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CARMEN WOBETO
EXTRAÇÃO DE ESQUALENO DO DESTILADO DA DESODORIZAÇÃO DO
ÓLEO DE SOJA MODIFICADO UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO
SUPERCRÍTICO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2007
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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
T
Wobeto, Carmen, 1967-
W837e Extração de esqualeno do destilado da desodorização
2007 do óleo de soja modificado utilizando dióxido de carbono
supercrítico / Carmen Wobeto. – Viçosa : UFV, 2007.
xi, 72f. : il. (algumas col.) ; 29cm.
Inclui apêndice.
Orientador: Júlio Maria de Andrade Araújo.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.
Referências bibliográficas: f. 61-68.
1. Extração com fluido supercrítico. 2. Esqualeno -
Separação. 3. Óleo de soja. 4. Desodorização. 5. Cromo-
tografia a gás. I. Universidade Federal de Viçosa. II.Título.
CDD 22.ed. 664.022
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ii
CARMEN WOBETO
EXTRAÇÃO DE ESQUALENO DO DESTILADO DA DESODORIZAÇÃO DO
ÓLEO DE SOJA MODIFICADO UTILIZANDO DIÓXIDO DE CARBONO
SUPERCRÍTICO
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
APROVADA: 16 de março de 2007.
Alexandre Gurgel Angelita Duarte Corrêa
José Benício Paes Chaves Marco Túlio Coelho Silva
(Co-Orientador) (Co-Orientador)
Júlio Maria de Andrade Araújo
(Orientador)
iii
À minha mãe por ser meu porto seguro e pela fé inabalável.
Aos meus irmãos, Haidi, Márcia, Eliane e Elton, pela alegria de tê-los.
Aos meus sobrinhos queridos, Rafael, Roberta, Norton, Ricardo, Dener,
Gabriel, Laura, Luiza e Heitor.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, fonte inesgotável de amor, misericórdia e luz.
À Universidade Federal de Viçosa (UFV) e ao Departamento de
Tecnologia de Alimentos, pela oportunidade de realização do curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo suporte financeiro.
À Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT) por ter permitido
meu afastamento para a conclusão deste trabalho.
Ao professor Júlio Maria de Andrade Araújo, pela orientação e pelos
ensinamentos durante a realização deste trabalho.
Aos professores Marco Túlio Coelho Silva e José Benício Paes Chaves,
pela colaboração, conselhos e incentivo.
A todos os funcionários do DTA, em especial a Geralda, Carlos Antônio
(Pio), Thiago, Adão e Juarez pelo convívio e auxílio constante.
Ao Marcondes, pela amizade, pelo privilégio de conhecê-lo e pelos
ensinamentos em cromatografia e extração supercrítica
Aos amigos colegas do curso, Cláudia, Fabiana, Érica, Romilda, Ana
Cláudia, Alexandre, João Tomaz, Aline, Márcia, Joecy, Omar, Aline Fonseca,
Fabrícia, Cida, Selene, Maurício, Baltazar, Júnia, Roberta, Vânia, Carol,
Michelle, Susana e Gerusa pelo convívio amigo, pela troca de experiências e
auxílio em todas as horas.
v
À Adriana pelo auxílio nas análises e por sua presença sempre
agradável, amável e cooperativa.
Aos amigos colegas da UNEMAT, especialmente a Leonarda, Núbia,
Cassiano, Santino, Vanessa e Milton, pela colaboração e apoio.
As amigas da república, Rosimar, Michelle, Elaine e Juliana, por terem
me recebido com tanto carinho.
Aos meus amigos, irmãos do coração, Sandra, Oscar, Flávia e Carla,
pelo privilégio de tê-los como companheiros de caminhada, pelos momentos
felizes e pelo apoio nas dificuldades.
Ao Juliano pelo auxílio na redação deste trabalho, pelas sugestões e,
principalmente, por ser meu anjo da guarda.
Aos meus cunhados José Luiz, Soi, Sérgio e minha cunhada Leila, por
torcerem por mim.
Aos amigos trabalhadores do centro espírita Camilo Chaves,
simplesmente por estarmos lado a lado.
Enfim, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................
vii
RESUMO........................................................................................................
viii
ABSTRACT.................................................................................................... x
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................
3
2.1. Esqualeno: química, bioquímica e absorção...................................... 3
2.2. Ação antioxidante e mecanismos anticarcinogênicos do
esqualeno............................................................................................
5
2.3. Ação hipolesterolemica do esqualeno................................................ 10
2.4. DDOS: uma fonte alternativa de esqualeno........................................
11
2.5. Fundamentos da cristalização............................................................ 14
2.6. Aplicações do processo de cristalização............................................ 17
2.7. Princípios da extração com fluido supercrítico....................................
19
2.8. Processos de separação do esqualeno.............................................. 25
3. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................
30
3.1. Preparação da matéria-prima............................................................. 30
3.2. Seleção e caracterização química do DDOS centrifugado................. 30
3.2.1. Determinação quantitativa de esqualeno e semi-quantitativa de
fitoesteróis e triglicerídios totais no DDOS centrifugado...............
31
3.2.2. Determinação de ácidos graxos livres no DDOS centrifugado..... 32
3.3. Concentração do esqualeno no DDOS por cristalização seguida de
tratamento com Na
2
CO
3
......................................................................
32
3.3.1.Cristalização...................................................................................
32
3.3.1.1. Delineamento experimental................................................... 34
3.3.2 Tratamento com Na
2
CO
3
............................................................. 34
3.4. Extração com CO
2
-SC....................................................................... 34
3.4.1. Delineamento experimental......................................................... 37
3.5. Análise cromatográfica do teor de esqualeno.................................... 38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................. 39
4.1. Seleção e caracterização do DDOS centrifugado...............................
39
4.2. Modificações físico-químicas do DDOS.............................................. 40
4.
3
.
Extração do esqualeno com CO
2
-
SC
.................................................
......
45
4.3.1. Efeito da pressão e da temperatura sobre a extração do
esqualeno....................................................................................
45
4.3.2. Efeito do fluxo do CO
2
, do TEE e do TED sobre a extração do
esqualeno....................................................................................
50
4.4. Comparação do efeito dos tratamentos na concentração do
esqualeno no DDOS...........................................................................
56
5. CONCLUSÃO.............................................................................................
60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................
61
APÊNDICE..................................................................................................... 69
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
DDOS = destilado da desodorização do óleo de soja
CO
2
-SC = dióxido de carbono supercrítico
FS = fluido supercrítico
MNC = massa não cristalizável
Cristalização/Na
2
CO
3
= cristalização seguida de tratamento com Na
2
CO
3
DDOSM = DDOS modificado por cristalização/Na
2
CO
3
AGL = ácidos graxos livres
TG = triglicerídios
T = temperatura (
o
C)
Tc = temperatura crítica
p = pressão (bar)
pc = pressão crítica
ESQ = esqualeno
F = fluxo de CO
2
TEE = tempo de extração estática
TED = tempo de extração dinâmica
CG = cromatografia em fase gasosa
ix
RESUMO
WOBETO, Carmen, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, março de 2007.
Extração de esqualeno do destilado da desodorização do óleo de soja
modificado utilizando dióxido de carbono supercrítico. Orientador:
Júlio Maria de Andrade Araújo. Co-Orientadores: Marco Túlio Coelho Silva
e José Benício Paes Chaves.
Neste trabalho, foi investigada a extração analítica de esqualeno do
destilado desodorizado de óleo de soja (DDOS), com dióxido de carbono
supercrítico (CO
2
-SC). A matriz foi inicialmente submetida a dois processos de
modificação físico-químicas: cristalização a baixas temperaturas e tratamento
com Na
2
CO
3
(cristalização/Na
2
CO
3
). Foram testadas quatro temperaturas e
dois tipos de solvente para a cristalização do DDOS. Verificou-se que a
condição de cristalização que acarretou menor massa não cristalizável (MNC)
foi a realizada em hexano seguida de acondicionamento em acetona a -40
o
C.
As modificações físico-química do DDOS reduziram em 41% os teores de
fitoesteróis totais, removeram em 98,9% os ácidos graxos livres (AGL) e
aumentaram a concentração de esqualeno em 84%. Durante a extração com
CO
2
-SC foram mantidas constantes as seguintes variáveis: quantidade de
amostra (15 mg), solvente de lavagem do coletor (n-hexano), temperatura do
x
restritor (55
o
C), temperaturas do coletor durante a extração (20
o
C) e durante a
reconstituição da amostra (55
o
C). Para a otimização da extração com CO
2
-SC,
inicialmente foram avaliados os efeitos de três temperaturas (40, 50 e 60
o
C) e
três pressões (110, 157 e 281 bar). Verificou-se que a pressão mais elevada e
a menor temperatura acarretaram o maior teor de esqualeno extraído (7,12
g/100 g), provavelmente devido a mais alta densidade do fluido (0,90 g/mL).
Posteriormente, foram testados dois tempos de extração estática (TEE de 0 e
5 min), dois fluxos de CO
2
(1 e 1,5 mL/min) e três tempos de extração dinâmica
(TED de 15, 20 e 25 min). Foi observado o maior teor de esqualeno (9,44 g/100
g), empregando-se o mais alto fluxo e os TEE e TED mais longos. Porém, os
níveis de esqualeno (9,33 g/100 g) obtidos com, TEE de 5 min, TED de 15 min
e fluxo de CO
2
-SC de 1,0 mL/min, não diferiram significativamente. Como
tempos e fluxos menores são economicamente mais viáveis, os parâmetros
otimizadas para a extração com CO
2
-SC foram: 40
o
C, 281 bar, 0,90 g/mL, 5
min (TEE), 15 min (TED) e fluxo de CO
2
de 1,0 mL/min. A metodologia
desenvolvida neste trabalho proporcionou um aumento de 2,8 vezes nos teores
de esqualeno, portanto, recomenda-se o estudo da relação custo/benefício,
assim como testá-la em escala piloto, para avaliar seu uso industrial.
xi
ABSTRACT
WOBETO, Carmen, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, March 2007.
Extraction of squalene in modified soy oil deodorizer distillate using
supercritical carbon dioxide. Adviser: Júlio Maria de Andrade Araújo.
Co-Advisers: Marco Túlio Coelho Silva and José Benício Paes Chaves.
In this work the analytical extraction of squalene in soy oil deodorization
distillate (SODD) by supercritical carbon dioxide (CO
2
-SC) was investigated.
The matrix was previously submitted to crystallization at low temperatures and
treatment with Na
2
CO
3
(crystallization/Na
2
CO
3
). Four temperatures and two
types of solvent were tested for crystallization of SODD. It was verified that the
crystallization condition that yielded lower mass of non cristalizable (MNC) was
storage in hexane and than in acetone, both at -40
o
C. The physical-chemistry
modifications of the SODD reduced in 41% the content of total phytosterols,
also was removed 98,9% of free fatty acid (FFA) and the concentration of
squalene increased in 84%. During the extraction with CO
2
-SC the following
variables were kept constant: amount sample (15 mg), sample reconstitution
solvent (n-hexane), temperature of the restrictor (55
o
C), temperatures of the
collector during the extraction (20
o
C) and during the reconstitution of the
sample (55
o
C). For the optimization of the extraction with CO
2
-SC, the effect of
three temperatures (40, 50 and 60
o
C) and three pressures (110, 157 and 281
bar) was initially evaluated. It could be concluded that the highest pressure and
the lowest temperature tested yielded the highest amount of extracted squalene
(7.12 g/100 g), probably because of the highest density of the fluid (0.90 g/mL).
Subsequently, two static extraction times (SET, 0 and 5 min), two CO
2
flow
rates (1 and 1.5 mL/min) and three dynamic extraction times (DET, 15, 20 and
25 min) were tested. The highest squalene amount (9.44 g/100 g) was obtained
by using the highest flow rate and longest SET and DET. However the squalene
levels (9.33 g/100 g) obtained with 5 min in SET, 15 min in DET and 1.0 mL/min
CO
2
flow rate did not differ significantly. Since more reduced times and flow
rates are more economically viable, the optimized parameters for the extraction
with CO
2
-SC were: 40
o
C, 281 bar, 0.90 g/mL, 5 min (SET), 15 min (DET) and
1.0 mL/min CO
2
flow rate. The methodology developed in this work provided a
concentration of 2.8 times in the squalene content, therefore, a study on the
cost/benefit ratio is recommended, as well as testing of pilot scale plant, in order
to assess its industrial potential.
1
1. INTRODUÇÃO
O esqualeno, um triterpeno precursor biossintético do colesterol, é
empregado como agente emoliente e umectante em formulações cosméticas e
farmacêuticas, além de lubrificante para instrumentos de precisão. Também é
proposto o seu uso em formulações nutracêuticas ou como alimento funcional,
pois apresenta ação anticarcinogênica, hipocolesterolêmica e antioxidante.
As fontes convencionais de esqualeno são o óleo de fígado de tubarão e
baleia. Contudo, fontes vegetais estão sendo amplamente propostas, em
virtude da preocupação com a preservação de espécies marinhas ameaçadas
de extinção (HE et al., 2002).
Como fontes vegetais destacam-se os óleos de oliva (0,1 a 0,7 g/100 g)
e de semente de amaranto - 3,6 a 6,1 g/100 g (HE et al., 2002; HE e CORKE,
2003). Uma alternativa é a utilização do destilado desodorizado de óleo de soja
(DDOS), um resíduo da refinação do óleo, pois é uma matriz com teores
apreciáveis de esqualeno, variando de 0,65 a 7,8 g/100 g (STOLDT e
BRUNNER, 1998; VERLEYEN et al., 2001).
Além disso, este resíduo apresenta baixo custo e ampla disponibilidade,
pois a produção nacional do óleo de soja é significativa, estimada na safra de
2006/2007 em 4,1 milhões de toneladas (ABIOVE, 2007), sendo que o
percentual produzido de DDOS corresponde de 0,1 a 0,4 % do óleo bruto
(MENDES et al., 2002).
2
Vários métodos de separação do esqualeno de matrizes biológicas
foram avaliados. A extração com CO
2
supercrítico (CO
2
-SC) é uma técnica de
separação viável para as indústrias de alimento e farmacêutica, pois este fluido
é inerte, não deixa resíduo no produto final e não gera resíduo ambiental
(COUTSIKOS et al., 2003).
A baixa polaridade do esqualeno garante boa solubilidade no CO
2
-SC e
sua suscetibilidade a oxidação é controlada, pois este processo de extração
ocorre na ausência de luz e oxigênio (CATCHPOLE et al., 2000a; KO et al.,
2002; BHATTACHARJEE e SINGHAL, 2003; HE et al., 2003).
A separação de esqualeno por CO
2
-SC foi investigada a partir de
diversas matrizes: óleo de fígado de tubarão, destilado desodorizado do óleo
de oliva (CATCHPOLE et al., 1997), óleo de oliva lampante (BONDIOLI et al.,
1992), óleo da semente de amaranto (HE et al., 2003) e farelo de arroz (KIM et
al., 1999). Contudo, não existem dados na literatura sobre a extração de
esqualeno do DDOS com CO
2
-SC.
O esqualeno apresenta baixo fator de separação com os ácidos graxos
livres (AGL) e fitoesteróis em sistemas de extração com CO
2
-SC (BONDIOLI et
al., 1992; MENDES et al., 2005). Por isso, neste estudo o DDOS foi submetido
a cristalização a baixas temperaturas para redução do teor de fitoesteróis e
tratamento com Na
2
CO
3
para a remoção de ácidos graxos livres; melhorando
deste modo a separação por CO
2
-SC do esqualeno no DDOS.
Considerando a importância do esqualeno para as indústrias
farmacêuticas e de alimentos em virtude de sua atividade biológica e a
necessidade da busca de fontes alternativas deste composto, bem como a
investigação de técnicas de separação, propôs-se neste estudo a otimização
das condições físico-químicas da extração com CO
2
-SC do esqualeno no
DDOS, submetido a processos prévios de purificação (cristalização e
tratamento com Na
2
CO
3
), a fim de se obter um extrato com maiores
concentrações deste composto.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Esqualeno: química, bioquímica e absorção
O esqualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22- tetrahexaneno)
é um lipídio hidrocarboneto insaponificável, contendo 6 duplas ligações não
conjugadas, pertencente ao grupo dos triterpenos, apresentando 6 unidades de
isopreno. Sua estrutura química é mostrada na Figura 1. O esqualeno atua
como precursor biossintético de todos os esteróis de plantas e animais (RAO et
al., 1998; HE e CORKE, 2003).
Figura 1 – Estrutura química do esqualeno.
4
A síntese endógena do esqualeno ocorre pela rota biossintética do
mevalonato/acetato e está esquematizada na Figura 2. Inicialmente três
moléculas de acetil-CoA condensam-se produzindo 3-hidróxi-3-metilglutaril-
CoA (HMG-CoA), que é reduzido pela HMG-CoA redutase em duas reações
acopladas, formando ácido mevalônico. Fosforilações dependentes de ATP do
ácido mevalônico e subseqüente descarboxilação produzem isopentenil
pirofosfato (IPP), a molécula doadora para todos os compostos
poliisoprenóides. As enzimas preniltransferase geram os ésters pirofosfato
alílicos geranil pirofosfato (GPP) e farnesil pirofosfato (FPP). Duas moléculas
de FPP são então unidas enzimaticamente resultando na formação de
esqualeno (CROTEAU et al., 2000).
Acetil-CoA
↓
HMG-CoA
↓
Mevalonato
↓
Isopentenilpirofosfato
(IPP)
↓
Geranilpirofosfato
(GPP)
↓
Farnesilpirofosfato
(FPP)
↓
Esqualeno
Figura 2 – Esquema simplificado da rota biossintética do esqualeno.
A HMG-CoA redutase é uma enzima regulatória responsável pelo
controle da biossíntese do colesterol. Por isso, esta enzima foi investigada para
o desenvolvimento de drogas hipocolesterolêmicas (LAAKSONEN et al., 1994).
Além disso, alguns estudos concluíram que a ação hipocolesterolêmica do
5
esqualeno estaria relacionada com a inibição da HMG-CoA redutase
(STRANDBER et al., 1989; MIETTINEN e VANHANEN, 1994; SHIN et al.,
2004).
Após sua biossíntese, o esqualeno pode ser transportado pelo
organismo, incorporando-se aos tecidos ou pode ser metabolizado, resultando
na formação de colesterol e outros esteróides (KELLY, 1999).
O esqualeno do plasma origina-se da síntese de colesterol endógena ou
de fontes dietárias, principalmente em populações que consumem grande
quantidade de óleo de oliva ou óleo de fígado de tubarão. Embora seu
metabolismo pós-absorção não tenha sido estudado com detalhes em
humanos, as evidências disponíveis indicam um percentual de absorção de 60
a 85% (MIETTINEN e VANHANEN, 1994). Até 90% do esqualeno é
transportado no plasma, geralmente em associação com lipoproteínas de baixa
densidade e distribuído aos tecidos humanos. O tecido epitelial é o que
apresenta a mais alta concentração deste composto, que se constitui no lipídio
mais abundante da superfície da pele. Baseado em evidências com animais, a
administração oral prolongada pode resultar em acumulação significativa desta
substância no fígado - 3 a 6 % da dose oral (GYLLING e MIETTINEN, 1994).
2.2. Ação antioxidante e mecanismos anticarcinogênicos do esqualeno
A ação antioxidante do esqualeno foi investigada empregando-se
modelos de reações de seqüestro de oxigênio singlete e de radical 1,1-difenil-
2- picril-hidrazil (KOHNO et al., 1995; KO et al., 2002). Também foi observado
que o esqualeno inibe a atividade da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima
A redutase (HMG-CoA redutase), acarretando diminuição da disponibilidade de
grupos farnesil pirofosfato para a prenilação de proteínas oncogênicas e
interferência na transdução de gene ras (Newmark, 1997, apud KO et al., 2002;
RAO et al., 1998; SMITH et al., 1998); além de efeitos hipocolesterolêmicos
(MIETTINEM e VANHANEN, 1994; KHOR e CHIENG, 1997) e cardioprotetores
(FARVIN et al., 2004).
Os efeitos antioxidantes e anticarcinogênicos do esqualeno dietário têm
intensificado seu uso em formulações de nutracêuticos ou alimentos funcionais.
6
No Japão é comercializado um produto alimentar a base de óleo de fígado de
tubarão, que apresenta altos teores de esqualeno, denominado “shinkaizame-
ekisu” (KO et al., 2002; REICHERT, 2002).
A ação antioxidante do esqualeno foi estudada e relacionada com
mecanismos de defesa ao estresse oxidativo, principalmente em tecidos
epiteliais humanos. As altas taxas de seqüestro de oxigênio singlete pelo
esqualeno também foram apontadas como possíveis mecanismos de sua ação
antimutagênica, pois os radicais livres oxigenados (RLO) interagem com o DNA
acarretando mutações.
Depois de ingerido o esqualeno é estocado nos tecidos epiteliais,
constituindo-se o lipídio mais abundante deste tecido em humanos, porém
normalmente é ausente em outros primatas. A superfície da pele é uma
interface biológica com o ambiente, portanto é sensível ao estresse oxidativo
ambiental (MIETTINEN e VANHANEN, 1994; KOHNO et al., 1995).
A exposição da pele à radiação causa peroxidação de seus lipídios,
podendo levar a destruição de biomembranas, inflamações e até mesmo
câncer. Por isso, a pele requer substâncias que previnam estas reações
(KOHNO et al., 1995).
Espera-se que a prevenção da peroxidação de lipídios da pele seja
muito eficiente em humanos como resultado da evolução, pois, devido à
ausência de pêlos, eles são mais suscetíveis a radiação solar do que os
demais primatas. Presume-se que o esqualeno na pele humana esteja
relacionado com a prevenção da peroxidação de lipídios da pele (KOHNO et
al., 1995).
KOHNO et al. (1995) investigaram as reações do esqualeno como
seqüestrante de oxigênio singlete e com modelos de radicais peroxil (LOO
?
) em
n-butanol, para elucidar o papel do mesmo na pele humana. Foram usados os
radicais 2,6-di-t-butil-4-(4-metoxifenil) fenoxil e 5,7-diisopropil tocoferil como
modelos de LOO
?
, pois trabalhos anteriores demonstraram que a relação
reativa não depende do tipo de oxiradical usado. Observou-se que a taxa de
seqüestro de oxigênio singlete do esqualeno foi menor do que a do a-tocoferol,
maior do que a do hidroxitolueno butilado (BHT) e bem superior a dos demais
lipídios encontrados na pele humana. Estes resultados sugerem que o
7
esqualeno funciona como um eficiente seqüestrante de oxigênio singlete e,
portanto, previne a peroxidação de lipídios na pele humana.
Outros trabalhos também demonstraram o efeito antioxidante de extratos
vegetais contendo esqualeno. KO et al. (2002) observaram que os extratos de
folhas de T. Catappa, obtidos por extração com CO
2
-SC, com mais alta
concentração de esqualeno, exibiram maior potencial antioxidante e atividade
seqüestrante de DPPH (1, 1- difenil - 2- picril - hidrazil) mais efetiva.
Por outro lado, FARVIN et al. (2004) observaram efeitos cardioprotetores
pela administração oral de esqualeno (2 % por 45 dias), antes da indução de
infarto do miocárdio por isoproterenol em ratos albinos machos. Assim,
concluíram que estes efeitos devem-se às propriedades antioxidantes desta
substância e sua ação na estabilização da membrana das células do tecido
cardíaco.
O desenvolvimento do câncer é reconhecido como um processo
microevolucionário que requer ações cumulativas e eventos múltiplos. Estes
eventos ocorrem em um modelo simplificado de três estágios: a indução de
mutação do DNA em células somáticas (iniciação); estimulação da expansão
tumorgênica do clone celular (promoção) e conversão maligna do tumor
(progressão). Os radicais livres oxigenados (RLO), particularmente os radicais
peroxil, podem estimular o desenvolvimento de câncer em todos os três
estágios. Em vista da ubiqüidade dos RLO em organismos aeróbicos este
potencial carcinogênico é preocupante. Alternativamente estes conhecimentos
podem abrir novas perspectivas para a prevenção de câncer, especialmente
com relação à investigação do potencial antioxidante de algumas substâncias
(DREHER e JUNOD, 1996).
Considerando-se que o efeito radioprotetor do esqualeno em
camundongos irradiados e a atividade protetora antitumoral de esqualeno na
carcinogênese epitelial se devem às suas propriedades antioxidantes,
demonstradas por sua eficiência como seqüestrante de oxigênio singlete e na
prevenção de peroxidação de lipídios na superfície da pele humana (KOHNO et
al., 1995; MURAKOSHI et al., 1992; Van DUUREN e GOLDSCHMIDT, 1976).
O’SULLIVAN et al. (2002) também constataram a relação entre a ação
antioxidante do esqualeno e a prevenção de mutações genéticas, ao
investigarem os efeitos da suplementação de ácido eicosapentaenóico, ácido
8
docosahexaenóico ou esqueleno, por 24 horas, em células fibroblásticas V79
de hamster, contra danos ao DNA induzidos por oxidação com peróxido. Estes
autores observaram que o pré-tratamento com esqualeno acarretou
decréscimos significativos destes danos, sendo este composto mais efetivo do
que os ácidos eicosapentaenóico e docosahexaenóico.
Algumas modificações das bases de DNA relacionadas aos RLO podem
induzir pontos de mutação pelo erro de leitura durante a replicação. Uma das
modificações oxidativas de bases do DNA mais observadas é a formação de 8-
hidroxi-guanina (8-OH-Gua), ocorrendo em aproximadamente um em cada
100.000 resíduos de guanina em células humanas normais. A 8-OH-Gua pode
produzir substituição de guanina-citosina (GC) por tiamina-adenina (TA), o que
é freqüentemente detectado no oncogene ras, representando um possível
mecanismo de iniciação de tumor por RLO (DREHER e JUNOD, 1996). O
oncogene ras foi observado em vários tipos de cânceres nos quais o esqualeno
teve efeito supressivo.
A substituição de GC por TA, no gene supressor de tumor TP53 foi
observada em cânceres de pulmão e fígado. Através da ativação do oncogene
ou da inativação do gene supressor de tumor, estes pontos de mutação podem
conduzir à iniciação de carcinogênese, assim como ter participação na
progressão do tumor em um estágio posterior (DREHER e JUNOD, 1996).
Os efeitos antitumorais do esqualeno em câncer de pulmão foram
investigados por SMITH et al. (1998), que induziram tumores nos pulmões de
camundongos fêmeas pela administração de dose única (103 mg/kg de peso
corpóreo) de 4-metilnitrosamino-1-3-piridil-1-butanona e analisaram os efeitos
da dieta com altos teores de óleo de oliva (19,61 %) ou esqualeno (2 %). Para
todos os grupos de animais analisados, inclusive o controle, foram formuladas
dietas com a mesma composição química de nutrientes e administradas por 3
semanas anteriores à dosagem da nitrosamina e mantida por um período de 16
semanas. Os pesquisadores observaram que as dietas com óleo de oliva e
esqualeno diminuíram significativamente a multiplicação de tumores nos
pulmões em 46 e 58%, respectivamente. Além disso, com a dieta contendo
esqualeno foi identificado um decréscimo de 70% na hiperplasia dos pulmões.
A nitrosamina 4-metilnitrosamino-1-3-piridil-1-butanona é formada
durante o processamento do tabaco para produzir os cigarros, comprovou-se
9
em animais experimentais, ser a nitrosoamina mais potente na carcinogênese
de pulmões. Esta nitrosamina é ativada pelo complexo enzimático citocromo
P450, o que leva a formação de espécies altamente reativas capazes de
acarretar danos no DNA celular, induzindo a ativação do ongene K-ras que é
responsável pela proliferação e progressão de tumores malignos em pulmões
(HECHT, 1994; HOFFMANN et al., 1994).
RAO et al. (1998) constataram o efeito inibitório do esqualeno na
formação de lesões pré-neoplásicas no colo intestinal de ratos F344, induzidas
por azoximetano (15mg/kg de peso corpóreo, 2 vezes por semana, durante 2
semanas). Este efeito foi observado pela ingestão de 1% de esqualeno por 10
semanas, e, como resultado, o número total de lesões decresceu entre 40 e
50% quando comparado com o grupo de animais alimentados com a dieta
controle. Lesões pré-neoplásicas podem expressar mutações no gene APC e
no oncogene ras.
Os mecanismos exatos envolvidos na ação anticarcinogênica do
esqualeno em vários tipos de cânceres não são completamente conhecidos.
Porém, além de sua ação no seqüestramento de radicais livres, também foi
citado ser devido à modulação com a rota biossintética do colesterol através de
inibição enzimática (RAO et al., 1998).
Alguns estudos relataram o efeito inibitório do esqualeno na atividade da
3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMG-CoA redutase) Este efeito
estaria relacionado a um mecanismo de retro-alimentação (“feedback”), pois,
conforme esquematizado na Figura 2, o esqualeno é produzido pela redução
de HMG-CoA, produzindo mevalonato, uma seqüência de várias reações que
produzem FPP, culminando com a condensação de duas destas moléculas
(STRANDBERG et al., 1989; MIETTINEN e VANHANEN, 1994; SHIN et al.,
2004). Portanto, a inibição da HMG-CoA redutase pode levar à redução de uma
série de intermediários tais como mevalonato, FPP e GPP, estes últimos são
essenciais para a ativação de várias proteínas intracelulares (GRAAF et al.,
2004).
A prenilação de proteínas é uma adição covalente do grupo farnesil (15
C) ou geranil (20 C) ao resíduo cisteína na carboxila terminal de várias
proteínas G, que estão envolvidas em processos de sinalização celular. Como
exemplos destas proteínas têm-se as oncogênicas ras, transdução γ, quinase e
10
rodopsina, que são dependentes da prenilação para serem ativadas (ADJEI,
2003; GRAAF et al., 2004).
A translocação da proteína ras do citosol para a membrana celular
somente ocorre após sua farnesilação. A união das proteínas ras farnelisadas,
com ligantes apropriados para receptores tirosina quinase, resulta na interação
entre ras associadas a GDP inativas e receptores de membrana.
Subseqüentemente, o GDP é trocado por GTP e a sinalização em cascata é
ativada. Proteínas ras farnelisadas estão associadas com sinal de transdução
na resposta para a estimulação do fator de crescimento celular e supressão de
apoptose (GRAAF et al., 2004). Portanto, o efeito anticarcinogênico do
esqualeno poderia estar relacionado com a inativação da enzima HMG-CoA
redutase, devido ao decréscimo na síntese de compostos farnesil pirofosfato
(RAO et al., 1998; SMITH et al., 1998).
A ação anticarcinogênica do esqualeno pode estar também relacionada
à sua interação metabólica com xenobióticos carcinogênicos. SMITH et al.
(1998) investigaram os efeitos do esqualeno dietário sobre o metabolismo de 4-
(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)1-butanona (NNK) no microssomo de tecidos
hepáticos e pulmonares de camundongos, e observaram que dietas contendo
2% de esqualeno, por 3 semanas, aumentaram significativamente a formação
de NNK-N-óxido, um produto de desintoxicação. Estes resultados sugerem que
o esqualeno, ou seu metabólito, esteja envolvido na ativação de NNK pelo
citocromo P450. Contudo, a contribuição destas mudanças no metabolismo de
NNK sobre a tumorgênese não é clara e necessita de investigações
posteriores.
Estudos específicos do efeito antitumoral do esqualeno em câncer de
colo intestinal apontam também para a hipótese de que dietas com esqualeno
possam inibir a biossíntese de ácidos biliares, que foram apontados como
promotores de tumores de colo (RAO et al., 1998).
2.3. Ação hipocolesterolêmica do esqualeno
O papel do esqualeno dietário na regulação da concentração de
colesterol sérico, na síntese e eliminação do colesterol, assim como na cinética
de proteínas de baixa densidade (LDL) e apolipoproteínas B foi investigado e
apresentou resultados contraditórios.
11
STRANDBERG et al. (1989) dosaram os níveis dos precursores do
colesterol em ratos alimentados com 1% de esqualeno e observaram inibição
significativa da atividade da enzima HMG-CoA redutase, portanto, com efeito
específico na redução da síntese de colesterol endógeno. Enquanto que, SHIN
et al. (2004) observaram que o esqualeno, extraído de sementes de amaranto,
inibiu apenas ligeiramente a atividade da HMG-CoA redutase.
A ação hipocolesterolêmica do esqualeno, em combinação com a
administração de tocotrienóis, foi observada por KHOR e CHIENG (1997).
Porém, MIETTINEN e VANHANEN (1994) demonstraram que o uso somente
do esqualeno foi efetivo no decréscimo dos níveis de colesterol sérico. Já,
NAKUMURA et al. (1997), testando dosagem crônica de esqualeno (8,62-86,22
mg/dia durante 25 dias) ou única (86,22 mg) em ratos, observaram que a
administração oral de esqualeno não teve efeito sobre lipídios hepáticos ou
séricos, porém acarretou aumento na excreção de esteróides neutros e ácidos
biliares.
SHIN et al. (2004) avaliaram, em ratos, o efeito hipocolesterolêmico de
esqualeno extraído de óleo de fígado de tubarão e de amaranto. Eles
observaram que o esqualeno extraído de óleo de semente de amaranto reduziu
os teores de colesterol no sangue e no fígado, além de provocar aumento de
excreções fecais de colesterol e ácidos biliares. Enquanto que, na
administração de esqualeno de origem animal não foi observado nenhum
destes efeitos. Os resultados sugerem que a redução de níveis de colesterol,
por ação do esqualeno de amaranto, pode estar relacionada ao aumento da
eliminação fecal de esteróides e à interferência na absorção do colesterol.
2.4. DDOS: uma fonte alternativa de esqualeno
No processamento do óleo de soja inicialmente os grãos são laminados,
o óleo bruto é extraído com hexano e o refino posteriormente. Na Figura 3
estão identificadas as etapas do processamento (MENDES et al., 2002).
O refino do óleo é necessário para a remoção de substâncias que são
prejudiciais à qualidade do produto. As etapas do refino são a degomagem,
neutralização, branqueamento e desodorização (ERICKSON, 1995).
12
A desodorização é realizada para a remoção de compostos voláteis e
coloridos, que poderiam produzir cheiro, cor ou sabor desagradáveis ao
produto final. Trata-se de uma destilação por arraste a vapor com temperaturas
variando de 240 a 260
o
C e pressões na faixa de 2 a 6 mbar. Durante a
condensação do vapor de água uma fase lipofílica precipita, constituindo-se um
resíduo do processamento, o DDOS (MORETTO e FETT, 1998; BUCZENKO et
al., 2002).
Figura 3 – Etapas do processamento de óleo de soja: prensagem (1), extração
com hexano (2), refino (3), branqueamento (4) e desodorização (5).
Adaptado de MENDES et al. (2002).
O aproveitamento dos subprodutos ou resíduos do refino do óleo de soja
é de relevância econômica para a indústria, pois este é um dos mais
consumidos no mundo, representando 54% do consumo de óleos no mercado
mundial (MENDES et al., 2002). No Brasil, destaca-se a produção significativa
de grãos de soja, estimada em 2006 em 52 milhões de toneladas (IBGE, 2006).
Além disso, a produção nacional do óleo de soja foi avaliada na safra de
2006/2007 em 4,1 milhões de toneladas (ABIOVE, 2007). O DDOS gerado
varia de 0,1 a 0,4% do peso do óleo bruto original (WOERFEL, 1981).
O DDOS apresenta em sua composição substâncias biologicamente
ativas, como fitoesteróis, tocoferóis e esqualeno. Por isso, essa matriz já foi
investigada para a extração de tocoferóis e fitoesteróis (ARAÚJO et al., 2000;
CHANG et al., 2000). Contudo, ainda não existem dados com relação ao seu
uso para a extração de esqualeno.
13
As fontes convencionais de esqualeno são o óleo de fígado de tubarão e
baleia, com concentrações variando de 40 a 75 % em massa (CATCHPOLE et
al., 1997; HE et al., 2002). Contudo, sua disponibilidade a partir destas fontes é
limitada devido à preocupação mundial com a proteção de animais marinhos
ameaçados de extinção. Além disso, a presença de compostos similares ao
colesterol pode dificultar a extração do esqualeno. Há interesse em buscar
outras fontes potenciais deste composto, e as fontes vegetais estão sendo
amplamente propostas (HE et al., 2002; KO et al., 2002; MATEOS et al., 2003).
O conteúdo de esqualeno em óleo de oliva, germe de trigo e farelo de
arroz varia de 0,1 a 0,8 g/100 g, enquanto que o óleo de semente de
Amarantthus apresenta níveis de esqualeno de 3,6 a 6,1 g /100 g (HE et al.,
2002; MATEOS et al., 2003). O DDOS é uma fonte alternativa de esqualeno,
apresentando níveis desta substância de 0,65 a 7,8 g/100 g (STOLDT e
BRUNNER, 1998; VERLEYEN et al., 2001).
Na Tabela 1 é descrita a composição química aproximada do DDOS
obtida de diversas fontes da literatura. Verifica-se a complexidade do DDOS
devido à diversidade de substâncias encontradas e a ampla faixa de variação
nos teores destas substâncias, que ocorre devido as diferenças inerentes a
matéria-prima empregada para o processamento do óleo e as condições físicas
da destilação, tais como: temperatura, pressão e tempo (WOERFEL, 1981;
STOLDT e BRUNNER, 1998; VERLEYEN et al., 2001).
Além disso, a técnica de refino também altera a concentração dos
constituintes do DDOS. No refino físico, os ácidos graxos livres são
vaporizados durante o processo de desodorização, conseqüentemente o
DDOS contém maior quantidade de ácidos graxos livre (> 80%) com pequena
quantidade de insaponificáveis (5 -10%). No refino químico os ácidos graxos
livres são neutralizados por uma solução cáustica e removidos do óleo antes
da desodorização, portanto, contêm uma menor concentração de ácidos graxos
livres (30 – 50%) e níveis mais elevados de insaponificáveis (25 a 33%). Os
níveis de esqualeno nos DDOS obtidos no refino por processos químicos
variaram de 1,28 g/100 g a 2,09 g/100 g, enquanto que, no DDOS oriundo de
processo físico de refino o teor desta substância foi de 0,65 g/100g
(VERLEYEN et al., 2001).
14
Tabela 1- Composição química aproximada do DDOS.
Substância
s
Variação de teores (g/100 g)
Compostos voláteis 0,10 – 9,30
a
Esqualeno 0,65 -7,80
a, b, c, d
AGL 25,30- 89,30
d,
e
,
f
d-Tocoferol 2,01 – 5,59
c, d
ß-Tocoferol 0,18 – 0,52
c, d
?
-
Tocoferol
4,96 – 11,26
c, d
a-Tocoferol 0,54– 2,2
a
, c, d, h
Tocoferois totais 4,1 – 14,7
d,
e,g,h,i
Triglicerídios 1,70 – 5,91
a, c
Diacilglicerídos 1,70 – 8,06
a, c
Monoacilglicerídios 1,24 -9,2
a, c
Campesterol 1,20 – 5,2
a, c, d, h
Estigmaesterol 1,38-5,2
c, d, h
ß
-
sitosterol
3,03-13,30
c, d, h
Esteróis totais 4,1 – 22,6
a, d, e, g,h
a
BRUNNER et al. (1991)
b
STOLDT e BRUNNER (1998)
c
VERLEYEN et al. (2001)
d
RAMAMURTHI e McCURDY (1993)
e
NAGESHA et al. (2003)
f
CHANG et al. (2000)
g
QUANCHENG et al. (2004)
h
WOERFEL (1981)
i
ARAUJO et al. (2000).
2.5. Fundamentos da cristalização
O processo de cristalização refere-se à formação de cristais a partir de
uma solução homogênea. É essencialmente uma técnica de separação sólido-
líquido com ampla aplicação nas indústrias química, farmacêutica e alimentícia
(PAUL et al., 2005).
As moléculas no estado cristalino apresentam-se como uma matriz
tridimensional ordenada, exibindo periodicidade e simetria. Todas as moléculas
são equivalentes em relação à sua energia de ligação, o que faz com que a
15
mudança do estado cristalino ocorra em uma temperatura fixa. No estado não-
cristalino (amorfo ou vítreo) também ocorre a formação de uma rede
tridimensional, porém não apresentando periodicidade ou simetria. Portanto,
nem todas as moléculas encontram-se igualmente ligadas à rede e a mudança
de estado ocorre em uma faixa de temperatura. O estado cristalino
corresponde à forma estável do material, isto é, aquela que se desenvolve em
condições de equilíbrio. Os materiais não cristalinos são instáveis, existindo em
um estado metaestável. A transição para a forma cristalina ocorre em uma
determinada faixa de tempo (SCHMIDT, 2004).
A compreensão da transição do estado amorfo para o cristalino envolve
os conceitos de solubilidade, saturação e supersaturação. Quando uma
solução contém a quantidade total de sólido que é capaz de dissolver, diz-se
que está “saturada”. A saturação é um estado de equilíbrio termodinâmico
estável entre as fases sólida e líquida, e corresponde ao ponto em que o
potencial químico do soluto na solução é idêntico ao potencial químico de um
cristal puro de tamanho infinito. A solubilidade varia com o tipo de soluto,
solvente e temperatura. A maioria das substâncias exibe um aumento de
solubilidade com a elevação da temperatura (MONTES, 2004).
Mesmo em concentrações superiores à da saturação, os cristais podem
não aparecer imediatamente. O sólido pode continuar dissolvido, em uma
situação de equilíbrio metaestável, e diz-se que a solução é “supersaturada”.
Na realidade, na zona metaestável as taxas de nucleação são muito pequenas
e o aparecimento de cristais pode levar anos (TERAN-ORTIZ, 2004).
A cristalização a partir de soluções envolve as seguintes etapas
fundamentais: o estabelecimento da força motriz, a formação do núcleo ou
nucleação (centro) do cristal e o seu crescimento. A primeira etapa do processo
de cristalização é a geração de um potencial suficiente para que a mesma
ocorra, o que está associado à estrutura da solução e ao desenvolvimento da
supersaturação (YU et al., 2004).
Existe uma correlação definida entre a concentração e a temperatura na
qual se formarão espontaneamente cristais em uma solução pura. Esta
correlação é representada graficamente na Figura 4 pela curva de
supersolubilidade, deslocada em relação à curva de solubilidade praticamente
por um mesmo fator constante. A formação espontânea de cristais ocorre
16
acima de um determinado coeficiente de supersaturação, indicado pela zona
lábil na Figura 4 (TERAN-ORTIZ, 2004).
Figura 4 - Etapas da cristalização por resfriamento (adaptado de PAUL et al.,
2005).
Em uma solução, a supersaturação pode ser criada de três formas
distintas: pelo resfriamento de uma solução não-saturada até um ponto onde a
concentração da solução exceda a concentração de solubilidade naquela
temperatura; ou pela evaporação de parte do solvente, acarretando um
aumento na concentração; e também pela adição de um segundo solvente, no
qual o soluto é insolúvel (Hartel, 1992, apud MONTES, 2004).
O processo de nucleação pode ser homogêneo ou heterogêneo. A
nucleação homogênea ocorre em sistemas puros, no qual os núcleos são
exclusivamente formados pela fase sólida pura e atuam como sítios para a
formação do cristal. Por sua vez, a nucleação heterogênea ocorre quando
partículas sólidas atuam como sítios catalíticos para a formação do cristal. Este
Zona lábil
17
último é comum em cristalizadores, cujas partículas introduzidas são
denominadas sementes.
O crescimento dos cristais é dependente da superação do chamado
tamanho crítico, que representa uma barreira de energia a ser superada pelo
núcleo antes de tornar-se estável. Assim que os agregados ordenados atinjam
um tamanho mínimo necessário, sua solubilidade torna-se menor do que dos
grupos menores transitórios, portanto seu crescimento é favorecido absorvendo
o soluto circundante e estes funcionarão como núcleo de cristalização. Quanto
mais elevada a saturação, menos transitórios são estes grupos e alguns deles
podem orientar-se com uma maior probabilidade (TERAN-ORTIZ, 2004).
O mecanismo de nucleação compreende duas fases: primária e
secundária. A nucleação primária é caracterizada pelo nascimento dos cristais
na ausência de cristais anteriores. No processo de nucleação secundária o
crescimento dos cristais é iniciado pelo contato com a solução, outros cristais
ou com as paredes do recipiente. Em cristalizadores, sob violenta agitação,
desencadeia-se o desprendimento de fragmentos que formarão novos núcleos.
(PAUL et al., 2005).
2.6. Aplicações do processo de cristalização
Os fitoesteróis fazem parte da porção insaponificável de óleos vegetais,
sendo que nestas fontes geralmente são encontrados estigmaesterol,
brasicaesterol, ß-sitosterol e campesterol. Conforme observado na Figura 5 os
mesmos apresentam estruturas químicas similares, porém com variação no
número e localização das insaturações e no número de átomos de carbono que
compõem a cadeia principal. Portanto, apresentam propriedades físicas muito
semelhantes, como por exemplo, sua solubilidade (XU et al., 2005).
18
OH
C
2
H
5
OH
C
2
H
5
OH
CH
3
OH
CH
3
Estigmaesterol
Sitosterol
Campesterol
Brasicaesterol
Figura 5 - Fitoesteróis encontrados em óleos vegetais.
XU et al. (2005) investigaram a separação de ß-sitosterol e
estigmaesterol em mistura de fitoesteróis baseando-se na diferença de
solubilidade destes compostos com a redução da temperatura usando n-
pentanol e ciclohexanona como solventes. Eles obtiveram uma concentração
de ß-sitosterol de 85% após três estágios de operações de recristalização em
ciclohexanona e estigmaesterol com pureza de 90% após cinco estágios de
cristalização fracionada em n-pentanol ou ciclohexanona.
Outra aplicação da cristalização é no refino de óleos comestíveis. A
versatilidade da aplicação de óleos, em formulações de alimentos, pode ser
significativamente aumentada pela disponibilidade de processos para modificar
o balanço sólido-líquido dos triglicerídios, em uma variação de temperatura de
interesse para aplicações específicas (HAMM, 1995).
A “winterização” é um processo de cristalização a baixas temperaturas,
usualmente 6
o
C por 24 horas, que utiliza acetona ou hexano como solventes,
com o objetivo de remover compostos de alto ponto de fusão, prevenindo deste
19
modo a turbidez do óleo devido a solidificação de algumas substâncias
(HAMM, 1995).
Também é possível o emprego de cristalização fracionada, na qual são
utilizadas diferentes temperaturas, a fim de se obter um produto com uma
composição de triglicerídios com propriedades específicas, como solubilidade,
ponto de fusão ou composição de ácidos graxos
LÓPES-MARTÍNEZ et al. (2004) empregaram a winterização no refino
de óleo de sementes de Echium fastuosum, para obter um produto com altos
teores de ácido ?-linolênico. Testaram diferentes concentrações do óleo (10%,
20% e 40%), em diferentes solventes (hexano, acetona, éter dietílico,
isobutanol e etanol), nas temperaturas de cristalização de 4
o
C, -24
o
C e -70
o
C.
A mais alta concentração de ?-linolênico foi obtida usando a concentração de
óleo de 10% em hexano e acondicionamento a -24 ou -70
o
C, pois não foram
observadas diferenças significativas para estas temperaturas.
2.7. Princípios da extração com fluido supercrítico
O estado supercrítico foi descrito pela primeira vez em 1822 pelo Barão
Gagniard de la Tour. Em 1879 Hannay e Hogarth demonstraram o poder
solvente dos fluidos supercríticos. Porém, as primeiras aplicações industriais e
analíticas somente ocorreram na década de 1970 (SIHVONEN et al., 1999). A
primeira planta industrial de extração com CO
2
-SC foi instalada em 1978, para
descafeinização de grão verdes de café (Kaffe HAG AG – Alemanha). Dois
anos mais tarde surge outra indústria (Carlton & Breweries - Austrália), para a
extração de flavour de lúpulo (RAVENTÓS et al., 2002).
O estado supercrítico é alcançado quando a temperatura e a pressão de
uma substância pura são aumentadas acima do seu ponto crítico (Figura 6). A
temperatura crítica é definida como a temperatura máxima, na qual um gás
pode ser convertido em um líquido, pelo aumento de pressão. Da mesma forma
a pressão crítica é a pressão máxima, na qual um líquido pode ser convertido
em um gás, mediante o aumento da temperatura (LEITNER, 2000).
20
Figura 6 – Diagrama de fases para uma substância pura (T
c
= temperatura
crítica e p
c
= pressão crítica). Fonte: POLIAKOFF e KING (2001).
No estado supercrítico desaparece a distinção entre as fases líquida e
gasosa e o fluido não pode mais ser liquefeito, pelo aumento de pressão e nem
pode tornar-se gasoso, pelo aumento de temperatura. Assim, propriedades
físico-químicas, tais como densidade, difusividade, constante dielétrica e
viscosidade podem ser facilmente controladas pelas alterações de pressão
e/ou temperatura, sem cruzar os limites de fases (DEL VALLE e AGUILERA,
1999).
Conforme observado na Tabela 2 os fluidos supercríticos (FS) exibem
propriedades físico-químicas intermediárias entre um gás e um líquido. A
densidade dos FS é semelhante à dos líquidos típicos, enquanto que, a
difusividade e a viscosidade assemelham-se mais aos gases. Estas
características peculiares conferem aos mesmos, propriedades químicas
(solvatação) e físicas (de transporte) favoráveis, tornando-os solventes em
potencial (LANG e WAI, 2001).
21
Tabela 2 – Comparação das propriedades físico-químicas de fluidos
supercríticos, gases e líquidos.
Estado físico
Densidade
(g/cm
3
)
Difusividade
(cm
2
/s)
Viscosidade
(g/cm.s)
Gás
P = 1 atm, T= 15 –30
o
C
0,6 – 2,0 x 10
-3
0,1 – 0,4
1 – 3 x 10
-4
Líquido
P = 1 atm, T= 15 –30
o
C
0,6 – 1,6
0,2 – 2,0 x 10
-5
0,2 – 3,0 x 10
-2
Supercrítico
P = P
c
; T = T
c
P = 4P
c
; T = T
c
0,2 – 0,5
0,4 – 0,9
0,7 x 10
-3
0,2 x 10
-3
1 – 3 x 10
-4
3 – 9 x 10
-
4
Fonte: ENGELHARDT e GROSS (1991).
Devido à alta compressibilidade dos FS, pequenas alterações de
temperatura e, principalmente pressão, acarretam grandes alterações na
densidade do fluido, sendo que esta tendência é mais acentuada em
temperaturas mais próximas ao ponto crítico. Estas características são
observadas na Figura 7, na qual a densidade do CO
2
-SC varia drasticamente
nas isotermas 32,1 e 40,15
o
C, enquanto que, esta mesma tendência não é tão
acentuada nas isotemas 70,15 e 120,15
o
C (SIHVONEN et al., 1999).
O desenvolvimento dos processos de extração com FS é dependente do
poder solvente do fluido e da volatilidade do soluto. O poder solvente do FS
está diretamente relacionado com sua densidade, que aumenta à medida que a
pressão aumenta ou a temperatura diminui. Ambos os fatores (densidade e
volatilidade) interagem de forma complexa, de modo que, quando a
temperatura aumenta isobaricamente, existem duas tendências opostas: o
poder solvente do FS diminui com o decréscimo da densidade ou aumenta com
a volatilidade do soluto (DEL VALLE e AGUILERA, 1999).
22
Figura 7 – Relação da pressão e densidade do CO
2
-SC em várias
temperaturas. (Adaptado de ISMADJI e BHATIA, 2002).
Na Figura 8 é mostrada a solubilidade de triglicerídios (substância com
baixa volatilidade) em CO
2
-SC, observa-se que a solubilidade aumenta com o
aumento da temperatura e da pressão, devido ao aumento da volatilidade do
soluto. Contudo, em temperaturas mais elevadas (80
o
C) a solubilidade diminui
drasticamente com o decréscimo da pressão, em virtude do decréscimo da
densidade do solvente. Na verdade, quando a substância a ser extraída por
CO
2
-SC apresentar maior pressão de vapor, sua solubilidade irá aumentar em
temperaturas menores (mais próximas à temperatura crítica) e pressões mais
elevadas (ISMADJI e BHATIA, 2002).
50 100 150 200 250 300 350 400 450
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Densidade (g/mL)
Pressão (bar)
T= 32,15
o
C
T= 40,15
o
C
T= 50,15
o
C
T= 70,15
o
C
T= 120,15
o
C
23
Figura 8 – Solubilidade de triglicerídios em CO
2
-SC em várias pressões e
temperaturas. Adaptado de DEL VALLE e AGUILERA (1999).
A extração e o fracionamento de produtos nos FS são realizados em
duas etapas operacionais: a extração seletiva e a separação seletiva. A
primeira envolve a manipulação das condições termodinâmicas de temperatura
e pressão e/ou da modificação do solvente pela adição de um cosolvente. A
segunda etapa é obtida por meio da despressurização, aquecimento ou
resfriamento gradual do extrato, permitindo deste modo um fracionamento
controlado dos produtos extraídos (MOHAMED, 1997; BRUNNER, 2005).
A maioria das aplicações com FS utilizam o dióxido de carbono como
solvente devido à fácil manipulação, uma vez que sua pressão (73,8 bar) e
temperatura críticas (31,1
o
C) são relativamente mais baixas do que outras
substâncias (Tabela 3). Além disso, este fluido é quimicamente inerte, não
inflamável, não tóxico, disponível a custos baixos com pureza elevada e não
gera resíduos ambientais (o CO
2
após despressurizado pode ser filtrado e
recuperado). Ressalta-se também seu emprego para a extração de produtos
termolábeis ou suscetíveis a oxidação, pois sua temperatura crítica é próxima a
200 300 400 500 600 700
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
24
do ambiente e o processo extrativo ocorre na ausência de luz e oxigênio
(COUTSIKOS et al., 2003).
Contudo, as altas pressões envolvidas em processos de extrações com
FS dificultam a introdução contínua de sólidos no extrator, assim como
requerem equipamentos e processos otimizados. Portanto, apresentam custos
elevados de instalação e manutenção, sendo viáveis somente para a
recuperação de compostos com alto valor agregado (JOHNSTON et al., 1989;
BRUNNER et al., 2005).
Na Tabela 3 constam os parâmetros, temperatura crítica (Tc), pressão
crítica (Pc) e densidade crítica (dc) de algumas substâncias que poderiam ser
usadas como FS. O dióxido de carbono pelas características acima citadas é
empregado na maioria das extrações com FS. Porém, possui limitações em
decorrência de sua baixa polaridade, sendo, portanto um solvente mais
eficiente para compostos apolares (CASTRO e JIMÉNEZ-CARMONA, 2000).
Devido aos seus baixos parâmetros críticos o óxido nitroso também
poderia ser empregado, porém é tóxico e explosivo na presença de altas
concentrações de compostos orgânicos (ARAÚJO, 2004). Por outro lado, a
água, devido a sua polaridade, poderia ser empregada para extração de
substâncias com propriedades químicas semelhantes, porém sua temperatura
e a pressão críticas muito elevadas comprometem o seu uso como FS. Além
disso, a água se torna corrosiva acima de seu ponto crítico (CASTRO e
JIMÉNEZ-CARMONA, 2000).
Uma das estratégias empregadas para alterar a polaridade do CO
2
-SC é
a adição de pequenas quantidades de cossolvente. Os mais utilizados são o
metanol e o etanol (YANG et al., 1995). O esqualeno, no entanto, é um
hidrocarboneto poliinsaturado (C
30
H
50
) e, como tal, apresenta baixa polaridade,
logo é solúvel em CO
2
-SC descartando a necessidade de adição de
cossolvente (CATCHPOLE et al., 1997; HE et al., 2003).
25
Tabela 3 – Parâmetros críticos de algumas substâncias
Substância
Tc (
o
Pc (bar)
Densidade
(g/mL)
Dióxido de carbono 31,1 73,8 0,47
Óxido nitroso 36,5 73,4 0,45
Clorodifluorometano 112 41,2 0,56
Hexafluoreto de enxofre 45,5 37,5 0,74
Água 374 229,9 0,34
n-Pentano 197 33,7 0,23
n-Butano 152 37,9 0,23
Amônia 132,5 113,9 0,24
Trifluoreto de carbono 25,9 47,5 0,52
Fonte: CLIFFORD (2000).
2.8. Processos de separação do esqualeno
As aplicações do esqualeno nas indústrias cosmética e farmacêutica e
o uso potencial em formulação de alimentos funcionais têm intensificado o
estudo de técnicas de separação deste composto de diversas matrizes
biológicas (REICHERT, 2002; KO et al., 2002; HE et al., 2003).
A separação do esqualeno foi realizada através de vários métodos:
fracionamento por cromatografia líquida (HE et al., 2002); separação
preparativa em cromatografia contra-corrente de alta velocidade (LU et al.,
2003); extração com CO
2
-SC em escala analítica com misturador estático e
fluxo contínuo de fluido supercrítico (KO et al., 2002; BHATTACHARJEE e
SINGHAL, 2003), em sistema contínuo de fracionamento com colunas
empacotadas em escala analítica e planta piloto de extração (CATCHPOLE et
al., 1997) e, ainda, empregando equipamento contracorrente de extração
contínua em coluna empacotada com três regiões de controle de temperatura
(BONDIOLI et al., 1993).
HE et al. (2002) isolaram e purificaram esqualeno de óleo de semente de
Amaranthus, através do fracionamento da porção insaponificável, em coluna
26
empacotada com sílica gel e obtiveram o composto com 94% de pureza. Já LU
et al. (2003) separaram esqualeno (96 % de pureza) de microalgas
(Thaustochitrium ATTC 26185), por cromatografia contra-corrente de alta
velocidade, empregando um sistema solvente de duas fases composto de n-
hexano:metanol (2:1, v/v). Constatou-se a eficácia destes dois métodos de
purificação, porém com relativa complexidade e requerendo muito tempo de
execução. Enquanto que, a extração com CO
2
-SC é uma técnica rápida,
permite certa seletividade através do monitoramento dos parâmetros físicos do
fluido, além de não gerar resíduos ambientais, eliminar o uso de grandes
quantidades de solvente e ser desnecessária a etapa de concentração do
extrato (RAVENTÓS et al., 2002; COUTSIKOS et al., 2003).
HE et al. (2003) avaliaram a extração do esqualeno de semente de
Amaranthus, com solvente líquido no sistema soxtec e com CO
2
-SC.
Observaram concentrações de esqualeno no extrato de 6 e 15,3%,
respectivamente. Comparando-se estes dois métodos de separação, observa-
se a maior seletividade da extração com CO
2
-SC.
Nos solventes líquidos a densidade é dificilmente modificada, enquanto
que, nos FS pequenas alterações de temperatura e pressão, próximas ao
ponto crítico, acarretam grandes mudanças na densidade, o que modifica a sua
capacidade de solvatação, tornando-o mais seletivo para determinado analito
(SIHVONEN et al., 1999).
KO et al. (2002) avaliaram a extração do esqualeno de folhas de T.
catappa pelo CO
2
-SC. Testaram vários parâmetros físicos e verificaram maior
concentração deste composto, nas seguintes condições: 15 min de tempo de
extração estática (TEE) e tempo de extração dinâmica (TED), fluxo de CO
2
de
3 mL/min., 40
o
C e 206,8 bar. Já BHATTACHARJEE e SINGHAL (2003)
realizaram a separação de esqualeno da biomassa liofilizada de sepas de
Torulaspor delbrueckii, e as condições otimizadas no processo foram: 60
o
C,
250-255 bar, fluxo de CO
2
de 0,2 L/min, TEE de 30 min e TED de 2 h. As
diferenças observadas na otimização dos parâmetros podem ter ocorrido
devido a natureza físico-química da matriz ou ainda ao sistema termodinâmico
empregado.
CATCHPOLE et al. (1997) realizaram a extração contínua de esqualeno
do óleo de fígado de tubarão, usando CO
2
-SC e colunas empacotadas, em
27
escala analítica e planta piloto. Investigaram a influência da pressão,
temperatura, relação do fluxo de CO
2
e óleo de alimentação, tipo e tamanho do
material de empacotamento. Dos parâmetros avaliados nos dois sistemas
extrativos, a pressão e a temperatura otimizadas apresentaram diferenças: em
escalas analítica e piloto foram de 200 bar, 40
o
C e 250 bar, 60
o
C,
respectivamente. Constata-se a influência da escala e do modelo
termodinâmico do equipamento na extração do composto de uma mesma
matriz.
Na Tabela 4 observam-se diferenças nos parâmetros físicos, para a
extração com CO
2
-SC do esqualeno, em função das diferentes matrizes e do
sistema termodinâmico empregado. Observa-se que, independentemente da
matriz e das diferenças operacionais do sistema extrativo, constata-se uma
faixa de variação de temperatura e pressão de 40 a 60
o
C e de 150 a 260 bar,
respectivamente (HE et al., 2003; KO et al., 2002; BHATTACHARJEE e
SINGHAL, 2003; BONDIOLI et al., 1993; CATCHPOLE et al., 1997).
O analito pode estar ligado a sítios orgânicos e/ou inorgânicos ativos da
matriz. Contudo, a complexidade destas interações, aliada à diversidade entre
matrizes, comprometem sua compreensão e é um dos fatores que acarretam
alterações nas condições físicas de extração, para a remoção do analito de
uma determinada matriz (YANG et al., 1995). Verifica-se na Tabela 4 que o
esqualeno já foi extraído de diversas matrizes biológicas. Porém, não existem
trabalhos com relação à otimização dos parâmetros para extração supercrítica
do esqualeno de DDOS.
BONDIOLI et al. (1992) refinaram óleo de oliva lampante com CO
2
-SC
em sistema contracorrente contínuo e observaram baixo fator de separação do
esqualeno e ácidos graxos livres (AGL), mas, por outro lado, o primeiro
composto foi satisfatoriamente separado de glicerídios. Devido a estas
observações, BONDIOLI et al. (1993) testaram a recuperação de esqualeno, do
destilado da desodorização do óleo de oliva (DDOO) pelo CO
2
-SC,
submetendo a matriz previamente a saponificação e esterificação com glicerol.
Nas condições de pressão, temperatura e fluxo de FS otimizadas obtiveram
extrato com concentração de esqualeno de 90%.
28
Tabela 4 – Condições otimizadas de extração supercrítica do esqualeno de
diversas matrizes empregando diferentes modelos termodinâmicos.
Matriz
Parâmetros físicos
otimizados
Especificaçõe
s da extração
Semente
Amaranto
1
50
o
C, 200 bar, 2 L de
CO
2
/min., 2 horas de
extração
Extração preparativa
semicontínua.
Folhas
Temilia
catappa
2
40
o
C; 206,8 bar; TEE
eTED de 15 min., 3mL de
CO
2
-SC/min
Extração analítica
Biomassa sepas
Torulaspora
delbrueckii
3
60
o
C, 250-255 bar, fluxo
de CO
2
de 0,2 L/min.,
TEE 30 min e TED 2 h
Extração preparativa
Destilado da
Desodorização do
óleo de oliva
4
50 – 40 – 30
o
C (base,
meio e topo da coluna de
extração); 150 bar; 30 Kg
de CO
2
/ kg de óleo
Extração preparativa
contracorrente contínua, em
coluna de 3 m x 30 mm de
diâmetro interno, com controle
de temperatura em três
regiões (base, meio e topo)
Óleo de fígado
tubarão
5
200 bar; 40
o
C Extração analítica contínua
em coluna empacotada.
Capacidade de produção 5
mL/min
Óleo de fígado
tubarão
5
250 bar; 60
o
C Extração contínua em coluna
empacotada em planta piloto,
com capacidade de produção
de 30 mL/min
1
HE et al., 2003;
2
KO et al., 2002;
3
BHATTACHARJEE & SINGHAL, 2003;
4
BONDIOLI et al., 1993;
5
CATCHPOLE et al., 1997.
CATCHPOLE et al. (2000b) fracionaram o DDOO por CO
2
-SC em
misturador estático e colunas empacotadas em escala piloto e avaliaram a
recuperação do esqualeno. No misturador estático foram empregadas as
seguintes variáveis: pressões de 100 a 250 bar, temperaturas de 40 a 60
o
C e
relação do fluxo de óleo de alimentação e CO
2
de 0,014 a 0,043. No
fracionamento contra-corrente, em colunas empacotadas, foram avaliadas as
29
seguintes variáveis: pressões de 160 a 250 bar, temperaturas de 40 a 60
o
C e
relação do fluxo de óleo de alimentação e CO
2
de 0,035 a 0,075. Observaram
concentrações de esqualeno ligeiramente mais altas na extração em colunas
empacotadas, porém o fator de separação do esqualeno e dos AGL foi muito
baixo. Portanto, para recuperar esqualeno de DDOO são necessários vários
estágios de processamento, ou a remoção dos AGL, antes da extração, ou
ainda, a sua conversão em triglicerídios.
MENDES et al. (2005) avaliaram a separação de misturas ternárias
envolvendo compostos presentes nos destilados desodorizados de óleos
vegetais (tocoferóis, esqualeno e estigmaesterol). Empregaram extrator
supercrítico em sistema semi-batelada com variações de pressão e
temperatura. O esqualeno e os tocoferóis foram separados com eficiência de
91 %, em temperatura de 40
o
C e pressão de 350 bar. Porém, para o
esqualeno e o estigmasterol a melhor eficiência da separação foi de 76,1% (40
o
C, 150 bar) e o fator de concentração foi 1, ou seja, nas condições testadas
estes compostos não foram separados com eficiência.
30
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Análise de
Alimento e de Extração Supercrítica do Departamento de Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal de Viçosa (UFV).
3.1. Preparação da matéria-prima
Foram utilizados como matérias-prima os DDOS cedidos pelas indústrias
Cargill Agrícola S/A (São Paulo, SP) e pela Olvebra Industrial S/A (Eldorado do
Sul, RS). O material foi centrifugado a 15.000 g por 30 minutos a 15 ºC, para
remover sedimentos, o sobrenadante foi armazenado em frasco âmbar a -20
o
C, a fim de evitar sua oxidação.
3.2. Seleção e caracterização química do DDOS centrifugado
Os DDOS centrifugados oriundos das duas indústrias foram submetidos
às análises de esqualeno, fitoesteróis e triglicerídios por cromatografia de fase
gasosa e os ácidos graxos livres (AGL) por titulação. Nesta fase foi selecionado
o DDOS com maior potencial de concentração de esqualeno, sendo
posteriormente submetido à cristalização e ao tratamento com Na
2
CO
3
.
31
3.2.1. Determinação quantitativa de esqualeno e semi-quantitativa de
fitoesteróis e triglicerídios totais no DDOS centrifugado
Os compostos foram separados por cromatografia de fase gasosa (CG),
em coluna capilar (Cromopack CP- TAP CB de 25 m x 0,25 mm x 0,1 µm), com
gradiente de temperatura. Utilizou-se o cromatógrafo Hewllett Packard modelo
5890, série II, com detector de ionização de chama.
As condições de análise empregadas foram: temperatura do injetor a
360
o
C; temperatura da coluna inicialmente a 135
o
C por 1 min, aumento de 15
o
C/min até 165
o
C, permanecendo por 2 min, aumento a uma taxa de 5
o
C/min
até 225
o
C por 7 min e finalmente aumento a 10
o
C/min até 345
o
C,
permanecendo isotérmica por 15 min; temperatura do detector a 370
o
C. O gás
de arraste utilizado foi o hidrogênio à pressão de 16 psi e velocidade de 51,7
cm/s. A injeção de 1,5 µL foi realizada no modo split, na razão de 70:1.
A quantificação de esqualeno foi realizada através do método de
padronização externa. A curva de calibração foi preparada a partir de solução-
estoque de esqualeno (97 % Fluka Riedel-de Haën, Seelze, Germany), cujas
diluições forneceram concentrações da curva padrão variando de 0,836 µg/µL
a 4,459 µg/µL Tanto o padrão como o DDOS (40 mg/mL) foram diluídos em n-
hexano grau cromatográfico.
As determinações de fitoesteróis totais foram realizadas por
normalização da área total do cromatograma. Para identificar os fitoesteróis
foram empregados os padrões de estigamaesterol (90% Sigma Chemical Co.,
St. Louis, NO, USA) e ß-sitosterol (40% Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
USA), sendo que o último apresentava em sua formulação campesterol e
dihidrobrasicaesterol, conforme informado pelo fabricante.
Os triglicerídios totais também foram determinados por normalização de
área, empregando-se, para identificação dos picos, cromatograma
característico de óleo de soja, conforme consta em GEERAERT e SANDRA
(1985).
32
3.2.2. Determinação de ácidos graxos livres no DDOS centrifugado
Os ácidos graxos livres no DDOS centrifugado foram determinados por
titulação, segundo o método oficial da AOAC n
o
. 940.28, com modificações
(AOAC, 1997).
A amostra (1 g) foi dissolvida em 4 mL de solução éter etílico:álcool
etílico (2:1), adicionada de 2 mL de solução alcoólica de fenolftaleína 1% e
titulada com NaOH (0,1 N) até o “ponto de viragem”. Os teores de ácidos
graxos livres foram expressos em função do ácido oléico.
3.3. Concentração do esqualeno no DDOS por cristalização seguida de
tratamento com Na
2
CO
3
Inicialmente foram testados 2 solventes e 4 temperaturas de
cristalização, para reduzir os teores de fitoesteróis no DDOS. O tratamento com
Na
2
CO
3
é uma saponificação a frio e tem a finalidade de remover AGL. O
33
último filtrado foi eliminado no evaporador rotatório a 60
o
C. O sólido não
cristalizável foi pesado e ressuspendido em acetona na mesma proporção, ou
seja, 1:6 e armazenado nas mesmas temperaturas. Novamente, após testar a
temperatura de -20
o
C, observou-se que foram necessárias duas
armazenagens de 24 horas, portanto para as demais temperaturas também
foram padronizadas 2 armazenagens de 24 horas. Após cada armazenagem,
procedeu-se como já descrito para o hexano. O solvente do último filtrado foi
removido no evaporador rotatório a 40
o
C. A variável analisada foi a massa não
cristalizável (MNC), obtida pela diferença entre a massa do DDOS centrifugado
e após a cristalização.
Figura 9 – Fluxograma dos testes de cristalização.
Com estes testes escolheu-se a condição de cristalização que acarretou
a menor MNC, ou seja, temperatura de -40
o
C e armazenagem em
Presença de cristais
DDOS
Hexano e/ou acetona
Rotaevaporação
Filtração a vácuo
-20, -30, -40 ou -50
o
C/ 24h
Dissolução
-20, -30, -40 ou -50
o
C/ 24h
Ausência de cristais
34
hexano/acetona. Porém, foram empregadas 2 armazenagens consecutivas de
24 horas em hexano e uma em acetona. O critério empregado para estabelecer
o número de armazenagens de 24 horas foi a impossibilidade da visualização
de cristais. A MNC foi submetida às análises de esqualeno, AGL, fitoesteróis e
TG totais.
3.3.1.1. Delineamento experimental
O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado,
em esquema fatorial 4 x 2, ou seja, 4 temperaturas e 2 tipos de solvente
(hexano, hexano/acetona), com 4 replicatas. Foi realizada análise de regressão
para avaliar o efeito da temperatura, em cada solvente, sobre a MRNC. Os
dados foram analisados segundo os procedimentos do Statistical Analisys
System (SAS), versão 9.1.
3.3.2 Tratamento com Na
2
CO
3
Foram utilizados 2 g da MNC obtida após a cristalização em
hexano/acetona a -40
o
C, dissolvido em 10 mL de hexano, transferido para funil
de separação, adicionou-se 10 mL de Na
2
CO
3
(1,0 mol/L), agitando-se por 1
min. Após a separação das fases, a fase aquosa foi recolhida e lavada com
hexano por 3 vezes consecutivas. As frações apolares foram reunidas e
lavadas com solução água:etanol (2:1), por duas vezes, seguidas de lavagem
com ácido ascórbico (1,0 mol/L), a fim de reduzir o pH, e o excesso de ácido foi
removido com água. O solvente orgânico foi eliminado em evaporador rotatório
(60 oC) e o sólido pesado e utilizado para as análises de esqualeno, AGL,
fitoesteróis e TG e para a extração pelo CO
2
-SC.
3.4. Extração com CO
2
-SC
A extração do esqualeno no DDOS modificado (cristalização/Na
2
CO
3
) foi
realizada em um equipamento analítico de extração supercrítica, modelo 7680A
(Hewlett-Packard, Palo Alto, USA), utilizando-se dióxido de carbono com
35
pureza mínima de 99,99% (White Martins, Osasco, SP). A configuração da
unidade de extração supercrítica esta esquematizada na Figura 10.
Figura 10 - Desenho esquemático do sistema de extração por fluido
supercrítico modelo 7680A - Hewlett Packard.
Neste processo de extração, quando o dióxido de carbono atinge a
temperatura e a pressão requeridas, o mesmo entra em contato, com a
amostra (DDOS modificado), na câmara extratora de aço inoxidável, com
volume de 3,93 mL. Este procedimento ocorre de duas formas denominadas:
tempo de extração estático (TEE) e tempo de extração dinâmico (TED). O TEE
corresponde a um tempo preestabelecido, no qual o fluido se mantém em
contatoTj6 .Tj304 fxe5s1de carbxtrt.336d.55açTD 0 04rcmTj29.3n c 2-lq95 Tc 0 140 (fluido398j29.25 Tc 4.165336 Two) Tj. Este procTj31oxidá99751.8324 Tw .3204 Tc 0 Tw 09 0 T5 Twinu9.25 e35.mov TD sobED) caxo09 Tc 0. (TEE) e temptra e5.1773 Tw (suE )fix0.3s.36 Tw ( ) Tj7.3 0 TD 0.126 Tc -0.462 23 Tj. Este proc47ã2339.75 14 875 0 TDpoi Tw sair d0 Tw (modi TD 0 Tc 0. (TE21ox(corresponde a um tempo preestabelecido, no qual o ) Tj304.5 0 TD 0.095 Tc 0 16 (fluido)9Tf0.048 Tc 0.414 Tw (0 T5 Tduz3.220.462 2 ( 5) e tempo d155(fluido)9851.8324paTc 0.42mtri Tc 2o (D 0.032suc -0spr (TE216f0 Tc -0.cÔ(fluido684, com) a )uriznadas: ) Tj5 Tseqwo)25 e3expan
36
coletor de ODS (octadecilsílica). Posteriormente, são eluídos com n-hexano e
coletados em frascos de vidro de 2 mL e analisados por CG.
O experimento foi dividido em duas etapas. Em uma primeira fase foram
testadas 3 temperaturas (40, 50 e 60
o
C) e 3 pressões (110, 157 e 281 bar),
conforme descrito na Tabela 5. Mantiveram-se constantes as seguintes
variáveis: TEE (0 min), TED (15 min) e o fluxo de CO
2
-SC (1,0 mL/min). A
magnitude destes parâmetros foi estipulada visando permitir a passagem de
volume de CO
2
suficiente para lavar a câmara extratora por 3 a 10 vezes,
durante todo o período da extração, garantindo desta forma a completa
recuperação do esqualeno (ARAÚJO, 2004).
Na segunda etapa do experimento, empregando-se os parâmetros já
otimizados na etapa anterior (temperatura e pressão) foram avaliados os
efeitos de 2 níveis de TEE (0 e 5 min), 3 de TED (15, 20 e 25 min) e 2 de fluxo
de CO
2
-SC (1,0 e 1,5 mL/min), conforme especificado na Tabela 6.
Em todas as etapas do experimento foram mantidos constantes os
seguintes parâmetros: quantidade de DDOS modificado (15 mg), adsorvido em
tiras de papel filtro de 2 x 4 cm; volume da câmara de extração (3,93 mL);
temperatura do restritor na extração e na reconstituição da amostra (55
o
C);
temperatura do coletor durante a extração (20
o
C) e durante a reconstituição da
amostra (55
o
C). A temperatura do coletor foi estabelecida seguindo a
recomendação do fabricante do equipamento, sendo a mesma mantida, no
mínimo, em 10
o
C abaixo da temperatura de ebulição do solvente utilizado na
lavagem (KNIPE et al., 1993).
37
Tabela 5 – Variáveis testadas na primeira etapa do experimento.
Tratamento
T (
o
C) p (bar)
Den
sidade do CO
2
(g/mL)
N
o
. de vezes*
1 40
o
C 110
±
2 0,68 5,16
2
157
±
2
0,79
4,44
3 281
±
3 0,90 3,90
4
50
o
C
110
±
2
0,50
7,02
5
157
±
2
0,72
4,88
6 281
±
3 0,86 4,08
7
60
o
C
110
±
2
0,35
10,03
8 157
±
2 0,64 5,49
9
281
±
3
0,81
4,33
*Número de vezes que o CO
2
-SC passa pela câmara extratora, calculado com
base na equação abaixo:
Volume de CO
2
= fluxo de CO
2
. (densidade na cabeça da bomba/densidade da
extração). TED; sendo que, densidade na cabeça da bomba = 0,92 g/mL.
Tabela 6 – Variáveis testadas na segunda etapa do experimento.
TEE = Tempo de extração estática
TED = Tempo de extração dinâmica
3.4.1. Delineamento experimental
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado
em triplicata. Na primeira etapa em esquema fatorial 3
2
(3 temperaturas e 3
Tratamento
Fluxo de CO
2
-
SC
(mL/min)
TEE (min) TED (min)
1 1,0 0 15
2 20
3 25
4 5 15
5 20
6 25
7 1,5 0 15
8 20
9 25
10 5 15
11 20
12 25
38
pressões). O efeito da temperatura e da pressão sobre os teores de esqualeno
extraído foi testado por meio de ajuste a um modelo quadrático.
Na segunda etapa empregou-se esquema fatorial 2 x 3 x 2 (2 TEE, 3
TED e 2 fluxos de CO
2
). Em cada nível de TEE (0 ou 5 min) foram avaliados os
efeitos do TED e do fluxo de CO
2
sobre os teores de esqualeno extraído
testando ajustes de modelos matemáticos quadrático e linear, respectivamente.
Todas as análises estatísticas foram realizadas segundo técnicas usuais do
software Statistical Analisys System (SAS), versão 9.1.
3.5. Análise cromatográfica do teor de esqualeno
As análises por CG foram realizadas de acordo com VERLEYEN et al.
(2001), com modificações. Para quantificar os teores de esqualeno foram
utilizados 15 mg do DDOS centrifugado e do DDOS modificado
(cristalização/Na
2
CO
3
) dissolvido em 2 mL de hexano, enquanto que o extrato
obtido do extrator supercrítico foi diretamente injetado no cromatógrafo.
Empregou-se o mesmo cromatógrafo anteriormente citado equipado
com coluna capilar HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,1µm). Foram feitas injeções de
1,5 µL, no modo split (83:1), utilizando-se hidrogênio como gás de arraste à
pressão de 16 psi e velocidade de 43,1 cm/s. A temperatura do injetor e do
detector foi de 360 ºC. A coluna foi mantida a 170 ºC por 5 minutos, com
aumento a uma taxa de 15 ºC/min até 230 ºC, permanecendo por 8 minutos.
Nesta etapa utilizou-se além do padrão externo (esqualeno 97%, Fluka
Riedel-de Haën, Seelze, Germany), o padrão interno (n-octacosano 99%,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), a fim de otimizar a análise, pois foi
empregada a injeção manual, que se constitui em um dos principais fatores de
erro experimental de técnicas cromatográficas (LANÇAS, 1993). Preparou-se
uma solução estoque de esqualeno e a partir desta foram preparadas soluções
para curva padrão com concentrações variando de 0,0456 µg/µL a 2,052
µg/µL. Utilizou-se uma solução estoque de n-octacosano para que todas as
soluções analisadas apresentassem a concentração de 0,16 µg/µL do padrão
interno.
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Seleção e caracterização do DDOS centrifugado
Na Tabela 7 constam os teores médios de esqualeno, AGL, fitoesteróis e
TG totais dos DDOS centrifugados Cargill e Olvebra; do DDOS Cargill após a
cristalização e após a cristalização seguida do tratamento com Na
2
CO
3
(cristalização/Na
2
CO
3
). Observa-se que, os DDOS brutos Cargill e Olvebra
apresentaram teores de esqualeno semelhantes, porém os teores de AGL do
primeiro foram bem superiores aos do DDOS Olvebra. Portanto, o DDOS
Cargill apresenta maior potencial para a concentração de esqualeno, visto que
os AGL serão removidos, por isto foi selecionado para a modificação físico-
química por cristalização/Na
2
CO
3
e posterior extração com CO
2
-SC.
Os teores de AGL, TG, esteróis e esqualeno dos DDOS estudados estão
dentro da faixa de variação relatada na literatura, em g/100, correspondente a:
25,3 - 89,3; 1,7 - 5,9; 4,1 - 22,6 e 0,6 - 7,8, respectivamente (BRUNNER et al.,
1991; STOLDT e BRUNNER, 1998; CHANG et al., 2000; VERLEYEN et al.,
2001). A ampla variação nos teores das diferentes substâncias no DDOS deve-
se as diferenças operacionais da desodorização, como pressão, temperatura e
tempo; além das diferenças inerentes a matéria-prima empregada (VERLEYEN
et al., 2001).
40
Tabela 7 – Teores médios de esqualeno, AGL, fitoesteróis e TG totais nos
destilados da desodorização do óleo de soja (DDOS)
1
AGL expresso em ácido oléico;
2
Centrifugado a 15.000 g por 30 min a 15
o
C;
3
Os dados referem-se a média ± desvio padrão de triplicatas.
4
Critalização em hexano/acetona a – 40
o
C.
5
Saponificação a frio com Na
2
CO
3
.
4.2. Modificações físico-químicas do DDOS
Inicialmente foi realizada uma pré-purificação do DDOS Cargill,
envolvendo cristalização com solventes a baixa temperatura seguida de
tratamento com Na
2
CO
3
, com a finalidade de excluir ou reduzir compostos que
apresentam baixo fator de separação entre estes e o esqualeno, nas condições
de extração com CO
2
-SC.
O DDOS é um produto complexo constituído de muitas substâncias,
incluindo ácidos graxos livres (AGL), tocoferóis, esteróis, esqualeno e
triglicerídios (TG). A natureza complexa desta mistura dificulta sobremaneira a
separação de seus componentes (VERLEYEN et al., 2001).
Foram testadas 4 temperaturas de cristalização (-20, -30, -40 e -50
o
C) e
dois solventes: armazenagem em hexano e em hexano seguido de
armazenamento em acetona (hexano/acetona), para averiguar qual a condição
que acarreta menor massa não cristalizável (MNC).
Como a cristalização reduz os teores de fitoesteróis (LEHMAN e
EMBREE, 1951), será observada maior concentração de esqualeno no DDOS
após a extração pelo CO
2
-SC, pois, segundo MENDES et al. (2005), este dois
compostos apresentam baixo fator de separação em sistemas de extração com
CO
2
-SC, constatado pela aplicação de um processo semi-contínuo com a
Especificações do produto
Esqualeno
(g/100 g)
AGL
1
(g/100 g)
Fitoesteróis
totais
(g/100 g)
TG totais
(g/100 g)
DDOS Olvebra centrifugado
2
3,35
±
0,62
3
39,71
±
3,06
4,723
±
1,23
8,73
±
1,66
DDOS Cargill
centrifugado
3,45
±
0,76
52,76
±
2,93
5,288
±
0,98
4,52
±
0,87
DDOS Cargill cristalizado
4
4,47
±
0,84
52,76
±
4,93
3,12
±
0,23
7,87
±
0,78
DDOS Cargill cristalizado
4
/
Na
2
CO
3
5
6,36
±
0,96
0,56
±
0,02
3,57
±
0,15
9,35
±
0,17
41
combinação dos principais constituintes do DDOS (estigmaesterol, esqualeno,
tocoferóis e ácido linolênico), em que verificaram que, para separar os
tocoferóis, foram necessários três extratores em série, operados a 40
o
C: o
primeiro sob pressão de 90 bar para separar o ácido linolênico da mistura, o
segundo a 250 bar para separar o estigmaesterol e finalmente o terceiro a 350
bar para separar o esqualeno, porém para estes dois últimos compostos, a
eficiência máxima alcançada foi de 76,3 %.
Na Tabela 8 é descrito o resumo da variância de regressão linear da
MNC para as temperaturas, quando o hexano foi empregado como solvente na
cristalização. Observa-se que a regressão e a falta de ajuste foram,
respectivamente, significativa e não significativa a 1% de probabilidade pelo
teste F. Portanto, as oscilações na MNC ocorreram devido as temperaturas
testadas e a equação linear é o modelo matemático mais adequado para
descrever estas variações.
Tabela 8 – Resumo da análise de variância de regressão linear da MNC do
DDOS armazenado em hexano, em função da temperatura.
Fontes de variação
Grau de liberd
ade
Quadrado médio
(Tratamentos) (3) (0,10136)
Regressão 1 0,27684**
Falta de ajuste 2 0,01362
ns
Resíduo 12 0,02355
MNC = massa não cristalizável.
**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.
ns
não significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.
O efeito da temperatura na MNC quando a cristalização foi realizada em
hexano/acetona é descrito pelo modelo de equação quadrática, pois conforme
observado na Tabela 9 a regressão é significativa e a falta de ajuste é não
significativa (p≤0,01).
42
Tabela 9 – Resumo da análise de variância de regressão da MNC do DDOS
armazenado em hexano/acetona em função da temperatura.
MNC = massa não cristalizável.
**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.
ns
não significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.
Na Figura 11 são mostradas as curvas obtidas com as equações de
regressão para o efeito da variação da temperatura na redução da MNC, em
cada solvente, com seus respectivos coeficientes de determinação (r
2
).
Verifica-se que a armazenagem em hexano/acetona acarretou maior redução
na MNC do que somente em hexano e que estas diferenças foram
significativas (p≤0,01). Além disso, para os dois solventes observa-se que a
temperatura de -40
o
C acarretou maior redução na MNC. Devido a isto, a
cristalização em hexano/acetona a -40
o
C foi a condição escolhida.
Após a cristalização o DDOS foi submetido a tratamento com Na
2
CO
3
,
ou seja, saponificação à frio, para remoção somente dos AGL. Procedeu-se
desta forma porque em trabalhos anteriores foi observado que, em extrações
com CO
2
-SC, o esqualeno apresentou baixo fator de separação dos AGL,
enquanto que compostos mono, di e triglicerídios foram satisfatoriamente
separados (BONDIOLI et al.,1992; BONDIOLI et al., 1993; CATCHPOLE et al.,
2000b).
A cristalização acarretou uma redução de 41% nos teores de fitoesteróis
totais e um aumento na concentração de esqualeno em aproximadamente 30%
(Tabela 7). Ambos os tratamentos, cristalização/Na
2
CO
3
, acarretam um
aumento de aproximadamente 84% na concentração de esqualeno
comparando-se com DDOS centrifugado.
Fontes de variação
Grau de liberdade
Quadrado médio
(Tratamentos) (3) (0,61482)
Regressão 2 0,87502**
Falta de ajuste 1 0,09442
ns
Resíduo 12 0,329035
43
Figura 11 – Massa não cristalizável (MNC) do deslilado da desodorização do
óleo de soja (DDOS) em função das temperaturas e dos solventes
empregados na cristalização
Na Figura 12 são mostrados os cromatogramas típicos do DDOS Cargill
bruto centrifugado, após ser submetido a cristalização e cristalização/Na
2
CO
3
.
Observam-se a redução nas áreas dos fitoesteróis e o aumento nas áreas do
esqualeno e dos TG totais, devido às modificações físico-químicas do DDOS
Cargill, confirmando os resultados mostrados na Tabela 7.
Nos cromatogramas A e B da Figura 12 verifica-se um pico acentuado
no tempo de retenção próximo a 8 min, que praticamente desaparece no
cromatograma C, comparando-se estes cromatogramas com os obtidos por
VERLEYEN et al. (2001), que também analisaram a composição química do
DDOS por CG, verifica-se que provavelmente este pico refere-se ao dos AGL.
Portanto, o tratamento com Na
2
CO
3
foi eficiente na remoção dos teores de
AGL, esta observação é confirmada na Tabela 7.
44
empo (min)
Figura 12 – Cromatogramas do DDOS Cargill bruto centrifugado (A), após a
cristalização (B) e após cristalização e tratamento com Na
2
CO
3
(C).
A
B
Tempo (min)
C
45
Modificações físico-químicas do DDOS, anteriores a extração com CO
2
-
SC, já foram testadas em outros trabalhos. Estas modificações incluem,
cristalização em n-hexano e metanol a 4
o
C, saponificação com NaOH e
esterificação (LEE et al., 1991; NAGESHA et al., 2003) ou somente
saponificação seguida de esterificação (BONDIOLI et al., 1993). Porém, a
saponificação à frio com Na
2
CO
3
não foi testada nesses estudos.
O tratamento com Na
2
CO
3
é um procedimento rápido e demonstrou ser
eficaz para a remoção de AGL (Tabela 7) e, provavelmente, acarreta menos
alterações indesejáveis no DDOS, enquanto que, na saponificação com NaOH
pode ocorrer a destruição de tocoferóis, devido a instabilidade deste composto
na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas (PARRISCH, 1980).
Contudo, a saponificação a frio com Na
2
CO
3
não é eficiente na remoção de
metil e etil ésteres, que também apresentam baixo fator de separação do
esqualeno em sistemas de extração com CO
2
-SC (BONDIOLI et al, 1992).
4.3. Extração do esqualeno com CO
2
-SC
O DDOS modificado por cristalização/Na
2
CO
3
(DDOSM) foi empregado
para realizar a extração com CO
2
-SC. A otimização dos parâmetros físicos da
extração foi realizada em duas etapas. Na primeira foram testadas 3
temperaturas e 3 pressões, sendo que a condição que acarretou a maior
quantidade de esqualeno extraído foi empregada na etapa seguinte. Enquanto
que, na segunda fase foram avaliados os efeitos da combinação de 2 níveis de
fluxo, 2 de TEE e 3 de TED na concentração do esqualeno no extrato.
4.3.1. Efeito da pressão e da temperatura sobre a extração do esqualeno
A análise estatística para teores de esqualeno em função da pressão (p)
e da temperatura (T) de extração consta na Tabela 10. Verifica-se que a
regressão e a falta de ajuste foram significativas (teste F; p ≤ 0,01), porém o
índice de exatidão (R
2
) foi alto (0,7675); logo, a falta de ajuste, mesmo
significativa, é pequena. Portanto, a variação de teores de esqualeno ocorreu
46
devido aos tratamentos (temperatura e pressão), e podem ser estimados
segundo a equação 1 (ver Tabela 3A; apêndice).
ESQ = 1,3 – 0,151T + 0,1487 p – 0,000336 p
2
R
2
= 0,7675 (eq. 01)
Em que: ESQ são os teores de esqualeno estimados, T e p são
respectivamente, a temperatura (
o
C) e pressão (bar) da extração por CO
2
-SC.
Tabela 10 – Resumo da análise de variância de regressão múltipla dos teores
de esqualeno, em função da pressão e da temperatura de extração.
*Teste F significativo a 1% de probabilidade.
Na Figura 13 é mostrado o gráfico da equação dos teores de esqualeno
em função de T e p. Observa-se que, a variação de esqualeno em função de T
é linear, ou seja, o decréscimo na temperatura de extração acarreta maior
concentração de esqualeno. Enquanto que, a influência da pressão segue
efeito quadrático. A partir da equação 01 pode-se calcular um valor máximo de
pressão (221 bar), na qual são obtidos os níveis mais elevados de esqualeno
extraído.
Na Tabela 11 são descritas as concentrações de esqualeno observadas
no DDOSM, em função das pressões e temperaturas empregadas. Verifica-se
que, conforme descrito pela equação de regressão, temperaturas menores e
pressões maiores acarretaram maior concentração do esqualeno no DDOSM,
exceto a 50
o
C, no qual os teores de esqualeno foram similares nas pressões
de 281 e 157 bar. Além disso, constata-se que em temperaturas superiores e
na pressão mais baixa (110 bar) a solubilidade do esqualeno no CO
2
-SC
apresenta uma queda brusca, sendo que a 60
o
C não foi mais detectada a
Fontes de variação
Grau de liberdade
Quadrado médio
(Tratamentos) (8) (14,71602)
Regressão 3 30,12003*
Falta de ajuste 5 5,47362*
Resíduo 18 0,01658
47
presença de esqualeno pelas análises por CG. Provavelmente, esta tendência
deve-se ao decréscimo na densidade do fluido (ISMADJI e BHATIA, 2002).
Figura 13 – Gráfico da equação de regressão para os teores de esqualeno em
função da temperatura e pressão de extração, mantendo-se
constante: TEE = 0 min, TED = 15 min, fluxo de CO
2
= 1,0 mL/min.
Tabela 11 – Teores médios de esqualeno (g/100 g de DDOSM) em função das
temperaturas e pressões de extração com CO
2
-SC, empregando-se
TEE = 0 min, TED = 15 min, fluxo de CO
2
= 1,0 mL/min.
Temperaturas (
o
C)
Pressões (bar)
40 50 60
110
6,407
±
0,078* 3,966
±
0,130
48
Observa-se que na temperatura de 40
o
C (Tabela 11) a concentração de
esqualeno no extrato apresentou pouca variação (de 6,41 a 7,12 g/100 g)
devido ao aumento da pressão. Este mesmo comportamento já foi descrito por
HE et al. (2003), que extraíram esqualeno de semente de amaranto e
concluíram que esta substância é facilmente extraída nesta temperatura.
Contudo, obtiveram maior concentração de esqualeno a 50
o
C e 200 bar, pois
nestas condições a seletividade é afetada pelos demais constituintes da matriz
empregada.
BONDIOLI et al. (1993) extraíram esqualeno de destilado desodorizado
de óleo de oliva, empregaram um equipamento em escala piloto em sistema de
fluxo contracorrente constante de CO
2
-SC, com colunas extratoras
empacotadas, e também observaram que a temperatura de 40
o
C foi mais
efetiva, porém a pressão otimizada foi de 150 bar, que é inferior a verificada
neste estudo (281 bar). Provavelmente, a diferença neste parâmetro foi devido
aos modelos operacionais dos equipamentos.
A influência da densidade e da temperatura do fluido na extração do
esqualeno é mostrada na Figura 14. Constata-se que o aumento da densidade
foi o fator predominante na concentração do esqualeno no DDOSM. Contudo,
comparando-se a densidade de 0,81 g/mL (60
o
C) com 0,79 g/mL (40
o
C),
verifica-se que na primeira condição a quantidade de esqualeno extraído foi
menor do que na segunda. Logo, deve-se considerar também o efeito da
temperatura.
A solubilidade de um determinado analito no CO
2
-SC é o principal fator
determinante da eficiência de sua extração. A solubilidade é controlada pela
interação de dois fatores: a volatilidade da substância, que está relacionada
com a temperatura; e o efeito de solvatação do FS, alterado pela manipulação
de sua densidade (LANG e WAI, 2001). Portanto, quando a temperatura
aumenta isobaricamente existem duas tendências opostas, a solubilidade
diminui em decorrência do decréscimo da densidade ou aumenta com a
volatilidade do soluto, devido ao aumento da temperatura (DEL VALLE e
AGUILERA, 1999; ISMADJI e BHATIA, 2002).
49
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0
1
2
3
4
5
6
7
Esqualeno (g/100 g de DDOS)
Densidade (g/mL)
40
o
C
50
o
C
60
o
C
Figura 14 – Efeito da densidade do CO
2
-SC e da temperatura nos teores de
esqualeno extraído
Na Tabela 12 é descrita a solubilidade do esqualeno em função dos
seguintes parâmetros físicos da extração: temperatura e pressão. Observa-se
que, na menor temperatura testada (40
o
C) e pressões mais elevadas, ou seja,
nas densidades mais altas testadas neste estudo, o esqualeno é mais solúvel
no CO
2
-SC, . Por outro lado, na temperatura de 60 ºC, onde se observa declive
na densidade, o índice de recuperação (Apêndice; equação 1A) deste
composto foi baixo (0 – 89,70%).
A maior concentração de esqualeno (7,12 g/100 g) foi obtida a 40
o
C,
281 bar e 0,90 g/mL. Contudo, na mesma temperatura a 157 bar os teores de
esqualeno foram somente um pouco inferiores (6,69 g/100 g). Provavelmente,
este comportamento foi observado porque o aumento da densidade acarreta a
solubilização de uma diversidade maior de componentes, logo a seletividade
decresce (DANIEILSKI et al., 2007).
50
Tabela 12 – Concentração do esqualeno no CO
2
-SC em diferentes condições
de extração
Temperatura
(
o
C)
Pressão
(bar)
Densidade do
CO
2
(g/mL)
Solubilidade do esqualeno no
CO
2
(mg/g)*
40
110 ± 2
0,68
0,0696
40
157 ± 2
0,79
0,0727
40
281 ± 3 0,90
0,0733
50
110 ± 2
0,50
0,0431
50
157 ± 2 0,72
0,0718
50
281 ± 3
0,86
0,0701
60
110 ± 2
0,35
nd**
60
157 ± 2 0,64
0,0591
60
281 ± 3
0,81
0,0620
*Massa de CO
2
= densidade na cabeça da bomba (0,92 g/mL) x TEE x fluxo
**nd = não detectado.
4.3.2. Efeito do fluxo do CO
2
, do TEE e do TED sobre a extração do
esqualeno
Foi empregada a condição otimizada na fase anterior do experimento
(40
o
C, 281 bar) e alterados o fluxo de CO
2
, o TEE e o TED, para verificar seus
efeitos na concentração do esqualeno no DDOSM.
As variáveis, fluxo de CO
2
-SC e TED determinam a massa e o volume
total de CO
2
(Apêndice; Tabelas 1A e 2A) utilizados durante a extração, por isto
são críticas na recuperação do analito. O fluxo ótimo é aquele que permite a
saturação dos componentes solubilizados e o tempo de extração deve permitir
que todos os compostos sejam removidos da matriz e adsorvidos ao coletor
(NICOLINO, 1995; PALMA et al., 2000).
O TEE corresponde a uma diluição em que a matriz permanece por um
intervalo de tempo mergulhada no FS, geralmente é mais efetivo para amostras
sólidas, ou para analitos fortemente ligados à matriz ou, ainda, quando são
adicionados modificadores (LANGENFELD et al., 1994). Como a matriz
51
empregada é líquida e o composto de interesse é apolar, dispensa-se o uso de
modificadores, por isso somente foi testado o TEE de 5 min.
Não foram encontrados na literatura dados sobre a otimização dos
parâmetros fluxo de CO
2
, TEE e TED para a extração de esqualeno de outras
matrizes, utilizando extrator analítico, semelhante ao deste estudo, pois nem
todos os equipamentos empregam a combinação de TEE e TED. Portanto, não
são possíveis comparações dos resultados obtidos com os já descritos. KO et
al. (2002) também empregaram equipamento de extração pelo CO
2
-SC em
escala analítica, porém somente avaliaram teores de esqualeno em função das
alterações de pressão e temperatura, enquanto que o fluxo de CO
2
(3 mL/min),
TEE (15 min) e TED (15 min) foram mantidos fixos.
Na Tabela 13 é descrito o resumo da análise de regressão para os
teores de esqualeno, na ausência de TEE, em função do fluxo de CO
2
-SC e do
TED. Verifica-se que o modelo de regressão empregado é significativo e a falta
de ajuste também (teste F; p≤0,01), contudo o índice de exatidão é elevado
(0,8872). Portanto, a variação de teores de esqualeno ocorreu devido aos
tratamentos (fluxo e TED) e, podem ser estimados segundo a equação 2 (ver
Tabela 4A; apêndice).
ESQ = 9,61 + 2,6187 F – 0,5553 TED + 0,0156 TED
2
R
2
= 0, 8872 (eq. 02)
Em que: ESQ são os teores de esqualeno estimados e F o fluxo de CO
2
-
SC (mL/min).
Tabela 13 – Resumo da análise de variância da regressão múltipla dos teores
de esqualeno extraído em função do fluxo e do TED, quando o
TEE=0 min.
Fontes de variação
GL
Quadrado médio
(Tratamentos) (5) (2,1788)
Regressão 3 3,2219*
Falta de ajuste 2 0,6143*
Resíduo 12 0,03794
*Significativo a 1% de probabilidade pelo teste F.
52
O gráfico da equação dos teores de esqualeno em função de TED e do
fluxo de CO
2
é mostrado na Figura 15. Observa-se que, a variação da
concentração do esqualeno em função do fluxo de CO
2
é linear, ou seja, o
aumento no fluxo acarreta aumento nesta concentração. Por outro lado,
considerando-se o efeito do TED, o comportamento é quadrático e o aumento
do TED proporcionou extração de maior quantidade de esqualeno.
Figura 15 – Gráfico da equação de regressão para os teores de esqualeno em
função do fluxo de CO
2
e do TED, mantendo-se constante:
temperatura = 40
o
C, pressão = 281 bar, densidade = 0,90 g/mL e
TEE = 0 min.
Na Tabela 14 são descritas as concentrações de esqualeno observadas
no DDOSM, em função dos fluxos de CO
2
e dos TED, quando o TEE é mantido
fixo em 0 min. Verifica-se que, conforme constatado pela análise de regressão,
53
o aumento do fluxo do CO
2
-SC acarretou uma concentração superior de
esqualeno. Isto pode ter ocorrido devido a fluxos elevados serem
recomendáveis para compostos altamente solúveis e de fácil acesso (ARAÚJO,
2004). A matriz empregada é líquida e na câmara de extração foi apenas
adsorvida em papel-filtro, o que aumenta o contato com o FS.
Tabela 14 - Efeito do fluxo de CO
2
-SC e TED na concentração do esqualeno
no DDOSM (g/100 g), empregando-se a seguinte condição de
extração: T = 40
o
C; P = 281 bar; d = 0,90 g/ml; TEE = 0 min.
TED (min)
Fluxo de CO
2
(mL/min) 15 20 25
1,0 7,116
±
0,024 * 7,288
±
0,069 8,417
±
0,280
1,5 8,997
±
0,184 8,717
±
0,318 9,036
±
0,097
* Os dados são as médias ± desvios padrão de triplicatas.
Porém, com testes posteriores usando fluxo de CO
2
de 2,0 mL/min, TED
de 15 min e TEE de 0 min, foram obtidos teores de esqualeno menores (8,023
g/100 g) do que com fluxo de 1,5 mL, TED de 15 min e TEE de 0 min (8,997
g/100 g), por isto não foram investigados fluxos superiores. Segundo KNIPE et
al. (1993) fluxos muito altos podem ocasionar decréscimo no rendimento pelas
perdas de extrato por arraste durante a adsorção no coletor.
Verifica-se que no fluxo de CO
2
de 1,0 mL/min (Tabela 14), TED mais
longos influenciaram na mais alta concentração do esqualeno, provavelmente,
devido ao aumento da massa de CO
2
-SC consumida na extração (13,8 g, 18,4
g e 23 g, para TED de 15, 20 e 25 min, respectivamente). Este mesmo
comportamento não foi observado para o fluxo 1,5 mL/min, no qual os teores
de esqualeno no DDOSM apresentaram pequena variação em função do
aumento do TED, de 8,72 a 9,04 g/100 g. Neste caso, provavelmente foi
atingida a saturação dos compostos extraídos, e o aumento no volume de CO
2
empregado não teve mais efeito sobre a solubilização do esqualeno (Tabela 2
A; apêndice).
54
A análise de regressão múltipla para o efeito da concentração de
esqualeno em função da variação do fluxo e do TED, quando o TEE é fixado
em 5 min é mostrada na Tabela 15. Observa-se que a equação linear não
explica significativamente a variação dos teores de esqualeno extraído, em
função do de fluxo de CO
2
. Além disso, os efeitos do TED na extração do
esqualeno, também não podem ser ajustados significativamente aos modelos
matemáticos, linear ou quadrático. Portanto, quando é utilizado o TEE de 5 min
o TED e o fluxo parecem não afetar os níveis de esqualeno, visto que,
conforme observado na Figura 16, a variação é pequena em decorrência
destes tratamentos (8,94 a 9,44 g/100 g de DDOSM).
Tabela 15 - Resumo da análise de variância da regressão múltipla dos teores
de esqualeno extraído em função do fluxo e do TED, no TEE = 5
min.
Fontes de variação
GL
Quadrado médio
(Tratamentos) (5) (0,13620)
Regressão 3 0,109813
ns
Falta de ajuste 2 0,17579**
Resíduo 12 0,031455
ns
Teste F não significativo a 1% de probabilidade
** Teste F significativo a 1% de probabilidade.
Na Figura 16 são mostradas as concentrações do esqualeno no DDOSM
em função do TED e do fluxo de CO
2
, quando a extração é realizada com TEE
de 5 mim. Verifica-se que, o aumento do fluxo ocasionou aumento na extração
do esqualeno, exceto para o TED de 15 mim. Também se observa um
decréscimo nos teores de esqualeno com o aumento do TED no fluxo de CO
2
de 1 mL/min e um efeito oposto em fluxo de 1,5 mL/min.
55
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
Esqualeno (g/100 g de DDOSM)
TED (min)
Fluxo de CO
2
= 1 mL/min
Fluxo de CO
2
= 1,5 mL/min
Figura 16 – Efeito do tempo de extração dinâmica (TED) e do fluxo de CO
2
na
concentração de esqualeno, empregando-se a seguinte condição de
extração: T = 40
o
C; P = 281 bar; d = 0,90 g.ml
-1
; TEE = 5 min.
Comparando-se a variação dos teores de esqualeno extraído
empregando-se TEE (0 min), fluxo de CO
2
de 1,5 mL/min, nos diversos TED
(8,943 a 9,329 g/100 g) com os obtidos no TEE de 5 mim, variando fluxo e TED
(8,717 a 9,444 g/100 g) verifica-se que são semelhantes. Portanto, o aumento
do TEE ou do fluxo de CO
2
tiveram efeito similar na recuperação do esqualeno
do DDOSM. Isto pode ter ocorrido porque o aumento do fluxo, do TED e do
TEE tem efeito sobre a transferência de massa do analito para o FS devido ao
aumento do volume de CO
2
empregado ou por facilitar a ruptura das interações
analito-matriz, até um determinado limite, no qual é atingida a saturação deste
analito no solvente (DANIELSKI et al., 2007).
Portanto, empregando-se o fluxo de CO
2
de 1,5 mL/min ou o TEE de 5
min, a variação dos demais parâmetros, na faixa testada neste estudo, não tem
efeito significativo no aumento dos níveis de concentração de esqualeno.
Porém, obteve-se a maior concentração de esqualeno no DDOSM (9,44 g/100
g), empregando-se os maiores fluxos, TED e TEE testados. Contudo, os teores
57
esqualeno e do n-octasano (padrão interno), verifica-se o aumento da área do
esqualeno em função dos tratamentos.
Nos cromatogramas A e B (Figura 17) observa-se que no tempo de
retenção de aproximadamente 7 min há um decréscimo significativo na área
deste pico, comparando-se com o perfil cromatográfico obtido por VERLEYEN
et al. (2001), que também analisaram DDOS utilizando a mesma coluna deste
estudo (HP-5), é possível identificar como sendo, provavelmente, AGL, que
conforme consta na Tabela 7 e no cromatograma da Figura 12 foram reduzidos
em virtude do tratamento com Na
2
CO
3
.
Na Tabela 17 estão descritos os teores de esqualeno no DDOS bruto, no
DDOS modificado e no DDOS modificado e submetido a extração com CO
2
-
SC. Observa-se que na pré-purificação (cristalização/Na
2
CO
3
) obteve-se uma
concentração de esqualeno de cerca de 84%. E após a extração com CO
2
-SC
os teores de esqualeno apresentaram um percentual de concentração de
176%. Constata-se, portanto, a eficiência da metodologia empregada na
obtenção de um DDOS com maiores teores de esqualeno, aumentado deste
modo a possibilidade do uso deste resíduo como fonte desta substância.
Tabela 17– Comparação entre os teores de esqualeno no DDOS bruto, no
DDOS cristalizado/Na
2
CO
3
e após a extração com CO
2
-SC.
DDOS
Esqualeno (g/100 g)
Bruto 3,382
±
0,037*
Modificado (cristalizado/Na
2
CO
3
) 6,037
±
0,207
Modificado e extração com CO
2
-SC 9,328
±
0,265
*Teores médio ± desvio padrão de triplicatas.
58
Figura 17 – Cromatogramas típicos do DDOS centrifugado (A), do DDOS
modificado (B), e DDOS modificado após a extração com CO
2
-SC
(C).
A
C
B
59
BONDIOLI et al. (1993) utilizaram para a separação de esqualeno, o
destilado da desodorização do óleo de oliva (DDOO), com concentração inicial
de esqualeno de 28 g/100 g. Para realizar a separação empregaram uma
planta piloto de extração, com CO
2
-SC em fluxo contracorrente contínuo (30 Kg
/ Kg de amostra), com um conjunto de três colunas empacotadas extratoras em
série e com possibilidade de controle diferencial de temperatura, e obtiveram
um extrato com 90 g/100 g de esqualeno. Porém, antes de submeter o DDOO
a extração com CO
2
-SC, realizaram modificações químicas que incluíram,
saponificação a quente sob refluxo com NaOH, seguida de esterificação com
glicerol e zinco como catalisador.
Comparando os resultados obtidos neste estudo com os do trabalho
descrito anteriormente, observa-se que os percentuais de concentrações de
esqualeno obtidos foram de 176% e 221%, respectivamente. Verifica-se que
estes níveis de concentração são próximos e que as diferenças observadas
devem-se, provavelmente, a constituição química inicial das amostras, as
metodologias para a modificação química inicial dos destilados e aos modelos
termodinâmicos empregados.
Utilizando os resultados deste estudo e os dados da produção nacional
de óleo de soja de 2006/2007, estimada em 4,1 milhões de toneladas
(ABIOVE, 2007) e o percentual de DDOS gerado de 0,1 a 0,4% do óleo bruto
(MENDES et al., 2002), é possível simular a disponibilidade total média de
esqualeno em aproximadamente 347 t, 619 t e 956 t, respectivamente para o
DDOS centrifugado, DDOSM e após a extração com CO
2
-SC. Portanto, a
metodologia deste estudo agregou valor ao DDOS, aumentando a
disponibilidade de esqualeno a partir desta matriz. Porém, é necessário avaliar
a relação custo/benefício, assim como sua implantação em escala piloto
visando à aplicação industrial.
60
5. CONCLUSÕES
Neste estudo, o DDOS foi submetido a processos prévios de purificação
(cristalização/Na
2
CO
3
) e após, otimizou-se as condições de extração com CO
2
-
SC, com a finalidade de se obter um extrato com mais altas concentração de
esqualeno.
A cristalização reduziu em 41% os teores dos fitoesteróis totais no
DDOS e o tratamento com Na
2
CO
3
foi eficiente na remoção de AGL. Ambos os
tratamentos aumentaram a concentração de esqualeno em 84% comparando-
se com o DDOS centrifugado.
As condições otimizados para a extração supercrítica do esqualeno do
DDOS modificado foram: 40
o
C, 281 bar, 0,90 g/mL, 5 min (TEE), 15 min (TED)
e fluxo de CO
2
de 1,0 mL/min.
A modificação físico-química do DDOS (cristalização/Na
2
CO
3
) seguida
da extração pelo CO
2
-SC proporcionou um aumento de 2,8 vezes nos teores
de esqualeno. Logo, agregou valor ao DDOS, que é uma matéria-prima de
baixo custo e amplamente disponível, visto que, o mesmo é um resíduo do
processamento de óleo de soja, cuja produção nacional é significativa.
61
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69
APÊNCIDE
70
APÊNDICE
Índice de recuperação = (X / Y) x 100 (equação 1A)
Em que,
X = concentração do composto na fração extraída por CO
2
-SC (g/100 g de
DDOS);
Y = concentração do composto no DDOS centrifugado (g/100 g)
71
Tabela 1 A – Relações entre as densidades da extração, massas e volumes de
CO
2
em extrações realizadas com TED = 15 min e fluxos de CO
2
=
1,0 mL/min
Densidade do CO
2
(g/mL)
Massa de CO
2
(g)*
Volume de CO
2
(mL)**
0,68
13,8 20,29
0,79
13,8 17,47
0,90
13,8 15,33
0,50
13,8 27,60
0,72
13,8 19,17
0,86
13,8 16,05
0,35
13,8 39,43
0,64
13,8 21,56
0,81
13,8 17,04
*Massa de CO
2
= 0,92 g/mL (densidade na cabeça da bomba) x TED x fluxo de CO
2
**Volume de CO
2
= massa de CO
2
/ densidade da extração
Tabela 2 A – Relações entre as massas e os volumes de CO
2
e os diferentes
TED e fluxos de CO
2
, em extrações realizadas em T = 40
o
C, p= 281
bar e densidade = 0,90 g/mL.
Massa de CO
2
(g)
Volume de CO
2
(mL)
TED (min)
Fluxo
s de CO
2
(mL/min)
13,8 15,33 15 1,0
20,7 23,00 15 1,5
18,4 20,44 20 1,0
27,6 30,67 20 1,5
23,0 25,55 25 1,0
34,5 38,33 25 1,5
72
Tabela 3 A – Resumo do teste de significância dos coeficientes da regressão
dos teores de esqualeno, em função da pressão e da temperatura de
extração, mantendo-se constante: TED = 15min TEE = 0 min, fluxo de
CO
2
= 1,0 mL/min
Coeficiente
Valor
ßo -1,28974
ns
ß11 -0,15092**
ß 12 0,14867**
ß 21 -0,000336**
ns
Teste t não significativo a 1% de probabilidade
**Teste t significativo a 1% de probabilidade
Tabela 4 A – Resumo do teste de significância dos coeficientes da regressão
dos teores de esqualeno extraído em função do fluxo e do TED,
mantendo-se constante os seguintes parâmetros: TEE = 0 min, T =
40
o
C; P = 281 bar; d = 0,90 g/mL
Coeficiente
Valor
ß
o
9,61217***
ß11 2,61867***
ß12 -0,55528*
ß21 0,01556**
***Teste t significativo a 1% de probabilidade
**Teste t significativo a 5% de probabilidade
*Teste t significativo a 6% de probabilidade
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