( PDF ) Avaliação da atividade anti-helmíntica dos óleos essenciais de Lippia sidoides e Croton zehntneri sobre nematóides gastrintestinais de ovinos

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DOS ÓLEOS

ESSENCIAIS DE Lippia sidoides E Croton zehntneri SOBRE

NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE OVINOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Ciências Veterinárias da Faculdade de Medicina

Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,

como requisito parcial para obtenção do grau de

doutor em Ciências Vetrinárias.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Leal

Bevilaqua.

Fortaleza

2006

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Aos meus familiares,

Aos amigos conquistados,

Aos meus amores, meu marido e minhas filhas,

Dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus.

Aos meus pais e irmãos que possibilitaram minha formação acadêmica e me

incentivaram a seguir meus estudos de pós-graduação.

À minha sogra pela ajuda e dedicação com minhas filhas durante minha ausência.

Ao meu amado marido cujo apoio tornou possível a conclusão deste trabalho.

Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade

Estadual do Ceará.

Aos funcionários do PPGCV, Adriana Maria Sales Albuquerque, Ana Cristina

Sabóia Nascimento e Frederico Rocha Cavalcanti, e à ex-funcionária Alzenira de Andrade

Ferreira por toda colaboração.

À Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua pela orientação e amizade.

À Profa. Dra. Selene Maia de Morais por suas orientações e toda ajuda durante o

doutorado e disponibilização do Laboratório de Química em Produtos Naturais.

Aos acadêmicos e bolsistas do Laboratório de Química em Produtos Naturais pela

colaboração na extração dos óleos essenciais.

À EMBRAPA Caprinos e ao Laboratório de Parasitologia por permitir a execução

de alguns experimentos para conclusão desta tese.

Ao Dr. Luiz da Silva Vieira pelo acolhimento e ajuda nos experimentos realizados

na EMBRAPA, assim como pela participação e orientação nos trabalhos desta tese.

Aos técnicos Felipe Cavalcante Machado e Helena Araújo da Ponte, e aos bolsistas

Adrine Maria do Carmo Navarro e Wladimir Rodrigues Aragão pela ajuda e despreendimento

durante a execução dos testes nas instalações da EMBRAPA.

Ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, Dra. Lúcia de Fátima e Dra. Fátima

pela participação em bancas e colaboração em trabalhos científicos.

Aos colegas do Laboratório de Doenças Parasitárias, pela colaboração e amizade, e

em especial aos amigos Cícero Temístocles Costa Coutinho, Michelline do Vale Maciel, Iara

Térsia Freitas Macedo, Lorena Mayana Beserra Oliveira, Roberta Braga da Rocha

e Rafaella

Albuquerque e Silva, companheiros do grupo de estudos com plantas medicinais.

Ao biotério da Universidade Estadual do Ceará, especialmente à Profa. Germana

Paixão, diretora do biotério, por conceder animais, equipamentos e rações para os

experimentos.

Ao CNPq e FUNCAP por participaram com o suporte financeiro para a realização

desta tese.

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-helmíntica dos óleos essenciais

de Croton zehntneri (OECz) e Lippia sidoides (OELs). O efeito dos óleos essenciais e de seus

principais constituintes, anetol e timol, foram determinados através de testes in vitro, de

inibição da eclosão de ovos e do desenvolvimento larvar de Haemonchus contortus. No teste

pré-clínico, OECz e OELs foram administrados à camundongos naturalmente infectados por

nematóides para determinar os efeitos destes óleos na redução da carga parasitária. O teste de

redução da contagem de ovos nas fezes (FECRT) e o teste controlado foram realizados sobre

ovinos naturalmente infectados com nematóides gastrintestinais. Os óleos essenciais e seus

principais constituintes apresentaram eficácia acima de 90% nas concentrações de 1,25 e 10

mg kg

-1

contra ovos e larvas de H. contortus. A eficácia do OECz e OELs na dose de 800 mg

-1

foi de 11,6 % e 46,3 %, respectivamente, e a do OELs nas doses de 1200 e 1600 mg kg

-1

foi de 57,6% e 68,9%, respectivamente, sobre nematóides de camundongos. No FECRT, a

eficácia de 230 e 283 mg kg

-1

do OELs e de 200 µg de ivermectina foi de 30%, 54% e 39,6%,

respectivamente, no 14º dia pós-tratamento. No teste controlado, a eficácia de 283 mg kg

-1

OELs e de ivermectina foi de 56,9% e 34,4%, respectivamente, contra Haemonchus spp, e

39,3% e 63,6% contra Trichostrongylus spp, respectivamente. O OELs apresentou atividade

superior ao OECz contra nematóides de camundongos e superior à ivermectina contra

nematóides gastrintestinais de ovinos.

Palavras-chave: anti-helmíntico, Haemonchus, fitoterapia; óleos essenciais; nematóide; ovino.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the anthelmintic activity of Croton zehntneri

(EOCz) and Lippia sidoides (EOLs) essential oils. The effects of the essential oils and their

main constituents, anethole and thymol, were determinated through in vitro tests of the egg

hatching and larval development inhibition of Haemonchus contortus. On the pre-clinical test,

OECz and OELs were administered to mice naturally infected with nematodes to determinate

the effects of these oils on worm burden. The feccal egg reduction count test (FERCT) and the

controlled test were realized with sheep naturally infected with gastrointestinal nematodes.

The essentials oils and their main constituents presented efficacy upper to 90% at 1.25 and 10

mg kg

-1

concentration against egg and larvae of H. contortus. The efficacy of EOCz and EOLs

at 800 mg kg

-1

dosage was 11.6% and 46.3%, respectively, and the efficacy of EOLs at 1200

and 1600 mg kg

-1

dosages were 57.6% and 68.9%, respectively, against mice nematodes. In

FECRT, 230 and 283 mg kg

-1

of OELs and 200 µg ivermectin efficacy were 30%, 54% and

39.6%, respectively, at 14

day after pos-treatment. In controlled test, the efficacy of 283 mg

-1

of EOLs and ivermectin were 56.9% and 34.4%, respectively, against Haemonchus spp,

and 39.3% and 63.6% against Trichostrongylus spp, respectively. The EOLs presented

anthelmintic activity superior to EOCz against nematodes from mice and superior to

ivermectin against sheep gastrointesintinal nematodes.

Keywords: anthelmintic; Haemonchus, phytotherapy; essential oils; nematodes; sheep.

LISTA DE ABREVIATURAS

ACh = Acetilcolina

AFA = Álcool + Formol + Ácido acético

BZD = Benzimidazóis

CE50 = Concentração efetiva para inibir 50%

CIP = Controle Integrado de Parasitos

DMSO = Dimetilsulfóxido

EP = Erro Padrão

FECRT = Teste de redução na contagem de ovos nas fezes

FDA = Food and Drugs Administration

GABA = Gamma-aminobutyric acid (Ácido Gama-aminobutírico)

L1 = Larva de 1°

°°

° estágio

L2 = Larva de 2°

°°

° estágio

L3 = Larva de 3°

°°

° estágio

LEV = Levamisol

OECz = Óleo Essencial de Croton zehntneri

OELs = Óleo Essencial de Lippia sidoides

OPG = Ovo Por Grama de Fezes

PADETEC = Parque de Desenvolvimento Tecnológico

TBZ = Tiabendazol

TME = Taxa Metabólica Específica

USA = United States of America

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição química dos óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides.......... 51

Tabela 2. Percentagem média de eficácia ±

±±

± ep dos óleos essenciais de C. zehntneri e

L. sidoides, anetol, timol e tiabendazol sobre a eclosão de ovos de H. contortus............

Tabela 3. Percentagem média de eficácia ±

±±

± ep dos óleos essenciais de C. zehntneri e

L. sidoides, anetol, timol e ivermectina sobre o desenvolvimento de larvas de H.

contortus................................................................................................................................

Tabela 4. Concentração efetiva 50 dos óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides, e

de anetol e timol contra ovos e larvas de H. contortus...................................................... 54

Tabela 5. Percentagem média de eficácia ±

±±

± ep dos óleos essenciais de L. sidoides e C.

zehntneri sobre a carga parasitária de camundongos ..................................................... 54

Tabela 6. Percentagem média de eficácia ±

±±

± ep do óleo essencial de L. sidoides e

ivermectina, baseada na redução da contagem de ovos nas fezes de

ovinos.....................................................................................................................................

Tabela 7. Gêneros de nematóides gastrintestinais identificados em coproculturas de

ovinos antes do teste de redução da contagem de ovos nas fezes.....................................

Tabela 8. Percentagem média de eficácia ±

±±

± ep do óleo essencial de L. sidoides e

ivermectina e percentagem média de parasitos no grupo controle negativo no teste

controlado com ovinos......................................................................................................... 58

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fotografia de Croton zehntneri ........................................................................ 36

Figura 2. Fotografia de Lippia sidoides ........................................................................... 37

Figura 3. Fotografia do processo de extração de óleo essencial de plantas ................. 41

Figura 4. Fotomicrografia de Syphacia obvelata, nematóide de camundongo............. 55

Figura 5. Fotomicrografia de Aspiculuris tetraptera, nematóide de camundongo....... 56

LISTA DE ANEXOS

Anexo I. Artigo intitulado “Validação de plantas medicinais” publicado na Revista

Brasileira de Plantas Medicinais....................................................................................

Anexo II. Artigo submetido ao periódico Veterinary Parasitology intitulado

“Anthelmintic activity of Croton zehntneri and Lippia sidoides essential

oils”..................................................................................................................................... 94

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................

LISTA DE TABELAS ......................................................................................

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................

LISTA DE ANEXOS ........................................................................................

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................

2. REVISÃO DE LITERATURA.....................................................................

INFECÇÕES POR NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS...................................... 16

ANTI-HELMÍNTICOS................................................................................................... 18

PLANTAS MEDICINAIS E A PESQUISA CIENTÍFICA......................................... 23

Seleção e identificação de plantas medicinais.......................................................... 24

Estudos de validação de plantas com atividade anti-helmíntica............................ 25

Testes de eficácia in vitro........................................................................................... 25

Ensaios in vitro com Caenorhabditis elegans............................................................ 26

Ensaios in vitro com parasitos adultos..................................................................... 26

Teste com larvas de nematóides............................................................................... 27

Teste de inibição de eclosão de ovos......................

JUSTIFICATIVA.............................................................................................................

HIPÓTESE CIENTÍFICA............................................................................................

OBJETIVO GERAL.......................................................................................................

OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................

MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................

1. Coleta da planta............................................................................................................... 41

2. Obtenção de óleo essencial.............................................................................................. 41

3. Análise química dos óleos essenciais.............................................................................. 42

4. Preparação do material para ser testado....................................................................... 42

5. Ovinos portadores e livres de infecção monoespecífica por Haemonchus contortus... 43

6. Testes in vitro.................................................................................................................... 44

6.1. Teste de inibição da eclosão de ovos............................................................................ 44

6.2. Teste de inibição de desenvolvimento larvar.............................................................. 45

7. Avaliação de atividade anti-helmíntica em camundongos............................................ 46

8. Avaliação da atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Lippia sidoides sobre

ovinos......................................................................................................................................

8.1. Teste de atividade anti-helmíntica através de FECRT.............................................. 47

8.2. Teste controlado............................................................................................................ 48

ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................................

RESULTADOS..................................................................................................................

DISCUSSÃO.......................................................................................................................

CONCLUSÕES.................................................................................................................

PERSPECTIVAS..............................................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................

INTRODUÇÃO

A produção de ovinos e caprinos tem sido estimulada no Brasil na tentativa de

garantir à população uma fonte de renda, além de fornecer carne e leite, fontes protéicas, que

passam a fazer parte da dieta desta população. Entretanto, o parasitismo por nematóides

gastrintestinais tem se apresentado como uma das principais causas de perdas econômicas

para os produtores de pequenos ruminantes no Brasil e em outras partes do mundo (Girão et

al., 1992; Pinheiro et al., 2000; Coop & Ky2 0 0 cm/R7 gs0 0 882938( )-186.17(a)7.82938(dt1(i)-9.2357131915(al)278]TJ.21279(a)-13.4472(z)7.12.)7.126(z)7.126 671.4 Tm( )Tj25.-5628 Tf8831918 522.48 Tm[(P)2.8-279(a)0831915(A gs0 28 Todut)1.40381(132.97.61782.80892( )-228.723(1(e)-13.4472-13.4472(m)1232.97.6al)278]TJ/c2( )-164.89nôm-47.8723(à)47.8723(c2( )-164.8at)1.40511(a)-2.800762(onô32.97.6dr)3.21279( )-)-9.23579()-228.723()-13.4459(nt)1.40511(n2 0 Td[(t)-9.23579(aa)-2.800762(onô32.97.6d)-2.80762(s)-4..40511(7(t)-9.2331f-13.4459(nt)1.40511()-)-9.23579çdt1(i92( )-165.894(ov.40511(-5.31915(K5(m)1.40251(a)v.40511(nout)-9.23319(r)3.2127)-2.80762(s2 0 Td[(tó2(s)6.0204(o )]TJ351.48Td[(pa)-1)v.40511(g)-175.532(pr)3.21279(i)-9.233192 0 Td[(t)-4.61788.88.31915(4(e)-13.44592 0 Td[(t)-9.23579(aa)23319(ul)1.40511(a)16.6587( n10.56 -19.5 )250]TJ/2.80762( )-17.40511(2.80762( ã9.4 -19.44o )-228.72:)he)679)278]TJ/R9 35.02105(s)-2.80892-69.1489(de)-13.44403894(250]TJ/92( )-164.894(ov)10.638n( )-69.1489(pr(ã)-2.80892(o )-164.89t-47.8723(à)47.8723(và)47.8723(1(e)-13.44723(i)1.40381(nos)-4.612((i)1.40381(nos)-4.61479(a)-2)3.2127po )]TJ351.48 0 Td[o )-228.723(pa)-2.80762(2)3.21277.82938()-47.8723(d)1)-9.23319(e)-13.44562(2)3.2127f)-7.42551(or)3.21279(n)2)3.21277.8.40511( )-4.9574( )-37.234(f(e)-13.4459(c)-2.80762(onô)10.6389(r)3.77K5(m)1.40251)-37.234(f(e)-13.4459l)1.40511(a)s)6.0204(7.82938(pe)-2.80762(r)3.21279( )-154.255(c)-13.445962( )-154.255(c)-13.4459-69.1489(de)2.81021(288.31915(b)-175.532(pr)3.21279nh2( )-154.255(c)-13.4459d(or)3.21279(n)2)3.21279( )-154.255(e)-2TJ/62( )-154.255(c)-)10.6383(Td[(pa)-13.4466(s021(2885(t)-9.23449c)-13.44403r)3.21279(i9( )-143.617(t)-9.80762( )-15440381(164.894(t)1.40511(e)-2.80381(nos)-4.6147ee)-13.4472-13.4472(t-47.8723(e)-2.80381(4(de)-2.80892( )-164.894(ov3.21279(i)1.4052( h)-47.8723(( )-154.25o-13.4472((ont)12.0421(ev3.21279r)3-2.808204i)-9.2532(c)7.83068((o )r)3.21279i 0 Td[(t)-40.92 0 Td[(e)-2.80892(t)1.4038184)-9.0]TJ-419.4 -19551)-37.234(fnos)-4.6147[(.)5.31915(,)-5.3191521.65.31915(2000;)12.0425a)-2.80762(2)3.2127279(ooe)-13.44562(2)3.2127G gs0 0 -15.9574( )-e)-13.445h-15.9574( g )-154.255(e)-27(a)7.82938(d[(e)-2.80892(t)1.403882)-9.0]TJ-419.4 -19551)-37.234(fnos))3.21277[(.)5.31915(,)-5.3191521.65.31915(2000;)12.0425a)-2.80762(2)3.212727940.92 0 .25a2

Plantas tidas como medicinais foram investigadas quanto às suas propriedades

contra vírus, bactérias, fungos e parasitos. Algumas plantas medicinais foram testadas quanto

às suas propriedades anti-helmínticas com o objetivo de controlar endo e ectoparasitos em

todo o mundo. Diversas pesquisas vêm sendo realizadas visando validar o uso de plantas

popularmente conhecidas como medicinais, ou seja, é necessária a avaliação científica destas

plantas a fim de assegurar a eficácia e a segurança da administração destas plantas ou de seus

derivados em organismos vivos.

REVISÃO DE LITERATURA

1. INFECÇÕES POR NEMATÓIDES

Segundo dados do IBGE (2005), o rebanho brasileiro de ovinos foi de 15.057.838

e o rebanho caprino foi de 10.046.888 no ano de 2004. Neste mesmo período, o nordeste

concentrou quase 93% do rebanho caprino brasileiro e o Ceará contava com quase 10% deste

rebanho. Com relação ao rebanho ovino, o Ceará no ano de 2004 contou com 12% do rebanho

nacional. Estes dados mostram a importância desta atividade para a balança econômica do

Brasil e do Ceará.

Além de representar uma fonte de renda para a população do nordeste brasileiro, a

produção de ovinos e caprinos fornece carne e leite para esta população e, portanto, a

ovinocaprinocultura é uma atividade estimulada para melhorar as condições nutricionais de

comunidades de baixa renda não só no Brasil, mas em vários países subdesenvolvidos ou em

desenvolvimento. Embora o nordeste seja o maior produtor de carne ovina e caprina no Brasil,

o consumo de carnes ainda é superior à produção, sendo necessária a importação de carnes

ovina e caprina para abastecimento nacional, indicando um mercado a ser conquistado através

do aumento da produtividade dos nossos rebanhos.

No nordeste brasileiro, o principal fator apontado como causa de baixa produção

de pequenos ruminantes é o estado sanitário dos animais associado à ausência ou ao uso

inadequado de tecnologias (Vieira et al., 1997). Em questionário aplicado em 127

propriedades no Ceará, Pinheiro et al. (2000) observaram que sintomas como anemia e edema

de barbela foram relatados em 81,9% dos criatórios de caprinos. Vale ressaltar que tais

sintomas são característicos das parasitoses causadas por nematóides gastrintestinais em

caprinos e ovinos.

Infecções por nematóides gastrintestinais relatadas em pequenos ruminantes em

vários países são incriminadas como causa de perdas da produção (Nginyi et al., 2001;

Githigia et al., 2001; Gasbarre et al., 2001; Papadopoulos et al., 2003; Beriajaya e Coperman,

2006), além de alta mortalidade nos rebanhos durante a estação chuvosa (Girão et al., 1992;

Coop & Kyriazakis, 2001; Pinheiro et al., 2000).

Haemonchus contortus é o nematóide gastrintestinal mais prevalente e mais

patogênico de pequenos ruminantes em países de clima tropical (Soulsby, 1987). Este fato

ocorre, também, na região nordestina do Brasil, onde a espécie H. contortus vem sendo

relatada como a mais prevalente entre os nematóides gastrintestinais (Costa e Vieira, 1984;

Charles et al., 1989; Costa et al., 1991; Arosemena et al.,1999; Mattos et al., 2005).

H. contortus, assim como outros nematóides gastrintestinais de pequenos

ruminantes, possuem um ciclo evolutivo direto, apresentando uma fase parasitária e uma fase

de vida livre meio (Vieira et al., 1997). Resumidamente, os animais parasitados eliminam

ovos nas fezes e as larvas de primeiro estágio eclodem no ambiente, se desenvolvem em

larvas de segundo e terceiro estágio. As larvas de terceiro estágio são infectantes, e ao serem

ingeridas no pasto passam por mais duas ecdises alcançando o estágio adulto. Após

acasalamento as fêmeas eliminam ovos juntamente com as fezes (Soulsby, 1987).

Os principais impactos da infecção por H. contortus nos hospedeiros são anemia e

perda progressiva de peso que podem causar danos à produtividade dos animais ou

mortalidade em casos de altas infecções (Soulsby, 1987). Os mecanismos que envolvem as

perdas na produtividade causadas por nematóides gastrintestinais incluem alterações no

Diversas estratégias têm sido estudadas no sentido de promover métodos que

auxiliem no controle dos nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Desta forma, o

Controle Integrado de parasitos (CIP) é a adoção combinada de métodos que utilizam anti-

helmínticos com métodos que não utilizam estes produtos e tem a finalidade de manter níveis

aceitáveis de infecção em animais de produção. Este controle vem sendo cada vez mais

difundido, e no sentido de melhorar a eficiência do CIP, a EMBRAPA/CNPC recomenda a

adoção das seguintes medidas (Vieira, 2003): manejo de pastagem; aplicações de medidas de

higiene que visem diminuir a contaminação dos animais, como limpeza e desinfecção das

instalações, manutenção de fezes em locais distantes dos animais; separação dos animais por

faixa etária; não introdução no rebanho de animais provenientes de outras propriedades sem

que estes sejam vermifugados, e manutenção no aprisco por no mínimo 12 horas após a

vermifugação.

2. ANTI-HELMÍNTICOS

Devido à sua natureza macroscópica, os nematóides estão provavelmente entre os

primeiros organismos infecciosos para os quais medidas de intervenção terapêuticas foram

criadas. A medicina veterinária contava apenas com medicamentos naturais para o controle de

nematóides até o meio do século 20, quando químicos sintéticos foram lançados no mercado

proporcionando maior eficácia e confiabilidade nos resultados (Reinemeyer e Courtney 2001).

Após a segunda guerra mundial, com o surgimento dos primeiros antibióticos e o

maior desenvolvimento da indústria farmacêutica, a descoberta de muitas drogas e

componentes ativos contra os agentes causadores de doenças, contribuiu para um grande

avanço no controle de diversas enfermidades. Durante anos, a pesquisa científica esteve

envolvida com a procura de novas moléculas capazes de controlar ou combater parasitos ou

agentes causadores de doenças e, por conseguinte, a utilização de drogas cada vez mais

potentes foi tornando-se uma prática comum na medicina humana e veterinária (Reinemeyer e

Courtney, 2001).

A fenotiazina foi a primeira droga a ser utilizada no controle dos nematóides, tendo

surgido após 1930, e somente na década de 50 foi lançado o composto tiabendazol, primeiro

anti-helmíntico do grupo dos benzimidazóis (Urquhart et al., 1996; Reinemeyer e Courtney,

2001). Os imidotiazóis e as tetrahidropirimidinas surgiram após 1966. Os organosfosforados

eram usados como pesticidas e somente após 1966, passaram a ser utilizados como anti-

helmínticos. As últimas drogas a serem descobertas contra nematóides foram as lactonas

macrocíclicas representadas pelas avermectinas e milbemicinas (Reinemeyer e Courtney,

2001).

BENZIMIDAZÓIS

A introdução do tiabendazol no início dos anos 50 marcou o início da era moderna

dos anti-helmínticos de largo espectro, seguros e eficazes contra uma ampla variedade de

nematóides parasitos e de administração versátil. O TBZ foi extensivamente usado em uma

ampla variedade de hospedeiros (ovinos, bovinos, caprinos, suínos, cavalos, aves e humanos).

O TBZ pode ser administrado em uma única dose terapêutica ou profilaticamente em doses

menores na alimentação por períodos mais longos. Além do amplo espectro de ação, tem

propriedade ovicida e larvicida (Reinemeyer e Courtney, 2001).

Baseado no sucesso do TBZ, programas extensivos foram lançados para modificá-

los e desenvolver drogas estruturalmente relacionadas com propriedades melhoradas. De

centenas de compostos sintetizados, os selecionados para desenvolvimento posterior com base

especialmente na segurança e eficácia incluem: albendazol, cambendazol, fenbendazol,

flubendazole, mebendazole, oxfendazole, oxibendazole, parbendazole e tiofanato (Reinemeyer

e Courtney, 2001).

Os BZD atuam primariamente ligando-se à sub-unidade de β-tubulina impedindo a

sua polimerização nos microtúbulos que são unidades estruturais essenciais de muitas

organelas, necessárias para numerosos processos celulares, incluindo mitose, codificação de

proteínas e metabolismo energético (Martin et al., 1998; Köhler, 2001; Ross, 1997). Os

mamíferos, também, contam com a tubulina para o metabolismo celular, porém os BZD têm

uma maior afinidade pela tubulina dos nematóides em condições normais de temperatura

corpórea dos mamíferos. Isto explica a sua ação seletiva em animais domésticos (Rang et al.,

1996).

As propriedades ovicida e larvicida dos BZD têm levado ao desenvolvimento de

ensaios in vitro de eclosão de ovos para detecção de populações de nematóides que sejam

resistentes aos compostos BZD. Nestes ensaios, ovos de nematóides resistentes são capazes de

desenvolver-se e eclodir na presença de altas concentrações de BZD solúveis (Reinemeyer e

Courtney, 2001).

IMIDOTIAZÓIS

Um dos principais representantes deste grupo é o levamisol, uma droga

nematodicida com variável espectro de atividade em numerosos hospedeiros (ovinos, bovinos,

suínos, cavalos, galinhas, cães). O LEV atua sobre estágios adultos de nematóides

gastrintestinais de ruminantes. É aprovado e comercializado nos USA somente para uso em

bovinos, ovinos e suínos. A maior vantagem do LEV é sua eficácia contra nematóides

parasitos de pulmões e trato gastrintestinal, e suas vias opcionais de administração (Urquhart

et al., 1996; Reinemeyer e Courtney, 2001).

O LEV é comercializado sob duas formas: sal de hidrocloreto ou sal fosfato. O

LEV hidrocloreto é um composto cristalino branco, altamente solúvel em água. Esta

solubilidade facilita a formulação de solução injetável e dosificação estável, sendo formulado

para administração oral, intra-ruminal, parenteral, pour-on, cápsulas de liberação lenta ou

como aditivo na ração (Lanusse, 1996). Embora possa existir absorção através do epitélio

ruminal, o principal local de absorção do levamisol é o trato gastrintestinal superior (Lanusse,

1996). A absorção e excreção do LEV são rápidas, após a administração oral, sendo 40%

excretado na urina em 12 horas (Lanusse, 1996; Rang et al., 1996).

O LEV é um agente bloqueador neuromuscular despolarizante tanto em

nematóides como nos hospedeiros e apresentam uma margem estreita de segurança em relação

a compostos de outros grupos (Urquhart et al., 1996). O hidrocloreto de LEV é um agonista

colinérgico direto que paralisa nematóides pela sustentação da contração muscular, ou seja,

provoca uma paralisia espástica nos nematóides (Martin et al., 1998; Köhler, 2001).

TETRAIDROPIRIMIDINAS: PIRANTEL

O pirantel foi introduzido como anti-helmíntico de amplo espectro em 1966,

inicialmente para uso contra nematóides do trato gastrintestinal parasitos de ovinos, e

subsequentemente foi desenvolvido para uso em bovinos, suínos, cavalos, cães e gatos. Foi

aprovado pelo FDA para todas as espécies acima exceto para bovinos.

O pirantel é um derivado do imidotiazol e é preparado para uso comercial como sal

de tartarato ou pamoato. O pirantel formado com sal de pamoato é hidrossolúvel e de baixa

absorção gastrintestinal em ruminantes. Tanto o pirantel como o morantel são fármacos muito

polares, de baixa absorção gastrintestinal em ruminantes, e são eliminados sem modificações

metabólicas através das fezes (Lanusse, 1996; Martin et al., 1997; Reinemeyer e Courtney,

2001).

Os efeitos do pirantel no hospedeiro são similares aos efeitos do LEV. O pirantel é

um agente despolarizante bloqueador neuromuscular em nematóides e hospedeiros

vertebrados (Range et al., 1996; Rayes et al., 2001; Köhler, 2001). A droga produz paralisia

dos parasitos causando contratura da musculatura similar à ação da ACh. Pirantel e morantel

são 100 vezes mais potentes que a ACh embora mais lentos no início da contração. O efeito da

ACh é facilmente reversível, porém não do pirantel e morantel (Reinemeyer e Courtney,

2001).

O pirantel e o morantel são fármacos de baixa absorção gastrintestinal em

ruminantes e elevada eliminação fecal, principalmente na forma não modificada (Lanusse,

1996; Reinemeyer e Courtney, 2001).

AVERMECTINAS/MILBEMICINAS

Os compostos deste grupo são derivados macrocíclicos da lactona que são produtos

da fermentação do actinomiceto Streptomyces avermitilis. Os fármacos deste grupo são

conhecidos como endectocidas e são divididos em duas famílias: avermectinas e milbemicinas

(Shoop et al., 1995; Lanusse, 1996; Reinemeyer e Courtney, 2001). Os compostos

endectocidas são fármacos antiparasitários de amplo espectro eficientes contra nematóides e

artrópodes (Lanusse, 1996). Estes compostos são drogas antiparasitárias extremamente

potentes, demonstrando ter excelente atividade, em doses muito baixas, contra uma ampla

variedade de nematóides (Shoop et al., 1995). Algumas drogas deste grupo podem permanecer

ativas durante no mínimo duas semanas após a administração graças à persistência no tecido

adiposo corpóreo. Afetam os canais de cloro, independentemente do GABA, resultando em

paralisia e eventual morte do parasito (Martin et al., 1997; Köhler, 2001; Rang et al., 1996;

Forrester et al., 2004).

Durante a última metade do século, as drogas nematocidas têm passado por rápida

expansão e melhoramentos. Esta classe de drogas deixou de ser uma coleção de compostos

relativamente inseguros com eficácia modesta contra espectro limitado de parasitos.

Compostos anti-nematóides modernos com o passar dos tempos constituíram um arsenal com

um amplo índice terapêutico, eficácias que se aproximam de 100% e excelente atividade se

administrado oralmente, parenteralmente ou topicamente. Além disto, muitos compostos

passaram a oferecer proteção persistente de re-infecção por várias semanas após tratamento, e

alguns não apresentam período de suspensão para o consumo após tratamento (Reinemeyer e

Courtney, 2001). Entretanto, apesar da engenharia molecular ter avançado obtendo recursos

que podem ser utilizados para diagnósticos mais precisos e a indústria farmacêutica contar

com drogas verdadeiramente notáveis que exibem excelente padrão de desenvolvimento

farmacêutico, este grupo profilático ou terapêutico necessita de uma diversidade química

maior.

As drogas usadas contra nematóides disponíveis para muitos hospedeiros

pertencem a somente poucas classes químicas. Desta forma, o número de alternativas

terapêuticas e profiláticas é limitado e a resistência anti-helmíntica tem sido descrita como o

maior desafio para o controle de parasitos neste milênio (Reinemeyer e Courtney, 2001;

Prichard, 1994). O desenvolvimento de populações de nematóides resistentes a anti-

helmínticos tem sido descrito desde os anos 60 e foi, inicialmente, relacionado aos compostos

benzimidazóis. Desde então, relatos sobre resistência anti-helmíntica têm sido descritos em

vários países e a todas as classes de produtos sintéticos disponíveis comercialmente (Donald et

al., 1980; Gill et al., 1998; Le Jambre et al., 1999; Schnyder et al., 2005; Sissay et al., 2006).

No Brasil, especificamente no nordeste brasileiro, a resistência a anti-helmínticos vem sendo

relatada à ivermectina, levamizóis e benzimodazóis (Echevarria et al., 1991; Echevarria et al.,

1996; Melo et al., 1998 e 2003; Vieira e Cavalcante, 1999).

Os compostos anti-helmínticos devem ser respeitados como recursos preciosos

para serem usados frugalmente e estrategicamente, porque o uso excessivo de qualquer

ferramenta pode torná-la fraca ou sem efeito. È importante salientar que, para a indústria

farmacêutica, a busca por novas moléculas anti-helmínticas que venham a colaborar com o

rodízio com as atuais drogas é um processo difícil, oneroso e uma possibilidade considerada

remota nos próximos anos (Hennessy, 1997), portanto a pesquisa de formas alternativas para o

controle das nematodioses gastrintestinais torna-se imprescindível.

3. PLANTAS MEDICINAIS

O contexto social moderno, as necessidades do mercado farmacêutico e o

reconhecimento que pesquisas com plantas medicinais usadas na medicina popular

representam uma abordagem compatível com o desenvolvimento de novas drogas levaram a

um aumento do número de publicações neste campo, em virtude do reconhecimento da

importância desta área de estudo por parte das instituições privadas ou governamentais (Rates,

2001).

A utilização de plantas no tratamento de diversas enfermidades infecciosas ou não,

é uma prática que foi bastante usada por nossos antepassados, principalmente em épocas de

inexistência de produtos farmacêuticos mais avançados. O uso de produtos naturais com

propriedades terapêuticas é tão antigo quanto é a civilização humana e, por um longo tempo,

produtos minerais, de plantas e animais foram as principais fontes de drogas (Rates, 2001).

Entretanto, a total aceitação de drogas derivadas de plantas e a utilização da

fitoterapia na medicina científica só ocorrerão se estes produtos cumprirem os mesmos

critérios de eficácia, segurança e controle de qualidade que os produtos sintéticos (Rates,

2001), ou seja, os produtos derivados de plantas devem ter eficácia avaliada e confirmada,

assim como deve ser garantida que sua administração a organismos vivos ocorra sem riscos

para sua saúde.

SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS

A primeira etapa no processo de validação científica é a seleção de plantas feita

através de levantamento de literatura ou diretamente nas comunidades que fazem uso popular

destas plantas, por meio da aplicação de questionários ou entrevistas. Nesta pesquisa, todos os

dados referentes à utilização das plantas devem ser considerados, tais como forma de preparo,

dose, forma e freqüência de administração, etc.

Após a escolha da planta medicinal a ser estudada, é feito um levantamento dos

dados botânicos da espécie de planta. Este levantamento inclui identificação botânica e dados

sobre o uso popular, ou seja, parte da planta a ser utilizada, forma de administração, dosagens,

tempo de tratamento, etc. As informações sobre o uso popular das plantas podem ser obtidas

através de fontes de pesquisas ou diretamente nas comunidades que fazem uso de plantas

medicinais.

Um problema muito comum na pesquisa de atividade medicinal é que mesmo

simples extratos ou outros produtos derivados de plantas podem conter uma mistura de vários

compostos que estão sujeitos à variação de concentração de acordo com mudanças ambientais

(Taylor et al., 2001). Com relação a este aspecto o óleo essencial de C. zehntneri coletado em

Viçosa do Ceará foi analisado por cromatografia gasosa e espectrometria de massa,

apresentando 82,55% de anetol e 3,52% de estragol, sendo portanto denominado variedade

anetol (Luciano e Morais, 2000). Em outros relatos, Sousa et al. (2005) e Siqueira et al.

(2006) avaliaram diferentes amostras do óleo essencial de C. zehntneri obtido a partir de

partes aéreas coletadas na região de Viçosa do Ceará, e as amostras apresentaram 73,6% e

42,09% de anetol; e 2,52% e 45,95% de estragol, respectivamente. Recente estudo sobre os

efeitos larvicidas dos óleos essenciais de Hyptis martiusii, L. sidoides e Syzigium aromaticum

sobre larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus revelou que seus principais

constituintes foram cineol (24,3%), timol (43,5%) e eugenol (80,8%), respectivamente (Costa

et al., 2005). Entretanto, a atividade do óleo essencial de L. sidoides sobre larvas de A.

aegypti, apresentou 73,1% de timol (Furtado et al., 2005). Silva et al. (1999) demonstraram

que a composição química do óleo essencial de Ocimum gratissimum pode variar de acordo

com o horário de coleta da planta, e as maiores concentrações de eugenol foram obtidas às 11

e 13 horas do dia e as menores concentrações nos horários de 8 horas e 17 horas. Esta

informação é de fundamental importância, e pode contribuir com o processo de coleta e

padronização da extração de óleo essencial da planta.

ESTUDOS DE VALIDAÇÃO DE PLANTAS COM ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA

Estudos de validação envolvem testes que determinam a eficácia contra os agentes

causadores da enfermidade a ser combatida e a segurança de administração para a espécie a

ser tratada. Nesta fase, são realizados os testes farmacológicos pré-clínicos e clínicos. Os

testes pré-clínicos são realizados in vitro e em animais de laboratório com o objetivo de

avaliar a eficácia desejada e determinar a toxicidade do produto em estudo. Os testes clínicos

realizados na espécie alvo possibilitam a determinação final de eficácia e toxicidade da planta

ou produto a ser utilizado.

TESTES DE EFICÁCIA in vitro

A maior parte dos campos da quimioterapia possui sistemas de testes in vitro que

permitem prever com acurácia as concentrações ideais das drogas para obtenção da eficácia in

vivo. Por exemplo, através da sobrevivência de bactérias em culturas expostas às drogas é

possível determinar a concentração necessária em tecidos ou sangue para o sucesso

terapêutico. Como os nematóides são o alvo primário para as drogas anti-helmínticas, a maior

parte das tentativas têm sido feitas sobre estas formas. Assim sendo, os sistemas primários

desenvolvidos incluem as culturas do nematóide de vida livre Caenorhabditis elegans e os

estágios larvares e ovos de nematóides (Geary et al., 1999).

Os testes in vitro servem como uma indicação inicial da atividade que está sendo

pesquisada, e quando utilizados em uma triagem de extratos de plantas, permitem selecionar

aqueles que apresentam melhores resultados, diminuindo gastos, evitando perda de tempo e

uso indiscriminado de animais de experimentação.

ENSAIOS in vitro COM Caenorhabditis elegans

Aparentemente é fácil detectar os efeitos de drogas nas culturas de C. elegans,

através do monitoramento do comportamento, sobrevivência e/ou reprodução. As drogas que

reduzem a motilidade ou sobrevivência, tais como levamisol e a classe das lactonas

macrocíclicas podem ser detectadas nestas culturas em baixas concentrações (McGraw et al.,

2005). No entanto, as correlações não são universais. Morantel e pirantel que possuem modo

de ação similar ao levamisol nos receptores da acetilcolina (Martin et al., 1997) são 50 a 100

vezes menos potentes do que o levamisol, respectivamente, contra C. elegans (Simpkin &

Coles, 1981). Este sistema quase sempre pode ser usado para manipular anti-helmínticos

conhecidos, mas é pouco adequado para caracterizar o potencial de novos compostos com

mecanismos de ação desconhecidos (Geary et al., 1999)

ENSAIOS in vitro COM PARASITOS ADULTOS

Os nematóides parasitos não podem ser desenvolvidos em culturas contínuas desde

a oviposição até o estágio adulto. A possibilidade de cultivar parasitos no laboratório fora do

hospedeiro seria de enorme utilidade para os estudos de biologia básica destes organismos e

para os efeitos de drogas, logo a ausência de um sistema de cultura adequado é o maior

impedimento para estas pesquisas. Como o estágio adulto é o principal alvo dos anti-

helmínticos o ideal seria determinar o potencial das drogas sobre estas formas. Nos sistemas

disponíveis atualmente para manutenção de adultos em cultura, após o isolamento do

hospedeiro, a viabilidade decresce inevitavelmente, complicando a interpretação dos testes de

toxicidade de drogas (Geary et al., 1999)

TESTES REALIZADOS COM LARVAS DE NEMATÓIDES

Vários ensaios anti-helmínticos foram desenvolvidos para larvas de nematóides

parasitos, sendo o teste de desenvolvimento larvar o mais amplamente utilizado, possui

numerosas variações. A origem deste teste está no conhecimento de que pequenas

concentrações de anti-helmínticos de amplo espectro afetam a eclosão, desenvolvimento ou

motilidade de nematóides (Taylor et al., 2002; Coles et al., 2006). Usando esta abordagem, a

técnica de paralisia ou motilidade larvar foi desenvolvida para detectar a resistência ao

levamisol e morantel (Martin & Le Jambre, 1979). Neste ensaio, larvas infectantes são

incubadas por 24 horas em diluições em série com a substância a ser testada. Após este tempo

a percentagem de larvas paralisadas ou imóveis é determinada para cada concentração. Apesar

da facilidade de execução, o teste de motilidade larvar pode ser subjetivo e existe a

possibilidade de gerar erros de avaliação, pois a larva pode apresentar-se imóvel ou em

movimento em diferentes momentos da leitura. Outra técnica que pode ser utilizada para

triagem de plantas com atividade anti-helmíntica é a técnica de desenvolvimento larvar

elaborada por Hubert & Kerboeuf (1992). Esta técnica foi desenvolvida para detecção de

nematóides resistentes e utiliza um meio de cultura para a obtenção de larvas infectantes a

partir de ovos recuperados nas fezes. A técnica de Roberts & O’Sullivan (1950) foi elaborada

com a finalidade de identificar em nível de gênero as larvas infectantes de nematóides

gastrintestinais, como teste complementar ao OPG. Uma modificação desta técnica permite a

realização do teste de desenvolvimento larvar simplificada. Assim sendo ovos recuperados de

animais infectados são colocados para incubação em fezes de animais livres de nematóides.

Após 48 h de incubação, adicionam-se os extratos a serem testados e após sete dias, é feita a

contagem das larvas. Os resultados são comparados a grupos não tratados e tratados com

droga padrão.

Em estudo realizado com larvas de H. contortus, Batista et al. (1999)

demonstraram que os extratos aquosos de Spigelia anthelmia e Momordica charantia

apresentaram ação paralisante sobre este parasito. Enquanto, Assis et al. (2003) utilizaram o

desenvolvimento larvar para testar o extrato acetato de etila de S. anthelmia que inibiu 81,2%

das larvas de H. contortus e Annona senegalensis inibiu 92,2% do desenvolvimento de larvas

de H. contortus (Alawa et al., 2003). A técnica de desenvolvimento larvar descrita por

Roberts & O’Sullivan (1950) foi utilizada para avaliar os efeitos de diferentes extratos de

Melia azedarach sobre larvas de H. contortus, e os melhores resultados foram obtidos com o

extrato etanólico das folhas (Maciel et al., 2006).

TESTE DE INIBIÇÃO DE ECLOSÃO DE OVOS

Este teste é realizado com ovos de nematóides coletados a partir de fezes de

animais portadores de infecções experimentais ou naturais. No caso de infecções

experimentais, deseja-se conhecer a atividade de um produto contra um parasito específico ou

contra infecções mistas. Este teste foi desenvolvido para avaliação da resistência anti-

helmíntica em nematóides gastrintestinais (Coles et al., 1992) e, atualmente, é amplamente

utilizado para avaliação do potencial anti-helmíntico de plantas. O tiabendazol é usado no

teste de eclosão de ovos para levantamentos, porém outros benzimidazóis podem ser usados

como propostas de pesquisas (Coles et al., 1992), entretanto, os benzimidazóis são pouco

solúveis o que dificulta o seu uso.

A coleta de fezes para o teste é realizada diretamente do reto do animal para que

não ocorra contaminação por nematóides de vida livre. Os ovos nas fezes embrionam

rapidamente e, no máximo, 48 horas após a coleta, o seu desenvolvimento e eclosão podem

ser observados ao microscópio. Os ovos recuperados de animais infectados são colocados em

placas ou tubos para incubação. Adicionam-se os extratos ou frações da planta a ser avaliada

em diferentes concentrações, e após incubação é feita a contagem de larvas eclodidas e ovos.

Os resultados são comparados com o grupo controle negativo. A adição de uma substância aos

ovos recentemente coletados permite avaliar seu efeito sobre as mitoses (Coles et al., 1992).

Neste teste, podem ser utilizados controles positivos, com drogas padrão, para comparar o

percentual de eficácia do produto natural em relação ao sintético.

Recentes triagens realizadas com plantas do nordeste têm demonstrado que

algumas plantas têm potencial para uso como anti-helmíntico. Menezes et al. (1992)

avaliaram o efeito de quatro leguminosas sobre fezes de animais infectados

experimentalmente, observando que Dioclea grandiflora e Canavalia brasiliensis inibiram

87,4 e 95,7% do desenvolvimento das larvas infectantes de H. contortus. Os extratos aquosos

de S. anthelmia e M. charantia inibiram o desenvolvimento de ovos de H. contortus (Batista

et al.,1999). O óleo essencial de Ocimum gratissimum e seu principal constituinte, eugenol,

inibiram 100% da eclosão de ovos de H. contortus na concentração de 0,5% (Pessoa et al.,

2002). A comparação entre os extratos hexânico, clorofórmico, acetato de etila e metanólico

de S. anthelmia demonstrou que o extrato acetato de etila apresentou os melhores resultados

inibindo 100% da eclosão de ovos de H. contortus na concentração de 50 mg mL

-1

(Assis et

al., 2003).

A avaliação dos efeitos de Vernonia amygdalina e Annona senegalensis sobre ovos

de H. contortus demonstrou que somente A. senegalensis demonstrou inibição da eclosão de

ovos em 88,5% (Alawa et al., 2003). Os efeitos de diferentes extratos de M. azedarach sobre

ovos de H. contortus demonstraram que os melhores resultados foram obtidos com o extrato

etanólico das sementes (Maciel et al., 2006).

TESTES DE EFICÁCIA E DE SEGURANÇA in vivo

Somente após a obtenção de resultados promissores com os testes in vitro, passa-se

aos testes in vivo que podem utilizar inicialmente animais de laboratório e, em seguida, os

testes toxicológicos. Depois desta primeira etapa, podem ser realizados os testes com animais

que representem a espécie alvo para a indicação terapêutica.

TESTES PRÉ-CLÍNICOS DE EFICÁCIA

São denominados pré-clínicos, os testes de eficácia com animais de laboratório. Os

testes pré-clínicos para determinação de eficácia anti-helmíntica de um produto natural são

realizados em animais infectados experimentalmente ou com infecção natural. Os resultados

dos grupos tratados são comparados, percentualmente, com os resultados obtidos em grupos

não tratados e em grupos tratados com drogas sintéticas. Animais de laboratório têm sido de

grande ajuda para testar plantas com propriedades medicinais. Camundongos e ratos

albergando parasitos intestinais são usados em ensaios preliminares para determinar atividade

anti-helmíntica de produtos. Os nematóides de maior ocorrência em infecções de

camundongos mantidos em laboratórios no Brasil foram Syphacia obvelata e Aspiculuris

tetraptera (Bressan et al., 1997; Bazzano et al., 2002; Scaini et al., 2003; Silva et al., 2005).

Amorim et al. (1987) testaram o efeito de nove plantas em camundongos

infectados com os nematóides do intestino grosso, S. obvelata e A. tetraptera, e o melhor

resultado foi obtido com Tynnanthus fasciculatus que apresentou eficácia de 57,2%. Por outro

lado, Ficus insipida e Ficus carica não demonstraram eficácia na redução da carga parasitária

sobre os mesmos nematóides (Amorim et al., 1999). O suco e o infuso de Chenopodium

ambrosioides apresentaram eficácia abaixo de 20% na eliminação de A. tetraptera e S.

obvelata em camundongos (Borba e Amorim, 2004). Da mesma forma o extrato aquoso de

Albizia anthelmintica administrado a camundongos infectados com Heligmosomoides

polygyrus, parasito do intestino delgado, não produziu efeitos significantes na contagem de

ovos ou na carga parasitária dos animais (Githiori et al., 2003).

TESTES TOXICOLÓGICOS

A toxicologia experimental desenvolve estudos para elucidação dos mecanismos

de ação dos agentes tóxicos sobre sistemas biológicos e a avaliação dos efeitos decorrentes

dessa ação (Oga e Siqueira, 2003). Os estudos toxicológicos, aplicados em animais de

laboratório e sob condições previamente estabelecidas, permitem determinar os possíveis

efeitos decorrentes da exposição a determinadas substâncias (Barros & Davino, 2003).

A avaliação toxicológica de produtos em organismos vivos pode envolver a

avaliação dos efeitos obtidos após 24 horas da administração (toxicidade aguda) ou após

administrações em doses repetidas (toxicidade sub-crônica e crônica). Outros estudos como

toxicidade reprodutiva, estudos de efeitos neurotóxicos e/ou teratogênicos e estudos de efeitos

carcinogênicos e/ou mutagênicos podem fazer parte de uma avaliação mais detalhada dos

efeitos da administração de fitoterápicos em animais. No Brasil, a resolução 1/78 (D.O.

17/10/78) do Conselho Nacional de Saúde estabelece os seguintes tipos de ensaios de

toxicidade: aguda, sub-aguda (sub-crônica), crônica, teratologia, embriotoxicidade e estudos

especiais, carcinogênicos, mutagênicos e neurotóxicos.

Após determinação de eficácia in vitro do extrato acetato de etila de S. anthelmia

sobre ovos e larvas de H. contortus, este extrato foi selecionado para estudo toxicológico em

animais de laboratório. O extrato acetato de etila de S. anthelmia apresentou DL50 de 345,9

mg kg

-1

por via oral em camundongos (Camurça-Vasconcelos et al., 2004) e não demonstrou

toxicidade sistêmica significante em administrações orais durante 30 e 60 dias em ratos

(Camurça-Vasconcelos et al., 2005). Fontenelle (2005) avaliou a toxicidade aguda dos óleos

essenciais de L. sidoides e C. zehntneri verificando que estes óleos administrados por via oral

não apresentaram qualquer toxicidade até 3 g kg

-1

. Assim sendo, a determinação da toxicidade

auxilia na escolha das doses a serem usadas nos testes in vivo, portanto são de fundamental

importância na validação de plantas medicinais.

TESTES CLÍNICOS DE EFICÁCIA

Os testes de eficácia com a espécie alvo devem ser os últimos testes a serem

realizados numa pesquisa sobre atividade de plantas medicinais. Alguns testes foram

desenvolvidos para avaliar a resistência aos anti-helmínticos disponíveis no mercado e vêm

sendo utilizados para determinar a eficácia de drogas contra nematóides.

A atividade anti-helmíntica de produtos em pequenos ruminantes pode ser

avaliada pelo teste de redução da contagem de ovos nas fezes (FECRT) conforme

recomendado por Coles et al. (1992) ou pelo teste controlado como recomendado por Wood et

al. (1995).

TESTE DE REDUÇÃO DA CONTAGEM DE OVOS NAS FEZES

O FECRT fornece uma estimativa da eficácia anti-helmíntica de uma substância

através da comparação da contagem de ovos eliminados nas fezes antes e após o tratamento

(Coles et al., 1992).

Os procedimentos e exigências para realização do FERCT foram descritos por

Coles et al. (1992) e serão citados a seguir:

1. Usar animais jovens, 3-6 meses de idade, ou animais mais velhos com

contagem de opg acima de 150 e sem tratamento num período prévio de 8 a 12 semanas.

2. Os animais devem ser distribuídos aleatoriamente ou pelo OPG nos grupos de

tratamento e controle negativo.

3. Os animais do grupo controle positivo devem ser tratados com anti-helmíntico

conforme recomendação do fabricante.

4. Os animais dos grupos de tratamento devem, também, receber a dose dos

produtos a serem testados conforme peso corporal.

5. Amostras de fezes devem ser coletadas diretamente do reto do animal e levadas

ao laboratório para contagem de ovos nas fezes utilizando o método de McMaster modificado

e, se possível, para realização de larvacultura para identificação do gênero dos nematóides.

6. A coleta das fezes para análise deve ser feita, no mínimo, até 10 a 14 dias após

tratamento.

Com relação ao número de animais nos grupos experimentais, Coles et al. (1992)

recomenda 15 animais por grupo, entretanto Vercruysse et al. (2001) relataram que, em casos

de pesquisa, o experimento pode contar com no mínimo seis animais por grupo.

Para análise dos dados, calcula-se a média aritmética, percentagem de redução e

intervalo de confiança de 95%. Para Coles et al. (1992), a média aritmética é preferível à

média geométrica porque é mais fácil de calcular, fornece uma melhor estimativa da postura

de ovos dos parasitos, e é uma medida mais conservadora da eficácia anti-helmíntica.

A percentagem de redução pode ser calculada usando a seguinte fórmula:

% redução = 100 (1 – Média de T/ Média de C)

Onde, T é o grupo tratado e C é o grupo controle.

A análise estatística do estudo é um procedimento de dois estágios. As

recomendações para aprovação de produtos anti-helmínticos são baseadas nas diferenças

estatísticas significativas entre os grupos controle e tratado, e no cálculo da percentagem de

eficácia de 90% ou mais (Vercruysse et al., 2001) ou 95% (Coles et al., 1992).

Várias plantas ou extratos obtiveram bons resultados na redução do OPG, como o

extrato aquoso de Albizia anthelmintica que obteve redução de 70% (Githiori et al., 2003); o

extrato aquoso bruto de Artemisia brevifolia reduziu em 67,2% a contagem de ovos nas fezes

(Iqbal et al., 2004); os efeitos de medicamentos anti-helmínticos preparados com as plantas

Myrsine africana, A. anthelmintica e Hilderbrantia sepalosa produziram eficácia de 77%,

89,8% e 90%, respectivamente (Gathuma et al., 2004); o extrato etanólico de Khaya

senegalensis reduziu em 88% a contagem de ovos nas fezes de ovinos (Ademola et al.,2004);

a atividade anti-helmíntica de Calotropis procera avaliada em ovinos diminuiu 88,4% a

contagem de ovos nas fezes (Iqbal et al., 2005); sementes de Butea monosperma obtiveram

eficácia de 78,4% através da contagem dos ovos por grama de fezes (Iqbal et al., 2006a); o

extrato aquoso do rizoma de Zingiber officinale exibiu um decréscimo de 66,6% no OPG

(Iqbal et al., 2006b).

TESTE CONTROLADO

Em relação ao FECRT, o teste controlado é um teste mais dispendioso em termos

de requerimentos de mão-de-obra e de animais (Taylor et al., 2002), porém é mais confiável,

sendo recomendado para triagens de titulações de doses ou de confirmação de dose (Wood et

al., 1995). A determinação da eficácia anti-helmíntica no teste controlado é feita comparando-

se as cargas parasitárias nos grupos tratados em relação ao grupo não tratado (Wood et al.,

1995). Com relação ao teste controlado a “World Association for the Advancement of

Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.)” preconiza as recomendações e procedimentos abaixo

(Wood et al., 1995):

1. A afirmação de eficácia de um produto deve ser expressa contra cada

gênero/espécie (larva/adulto) como: altamente eficaz (acima de 98%), eficaz (90-98%),

moderadamente eficaz (80-89%) ou insuficientemente ativo (menos de 80%);

2. As doses devem ser baseadas no peso corporal;

3. O conhecimento do modo de ação de um produto não é um

requerimento exigido para registro. Entretanto pode ser útil para estabelecer se o produto

poderá ser eficaz contra populações resistentes de parasitos;

4. A distribuição dos animais nos grupos deve ser feita ao acaso, entretanto

quando usadas infecções naturalmente adquiridas, uma maior uniformidade pode ser atingida

se a contagem de ovos nas fezes ou larvas de parasitos for usada como critério de infecção;

5. Com relação ao procedimento de tratamento, um fator essencial é

garantir que cada animal receba uma dose adequada, portanto os seguintes procedimentos

visam minimizar erros experimentais:

• horário de tratamento: dispensar tempo adequado para os tratamentos, evitando pressa;

• identificação do animal antes do início de cada tratamento;

• calibragem do equipamento de dosificação dos animais;

• a pesagem dos animais deve ser feita no máximo dois dias antes dos tratamentos e não

no dia dos tratamentos para evitar confusão com muitas tarefas;

• o cálculo das doses dos tratamentos deve ser feito baseado no peso corporal dos

animais, e deve ser feito antes da hora do tratamento;

• checagem cautelosa da identificação dos animais antes dos tratamentos para evitar

erros de administração;

• observações pós-tratamentos devem ser feitas por pelo menos 4 h, e depois diariamente

para detectar possíveis efeitos adversos.

O intervalo entre os tratamentos e o procedimento das necropsias varia em função

da farmacocinética e/ou persistência, e para produtos orais que atingem níveis terapêuticos

rapidamente e/ou possuem pouca ou nenhuma atividade persistente, a necropsia deve ser feita

4 a 7 dias após o tratamento contra nematóides adultos (Wood et al., 1995). Quando a

necrópsia de todos os animais não pode ser completada em 1 dia, réplica ou um número igual

de animais de cada grupo de tratamento deve ser examinado, diariamente e tão rápido quanto

possível, preferivelmente dentro de 3-4 dias (Wood et al., 1995).

A eficácia dos tratamentos é expressa como a percentagem de eficácia (% E) da

dose contra uma determinada espécie de parasito (S) em um único grupo de tratamento (T)

quando comparado com o controle não tratado (C), dado pela seguinte fórmula (Wood et al.,

1995):

(% E) = __Média de S em C – Média de S em T_ x 100

Média de S em C

No teste controlado, a média geométrica deve ser usada uma vez que representa

com maior exatidão a distribuição da população de nematóides dentro de um grupo de animais

e fornece uma indicação mais precisa do grau de eficácia do produto analisado (Wood et al.,

1995).

Com relação à análise estatística, para animais com infecções naturalmente

adquiridas, a análise não-paramétrica pode ser mais apropriada uma vez que as populações

estão normalmente distorcidas. O nível de significância, comumente aceito, é aquele em que a

significância ocorre com P < 0,05 (Wood et al., 1995).

Tendo em vista a laboriosidade do teste controlado em pequenos ruminantes e a

necessidade de sacrificar muitos animais, em geral é a última etapa realizada na avaliação de

substâncias com atividade anti-helmíntica. Logo, poucos são os autores que empregaram esta

técnica na pesquisa de fitoterápicos.

Croton zehntneri e Lippia sidoides

Entre as muitas plantas que vêm sendo testadas, Croton zehntneri Pax & K. Hoffm

(Euphorbiaceae) e Lippia sidoides Cham (Verbenaceae) são usadas na medicina popular do

Brasil para tratar distúrbios gastrintestinais (Craveiro et al., 1977).

C. zehntneri (figura 1) é um arbusto de porte variável, com folhas simples e

pilosas, folhas bem pequenas, em espigas terminais, e fruto do tipo cápsula de deiscência

explosiva, abrindo-se em três partes e atirando longe as sementes oleagenosas, que são

manchadas e medem cerca de 3 mm de comprimento (Lorenzi & Matos, 2002) . É originária

do Brasil e cresce de forma silvestre nas áreas da caatinga desde o nordeste até Minas Gerais,

sendo planta nativa da ecorregião do Complexo Ibiapaba-Araripe, Ceará, sendo conhecida

popularmente como canela-de-cunhã, canelinha e canela-do-mato (Matos, 2002). O óleo

essencial de C. zehntneri apresentou efeitos estimulantes no sistema nervoso central (Bernadi

et al., 1991), e exerceu efeitos diferentes em uma variedade de preparações do músculo liso

(Coelho-de-Souza et al., 1998). Em recentes estudos, C. zehntneri coletado em Viçosa do

Ceará foi analisado por cromatografia gasosa e espectrometria de massa, apresentando

82,55%, 73,6% e 42,09% de anetol e 3,52%, 2,52% e 45,95% de estragol, respectivamente

(Luciano e Morais, 2000; Sousa et al., 2005; e Siqueira et al., 2006).

Figura 1. Croton zehntneri (Fonte: Lorenzi & Matos, 2002.)

L. sidoides é um arbusto caducifólio, ereto, muito ramificado e quabradiço, próprio

da vegetação do semi-árido nordestino, comum na caatinga entre Mossoró-RN e Tabuleiro do

Norte-Ce (Matos, 2002; Lorenzi & Matos, 2002). Apresenta folhas aromáticas e picantes,

opostas, simples e pecioladas; flores pequenas, esbranquiçadas, reunidas em espigas de eixo

curto nas axilas das folhas; e frutos extremamente pequenos e produzem sementes muito

pequenas que raramente germinam (Matos, 2002; Lorenzi & Matos, 2002) (Figura 2). Contém

até 6% de óleo essencial muito rico em timol (Matos et al., 2004). Após sua introdução nos

programas de fitoterapia em atenção primária de saúde, passou a ser cultivada em vários

estados do Brasil (Lorenzi & Matos, 2002; Matos et al., 2004). L. sidoides é conhecida

popularmente como alecrim-pimenta, alecrim-bravo, estrepa-cavalo e alecrim-grande e seu

uso popular é relatado para tratar infecções da boca e garganta, como espasmódico e

estomáquico (Matos, 2002; Lorenzi & Matos, 2002; Barraca, 2006). L. sidoides demonstrou in

vitro ser eficaz contra Clostridium perfrigens, Serraria sp., Staphylococcus aureus Salmonella

sp (Aguiar et al., 1984; Bara e Vanetti, 1998), Leishmania spp (Façanha et al., 1995), Aedes

aegypti (Furtado et al.2005). Girão et al. (2003) demonstraram que um creme dental

preparado com óleo essencial de L. sidoides reduziu significantemente os escores clínicos do

aspecto gengival quando aplicado em cães com gengivite.

Figura 2. Lippia sidoides (Fonte: Lorenzi &Matos, 2002.)

JUSTIFICATIVA

O desenvolvimento de populações de nematóides resistentes a todas as classes de

anti-helmínticos de amplo espectro é uma realidade disseminada em grande parte dos

rebanhos de pequenos ruminantes do Brasil e principalmente do Nordeste brasileiro. Os custos

da pesquisa e desenvolvimento de uma nova droga para ser usada em animais para o consumo

do homem é de aproximadamente 100 a 200 milhões de dólares e este trabalho leva pelo

menos 10 anos. Ademais é necessário tornar o controle de nematóides gastrintestinais menos

dispendioso de modo que esteja ao alcance de todos os pequenos produtores. Tendo em vista a

grande demanda atual do mercado consumidor cada vez mais exigente pelos chamados

produtos “orgânicos”, ou seja, produtos derivados de animais que não foram tratados com

produtos químicos sintéticos, a pesquisa de fitoterápicos com atividade anti-helmíntica a partir

da rica flora brasileira é uma alternativa viável e economicamente importante para solucionar

tais problemas.

HIPÓTESE CIENTÍFICA

Os óleos essenciais de L. sidoides e C. zehntneri possuem atividade contra

nematóides gastrintestinais de ovinos.

OBJETIVO GERAL

Aprimorar o controle de nematóides gastrintestinais de ovinos através da utilização

de fitoterápicos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar a composição química dos óleos essenciais de L. sidoides e C.

zehntneri;

2. Avaliar a eficácia dos óleos essenciais de L. sidoides e C. zehntneri e dos seus

principais constituintes, anetol e timol, contra ovos e larvas de H. contortus;

3. Avaliar a eficácia anti-helmíntica do óleo essencial que obtiver o melhor

resultado nos testes anteriores sobre nematóides gastrintestinais de ovinos.

MATERIAL E MÉTODOS

1. COLETA DA PLANTA

As partes aéreas de C. zehntneri foram coletadas em Viçosa, estado do Ceará,

Brasil, entre os meses de janeiro e março de 2004. As amostras de C. zehntneri foram

identificadas no herbário Prisco Bezerra onde um voucher espécie foi depositado com exsicata

de número 33614.

2. OBTENÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL

As partes aéreas de C. zehntneri foram colocadas em ambiente fresco e sob a

proteção dos raios solares, para secagem. Após secagem foi determinado o peso da planta

utilizada para posterior determinação do rendimento em óleo. Um vidro Marriot contendo as

folhas secas foi conectado na parte inferior a um erlemeyer e uma panela sob pressão,

permitindo a passagem do vapor de água através do material e, conseqüentemente, o arraste

do óleo junto com o vapor (Figura 3). Na parte superior, o vidro de Marriot foi conectado a

um condensador para separação da água e óleo. O óleo coletado foi colocado em erlemeyer

onde adicionou-se sulfato anidro até que ocorresse a separação da água restante. Finalmente, a

mistura foi colocada em funil de separação para coleta do óleo.

Figura 3: Extração de óleo essencial de Croton zehntneri

O cálculo do rendimento do óleo foi feito da seguinte forma:

Rendimento = ___Quantidade de óleo obtida na extração _____ x 100

Quantidade de planta pesada antes da extração

O óleo essencial de Lippia sidoides foi adquirido da empresa de produtos naturais,

PRONAT, que cultiva a planta e obtém o óleo essencial por arraste a vapor conforme

procedimento descrito acima.

3. ANÁLISE QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS

A composição química dos óleos essenciais usados neste estudo foi determinada

através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa no PADETEC da

Universidade Federal do Ceará. Os óleos essenciais foram analisados usando um instrumento

da Hewlett-Packard modelo 5971 GC/MS sob as seguintes condições: coluna capilar de sílica

fundida Dimethylpolysiloxane DB-1 (30 m x 0.25 mm); gás de arraste: He (1 mL/min);

temperatura do injetor: 250 °C; temperatura do detector: 200 °C; temperatura da coluna: 35-

180 °C a 4 °C/min e depois 180-25 °C at 10 °C/min; espectro de massa: por impacto

eletrônico a 70 e V. A identificação dos constituintes foi feita por procura em biblioteca de

espectros de massa do computador, tempos de retenção e comparação visual dos espectros de

massa obtidos com os publicados na literatura (Alencar, 1984; Adams, 1989).

4. PREPARAÇÃO DO MATERIAL PARA OS TESTES

Anetol e timol, os principais constituintes de C. zehntneri e L. sidoides,

respectivamente, foram adquiridos da empresa Sigma

. Duas soluções-mãe foram preparadas,

uma solução com 64% de anetol e outra solução com 60% de timol, diluídos em solução

fisiológica de cloreto de sódio a 0,9%.

Os óleos essenciais e as soluções-mãe foram diluídos em solução fisiológica de

cloreto de sódio a 0,9% e 0,5% de DMSO a fim de serem usados nos testes de eclosão de ovos

e de desenvolvimento larvar com concentrações finais equivalentes a 0,031; 0,062; 1,25; 2,5;

5; 10 e 20 µL mL

-1

Para os testes in vivo, os óleos essenciais foram diluídos em solução fisiológica de

cloreto de sódio a 0,9% e 0,5% de DMSO com o objetivo de obter soluções com

concentrações finais de 50 e 60% dos óleos essenciais para administração aos animais

conforme a dose e peso.

Nos testes in vitro foram testadas duas amostras de óleo essencial de Croton

zehntneri denominadas CC1 e CC12 por apresentaram diferentes concentrações de anetol na

análise química. Nos testes in vivo, foi usada somente a amostra CC12.

5. OVINOS PORTADORES E LIVRES DE INFECÇÕES MONOESPECÍFICAS POR

H. contortus

Todos os procedimentos realizados em animais foram submetidos e aprovados pelo

Conselho de Ética da Universidade Estadual do Ceará.

Dois ovinos foram tratados com três anti-helmínticos de diferentes princípios

ativos, oxfendazol, levamisol e ivermectina, com intervalos de dois dias entre as

vermifugações. O oxfendazol foi administrado na dose de 5 mg kg

-1

, correspondente ao dobro

da dose recomendada pelos fabricantes no Brasil, e o levamisol e ivermectina nas doses 5 mg

-1

e 200 µg kg

-1

, respectivamente, de acordo com as recomendações dos fabricantes. Estes

animais foram acompanhados com exames de fezes pela técnica de McMaster (Ueno &

Gonçalves, 1998) durante 14 dias até que o número de ovos eliminados nas fezes fosse zero.

Caso o OPG continuasse positivo, o tratamento era repetido. Os animais foram mantidos em

gaiolas metabólicas alimentados com feno e ração. Estes animais considerados livres de

nematóides gastrintestinais foram assim mantidos como doadores de fezes para os testes in

vitro de desenvolvimento larvar, respeitando o período residual de ação dos produtos usados.

Os ovinos foram inoculados com 5.000 larvas infectantes obtidas de coproculturas

com predominância do nematóide H. contortus. O estabelecimento da infecção foi

acompanhado por exame de fezes semanal. Após 45 dias, os animais foram necropsiados e as

fêmeas de H. contortus foram coletadas do abomaso. As fêmeas foram então finamente

maceradas a fim de liberar os ovos do útero. Em seguida, adicionaram-se fezes dos animais

livres de nematóides gastrintestinais que serviram de meio para desenvolvimento das larvas.

Após sete dias de incubação as larvas foram recuperadas (Roberts & O’Sullivan, 1950) e as

L3 de H. contortus obtidas foram administradas em dois ovinos para o estabelecimento de

infecção monoespecífica por H. contortus. Da mesma forma que os animais livres de

nematóides, estes dois ovinos foram mantidos em gaiolas metabólicas. A partir das fezes

destes animais foram obtidos ovos de H. contortus para os testes in vitro.

6. TESTES in vitro

6.1 TESTE DE ECLOSÃO DE OVOS

Para realização do teste de eclosão de ovos, foi realizada a recuperação de ovos de

H. contortus de acordo com técnica de Hubert & Kerboeuf (1992). Fezes coletadas de ovinos

portadores de infecção monoespecífica de H. contortus foram lavadas sob água corrente e

pressão em tamis com espaçamento entre malhas de 0,150 mm, 0,100 mm, 0,036 mm e 0,020

mm. Os ovos ficaram retidos no último tamis foram acondicionados em tubos tipo Falcon e

levados a centrifugação por 7000 rpm durante 10 minutos. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi descartado completando-se com solução saturada de açúcar, e uma nova

centrifugação foi realizada. Após a segunda centrifugação, o material foi passado para o tamis

com espaçamento entre malhas de 0,020 mm para retirada dos resíduos de açúcar. Em

seguida, a solução contendo os ovos foi colocada em cálice graduado para estimativa de

número de ovos por mL de solução.

O teste de eclosão de ovos foi realizado conforme descrito por Coles et al. (1992).

Resumidamente, uma suspensão de 250 µL contendo aproximadamente 100 ovos frescos,

recuperados de fezes dos ovinos portadores de infecção monoespecífica de H. contortus, foi

distribuída em tubos de vidro e incubados com o mesmo volume das soluções contendo os

óleos essenciais, anetol e timol em diferentes concentrações. Neste teste foram usadas as

seguintes concentrações dos óleos essenciais de L. sidoides e C. zehntneri e seus principais

constituintes, anetol e timol: 0,031; 0,062; 1,25; 2,5 e 5 mg mL

-1

. Os ovos foram incubados

por 48 horas a temperatura ambiente. Após este período, uma gota de lugol foi adicionada a

cada tubo com o objetivo de parar a eclosão das larvas. Todos os ovos e larvas eclodidas

foram contados ao microscópio. Este teste foi realizado com um controle negativo utilizando

água destilada e o controle positivo com tiabendazol (0,02 mg mL

-1

). O teste de eclosão de

ovos foi realizado com três repetições contendo cinco réplicas para cada tratamento e controle.

Somente água foi utilizada no controle negativo, pois o diluente DMSO na concentração

utilizada não possui efeito sobre ovos ou larvas (Assis et al., 2003).

6.2. TESTE DE DESENVOLVIMENTO LARVAR

O teste de desenvolvimento larvar foi realizado conforme método descrito por

Roberts & O’Sullivan (1950) modificado. Foram coletadas 2g de fezes de ovino livre de

infecção por nematóide gastrintestinal e dispostas em copos de vidro. Em seguida, adicionou-

se uma suspensão contendo aproximadamente 100 a 200 L1 recuperadas de fezes de ovino

portador de infecção monoespecífica de H. contortus. Esta coprocultura foi incubada durante

seis dias com diferentes concentrações dos óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides,

anetol e timol em uma incubadora a uma temperatura de 28 °C. Neste teste foram usadas as

seguintes concentrações dos óleos essenciais de L. sidoides e C. zehntneri, anetol e timol:

1,25; 2,5; 5; 10 e 20 mg mL

-1

Após seis dias, os copos foram preenchidos por água e virados

sobre placa de Petri. Três horas após a água na placa de Petri foi coletada, e após deixar em

repouso, o sobrenadante foi descartado e o restante que ficou no tubo foi analisado. Este teste

foi realizado com o controle negativo utilizando água destilada e o controle positivo com

ivermectina na concentração de 0,008 µg mL

-1

, com três repetições e cinco réplicas por

tratamento.

7. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA EM CAMUNDONGOS

Foram utilizadas 64 fêmeas de camundongos albinos Swiss alojadas em caixas

padrões de polipropileno (40 x 34 x 17 cm

) mantidas em sala com ventilação natural. A

troca da raspa das caixas foi suspensa com objetivo de contribuir com o desenvolvimento da

infecção por nematóides intestinais. Os animais recebiam ração e água ad libitum.

Semanalmente, fezes foram coletadas das caixas para realização de exame pelo

método de Willis (Ueno & Gonçalves, 1998) para determinação do estabelecimento da

infecção por S. obvelata e A. tetraptera.

Inicialmente, foi realizado um experimento com 32 camundongos que foram

distribuídos em quatro grupos (n = 8), ao acaso, e receberam os seguintes tratamentos:

Grupo 1: apenas água (controle negativo);

Grupo 2: 0,56 mg kg

-1

de febendazol;

Grupo 3: 800 mg kg

-1

do óleo essencial de L. sidoides

Grupo 4: 800 mg kg

-1

do óleo essencial de C. zehntneri.

O tratamento foi realizado através de gavagem por cânula esofageana. Os

camundongos dos grupos 1, 3 e 4 foram tratados durante três dias, e os do grupo 2 foram

tratados durante cinco dias conforme recomendações do fabricante.

De acordo com os resultados obtidos, foi realizado outro experimento para testar

doses maiores do óleo essencial que apresentou melhor eficácia no teste com camundongos.

Portanto, o mesmo protocolo foi usado em 32 camundongos com o objetivo de testar duas

concentrações diferentes do óleo essencial de L. sidoides, no segundo experimento. Os

animais receberam os seguintes tratamentos:

Grupo 1: apenas água (controle negativo);

Grupo 2: 0,56 mg kg

-1

de febendazol;

Grupo 3: 1200 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides;

Grupo 4: 1600 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides.

A dosificação dos animais foi feita por via oral de acordo com o peso vivo

individual, e as doses foram calculadas com base em estudo anterior realizado em

camundongos, e a extrapolação de dose foi feita através de cálculo alométrico (Felippe, 2005).

Assim sendo, para determinação da dose a ser usada nos ovinos foram realizados três cálculos:

a) cálculo da taxa metabólica específica do camundongo e do ovino (TME = K (Peso

0,25

), onde K é uma constante específica para diferentes grupos de animais, e no caso de

mamíferos placentários K = 70.

b) cálculo do fator dose do camundongo (dose usada no camundongo/TME do

camundongo)

c) cálculo da dose para ovino (TME do ovino x fator dose do camundongo).

As doses de 1200 mg kg

-1

e 1600 mg kg

-1

de peso vivo de óleo essencial de L.

sidoides usadas em camundongos foram transformadas através do cálculo alométrico em 230

e 283 mg kg

-1

de peso vivo de óleo essencial de L. sidoides para serem usadas em ovinos. Os

ovinos receberam quatro tratamentos distintos conforme descrito abaixo:

Grupo 1: sem tratamento (controle negativo);

Grupo 2: ivermectina na dose de 0,08 µg kg

-1

de peso vivo, acordo com a

recomendação do fabricante (controle positivo)

Grupo 3: 230 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides;

Grupo 4: 283 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides.

Amostras de fezes de cada ovino foram coletadas diretamente do reto antes dos

tratamentos e nos dias 7, 14 e 21 pós-tratamento para contagem do OPG pela técnica de

McMaster (Ueno & Gonçalves, 1998). Nas mesmas datas, foram feitas coproculturas para

identificação genérica dos nematóides gastrintestinais.

8.2. TESTE CONTROLADO

Este experimento foi realizado na mesma fazenda Santa Rita, de propriedade da

EMBRAPA/CAPRINOS no mês de fevereiro de 2006. Neste período, a pluviosidade total na

cidade de Sobral foi de 198 mm e os ovinos deslanados machos foram alojados em piquetes

com capim irrigado.

Participaram do experimento 21 ovinos machos deslanados com peso médio de

25,2 kg e naturalmente infectados por nematóides gastrintestinais. Os ovinos foram

distribuídos em três grupos de acordo com o OPG com objetivo de obter grupos uniformes, e

identificados por brinco na orelha e diferentes grupos receberam colares de diferentes cores

para diferenciar os grupos de tratamentos. Os ovinos foram distribuídos nos seguintes grupos

(n = 7):

G1: não tratados (controle negativo);

G2: 200 µg kg

-1

de ivermectina;

G3: 283 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides.

O tratamento com óleo essencial foi realizado por administração oral durante cinco

dias consecutivos, e os animais do controle positivo foram tratados com ivermectina em dose

única conforme recomendação do fabricante.

Sete dias após tratamento (Wood et al., 1995), todos os ovinos foram eutanasiados

e submetidos à necropsia para determinação da carga parasitária. Os tratos gastrintestinais dos

ovinos foram separados por ligaduras duplas no abomaso, intestino delgado e intestino grosso.

O conteúdo do abomaso e do intestino delgado foram coletados e colocados em peneiras com

aberturas entre malhas de 67 mm (230 malhas/polegada) e o intestino grosso em peneiras com

177 mm de abertura (80 malhas/polegada) e lavados em jato lento de água corrente. Após a

completa lavagem, o material foi colocado em recipientes graduados de 250 mL e

conservados em líquido de Railliet até a contagem dos parasitos. Amostras de 20% dos

conteúdos foram separadas e colocadas em placas de Petri sob estereomicroscópio para

separação, contagem e identificação dos parasitos de acordo com as características

morfológicas (Ueno e Gonçalves, 1998). Quando necessário, os parasitos eram colocados em

lâminas com uma gota de lactofenol para clareamento e identificação no microscópio. Os

parasitos foram separados por sexo e gênero e foram estocados em recipiente de vidro com

álcool a 70%.

9. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Nos testes in vitro, os resultados foram expressos como percentagem de eficácia

da inibição da eclosão de ovos e do desenvolvimento larvar de H. contortus. Os resultados

foram analisados usando ANOVA e teste de Tukey com nível de significância de 5%

usando o software STATISTIC 7.

No teste de eclosão de ovos, a eficácia de cada tratamento foi determinada com

base no percentual de eclosão calculado usando-se a seguinte fórmula: (nº de larvas

eclodidas/ nº de larvas eclodidas + nº de ovos) x 100.

No teste de desenvolvimento larvar, a eficácia foi calculada com base no

percentual de redução no número de L3 recuperadas em relação ao controle negativo.

A concentração efetiva 50 (CE50), ou seja, a concentração capaz de inibir 50%

da eclosão de ovos ou do desenvolvimento larvar foi calculada usando o programa

estatístico SPSS 8.0 para Windows.

Nos testes de contagem de ovos nas fezes e controlado em ovinos, assim como

no teste com camundongos, a eficácia de cada tratamento foi baseada na percentagem de

redução do OPG ou da carga parasitária (Coles et al., 1992; Wood et al., 1995). Os

resultados foram analisados usando ANOVA e Kruskall-Wallis, um método não-

paramétrico de avaliação de dados.

RESULTADOS

Os principais constituintes dos óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides estão

apresentados na tabela 1. As diferentes amostras do óleo essencial de C. zehntneri, CC1 e

CC12, apresentaram variações nas concentrações de anetol e estragol.

Tabela 1. Composição química dos óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides.

Croton. zehntneri

(amostra CC1)

Croton zehntneri

(amostra CC12) Lippia sidoides

Composto % Composto % Composto %

Anetol 39,34 Anetol 63,88

α-tujeno

1,48

Estragol 14,95 Estragol 21,84

α-pineno

0,51

Anisaldeído 20,17 δ-elemeno 0,35 Mirceno 5,43

Anisil acetato 14,47

β-elemeno

0,38

α-terpineno

1,43

Cariofileno (E) 0,39 Germacrene D 1,53 Cymeno para 9,08

Aromadendreno 0,43 Germacrene B 5,07 Limoneno 1,01

p-metoxiacetofenono 0,57

α-cis-bergamopteno

0,33

β-ocimeno

0,27

2-metoxiacetofenono 0,31 Aromadendreno allo

0,31

γ-terpineno

3,83

Ledol 0,26 Cariofileno (E) 1,77 Linalool 0,28

Espatulenol 0,24 Espatulenol 1,02 Tymol, metil eter 1,79

Farnesol trans 0,23 Myrceno 0,84 Timol 59,65

Cineol 0,58 Cineol 0,52

α-Copaeno

0,66

Cânfora 0,25 n.i. 2,16 Cariofilleno (E) 10,60

α-Terpineol

0,24 Aromadendreno 0,53

n.i. 7,57

α-Humuleno

0,56

Dihydroaromadendreno 0,91

α-Murolene

0,45

δ-Cadinene 0,35

Caryofillene oxide 0,72

n.i. 0,46

n.i. = não identificado; C. zehntneri CC1 e C. zehntneri CC12: amostras coletadas em diferentes períodos.

A extração de óleo das partes aéreas de C. zehntneri apresentou um rendimento de

3,15%.

A percentagem média de eficácia nos testes de eclosão de ovos e de

desenvolvimento larvar, usando diferentes concentrações dos óleos essenciais de C. zehntneri

e L. sidoides, anetol e timol estão dispostos na tabela 2 e 3. O efeito inibitório do óleo

essencial de L. sidoides na eclosão de ovos na concentração de 0,62 mg mL

-1

foi de 94,84 ±

2.3, similar ao tiabendazol (0,02 mg mL

-1

). Entretanto, a atividade ovicida das amostras de C.

zehntneri (CC1 e CC12) e o anetol foram de 58%, 12,2% e 26,6% na mesma concentração.

Tabela 2. Percentagem média de eficácia ± ep dos óleos essenciais de C. zehntneri (amostras

CC1 e CC12) e L. sidoides, anetol, timol, e tiabendazol sobre a eclosão de ovos de H. contortus

Óleos essenciais e seus constituintes

C. zehntneri

Concentração

(mg mL

-1

)

CC1 CC12

L. sidoides

Anetol

Timol

0.31

6,8 ± 0,7aA 9,2 ± 0,7aAB 18,8 ± 2,1cB 6,7 ± 0,5aA 9,9 ± 1,4aAB

0.62

58,0 ± 2,1cC

12,2 ± 0,6aB 94,9 ± 0,6bA 26,6 ± 4,9cB 93,6 ± 0,9cA

1.25

99,9 ± 0,1bA

99,9 ± 0,1bA 100 ± 0,0bA 99,9 ± 0,1bA 98,2 ± 0,9bA

2.5

99,9 ± 0,1bA

100 ± 0,0bA 100 ± 0,0bA 99,9 ± 0,1bA 99,9 ± 0,1bA

5.0

100 ± 0,0bA

100 ± 0,0bA 100 ± 0,0bA 100 ± 0,0bA 99,8 ± 0,2bA

Água

2,48 ± 0,6a 2,48 ± 0,6a 2,48 ± 0,6a 2,48 ± 0,6a 2,48 ± 0,6a

TBZ (0,02)

99,5 ± 0,3b 99,5 ± 0,3b 99,5 ± 0,3b 99,5 ± 0,3b 99,5 ± 0,3b

Letras minúsculas indicam resultados diferentes na mesma coluna e letras maiúsculas indicam

resultados diferentes na mesma linha (P > 0,05).

Tabela 3. Percentagem média de eficácia ± ep dos óleos essenciais de C. zehntneri (amostras CC1

e CC12) e L. sidoides, de seus principais constituintes, anetol e timol, e ivermectina (IVM) sobre

o desenvolvimento de larvas de H. contortus.

Óleos essenciais e seus constituintes

C. zehntneri

Concentração

(mg mL

-1

)

CC1 CC12

L. sidoides

Anetol

Timol

1,25

69,6 ± 6,4Ab

55,8 ± 8,3Ab 24,9 ± 14,7Aa 35,8 ± 9,5Aa 33,0 ± 7,7Aa

2,5

72,9 ± 7,9Ab

73,3 ± 10,3Ab 40,5 ± 11,6Aa 52,1 ± 7,8Aa 54,8 ± 12,3BAb

5,0

86,2 ± 3,4Ab

81,5 ± 5,1Ab 64,1 ± 16,5Ab 87,7 ± 2,6Ab 73,9 ± 9,0Ab

10,0

92,1 ± 2,8Ab

99,2 ± 0,5Ab 90,2 ± 3,4Ab 96,7 ± 1,1Ab 99,2 ± 0,5Ab

20,0

96,2 ± 1,8Ab

98,6 ± 0,8Ab 94,5 ± 3,1Ab 100 ± 0,0Ab 99,7 ± 0,2Ab

Água

0,0 ± 15,4a 0,0 ± 15,4a 0,0 ± 15,4a 0,0 ± 15,4a 0,0 ± 15,4a

IVM (8,10

-5

)

95,2 ± 1,4b 95,2 ±3,1b 95,2 ±3,1b 95,2 ±3,1b 95,2 ±3,1b

Letras maiúsculas comparam resultados na mesma linha e letras minúsculas comparam resultados na

mesma coluna.

Não ocorreram diferenças estatísticas nas diferentes concentrações entre os

tratamentos no teste de inibição do desenvolvimento larvar. O óleo essencial de C. zehntneri

foi eficiente na inibição de desenvolvimento larvar em menores concentrações que o óleo

essencial de L. sidoides, e as concentrações efetivas 50 (CE50) de CC1 e CC12 foram

memores do que a CE50 do óleo essencial de L. sidoides.

No teste de eclosão de ovos, a atividade dos óleos essenciais de C. zehntneri e L.

sidoides foram estatisticamente semelhantes em todas as concentrações, entretanto a CE50 do

óleo essencial de L. sidoides foi 0,40 µL mL

-1

enquanto a CE50 da amostra CC1 foi 0,55 µL

-1

e a da amostra CC12 foi 0,74 µL mL

-1

(tabela 4).

Tabela 4. Concentração efetiva 50 (CE50) dos óleos essenciais de Croton zehntneri (CC1 e

CC12) e Lippia sidoides, e do anetol e timol sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento

larvar de H. contortus.

Tratamentos

CE 50 ovicida

(mg mL

-1

)

CE50 larvicida

(mg mL

-1

)

Óleo essencial de C. zehntneri (CC1) 0,55 1,17

Óleo essencial de C. zehntneri (CC12) 0,74 1,37

Óleo essencial de L. sidoides 0,40 2,97

Anetol 0,69 2,11

Timol 0,55 2,49

Os parasitos identificados nos camundongos foram A. tetraptera e S. obvelata

(figuras 2 e 3).

A eficácia de 800 mg kg

-1

de óleo essencial de L. sidoides e C. zehntneri contra A.

tetraptera e S. obvelata foi de 46,29% e 11,64%, respectivamente, enquanto a eficácia do

fenbendazol foi de 99,37%± 0,41. As doses de 1200 e 1600 mg kg

-1

do óleo essencial de L.

sidoides obtiveram eficácia de 57,62 e 68,94% na redução da carga parasitária,

respectivamente.

Figura 4. Syphacia obvelata, nematóide recuperado de camundongos no teste de eficácia

com os óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides. A: extremidade anterior; B: parte

central rompida com liberação de ovos; C: extremidade posterior (Aumento de 10x).

Figura 5. Aspiculuris tetraptera, nematóide recuperado de camundongos no teste de

eficácia com os óleos essenciais de C. zehntneri e L. sidoides. A: extremidade anterior;

B: parte central de fêmea com ovos; C: extremidade posterior (Aumento de 10x).

A eficácia de 230 e 283 mg kg

-1

do óleo essencial de L. sidoides medida através do

testes de redução da contagem de ovos nas fezes variou de 38% para 30% e de 45% para 54%

com 7 e 14 dias pós-tratamento, respectivamente. A eficácia da ivermectina na dose de 0,2 µg

-1

variou de 40,2% a 39,6% após 7 e 14 dias do tratamento (tabela 6).

Tabela 6. Percentagem média de eficácia ± ep de óleo essencial de L. sidoides (OELs) e

ivermectina (IVM) baseada na redução da contagem de ovos nas fezes dos ovinos.

Tratamentos

Dias após

tratamento

230 mg kg

-1

de OELs 283 mg kg

-1

de OELs

200 µg kg

-1

de IVM

38,0 ± 10,7 45,9 ± 10,2 40,2 ± 10,9

30,0 ± 11,0 54,0 ± 10,5 39,6 ± 11,9

29,8 ± 10,8 22,9 ± 7,9 27,5 ± 11,3

Os resultados não diferiram estatisticamente entre si (P> 0,05).

Os resultados das coproculturas estão dispostos na tabela 7. O nematóide mais

prevalente foi Haemonchus spp representando mais de 90% das larvas identificadas.

Tabela 7. Gêneros de nematóides gastrintestisnais identificados em coprocultura de ovinos

naturalmente infectados antes do teste de redução da contagem de ovos nas fezes

Tratamento

Nematóides

230 mg kg

-1

OELs

283 mg kg

-1

OELs

200 µg kg

-1

IVM

Controle

Haemonchus spp 96% 95,7% 98% 96,7%

Trichostrongylus spp 4% 4,3% 2% 3,3%

IVM = ivermectina; controle = ovinos não tratados.

Na tabela 8, estão apresentadas as percentagens de eficácia do óleo essencial de L.

sidoides e ivermectina e a percentagem de parasitos identificados no grupo não-tratado no

teste controlado. Os ovinos tratados com 283 mg kg

-1

do óleo essencial de L. sidoides

apresentaram 56,9% de redução de Haemonchus spp e a ivermectina reduziu 34,4%.

Entretanto, estes resultados quando analisados não foram estatisticamente diferentes. Com

relação a Trichostrongylus spp, ovinos tratados com o óleo essencial de L. sidoides tiveram

uma redução da carga parasitária de 39,3% e a eficácia da ivermectina foi de 63,6%.

Tabela 8. Percentagem média da eficácia ± ep de óleo essencial de L. sidoides (OELs) e

ivermectina (IVM) e percentagem média de parasitos no grupo controle negativo no teste

controlado com ovinos.

Nematóides 283 mg kg

-1

OELs

200 µg kg

-1

IVM

Controle

Haemonchus spp

56,9 ± 10,7 34,4 ± 10,3

16,930 (37,9%)

Trichostrongylus spp

39,3 ± 11,7 63,6 ± 10,2

27,715 (62,1%)

Total

43,7 ± 11,8 50,3 ± 8,7

44,645 (100%)

Os resultados não diferiram estatisticamente entre si (P > 0,05).

Haemonchus spp foi o parasito mais prevalente (97%) seguido de Trichostrongylus

spp (3%) no teste de redução da contagem de ovos nas fezes, enquanto no teste controlado nos

animais não tratados o gênero Haemonchus representou 37,9% e Trichostrongylus 62,1% da

carga parasitária dos animais.

DISCUSSÃO

A composição do óleo essencial de C. zehntneri usado neste estudo foi diferente

daquela apresentada por Luciano & Morais (2000). As partes aéreas de C. zehntneri foram

coletadas na mesma região, porém em diferentes épocas do ano. Sousa et al. (2005) e Siqueira

et al. (2006) avaliaram diferentes amostras do óleo essencial de C. zehntneri de partes aéreas

coletadas na mesma região do presente trabalho, e as amostras apresentaram 73,6% e 42,09%

de anetol; e 2,52% e 45,95% de estragol, respectivamente.

O efeito inibitório da solução de anetol e das amostras CC1 e CC12 do óleo

essencial de C. zehntneri sobre a eclosão de ovos de H. contortus foram estatisticamente

similares em todas as concentrações testadas, exceto na concentração de 0,62 mg mL

-1

na qual

a amostra CC1 apresentou melhor eficácia. A amostra CC1 apresentou 39,35% de anetol

comparado a 63,88% da amostra CC12 e a solução de anetol, 64%. Logo, o anetol

provavelmente não é a única substância com atividade ovicida no óleo essencial de C.

zehntneri.

Em outros relatos, o óleo essencial de C. zehntneri exerceu efeitos modulatórios

diferenciados em vários músculos de porquinho da Índia (Coelho-de-Sousa et al., 1998).

Albuquerque et al. (1995) relataram que o óleo essencial de C. zehntneri e o anetol

bloquearam contrações musculares provocadas por estimulações nervosas e reduziram a

resposta do músculo reto de sapos à acetilcolina. De acordo com estas informações, o óleo

essencial de C. zehntneri e o anetol podem ter locais de ação na fibra muscular, e isto pode

explicar suas propriedades anti-helmínticas, uma vez que vários anti-helmínticos têm local de

ação nas fibras musculares. Estudos são necessários para determinar o mecanismo de ação

ovicida e larvicida do óleo essencial de L. sidoides e timol.

Os resultados do teste de desenvolvimento larvar apresentaram uma grande

variabilidade e os efeitos dos óleos essenciais, anetol e timol, não apresentaram diferenças

estatísticas entre si ou entre as concentrações testadas. Contudo, este teste foi usado com

sucesso para demonstrar a atividade larvicida de extratos de plantas (Assis et al., 2003; Costa,

2004; Maciel et al., 2006). Na tabela 3, o desvio padrão obtido é muito maior nas menores

concentrações, 1,25 e 2,5 mg mL

-1

. Como no teste in vitro o efeito depende do contato direto

da substância com a larva, é possível que menores quantidades dos produtos testados não

tenham tido um contato uniforme com as larvas em desenvolvimento.

O timol, principal constituinte do óleo essencial de L. sidoides, apresentou

atividade ovicida e larvicida contra H. contortus e é a provável substância ativa. Carvalho et

al. (2003) relataram atividade larvicida do óleo essencial de L. sidoides e apontaram o timol

como substância ativa.

Outras plantas testadas quanto à atividade larvicida, D. grandiflora e C.

brasiliensis produziram eficácia de 87,4 e 95,7% na dose de 30 mg por grama de fezes

(Menezes et al., 1992). O extrato acetato de etila de S. anthelmia na concentração de 50 mg

-1

inibiu 81% do desenvolvimento larvar de H. contortus (Assis et al., 2003). Os resultados

obtidos nos testes in vitro do presente estudo foram melhores do que aqueles utilizando outras

plantas ou extratos em maiores concentrações.

Testes com animais de laboratório têm sido usados na triagem para validar

atividades medicinais de plantas. Os testes in vitro são úteis na triagem de substâncias com

atividade anti-helmíntica e precedem os testes in vivo com as espécies alvo da indicação

clínica (Camurça-Vasconcelos et al., 2005). O próximo passo para avaliação da atividade anti-

helmíntica é a realização de testes toxicológicos que definem a DL50 em animais de

laboratório. Fontenelle (2005) avaliou a toxicidade aguda dos óleos essenciais de C. zehntneri

e L. sidoides, e estes óleos não apresentaram efeitos tóxicos na dose de até 3 g kg

-1

Em camundongos, os efeitos dos ensaios anti-helmínticos foram dose-dependente e

o melhor resultado obtido foi uma redução de quase 70% na carga parasitária dos animais.

Estudos realizados em camundongos naturalmente infectados com S. obvelata e A. tetraptera,

nematóides parasitos do intestino grosso e H. polygyrus, parasito do intestino delgado

obtiveram eficácia de 50% para T. fasciculatus e não houve eficácia para A. anthelmintica

(Amorim et al.,1987; Githiori et al., 2003).

O teste de redução na contagem de ovos nas fezes de ovinos infectados com H.

contortus foi utilizado para avaliar a atividade anti-helmítica de extratos de plantas como A.

anthelmintica (Githiori et al., 2003), A. brevifolia (Iqbal et al., 2004), M. africana, A.

anthelmintica, H. sepalosa (Gathuma et al., 2004) e K. senegalensis (Ademola et al., 2004)

que apresentaram redução de OPG de 70%, 67,2%, de 77%, 89,8%, 90% e 88%

respectivamente, todos superiores aos obtidos com o óleo essencial de L. sidoides. No entanto

no presente trabalho, a redução do opg promovido pela ação da ivermectina foi de apenas

39,6%. De acordo com Coles et al. (1992), a resistência está presente se a percentagem de

redução da contagem de ovos for menor que 95%. Logo, a população de nematóides dos

ovinos utilizados no FECRT é resistente à ivermectina, um fato comum no Brasil (Padilha et

al., 1995; Vieira & Cavalcante, 1999; Melo et al., 2003). A utilização do óleo essencial de L.

sidoides seria justificada mesmo com eficácia inferior a 95%, em situações onde os fármacos

sintéticos não fossem recomendados como em criações orgânicas, animais em fase de

produção leiteira, ou quando o custo fosse compensatório.

Neste estudo, ocorreu uma grande variação entre as contagens de ovos nas fezes de

ovinos que foi consistente com os resultados obtidos por Stear et al. (2006), reforçando a

sugestão de Coles et al. (1992) de que o teste controlado deve ser realizado para confirmação

de dose na espécie alvo.

Existem poucos estudos com plantas medicinais e suas propriedades anti-

helmínticas envolvendo o teste controlado, porque este é um teste oneroso e indicado para uso

nos estágios finais de triagens com plantas que tenham demonstrado efeitos em estudos

preliminares como estudos in vitro, toxicológicos e com animais de laboratório (Camurça-

Vasconcelos et al., 2005). Nove plantas nativas do Ceará (Allium sativum L., Carica papaya,

Musa acuminata, Carnavalia brasiliensis, Momordica charanthia, Anona squamosa, Menta

sp., Chenopodium ambrosioides e Hymenaea courbaril), o óleo essencial de C. ambrosioides

e A. indica foram testadas em ovinos portadores de infecções naturais por nematóides

gastrintestinais sem alcançar eficácia na redução da carga parasitária (Vieira et al.,1999;

Ketzis et al., 2002; Costa et al., 2006).

A eficácia obtida em camundongos, aproximadamente 70% e o baixo custo do óleo

essencial de L. sidoides incentivaram os testes em ovinos. Porém, o modelo de avaliação de

atividade anti-helmíntica de plantas utilizando camundongos apresenta a desvantagem de que

os nematóides dos camundongos têm como habitat o intestino grosso diferindo do alvo a ser

atingido, nematóides do trato gastrintestinal de pequenos ruminantes. A relação localização do

parasito e local de absorção do anti-helmíntico determina a maior ou menor eficácia do

fármaco (Hennessy, 1999). Outra hipótese para explicar as diferenças na eficácia obtida sobre

nematóides de camundongos e ovinos é a possibilidade do mecanismo de distribuição e

biotransformação deste óleo ser diferente nas duas espécies principalmente em se tratando da

comparação entre monogástricos e poligástricos. Entretanto, o teste de eficácia contra

nematóides de camundongos auxilia na extrapolação de doses a serem usadas em ovinos e

caprinos.

A pesquisa científica com plantas envolve várias etapas desde a seleção até a

obtenção do produto final para o consumidor, estima-se que somente 5 entre 10.000 produtos

venham a ter sua atividade comprovada e cheguem ao consumidor (Rates, 2001). Portanto, a

busca por novas alternativas nem sempre é rápida e não deve ser desmotivada.

CONCLUSÕES

O desempenho do óleo essencial de L. sidoides foi superior ao de C. zehntneri

nos testes in vitro sobre ovos e larvas de H. contortus e in vivo sobre nematóides intestinais de

camundongos.

A eficácia do óleo essencial de L. sidoides obtida sobre H. contortus parasito

gastrintestinal de ovinos foi de 56,9%, inferior àquela recomendada para anti-helmínticos

comerciais, 95%. Entretanto, a população de nematóides em ovinos, neste estudo, demonstrou

ser resistente à ivermectina. Assim sendo o uso alternativo de plantas pode ser uma ferramenta

que aliada a outros métodos permita o controle eficiente de nematóides gastrintestinais de

pequenos ruminantes.

PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos neste estudo indicam dois caminhos: o primeiro é a

pesquisa envolvendo absorção e distribuição do óleo essencial de L. sidoides em pequenos

ruminantes para verificar a possibilidade de outras formulações que possam melhorar a

atividade deste óleo, e a segunda opção seria modificar a forma de administração e dosagem.

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WALLER, P. J., DASH, K. M., BARGER, I. A., LE JAMBRE, L. F., PLANT, J.

Anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep: learning from the Australian

experience. Veterinary Record, v. 136, p. 411-413, 1995.

WHO. Traditional medicine. Fact sheet nº 134, May 2003 acesso internet <

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/print.html> acesso em 21/10/2006.

WOOD, I. B., AMARAL, N. K., BAIRDEN, K., DUNCAN, J. L., KASSAI, T., MALONE, J.

B., JR., PANKAVICH, J. A., REINECKE, R. K., SLOCOMBE, O., TAYLOR, S. M.,

VERCRUYSSE, J. World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology

(W.A.A.V.P.) second edition of guidelines for evaluating the efficacy of anthelmintics in

ruminants (bovine, ovine, caprine). Veterinary Parasitology, v. 58, p. 181-213, 1995.

ANEXOS

ANEXO I

Anexo I. Artigo intitulado “Validação de plantas medicinais” publicado na Revista

Brasileira de Plantas Medicinais”

ANEXO II

Anexo II. Artigo submetido ao periódico Veterinary Parasitology intitulado

“Anthelmintic activity of Croton zehntneri and Lippia sidoides essential oils”

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