de
sulfomocinas
e
sialomucinas
94
3.2.4.2. Morfologia da
mucosa colônica
101
4. Conclusões
106
5.
Referências Bibliográficas
106
ANEXOS
115
Formatados: Marcadores e
numeração
Formatados: Marcadores e
numeração
xi
LISTA DE QUADROS
CAPÍTULO 1
Página
1.
Dietary Reference Intakes (DRIs): requerimentos médios estimados
por grupos. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National
Academies (2000)
20
2. Comparação de
níveis médios de Se no soro entre adultos
de
diferentes países/região
24
CAPÍTULO 2
1. Programa de digestão
dos
materiais experimentais em microondas
marca Milestone, modelo Ethos Plus
45
2. Composição das die
tas experimentais
(g kg
-
1
)
50
3. Programa de aquecimento em bloco digestor para mineralização de
amostras de eritrócitos submetidas à determinação da concentração
de Se
51
4.
Composição centesimal em base úmida e concentração de Se em
base úmida e base seca dos cultivares de feijão
52
5. Composição aminoacídica
dos cultivares de feijão em base úmida
55
6. Consumo alimentar (CA), ganho de peso
(GP) e coeficiente
de
eficiência alimentar (CEA) dos animais em função das dietas
experimentais
57
7. Atividade
enzimática de glutationa
peroxidase plasmática (GPx3),
glutationa peroxidase hepática (GPx1) e concentração eritrocitária de
Se (Se eritrocitário) em ratos alimentados com diferentes dietas
experimentais
59
CAPÍTULO 3
1. Formulação das dietas experime
ntais com base na Dieta Padrão AIN
-
93G (g kg
-1
)
74
2. Programa de digestão do material experimental e de dietas em
microondas marca Milestone, modelo Ethos sel
76
3. Programa
de digestão de amostras de plasma sanguíneo
em
Microondas Marca Milestone modelo Ethos sel
79
4. Composição centesimal e
concentração
de Se de feijão e castanha
-
do-Pará e das dietas experimentais em base úmida
8
2
5. Consumo alimentar
(CA),
ganho de peso (GP) e coeficiente de
eficiência alimentar (CEA) dos animais em função das dietas
experimentais
8
3
xii
Página
6. Atividade
de
g
lutationa
p
eroxidase plasmática
(GPx plasmática)
e
glutationa peroxidase eritrocitária (GPx eritrocitária) nos animais em
função das dietas experimentais
85
7.
Resumo da análise de variância para atividade d
e
g
lutationa
peroxidase plasmática (GPx plasmática) e glutationa peroxidase
eritrocitária (GPx eritrocitária) de ratos alimentados com dietas
experimentais e submetidos à indução química de câncer com DMH
86
8
. Atividade
de
g
lutationa
p
eroxidase (GPx) e
g
lutationa S
-
t
ransferase
(GST) em homogenato de fígado de ratos alimentados com dietas
experimentais e submetidos à indução de câncer de cólon com DMH
87
9
. Concentração
plasmática de Se nos animais em função das dietas
experimentais e da aplicação de DMH
91
10
. Percentual de
células
secretoras
de
sulfomucinas
(SUM),
células
secretoras de sialomucinas (SIM), células de secreção mista
(SUM+SIM) e coeficiente entre sialomucinas e sulfomucinas
(SIM:SUM) em mucosa colônica de ratos alimentados com dietas
experimentais e submetidos à indução de câncer com DMH
97
11
. Altura de cripta em
número de células
de
mucosa colônica de ratos
alimentados com dietas experimentais e submetidos à indução de
câncer com DMH
102
1
2
.
Altura, diâmetro da base e diâmetro do áp
ice de criptas em
µm
e
densidade de criptas de cólon de ratos alimentados com dietas
experimentais
104
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 3
Página
1. Desenho
experimental
seguido para avaliação do efeito de distintas
dietas experimentais na prevenção do câncer de cólon induzido
quimicamente em ratos F344 por dimetilhidrazina (DMH).
77
2.
Corte transversal de cólon distal de ratos F344 corado pela técnica
histoquímica Orceína-AA mostrando cripta seccionada
longitudinalmente com células caliciformes secretoras de sulfomicinas
(a), de sialomucinas (b), e de secreção mista (c).
96
3.
Corte
transversal de cólon distal de ratos F344
corado
pela técnica de
coloração HE. (a) altura da cripta; (b) diâmetro da base da cripta; (c)
diâmetro do ápice da cripta; (d) célula colunar.
102
xiv
RESUMO
SALES, Nadja Santos de, D.Sc. Universidade Federal de Viçosa, Março de 2007.
Biodisponibilidade de selênio em feijão (Phaseolus vulgaris L.) e castanha-
do-Pará (Bertholletia excelsa H.B.K.) e seu potencial anticarcinogênico na
mucosa do cólon de ratos. Orientadora: Neuza Maria Brunoro Costa. Co-
Orientadores: Nilda de Fátima Ferreira Soares e Paulo Roberto Cecon
O selênio (Se) é um elemento traço antioxidante, com importantes
funções bioquímicas relacionadas à atividade de enzimas nas quais está presente
como selenocisteína. O baixo estado nutricional de Se tem mostrado correlacionar-
se positivamente com a incidência de doenças, entre elas o câncer. Alimentos
componentes da dieta brasileira, como a castanha-do-Pará, naturalmente rica em
selênio, e o feijão, com propriedades funcionais atribuídas à presença de
constituintes como fibra, fitatos e taninos tem mostrado efeitos promissores na
redução do risco de doenças crônicas . Este estudo teve como objetivo avaliar a
biodisponibilidade de Se em 5 cultivares de feijão (Ouro Branco, Diamente Negro,
BRS Radiante, Pérola e Talismã) e em feijão do cultivar Pérola submetido ao
enriquecimento com Se bem como o potencial funcional do feijão e da castanha-do-
Pará na redução do risco de câncer de cólon em animais. No ensaio de
biodisponibilidade, feijões dos 5 cultivares e do cultivar enriquecido com Se e seu
controle foram cozidos com água de maceração, secos em estufa, triturados e
quantificados quanto ao teor de Se. Ratas adultas Wistar receberam, por 28 dias,
dietas experimentais com o mesmo nível de Se fornecidos pelos feijões e dietas
controle com e sem adição do nutriente. Foram determinados a atividade enzimática
de Glutationa Peroxidase (GPx) plasmática e hepática bem como a concentração
eritrocitária de Se. Os cultivares de feijão estudados e o cultivar Pérola adubado
com Se e seu controle não apresentaram diferenças entre si na biodisponibilidade
do nutriente medida pela atividade GPx plasmática e hepática, não estando,
portanto, condicionada por fatores antinutritivos presentes no alimento. Na avaliação
do potencial anticarcinogênico do feijão e da castanha-do-Pará sobre o câncer de
cólon, ratos machos F344 (45) foram divididos em cinco grupos e alimentados com
dietas hiperlipídicas constituindo-se nos controles AIN-93 sem adição de selênio
(CN) e AIN-93 suplementada com 4 mg de Se por kg de dieta (CP), dietas contendo
a mesma dose de selênio da dieta CP fornecidos pela castanha-do-Pará de forma
isolada (C) ou combinada com feijão (F+C) e dieta com feijão (F) por um período de
xv
12 semanas. O carcinógeno de cólon dimetilhidrazina (DMH) foi aplicado a seis
animais de cada grupo em duas doses consecutivas na segunta e terceira semanas
após a introdução das dietas experimentais. Três animais de cada grupo receberam
apenas a solução veículo constituindo-se nos controles. Foram medidos a atividade
das enzimas GPx plasmática, eritrocitária e hepática e Glutationa S-transferase
(GST) hepática e a concentração plasmática de Se. Diferenciação celular,
proliferação celular e características morfológicas da cripta e do cólon foram
utilizados como biomarcadores do risco de câncer. As dietas CP, C, F e F+C
promoveram o mesmo nível de expressão das enzimas GPx e GST, maior grau de
diferenciação celular e menor grau de proliferação celular da mucosa colônica em
relação à dieta CN, não sendo observadas alterações de padrão quando da
aplicação do DMH. A administração de doses supranutricionais de Se na forma de
SeMet ou fornecida pela castanha-do-Pará e a utilização de feijão de forma isolada
ou em combinação com a castanha favoreceu a homeostase do desenvolvimento
colônico evitando alterações na diferenciação e proliferação celular em ratos
tratados com DMH, sugerindo um papel protetor destes alimentos no câncer de
cólon. Os resultados indicam ainda um possível envolvimento de mecanismos
múltiplos de ação.
xvii
were biomarkers for the risk of cancer. The diets CP, C, F and F+C promoted the
same expression levels of GPx and GST, higher cell differentiation and lower cell
proliferation of colon mucosa, in relation to CN diet. No change was observed with
DMH administration. Nutritional overdoses of Se provided by SeMet, Brazil nut or
their combination with beans (C+F) and the supplied bean separately (F) promoted
homeostase of colon development, and avoided changes in cell differentiation and
proliferation in DMH-treated rats. This suggests a protective role of these food or its
components on colon cancer. The results seem to be due to multiple mechanisms of
action.
1
CAPÍTULO 1 - Selênio na nutrição humana
RESUMO
O selênio (Se) é um mineral traço, antioxidante, com importantes
funções bioquímicas relacionadas à atividade de enzimas nas quais está presente
na forma de selenocisteína. Sintomas de deficiência de selênio são raros exceto em
situações extremas. No entanto, seu baixo estado nutricional tem mostrado
correlacionar-se positivamente com a incidência de um grande número de doenças
com destaque para o câncer. A recomendação dietética adequada para Se é de 55
µg por dia os quais podem ser obtidos pela ingestão de alimentos como frutos do
mar, vísceras , carnes e cereais. Entretanto, devido à grande variação no conteúdo
de Se em fontes vegetais e à ingestão irregular de alimentos de origem animal
notadamente ricos neste nutriente, estima-se que milhões de pessoas no mundo
sejam deficientes, o que aumenta o risco de doenças relacionadas principalmente
com estresse oxidativo. Desta forma, tem-se tornado de importância crescente a
caracterização e discussão dos aspectos relacionados ao Se como nutriente e
elemento funcional envolvendo considerações sobre suas funções, fontes,
biodisponibilidade, índices de avaliação do estado nutricional, sintomas e
prevalecência da deficiência e estratégias de combate dentre outros cuja revisão
constitui-se no objetivo deste trabalho.
2
Selenium in human nutrition
ABSTRACT
Selenium (Se) is a trace mineral, antioxidant, with important
biochemical functions related to the activity of enzymes in which it occurs as
selenocysteine. Symptoms of selenium deficiency are rare except in extreme
situations. However, the low Se status has been positively related with incidence of
some diseases, with relevance for cancer. The adequate selenium requirement is 55
µg per day. This requirement of Se can be reached by the intake of seafood, organ
meants, muscle meats and cereals. However, due to the high variation in the content
of Se in plant foods and to the irregular ingestion of the selenium-rich animal foods,
millions of people in the world are Se deficient, with increased risk of diseases
related with oxidative stress. Therefore, it is of great concern the characterization
and discussion of the nutritional and functional properties of the selenium
considering its functions, sources, bioavailability, nutritional status, symptoms and
prevalence of the deficiency and strategies to overcome it, among others, objective s
of this revision.
3
SELÊNIO NA NUTRIÇÃO HUMANA
1. Introdução
O selênio (Se), descoberto por Berzelius em 1817, foi primeiramente
reconhecido como elemento tóxico para organismos animais e humanos, tendo sido
considerado inicialmente, um agente carcinogênico. Somente em 1957 teve sua
essencialidade comprovada para animais (SHWARZA e FOLKS, 1957) e em 1973
pesquisadores comprovaram seu papel biológico primariamente como componente
da enzima glutationa peroxidase, participante do sistema antioxidante de defessa
das células (FLOHÉ et al., 1973). Em 1979, um grupo de pesquisadores descobriu
na região de Keshan, na China, a relação entre a ocorrência de patologia endêmica
(doença de Keshan) e a baixa concentração deste elemento no solo. Desde então, o
Se tem sido objeto de muitas pesquisas envolvendo tanto aspectos nutricionais
quanto funcionais relacionados à saúde humana.
No organismo humano, o Se normalmente exerce sua atividade
biológica por meio de sua incorporação a proteínas (selenoproteínas), dentre as
quais se encontram as isoenzimas glutationa peroxidases, as tioredoxina redutases
e as deiodinases (HOLBEN e SMITH, 1999; KRYUKOV et al., 2003).
Classificado como nutriente antioxidante (US NATIONAL ACADEMY
OF SCIENCES, 2000), o estado nutricional de Se no organismo humano tem
mostrado correlacionar-se positivamente com a incidência de uma série de doenças
incluindo vários tipos de câncer, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas,
doenças transmitidas por vírus (influenza e HIV) dentre outras relacionadas,
principalmente, com o estresse oxidativo. Apesar dos mecanismos envolvidos no
efeito funcional do Se ainda não terem sido bem estabelecidos, tem-se indicações
de que sua ação preventiva se dê pela ingestão de níveis acima da recomendação
nutricional e que a forma de Se ingerida esteja relacionada com tais efeitos
(GANTHER e LAWRENCE, 1997).
A forma de Se ingerida também tem sido relacionada com a
biodisponibilidade do nutriente. Selenometionina (SeMet) e selenocisteína (SeCys)
são as principais formas de Se encontradas em alimentos de origem vegetal e
animal, respectivamente, sendo a SeMet melhor absorvida que a SeCys (BUGEL et
al., 2002). Outras formas como metil-Se-cisteína podem ser encontradas em
vegetais produzidos sob alto teor de Se disponíveis, as quais parecem estar
4
relacionadas ao efeito funcional do elemento (GANTHER e LAWRENCE, 1997). A
ingestão de formas inorgânicas como selenito e selenato de sódio se dão,
principalmente, na forma de suplementos, os quais são menos biodisponíveis que
SeMet. Entretanto, nos últimos anos, suplementos de Se tem sido também
disponibilizados sob forma orgânica como levedura rica em Se (CLARK et al., 1996)
e SeMet purificada (NYBERG, 1991).
Ainda que timidamente, a mais recente recomendação nutricional
(DRI) para Se (US NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2000) utilizou como
critério, o potencial do nutriente sobre a prevenção de doenças. Entretanto, a atual
Recomendação Dietética Adequada (RDA) encontra-se muito abaixo do nível de
ingestão de Se no qual a expressão do seu potencial funcional tem sido observada.
Ademais, evidências sugerem que há uma tendência de redução de Se na cadeia
global de alimentos (FROST, 1987), e que 0,5 a 1 bilhão de pessoas no mundo são
deficientes em Se aumentando o risco de câncer, doença cardiovascular, viroses e
de uma série de desordens relacionadas indiretamente à baixa ingestão do nutriente
(COMBS, 2001).
Como estratégias para elevação do nível de ingestão de Se, estão
sendo estudados e desenvolvidos em muitos países programas que incluem
suplementação individual, educação nutricional, suplementação de animais e
enriquecimento de alimentos por meio da adubação de culturas ou pelo emprego de
técnicas de melhoramento de plantas visando à obtenção de alimentos
biofortificados. Neste sentido, deve-se ressaltar que a utilização conjunta e
adequada das medidas disponíveis e seu constante monitoramento são
imprescindíveis para segurança e efetividade das ações interventivas relacionadas
ao Se.
Diante do exposto, tem-se tornado indispensável a caracterização e
discussão dos aspectos nutricionais do Se não só à luz de sua essencialidade como
também do seu potencial funcional. Estas abordagens, aliadas ao conhecimento da
prevalência da deficiência em nível populacional e de suas causas, bem como da
efetividade e adequação de estratégias de elevação da ingestão do nutriente,
podem constituir-se em subsídios na formação de conceitos mais amplos sobre a
importância dos nutrientes, e em particular do Se, na saúde e qualidade de vida da
população e no direcionamento das pesquisas sobre o tema, objetivos para os quais
este trabalho propõe uma contribuição.
5
2. Funções e fontes de selênio
2.1. Funções
O Se no organismo humano encontra-se normalmente incorporado a
proteínas denominadas de selenoproteínas por meio das quais exerce suas funções
biológicas. Segundo KRYUKOV et al. (2003), cerca de vinte e cinco selenoproteínas
foram identificadas em mamíferos, muitas das quais ainda não possuem funções
definidas.
A primeira função reconhecida do Se foi como componente da enzima
glutationa peroxidase (ROTRUCK et al., 1973), identificada hoje como quatro
isoenzimas (GPx
1
, GPx
2
, GPx
3
e GPx
4
) de localizações específicas, mas com
funções similares. O Se, como SeCys, é parte integrante do sítio ativo destas
enzimas, cuja função é proteger o organismo contra o estresse oxidativo catalizando
a destruição de peróxidos de hidrogênio e a decomposição de hidroperóxidos
lipídicos, interrompendo a reação peroxidativa em cadeia dos radicais livres. De
acordo com alguns estudos (ARTEEL et al., 1998; SAITO et al., 1999), postula-se
que a selenoproteína P, maior selenoproteína presente no plasma, também
desempenhe função antoxidante, atuando ainda no transporte de Se do fígado para
outros tecidos.
Outro grupo de selenoenzimas, as tioredoxina redutases, estão
envolvidas na redução de nucleotídeos no processo de síntese do DNA, na
regeneração do sistema antioxidante envolvendo, inclusive, a redução dos
metabólitos oxidados de vitamina C, e na manutenção do estado redox intracelular
(MAY et al., 1998; SUN et al., 1999; ALLAN et al., 1999).
Dentre os órgãos do corpo humano, a glândula tireóide é a que
apresenta mais alta concentração de Se (KOHRLE, 1999). Neste órgão, o Se está
envolvido no metabolismo hormonal pela ação catalizadora da selenoenzima
iodotironina deiodinase na conversão do hormônio da tireóide (tiroxina – T
4
) para a
sua forma ativa (triiodotironina – T
3
) (BERRY e LARSEN, 1992; ARTHUR et al.,
1993). A selenofosfato sintetase sintetiza selenofosfato que é precursor da síntese
de selenocisteína – forma de Se presente nos sítios ativos das selenoenzimas.
Além das já conhecidas funções do Se como nutriente essencial, uma
série de evidências tem apontado para a sua ação preventiva sobre importantes
doenças relacionadas principalmente com o estresse oxidativo. Câncer, doenças
cardiovasculares e neurodegenerativas e doenças transmitidas por vírus como
6
influenza e HIV são alguns exemplos de estados patológicos influenciados pelo
baixo nível de ingestão de Se e cujos mecanismos envolvidos podem ou não estar
associados a sua função nutritiva (GANTHER e LAWRENCE, 1997).
O Se parece agir na modulação do sistema imunológico. Deficiência
de Se reduz a imunocompetência, envolvendo comprometimento da atividade das
células de defesa do organismo (BOYNE e ARTHUR, 1986). A suplementação com
Se, de indivíduos ainda que supostamente repletos no nutriente, é
imunoestimulatória e envolve o favorecimento da atividade das células de defesa
tanto quanto da proliferação das células de defesa ativadas (KIREMIDJIAN-
SCHUMACHER et al., 1994).
A deficiência de Se pode predizer significativamente a mortalidade
relacionada à AIDS (BAUM e SHOR-POSNER, 1998; CAMPA et al., 1999) bem
como a carga viral dos indivíduos soropositivos (BAETEN et al., 2001). BAUM et al.
(1997), relatam que o estado nutricional de Se em pacientes HIV se correlacionou
positivamente com a sua expectativa de vida; pacientes HIV deficientes em Se
apresentam probabilidade vinte vezes maior de morrer em relação àqueles com
níveis adequados do nutriente.
Outros estudos documentados por RYMAN (2000) indicam
associação entre o baixo nível de Se com o comprometimento cognitivo, depressão,
ansiedade e hostilidade. Estas condições podem ser aliviadas pela suplementação
com Se de indivíduos com baixos níveis basais do nutriente. Estudos mais recentes
sugerem que a selenoproteína P (WHANGER, 2002), selenoproteína W (JEONG et
al., 2002) e a mais recentemente descoberta selenoproteína M (KOROTKOV et al.,
2002) têm importantes papéis no cérebro.
O Se ainda protege o organismo contra a intoxicação por metais
pesados em virtude de sua complexação com Hg, Cd, Pb, Ag, Ti e As (WHANGER,
1992).
Dentre as doenças correlacionadas com o estado nutricional de Se no
organismo humano, o câncer é a que tem apresentado maior corpo de evidências
para o potencial preventivo do referido nutriente.
Neste sentido, muitos estudos epidemiológicos foram desenvolvidos
ao longo dos últimos anos em diversas regiões do mundo enfocando a correlação
positiva entre o estado nutricional de Se em humanos e a incidência de vários tipos
de câncer. Uma abordagem completa destes estudos e de ensaios conduzidos com
7
animais e humanos avaliando o efeito da elevação do nível de ingestão de Se sobre
a incidência do câncer e o desenvolvimento de tumores estão disponíveis em um
abrangente artigo de revisão publicado por WHANGER (2004). Considerável
número dos estudos apresentados pelo autor indica efeito positivo da aplicação ou
ingestão de Se sobre a redução da incidência de câncer (YU et al., 1991; BURKE et
al., 1992; YU et al., 1997; COMBS e GRAY, 1998; DUFFIELD-LILLICO et al., 2002).
Com relação à supressão de tumores, os estudos com animais indicam que o Se é
mais eficaz em prevení-los do que em revertê-los (IP, 1998). Entretanto, em ambos
os casos, fatores como estado nutricional inicial de Se, forma de Se utilizada, tipos
de câncer e biomarcadores analisados parecem influenciar os resultados obtidos.
Apesar de não se conhecer ao certo o mecanismo de ação
anticarcinogênica do Se, algumas hipóteses têm sido discutidas em muitos
trabalhos incluindo, mais recentemente, aqueles produzidos por COMBS e GRAY
(1998), IP (1998), GANTHER (1999), SCRAUZER (2000), EL-BAYOUMY (2001) e
FLEMING et al. (2001), WHANGER (2004). Os mecanismos sugeridos para
prevenção do câncer pelo Se incluem seu papel nas selenoenzimas
(particularmente a GPx e a tioredoxina redutase) (PENCE et al., 1994;
PERCHELLET et al., 1987; GANTHER, 1999), seus efeitos sobre a morte
programada da célula (SINHA et al., 1999; IP e DONG, 2001; WANG et al., 2001), o
efeito sobre o reparo do DNA (SEO et al., 2002a e 2002b) e no metabolismo de
carcinógenos (OLSSON et al., 1984; CHOW e GAIROLA, 1984). Atuam também no
sistema imune (KIREMIDJIAN-SCHUMACHER et al., 1994; TAYLOR, 1995), como
agente antiangiogênico (LU e JIANG, 2001) e na inibição específica no crescimento
de tumores por certos metabólitos de Se antitumorigênicos (HARRISSON et al.,
1996; GANTHER e LAWRENCE, 1997). Uma descrição detalhada de alguns dos
mecanismos anticarcinogênicos acima citados pode ser obtida em um artigo
publicado por COMBS e GRAY (1998).
Em virtude da ação das GPx sobre a conversão de peróxidos a
compostos menos prejudiciais e devido à associação entre danos peroxidativos e
câncer, tem-se assumido que estas peroxidases poderiam estar envolvidas na
redução de tumores. Todavia, as informações obtidas têm dado pouca sustentação
a esta hipótese. Considerando-se que a maior proteção do Se contra tumores
ocorre em níveis elevados de ingestão e que a atividade das GPx alcança um platô
em níveis nutricionais, nenhum aumento na atividade da enzima seria observado em
8
níveis mais elevados de Se em muitos tecidos (HORVATH e IP, 1983; LANE e
MEDINA, 1985).
GANTHER (1999) levantou a hipótese de que a selenoenzima
tioredoxina redutase poderia estar envolvida na redução de tumores, mas
subseqüentes resultados experimentais obtidos por GANTHER e IP (2001) não
confirmaram esta possibilidade. Segundo constatação dos autores, a atividade da
tiodoxina redutase não foi alterada pelo alto nível dietético de metil-Se-cisteína
(SeMCys) ou ácido metilselenínico, precursores de metilselenol em fígado de rato.
KUMARASWAMY et al. (2000) relatam a existência de uma
selenoproteína de 15 kDa (sep 15) localizada no cromossomo 1p31, um lócus
genético normalmente mutado ou deletado em cânceres humanos e manifestada
em mais altos níveis na próstata, fígado, rim, testículos e cérebro de humanos e
camundongos tem sido envolvida na redução de tumores. Segundo os autores, tem-
se observado que em linhagens de células malignas de próstata e em
hepatocarcinomas os níveis desta selenoproteína decrescem consideravelmente
sugerindo que ela pode estar envolvida tanto no risco quanto no desenvolvimento
do câncer.
Apesar dos resultados variáveis obtidos nos estudos sobre o
metabolismo de carcinógenos tem-se observado que a suplementação de ratos com
Se reduz a produção hepática microssomal de metabólitos mutagênicos de alguns
carcinógenos, incluindo N,N-dimetilanina (OLSSON et al., 1984),
dimetilbenz(a)antraceno (MARTIN e SCHILLACI, 1984), 2-acetilaminofluoreno
(CHOW e GAIROLA, 1984) e benzo(a)pireno (TEEL e KAIN, 1984). Neste
mecanismo, o efeito da suplementação com altos níveis de Se pode afetar o
metabolismo de tais carcinógenos por vias que se espera inibir o estágio inicial do
processo carcinogênico. Entretanto, tais efeitos podem variar tanto em relação ao
carcinógeno quanto ao hospedeiro.
O câncer de mama tem-se figurado como a primeira causa de morte
em mulheres no Brasil e a segunda neoplasia maligna mais incidente no mundo
(BRASIL, 2003). Neste sentido, estudos com humanos e animais indicam que a
ingestão adicional de Se, ou seja, acima do requerimento nutricional, é necessária
porque uma forma metilada do elemento (metilselenol), ativa sobre a redução deste
tipo de câncer, só está presente em mais altos níveis com a ingestão elevada do
nutriente (WHANGER, 2004). Alguns estudos sugerem (CAI et al., 1995; IP e LISK,
9
1995) que o metabolismo desta forma de Se seria mais eficientemente alcançado
quando da ingestão de compostos específicos do nutriente como SeMCys, a qual se
constitui na forma primária de Se presente em vegetais enriquecidos no nutriente
como brócolis e alho. Evidências sobre a ação desta forma de Se sobre outros tipos
de câncer ainda estão sem estudo.
De modo geral, os estudos têm demonstrado, independentemente dos
mecanismos envolvidos, que a dose necessária de Se para promover sua ação
anticarcinogênica está acima (2 a 5 vezes) da dose nutricional recomendada (45 a
70 µg por dia) (COMBS, 2001; DUFFIELD-LILLICO et al., 2002; WHANGER, 2004)
e que formas específicas do nutriente apresentam ação potencializada sobre
determinados tipos de câncer (GANTHER e LAWRENCE, 1997).
Pode-se concluir, portanto, que os mecanismos relacionados ao efeito
anticarcingênico do Se vão além de sua ação como nutriente dentro das
selenoenzimas e que outras selenoproteínas de funções ainda não definidas, bem
como a formação de metabólitos específicos do elemento podem estar envolvidos,
havendo a necessidade de estudos mais detalhados e aprofundados sobre a ação
do Se como nutriente e elemento funcional para o organismo humano.
2.2. Fontes
Tanto os animais quanto o homem são primariamente dependentes
das plantas para seu requerimento nutricional de Se. Desta forma, a quantidade
deste nutriente em alimentos de origem vegetal é um fator determinante da sua
disponibilidade na cadeia alimentar.
O conteúdo de Se em plantas depende da região de cultivo (TERRY et
al., 2000), ou seja, do nível de Se disponível nos solos. No entanto, observa -se
variação entre espécies de plantas quanto à sua capacidade de acumulação.
O trigo, cereal básico amplamente consumido na dieta humana, é uma
boa fonte de Se apesar de apresentar uma ampla faixa de concentração em função
do local de cultivo (0,04 - 21,4 mg kg
-1
). Devido à sua capacidade natural de
acumulação do nutriente no grão e por seu amplo consumo em várias partes do
mundo, o trigo tem sido bastante estudado como veículo para o Se por meio do
enriquecimento via adubação da cultura (LYONS et al., 2003). Outros cereais como
arroz e milho também têm sido enriquecidos objetivando elevar o nível de ingestão
dietética de Se (BEILSLEIN et al., 1991; CHEN et al., 2002; WHANGER, 2002).
10
Frutas, leguminosas e hortaliças apresentam baixos teores de Se (<
0,1 µg g
-1
peso úmido) mesmo quando cultivados em solos considerados seleníferos
(máximo de 6 µg g
-1
) (TERRY et al., 2000). Todavia, os mesmos autores
acrescentam que vegetais como alho e aspargo podem acumular teores do
nutriente acima de 17 µg g
-1
quanto cultivados nestes solos.
Os cereais, de modo geral, apresentam níveis relativamente altos de
Se (< 0,1 - > 0,8 µg g
-1
peso úmido) apesar da variação observada em função do
local de cultivo. Entretanto, grãos beneficiados e seus produtos derivados podem
apresentar redução no conteúdo de Se em relação ao alimento integral (MORRIS e
LEVANDER, 1970; FERRETTI e LEVANDER, 1974) a exemplo do que ocorre para
outros minerais traços.
Alimentos de origem animal como frutos do mar, fígado, rim (0,4 – 1,5
µg g
-1
peso úmido), carne (0,1 – 0,4 µg g
-1
peso úmido) e derivados do leite (< 0,1 –
0,3 µg g
-1
peso úmido), apresentam geralmente alto conteúdo de Se em relação aos
produtos de origem vegetal sendo considerados, em termos quantitativos, boas
fontes do nutriente (FERRETTI e LEVANDER, 1974; SAKURAI e TSUCHIYA, 1975;
BIERI e AHMAD, 1976; OLSON et al., 1978).
No Brasil, apesar da escassez de estudos sobre a concentração de Se
nos alimentos, tem-se constatado que os peixes podem contribuir com razoável
quantidade do micronutriente na dieta seguindo-se das carnes, das víceras e do
trigo (FERREIRA, 2002). A castanha-do-Pará, alimento típico da região norte do
país, tem despertado o interesse dos pequisadores em virtude de seus altos níveis
de Se, sendo considerada a maior fonte natural de Se orgânico já identificada (IP e
LISK, 1994). Todavia, como observado por FERREIRA (1999), o consumo regular
tanto de peixe quanto de castanha-do-Pará não faz parte do hábito alimentar de
grande parte da população brasileira. Além disso, o trigo utilizado no Brasil, devido a
sua procedência diversa, apresenta variáveis quantidades de Se. Desta forma,
estes alimentos não podem ser considerados como uma real fonte dietética do
nutriente para a população brasileira.
Apesar do nível de Se nos alimentos representar um importante
indicador do seu estado nutricional na população, deve-se ressaltar que a
determinação da quantidade ingerida do nutriente não prediz, por si só, a
contribuição do elemento na manutenção das funções vitais do organismo. É a
11
determinação da biodisponibilidade do nutriente no alimento ou na dieta que
indicará a eficiência do suprimento de Se ao organismo humano.
3. Biodisponibilidade
A biodisponibilidade é definida como a proporção de um nutriente
ingerido e que é utilizado para as funções normais ou armazenado. A
biodisponibilidade de Se depende da conversão do Se absorvido dentro de uma
forma biologicamente ativa a qual é retida pelos tecidos (TAPIERO et al., 2003).
A absorção de Se pelo organismo parece não sofrer regulação
homeostática, mostrando-se normalmente elevada, não se constituindo, portanto,
em um fator limitante da biodisponibilidade do micronutriente. A homeostase do Se
em condições fisiológicas normais é obtida principalmente pela regulação da
excreção urinária (GROFF et al., 1995).
O determinante primário da absorção e subsequente utilização do Se
pelo organismo é sua forma química a qual tem sido envolvida também nos efeitos
funcionais do nutriente.
O Se nos alimentos é encontrado na forma orgânica (ex.
selenometionina e selenocisteína) e na forma inorgânica (Ex. selenito e selenato).
Em plantas, o Se está presente principalmente na forma de SeMet incorporado não
especificamente a proteínas no lugar da metionina (Met) podendo representar mais
de 50 % do total de Se (TAPIERO et al., 2003). A SeMet é também a principal
forma de Se em leveduras enriquecidas a qual se constitui na maior fonte de Se
disponível comercialmente. As demais formas presentes em plantas como SeCys,
SeMCys e ?-glutamil-Se-metil-cisteína não são significativamente incorporadas nas
proteínas (TAPIERO et al., 2003). Todavia, alguns estudos têm atribuído os efeitos
funcionais do Se na prevenção do câncer à presença de SeMCys em algumas
plantas cultivadas sob elevada disponibilidade do elemento (IP et al., 2000; FINLEY
et al., 2001; WHANGER, 2002). Em mamíferos, a SeMet é absorvida no intestino
delgado pelo mesmo mecanismo de transporte da metionina (VENDELAND et al.,
1992).
Em animais, a maior parte do Se se encontra na forma de SeCys que
é provavelmente absorvida por um mecanismo comum de transporte ativo com
aminoácidos básicos e incorporada de forma específica a proteínas (VENDELAND
et al., 1992).
12
O Se inorgânico (selenito e selenato de sódio) está presente nos
alimentos em baixíssima concentração. Sua significância em relação ao suprimento
de Se está relacionada à sua utilização como suplemento alimentar, isoladamente
ou em complexos de nutrientes (SCRAUZER, 2001).
Estudos em humanos e animais têm mostrado que SeMet é absorvida
e retida mais eficientemente que o selenato (BUTLER et al., 1991) ou selenito
(GRIFFITHS et al., 1976; RAGHIB et al., 1986; MOSER-VEILLON et al., 1992), e
que o selenato é absorvido mais eficientemente que o selenito (LEVANDER et al.,
1983; MOSER-VEILLON et al., 1992), mas não é tão efetivo em manter o estado
nutricional de Se (determinado pela atividade da GPx em plaquetas) como ocorre
com o Se presente no trigo e na levedura enriquecidos (LEVANDER et al., 1983).
Os ensaios de biodisponibilidade de Se têm mostrado ainda que o Se
presente em alimentos de origem animal é geralmente menos biodisponível do que
as formas presentes em vegetais (BUGEL et al., 2002).
Peixes e mariscos são considerados boas fontes de Se. Entretanto,
DOUGLASS et al. (1981), utilizando modelo com ratos, observaram que o Se
contido em atum enlatado foi apenas 57 % tão efetivo quanto o selenito em
restaurar a atividade da GPx no fígado dos animais previamente deficientes,
enquanto que o Se no fígado bovino cozido e no trigo enriquecido tiveram,
respectivamente, 96 e 83 % da atividade do selenito. A baixa biodisponibilidade do
Se em peixes em relação a alimentos vegetais também foi verificada por MELTZER
et al. (1993) em humanos. Uma das explicações para este fato tem se baseado em
uma possível inibição da absorção do nutriente pela formação de complexos com
metais pesados, como o Hg. Entretanto, foi verificado que mesmo em casos onde a
concentração de metal pesado no alimento foi considerada irrelevante a baixa
biodisponibilidade se manteve (GROFF et al., 1995).
Além da forma química, alguns fatores dietéticos têm mostrado afetar
a biodisponibilidade de Se em animais, normalmente pelo seu efeito sobre a
absorção do nutriente. Como favorecedores da absorção inclui-se a relação
metionina/proteína e a presença de nutriente antioxidante como o ácido ascórbico.
Como inibidores, pode-se incluir metais pesados e altos níveis de enxofre dietético
(FAIRWEATHER-TAIT, 1997; GREGER e MARCUS, 1981).
CHOE e KIES (1989) encontraram que a dose de ácido ascórbico de
200 mg não teve efeito sobre o metabolismo do Se (selenato de sódio na dose de 5
13
µg), mas parece melhorar a biodisponibilidade do nutriente, avaliada pela mudança
da concentração de Se no plasma e pela atividade de GPx, proveniente de uma
mistura de alimentos servidos na dieta (MUTANEN e MYKKANEN, 1985).
Não obstante a sua relevância, informações obtidas nos ensaios de
biodisponibilidade de Se devem ser avaliadas à luz de algumas importantes
considerações sobre a abrangência e o significado dos parâmetros utilizados. De
modo geral, o Se proveniente de diversas fontes é bem absorvido. Mais de 90 % da
SeMet, a maior forma dietética do elemento, é absorvida pelo mesmo mecanismo
da metionina (Swanson et al., 1991). Desta forma, o principal parâmetro de
avaliação da biodisponibilidade do nutriente é a sua incorporação em uma forma
biologicamente ativa, ou seja, a sua eficiência de utilização pelo organismo, a qual é
medida pela atividade de selenoenzimas, principalmente a GPx em tecidos ou
fluidos biológicos. Todavia, este parâmetro não considera o Se retido não
especificamente à proteína, o qual, por ocasião do turnover normal da célula,
poderia ser liberado e aproveitado biologicamente. Por outro lado, a retenção por si
só não se constitui um bom parâmetro de avaliação da biodisponibilidade, pois a
incorporação não específica de SeMet em proteínas no lugar de Met
(WASCHULEWSKI e SUNDE, 1988) confere a esta forma de Se uma óbvia
vantagem sobre as demais formas orgânicas e inorgânicas mencionadas.
De acordo com FAIRWEATHER-TAIT (1997) não há, até o momento,
uma metodologia que possa ser considerada ideal. O autor acrescenta ainda que,
um caminho aparentemente mais fácil de pesquisar a biodisponibilidade de Se nos
diversos alimentos envolveria a caracterização, em detalhes, da utilização pelo
organismo das diferentes formas químicas do nutriente (usando mudança do estado
nutricional e cinética de modelagem). Estes dados, quando combinadas com
informações sobre a concentração e especificação de tais formas no alimento,
possibilitariam predizer a biodisponibilidae de Se proveniente das diferentes fontes
alimentares.
Além disso, deve-se considerar ainda a hipótese de que a
determinação da biodisponibilidade de Se por meio dos indicadores utilizados pode
não ser eficiente em predizer o efeito funcional do Se no organismo humano visto
que os mecanismos envolvidos podem não estar relacionados às suas já
reconhecidas funções como nutriente, como é o caso dos efeitos anticarcinogênicos
14
de compostos metilados de Se formados durante metabolismo do elemento
observados por IP e LISK, 1993.
4. Interação com outros nutrientes
Poucas são as pesquisas enfocando interações entre Se e demais
nutrientes ou componentes do alimento. Alguns metais como chumbo, ferro, cobre e
mercúrio tem mostrado interagir com o nutriente reduzindo significativamente sua
concentração nos tecidos (no caso do chumbo) ou complexando-se com ele inibindo
sua absorção no intestino (Fe, Cu e Hg) (WHANGER, 1976; REILLY, 1996).
Outras interações estão relacionadas com a ação antioxidante
complementar entre o Se e demais nutrientes como a vitamina E, e na manutenção
das condições fisiológicas normais como na interação entre Se e iodo.
Estudos demostram que a vitamina E e o Se são interdependentes
podendo, inclusive, agir sinergisticamente na prevenção de alguns tipos de câncer
(HORVATH e IP, 1983; IP e WHITE, 1987; KLEIN et al., 2000).
O Se é importante para o estado nutricional da vitamina E por
preservar a integridade pancreática, mantendo a digestão normal de gordura,
formação de micelas e absorção da vitamina. O Se, como parte da GPx, destrói
peróxidos prevenindo o seu ataque aos ácidos graxos poliinsaturados presentes nas
membranas das células, o que reduz a quantidade de vitamina E que é requerida
para manter a integridade das membranas. Finalmente, o Se ajuda a reter a
vitamina E no plasma sangüíneo. A vitamina E, por sua vez, ajuda a prevenir a
perda de Se pelo organismo em virtude de sua própria atividade antioxidante, por
limitar a cadeia de reações de destruição dos lipídios de membrana reduzindo a
produção de hidroperóxidos, os quais pod1aogp74destrorção da Gte pa a
15
Os estudos demonstram que, pelo decréscimo da atividade de GPx
intracelular, a deficiência de Se pode aumentar a concentração de H
2
O
2
em
condições adequadas de suprimento de iodo promovendo, em algumas semanas, a
atrofia da tireóide observada no cretinismo mixedematoso. Já em mulheres
deficientes em iodo, a elevação no nível de ingestão de Se promoveria aumento na
deiodinação de T
4
e produção de T
3
reduzindo o suprimento de T
4
para o feto e seu
cérebro com efeitos deletérios da deficiência de iodo caracterizada no cretinismo
neurológico (CORVILAIN et al., 1993). Desta forma, tanto a deficiência de Se em
condições adequadas de suprimento de iodo quanto à situação contrária pode
promover efeitos nocivos ao organismo humano, devendo-se atentar para o estado
nutricional de um e de outro nutriente quando da suplementação para correção de
deficiências.
5. Sinais e sintomas da deficiência
A identificação de alguma doença humana devido à baixa ingestão de
Se é difícil porque a deficiência deste nutriente em animais é caracterizada por
grande variedade de sinais envolvendo diferentes sistemas e órgãos. Este é talvez o
motivo pelo qual evidências de deficiência em humanos sejam relativamente raras e
populações com baixo nível de ingestão do nutriente não demonstrem,
normalmente, sintomas aparentes (DANIELS, 1996).
Entretanto, casos de deficiência severa de Se em humanos resultam
em uma cardiomiopatia denominada doença de Keshan, prevalente em crianças na
idade pré-escolar e mulheres em fase reprodutiva, com média de ingestão de Se de
10 µg por dia (YANG et al., 1988; GE e YANG, 1993). Indivíduos com caso agudo
da doença sofrem de insuficiência cardíaca repentina e em casos crônicos há o
alargamento do coração com graus variáveis de insuficiência.
A deficiência de Se também tem sido mencionada como um dos
fatores contribuintes para uma desordem nas articulações conhecida como doença
de Kashin-Beck que se manifesta durante a adolescência (CHENG e QUIAN, 1990).
A doença é freqüentemente caracterizada por degeneração de nervos e células
cartilaginosas do corpo, o que resulta em nanismo e deformações das articulações
(GE e YANG, 1993). A incidência desta doença foi observada em áreas da China
com baixo conteúdo de Se no solo, o qual refletia sobre os alimentos e, por
conseguinte, sobre o nível de ingestão do nutriente pela população.
16
BECK et al. (1995) afirmam que experimentos com animais têm
demonstrado que a deficiência em Se promove a redução da atividade das
selenoenzimas, mas se os animais são adequadamente nutridos, a deficiência
causa relativamente poucos sintomas clínicos. Entretanto, quando da presença de
certos tipos de estresses químico, nutricional e infeccioso, a deficiência de Se pode
levar a ocorrência de sérias doenças. É o caso, por exemplo, da indução de
deficiência de vitamina E em animais deficientes em Se que tem demostrado causar
peroxidação lipídica e necrose do fígado em ratos e porcos e injúrias cardíacas em
porcos, ovelhas e bovino (VAN VLEET, 1980).
Uma exceção ao postulado no parágrafo anterior, diz respeito à
interação entre iodo e Se. Neste caso, como explicado anteriormente no item 2, a
deficiência de Se pode proteger contra a deficiência de iodo pelo decréscimo no
metabolismo de T
4
, com conseqüente redução na perda deste nutriente pelo
organismo (CORVILAIN et al., 1993).
Pessoas submetidas à nutrição parenteral total geralmente
apresentam deficiência de Se, apresentando sintomas que incluem dor muscular,
debilidade e perda da pigmentação do cabelo e da pele e o branqueamento do
fundo da unha (GROFF et al., 1995).
6. Indicadores do estado nutricional
O índice utilizado na avaliação do estado nutricional de Se tem sido a
determinação da atividade de GPx em fluidos biológicos, cuja expressão máxima no
plasma é empregada como parâmetro de determinação do nível de ingestão
adequado de Se por humanos. Entretanto, a falta de uniformidade nas condições de
avaliação e as diferentes unidades utilizadas para expressar os resultados têm
tornado muito difícil à comparação interlaboratorial. Apesar disso, a medição da
atividade de GPx no sangue ou em um componente sangüíneo pode ser uma
medida prática do estado nutricional de Se.
Dentre as vantagens de utilização da medição da atividade de GPx
incluem-se a mais fácil execução e o fato de não estar sujeita à contaminação.
Todavia, a GPx representa apenas o Se “funcional” nos tecidos, não o Se que tem
sido incorporado não especificamente dentro de proteínas ou que tem formado
complexos biologicamente inativos com metais pesados. Finalmente, pelo menos
em alguns tecidos, a atividade da enzima parece diminuir quando o nível dietético
17
de Se se aproxima do requerimento nutricional do animal (HORVATH e IP, 1983;
LANE e MEDINA, 1985).
Em células vermelhas sangüíneas, um material biológico que é
altamente conveniente para o propósito de amostragem, o “efeito platô” da atividade
de GPx parece não ocorrer (HOEKSTRA, 1975). Assim, segundo o autor, a
ausência de platô pode limitar a utilização de GPX nos eritrócitos para o
estabelecimento do requerimento de Se, mas não diminui a utilidade desta fonte da
enzima como índice geral do estado nutricional de Se. Entretanto, devido a meia
vida das células vermelhas do sangue ser relativamente longa (120 dias), a medição
da atividade de GPx em eritrócitos pode não refletir adequadamente o estado
nutricional imediato de Se e, assim, de acordo com SIMONOFF et al. (1992), o
plasma poderia ser um melhor indicador a curto prazo enquanto que os eritrócitos
poderiam ser utilizados como indicadores a longo prazo.
Como a atividade da enzima é influenciada por variáveis fisiológicas
como idade, sexo, estado nutricional geral, exposição a certos estressores,
intoxicantes ou metais pesados e também pela deficiência de Fe e vitamina B
12
(GANTHER et al., 1976), estas devem ser controladas e, ou compensadas se a GPx
for utilizada como índice nutricional.
Outros índices de avaliação do estado nutricional de Se têm sido
utilizados e mencionados em alguns trabalhos reportados na literatura. Dentre eles,
estão às medições da concentração do elemento traço no sangue total, no soro ou
no plasma, nos eritrócitos, na urina, no cabelo e nas unhas (CHEN et al., 1980;
LEVANDER et al., 1983; WASOWICZ et al., 2001; WASOWICZ et al., 2003). Resta
a questão, todavia, se há ou não boa correlação entre estas medições e o
verdadeiro estado de Se no indivíduo definido pelo Se funcional em uma enzima.
Neste sentido, alguns trabalhos foram realizados correlacionando a
concentração de Se em um fluido biológico e a atividade de GPx no mesmo fluido
ou em outro. Os estudos indicam que há boa correlação entre estas variáveis. No
entanto, em concentrações muito elevadas de Se no sangue, a correlação não se
verifica (THOMSON et al., 1977; LANE et al., 1981; LANE et al., 1983). REA et al.
(1979) encontraram boa correlação entre a concentração de Se no plasma e nos
eritrócitos, em indivíduos com estado moderado de Se, bem como entre a
concentração de Se no plasma e a atividade GPX nos eritrócitos.
18
De acordo com tais estudos é possivel assumir, com alguma
segurança, que em concentrações de Se no sangue abaixo de 1,0 µmol L
-1
há uma
boa correlação entre a concentração do elemento no plasma ou no sangue e a
atividade GPx em eritrócitos e que, portanto, a concentração de Se no plasma pode
ser utilizada como um bom índice do seu estado nutricional em humanos. Em
concentrações de Se no sangue, acima de 1,0 µmol L
-1
, a correlação torna-se
progressivamente mais fraca, devido provavelmente à ausência de síntese da
enzima (a enzima chega à sua atividade máxima) nestas concentrações (DIPLOCK,
1993).
A medição da GPx em plaquetas vem sendo utilizada em alguns
trabalhos. LEVANDER et al. (1983), em um ensaio de biodisponibilidade de Se com
homens finlandeses, observaram que a concentração de GPx em plaquetas
duplicou dentro de duas a três semanas em seguida à suplementação com 200 µg
de Se por dia, enquanto que a concentração da enzima no plasma aumentou
apenas 20 %. Neste caso, a atividade GPx em plaquetas poderia ser utilizada como
índice de relativa eficiência quando respostas rápidas a mudanças no estado
nutricional de Se são necessárias. RAYMAN (2000), referindo-se ao estudo de
NEVE (2000), afirmou que se a saturação de GPx em plaquetas for utilizada na
medição da repleção de Se, em substituição à máxima atividade da enzima no
plasma, uma ingestão mais elevada de Se, na faixa de 80 – 100 µg por dia, é
requerida.
A avaliação do estado nutricional de Se pela medição da concentração
do elemento no cabelo ou nas unhas apresenta como vantagem o fato de ser uma
técnica não invasiva, que não requer habilidades específicas na obtenção da
amostra, e não necessita de sistema de refrigeração para estocar o material a ser
analisado, sendo esta última vantagem de especial importância quando da
avaliação do estado nutricional em populações de partes remotas do mundo. Além
disso, foi observada uma excelente correlação entre a concentração de Se no
cabelo e no sangue total (CHEN et al., 1980).
A medição de Se na urina apresenta uma série de dificuldades não
representando um método prático de avaliação do estado nutricional.
19
7. Bases para recomendação nutricional de selênio
O estabelecimento dos níveis de Se requeridos para se obter os
benefícios nutritivos, tanto quanto os níveis de segurança para proteger o organismo
humano de possíveis efeitos tóxicos, tem se baseado quase que exclusivamente em
resultados chineses (YANG et al., 1989b; YANG e ZHOU, 1994).
Nestes estudos, observou-se que a ingestão de aproximadamente 5
mg por dia resultou em clara ocorrência de selenose, caracterizada pela perda de
unhas e de cabelo. No entanto, a tolerância dos indivíduos a tão altos níveis de Se
só ocorreu devido ao consumo de dietas com elevado teor de fibras. O nível mais
baixo de Se dietético promotor de efeitos tóxicos foi estimado em aproximadamente
1600 µg por dia. Todavia, alguns efeitos foram observados em indivíduos com
ingestão de 900 µg por dia. A ingestão dietética máxima de Se considerada segura
foi calculada em 800 µg por dia, mas em alguns indivíduos a quantidade de 600 µg
por dia apresentou-se como a ingestão máxima segura. Assim, para obter-se um
fator de segurança, a máxima ingestão dietética para o Se foi sugerida como 400 µg
por dia. Um nível de cerca de 40 µg de Se diários foi sugerido como requerimento
mínimo, enquanto que uma ingestão menor que 11 µg diários certamente resultaria
em problemas de deficiência.
As mais recentes Dietary Reference Intakes (DRIs), ou Ingestão
Alimentar de Referência para Se são apresentadas no Quadro 1.
A Food and Nutrition Board da US NATIONAL ACADEMY OF
SCIENCES (2000) recomenda a ingestão diária de 55 µg tanto para homens quanto
para mulheres. Este valor foi baseado na quantidade de Se necessária para
maximizar a atividade da enzima GPx no plasma (GPx plasmática).
As estimativas destes novos valores de referência tiveram por base um
número diversificado de informações químicas, nutricionais e toxicológicas
acumuladas por mais de meio século sobre a ingestão alimentar de Se. A avaliação
conjunta destes fatores permitiu chegar a algumas importantes conclusões e
determinações tais como: a não variação das recomendações RDA (Recommended
Dietary Allowances) para o Se em função do gênero ou idade depois dos 14 anos; o
estabelecimento do UL (Tolerable Upeer Intake Level) para o nutriente e; a
recomendação de pesquisas de intervenção em grande escala sobre os potenciais
efeitos preventivos de doenças pelo Se dentre outros nutrientes considerados
antioxidantes (AMAYA-FARFAN et al., 2001).
20
Quadro 1. Dietary Reference Intakes (DRIs): requerimentos médios estimados por
grupos. Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National
Academies (2000)
Grupos/Estágio de vida
AI
1
EAR
2
RDA
3
UL
4
_________________ µg por dia _______________
Lactentes
0
–
6 meses
15
45
7
–
12 meses
20
60
Crianças
1
–
3 anos
17
20
90
4
–
8 anos
23
30
150
9
–
13 anos
35
40
280
Adolescentes
14
–
18 anos
45
55
400
Adultos
19
–
30 anos
45
55
400
31
–
50 anos
45
55
400
51
–
70 anos
45
55
400
> 70 anos
45
55
400
Gestação
= 18 anos
49
60
400
19
–
30 anos
49
60
400
31 50 anos
49
60
400
Lactação
= 18 anos
59
70
400
19
–
30 anos
59
70
400
31
–
50 anos
59
70
400
1
AI: Adequate Intake;
2
EAR: Estimated Averange Requeriment;
3
RDA: Recommended Dietary Allowances;
4
UL: Tolerable
Upeer Intake Level
Como nenhum critério do estado nutricional de Se tem demonstrado
refletir a resposta à ingestão alimentar em lactentes, as recomendações de Se para
este grupo foram baseadas na Ingestão AI que reflete a ingestão média de Se por
lactentes alimentados principalmente com leite humano.
21
Para crianças e adolescentes, a falta de dados se repete e assim, EAR
e as RDAs para estes grupos têm sido obtidos pela extrapolação dos valores para
adultos.
Dada a mais elevada suscetibilidade das mulheres para desenvolver a
doença de Keshan, os requerimentos para as várias idades nos grupos são
baseados no mais alto peso de referência dos homens não havendo, portanto,
distinção de gêneros.
Como nenhuma condição patológica relacionada à insuficiência de Se
foi reportada em indivíduos com mais idade (grupo acima de 50 anos) e como os
marcadores do estado nutricional de Se no sangue não diferem com a idade ou
gênero (HILL et al., 1996), as mesmas necessidades estabelecidas para adultos
jovens foram utilizados para este grupo.
Para gestantes, a necessidade média de Se foi baseada na deposição
fetal de 4 µg por dia durante todo período de gestação totalizando EAR de 49 µg por
dia. Uma vez que a maior parte do Se é altamente biodisponível, nenhum ajuste é
feito para absorção, o mesmo ocorrendo com relação à idade da mulher.
No caso de mulheres em fase de lactação, a estimativa das
necessidades de Se teve como base a quantidade média do nutriente excretado no
leite humano e a quantidade diária de leite ingerido por lactentes dos dois aos seis
meses de vida. O valor obtido foi então acrescido do estimado para mulheres não
gestantes e não lactantes, sem qualquer distinção quanto à idade ou
biodisponibilidade.
Apesar do ainda escasso número de informações necessárias à
obtenção de uma estimativa mais precisa das necessidades de Se para alguns
grupos considerados, as atuais DRIs, de acordo com AMAYA-FARFANI et al.
(2001), apresentam alguns importantes avanços principalmente no que diz respeito
aos critérios utilizados para se chegar ao que seria um consumo adequado. Desta
forma, foi dado ênfase aos parâmetros de saúde como a redução do risco de
doenças, que embora timidamente considerados nas RDAs anteriores podem ser
tidos como inovadores, pois diminuem o peso dado ao fator crescimento.
Considerando que outros mecanismos, além da atividade antioxidante
da GPx, estão envolvidos nos efeitos do Se sobre a saúde humana, observa -se a
necessidade de estudos que objetivem determinar índices funcionais que
correlacionem a quantidade e a forma de Se ingerida com a máxima expressão de
22
tais efeitos. Estes índices poderiam, assim, ser empregados na determinação da
ingestão dietética adequada para se obter tanto os benefícios nutricionais quanto
funcionais atribuídos ao Se.
8. Prevalência de deficiência em nível populacional
A ingestão de Se por humanos foi estimada principalmente em função
do nível de Se disponível no solo do qual provem, via de regra, todo o Se presente
nos alimentos, pela combinação da dieta e ainda por meio da avaliação de índices
do estado nutricional de Se na população.
Devido à distribuição desuniforme de Se na crosta terrestre, desordens
relacionadas tanto a deficiência quanto a toxidez do elemento são conhecidas. A
China, por exemplo, apresenta em seu território áreas com os mais baixos e os mais
altos teores de Se em todo o mundo (YANG et al., 1989a), o que explica a
ocorrência de casos extremos de deficiênica e toxidez por este elemento em sua
população. Neste país, são encontrados os dois extremos de ingestão diária de Se
por adultos que é de 7 µg, em áreas de ocorrência da doença de Keshan, e de 5000
µg, em área de incidência de selonose (YANG et al., 1989b).
Níveis de ingestão menos extremos, mas largamente diversos, têm
sido observados em outras partes do mundo. Algumas estimativas da ingestão
diária de Se por parte da população de alguns países são apresentadas por
COMBS (2001) e incluem a Inglaterra (12 – 43 µg), Bélgica (45 µg), Canadá (98 –
224 µg), USA (60 – 220 µg), Croácia (27 µg) e Nova Zelândia (19 – 80 µg). Segundo
esse autor, estima-se que 0,5 a 1,0 bilhão de pessoas no mundo são deficientes em
Se, apresentando a grande maioria da população m
23
do Sul são escassos. Sabe-se que, até o momento, nenhuma área com baixo teor
de Se foi encontrada na Rússia, enquanto na África já foram detectadas áreas
deficientes as quais estão curiosamente relacionadas com a prevalência de AIDS.
Algumas informações já disponíveis indicam também a existência de áreas
deficientes de Se na Argentina e áreas seleníferas na Venezuela. Dados relativos à
distribuição e teor de Se nos solos brasileiros ainda não estão disponíveis na
literatura. No entanto, estão em curso estudos iniciais de mapeamento de Se no
Brasil, desenvolvidos por meio de parceria entre instituições públicas nacional e
estrangeira (MARTENS et al., 2004).
Apesar de sua importância sob vários aspectos, informações sobre o
teor de Se nos solos não se constitui, na maioria dos casos, em um indicador
eficiente do nível de ingestão de Se pela população. Devido à variação na
disponibilidade de Se para as plantas, alimentos obtidos em áreas com alto
conteúdo de Se podem apresentar baixa concentração do elemento. Além disso,
mesmo que conhecida a disponibilidade de Se nos solos, o considerável
intercâmbio de alimentos entre populações de muitas partes diferentes do mundo
não permite estabelecer, por si só, uma relação confiável entre esta variável e o
estado nutricional de Se em nível populacional (DIPLOCK, 1993).
Ainda que precárias, as estimativas do nível de ingestão dietética de
Se por parte da população brasileira foram obtidas pela determinação da
concentração do nutriente em alimentos regularmente consumidos em nível local ou
regional, como parte da dieta dos seus habitantes, bem como por meio da avaliação
de índices do estado nutricional de Se.
FERREIRA (1999), analisando o conteúdo de Se de uma variedade de
alimentos, constatou haver déficit de Se na dieta da população brasileira, concluindo
que a deficiência do nutriente pode atingir, inclusive, indivíduos de elevado poder
aquisitivo.
Em estudos desenvolvidos por CUNHA et al. (2003) com indivíduos de
baixa renda morando no Rio de Janeiro (Brasil), foram detectados níveis de Se no
soro inferiores aos observados em habitantes de algumas cidades européias
embora um pouco acima daqueles observados na Nova Zelândia e na Finlândia
(Quadro 2), países onde a baixa concentração de Se nos alimentos reflete a
deficiência do nutriente nos solos.
24
Quadro 2. Comparação de níveis médios de Se no soro entre adultos de diferentes
países/região
País/Região
Se (µg L
-
1
)
Finlândia (Helsinki)
41,71
Nova Zelândia (Dunedin)
47,24
Brasil (Rio de Janei
ro)
73,18
Alemanha Ocidental (Mainz)
81,10
Suécia (Lund)
85,03
Itália (Roma)
89,76
Japão (Hiroshima)
97,63
USA (Mort. Gr.)
110,23
Inglaterra (Southampton)
115,74
Canadá (Toronto)
158,26
Fonte: NEVE (1995) op cite.
O valor de 73,18 µg L
-1
para habitantes da cidade do Rio de Janeiro,
obtido neste trabalho, encontra-se um pouco acima do nível de referência da OMS
de 70 µg L
-1
, o qual representa o nível mínimo para maximilização da atividade GPx
no soro (NEVE, 1995). Entretanto, RAYMAN (1997) citou estudos que mostram que
o nível plasmático de Se de 100 µg por dia é requerido para expressão ótima de
GPx plasmática.
9. Estratégias para elevar a ingestão de selênio
Diante das evidências em relação à baixa ingestão de Se por grande
parte da população mundial e considerando-se os possíveis benefícios que a
ingestão deste nutriente poderia trazer à saúde humana, estratégias têm sido
desenvolvidas para possibilitar o acesso ao Se em níveis considerados
nutricionalmente adequados. Dentre as estratégias estão incluídas: a) o aumento no
consumo de alimentos ricos em Se, por meio da educação nutricional; b) a
suplementação individual; c) a suplementação animal; d) a adubação de plantas
com sais de Se e; e) o melhoramento de plantas para favorecer a acumulação do
nutriente no alimento. Tais estratégias serão brevemente discutidas nos itens que se
seguem.
25
9.1 Aumento no consumo de alimentos ricos em Se por meio da educação
nutricional
O trigo é mundialmente considerado como uma das mais importantes
fontes de Se na dieta. Mesmo na Europa, com seus baixos níveis de Se disponíveis
no solo, alimentos de consumo diário como o pão e cereais, são importantes fontes
do nutriente.
No Brasil, de acordo com os dados sobre o teor de Se em alimentos
obtidos por FERREIRA (2002), estima-se que, a exemplo do que se tem observado
em outros países, carnes, peixe e trigo estejam entre as melhores fontes do
nutriente para a população. Entretanto, não é hábito da população brasileira o
elevado consumo de pescados, o que faz do trigo, também no Brasil, até onde se
sabe, uma das mais importantes fontes de Se, embora sujeita a oscilações na
concentração de acordo com sua procedência (local de cultivo).
A castanha-do-Pará, alimento típico da região norte do Brasil, é
conhecida como a fonte alimentar de maior concentração natural de Se, embora os
níveis possam variar de 0,20 – 253 mg kg
-1
em peso fresco (SECOR e LINK, 1989
citado por CHANG, 1995). Estas variações se dão provavelmente em virtude das
diferenças no conteúdo de Se disponíveis no local de origem da castanha como
afirmado por CHANG et al. (1995). Todavia, apesar da elevada concentração de Se,
a castanha-do-Pará, devido ao seu hábito regionalizado de consumo, não pode ser
considerada como uma ampla fonte de Se por parte da população brasileira.
Sendo assim, medidas educativas visando à divulgação e incentivo
para o consumo de alimentos ricos em Se como peixes, vísceras e castanha-do-
Pará, por exemplo, poderiam contribuir consideravelmente na elevação da ingestão
deste nutriente por parte das populações deficientes. Entretanto, esta medida
esbarra no fato de que grande número de pessoas, em países em desenvolvimento,
tem dificuldade de acesso a alimentos de origem animal e mesmo que assim não
fosse, a reduzida disponibilidade destes alimentos no mercado limitaria o seu
consumo regular por mais ampla faixa da população.
9.2. Suplementação individual
Em países ocidentais, muitos indivíduos consomem regularmente
suplementos de Se, os quais são disponíveis tanto na forma inorgânica quanto na
forma orgânica. O selenito de sódio, em tabletes ou na forma fluida, é preferido ao
26
selenato devido à sua maior absorção e mais rápido acúmulo deste último e,
portanto, maior probabilidade da ocorrência de toxidez (CHEN et al., 2000; FINLEY
e DAVIS, 2001). Leveduras ricas em Se apresentam alta concentração de formas
orgânicas do elemento incluindo SeCys e SeMet (BIRD et al., 1997), sendo esta
última considerada de maior biodisponibilidade em relação às formas inorgânicas do
nutriente.
Apesar de ser uma medida bastante eficiente na elevação de Se, a
prática da suplementação deve ter acompanhamento especializado sendo
principalmente direcionada aos indivíduos de risco, a exemplo do que ocorre para
os demais nutrientes fornecidos na forma de suplementos.
Desta forma, estudos sugerem que as fontes dietéticas de Se, dentre
outros antioxidantes, são preferíveis aos suplementos quando da necessidade de
elevação da ingestão do nutriente por parte de populações (MOYAD, 2002). Além
disso, um inconveniente muito comum da suplementação individual como estratégia
para melhorar o estado nutricional da população, principalmente em países
desenvolvidos, é a maior dificuldade de acesso pela camada da população que mais
necessita do suplemento.
9.3. Suplementação de animais
Em se tratando de nutrição animal, a prática da suplementação de
rações com Se têm sido utilizada para controlar o baixo suprimento do nutriente
pelas forragens. Esta medida tem se mostrado eficiente não só no combate à
deficiência de Se nos rebanhos, mas também como meio de elevar a concentração
do mineral nos alimentos de origem animal consumidos pelo homem, contribuindo
para a maior ingestão dietética do nutriente em nível populacional.
A suplementação de animais com Se pode ser realizada diariamente
pela adição de formas orgânicas ou inorgânicas às rações, ou pela administração
direta de cápsulas ou suplementos líquidos injetáveis ou orais.
Estudos têm demonstrado (ALLAWAY, 1973; ULLREY et al., 1977)
que a suplementação de rações com Se inorgânico em níveis apropriados não
altera
27
estudados com relação ao seu potencial para o enriquecimento por meio da
suplementação com objetivos sobre a elevação do nível de ingestão, bem como
sobre a produção de formas de Se com elevada capacidade anticarcinogênica
tendo-se obtido resultados bastante promissores (WHANGER et al., 2000).
Todavia, a prática da suplementação de animais com Se requer alguns
cuidados, uma vez que, em virtude da capacidade tóxica do elemento, a aplicação
inadvertida de doses mais elevadas pode levar à morte do animal. Para contornar
este problema, uma forma mais segura de se obter um nível adequado de ingestão
pelos animais seria a produção de forragens enriquecidas por meio da adubação
com sais de Se (selenito e selenato de sódio) que será discutida a seguir também
como medida de elevação do nível de ingestão de Se pelo homem.
9.4. Adubação de culturas
O uso de Se como fertilizante de culturas é praticado principalmente
na Finlândia, desde 1984, onde é normalmente adicionado à mistura de NPK a uma
concentração de 16 mg kg
-1
ou 6 mg kg
-1
para cereais e culturas forrageira,
respectivamente (KOIVISTOINEN e HUTTUNEN, 1985; EUROLA e HIETANIEMI,
2000).
A experiência finlandesa tem caracterizado a fertilização de culturas
com Se como uma prática segura, de baixo custo, fácil execução e muito eficaz na
elevação do nível de Se na população. Segundo ARO et al. (1995), três anos após o
início do programa, a ingestão dietética de Se triplicou e a concentração do nutriente
no plasma quase duplicou. Tem-se observado também, a partir de 1985,
decréscimo na taxa de doenças cardiovasculares e de certos tipos de câncer, mas
pela falta de controle para comparações, tais efeitos não podem ser atribuídos
apenas ao Se (VARO et al., 1994).
O enriquecimento de cereais como trigo e arroz por meio da adubação
com sais de Se têm sido estudado em países como a Austrália e a China,
respectivamente, como meio de elevação da ingestão de Se por indivíduos
residentes em áreas onde a deficiência do elemento no solo é refletida em sua
concentração nos alimentos (LYONS et al., 2003; CHEN et al., 2002). Nestes
alimentos enriquecidos, o Se se encontra predominantemente na forma de SeMet
(OLSON et al., 1970; BEILSTEIN et al., 1991), cuja biodisponibilidade tem se
mostrado superior às outras formas do nutriente.
28
Outros estudos de enriquecimento de alimentos por meio da adubação
de culturas são realizados com o objetivo não apenas de elevar a ingestão de Se,
mas principalmente, de obter formas do nutriente consideradas anticarcinogênicas.
É o caso, por exemplo, do alho, da cebola e do brócolis (CAI et al., 1995; IP et al.,
2000) nos quais a principal forma de Se é a SeMCys. Esta forma foi indicada como
de alta eficácia na prevenção do câncer (FINLEY et al., 2000) o que maximiza os
benefícios oriundos de plantas enriquecidas com o referido nutriente.
9.5. Melhoramento de plantas para favorecer a acumulação de Se
(biofortificação)
O melhoramento de plantas com o objetivo de elevar a absorção e, ou
retenção de Se (biofortificação) pode ser, de acordo com LYONS et al. (2003), uma
estratégia eficaz e sustentável de elevação da ingestão do nutriente a exemplo do
que tem sido desenvolvido para outros micronutrientes como Fe, Zn e vitamina A.
A variabilidade observada entre plantas na sua capacidade de
acumulação de Se poderia funcionar como base genética para seleção. Estudos
preliminares têm encontrado uma variação na acumulação de Se entre plantas da
família das brássicas de cerca de 15 vezes (COMBS, 2001) e identificado uma soja
acumuladora de Se (WEI, et al., 1996). O trigo é outro alimento que tem se
mostrado muito promissor como alvo do melhoramento tanto pelo seu consumo
abrangente como pela sua variabilidade no conteúdo de Se (LYONS et al., 2003)
podendo, como já visto, acumular teores elevados do nutriente.
A utilização da biofortificação não dispensa o emprego das demais
estratégias vindo a complementá-las. Entretanto, como medida de elevação da
ingestão de micronutrientes dentre os quais está o Se, a utilização de plantas
biofortificadas apresenta algumas vantagens adicionais, destacando-se como mais
importantes a ausência de necessidade de mudança de comportamento ou de
hábitos por parte do consumidor, o baixo custo relativo e a elevada abrangência.
Um fator importante relacionado ao enriquecimento de alimentos com
Se por meio da adubação ou melhoramento de culturas é a evidência de que a
utilização de compostos puros do nutriente pode promover resultados diferentes
quando comparado com a sua presença em plantas. Observa-se que a SeMet pura
não é tão eficaz na redução de tumores de cólon, mas trigo enriquecido com Se,
onde a maior forma de Se é SeMet, apresentou alta efetividade. O mesmo foi
29
observado com relação à SeMCys em brócolis enriquecido (FINLEY e DAVIS,
2001).
10. Considerações finais
Apesar de evidências crescentes da deficiência de Se em muitas
partes do mundo e da provável relação entre incidência de doenças graves como o
câncer e a baixa ingestão do nutriente, estudos ainda são necessários para se
esclarecer os mecanismos pelos quais o Se promove seu efeito funcional ou
terapêutico e qual a importância ou contribuição das demais selenoproteínas não
funcionalmente caracterizadas, bem como das diferentes formas de Se presentes
nos alimentos, na promoção da saúde humana.
Ademais, estratégias de elevação do nível de ingestão de Se, ainda
que em determinadas situações se mostrem necessárias e urgentes, só devem ser
implementadas mediante rigorosa caracterização da situação nutricional da
população de modo a minimizar efeitos indesejáveis, como no caso da interação
negativa ente iodo e Se, e potencializar os efeitos almejados, utilizando estratégias
que permitam a maximização de sua ação, tanto nutricional quanto terapêutica,
resguardando sempre o limite de segurança acima do qual é expressa a capacidade
tóxica do nutriente.
11. Referências Bibliográficas
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40
CAPÍTULO 2 - Biodisponibilidade de selênio em cultivares de feijão comum e
em feijão submetido à adubação foliar com selenito de sódio
RESUMO
O feijão é uma leguminosa consumida regularmente na dieta da
população brasileira sendo considerado, em muitos países, uma importante fonte de
proteína, carboidratos complexos, vitaminas e minerais. Além de seus componentes
nutritivos, o feijão apresenta quantidades relevantes de compostos químicos com
propriedades antinutricionais, os quais têm mostrado reduzir o valor nutricional dos
alimentos, diminuindo a digestibilidade ou biodisponibilidade de macro e
micronutrientes. Este estudo teve por objetivo avaliar a biodisponibilidade de selênio
(Se) em 5 cultivares de feijão cozidos com sua água de maceração: branco (Ouro
Branco), negro (Diamante Negro) e marrom-rajado (BRS Radiante, Pérola e
Talismã), e em feijão Pérola submetido à adução com selenito de sódio e seu
controle. Ratas adultas Wistar foram submetidas a um período de depleção de 7
dias com dieta sem adição de Se. Posteriormente, os animais foram divididos em
nove grupos (n= 10 animais por grupo) e alimentados por um período de 28 dias
com as deitas experimentais com feijão e dietas contole (AIN-93 sem adição e com
adição de Se). As dietas com feijão bem como a dieta controle com Se foram
formuladas de modo a fornecer 0,1mg Se kg
-1
. A atividade das enzimas glutationa
peroxidase (GPx) plasmática e hepática bem como a concentração de Se nos
eritrócitos foram utilizados como biomarcadores da biodisponibilidade do nutriente.
Não foram observadas diferenças na biodisponibildade de Se entre os cultivares
estudados (P>0,05). A biodisponibilidade relativa de Se variou de 68,5 % (Diamante
Negro) a 55,5 % (BRS Radiante) avaliado pela atividade GPx plasmática. O feijão
Pérola submetido à adubação com Se apresentou biodisponibilidade relativa
superior ao feijão não adubado, embora suas concentrações no nutriente tenham
sido semelhantes.
41
Bioavailability of selenium in common bean cultivars and in foliar fertilized
beans with sodium selenide
ABSTRACT
Common beans is a legume consumed frequently in the Brazilian diet
and considered, in many countries, an important source of protein, complex
carbohy drates, vitamins and minerals. However, beans also possesses appreciable
amount of chemical compounds with antinutritional properties. These compounds
reduce the nutritional value of foods due the lowest absorption and bioavailability of
macro- and micronutrients. The aim of this current study was to evaluate the
bioavailability of Se in 5 beans cultivars cooked with their soaking water: white (Ouro
Branco), black (Diamante Negro) and brown (BRS Radiante, Pérola and Talismã),
and in Pérola beans fertilized or no with sodium selenite. Female adult Wistar rats
were placed in a selenium-free diet for 7 days (depletion). Then, they were
distributed in 9 groups (n= 10 animals per group) and fed with experimental diets
with beans and control diets (AIN-93 without addition of Se and with addition of Se)
for 28 days. The diets with bean as well as the control diets were formulated in order
to supply 0,1 mg Se kg
-1
. The activity of plasm and liver glutathione peroxidase
(GPx) enzymes and erythrocyte Se were used as biomarkers for bioavailability of the
nutrient. There was no difference in Se bioavailability between bean cultivars
(P>0,05). The relative bioavailability of Se varied from 68,5 % (Diamante Negro) to
55,5 % (BRS Radiante) evaluated by plasm GPx activity. Pérola beans fertilized with
Se presented higher relative bioavailability related to bean without fertilization,
despite their similar concentrations in Se.
42
BIODISPONIBILIDADE DE SELÊNIO EM CULTIVARES DE FEIJÃO COMUM E
EM FEIJÃO SUBMETIDO À ADUBAÇÃO FOLIAR COM SELENITO DE SÓDIO
1. Introdução
O selênio (Se) é um elemento essencial à nutrição humana com
importantes funções biológicas relacionadas, principalmente, à atividade das
enzimas tipo 1,5’-iodotironina deiodinase, envolvida no metabolismo dos hormônios
da tireóide (ARTHUR et al., 1993), e glutationa peroxidase (GPx), que auxilia nos
mecanismos de defesa da célula contra danos oxidativos (URSINI e BINDOLI,
1987).
A recomendação diária de ingestão do nutriente para adultos é de 55
µg com base na expressão máxima da atividade GPx em plasma sanguíneo (FOOD
AND NUTRITION BOARD, 2000). A deficiência de Se está implicada na etiologia de
doenças graves como a de Keshan, uma cardiopatia amplamente observada na
China em áreas onde o baixo nível de Se no solo reflete-se no seu teor nos
alimentos (GE e YANG, 1993; TAN et al., 2002). Não obstante este fato, evidências
de deficiência deste elemento traço em humanos são relativamente raras e muitas
populações com baixo nível de ingestão do nutriente não têm mostrado sintomas
aparentes (DANIELS, 1996). Contudo, nos últimos anos, estudos epidemiológicos
têm correlacionado positivamente o estado nutricional de Se no organismo humano
com uma ampla faixa de desordens incluindo doenças cardíacas e vários tipos de
câncer (SALONEN et al., 1982; WHANGER, 2004).
Em alimentos, o Se pode estar presente em menor proporção, nas
formas inorgânicas de selenito e selenato e, em maior quantidade, em formas
orgânicas como selenometionina, selenocisteína e selenocistina dentre outras
(BENDER e BENDER, 1997). Estudos utilizando vários modelos experimentais
constataram que as formas de Se ligadas organicamente são mais retidas que o Se
inorgânico, sendo a selenometionina a forma mais biodisponível do nutriente
comparativamente com as outras formas orgânicas mencionadas (BEHNE et al.,
1991; BEHNE e KYRIAKOPOULOS, 1993).
Os vegetais, de modo geral, incorporam o Se absorvido do solo em
proteínas, principalmente na forma de selenometionina e selenocisteína. Todavia, a
concentração de Se em alimentos de origem vegetal pode variar em função da
43
localidade em que foi produzido, particularmente quanto ao nível de Se no solo
(LEVANDER, 1987; GUPTA et al., 2000).
Nos últimos anos, pesquisas foram realizadas com o objetivo de
enriquecer alimentos de origem vegetal com Se por meio da adubação de culturas
com sais inorgânicos (selenito e selenato) (LU et al., 1996; FINLEY et al., 2001;
CHEN et al., 2002). Esta prática vem sendo discutida tanto no sentido de prevenção
da deficiência de Se pela elevação do seu nível dietético (CHEN et al., 2002),
quanto de redução do risco de câncer pelo aumento da ingestão de formas do
elemento que promova metabólitos considerados antimutagênicos (HU et al., 2002).
No Brasil, alimentos de origem vegetal apresentam, em sua maioria,
baixos teores de Se sendo os pescados considerados uma das principais fontes do
nutriente (FERREIRA, 1999). Entretanto, o elevado consumo de pescados não faz
parte do hábito alimentar de grande parte da população brasileira. Além disso,
segundo NEVE et al. (1987), as formas de Se encontradas nos peixes apresentam
baixa biodisponibilidade (20% a 50 %), em relação aos alimentos de origem vegetal
(85% a 100 %). Desta forma, a prática de enriquecimento de alimentos de origem
vegetal, utilizando técnicas de adubação com Se, poderia constituir-se numa medida
eficaz de elevação da ingestão e adequação deste elemento traço pela população
brasileira.
Neste sentido, o feijão, considerado um dos alimentos de maior
consumo per capita no Brasil e uma importante fonte de proteína na dieta brasileira,
pode constituir-se em um veículo promissor para o Se por meio do enriquecimento.
Deve-se considerar, no entanto, que a contribuição de um alimento na melhoria do
estado nutricional de Se em humanos e animais não está apenas em função da sua
concentração no alimento natural ou enriquecido, mas, sobretudo, de sua
biodisponibilidade.
Em alimentos, a biodisponibilidade de Se tem se mostrado variável em
função de fatores intrínsecos ao alimento e, principalmente, das formas químicas do
nutriente presentes no mesmo (MARKS e MASON, 1993; IP e LISK, 1993; FINLEY
e CINDY, 2001) e dos processos de preparação do alimento para consumo.
A biodisponibilidade de Se é geralmente avaliada pela determinação
da atividade enzimática de glutationa peroxidase (GPx) e do nível de Se em
componentes sanguíneos (plasma, eritrócitos e sangue total) ou em outros tecidos
44
(LEVANDER, 1987; NEVE, 1995). Estes parâmetros estão relacionados com o
estado nutricional relativo ao Se tanto em humanos como em animais.
Não obtante o seu elevado potencial nutritivo, o feijão tem sido alvo de
muitos estudos relativos à presença de substâncias antinutritivas que podem
complexar proteínas, vitaminas e sais minerais promovendo sua indisponibilização
para o organismo. Sendo assim, faz-se necessário determinar a biodisponibilidade
de Se em feijões como uma das principais medidas de avaliação do seu potencial
como fonte de Se.
O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito da adubação com
selenio de sódio nos níveis de selênio do cultivar Pérola e a biodisponibilidade de
Se neste cultivar e em cultivares de feijão das classes branca, pretorepresentativos
das variedades de maior consumo no Brasil.
2. Material e Métodos
2.1. Obtenção e preparo do material experimental
Foram utilizados os cultivares de feijão comum (Phaseolus vulgaris, L.)
Pérola (PE), Ouro Branco (OB), Diamante Negro (DN) e BRS Radiante (BRS)
fornecidos pela EMBRAPA – Arroz e Feijão, localizada em Santo Antônio de Goiás,
GO, o cultivar Talismã (TL) fornecido pela Universidade Federal de Viçosa, MG e o
cultivar Pérola submetido a adubação com Se (PE+Se) e seu respectivo controle
(PE-Se), fornecidos pela EPAMIG, MG.
Para obtenção do feijão PE+Se foi realizada, aos 30 dias após o
plantio, adubação foliar com 10 g ha
-1
de Se na forma de selenito de sódio diluído
em 200 litros de água aplicados com pulverizador costal de 20 litros. Outra área do
plantio foi submetida ao mesmo processo de pulverização utilizando-se água isenta
de selenito de sódio, constituindo-se no tratamento controle (PE-Se).
Obtidos os cultivares de feijão, foi realizada a preparação do material
experimental que se iniciou com a seleção e lavagem dos grãos seguindo-se de um
período 15 horas de maceração em água à temperatura ambiente, empregando-se
a proporção feijão:água de 1:2. Após este período, os feijões foram cozidos,
juntamente com a água de maceração acrescida de mais 500 mL de água, em
panela de pressão doméstica por 15 minutos contados após a saída constante de
vapor pela válvula de pressão. Os feijões com seu caldo de cocção foram dispostos
em bandejas de aço inoxidável e secos a 60 ºC em estufa de ar circulante por cerca
45
de 24 horas sendo, posteriormente, moídos em microprocessador doméstico e
passados por peneira com malha de 850 µm até sua completa trituração e
obtenção de uma farinha homogênea.
2.2. Determinação da concentração de Se
As amostras dos materiais experimentais acima especificados foram
submetidas a processo fechado de mineralização úmida, seguido da determinação
do teor de Se por Espectrofotometria de Absorção Atômica com Geração de
Hidretos de acordo com metodologia descrita por DIAZ-ALARCÓN e colaboradores
(1994).
Amostras de aproximadamente 0,5 g foram pesadas dentro de potes de
politetrafluoretileno (PTFE) aos quais foram adicionados 5 mL de ácido nítrico
concentrado e 1 mL de peróxido de hidrogênio a 30 %. O processo de mineralização
foi realizado em microondas modelo Ethos Plus, marca Milestone seguindo-se a
programação especificada no Quadro 1. Após a mineralização das amostras, foi
feita a redução do Se
+6
para o estado de oxidação Se
+4
pela adição de HCl
concentrado e aquecimento a 90 ºC por 30 minutos. Este procedimento é
necessário à obtenção de hidretos de Se quando da determinação do elemento por
espectrofotometria de absorção atômica com geração de hidretos. Após o
resfriamento das soluções, procedeu-se a sua transferência quantitativa para balões
volumétricos de 25 mL completando-se o volume com água deionizada,
procedendo-se da mesma forma com os padrões constituintes da curva de
calibração. A precisão (percentagem de recuperação) do processo de mineralização
da amostra foi obtida pelo método de padronização interna, acrescentando-se
quantidades crescentes de Se às amostras antes de sua mineralização. A
percentagem de recuperação foi de 101,02 %.
Quadro 1. Programa de digestão dos materiais experimentais em microondas
marca Milestone, modelo Ethos Plus
Etapa
Tempo
Temperatura
1
10 minutos
100
ºC
2
20 minutos
200
ºC
46
2.3. Determinação da composição centesimal
Na determinação da composição centesimal do material experimental
foram analisados os teores de umidade, cinzas, proteínas e lipídios seguindo-se os
métodos oficiais recomendados pela AOAC (1984). O teor de carboidrato foi obtido
pela subtração percentual dos teores de proteína, lipídios e cinzas.
2.4. Determinação do perfil de aminoácidos
A determinação da composição relativa e quantificação dos
aminoácidos presentes nos cultivares de feijão utilizados neste experimento bem
como do cultivar pérola adubado com Se (PE-Se) e seu controle (PE-Se), foi
realizada pelo método feniltiocarbamil aminoácidos (PTC) (análise de aminoácidos:
derivação pré-coluna com fenilisotiocianato) (ROSA et al., 1987). As amostras
foram submetidas às etapas consecutivas de a) hidrólise com LiOH 4N para o
triptofano por 24 h à 110 ºC e com HCl 6N bidestilado por 22 h à mesma
temperatura para os demais aminoácidos; b) derivação pré-coluna dos aminoácidos
livres com fenilisotiocianato (PITC); e c) separação dos derivados feniltiocarbamil-
aminoácidos (PTC-aa) em coluna de fase reversa C18 (Pico-Tag-3,9 x 150 mm)
com monitoração de comprimento de onda em 254 nm. Obteve-se a quantificação
dos PTC-aminoácidos pela integralização das áreas dos picos de cada aminoácido
tomando-se como referência a área do pico do padrão de aminoácidos com
concentração conhecida derivado nas mesmas condições e ao mesmo tempo que
as amostras.
2.5. Ensaio biológico
Para determinação da biodisponibilidade de Se nas variedades de
feijão, foi conduzido ensaio biológico no Laboratório de Nutrição Experimental do
Departamento de Nutrição e Saúde da Universidade Federal de Viçosa. Noventa
ratas (Rattus novergicus, variedade albinus, classe Rodentia), da linhagem Wistar,
adultas, com idade média de 50 dias foram pesadas, distribuídas em gaiolas
individuais e mantidas em ambiente com temperatura variando entre 22 ± 2
o
C
e
ciclo claro-escuro de 12 horas. Inicialmente as ratas foram submetidas a um período
de depleção de Se de 7 dias durante os quais receberam, ad libitum, água
deionizada e dieta AIN-93M com mistura de minerais isenta de Se. Ao término deste
período, os animais foram distribuídos, de acordo com o peso, entre os nove grupos
47
experimentais com 10 animais por grupo. Durante um período de 28 dias, foram
fornecidos água deionizada ad libitum e dietas experimentais controladas variando
de 10 a 20 g diários. Em ambos os períodos experimentais, o peso e consumo
alimentar dos animais foram registrados semanalmente para obtenção do consumo
total e cálculo do ganho de peso e do coeficiente de eficiência alimentar (CEA=
ganho de peso (g) / consumo alimentar (g) x 100).
2.5.1. Constituição das dietas experimentais
As dietas experimentais utilizadas no ensaio constaram dos cultivares
de feijão anteriormente mencionadas tomando a identificação destes antecedidos
pela letra D (DPE, DOB, DDM, DBRS, DTL, DPE-Se e DPE+Se), e de duas dietas
denominadas de controle positivo (CP: com mistura de minerais com Se na forma
de Na
2
SeO
3
) e controle negativo (CN; com mistura de minerais isenta de Se)
(Quadro 2).
A composição das dietas experimentais teve como base a dieta AIN-
93M (REEVES et al., 1993).
Considerando-se o requerimento de Se indicado na referida dieta
padrão de 0,15 mg Se kg
-1
de dieta para roedores adultos com base na expressão
máxima da atividade GPx, foi estabelecido, neste ensaio, um nível inferior de
fornecimento de Se (0,10 mg kg
-1
) de modo a permitir a observação de possíveis
diferenças nos níveis de atividade da enzima entre os grupos experimentais.
Para o cálculo das quantidades de feijão dos diferentes cultivares a
serem adicionadas às dietas, tomou-se a cultivar de menor concentração de Se (PE:
82,59 µg kg
-1
), calculando-se a quantidade máxima de feijão que se poderia
adicionar a dieta AIN-93M de modo a aproximar-se do teor de Se estabelecido,
resguardando os ingredientes considerados indispensáveis e considerando
informações bibliográficas relativas à quantidade máxima possível de ingestão de
feijão por roedores que não promovessem transtornos intestinais. Com base no teor
de Se fornecido à dieta pela cultivar de menor concentração do elemento (PE=
0,075 mg kg
-1
de dieta), calculou-se a quantidade de feijão a ser utilizada na
composição das dietas dos demais cultivares, com exceção da dieta DPE+Se onde
foi empregada a mesma quantidade de feijão calculada para o seu controle (DPE-
Se). Com o objetivo de totalizar o fornecimento de 0,10 g Se kg
-1
de dieta, foi
adicionado às dietas experimentais com feijão uma mistura de minerais que
48
fornecesse os 0,025 mg Se Kg
-1
de dieta pela adição de Se na forma de selenito de
sódio (Na
2
SeO
3
).
Determinados os quantitativos de feijão empregados na composição
das dietas, calculou-se o fornecimento de proteínas por parte destas igualando-os
pela adição de caseína de modo a obterem-se dietas isoprotéicas (21,54 %).
Devido ao baixo teor de lipídios em feijões, não foi realizado ajustes na quantidade
de óleo adicionado às dietas enquanto que, com relação à celulose, por ser o feijão
uma boa fonte de fibra, optou-se pala supressão do referido componente.
2.5.2. Sacrifício dos animais e coleta de material para análise
Terminado o período experimental, os animais foram anestesiados sob
atmosfera de dióxido de carbono, procedendo-se a abertura das cavidades
abdominal e torácica para coleta de sangue por punção cardíaca. As amostras de
sangue foram acondicionadas em tubos contendo heparina como anticoagulante.
Em seguida, coletou-se o fígado dos animais o qual foi lavado em solução salina,
pesado, embalado, identificado e congelado em nitrogênio líquido para posterior
processamento.
2.5.3. Análise da atividade de GPx em plasma e fígado
Para análise da atividade de GPx plasmática, logo após o sacrifício
dos animais, o sangue coletado foi centrifugado a 1.000 x g por 10 minutos a 4 ºC
obtendo-se plasma sangüíneo e massa eritrocitária. Do fígado parcialmente
descongelado, foi pesado aproximadamente 1 g de tecido e adicionado 10 mL de
tampão frio (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA e 5 mM de betamercaptoetanol)
procedendo-se a homogeinização da amostra e posterior centrifugação a 10.000 x g
por 15 minutos a 4 ºC removendo-se o sobrenadante para avaliação da atividade
GPx celular.
A atividade GPx plasmática e hepática foi avaliada pelo método
modificado de PAGLIA E VALENTINE (1967) usando kit comercial da Cayman
Chemical (nº 703102) o qual emprega hidroperóxido de cumeno como substrato.
Para padronização da análise, utilizou-se GPx de eritrócito bovino fornecida pelo
referido kit. A atividade de GPx das amostras foi obtida em leitora de ELISA a
temperatura de 25 ºC por meio do monitoramento da oxidação de NADPH a 340
nm. A unidade de atividade da enzima foi definida como 1 µmol de NADPH oxidado
49
min
-1
e os resultados foram expressos µmol min
-1
mL
-1
de plasma ou em µmol min
-1
mg
-1
de proteína para o fígado. A determinação de proteínas totais no fígado foi
realizada espectrofotometricamente pelo método colorimétrico de biureto com
absorção a 540 nm, utilizando-se kit comercial (CELM, São Paulo, Brasil).
50
DIETAS EXPERIMENTAIS (g Kg
-1
)
DPE-Se
9,46
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
285,63
-
-
-
-
-
-
615,61
DPE+Se
9,57
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
285,52
-
-
-
-
-
615,61
-
DTL
7,45
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
285,71
-
-
-
-
617,54
-
-
DBRS
1,00
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
21,29
-
-
-
888,41
-
-
-
DDN
9,59
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
320,8
-
-
580,27
-
-
-
-
DOB
4,94
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
190,9
-
714,83
-
-
-
-
-
DPE
-
-
-
40
-
35
a
10
1,8
2,5
-
910,70
-
-
-
-
-
-
CP
260,22
155
100
40
50
35
a
10
1,8
2,5
345,4
-
-
-
-
-
-
-
CN
260,22
155
100
40
50
35
a
10
1,8
2,5
345,4
-
-
-
-
-
-
-
INGREDIENTES (g)
Caseína
Maltodextrina
Sacarose
Óleo de soja
Fibra (celulose microfina)
Minerais
Vitaminas
L-cistina
Bitartarato de colina
Amido de milho q.s.p.
Feijão Pérola
Feijão Ouro Branco
Feijão Diamante Negro
Feijão BRS Radiante
Feijão Talismã
Feijão Pérola suplementado com
Feijão Pérola não suplementado
Quadro 2
. Composição das dietas experimentais
(g Kg
-
1
)
Fonte: Adaptado de REEVES
et al
. (1993)
op cite
; ausência ou redução do fornecimento de Se; CN: Controle Negativo; CP: Controle Positivo; DPE:
Feijão Pérola; DOB: Feijão Ouro Branco; DDN: Feijão Diamante Negro; DBRS: Feijão BRS Radiante; DTL: Feijão Talismã; DPE+Se: Feijão Pérola
submetido à adubação com Se; DPE-Se: Feijão Pérola sem adubação com Se; q.s.p.: quantidade suficiente para completar 1 kg;
a
Mistura de minerais
isenta de Se.
b
Mistura de Minerais com 2,857 mg de Se kg
-1
, na forma de selenito de sódio.
C
Mistura de minerais com 0,025 mg de Se kg
-1
, na forma
de selenito de sódio; Se fornecido pelos feijões nas respectivas dietas: 0,075 mg kg
-1
51
2.5.4. Determinação da concentração de Se em eritrócitos
A determinação da concentração de Se eritrocitário foi realizada por
espectrofotometria de absorção atômica com geração de hidretos de acordo com
método proposto por HANSSON et al. (1987) e FINLEY et al. (1996) com
modificações. Inicialmente, tomou-se 0,5 mL de amostra de eritrócitos por animal,
procedendo-se a sua mineralização pela adição de 5 mL de solução nitroperclórica
(3:1) seguido de pernoite e de um programa de aquecimento em bloco digestor,
descrito no Quadro 3. A elevação programada da temperatura de digestão das
amostras tem como objetivo, evitar a perda de Se por volatilização em condições de
rápido e elevado aquecimento. Em seguida à mineralização das amostras, realizou-
se o processo de redução do Se
+6
, presente na solução, para o estado de oxidação
Se
+4
por meio da adição de 5 mL de HCl 6M seguido de aquecimento a 90 ºC por 1
hora. Após resfriamento, as soluções tiveram seu volume aferido com água
deionizada para 25 mL. A determinação da concentração de Se nas amostras foi
realizada em espectrofotômetro de absorção atômica acoplado de gerador de
hidretos desenvolvido por pesquisadores do Departamento de Geoquímica da
Universidade Federal de Ouro Preto. O coeficiente de recuperação do analito foi de
92 % pelo método de adição de padrão.
Quadro 3. Programa de aquecimento em bloco digestor para mineralização de
amostras de eritrócitos submetidas à determinação da concentração de
Se
Temperatura (ºC)
Tempo (min)
50
30
70
30
100
30
120
30
180
até a ausência de fum
os de ácido (cerca de 2 h)
2.6. Delineamento experimental e análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado,
com 10 repetições. Os tratamentos constaram de 7 dietas experimentais
constituídas com fontes diferenciadas de Se (cultivares de feijão e feijão
suplementado com seu controle) e de duas dietas controle, perfazendo o total de 9
52
tratamentos. Os dados de consumo, ganho de peso, CEA, atividade GPx em plasma
e fígado e concentração de Se nos eritrócitos foram submetidos à análise de
variância sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5 % de
probabilidade. Todas as análises foram realizadas utilizando-se o programa Sistema
para Análises Estatísticas - SAEG, versão 8.0, desenvolvido pela Universidade
Federal de Viçosa (FUNARBE, 1998).
3. Resultados e Discussão
3.1. Composição centesimal e concentração de Se dos cultivares de feijão
A composição centesimal e o teor de Se dos cultivares de feijão
utilizados encontram-se na Quadro 4. Os teores de proteína, lipídio e Se foram
utilizados como base para o cálculo dos constituintes das dietas experimentais
usadas no ensaio biológico.
Quadro 4. Composição centesimal em base úmida e concentração de Se em base
úmida e base seca dos cultivares de feijão
Cul
tivar/cor
Umidade
Proteína
Lipídio
Cinza
Carboidrato
Se
base úmida
Se
base seca
---------------------------------- g/100g --------------------------------
------------ µg/100g -----------
PE (MR)
6,31
21,78
2,22
3,82
64,00
8,26
8,81
OB (B)
5,65 24,80 2,32
3,58
64,00 10,49 11,12
DN (P)
7,03
22,67
2,64
3,97
62,81
12,92
13,90
BRS (MR)
5,17 24,28 2,31
3,55
65,64 8,44 8,90
TL (MR)
3,72
23,99
2,11
3,67
65,52
12,14
12,61
PE
-
Se
6,99 22,22 1,73
3,86
65,20 12,19 13,10
PE+Se
7,25
22,37
1,79
4,
03
64,56
12,33
13,29
Média de três determinações; PE: feijão pérola; OB: feijão ouro branco; DN: feijão diamante negro;
BRS: feijão BRS radiante; TL: feijão talismã; PE-Se; feijão pérola sem suplementação; PE+Se: feijão
pérola suplementado com Se; MR: marrom-rajado; B: branco; P: preto.
3.2. Concentração de Se
As plantas são fontes primárias de Se e concentrações variáveis deste
nutriente em alimentos de origem vegetal têm sido observadas em função da
disponibilidade do elemento no solo onde foram produzidos e de possíveis limites
genéticos inter e intraespecíficos (ZHANG et al., 2003).
A concentração de Se aqui determinada, refere-se a feijões macerados
e cozidos com a água de maceração. Esta forma de processamento foi escolhida em
53
função das observações obtidas por RAMÍREZ-CÁRDENAS (2006), quando do
estudo de quantificação e biodisponibilidade de minerais nestes mesmos cultivares
submetidas a distintas formas de processamento.
De acordo com os resultados de teor de Se apresentados na Quadro 4,
verificou-se variação na concentração do mineral nos cultivares de feijão produzidos
pela EMBRAPA (PE, OB, DN, BRS) e pela UFV (TL) apresentando o cultivar PE o
mais baixo valor (8,81 µg/100 g) e o cultivar DN o mais alto (13,90 µg/100 g)
Estudos de quantificação de Se em feijão têm mostrado haver variação
na concentração do elemento no grão em função do local de produção e/ou da
variedade/cultivar estudada a exemplo do que ocorre em soja (ZHANG et al., 2003).
FERREIRA (1999), avaliando a contribuição em minerais de diversos
alimentos componentes da dieta brasileira oriundos de várias localidades, observou
que a concentração de Se em feijões variou de 0,5 a 23,9 µg/100 g, sendo os feijões
dos cultivares de cor preta os que apresentaram níveis mais elevados do nutriente.
Embora a concentração de Se encontrada no feijão tipo preto utilizado no presente
estudo tenha diferido consideravelmente dos reportados por FERREIRA (1999), a
mesma tendência foi observada, ou seja, o cultivar DN (preto) apresentou maior teor
de Se que os demais feijões de cor mais clara.
Comparando-se os dados de concentração de Se no cultivar Pérola
fornecimento pela EMBRAPA (PE) em relação ao mesmo cultivar produzido pela
EPAMIG (PE-Se), verifica-se que o segundo apresentou um percentual de 28 % a
mais de Se em relação ao primeiro (Quadro 4). Considerando-se a ausência
significativa de perdas entre os cultivares de feijão durante o seu procesamento, esse
fato pode ser atribuído a diferenças nas condições de cultivo, principalmente com
relação à disponibilidade de Se no solo onde foi produzido. Este mesmo cultivar,
quando produzido sob as mesmas condições experimentais do PE-Se e submetido à
adubação com selenito de sódio (PE+Se) não apresentou elevação na concentração
do mineral. Diante do exposto, pode-se inferir que o cultivar PE suplementado com
Se (PE+Se) produzido no campo experimental da EPAMIG, possa ter chegado à sua
capacidade máxima de acúmulo do nutriente não permitindo que houvesse maiores
incorporações do mineral no grão.
Trabalhos ainda não publicados de mapeamento do Se em território
brasileiro realizado por pesquisador da Technical University of Braunschweig,
Germany em cooperação com pesquisadores da Universidade de São Paulo
54
(MARTENS et al., 2004), têm utilizado o feijão como alimento nativo na predição da
distribuição e disponibilidade de Se nos solos brasileiros. Os resultados têm
mostrado, por exemplo, que o feijão cultivado na região de São Paulo contém muito
menos Se em relação ao feijão produzido na região sul ou nordeste do país, onde o
solo é mais rico neste mineral. Todavia, de acordo com os pesquisadores, as
diferenças parecem não ser tão elevadas a ponto de interferir na nutrição, uma vez
que características genéticas da planta parecem regular a acumulação do nutriente
no grão.
3.3. Perfil de aminoácidos
Alimentos de origem vegetal incorporam Se nas proteínas
principalmente na forma de selenometionina e selenocisteína (JAFFÉ, 1992).
Grande parte do Se presente em plantas e animais se encontra ligado a
proteínas originando as selenoproteínas (JAFFÉ, 1992). Estudos de enriquecimento
de alimentos com Se via adubação de culturas com sais inorgânicos do elemento têm
constatado alterações relativas não só à concentração de Se como ao perfil de
aminoácidos no alimento estudado.
Brócoli cultivado em solos adubados com níveis crescentes de selenato
de sódio apresentou elevação no nível de todos os aminoácidos detectados quando
produzido sob a concentração mais baixa do elemento, sendo observado ainda, que
níveis mais elevados de adubação produziram respostas mistas (LEE et al., 2005).
Em outro estudo com chá verde, HU e colaboradores (2001)
constataram elevação no nível de aminoácidos essenciais, com destaque para
metionina e cisteína, em folhas produzidas sob adubação de Se na forma de
selenito de sódio.
No presente trabalho, a cultivar PE submetida à adução com Se
(PE+Se) apresentou apenas pequenas elevações na concentração da maioria dos
aminoácidos analisados em relação ao seu controle (PE-Se) (Quadro 5) a exemplo
do observado com a concentração de Se (Quadro 4).
Avaliando a composição aminoacídica dos demais cultivares
estudados não foi observada correlação linear entre aminoácidos livres totais e
conteúdo de Se. Entretanto, quando comparados isoladamente, os aminoácidos
ácido aspártico (r= 0,98**), serina (r= 0,90**), ácido glutâmico (r= 0,87**), glicina (r=
0,82**) e metionina (r= 0,71**) apresentaram correlações lineares positivas com a
55
concentração de Se nos feijões. Contudo, não se pode dizer qual a variável
condicionante ou até mesmo se ambas estão sob efeito de outra variável
desconhecida.
Neste sentido, comparando-se ainda o cultivar PE produzido pela
EMBRAPA com o mesmo cultivar produzido pela EPAMIG (PE-Se), observou-se
distintos perfis aminoacídicos indicando um provável efeito das condições de cultivo
sobre a composição de aminoácidos dentro de um mesmo cultivar.
Quadro 5. Composição aminoacídica dos cultivares de feijão em base úmida
Aminoácidos
Cultivares de feijão
PE*
OB*
DN*
OB*
56
particularmente no que se refere à biodisponibilidade de minerais essenciais como
ferro e zinco (SANDBERG, 2002).
Com relação ao Se, são escassos os estudos sobre a influência de
fatores antinutricionais na sua biodisponibilidade, sendo quase ou senão
inexistentes pesquisas de biodisponibilidade deste mineral em feijão. Apenas
algumas indicações têm sido feitas por GIBSON (1994) sobre o possível efeito
negativo de fibra alimentar solúvel (pectina) na biodisponibilidade deste mineral bem
como da necessidade de estudos sobre o efeito que o ácido fítico possa ter sobre a
mesma.
Estudos com Se têm constatado não haver controle homeostático para
a absorção do elemento pelo intestino e diferenças na biodisponibilidade do
nutriente estão relacionadas, principalmente, à forma de Se ingerida (PATRICK,
2004).
Em alimentos de origem vegetal, grande parte do Se se encontra
incorporado à proteínas nas formas principais de selenometionina (SeMet) e
selenocisteína (SeCys) (JAFFÉ, 1992).
Embora estudos de determinação das formas de Se presentes no
feijão ainda não tenham sido realizados, supõe-se que, em condições normais de
fornecimento de Se e a exemplo de outras leguminosas como a soja (YANG et al.,
2003), as principais formas do nutriente presentes no grão sejam aquelas ligadas às
proteínas.
De acordo com PADOVESE et al. (2001), o feijão, assim como a maioria
das leguminosas, apresenta em sua fração nitrogenada quantidade relativamente
elevada do aminoácido não-protéico S-metil-cisteína, presente normalmente na forma
de dipeptídeo (gama-glutamil-S-metil-cisteína).
Estudo com a leguminosa Phaseolus lunatus demonstrou aumento na
concentração do análogo Se-metil-seleno-cisteína pela substituição do enxofre
presente em S-metil-cisteína quando do fornecimento à planta de Se inorgânico
(NIGAN e McCONNEL, 1973). Este aminoácido também foi identificado como a
principal forma de Se em plantas consideradas acumuladoras do elemento
submetidas ao enriquecimento como brócoli (FINLEY e CINDY, 2001) e alho (IP e
LISK, 1995), apresentando, nestes alimentos, atividade antimutagênica e
anticancerígena. Diante destas considerações, não se sabe se modificações nas
formas de Se presente no feijão PE+Se possam ter ocorrido em virtude de alterações
57
no metabolismo da planta em condições de elevação no fornecimento do elemento
na forma de selenito de sódio decidindo-se, portanto, pela avaliação de sua
biodisponibilidade no mineral.
No Quadro 6, são apresentados os valores médios para consumo
alimentar, ganho de peso e coeficiente de eficiência alimentar nas diferentes dietas
experimentais. De acordo com os resultados da análise estatística não foram
observadas diferenças significativas de consumo entre as dietas experimentais
estudadas, com exceção da dieta OB, cujo consumo foi inferior às dietas CN e CP.
Quadro 6. Consumo alimentar (CA), ganho de peso (GP) e coeficiente de eficiência
alimentar (CEA) dos animais em função das dietas experimentais
Dieta
CA
(g)
GP
(g)
CEA
(%)
CN
371,44a
28,10a
7,64a
CP
373,38a
28,00a
7,50a
DPE
333,13ab
9,90b
2,90b
DOB
313,14b
13,00b
4,07b
DD
N
355,03ab
13,90b
3,90b
DBRS
339,10ab
13,20b
3,80b
DTL
344,21ab
14,70b
4,24b
DPE
-
Se
353,07ab
15,50b
4,38b
DPE+Se
341,48ab
13,60b
3,85b
PE: feijão pérola; OB: feijão ouro branco; DN: feijão diamante negro; RS: feijão BRS radiante; TL:
feijão talismã; PE-Se: feijão pérola sem suplementação; PE+Se: feijão pérola suplementado com Se;
Para cada parâmetro avaliado, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra nas colunas não
diferem entre si, ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste Tukey.
Com relação ao ganho de peso e ao coeficiente de eficiência alimentar,
não se constatou diferença entre as dietas experimentais com feijão, sendo
observado, entretanto, que estas diferiram das dietas CN e CP, as quais se
mostraram iguais entre si e superiores às demais. Este fato deve ter ocorrido em
virtude do baixo valor biológico da proteína presente no feijão em relação à caseína
nas dietas controle, como observado pela avaliação do perfil de aminoácidos
apresentado no Quadro 5.
A determinação da atividade de GPx e da concentração de Se em
fluidos corporais e tecidos constituem os principais biomarcadores utilizados em
59
Quadro 7. Atividade enzimática de glutationa peroxidase plasmática (GPx
plasmática), glutationa peroxidase hepática (GPx hepática) e
concentração eritrocitária de Se (Se eritrocitário) em ratos alimentados
com diferentes dietas experimentais
Dieta
GPx plasmática
GPx hepática
Se eritrocitário
(nmol min
-
1
mL
-
1
)
(nm
ol min
-
1
mg de P
-
1
)
(
µ
g L
-
1
)
CN
3619b
266,15a
295,69a
CP
4531a
255,35a
424,50a
DPE
2553cd
249,81a
380,77a
60
proporcionais nas formas de Se armazenadas no grão quando de sua acumulação
em diferentes níveis de concentração. Este fato parece não estar correlacionado com
diferenças entre cultivares, uma vez que o mesmo cultivar (PE e PE-Se) com
concentrações distintas de Se apresentou valores variáveis de biodisponibilidade
relativa. Quando o cultivar PE+Se foi considerado, a correlação foi reduzida para r=
0,87**, indicando que um mesmo cultivar com concentrações de Se semelhantes
(PE-Se e PE+Se) pode apresentar valores de biodisponibilidade relativa diferentes
em função de possíveis alterações metabólicas na incorporação de Se quando
submetida à adubação foliar com selenito de sódio. Desta forma, a mais elevada
biodisponibilidade relativa de Se na dieta PE+Se pode ter ocorrido em virtude de
alterações quantitativas e, ou qualitativas nas formas de Se presentes no cultivar
submetido à adubação.
Cerca de 30 % do Se armazenado nos tecidos animais encontra-se no
fígado. Estudos têm demonstrado que em animais submetidos à deficiência de Se a
atividade GPx hepática se reduz rapidamente a valores próximos de zero (KNIGHT e
SUNDE, 1988; WEISS et al., 1997).
Quando a atividade GPx no fígado foi utilizada como biomarcador da
biodisponibilidade de Se, observou-se a ausência de diferenças significativas entre as
dietas controle (CN e CP). Este fato pode ter ocorrido em função do emprego de
hidroperóxido de cumeno como substrato para GPx.
De acordo com LAWRENCE et al. (1978), há no fígado, em adição a
atividade GPx dependente de Se, uma Glutationa S-transferase (GST) não
dependente de Se com atividade peroxidase. Segundo os mesmos autores, animais
deficientes neste nutriente apresentam elevação da atividade de GST como
mecanismo de compensação. Uma afinidade enzimática (Km) de 0,57 mM para a
GTS foi determinado quando hidroperóxido de cumeno foi usado como substrato
(PIERCE e TAPPEL, 1978).
Desta forma, não foi possível estabelecer considerações sobre a
biodisponibilidade de selênio entre os cultivares de feijão quando avalida pela
atividade GPx em figado utilizando hidroperóxido de cumeno como substrato.
61
4. Conclusões
A adubação foliar do feijoeiro do cultivar Pérola com selenito de sódio na
dose de 10 g de Se ha
-1
não elevou a concentração de Se no grão tão pouco alterou
sua composição aminoacídica.
Os cultivares de feijão estudados bem como o cultivar pérola adubado
com Se e seu controle não apresentam diferenças entre si na biodisponibilidade de
Se medida pela atividade GPx plasmática não estando, portanto, condicionada por
fatores antinutritivos presentes no alimento.
Em termos de biodisponibilidade relativa dos cultivares de feijão,
calculada com base na diferença de atividade da GPx plasmática entre as dietas com
feijão e a dieta padrão, foram constatadas variações entre os cultivares os quais
apresentaram percentuais de 68,5 % (DDN), 66,2 % (DTL), 58,1 % (DOB), 56,3 %
(DPE) e 55,5 % (DBRS).
O cultivar pérola submetido à adubação com Se apresentou maior
biodisponibilidade relativa do nutriente (71,5 %) em relação ao seu controle (61,8 %).
Este fato reflete na eficácia do processo de adubação utilizado na melhoria da
biodisponibilidade de Se em feijão, com possível aumento dos seus efeitos
fisiológicos.
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66
CAPÍTULO 3 - Potencial anticarcinogênico de feijão e castanha-do-Pará sobre
o risco de câncer de cólon induzido por 1,2-dimetilhidrazina em
ratos F344
RESUMO
A castanha-do-Pará (Bertholletia excelsa H.B.K.), alimento nativo da
região amazônica, é rica em selênio (Se), enquanto o feijão (Phaseolus vulgaris L.)
é uma leguminosa consumida regularmente na dieta brasileira. Ambos tem sido alvo
de interesse por parte dos pesquisadores como alimentos promotores da saúde em
virtude da presença de compostos com relevantes propriedades funcionais. O
objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anticarcinogênico da castanha-do-Pará
e do feijão preto, utilizados isoladamente ou em combinação, sobre o câncer de
cólon induzido quimicamente em ratos. Após um período de 28 dias de depleção de
Se, ratos machos F344 (45) foram alimentados por 12 semanas com as seguintes
dietas hiperlipidêmicas: controle AIN-93 sem adição de Se (CN); controle AIN-93
suplementada com 4 mg Se kg
-1
(CP); dieta contendo a mesma dose de Se da dieta
CP fornecidos pela castanha-do-Pará (C); dieta C formulada com feijão (F+C) e;
dieta com feijão (F). O carcinógeno de cólon 1,2-dimetilhidrazina · 2HCl (DMH) ou o
seu veículo (controle) foram aplicados aos animais em duas doses consecutivas na
segunda e terceira semanas após a introdução das dietas experimentais. Ao final do
período experimental foram realizadas a avaliação da atividade das enzimas
Glutationa Peroxidase (GPx) e Glutationa S-transferase (GST) bem como a
determinação da concentração plasmática de Se. Os biomarcadores do risco de
câncer de cólon avaliados incluíram diferenciação celular medido pela relação entre
a percentagem de células secretoras de sialomucinas e de sulfomucinas
(SIM:SUM); proliferação celular, avaliada pela altura de cripta em número de células
e; alterações morfológicas da cripta (altura, diâmetro da base e diâmetro do ápice) e
do cólon (densidade de cripta por mm de cólon). As dietas CP, C, F e F+C
promoveram o mesmo nível de expressão das enzimas GPx e GST não sendo
observadas alterações de suas atividades quando da aplicação do carcinógeno
(DMH+) em relação aos seus respectivos controles (DMH-). Estas dietas também
promoveram maior grau de diferenciação celular e menor grau de proliferação
celular da mucosa colônica em relação à dieta CN, não sendo observadas
alterações de padrão quando da aplicação do DMH. A administração de doses
67
supranutricionais de Se na forma de SeMet ou fornecida pela castanha-do-Pará e a
utilização do feijão de forma isolada ou em combinação com a castanha nas dietas
avaliadas favoreceu a homeostase do desenvolvimento colônico evitando alterações
na diferenciação e proliferação celular em ratos tratados com DMH, sugerindo um
papel protetor destes alimentos no câncer de cólon. Os resultados indicam ainda um
possível involvimento de mecanismos múltiplos de ação.
68
CAPÍTULO 3 - Anticarcinogenic potential of common bean and Brazil nut on
1,2-dimethylhydrazine-induced colon cancer in F344 rats
ABSTRACT
Brazil nut (Bertholletia excelsa H.B.K.), the richest known natural food
source of selenium, is native of the Amazon rain, while the common bean
(Phaseolus vulgaris L.) is a legume consumed frequently in the Brazilian diet. Both
foods raised the attention of researchers for their potential as health promoters due
to the presence of components with excellent functional properties. The aim of this
study was to evaluate the anticarcinogenic potential of the Brazil nut and black
beans, used separately or combined, on 1,2-dimethylhydrazine-induced colon
cancinogenesis in rats. After 28 day-period of Se depletion, male F344 rats (45)
were fed during 12 weeks with the following hyperlipidic diets for 12 weeks: control
AIN-93 without addition of Se (CN); control AIN-93 supplemented with 4 mg Se kg
-1
(CP); diet with the same dose of Se of CP diet provided by Brazil nut (C); diet C
formulated with beans (F+C) and diet with beans (F). The colon carcinogen 1,2-
dimethylhydrazine · 2HCl (DMH) or its vehicle (control) were applied to the animals
in two consecutive doses in the second and third weeks after the introduction of the
experimental diets. At the end of the experimental period, the activity of glutathione
peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST) and the levels of plasm Se
were analyzed. The biomarkers for the risk of colon cancer evaluated included
cellular differentiation, measured by the ratio of producing cells of sialomucins and
sulphomucins (SIM:SUM); cellular proliferation, evaluated by the height of crypt in
cells numbers; morphologic alteration of crypt (height, diameter of the base and
diameter of the apex) and of colon (density of crypt for mm of colon). The diets CP,
C, F and F+C promoted the same level of expression of GPx and GST, showing no
alteration in the activity of these enzymes in the treated animals with the carcinogen
(DMH+) in relation to its respective controls (DMH-). These diets also promoted
higher degree of cellular differentiation and lower degree of cellular proliferation of
the colonic mucosa in relation to CN diet, not being observed alterations of standard
with the application of the DMH. The administration of supranutritional doses of Se in
the form of SeMet or supplied by the Brazil nut and the use of the beans of isolated
form or combinated with the nut favo ured the homostasis of the colonic development
69
preventing alterations in the cellular differentiation and proliferation in rats treated
with DMH suggesting a protective role of these foods in the colon cancer. The results
still indicate a possible envolvement of multiple mechanisms of action.
70
POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DE FEIJÃO E CASTANHA-DO-PÁRÁ
SOBRE O CÂNCER DE CÓLON INDUZIDO POR 1,2-DIMETILHIDRAZINA RATOS
F344
1. Introdução
O estudo do câncer nestas últimas décadas ganhou impulso
considerável a partir do desenvolvimento de tecnologias que possibilitaram nível de
conhecimento mais aprofundado sobre esta patologia, refletindo a preocupação
política, social e científica frente a esta importante causa de mortalidade e
morbidade mundial, responsável pela morte anual de 7,0 milhões de pessoas em
todo o mundo, e de 130.000 apenas no Brasil (BRASIL, 2006).
O avanço da ciência também permitiu estabelecer uma relação entre
dieta e o binômio saúde-doença, o que levou à geração de novos produtos
denominados de alimentos funcionais. Estes produtos, além do seu papel
nutricional, apresentam capacidade de reduzir os riscos de doenças. Diversos
alimentos tem sido objeto de pesquisa visando à análise de suas características e
propriedades funcionais. Constata-se que algumas espécies de plantas destinadas
à alimentação humana são portadoras de componentes funcionais nutritivos e não-
nutritivos, estes últimos chamados também de compostos bioativos, fitoquímicos ou
fitoterápicos (FERGUNSON et al., 2004). Tais constituintes apresentam, em sua
maioria, atividade antioxidante e são capazes de ativar sistemas de enzimas
mprolntaoar sistes, si(pol63g1pi ando ) T-20147 -17.25 TD -0.2334 T2 1.7214 Twors gism43o humo,sa de indo a omoDivdo o saú de reduziros rissa de doençde
71
Segundo alguns pesquisadores (IP e LISK, 1997; IP, 1998; ROVER JÚNIOR et al.,
2001) a GPx faz parte do sistema secundário de defesa da célula contra danos
oxidativos, os quais estão envolvidos em processos cancerígenos. O potencial
anticâncer do Se parece também estar relacionado com alterações no metabolismo
de carcinógenos via atividade de enzimas que participam da Fase II do sistema de
detoxificação de xenobióticos, dentre as quais está a Glutationa S-Transferase (IP e
LISK, 1997). Esta enzima age inativando os produtos da Fase I do sistema de
detoxificação, tornando os metabólitos hidrofílicos e passíveis de excreção (ROSSIT
e FROES, 2000).
Pesquisas têm demonstrado que a utilização de alimentos
enriquecidos com Se,
72
(HARLAND e MORRIS, 1995). Já a fibra, como fator protetor na carcinogênese de
cólon foi proposta pela primera vez por BURKITT (1971) e, posteriormente, diversos
estudos epidemiológicos têm demonstrado a associação do consumo de fibra com
um menor risco de câncer gastrointestinal com destaque para o câncer coloretal
(TROCK et al., 1990; BOYLE e LEON, 2002).
Dentre os vários tipos de câncer já estudados, o câncer de cólon é o
que parece sofrer maior influência dos fatores dietéticos, sendo o consumo de
dietas hiperlipídicas e o baixo consumo de fibra alguns dos fatores relacionados
com a maior incidência da doença (REDDY, 2000). Pesquisas também têm
desmonstrado a eficácia do Se, isoladamente ou como componente de alimentos,
na prevenção do câncer de cólon em animais e humanos (WHANGER, 2004).
Neste sentido, alterações histológicas da mucosa colônica bem como
do padrão de glicoproteínas do muco têm sido empregados como marcadores de
mudanças premalignas em pacientes com risco de desenvolvimento de tumores
colônicos e na determinação do efeito potencial de alimentos ou de seus
componentes na prevenção do câncer de cólon (YANG et al., 1996; CHANG et al.,
1997; HONG et al., 1997; JENAB e THOMPSON, 2000). Pesquisas (FILIPE e
BRANFOOT, 1974; ALTMANN, 1983) têm demonstrado a predominância de
mucinas sulfatadas em cólon distal considerado normal de ratos e humanos sendo o
quociente entre células secretoras de sialomucinas e sulfomucinas (SIM:SUM)
relacionado ao grau de diferenciação celular da mucosa colônica (JENAB e
THOMPSON, 2000).
Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial
protetor da castanha-do-Pará e do feijão, de forma isolada ou em conjunto, sobre o
risco de câncer de cólon induzido quimicamente em ratos F344 alimentados com
dietas hiperlipídicas.
2. Material e Métodos
Este ensaio foi conduzido no Departamento de Nutrición, Bromatología
y Tecnología de Alimentos da Facultad de Veterinária da Universidad de Murcia,
Espanha. As análises dos alimentos e do material biológico animal foram realizadas
nos laboratórios do referido departamento, no Hospital Veterinário da Facultad de
Veterinária e nos laboratórios do Servicio de Apoyo a las Ciencias Experimentales
(SACE) pertencente à mesma universidade. As análises histológicas foram
73
conduzidas no Laboratório de Biologia Estrutural do Departamento de Biologia Geral
da Universidade Federal de Viçosa, MG.
2.1. Animais
Foram empregados 45 ratos machos Fischer (F334), recém
desmamados com 21 dias de idade provenientes da Harlan, Barcelona, Espanha.
Após dois dias de adaptação, os animais foram distribuídos em gaiolas (três animais
por gaiola) e mantidos em condições controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e ciclo
claro/escuro de 12 horas por todo o período experimental.
2.2. Dietas experimentais
No período de depleção de Se os animais consumiram dieta baseada
na AIN-93, sem adição de Se e hipercalórica.
Durante o período experimetal os animais foram alimentados com
cinco dietas distintas: CN (controle negativo; sem adição de Se), CP (controle
positivo; 4 mg SeMet kg
-1
), F (dieta com feijão), C (dieta com castanha-do-Pará),
F+C (dieta com feijão+castanha-do-Pará).
Para elaboração das dietas com feijão (Phaseolus vulgaris L.) foi
utilizado o tipo negro, cultivar “Uirapuru”, produzido em Viçosa, MG, Brasil, sob
condições de campo, seguindo os tratos culturais convencionais para a cultura.
Estudos têm constatado que os cultivares de feijão do tipo negro apresentam
elevada concentração de fitoquímicos como taninos e fitatos (RAMÍREZ-
CÁRDENAS, 2006), bem como de selênio (FERREIRA et al., 2002). Os grãos de
feijão, após sua colheita, foram armazenados em câmara fria até sua preparação
para uso nas dietas.
A castanha-do-Pará (Bertholletia excelsa, H.B.K.), branqueada e
embalada em bandejas de poliestireno cobertas com filme de PVC, foi obtida em
loja de alimentos no mercado de Bélem, PA, Brasil.
As dietas foram formuladas a partir da dieta padrão AIN-93G
(REEVES et al., 1993) com modificações, de modo que se obtivessem dietas
hiperlipídicas com composição final o mais semelhante possível com relação ao teor
de proteína e valor energético (Quadro 1).
A quantidade de castanha-do-Pará empregada na dieta C foi calculada
com base no fornecimento, pelo referido alimento, de 4 mg de Se por kg de dieta. A
74
dieta C+F teve sua percentagem de feijão calculada com base na quantidade
máxima permitida quando resguardados todos os ingredientes considerados
indispensáveis e considerando ainda informações bibliográficas relativas à
quantidade máxima possível de ingestão de feijão por roedores, que não provoque
transtornos intestinais. A dieta F teve sua quantidade de feijão semelhante àquela
calculada para a dieta F+C.
Neste trabalho, procurou-se ainda manter o mesmo teor de fibra nas
dietas alterando-se, todavia, a sua fonte. Nas dietas com feijão (F, F+C), o referido
alimento foi a principal fonte de fibra enquanto que nas demais (CN, CP e C), a fibra
foi adicionada como celulose. Sabe-se que o efeito protetor da fibra no câncer de
cólon está relacionado não apenas com o seu teor na dieta, mas também com o tipo
de fibra utilizado e que esta pode mitigar, por vezes, o efeito pro-carcinogênico do
consumo de dietas hiperlipídicas.
Quadro 1. Formulação das dietas experimentais com base na Dieta Padrão AIN-
93G (g kg
-1
)
Ingrediente Dietas
CN
CP
F
C
F+C
Caseína (g)
Amido Dextrinizado (g)
Sacarose (g)
Celulose (g)
Mix de Minerais (g)
Mix de Vitaminas (g)
Óleo de milho (g)
DL-Metionina (g)
Bitartarato de colina (g)
T-butyl (g)
Amido de milho (g)
Feijão (g)
Castanha (g)
238,533
66,000
60,000
167
35
1
10
220
3
2,5
0,014
197,953
0
0
238,533
66,000
60,000
167
35
3
10
220
3
2,5
0,014
197,953
0
0
71,000
0
0
0
35
2
10
250
3
2,5
0,014
43,944
584,542
0
167,5
0
0
154
35
1
10
0
3
2,5
0,014
263,042
0
364,944
0
0
0
0
35
1
10
0
3
2,5
0,014
0
584,542
364,944
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha;
1
Mistura de minerais AIN-93G sem Se;
2
Mistura de minerais AIN-
93G com Se;
3
Mistura de minerais AIN-93G com 4 mg de Se na forma de DL-SeMet.
2.3. Preparação do material experimental
O feijão utilizado neste experimento foi preparado de acordo com o
procedimento doméstico. Inicialmente realizou-se a separação e descarte dos grãos
danificados, seguindo-se de lavagem e maceração em água destilada na proporção
feijão:água de 1:2 (w/v) por um período de 16 horas de acordo com metodologia
75
descrita por RAMÍREZ-CÁRDENAS (2006). Após este período, o feijão juntamente
com a água de maceração, acrescido de uma quantidade fixa de água destilada de
modo a cobrir os grãos, foi cozido em panela de pressão doméstica marca Fagor, a
uma pressão de 1 kg cm
-2
por cerca de 5 minutos , contados após a saída constante
de vapor pela válvula de pressão. Ao final do cozimento, a pressão foi liberada e os
grãos de feijão com sua água de cozimento foram colocados em bandejas de aço
inoxidável e secos em estufa de circulação de ar marca HERAEUS, à temperatura
de 55 ºC, por aproximadamente 24 horas. Os grãos secos foram então triturados em
Termomix modelo TM-21, passados em peneira de 25 mesh, embalados em sacos
de PVC e armazenados sob refrigeração até seu uso.
As castanhas foram inicialmente secas em estufa de circulação
forçada de ar marca HERAEUS, à temperatura de 55 ºC, por aproximadamente 24
horas e, em seguida, trituradas em Termomix modelo TM-21, embaladas em sacos
de PVC e armazenadas sob refrigeração até sua utilização.
2.4. Composição centesimal do material experimental e das dietas
Para a determinação do teor de umidade, proteína, lipídios, fibra e
cinzas no material experimental e nas dietas foram empregados os métodos oficiais
recomendados pela AOAC (1999). O teor de carboidratos foi obtido pela subtração
percentual dos teores de proteína, lipídios e cinzas.
2.5. Determinação de Se
Para a determinação de Se, foram pesados aproximadamente 0,3
gramas de amostra em potes de politetrafluoretileno (PTFE) devidamente limpos e
identificados aos quais foram adicionados 5 mL de ácido nítrico concentrado, 3 mL
de água ultrapura e 2 mL de peróxido de hidrogênio a 30 %, procedendo-se a
digestão em microondas marca Milestone, modelo Ethos sel. A programação
utilizada no processo de digestão encontra-se no Quadro 2. A exatidão do método
foi determinada pela adição de padrão. As análises foram realizadas em triplicata e
utilizando brancos reativos.
A determinação da concentração de Se nas amostras foi realizada por
espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) elegendo-
se dentre os isótopos lidos (
74
Se,
76
Se,
77
Se,
78
Se e
82
Se) o que apresentava menor
coeficiente de variação para cada tipo de amostra. A precisão do método foi medida
76
por 3 leituras seqüenciais da mesma amostra de modo a obter-se o coeficiente de
variação.
Quadro 2. Programa de digestão do material experimental e dietas em microondas
marca Milestone, modelo Ethos sel
Etapas
Tempo
Temperatura
Potência
do microondas
1
5 minutos
Até 100
ºC
até 500 W
2
10 minutos
100
ºC
até 500 W
3
5 minutos
100 a 200
ºC
até 500 W
4
20 minuto
s
200
ºC
até 500 W
2.6. Desenho experimental
O desenho experimental seguido está representado na Figura 1 e
tomou como referência o modelo proposto por FINLEY et al. (2000), com algumas
modificações.
Quarenta e cinco ratos F344 machos, com 3 semanas, recém-
desmamados, foram pesados e inicialmente alimentados com dieta controle sem Se
(CN) por um período de 28 dias (período de depleção em Se). Ao término deste,
amostras de sangue de aproximadamente 2 mL foram coletadas da cauda dos
animais devidamente anestesiados, e preparadas para determinação de Se
plasmático por ICP-MS (descrita no item 2.9) e atividade enzimática de Glutationa
Peroxidase (GPx) em eritrócitos (item 2.8.2). Estes índices foram utilizados como
biomarcadores do estado nutricional inicial de Se nos animais.
Determinado o estado nutricional inicial de Se, os animais foram
divididos em cinco grupos de nove animais (G1, G2, G3, G4 e G5) aos quais foram
administradas as dietas anteriormente especificadas (C, F, F+C e CP)
permanecendo um grupo com a dieta deficiente em Se (CN).
77
Figura 1. Desenho experimental seguido para avaliação do efeito de distintas dietas
experimentais na prevenção do câncer de cólon induzido em ratos F344
por 1,2-dimetilhidrazina (DMH)
Três semanas após a introdução das dietas experimentais, iniciou-se a
indução de câncer pela aplicação subcutânea, a seis animais de cada grupo, de
duas doses, ministradas em semanas consecutivas, do carcinógeno de cólon 1,2-
dimetilhidrazina · 2HCl (DMH, 25 mg kg
-1
de peso corporal, dissolvido em solução
de EDTA 1 mmolar e corrigido para pH 6,5 com NaOH 0,1 M). Aos três animais
restantes foram aplicadas injeções do veículo (solvente) os quais constituíram os
grupos controle para indução de câncer dentro de cada tratamento.
Após a aplicação das injeções, os animais foram mantidos nas dietas
experimentais por mais oito semanas consecutivas até seu sacrifício.
Durante todo o período experimental, o peso e consumo alimentar dos
animais foram registrados semanalmente e utilizados para os cálculos de ganho de
Grupo 5
9 animais
(Dieta
CN)
Grupo 4
9 animais
(Dieta CP)
Grupo 1
9 animais
(Dieta
C)
Grupo 2
9 animais
(Dieta F)
Grupo 3
9 animais
(Dieta F+C)
45 ANIMAIS (Ratos F344)
Período de Depleção (4 semanas)
Manutenção das dietas experimentais
(+ 8 semanas)
Aplicação de duas doses do carcinógeno de cólon DMH em semanas consecutivas (7ª e 8ª semanas)
Sacrifício dos animais e coleta de sangue, fígado e colón (16ª semana)
6 animais
6 animais
6 animais
6 animais
6 animais
Distribuição dos animais e introdução das dietas experimentais (5ª semana)
78
peso e coeficiente de eficiência alimentar (CEA= ganho de peso (g) / consumo
alimentar (g) x 100).
2.7. Sacrifício dos animais e coleta de material para análise
Ao término do período experimental, os animais foram sacrificados por
exsangüinação via punção cardíaca, após anestesia intraperitonial com uma
combinação de ketamina (75 mg kg
-1
de peso corporal) e xilazina (10 mg kg
-1
de
peso corporal). O sangue foi coletado em tubos com heparina e distribuído em
microtubos para sua devida preparação e/ou acondicionamento de acordo com o
protocolo da análise a que se destinava. O fígado foi rapidamente coletado, limpo
em solução salina, pesado, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ºC
para posterior análise. O cólon dos animais foi coletado e a sua porção distal foi
esvaziada por meio da passagem pelo seu interior de solução fixadora de
formaldeído a 10 %. Em seguida, os fragmentos de cólon distal foram fixados na
mesma solução e destinados às análises histológicas.
2.8. Análise enzimática
2.8.1. Preparo das amostras
Imediatamente após a coleta do sangue, tomou-se uma alíquota de
cada amostra e procedeu-se a sua separação em plasma e eritrócitos por meio de
centrifugação a 1.000 x g por 10 min a 4 ºC. Desta forma, a camada de plasma
sobrenadante foi pipetada e armazenada em microtubos a -80 ºC. Descartada a
camada de leucócitos que separa as duas frações, foi adicionado aos eritrócitos
precipitados 4 volumes de água fria grau HPLC sendo, em seguida, centrifugados a
10.000 x g por 15 minutos a 4 ºC, provocando assim a ruptura das células
vermelhas. Ao final do processo de centrifugação, o sobrenadante foi coletado e
armazenado à -80 ºC até a realização da análise de atividade enzimática.
Para obtenção de homogenato de fígado, pesou-se 1 g de amostra ao
qual foi adicionado 5 mL de tampão frio (tampão fosfato de sódio 50 mM com 0,40
mM de EDTA e 1 mM de DTT, pH 7 a 25 ºC), seguindo-se sua homogeneização e
centrifugação do homogenato a 12000g por 15 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi
armazenado a -80 ºC até sua análise.
79
2.8.2. Análise da atividade de glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-
transferase (GST)
As amostras de plasma, eritrócitos e homogenato de fígado foram
analisadas para atividade de GPx seguindo-se o método proposto por PAGLIA e
VALENTINE (1967) com algumas modificações. Peróxido de hidrogênio foi utilizado
como substrato. A análise foi realizada à temperatura de 37 ºC, em autoanalizador
Cobas Mira plus. O controle de qualidade foi obtido pela utilização de padrão da
enzima GPx, originada de eritrócito bovino, e pelo estudo de precisão a partir da
obtenção de sete leituras consecutivas da mesma amostra.
A análise de GST em homogenato de fígado seguiu o método descrito
por HABIG et al. (1974) utilizando-se 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como
substrato. A análise foi realizada à temperatura ambiente (25 ºC) utilizando-se
espectrofotômetro UV-visível, modelo U-2000, marca Hitachi. O controle de
qualidade foi obtido pelo estudo de precisão a partir da obtenção de sete leituras
consecutivas da mesma amostra.
2.9. Análise da concentração de Se em plasma sangüíneo
Para análise da concentração de Se em plasma sanguíneo, procedeu-
se, inicialmente, a digestão fechada das amostras em microondas marca Milestone,
modelo Ethos sel.
Alíquotas de 100 µL de plasma foram acondicionadas em potes de
TFM aos quais foram adicionados 400 µL de ácido nítrico e 200 µL de peróxido de
hidrogênio. O programa de digestão utilizado encontra-se no Quadro 3.
Quadro 3. Programa de digestão de amostras de plasma sanguíneo em Microondas
Marca Milestone modelo Ethos sel
Etapas
Tempo
Potência do microondas
1
2 minutos
250 W
2
1 minuto
0 W
3
5 minutos
400 W
4
5 minutos
500 W
Após a digestão, as amostras foram diluídas com água ultra pura para
um volume de 10 mL e analisadas por espectrometria de massas com plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS) conforme descrito no item 2.5.
80
2.10. Análises histológicas do cólon
As amostras de cólon distal foram submetidas à técnica padrão de
coloração (HE) e à técnica histoquímica Orceína-Azul de alcian para determinação
morfométrica de alterações histológicas das criptas e do padrão de glicoproteínas
do muco, respectivamente.
Fragmentos de cólon distal foram desidratados em concentrações
crescentes de etanol, clareados em xilol e incluídos em parafina histológica a 58 ºC.
Foram obtidas secções histológicas semi-sequenciais, transversais e
longitudinais, de 3 µm de espessura, com inetrrvalo de 50 µm entre secções. As
preparações foram então coradas segundo as técnicas descritas a seguir.
A análise do padrão de secreção de mucinas ácidas e quantificação de
células secretoras de sulfomucinas, sialomucinas e de secreção mista foi realizada
empregando-se a técnica alternativa Orceína-Azul de alcian (Orceína-AA), descrita
por SINGH e GORTON (1989) com algumas modificações. Seções de 3 µm de
tecido embebido em parafina foram hidratadas e oxidadas em solução de 0,25 % de
permanganato de potássio diluído em solução de ácido sulfúrico a 0,25 % por 1
minuto, seguindo-se de sua descoloração em solução de ácido oxálico a 2 % por
aproximadamente 5 segundos. As seções foram então lavadas em água destilada e
coradas por 6 horas em solução de orceína (pH 1,5), obtida pela diluição de 1 g de
orceína sintética em 100 mL de álcool 75 % adicionado de 2 mL de ácido sulfúrico
concentrado. As preparações foram então lavadas por 10 minutos em água corrente
e diferenciadas em solução alcoólica acidificada por 10 segundos. As preprações
foram novamente lavadas em água e coradas, por 2 minutos, em Azul de Alcian (pH
2,5) 1 %, diluído em 3 % de ácido acético, seguindo-se os procedimentos de
desidratação, diafanização e montagem. Realizadas as contagens, obtiveram-se as
percentagens de células secretoras de sulfomucinas (SUM), sialomucinas (SIM) e
de secreção mista (SUMSIM) bem como o quociente entre as percentagens de SIM
e SUM (SIM:SUM).
As seções histológicas de cólon submetidas às técnicas de coloração
acima descritas foram analisadas por microscopia de luz em conjunto com o
software Image-Pro Plus da Cybernetic.
No estudo morfométrico, utilizando secções de tecido colônico coradas
com HE , foram determinados a altura de cripta em número de células, obtida pela
contagem das células colunares, altura de cripta pela medição do comprimento da
81
cripta desde a base até seu ápice, diâmetro da base da cripta medindo-se o maior
diâmetro da porção inferior da cripta com lúmen visível, diâmetro do ápice da cripta
medindo-se o maior diâmetro da porção superior da cripta voltada para o lúmen do
cólon e densidade de cripta, obtida pela contagem do número de criptas por mm
linear de cólon.
As medições e contagens foram realizadas em criptas inteiras,
seccionadas longitudinalmente, onde pudesse ser observado, tanto quanto possível,
a luz da glândula desde a base, logo acima da muscular da mucosa, até o ápice,
voltado para o lúmen colônico. Para as determinações acima especificadas foram
analisadas, no mínimo, 20 criptas por animal.
2.11. Análise estatística
O experimento foi montado seguindo-se o esquema fatorial 5x2,
correspondendo a cinco dietas e a aplicação ou não do carcinógeno de cólon DMH.
Os tartamentos foram dispostos no delineamento inteiramente casualizado com 6
repetições para aplicação de DMH e 3 repetições sem aplicação do carcinógeno.
Os dados foram interpretados por meio de análise de variância, e as
médias testadas pelo teste Tukey, ao nível de 5 % de probabilidade. Para tanto,
lançou-se mão do programa Sistema para Análises Estatíscas - SAEG, versão 9.0,
desenvolvido pela Universidade Federal de Viçosa (FUNARBE, 2000).
3. Resultados e Discussão
3.1. Composição centesimal e concentração de Se
A composição centesimal e concentração de Se do feijão e da
castanha-do-Pará e das dietas estudadas encontram-se no Quadro 4. Os teores de
proteína, lipídio, fibra e Se no material experimental foram utilizados como base
para o cálculo dos constituintes das dietas experimentais usadas no ensaio
biológico.
82
Quadro 4. Composição centesimal e concentração de Se de feijão e castanha-do-
Pará e das dietas experimentais em base úmida
Material Umidade Proteína Lipídio Fibra Cinza Carboidrato Se
experimental -------------------------------------------- g/100g -----------------------------------------
µg/100g
Feijão 6,35 24,36 1,45 23,55 4,29 63,55 12,36
Castanha 1,89 16,55 70,58 nd 3,56 7,42 1199,80
Dieta
mg kg
-
1
CN 3,05 20,97 22,47 nd 3,67 49,84 0,15
CP 2,64 21,36 22,24 nd 3,42 50,34 4,34
F 4,39 19,97 25,41 nd 5,41 44,82 0,26
C 3,48 20,92 24,13 nd 4,77 46,70 4,25
F+C 4,53 20,75 24,64 nd 6,59 43,49 3,82
Média de três determinações; CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com
feijão; C: dieta com castanha; F+C: dieta com feijão e castanha; nd= não determinado.
Embora a dieta CN tenha sido elaborada com mistura de minerais
isenta de Se, observa -se, de acordo com os dados de concentração de Se nas
dietas, que a mesma apresentou o nível recomendado do nutriente para os animais
em estudo. O Se presente nesta dieta deve, em grande parte, ser proveniente da
caseína utilizada na sua composição.
3.2. Ensaio Biológico
3.2.1. Consumo, ganho de peso e CEA
No período de depleção de Se, os valores médios de consumo diário,
ganho de peso e CEA dos animais foram, respectivamente, 16,46±0,22 g por dia,
108,61±13,17 g e 24,75±1,70 %. Ao final deste período, os animais apresentaram
atividade média de GPx em eritrócitos de 209,14±29,41 nmol min
-1
mg
-1
de Hg (CV=
14,06 %) e concentração de Se plasmática de 219,54±24,49 µg L
-1
(CV=11,15 %). A
concentração de Se plasmática observada encontra-se abaixo dos valores
reportados por UTHUS et al. (2002), de 588,25 µg L
-1
, e por FINLEY et al. (2000), de
577,20 µg L
-1
, em ratos F344 com níveis normais de Se, o mesmo ocorrendo para a
atividade GPx em eritrócitos de acordo com resultados obtidos por FENG et al.
(1999).
Tem sido demonstrado que a suplementação de Se, em doses acima
da recomendação nutricional, apresenta maior efeito sobre a redução da incidência
de vários tipos de câncer em indivíduos onde o nível de Se no plasma mostrou-se
83
relativamente mais baixo ao início da investigação (CLARK et al., 1996) denotando
que o estado nutricional inicial de Se tem efeito sobre a resposta à suplementação.
Os dados médios de consumo alimentar total, ganho de peso e CEA
dos animais durante o período experimental que se seguiu à depleção de Se são
apresentados no Quadro 5.
Quadro 5. Consumo alimentar (CA), ganho de peso (GP) e coeficiente de eficiência
alimentar (CEA) dos animais em função das dietas experimentais
Dieta CA (g) GP (g) CEA (%)
CN
1357,81a
161,32a
11,88c
CP
1344,33a
160,94a
11,97bc
F
1178,93bc
155,64a
13,20ab
C
1194,21b
144,54a
12,10bc
F+C
1156,50c
155,48a
13,44a
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha. Para cada parâmetro avaliado, médias seguidas de pelo menos
uma mesma letra nas colunas não diferem entre si, ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste
Tukey.
Os valores médios de consumo das dietas controle (CN e CP) foram
estatisticamente semelhantes e significativamente mais elevados que os das dietas
F, C e F+C sendo observado, entre estas, redução significatica de consumo da dieta
F+C em relação à dieta C. Entretanto, tais diferenças de consumo entre as dietas
não influenciaram nos resultados de ganho de peso dos animais, os quais se
mostraram estatisticamente iguais. Este fato pode ser explicado pelo maior
coeficiente de eficiência alimentar dos grupos de animais alimentados com as dietas
experimentais de menor consumo (F e F+C) os quais apresentaram valores médios
superiores aos grupos das dietas de consumo mais elevado (CN e CP) não sendo
observadas diferenças significativas entre as dietas CN, CP e C.
Considerando-se a ausência de diferenças significativas de consumo
entre as dietas CN e CP e do CEA entre as dietas CN, CP e C, pode-se inferir que o
teor de Se parece não ter influenciado tais parâmetros.
Grande parte das diferenças observadas no CEA entre os grupos de
animais parece estar relacionada com a presença de feijão nas dietas experimentais
F e F+C as quais apresentaram valores mais elevados.
As alterações na ingestão média de Se promovidas pelo consumo
diferenciado das dietas experimentais, com dose elevada do nutriente (CP, C e
84
F+C), mostraram-se insignificantes em virtude, principalmente, da magnitude da
concentração de Se presente nas mesmas (4,0 mg kg
-1
) não sendo, portanto,
consideradas na avaliação dos efeitos relativos ao nutriente.
3.2.2. Atividade enzimática de GPx e GST e concentração plasmática de Se
O efeito do Se na prevenção do câncer é frequentemente observado
em nível supranutricional ou farmacológico, e a bioatividade específica do Se
depende de sua forma química (COMBS e GRAY, 1998). Entretanto, o mecanismo
específico pelo qual o Se inibe o câncer não está claro. Potenciais mecanismos
podem incluir vias mediadas pelas selenoproteínas, alteração na atividade de
enzimas de detoxificação, proteção antioxidante, controle do ciclo celular,
estimulação do apoptose e inibição específica do crescimento de células tumorais
pela produção de metabólitos específicos de Se (WHANGER, 2004).
Considerando-se que a GPx age na conversão de peróxidos para
compostos menos danosos e devido aos danos peroxidativos associados com o
câncer, é razoável assumir que estas peroxidases poderiam estar envolvidas na
redução de tumores. Todavia, há poucas informações que suportam esta
possibilidade. De acordo com WHANGER (2004), a maior proteção do Se contra
tumores ocorre em níveis elevados de ingestão do elemento, mas a atividade de
GPx atinge seu ponto máximo a níveis nutricionais com nenhum aumento a níveis
mais elevados em muitos tecidos.
Por outro lado, é difícil predizer o comportamento da GPx nos vários
tecidos, em níveis mais elevados de ingestão de Se e sob condições fisiológicas
distintas, como observado por BELLISOLA et al., (1996). A presença de
polimorfismos genéticos de GPx e sua associação com o risco de câncer é outro
fator que pode alterar o requerimento mínimo de Se para expressão máxima da
atividade GPx em humanos (RATNASINGHE et al., 2000; HU e DIAMOND, 2003;
ICHIMURA et al., 2004).
O sangue contém três tipos de selenoproteínas já identificadas. No
plasma sanguíneo são encontadas a GPx plasmática ou extracelular e a
selenoproteína P enquanto que os eritrócitos contêm a mais abundante forma de
GPx contendo Se, a GPx intracelular, celular ou citosólica (COHEN et al., 1985).
Os valores obtidos de atividade GPx em plasma e eritrócitos
encontram-se no Quadro 6. Foram observadas diferenças significativas, tanto na
85
atividade de GPx plasmática quanto eritrocitária, entre os grupos de animais
alimentados com as dietas CN e CP. Considerando-se a atividade de GPx
plasmática, não foi observada diferença significativa entre as dietas CP, F e C.
Entretanto, a dieta F+C mostrou-se significativamente inferior à dieta CP. Ao que
parece, o consumo conjunto da castanha e do feijão na dieta F+C reduziu a
atividade GPx plasmática dos animais, levando a diferenças significativativa na
indução da atividade da enzima quando comparado com a dieta com mesmo nível
de Se suprido na forma de selenometionina.
Quadro 6. Atividade de glutationa peroxidase plasmática (GPx plamática) e
glutationa peroxidase eritrocitária (GPx eritrocitária) nos animais em
função das dietas experimentais
Dieta
GPx plasmática
GPx eritrocitária
(nmol min
-1
mL
-1
) (nmol min
-1
mg de Hg
-1
)
CN 2170,62c 231,65b
CP
2834,91a
315,98a
F 2535,64ab 241,46b
C
2505,36abc
310,04a
F+C
2333,83bc
299,58a
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha. Para cada parâmetro avaliado, médias seguidas de pelo menos
uma mesma letra nas colunas não diferem entre si, ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste
Tukey.
Foi observa do ainda, que as dietas com níveis supranutricionais de Se
fornecido pela castanha (C e F+C) apresentaram atividade GPx plasmática
semelhante à dieta sem adição de Se (CN). Este fato se deu, provavelmente, devido
à saturação da enzima em níveis de Se próximos à recomendação nutricional não
sendo, portanto, atribuída à biopotência das formas de Se presentes na castanha-
do-Pará na expressão da atividade GPx plasmática.
WEISS et al. (1997), estudando o efeito de níveis crescentes de Se
(0,0 a 0,2 mg kg
-1
) na forma de selenito de sódio na regulação da atividade GPx em
ratos, observaram que a atividade GPx plasmática alcançava o seu platô próximo a
0,1 mg kg
-1
não sendo observado nenhum aumento significante quando dietas com
0,15 e 0,20 mg kg
-1
foram empregadas.
Avaliando-se a atividade GPx em eritrócitros, verificou-se que as
dietas C e F+C apresentram-se estatisticamente iguais à dieta CP enquanto a dieta
CN mostrou-se inferior a estas e estatisticamente semelhante à dieta F.
86
A promoção da atividade GPx eritrocitária nos grupos de animais
alimentados com doses supranutricionais de Se (dietas CP, C e F+C) indica que
níveis acima da recomendação nutricional do elemento podem ser requeridos para
obtenção da expressão máxima da enzima. Estes resultados estão de acordo com
as observações feitas por WEISS et al. (1997), que estudando o padrão de
comportamento da enzima em níveis crescentes de suplementação com Se,
constataram elevação da atividade GPx eritrocitária em doses de Se acima da
recomendação nutricional, em contraste com a atividade da enzima em plasma e
tecido hepático. Já FENG et al. (1999), avaliando o efeito protetivo de doses
crescentes de Se na forma de sais inorgânicos (selenito e selenato de sódio) e
selenometionina sobre a carcinogênese de cólon em ratos, observaram elevação da
atividade GPx, tanto hepática quanto eritrocitária, quando do emprego de doses
supranutricionais do elemento em relação às dietas deficientes e adequadas em Se
em todas as formas estudadas. Outros pesquisadores (HAFEMAN et al., 1974),
constataram ainda que a atividade de GPx eritrocitária continua a elevar-se até
níveis dietéticos de Se próximos à toxidez.
Em ambas as variáveis não foi verificado efeito do carcinógeno e da
interação dieta x carcinógeno, indicando que as diferenças observadas na atividade
GPx plasmática e eritrocitária entre os grupos de animais não foram influenciadas
pela presença de DMH (Quadro 7).
Quadro 7. Resumo da análise de variância para atividade de glutationa peroxidase
plasmática (GPx plasmática) e glutationa peroxidase eritrocitária (GPx
eritrocitária) de ratos alimentados com dietas experimentais e
submetidos à indução de câncer de cólon com DMH
FV
GL
-----------------------
Quadrado Médio
----------------------
GPx plasmática GPx eritrocitária
(nmol min
-
1
mL
-
1
)
(nmol min
-
1
mg de Hg
-
1
)
Dietas
4
493401,20**
12806,89**
Carc
1
74002,17
ns
417,14
ns
Dietas*Carc
4
38644,70
ns
1129,36
ns
Resíduo
35
69226,80
1183,01
CV(%)
10,69
12,34
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
ns: não significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
No Quadro 8 são apresentados os valores médios das atividades de
87
se efeitos significativos isolados, das dietas e da aplicação de DMH. Ambas as
enzimas apresentaram comportamento idêntico com relação às dietas estudadas,
ou seja, os níveis hepáticos de atividade das enzimas antioxidantes GPx e GST
foram significativamente maiores nos grupos de animais alimentados com as dietas
CP, F, C e F+C em relação ao grupo da dieta controle sem adição de Se (CN), o
que implica em uma promoção, por parte destas dietas, da capacidade antioxidante
para defesa contra o estresse oxidativo.
O efeito na redução da atividade de ambas as enzimas no grupo de
animais alimentados com a dieta CN ocorreu, provavelmente, em função do seu
nível reduzido de Se quando comparado com a dieta CP, C e F+C. Este fato denota
a participação do Se na modulação da atividade enzimática, tanto de GPx quanto de
GST hepáticas, sob níveis diferenciados do elemento, corroborando com resultados
obtidos por outros pesquisadores (MASUKAWA et al., 1984; DAVIES et al., 1987;
CHRISTENSEN et al., 1994).
Quadro 8. Atividade de glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferase
(GST) em homogenato de fígado de ratos alimentados com dietas
experimentais e em ratos submetidos ou não à indução de câncer de
cólon com DMH
Dieta
GPx hepática
GST hepática
(nmol min
-
1
mg de P
-
1
)
(nmol min
-
1
mg de P
-
1
)
CN
95,06b
56,20b
CP
141,63
a
70,49a
F
137,20a
69,51a
C
125,96a
68,63a
F+C 133,52a 79,01a
DMH
+
119,94b
71,39a
-
133,41a
66,14b
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha; DMH: 1,2-dimetilhidrazina · 2HCl ; (+) com DMH; (-) sem DMH.
Para cada parâmetro avaliado, médias seguidas de pelo menos uma mesma letra nas colunas não
diferem entre si, ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste Tukey.
Em estados de deficiência de Se, a atividade GPx hepática tem
mostrado decrescer mais rapidamente que outras selenoproteínas (YANG et al.,
1989). Na dieta CN, a dose de Se em nível aproximado ao requerimento nutricional,
preveniu a saturação da atividade GPx, uma selenoproteína, segundo WEISS et al.
(1997), de relativamente baixa hierarquia para uso do Se. Entretanto, nas demais
88
dietas, o Se foi suficiente para maximizar a atividade da enzima, não sendo
verificadas diferenças significativas entre elas.
Vale salientar, que para GST, estudos têm constatado elevação de
sua atividade hepática quando do emprego de dietas deficientes no nutriente como
mecanismo compensatório da redução da atividade GPx sob tais condições
(CASES et al., 1999; FINLEY et al., 2000). Todavia, nesse estudo, o nível de Se
presente na dieta CN não deve, provavelmente, ter sido suficientemente baixo para
promover o efeito compensatório mencionado.
A ausência de diferenças significativas entre os níveis de atividade de
GPx hepática entre a dieta com feijão (F; Se= 0,26 mg kg
-1
) e as demais dietas com
níveis elevados de Se (CP, C e F+C; aprox. 4,0 mg kg
-1
) sugere um possível efeito
platô da atividade GPx no fígado quando do emprego de concentrações acima do
nível de ingestão considerado adequado para roedores como verificado por WEISS
et al. (1997).
Entretanto, considerando ambas as enzimas hepáticas, outros fatores
presentes no feijão, podem estar contribuindo na modulação de suas atividades.
De acordo com alguns pesquisadores (WATTENBERG, 1992;
DASHWOOD, 1999; MANSON et al., 2000; REDDY, 2000), alimentos vegetais são
portadores de numerosos agentes anticarcinogênicos os quais apresentam vários
mecanismos potenciais de ação na iniciação e em estágios posteriores de
carcinogênese. Compostos classificados como agentes bloqueadores podem
previnir ou reduzir consideravelmente a iniciação do processo cancerígeno em
função de vários fatores dentre os quais estão à capacidade de alteração da
atividade de enzimas que metabolizam drogas tanto na fase I como na fase II do
sistema celular de detoxificação de xenobióticos bem como pela captura ou redução
na formação de oxigênio reativo e outras espécies de radicais livres, ou seja, na
capacidade antioxidante da célula.
No que se refere ao feijão como agente protetor do câncer, estudos
desenvolvidos por AZEVEDO et al. (2003) têm constatado a ação antimutagênica de
polifenóis presentes no feijão ou de seus extratos em ratos submetidos a
substâncias mutagênicas. De acordo com estes autores, os polifenóis presentes no
feijão poderiam ter agido de quatro maneiras diferentes: (1) inibindo o metabolismo
de benzopireno e reduzindo a concentração final de seus metabólitos ativos; (2)
capturando metabólitos eletrofílicos intermediários; (3) interagindo diretamente com
89
o composto mutagênico final e; (4) estabelecendo um complexo com o composto,
reduzindo sua biodisponibilidade. Uma outra possibilidade seria a alteração do
metabolismo hepático promovendo redução da quantidade de metabólitos ativos
circulando pelo sangue e, consequentemente, induzindo menos dano ao DNA.
HELSBY et al. (2000), estudando o efeito antimutagênico de dieta com
farelo de trigo por meio da modificação de enzimas que metabolizam xenobióticos
observaram que a suplementação de dietas com farelo de trigo, alimento rico em
fibras, reduziu a atividade de GST hepática enquanto que a atividade GST colônica
foi elevada. Todavia, os mesmos autores observaram que, a utilização de um
produto comercial derivado do farelo de trigo com menor teor de fibra e acrescido de
vitaminas, minerais e vários fitoquímicos mostrou um potente efeito na elevação de
ambas as enzimas mencionadas.
Diante do exposto, pode-se inferir que o efeito da dieta F na atividade
GST deve provavelmente estar relacionado com a presença de micronutrientes e
fitoquímicos promovidos pelo feijão, adicionando-se ou não ao efeito da fibra
presente nesta leguminosa. Estas observações podem ser corroboradas pela
verificação de uma tendência de elevação da atividade enzimática de GST no grupo
de animais alimentados com a dieta F+C em relação àqueles das dietas onde a
castanha e o feijão foram utilizados isoladamente (C e F), embora não tenha sido
possível detectar diferenças significativas entre eles.
Independente da dieta utilizada, a aplicação de DMH promoveu
redução na atividade de GPx e elevação da atividade de GST. Tal efeito deve
relacionar-se com a função específica de cada enzima o que, por sua vez, pode
estar influenciando na utilização do cofator glutationa (GSH) comum às duas
enzimas sob estudo.
DESAI et al. (2001), estudando a atividade de enzimas dependentes
de glutationa em ratos suplementados com antioxidantes e tratados com
carcinógenos, verificaram que a atividade GPx hepática reduziu em animais
expostos aos carcinógenos enquanto que a atividade GST se elevou quando o Se
foi utilizado como suplemento antioxidante.
GSH, GST e Se apresentam um importante papel na detoxificação de
xenobióticos. A GSH e suas enzimas relacionadas assim como GPx e GST estão
envolvidas na detoxificação intracelular (GUY et al., 2000). Sabe-se que a GST
possuir um papel fisiológico no sistema de detoxificação de xenobióticos iniciando a
90
detoxificação de potentes agentes alquilantes (TRAKSHEL et al., 1988, HABIG et
al., 1974). Esta enzima cataliza a reação de tais compostos com o grupo SH da
glutationa, originando produtos que são mais solúveis em água (HABIG et al., 1974).
O Se é um elemento traço essencial na nutrição humana funionando como co-fator
da GPx (EDENS et al., 2001). A GPx dependente de Se bem como outras enzimas
antioxidantes estão envolvidas na eliminação de radicais livres e espécies reativas
de oxigênio (ROS).
O DMH é um procarcinógeno que requer ativação dentro do organismo
para transfromar-se em carcinógeno ativo (LAMONT e O´GORMAN, 1978). A
ativação metabólica do DMH inclui primeiramente sua oxidação a azometano
(FIALA et al., 1976); uma segunda oxidação converte o azometano em
azoximetano, que é logo N–hidroxilado a metilazoximetanol, transformações que
ocorrem no fígado e possivelmente em outros tecidos (LAMONT e O´GORMAN,
1978). O metilazoximetanol é instável quimicamente à temperatura corporal; in vitro
é descomposto espontâneamente em formaldeído, água e nitrogênio. Durante este
processo se forma um agente alquilante, o metildiazônio, o qual gera um íon
carbônico capaz de metilar DNA, RNA e proteínas (MATSUMOTO e HIGA, 1966). A
ação carcinogênica do DMH envolve, portanto, metilação do DNA de células
epiteliais do cólon (HAWKS e MAGEE, 1974).
Nesse contexto, a principal função da enzima GST está relacionada à
degradação do DMH na Fase II do sistema de detoxificação de xenobióticos
presentes nas células hepáticas. A presença do carcinógeno, portanto, pode ter tido
efeito sobre a modulação da atividade das duas enzimas no sentido de promover a
metabolização do DMH e seu consequente processo de eliminação.
Os dados médios de concentração plasmática de Se estão
apresentados no Quadro 9.
91
Quadro 9. Concentração plasmática de Se nos animais em função das dietas
experimentais e da aplicação de DMH
Dieta
Concentração plasmática
de Se
(
µ
g L
-
1
)
DMH +
DMH
-
CN
211,61dA
233,96cA
CP
473,57cA
484,59cA
F
374,28cA
325,07cA
C
1768,87aB
2076,83aA
F+C
1266,53bA
1317,77bA
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha; DMH: 1,2-dimetilhidrazina · 2HCl; (+) com indução química e (-)
sem indução química de câncer de cólon. Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra
minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem entre si, ao nível de 5 % de
probabilidade pelo teste Tukey.
De acordo com a análise estatística foi verificado efeito significativo da
interação dieta x carcinógeno. Em ambos os grupos de animais submetidos e não
submetidos ao DMH, as dietas tenderam a apresentar o mesmo efeito sobre a
variável estudada. Neste sentido, os grupos de animais alimentados com a dieta
sem adição de Se (CN) apresentaram níveis inferiores de Se plasmático em relação
aos demais, enquanto que as dietas com níveis supranutricionais fornecidos pela
castanha (C e F+C) promoveram elevação considerável deste parâmetro, diferindo-
se significativamente da dieta CP com mesmo nível de Se suprido na forma de
SeMet. Observa-se ainda, que a dieta F manteve níveis plasmáticos de Se idêntico
à dieta CP. Quando o feijão foi adicionado à dieta com castanha (F+C), verificou-se
redução significativa na concentração plasmática de Se em relação à dieta onde a
castanha foi utilizada isoladamente.
Em relação às diferenças observadas entre os grupos de animais
submetidos e não sumetidos ao carcinógeno, dentro de cada dieta experimental,
verifica-se que apenas os animais alimentados com a dieta C apresentaram redução
na concentração plasmática de Se quando expostos ao carcinógeno de cólon,
enquanto que nos demais grupos experimentais não houve diferença significativa.
De acordo com BURK et al. (2001), a concentração total de Se
plasmático reflete a soma de dois “pools” principais. O primeiro envolve o Se que
está presente como selenometionina e que é incorporado na albumina (principal
proteína plasmática) de forma não específica. O segundo, diz respeito ao Se que é
incorporado em selenoproteínas como a selenoproteína P e GPx plasmática, as
quais, por sua vez são claramente reguladas por mecanismos intrínsecos.
92
BURK e LEVANDER (1999) afirmam que em condições adequadas de
Se em humanos, aproximadamente 8 µg de Se dL
-1
de plasma são necessários
para satisfazer os requerimentos fisiológicos da enzima GPx plasmática e da
selenoproteína P. Concentrações de Se no plasma abaixo deste nível constituem
bons índices do grau de comprometimento da ingestão e do estado nutricional de
Se. Em níveis de ingestão mais altos, o Se no plasma continua a elevar-se, mas a
intensidade de correlação com a ingetão dietética depende da forma química do Se
na dieta.
FINLEY e colaboradores (2000) pesquisaram o efeito de dietas com
doses supranutricionais de Se na forma de selenato de sódio e brocoli enriquecido
com Se na proteção do câncer cólon em ratos F344 submetidos à indução química
da doença. Foi observado que na dieta com selenito o nível de Se plamático atingiu
seu máximo na dose de 0,1 µg kg
-1
não havendo acréscimo quando dose mais
elevada do nutriente foi empregada. Entretanto, na dieta com brocoli, observou-se
elevação contínua da concentração de Se no plasma quando da utilização do nível
supranutrional do nutriente. Isto indica, de acordo com o autor, diferenças no
metabolismo do Se em virtude, provavelmente, da presença de diferentes formas
químicas do elemento no brocoli enriquecido o que promoveu a elevação paulatina
dos níveis de Se plasmático nos animais.
Estudos de “especiação” de Se em castanha-do-Pará identificaram a
selenometionina como a principal forma do elemento (VONDERHEID et al., 2002;
KANNAMKUMARATH et al., 2002; WROBEL et al., 2003; KANNAMKUMARATH et
al., 2005). CHUNHIENG et al. (2004) e DUMONT et al. (2006), detectaram
selenometionina e selenocisteína como os principais componentes dessa matrix
sendo o primeiro o maior componente encontrado. Tais estudos têm confirmado a
associação do Se às proteínas da castanha, contudo, a natureza destas
selenoproteínas ainda necessita ser caracterizada bem como a identificação e
quantificação das demais formas de Se presentes em menor quantidade na
castanha-do-Pará. Em adição, tem sido constatado que a concentração de Se em
castanha-do-Pará pode variar de 0,20 a 253 µg kg
-1
dependendo da sua área
geográfica de produção (SECOR e LISK, 1989; CHANG et al., 1995). Tal variação
pode promover alterações qualitativas nas formas do elemento a exemplo do que
ocorre em alho enriquecido com Se onde, a baixas concentrações do nutriente, a
selenometilcisteína (SeMCys) é a forma principal de Se, predominando, em altas
93
concentrações, a forma alfa-glutamil-selenometilcisteína (γ-glutamil-SeMCys)
(DONG et al., 2001).
O fornecimento, pela castanha-do-Pará, de níveis supranutricionais de
Se nas dietas C e F+C elevou sobremaneira a concentração plasmática do nutriente
em relação à dieta com o mesmo nível de Se na forma de selenometionina (CP). De
modo contrário, a percentagem de Se associada à GPx plasmática foi maior em
animais alimentados com nível elevado de Se na dieta CP comparativamente com
os animais alimentados com as dietas C e F+C (Tabelas 3 e 5). Desta forma, é de
se supor que a elevação da concentração de Se plasmática observada em animais
alimentados com as dietas C e F+C pode estar relacionada não só à incorporação
não específica em proteínas plasmáticas do elemento presente na forma principal
de selenometionina na castanha, mas também com um possível metabolismo
diferenciado das outras formas de Se contidas na noz.
Contudo, estudos realizados por IP e LISK (1999) não confirmam esta
hipótese. Estes pesquisadores, objetivando verificar um possível acúmulo
diferenciado de Se em tecidos e plasma de ratos alimentados com dietas elevadas
no nutriente (3 mg kg
-1
) fornecidos por fontes diferenciadas, observaram que, nos
animais supridos com Se na forma de SeMeta ou de castanha-do-Pará, a
concentração de Se nos tecidos e no plasma superou àquelas verificadas quando a
fonte de Se foi o selenito ou o alho e a cebola enriquecidos. Eles observaram ainda
que, contrariamente o verificado neste trabalho, os níveis de Se plasmático nos
animais alimentados com SeMet e castanha-do-Pará não diferiram entre si,
apresentando concentrações de 940,0 µg L
-1
e 900,0 µg L
-1
, respectivamente, o que
denota um comportamento semelhante no metabolismo e acúmulo de Se no plasma
entre a SeMet e o Se presentes na castanha-do-Pará quando ingeridos a doses
elevadas do elemento.
O efeito pronunciado do Se fornecido pela castanha-do-Pará sobre a
concentração do nutriente no plasma sanguíneo dos ratos deve-se, portanto, às
condições experimentais específicas neste estudo, as quais podem ter alterado a
resposta dos animais à incorporação de Se no plasma.
3.2.4. Análises histoquímicas e morfométricas
No processo de carcinogênese de cólon o intercâmbio entre a
proliferação, diferenciação e apoptose é muito importante. De acodo com CHANG et
94
al., 1997, o aumento ou descontrole da proliferação celular, falhas no processo de
diferenciação e redução da apoptose podem coletivamente levar a mudanças na
morfologia e arquitetura do cólon e da cripta, aumentando o volume celular e
elevando a probabilidade de progressão de mutações celulares que podem estar
presentes. Desta forma, tem sido sugerido recentemente que a medição destes
fatores pode apresentar maior significância prognóstica na avaliação dos efeitos
dietéticos sobre a incidência de tumores e o risco de câncer de cólon.
O epitélio da mucosa colônica apresenta células secretoras de
mucosubstâncias que se diferenciam principalmente em função das características
do muco produzido e liberado por elas (SHEAHAN e JERVIS, 1976).
Numerosos estudos têm utilizado análises histoquímicas e do padrão
de secreção e da distribição de mucosubstâncias do epitélio gastrointestinal como
biomarcadores de alterações em estados patológicos induzidos experimentalmente
em animais de laboratório (SHEAHAN e JERVIS, 1976; HONG et al., 1997; JENAB
e THOMPSON, 2000) ao mesmo tempo em que estudos histoquímicos similares
têm sido conduzidos em epitélio gastrointestinal humano sob várias condições
(FILIPE e BRANDFOOT, 1974; SHEAHAN e JERVIS, 1976; BOLAND et al., 1982;
SUNTER, 1984; HOLT et al., 1998; BERNSTEIN et al., 2002).
3.2.4.1. Diferenciação celular: determinação de sulfomocinas e sialomucinas
Dentre os métodos histoquímicos mais usados na determinação do
padrão de secreção de mucinas ácidas está o método introduzido por SPICER
(1965) de Alto ferro diamina-azul de alcian (HID-AB). Este método distingue
mucosubstâncias ácidas não sulfatadas (AB positivo) de coloração azul e
denominadas de sialomucinas das mucosubstâncias sulfatadas (HID-positivo)
coradas de preto, denominadas de sulfomucinas.
Neste trabalho, a determinação do padrão de mucosubstâncias ácidas
foi realizada pela utilização de um método alternativo desenvolvido por SINGH e
GORTON (1989) utilizando orceína e azul de alcian (Orceína-AB) e cujos resultados
apresentaram alta corelação com aqueles obtidos pela técnica HID-AB.
A relação entre sulfomucinas (SUM) e sialomucinas (SIM) em células
da mucosa colônica está associada ao seu estado de maturação; ela tem sido
usada como marcador válido no grau de diferenciação da mucosa colônica em
95
estudos com animais (YANG et al., 1996; CHANG et al., 1997; HONG et al., 1997;
JENAB e THOMPSON, 2000) e humanos (HOLT et al., 1998).
SHEAHAN e JERVIS (1976), estudando várias espécies animais
incluindo roedores e o homem, constataram a predominância de mucosubstâncias
ácidas no intestino grosso e, em particular, de sulfomucinas no cólon distal das
espécies estudadas.
O redução da razão SIM:SUM é indicativo do aumento da maturidade
ou do grau de diferenciação celular, uma vez que o decréscimo na produção de
SUM tem sido observado em tecido colônico anormal, preneoplásico e neoplásico
(FILIPE e BRANFOOT, 1974; BOLAND et al., 1982; CAMPO et al., 1988; SHAH et
al., 1989; SAMS et al., 1990). Desta forma, falha ou redução na diferenciação
celular tem sido proposta como um importante fator na avalição do risco de câncer
de cólon (YANG et al., 1996). Quanto mais as células do cólon são estimuladas a se
diferenciar menos provavelmente elas irão se proliferar e, hipoteticamente, maior
sua taxa de apoptose.
Na Figura 2 é apresentado corte tranversal de cólon distal tingido pela
técnica histoquímica Orceína-AA. Os dados médios das percentagens de células
secretoras de sialomucinas (SIM), sulfomucinas (SUM) e células de secreção mista
(SUM+SIM) bem como a razão SIM:SUM são apresentados no Quadro 10.
96
Figura 2. Corte transversal de cólon distal de ratos F344 corado pela técnica
histoquímica Orceína-AA mostrando cripta seccionada longitudinalmente
com células caliciformes secretoras de sulfomicinas (a), de sialomucinas
(b), e de secreção mista (c).
a
2
0
µ
m
b
c
97
Quadro 10. Percentual de células secretoras de sulfomucinas (SUM), células
secretoras de sialomucinas (SIM), células de secreção mista
(SUM+SIM) e coeficiente entre sialomucinas e sulfomucinas
(SIM:SUM) em mucosa colônica de ratos alimentados com dietas
experimentais e submetidos à indução de câncer com DMH
Dieta SUM SIM SUM+SIM SIM:SUM
DMH + DMH - DMH + DMH - DMH + DMH - DMH + DMH -
------------------------------------------ % ------------------------------------------
CN 54,71aA 58,35aA 19,10aA 7,32aB 26,19bB 34,33aA 0,42aA 0,15aB
CP 55,90aA 55,07aA 15,81aA 15,28aA 28,29bA 29,64aA 0,33aA 0,30aA
F 61,80aA 60,93aA 9,67bA 10,18aA 28,53bA 28,89aA 0,20bA 0,19aA
C 61,84aA 54,49aA 9,04bA 11,70aA 29,12bB 33,81aA 0,17bA 0,24aA
F+C 58,33aA 57,31aA 8,56bA 9,83aA 34,78aA 32,86aA 0,20bA 0,22aA
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha; DMH: 1,2-dimetilhidrazina · 2HCl; (+) com indução química e (-)
sem indução química de câncer de cólon. Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra
minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem entre si, ao nível de 5 % de
probabilidade pelo teste Tukey.
As percentagens de células SUM presentes nas criptas da mucosa
colônica dos animais foram estatisticamente iguais entre as dietas experimentais e,
dentro de cada dieta, entre os animais com e sem aplicação de DMH. Com relação
à percentagem de células SIM, as dietas F, C e F+C apresentaram-se iguais entre si
e significativamente inferiores às dietas CN e CP quando da aplicação de DMH, não
sendo observadas diferenças significativas entre as dietas experimentais nos grupos
de animais não submetidos ao carcinógeno. O mesmo foi verificado para a
percentagem de células de secreção mista (SUM+SIM) no cólon dos animais DMH-,
enquanto que naqueles tratados com carcinógeno (DMH+), observou-se a elevação
destas células na mucosa do grupo de animais alimentados com a dieta F+C em
relação às demais dietas estudadas.
Obtendo-se a relação SIM:SUM, constatou-se não haver dierenças
significativas entre as dietas experimentais nos grupos de animais DMH- enquanto
que nos animais DMH+ foi observada redução desta relação nas dietas F, C e C+F,
as quais apresentaram-se iguais entre si e diferentes das dietas CN e CP.
Comparando-se os animais submetidos ou não ao DMH dentro de
cada dieta experimental, foi observado o mesmo comportamento na percentagem
de células SIM e na relação SIM:SUM, sendo constatada a elevação de tais
parâmetros em animais alimentados com a dieta CN e submetidos à aplicação do
carcinógeno, enquanto que, nas demais dietas, não foram verificadas diferenças
significativas.
98
Os resultados da análise estatística demonstram, portanto, não ter
havido diferenças no padrão de secreção de mucosubstâncias ácidas entre os
grupos de animais nas dietas experimentais quando da ausência do carcinógeno de
cólon. Entretanto, quando os grupos de animais foram submetidos à aplicação de
DMH o padrão de secreção foi modificado como observado pelas alterações na
percentagem de células SIM e de células SUM+SIM. Estas mudanças
influenciaram, por sua vez, o coeficiente entre sialomucionas e sulfominas
(SIM:SUM), utilizado como índice de maturidade e diferenciação celular da mucosa.
As alterações observadas no coeficiente SIM:SUM demonstram que
os animais alimentados com a dieta sem adição de Se (CN) sofreram redução na
diferenciação celular quando sumetidos ao carcinógeno de cólon, enquanto que a
mesma dieta acrescida de dose supranutricional do nutriente (CP) manteve o
índice de diferenciação nos animais DMH+, indicando um possível efeito do Se na
proteção contra alterações da mucosa colônica. Nas demais dietas experimentais, a
exemplo da dieta CP, a presença do DMH não promoveu alterações no processo de
diferenciação celular, denotando a influência positiva destas dietas na manutenção
da homeostase do desenvolvimento colônico e, em consequência, na proteção da
mucosa contra alterações pré-malignas.
Analisando-se o efeito das dietas entre si, nos grupos de animais
submetidos à indução de câncer, observou-se que os animais alimentados com
dose supranutricional de Se suprido pela adição de castanha-do-Pará à dieta (C)
mostraram-se mais protegidos contra alterações no grau de diferenção celular do
que o grupo alimentado com a mesma dose de Se adicionado na forma de SeMet
(CP). Considerando-se que a forma de Se utilizada está intimamente relacionada
com seus efeitos anticarcinogênicos é de se esperar que as formas de Se presentes
na castanha estejam condicionando, ao menos em parte, os resultados obtidos.
Em trabalhos de “especiação” de Se desenvolvidos por
CHUNHIENG et al. (2004), foi detectado que a maior percentagem de Se presente
em castanha-do-Pará está na forma de SeMet, tendo sido detectadas outras formas
de Se sem que fosse possível a identificação e quantificação das mesmas. Todavia,
não se pode descartar a hipótese do efeito conjunto de outros fatores presentes em
matrizes tão complexas como os alimentos e de sua interação com o ambiente
colônico.
99
A ausência de diferenças significativas entre as dietas F, C e F+C
indicam não ter havido efeito sinérgico ou aditivo sobre a percentagem de células
SUM e SIM e na relação SIM:SUM quando da utilização conjunta de feijão e
castanha (F+C) em relação à ação destes alimentos utilizados isoladamente.
Ressalte-se ainda, que o efeito semelhante da dieta F em relação às
dietas C e F+C indicam que o feijão ofereceu o mesmo nível de proteção que estas
contra possíveis alterações no grau de diferenciação da mucosa avaliado por este
parâmetro.
Os feijões são uma boa fonte tanto de fibra dietética quanto de uma
ampla faixa de fitoquímicos, os quais têm sido relacionados à redução do risco de
câncer de cólon (HUGHES et al., 1997; BAWADI et al., 2005).
Neste trabalho, a elevada percentagem de fibra alimentar solúvel e
insolúvel fornecida pelo feijão pode ser considerada um dos fatores condicionantes
dos efeitos na redução do risco de câncer das dietas baseadas neste alimento.
Fibra alimentar é a soma de lignina e polissacarídeos originados de
plantas, que não são digeridos pelas enzimas do intestino delgado, mas podem ser
degradados por fermentação microbiana. Elas podem ser classificadas em fibras
solúveis e insolúveis.
As fibras insolúveis como celulose, não fermentáveis, são excretadas
de forma inalterada (WIJNANDS et al., 1999). Resultam em fezes mais volumosas e
consequente diluição de carcinógenos e promotores luminais. Em adição, seu
trânsito é acelerado, reduzindo o tempo de exposição a irritantes e (co-
)carcinógenos. Já as fibras solúveis são substratos fermentáveis para bactérias
anaeróbicas no intestino grosso. O principal produto da fermentação são ácidos
graxos de cadeia curta como acetato, propionato e butirato. Os ácidos graxos de
cadeia curta reduzem o pH colônico resultando na precipitação de ácidos biliares e
inibição da formação de ácidos biliares secundários os quais são citotóxicos e
considerados favorecedores da carcinogênese (CHEAH, 1990; Van MUNSTER e
NAGENGAST, 1993). Altas concentrações de ácidos graxos secundários têm sido
associadas com aumento no risco de câncer de cólon. O butirato tem mostrado
suprimir a formação de tumores coloretais (MCINTYRE et al., 1993), protegendo o
epitélio colônico de mudanças displásicas, estimulando a diferenciação celular,
induzindo a apoptose e diminuindo a proliferação das células colônicas in vivo e in
vitro (AWAD et al, 1991; HAGUE et al., 1996).
100
A fibra alimentar também tem mostrado reduzir os efeitos
prócarcinogênicos observados quando do consumo de dietas hipercalóricas e/ou
hiperlipídicas. O aumento dos níveis de insulina e da energia intracelular pode
promover estímulos proliferativos no epitélio colônico levando ao aumento de
células e criptas anormais com promoção da carcinogênese (BIRD et al., 1985).
Além disso, o aumento da energia intracelular poderia resultar em um aumento da
oxidação e formação de espécies reativas de oxigênio, aumentando os danos
celulares, a oxidação do DNA e a frequência de mutações com consequente
influência na iniciação e promoção da carcinogênese colônica (BRUCE et al., 2000).
WIJNANDS et al. (1999) estudando o efeito protetor de fibras
fermentáveis (galactooligossacarídeos) e não fermentáveis (celulose) sobre o
câncer de cólon induzido por DMH em ratos alimentados com dietas com níveis
diferenciados de gordura, verificaram que a tumorigênese foi favorecida pelo
aumento do conteúdo de gordura da dieta e que as dietas que continham fibra
fermentável conferiram maior proteção contra o câncer colorretal em relação às
dietas contendo celulose não fermentável.
Desta forma, os já conhecidos efeitos fisiológicos da fibra alimentar
indicam que para promover proteção máxima sobre o câncer de cólon uma fibra
dietética deveria: a) ser rica em fibra alimentar insolúvel, particularmente celulose; b)
conter suficiente fibra alimentar solúvel para produzir butirato sob fermentação e; c)
não aumentar a concentração de ácidos biliares nas fezes (HUGHES et al., 1997).
Diante destas considerações, a fibra alimentar do feijão apresenta-se
como um bom candidato para as propriedades anticarcinogênicas do feijão uma vez
que a mesma: a) está entre as melhores fontes conhecidas de fibra alimentar
insolúvel contendo maior percentagem do que muitos cereais (HUGHES e
SWANSON 1989); b) é rica em fibra solúvel a qual tem mostrado converter-se
facilmente a butirato no cólon (FLEMING et al., 1985); c) não aumentam
significantemente a concentração de ácidos biliares fecais a exemplo do observado
com o farelo de aveia (ANDERSON et al., 1984) e; d) mostram-se igualmente
efetivas ao farelo de aveia na redução das concentrações de colesterol sanguíneo
(ANDERSON et al., 1984).
Além de boa fonte de fibra alimentar, os feijões são também ricos em
muitos fitoquímicos com propriedades anticarcinogênicas.
101
Neste sentido, a presença de considerável concentração de ácido
fítico ou inositol hexafosfato (IP6) em feijão é outro fator que pode estar
influenciando, a exemplo de estudos com trigo (JENAB e THOMPSON, 1998;
REDDY et al., 2000), a manutenção da homeostase do desenvolvimento do epitélio
colônico.
O ácido fítico é uma substância presente em muitas leguminosas
sendo considerado um antinutriente em virtude de sua ação na complexação de
proteínas, vitaminas e sais minerais reduzindo o aproveitamento destes pelo
organismo (URBANO et al., 2000). Entretanto, estudos com animais têm mostrado
que esta substância pode inibir o crescimento neoplásico em diversos tipos de
câncer incluindo o câncer de cólon (SHAMSUDDIN et al., 1989; ULLAH E
SHAMSUDDIN, 1990; PRETLOW et al., 1992). Os mecanismos de ação propostos
são o aumento da morte natural da célula, alterações na tradução de sinais,
estimulação de genes que levam à maior diferenciação celular e atividade
antioxidante (SHAMSUDDIN, 1992; FOX e EBERL, 2002).
Os taninos, outro consituinte do feijão com propriedades antinutritivas,
também têm sido relacionados com o efeito protetivo do câncer por esta
leguminosa. Estudo realizado por BAWADI et al. (2005), demonstrou o efeito de
taninos condensados, extraídos do feijão preto, na inibição do crescimento de
células Caco-2, denotanto sua ação protetora sobre a carcinogênese colônica.
3.2.4.2. Morfologia da mucosa colônica
Alterações na morfologia da cripta e do epitélio colônico como um todo
têm sido utilizadas como indicadores da ação de carcinógenos sobre a mucosa
colônica bem como do efeito protetor de agentes anticarcinogênicos.
A Figura 3 apresenta corte transversal de cólon distal corado pela
técnica HE indicando o procedimento adotado de medição dos parâmetros
morfométricos estudados. Os dados médios de altura da cripta em número de
células, obtidos pela contagem das células colunares do epitélio da mucosa colônica
são apresentados no Quadro 11.
102
Figura 3. Corte transversal de cólon distal de ratos F344 corado pela técnica HE. (a)
altura da cripta; (b) diâmetro do ápice da cripta; (c) diâmetro da base da
cripta; (d) célula colunar.
Quadro 11. Altura de cripta em número de células de mucosa colônica de ratos
alimentados com dietas experimentais e submetidos à indução de
câncer com DMH
Dieta
Altura da cripta em número de células
DMH
+
DMH
-
CN
60,34bA
49,88bB
CP
64,06bA
61,64aA
F
64,89bA
66,42aA
C
72,54aA
72,01aA
F+C
64,86bA
61,69aA
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha; DMH: 1,2-dimetilhidrazina · 2HCl; (+) com indução química e (-)
sem indução química de câncer de cólon. Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra
minúscula nas colunas ou maiúscula nas linhas não diferem entre si, ao nível de 5 % de
probabilidade pelo teste Tukey.
20
µ
m
103
A manutenção do comprimento constante da cripta é obtida pelo
balanço entre proliferação e morte celular. Desta forma, a altura da cripta em termos
de número de células colunares, dá uma idéia do seu nível proliferativo.
MASKENS (1976), estudando a histogênese e o padrão de
crescimento de adenocarcinomas em cólon de ratos induzidos com DMH, observou
anterior à formação de tumores, significativa elevação na profundidade da cripta,
expressa pelo número de células colunares, de mucosa de ratos tratados com DMH
em relação ao seu controle (ratos não tratados).
Constatou-se que a dieta sem adição de Se (CN) promoveu um
padrão diferenciado de altura apresentando-se significativamente inferior a dieta CP
e as demais dietas estudadas nos animais não tratados com o carcinógeno (DMH -).
Entretanto, quando da aplicação do carcinógeno de cólon (DMH +), observou-se
elevação significativa da altura de cripta no grupo de animais tratados com a dieta
CN enquanto que no grupo CP e nas demais dietas não foram verificadas
alterações. Estes resultados indicam o efeito do Se na forma de SeMet na
manutenção do padrão de proliferação celular da cripta medido pela altura de
criptas em número de células.
Considerando o efeito das dietas entre os grupos de animais tratados
com DMH, observou-se que a dieta C apresentou maior grau de proliferação celular
em relação às dietas com o mesmo nível de Se (CP e F+C) e a dieta com feijão (F).
Entretanto, constatou-se que a utilização conjunta de castanha e feijão na dieta
F+C, promoveu redução da proliferação celular comparado à dieta onde a castanha
foi empregada isoladamente (C). Este fato indica um possível efeito interativo entre
os constituintes destes dois alimentos no grau de proliferação celular da mucosa
colônica, medida pela altura da cripta em número de células.
JENAB e THOMPSON (2000) estudaram o efeito do trigo e do ácido
fítico de forma isolada e conjunta sobre biomarcadores do câncer de cólon induzido
com azoximetano em ratos. Foi constatado, que tanto o trigo quanto o ácido fítico
promoveram redução na altura de criptas medida em número de células colunares
bem como na razão SIM:SUM, indicando o efeito potencial dos mesmos na redução
do risco de câncer de cólon.
A análise estatística dos parâmetros de altura de cripta, diâmetro da
base, diâmetro do ápice e densidade de cripta avaliados no estudo morfométrico da
104
mucosa colônica dos grupos de animais submetidos às dietas experimentais
encontram-se no Quadro 12.
Quadro 12. Altura, diâmetro da base e diâmetro do ápice de criptas em µm e
densidade de criptas de cólon de ratos alimentados com dietas
experimentais
Dieta
Altura da cripta
Diâmetro da
base
Diâmetro do
ápice
Densidade
de cripta
(nº de criptas/mm linear
--------------------------------
µm
--------------------------------
d
e cólon)
CN
180,63b
42,90a
40,44b
20,60ab
CP
254,98a
45,07a
44,43ab
20,13b
F
228,80a
42,17a
42,13b
21,31ab
C
237,18a
42,96a
46,32a
20,31b
F+C
226,83a
40,82a
42,47ab
22,11a
CN: dieta controle negativo; CP: dieta controle positivo; F: dieta com feijão; C: dieta com castanha;
F+C: dieta com feijão e castanha; Para cada parâmetro avaliado, médias seguidas de pelo menos
uma mesma letra nas colunas não diferem entre si, ao nível de 5 % de probabilidade pelo teste
Tukey.
TSUKAMOTO e colaboradores (2006) estudaram o efeito de
alterações na atividade de hexosaminidase, em criptas normais e aberrantes (ACF)
de ratos F344 tratados com DMH e sua relação com características morfolóligas e
proliferativas. Estes pesquisadores observaram que, após a décima semana
experimental, houve elevação significativa no comprimento da cripta (316,3 µm) de
ratos tratados com DMH e com atividade hexosaminidase reduzida em relação aos
grupos não tratado com DMH (224,7 µm) e tratados com DMH mas com atividade
enzimática normal (280,0 µm). Em estudo anterior realizado por TSUKAMOTO et al.
(2001), foi observado ainda que criptas com atividade hexosaminidade decrescida
apresentam-se mais largas que criptas com atividade enzimática normal tendo sido
consideradas normais, criptas com diâmetro igual ou inferior a 60 µm e aberrantes
aquelas com diâmetro superior a 115 µm.
Não obstante a constatação, por diversos pesquisadores (BARNES et
al., 1999; JENAB e THOMPSON, 2000; MA et al., 2002), de alterações morfológicas
da mucosa colônica e de suas glândulas em ratos submetidos à carcinógenos de
cólon, nenhuma diferença foi observada, neste trabalho, entre os grupos de animais
tratados com DMH e seus controles nas dietas experimentais estudadas (resultados
não mostrados).
Diante dos resultados obtidos, não se pode fazer inferências sobre o
possível efeito das dietas experimentais sobre a preservação da morfologia
105
colônica, avaliada pelos parâmetros morfométrico aqui estudados, quando da
aplicação do DMH, sendo apenas possível discutir as diferenças promovidas pelas
dietas experimentais de forma individual e da relação entre eles.
Comparando-se as dietas experimentais entre si, foram constatadas
diferenças em todos os parâmetros avaliados com exceção do diâmetro da base.
Considerando-se a altura de cripta em µm, verificou-se que os animais
alimentados com a dieta CN apresentaram a menor altura média em relação às
demais dietas estudadas. No que se refere ao diâmetro não foi observada diferença
significativa entre as dietas com nível supranutricional de Se (CP, C e F+C) com o
maior valor sendo observado para a dieta C. Contudo, quando o feijão foi utilizado
conjuntamente com a castanha-do-Pará (F+C), observou-se redução no diâmetro do
ápice da cripta levando a valores próximos àqueles observados para a dieta com o
mesmo nível de Se na forma de SeMet (CP).
Não foi observada diferença significativa na densidade de criptas,
medida em número de criptas por milímetro linear de cólon, entre as dietas CN, CP,
F e C. Entretanto, quando os animais foram alimentados com a dieta F+C, verificou-
se elevação significativa desta medida em relação às dietas C.
Estas observações indicam que as dietas alteraram, de forma distinta,
a morfologia da mucosa colônica avaliada pela medida altura da cripta, diâmetro da
base, diâmetro do ápice e densidade de cripta e pela correlação entre elas.
BUTLER e colaboradores (1992), objetivando determinar os fatores
que influenciaram a proliferação celular no cólon distal, observaram, por meio de
estudo morfométrico, que o índice proliferativo, obtido pela densidade de criptas e o
número de colonocitos por densidade de área, era mais elevado no cólon distal em
relação ao proximal e que a proliferação celular das distintas porções do intestino
grosso pode ser modificada com a dieta.
Em adição a isto, estudos têm demostrado que alterações
morfológicas e proliferativas da mucosa colônica aparentemente normal podem ser
observadas como indicativo de suscetibilidade ou predisposição a doenças do
intestino grosso, com destaque para o câncer (SHAMSUDDIN, et al., 1981;
TERPSTRA et al., 1987; BARNES, et al., 1999).
106
4. Conclusões
Nas dietas estudadas, a atividade enzimática de GPx em plasma,
eritrócitos e fígado bem como de GST hepática não foram alteradas com a presença
do carcinógeno de cólon DMH, em relação aos seus controles. Entretanto,
independente da dieta utilizada, a aplicação de DMH promoveu redução da
atividade GPx no fígado com concomitante elevação da atividade GST no mesmo
órgão.
Todas as dietas com nível supranutricional de Se elevaram a atividade
GPx e GST em todos os tecidos avaliados, bem como a concentração plasmática de
Se em relação à dieta sem adição do nutriente sendo as dietas com nível
supranutricional de Se fornecido pela castanha-do-Pará tão hábeis quanto a dieta
com SeMet na promoção da atividade destas enzimas.
A dieta com feijão promoveu o mesmo nível de atividade GPx
plasmática e hepática e de GST hepática observados nos grupos de animais
alimentados com as dietas elevadas em Se.
Todas as dietas, com exceção da dieta sem adição de Se, mantiveram
o grau de diferenciação e proliferação celular da mucosa colônica, medido pelo
quociente entre as percentagens de células secretoras de sialomucinas e células
secretoras de sulfomucinas e pela altura de cripta em número de células, quando da
aplicação do carcinógeno de cólon DMH.
A administração de doses supranutricionais de Se na forma de SeMet
ou fornecida pela castanha e a utilização combinada do feijão e da castanha em
dietas hiperlipídicas favoreceu a homeostase do desenvolvimento colônico evitando
alterações na diferenciação e proliferação celular em ratos tratados com DMH,
reduzindo, consequentemente o risco de cânce de cólon.
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115
ANEXOS
Quadro 1A. Resumo da análise de variância para consumo alimentar (CA), ganho
de peso (GP) e coeficiente de eficiência alimentar (CEA) de ratos
alimentados com dietas experimentais e submetidos à indução química
de câncer com DMH
FV
GL
Quadrado Médio
CA (g)
GP (g)
CEA (%)
Dietas
4
74722,190**
367,02
ns
4,41**
Carc
1
0,009
ns
464,66
ns
2,81
ns
Dietas*Carc
4
49,823
n
s
53,00
ns
0,27
ns
Resíduo
35
564,628
142,10
0,87
CV(%)
1,91
7,72
7,53
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
ns: não significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
Quadro 3A. Resumo da análise de variância para atividade de Glutationa
Peroxidase (GPx) e Glutationa S-Transferase (GST) no fígado de
ratos alimentados com dietas experimentais e submetidos à indução
química de câncer com DMH
FV
GL
Quadrado Médio
GPx hepática
GST hepática
---------------
nmol min
-
1
mg de P
-
1
-----------
--
Dietas
4
2762,37**
532,87**
Carc
1
1813,42**
275,86*
Dietas*Carc
4
274,45
ns
79,90
ns
Resíduo
35
175,79
64,06
CV(%)
10,64
11,49
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
ns: não significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
Quadro 4A. Resumo da análise de variância para concentração de Se em plasma
sanguíneo de ratos alimentados com distas experimentais e
submetidos à indução química de câncer com DMH
FV
GL
Quadrado Médi
o
Concentração plasmática de Se
(
µ
g/L)
Dietas
4
4255521,0**
Carc
1
47155,6*
Dietas*Carc
4
38466,6**
Resíduo
35
9151,4
CV(%)
11,36
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
116
Quadro 5A. Resumo da análise de variância para células secretoras de
sulfomucinas (SUM), células secretoras de sialomucinas (SIM),
células de secreção mista (SUM+SIM) e coeficiente entre
sialomucinas e sulfomucinas (SIM:SUM) em mucosa colônica de
ratos alimentados com dietas experimentais e submetidos à indução
química de câncer com DMH
FV
GL
Quadrado Médio
SUM
SIM
SUM+SIM
SIM:SUM
----------------------
%
----------------------
Dietas
4
39,57
ns
56,56**
34,95*
0,02391**
Carc
1
16,47
ns
24,77
ns
63,70*
0,018
70
ns
Dietas*Carc
4
30,74
ns
67,76**
30,98*
0,03503**
Resíduo
35
24,09
7,66
10,58
0,00473
CV(%)
8,45
23,24
10,76
27,52
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
ns: não significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
Quadro 6A. Resumo da análise de variância para altura de cripta em número de
células (ALTNC), altura de cripta (ALTC), diâmetro da base (DB)
diâmetro do ápice (DA) e densidade de criptas (DC) em mucosa
colônica de ratos alimentados com dietas experimentais e submetidos
à indução química de câncer com DMH
FV
GL
Quadrado Médio
ALTC
DB
DA
ALT
NC
DC
-----------------
µ
m
----------------
(nº de células)
(nº de criptas/mm
linear de cólon)
Dietas
4
6062,4
**
18,99
ns
41,05
*
303,
83
**
5,29
**
Carc
1
141,7
ns
4,96
ns
5,32
ns
90,77
**
5,26
ns
Dietas*Carc
4
1100,5
ns
9,88
ns
14,70
ns
41,33
*
0,65
ns
Resíduo
35
508,3
10,92
9,13
10,88
1,29
CV(%)
10,02
7,70
7,02
5,13
5,47
** significativo a 1 % de probabilidade pelo teste F
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
ns: não significativo a 5 % de probabilidade pelo teste F
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