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CÉSAR AUGUSTO SODRÉ DA SILVA
PARTIÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO USANDO
SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2007
Dissertação
apresentada à
Universidade Federal de Viçosa, como
parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
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CÉSAR AUGUSTO SODRÉ DA SILVA
PARTIÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO
USANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
APROVADA: 27 de julho de 2007.
_________________________________
Prof. Luis Henrique Mendes da Silva
(Co-Orientador)
Prof. Edwin Elard García Rojas
(Co-Orientador)
_________________________________
Prof
a
. Maria do Carmo Hespanhol da Silva
Prof
a
.
Renata Cristina Ferreira Bonomo
________________________________________
Prof
a
. Jane Sélia dos Reis Coimbra
(Orientadora)
Dissertação
apresentada à
Universidade Federal de Viçosa, como
parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
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ii
Dedico esta tese aos meus pais, Creuza e Nízio,
Ao meu irmão, Fernando,
E à minha namorada, Rejane,
Pessoas com as quais pude compreender
O significado da palavra Amor.
iii
“Quero, um dia, poder dizer às pessoas que nada foi em vão... que o amor existe, que vale a pena se
doar às amizades e às pessoas, que a vida é bela sim, e que eu sempre dei o melhor de mim...
e que valeu a pena”!
(Mário Quintana)
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e a graça da saúde.
À Universidade Federal de Viçosa (UFV) e ao Departamento de Tecnologia de
Alimentos (DTA), pelo Programa de Pós-Graduação.
Ao CNPq, pelos recursos financeiros e pela bolsa concedida.
À professora Jane Sélia dos Reis Coimbra, pela orientação, confiança, incentivo e apoio
durante todo o mestrado. Ressalto a minha admiração e agradeço pela oportunidade, que
me fez crescer bastante tanto pessoal como profissionalmente.
Ao professor e co-orientador Luis Antônio Minim, pela orientação e incentivo
oferecidos.
Ao mestre e amigo Edwin, pelos conselhos, prestatividade, incentivo e por me fazer
entender o que representa a pesquisa científica.
À Rita, pela amizade e pela grande ajuda durante esse dois anos de mestrado.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Processos de Separação (LPS): Bruno, Omar,
Paulo Sérgio, Oscar, Luiz Fernando, Fabíola, Tininha, Rafael, Gisele, Roberta, Tarliane,
Regina, Marcelo, Guilherme, Simone, Rosana e Daniela.
Aos amigos da turma de 2000 da Engenharia de Alimentos: Marlus, Bruno, Thiago,
Vanessa, Igor, Ruither, Paulo Henrique, Roberta, Jackson, Sartori, Silvia e Wellington.
Aos alunos de MAT106 (2007-I), TAL475 (2006-II), TAL488 (2006-I) e TAL492
(2005-II), pelo aprendizado desenvolvido em cada dia de aula e pela oportunidade a
mim concedida de fazer aquilo que mais gosto na vida.
Aos funcionários do DTA e do Departamento de Matemática.
E a todos os amigos que de alguma forma contribuíram neste trabalho e não foram aqui
citados, meus sinceros agradecimentos.
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... vii
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ................................................................x
RESUMO ........................................................................................................................xi
ABSTRACT ................................................................................................................... xii
INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 3
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 3
CAPÍTULO 1.................................................................................................................... 4
1. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 4
1.1 GLICOMACROPEPTÍDEO (GMP) ................................................................... 4
1.2 SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS (SAB) ..................................................... 7
1.2.1 Diagrama de fases do sistema aquoso bifásico .............................................. 9
1.2.2 Variáveis que influenciam o sistema de duas fases aquosas ....................... 11
1.2.3 Constituintes das fases ................................................................................. 14
1.3 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR (CEM) ...................... 15
2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 18
2.1 Reagentes e Equipamentos................................................................................. 18
2.2 Metodologia ....................................................................................................... 19
2.2.1 Escolha dos sistemas de trabalho................................................................. 19
2.2.2 Preparo dos sistemas aquosos bifásicos....................................................... 19
2.2.3 Medida do volume das fases ........................................................................ 20
2.2.4 Cálculo do coeficiente de partição............................................................... 20
2.2.5 Quantificação da proteína presente nas fases .............................................. 21
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 21
CAPÍTULO 2 - Partitioning of glycomacropeptide in aqueous two-phase systems:
influence of type of salt and temperature ....................................................................... 28
ABSTRACT .................................................................................................................... 28
INTRODUCTION ............................................................................................................. 29
vi
MATERIALS AND METHODS .......................................................................................... 30
Chemicals................................................................................................................. 30
Preparation of the aqueous two-phase systems........................................................ 30
Determination of the protein partition coefficient (K
p
) ........................................... 31
Determination of thermodynamic functions associated with protein partitioning... 31
Protein quantification ............................................................................................... 32
RESULTS AND DISCUSSION ........................................................................................... 33
Effect of phase-forming salt on protein separation .................................................. 33
Effect of the temperature on protein partitioning..................................................... 36
CONCLUSIONS .............................................................................................................. 41
REFERENCES................................................................................................................. 41
CAPÍTULO 3 - Partitioning features of glycomacropeptide in aqueous two-phase
systems compound by polyethylene glycol-sodium citrate ............................................ 44
ABSTRACT .................................................................................................................... 44
INTRODUCTION ............................................................................................................. 45
MATERIALS AND METHODS .......................................................................................... 46
Chemicals................................................................................................................. 46
Preparation of the aqueous two-phase systems........................................................ 46
Determination of the protein partition coefficient (K
p
) ........................................... 47
Protein quantification ............................................................................................... 47
RESULTS AND DISCUSSION ........................................................................................... 48
Effect of the addition of sodium chloride and pH on protein partitioning............... 48
Influence of PEG molar mass, tie-lie length and temperature on the protein
partitioning ............................................................................................................... 51
CONCLUSIONS .............................................................................................................. 55
REFERENCES................................................................................................................. 55
vii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1.................................................................................................................... 4
Figura 1. Diagrama de fases genérico para um sistema contendo PEG e sal, expresso em
coordenadas retangulares. ............................................................................................... 10
CAPÍTULO 2 - PARTITIONING OF GLYCOMACROPEPTIDE IN AQUEOUS
TWO-PHASE SYSTEMS: INFLUENCE OF TYPE OF SALT AND TEMPERATURE
........................................................................................................................................ 28
Figure 1. Dependence of the salt concentration difference between the top and bottom
phases for the GMP partition. Sodium citrate (?), sodium sulfate (?), potassium
phosphate (?), and lithium sulfate (?).Temperature: 298.15 K. .................................... 35
Figure 2. Van’t Hoff plots. Temperature effect of the partition equilibrium of GMP at
different concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?),
and 18 mass % PEG1500 (?). pH 8.0. ............................................................................ 37
Figure 3. Enthalpy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0. ........................................................................................ 39
Figure 4. Entropy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0. ........................................................................................ 39
Figure 5. Free energy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG: 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0. ........................................................................................ 40
CAPÍTULO 3 - PARTITIONING FEATURES OF GLYCOMACROPEPTIDE IN
AQUEOUS TWO-PHASE SYSTEMS COMPOUND BY POLYETHYLENE
GLYCOL-SODIUM CITRATE ..................................................................................... 44
Figure 1. Influence of pH on GMP partitioning in PEG1500-sodium citrate ATPS at
different NaCl concentrations. 0.0 M (?), 0.1 M (?), and 0.5 M (?). Temperature:
298.15 K. ........................................................................................................................ 50
Figure 2. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG1500-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0. ........................................................................................ 53
viii
Figure 3. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG2000-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0. ........................................................................................ 54
Figure 4. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG4000-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0. ........................................................................................ 54
ix
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 - PARTITIONING OF GLYCOMACROPEPTIDE IN AQUEOUS
TWO-PHASE SYSTEMS: INFLUENCE OF TYPE OF SALT AND TEMPERATURE
........................................................................................................................................ 28
Table I. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP in
each ATPS formed for PEG1500-salt, at different compositions of the assayed ATPS.
Medium conditions: Temperature 298.15 K and pH 7.0. ............................................... 34
Table II. Adjusted parameters of the Van’t Hoff equation. ............................................ 38
Table III. Thermodynamic parameters for the partitioning of GMP in ATPS, at different
PEG concentrations. ....................................................................................................... 38
CAPÍTULO 3 - PARTITIONING FEATURES OF GLYCOMACROPEPTIDE IN
AQUEOUS TWO-PHASE SYSTEMS COMPOUND BY POLYETHYLENE
GLYCOL-SODIUM CITRATE ..................................................................................... 44
Table I. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP in
each system formed for PEG1500 (14.00 mass %) and sodium citrate (14.89 mass %), at
different pH values and NaCl concentration of the assayed ATPS. Medium condition:
Temperature 298.15 K. ................................................................................................... 50
Table II. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG1500-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0. ................................................................................................... 52
Table III. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG2000-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0 .................................................................................................... 52
Table IV. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG4000-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0. ................................................................................................... 53
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
GMP - Glicomacropeptídeo;
SAB - Sistemas Aquosos Bifásicos;
CMP – Caseinomacropeptídeo;
CDP - Peptídeo Derivado da Caseína;
pI - Ponto Isoelétrico;
BSA - Albumina do Soro Bovino;
PEG – Polietilenoglicol;
K
p
- Coeficiente de Partição
[P]
sup
- Concentração de equilíbrio da proteína particionada nas fase superior;
[P]
inf
- Concentração de equilíbrio da proteína particionada nas fase inferior;
TLL - Comprimento da Linha de Amarração;
[? PEG] - Diferença de concentração de PEG nas fases superior e inferior expressa em
% em massa;
[? Sal] - Diferença de concentração de sal nas fases superior e inferior expressa em %
em massa;
PEO - Poli (óxido de etileno);
Li
2
SO
4
- Sulfato de Lítio;
K
2
HPO
4
- Fosfato de Potássio Dibásico;
KH
2
PO
4
- Fosfato de Potássio Monobásico;
Na
2
SO
4
-
Sulfato de Sódio;
C
6
H
5
Na
3
O
7
- Citrato de Sódio;
CEM - Cromatografia de Exclusão Molecular;
y - Recuperação Teórica da Proteína na Fase Superior (%);
V
S
- Volume da fase superior;
V
I
- Volume da fase inferior.
xi
RESUMO
DA SILVA, César Augusto Sodré, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, julho de
2007. Partição do glicomacropeptídeo usando sistemas aquosos bifásicos.
Orientadora: Jane Sélia dos Reis Coimbra. Co-orientadores: Luis Henrique Mendes
da Silva, Luis Antônio Minim e Edwin Elard García Rojas.
Neste trabalho, estudou-se a aplicação da extração líquido-líquido para a
separação do glicomacropeptídeo (GMP), utilizando sistemas aquosos bifásicos (SAB)
compostos por polietileno glicol (PEG) e um sal inorgânico. Esta técnica pode ser usada
para purificação de biocompostos em larga escala pela possibilidade de partição seletiva
com altos rendimentos. O comportamento da partição do GMP em SAB foi verificado
estudando a influência do tipo de sal (fosfato de potássio, citrato de sódio, sulfato de
lítio e sulfato de sódio), massa molar do polímero (PEG1500, PEG2000 e PEG4000),
adição de cloreto de sódio, valor de pH, concentração das fases e temperatura do
sistema, a fim de se obter o melhor sistema para a separação da biomolécula. Nestes
ensaios foi obtido o coeficiente de partição do GMP entre a fase aquosa superior (PEG)
e a fase aquosa inferior (sal). Observou-se que a proteína migrou predominantemente
para a fase superior, rica em PEG, onde os contaminantes não protéicos presentes na
fase são o PEG e uma pequena quantidade de sal, que podem ser removidos da proteína
alvo por meio de uma técnica cromatográfica, como a cromatografia de exclusão
molecular (CEM). Entre os sistemas avaliados e em razão das características não-
tóxicas e biodegradáveis do citrato, o sistema de extração que proporcionou as melhores
condições foi o constituído por PEG1500 na concentração de 15 % em massa e citrato
de sódio na concentração de 18,91 % em massa, em pH 8,0 e na temperatura de 318,15
K. Foram encontrados valores de coeficientes de partição para esse sistema acima de 30,
sendo que aproximadamente 94,66 % do GMP foi recuperado na fase superior, o que
indica uma boa separação. Em adição, parâmetros termodinâmicos (? H
?
, ? S
?
, ? G
?
) em
função da temperatura do sistema, foram calculados para o sistema formado por
PEG1500 e citrato de sódio em diferentes concentrações de PEG. Os resultados
exibiram diferenças termodinâmicas para a partição do GMP nos diversos sistemas
avaliados. Este estudo mostrou claramente que o sucesso do uso do SAB para a
recuperação e purificação inicial do GMP.
xii
ABSTRACT
DA SILVA, César Augusto Sodré, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, July, 2007.
Partition of glycomacropeptide in aqueous two-phase systems. Adviser: Jane
Sélia dos Reis Coimbra. Co-advisers: Luis Henrique Mendes da Silva, Luis Antônio
Minim and Edwin Elard García Rojas.
In this work, separation of glycomacropeptide (GMP) was studied using liquid-
liquid extraction with aqueous two-phase systems (ATPS) composed by poly (ethylene
glycol) (PEG) and an inorganic salt. This technique is an advisable purification process
applied to large scale since it provides a selective partition with high yields. The
partition behavior of GMP in ATPS was investigated studying the influence of the type
of salt (potassium phosphate, sodium citrate, lithium sulfate or sodium sulfate), polymer
molar mass (PEG1500, PEG2000, and PEG4000), phase concentrations (tie line length),
sodium chloride addition, pH value, and temperature in the system in order to fit ratio of
system to the separation. The partition coefficient was defined as the ratio of GMP
concentration in the upper phase (PEG) and in the bottom phase (salt). It was observed
that the protein partitioned almost in the top PEG-rich phase, where the prevalent non-
protein contaminants are PEG and a little amount of the salt, which can easily be
removed from the target protein by means of size exclusion chromatography technique.
Among the systems analysed and due to citrates characteristics as a biodegravel and
nontoxic compound, the extraction conditions which provided the best results were:
PEG1500 with concentration of PEG of 15.00 mass % and sodium citrate with
concentration of 18.91 mass %; at pH 8.0 and temperature of 318.15 K. In this system
were found values of partition coefficient above 30 and approximately 94.66 % of GMP
was recovered in the top phase, what demonstrates a good separation. In addition,
thermodynamic parameters (?H
?
, ?S
?
, ?G
?
) as a function of temperature, were
calculated for the system PEG1500-sodium citrate at different PEG concentrations and
the results imply thermodynamic differences between partitioning of GMP in this
system. This study clearly showed that ATPS can be successfully used for recovery and
initial purification of GMP.
1
INTRODUÇÃO
O glicomacropeptídeo (GMP) é um dos peptídeos bioativos do soro, derivado da
caseína e resultante da produção de queijos pela via da renina, sendo sua concentração
estimada de 1,2 a 1,5 g/L. Entre as atividades biológicas e fisiológicas potenciais
relacionadas ao GMP têm-se: contribuir para reduzir desordens estomacais ao
possibilitar a regulação de respostas imunológicas bem como prevenir a azia por levar à
diminuição da secreção gástrica; minorar o risco de ataques cardíacos ao induzir à
inibição da agregação de plaquetas; diminuir o apetite ao estimular a liberação de
colecistoquina, um hormônio que promove a sensação de saciedade; inibir a adesão de
microrganismos em polímeros, sugerindo o uso do GMP como inibidor de placas
bacterianas e de cáries dentárias (ABD EL-SALAM et al, 1996; THOMÄ-
WORRINGER et al., 2006). Deve-se ressaltar também que a quantificação do GMP é,
atualmente, o indicador mais recomendável para detecção da adulteração de leite pela
adição de soro de queijo àquele e que sua estabilidade frente ao calor e sua solubilidade
em condições ácidas sugerem múltiplos usos em sistemas alimentícios. Diferentes
métodos para separação de GMP são descritos na literatura, sendo que a maior parte foi
desenvolvida em escala de laboratório ou encontra-se protegida por patentes.
Atualmente, dois métodos de separação do GMP do soro de queijo têm sido
empregados, sendo que ambos utilizam a ultrafiltração, portanto com custo elevado e
difíceis de escalonar. Diante do seu elevado valor nutricional e funcional e do potencial
de aplicações médicas e terapêuticas às quais o GMP se adequa, fica explicitado o
interesse no desenvolvimento de novas técnicas para a recuperação e purificação de
GMP do soro de queijo doce.
Nos últimos anos a extração líquido-líquido usando sistemas aquosos bifásicos
(SAB) tem adquirido importância e crescente sucesso para a concentração, isolamento e
separação de proteínas. Os SAB são constituídos por duas fases imiscíveis, que
promovem a separação de biomoléculas, em condições amenas e em um ambiente
adequado, de forma que sejam preservadas as suas principais características. A alta
concentração de água, de 65 % a 90 % em massa, em tais sistemas favorece a
estabilidade das proteínas durante a separação, quando comparados com sistemas de
extração líquida tradicionais, compostos com solventes orgânicos. Apresentam também
vantagens como rapidez da separação, baixo custo e possibilidade de aplicação em
2
grande escala. Têm sido importante ferramenta na partição e/ou concentração de
compostos como células animais ou vegetais, microorganismos, fungos e seus esporos,
cloroplastos, mitocôndrias, membrana vesicular, enzimas, proteínas, ácidos nucléicos,
vírus, metais, entre outros (ZASLAVSKY, 1995; ALBERTSSON, 1986).
No presente trabalho foram determinadas as melhores condições de separação do
glicomacropeptídeo do soro usando sistemas aquosos bifásicos compostos por
polímeros e sais, em função da massa molar do polímero e de sua concentração, do tipo
de sal, da temperatura e do pH do sistema. O GMP foi quantificado com elevado grau
de rendimento pelo processo de extração líquida com sistemas aquosos bifásicos.
3
OBJETIVO GERAL
• Analisar a viabilidade técnica do emprego da extração líquido-líquido com sistemas
aquosos bifásicos, como uma alternativa à separação de glicomacropeptídeo do soro
de queijo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar as condições ótimas de separação do glicomacropeptídeo do soro usando
sistemas aquosos bifásicos compostos por polímeros e sais.
• Estudar a influência do tipo de sal formador de sistema aquoso bifásico (citrato de
sódio, fosfato de potássio, sulfato de lítio e sulfato de sódio) e de sua concentração,
em função da temperatura do sistema sobre a partição do glicomacropeptídeo
utilizando sistema aquoso bifásico composto por PEG1500 e sal.
• Avaliar a influência da massa molar do polietilenoglicol (PEG1500, PEG2000 e
PEG4000) e da concentração do PEG, em função do pH, comprimento da linha de
amarração, temperatura e adição de NaCl sobre a partição do glicomacropeptídeo
utilizando sistema aquoso bifásico composto por PEG e citrato de sódio.
CAPÍTULO 1
1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1 GLICOMACROPEPTÍDEO (GMP)
As proteínas do soro correspondem a 20 % das proteínas do leite sendo que a α-
lactoalbumina, a β-lactoglobulina e o glicomacropeptídeo (GMP) representam cerca de
90 % do total das proteínas do soro. No soro são encontradas também a albumina de
soro bovino, imunoglogulinas, protease-petonas, lactoferrina, lactoperoxidase e outras
enzimas (MORR e HÁ, 1993).
Quando o leite é submetido ao tratamento com a enzima quimosima durante a
fabricação de queijo, a proteína κ-caseína é hidrolisada em dois peptídeos. A clivagem
ocorre entre os aminoácidos 105 (Phe) e 106 (Met), liberando um peptídeo C-terminal
solúvel de 6,8 kDa que é o GMP e um peptídeo insolúvel, denominado para-κ-caseína
N-terminal de 12 kDa (DZIUBA e MINKIEWICZ, 1996; ABD EL-SALAM et al,
1996). A ?-caseína bovina apresenta duas variantes genéticas, sendo que a distinção
entre elas está presente na região do GMP, consequentemente é de se esperar que o
GMP contenha dois grupos de peptídeos, aqueles originados da ?-caseína A (GMPA) e
aqueles da variante B (GMPB) que diferem em resíduos de aminoácidos treonina ou
isoleucina na posição 136 e no resíduo de ácido aspártico ou alanina na posição 148.
(TOLKACH e KULOZIK, 2005). O GMP está presente em quantidade significante no
soro de queijo feito por coagulação enzimática, estudos recentes estimam que o GMP
constitua entre 15 a 25 % das proteínas do soro (ABD EL-SALAM et al, 1996).
O GMP também é referido como caseinomacropeptídeo (CMP), ou como um
peptídeo derivado da caseína (CDP). O GMP consiste de uma cadeia de 64
aminoácidos, caracterizada pela ausência de aminoácidos aromáticos,
consequentemente não apresentando absorção a 280 nm e podendo ser detectada
somente entre 217 nm a 250 nm (ABD EL-SALAM et al, 1996). Por ter mais do que
quatro resíduos de açúcar por molécula ele apresenta um caráter parcialmente
hidrofílico, enquanto sua cadeia de peptídeos possui mais propriedades hidrofóbicas. É
um peptídeo ácido com pI entre 4,0 e 5,0, altamente solúvel e estável ao calor
(THOMÄ-WORRINGER et al., 2006). Praticamente quase que todo conteúdo de ácido
siálico presente na caseína está presente no GMP, consequentemente a medida do teor
5
de desse ácido possibilita a detecção de soro de queijo adicionado fraudulentamente ao
leite (DRACZ, 1996).
O interesse na purificação do GMP do soro de queijo tem sua origem tanto no
seu elevado valor nutricional e funcional quanto no potencial de aplicações médico-
terapêuticas às quais se adequa. Entre as aplicações potenciais do GMP está à redução
da incidência de cáries dentarias. MALKOSKI et al. (2001) demonstraram que o GMP
inibiu o crescimento dos patógenos orais Streptococcus mutans, Porphynomonas
gingivalis e Escherichia coli, responsáveis pelo desenvolvimento de cáries.
Além disso, estudos mostraram que o GMP tem efeito na secreção gástrica,
promovendo a atividade de crescimento da bifidobacteria, e modificação do crescimento
da bactéria do ácido lático (ABD EL-SALAM et al., 1996). Estudos de sua habilidade
para nutrir a microflora intestinal saudável apontam-no como um ótimo potencial para
uso como prebiótico em alimentos (IDOTA et al., 1994). Estudos adicionais têm
mostrado que o GMP reduz o apetite, fazendo dele um componente apropriado em
produtos utilizados no controle de peso (YVON et al., 1994). TAKAHASHI et al.
(1992) relataram a obtenção de um alimento hipoalergêncio a base de GMP, com
elevado valor nutritivo, facilmente absorvido e digerido e com ação anti-inflamatória.
KELLEHER et al. (2003) verificaram que Macacos Rhesus (Macaca mulatta), recém
nascidos, alimentados com formulações lácteas fortificadas com GMP e a-
lactoalbumina não apresentaram efeitos adversos nutricionais em relação ao
crescimento dessas espécies. Além disso, houve um ganho na absorção de zinco, ferro e
cobre em cada uma das fórmulas. Caso esses resultados sejam semelhantes em
humanos, fórmulas industriais poderiam ser desenvolvidas com uma redução nas
concentrações de minerais traços, protegendo dessa maneira os recém nascidos de
efeitos adversos causados pelo consumo excessivo de minerais.
O GMP apresenta diferentes propriedades funcionais. As vantagens nutricionais
do GMP conduzem para o desenvolvimento de alimentos infantis e resultam na
incorporação do GMP em inúmeros modelos alimentícios. Algumas das propriedades
inerentes deste peptídeo foram descritas por SMITHERS et al. (1991) e MARSHALL
(1991), esses autores estudaram as propriedades funcionais de formação de espuma e
gel em soluções aquosas de GMP como também os efeitos da incorporação destes em
inúmeros alimentos, incluindo merengues, biscoitos e geléias de frutas. MARSHALL
(1991) estudou com mais detalhes as propriedades de espumabilidade e estabilidade de
espuma, além disso, ele encontrou uma forma atrativa de fortificar geléias de frutas com
6
GMP, obtendo dessa forma uma fonte protéica baixa em fenilalanina ideal para os
individuos fenilcetonúricos.
Diferentes métodos para separação de GMP são descritos na literatura, sendo
que a maior parte foi desenvolvida em escala de laboratório ou encontra-se protegida
por patentes. Atualmente, dois métodos de separação do GMP do soro de queijo têm
sido empregados, sendo que ambos utilizam a ultrafiltração.
O primeiro método descrito por KAWASAKI et al. (1996) é baseado na
habilidade do GMP em estabelecer ligações não covalentes formando dessa maneira
polímeros com massa molecular maiores do que 50 kDa em pH 7,0, com posterior
dissociação em condições ácidas. A forma dissociada do GMP permeia através de uma
membrana MWCO 20 kDa a 50 kDa em pH 3,5, enquanto a maioria das proteínas do
soro como, por exemplo, a ß-lactoglobulina, a a-lactoalbumina, a imunoglobina e
albumina do soro bovino (BSA) são retidas nessa membrana. Depois o pH é ajustado
para 7,0 e o filtrado contendo o GMP pode ser concentrado por meio da mesma
membrana. Esta técnica garante uma boa separação do GMP de outras proteínas nativas
do soro, mas devido à baixa taxa de permeabilidade do GMP, pelo menos duas etapas
de diafiltração são necessárias para obter uma fração com alto grau de pureza e
rendimento.
O segundo método descrito por MARTÍN-DIANA e FONTECHA (2002) utiliza
da alta estabilidade térmica do GMP frente às demais proteínas do soro. De acordo com
essa técnica, é feito um tratamento térmico no soro de queijo a 90 ºC por 1 hora,
deixando uma completa desnaturação e agregação das proteínas do soro. Essas proteínas
desnaturadas são removidas por centrifugação a 5200 g a 4 ºC por 15 minutos e o
sobrenadante contendo o GMP pode ser concentrado por ultrafiltração com uma
membrana MWCO 10 kDa depois de ajustado o pH para 7,0. Este método garante um
bom rendimento, mas as proteínas do soro perdem a sua funcionalidade devido a
desnaturação
Para a quantificação do GMP os métodos propostos usam normalmente a
cromatografia de fase reversa, a cromatografia de troca iônica e a cromatografia de
exclusão molecular (MOLLÉ e LÉONIL, 2005; BRAMANTI et al., 2003; ABD EL-
SALAM et al., 1996; DZIUBA e MINKIEWICZ, 1996; OLIEMAN e RIEL, 1989;
BRANDÃO et al., 1988; HOOYDONK e OLIEMAN, 1982). Outro método utilizado é
a eletroforese capilar (MIRALLES et al., 2001).
7
1.2 SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS (SAB)
A extração com sistemas aquosos bifásicos permite isolar biomoléculas de
misturas complexas e oferece vantagens, como curto tempo de processamento e fácil
aumento de escala, além de usar um meio adequado para o trabalho com compostos de
origem biológica. As fases da maior parte dos SAB são constituídas por 70 % a 90 % de
água, o que favorece a estabilidade das biomoléculas durante a separação, quando se
compara com sistemas tradicionais, compostos com solventes orgânicos. Recentes
melhorias da técnica, com o emprego de novos SAB compostos por polímero e sal,
polímero e polímero, permitem o seu uso em nível industrial (ALBERTSSON, 1986;
BROOKS et al., 1994; ZASLAVSKY, 1995).
A utilização dos sistemas aquosos bifásicos na partição e purificação de
materiais biológicos foi inicialmente proposta por Albertsson em meados da década de
50 (ALBERTSSON, 1986). Nestes casos, a extração através de SAB é adequada para
substituir a extração convencional por solventes orgânicos, pois, pelo fato do solvente
ser a água, são ambientalmente seguros e permitem a separação de partículas sensíveis à
desnaturação em outros solventes (GUSTAFSSON et al, 1986). Desde então, as
pesquisas nesta área têm-se aprofundado, tornando a utilização dos SAB importante
ferramenta na partição e, ou concentração de compostos como células animais ou
vegetais, microorganismos, fungos e seus esporos, cloroplastos, mitocôndrias,
membrana vesicular, enzimas, proteínas, ácidos nucléicos, vírus, metais, entre outros
(HATTI-KAUL, 2001).
Os SAB são, então, sistemas formados por duas fases líquidas que se encontram
em equilíbrio termodinâmico. As fases são regiões que possuem propriedades
termodinâmicas intensivas diferentes, como densidade, índice de refração e composição.
Mas como as duas fases dos SAB estão em equilíbrio, nenhuma propriedade
termodinâmica está variando em uma dimensão temporal, ou ainda, não há troca
resultante de matéria entre as fases. Estas fases estão separadas por uma interface que é
a região na qual as propriedades termodinâmicas intensivas de cada fase transitam para
valores diferentes, sempre tendendo para o valor daquela propriedade no seio da outra
fase em equilíbrio (CARVALHO, 2004).
Em princípio, todos os tipos de sistemas aquosos bifásicos podem ser
empregados na separação de biomoléculas. Mas, dentre os diferentes sistemas, o mais
estudado é aquele composto por polietilenoglicol (PEG), dextrana e água. Os sistemas
8
PEG-dextrana e PEG-sais são normalmente usados também por se encontrarem
disponíveis no mercado em grandes quantidades e não serem tóxicos, mas para uso em
escala industrial, a dextrana apresenta custo muito alto. Os SAB formados por polímero-
sal-água apresentam vantagens em relação aos compostos por polímero-polímero-água
como baixo custo, menor viscosidade, maior viscosidade e menor tempo de separação
de fases. Assim, os sistemas PEG-sal têm sido usados para a extração em larga escala.
Estes sistemas são formados a temperatura ambiente, sendo a fase superior rica em PEG
e a fase inferior rica em sal, a separação de fases é atingida mais rapidamente devido á
menor densidade de uma das fases, o que facilita o uso de sistemas polímero-sal em
aplicações industriais (SALABAT, 2001; GIRALDO-ZUÑIGA, 2000; HUSTED et al.,
1985).
Materiais biológicos adicionados em SAB distribuem-se entre as duas fases, sem
perda da atividade biológica. A relação entre as concentrações de certa biomolécula nas
fases superior e inferior do SAB define o coeficiente de partição (K
p
) em sistemas
aquosos (ALBERTSSON, 1986), o K
p
é definido como:
sup
inf
[]
[]
p
P
K
P
=
(1)
onde [P]
sup
e [P]
inf
são as concentrações de equilíbrio da proteína particionada nas fases
ricas em PEG-(superior) e salina-(inferior), respectivamente. Entre as relações capazes
de expressar o coeficiente de partição pode ser citada, por exemplo, segundo
DIAMOND e HSU (1989) a expressão:
pambest
KKK
=+ (2)
em que K
amb
e K
est
representam, as contribuições dos fatores ambiental e de ordem
estrutural respectivamente. Dentre os fatores ambientais estão consideradas
propriedades do SAB, como tipo e concentração de sais, tipo, concentração e massa
molar do polímero, pH, temperatura e ligantes específicos. ALBERTSSON (1986)
propôs o seguinte modelo mais simples para o cálculo de K
p
, desmembrando-o em:
pel.hidrof.hifil.conf.lig.
lnK=lnK+lnK+lnK+ln K+lnK
(3)
em que os índices el., hidrof., hifil., conf. e lig. referem-se às contribuições
eletrostáticas, hidrofóbicas, hidrofílicas, de conformação e de interação com os ligantes,
respectivamente.
9
A base da partição em SAB é a distribuição seletiva de compostos entre as duas
fases. Esta distribuição é governada por um grande número de fatores, por exemplo:
natureza e tamanho da partícula alvo; constituição, tamanho e estrutura molecular do
polímero; temperatura; natureza do eletrólito e pH do sistema bifásico (ALBERTSSON,
1986). Por isto, a predição e a interpretação da partição de biopartículas em sistemas
aquosos bifásicos é uma difícil tarefa, embora a manipulação das propriedades do
sistema tornando predominante um determinado tipo de interação venha a ser uma
forma de controlar a partição (HATTI-KAUL, 2001). Daí a importância de estudar
diferentes SAB, ampliando e facilitando a utilização dos mesmos na extração líquido-
líquido.
1.2.1 Diagrama de fases do sistema aquoso bifásico
Para a utilização de SAB é necessário o conhecimento do comportamento das
fases nos sistemas. Para isto são efetuados os diagramas de fases para os componentes,
nos quais as composições dos constituintes para a separação das fases são determinadas.
A Figura 1 apresenta um exemplo de diagrama de fases mostrando a composição das
fases em equilíbrio. Convencionalmente, os componentes presentes em maior
quantidade nas fases inferior e superior são representados no eixo das abscissas e das
ordenadas, respectivamente. A quantidade de água é calculada por diferença. A curva
que divide a região em duas fases é chamada de curva binodal ou curva de equilíbrio. A
região acima da curva binodal é chamada de bifásica e a abaixo, monofásica.
As linhas são chamadas “tie-lines” ou linhas de amarração e qualquer ponto
sobre ela representa um sistema com a mesma composição, porém com diferentes
volumes das fases superior e inferior. Para se estudar a separação de fases em SAB, faz-
se uso de uma medida numérica de referência para a composição das fases. O
comprimento da linha de amarração, usualmente referido como TLL, é um valor
empírico adequado para a utilização como tal medida. O valor TLL pode ser calculado,
a partir das concentrações dos componentes nas fases, pela equação:
22
[][]
TLLPEGSal
=∆+∆ (4)
onde [? PEG] e [? Sal] correspondem a diferença de concentração de PEG e sal nas
fases superior e inferior expressa em % em massa, respectivamente. Outra característica
importante dos diagramas de fases é a inclinação da linha de amarração, usualmente
definido como STL. O STL é uma medida de como a composição das fases pode variar
10
com a alteração de uma propriedade físico-química, como a temperatura e a massa
molar, por exemplo, (CARVALHO, 2004). O valor da inclinação pode ser calculado
por:
PEG
STL
Sal
∆
=
∆
(5)
onde [? PEG] e [? Sal] foram definidas acima.
Outra particularidade de um diagrama de fases é o ponto crítico (Pc). O ponto crítico é
aquele no qual as propriedades físico-químicas (composição e volume, dentre outras)
das duas fases são teoricamente iguais (ALBERTSSON, 1986). Quanto mais a
composição do sistema se aproxima do ponto crítico, menor é a diferença entre as fases,
ou seja, no ponto crítico as composições e os volumes entre as fases teoricamente são
iguais. No entanto, nas proximidades do ponto crítico, pequenas alterações na
composição dos sistemas provocam drásticas mudanças, levando o sistema de uma para
duas fases e vice-versa (ALBERTSSON, 1986).
Figura 1. Diagrama de fases genérico para um sistema contendo PEG e sal, expresso
em coordenadas retangulares.
11
1.2.2 Variáveis que influenciam o sistema aquoso bifásico
As variáveis que influenciam a partição de biomoléculas entre duas fases podem
ser classificados como variáveis inerentes ao próprio sistema (por exemplo:
componentes do sistema, massa molar do polímero, concentração do polímero ou do sal,
pH e temperatura) ou à proteína alvo (por exemplo: hidrofobicidade, distribuição de
cargas, ponto isoelétrico e massa molar) (COSTA et al., 1998; COSTA et al., 2000;
OLIVEIRA et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2003; TUBIO et al., 2004). Os mecanismos
que governam a partição de materiais biológicos não são ainda entendidos por
completo, sabe-se que o coeficiente de partição é resultante de forças de van de Walls,
hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e interações iônicas das biomoléculas com as fases
do sistema (GÜNDÜZ e KORKMAZ, 2000).
1.2.2.1 Massa molar e concentração do polímero
Em geral, um aumento da massa molar do polímero do sistema de duas fases
aquosas, para uma determinada composição de fases, diminui a partição de material
biológico para a fase rica em polímero. Quanto maior for a massa molar do polímero,
menor é o volume de solvente disponível, o que implica em uma diminuição de
solubilidade das proteínas na fase rica em polímero e conseqüentemente uma
diminuição do coeficiente de partição (ALBERTSSON, 1986). O efeito da massa molar
dos polímeros por sua vez depende da massa molar da biomolécula a ser separada. No
caso de proteínas, aquelas com massas molares maiores são mais influenciadas pelas
mudanças na massa molar dos polímeros que as proteínas com pequena massa molar
(ASENJO, 1990). O PEG é capaz de excluir (teoria do volume excluído) as proteínas
sem desnaturação de acordo com o aumento de sua massa molar. O mesmo efeito não
pode ser observado quando as moléculas menores de proteínas são utilizadas
(SCHMIDT et al., 1994). A massa molar do polímero influencia na separação do
biomaterial por alteração do diagrama de fase (isto é, por influenciar a composição das
fases) e por mudança no número de interações polímero-proteína. Em geral, o aumento
na massa molar de um dos polímeros (em sistemas polímero e polímero) levará a uma
separação mais acentuada do material em outra fase. Entretanto, a magnitude desse
efeito decresce com o aumento da cadeia do polímero (ALBERTSON, 1986;
12
FORCINITI e HALL, 1991). Com relação à concentração do polímero, tem sido
demonstrado que o sistema de fases desloca-se em direção à região bifásica com o
aumento da concentração do polímero. A viscosidade das fases também aumenta com o
aumento na concentração do polímero e isto pode influenciar a partição da proteína alvo
(ASENJO, 1990; ALBERTSSON, 1986).
1.2.2.2 Tipo de cátion e pH
O pH altera as cargas da superfície das proteínas e, conseqüentemente, o seu
coeficiente de partição (LEHNINGER, 1976). Um exemplo clássico é a desnaturação de
proteínas devido à redução de pH. A distribuição de proteínas desnaturadas em soluções
líquidas é diferente daquela obtida em seu estado natural, por apresentarem área
superficial significativamente maior que na forma nativa. Contudo, a influência da carga
da biomolécula depende muito do tipo de sal presente no sistema, uma vez que
diferentes sais dão origem a diferentes potenciais elétricos entre as fases. Mudanças no
pH podem também induzir mudanças conformacionais na estrutura das proteínas,
causando mudança em seus comportamentos de separação. Em condições extremas de
pH é possível que ocorra a desnaturação das proteínas. Geralmente, a partição de
proteínas desnaturadas é diferente da partição das mesmas proteínas na forma nativa, o
que pode ser atribuído não só a maior área superficial da forma desnaturada, mas
também ao fato da superfície exposta desta ser muito mais hidrofóbica
(ALBERTSSON, 1986). Como regra geral às proteínas carregadas mais negativamente
(nos casos em que o pH é superior ao pI) tem maior afinidade pela fase superior que é
rica em PEG.
1.2.2.3 Tipo e concentração de sal
A composição do sal é outra variável de suma importância na partição de todas as
espécies de moléculas e partículas celulares (COSTA et al., 1998). Sais que possuem
distribuição diferenciada entre as duas fases são importantes para o sistema, pois eles
terão grande influência na diferença de potencial elétrico entre as fases. A adição de
sais, mesmo que em concentrações milimolares, influencia fortemente a partição de
materiais eletricamente carregados. Embora os sais se distribuam quase que igualmente
entre as fases, existem pequenas diferenças nos coeficientes de partição de diferentes
13
sais, o que significa que diferentes íons possuem diferentes afinidades pelas fases,
criando uma diferença de potencial elétrico entre as fases, que por sua vez direciona a
partição de materiais biológicos carregados (SARUBBO, 2000). A adição de sais, tais
como NaCl, em um sistema PEG e dextrana tende a diminuir o coeficiente de partição
das proteínas carregadas negativamente e tende a aumentar o coeficiente de partição das
proteínas carregadas positivamente. A magnitude do efeito aumenta na seguinte ordem:
SO
4
-2
< F
-
< Cl
-
< I
-
< NH
4
+
< Na
+
< K
+
(CASCONE et al., 1991; SCHIMIDT et al.,
1996).
1.2.2-4 Temperatura
A influência da temperatura é bastante complexa devido ao seu efeito na
composição das fases em equilíbrio, assim como a alteração da estrutura da biomolécula
e desnaturação (SARUBBO, 2000). Geralmente, para baixas temperaturas (menores que
20 °C) a curva binodal desloca-se em direção às baixas concentrações dos componentes
que formam as fases, resultando no aumento do comprimento das linhas de amarração.
Os sistemas de fases próximos do ponto crítico podem ser mais influenciados pela
mudança de temperatura devido à sua instabilidade, quando a curva binodal é deslocada,
podendo assim o sistema passa facilmente para a região monofásica (BAMBERGER et
al., 1985; TJERNELD et al., 1990). O efeito da temperatura varia de acordo com o tipo
de sistema, polímero e polímero ou polímero e sal. Para o sistema PEG e dextrana, foi
constatada que com o aumento da temperatura era necessária uma concentração maior
dos polímeros para a separação das fases. Neste caso, para que a separação das fases
seja favorecida, deve-se trabalhar em temperaturas inferiores à ambiente. Já para PEG e
sal, ocorre justamente o contrário, pois em temperaturas maiores ou próximas à
ambiente a separação das fases do sistema é facilitada. Foi observado também para o
sistema PEG e sal, que o aumento da temperatura favorece o aumento da concentração
de PEG na fase superior do sistema e conseqüentemente ocorre uma redução da
concentração do polímero na fase inferior (FORCINITI e HALL, 1991; ZASLAVSKY,
1995). Alguns trabalhos relatam um aumento do coeficiente de partição com a
temperatura (JOHANSSON et al., 1984); outros que não há relação entre o coeficiente
de partição e a temperatura (TJERNELD et al., 1985), demonstrando a necessidade de
estudos mais aprofundados para se esclarecer o efeito deste parâmetro sobre a partição.
14
1.2.3 Constituintes das fases
Polietilenoglicol
O polietilenoglicol é um composto de grande importância para as áreas
biomédicas e de biomateriais (LI, 2001). É produzido mundialmente em grandes
quantidades e com massas molares variando de poucas centenas a milhares de Daltons,
sendo obtido a partir da ligação de polímeros de oxietileno de massa molar menor que
40000 g mol
-1
com metóxido de sódio ou hidróxido alcalino. A designação PEG é usada
para compostos de baixa massa molar (abaixo 20000 g mol
-1
) e a designação PEO poli
(óxido de etileno) é restrito para compostos de altas massas molares (maiores que 20000
g mol
-1
). Os PEGs com massas molares menores que 1000 g mol
-1
são fornecidos na
forma de soluções incolores estáveis ou pastas. Os de massas molares elevadas, acima
de 1000 g mol
-1
, são encontrados na forma de pó ou flocos brancos. Os PEGs podem ser
estocados à temperatura ambiente, embora a 4 °C a ocorrência de oxidação em soluções
seja retardada (RIBEIRO, 2001). A utilização do PEG é de grande interesse na
biotecnologia principalmente por excluir, em ambiente aquoso, outros polímeros de sua
vizinhança, não se solubilizando com eles. Por serem compostos biodegradáveis e
atóxicos, a descarga de PEG não é problemática para o meio ambiente. O PEG possui
uma variedade de propriedades pertinentes para aplicações biomédicas, são elas:
insolubilidade em água a elevadas temperaturas, forma complexos com cátions
metálicos, alta mobilidade com grande poder de volume excluído em água, agente
precipitante de proteínas e ácidos nucléicos. Vale ressaltar que na indústria de
alimentos, é regulamentada a sua utilização como veículo em adoçantes de mesa
(Portaria nº 38, de 13 de janeiro de 1998) e em suplementos vitamínicos e ou minerais
(Resolução - RDC nº 2, de 2 de janeiro de 2001).
Sais
O sulfato de lítio (Li
2
SO
4
) é um componente de interesse tecnológico com
aplicações na detecção de radiação a laser, como elemento ótico de transmissão de
imagens, na fabricação de cristais de alta resistência e na indústria farmacêutica. A
solubilidade desse sal em água a 18 °C é de 35,64 g/100 mL. Apresenta altos valores de
condutividade iônica, em elevadas temperaturas, o que torna possível a sua aplicação na
armazenagem de energia e em sistemas de conversão. O sulfato de lítio pode ser
15
utilizado na recuperação de soluções com a adição de agentes precipitantes, como anti-
solventes, em função da sua solubilidade invertida e da pequena variação da
solubilidade com a temperatura. Esta técnica é uma alternativa para a recuperação deste
sal visando substituir a precipitação por congelamento e evaporação (TABOADA,
2002).
O fosfato de potássio dibásico (K
2
HPO
4
)
é branco, higroscópico, solúvel em
água e ligeiramente solúvel em álcool. Pode ser convertido em pirofosfato por ignição.
A solução aquosa formada com este sal é ligeiramente alcalina (pH entre 8,7 e 9,3
quando em solução aquosa de concentração de 50 g/L). A solubilidade em água a 20 °C
é igual a 160 g/100 mL. O fosfato de potássio monobásico (KH
2
PO
4
) também possui a
coloração branca e é granulado. Apresenta solubilidade em água igual a 22,2 g/100 mL
a 20 °C. É insolúvel em álcool. Possui o pH entre 4,4 e 4,7 quando em solução aquosa
de concentração de 50 g/L (SIGMA-ALDRICH, 2001).
O sulfato de sódio (Na
2
SO
4
) é um sal branco, cristalino, com solubilidade em
água de 16,86 g/100 mL a 18 °C. Apresenta pH entre 5,2 e 9,2 a 20 °C quando em
solução de 50 g/L de sulfato de sódio em á
16
mas também a economia global do processo. O método clássico para aumentar a
produtividade é o de maximizar o uso da coluna utilizando maiores volumes da amostra
(RAHMS, 1993).
Para a purificação de proteínas são empregadas técnicas cromatográficas que não
alteram as características físico-químicas dos compostos, como, por exemplo, exclusão
molecular, troca iônica e hidrofobicidade. Na prática, a cromatografia de exclusão
molecular (CEM) é normalmente utilizada no final do processo de purificação visando
mudar a fase móvel por outra que possa ser volatilizada durante uma etapa posterior de
liofilização ou de concentração bem como para remover as moléculas contaminantes de
baixa massa molar como sais, polipropileno e detergentes não iônicos dentre outros
(FALLOW, 1993).
A técnica de CEM foi introduzida em 1959, com o nome de filtração gélica. É
um método cromatográfico capaz de separar os componentes de uma mistura com base
nos seus tamanhos moleculares (LOUGH et al, 1995). A remoção de compostos de
baixa massa molar é denominada de dessalinização mesmo que sais não estejam
envolvidos no processo. A dessalinização é a aplicação da CEM mais difundida no
processo de purificação de proteínas, sob condições que não desnaturem as proteínas.
De acordo com GARCIA et al. (2000), a característica peculiar da CEM em relação aos
outros tipos de cromatografia de partição é que as partículas que formam a fase
estacionária no leito cromatográfico são constituídas por um gel sem carga. Este gel
apresenta turgescência no mesmo solvente que atua como fase móvel através do leito.
As matrizes utilizadas na CEM são macromoléculas que tem grande afinidade pelo
solvente empregado. Estas matrizes apresentam intercruzamentos formando uma rede
tridimensional, tornando-as insolúveis. Ao entrarem em contato com o líquido absorvem
grandes quantidades do solvente devido à porosidade exibida.
Segundo COLLINS et al. (1997), os géis usados na CEM são, dentre outros, os
géis de dextrana (como os Shephadexes) e os polímeros de anidroglucose, produzidos
pela fermentação da sacarose por diferentes raças de Leuconostocus mesenteroides,
artificialmente tratados com epicloridrina (agente de cruzamento). Como os poros das
resinas são formados pelo intercruzamento das moléculas constituintes, quanto maior a
percentagem do agente de cruzamento menor o tamanho do poro. O gel de shephadex
apresenta elevado teor de hidroxilas, forte caráter hidrofílico, elevada turgescência em
água ou soluções aquosas e são estáveis entre pH 2 e 11. O limite de exclusão de massa
17
molar localiza-se entre (0,7 e 800) kDa, mas são susceptíveis a ataques fúngicos quando
hidratados.
Na CEM, a separação por grupos ocorre devido ao efeito estérico já que existe
uma diferenciação no acesso ao volume do poro do gel para moléculas de tamanhos
variados. Os compostos de baixas massas moleculares, como um sal, penetrarão no poro
e serão retidos, caso o seu tamanho seja muito pequeno se comparado com o do poro da
resina de filtração. Se as substâncias têm dimensões intermediárias somente penetrarão
uma parte do volume de poro podendo reduzir a eficiência do processo. No caso em que
o composto seja muito grande, como as proteínas, o mesmo será eluído através do
volume intersticial da coluna (PHARMACIA BIOTECH, 1998).
18
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho experimental foi realizado no Laboratório de Processos de Separação
(LPS) do Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA), da Universidade Federal
de Viçosa, Viçosa – MG.
2.1 Reagentes e Equipamentos
2.1.1 Reagentes
• Polietilenoglicol 1500 g mol
-1
(SYNTH, Brasil);
• Polietilenoglicol 2000 g mol
-1
(RIEDEL DE HAEN, Alemanha);
• Polietilenoglicol 4000 g mol
-1
(ISOFAR, Brasil);
• Fosfato de potássio (monobásico e dibásico, VETEC, Brasil);
• Sulfato de Sódio (ECIBRA, Brasil);
• Citrato de Sódio (SYNTH, Brasil);
• Sulfato de lítio (VETEC, Brasil);
• Cloreto de Sódio (DINÂMICA, Brasil);
• Glicomacropeptídeo (DAVISCO FOODS INTERNATIONAL, EUA).
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico, não necessitando de
maiores purificações.
2.1.2 Equipamentos
• Cromatógrafo AKTA purifier (10/100, PHARMACIA BIOTECH, Suécia);
• Agitador magnético (FISATON, Brasil);
• Balança analítica (M-310, DENVER INSTRUMENT, USA);
• Centrífuga (5804, EPPENDORF, Alemanha);
• Banho termostático (TE-184, TECNAL, Brasil);
• Vidrarias diversas.
19
2.2 Metodologia
2.2.1 Escolha dos sistemas de trabalho
Os dados de equilíbrio para os sistemas aquosos bifásicos utilizados neste
trabalho se basearam nos diagramas de fases de sistemas compostos por
polietilenoglicol, sal e água obtidos por CARVALHO (2004) e OLIVEIRA (2006). A
partir dos sistemas bifásicos contendo PEG de massas molares (1500, 2000 e 4000 g
mol
-1
) e do sal formador da fase (fosfato de potássio, citrato de sódio, sulfato de lítio ou
sulfato de sódio), foram obtidos os coeficientes de partição do GMP, nas temperaturas
de (5, 25, 35 e 45) ºC em função da concentração do PEG (10 % em massa a 18 % em
massa) e do tipo de sal (9 % em massa a 17 % em massa). Os experimentos empregando
a cromatografia de exclusão molecular partiram dos mesmos sistemas. As análises
foram conduzidas em duplicata.
2.2.2 Preparo dos sistemas aquosos bifásicos
Sistemas aquosos bifásicos foram preparados pela mistura de PEG (1500, 2000
ou 4000) e um sal (fosfato de potássio, citrato de sódio, sulfato de lítio ou sulfato de
sódio). Para preparar os SAB, soluções estoques dos componentes das fases PEG1500,
PEG2000 ou PEG4000 a 50 % em massa, fosfato de potássio, pH 7,0, a 40 % em massa,
e água foram misturados até a obtenção da composição total do sistema. Para o preparo
de uma solução estoque de fosfato de potássio, o ajuste do pH em 7,0 foi obtido
adicionando fosfato de potássio monobásico e dibásico na proporção de 1:1,82,
respectivamente. O sulfato de sódio, o sulfato de lítio e o citrato de sódio foram
empregados pela pesagem de sua forma sólida. Os valores de pH das soluções salinas
utilizadas de sulfato de sódio e sulfato de lítio eram próximos de 7,0, não necessitando
de ajustes. O efeito do pH sobre o coeficiente de partição do GMP também foi estudado,
para tanto, os SAB compostos por PEG1500 e citrato de sódio tiveram os valores de pH
ajustados para 6,0, 7,0 e 8,0. Todos os sistemas foram preparados em tubos de
centrífuga graduados. A massa total do sistema em cada tubo foi de 10 g, sendo que a
quantidade de GMP adicionada ao sistema foi sempre 20 mg. O GMP foi o último
componente a ser adicionado. Cada tubo foi agitado manualmente por,
aproximadamente, 2 minutos e então centrifugado a 2000 g por 20 minutos, objetivando
20
acelerar a formação das fases. Os tubos foram colocados em um banho termostático de
acordo com a temperatura de trabalho (5, 25, 35 e 45) ºC, sendo mantidos em repouso
durante 12 horas. Após esse tratamento, para determinar a concentração de proteína em
cada uma das fases, amostras de ambas as fases foram coletadas usando uma pipeta para
a fase superior e uma seringa com uma agulha longa e fina para a fase inferior. Os
volumes foram determinados em tubos graduados. A massa molar do polímero, a
concentração de sal e polímero, a temperatura e o pH foram ajustados para atingir o
máximo coeficiente de partição do GMP usando um SAB.
O comprimento da linha de amarração, usualmente referido como TLL, foi calculado, a
partir das concentrações dos componentes nas fases, pela equação (1):
22
[][]
TLLPEGSal
=∆+∆ (1)
em que [? PEG] e [? Sal] correspondem à diferença das concentrações de PEG e sal nas
fases superior e inferior expressa em % em massa, respectivamente. A inclinação da
linha de amarração (STL) foi calculada por:
PEG
STL
Sal
∆
=
∆
(2)
2.2.3 Medida do volume das fases
Para cada tubo (ou célula de equilíbrio) foi obtida uma relação entre a massa de
água e a altura da coluna de água atingida por esta massa. A partir da densidade da
água, na temperatura ambiente, e da relação
V
m
=ρ , uma curva analítica para a
determinação do volume das fases nos tubos foi construída em função do volume de
água e da altura da coluna de água. Desta forma, antes da retirada das alíquotas das
fases, a altura de cada fase foi medida com régua e o volume calculado. A altura da fase
inferior foi lida a partir do fundo do tubo até a interface e a altura da fase superior foi
calculada subtraindo a altura total (medida do fundo do tubo até a superfície da fase
superior) da altura da fase inferior.
2.2.4 Cálculo do coeficiente de partição
O coeficiente de partição (K
p
) foi definido como:
sup
inf
[]
[]
p
P
K
P
=
(3)
21
em que [P]
sup
e [P]
inf
são as concentrações de equilíbrio da proteína particionada nas
fases ricas em PEG-(superior) e salina-(inferior), respectivamente. Este coeficiente é
usado para quantificar o grau de separação alcançado em um processo de extração. Os
experimentos foram feitos em duplicata e a média dos resultados foram os valores
empregados neste trabalho. Para selecionar os SAB com a melhor capacidade de
purificação do GMP, foi calculada uma recuperação teórica (y, %) na fase superior. A
percentagem de recuperação de uma proteína depois de uma etapa de extração foi
calculada por meio da seguinte equação:
100
(%)
1(1/)
p
y
RK
=
+
(4)
em que R = V
S
/V
I
, V
S
e V
I
correspondem aos volumes das fases superior e inferior,
respectivamente.
2.2.5 Quantificação da proteína presente nas fases
A quantificação da proteína na fase salina e polimérica foi realizada por meio da
cromatografia de exclusão molecular (CEM), sendo conduzida por um cromatógrafo
ÄKTA Purifier
®
10/100 System (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia). O eluente foi
monitorado pela absorção UV (UV-900) a 205 nm e a condutividade foi medida em
uma célula de fluxo pH/C-900. As amostras foram injetadas por meio de um loop de 50
µl. A coluna de CEM usada foi uma Superdex
®
75 HR 10/30 (Pharmacia Biotech,
Suécia). A fase móvel foi um tampão pH 6,0, sendo a vazão de 0,65 mLmin
-1
. A pressão
máxima no leito da coluna foi de 1,78 MPa. Devido a sua alta viscosidade, a fase
polimérica foi diluída antes de ser injetada em 2:1 (água: amostra).
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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28
CAPÍTULO 2 - Partitioning of glycomacropeptide in aqueous two-phase systems:
influence of type of salt and temperature
Abstract
This study evaluates the influence of type of salt and temperature on the partition
coefficient of glycomacropeptide (GMP) to determine the best conditions for the
recovery of GMP in aqueous two-phase systems (ATPS) composed by poly(ethylene
glycol) (PEG) 1500 and an inorganic salt (potassium phosphate, sodium citrate, lithium
sulfate or sodium sulfate). In all systems, GMP presented affinity for the PEG rich-
phase. The PEG1500 + lithium sulfate showed the highest values of partitioning
coefficient. In addition, thermodynamic parameters (?H
?
, ?S
?
, ?G
?
) as a function of
temperature, were calculated for the system PEG1500-sodium citrate at different PEG
concentrations and the results imply thermodynamic differences between partitioning of
GMP in this system.
Keywords: aqueous two-phase systems; caseinomacropeptide; hydrophobicity; salt;
temperature; thermodynamic parameters.
Abbreviations: GMP, glycomacropeptide; ATPS, aqueous two-phase systems;
PEG1500, poly(ethylene glycol) with average molar mass of 1500; ?H
?
, standard
enthalpy change; ?S
?
, standard entropy change; ?G
?
, variation of Gibbs free energy.
29
Introduction
Glycomacropeptide (GMP) or caseinomacropeptide is formed by chymosin (or pepsin)
cleavage of ?-casein between Phe105-Met106 during cheese-making [1]. GMP accounts
for around 20% of the total protein content in whey protein products. In recent years,
GMP has been the subject of growing interest, due to its beneficial biological and
physiological properties [2], including the ability to bind cholera and Escherichia coli
enterotoxins, inhibit bacterial and viral adhesion, modulate immune system responses,
promote bifidobacteria growth, suppress gastric secretions and regulate blood
circulation, as reviewed by Abd El-Salam et al. [3] and Thomä-Worringer et al. [1]. The
most recent isolation techniques for the production of GMP are generally based on
chromatography or ultrafiltration techniques using either chymosin-treated
casein/caseinate or rennet whey as starting material. However, these techniques are
usually expensive and difficult to scale up.
Aqueous two-phase systems (ATPS) have been successfully used for separation and
purification of proteins due to their advantages over traditional methods [4]. The ATPS
are advantageous over other separation techniques due to the high water content of both
phases, which means high biocompatibility and low interfacial tension, thus minimizing
degradation of biomolecules [5]. ATPS also provide good resolution, high yield, and a
relatively high capacity. In addition, this system is easily scaled-up [6]. ATPS could be
a good alternative for a first purification step since such systems allow removal of
several contaminants by a simple and low-cost process [7].
The ATPS technology is based on the incompatibility of two different hydrophilic
polymers in the common solvent water or aqueous solutions of polymers and salts
above certain critical concentrations [5, 8]. The mechanism governing the partition of
proteins in ATPS is driven by the van der Waals, hydrogen bond, hydrophobic, and
ionic interactions between the biomolecules and the surrounding phase. Therefore,
partition may be influenced by the concentrations and molar mass of phase-forming
polymer, concentration of phase-forming salt, type and concentration of added salts,
temperature and pH. Molar mass, shape, specific bonding sites, and surface
hydrophobicity of the biomolecules also affect partition behavior [5, 6]. The net effect
of these interactions is not the same in the two phases, and the protein will partition into
one phase where energy is more favourable [9].
30
In this work, the effects of type of salt and temperature on the partition coefficient of
GMP were studied aiming to improve the selectivity of the aqueous two-phase systems
and to determine the best recovery conditions.
Materials and Methods
Chemicals
Poly (ethylene glycol) (PEG) with average molar mass of 1500 was obtained from
Synth (Diadema, SP, Brazil). The polymer and salts were used without further
purification. Glycomacropeptide (GMP) was a kindly gift of Davisco Foods
International (Eden Prairie, MN, USA), with purity higher than 83 mass %. All
chemicals were of analytical grade and readily available commercial products.
Ultrapure water for the experiments was obtained from a Milli-Q system (Millipore Inc.,
MA, U.S.A.).
Preparation of the aqueous two-phase systems
Biphasic systems were prepared by a mixture of PEG1500 and an inorganic salt
(potassium phosphate, sodium citrate, lithium sulfate or sodium sulfate). To prepare
ATPS, stock solutions of the phase components PEG1500 50 mass %, potassium
phosphate, pH 7.0, 40 mass %, and water were mixed to obtain a total system
composition. To obtain a stock solution of potassium phosphate, 40 mass % at pH 7.0,
monobasic potassium phosphate (KH
2
PO
4
) and dibasic potassium phosphate (K
2
HPO
4
)
were weighed and added in the proportion 1:1.82 (mono:di). Sodium citrate, lithium
sulfate or sodium sulfate were employed by weighing the solid form; the pH of the
PEG-sodium citrate aqueous biphasic system was adjusted (Digimed DM-20 pH meter,
Brazil) to 7.0 and the buffer used was 0.1 M HCl; the pH values of the PEG-lithium
sulfate and PEG-sodium sulfate biphasic systems were not adjusted since the systems
presented pH 7.0. All the systems were prepared in graduated centrifuge tubes. The total
weight of the phase system was 10 g. The amount of GMP added to the systems was 20
mg, and was the last component added to the systems. After 2 minutes of gentle stirring,
the systems were centrifuged (Centrifuge Eppendorf 5804, Germany) at room
temperature and 2000 g for 20 minutes. The tubes were brought to equilibrium in a
thermostatic bath (TECNAL, TE-184, Brazil) with a precision of ± 0.1 K, according to
31
the temperature used (278.15, 298.15, 308.15 and 318.15 K) and left overnight (at least
12 h). Following this treatment, it was observed a well defined interface and clean,
transparent bottom and top phases. To determine the concentration of proteins in each of
the co-existing phases, samples from each phase were collected using a pipette for the
upper phase and a long needle-syringe for the bottom phase. The volumes were
determined in graduated centrifuge tubes. The molar mass of the polymer, salt and
polymer concentration, temperature and pH were optimized to achieve the maximum
partition coefficient for the GMP partitioning using ATPS. The top and bottom phases
were withdrawn separately. The tie line length (TLL) was calculated according to the
equation (1):
22
[][]
TLLPEGSalt
=∆+∆ (1)
where [? PEG] and [? Salt] are the differences between the concentration of PEG and
salt in the top and bottom phases expressed in mass %.
Determination of the protein partition coefficient (K
p
)
The partition coefficient (K
p
) was defined as:
[]
[]
top
p
bottom
P
K
P
= (2)
where [P]
top
and [P]
bottom
are the equilibrium concentrations of the partitioned protein in
the PEG-(top) and salt-(bottom) enriched phases, respectively. This coefficient is used
to quantify the degree of separation reached in an extraction process. The partition
experiments were carried out in duplicate and the average results are the values reported
in this work. To select the ATPS with the best capability of purifying GMP, it was
calculated the theoretical recovery (y, %) in the top phase. The recovery percentage for
any protein after one extraction step can be calculated according to the equation:
100
(%)
1(1/)
p
y
RK
=
+
(3)
where R is V
T
/V
B
, V
B
and V
T
are the bottom and top phase volumes, respectively.
Determination of thermodynamic functions associated with protein partitioning
The partitioning coefficient was determined at different temperatures for the systems
compounds for PEG1500-sodium citrate at different PEG concentrations. The sodium
citrate was selected due to its environment safe characteristics. The temperature
32
dependant thermodynamic parameters were obtained from the Van’t Hoff plot by fitting
ln K
p
vs. the reciprocal of the temperature by a non-linear regression analysis of data
and to obtain the parameters a, b, and c:
2
ln
p
bc
Ka
TT
=++ (4)
According to Griffin et al. [10], the three parameters a, b, and c can then be used in Eqs.
(4)–(5), derived from Kirchoff’s relations:
ln
2
(1/)
p
K
cH
b
TTR
∂
∆
=+=−
∂
o
(5)
2
Sc
a
RT
∆
=−
o
(6)
Where, ?H
?
denotes the standard enthalpy change (kJ mol
-1
) and ?S
?
(J mol
-1
K
-1
) the
standard entropy change associated to protein partitioning, and R the universal gas
constant.
The ?G
?
denotes variation of Gibbs free energy (kJ mol
-1
) of solute transfer between two
phases, expressed by
GHTS
∆=∆−∆
ooo
(7)
Protein quantification
Protein quantification in the saline and polymeric phases was conducted using a
chromatography ÄKTA Purifier
®
10/100 system (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). The eluent was monitored by UV absorption UV-900 at 205 nm and
conductivity measurements in a flow cell pH/C-900. Samples were injected by means of
a loop of 50 µl. The column used was a Superdex
®
75 HR 10/30 (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). The mobile phase was 0.1 M sodium phosphate monobasic, 0.1 M
sodium phosphate dibasic, pH 6.0, with a flow rate of 0.65 mLmin
-1
. The maximum
pressure of the column bed was 1.78 MPa. The polymeric phase was diluted before
injection in a 1:2 (sample: water) ratio due to its high viscosity.
33
Results and Discussion
Effect of phase-forming salt on protein separation
The change of the type and concentration of salt can alter the partition behavior of
biological materials [5]. Besides, PEG-phosphate, PEG-citrate and PEG-sulfate ATPS
are adequate for continuous large-scale purification of biological origin materials and
allow the use of traditional liquid-liquid extraction equipment [11-14]. Thus, four
PEG1500-
34
Table I. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG1500-salt, at different compositions of the assayed ATPS.
Medium conditions: Temperature 298.15 K and pH 7.0.
ATPS
TLL
(mass %)
PEG
(mass %)
Salt
(mass %)
K
p
y (%)
PEG
-
Sodium Citrate
24.08 14.00 14.89 8.85 ± 0.12
85.59 ± 0.28
32.31 16.00 16.10 14.73 ± 0.15
92.00 ± 0.08
34.60 18.00 17.28 18.56 ± 0.17
92.85 ± 0.07
PEG
-
Potassium Phosphate
19.67 14.00 10.52 3.29 ± 0.32
83.88 ± 1.36
31.55 16.00 11.43 9.89 ± 0.08
93.95 ± 0.14
34.86 18.00 11.45 10.61 ± 0.26
93.66 ± 0.09
PEG
-
Lithium Sulfate
29.35 10.00 13.03 10.91 ± 0.21
78.86 ± 0.31
33.46 10.50 13.77 14.62 ± 0.36
88.33 ± 0.16
37.57 11.00 14.52 22.25 ± 0.34
83.35 ± 0.34
PEG
-
Sodium Sulfate
26.79 10.00 9.52 2.02 ± 0.05
50.56 ± 0.21
29.74 10.25 10.48 3.03 ± 0.10
59.59 ± 0.52
35.12 10.50 11.87 6.04 ± 0.20
71.40 ± 1.13
In spite of the difficulty in developing a model that predicts the partition coefficient for
the target molecules, many investigators have been searched for a mathematical
relationship to the K
p
values. Thus, Blázquez et al. [9] proposed the following simple
linear relation to correlate protein partitioning in ATPS:
(
)
ln
pbottomtop
KAww
=−
(8)
where, w
bottom
and w
top
are the salt mass fractions in the bottom and top phase and A is a
function of the interaction between salt and water. This simplified relationship could
adequately describe the partition data of α-amylase.
35
Figure 1 shows the partition data for GMP in different PEG1500-salt systems at
increasing salt concentration difference (?[salt]) values, calculated as the difference
between salt equilibrium concentration in the top and bottom phases, w
top
and w
bottom
,
respectively. The trend observed is a linear relationship between ln K
p
vs. ?[salt]. In all
cases, higher values of the determination coefficients (R
2
>0.96) were obtained. The
increase of ? [salt] for all types of salt induced an increment in the K
p
value. Also, the
slope values modify for each type of salt, suggesting the presence of salt–protein
interactions.
∆[salt]
8 10 12 14 16 18 20 22 24
ln K
p
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Figure 1. Dependence of the salt concentration difference between the top and bottom
phases for the GMP partition. Sodium citrate (?), sodium sulfate (?), potassium
phosphate (?), and lithium sulfate (?).Temperature: 298.15 K.
Although partitioning depends on a number of factors such as hydrophobic properties,
addition of salts, electrical potential between the phases, molecular size, and
conformation of the molecules, the hydrophobic characteristics are considered to be the
dominant factor when the influence of type of salts is analyzed. Hydrophobic effect is
defined as an unfavorable interaction of nonpolar substances or moieties of molecules
with water, which is responsible for their low solubility [16]. Moreover, the
hydrophobicity of a substance could be described as a measure of the overall intensity
36
of its total interactions with an aqueous medium (including hydrogen bonding, van der
Waals, electrostatic interactions, etc.) [17].
When a protein is partitioned in PEG-salt ATPS, the type of salt and salt concentration
have an effect on the hydrophobic interactions between the proteins and the
hydrophobic media; the salt ions will interact with the oppositely charged groups in the
protein to form a double layer of ionic groups. Thus, the protein will be dehydrated due
to the hydration effect of salt molecules surrounding the protein, and the hydrophobic
zones of the protein will be gradually naked, increasing with the salt concentration
increment [18]. The influence of the salt ions on the protein behavior is usually related
to their position in the Hofmeister series. The effectiveness of the Hofmeister series is
given for anions by SO
4
2-
> HPO
4
2-
> CH
3
COO
-
> Cl
-
> Br
-
> I
-
> SCN
-
, and for cations
by Li
+
> Na
+
> K
+
> NH
4+
> Mg
2+
[19]. At higher concentrations, the ions to the left of
the series decrease protein solubility (salting-out effect) by increasing hydrophobic
interaction and aggregation, and the hydration effect of the salt molecule surrounding
the protein [20]. Thus, most proteins strongly favor the phase with lower salt
concentration, increasing the interaction between the protein and the PEG molecules,
improving the extraction to PEG rich phase. According to Figure 1 and Table I, the
PEG1500-lithium sulfate showed the highest values of coefficient partitioning,
suggesting that the hydrophobic effect in ATPS was influenced by the Hofmeister
series, and consequently by the type of salt.
Effect of the temperature on protein partitioning
The partitioning coefficient was determined at different temperatures for the systems
compounds for PEG1500-sodium citrate at different PEG concentrations. The sodium
citrate was selected due to citrates characteristics as a biodegravel and nontoxic
compound. As can be seen in Figure 2 the temperature affected the partition behavior of
GMP. Willauer et al [21], studying the influence of temperature and type of salt on the
lignin distribution using ATPS verified that the increase of the salt concentration of any
salt is identical to the effect of increasing temperature on partitioning. Recent studies
have shown that polymer-salt interactions are endothermic events, and the rise in
temperature should be favorable to this reaction, which leads to an increase in the
amount of salt necessary for phase splitting, enlarging the biphasic area and increasing
the slope of the tie line [22, 23]. Thus, it is expected in our study an increase in the
37
phase divergence with the increase of the temperature. Consequently, the GMP will
exhibit higher partitioning coefficients due to its preference for the PEG-rich phase, as it
was found in this work in the systems with high salt
concentration.
1/T (K
-1
)
0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036
ln K
p
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
Figure 2. Van’t Hoff plots. Temperature effect of the partition equilibrium of GMP at
different concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?),
and 18 mass % PEG1500 (?). pH 8.0.
Figure 2 shows the temperature effect on the partitioning coefficient, expressed as non
linear Van’t Hoff plots. Changes in temperature and PEG concentration affected the
partitioning coefficient of GMP. The increase of PEG concentration in the system
increases the partitioning coefficient, but this behavior is in contrast with the excluded
volume effect theory. This theory suggests that the increase of either the PEG
concentration or the PEG molar mass induces a reduction of the protein solubility in the
phase where the protein is placed. Spelzini et al. [24] reported that the PEG–protein–salt
interaction prevails on the excluded volume effect. Furthermore, as the PEG
concentration increases, the number of polymer units involved in the bio-molecular
partitioning also increases, and, hence, more protein molecules partition into the PEG
phase, due to the hydrophobic interaction between the protein and PEG [14].
38
Figure 2 also suggests that the enthalpic change associated to protein partition is
temperature-dependent. The solids curves in the figure represent the predicted values
using the quadratic form of Eq. (4). The adjusted parameters of the Van’t Hoff equation
obtained are presented in Table II. In all cases, higher values of the coefficients of
determination (R
2
>0.93) were obtained.
Table II. Adjusted parameters of the Van’t Hoff equation.
PEG (mass %) Parameters
a b c R
2
14.00 62.33 -33446.57 4632541.66 0.96
16.00 148.63 -86047.14 12638755.51 0.97
18.00 139.32 -81520.27 12141187.73 0.93
The thermodynamic parameters for the partitioning of GMP were calculated based on
Table 2 data and using Eqs. (4)-(7). The results are shown in Table III and Figures 4-6.
Table III. Thermodynamic parameters for the partitioning of GMP in ATPS, at
different PEG concentrations.
Temperature (K) PEG 1500 (mass %) ?H
?
(kJ mol
-
1
) ?S
?
(Jmol
-
1
K
-
1
) ?G
?
(kJmol
-
1
)
278.15 14.00 1.14 20.38 -4.53
298.15 19.72 84.93 -5.61
308.15 28.10 112.60 -6.60
318.15 35.96 137.69 -7.85
278.15 16.00 -40.16 -122.50 -6.09
298.15 10.53 53.61 -5.46
308.15 33.40 129.09 -6.38
318.15 54.84 197.56 -8.02
278.15 18.00 -48.05 -146.42 -7.32
298.15 0.64 22.76 -6.15
308.15 22.61 95.26 -6.74
318.15 43.21 161.04 -8.03
39
Temperature (K)
270 280 290 300 310 320 330
∆H
ο
(kJ/mol)
-60
-40
-20
0
20
40
60
Figure 3. Enthalpy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0.
Temperature (K)
270 280 290 300 310 320 330
∆
S
ο
(J/molK)
-200
-100
0
100
200
300
Figure 4. Entropy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0.
40
Temperature (K)
270 280 290 300 310 320 330
∆
G
ο
(kJ/mol)
-8
-7
-6
-5
Figure 5. Free energy change of the partition equilibrium of GMP at different
concentrations of PEG: 14 mass % PEG1500 (?), 16 mass % PEG1500 (?), and 18
mass % PEG1500 (?). pH 8.0.
These thermodynamic functions provide information on the molecular mechanism
taking part in the protein transfer from the salt to the PEG-rich phase. The results
presented demonstrate that protein partitioning enthalpy and protein partitioning entropy
increase with temperature for GMP at all PEG concentrations. The partitioning process
tends to be more enthalpic favorable with increase in temperature [22, 23]; therefore,
the transfer of GMP to the top phase was endothermic at the temperature range 298.15-
318.15 K, while at 278.15 K, an inversion of the sign in ?H
?
was observed for
concentrations of 16 and 18 mass % PEG1500. A similar inversion in the ?S
?
sign was
verified. In Figures 3 and 4, a linear dependence of ?H
?
and ?S
?
on temperature was
observed for all PEG concentrations. The partitioning process was found to be
entropically driven as temperature increased [22, 23]. The results also indicated that the
change in Gibbs free energy is negative in all cases, a characteristic of spontaneous
process, and becomes more negative as temperature is increased, in nearly all cases.
41
Conclusions
The influence of type of salt (potassium phosphate, sodium citrate, lithium sulfate or
sodium sulfate) and temperature (278.15-318.15 K) on the GMP partition coefficient in
the PEG/salt ATPS was studied. The GMP is a protein source of promising industrial
potential. Thus, the influence of various factors on its partitioning was analyzed.
Efficient and low cost GMP extraction can be achieved by using PEG-salt biphasic
system. The most favorable condition for recovery was found at 16 mass % PEG 1500 +
11.43 mass % potassium phosphate + 72.57 mass % water, pH 7.0 and room
temperature (298.15 K), being approximately 93.95% of GMP recovered. The effect of
temperature on the partition behavior of GMP was also studied. The thermodynamic
parameters (?H
?
, ?S
?
, and ?G
?
) as a function of temperature were calculated for the
system PEG1500-sodium citrate at different PEG concentrations and the results explicit
thermodynamic differences between partitioning of GMP. The ?H
?
, ?S
?
, and ?G
?
values
of the process studied have shown that this process is driven by entropy. Furthermore,
GMP partitioning needs to be investigated in other polymer–polymer systems and the
partitioning parameters must be determined, especially under a continuous mode of
operation, to make the technique commercially viable.
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44
CAPÍTULO 3 - Partitioning features of glycomacropeptide in aqueous two-phase
systems compound by polyethylene glycol-sodium citrate
Abstract
The partition behavior of glycomacropeptide (GMP) in poly (ethylene glycol) (PEG)
sodium citrate aqueous two-phase systems have been characterized. The GMP
partitioned preferentially into the PEG phase. Investigation on the effect of the PEG
molar mass, tie-line length, pH, NaCl addition and temperature of system lead to the
conclusion that the system properties had affected the GMP partition coefficients. The
ATPS composed by 15.00 mass % PEG1500 + 18.91 mass % sodium citrate at 318.15
K showed to have the best capability of recovering the GMP. In this system, the
recovery of this protein was of 94.66% in the top phase, thus, ATPS was shown to be
suitable as a starting point to separation of the GMP.
Keywords: aqueous two-phase systems; PEG molar mass; NaCl addition; tie line
length; pH.
Abbreviations: GMP, glycomacropeptide; ATPS, aqueous two-phase systems;
PEG1500, poly(ethylene glycol) with average molar mass of 1500; PEG2000,
poly(ethylene glycol) with average molar mass of 2000; PEG4000, poly(ethylene
glycol) with average molar mass of 4000; TLL, tie-line length; STL, slope of the tie
line; NaCl, sodium chloride.
Introduction
Glycomacropeptide (GMP) comprises the 64 amino acids in the hydrophilic C-terminal
portion of ?-CN, this peptide is formed by chymosin (or pepsin) cleavage of k-casein
between Phe105-Met106 during the manufacture of cheese [1-2]. Next to ß-
lactoglobulin and a-lactalbumin, GMP is the most abundant protein/peptide in whey
proteins produced from cheese whey with typical concentrations between 20 % and 25
% of proteins [1]. In recent years, an increasing number of studies show that GMP may
exert important biological activities. The literature has highlighted the ability of GMP to
bind cholera and Escherichia coli enterotoxins, growth-promoting effects on
bifidobacteria, suppression of gastric secretion and the inhibition of viral or bacterial
adhesion to intestinal epithel cell [1, 3]. This explains the growing interest in developing
techniques for the isolation and purification of GMP. Thus as an alternative to the first
purification step of GMP, we proposed a purification process based on aqueous two-
phase systems (ATPS).
Aqueous two-phase extraction has been developed since the mid 1950s as a mild
separation method of wide applicability within biochemistry, cell biology and
biotechnology [4]. An ATPS is formed when two water-soluble polymers, such as poly
(ethylene glycol) (PEG) and dextran, or a polymer and a salt are dissolved in water
beyond a critical concentration at which two immiscible phases form [5]. However
PEG–salt ATPS have certain advantages over PEG–dextran such as low viscosity and
lower cost [6]. PEG had been combined with sodium citrate to form ATPS, due to
citrates characteristics as a biodegravel and nontoxic compound. PEG + citrate salts
form environmentally safe ATPS, which are more suitable for the extraction of
biological materials [7].
ATPS have several advantages as regards the conventional methods for the isolation and
purification of proteins such as their low cost, nontoxic, the possibility of applying them
on large scale and the short time required for reaching the equilibrium condition [8].
The selective distribution of constituents of ATPS may be affected by different factors
like the nature and size of the biocompound, molecular structure and size chain of the
polymer, type of salt, pH, initial composition of the system, and temperature [9, 10].
Thus, the goal of this work is to make a preliminary study about the partition of GMP
using the PEG-sodium citrate system. Some relevant parameters such as pH, polymer
46
molar mass, tie line length, NaCl addition, and temperature which affect the partitioning
behavior of the protein were investigated.
Materials and Methods
Chemicals
Glycomacropeptide (GMP) was a kindly gift of Davisco Foods International (USA),
with purity higher than 83 mass %. Poly (ethylene glycol) (PEG) with average molar
mass of 1500, 2000 and 4000 (PEG1500, PEG2000 and PEG4000) were purchased
from Synth (Brazil), Riedel de Haen (Germany) and Isofar (Brazil), respectively. All
chemicals were of analytical grade. The polymer and salts were used without further
purification. Ultrapure water for the experiments was obtained from a Milli-Q system
(Millipore Inc., MA, U.S.A).
Preparation of the aqueous two-phase systems
Biphasic systems were prepared by a mixture of PEG (1500, 2000, and 4000) and
sodium citrate. To prepare ATPS, stock solutions of the PEG 50 mass %, sodium citrate
and water were mixed to obtain a total system composition. Sodium citrate was
employed by weighing the solid form; the desired pH (6.0, 7.0 or 8.0) of the ATPS was
adjusted (Digimed DM-20 pH meter, Brazil) by the addition of sodium hydroxide or
citric acid. All the systems were prepared in graduated centrifuge tubes. The total mass
of the phase system was 10 g. The amount of GMP added to the systems was 20 mg,
and it was the last component added. For study of sodium chloride addition, systems
were prepared by dissolving the powdered compound directly into the systems, to
achieve concentrations of 0.1 or 0.5 M. Each system was further centrifuged (Centrifuge
Eppendorf 5804, Germany) at 2000 g for 20 min and transferred to a thermostatic bath
(TECNAL, TE-184, Brazil) with a precision of ± 0.1 K, where the mixture was allowed
to settle for 12 h at the operational temperature (298.15, 308.15, and 318.15) K to obtain
clear phase separation and to reach the equilibrium. After equilibration, estimates of the
volumes of top and bottom phases were made in graduated centrifuge tubes. In order to
determine the concentration of proteins in each of the co-existing phases, samples from
each solution phase was collected using a syringe. The top and bottom phases were
47
withdrawn separately. The tie line length (TLL) was calculated according to the
equation (1):
22
[][]
TLLPEGSalt
=∆+∆ (1)
where [? PEG] and [? Salt] are the differences between the concentration of PEG and
salt in the top and bottom phases expressed in mass %. And the slope of the tie line
(STL) was calculated by:
PEG
STL
Salt
∆
=
∆
(2)
Determination of the protein partition coefficient (K
p
)
The partition coefficient (K
p
) was defined by equation (3):
[]
[]
top
p
bottom
P
K
P
= (3)
where [P]
top
and [P]
bottom
are the equilibrium concentrations of the partitioned protein in
the PEG and sodium citrate rich-phases, respectively. The partition experiments were
carried out in duplicate and the average results are the values reported in this work. To
select the ATPS with the best capability of purifying GMP, it was calculated the
theoretical recovery (y, %) in the top phase. The recovery percentage can be calculated
according to the equation (4):
100
(%)
1(1/)
p
y
RK
=
+
(4)
where R is V
T
/V
B
, V
B
and V
T
are the bottom and top phase volumes, respectively. It is
generally desirable to recover the target protein in the top phase, which is better for
protein stability; recovery in the bottom salt phase also requires desalting if followed by
an ion exchange step [5]
Protein quantification
Protein quantification in the saline and polymeric phases was conducted using a
chromatography ÄKTA Purifier
®
10/100 system (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). The eluent was monitored by UV absorption UV-900 at 205 nm and
conductivity measurements in a flow cell pH/C-900. Samples were injected by means of
a loop of 50 µl. The column used was a Superdex
®
75 HR 10/30 (Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden). The mobile phase was 0.1 M sodium phosphate monobasic, 0.1 M
48
sodium phosphate dibasic, pH 6.0, with a flow rate of 0.65 mLmin
-1
. The maximum
pressure of the column bed was 1.78 MPa. The polymeric phase was diluted before
injection in a 2:1 (water: sample) ratio due to its high viscosity.
Results and Discussion
Effect of the addition of sodium chloride and pH on protein partitioning
The ATPS formed by 14.00 mass % PEG1500 and 14.89 mass % sodium citrate
systems was used to investigate the effect of addition of sodium chloride (NaCl) and pH
on partitioning and recovery of GMP. The partition experiments were carried out at
different pH values (6.0, 7.0, and 8.0) and NaCl concentration (0.0, 0.1, and 0.5 M). The
results are show in the Table I and in the Figure 1. In spite of GMP pI between 4 and 5
[1], these pH values were chosen to study so that the aqueous phase is neither too acidic
nor too basic. This is important since, too acidic or too basic solution cannot be
discharged in the environment without further treatment.
The partition coefficient of the systems without NaCl for pH values of 6.0, 7.0, and 8.0
are 5.69, 7.58 and 8.82, respectively. In these systems, the percentage yield of the
extraction in the ATPS, as seen from Table I, increases from 79.24 to 85.60. This
provides better partitioning of the proteins in the top phase (PEG rich-phase) on
increasing the pH from 6 to 8. This increase in partition coefficient value could be due
to hydrophobic interaction and net charge. According to Mikkelsen et al. [2], the
sequence-derived molar mass (MM) of GMP is 6.7 kDa, however, previous studies
suggest that GMP forms aggregates, and that aggregation occurs at pH values above 4.5.
Kawasaki et al. [11], reported a pH-dependent association/dissociation of the GMP. At
pH 7.0, the apparent molar mass of GMP ranged from 20 to 50 kDa but at pH 3.5 it
ranged from 10 to 30 kDa. Mikkelsen et al. [2], verified that tetrameric forms (MM
above 35 kDa) of GMP from size exclusion chromatography (SEC) fractions were
significantly more hydrophobic than the dimeric and monomeric forms of GMP isolated
by SEC. Moreover, proteins with great hydrohobic surface area exposed to solvent,
have the possibility of interacting with PEG [12], consequently, this hydrophobic
interaction between PEG and protein when pH values increase is the factor that drives
the GMP partition in favor of the PEG-rich phase, which is more hydrophobic than the
salt rich phase [13-14].
49
It is known that salt concentration alters protein partition in aqueous two phase systems.
To obtain a more complete characterization of protein partition, the effect of the
addition of sodium chloride to the system at two concentrations (0.1 and 0.5 M) was
measured at pH values of 6.0, 7.0 and 8.0. From the Table I and the Figure 1 it is
observed a decrease trend of the partition coefficient with the increase of the NaCl
contend in the system. The partition coefficient at pH 8.0 decreases from 8.82 to 2.40
with increase in NaCl concentration for 0.5 M. Similar behavior was verified for pH
values of 6.0 and 7.0. This effect is probably verified because of the addition of
electrolytes, e. g. NaCl, at a concentration in order of 0.1-1 M may increase protein
solubility [15-16]. This electrostatic repulsive force should also prevent protein
association or aggregation; in other words, it should increase the solubility of the GMP
in system, which is fully in agreement with the known protein salting-in property of
NaCl. Thus, we suggested a dissociation of GMP tetrameric form with the increase of
the NaCl contend in the system. In addition, originally, the monomeric form of GMP is
a highly acidic and hydrophilic [1], consequently, the affinity that had between GMP
and PEG is lower and a decreasing in the K
p
values is verified. According to the results,
the ATPS composed by PEG1500-sodium citrate at pH 8.0 and without addition of
NaCl was chosen for the subsequent studies.
50
Table I. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each system formed for PEG1500 (14.00 mass %) and sodium citrate (14.89 mass
%), at different pH values and NaCl concentration of the assayed ATPS. Medium
condition: Temperature 298.15 K.
pH NaCl (M) K
p
y (%)
6.00 0.00 5.69 ± 0.20 79.24 ± 0.57
0.10 3.97 ± 0.05 72.65 ± 0.22
0.50 2.65 ± 0.06 64.01 ± 0.48
7.00 0.00 7.58 ± 0.26 82.85 ± 1.46
0.10 2.82 ± 0.12 65.48 ± 1.01
0.50 2.06 ± 0.05 58.03 ± 0.53
8.00 0.00 8.82 ± 0.12 85.60 ± 0.28
0.10 4.31 ± 0.28 74.23 ± 1.80
0.50 2.40 ± 0.21 61.67 ± 2.01
pH
6 7 8
K
p
0
2
4
6
8
10
Figure 1. Influence of pH on GMP partitioning in PEG1500-sodium citrate ATPS at
different NaCl concentrations. 0.0 M (?), 0.1 M (?), and 0.5 M (?). Temperature:
298.15 K.
51
Influence of PEG molar mass, tie-lie length and temperature on the protein
partitioning
Tables II-IV and Figures 2-4 show the effect of the tie line length (TLL), PEG molar
mass and temperature on the GMP partitioning at pH 8.0, without addition of NaCl. The
results indicate that the system studied is slightly influenced by the PEG molar mass.
The effect of polymer molar mass could be attributed to the excluded volume effects
that increase with increasing polymer molar mass. According to this theory, the increase
in the molar mass of PEG induces a reduction of the protein solubility in the phase
where the protein is located [17], due to this effect. The general tendency expected is a
decrease of the partition coefficients on the PEG molar mass increase which was
verified in our results. However, it is important to have in mind that by changing the
polymer molar mass, one needs to alter the polymer and salt concentration.
Consequently, the effect of the tie line length on the partition coefficients of GMP
should also be analyzed.
From the Tables II-IV and Figures 2-4, it has been observed that the partitioning of
GMP in PEG-sodium citrate system is dependent on the TLL. When the TLL increase it
was observed an increase in the K
p
values for molar mass of PEGs studied. This effect
of TLL on a protein can be due to a fine balance between two factors: the high ionic
strength created by the increasing in the salt concentration, which improves the
movement of the protein to the PEG rich-phase as a consequence of the electrostatic
repulsion effects [18]; and the PEG-GMP binding through the hydrophobic area of the
protein exposed to the solvent [2].
According to the results, changes in the temperature are able to increase the partition
coefficient of GMP. Aiming to analyze the temperature effect on the K
p
, we applied the
slope of the tie line (STL) concept. The STL explains the effect of the operational
conditions on system composition. When the temperature increase, the slope of the tie
line (STL) tends to increase, reducing the quantity of salt necessary to form a biphasic
system with a given amount of PEG at higher temperatures [10]. Thus, for a given
system composition, tie line length increases with increasing temperature as also with
increasing STL (Tables II-IV). Thus, the effect of increasing temperature in an ATPS
may be considered similar to increasing tie line length [19]. Moreover, PEG seems to be
a molecule for wich each ethylene group in its structure interacts with 14 water
molecules, however, the ordered water formation is very sensitive to the temperature
52
changes. Thus a temperature increase causes the water molecules to lose their order
around the hydrophobic polymer surface, which could improve the interaction protein-
PEG and increase the K
p
values [20].
Table II. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG1500-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0.
TLL (mass %) STL PEG (mass %) Salt (mass %)
K
p
y (%)
298.15 K
24.08 1.50 14.00 14.89 8.82 ± 0.12 85.60 ± 0.28
32.31 1.43 14.25 17.23 15.60 ± 0.13 90.76 ± 0.08
34.60 1.38 15.00 19.25 29.74 ± 0.35 94.31 ± 0.06
308.15 K
26.57 1.53 14.00 14.52 8.56 ± 0.49 85.92 ± 0.72
31.27 1.49 14.25 16.62 18.39 ± 0.86 91.51 ± 0.37
36.60 1.41 15.00 18.79 24.66 ± 0.75 93.55 ± 0.27
318.15 K
27.93 1.54 14.00 14.93 10.99 ± 0.40 87.77 ± 1.40
30.54 1.48 14.25 16.77 20.60 ± 0.50 91.25 ± 0.21
34.96 1.46 15.00 18.91 33.41 ± 0.10 94.66 ± 0.03
Table III. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG2000-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0
TLL (mass %) STL PEG (mass %) Salt (mass %)
K
p
y (%)
298.15 K
22.00 1.65 14.00 14.53 5.16 ± 0.07 81.07 ± 0.26
26.90 1.57 14.25 16.21 6.09 ± 0.19 86.52 ± 0.05
31.20 1.55 18.00 17.40 8.86 ± 0.01 86.66 ± 0.05
308.15 K
18.37 2.04 14.00 11.92 2.89 ± 0.02 69.12 ± 0.03
25.04 1.85 14.25 13.62 5.17 ± 0.18 77.93 ± 0.74
30.36 1.81 15.00 15.04 9.44 ± 0.09 83.92 ± 0.45
318.15 K
25.40 2.20 14.00 11.40 3.08 ± 0.30 65.07 ± 2.25
29.81 2.10 14.25 12.68 3.71 ± 0.30 68.04 ± 2.16
35.46 2.05 15.00 13.59 5.70 ± 0.08 76.83 ± 0.26
53
Table IV. Theoretical recoveries in the top phase and partition coefficients for the GMP
in each ATPS formed for PEG4000-sodium citrate, at different compositions of the
assayed ATPS. pH 8.0.
TLL (mass %) STL PEG (mass %) Salt (mass %)
K
p
y (%)
298.15 K
35.52 1.77 14.00 14.85 2.31 ± 0.29 60.01 ± 2.99
38.13 1.64 14.25 16.81 4.14 ± 0.46 72.07 ± 2.40
43.17 1.68 15.00 18.36 5.01 ± 0.35 73.27 ± 1.39
308.15 K
37.99 1.88 14.00 14.98 2.19 ± 0.07 59.80 ± 0.71
41.92 1.78 14.25 17.24 4.96 ± 0.31 74.33 ± 3.04
44.04 1.64 15.00 18.65 5.54 ± 0.14 76.30 ± 1.13
318.15 K
39.32 1.93 14.00 14.87 2.05 ± 0.18 54.52 ± 2.17
42.84 1.89 14.25 16.42 3.47 ± 0.04 65.02 ± 0.32
44.61 1.71 15.00 18.95 6.77 ± 0.13 78.65 ± 0.32
TLL (mass %)
24 26 28 30 32 34 36
K
p
5
10
15
20
25
30
35
Figure 2. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG1500-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0.
54
TLL (mass %)
18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
K
p
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Figure 3. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG2000-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0.
TLL (mass %)
36 38 40 42 44
K
p
1
2
3
4
5
6
7
8
Figure 4. Dependence of the GMP partition coefficients on the TLL for the PEG4000-
sodium citrate ATPS at different temperatures of the system. 298.15 K (?), 308.15 K
(?), and 318.15 K (?). pH 8.0.
55
Conclusions
In all cases, the GMP partitioning behavior showed that it is possible to change the
degree of partitioning by selecting the right conditions of the system. The results show
that the GMP is obtained in the PEG-rich phase, where the prevalent non-protein
contaminants are PEG and a little amount of the sodium citrate (a biodegradable and
nontoxic salt), which can easily be removed from the target protein by means of size
exclusion chromatography technique. Moreover it was verified that the GMP
partitioning can be influenced by many factors, including PEG molar mass, TLL,
temperature and pH. It has been observed that lower molar mass of PEG1500 is
beneficial for extraction of GMP. When the 15.00 mass % of PEG1500 + 18.91 mass %
of sodium citrate + water ATPS was operated at pH 8.0 and temperature 318.15 K
without addition of sodium chloride, approximately 94.66 % of GMP was recovered in
the top phase. This study has clearly shown that ATPS can be successfully used for
recovery and initial purification of GMP.
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