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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE
Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM
ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Ana Karinne Paiva Vasconcelos
Fortaleza – Ceará
Dezembro, 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Ana Karinne Paiva Vasconcelos
AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE
Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM
ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Fortaleza – Ceará
Dezembro, 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
Ana Karinne Paiva Vasconcelos
AÇÃO BIOLÓGICA DOS EXTRATOS HEXÂNICO E ETANÓLICO DAS FOLHAS DE
Momordica charantia L. SOBRE A RESPOSTA IMUNE E A CICATRIZAÇÃO EM
ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Ciências Veterinárias –
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias.
Área: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa
Nunes Pinheiro.
Fortaleza – Ceará
Dezembro, 2006
4
Universidade Estadual do Ceará
Curso de Pós-Gradução em Ciências Veterinárias
Título do Trabalho: Ação biológica dos extratos hexânico e etanólico das folhas de
Momordica charantia L. sobre a resposta imune e a cicatrização em animais de
experimentação
Autora: Ana Karinne Paiva Vasconcelos
Defesa em: 21/12/2006 Conceito obtido: SATISFATÓRIO
Banca Examinadora
__________________________________________
Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro
Orientadora
________________________________ __________________________________
Profª. Drª. Adriana da Rocha Tomé Profª. Drª. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos
Membro da banca examinadora Membro da banca examinadora
____________________________
Profª. Drª. Erika Freitas Mota
Membro da banca examinadora
5
DEDICATÓRIA
Não apenas essa dissertação de
mestrado, mas todas as minhas
conquistas profissionais são dedicadas a
minha família, que em nenhum momento
deixou de me apoiar e ao meu namorado,
Robson Mendes.
6
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora, Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro pela
compreensão e valiosa orientação, para mim um exemplo diário de disciplina. A quem devo
os meus primeiros passos na área científica
7
À todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias pelos
conhecimentos transmitidos, seja através das aulas, seminários e esclarecimentos
informais.
Às “meninas da secretaria“, Adriana Maria Sales Albuquerque e Ana Cristina Sabóia,
pela inestimável ajuda e agradável convivência.
À Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP), por ter confiado
plenamente na realização do projeto e concedido apoio financeiro durante o mestrado para
que fosse possível a execução do mesmo.
Agradeço às minhas amigas da iniciação científica, Juliana Furtado Lima Verde e
Renata Sá de Castro Pires por sempre me ajudarem e por me proporcionarem bons
momentos nesse período em que convivemos.
Agradeço à minha companheira de pós-graduação, Bárbara Sucupira Pereira, pelo
apoio, amizade e por tudo o que passamos juntas.
Aos Biotérios da UFC e da UECE, pelo fornecimento dos animais de experimentação
e de ração para manutenção dos mesmos.
Ao seu José Lino e ao José Gomes Xavier por terem me auxiliado na manutenção
dos animais de experimentação.
À Deus por mais esta oportunidade de trabalho, pela qual me permitiu exercitar e
aprimorar minha paciência, tolerância e autoconfiança. Obrigado senhor, por tudo e por
todos em minha vida.
8
RESUMO
No presente estudo, objetivou-se avaliar a ação do extrato hexânico (EH) e etanólico
(EE) das folhas de Momordica charantia sobre a resposta imune de animais de
experimentação. Para tanto, os extratos foram preparados, avaliados quanto a presença de
fitoquímicos e quanto a sua atividade antioxidante. Em seguida, foram realizados protocolos
experimentais para investigar os efeitos do EH e do EE sobre a produção de anticorpos
específicos induzidos pela imunização de camundongos com hemácia de carneiro (HC) e
ovalbumina (OVA), no D0, sendo dado um reforço no D7 para os animais sensibilizados com
HC e no D14 e D35 após imunização com OVA. Os grupos receberam tratamento prévio por
5 dias, via i.p. Os tratamentos consistiram de um grupo controle que recebeu salina a 0,9%
e dos grupos testes, representados pelo EH e pelo EE nas concentrações de 10 e 100
mg/Kg. Os títulos de anticorpos específicos anti-HC (IgM e IgG) foram determinados por
hemaglutinação, enquanto os títulos anti-OVA (IgG e IgE) foram dosados por PCA. Para
avaliação da resposta imune celular através da RHR, os animais foram previamente
imunizados com 0,1 ml de PPD, por via s.c, no D1 do ensaio experimental e os tratamentos
ministrados por 14 dias, após a imunização. No D14, o antígeno foi injetado
intradermicamente no dorso dos animais, no lado direito. Para efeito comparativo, no lado
esquerdo, foi injetada, salina a 0,9%. A RHR foi determinada pela diferença do grau de
endurecimento da pele entre o lado direito e o esquerdo após 24, 48 e 72 horas do desafio,
através de um paquímetro. Ainda relacionado à resposta imune celular, realizou-se a análise
macroscópica e histológica das lesões cutâneas induzidas experimentalmente e tratadas
com um ungüento a base dos extratos por 4 e 14 dias. Os resultados obtidos sugerem que o
EH apresenta ação estimulatória sobre a resposta imune humoral e celular em relação ao
controle, por aumentar a produção de anticorpos específicos anti-HC e anti-OVA (P<0,05),
bem como estimular a RHR (P<0,05) e contribuir para a evolução do processo de
cicatrização (P<0,01). Enquanto o EE, não exerceu ação sobre a resposta imune, sendo os
dados obtidos com esse extrato similares ao do grupo controle. Isso tem sido atribuído ao
fato de que apesar de ambos os extratos apresentarem esteróides na sua composição
fitoquímica, a diferença de polaridade entre os solventes possibilita que estes esteróides
contenham estruturas que lhes confiram características particulares. Além disso, o poder
antioxidante do EH é superior ao do EE, possibilitando a captação de radicais livres e
facilitando a cicatrização. Os resultados obtidos permitiram concluir que o extrato hexânico
confirmou seu efeito estimulatório sobre a resposta imune celular e humoral, além de ter
revelado efeito benéfico no processo de cicatrização, sendo o mesmo não verificado em
relação ao extrato etanólico.
9
ABSTRACT
In the present study, it was aimed at to evaluate the action of the hexane (EH) and
ethanol (EE) from the leaves of Momordica charantia L. on the immune answer of
experimentation animals. For so much, the extracts were prepared and appraised
phitoquimically and with relationship your antioxidant activity. Right after, experimental
protocols were accomplished to investigate the effects of the HE and EE about the
production of specific antibodies induced by the immunization of mice with HC and OVA, in
D0, being given a reinforcement in D7 for the animals sensitized with HC and in D14 and
D35 after immunization with OVA. The groups received previous treatment for 5 days,
through i.p. The treatments consisted of a control group, that received 0,9% saline and the
test group, represented by the HE and EE in the concentrations of 10 and 100 mg/Kg. The
titles of antibodies specific anti-HC (IgM and IgG) were determined for hemaglutination, while
the titles anti-OVA (IgG and IgE) were dosed by PCA. For evaluation of the cellular immune
answer through RDH, the animals were previously immunized with 0,1 ml of PPD, for s.c
way, in the D1 of the experimental rehearsal and the treatments supplied by 14 days, after
the immunization. On the D14, intradermically was injected the antigen in the back of the
animals, on the right side. For comparative effect, on the left side, it was injected, 0,9 %
saline. The RHR was determined by the difference of the degree of hardening of skin
between the right side and the left, after 24, 48 and 72 hours of the challenge, through a
measure calliper. Still regarding the cellular immune answer, took place the macroscopic
analysis and histologic of cutaneous lesions induced experimentally and treated with an
ointment made from extracts, during 4 and 14 days. The obtained results suggest that the
HE shows estimulactory action on the immune humoral and celullar answer in relation to the
control for increasing the production of antibodies specific anti-HC and anti-OVA (P<0,05), as
well as to stimulate RDH (P<0,05) and to contribute for the evolution of the healing process
(P<0,01). While EE didn't show any action on the immune answer, being the data obtained
similar to the of the control group. That has been attributed to the fact that in spite of both
extracts presents steroids in your composition phitoquimic, the polarity difference among the
solvents allows that these steroids contains structures that give to it particular characteristics.
In addition, the antioxidant activity of HE is higher than the EE one, making possible the
reception of free radicals and facilitating the healing process. The results allowed to observe
that the HE confirmed its stimulatory effect above the imune and humoral celular answer,
besides, it showed its postive effect in the wound healing process. Unfortunatelly the same
results could not be observed in the EE experiments.
10
SUMÁRIO
RESUMO 08
ABSTRACT 09
Lista de Figuras 12
Lista de Tabelas e Gráficos 13
Lista de Abreviaturas 14
1. Introdução 16
2. Revisão de Literatura 18
2.1. Mecanismos de Cooperação Celular da Resposta Imune 18
2.2. Imunomodulação 22
2.3. Principais Agentes Imunomoduladores 23
2.3.1. Imunopotencializadores 24
2.3.2. Imunossupressores 25
2.4. Plantas medicinais com atividade imunomoduladora 27
2.5. Momordica charantia L. 29
3. Justificativa 31
4. Objetivos 32
4.1. Objetivo Geral 32
4.2 Objetivos Específicos 32
5. Material e Métodos 33
5.1. Animais 33
5.2. Material Vegetal
5.2.1. Coleta da Planta
33
33
5.2.2. Preparo dos extratos 34
5.2.3. Prospecção fitoquímica
5.2.4. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico e
etanólico das folhas de M. charantia pelo método de varredura do radical livre
DPPH
35
37
5.3. Imunidade humoral e imunidade celular e sua modulação in vivo por
extratos hexânico e etanólico de M. charantia
37
5.3.1. Imunização de camundongos com hemácias de carneiro e os efeitos
dos extratos etanólico e hexânico sobre a produção de anticorpos circulantes
37
5.3.2. Imunização de camundongos com ovalbumina e os efeitos dos extratos
etanólico e hexânico sobre a produção de anticorpos circulantes
5.3.2.1.Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA) para IgE e IgG
38
40
11
5.4 Imunização de coelhos com derivado de proteína purificada (PPD) e os
efeitos dos extratos etanólico e hexânico de M.charantia sobre a reação de
hipersensibilidade retardada
44
5.5. Indução de lesões cutâneas experimentais em coelhos e o efeito da
aplicação tópica dos extratos hexânico e etanólico de Momordica charantia L.
sobre a resposta imune celular
45
5.6 Análise Estatística 46
6. Resultados 47
6.1. Prospecção fitoquímica
6.2. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de
Momordica charantia L.pelo método de varredura do radical livre DPPH
6.3. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a resposta imune humoral
induzida por hemácias de carneiro em camundongos
47
47
47
6.4. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a produção de anticorpos
específicos anti-ovalbumina
49
6.5. Efeito do EE e do EH de M. charantia sobre a reação de hipersensibilidade
retardada em animais imunizados com derivado de proteína purificada (PPD)
54
6.6. Efeito imunomodulador da aplicação tópica do EE e do EH de M. charantia
em lesões cutâneas experimentais em coelhos
55
7. Discussão 61
8. Conclusões Gerais 67
9. Perspectivas 68
10. Referências Bibliográficas 69
ANEXOS 78
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Resposta Imune Humoral 19
Figura 2. Resposta Imune Ceular 21
Figura 3. Momordica charantia L. 30
Figura 4. Animais de experimentação. (a) Camundongo Swiss (b) Rato Wistar (c)
Coelho da Nova Zelândia
33
Figura 5. Coleta da M. charantia 34
Figura 6. Folhas de M. charantia: (a) frescas (b) após secagem. 34
Figura 7. Extratos Hexânico (EH) e Etanólico (EE) das folhas de M. charantia 35
Figura 8. Tratamentos (a) Grupos de animais (b) Administração intraperitoneal 39
Figura 9. Imunização com o antígeno (a) Ovalbumina + adjuvante (b) Admninistração
via subcutânea no dorso dos animais
39
Figura 10. (a) Coleta de sangue (b) Retração do coágulo 39
Figura 11. (a) Centrifugação do sangue (b) Obtenção do soro 40
Figura 12 . Anestesia em câmara de éter e depilação do dorso do animal 41
Figura 13. (a) Injeção intradérmica das diluições dos soros no dorso do animal
(b) Desencadeamento da PCA via plexo retroorbital
41
Figura 14. Dissecação da pele para leitura da reação 41
Figura 15. Extensão da pele para leitura da reação 42
Figura 16. Anestesia de rato Wistar em câmara de éter 42
Figura 17. Tricotomia para injeção das diluções dos soros no dorso do animal 43
Figura 18. Desencadeamento da PCA via peniana 43
Figura 19. PCA em ratos Wistar (a) Positiva (b) Negativa 44
Figura 20. Sonda orogástrica 44
Figura 21. Demarcação das áreas das feridas experimentais 45
Figura 22. Aspectos histológicos de lesões cutâneas experimentais (4x) em coelhos
tratados com ungüentos a base dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M.
charantia nas concentrações de 10 e de 20%, por 4 e 14 dias.
60
13
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Tabela 1. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das
folhas de Momordica charantia L. pelo método de varredura do
radical livre DPPH.
47
Tabela 2. Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre os títulos de
anticorpos específicos anti-HC.
49
Tabela 3. Efeito do EH e do EE sobre a RHR em coelhos imunizados com
PPD.
55
Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre
a retração da área (mm) do processo inflamatório.
56
Tabela 5. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre
as células mononucleares.
57
Tabela 6. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre
os fibroblastos.
58
Tabela 7. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre
os vasos sanguíneos.
59
Gráfico 1. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em
camundongos tratados com EH.
51
Gráfico 2. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em
camundongos tratados com EE.
51
Gráfico 3. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em
camundongos tratados com EH.
53
Gráfico 4. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em
camundongos tratados com EE.
53
14
LISTA DE ABREVIATURAS E/OU SÍMBOLOS
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
BCG Bacilo Calmette-Guérin (Mycobacterium Bovis)
CAAs Células apresentadoras de antígenos
Células T Linfócitos T
Células B Linfócitos B
Célula Th Célula T auxiliadora
Célula Tc Célula T citotóxica
Célula NK Célula natural killer (matadoras naturais)
CSA Ciclosporina A
°C Graus Celsius
CRD Cranial direito
CRE Cranial esquerdo
CND Central direito
CNE Central esquerdo
CDD Caudal direito
CDE Caudal esquerdo
D Dias
EE Extrato etanólico de M. charantia
EH Extrato hexânico de M. charantia
ELISA Técnica de imunoabsorbância ligada à enzima
et al., E colaboradores
FAVET Faculdade de Veterinária
FK506 Tracolimus
HC Hemácias de carneiro
HIV Vírus da imunodeficiência humana
h Horas
IFN Interferon
Ig Imunoglobulina
L Linn
IL Interleucina
LAK Células exterminadoras ativadas por linfocinas
LIBA Laboratório de imunologia e bioquímica animal
LPF Fator promotor de linfocitose
LPS Lipopolissacarídeos
MDP Muramildipeptídeo
15
MHC Complexo de histocompatibilidade principal
MIM Monofosfato de inosina de metil
mL Mililitros
mg Miligramas
mg/kg Miligramas por kilograma de peso do animal
NaCl Cloreto de sódio
nm Nanômetros
OVA Ovalbumina
pA:U Ácido poliadenílico-poliuridínico
PCA Anafilaxia cutânea passiva
pH Potencial hidrogeniônico
pI:C Polinosínico-policitidílico
PPD Derivado protéico purificado da tuberculina
® Marca registrada
RHR Reação de hipersensibilidade retardada
TCGF Fator de crescimento da célula T
TCR Receptor da célula T
TNF Fator de necrose tumoral
UFC Universidade Federal do Ceará
UECE Universidade Estadual do Ceará
μg Micrograma
μl Microlitro
% Por cento
α Alfa
β Beta
γ Gama
μ Mi
1000X Aumento de 1000 vezes
16
1. INTRODUÇÃO
O conflito saúde X enfermidade sempre existiu para toda espécie de ser vivo. Na
antiguidade, o homem parecia agir instintivamente como os animais no tratamento das
enfermidades e desde já as civilizações tinham o hábito de recorrer às propriedades
curativas de certos vegetais. A exploração da virtude das plantas com o objetivo de adquirir
novas estratégias de combater doenças foi a mais vislumbrada e especulada pelo homem.
(LUENGO, 2005).
As atividades farmacológicas destas plantas, em particular suas ações
imunológicas, tem sido foco de pesquisas no intuito de prevenir e curar doenças, já que
algumas plantas medicinais demonstraram capacidade de promover a saúde física e mental,
estimular os mecanismos de defesa do corpo e aumentar a longevidade. A capacidade de
induzir um efeito sobre as funções imunes específicas e inespecíficas em animais
experimentais despertou o interesse para a identificação dos constituintes fitoquímicos
imunoativos (BHATTACHARYA, 2000).
Podemos citar como exemplos de plantas com atividade imunomoduladora, a
Thymus broussonetii gerando uma maior capacidade adaptogênica em face de fatores
estressantes (ELHABAZI et al., 2006) e a ação imunoestimulatória do extrato metanólico de
Curculigo orchioides e da fração bioativa de Sphaerantus indicus Linn em ratos
imunossuprimidos (BAFNA et al., 2006). Pesquisas recentes verificaram que determinados
constituintes presentes em plantas medicinais como a Aloe barbadensis Miller e a Calendula
officinalis são capazes de modular a resposta inflamatória, estimulando as células
envolvidas no processo cicatricial (DORNELES et al., 2003).
A Momordica charantia L., planta alvo do nosso estudo, é uma trepadeira, comum
na beira de estradas do semi-árido nordestino, pertencente à família Curcubitaceae, sendo
conhecida popularmente conhecida como melão-de-São-Caetano (SOUZA, 2001). Várias
propriedades medicinais já foram descritas, dentre estas se destacam: atividade
hipoglicemiante (VIRDI et al., 2003); antibacteriana (KHAN et al., 1998); antiviral (CUNNICK
et al., 1990), anti-HIV (AU et al., 2000), antitumoral (RIBAK et al., 1994, LEE-HUANG et al.,
1995), antiulcerogênica (GURBUZ et al., 2000), anti-helmíntica (YESILADA et al., 1999) e
imunomoduladora (LEUNG et al., 1987).
A Momordica charantia L. foi usada em diferentes protocolos experimentais para
estudar os mecanismos envolvidos na resposta imune.
Em um estudo in vivo, Leung et al., (1987) observaram que injeções de
microgramas de uma proteína inibidora obtida da M. charantia em camundongos retardavam
a rejeição de aloenxertos da pele incompatíveis em decorrência da redução na atividade das
células NK e do aumento de macrófagos, intermediando espontaneamente a citotoxicidade.
17
In vitro, a proteína inibidora da M. charantia inibiu as células linfóides estimuladas
pela fitohemoaglutinina e concavalina A, mas não para o lipopolissacarídeo (LPS) e
notadamente aumentou a citotoxicidade dependente de macrófagos (SPREAFICO et al.,
1983).
A administração intraperitoneal de alfa-mormocharin e beta-mormocharin (50 µg
semanalmente por cinco semanas) em camundongos Baby resultou em altos níveis de
produção de IgE (título de PCA) (ZHENG et al., 1999). Contudo, sua atividade
imunoestimulante tem sido atribuída a um aumento na produção de interferon e atividade
das células natural killer (CUNNICK et al., 1990). Alfa-mormocharin e beta-mormocharin
mostraram atividade imunosupressora via linfocitotoxicidade ou pela mudança nos
parâmetros cinéticos da resposta imune (LEUNG et al., 1987).
A ação da Momordica charantia L. sobre a resposta imune em diferentes
protocolos experimentais mostrou que esta planta atua em algumas situações como
imunosupressora, para evitar rejeição de aloenxertos (LEUNG et al., 1987; SPREAFICO et
al., 1983). Entretanto, em outras (HIV), esta planta exibe atividade imunoestimulatória
(ZHENG et al., 1999).
Estudos enfocando a atuação da Momordica charantia L. sobre o sistema imune
são necessários devido aos diferentes padrões de resposta imunológica por ela
estabelecida, já que estes nos permitirão compreender a função e regulação das células T e
B nos mecanismos envolvidos na patogênese, resistência e susceptibilidade a diversas
doenças. Quanto à cicatrização, este estudo é importante já que esta planta é largamente
utilizada na medicina popular no tratamento de lesões cutâneas, sendo necessário
confirmação científica da veracidade de seu efeito cicatrizante.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Mecanismos de Cooperação Celular da Resposta Imune
A resposta imunológica é um processo de acomodação variável, que leva os animais
a produzirem anticorpos e células reativas, em resposta a uma grande variedade de
moléculas e de macromoléculas orgânicas. Constitui o principal meio de defesa do
organismo, não somente contra agentes infecciosos, como também outros agentes (por
exemplo: enxertos, hemácias, drogas) e mesmo a constituintes do próprio organismo nos
processos de auto-imunidade (PARKIN & COHEN, 2001).
O sistema imunológico possui uma arquitetura de múltiplas camadas, com
mecanismos de regulação e defesa espalhados em vários níveis. As principais barreiras
entre os hospedeiros e seu ambiente são os epitélios da pele e dos tratos gastrintestinal e
respiratório. No entanto, se microorganismos forem capazes de atravessar esses epitélios,
irão se deparar com as barreiras bioquímicas, que incluem os fluidos como a saliva, o suor,
as lágrimas e os ácidos estomacais, além de fatores como o pH e a temperatura corporal. A
próxima camada de proteção é representada pela imunidade inata, formada por células
fagocitárias, como os macrófagos e os neutrófilos, além de fatores solúveis como o
complemento e algumas enzimas (JANEWAY & MEDZHITOV, 2002). As células do sistema
imune inato desempenham um papel crucial na iniciação e posterior direcionamento das
respostas imunes adquiridas (DELVES & ROITT, 2000).
Os linfócitos T e B são as principais células do sistema imune adquirido e
apresentam memória imunológica, que permite o reconhecimento de um estímulo antigênico
caso ele entre novamente em contato com o organismo, evitando assim o restabelecimento
da doença e resultando na imunidade contra a reinfecção ao mesmo agente infectante
(DEFRANCO & WEISS, 1998; DUTTOM et al., 1998).
As respostas imunes adquiridas dos linfócitos T e B antígeno-específicos são
denominadas, respectivamente de imunidade celular e humoral. A imunidade celular
defende o organismo contra os microorganismos intracelulares e a imunidade humoral atua
sobre os microorganismos extracelulares e suas toxinas (JANEWAY & MEDZHITOV, 2002).
O mecanismo de reconhecimento e ativação da resposta imune específica tem início
quando os antígenos são captados pelas células apresentadoras de antígenos (CAAs)
(BANCHEREAU et al., 2000). Os principais tipos de CAAs são os monócitos sangüíneos, os
linfócitos B, os macrófagos e as células dendríticas foliculares. As CAAs circulam pelo
corpo fagocitando os patógenos encontrados, fragmentando-os em peptídeos antigênicos.
Partes destes peptídeos se ligam a moléculas do complexo de histocompatibilidade principal
19
Figura 1. Resposta Imune Humoral. Fonte: TIZARD, 1998.
(MHC) e são apresentados na superfície celular sob a forma de um complexo MHC/peptídeo
(ZINKERNAGEL & DOHERTY, 1997).
As moléculas coestimulatórias que interagem durante a apresentação do antígeno
fornecem um segundo sinal para a ativação dos linfócitos T (MURTAUGH & FOSS, 2002).
Sem este segundo sinal não há uma resposta adequada e as células T tornam-se inativas,
produzindo um estado de tolerância imunológica específica, conhecido por anergia clonal
(KAMRADT& MITCHISON, 2001).
A resposta imune humoral mediada por anticorpos é resultante de uma série de
interações celulares que ocorrem em uma seqüência ordenada (HARLOW & LANE, 1988);
onde inicialmente as células T são ativadas quando os antígenos são apresentados pelas
CAA, em seguida as células B interagem com as células T auxiliares antígeno-específicas e
só então, os linfócitos B ativados proliferam e se diferenciam em plasmócitos e células B de
memória (MCHEYZER-WILLIAMS & MCHEYZER-WILLIAMS, 2005) (Figura 1).
20
O receptor de antígeno das células B é formado por glicoproteínas
transmembranares Ig-α e Ig-β juntamente com a imunoglobulina de membrana, na qual se
liga o antígeno. Com exceção dos antígenos T-independentes, o contato com o antígeno é
insuficiente para ativar as células B, sendo necessário auxílio das células T para produzir
resposta. As células B são eficientes na captação do antígeno através do mecanismo de
endocitose mediada por receptor, e isso se deve ao fato de que a imunoglobulina atua como
receptor de alta afinidade (SRIVASTAVA, 2002). No entanto, estas células são ineficazes na
captação de antígenos por fagocitose ou pinocitose (BANCHEREAU et al., 2000). Após a
captação, o antígeno é processado e combina-se com moléculas recém sintetizadas de
MHC (PINET et al., 1995).
A resposta por anticorpos pode ser induzida por dois tipos de antígenos. A maioria
dos antígenos protéicos requer o auxílio das células T antígeno-específicas para produzir
uma resposta humoral (antígenos T-dependentes), dentre estes podemos citar, as hemácias
de carneiro e a ovalbumina. Porém alguns antígenos, como o LPS, não necessitam da
presença de células T auxiliares, sendo denominados T-independentes (JANEWAY et al.,
2002).
Os antígenos T-independentes caracterizam-se por constituírem grandes moléculas
poliméricas, altamente resistentes à degradação, sendo a maioria de origem bacteriana, que
provocam geralmente respostas mais fracas que os antígenos T-dependentes. Estes
antígenos geram, principalmente, resposta IgM, no entanto não induzem a diferenciação de
células B de memória (JANEWAY et al., 2002).
Na resposta imune celular, os principais componentes compreendem os mecanismos
especializados que envolvem a citotoxicidade mediada por linfócitos T e a ativação de
macrófagos pelas células T efetoras (JANEWAY et al., 2002) (Figura 2).
Os linfócitos T apenas reconhecem o antígeno na forma de fragmentos peptídicos
ligados a moléculas da classe I ou II do MHC próprio, através do TCR (receptor de células
T). Os antígenos de histocompatibilidade MHC classe I são expressos em quase todas as
células nucleadas do organismo e são responsáveis pela transdução de sinais para ativação
das células T CD8
+
citotóxicas. Já os antígenos de histocompatibilidade MHC de classe II
são expressos pela dendríticas,
linfócito B e são responsáveis pela ativação das células T CD4
+
(EFFROS et al., 2003).
s células imunocompetentes, incluindo macrófagos, células
s
21
A identificação de subpopulações distintas de linfócitos Th CD4+ (auxiliares) em
ão da diversidade funcional das células no
sistema
na resposta inflamatória mediada por macrófagos e dirigida a patógenos intracelulares. As
ução de anticorpos
por cél
estas expressam sinais estimulatórios. No entanto, na maioria das vezes, eles precisam
Figura 2. Resposta Imune Celular. Fonte: TIZARD, 1998.
camundongos, de acordo com as citocinas secretadas, denominadas Th1 e Th2
(MOSMANN et al., 1986), facilitou a compreens
imune.
Deste modo, citocinas de Th1, IL-2, TNF-β, IFN-y, estão principalmente envolvidas
células Th2 produzindo IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 auxiliam na prod
ulas B e participam da maturação e ativação de mastócitos e eosinófilos (MOSMANN
& COFFMAN, 1989).
Os linfócitos T CD8
+
citotóxico podem ser ativados diretamente pelas CAAs, quando
de cooperação das células CD4+ Th1 para serem ativados. Uma vez ativados os linfócitos T
citotóxicos (Tc) interagem com as células-alvo e liberam o conteúdo de seus grânulos. Os
22
As moléculas de perforina formam poros na membrana plasmática da célula-alvo,
porém estes não são suficientes para destruir as células. Através dos poros, as granzimas
entram na célula-alvo e deflagram a apoptose (FROELICH et al., 1998). Outra forma pela
qual o LT CD8
+
extermina outra célula é através da glicoproteína Fas através do seu ligante
fasL presente na célula alvo (EFFROS et al., 2003).
As respostas imunes adquiridas declinam à medida que o antígeno vai sendo
eliminado e a imunidade inata vai se extinguindo, cessando com os estímulos que são
necessários para a sobrevivência dos linfócitos. Grande parte desse declínio é devida à
morte apoptótica dos linfócitos ativados (LENARDO et al., 1999; SCAFFIDI et al., 1999,
REVILLARD et al., 1998), que ficam privados dos sinais para a sobrevivência. Esse
processo mantém a homeostase do sistema imune, fazendo-o retornar ao seu estado de
repouso basal (MURTAUGH & FOSS, 2002).
2.2 Imunomodulação
A imunomodulação pode alterar o funcionamento do sistema imune de um indivíduo.
O sistema imune pode suprimir ou promover as respostas imunológicas de modo antígeno-
específico (HOLLAND & VIZI, 2002).
Muitos são os fatores que modulam o resultado de qualquer resposta imune e estes
incluem o próprio antígeno. Quanto a natureza química do antígeno, os antígenos protéicos
induzem imunida o incapazes de
estimular células T através das moléculas de MHC classes I e II. No tocante as quantidades,
duzem uma resposta imune, sendo, portanto, considerados como
JANEWAY et al., 2002).
A
SON, 2001). Já as células dendríticas e macrófagos ativados são CAAs
de celular e humoral. Os polissacarídeos e lipídeos sã
doses elevadas do antígeno podem induzir tolerância específica das células T ou, algumas
vezes, das células B (KAMRADT & MITCHISON, 2001). A via de administração do antígeno
também influencia a resposta imune, os antígenos administrados por via subcutânea ou
intradérmica in
imunogênicos, enquanto que os antígenos administrados por via endovenosa, oral ou
aerossol, muitas vezes induzem a falta de imunidade específica. O histórico anterior da
exposição ao antígeno em questão também influencia na resposta imune. Se o animal já
estiver sido exposto a um determinado antígeno, a memória imunológica permitirá uma
resposta mais rápida (
s células apresentadoras de antígenos podem interferir na resposta imune através de
sua capacidade de fornecer coestímulo as células T (STITES & TERR, 1995). As células
acessórias como macrófagos e linfócitos B em repouso são deficientes na função de co-
estimuladores, já que os antígenos apresentados por estas CAAs podem deixar de
estimular as células Th virgens e induzir tolerância as células T (KAMRADT &
MITCHI
23
compe
A
uroendócrino afete as funções imunológicas,
abe-se que o estresse pode induzir a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)
o a liberação de glicocorticosteróides que são imunossupressores e
tuam controlando negativamente as respostas das células Th1 e a ativação dos
macróf
istema imune, mas que são capaz de acarretar uma
2.3 P
tentes, pois expressam co-estimuladores, altos níveis de MHC-II e secretam
citocinas (BANCHEREAU et al., 2000).
A migração seletiva das subpopulações de linfócitos para os diferentes sítios pode
modular o tipo e o local da resposta imune, uma vez que as células Th1 e Th2 respondem a
diferentes grupos de citocinas (ROMAGNANI, 1997).
s ações das citocinas sobre as células T e B também correspondem a fatores de
imunorregulação (OPPENHEIM & FELDMAN, 2000).
Os componentes genéticos do indivíduo desafiado com o antígeno afetam o nível das
respostas imunes, a susceptibilidade à infecção e às doenças auto-imunes. Defeitos em
muitos dos genes envolvidos podem levar a uma imunodeficiência ou a anormalidades das
respostas imunes (JANEWAY et al., 2002).
Existem evidências de que o sistema ne
s
pela hipófise, provocand
a
agos (VACCA et al., 1992).
A desnutrição e a falta de nutrientes (ferro, zinco, cobre, selênio) e vitaminas (A, B, C,
E) constituem fatores extrínsecos ao s
imunodepressão celular e humoral. Desta forma, a nutrição e uma dieta bem equilibrada
compõem ferramentas fundamentais na redução da ocorrência de doenças e mortes por
infecções oportunistas (CHANDRA, 1997).
Outra forma de regulação é o “feedback” pelo anticorpo, onde a ligação de complexos
antígeno-anticorpo a receptores de Fc na superfície do linfócito B suprimem a ativação
do linfócito, sendo um mecanismo de retroalimentação negativa após produção máxima
de anticorpos (RAVETCH & CLYNES, 1998).
Esse mecanismo imunoregulador assegura que as respostas sejam apropriadas
tanto qualitativamente quanto quantitativamente (HOLLAND & VIZI, 2002). No entanto, em
algumas situações, a ativação do sistema imune pode culminar em patologias, necessitando
de substâncias imunossupressoras para o controle, em contrapartida, fatores ambientais,
parasitas e imunodeficiências tornam necessário o uso de substâncias imunoestimulantes.
rincipais agentes imunomoduladores
Nos últimos anos, ocorreram avanços significativos na compreensão dos eventos que
controlam o sistema imune e nos efeitos seletivos de medicamentos de origem natural ou
sintética, capazes de modificar a função imune produzindo não apenas uma
imunodepressão, como também uma imunopotencialização (HOLLAND & VIZI, 2002).
24
transplantes, como forma de evitar a rejeição e no
contr
bacterianos, químicos, como os
polinu
te com o antígeno. Inúmeras dessas
subst
imunoterapia sistêmica serão descritos a seguir.
cias semelhantes a hormônios. Extratos puros do timo
bovin
de células T (MASIHI, 2000)
diferenciação de linfócitos T, aumentar a
prolife
,
erpes zoster, influenza e rinovírus (DUTTA, 2002).
eno glicopeptídeo, usado como adjuvante. O
DP – Lis (L18) é um potente indutor de uma variedade de citocinas, tais como IL-1, IL-6,
são
A imunossupressão descreve os recursos normalmente utilizados para reduzir as
respostas imunes, particularmente nos
ole das doenças alérgicas e auto-imunes (STITES & TERR, 1995).
A imunopotencialização inclui compostos que modificam a resposta imune, no sentido de
potencializá-la. Estes agentes incluem produtos
cleotídeos, moléculas fisiologicamente ativas como as citocinas, bem como os
verdadeiros adjuvantes que são ministrados juntamen
âncias vêm sendo utilizadas como tentativas de potencializar as reações imunes em
pacientes com câncer, em indivíduos susceptíveis a invasões de agentes devido a fatores
ambientais e em aidéticos (STITES & TERR, 1995).
Os agentes mais comumente usados na
2.3.1 Imunopotencializadores
O timo é um órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T
através de secreções de substân
o têm sido usados para isolar e identificar hormônios responsáveis pelas funções
fisológicas do mesmo. Esses extratos têm produzido misturas peptídicas tais como a fração
timosínica-5 e preparações peptídicas purificadas como timopoietina, fator humoral tímico,
timulina e timosina. Estas preparações podem induzir marcadores de superfície de linfócitos
T nos pró-timócitos e modular a proliferação
A timopoetina é um peptídeo sintético que combinado com a 1α-timosina, o interferon -
γ e a zidovudina é capaz de estimular a função de linfócitos T CD4 (GARACI et al., 1994).
O monofosfato de inosina de metil (MIM) é um imunomodulador timomimético capaz
de induzir a expressão de marcadores de
ração de linfócitos bem como a produção de IgM (DUTTA, 2002). No entanto, é capaz
de induzir a hipersensibilidade do tipo retardada.
A isoprinosina é um complexo do p-acetamidobenzoato de N-dimetilamino-2-
propanolol:inosine que foi desenvolvida como um agente antiviral pois aumenta a produção
de interferon. É utilizada no tratamento de doenças causadas pelos vírus herpes simples
h
O muramildipeptídeo (MDP) é um pequ
M
fatores estimuladores de colônias, TNF e interferon-γ em camundongos e humanos (DUTTA,
2002).
O uso de adjuvantes, objetiva conseguir uma lenta, porém, duradoura liberação do
antígeno e assim, obter um aumento na resposta imune específica, geralmente
25
las apresentadoras
úmero de linfócitos nos linfonodos que
células lo ais inativadas. Os polinucleotídeos sintéticos, como o ácido poliadenílico-
ico-policitidílico (pI:C) exercem apreciável ação adjuvante;
mbos atuam sobre os macrófagos, enquanto só o pA:U é ativo sobre os linfócitos T,
ativan
o na indução da
prolife
e
tardia
idas no paciente como imunoterapia do
cânce
arvum atua induzindo uma hiperplasia
linfóid
necessários nas vacinas preparadas com organismos inativados (AU et al; O’HAGAN et al.,
2001). Os adjuvantes formam depósito e estimulam o recrutamento de células, causando
uma lenta disseminação do antígeno, que vai ser processado pelas célu
e posteriormente reconhecido pelos linfócitos T e B atraídos para o sítio de injeção ou nos
próprios órgãos linfóides. Acredita-se que a estimulação dos macrófagos seja a atividade
mais importante dos adjuvantes (COX & COULTER, 1997). De fato, os agentes que
aumentam o número de macrófagos ou que potencializam suas atividades também
intensificam a resposta imune. Alguns desses agentes são lipopolissacarídeos (LPS),
zimosan, ácidos poliacrílicos e BCG (Bacilo Calmette-Guérin). Além disso, os adjuvantes,
via de regra, induzem um aumento significativo do n
drenam a área da injeção, estimulando o afluxo de células bem como a multiplicação das
c
poliuridínico (pA:U) e o polinosín
a
do T auxiliar e T citotóxico (COX et al., 1997).
O LPS compõe as paredes celulares das bactérias Gram-negativas, é mitogênico para
as células B e capaz de ativar macrófagos. O LPS exerce efeito adjuvante quando injetado
simultaneamente com o antígeno e é utilizado em diferentes modelos experimentais (COX &
COULTER, 1997; JANEWAY et al., 2002).
O levamisol é um composto sintético tradicionalmente empregado como anti-
helmíntico, cujo efeito imunoestimulante é caracterizado pelo aument
ração de linfócitos T, aumento da quimiotaxia de neutrófilos e macrófagos, aumento
da atividade fagocítica, no entanto, induz exarcebação das reações de hipersensibilidad
(BONAMIN & PAULINO, 1996; JANEWAY et al., 2002).
As células exterminadoras ativadas por linfocinas (células LAK) são linfócitos T
citotóxicos, gerados in vitro pelo tratamento das células de um indivíduo com citocinas como
a IL-2. Algumas vezes, estas células são infud
r (PARDOLL, 1998).
A Bordetella pertussis produz um fator promotor de linfocitose (LPF), que é um mitógeno
de células T e um imunoestimulante. B. pertussis é o agente etiológico da coqueluche
(MCGUIRK et al., 2002). Já o Corynebacterium p
e e ativando os macrófagos (DIBASIO & LOBUGLIO, 1996).
2.3.2 Imunossupressores
Os esteróides, incluindo os glicocorticosteróides, os hormônios corticosteróides
(cortisona, desidrocortisona e similares) e os esteróides sintéticos, como a dexametasona,
26
os linfócitos B induzindo a depressão
da sí
0). A CsA
utras ações em várias células: determina a redução da
e hiper-responsividade após provocação antigênica vivo (BACH & STROM,
otóxica, no entanto sua utilização é restrita devido aos
ecções, hipertensão arterial, hipertricose,
hiperplasia
possuem numerosos efeitos imunossupressores e antiinflamatórios, com os macrófagos
sendo as células particularmente sensíveis a estes agentes (DE JONG et al., 1999). Os
esteróides inibem a liberação do ácido araquidônico e portanto, reduzem a produção de
eicosanóides bem como a secreção de proteases neutras e de IL-1. Os esteróides
interferem na apresentação de antígenos, inibem a resposta primária por anticorpos e
reduzem o número de células T circulantes. Os corticosteróides quando administrados antes
do antígeno inibem a produção dos anticorpos no coelho e rato, enquanto o homem, o
macaco e a cobaia são mais resistentes à sua ação imunossupressora (BACH & STROM,
1986).
A azatioprina e a 6-mercaptopurina são análogos a purinas que agem sobre os
linfócitos e sobre as células em divisão, bloqueando o desenvolvimento das células efetoras
pela inibição da síntese do ácido nucléico. Estas drogas reduzem quantitativamente os
monócitos e inibem a atividade das células NK (BACH et al., 1986).
A ciclofosfamida constitui um agente alquilante que danifica o DNA e impede sua
replicação. Estes agentes atuam primariamente sobre
ntese de anticorpos. Não altera a proliferação de linfócitos T, quando administrada no
segundo dia após a administração do antígeno (BEL & BARNES, 2000).
A ciclosporina A (CsA) é um potente agente imunossupressor utilizado para prevenir a
rejeição em
transplantes de órgãos, sendo efetiva em doses relativamente baixas em várias
doenças "auto-imunes" como artrite reumatóide, psoríase e doença de Crohn. É um
metabólito polipeptídico cíclico extraído de um fungo To/ypocladium inflatum, originalmente
isolado na Noruega, agindo principalmente na inibição da ativação de linfócitos T, com a
supressão da produção de citocinas pró-inflamatórias (BEL & BARNES, 200
impede a transcrição gênica de várias citocinas como IL-2, IL-4, IL-13 e em especial a IL-5.
A IL-2 era anteriormente conhecida como TCGF (T Cell Growth Factor) e tem como
principal ação a de assegurar a expansão clonal dos linfócitos T ativados (BARNES &
ADOCK, 1995). A CsA apresenta o
liberação de histamina pelos basófilos, reduz a síntese de IL-1 do fator de necrose tumoral
(TNF), do superóxido, do peróxido de hidrogênio pelos macrófagos, assim como reduz a
quimiotaxia de neutrófilos e as concentrações do receptor solúvel IL-2 (LEADFORD, 1996).
Em modelos animais a CsA inibe a resposta tardia da asma, a afluência de eosinófilos e a
subseqüent
1986). A ciclosporina não é miel
efeitos colaterais como a propensão a inf
gengival, toxicidade ao fígado, rins e sistema nervoso (BEL & BARNES, 2000).
27
respectivamente (BACH et al., 1986).
2.4 P
zes de modular o
sistema imune e são citadas a seguir.
Os extratos metanólicos da raiz da Withania somnifera (DAVIS & KUTTAN, 2000)
e do caule de Tinospora cordifolia (MATHEW & KUTAN, 1999), o extrato etanólico da casca
O tracolimus (Fk506) é um composto fúngico isolado do actinomiceto do solo
Streptomyces tsukubaensis que impede a ativação da mitogênese dos linfócitos T,
possivelmente por bloquear a produção de IL-2. O seu modo de ação é semelhante ao da
ciclosporina, com potente ação imunodepressora (BACH et al., 1986).
O tosilate suplatast, desenvolvido no Japão atua prevenindo a liberação de IL-4 e IL-5
pelas células Th2 e desta forma reduz a eosinofilia brônquica em modelo animal de
hiperesponsividade brônquica (ASANO et al., 2000; ZHAO et al., 2000).
O brequinar sódico e micofenolato mofetil são inibidores da síntese de pirimidinas e
purinas,
A rapamicina inibe a capacidade dos fatores de crescimento das células T em induzir o
ciclo celular nas células T. Tanto a rapamicina quanto o tracolimus ligam-se ao mesmo
receptor, embora seus modos de ação sejam diferentes (DUMONT & SU, 1995).
lantas medicinais como imunomoduladores
Uma variedade de substâncias, como polissacarídeos, lectinas, peptídeos,
saponinas, óleos e outras, oriundas de plantas medicinais são capa
Um polissacarídeo isolado do mesocarpo de frutas de Orbignya phalerata elevou
a atividade de células fagocíticas in vivo apresentando atividade imunomoduladora (SILVA &
PARENTE, 2001). O óleo da casca de Cedrus deodora atuou sobre os neutrófilos, reduzindo
a atividade fagocítica (SHINDE et al., 1999). Já o extrato metanólico da raiz da Withania
somnifera aumentou essa atividade em macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c
(DAVIS & KUTTAN, 2000).
O extrato etanólico das sementes de Psoralea corylifolia aumentou a atividade
citotóxica, além de combater as células tumorais através da ativação das células NK. Já o
extrato etanólico da raiz da Boerhaavia difusa inibiu tanto a citotoxicidade mediada pelas
células NK, quanto a produção de óxido nítrico por macrófagos estimulados por LPS
(MEHROTTA et al., 2002). Por outro lado, o extrato metanólico do caule de Tinospora
cordifolia ativou a citotoxicidade dos macrófagos contra células do carcinoma ascítico de
Ehrlich e em contrapartida apresentou atividade proliferativa dos leucócitos, além de elevar
a produção de anticorpos (MATHEW & KUTAN, 1999). As saponinas isoladas do extrato
etanólico de Astragalus peregrinus estimularam a proliferação de esplenócitos de
camundongos ativados in vitro, e não apresentaram citotoxicidade contra diferentes
linhagens celulares tumorais de humanos, como tumores de mama, pulmão, cólon e
próstata (VEROTTA et al., 2001).
28
do ca
Janakia arayalpathra
result
s de inibir a reação
de hi
utos de Punica granatum (ROSS et al., 2001)
aume
Boerhaavia
difusa ia a produção de IL-2,TNF-α, IL-13, IL-15, interferon-γ, IL-4, IL-5 e IL-10, citocinas
élulas T e B.
O extrato aquoso de folhas da Osbeckia aspera apresentou atividade
imunossup
o a proliferação de linfócitos, enquanto o extrato
aquoso da
o estímulo para a atuação de células plaquetárias, neutrófilos,
macrófago
NER, 1998).
ule de Mangifera indica (MAKARE et al., 2001) e os frutos de Punica granatum (ROSS
et al., 2001) aumentaram o título de anticorpos circulantes enquanto o óleo da casca de
Cedrus deodora (SHINDE et al., 1999) inibiu a reação de Arthus, indicando declínio na
produção de anticorpos. A administração oral de extratos de raízes de
ou em aumento dos títulos de anticorpos circulantes, quando comparado ao levamisol
(SUBRAMONIAN et al., 1996).
O extrato metanólico da raiz da Withania somnifera (DAVIS & KUTTAN, 2000) e
o óleo da casca de Cedrus deodora (SHINDE et al., 1999) foram capaze
persensibilidade retardada (RHR) enquanto o extrato etanólico da casca do caule de
Mangifera indica (MAKARE et al., 2001) e os fr
ntaram a RHR. No entanto, os mecanismos responsáveis por estas atividades ainda
são desconhecidos.
Mehrotra et al (2002) verificaram que o extrato etanólico da raiz da
inib
importantes no controle das respostas mediadas por c
ressora sobre células mononucleares do sangue periférico em pacientes com
hepatite crônica do tipo C (NICHOLL et al., 2001).
O suco das folhas da Kalanchoe brasiliensis (IBRAHIM et al., 2002) apresentou
atividades imunossupressoras, inibind
s flores de Tília cordata (ANESINI et al., 1999) demonstrou ação estimulatória
sobre os linfócitos, associada à presença de flavonóides. Já o extrato metanólico das folhas
de Bidens pilosa L. inibiu a atividade linfoproliferativa in vitro e esta atividade está associada
à presença de um poliacetileno que foi isolado da mesma (PEREIRA et al., 1999).
A literatura refere o uso de fitoterápicos como agentes estimulantes da resposta
imune celular, amplificando
s, linfócitos, mastócitos e fibroblastos sobre a regulação da vascularização,
fibroplasia e maturação das feridas crônicas. Além de constituírem importantes fontes de
citocinas, que conforme observações de Robson & Philips (1992), Candido (2001) e
Rodrigues et al (2001), são substâncias responsáveis pela comunicação nas interações
celulares e representam a descoberta mais interessante na cicatrização de feridas da
década.
Dentre as plantas medicinais, que se destacam por essa ação, podemos citar, a
Calendula officinalis, que possui na sua composição uma fração lipofílica, os triterpenóides,
responsáveis pela ação antiinflamatória (AKIHISA et al., 1996), carotenóides, flavonóides,
carboidratos, ácidos graxos e polissacarídeos, que lhe conferem ação epitelizante e
imunoestimulante (BROWN & DATT
A papaína, uma enzima de origem vegetal, vem sendo bastante utilizada por
profissionais de saúde como alternativa para o tratamento de feridas, principalmente por
29
s e cicatrizar feridas, acredita-se que esta planta atue sobre
a fase de
m responsáveis por validar sua utilização na medicina popular.
semi-árido nordestino,
pertencent
pequeno pepino. As folhas apresentam
bordos pon
et al.,
1990) , ant
m algumas condições atua como imunossupressora (rejeição de aloenxertos),
ais pela promoção de efeitos
seus efeitos antiinflamatórios e cicatrizantes. Em um estudo realizado por Rocha et al (2005)
foram verificados os efeitos cicatrizantes benéficos da ação da papaína sobre lesões
ulcerativas principalmente por facilitar a organização do tecido de granulação.
A Aloe Vera Linné, também conhecida como babosa, apresenta no parênquima
da sua folha (MCKEOWN, 1987), uma mucilagem com aspecto de gel incolor e que tem sido
utilizado para curar queimadura
neocapilarização, estimulando a liberação de fatores angiogênicos secretados
pelos macrófagos que estimulam a proliferação de células endoteliais dos vasos sangüíneos
(DORNELES et al., 2003).
Verifica-se, portanto, ampla atuação das plantas medicinais nos diferentes
protocolos empregados para avaliação de suas ações sobre o sistema imunológico. Muitos
desses trabalhos fora
2.5 Momordica charantia L.
A Mormordica charantia L. é uma trepadeira, comum no
ente à família Curcubitaceae sendo conhecida popularmente como melão-de-
São-Caetano (SOUZA, 2001). Todas as partes da planta possuem sabor amargo. Os frutos
são de formato retangular e se assemelham a um
tiagudos e irregulares (GROVER & YADAV, 2004) (Figura 3).
Esta planta é encontrada nas áreas tropicais da Ásia, América do Sul, Índia, África e
Caribe, onde vêm sendo cultivada e utilizada como um remédio popular para diversas
doenças (YESILADA et al., 1999; GROVER & YADAV, 2004).
Várias propriedades vêm sendo descritas tais como: hipoglicemiante (JAYASOORIYA
et al., 2000, VIRDI et al., 2003); antibacteriana (KHAN, 1998); antiviral (CUNNICK
i-HIV (AU et al., 2000), antitumoral (RIBAK et al., 1994, LEE-HUANG et al., 1995),
antiulcerogênica (GURBUZ et al., 2000), anti-helmíntica (YESILADA et al., 1999) e
imunomoduladora (LEUNG et al., 1987).
A M. charantia possui glicosídeos, saponinas, alcalóides, óleos fixos, triterpenos,
proteínas e esteróides que são responsáveis por suas ações biológicas (RAMAN & LAU,
1996).
Estudos têm demonstrado que a M. charantia apresenta um variável efeito no sistema
imune, e
porém em outras situações, esta planta exibiu atividade imunoestimulante. A atividade
imunosupressora tem sido atribuída a linfocitotoxicidade ou uma troca nos parâmetros
cinéticos da resposta imune. Contudo, acredita-se que a atividade imunoestimulante se deve
a um aumento na produção de interferon e atividade das células NK (LEUNG et al., 1987).
Em um estudo in vivo, extratos das folhas de M. charantia demonstraram habilidade
para aumentar a resistência contra as infecções vir
imunoestimulatórios tanto na prática clínica como no cenário experimental (CUNNICK et al.,
1990).
30
Figura 3. Momordica charantia L.
31
3. JUSTIFICATIVA
Com a evolução de pesquisas científicas demonstrando o amplo potencial do uso de
plantas medicinais em diversas atividades terapêuticas, abriu-se mercado para o
desenvolvimento de fitoterápicos seguros e eficazes, os quais futuramente, poderão vir a
substituir as drogas sintéticas, barateando assim, os custos para a sociedade.
O uso potencial de plantas medicinais com atuação sobre a resposta imune e sobre o
reparo tecidual na clínica médico-veterinária ainda é insignificante (NUNES-PINHEIRO et
al., 2003). No entanto, inúmeros estudos, t smas, como recursos
promissores em novos protocolos terapêuticos de doenças relacionadas ao sistema imune e
a regeneração cutânea (ENGEL & STARUSS, 2002).
Apesar de diversas atividades terapêuticas comprovadas, a ação dos extratos
hexânico e etanólico da folhas da M. charantia sobre a resposta imune in vivo é pouco
conhecida. Faz-se necessário, portanto, pesquisas que comprovem cientificamente se os
constituintes presentes na folhas desta planta interferem ou não sobre o sistema
imunológico e em caso de interferência, anseia-se descobrir se os extratos da planta atuam
como imunoestimulantes ou imunodepressores. Tendo como base esses conhecimentos, é
que se tornará possível à indicação ou a contra-indicação do uso destes extratos para a
população, de acordo com os quadros clínicos apresentados pelos pacientes.
êm considerado as me
32
4.1
animais imunizados com hemácias de
carne
4.2.4 Avaliar o processo de cicatrização através da aplicação tópica dos extratos hexânico e
tanólico de Momordica charantia L.em lesões cutâneas induzidas experimentalmente.
.2.5 Avaliar a atividade antioxidante dos extratos etanólico e hexânico de M.charantia.
4. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar a ação dos extratos hexânico e etanólico das folhas de Momordica charantia
L. sobre a resposta imune e a cicatrização em animais de experimentação.
4.2 Objetivos Específicos
4.2.1 Avaliar a produção de anticorpos específicos da resposta primária e secundária após
tratamento com os extratos hexânico e etanólico em
iro.
4.2.2 Avaliar a cinética da síntese de anticorpos específicos, IgG e IgE, em animais tratados
com os extratos etanólico e hexânico e imunizados com ovalbumina.
4.2.3 Avaliar o efeito modulador dos extratos etanólico e hexânico sobre a reação de
hipersensibilidade retardada.
e
4
33
MÉTODOS
Foram utilizados camundongos Swiss, entre 6 e 10 semanas de idade, ratos Wistar,
com idade superior a 6
ntral da
uanto os coelhos foram adquiridos em um
submetidos a um período de quarentena, no qual foram
s e observados quanto ao estado de saúde geral e só então, destinados à
5. MATERIAL E
5.1 Animais
meses e coelhos da raça Nova Zelândia, com idade de 2 a 6 meses,
todos machos (Figura 4). Os camundongos e os ratos foram oriundos do Biotério Ce
Universidade Federal do Ceará (UFC). Enq
estabelecimento comercial, sendo
vermifugado
realização dos experimentos.
(a) (b) (c)
o
Nova Zelândia
Os animais foram separados em grupos e mantidos no Laboratório de Imunologia e
ioquímica (LIBA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE), em caixas plásticas
ssépticas e ou gaiolas, no caso dos coelhos, sob condições adequadas de higiene, luz e
mperatura, recebendo ração comercial e água ad libitum.
O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
niversidade Estadual do Ceará.
.2 Material Vegetal
5.2.1 Coleta da Planta
As folhas de M. charantia foram coletadas pela manhã, nos meses de março, abril e
ida Carlos Jereissati, pelos arredores do Aeroporto Internacional de
eará (Figura 5).
Figura 4. Animais de experimentação. (a) Camundongo Swiss (b) Rato Wistar (c) Coelh
B
a
te
U
5
maio de 2005, na Aven
Fortaleza, C
34
Figura 5. Coleta da M. charantia
A identificação botânica da planta foi realizada no Herbário Prisco Bezerra do
Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará - UFC, onde foi depositada,
recebendo o “voucher” de número 32441.
5.2.2 Preparo dos extratos hexânico e etanólico das folhas de M.charantia
Os extratos hexânico e etanólico foram preparados a partir das folhas de M. charantia.
a
6).
As folhas foram mantidas em um local fresco e arejado por sete dias para secagem (Figur
(a) (b)
Figura 6. Folha
s de M. charantia: (a) frescas; (b) após secagem.
35
A seguir, as folhas secas foram pesadas e colocadas em um balão de vidro, de modo
que todo o material ficasse submerso em hexano. A mistura ficou em repouso por cerca de
sete dias para que se extraísse o princípio ativo das folhas. Em seguida, a solução
resultante (hexano + folhas) foi filtrada através de um funil. Esta sofreu um processo de
evaporação através de evaporador rotatório a 69°C e o extrato obtido foi colocado em
banho-maria, para total evaporação do solvente.
Para a obtenção do extrato etanólico, foi utilizado o resíduo obtido do extrato hexânico
após dois dias de repouso, tempo necessário para a evaporação do hexano residual e o
mesmo procedimento anterior foi realizado, exceto que o solvente utilizado foi o etanol e a
temperatura do evaporador rotatório subiu para 100°C, devido ao ponto de ebulição do
álcool ser superior ao do hexano
avaliação fitoquímica para detecção ou
não onóis,
avononas, flavanonóis, xantonas, esteróides, triterpenóides, saponinas, alcalóides, nos EE
e EH
.
5.2.3 Prospecção fitoquímica dos extratos hexânico e etanólico de M. charantia
Os extratos obtidos foram submetidos a uma
de fenóis, taninos, antocianidinas, antocianinas, flavonóides, catequinas, flav
fl
das folhas de M. charantia de acordo com a metodologia descrita por Matos (1997)
(Figura 7).
Fig harantia ura 7. Extratos Hexânico (EH) e Etanólico (EE) das folhas de M. c
36
antocianidinas, antocianinas e flavonóides, o tubo 2 foi
acidulado a pH 3 e o tubos 3 e 4 alcalinizados a pH 8,5 e 11, respectivamente. A
observação de mudança de coloração, no meio alcalino (pH 11) para vermelho laranja,
s
eriam indicadas pela mudança de coloração para vermelho em meio ácido, lilás no meio
ença ou ausência de flavonóis, flavononas, flavonónois e xantonas foi detectada
através do seguinte experimento: ao tubo 6 foram adicionados 0,5 g de magnésio granulado
ídrico concentrado, após o término da reação, a visualização da
mudança de coloração para vermelho indicaria a presença de flavonóis, flavononas,
flavonónois e xantonas.
A presença ou ausência de esteróides e triterpenóides foi determinada da seguinte
forma: o resíduo seco oriundo do tubo 6 foi extraído com 2 mL de clorofórmio, formando
uma solução que foi filtrada em um funil fechado com um fragmento de algodão, coberto
com 100 mg de sulfato de sódio anidro. O algodão embebido em sulfato de sódio foi
colocado em um tubo de ensaio e a este foi adicionado 1mL de anidrido acético e 3 gotas de
ácido sulfúrico concentrado. A mudança de coloração da solução de azul evanescente para
verde permanente indicaria a presença de esteróides livres, enquanto a mudança de
coloração para parda indicaria presença de triterpenóides.
A presença ou ausência de saponinas foi determinada a partir do resíduo insolúvel em
clorofórmio obtido do teste anterior. Este foi dissolvido em água destilada e filtrado para um
tubo de ensaio. O líquido obtido foi agitado por 3 minutos e a formação de espuma indicaria
a presenç rico
Um grama de cada extrato foi diluído em 200 mL de solução hidroalcoólica a 70%.
Cada solução foi dividida em porções de 4mL colocadas em 6 tubos de ensaio numerados e
duas porções de 10 mL colocados em béqueres rotulados previamente. Os béqueres foram
submetidos a banho-maria até a secagem e mantidos em dessecador até o seu uso. O
restante dos extratos foi concentrado em banho-maria até a obtenção de metade do volume,
o pH foi ajustado para 4 e o líquido obtido foi filtrado e reservado para a detecção de
alcalóides.
Para evidenciar a presença de fenóis e taninos, foram adicionadas três gotas de
solução alcoólica de cloreto férrico ao tubo 1, após o qual este foi agitado e a visualização
de mudança de coloração para azul ou vermelho indicaria a presençade fenóis, enquanto a
formação de precipitado escuro indicaria a presença de taninos.
Para detectar a presença de
indicaria a presença de flavononóis, enquanto a presença de antocianidinas e antocianina
s
alcalino (pH 8,5) e azul em pH 11.
A presença de catequinas foi detectada da seguinte forma: o tubo 5 foi acidulado pela
adição de ácido clorídrico a pH 1 a 3 e aquecido em uma lâmpada de álcool por 3 minutos.
A mudança de coloração para pardo-amarelado indicaria a presença de catequinas.
A pres
e 0,5 mL de ácido clor
a de saponinas. Para confirmação, foram adicionados 2 mL de ácido cloríd
37
ção éter-clorofórmio (3:1). A solução foi filtrada em funil de separação, obtendo-
da tubo foram adicionadas
tia pelo método de varredura do radical livre DPPH
ção da
DPPH a 6,5 x 10
-5
M em metanol. Em seguida foi adicionado ao
odulação in vivo por extratos
concentrado ao tubo que foi imerso em banho-maria a 70°C por 1 h, após o qual o líquido foi
neutralizado e agitado, de forma que a presença de precipitado e não formação de espuma
confirmaria a presença de saponinas.
A presença ou ausência de alcalóides foi determinada da seguinte forma: a 26 mL do
38
role – salina (0,9%); testes – EH (10 e 100 mg/Kg) e
s de sangue foram centrifugadas e os soros
btidos foram armazenados a –20°C para uso posterior. O título de anticorpos específicos
para
),
posteriormente, adicionou-se igual volume de hemácias de carneiro a 1 %. As placas foram
leveme
5.3.2 Imuni
hexânico e etanólico sobre a produção de anticorpos circulantes
e foram obtidas através do plexo retro-orbital (Figura
10) no dia 0 antes do tratamento e nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a imunização e
s dias 14 e 35 após a imunização inicial foram
plicados reforços nas mesmas condições da imunização inicial.
Camundongos de ambos os sexos foram divididos em sete grupos (n=10). Os
animais receberam, por via i.p, diariamente, por cinco dias consecutivos (DAVIS & KUTTAN,
2000), os seguintes tratamentos: cont
EE (10 e 100 mg/Kg); referência – ciclosporina (5mg/kg). Vale ressaltar, que a ciclosporina
como droga de referência foi administrada somente no 5º dia de tratamento, devido ao seu
potente efeito imunosupressor sobre os animais.
As hemácias de carneiro (HC) foram obtidas por punção da veia jugular de carneiros
oriundos da FAVET (Faculdade de Veterinária), armazenadas e mantidas em solução salina
estéril, após serem lavadas três vezes com salina apirogênica (NaCl, 0,9%) e ajustadas na
concentração 20% para imunização. No dia zero, os camundongos foram imunizados com
20μl de uma suspensão de hemácias de carneiro intraperitonealmente (i.p) e as amostras de
sangue foram coletadas através do plexo retroorbital no dia 7 para a obtenção dos títulos de
anticorpos primários (IgM) e no dia 14 para os títulos de anticorpos secundários (IgG).
(SARANG et al., 2005). No sétimo dia, foi administrado um reforço, nas mesmas condições
do protocolo de imunização inicial. As amostra
o
HC foi determinado pelo método da hemaglutinação. Para tanto, uma alíquota de 50
µL do soro de cada animal foi diluído em série em salina em placas de 96 poços (Figura 11
nte agitadas por cerca de 5 minutos e incubadas a 37°C por 1 hora. A reação de
aglutinação foi observada ao microscópio óptico e o título de anticorpos de cada animal foi
expresso como o título da maior diluição positiva, em logaritmo na base 2 (log
2
).
zação de camundongos com ovalbumina e os efeitos dos extratos
Para analisar a capacidade imunoreguladora dos extratos etanólico e hexânico de M.
charantia, grupos de animais (n=10) foram imunizados no dorso por via subcutânea com 0,1
mL de uma mistura contendo o antígeno OVA (10 μg) e 1,0 mg do adjuvante (gel de
hidróxido de alumínio) dissolvidos em salina esterilizada (Pan et al., 2005) (Figura 9). Os
animais receberam previamente a imunização, os seguintes tratamentos, via i.p., por 5 dias
consecutivos: controle – salina (0,9%); testes – EH ( 10 e 100 mg/Kg ) e EE ( 10 e 100
mg/Kg) (Figura 8). Amostras de sangu
centrifugados para obtenção de soro imune, a fim de dosar IgG e IgE pela técnica de
anafilaxia cutânea passiva (PCA). No
a
39
(a) (b)
Figura 8. Tratamentos (a) Grupos de animais (b) Administração intraperitoneal
(a) (b)
Figura 9. Imunização com o antígeno (a) Ovalbumina + adjuvante (b) Admninistração via
subcutânea no dorso dos animais
(a)
(b)
Figura 10. (a) Coleta de sangue (b) Retração do coágulo
40
(a) (b)
Figura
5
O método utilizado para as reações de anafilaxia cutânea passiva (PCA) foi descrito
por Ovary (1952) e modificado por Mota & Wong (1969).
Para a detecção de IgG por anafilaxia cutânea passiva foram utilizados
camundongos e para detecção de IgE, foram usados ratos velhos (mais de 6 meses de
idade). Após a depilação do dorso dos animais, foram injetados os soros diluídos. Em cada
camundongo, foram injetados 4 soros, já nos ratos, foram marcadas três fileiras, e em cada
uma foram injetadas 8 soros (24 diluições de soro /animal). As PCAs foram realizadas em
duplicata. Após 2 e 18h foi injetado por via endovenosa a ovalbumina associada ao corante
azul de Evans. A detecção de IgG e IgE foi determinada pelo grau de extravasamento do
corante azul de Evans
Os títulos de PCA correspondem ao logaritmo na base 2 do inverso da diluição
A - Detecção de IgG em camundongos por Anafilaxia Cutânea Passiva
Os testes para determinação qualitativa e quantitativa de IgG foram feitos em
41
Figura 12 . Anestesia em câmara de éter e depilação do dorso do animal
42
Figura 15. Extensão da pele para leitura da reação
B - Detecção de IgE em ratos por Anafilaxia Cutânea Passiva
A reação de anafilaxia cutânea passiva foi usada para a dosagem qualitativa e
quantitativa de anticorpos IgE, como descrito por Mota & Wong (1969).
Foram feitas diluições seriadas das misturas dos soros dos diferentes grupos de
ratos imunizados com OVA. Estas diluições foram injetadas, em volume de 0,1 mL, no dorso
de ratos previamente depilados (Figura 17) de modo a obter uma pequena pápula. Após 18 -
24 horas, os ratos foram desafiados por via endovenosa, com uma suspensão do antígeno
específico para os anticorpos em solução de Evans 0,5% (Figura 18). A quantidade do
antígeno utilizada para o desencadeamento da PCA foi de 1,0 mg. Os ratos foram
sacrificados 30 minut
Os animais for ura 16).
os mais tarde e a leitura das reações foi realizada na pele dissecada
invertida, feita através de manchas azuladas provocadas pelo extravasamento do corante
nos sítios de injeção das diluições dos soros contendo anticorpos a serem detectados.
am previamente anestesiados em câmara de éter (Fig
Figura 16. Anestesia de rato Wistar em câmara de éter
43
Figura 17. Tricotomia para injeção das diluções dos soros no dorso do animal
Figura 18. Desencadeamento da PCA via peniana
44
(a) (b)
Figura 19. PCA em ratos Wistar (a) Positiva (b) Negativa
5.4 Imunização de coelhos com derivado de proteína purificada (PPD) e os efeitos dos
extratos hexânico e etanólico de M. charantia sobre a reação de hipersensibilidade
retarda
Para avaliação da resposta imune celular, os animais foram previamente imunizados
om 0,1 ml de um derivado proteíco purificado de tuberculina (PPD) (Ministério da
Brasil), por via subcutânea, no dia 1 (D1) do ensaio experimental.
Os tratamentos tiveram início no D1, duas horas após a imunização dos animais e se
estenderam por 14 dias consecutivos, sendo administrados por via oral através da utilização
de um sonda orogástrica (Figura 20) somente uma vez ao dia, no período matutino, sendo 5
ml/animal. Os animais foram divididos em 6 grupos (n=3), os quais receberam os seguintes
tratamentos: um grupo serviu como controle, recebendo apenas solução salina a 0,9%, a
outro, foi ministrado, o extrato etanólico na dose de 10 mg/kg, o terceiro grupo, recebeu o
extrato etanólico na dose de 100 mg/kg. O quarto e o quinto grupos receberam o extrato
hexânico, nas doses de 10 e 100 mg/kg, respectivamente. A droga de referência utilizada foi
o levamisol (20 mg/kg), sendo esta destinada ao tratamento do sexto grupo.
da (RHR)
c
Agricultura,
Figura 20. Sonda orogástrica
45
No dia 14, foram injetados no dorso dos animais 0,1 ml de PPD (0,5 mg mL
–1
) por
via intradérmica, paralelamente à coluna vertebral do lado direito, entre a escápula e a
tuberosidade ilíaca. Para efeito comparativo, no lado esquerdo, foi injetada, salina a 0,9%,
em um ponto correspondente ao contra-lateral. Vale ressaltar, que essas regiões foram
submetidas a uma tricotomia prévia. A reação de hipersensibilidade retardada foi
determinada pela diferença do grau de endurecimento da pele entre o lado direito (teste) e o
esquerdo (controle), após 24, 48 e 72 horas do desafio, através de um paquímetro digital,
modelo Hauptner nº 33865 (KENNETH, 1982).
5.5 Indução de lesões cutâneas experimentais em coelhos e o efeito da aplicação
tópica dos extratos hexânico e etanólico de Momordica charantia L. sobre a migração
Para a produção das eral
dos e a sua duração foi de aproximadamente duas horas (Figura 21).
celular
em cora a dossofres foan (tsotog
46
nestésico, similar ao utilizado para indução
as feridas, para a secção das lesões, as quais foram encaminhadas para análise
bebidas em parafina e secções de 4 μm de espessura foram preparadas. As
minas foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e observadas ao microscópio óptico
luz
é o
14, considerando os seguintes parâmetros: edema, hiperemia e presença de exsudato.
Realizou-se também a mensuração do halo da ferida no dia da indução da ferida no 4° (D4)
e 14° (D14) dias após a indução, através da colocação de plástico transparente sobre a
ferida e demarcação com caneta de retroprojetor, submetendo-se este traçado a
mensuração com planímetro, com 3 repetições de cada medida (MARTINS et al., 2003).
5.6 Análise estatística
Todos os resultados obtidos foram submetidos ao programa estatístico STATVIEW
(1992-1998, SAS Inc Instituto), sendo expressos como média e desvio padrão.
Para análise da titulação de anticorpos específicos para hemácias de carneiro e para
os títulos de PC e em seguida,
submetidos a análise variância (ANOVA) ao teste t-Student, ao nível de 5% de
signific
Para o tratamento das lesões, preparou-se um unguento, obtido pela mistura de 10 e
20% dos extratos etanólico ou hexânico de M. charantia com uma base de lanolina e
vaselina (2: 1) (Farmácia de manipulação Ethicall). Em cada ferida, aplicou-se topicamente e
de forma padronizada: CRD e CRE (base), CND e CNE (extratos hexânico e ou etanólico a
10% + base), CDD e CDE (extratos hexânico e ou etanólico a 20% + base) (DORNELES et
al., 2003). Cada tratamento foi administrado uma vez ao dia no mesmo horário. As feridas
do lado direito foram tratadas por 4 dias e as do lado esquerdo por 14 dias. Após 4 e 14
dias, procedeu-se a realização do protocolo a
d
histológica. Para tanto, as lesões foram inicialmente submetidas a fixação em formol
tamponado a 10% por 6 horas, seguida de desidratação em álcool a 70%. As amostras
foram em
lâ
de comum. Foram avaliados três sítios de cada corte histológico, visando avaliar a
qualidade de epitelização dos diferentes tratamentos através da quantificação das células
mononucleares inflamatórias, fibroblastos e vasos (1000X) (DALAZEN et al., 2005).
As lesões foram também submetidas à avaliação macroscópica diária at
D
A anti-OVA, os resultados foram transformados em logaritmo
e
ância.
Os valores da reação de hipersensibilidade retardada e da retração da área da
ferida (mm) foram avaliados através da análise variância (ANOVA) e posteriormente
sumetidos ao teste t-Student. Já os resultados da contagem de células e vasos de 3 áreas
de cada lesão foram tabulados e analisados através do teste estatístico de Kruskall Wallis.
As diferenças significativas foram consideradas como (P< 0,05).
47
6. RES
o EH
prese ou ma
(mg/mL) (IV%)
ULTADOS
6.1 Prospecção Fitoquímica
O estudo fitoquímico revelou a presença de esteróides e a ausência para alcalóides,
saponinas, catequinas, taninos, fenóis, flavonas, flavonóis, leucoantocianidinas, xantonas,
triterpenóides e resinas em ambos os extratos.
6.2 Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de
Momordica charantia L. pelo método de varredura do radical livre DPPH
Os resultados demonstraram que o EE das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5
e 10 mg/mL apresentaram índice de varredura (IV) de 28,66%; 38,73% e 39,75%,
respectivamente. O EH das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg/mL
apresentaram IV de 40,07%; 76,64% e 79,79%, respectivamente. Os grupos controle BHT e
quercetina apresentaram IV de 90,89% e 90,32%, respectivamente.Portanto,
a nt ior poder antioxidante que o EE.
Tabela 1. Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos das folhas de
Momordica charantia L. pelo método de varredura do radical livre DPPH.
Amostras Dose Índice de varredura
2 28,66
5 38,73
EE
trole positivo)
0,5% 90,32
10 39,75
2 40,07
5 76,64
EH
10 79,79
BHT (controle positivo)
0,5% 90,89
Quercetina (con
6.3 Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre o título de anticorpos
específicos anti-hemácias de carneiro em camundongos
48
ostra o efeito dos tratamentos com EH e EE de M. charantia, nas doses
e 10 e 100 mg/kg sobre os títulos de anticorpos primários e secundários induzidos pela
arneiro (HC). O título da reação de hemaglutinação foi usado
ara avaliar a resposta imune humoral.
de 159,93 ± 1,97 e 164,95 ± 1,12,
spectivamente. Já nos grupos tratados com EE nas doses de 10 e 100 mg/kg, os títulos
e 82,51 ± 1,63
para o controle, os títulos atingiram uma média de 103,78 ± 0,94.
Na avaliação da resposta imune secundária no D14, sete dias após o reforço,
o EE, os títulos foram de 318,16 ± 2,22 e 323,45 ± 1,11, nas doses
de 10 e 10 pectivamente. O grup role apresentou ,99
± 1,11 enquanto que para a CSA, os títulos 33 ± 2,09.
Com base nos resultados, pode-se afirmar que no D14 os níveis de anticorpos dos
grupos tratados com o EH a 10 e a 100 mg/kg aumentaram significativamente (P<0,05),
diferindo do controle, não havendo diferença entre as doses analisadas (P 0,05). Com
relação à droga de referência imunossupressora, verificou-se que esta inibiu
significativamente o título de anticorpos em relação ao grupo controle. Os grupos tratados
com EE em ambas concentrações mantivera s de anticorpos semelhantes ao
controle (P
grupos
atisticamente (P<0,05), no tocante aos intervalos de tempo analisados dentro de
A Tabela 2 m
d
imunização com hemácias de c
p
Na avaliação da resposta imune primária através da produção de anticorpos
específicos anti-HC, os grupos que receberam tratamento com EH nas doses 10 e 100
mg/kg, apresentaram títulos de anticorpos
re
encontrados, foram de 119,96 ± 0,61 e 124,03 ± 1,08, respectivamente. No grupo tratado
com a ciclosporina (5mg/kg, droga de referência), verificou-se uma titulação d
e
Desta forma, no D7 após a imunização, verificou-se que não houve diferença
significativa (P>0,05), no título de anticorpos primários (TAP) nos animais tratados com EE
nas concentrações de 10 e 100 mg/kg em relação ao grupo controle. Já os animais tratados
com EH em ambas concentrações produziram um aumento significativo (P<0,05) do título de
anticorpos específicos anti-HC, enquanto que ciclosporina reduziu estes títulos
significativamente (P<0,05) em comparação ao controle.
observou-se que os títulos de anticorpos secundários (TAS), nos grupos tratados com EH
nas doses de 10 e 100 mg/kg, corresponderam a 369,16 ± 1,67 e 378,09 ± 1,14,
respectivamente. Para
0 mg/kg, res o cont uma titulação de 305
foram de 2
>
m os título
>0,05).
Comparando-se os TAP (D7) e os TAS (D14), observou-se que todos os
diferiram est
cada grupo.
49
Tabela
anticorpos
2. Efeito do EH e EE de Momordica charantia L. sobre os títulos de anticorpos
específicos anti-HC.
Título de
TAP (D7) TAS (D14)
Tratamento
Dose (mg/kg)
i.p.
X ± D.P X ± D.P
Controle
- 103,78 ± 0,94
a,A
305,99 ± 1,11
a,B
10 159,93 ± 1,97
b,A
369,16 ± 1,67
b,B
EH
100 164,95 ± 1,12
b,A
378,09 ± 1,14
b,B
10 119,96 ± 0,61
a,A
318,16 ± 2,22
a,B
EE
100 124,03 ± 1,08
a,A
323
HC
,45 ± 1,11
a,B
CSA
5 82,51 ± 1,63
b,A
233,83 ± 2,09
b,B
Dados representados em média e desvio padrão (n=10).
a,b P<0,05 significativamente diferente do grupo controle.
A,B P<0,05 diferença estatística entre os intervalos de tempo analisados dentro de cada grupo.
TAP, Título de anticorpos primários; TAS, Título de anticorpos s
ecundários.
de IgG anti-OVA que foi
detecta
E em ambas concentrações mantiveram títulos de anticorpos IgG anti-
OVA si
No D14 os animais receberam um 1° reforço do antígeno, sendo o
rpos do grupo controle de 2,81 ± 0,02. Para o EH nas doses de 10 e 100
ulos foram de 3,45 ± 0,02 e de 3,52 ± 0,02, respectivamente. Já para o EE nas
0 e de 100 mg/kg, os títulos ficaram em torno de 3,21 ± 0,02 e de 2,99 ± 0,06,
respectivamente.
6.4 Efeito do EH e do EE sobre a produção de anticorpos específicos anti-OVA
Os títulos de PCA para a detecção de IgG e IgE anti-OVA estão apresentados nos
gráficos 1, 2, 3 e 4, e foram expressos como logaritmo na base 2.
Os gráficos 1 e 2 demonstram a cinética da síntese
da a partir do D7. Os títulos de anticorpos encontrados no D7 para o grupo controle
foram de 2,23 ± 0,06. Nos grupos tratados com EH nas doses de 10 e 100 mg/kg, verificou-
se um titulação de 2,74 ± 0,06 e 2,75 ± 0,01, respectivamente. Para o EE, os títulos
respectivos a estas concentrações, foram de 2,53 ± 0,01 e 2,31 ± 0,01. Desta forma,
verificou-se um aumento significativo (P<0,05) dos títulos de anticorpos anti-OVA nos grupos
tratados com o EH nas concentrações de 10 e 100 mg/kg em relação ao controle. Os grupos
que receberam o E
milares ao controle (P>0,05).
No D14 houve um aumento significativo (P<0,05) do título de anticorpos IgG anti-
OVA em relação ao D7.
título de antico
mg/kg, os tít
doses de 1
50
mento. Os títulos para o controle foram de 3,45 ± 0,06. O EH e o EE,
as doses de 10 e 100 mg/kg apresentaram títulos de 4,30 ± 0,03, 4,39 ± 0,04, 3,57 ± 0,06,
3,57 ± 0,04, respectivamente. tam uma diferença significativa do EH
em ambas concentrações em o con ,05).
Acompanhando a cinética de IgG anti-OVA, verificou-se que do D21 para o D28
houve um aumento significativo (P<0,05) no título destes anticorpos. No D28 a titulação para
o grupo controle foi de 5,23 ± 0,05 EH e d sentaram
títulos de 6,28 ± 7, 6,39 ± 0,0 86 ± 0 te. Como
verificado anteriormente, apenas o EH nas du e estimulou
um aumento no título de anticorpo 0,05), s
grupos tratados com o EE foram simi es ao co
Do D28 para o D35 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis (P>0,05). No
tígeno, sendo os títulos de anticorpos
as concentrações de 10 e 100mg/kg,
0,04,
7,18 ± 0,02 e na dose
mg/kg o título encontrado foi de 7,20 ± 0,05, no entanto os grupos tratados com este
xtrato mantiveram títulos que não diferem estatisticamente dos encontrados para o grupo
No D42 houve um aumento significativo (P<0,05) no título de IgG anti-OVA, sendo
9,74 ±
No D21 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis em relação ao D14 (P>0,05)
independente do trata
n
Esses resultados deno
relação ao grup trole (P< 0
. O o EE nas doses e 10 e 100, apre
0,0 6, 5, 0,03 e 5,99 ± 0, 6, respectivamen
as concentrações studadas é que
s (P< enquanto que o títulos verificados para os
lar ntrole.
D35, os animais receberam o 2° reforço com o an
encontrados para o controle de 6,20 ± 0,08. O EH n
diferiu significativamente do controle, apresentando títulos de 7,76 ± 0,05 e 7,97 ±
respectivamente. O EE na dose de 10 mg/kg apresentou um título de
de 100
e
controle (P>0,05).
alcançado o pico máximo da síntese de anticorpos. Os títulos de anticorpos chegaram a
0,07 para o grupo tratado com EH 10, 9,98 ± 0,08 para o grupo tratado com EH 100.
Nos grupos tratados com EE 10 e EE 100, a titulação foi de 9,30 ± 0,07 e 9,68 ± 0,06,
respectivamente. No grupo controle, o título foi de 8,07 ± 0,02. Como aconteceu nos
intervalos de tempo anteriores, o EH apresentou efeito imunoestimulatório em relação ao
controle, independente da dose. Entretanto, o EE não apresentou comportamento
imunomodulador, pois os níveis de anticorpos não diferiram estatisticamente daqueles
apresentados pelo grupo controle.
51
Gráfico 1. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos
tratados com EH.
Gráfico 2. Cinética da síntese de IgG sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos
tratados com EE.
5
obre a síntese de anticorpos IgE anti-OVA em ratos. A IgE foi detectada
omente a partir do D14 em todos os grupos que foram sensibilizados. Neste intervalo de
mpo, o título de anticorpos encontrado para o grupo controle foi 4,23 ± 0,01. Para o EH
nas doses de 10 e 100 mg/kg, os títulos de anticorpos determinados por PCA foram de 5,14
± 0,07 e 5,27 ± 0,04, respectivamente, enquanto que para o EE, nas mesmas doses, os
títulos foram de 4,99 ± 0,06 e 5,02 ± 0,03, respectivamente. Desta forma, verificou-se que
houve um aumento significativo (P<0,05) nos títulos de IgE em relação ao controle nos
grupos tratados com o EH.
Com a administração de um reforço no D14, os títulos de anticorpos IgE anti-OVA
aumentaram significativamente (P<0,05) no D21. Os valores encontrados para o controle,
EH a 10 e 100 mg/kg e EE nas mesmas doses foram de 5,42 ± 0,05, 6,54 ± 0,05, 6,72 ±
0,07, 6,30 ± 0,05 e 6,50 ± 0,04, respectivamente. Analisando estatisticamente estes dados
verificou-se que apenas o EH independente da dose, diferiu do grupo controle, induzindo um
aumento significativo na titulação de IgE anti-OVA (P<0,05).
No D28 os títulos de anticorpos permaneceram estáveis (P>0,05) em relação ao
D21. O EH nas doses 10 e 100 mg/kg apresentaram títulos de 7,07 ± 0,05 e 7,30 ± 0,04,
respectivamente. Para o EE os títulos foram de 6,41 ± 0,05 e 6,56 ± 0,08, respectivament
para as doses de 10 e 100 mg/kg, enquanto que o controle apresentou uma titulação para
do EH continuou a ocorrer, bem como EE continuou a não diferir
estatisticamente do controle, independente da dose estudada. Do D28 para o D35, a curva
de IgE apresentou um decréscimo significativo (P<0,05), tendo os títulos do grupo controle,
EH e EE nas doses de 10 e a 100 mg/kg apresentado os seguintes valores 4,68 ± 0,06, 5,82
± 0,02 5,79 ± 0,03 5,07 ± 0,04 e 5,28 ± 0,02, respectivamente.
No D35, foi administrado um 2° reforço com o antígeno específico. Verificou-se que
após este reforço, os títulos de anticorpos voltaram a aumentar, alcançando o máximo da
síntese de anticorpos IgE anti-OVA no D42. O título máximo alcançado foi 9,70 ± 0,03 sendo
verificado no grupo tratado com o EH100, seguido pelo EH10, com um título de 9,53 ± 0,08,
no entanto não houve diferença significativa entre as doses do tratamento com EH. Os
títulos para o EE nas doses de 10 e 100 mg/kg foram 8,08 ± 0,05 e 8,49 ± 0,09,
respectivamente, enquanto o controle apresentou um título de 7,88 ± 0,08. Diante dos
resultados, mais uma vez, o EH demonstrou capacidade em aumentar o título de anticorpos
em relação ao controle (P<0,05).
Diante das evidências, sugere-se que o EH apresenta efeito imunoestimulatório de
IgE sérica anti-OVA independente da dose, enquanto que o EE não causou mudança
significativa no título de anticorpos em relação ao grupo controle (P>0,05).
2
Os gráficos 3 e 4 nos mostram o efeito do tratamento com EH e EE de M. charantia
espectivamente, s
r
s
te
e
IgE anti-OVA de 5,79 ± 0,08. Como verificado anteriormente, o mesmo comportamento
imunoe timulatório
s
53
Gráfico 3. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos
tratados com EH.
Gráfico 4. Cinética da síntese de IgE sérica anti-OVA avaliada por PCA em camundongos
tratados com EE.
nimais imunizados com derivado de proteína purificada (PPD)
A Tabela 3 mostra o efeito dos tratamentos com EH e EE de M. charantia sobre a
RHR em coelhos imunizados com PPD no D14 após a imunização.
No tempo de 24 h após o desafio, o grupo controle apresentou, um resultado de RHR
expresso como média e desvio padrão, em torno de 2,90 ± 0,05 mm. Nos grupos tratados
com o EH nas concentrações de 10 e 100 mg/kg, obteve-se como resultado da reação, 5,59
± 0,09 e 5,88 ± 0,09 mm, respectivamente. Para EE nas doses de 10 e a 100 mg/kg, os
valores foram de 3,37 ± 0,09 e 3,45 ± 0,12 mm, respectivamente. Já para a droga de
referência (levamisol - 20mg/kg), o valor obtido foi 6,01 ± 0,10 mm. Verificou-se que nos
grupos tratados com EH em ambas concentrações e com a droga de referência
imunoestimulatória houve uma RHR mais acentuada, diferindo estatisticamente do controle
(P<0,05).
De 24 para 48 h, houve um aumento significativo (P<0,05) da resposta imune celular
eterminado pelo aumento da RHR, sendo alcançado seu valor máximo. No tempo de 48 h
pós a inoculação do PPD, o valor encontrado para o grupo controle foi de 3,68 ± 0,20 mm e
e 7,10 ± 0,15 e 7,19 ± 0,09 mm, respectivamente. O EE nas doses
de 10 e 100 mg/kg apresentou uma reação de 4,35 ± 0,12 e de 4,32 ± 0,08 mm,
respectivamente. Observou-se que o EH, bem como o levamisol, estimulou a RHR em
relação ao controle (P<0,05).
No tempo de 72 h o valor da reação encontrada para o grupo controle foi de 3,28 ±
0,14 mm. O EH nas doses de 10 e 100 mg/kg aumentaram significativamente a RHR
(P<0,05), com resultados de 5,98 ± 0,05 e 5,96 ± 0,05 mm, respectivamente. O valor
referente ao levamisol foi de 6,70 ± 0,07 mm, que por sua vez, também diferiu do grupo
controle. Já o EE na dose de 10 mg/kg apresentou um valor reacional de 3,89 ± 0,08 mm
enquanto o EE100 apresentou uma reação de 3,94 ± 0,07 mm.
Portanto, os tratamentos a base de EH e da droga imunoestimulatória induziram um
aumento significativo na RHR (P<0,05) em relação ao controle em todos os intervalos de
tempo analisados, sendo este aumento mais pronunciado com 48 h.
54
6.5 Efeito do EH e do EE sobre a reação de hipersensibilidade retardada (RHR) em
54
a
d
a
para o grupo tratado com levamisol foi de 7,20 ± 0,10 mm. O EH a 10 e a 100 mg/kg
apresentou uma RHR d
55
Tabela 3. Efeito do EH e do EE sobre a RHR em coelhos imunizados com PPD.
RHR (mm)
24 h 48 h 72 h
T
X ± D.P
ratamento
Dose
(mg/kg i.p.)
X ± D.P X ± D.P
Controle
2,90 ± 0,05
a,A
3,68 ± 0,20
a,B
3,28 ± 0,14
a,B
10
5,59 ± 0,09
b,A
7,10 ± 0,15
b,B
5,98 ± 0,05
b,B
EH
100
5,88 ± 0,09 7,19 ± 0,09 5,96 ± 0,05
a,A a,B a,B
b,A b,B b,B
10
3,37 ± 0,09
a,A
4,35 ± 0,12
a,B
3,89 ± 0,08
a,B
EE
100
3,45 ± 0,12 4,32 ± 0,08 3,94 ± 0,07
Levamisol
20
6,01 ± 0,12
b,A
7,20 ± 0,10
b,B
6,70 ± 0,07
b,B
sentados em média e desvio padrão (n=3).
a,b P<0,05 si
A,B P<0,05 diferen s
nas concentrações de 10 e 20% obedeceram a mesma
seqüên
hiperemia e presença de exsudato foram discretos nas feridas tratadas com o extrato
nos dias iniciais após a indução das feridas experimentais, fazendo-se necessário um maior
e um colar em torno do
pescoço de cada animal, além de permanecerem alojados em gaiolas individuais.
Dados repre
gnificativamente diferente do grupo controle.
ça estatística entre os intervalos de tempo anali ados dentro de cada grupo.
6.6 Efeito da aplicação tópica do EH e do EE de Momordica charantia L. em lesões
cutâneas experimentais em coelhos
A avaliação macroscópica foi realizada diariamente até o D14. Nesse estudo foi
observado que as lesões teciduais experimentais nos grupos controle e tratados com o EE
de Momordica charantia L.
cia de eventos dependente do tempo. No entanto, os grupos tratados com EH a 10 e
20%, apresentaram uma evolução cicatricial mais precoce em relação ao controle. No
decorrer de toda a investigação observou-se que os sinais de inflamação como edema,
hexânico adicionado ao unguento. Nos animais tratados com unguento associado ao extrato
etanólico, contatou-se moderada exsudação a partir do quarto dia permanecendo até o
último dia analisado (14° dia).
Nos exames físicos diários foram observadas manifestações de dor e inapetência
cuidado na manipulação dos coelhos, para que estes, não interferissem na aplicação e
manutenção dos tratamentos sobre as lesões, desta forma, utilizou-s
56
Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre a retração da
rea (mm) do processo inflamatório.
a (mm)
á
Áre
D4 D14
Tratamentos
ão
X
Controle
,1
a,A
8
a,B
Concentraç
%
(X ± D.P) ( ± D.P)
- 2 3 ± 0,06 2,7
± 0,06
10 2,5
b,A b,B
,6
b,A
0
b,B
,1
a,A
8
a,B
Ungüento
(Lanolina -
Glicerina 2:1)
,2 6
8 ± 0,08 3,37 ± 0,09
EH
20 2 9 ± 0,17 3,5
± 0,12
10 2 7 ± 0,05 2,8 ± 0,10
EE
20 2 1 ± 0,11
a,A
2,9 ± 0,10
a,B
Dados representados em média e desvio padrão (n=3).
a,b P< 0,05 significativamente diferente do grupo controle.
A,B P< 0,05 diferença estatística entre os intervalos de tempo analisados dentro de cada grupo.
A Tabela 4 demonstra os efeitos do EH e EE das folhas de M. charantia sobre a área
No D4, o grupo controle apresentou uma área de retração correspondente a 2,13 ±
0,06 m
e a 20%, os resultados foram de 2,88 ± 0,10 e 2,96 ± 0,10
respec
evoluído
de retração de lesões cutâneas determinada pela mensuração do halo da ferida após 4 (D4)
e 14 (D14) dias de tratamento.
m. Os grupos tratados com os ungüentos a base do EH a 10 e a 20%, apresentaram
valores de 2,58 ± 0,08 e 2,69 ± 0,17mm, respectivamente. Os ungüentos a base de EE nas
mesmas concentrações induziram retração de 2,17 ± 0,05 e 2,21 ± 0,11 mm,
respectivamente. Pode-se verificar que o ungüento associado ao EH, independente da dose,
provocou uma retração significativa (P<0,05) na área das lesões induzidas
experimentalmente em relação ao controle.
No D14, o grupo controle apresentou como média de retração 2,78 ± 0,06 mm. Os
grupos tratados com o ungüento a base do EH a 10 e a 20% apresentaram uma área de
retração de 3,37 ± 0,09
e 3,50 ± 0,12 mm, respectivamente. Para as lesões tratadas com
ungüentos a base de EE a 10
tivamente. Desta forma, também foi verificada uma retração da ferida mais
significativa nos grupos tratados com EH a 10 e a 20% em relação ao controle.
Com base nos resultados do estudo morfométrico pela mensuração do halo da
ferida, observou-se que no D14 o processo de cicatrização tecidual havia
57
significativamente em comparação ao D4, já que a área de retração das feridas foi
significativamente maior neste interv
alo de tempo (P<0,05). Diante dos dados obtidos,
ugere-se que o EH é capaz de aumentar o estímulo para que ocorra a regeneração
cutânea, atuando desta forma como agente estimulante da ci ntretanto o EE não
foi capaz de ntração
A contagem de células mononucleares, fibroblastos e vasos sanguíneos na região da
lesão para todos os tratamentos avaliados está apr as Ta e 7 e na
Figura 22. As células sangu os foram avé io de três
campos histológicos em aumento de 100
Tabela tratamentos com os ungüentos à base
mononucleares.
N° células mononucleares
s
catrização, e
favorecer a co das lesões.
esentada n belas 5, 6
e os vasos íne contados atr s do somatór
X.
5. Efeito dos de EH e EE sobre as células
Tratamentos
Concentração
%
(X ± D.P)
D4 D14
Controle
- 32,66 ± 0,83 12,12 ± 0,14
10 14,83 ± 1,52* 4,20 ± 0,18**
EH
20 13,45 ± 1,62* 4,33 ± 0,13**
ngüento
(Lanolina -
Glicerina
2:1)
10 27,12 ± 1,00 10,40 ± 0,10
U
EE
20 28,35 ± 1,75 10,83 ± 0,07
Dados representados em média e desvio padrão (n=3).
*Diferença estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 4 dias.
**Diferença estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 14 dias.
Em relação às células mononucleares no D4, a média do somatório de três campos
histológicos foi de 32,66 ± 0,83, para o tratamento controle, 14,83 ± 1,52 para a lesão
tratada com EH10 e 13,45 ± 1,62
para aquela tratada com EH20. A contagem destas células
na lesão tratada com o EE a 10 e a 20% foi de 27,12 ± 1,00 e 28,35 ± 1,75 células,
respectivamente. No D14, a lesão controle apresentou 12,12 ± 0,14 células, enquanto a
ferida cutânea que recebeu o EH10 e o EH20, apresentou 4,20 ± 0,18 e 4,33 ±
0,13 células,
respec
tivamente. Já para as lesões tratadas com EE10 e o EE20, foram contadas 10,40 ±
0,10 e 10,83 ± 0,07 mononucleados, respectivamente.
58
A Tabela 5 indica que o ungüento que demonstrou capacidade de estimular a
resposta inflamatória, fazendo com que esta ocorra mais precocemente, foi aquele
associado ao extrato hexânico em ambas concentrações, já que este gerou uma redução
significativa na quantidade de células mononucleares em relação ao controle nos dois
intervalos de tempo analisados. A diminuição do
número de células mononucleares também
é estat
s ungüentos à base de EH e EE sobre os
broblastos.
N° fibroblastos
isticamente significante (P<0,01) quando avaliada entre os tempos 4 e 14 dias do
mesmo grupo.
Tabela 6. Efeito dos tratamentos com o
fi
(X ± D.P)
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 26,00 ± 2,25 23,33 ± 1,20
10 20,90 ± 0,86 14,66 ± 1,16*
20 21,43 ± 1,28 16,16 ± 1,23*
10 21,84 ± 0,83 22,55 ± 1,37
Ungüento
(Lanolina-
EE
20 22,46 ± 1,02 21,98 ± 1,93
EH
Glicerina
2:1)
os representados em média e desvio padrão (n=3).
a estatisticamente significativa (P<0,01) em relação ao grupo controle no tempo de 14 dias.
10 e a 20% apresentaram 20,90 ± 0,86 e 21,43 ± 1,28 fibroblastos, respectivamente. Já nas
lesões
o ungüento a base de EH a 10 e a
20% em relação ao controle no tempo de 14 dias.
Dad
*Diferenç
No tocante a quantificação de fibroblastos observou-se que no D4, a lesão controle
apresentou 26 ± 2,25 fibroblastos, enquanto aquelas tratadas com ungüento a base do EH a
tratadas com ungüento a base do EE a 10 e a 20% contou-se 21,84 ± 0,83 e 22,46 ±
1,02 células. No D14, foram achados 23,33 ± 1,20 fibroblastos, para a lesão controle e uma
média de 14,66 ± 1,16 e 16,16 ± 1,23 para os grupos que receberam o ungüento associado
ao EH a 10 e a 20%, respectivamente. Já para os grupos que receberam o ungüento
associado ao EE a 10 e a 20%, a quantificação de fibroblastos revelou valores de 22,55 ±
1,37 e 21,98 ± 1,93 respectivamente.
Os dados expressos na Tabela 6 revelam que houve redução significativa (P< 0,01)
no número de fibroblastos entre os grupos tratados com
59
Tabela 7. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base de EH e EE sobre a formação
dos vasos sangüíneos.
N° vasos sanguíneos
(X ± D.P)
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 7,23 ± 0,50 6,78 ± 0,70
10 6,48 ± 0,56 4,96 ± 0,67*
EH
20 6,74 ± 0,40 5,03 ± 0,42*
10 6,97 ± 0,72
ento
(Lanolina-
Glicerina
2:1)
E
6,39 ± 0,7 3 ± 0,73
Ungü
0,71 5,74 ±
E
20 9 5,9
Dados representados desvio padrão (n=3).
*Difer amente significativa (P ) em re ntrole dias.
7 demonstra que no D4 o número de vasos no grupo controle era 7,23 ±
0,50. A quantificação de vasos nas lesões tratadas com o ungüento associado ao extrato
hexânico a 10 e a 20 %, revelou a presença de 6,48 ± 0,56 e 6,74 ± 0,40, respectivamente.
á para as lesões tratadas com ungüento a base de EE nas concentrações de 10 e 20%, os
o D14, a contagem de vasos para as lesões controle foi 6,78 ± 0,70. Para o EH e
EE a 1
em média e
ença estatistic
A Tabela
<0,01 lação ao grupo co no tempo de 14
J
valores obtidos corresponderam a 6,97 ± 0,71 e a 6,39 ± 0,79, respectivamente.
N
0 e a 20%, os resultados obtidos foram 4,96 ± 0,67, 5,03 ± 0,42, 5,74 ± 0,72, 5,93 ±
0,73, respectivamente.
A Tabela 7 indica que a quantidade de vasos sanguíneos foi significativamente
menor (P<0,01) no grupo tratado com o ungüento associado ao extrato hexânico nas
concentrações de 10 e de 20% em relação ao controle no tempo de 14 dias.
60
igura 22. Aspectos histológicos de lesões cutâneas experimentais (4x) em coelhos
atados com ungüentos a base dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M. charantia
as concentrações de 10 e de 20%, por 4 (D4) e 14 (D14) dias.
) controle D4 b) controle D14 c) EE10 D4 d) EE10 D14 e) EE20 D4
EE20 D14 g) EH10 D4 h) EH10 14 i) EH20 D4 j) EH20 D14
F
tr
n
a
f)
61
7. DISCUSSÃO
A Momordica charantia L. pertencente à família Cucurbitaceae, é uma planta
medicinal que vêm ganhando espaço no cenário científico. Constitui uma trepadeira,
bastante comum no semi-árido nordestino, sendo popularmente conhecida por melão-de-
São-Caetano. Estudos prévios comprovaram inúmeras propriedades farmacológicas desta
planta. Recentemente, tem aumentado o interesse por fitoterápicos, destacando-se aqueles
com potencialidade para atuar sobre o sistema imunológico e sobre o processo de
regeneração cutânea.
A abordagem fitoquímica dos extratos hexânico e etanólico das folhas de M.
charantia revelou a presença de esteróides em ambos. A atividade imunomoduladora e
cicatrizante de muitas plantas medicinais é atribuída a diferentes princípios ativos. Desta
forma, as ações do EH das folhas de M. charantia pode ser atribuída aos princípios ativos
contidos nos esteróides. Entretanto, vale ressaltar que como os solventes apresentam
diferenças de polaridade, os esteróides encontrados no método qualitativo devem conter
estruturas que conferem características particulares. Desta forma, é necessário que seja
dada uma maior ênfase ao isolamento e purificação dos constituintes imunoativos.
O sistema imune está envolvido na etiologia bem como nos mecanismos
patofisiológicos de muitas doenças. A modulação da resposta imune para aliviar doenças
tem sido de interesse por muitos anos. Algumas plantas medicinais são ricas em fontes de
substâncias as quais contribuem para o aumento da imunidade específica e não específica
dos granulócitos, macrófagos, células NK e sistema complemento, prevenindo o
envelhecimento e melhorando as funções mentais pelo fortalecimento do eixo psico-neuro-
imune (SHARMA et al., 1996).
São relatadas na medicina tradicional, plantas medicinais com propriedades
imunomoduladoras e que vêm sendo validadas cientificamente. Muitos modelos
experimentais têm sido utilizados para avaliação desta atividade (ROSS et al., TIWARI et al.,
2004; PAN et al., 2005; GHULE et al., 2006).
A imunidade humoral envolve a interação das células B com o antígeno e sua
proliferação e diferenciação em células plasmáticas secretoras de anticorpos. Os anticorpos
funcionam como efetores da resposta humoral por sua capacidade de ligar-se ao antígeno e
neutralizá-lo ou facilitando a sua eliminação pela ligação cruzada, através das quais se
formam agrupamentos, que são mais prontamente ingeridos pelas células fagocíticas.
xia cutânea passiva (PCA),
Para avaliar o efeito dos extratos hexânico e etanólico das folhas de Momordica
charantia L. sobre a produção de anticorpos específicos para hemácias de carneiro e
ovalbumina, utilizou-se às técnicas de hemaglutinação e anafila
respectivamente.
62
Os títulos de anticorpos da reação de hemaglutinação foram determinados para
stabelecer a resposta humoral contra hemácias de carneiro em camundongos após 7 e 14
dias d
05) em comparação ao controle. No D14, observou-se um aumento
signific
o dorso
de PCA. Através desta reação acompanhou-se a cinética de
todos os grupos que foram sensibilizados, o
OVA
alcança
. Entretanto, o EE não apresentou comportamento imunomodulador,
e
e tratamento, para avaliação da resposta imune primária e secundária,
respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que não houve diferença significativa
(P>0,05), no TAP e no TAS nos animais tratados com EE nas concentrações de 10 e 100
mg/kg em relação ao grupo controle. Já os animais tratados com EH em ambas
concentrações produziram um aumento significativo (P<0,05) do título de anticorpos
específicos anti-HC no D7 e no D14, enquanto que ciclosporina reduziu estes títulos
significativamente (P<0,
ativo no título de anticorpos anti-HC em todos os grupos (P<0,05) em relação ao D7
(Tabela 2). Estes resultados estão de acordo, com o descrito por Holland & Vizi (2002) que
atribuem a titulação de anticorpos mais alta no D14, ao fato da resposta imune secundária
acontecer muito mais rapidamente que a primária, em decorrência da memória imunológica.
A ovalbumina é uma proteína de baixo peso molecular, que quando usada como
antígeno, estimula a síntese de IgG e de IgE. A técnica de anafilaxia cutânea passiva in vivo
foi utilizada para dosar anticorpos específicos IgG em camundongos e IgE em ratos, após
imunização com OVA. Nesse teste, foram injetadas diluições dos soros-teste, sobre
dos animais. Após o tempo de imunização, injetou-se endovenosamente a solução
antigênica associada ao corante azul de Evans. Em uma reação positiva, cada local da
reação mostrou uma resposta inflamatória imediata. O corante se conjuga com a albumina
sérica e não sai normalmente da corrente sanguínea. Nos locais de inflamação aguda, onde
se aumenta a permeabilidade vascular, a albumina marcada com corante entra no fluido
tecidual e forma uma mancha azul nítida. Utilizou-se o tamanho e a intensidade dessa
mancha como medida do título
IgG e IgE através da obtenção de soros de animais tratados com EE e EH e imunizados
com ovalbumina.
A síntese de anticorpos IgG anti-OVA foi detectada a partir do 7° dia, enquanto a IgE
foi verificada somente a partir do 14º dia em
que demonstra a resposta tardia desta imunoglobulina. No 14° e 35º dias, os animais
receberam um reforço do antígeno. Verificou-se uma tendência contínua no aumento de IgG
com o passar do tempo. Entretanto para a IgE, a titulação permaneceu crescente até o 28°
dia, havendo no 35° dia um decréscimo destes anticorpos. Porém, após o 2° reforço no D
35, é que se percebeu o pico máximo da síntese de anticorpos IgG e IgE anti-
do no D42. Verificou-se um aumento significativo dos títulos de IgG e IgE anti-OVA
nos grupos tratados com EH nas doses de 10 e 100 mg/kg em relação ao controle em todos
os intervalos de tempos analisados, sugerindo que este extrato tenha efeito
imunoestimulatório
63
manten
respos
1983). Os efeitos integrais dessas citocinas consistem em recrutar
macróf
do os níveis de anticorpos compatíveis com os do grupo controle (Gráficos 1, 2, 3 e
4).
Vale ressaltar que as hemácias de carneiro e a ovalbumina, constituem antígenos T-
dependentes, havendo a necessidade de auxílio das células T antígeno-específicas para a
produção da resposta humoral.
A estimulação da resposta humoral pelo extrato hexânico de Momordica charantia L.
indica uma responsividade aumentada dos macrófagos e linfócitos T e B, envolvidos na
síntese de anticorpos. O tratamento com o EH estimula a resposta imune humoral, isto
demonstra ser muito promissor para o tratamento de pacientes imunossuprimidos, como no
caso dos aidéticos ou cancerosos. No entanto, são necessários maiores estudos para
assegurar o efeito prolongado da administração do extrato no organismo e desvendar o seu
papel na prática clínica moderna.
Já para verificar a ação dos extratos etanólico e hexânico de M. charantia sobre a
ta imune celular, utilizou-se a RHR, usando como antígeno o PPD. A análise
macroscópica de lesões cutâneas induzidas experimentalmente em coelhos, bem como
mensuração da área da ferida após 4 e 14 dias de tratamento com um ungüentos a base de
EH e EE e a avaliação do processo de cicatrização através da análise histológica foram
outros parâmetros utilizados para analisar este efeito.
A RHR é caracterizada pelo aumento no influxo de células inflamatórias não-
específicas, onde os macrófagos são os principais participantes. A reação de
hipersensibilidade tipo IV ocorre quando o antígeno ativado sensibiliza as células T. Essas
células geralmente se apresentam sob a forma de uma subpopulação de Th1, entretanto,
outras vezes, as células T citotóxicas são também envolvidas. A ativação das células T se
dá pela apresentação do antígeno através das células apresentadoras de antígeno
apropriadas, resultando na secreção de várias citocinas incluindo interleucina-2, interferon-γ,
fator de inibição da migração de macrófagos e fator-β de necrose tumoral (ASKENASE &
VAN LOVEREN,
agos dentro da extensão e ativação delas, promovendo um aumento da atividade
fagocítica pelo aumento da concentração de enzimas líticas para uma matança mais efetiva.
Várias linhas de evidências sugerem que a reação de hipersensibilidade retardada é um
importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra parasitas e bactérias que podem
viver e proliferar intracelularmente.
O EH independente da concentração e do intervalo de tempo analisado promoveu
uma ação imunoestimulatória sobre os linfócitos e demais células necessárias para a
expressão da reação, bem como da participação das citocinas pro-inflamatórias, em relação
ao controle. Isso pode ser percebido pela formação de uma pápula, no local da
sensibilização (Tabela 3). No tempo de 48 h, verificou-se uma reação mais intensa
independente do grupo, o que está concordante com o indicado por Janeway (2002), o qual
64
cita que uma resposta inflamatória poderia atingir a sua maior intensidade entre 24 e 72
hora
s.
l) permaneceram dentro dos limites fisiológicos de variação
para a
001) e do extrato aquoso de Capparis zeylanica (GHULE
et al., 2
a resposta inflamatória. Os neutrófilos
são as
eis pela síntese de componentes da matriz de tecido
conjun
entre o 3º e o 10º dia após a lesão. Para a eficiência da fibroplasia é necessária a ocorrência
É válido ressaltar que, nenhum animal apresentou qualquer alteração clínica em seu
estado geral. Durante o experimento, as funções vitais (frequência respiratória, batimentos
cardíacos e temperatura corpora
espécie cunícola. Este fato pode ser explicado, pois o teste tuberculínico estimula
uma reação de hipersensibilidade retardada (tipo IV) geralmente sem manifestações
sistêmicas, caracterizada por uma resposta inflamatória no local da aplicação da tuberculina.
Essse estudo demonstra a ação do extrato hexânico de M. charantia na estimulação da
resposta imune celular. Outras plantas foram capazes de provocar imunoestimulação
associada à resposta imune celular, como foi o caso da suspensão aquosa de frutos da
Punica granatum (ROSS et al., 2
006).
Danos tissulares de qualquer natureza (física, química ou biológica) desencadeiam
de imediato uma série de eventos que de forma simplista se traduzem como rubor, tumor,
calor e dor. Estes sinais resultam da ativação de células nervosas, estromais, vasculares e
circulatórias por estímulos físicos ou por sinalização química. A sinalização química orienta
a migração das células envolvidas com a instalação d
células mais abundantes no sangue, com capacidade de migrar para a superfície da
ferida a fim de formar uma barreira contra a invasão de microorganismos e promover o
recrutamento ativo de mais neutrófilos a partir dos vasos adjacentes não lesados
(ENGELHARD et al., 1998). Ao final de um dia após a lesão, eles constituirão 50% das
células locais. Contudo, na dependência do estímulo, outros tipos celulares podem
predominar, desde eosinófilos (reações de hipersensibilidade) e até macrófagos. O influxo
destas células para o sítio da lesão durante a fase inflamatória, revelou no 4º dia de
tratamento uma redução destas células nos grupos tratados com o ungüento à base de
extrato hexânico a 10 e a 20% em relação ao controle, indicando que este tratamento foi
capaz de modular o processo inflamatório neste intervalo de tempo.
Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação dos mediadores
químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada. Essas
células são as principais responsáv
tivo, que, na ocorrência de inflamação encontram um meio e fatores favoráveis ao
seu desenvolvimento. O fibroblasto é a principal célula para a formação de tecido de
granulação, sintetizando ácido hialurônico, fibronectina, colágenos tipos I e II, elastina e
proteases, como a colagenase, importante para o debridamento e o remodelamento das
fibras colágenas (KITCHEN & YOUNG, 1998). O aumento de fibroblastos na regeneração
tecidual encontra seu ápice na fase proliferativa deste processo, que ocorre geralmente
65
em paralelo da formação de novos vasos sangüíneos, ou seja, é necessária a
neovasc
ularização da região, já que esta permite a troca de gases e a nutrição das células
metabo
foi ainda mais significativa em relação ao grupo controle, sugerindo que este
extrato
idas experimentais foi
conside
licamente ativas (ECKERSLEY & DUDLEY, 1988). Além da ação direta de fatores de
crescimento sobre as células da vasculatura, a indução da angiogênese é, em parte,
creditada à baixa tensão de oxigênio característica que ocorre no centro de uma ferida
(KNIGHTON et al., 1981).
No início da fase de remodelação, que corresponde aos grupos analisados no 14°
dia neste experimento, observou-se uma redução no número de células mononucleares,
fibroblastos e vasos sanguíneos (Tabelas 5, 6 e 7, respectivamente) e isto se justifica pela
mudança de fase do processo inflamatório, isto é, da fase de proliferação passa-se para a
fase de remodelamento, onde há aumento de colágeno e redução de células e vasos.
Sendo que nos grupos experimentais tratados com ungüento à base do extrato hexânico
essa redução
acelerou a reparação tecidual na fase tardia da reação inflamatória, possibilitando o
alcance da fase de remodelamento mais precocemente que os demais grupos. Neste
mesmo intervalo de tempo, o leito da ferida apresentou-se totalmente preenchido pelo tecido
de granulação (GUIDUGLI-NETO, 1987), com uma rede capilar atravessando-o e a rede
linfática em franca regeneração, devido a sua reconstrução ter início posterior ao da
vasculatura. O tecido de granulação vai sendo enriquecido com mais fibras de colágeno e
começa a adquirir a aparência de massa fibrótica característica da cicatriz. Ao final da fase
de remodelamento, os anexos da pele, como folículos pilosos e glândulas sofrem
regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece pálida, pois a regeneração dos
melanócitos é deficiente (JOHNSTON, 1990) e as cicatrizes são hipovascularizadas devido
ao desaparecimento dos neocapilares, o que justifica a redução dos vasos sanguíneos com
14 dias de tratamento, observada em todos os tratamentos.
As etapas do processo de cicatrização foram observadas no presente trabalho tanto
nas lesões tratadas com os extratos hexânico e etanólico de M. charantia, como nas não-
tratadas, conforme os dias analisados. A evolução cicatricial das fer
rada clinicamente normal. No entanto, a presença de exsudato no grupo controle e
tratado com extrato etanólico, prejudicou a cicatrização, já que este é capaz de promover a
desagregação do tecido de granulação em formação e o desenvolvimento de
microorganismos (OLIVEIRA, 1992).
As infecções microbianas causam um aumento nas complicações no processo de
cicatrização. Estudos prévios revelaram que a M. charantia apresenta um amplo espectro de
atividade antimicrobiana (KHAN, 1998). A determinação da atividade antimicrobiana in vitro
dos extratos das folhas demonstrou eficácia contra Escherichia coli, Salmonella paratiphy,
Shigella dysenterae, Streptomyces griseus e Mycobacterium tuberculosis (OMOREGBE et
al., 1996; FRAME et al., 1998).
66
O estudo morfométrico revelou que no D14, o processo de cicatrização tecidual
evoluiu significativamente em relação ao D4, sendo que o EH foi capaz de promover um
maior estímulo para a ocorrência da regeneração cutânea. Isto pôde ser verificado pela
maior área de retração das feridas em relação às lesões do controle (Tabela 4).
Quanto aos aspectos histológicos das lesões cutâneas induzidas experimentalmente,
verificou-se que os trata
mentos a base do extrato hexânico de M. charantia nas
concen
trações de 10 e de 20% induziram uma melhor e mais rápida regeneração tecidual
(Figura 21).
Através da avaliação da atividade antioxidante, verificou-se resultados mais
satisfatórios relacionados ao extrato hexânico, enquanto que o extrato etanólico apresentou
índices de varredura baixos em relação ao controle (Tabela 1). A atividade antioxidante
contribui favoravelmente para a cicatrização de feridas, porque a produção de oxigênio
durante o processo inflamatório agrava as desordens nos tecidos. As propriedades anti-
radicais observadas no extrato hexânico provavelmente favorecem a cicatrização.
A sinergia de todos esses fatores avaliados pode estar envolvida com a capacidade
estimulatória de atuação do extrato hexânico sobre a resposta imune e sobre o processo
cicatricial.
67
8. CON
rodução de
estimulante sobre a resposta imune celular, estimulando a reação de
er
o dos mecanismos de ação.
5. sentou maior atividade antioxidante in vitro do que o EE, estando as
s anti-radicais observadas no extrato hexânico relacionadas com o
to da cicatrização.
CLUSÕES GERAIS
1. O tratamento com EH das folhas de M. charantia apresentou atividade
imunoestimulante sobre a resposta imune humoral, aumentando a p
anticorpos específicos em animais sensibilizados com antígenos B dependentes de
T, hemácias de carneiro e ovalbumina.
2. O tratamento com EH das folhas de M. charantia apresentou atividade
imuno
hipersensibilidade retardada em animais sensibilizados com PPD.
3. O tratamento com EE das folhas de M. charantia não exerceu efeito sobre a resposta
imune humoral e celular diante dos parâmetros avaliados.
4. Apesar dos extratos hexânico e etanólico apresentarem sua composição fitoquimica
semelhante, revelando apenas esteróides. Acredita-se que devido às diferenças de
polaridade dos solventes, os esteróides encontrados em cada extrato devem cont
estruturas que lhes conferem características particulares. Entretanto, é necessário,
que seja dada uma maior ênfase ao isolamento e purificação dos constituintes
imunoativos para o esclareciment
O EH apre
propriedade
favorecimen
68
9. PERSPECTIVAS
Em determinadas situações faz-se necessário à supressão ou a estimulação do
imunológico. A redução das respostas imunes é útil como forma de evitar a rejeição
plantes e no controle das doenças auto-imunes. Já a imunopotencialização visa
tar as reações imunes em pacientes
sistema
a trans
aumen com câncer, em indivíduos susceptíveis a
inva
As plan
de nos gias. No entanto,
o s m
ainda é
é basta
de-São
proces
os ung
como Em decorrência das
par
espécie
determ
O surgimento de uma medicina sustentável voltada para os animais objetivando a
integração entre a medicina veterinária tradicional com um sistema veterinário moderno
cipalmente fitoterápicos, já é uma realidade.
Não havia na literatura científica trabalhos que relatassem a ação do EH e do EE das
lhas de M. charantia sobre a resposta imune e a cicatrização em animais experimentais.
orém os resultados aqui encontrados estimulam novas pesquisas, uma vez que o extrato
exânico de M. charantia apresentou ação estimulatória sobre o sistema imune e sobre o
rocesso de regeneração cutânea. Sendo considerado de extrema importância para a
edicina veterinária.
sões de agentes devido a fatores ambientais e em aidéticos (STITES & TERR, 1995).
tas medicinais com atividade imunomoduladora, como é o caso da M.charantia, alvo
so estudo, têm surgido como alternativa no tratamento dessas patolo
eu ecanismo de ação associado aos princípios ativos responsáveis por esta atividade
pouco esclarecido.
Na medicina veterinária, a utilização de algumas plantas medicinais como cicatrizante
nte comum, dentre estas podemos citar a babosa, a aroeira e em especial, o melão-
-Caetano. No entanto se faz necessário avaliar a eficácia destes fitoterápicos no
so de reparação cutânea, para que seu uso possa ser difundido para a sociedade e
üentos preparados a partir de extratos destas plantas possam ser comercializados
agente terapêutico de feridas em animais domésticos.
ticularidades fisiológicas de cada espécie, é preciso testar o ungüento em várias
s, para realmente obter o efeito confirmatório ou não do poder cicatrizante de
inado extrato.
baseado em medicamentos alternativos, prin
fo
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69
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78
ANEXO
Artigo submetido à Acta Scientiae Veterinarie
79
Avaliação dos ungüentos à base de extratos hexânico ou etanólico das folhas de
Momordica charantia L. sobre as lesões cutâneas experimentais em coelhos
Evaluation of the ointment containing the hexanic or ethanolic extracts of leaves of
Momordica charantia L. on experimental cutaneous wounds in rabbits
Ana Karinne Paiva Vasconcelos, Adriana Rocha Tomé, Bárbara Sucupira Pereira,
Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro
Trabalho originado da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará, Avenida
Paranjana, 1700 - CEP 60740-000. Campus do Itaperi, Fortaleza-CE, Brasil.
CORRESPONDÊNCIA: D.C.S. Nunes-Pinheiro [[email protected]; Fone +81 31019840]
RESUMO
Entre as inúmeras plantas empregadas na medicina tradicional destaca-se a
Momordica charantia, que vem ganhando notoriedade científica por suas diversas
propriedades biológicas e farmacológicas. O objetivo deste trabalho foi investigar a
regeneração de lesões cutâneas em coelhos, tratadas diariamente com ungüento
contendo os extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) das folhas de M.charantia nas
concentrações de 10 e 20%, comparadas com o controle (base do ungüento). Lesões
cutâneas de cerca de 5 mm foram induzidas experimentalmente por um punch, tendo
os coelhos sido anestesiados previamente e após 4 (D4) e 14 (D14) dias de
tratamento, as lesões foram removidas cirurgicamente e encaminhadas para análise
histopatológica. O processo de reparo cutâneo foi avaliado nestes intervalos de tempo
através da observação macroscópica, mensuração da área de retração da ferida e
avaliação microscópica através da contagem do número de células mononucleares e
fibroblastos e dos vasos sanguíneos. O ungüento contendo o EH (10 e 20%)
80
demonstrou ser o mais eficaz por acelerar (P<0,01) o processo de regeneração
cutânea. Isto demonstra o potencial farmacológico desta planta para uso Veterinário.
Descritores: Momordica charantia, Cucurbitaceae, cicatrização cutânea, análise
histopatológica, observação macroscópica, coelhos.
ABSTRACT
Among the countless plants maids in the traditional medicine stands out the
Momordica charantia, which is winning scientific fame, for many biological and
pharmacological properties. This work investigated the healing process on excisional
wounds in the skin of rabbits, treated daily with ointment containing 10 and 20 % of the
hexanic and ethanolic extracts of the leaves of M.charantia, compared with the control.
A skin wound area of about 5 mm was excised trough of punch on anaesthetised
rabbits and after 4 (D4) and 14 (D14) days of treatment, the lesions were surgically
removed and histologically processed. Wound healing activity was determined by
macroscopic observation, measure of the area of contraction and microscopic
evaluation on the count of the number of fibroblasts and mononuclear inflammatory
cells, and blood vessels. The ointment containing HE (10 and 20%) was demonstrated
effective for accelerating (P<0,01) the process of cutaneous regeneration. So, the
results demonstrate the potential pharmacological of this plant for Veterinary use.
Key words: Momordica charantia, Cucurbitaceae, cutaneous cicatrization,
histopathological analysis, macroscopic observation, rabbits.
INTRODUÇÃO
A Momordica charantia L. é uma planta medicinal, pertencente à família
Cucurbitaceae, que vêm ganhando espaço no cenário científico mundial. Constitui
uma trepadeira, bastante comum no nordeste brasileiro, sendo popularmente
81
conhecida por melão-de-São-Caetano. Estudos prévios comprovaram inúmeras
propriedades farmacológicas desta planta como agente fitoterápico. Dentre estas,
destacam-se sua atividade hipoglicemiante [16], antibacteriana [7], antiviral [9], anti-
HIV [1], antitumoral [2, 14], anti-helmíntica [18] e abortiva [10]. Recentemente, tem
aumentado o interesse por drogas obtidas a partir de plantas medicinais, destacando-
se aquelas com potencialidade para promover a cicatrização de feridas.
O processo de cicatrização tecidual consiste de um fenômeno fisiológico que
se inicia a partir da perda de integridade da pele, gerando uma solução de
continuidade que atinge os planos subjacentes em diversos graus, e depende de uma
série de reações químicas [6]. Este processo está classicamente dividido em três
fases: inflamação, reparação e deposição de matriz extracelular e remodelação.
Existem relatos do uso popular da M. charantia como cicatrizante. No entanto,
ainda não existe literatura que comprove a atividade cicatrizante da aplicação tópica
de extratos desta planta in vivo.
Desta forma, o presente trabalho propõe avaliar ungüentos à base de extrato
hexânico (EH) ou etanólico (EE) de M. charantia na regeneração de feridas cutâneas
de coelhos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Material vegetal e preparação do extrato
As folhas de M. charantia foram coletadas pela manhã no mês de maio de
2005, na cidade de Fortaleza, Estado do Ceará, Nordeste do Brasil. A identificação
botânica da planta foi realizada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de
Botânica e Biologia da Universidade Federal do Ceará, recebendo o voucher 32441.
Folhas secas (150g) da planta foram colocadas em um balão de vidro com 500
ml de hexano, por 7 dias na ausência de luz. Em seguida, a solução resultante
82
(hexano + folhas) foi filtrada através de um funil. Esta sofreu um processo de
evaporação através do evaporador rotatório a 69°C e o extrato foi colocado em banho-
maria para total evaporação do solvente. Para a obtenção do extrato etanólico, foi
utilizado o resíduo das folhas após 2 dias de repouso e o mesmo procedimento foi
realizado, exceto que o solvente utilizado foi o etanol e a temperatura do
rotaevaporador foi 100°C.
Prospecção fitoquímica dos extratos hexânico (EH) e etanólico (EE) de M.
Charantia
Os extratos obtidos foram submetidos a uma avaliação fitoquímica para
detecção ou não de fenóis, taninos, antocianidinas, antocianinas, flavonóides,
catequinas, flavonóis, flavononas, flavanonóis, xantonas, esteróides, triterpenóides,
saponinas, alcalóides, em EH e EE das folhas de M.charantia de acordo com a
metodologia descrita por Matos [12].
Determinação da atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico (EH) e
etanólico (EE) das folhas de M.charantia
A atividade antioxidante dos extratos hexânico e etanólico das folhas de
M.charantia foi determinada pelo método varredor de radical livre DPPH (1,1-difenil-2-
picrihidrazil) [17].
Preparação do ungüento
O ungüento foi obtido pela mistura de 10 e ou 20% dos extratos (EH e EE) das
folhas de M. charantia com uma base de vaselina e lanolina (1:2). As lesões controle
foram tratadas com a base do ungüento, sem adição dos extratos.
83
Animais de experimentação
Foram utilizados quinze coelhos da raça Nova Zelândia, pesando 2 kg, com
idade de 2 a 6 meses, machos. Os animais foram adquiridos de um estabelecimento
comercial, sendo submetidos a um período de quarentena em que foram vermifugados
e observados quanto ao estado de saúde geral e só então, destinados à realização
dos experimentos. Os animais foram separados em grupos e mantidos em gaiolas no
Laboratório de Imunologia e Bioquímica (LIBA) na Universidade Estadual do Ceará
(UECE), sob condições adequadas de higiene, luz e temperatura, recebendo ração
comercial e água ad libitum. Os procedimentos experimentais foram realizados de
acordo com as normas de experimentação animal do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA).
Indução e tratamento das lesões experimentais
Previamente, os coelhos sofreram anestesia geral realizada por via
intramuscular na região do quadríceps, utilizando-se cloridrato de ketamina 44 mg.kg
-1
,
xilazina 4 mg.kg
-1
e valium 0,43 mg.kg
-1
. Foram produzidas seis lesões no dorso de
cada animal, sendo três de cada lado, paralelamente a coluna vertebral a 2 cm de
distância, entre a escápula e a tuberosidade ilíaca com um punch de 5 mm (técnica
modificada), incluindo lesionamento da pele, tecido celular subcutâneo e músculo
cutâneo do tronco. A identificação das feridas seguiu a sua localização, portanto,
84
do lado direito foram tratadas por 4 dias e as do lado esquerdo por 14 dias. No D4 e
no D14, as lesões foram seccionadas e encaminhadas para análise histológica.
Avaliação das lesões
As lesões foram submetidas a avaliação macroscópica diária, verificando-se os
seguintes parâmetros: edema, hiperemia e presença de exsudato [11].
Foi também realizado um estudo morfométrico visando a mensuração do halo
da ferida no dia da indução da ferida no 4° e 14° dia pós-indução, através da
colocação de plástico transparente sobre a ferida e demarcação com caneta de
retroprojetor, submetendo-se este traçado a mensuração com planímetro. A área de
retração da ferida foi calculada subtraindo-se a área previamente estipulada (A
0
= 5
mm) da área da ferida em D4 e D14 (R = A
0
– A). Os resultados das diferenças entre
as feridas experimentais e controle foram comparadas.
Após a realização do protocolo anestésico, similar ao utilizado para indução
das feridas, as lesões foram removidas e submetidas à fixação em formol tamponado
a 10% por 48 h, seguida de desidratação em álcool a 70%. As amostras foram
embebidas em parafina e secções de 5 μm de espessura foram preparadas. As
lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina (H&E) e observadas ao microscópio
óptico. Para análise histopatológica foram avaliados três sítios de cada corte
histológico (3 cortes/animal) em cada intervalo de tempo. Nestas áreas foi realizada a
contagem do número de células mononucleares inflamatórias, fibroblastos e vasos
sanguíneos de cada sítio (1000X).
Análise estatística
A análise de variância (ANOVA) foi realizada para todas as medidas
obtidas relativas a área da ferida (mm), sendo os dados posteriormente submetidos ao
85
teste t Student, aceitando-se 5% (P<0,05) como nível de significância para
interpretação dos resultados. Os resultados relativos à contagem de células e vasos
foram tabulados e analisados através do teste estatístico Kruskall Wallis.
RESULTADOS
Prospecção fitoquímica e atividade antioxidante in vitro dos extratos hexânico
(EH) e etanólico (EE) de M. Charantia
O estudo fitoquímico revelou a presença de esteróides e a ausência para
alcalóides, saponinas, catequinas, taninos, fenóis, flavonas, flavonóis,
leucoantocianidinas, xantonas, triterpenóides, resinas e alcalóides em ambos os
extratos.
Os resultados da atividade antioxidante in vitro dos extratos (EH e EE) das
folhas de Momordica charantia pelo método de varredura do radical livre DPPH
demonstraram que o EE das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg.mL
-1
apresentaram índice de varredura (IV) de 28,66; 38,73 e 39,75%, respectivamente. O
EH das folhas de M. charantia nas doses de 2, 5 e 10 mg.mL
-1
apresentaram IV de
40,07; 76,64 e 79,79%, respectivamente. Os grupos controle BHT e quercetina
apresentaram IV de 90,89 e 90,32%, respectivamente. Desta forma, o EH demonstrou
maior capacidade em captar os radicais livres.
Avaliação macroscópica
A avaliação macroscópica foi realizada diariamente até o D14. Nesse estudo foi
observado que as lesões teciduais experimentais nos grupos controle e tratados com o
EE (10 e 20%) de M. charantia obedeceram à mesma seqüência de eventos
dependente do tempo. No entanto, os grupos tratados com EH (10 e 20%)
86
apresentaram uma evolução cicatricial mais precoce em relação ao controle. No
decorrer de toda a investigação foram observados que os sinais de inflamação como
edema, hiperemia e presença de exsudato foram discretos nas feridas tratadas com
ungüento à base de EH. Nos animais tratados com ungüento à base de EE, foi
verificada moderada exsudação a partir do quarto dia permanecendo até o último dia
analisado (D14).
Estudo morfométrico
A Tabela 1 demonstra os efeitos do EH e EE das folhas de M.charantia sobre a
área de retração de lesões cutâneas determinada pela mensuração do halo da ferida
após 4 e 14 dias de tratamento.
O estudo morfométrico revelou que houve aumento significativo (P< 0,05) da
área de retração das feridas em todos os tratamentos no decorrer dos dias analisados.
Os ungüentos associado ao EH (10 e 20%) induziram maior área de retração
em relação ao controle (P<0,05). Em contrapartida os ungüentos a base de EE não
exerceram efeito significativo na retração das feridas.
Estudo histológico
A contagem de células mononucleares, fibroblastos e vasos sanguíneos na
região da lesão para todos os tratamentos avaliados está apresentada nas Tabelas 2,
3 e 4.
A Tabela 2 indica que o ungüento que demonstrou capacidade de modular a
resposta inflamatória foi aquele associado ao EH em ambas as concentrações, já que
este gerou uma redução significativa (P<0,01) na quantidade de células
mononucleares em relação ao controle nos dois intervalos de tempo analisados.
87
No tocante a quantificação de fibroblastos expressa na Tabela 3 foi observado
que houve uma redução significativa (P<0,01) no número de fibroblastos entre os
grupos tratados com o ungüento a base de EH (10 e a 20%) em relação ao controle
nos tempo 14 dias.
A Tabela 4 indica que a quantidade de vasos sanguíneos foi significativamente
menor (P< 0,01) no grupo tratado com o ungüento associado ao EH (10 e 20%) em
relação ao controle no tempo de 14 dias.
O EE não apresentou ação sobre o processo de regeneração cutânea quanto
aos parâmetros analisados, não diferindo significativamente das lesões tratadas
apenas com a base do ungüento (P >0,01).
DISCUSSÃO
A importância da pele como barreira de proteção contra agentes nocivos [13]
aliada a alta incidência de feridas resultantes de acidentes traumáticos em animais
domésticos motivaram a realização deste experimento. Além disto, os constantes
avanços científicos no ramo da fitoterapia levando a mudanças nos vários conceitos
tradicionais no tratamento de feridas reforçaram a necessidade de estudos nesta área.
As etapas do processo de cicatrização foram observadas no presente trabalho
tanto nas lesões tratadas com EH e EE de M. charantia, como nas não-tratadas,
conforme os dias analisados. A evolução cicatricial das feridas experimentais foi
considerada clinicamente normal.
A análise macroscópica revelou que a presença de exsudato no grupo controle
e tratado com EE prejudicou a cicatrização, já que este é capaz de promover a
desagregação do tecido de granulação em formação e o desenvolvimento de
microorganismos.
88
As infecções microbianas causam um aumento nas complicações no processo
de cicatrização. Estudos prévios revelaram que a M.charantia apresenta um amplo
espectro de atividade antimicrobiana [7].
A medida da retração da área do processo inflamatório revelou que durante o
tratamento, houve diferença significativa (P< 0,01) nas áreas de retração das lesões
que receberam ungüento a base do EH de M. charantia, as quais cicatrizaram com
maior rapidez que às lesões controle e as tratadas com ungüento associado ao EE.
O influxo de macrófagos e neutrófilos para o sítio da lesão durante a fase
inflamatória revelou uma redução (P< 0,01) destas células nos grupos tratados com o
ungüento à base de EH (10 e 20%) em relação ao controle no D4, indicando que este
tratamento foi capaz de modular o processo inflamatório neste intervalo de tempo.
Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação dos mediadores
químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada.
Essas células são as principais responsáveis pela formação de tecido de granulação,
sintetizando ácido hialurônico, fibronectina, colágenos tipos I e II, elastina e proteases,
como a colagenase, importante para o debridamento e o remodelamento das fibras
colágenas. O aumento de fibroblastos na regeneração tecidual encontra seu ápice na
fase proliferativa deste processo, que ocorre geralmente entre o 3° e o 10° dia após a
lesão. Para a eficiência da fibroplasia é necessária a ocorrência em paralelo da
neovascularização da região, já que esta permite a troca de gases e a nutrição das
células metabolicamente ativas [4, 5]. Além da ação direta de fatores de crescimento
sobre as células da vasculatura, a indução da angiogênese é, em parte, creditada à
baixa tensão de oxigênio característica que ocorre no centro de uma ferida [8].
No início da fase de remodelação, que corresponde aos grupos analisados no
D14 neste experimento, observa-se redução no número de células mononucleares,
fibroblastos e vasos sanguíneos (Tabelas 2, 3 e 4, respectivamente) e isto se justifica
pela mudança de fase do processo inflamatório.
89
Numa etapa avançada do reparo tecidual acredita-se que os fibroblastos
estejam relacionados com o fenômeno de remodelação dos feixes de colágeno, no
sentido de conferir maior resistência a este tecido lesionado [15]. Isto reforça ainda
mais a idéia de que o EH acelerou a atividade de fibroblastos fazendo com que o
tecido lesionado apresentasse uma organização muito maior em comparação ao
controle.
Nos grupos experimentais tratados com ungüento à base do EH houve uma
redução significativa no número de fibroblastos e vasos sanguíneos em relação ao
controle no D14, sugerindo que este extrato acelerou a reparação tecidual na fase
tardia da reação inflamatória, possibilitando o alcance da fase de remodelamento mais
precocemente que os demais grupos.
A sinergia de todos esses fatores avaliados pode estar envolvida com a
regeneração cutânea observada nas lesões tratadas com os extratos estudados. Os
efeitos sinérgicos foram mais pronunciados nas lesões tratadas com ungüento
associado ao EH de M. charantia, e isso têm sido atribuído às propriedades anti-
radicais observadas no extrato hexânico e aos constituintes imunoativos presentes no
extrato. No entanto, maiores estudos são necessários para desvendar esse
mecanismo de ação.
CONCLUSÃO
O ungüento associado ao extrato hexânico (EH) das folhas de M.charantia,
dentro dos parâmetros utilizados, demonstra ser eficaz por acelerar o processo de
regeneração cutânea.
Agradecimentos. A Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP), por ter
concedido apoio financeiro. Agradecimento especial à Drª Selene Maia de Morais.
90
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91
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92
Tabela 1. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)
e etanólico (EE) sobre a retração da área (mm) da lesão com 4 (D4) e 14 (D14) dias
de tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3
animais/grupos). Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa (P<0,05)
na mesma coluna em relação ao grupo controle. Letras maiúsculas indicam diferença
significativa (P<0,05) entre D4 e D14.
Área (mm)
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 2,13 ± 0,06
a,A
2,78 ± 0,06
a,B
10 2,58 ± 0,08
b,A
3,37 ± 0,09
b,B
EH
20 2,69 ± 0,17
b,A
3,50 ± 0,12
b,B
10 2,17 ± 0,05
a,A
2,88 ± 0,10
a,B
Ungüento
(Lanolina -
Glicerina 2:1)
EE
20 2,21 ± 0,11
a,A
2,96 ± 0,10
a,B
93
Tabela 2. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)
e etanólico (EE) sobre as células mononucleares com 4 (D4) e 14 (D14) dias de
tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3
animais/grupos). Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3
animais/grupos). * Indica diferença significativa (P<0,01) no D4 em relação ao grupo
controle. ** Indica diferença significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo
controle.
N° células mononucleares
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 32,66 ± 0,83 12,12 ± 0,14
10 14,83 ± 1,52* 4,20 ± 0,18**
EH
20 13,45 ± 1,62* 4,33 ± 0,13**
10 27,12 ± 1,00 10,40 ± 0,10
Ungüento
(Lanolina -
Glicerina 2:1)
EE
20 28,35 ± 1,75 10,83 ± 0,07
94
Tabela 3. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)
e etanólico (EE) sobre os fibroblastos com 4 (D4) e 14 (D14) dias de tratamento. Os
dados são representados em média e desvio padrão (n=3 animais/grupos). Os dados
são representados em média e desvio padrão (n=3 animais/grupos). * Indica diferença
significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo controle.
N° fibroblastos
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 26,00 ± 2,25 23,33 ± 1,20
10 20,90 ± 0,86 14,66 ± 1,16*
EH
20 21,43 ± 1,28 16,16 ± 1,23*
10 21,84 ± 0,83 22,55 ± 1,37
Ungüento
(Lanolina-
Glicerina 2:1)
EE
20 22,46 ± 1,02 21,98 ± 1,93
95
Tabela 4. Efeito dos tratamentos com os ungüentos à base dos extratos hexânico (EH)
e etanólico (EE) sobre a formação dos vasos sangüíneos com 4 (D4) e 14 (D14) dias
de tratamento. Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3
animais/grupos). Os dados são representados em média e desvio padrão (n=3
animais/grupos). * Indica diferença significativa (P<0,01) no D14 em relação ao grupo
controle.
N° vasos sanguíneos
Tratamentos
Concentração
%
D4 D14
Controle
- 7,23 ± 0,50 6,78 ± 0,70
10 6,48 ± 0,56 4,96 ± 0,67*
EH
20 6,74 ± 0,40 5,03 ± 0,42*
10 6,97 ± 0,71 5,74 ± 0,72
Ungüento
(Lanolina- Glicerina
2:1)
EE
20 6,39 ± 0,79 5,93 ± 0,73
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