( PDF ) Avaliação do risco ocupacional no setor coureiro-calçadista do Rio Grande do Sul

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL - UFRGS

AVALIAÇÃO DE RISCO OCUPACIONAL NO SETOR

COUREIRO-CALÇADISTA DO RIO GRANDE DO SUL

Vanina Dahlström Heuser

Tese submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Genética e Biologia Molecular

da UFRGS como requisito parcial para

obtenção do grau Doutor em Ciê ncias.

Orientador: Bernardo Erdtmann

Co-orientadora: Juliana da Silva

Porto Alegre, fevereiro de 2005.

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Aos meus pais,

meus maiores mestres,

dedico.

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de

Citogenética e Evolução e no Laboratório de

Imunogenética, ambos nas dependências do

Departamento de Genética da Universidade Federal do

Rio Grande do Sul, e foi financiado pelo Conselho Nacional

de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

AGRADECIMENTOS:

À Dra. Jacinta da Faculdade de Engenharia (UFRGS) que nos encaminhou ao

CESSTIC (Centro de Saúde e Segurança do Trabalhador das Indústrias Calçadistas da

Região de Parobé).

A todo o pessoal do CESSTIC: Verônica, Eduardo, César, Ivani e Sílvia, por nos

possibilitar as coletas de amostras dos funcionários das empresas fabricantes de

calçados, e por nos dar acesso a todos os resultados toxicológicos.

À Diolanda e Luciana do Laboratório Bom Pastor de Taquara (RS) e à Cíntia,

Líliam e especialmente à Suzi do CESSTIC, por toda a ajuda e ótima companhia durante

as coletas nas fábricas calçadistas.

Ao Tedi, Laoni e Jaime, por nos possibilitarem a obtenção de amostras em

curtumes de Estância Velha.

A toda a equipe do Laboratório Vida (Estância Velha): Dra. Vera, Poliana, Anita,

Elisa e em especial à Cíntia, por todo o apoio nas coletas, pelas análises feitas

especialmente para esse trabalho e por nos fornecerem os resultados toxicológicos dos

voluntários na indústria do couro.

Às empresas que nos depositaram confiança participando desse projeto, e a todos

os voluntários que gentilmente nos cederam amostras como grupo exposto, tanto nos

curtumes quanto nas fábricas de calçados.

A José Celso da empresa Artecola que, mesmo sem me conhecer pessoalmente,

me esclareceu muitas dúvidas por telefone, me indicou sites na internet, e enviou Fichas

de Segurança de produtos utilizados nas indústrias calçadistas.

À Liliam, do Laboratório Toxilab, por toda paciência nas negociações e pelos

descontos nos exames ocupacionais.

Ao amigo Horst, pela ajuda na interpretação de algumas informações e pela

oportunidade de divulgação da pesquisa no Senai Couros de Estância Velha através de

palestra e, indiretamente, na obtenção de voluntários para o estudo. E por responder tão

prontamente meus e-mails desesperados.

A todos aqueles que participaram como voluntários do grupo controle: meu irmão

Martin, vizinhos, conhecidos, funcionários de setores burocráticos das regiões de coleta,

estudantes da UFRGS, Bombeiros de Estância Velha e ouvintes da rádio Ipanema, que

atenderam ao convite para participação desta pesquisa.

A todos do Laboratório de Citogenética e Evolução, pela amizade e ótima

companhia, em todos esses anos de convivência.

Aos colegas e amigos da sala 103 (agora 101): Gabriela, José, Elise, Eunice,

Rodrigo, Fabiano e Cristine, principalmente à Lígia, Tatiane, Ana Paula e Vanessa, com

as quais compartilhei aTJoigoã55gup.lhei aTmoaes anTJegri Paufr otraEvoluç.( com )]TJ07.0011 T22.2019 Tw 3.23 -2.273 Td[(s e amro Genotox:)-ssaM340 ri m, Izabel, Miria.

SUMÁRIO

ABREVIATURAS ................................................................................................................

RESUMO.............................................................................................................................

ABSTRACT.......................................................................................................................

1. INTRODUÇÃO ..............................................................................................................

1.1. RISCO OCUPACIONAL.............................................................................................

1.2. CONTROLE DA EXPOSIÇÃO...................................................................................

1.2.1. Monitoramento Biológico ..............................................................................

1.2.2.1. Biomarcadores de Exposição ....................................................................

1.2.2.2. Biomarcadores de Efeito ............................................................................

1.2.2.3. Biomarcadores De Suscetibilidade: Características Genéticas

Individuais...................................................................................................

1.3. FATORES DE RISCO NÃO-OCUPACIONAIS..........................................................

1.3.1. IDADE E SEXO................................................................................................

1.3.2. TABAGISMO E ÁLCOOL ................................................................................

1.4. NÍVEIS DE AÇÃO – CONTROLE NO BRASIL .........................................................

1.5. SETOR COUREIRO-CALÇADISTA BRASILEIRO ...................................................

1.5.1. Setor Coureiro-Calçadista X Fatores De Risco............................................

1.5.1.1. Produção do Couro.....................................................................................

1.5.1.2. Produção de Calçados................................................................................

1.6. METODOLOGIAS UTILIZADAS NESTE ESTUDO...................................................

1.6.1. Amostra Biológica..........................................................................................

1.6.2. Ensaio Cometa................................................................................................

1.6.3. Teste de Micronúcleos (MN)..........................................................................

1.6.4. Identificação de Polimorfismos nos Genes de Metabolização...................

2. OBJETIVOS..................................................................................................................

3. CAPÍTULO I - EVALUATION OF GENOTOXIC EXPOSURE IN BRAZILIAN

TANNERY WORKERS: COMPARISON BETWEEN DRUM WORKSHOP AND

FINISHING WORKSHOP..................................................................................................

4. CAPÍTULO II - INFLUENCE OF METABOLIZING GENE POLYMORPHISMS ON

GENOTOXICITY IN BRAZILIAN TANNERY WORKERS. ...............................................

5. CAPÍTULO III - COMPARISON OF GENETIC DAMAGE IN BRAZILIAN

FOOTWEAR-WORKERS EXPOSED TO SOLVENT-BASED OR WATER-BASED

ADHESIVE ........................................................................................................................

6. CAPÍTULO IV - EVALUATION OF GENETIC DAMAGE IN BRAZILIAN

FOOTWEAR-WORKERS: CORRELATION OF CYTOGENETIC ANALYSIS

AND POLYMORPHISMS IN METABOLIZING GENES GSTM1, GSTT1,

GSTP1, CYP1A1, AND CYP2E1. ...................................................................................

104

7. DISCUSSÃO ...............................................................................................................

127

7.1. Risco Ocupacional no Curtume............................................................................

127

7.1.1. Biomarcadores de Exposição e de Efeito ..................................................

127

7.1.2. Biomarcadores de Suscetibilidade.............................................................

131

7.2. Risco Ocupacional na Produção de Calçados ....................................................

133

7.2.1. Biomarcadores de Exposição e de Efeito ..................................................

133

7.2.2. Biomarcadores de Suscetibilidade.............................................................

136

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................

141

9. ANEXOS......................................................................................................................

160

9.1. Norma Regulamentadora N

. 7 (NR-7) ..................................................................160

9.2. Informações ao Voluntário – Consentimento Informado....................................

160

9.3. Questionário de Saúde Pessoal............................................................................

161

9.4. Exames realizados em Laboratórios Particulares...............................................

163

9.5. Resolução do Comitê de Ética em Pesquisa.......................................................

163

ABREVIATURAS

PORTUGUÊS

AC – aberrações cromossômicas

AH - ácido hipúrico

CBA – cola a base de água

CBS – cola a base de solventes

CMBMN – célula(s) de mucosa bucal com micronúcleo(s)

CI - Comprimento de imagem (Ensaio Cometa)

FD – Freqüência de dano (Ensaio Cometa)

HAP - hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

ID – Índice de Dano (Ensaio Cometa)

LBMN – linfócito(s) binucleado(s) com micronúcleo(s)

MN – micronúcleo

NR-7 - Norma Regulamentadora N°7, da Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho,

que estabelece os parâmetros biológicos para o controle da exposição a agentes

químicos no Brasil

TCI – Troca de cromátides irmãs

VR - Valor de Referência da normalidade

INGLÊS

BNLMN – binucleated lymphocyte with micronucleus (linfócito binucleado com

micronúcleo)

CA – cromosomal aberrations (aberrações cromossômicas)

DF – damage frequency (freqüência de danos – Ensaio cometa)

DI – damage index (índice de dano – Ensaio cometa)

DW – drum workshop (setor de curtimento e/ou recurtimento – curtume)

EBCMN – exfoliated buccal cell with micronucleus (célula bucal exfoliada com

micronúcleo)

IL – image lenght (comprimento de imagem – Ensaio cometa)

FW – finishing workshop (setor de acabamento – curtume)

NPB – nucleoplasmic bridges (pontes nucleoplasmáticas – nos LBN)

SBA – solvent based adhesive (cola a base de solventes)

SCE – sister chromatid exchanges (troca de cromátides irmãs)

WBA – water based adhesive (cola a base de água)

RESUMO

Várias pesquisas descrevem um aumento de mortalidade por câncer em

trabalhadores de curtumes e de fábricas de calçados, do mesmo modo que um aumento

nas freqüências de biomarcadores de danos citogenéticos. Essas indústrias são de

grande importância no sul do Brasil e, portanto, buscou-se avaliar o risco ocupacional

nesses setores em relação a danos genotóxicos.

No primeiro trabalho, foram comparados dois setores de processamento de couro

em curtumes: o recurtimento (17 indivíduos), e o acabamento (32 indivíduos). Como

controles, foram utilizadas amostras de 32 indivíduos de sexo masculino, sem exposição

ocupacional. Os biomarcadores de exposição utilizados foram as concentrações de

cromo na urina e os níveis de metahemoglobina e hemoglobina, dos quais somente a

hemoglobina demonstrou relação com a exposição, sendo encontrada em menores

quantidades nos indivíduos do setor de acabamento quando comparados ao grupo

controle (P < 0,05).

A análise do Ensaio Cometa em leucócitos e o teste de micronúcleo em células de

mucosa bucal (CMBMN) não demonstraram diferenças entre os grupos de estudo. No

entanto, os trabalhadores do setor de acabamento tiveram um aumento estatisticamente

significativo na freqüência de micronúcleos em linfócitos binucleados (LBMN) e no

número de pontes nucleoplasmáticas (PN) (P < 0,01 e P < 0,05, respectivamente). Para

os trabalhadores do recurtimento esse aumento só foi estatisticamente significativo nas

freqüências de PN em relação ao grupo não exposto (P < 0,01).

No segundo artigo são apresentados os dados obtidos com a avaliação de 45

trabalhadores de curtume, de ambos os setores (recurtimento e acabamento). Quarenta

indivíduos do sexo masculino foram utilizados como controles. Como observado no

primeiro estudo, com exceção dos níveis de hemoglobina mais baixos no grupo exposto

(P < 0,01), os demais biomarcadores de exposição (cromo na urina, metahemoglobina e

níveis de dano de DNA obtidos pelo Ensaio Cometa) não demonstraram haver diferenças

significantes entre os grupos. Com relação às freqüências de CMBMN os grupos

apresentaram resultados similares, mas para as freqüências de LBMN e PN observou-se

um aumento significativo nos trabalhadores de curtume (P < 0,05 e P < 0,001,

respectivamente). Considerando que variações genéticas individuais podem estar

envolvidas na modulação dos efeitos genotóxicos observados, foram identificados

polimorfismos nos genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1 e CYP2E1, como

biomarcadores de suscetibilidade. Os resultados obtidos sugerem que enzimas do

sistema CYP450 podem influenciar os resultados de genotoxicidade, pois os

trabalhadores de curtume com o genótipo CYP2E1 selvagem (*1A/*1A) apresentaram

níveis maiores de danos no DNA detectados pelo Ensaio Cometa, quando comparados

ao genótipo CYP2E1 variante (*1A/*5B ou *5B/*5B) ( P < 0,03). Os genótipos GSTs

investigados não influenciaram os níveis de dano citogenético entre os grupos.

Nas indústrias calçadistas, o reconhecimento do risco para a saúde associado com

o uso de colas a base de solvente (CBS), levou ao desenvolvimento de adesivos sem

essas substâncias, as colas a base de água (CBA). Deste modo, nosso terceiro artigo

mostra os resultados obtidos em relação aos trabalhadores de fábricas de calçados

expostos a CBS (29 indivíduos) e CBA (16 indivíduos); 25 indivíduos saudáveis foram

utilizados como grupo controle. Como biomarcador de exposição, foram obtidos valores

de ácido hipúrico (AH) na urina, o principal metabólito de exposição ao tolueno, o qual

apresentou concentrações significativamente mais baixas no grupo controle em relação

aos grupos expostos às CBS e CBA (P < 0,001 e P < 0,05, respectivamente). Os

resultados do Ensaio Cometa demonstraram aumento de danos de DNA no grupo

exposto a CBS em comparação ao grupo exposto a CBA (P < 0,001), bem como em

comparação com o grupo controle (P < 0,05). Em relação às freqüências de CMBMN e

LBMN não se observou diferença significativa entre os três grupos.

Portanto, neste artigo foi demonstrado que a utilização da CBA, mesmo contendo

isocianato, é uma opção menos prejudicial à saúde dos trabalhadores de fábricas de

calçados. Os resultados positivos de genotoxicidade nos trabalhadores expostos a CBS

possivelmente podem ser explicados pela presença de policloropreno na fórmula deste

adesivo.

Tendo sido encontrados esses resultados positivos, nosso quarto artigo descreve

um estudo envolvendo 39 trabalhadores da indústria calçadista (31 homens e 8

mulheres), expostos ocupacionalmente a colas contendo solvente e policloropreno. Como

grupo controle foram utilizados 55 indivíduos (44 homens e 11 mulheres) sem exposição

ocupacional. Os danos no DNA, observados com o Ensaio Cometa, e as concentrações

de AH, foram significativamente maiores nos trabalhadores expostos em comparação aos

controles (P < 0,001). Diferenças nas freqüências de LBMN, PN e CMBMN entre os

grupos não foram observadas. O hábito tabagista e o sexo não influenciaram os

resultados em nenhum dos parâmetros analisados. Com o objetivo de identificar

diferenças de sensibilidade à genotoxicidade, foram determinados polimorfismos nos

genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1, e CYP2E1, com os quais foi demonstrada a

influência dos genótipos variantes dos genes GSTP1 e CYP2E1, sugerindo uma

associação dos mesmos com os elevados níveis de dano de DNA nos trabalhadores de

indústrias calçadistas.

Embora não tenha sido possível apontar um único agente genotóxico no ambiente

de trabalho, devido à presença de misturas complexas neste, os dados indicam

exposição genotóxica em curtumes e em fábricas de calçados. Também se observou

aumento de dano nos indivíduos com mais idade, o que nos leva a uma discussão sobre

a possibilidade desses danos apresentarem maior acúmulo em pessoas expostas. Em

todos os grupos estudados foi encontrada uma correlação positiva entre as freqüências

LBMN e idade, o que é amplamente discutido por inúmeros autores.

ABSTRACT

Several investigations report increased mortality from cancer in tannery and

footwear workers, as well as increase in frequency of cytogenetic biomarkers. Since these

industries are some of the most important in So uthern Brazil, it was therefore considered

interesting to examine whether occupational exposure in this occupational settings could

bear genotoxic risk to the workers.

Firstly, we compared two different processing areas in tannery industry, the Drum

Workshop (DW; 17 subjects) and Finishing Workshop (FW; 32 subjects). As control, a

group of 32 healthy males was used, with no occupational exposure. As biomarkers of

exposure, we obtained data on the chromium in urine, hemoglobin and methemoglobin

levels, from which only the hemoglobin levels seem to demonstrate association with

exposure, being lower in FW compared to control group (P < 0.05). The analysis of Comet

assay in leukocytes and micronucleus in epithelial buccal cells (EBCMN) failed to show

differences between the control and test groups. The FW workers presented a statistical

significant increase in the frequency of MN in binucleated lymphocytes (BNLMN) and

nucleoplasmic bridges (NPB), while the DW workers showed a statistically significant

increase in NPB frequencies compared to control group.

Our second paper presented evaluations carried out in a group of 45 male Leather

workers, independently of section in tannery. Forty healthy males were used as controls.

As observed at the firsth study, with exception of lower hemoglobin levels in Tannery

workers, the other biomarkers of exposure (chromium in urine, methemoglobin, and

reparable DNA damage measured by Co met assay) failed to show marked differences

between the groups. However, although no difference was found between controls and

Tannery workers regarding EBCMN frequencies, the other biomarkers of early effect

used, BNLMN and NPB were significantly increased in Tannery workers (P < 0.05 and P <

0.001, respectively). Individual variations of the genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1

and CYP2E1 were used as biomarkers of susceptibility, suggesting the modulation of the

genotoxicity by the enzymes of the CYP450 system, since Tannery workers with the

CYP2E1*1A/*1A (the wild type) had increased values in DNA damage measured by

Comet assay in comparison to CYP2E1 variant genotypes (*1A/*5B or *5B/*5B) (P <

0.03). The different GST genotypes investigated did not influence the level of cytogenetic

damage between groups.

At the footwear industry, the recognition of the potential health-hazards of solvent-

based adhesives (SBAs) has lead to the development of adhesives with no organic

solvents, the water-based adhesives (WBA). Thus, in our third paper we described the

comparison between footwear-workers (all males) exposed to SBA (n=29) and WBA

(n=16); 25 healthy subjects were used as controls. As biomarkers of exposure, we

obtained data on the concentration of hippuric acid (HA) in urine, the main metabolite of

exposure to toluene, which show a significantly lower mean values in the control group in

relation to SBA (P < 0.001) and WBA (P < 0.05) groups. The Comet assay results showed

increased levels for the SBA (P < 0.001) group in comparison to the WBA and control (P <

0.05), while in the frequencies of BNLMN and EBCMN, the three groups were not

statistically different. Therefore, in this study it was demonstrated water-based adhesives

are clearly a better option for safeguarding the health of footwear-workers, even with

possibility of isocyanate presence, while the positive results observed in SBA group might

be explained by chloroprene presence in adhesive.

Due to the positive findings in the third paper, our fourth study involved 39

Footwear-workers (31 males and 8 females), occupationally exposed to solvent-based

polychloroprene glue and solutions containing organic solvents. The control group

consisted of 55 subjects (44 males and 11 females) with no occupational exposure. The

HA concentration and Comet assay show statistical increase in footwear-workers in

relation to controls (P < 0.001), but no differences were observed in BNLMN, NPB and

EBCMN frequencies. Males and females did not show differences in any of the

parameters analyzed. To make it possible to identify differences in sensitivity to

genotoxicity, the polymorphisms in genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1, and

CYP2E1 were determined, showing that GSTP1 and CYP2E1 variant polymorphisms

seem be associated with increasing in DNA damage footwear-workers.

Although it may not be possible to point out a single genotoxic agent at the

workplace our data indicate the presence of genotoxic exposure at the Tannery and

Footwear industry, with increased values in older subjects, leading to the discussion about

the possibility accumulated damage to be increased in exposed people, since a positive

correlation was found between age and BNLMN frequency in all the study groups in the

four papers, what are also widely described for several authors.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Risco Ocupacional

O desenvolvimento industrial tem como conseqüência inevitável a exposição do

homem a um número crescente de substâncias químicas sintéticas ou naturais, que

incluem poeiras, fibras, compostos químicos orgânicos e inorgânicos, e que podem

causar sérios efeitos toxicológicos (Keshava & Ong, 1999; Lucas et al., 2001).

É crescente a preocupação com o efeito mutagênico e carcinogênico de agentes

genotóxicos em populações expostas ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de

vida. Estas substâncias podem afetar a saúde humana por sua disseminação no

ambiente, mas os trabalhadores que manipulam rotineiramente estes agentes constituem

o maior grupo de risco, devido à constante exposição (Maluf & Erdtmann, 2003).

Programas de saúde e segurança foram implementados em diversos países do

mundo, dando maior atenção aos problemas causados por intoxicações ocupacionais

causados por agentes químicos. Os trabalhadores dos países desenvolvidos que têm

risco de exposição a esses agentes, têm sido esclarecidos sobre seu manuseio, porém,

devido a grande diversidade do parque industrial e devido a desigualdades culturais do

planeta, muitos países ainda desprezam sua importância por questões políticas e

econômicas. Apesar da existência de medidas regulatórias, trabalhadores continuam

sendo expostos a agentes genotóxicos por desconhecerem tal exposição, e o tipo e a

quantidade de substâncias potencialmente perigosas utilizadas em seu trabalho

(Keshava & Ong, 1999).

A exposição a agentes genotóxicos pode levar a alterações nas células

germinativas causando problemas reprodutivos. Estima-se que mais de 50% das mortes

fetais, 30% de retardo mental, 20% dos defeitos congênitos e 2% da infertilidade

masculina estejam associados a aberrações cromossômicas. Estudos de risco

ocupacional reprodutivo consistem de dados epidemiológicos de exposição maternal e

têm mostrado aumento nas taxas de aborto espontâneo em mulheres trabalhando com

químicos em hospitais e laboratórios. Dados indicam de que cerca de 10% de todas as

doenças crônicas, incluindo doenças cardiovasculares, podem ser resultantes de

mutações (Keshava & Ong, 1999).

O processo carcinogênico desenvolve-se após vários estágios e cada um deles

pode ser influenciado por diferentes fatores. Dados epidemiológicos, estudos com

animais e o uso de técnicas modernas de biologia molecular demonstraram não haver

dúvidas sobre a influência de agentes químicos em alguns destes estágios, embora

existam muitos outros fatores envolvidos. Há evidências convincentes de que o sítio de

ação destes agentes é o material genético celular, sendo que essas mutações, quando

ocorrem em proto-oncogenes ou genes supressores de tumor, que estão envolvidos no

controle do crescimento ou na diferenciação celular, podem levar ao desenvolvimento de

câncer em determinados órgãos atingidos (Au, 1991; Maluf & Erdtmann, 2003).

Evidências indicam que fatores ambientais podem ser os maiores responsáveis

pelo desenvolvimento do câncer e que o ambiente de trabalho ainda é o principal local

em que ocorre exposição ambiental a substâncias potencialmente carcinogênicas

(Keshava & Ong, 1999). O ambiente ocupacional é um dos ambientes mais propícios

para investigar a etiologia e patogênese do câncer em humanos. Até a década de 1970,

as substâncias ou circunstâncias causadoras de câncer em humanos eram encontradas

primariamente no ambiente ocupacional, e embora atualmente o número de carcinógenos

não ocupacionais esteja aumentando, carcinógenos de origem ocupacional ainda

representam uma grande fração do total, ocupando uma posição especial entre as

diferentes classes de carcinógenos humanos (Siemiatycki et al., 2004).

Estima-se que a exposição ocupacional é responsável por pelo menos 4% dos

casos de câncer em humanos (NORA, 2003). Em alguns casos, sabe-se que

determinado grupo ocupacional ou industrial apresenta risco aumentado para o

desenvolvimento de câncer, e pode-se ter alguma idéia sobre o agente causador, como

por exemplo, o câncer de testículos em limpadores de chaminés expostos à

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), e o câncer de pulmão em trabalhadores

de mineração de asbestos. Em outras situações, sabe-se que determinados grupos têm o

risco de desenvolvimento de câncer aumentado, mas o agente causador é desconhecido

ou de difícil comprovação, como por exemplo, o câncer de pulmão entre pintores, e de

bexiga entre trabalhadores na indústria de alumínio (Siemiatycki et al., 2004).

Entre as várias substâncias no ambiente industrial para as quais não existem

estudos com respeito à carcinogenicidade em humanos, centenas têm se mostrado

carcinogênicas para animais de laboratório e milhares têm demonstrado efeitos em testes

de mutagenicidade ou genotoxicidade (Siemiatycki et al., 2004). Apesar disso, menos de

2% dos químicos comercializados foram testados adequadamente para

carcinogenicidade. São necessários métodos melhores para testar essas substâncias

quanto ao seu potencial carcinogênico, especialmente para a avaliação de materiais que

são misturas e circunstâncias em que a exposição inclui misturas químicas (Fung et al.,

1995; NORA, 2003). Além disso, os efeitos das exposições podem ser sobrepostos ou

sofrer interações com outros fatores ambientais e/ou genéticos, diminuindo o risco para

certos trabalhadores e aumentando risco para outros (Siemiatycki et al., 2004).

Como a incidência de câncer e a mortalidade têm utilidade limitada para a

prevenção da doença, pois são detectáveis apenas após a exposição com o

desenvolvimento do câncer ou morte, estudos com marcadores intermediários em

trabalhadores saudáveis são importantes na avaliação do risco de carcinogenicidade,

antes que tais eventos aconteçam (NORA, 2003). São necessários mais esforços para se

detectar e identificar essas substâncias no ambiente ocupacional, bem como para se

estabelecer biomarcadores adequados relacionados com doenças quer seja em nível

químico, fisiológico, celular e sub-celular, ou molecular, para facilitar a prevenção do

câncer ocupacional (Keshava & Ong, 1999).

1.2. Controle da Exposição

A avaliação da exposição, associada aos conhecimentos relativos aos efeitos na

saúde e os limites considerados seguros, permite estabelecer as prioridades e formas de

intervenção efetiva para proteger uma população dos riscos químicos (Amorim, 2003),

podendo ser avaliada por medida da concentração do agente químico em amostras

ambientais, como ar (monitoramento ambiental), ou através da medida de parâmetros

biológicos (monitoramento biológico), denominados indicadores biológicos ou

biomarcadores.

1.2.1. Monitoramento Biológico

O monitoramento biológico da exposição aos agentes químicos, propriamente dita,

significa a medida da substância ou seus metabólitos em vários meios biológicos, como

sangue, urina, ar exalado e outros. O conceito de monitoramento biológico inclui também

a detecção precoce de efeitos não-adversos e reversíveis (monitoramento biológico de

efeito) (Dougherty, 1998; WHO, 2001; Amorim, 2003).

A detecção precoce de uma exposição perigosa pode diminuir significativamente a

ocorrência de efeitos adversos na saúde dos trabalhadores expostos às substâncias

químicas, pois as informações provenientes do monitoramento da exposição ocupacional

possibilitam a implantação de medidas de prevenção e controle apropriadas. Para isto é

necessário: (I) a definição dos níveis permissíveis de exposição, os quais, de acordo com

os conhecimentos atuais, são estabelecidos para não causarem efeitos adversos

decorrentes da exposição química; e (II) a avaliação regular dos possíveis riscos à saúde

associados à exposição, por comparação aos seus limites permissíveis (Amorim, 2003).

Além do monitoramento ambiental e biológico através da formação de metabólitos,

técnicas para detectar alterações nas células de trabalhadores ocupacionalmente

expostos são igualmente importantes, pois: a) se agentes genotóxicos ou condições de

genotoxicidade estão presentes, medidas preventivas podem ser introduzidas para evitar

maiores efeitos nos trabalhadores; b) em caso de exposição acidental, alguma estimativa

da dose absorvida pode ser obtida; c) em caso de problema genético de saúde

(reprodutivo ou câncer), alguma estimativa pode ser obtida, da probabilidade de que o

efeito tenha vindo da exposição (Sorsa et al., 1992).

Assim, o monitoramento biológico complementa o monitoramento ambiental,

considerando-se que determina a exposição global efetiva diretamente no indivíduo e

detecta efeitos precoces reversíveis, proporcionando melhor estimativa de risco.

Uma série de trabalhos ressalta a utilidade de biomarcadores em estudos de

monitoramento de populações. O termo “biomarcador” é usado para expressar uma

medida específica de uma interação entre determinado sistema biológico com um agente

genotóxico (Cebulska-Wasilewska, 2003). Os biomarcadores disponíveis podem ser

classificados em três categorias: a) biomarcadores de exposição; b) biomarcadores de

efeito; e c) biomarcadores de suscetibilidade (WHO, 2001; Bonassi & Au, 2002; Amorim

2003; Cebulska-Wasilewska, 2003).

Os biomarcadores, sejam de exposição ou efeito, como ferramentas para avaliar a

exposição ocupacional são também utilizados nos estudos epidemiológicos, buscando-se

estabelecer uma relação entre a exposição aos agentes químicos e os efeitos na saúde

dos indivíduos expostos. A importância do uso destes biomarcadores como parâmetros

biológicos de exposição a substâncias químicas, deve-se ao fato de eles estarem mais

diretamente relacionados aos efeitos na saúde do que os parâmetros ambientais,

podendo, assim, oferecer uma melhor estimativa do risco. Além disso, a avaliação

biológica da exposição ocupacional a substâncias químicas leva em consideração a

absorção por diferentes vias e rotas de introdução no organismo, permitindo avaliar a

exposição global do indivíduo ou população (Amorim, 2003).

Vários são os parâmetros biológicos que podem estar alterados como

conseqüência da interação entre o agente químico e o organismo. Entretanto, a

determinação quantitativa desses parâmetros será usada como indicador biológico ou

biomarcador somente se existir uma correlação com a intensidade de exposição e/ou

com o efeito biológico da substância ou seu produto de biotransformação, assim como

qualquer alteração bioquímica precoce, cuja determinação nos fluidos biológicos, tecidos

ou ar exalado, avalie a intensidade da exposição e o risco à saúde (WHO, 2001; Amorim,

2003).

1.2.2.1. Biomarcadores de Exposição

Segundo Lawry (1995) existem dois tipos de Biomarcadores de exposição: (1) a

medida quantitativa de uma substância química ou seus metabólitos em fluidos

biológicos, e (2) a medida de uma alteração bioquímica precoce e reversível em fluidos

biológicos que reflita exposição.

A medida de substâncias químicas ou seus metabólitos são os biomarcadores de

exposição mais utilizados. O indicador biológico de exposição estima a dose interna,

através da determinação da substância química ou seu produto de biotransformação em

fluidos biológicos, como sangue, urina, ar exalado entre outros, possibilitando quantificar

a substância no organismo, quando a toxicocinética é bem conhecida (Bonassi & Au,

2002; Amorim, 2003).

Para muitos tipos de biomarcadores a consideração mais importante é a

estabilidade dos mesmos com respeito ao tempo após a exposição, pois a tendência é de

que as concentrações dos mesmos diminuam com o passar do tempo (Bonassi & Au,

2002). Alguns biomarcadores de dose interna, como o benzeno no sangue, ácido hipúrico

e 2,5-hexanodiona na urina, refletem apenas a exposição recente ao benzeno, tolueno e

n-hexano, respectivamente, enquanto outros refletem a exposição média dos últimos

meses, como o chumbo e mercúrio no sangue, ou até mesmo em anos, como cádmio na

urina (WHO, 2001; Amorim, 2003).

O segundo tipo de biomarcador de exposição identifica mudanças bioquímicas

precoces e reversíveis que refletem exposição. Exemplos: adutos de albumina-HAP no

sangue como biomarcador de exposição a HAP; ácido s-fenilmercaptúrico no sangue

como biomarcador de exposição ao benzeno; carboxihemoglobina no sangue como

biomarcador de exposição ao monóxido de carbono e diclorometano; adutos de anilina

em hemoglobina como biomarcador de exposição a anilinas; colinesterase em eritrócitos

como biomarcador de exposição a pesticidas organofosforados e outros (Lowry, 1995).

Biomarcadores de exposição a solventes orgânicos que produzem efeitos

neurotóxicos ou metais que podem causar toxicidade renal são úteis para avaliação do

risco de neurotoxicidade e degeneração de túbulos renais, respectivamente, mesmo que

o índice químico analisado em fluidos biológicos não seja uma medida direta de efeito na

saúde (Lowry, 1995).

Outros tipos de biomarcadores de exposição incluem a medida de quebras

reparáveis no DNA usando vários testes (Bonassi & Au, 2002), como por exemplo, o

independentemente de exposição à carcinógenos (Bonassi et al., 2000).

Segundo Fenech et al. (1999) e Thomas et al. (2003) o teste de MN pode não

identificar todos os eventos de dano cromossômico, como translocações recíprocas que

não são expressas em MN, mas pode indentificar translocações assimétricas, como

cromossomos dicêntricos e seus fragmentos acêntricos associados, pontes

nucleoplasmáticas (PN) e MN. Além disso, o processo responsável pela formação de um

MN pode ser um mecanismo importante pelo qual uma célula pode perder a

heterozigosidade em um locus genético chave (Inoue et al., 1997). Deste modo, a

hipótese de associação direta entre a freqüência de MN em determinado tecido e o

desenvolvimento de câncer, é embasada em várias observações:

a) há um nítido aumento na freqüência de MN em determinados órgãos e linfócitos

periféricos de pacientes com câncer (Cheng et al., 1996; Duffaud et al., 1997);

b) indivíduos com instabilidade cromossômica congênita, como na Anemia de

Fanconi e na Síndrome de Bloom, normalmente desenvolvem câncer, mesmo sem

exposição a condições de risco (Rosin et al., 1985; Rudd et al., 1988);

c) avaliações clínicas de câncer oral têm usado MN em mucosa bucal como

biomarcador de câncer (Benner et al., 1994; Desai et al., 1996);

d) existe correlação entre carcinogenicidade e genotoxicidade para alguns agentes

capazes de aumentar a freqüência de MN em humanos e em animais (Sorsa et al.,

1992);

e) a freqüência de micronúcleos é fortemente associada com a concentração de

vitaminas e folatos no sangue, que também estão associados com um risco aumentado

de algumas formas de câncer (Fenech & Rinaldi, 1995; Blount et al., 1997; Fenech et al.,

1997b; Fenech et al., 1998).

Assim, a maioria das investigações citogenéticas em populações quimicamente

expostas é realizada através de métodos clássicos, como AC e a análise MN para

detectar efeitos aneugênicos e clastogênicos, ou TCI para detecção de alterações no

DNA (Marcon et al., 1999).

Recentemente, em função de regulamentação exigindo a redução progressiva dos

níveis de exposição na maioria das condições de risco, aumentou o interesse no

monitoramento biológico da exposição associado à baixa exposição ocupacional ou

ambiental a agentes perigosos. Embora bem conduzidos, muitos estudos nesta área têm

falhado em tornar mais clara a associação entre estes baixos níveis de exposição e

alterações citogenéticas. Pesquisas cuidadosas usando técnicas novas e mais sensíveis

são necessárias para uma estimativa eficiente e precisa dos efeitos citogenéticos em

níveis baixos de exposição (Marcon et al., 1999).

1.2.2.3. Biomarcadores de Suscetibilidade: Características Genéticas Individuais

A atividade dos xenobióticos, que são compostos estranhos ao organismo, não

depende apenas das suas propriedades intrínsecas e das doses recebidas, mas também

de sítios alvos nos hospedeiros, de sua biotransformação e do reparo do DNA (Omenn,

1991).

A biotransformação de xenobióticos, em especial a que se processa no fígado, é

comumente separada em duas fases. A Fase I, que envolve as enzimas microssomais e

inclui as reações de oxidação, de redução ou de hidrólise, que podem ativar, inativar ou

deixar inalteradas as atividades do xenobiótico; e a Fase II, na qual quase sempre ocorre

a inativação da substância caso esta ainda não tenha sido inativada na fase I (Kelada et

al., 2003).

As enzimas da Fase I, também chamadas de enzimas de ativação, representadas

pela superfamília citocromo P450 (CYP450), realizam o metabolismo oxidativo através da

inserção de um átomo de oxigênio em um xen obiótico, tornando-o altamente eletrofílico.

As enzimas da Fase II, chamadas também de enzimas de detoxific ação, como as

glutationa S-transferases (GSTs), por exemplo, conjugam os reativos intermediários

eletrofílicos formados no metabolismo oxidativo da Fase I com substâncias endógenas

como a glutationa, tornando-as mais solúveis em água e mais facilmente elimináveis do

organismo. Dependendo do xenobiótico, a reação da Fase I pode ser suficiente para

tornar o composto mais hidrossolúvel, sem que haja necessidade de reação da Fase II

para sua eliminação do organismo (Venitt, 1994).

A regulação coordenada das enzimas das Fases I e II é um fator importante para

assegurar o metabolismo de xenobióticos, diminuindo o risco de acumular intermediários

oxigenados reativos (Hirvonen, 1994; Venitt, 1994). Assim sendo, a associação entre

alelos específicos de genes responsáveis pela metabolização de compostos químicos e o

risco aumentado para diversas neoplasias, se deve à existência de múltiplos passos

enzimáticos no biometabolismo, que podem resultar na ativação ou detoxificação de

xenobióticos (Viezzer et al., 1999).

A identificação de marcadores genéticos que predispõem indivíduos à indução de

cânceres oriundos de exposição ambiental é de grande importância na determinação do

risco individual a esta doença. Por esta razão, indivíduos com variações na expressão de

enzimas envolvidas nas reações de biotransformação de xenobióticos são

extensivamente estudados (Hirvonen et al., 1993), principalmente para as enzimas da

Fase I (CYP1A1, CYP2E1, CYP2D6), e de Fase II, as glutationas s-tranferases (GSTM1,

GSTT1, GSTP1) e N-acetil transferases (NAT2) (Au et al., 1998; Srám, 1998; Perera &

Weinstein, 2000; Norppa, 2003). Muitos desses genes mostram-se polimórficos dentro da

população, e os produtos desses genes podem ser enzimas inativas ou com atividade

modificada (aumentada ou diminuída). Esses polimorfismos parecem contribuir para um

aumento na suscetibilidade individual a doenças como o câncer (Raunio et al., 1995;

Rebbeck, 1997; Aynacyoglu et al., 1998; Ingelman-Sundberg, 2001; WHO, 2001).

Recentemente foram descobertos polimorfismos que afetam o reparo de DNA dos

quais se espera uma importância especial na modulação de efeitos genotóxicos, mas, até

o momento, existem poucas informações sobre o significado desses polimorfismos e

sobre o seu impacto nos biomarcadores citogenéticos (Norppa, 2004). No entanto, alguns

trabalhos sugerem a influência de polimorfismos nos genes de reparo XRCC1, XRCC2,

XRCC3, XPC, XPD e XPG, sendo que alguns parecem afetar respostas de

genotoxicidade individuais (Norppa, 2001; Tuimala et al., 2004) e incidência de câncer

(Ratnasinghe et al., 2001; Spitz et al., 2003).

Diferenças individuais nos genes polimórficos envolvidos no metabolismo de

xenobióticos e no reparo são associados com um aumento no risco de desenvolvimento

de diferentes doenças em vários estudos (IARC, 1999b). Essas diferenças individuais

podem ser importantes na estimativa de risco resultante da exposição a tóxicos

ambientais. Entender o significado desses polimorfismos genéticos na determinação de

resultados de genotoxicidade também se torna importante quando se utiliza células

humanas para esse tipo de avaliação. Algumas discrepâncias entre resultados negativos

e positivos ou variações muito grandes nos resultados podem ser atribuídas aos

diferentes genótipos encontrados nos doadores de amostras. Assim, estudos com

biomarcadores citogenéticos em populações expostas demonstram que a determinação

de polimorfismos está se tornando cada vez mais importante para tornar os testes mais

sensíveis e específicos na identificação de efeitos e de subgrupos com maior

sensibilidade (Norppa, 1997).

Apesar do risco individual associado a esses polimorfismos ser considerado

relativamente baixo, o risco atribuível a uma população deve ser maior, dando mérito às

investigações nesta área de pesquisa (Kelada et al., 2003).

Além dos polimorfismos genéticos, idade, sexo, fatores comportamentais como o

consumo de cigarro, álcool e estado nutricional podem influenciar a expressão dos genes

de biotransformação da Fase I e II e são, portanto também importantes para

compreender o risco de doenças ambientais (Kelada et al., 2000).

1.3. Fatores de Risco Não-ocupacionais

Alguns testes para genotoxicidade têm seus resultados alterados em função de

fatores não ocupacionais. Portanto, com a finalidade de incrementar a relevância destes

testes é de suma importância avaliar quais os fatores que contribuem significativamente

na variação encontrada entre os indivíduos estudados (Fenech et al., 1994). Fatores

como a predisposição genética, além de fatores como a idade, sexo, dieta e estilo de vida

podem influenciar/afetar a suscetibilidade de indivíduos expostos a substâncias químicas

(WHO, 1993), bem como aumentar e/ou diminuir a taxa basal de alterações citogenéticas

em uma população a ser usada como referência.

1.3.1. Idade e Sexo

As freqüências de AC, TCI e MN aumentam com a idade, e esse efeito é

particularmente claro na freqüência de MN em mulheres (Bolognesi et al., 1997; Fenech

et al., 1993; Norppa, 2004).

A maioria dos trabalhos de biomonitoramento de populações humanas descreve

que sexo e idade afetam a freqüência de MN em linfócitos em cultura, tanto para grupos

expostos quanto para grupos controles (Fenech et al., 1994; Hando et al., 1994;

Bolognesi et al., 1997; Hando et al., 1997; Barale et al., 1998; Catalán et al., 1998;

Fenech et al., 1999; Albertini et al., 2000; Crebelli et al., 2002; Ishikawa et al., 2003;

Högstedt et al., 1983; Richard et al., 1994), principalmente devido aos micronúcleos

conterem cromossomos sexuais (Hando et al., 1994; Fenech et al., 1997a; 1997b; Hando

et al., 1997; Catalán et al., 1998).

Segundo Crome (2003), com o aumento da idade aumenta a suscetibilidade de

riscos a efeitos adversos causados por drogas, substâncias químicas e alterações

ambientais. A freqüência de MN é significativamente e positivamente correlacionada com

idade em homens e mulheres, e isso é afetado por fatores como a deficiência de folato e

níveis plasmáticos de vitamina B12 e homocisteína (Fenech & Rinaldi, 1994; 1995;

Fenech et al., 1997a; 1998). Outros estudos demonstram a mesma relação, e sugerem

que esse aumento na freqüência de micronúcleos pode estar associado com mudanças

na ativação transcricional do gene CYP2E1 e os níveis de expressão dos seus mRNAs e

proteínas (Ishikawa et al., 2004). Além disso, o aumento do efeito da idade na freqüência

de MN pode refletir danos genéticos acumulados durante a vida dos indivíduos (Migliore

et al., 1991a; Ishiwaka et al., 2003), podendo ser, portanto, mais acentuado em grupos

expostos a substâncias genotóxicas.

1.3.2. Tabagismo e Álcool

O cigarro é uma mistura altamente complexa de mais de 3.800 componentes

químicos, alguns dos quais são diretamente ativos, enquanto outros precisam de ativação

metabólica para produzir metabólitos reativos (Au et al., 1998). Desses componentes,

pelo menos 20 são indutores tumorais, incluído o benzeno, aminas aromáticas e HAP

(Hecht, 1999), sendo que os últimos são capazes de formar adutos de DNA que são

convertidos em quebras (Jalozynski et al., 2003).

O hábito tabagista é conhecido por aumentar o nível de TCI e AC, mas sua

capacidade na indução de MN não é clara (Norppa, 2004). Vários trabalhos de

biomonitoramento de populações expostas a diferentes substâncias descrevem um

aumento nos níveis de dano citogenético em fumantes, provavelmente devido aos

hidrocarbonetos aromáticos (HA) (Tomanin et al., 1991; Warshawsky et al., 1995;

Ishikawa et al., 2003), enquanto outros não encontram essa associação (Crebelli et al.,

2002).

Do mesmo modo, a influência do consumo de bebidas alcoólicas na freqüência de

alterações citogenéticas apresenta resultados contraditórios na literatura. Em trabalhos

de biomonitoramento ocupacional poucos trabalhos sequer fazem um levantamento do

número de usuários de álcool, e muitos estudos que levam em consideração este hábito

não encontram relação entre a ingestão de bebidas alcoólicas e MN (Ishikawa et al.,

2003). No entanto, a ingestão de doses elevadas de álcool, principalmente em

associação com o tabagismo, como descrito por Maffei et al. (2002), pode levar a um

aumento estatisticamente significativo de AC e MN.

1.4. Níveis de ação – Controle no Brasil

A presença e a evidência de riscos químicos no ambiente de trabalho são

reconhecidas com base nos limites permissíveis no meio biológico, os quais são

propostos a partir das informações obtidas nos estudos de toxicidade, através das

relações dose-resposta, e reconhecidos como níveis de advertência.

No Brasil, os Limites Biológicos de Exposição são estabelecidos para os

Biomarcadores de Exposição e Efeito relativos a substâncias químicas presentes no

ambiente de trabalho, os quais constam no Quadro I da Norma Regulamentadora n°7

(NR-7, 1994), da Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho, onde constam os

respectivos valores de referência para indivíduos não expostos ocupacionalmente. Estes

limites foram atualizados em 1994, recebendo a denominação de Índice Biológico

Máximo Permitido (IBMP), e são estabelecidos para apenas 26 substâncias. Conforme

esta Portaria, todos os empregados e instituições que admitam trabalhadores como

empregados são obrigados a elaborar e implementar o Programa de Controle Médico de

Saúde Ocupacional (PCMSO) (Anexo 9.1).

Uma vez estabelecidos estes limites, a comparação com os valores evidenciados

nos trabalhadores requer a interpretação dos resultados para a tomada de decisão ou

mesmo para a comprovação de que o indivíduo está submetido a uma exposição

considerada adequada. Os resultados da Monitorizarão Biológica podem ser

interpretados com base individual ou de grupo, e a interpretação dos dados individuais só

é possível quando a variabilidade do parâmetro biológico utilizado não for muito grande e

sua especificidade for suficientemente alta (Amorim, 2003).

1.5. Setor Coureiro-calçadista Brasileiro

O setor coureiro-calçadista é de extrema importância na economia Brasileira, não

só pelo volume de exportações, mas também pela geração de empregos, atualmente em

cerca de 221 mil (Abicalçados, 2004).

No Brasil, o setor iniciou suas atividades no século XIX no Estado do Rio Grande do

Sul (RS), com o surgimento de curtumes implantados por imigrantes alemães e italianos

que aproveitaram a grande disponibilidade de peles bovinas, oriundas inicialmente das

charqueadas e, mais tarde, dos frigoríficos. A maior concentração de curtumes aconteceu

na região do Vale dos Sinos (RS), seguida pela região da cidade de Franca (São Paulo,

SP) (Corrêa, 2001).

Antes do final da década de 1860, a produção de calçados era desenvolvida por

uma indústria local em pequena escala, principalmente por artesãos. A produção em

fábricas teria iniciado na primeira metade da década de 1870, impulsionado pela

introdução da máquina de costura (Corrêa, 2001).

1.5.1. Setor Coureiro-Calçadista X Fatores de Risco

Embora alguns estudos tenham encontrado associação entre atividades

relacionadas ao beneficiamento do couro (que inclui o curtimento e a manufatura de

artefatos de couro) e algumas formas de câncer (bexiga e leucemia) a atividade não é

classificada como carcinógena em humanos (IARC, 1987a; 1987b).

1.5.1.1. Produção do Couro

O Brasil possuía, no ano de 2002, o segundo maior rebanho bovino do mundo,

embora seu aproveitamento para a produção de couro tenha sido sempre relativamente

baixo quando comparado àqueles dos países tradicionais e de menor rebanho, como a

Argentina, por exemplo (Santos et al., 2002a).

A indústria Brasileira do couro é constituída por aproximadamente setecentos

curtumes, sendo cerca que 80% são considerados pequenas empresas, gerando

diretamente cerca de 65 mil empregos (Gorini & Siqueira, 1999; Corrêa, 2001). Em

relação ao número de curtumes, as regiões Sul e Sudeste concentram 72% da produção

total e registram o maior número de estabelecimentos curtidores (Santos et al., 2002a).

Trinta por cento do total produzido é destinado às exportações (Gorini & Siqueira, 1999).

A produção de couro é uma das tecnologias humanas mais antigas. Os primeiros

métodos na arte de curtir utilizavam basicamente ácidos tânicos extraídos de plantas,

técnica que ainda hoje é utilizada. Entretanto, a técnica mais utilizada na indústria de

couro moderna é a que utiliza sais de cromo, introduzido nos curtumes na segunda

metade do século XIX (Covington et al., 2001). Segundo estimativas da Associação das

Indústrias de Curtumes do RS (AICSUL, 2004), 95,5% do couro curtido no Brasil é obtido

com a utilização de cromo.

Dependendo do estágio no processo de beneficiamento do couro no curtume,

podem ocorrer diferentes modos de exposição a substâncias químicas variadas (Stern,

2003). De todas as fases do processo de curtimento, quanto ao risco ocupacional a

substâncias genotóxicas, destacam-se os setores de curtimento (Figura 1) e

recurtimento, principalmente pela utilização de ácidos e sais de cromo, e de acabamento,

pela potencial exposição a uma ampla gama de substâncias químicas, principalmente

anilinas, tintas, lacas, solventes e fixadores, além de fragmentos de couro contendo

cromo (Sbrana et al., 1991; Stupar et al., 1999).

Figura 1. Setor de curtimento do couro.

Apesar dos trabalhadores em curtumes serem expostos a numerosas substâncias

potencialmente carcinógenas, essa atividade não é classificada como causadora de

câncer em humanos (IARC, 1987b; Stern, 2003). No enta nto essa possibilidade é bem

discutida na literatura, sendo que vários estudos descrevem um aumento da mortalidade

por câncer em trabalhadores de curtume (Constantini et al., 1990; Battista et al., 1995;

Montanaro et al., 1997; Feron et al., 2001; Majer et al., 2001; Veyalkin & Mil yutin, 2003),

enquanto outros não encontram essa associação ou apresentam resultados inconclusivos

a respeito do aumento na incidência de câncer e essa atividade ocupacional (Stern et al.,

1987; Mikoczy et al., 1996; Stern, 2003).

Do mesmo modo, estudos com biomarcadores descrevem um aumento de adutos

de DNA, MN em linfócitos de sangue periférico (Medeiros et al., 2003), MN em células

esfoliadas da bexiga, elevação nos níveis de AC (Cid et al., 1991; Sbrana et al., 1991),

indícios de citotoxicidade, genotoxicidade, e TCI em linfócitos de sangue periférico em

trabalhadores de curtume (Venier et al., 1985), enquanto outros não observam aumento

significativo de danos cromossômicos (Hamamy et al., 1987; Migliore et al., 1991). Além

disso, diferentes setores podem apresentar diferentes respostas genotóxicas, como

descrito por Sbrana et al., (1991), em um estudo com curtumes Italianos, que encontrou

aumento de aberrações cromossômicas em trabalhadores do curtimento e recurtimento,

mas não em trabalhadores do acabamento em comparação com o grupo controle. Outros

trabalhos descrevem infertilidade com diminuição na produção de espermatozóides,

possivelmente devido a exposição aos solventes (Kurinczuk & Clarke, 2001) ou Cr(III)

(ASTDR, 2000).

O emprego de sais de cromo (Cr(III)) curtentes e sua possível toxicidade têm sido

amplamente discutidos. Também é de grande importância a preocupação com a

identificação do cromo hexavalente (Cr(VI)) no ambiente, efluentes e resíduos gerados

nos curtumes (Rao et al., 2004; Tagliari et al., 2004), pois o Cr(VI) é cerca de mil vezes

mais tóxico que o Cr(III) (ASTDR, 2000). Entretanto, Cr(VI) ainda pode ser encontrado

nos curtumes, possivelmente devido a contaminações, já que o cromo utilizado nos

curtumes encontra-se em sua forma trivalente (Cr(III)) e não existem condições que

permitam sua oxidação a Cr(VI) (EPA, 1998). O EPA (Agência de Proteção Ambiental

dos EUA, 1998) determinou que o cromo VI no ar deve ser considerado um carcinógeno

humano, sendo que para o cromo III não se tem informações suficientes para determinar

uma classificação (ASTDR, 2002c).

Mesmo o Cr(III) apresentando baixa toxicidade por não conseguir atravessar a

membrana celular como o Cr(VI) (Pan et al., 1996), compostos com Cr(III) podem causar

citotoxicidade em altas concentrações e/ou combinado com outras substâncias (Bagchi et

al., 2002), podendo entrar nas células por mecanismos de endocitose (Bianchi et al.,

1984).

Trabalhadores da indústria do couro podem ser expostos a quantidades muito altas

de cromo, principalmente o cromo trivalente (Cr(III)) (ASTDR, 2002c), em soluções ou

ligado a proteínas (poeira do couro) (Stupar et al., 1999). Poucos estudos descrevem

diretamente a toxicidade do Cr(III), particularmente em exposição por inalação, e essa

falta de informações resultam na incerteza sobre o risco associado a exposição ao Cr(III)

(EPA, 1998; Medeiros et al., 2003).

O biomarcador de exposição utilizado mais comumente em avaliações de

exposição ao cromo, tanto em estudos para a investigação de exposição ocupacional

quanto ambiental, é a medida de sua concentração no sangue, plasma, urina (Rajaram et

al., 1995; Pan et al., 1996; EPA, 1998; Stupar et al., 1999; Medeiros et al., 2003) e, em

alguns casos, também no cabelo (Simpson & Gibson, 1992), mas estas análises não

informam sobre a valência do cromo que foi absorvido (Medeiros et al., 2003). No Brasil,

o método utilizado pelas indústrias do couro para avaliação da exposição dos

trabalhadores é também a medida de cromo na urina e/ou plasma, como determinado

pela NR-7 (1994).

Estudos com trabalhadores de curtumes que encontram alterações citogenéticas,

mas que não observam dose-resposta e/ou aumento na concentração de cromo na urina

dos indivíduos analisados atribuem os resultados a outras substâncias encontradas nos

curtumes, como a corantes a base de benzidina ou toluidina, anilina, formaldeído e outros

solventes orgânicos (Sbrana et al., 1991; Medeiros et al., 2003).

Das substâncias citadas acima, a toluidina é considerada carcinogênica em

animais, enquanto que a genotoxicidade e carcinogenicidade da benzidina em humanos

é conhecida (ASTDR, 2001a; IARC, 1987c). A produção dessas substâncias está

proibida desde a década de 1970 na maioria dos países, mas devido a problemas

econômicos, países como Brasil, México, Índia e Argentina, não cessaram

completamente a produção de alguns corantes à base de benzidinas de grande

potencialidade econômica (Guaratini & Zanoni, 2000).

A anilina não é classificada como carcinógena pela Agencia Internacional de

Pesquisas sobre o Câncer, mas como provável carcinógena em humanos pela Agência

de Proteção Ambiental Norte Americana (EPA, 1994). A exposição excessiva a anilinas

causa lesões na molécula de hemoglobina, formando a metahemoglobina (ASTDR,

2002a). Em casos de exposição crônica ou aguda a anilinas a legislação Brasileira

determina que o bioindicador de exposição utilizado seja a medida de p-aminofenol na

urina e/ou metahemoglobina (NR-7, 1994).

O formaldeído deve ser considerado um provável carcinógeno humano (ASTDR,

1999b), além de ser considerado mutagênico em vários testes de laboratório e com

populações humanas expostas (Feron et al., 1991; Ballarin et al., 1992; Norppa et al.,

1992; Titenko-Hollad et al., 1996; Ying et al., 1997; Burgaz et al., 2002; Shaham et al.,

2002). O bioindicador de exposição ao formaldeído é a medida do mesmo em ar exalado,

sangue ou plasma (ASTDR, 1999b).

1.5.1.2. Produção de Calçados

O setor calçadista nacional é composto por aproximadamente seis mil empresas

que geram diretamente cerca de 170 mil empregos e indiretamente cerca de 475 mil.

Apresenta capacidade de 700 milhões de pares/ano, sendo 70% destinados ao mercado

interno e 30% à exportação. Com esses números, o Brasil é atualmente o terceiro maior

produtor mundial de calçados (Abicalçados, 2004). O Vale dos Sinos (RS) é o maior pólo

produtor de calçados do Brasil e também está entre os maiores do mu ndo, com cerca de

mil fábricas de calçados. É responsável por aproximadamente 40% da produção nacional

e 75% das exportações totais (Gorini & Siqueira, 1999; Corrêa, 2001).

Trabalhadores de fábricas de calçados são potencialmente expostos a vários

solventes orgânicos presentes em colas, adesivos, primers e outras soluções, sendo que

os principais são o tolueno, n-hexano, acetona e metiletilcetona (Denton, 1985; Pitarque

et al., 1999; Uuksulainen et al., 2002). Nenhum desses solventes é considerado

genotóxico e/ou carcinogênico (ASTDR, 1995a; 1995b; 1999a; 2001b; EPA, 2003a;

2003b), mas o efeito de misturas orgânicas à saúde é desconhecido, e o aumentado do

risco de efeitos adversos pode ser considerado uma conseqüência dessa exposição.

Outras substâncias possivelmente perigosas incluem materiais particulados, aditivos em

materiais para calçados e produtos de degradação de materiais, como o isocianato e o

cloropreno (Uuksulainen et al., 2002).

Um dos problemas crônicos observados em fábricas de calçados é a proteção

inadequada a solventes tóxicos utilizados no processo de produção. A maioria dos

equipamentos de segurança disponíveis não é apropriada para a função a ser

desempenhada, levando os funcionários a recusar a utilização do equipamento de

segurança, como luvas e máscaras, as quais têm pouca utilidade quando se trata de

vapores de solventes. Funcionários das sessões de colagem (Figura 2) e pintura são,

portanto, especialmente vulneráveis, pois não existe proteção efetiva contra esses

vapores tóxicos (Nijem et al., 2001).

Segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC, 1987a),

trabalhadores das indústrias de calçados têm aumentado o risco de câncer,

principalmente o câncer nasal e leucemia, associados à poeira do couro e a exposição ao

benzeno, respectivamente. Assim, muitos fatores de risco nas fábricas de calçados e

curtumes, como o Cr(VI) e o benzeno foram substituídos por substâncias similares mas

menos tóxicas, como o Cr(III) e o tolueno.

Embora controversos na literatura, vários estudos ainda descrevem associação

entre o aumento da incidência de câncer e a atividade ocupacional em fábricas de

calçados, atribuindo suas suspeitas e/ou achados às misturas de solventes, incluindo o

benzeno (Mayan et al., 1999), a poeiras de couro (Constantini et al., 1990; Battista et al.,

1995), a substâncias encontradas em colas e adesivos, como o e cloropreno (Bulbulyan

et al., 1998), e ao conjunto de vários desses elementos (Zaridze et al., 2001).

Figura 2. Setor de montagem em uma fábrica de calçados.

Do mesmo modo, estudos também descrevem imunotoxicidade (Bogadi-Sare et al.,

2000), aumento na taxa de abortos (Agnesi et al., 1997; Xiau et al., 1999), e aumento de

alterações citogenéticas como TCI (Karacicacute et al., 1995; Kasuba et al., 2000), AC

(Tunka et al., 1996; Bogadi-Sare et al., 1997) e MN em linfócitos de sangue periférico

(Pitarque et al., 2002) de trabalhadores de fábricas de calçados.

Há possibilidade de encontrar benzeno em concentrações acima do permitido por

lei como contaminantes em solventes (ASTDR, 2002b). Os principais efeitos da

exposição crônica ao benzeno estão relacionados à sua ação hematotóxica e/ou

imunotóxica e carcinogênica, principalmente através da formação de metabólitos. Sua

capacidade de provocar danos cromossômicos e à medula óssea já foi amplamente

demonstrada em humanos e animais (EPA, 2002).

No Brasil, a ação cancerígena do benzeno foi reconhecida oficialmente a partir de

1994, pela Portaria SSST N° 3, de 10 de março de 1994, sendo que a Portaria

Interministerial N° 775, de 28 de abril de 2004, proíbe em todo o Território Nacional a

comercialização de produtos acabados que contenham benzeno em sua composição,

admitida, porém a presença desse solvente como agente contaminante em percentual

não superior a: 1% (em volume), até 30 de junho de 2004; 0,8% a partir de 1° de julho de

2004; 0,4% a partir de 1° de dezembro de 2005; 0,1% a partir de 1° de dezembro de

2007. A NR-7 (1994) determina que nos casos de suspeita de exposição ocupacional ao

benzeno (como impureza em outros solventes), seja feito um exame completo de

hemograma e plaquetas, complementando os exames feitos em condições normais

(considerando a ausência de contaminação por benzeno).

A exposição nas fábricas de calçados ocorre principalmente por inalação e/ou

absorção dérmica (Kezic et al., 2001; Santos et al., 2002b), sendo que o agente

predominante na exposição é o tolueno, o solvente utilizado em maior quantidade.

Embora a neurotoxicidade do tolueno seja aceita (Spencer & Schaumburg, 1985;

Greenberg, 1997; ASTDR, 2001b), sua genotoxicidade é discutida. O tolueno testado

isoladamente apresenta resultados negativos na maioria dos testes (Rodrigue-Arnaiz &

Villalobos-Pietrini, 1985; MacGregor et al., 1994; Nakamura et al., 1997; Zarani et al.,

1999; SCGOS, 2002). Nos estudos de monitoramento com exposição predominante ao

tolueno em que se encontrou genotoxicidade, a influência de outros solventes ou

substâncias presentes não pode ser descartada (Bauchinger, 1982; Pelclová et al., 1990;

Nise et al., 1991; Popp et al., 1992; Tunka et al., 1996; Boga di-Sare et al., 1997; Hammer

et al., 1998; Pelcková et al., 2000; Pitarque et al., 2002; SCGOS, 2002; Çok et al., 2004).

Alguns autores sugerem que a presença do tolueno em misturas possa aumentar a

suscetibilidade de absorção a outras substâncias ou biodisponibilizar produtos

genotóxicos (Toftgård et al.,1982; Wang et al., 1993; Nakajima & Wang, 1994; Pitarque et

WHO, 1998) e in vivo (Basler, 1986), todos apresentando resultados negativos. Do

mesmo modo, testes de curta duração para investigação do potencial genotóxico da

metiletilcetona demonstram a ausência de mutagenicidade causada por esse solvente

tanto in vitro (Florin et al., 1980; O’Donoghue et al., 1988; Zeiger et al., 1992) quanto in

vivo (O’Donoghue et al., 1988; WHO, 1992; EPA, 1998). O marcador de exposição à

acetona pode ser a medida da concentração da mesma no ar exalado, sangue ou urina

(ASTDR, 1995a), enquanto que para a metiletilcetona o método utilizado é a medida da

concentração do solvente também em ar exalado, sangue e urina, ou de seus metabólitos

em sangue e urina (ASTDR, 1995b; NR-7, 1994).

A maioria dos estudos sobre o potencial de genotoxicidade e/ou mutagenicidade do

n-hexano descrevem resultados negativos (McCarroll et al., 1980; Ishidate & Sofuni,

1984; Mortelmans et al., 1986; Houk et al., 1989), sendo que apenas em doses

excessivamente altas algum efeito mutagênico pôde ser observado em raízes de Vicia

faba (Gome z-Arroyo et al., 1986) e células germinativas de ratos (DeMartino et al., 1987).

O marcador de exposição a esse solvente é a presença de 2,5-hexanodiona, seu

principal metabólito, na urina, sendo que este metabólito normalmente não é encontrado

em amostras de indivíduos não expostos (NR-7, 1994; ASTDR, 1999a, Santos, 2002b).

Muitos estudos descrevem a exposição ocupacional ao n-hexano e a incidência de

neuropatias, devido à formação da 2,5-hexanodiona (WHO, 1991; ASTDR, 1999a).

Entretanto, a exposição industrial normalmente ocorre durante o uso de produtos a base

de solventes, no qual os trabalhadores são expostos a uma mistura de compostos

voláteis, como por exemplo, etilacetato, metiletilcetona, tolueno, acetona e

hidrocarbonetos alifáticos (WHO, 1991). Há indícios de que interações metabólicas

podem ocorrer entre os solventes, por exemplo, a metiletilcetona potencializa o efeito

neurotóxico da exposição ao n-hexano (WHO, 1992), do mesmo modo que a acetona

(Cardona et al., 1996) e a presença do tolueno induziria a supressão do metabolismo do

n-hexano, reduzindo a neurotoxicidade causada pelo mesmo (Takeuchi, 1993; Ikeda,

1995; Karakaya et al., 1999). Estudos sugerem que o tolueno, por ser o solvente mais

frequentemente usado e em maiores quantidades, além de ter alta afinidade pelas

enzimas de metabolização de xenobióticos, seria o menos afetado por essas interações

(Ikeda, 1995; Baelum, 1998; Ali & Tardif, 1999). No entanto, de um modo geral, a maioria

dos autores descreve a exposição a misturas complexas como exponencialmente

perigosas em comparação com exposições a substâncias únicas (Shy, 1993;

Uuksulainen et al., 2002).

Um avanço verificado na indústria calçadista que contribui para a diminuição da

exposição é a utilização de adesivos à base de água, em substituição os adesivos à base

de outros tipos de solventes. No entanto, calçados feitos com cola à base de água podem

ter um custo de 10 a 100% maior do que os calçados feitos com colas tradicionais, pelo

preço do adesivo ser mais elevado e o tempo de secagem mai s longo, além dos

investimentos necessários para sua utilização, como a construção de câmaras

aquecidas, por exemplo. Mesmo nos países mais avançados da Europa, os adesivos à

base de água ainda não atingiram um estágio tecnológico que permita a substituição total

dos adesivos à base de solventes orgânico (Abicalçados, 2004).

O maior problema descrito para as fábricas de calçados é a exposição aos

solventes. No entanto, substâncias presentes nas colas, tanto à base de água quanto à

base de solventes, como o poliuretano e policloropreno, podem ser igualmente perigosas

segundo alguns autores. Os monômeros dessas substâncias, isocianato e cloropreno,

são considerados, respectivamente, suspeito e possível carcinógeno em humanos (IARC,

1999a; 1999b).

Vários trabalhos descrevem a possibilidade de emissão de isocianato presente nos

adesivos de poliuretano quando aquecido ou em temperatura ambiente (Zhong & Siegel,

2000; Wirts & Salthammer, 2002). A exposição ao isocianato está associada a problemas

respiratórios (Skarping et al., 1996; Collins, 2002), toxicidade e/ou genotoxicidade,

mesmo depois de polimerizado (Andersen et al., 1980; Kligerman et al., 1987; Mäki-

paakkanen et al., 1987; Mori et al., 1988; Marczynski et al., 1992; Zhong & Siegel, 2000;

Collins, 2002; Bilban, 2004). Do mesmo modo, estudos com altas concentrações de

cloropreno demonstram mutagenicidade (Bartsch et al., 1979; Westphal et al., 1994), mas

os resultados são negativos com concentrações que podem ser observadas em fábricas

de calçados (Tice et al., 1988; Valentine & Himmelstein, 2001).

1.6. Metodologias Utilizadas neste estudo

1.6.1. Amostra Biológica

Muitas pesquisas são desenvolvidas para o biomonitoramento de populações

humanas expostas a mutágenos ambientais. As técnicas tradicionais utilizam células

sanguíneas, tais como linfócitos e eritrócitos, como biomarcadores dos efeitos da

exposição. Embora doenças em longo prazo não sejam esperadas a partir de células

sanguíneas afetadas, geralmente é aceito que estas possam ser utilizadas como células

sentinelas na indicação de problemas de saúde (Salama et al., 1999; Faust et al., 2004).

Assim, na maioria das pesquisas, linfócitos de sangue periférico são utilizados devido ao

fato de poderem ser obtidos através de procedimentos relativamente não invasivos, e por

que sua distribuição através do organismo permite sua utilização com substituto para

muitos tecidos atingidos (Marcon et al., 1999).

Com exceção das células sanguíneas, as células mais disponíveis para o

biomonitoramento de populações humanas são de mucosa bucal, mucosa nasal, células

de folículo piloso, escarro, células de lavagem broncoalveolar, células de cólon, cervicais,

uroteliais e espermáticas, dentre outras. A decisão sobre a utilização de células não

sanguíneas para o biomonitoramento é baseada na condição de exposição e no projeto

experimental. No planejamento desses estudos, os benefícios e limitações do uso de

células não sanguíneas devem ser considerados. Por exemplo, o uso de células de

mucosa nasal é apropriado para a exposição a químicos reativos presentes no ar.

Nessas células diretamente expostas espera-se encontrar maiores danos devido à

exposição quando comparado aos outros tipos de células. Além disso, deve-se levar em

consideração que a coleta dessas amostras é relativamente simples (Salama et al.,

1999).

Do mesmo modo, células de mucosa bucal são excelentes no monitoramento de

exposição humana a genotoxinas ocupacionais e ambientais, pois encontram-se na rota

direta de exposição de poluentes ingeridos e são capazes de metabolizar carcinógenos e

químicos reativos (Salama et al., 1999). Os níveis de enzimas que ativam muitos

genotóxicos presentes no ar são maiores em células epiteliais humanas, enquanto que

nos linfócitos as mesmas enzimas são pouco expressas (Vondracek et al., 2001; Faust et

al., 2004). Por isso, parece ser indicado o uso de células esfoliadas paralelamente com

linfócitos em estudos de dano em DNA devido à exposição ocupacional, pois os efeitos

podem não ser observados somente com o uso de linfócitos (Faust et al., 2004).

1.6.2. Ensaio Cometa

A técnica do Ensaio Cometa consiste em obter, a partir de células individualizadas

(colocadas em agarose, lisadas, submetidas à eletroforese e coradas), uma matriz com

um halo fluorescente, formado por DNA não danificado e que não migrou. Células com

DNA danificado apresentam o formato de um cometa, consistindo de uma cabeça (matriz

nuclear) e uma cauda (DNA quebrado). A extensão do DNA que mig rou está

correlacionado com o dano ocorrido (Fairbairn et al., 1995) (Figura 3).

A determinação de quebras simples no DNA através de eletroforese em célula

única, ou Ensaio Cometa, é útil para a detecção de efeitos da exposição à mutágenos e

carcinógenos (Salama et al., 1999). Como biomarcador, danos no DNA de leucócitos

provavelmente refletem exposição de poucos dias/poucas semanas, mas se alguns

danos são de difícil reparo, podem resultar em um aumento cumulativo (So morovská et

al., 1999).

Esta técnica permite análise de dano em células individuais, em qualquer

população de células individuais eucarióticas, e mostra algumas vantagens em estudos

de biomonitoramento humano por ser um método rápido, simples e sensível,

necessitando de um pequeno número de células e podendo ser aplicado tanto em células

proliferativas quanto não proliferativas, tornado-se, portanto, muito popular durante a

última década (Singh et al., 1988; Moller et al., 2000; Rojas et al., 2000; Silva et al., 2000;

Tice et al., 2000; Faust et al., 2004).

Figura 3. Lâmina de Ensaio Cometa (células classificadas em tipo 0, sem dano, até

tipo 4, com a maior parte do DNA na “cauda do cometa”.

1.6.3. Teste de Micronúcleos (MN)

O MN lembra o núcleo em forma, estrutura e propriedades de coloração, e pode

variar grandemente em tamanho. O MN pode ser formado a partir de quebras em

cromossomos ou cromátides (clastogênese), ou problemas no fuso mitótico

(aneugênese). Os fragmentos ou cromossomos inteiros, que não se orientam para os

núcleos filhos de uma célula em divisão, ficam perdidos no citoplasma e formam sua

própria membrana nuclear, originando os MNs, que são detectados em células

interfásicas como pequenos corpúsculos arredondados de cromatina, separados do

núcleo principal (Schmid, 1975; Heddle et al., 1983; Heddle et al., 1991).

O MN aparece pela primeira vez no final da primeira divisão mitótica, porém MNs

adicionais podem se formar nas divisões seguintes. Por isso, para visualizar MNs, as

células precisam ter passado por um ciclo mitótico (Carrano & Natarajan, 1988).

A análise cromossômica permite identificar com maior precisão os tipos e a

localização das alterações cromossômicas. Porém em estudos populacionais, a análise

de MNs é bem mais viável, podendo-se contar com resultados estatisticamente mais

significantes (Heddle et al., 1983; Fenech et al., 1999). Além disso, o teste de MNs é bem

mais sensível que a contagem cromossômica na detecção de perda cromossômica por

lesão do fuso mitótico (Migliore et al., 1991b).

O teste de MN em linfócitos binucleados (Figura 4) desenvolvido por Fenech &

Morley (1985) é um teste eficiente para a detecção de efeitos clastogênicos decorrentes

de vários poluentes físicos e químicos (Szirmai et al., 1993; Fenech et al., 1999). Nesta

técnica se utiliza Citocalasina B, que impede a divisão do citoplasma sem inibir a mitose,

tornando as células reconhecíveis pela presença de dois núcleos após uma divisão

nuclear (Fenech et al., 1999).

Embora o Teste de MN em linfócitos binucleados seja o mais utilizado no

monitoramento de populações expostas, essa técnica também pode ser utilizada em

outros tipos de célula, sem necessidade de cultura in vitro, como células epiteliais. A

análise de MN em células de mucosa bucal (Figura 5) tem demonstrado ser um método

muito sensível no monitoramento de dano genético de populações humanas expostas

(Karahalil et al., 1999; Gattás et al., 2001; Maj er et al., 2001; Burgaz et al., 2002; Pastor

et al., 2003). Nesse tipo de análise deve-se levar em conta que o período crítico de

exposição para a formação do MN ocorreu na última divisão das células coletadas, e o

tempo exato entre a divisão na camada basal e a migração das células até a superfície é

desconhecido (Albertini et al., 2000). No entanto, alguns autores estimam que seja um

período de uma a duas semanas (Tolbert et al., 1992; Burgaz et al., 2002).

Figura 4. Teste de Micronúcleos em linfócitos binucleados. A – linfócito binucleado normal (LB);

B – linfócito binucleado com micronúcleo (LBMN); C – linfócito binucleado com dois micronúcleos

(LBMN); e D – linfócito binucleado com ponte nucleoplasm ática (PN) ligando os núcleos.

Figura 5. Célula de mucosa bucal com micronúcleo (CMBMN).

1.6.4. Identificação de Polimorfismos nos Genes de Metabolização

Muitos dos genes que participam da ativação ou desativação de compostos

potencialmente carcinogênicos encontram-se distribuídos de uma maneira polimórfica

nas populações, sendo descritos vários alelos relacionados com aumento de

suscetibilidade para desenvolver tumores, perante a exposição a determinadas drogas.

Estes polimorfismos contribuem na determinação da suscetibilidade ao câncer,

decorrente das respostas diferenciais dos indivíduos em relação à exposição a mesma

droga (Idle, 1991; Venitt, 1994; Raunio et al., 1995).

Vários sistemas polimórficos são descritos como ligados à suscetibilidade ao câncer

e aumentos de danos citogenéticos, entre eles: polimorfismos em genes do citocromo

P450 (CYP) e GST (glutationa-s-transferase). Vários trabalhos demonstram a existência

de alto risco de desenvolvimento de tumores, principalmente de pulmão, esôfago,

próstata, laringe, bexiga, mama entre outros, associados com determinados

polimorfismos de genes destas famílias e com exposição ambiental (Harries et al., 1991;

Hubert et al., 1993; Venitt, 1994; Raunio et al., 1995; Kihara et al., 1997; Nimura et al.,

1997; Ingles et al., 1998; Millikan et al., 1998).

Dois polimorfismos do gene CYP1A1 são estudados em relação a suscetibilidade:

uma substituição 462 Ile→Val (alelo CYP1A1*2C) e uma mutação 6235 T→C na região

3`não codificadora (alelo CYP1A1*A) (Hayashi, 1991). Segundo Kyohara et al. (19 96), a

mutação Ile→Val ocorre na região correspondente ao sítio catalítico da enzima, e com

isso o alelo CYP1A1*2C codifica uma enzima com aumento de atividade. As freqüências

dessas mutações são diferentes entre as etnias (Aynacioglu et al., 1998; Kvitko et al.,

2000). Para o gene CYP2E1 estão descritos dois RFLPs (random fragments length

polimorphisms) em desequilíbrio de ligação na região regulatória. Devido a esse

desequilíbrio, dois arranjos principais são normalmente encontrados, CYP2E1*5B e

CYP2E1*1A. Embora seja raro em muitas populações (Hamada et al., 1995; Griese et al.,

2001), o haplótipo CYP2E1*5B é comum e m asiáticos (19-30%) (Morita, 1997; Tan, 2000)

e ameríndios (25%) (Muñoz, 1998). Estudos de expressão demonstraram que a forma

mutante CYP2E1*5B resulta no aumento da transcrição do seu mRNA (Watanabe et al.,

1994). A enzima CYP2E1 é toxicologicamente importante devido a sua capacidade de

metabolizar vários xenobióticos de baixo peso molecular como N-nitrosaminas e

solventes orgânicos, tais como o benzeno, tolueno e outros, enquanto que a CYP1A1

metaboliza vários xenobióticos como aminas aromáticas e HAP gerando outras

substâncias tóxicas (Guengerich & Shimada, 1998).

Os polimorfismos genéticos da família GST estão relacionados com o risco de

desenvolvimento de câncer (Indulski & Lutz, 2000). Deleções nos loci GSTM1 ou GSTT1,

resultam na falta de atividade enzimática (Pemble et al., 1994; Xu et al., 1998); amb os os

genótipos GSTM1*0/*0 e GSTT1*0/*0 apresentam freqüência variável entre as etnias

(Rebbeck, 1997). Dentre os caucasianos, cerca de 20% da população apresenta

ausência da enzima GSTT1 e 50% da enzima GSTM1 (Hirvonen et al., 1993; Zhong et

al., 1993). No gene GSTP1, uma mudança do aninoácido Ile→Val no códon 105

(GSTP1*Val105), na região correspondente ao centro catalítico, parece resultar em

redução de atividade enzimática (Zimniak et al., 1994; Ali-Osmam et al., 1997; Watson et

al., 1998). Entretanto, algumas investigações sugerem que a forma GSTP1*Val105 está

associada com aumento de atividade catalítica, dependendo do substrato (Hu et al.,

1997; Sundberg et al., 1998; Watson et al., 1998). O alelo GSTP1*Val105 tem a sua

especificidade por compostos eletrofílicos, estando relacionado com a predisposição ao

câncer de pulmão, bexiga, testículos entre outros (Gaspar et al., 2002).

É bem aceito que a distribuição polimórfica das enzimas de metabolizadoras nas

diferentes populações do mundo influencia na suscetibilidade ao desenvolvimento de

doenças ambientais, sendo de grande importância o conhecimento da freqüência destes

genes nas diferentes etnias, visando gerar uma forma efetiva de prevenção,

especialmente contra o câncer (Au et al., 1999).

Estudos utilizando Biomarcadores de exposição (substâncias ou seus metabólitos

em fluidos biológicos, danos reparáveis de DNA, adutos de proteína e DNA) e de efeitos

(AC, TCI, MN e outros) demonstraram que a determinação de polimorfismos nos genes

de ativação e detoxifiação são aspectos importantes na implementação de testes mais

sensíveis e específicos, e na identificação de subgrupos com maior sensibilidade

(Norppa, 1997; WHO, 2001). Por outro lado, Pavanello & Clonfero (2000), num trabalho

de revisão sobre o assunto, relataram que em menos da metade dos estudos se

encontrou relação entre genótipo e indicador biológico de efeito e/ou exposição,

concluindo que esse efeito dos polimorfismos sobre os biomarcadores não é tão simples,

e que muito ainda deve ser elucidado através de diferentes estudos.

2. OBJETIVOS

Em função do que se conhece sobre os produtos químicos utilizados no setor

coureiro-calçadista, visando avaliar os possíveis riscos que os trabalhadores pudessem

estar sofrendo, e ainda possibilitar a prevenção e monitoramento, este trabalho teve

como objetivos:

• avaliar através de Biomarcadores de Efeito precoce (Ensaio Cometa e Teste de

Micronúcleos) os trabalhadores de curtumes de fábricas de calçados em relação aos

danos ao DNA que possam estar sofrendo, observando correlação com as

diferenças individuais (suscetibilidade, hábitos, idade, sexo, tempo de exposição,

setor de trabalho);

• comparar as respostas de mutagenicidade e/ou genotoxicidade encontradas nos

diferentes tipos de células e metodologias;

• identificar alguns dos genes correlacionados com suscetibilidade ao tipo de

exposição, através da genotipagem dos indivíduos, para posterior correlação com os

dados de danos ao DNA;

• relacionar os dados obtidos com a utilização de Biomarcadores de Efeito Biológico

Precoce e de Suscetibilidade com os Biomarcadores de Exposição determinados

pela Norma Regulamentadora N

7 (NR-7) para as exposições nos setores avaliados

nesse estudo.

3. CAPÍTULO I

Evaluation of genotoxic exposure in Brazilian Tannery workers: Comparison

between Drum Workshop and Finishing Workshop.

Vanina Dahlström Heuser

, Juliana da Silva

& Bernardo Erdtmann

1,3

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGGBM),

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre-RS, Brazil.

Laboratório de Genética Toxicológica, Programa de Pós-Graduação em Ensino de

Ciências e Matemática (PPGECIM), Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Canoas-

RS, Brazil.

Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul (UCS), Caxias do Sul-RS,

Brazil.

*Correspondence to: Juliana da Silva, Programa de Pós-Graduação em Ensino de

Ciências e Matemática (PPGECIM), Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Prédio 14,

Sala 230, Rua Miguel Tostes 101, Bairro São Luís, CEP 92420-280, Canoas-RS, Brazil.

E-mail:

[email protected]

A SER ENVIADO PARA A REVISTA MUTAGENESIS

Abstract

Several studies report increased mortality from cancer in tannery workers, as well as

increase in frequency of cytogenetic biomarkers. Two different processing areas were

considered as potentially harmful to tannery workers, the Drum Workshop (DW), where

basic trivalent chromic sulfate solutions and hydrosoluble dyes are used, and the

Finishing Workshop (FW), where several operations are carried out, which expose the

workers to leather dust, organic solvents and pigments. The aim of this study was

evaluate the genotoxic exposure in DW (17 subjects) and FW (32 subjects) workers (all

males) from 3 tannery industries. As control, a group of 32 healthy males with no

occupational exposure was used. The DNA damage was assessed by Comet assay in

blood cells, and micronucleus in binucleated lymphocytes (BNLMN) and in exfoliated

buccal cells (EBCMN). As biomarkers of exposure, we obtained data on the chromium in

urine, hemoglobin and methemoglobin levels. The analysis of Comet assay and EBCMN

failed to show differences between the control and test groups. The FW workers

presented an increase in the frequency of BNLMN and nucleoplasmic bridges (NPB) (P <

0.01 and P < 0.05, respectively), while the DW workers showed a statistically significant

increase in NPB frequencies (P < 0.01) compared to control group. A positive correlation

was found between age and BNLMN frequencies in DW and FW workers (P < 0.001 and

P < 0.05, respectively), but not in control group (P = 0.235). Urinary chromium and

methemoglobin levels showed no statistical differences among DW, FW and controls,

while the hemoglobin was lower in FW compared to control group (P < 0.05). Although it

may not be possible to point out a single genotoxic agent at the workplace our data

indicate the presence of genotoxic exposure at the DW and FW sections, with increased

values in older exposed people. The possibility of body chromium accumulation, influence

of chromium on iron metabolism, and its mechanisms of induced DNA damage are also

discussed.

Keywords: Occupational exposure, Tannery-worker, Comet assay; Micronucleus test

(MN), Trivalent chromium (Cr(III)).

1. Introduction

Brazil is one of the largest producers of bovine leather in the world, with the main

concentration of producers located in States of Rio Grande do Sul and São Paulo. With

more than 700 industries, tanneries employ directly about 65 thousand workers (Santos et

al., 2002).

People employed in leather tanning industries may be exposed to higher-than-

normal level of chromium, mostly trivalent chromium (Cr(III)) (ASTDR, 2002a), either

inorganic Cr(III) compounds or Cr bound to proteins (leather dust) (Stupar et al., 1999).

Little toxic effect is attributed to Cr(III) when present in very large quantities while

hexavalent chromium (Cr(VI)) has been found biologically active (Pan et al., 1995). The

failure of Cr(III) ions to pass through the cell membrane explains the genetic inertness of

Cr(III). However, some data suggest that in mammalian cells endocytosis is a mechanism

that allows Cr(III) complexes to pass the membrane barrier and enter cells (Bianchi and

Levis, 1984). Cr(III) compounds are 1000-fold less toxic than Cr(VI) compounds (ASTDR,

2000), but Cr(III) compounds may cause toxicity at higher concentration and/or depending

on the ligant attached to it (Bagchi et al., 2002).

Relatively few studies are available in the literature that directly address the toxicity

of Cr(III), particularly by the inhalation route of exposure. This lack of data results in

considerable uncertainty regarding the hazard associated with exposures to Cr(III) (EPA,

1998; Medeiros et al., 2003). Concentrations of chromium in blood, serum, urine and hair

have long been used in biological monitoring of environmentally and occupationally

exposed populations, as biomarker of exposure (Simpson and Gibson, 1992; Rajaram et

al., 1995; Pan et al., 1996; EPA, 1998; Stupar et al., 1999; Medeiros et al., 2003).

Two different processing areas were considered as potentially harmful to tannery

workers: (a) the Drum Workshop, and (b) the Finishing Workshop. In the former

department tanning is carried out by placing the hides in a drum containing basic trivalent

chromic sulfate solutions; moreover leather is colored using hydrosoluble dyes. In the

latter department several mechanical operations are carried out (conditioning, staking,

buffing) which expose the workers to leather dust; moreover finishing is carried out using

formaldehyde as a leather preservative and as a protein fixer on glazed leather; painting is

carried out during which solvents, paints and pigments containing oxide and insoluble

salts of metals, including anilines and Cr salt are used.

In spite of employees engaged in the tanning and finishing of leather being

potentially exposed to numerous carcinogens (Stern, 2003), leather tanning and

processing entail exposures that are not classifiable as to carcinogenicity to humans

(IARC, 1987); and in the same way, no evidence of toxic effects of Cr(III) in human d ose

response studies was detected (Campbell et al., 1999; Cefalu et al., 1999).

Controversially, several studies report increased mortality from cancers in tannery workers

(Constantini et al., 1990; Battista et al., 1995; Montanaro et al., 1997; Stern, 2003;

Veyalkin and Milyutin, 2003). Similarly, studies have reported the increase in DNA-protein

crosslinks, micronuclei (MN) in peripheral blood lymphocytes (Medeiros et al., 2003),

micronucleated exfoliated bladder cells and elevated chromosomal aberration (CA) rates

in tannery workers (Cid et al., 1991; Sbrana et al., 1991), while others have found no

significant increase in chromosome damage (Hamamy et al., 1987; Migliore et al., 1991).

In addition, Sbrana et al. (1991) found an increase in CA in Drum Workshop workers but

not in Finishing Workshop workers in comparison to controls in Italian tanneries.

Due to the discrepancies in the literature and because leather tannery is one of the

most important industries in Southern Brazil, it was therefore considered interesting to

examine whether occupational exposure to chemicals in a tannery could bear genotoxic

risk to the workers. The induction of DNA damage and MN formation represent sensitive

cytogenetic endpow 1 ofenl muort

Brazilian National Ethical Committee on Research (Comissão Nacional de Ética em

Pesquisa – CONEP) and informed written consent was obtained from each individual prior

to the start of the study.

All the individuals examined were required to answer a Portuguese version of a

questionnaire from the International Commission for Protection against Environmental

Mutagens and Carcinogens (Carrano and Natarajan, 1988) and participate in a face-to-

face questionnaire which included standard demographic data (age, gender, etc.) as well

as questions relating to medical issues (exposure to X-rays, vaccinations, medication,

etc.), life style (smoking, coffee, alcohol, diet, etc.) and their occupation (number of hours

worked per day, time of exposure, use of protective measures, etc.). In all the groups,

individuals who smoked more than 5 cigarettes/day for at least 1 year were considered

smokers. The characteristics of the three groups are presented in Table I.

Blood and urine samples were obtained from individuals in the DW and FW groups

on the same day during a normal shift during the workers periodical medical examinations

by the nurses by Vida Laboratory (laboratory of Clinic Analysis, Estância Velha, RS). For

the control group, blood and urine samples were taken at the same region. All blood

samples were collected by venipuncture using vacutainers with heparine and processed

as quickly as possible to avoid the damage associated with storage (Albertini et al., 2000),

the blood cell samples being transported to the laboratories at or below 8

C and

processed within 8 h of collection in order to minimize loss of DNA and damage due to

DNA repair processes.

2.2. Chromium in Urine, Methemoglobin, and Hemoglobin values

A spot urine sample was obtained (Control, n=21; DW, n=17; and FW, n=30) in the

last day of the working week. The chromium determination in urine was performed by

graphite furnace atomic absorption (Zeeman, Simaa 600-EUA, Perquin-Elmer).

Hemoglobin levels (Control, n=26; DW, n=10; and FW, n=16) were determined using a

hematological electronic analyzer (Pentra 60 plus, ABX, France). Methemoglobin

percentages (Control, n=20; DW, n=17; and FW, n=31) were analyzed by

spectrophotometric method. For all study groups, these analyses were performed by

Toxilab (Toxicological Laboratory, Porto Alegre, RS) and Vida Laboratory (Clinic Analysis,

Estância Velha, RS).

2.3. Comet Assay

The alkaline Comet assay was performed as described by Singh et al. (1988) with

the modifications suggested by Tice et al. (2000). Blood cells (5 µl) were embedded in 95

µl of 0.75% low-melting point agarose and when the agarose had solidified the slides were

placed in lysis buffer (2.5M NaCl, 100mM EDTA and 10mM Tris; pH 10.0-10.5) containing

freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) for a

minimum of 1 hour and a ma ximum of two weeks. After treatment with lysis buffer, the

slides were incubated in freshly-made alkaline buffer (300 mM NaOH and 1 mM EDTA;

pH >13) for 20 min and the DNA was electrophoresed for 20 min at 25 volts (0.90 V/cm)

and 300 mA after which the buffer was neutralized with 0.4 M Tris (pH 7.5) and the DNA

stained with ethidium bromide (2 µg/ml). The electrophoresis procedure and efficiency for

each electrophoresis run was checked using negative and positive internal controls

consisting of whole human blood collected in the laboratory, the negative control being

unmodified blood and the positive control 50 µl of blood mixed with 13 µl (8 x 10

-5

M) of

methyl methanesulfonate (CAS No 66-27-3; Sigma, St. Louis, MO, USA) and incubated

for 2 hours at 37

C. Each electrophoresis run was considered valid only if the negative

and positive controls yielded the expected results.

Images of 200 randomly selected cells (100 cells from each of two replicate slides)

were analyzed for each person. Comet image lengths (IL) (i.e. the nuclear region+tail)

were measured in arbitrary units using a calibrated eyepiece micrometer (1 unit= ≈5 µm at

200X) and a fluorescence microscope equipped with a 12nm BP546 excitation filter and a

590nm barrier filter. Cells were also visually allocated to one of five classes depending on

tail size (class 0 = no tails, class 4 = longest tails) to give a single DNA damage score for

each subject and hence for each group studied, the group damage index (DI) ranging

from 0 (no tails on any cells, i.e. 200 cells x 0) to 800 (all cells with maximally long tails,

i.e. 200 cells x 4) (Collins et al., 1997; Albertini et al., 2000; Silva et al., 2000). The

damage frequency (DF (%); i.e. the proportion of cells with altered migration), was

calculated based on the number of cells with tails versus the number of cells without tails.

All the slides were scored blindly on the same day on which they were subjected to

electrophoresis.

2.4. MN in binucleated lymphocytes

For each blood sample, duplicate lymphocytes cultures were set up in culture flasks

by adding 0.3 ml of whole blood to 5 ml of RPMI 1640 medium (Nutricell, Campinas-SP,

Brazil) containing 1% (v/v) phytohemagglutinin and the flasks incubated at 37ºC for 44 h

before adding 5 µg/ml of cytochalasin B (Sigma) (Fenech et al., 1999) and continuing

incubation until the total incubation time reached was 72 h. After incubation the

lymphocytes were harvested by centrifugation at 800 revs/min for 8 min, recentrifuged,

fixed in 3:1 (v/v) methanol/acetic acid, placed onto a clean microscope slide and stained

with 5% (v/v) Giemsa. For each blood sample, 2000 binucleated lymphocytes (BNL ) (i.e.

1000 from each of the two slides prepared from the duplicate cultures) were scored for

both micronuclei (MN) presence and nucleoplasmic bridges (NPB) between daughter

nuclei, assessment being made using bright-field optical microscopy at a magnification of

200-1000X. All sides were coded to blind analysis.

2.5. MN in Exfoliated Buccal Cells

Buccal cells were collected by swabbing the inner cheek of the individuals with a

moistened wooden tongue depressor, the tip of which was immersed in 5 ml of cold saline

(0.9% (w/v) aqueous NaCl) in a conical tube and transported under refrigeration to the

laboratory where the saline was centrifuged at 1500 revs/min for 8 min and the

sedimented buccal cells washed twice more with saline under the same centrifugation

conditions to remove bacteria and cell debris which would have complicated scoring. After

washing, a drop of cell suspension was placed onto each of two duplicate microscope

slides and dried at room temperature for 1-2 weeks and then feulgen-stained (hydrolysis

in 1N HCl at 60

C for 10 minutes followed by immersion in Schiff`s reagent for 3-4 h) and

the cytoplasm counterstained by immersion in 0.5% (w/v) fast-green for 30 seconds.

The criteria used for micronuclei analysis were those of Tolbert et al. (1992) and

Titenko-Holland et al. (1998). Only cells that were not smeared, clumped or overlapped

and that contained intact nuclei were included in the analysis. Cells undergo degenerative

processes which can produce anomalies that are difficult to distinguish from micronuclei

(binucleated cells, condensed chromatin, ‘broken egg’, pycnosis, karyorrhexis and

karyolysis) were excluded from the micronucleus analysis and all the slides were coded to

blind analysis. The quality of the slides were determined at 200X magnification using a

bright-field Zeiss microscope and the micronuclei frequency estimated based on the

number of normal exfoliated buccal cells counted using bright-field optical microscopy at a

magnification of 1000X. For each volunteer, 2000 buccal cells (i.e. 1000 from each of the

duplicate slides) were scored.

2.6. Statistical Analysis

The normality of the variables was evaluated using the Kolmogorov-Smirnov test. χ

and t-test were used to compare the basic characteristic of study populations. According

with the distribution of data, the Kruskal-Wallis (Dunn`s Multiple Comparisons) and

ANOVA (Tukey's Multiple Comparison Test) were used to compare the parameters

analyzed for the three groups (control, DW, and FW). The Spearman and Pearson

correlation test were used to analyze possible correlations as appropriated. The critical

level for rejection of the null hypothesis was considered to be a P value of 5%.

3. Results

The main characteristics of the control, DW and FW groups are presented in Table

1. The mean ages of the groups showed no significant differences (t-test). The time of

exposure was statistically higher in FW in relation to DW (P < 0.01, t-test). Few volunteers

were considered smokers (smoking five or more cigarettes per day) for all study groups.

No statistical differences were found in smoking and drinking habits among the groups

(χ

-test).

Table 1

Size of sample, mean age, time of exposure, smoking and drinking status of control,

Drum Workshop (DW), and Finishing Workshop (FW).

Control DW FW

Number of subjects 32 17 32

Mean age ± S.D. (years) 31.94 ± 6.80 32.29 ± 8.23 33.61 ± 6.97

Years of exposure (mean ± S.D.)

7.65 ± 7.32 12.70 ± 6.97*

Smokers

/ non-smokers 3/29 1/16 6/26

Drinkers

/ non-drinkers 2/30 4/13 2/30

smoking 5 or more cigarettes per day;

drinking 4 or times per week; *P < 0.01 (t-test).

The mean values (mean ± S.D.) of chromi um in urine, methemoglobin and

hemoglobin levels are presented in Figure 1. Although the FW show a slight increase on

chromium excretion in urine, there were no statistical differences among DW, FW and

controls, as well as the methemoglobin percentages. The mean levels of hemoglobin were

not different between DW and controls, or between DW and FW, but lower in FW

compared to control group (P < 0.05; ANOVA, Tukey's Multiple Comparison Test). No

correlation was found between chromium concentration in urine and hemoglobin or

methemoglobin levels, age, and cytogenetic analysis (Spearman correlation test; data

non-shown). With exception of one subject in FW group, all volunteers presented normal

chromium concentration, hemoglobin and methemoglobin levels (up to 5.0 µg/g creatinine,

1.15 - 1.78 g/l blood, and up to 2% of total hemoglobin, respectively) (NR-7, 1994).

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

Chromium (µg/g creatinine)

Methemoglobin (%)

Hemoglobin (g/l)

Control

Drum Workshop Finishing Workshop

Fig. 1. Mean values on total chromium in urine (µg/g creatinine), methemoglobin (%)

and hemo globin (g/l) in study groups. Err or bars represent the standard deviation

(S.D.) of the mean. *P < 0.05 ( ANOVA, T ukey's Multiple Comp ar ison Test).

The cytogenetic parameters analyzed are presented in Table 2. The Comet assay

analysis indicated a slight but not significant increase in Damage Index (DI) in DW and

FW workers in relation to control. Workers from DW and FW did not present different

results obtained by Comet assay (Kruskal-Wallis Test, Dunn’s Multiple Comparison).

Smokers in all groups showed no significant increase in Comet assay values than their

non-smoking counterparts (data non-shown). Negative (DI = 0-4) and positive control (DI

= 615-800) for electrophoresis demonstrated negative and positive results, respectively

(data non-shown).

The results of MN frequency on 2000 binucleated lymphocytes (BNLMN) and NPB

(nucleoplasmic bridges) are also presented in Table 2. The FW workers presented an

increase in the number of BNLMN and NPB (P < 0.01 and P < 0.05, respectively), while

the DW workers showed a statistically significant increase in NPB frequencies (P < 0.01)

in relation to control group (ANOVA, Tukey's Multiple Comparison Test). The analysis of

EBCMN failed to show differences between the control and test groups. No difference was

detected between smokers and their counterparts on BNLMN, NPB, an d EBCMN analysis

(data non-shown).

Positive correlation was found between age and BNLMN frequencies in DW and FW

workers (r = 0.759, P < 0.001; and r = 0.361, P < 0.05, respectively). The same was not

observed for control group (r = 0.237, P = 0.235; Pearson correlation test) (Figure 2).

The effect of age on BNLMN frequency is presented in Figure 3, which shows the

individuals more than 30 years old (Control, n=14; DW, n=8; and FW, n=21) compared to

those to 30 years old (Control, n=15; DW, n=9; and FW, n=10). A significant increased

mean frequency of BNLMN in older individuals was observed in both DW and FW (P <

0.05). The correlation between BNLMN and the working time was not so clear; while the

DW presented a correlation (r = 0.679, P = 0.011), in the FW this correlation was not

significant (r = 0.265, P = 0.173; Pearson correlation test) (data non-shown).

Table 2

Mean values (mean ± S.D.) obtained by the cytogenetic parameters analyzed in control, Drum Workshop (DW), and Finishing

Workshop (FW) groups.

Comet assay

(200 leukocytes)

Binucleated Lymphocytes

(2000/subject)

Esfoliated Buccal Cells

(2000/subject)

n DI IL DF n BNLMN NPB n EBCMN

Control

3.45 ± 3.47 21.05 ± 0.11 1.52 ± 1.97

5.44 ± 2.44 2.78 ± 1.81

0.66 ± 0.81

4.24 ± 3.60 21.14 ± 0.16 1.56 ± 1.47

8.12 ± 4.96 7.06 ± 5.14**

0.50 ± 0.63

4.47 ± 4.19 21.12 ± 0.15 1.63 ± 1.41

8.72 ± 3.94** 5.84 ± 4.84*

0.75 ± 0.89

DI (Damage Index, 0–800); IL (DNA Image length, µm); DF (Damage Frequency, %); BNLMN (Binucleated Lymphocytes with

Micronucleus); NPB (Nucleoplasmatic Bridges); EBCMN (Exfoliated Buccal Cell with Micronucleus). *Data significant in relation to

control group at P < 0.05; **P < 0.01 (ANOVA, Tukey's Multiple Comparison Test).

Fig. 2. Correlation between MN frequencies in Binucleated Lymphocytes (BNLMN) and

age in Control (n=27), Drum Workshop (DW) (n=17), and Finishing Workshop (FW)

workers (n=32) (Pearson correlation test).

up to 30 ye ar s ol d

m or e t han 30 years old

Control

Drum Workshop

Finishing Workshop

Fig. 3. Effect of age on MN frequency Binucleated Lymphocytes. Error bars

represent the standard deviation (S.D.) of the mean. * P < 0.05 vs. younger

of the same group (t-test, two-tailed).

MN in 2000 Binucleated

Lymphocytes

4. Discussion

As soon as it was realized that Cr(VI) entails a high potential risk of cancer it was

completely replaced with the less dangerous Cr(III) in tannery industry. However, there

are still hazardous chemicals like alkalis, acids, dyes or solvents, which must be used in

several tannery departments and, although Cr(III) is considered to be of much lower

toxicity, the risk involved in chronic exposure is uncertain (EPA, 1998).

In the present study, although not statistically significant, chromium excretion in

urine from FW workers was slightly increased than in control and DW (Fig.1), probably

due to aniline and leather dust exposure in this workshop. This is in accordance with the

study made by Stupar et al. (1999), who concluded that the absorption of chromium from

leather dust may be more efficient in comparison to inorganic chromium. In addition,

hemoglobin levels were decreased in FW, possibly associated with body chromium

accumulation, causing adverse effects on iron metabolism, as suggested by Kornhauser

et al. (2002), who reported similar results in Mexican tannery workers. The occupational

exposure has shown that Cr(III) associated to certain ligants leads to cell death and/or

structural modification of proteins (Balamurugan et al., 2002; Rao et al., 2004). It is

reported that metal toxicity can be associated to oxidative tissue damage, due to the

catalytic role of metals in the oxidative deteriorating effect to biological macromolecules

(Okada, 1996). Also, studies describe that chromate promotes changes in morphology in

the red blood cells, and hemoglobin oxidation (methemoglobin formation) (Fernandes et

al., 1999), that also occur due to aniline exposure (Krishnan and Pelekis, 1995; Khan et

al., 1997; ASTDR, 2002b). Hemoglobin/methemoglobin ratio and cell shape, which are

crucial for the cell functions and survival, are irreversibly disrupted. Thus, in vivo, these

cells will be removed early from circulation, decreasing the hemoglobin in individuals

exposed to high chromate concentrations (Fernandes et al., 1999), as well as anilines.

Non-invasive urinary samples have been extensively used in biological monitoring of

chromium but its reliability is controversial. Once absorbed, Cr(III) compounds are rapidly

cleared from the blood and more slowly from the tissues (EPA, 1998). Since the half-life of

the metal in the blood stream is short, followed by a rapid urinary excretion or storage in

body tissues such as bone and liver, urinary levels, as well as plasma determinations,

may not provide an indication of low chronic exposure to chromium (Bukowski et al., 1991;

Simpson and Gibson, 1992; Christensen, 1995; Finley et al., 1996). According to Pan et

al. (1996) serum chromium concentration in exposed workers increased proportionally to

their working years, possible due to the accumulation. However, studies of chronic animal

exposure to various Cr(III) salts have provided no evidence of health effects consistent

with bioaccumulation (Anderson et al., 1997).

Studies using cytogenetic tests like the MN assay showed that nasal and buccal

mucosal cells, being directly exposed, are an excellent target for biomonitoring exposure

to mutagenic compounds (Salama et al., 1999; Majer et al., 2001; Faust et al., 2004). In

some of them, the frequency of MN in mucosal cells was significantly higher in individuals

exposed than in non-exposed, without an increase in micronuclei frequency in

lymphocytes (Norppa et al., 1992; Ying et al., 1997). Although the main exposure in

tanneries occurs by airborne substances, in the present study, an inverse result was

obtained: the Brazilian tannery workers did not present an increase in EBCMN, but on

other hand, an increased frequency of NPB was observed in both DW and FW workers,

as well as BNLMN, but it was statistically significant increased only in FW group.

The positive results of BNLMN but not of EBCMN were somewhat unexpected. The

increase in NPB denotes the micronucleus resulted mainly from clastogenic mechanism.

A possible explanation of the difference between the lymphocytes and exfoliated buccal

cells could be the metabolism and exposure of the tissues. It is known that blood cells

have a more complex metabolism, and are also submitted to the action of the products of

metabolism, while the epithelial cells are less affected by the metabolites. So, if one or

more metabolic products are responsible for the genotoxicity, it is expected that the target

are the blood cells. In addition, MN frequencies in lymphocytes reveal accumulated

chromosome damage (Delf et al., 1998), while MN in exfoliated cells reflect genotoxic

events that occurred in the dividing basal layer 1-3 weeks earlier (Tolbert et al., 1992).

If the clastogenicity is responsible for NPB in the lymphocytes, the absence of DNA

damage detected by Comet assay is surprising. Pitarque et al. (1999; 2002) found similar

results in shoe factory workers, with no sister chromatid exchange and DNA damage

measured by Comet assay, but increasing MN in binucleated lymphocytes. One possibility

is that the reduced DNA strand breaks can be caused by the elimination of cells with

extensive strand breaks, or the reduction in strand breaks due to incorrect rejoining of the

DNA molecules (Bonassi and Au, 2002), which could lead to MN formation, since there is

evidence that metal ions might interfere with distinct steps of diverse DNA repair systems

(Hartwig, 1998).

The effect of age on the frequency of BNLMN clearly emerges in the present study:

both DW and FW show an increase in MN frequency due to age (Fig. 2 and 3). The

BNLMN frequencies were also associated to working time, but this correlation was not so

clear. Data from most biomonitoring studies describe the positive correlation between MN

and age in control and in exposed groups (Bolognesi et al., 1997; Fenech et al., 1999;

Albertini et al., 2000) including tannery workers (Migliore et al., 1991). To explain these

findings, several possibilities have been suggested: a general increase of susceptibility in

older people (Crome, 2003); possible age-related changes in the transcriptional activation

xenobiotic genes (Ishikawa et al., 2004); changes in the ionic blood concentrations

(Fenech et al., 1997; 1998; Landi et al., 2000); and the possibility of cumulated exposure

and/or DNA damage (Migliore et al., 1991; Ishikawa et al., 2003). In the present study,

positive correlation was found between age and BNLMN in tannery workers, but not in

controls, suggesting that this age-associated increase in susceptibility can be higher in

exposed people, since the increasing effects of aging on MN frequency might reflect

accumulated genetic damage throughout the lifetime of the exposed people.

There was no evidence of toxic effects of Cr(III) in human dose response studies

(Campbell et al., 1999; Cefalu et al., 1999), but Cr(III) has been demonstrated to decrease

the accuracy of DNA synthesis (Snow, 1994). In vitro studies have also shown the

induction of micronuclei by Cr(III) in human diploid fibroblasts, showing a predominace of

aneugenic over clastogenic effects, since this compound should damage spindle proteins

(Seoane and Dulout, 2001). On the other hand, Blasiak and Kowalic (2000) report the

formation of DNA strand breaks as the prevalent mode of chromium damage to DNA.

These contradictory data suggest that further studies are needed to clarify this point.

However, leather processing in DW and FW also involves a considerable number of

potentially genotoxic substances, such as organic solvents, mainly formaldehyde, a

known mutagen and possibly a human carcinogen (Ballarin et al., 19 92; ASTDR, 1999;

Burgaz et al., 2002; Shaham et al., 2002) which may be contributing to the cytogenetic

lesions reported in this study.

Finally, our data indicate the presence of genotoxic exposure at the tannery

workplace, with increased values in older people. It is important to have in mind that

biomarker studies are still not generating the type of reliable information needed for

precise risk assessment, mainly in complex mixture exposures, as in tannery industry,

where the distinct production processes result in different levels, as well as different types

of exposures. For instance, the amount of chromium absorbed from airborne particulate

matter depends on the combined effect of several factors, which are responsible for the

large variability of absorption rate in the tannery population, even in the same department.

Also, there are other problems as the lack of predictable dose-response relationship, as

observed in the present study, and the existence of interindividual variations in response

to exposure, as suggested by Au et al. (1998). Studies of cytogenetic biomarkers among

exposed humans show that the determination of polymorphisms is becoming an

increasingly important aspect that may make the assays more sensitive and more specific

in identifying the effect and the sensitive subgroups (Norppa, 1997).

Acknowledgements

The authors would like to express their gratitude to all volunteers, for their

acceptation to participate in this study. We wish to thank Dr. Vera L.T. de Azevedo, Dr.

Poliana K. Hernandez, Dr. Anita Lehnen, from Vida Laboratory, especially Cíntia S. da

Silva and Dorelis M. de Souza for their valuable participation in the sampling. We also

thank Roseli O. de Cândido, Vanessa M. de Andrade, and Marcos R. Furini for their help

in questionnaire application. This work was financially supported by the CNPq (Conselho

Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico).

References

Albertini,R., Anderson,D., Douglas,G.R., Hagmar,L., Hemminki,K., Merlo,F.,

Natarajan,A.T., Norppa,H., Shuker,D.E.G., Tice,R.R., Waters,M.D. and Aitio,A. (2000)

IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans,

International Program on Chemical Safety. Mutat. Res., 463, 111-172.

Anderson,R.A., Bryden,N.A. and Polansky,M.M. (1997) Lack of toxicity of chromium

chloride and chromium picolinate in rats. J. Am. Coll. Nutr., 16, 273-270.

Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) (1999) Toxicological profile

for formaldehyde. On line:

http://www.astdr.cdc.gov/toxfaq.html

Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) (2000) Chromium Toxicity,

Case studies in Environmental Medicine. On line:

http://www.astdr.cdc.gov/HEC/CSEM/

Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) (2002a) Toxicological profile

for chromium. On line:

http://www.astdr.cdc.gov/toxfaq.html

Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) (2002b) Toxicological profile

for anilines. On line:

http://www.astdr.cdc.gov/toxfaq.html

Au,W.W., Cajas-Salazar,N. and Salama,S. (1998) Factors contributing to discrepancies in

population monitoring studies. Mutat. Res., 400, 467-478.

Bagchi,D., Stohs,S.J., Downs,B.W., Bagchi,M. and Preuss,H.G. (2002) Cytotoxicity and

oxidative mechanism of different forms of chromium. Toxicology, 180, 5-22.

Balamurugan,K., Rajaram,R., Ramasani,T. and Narayanan,S. (2002) Chromium(III)-

induced apoptosis of lymphocytes: death decision by ROS and Src-family tyrosine

kinase. Free Rad. Biol. Med., 33, 1622-1640.

Ballarin,C., Sarto,F., Giacomelli,L., Bartolucci,G.B. and Clonfero,E. (1992) Micronucleated

cells in nasal mucosa of formaldehyde-exposed workers. Mutat. Res., 280, 1-7.

Battista,G., Comba,P., Orsi,D., Norpoth,K. and Maier,A. (1995) Nasal cancer in leather

workers: an occupational disease. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 121, 1-6.

Bianchi,V. and Levis,A.G. (1984) Mechanisms of chromium genotoxicity. Toxicol. Environ.

Chem., 9, 1-25.

Blasiak,J. and Kowalik,J. (2000) A comparison of in vitro genotoxicity of tri- and

hexavalent chromium. Mutat. Res., 469, 135-145.

Bolognesi,C., Abbondandolo,A., Barale,R., Casalone,R., Dalpra,L., DeFerrari,M.,

Degrassi,F., Forni,A., Lamberti,L., Lando,C., Migliore,L., Padovani,P., Pasquini,R.,

Puntoni,R., Sbrana,I., Stella,M. and Bonassi,S. (1997) Age-related increase of baseline

frequencies of sister chromatid exchanges, chromosome aberrations, and micronuclei

in human lymphocytes. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 6, 249-256.

Bonassi,S. and Au,W.W. (2002) Biomarkers in molecular epidemiology studies for health

risk prediction. Mutat. Res., 511, 73-86.

Burgaz,S., Erdem,O., Cakmak,G., Erdem,N., Karakaya,A. and Karakaya,A.E. (2002)

Cytogentic analysis of buccal cell from shoe-workers and pathology and anatomy

laboratory workers exposed to n-hexane, toluene, metyl ethyl ketona and

formaldehyde. Biomarkers, 7, 151-161.

Bukowski,J.A., Golstein,M.D., Korn,L.R. and Johnson,B.B. (1991) Biological markers in

chromium exposure assessment: confounding variables. Arch. Environ. Health, 46,

230-236.

Campbell,W.W., Joseph,L.J., Davey,S.L., Cyr-Campbell,D., Anderson,R.A. and

Evans,W.J. (1999) Effects of resistance training and chromium tripicolinate on body

composition and skeletal muscle in older men. J. Appl. Physiol., 86, 29-39.

Carrano,A.V. and Natarajan,A.T. (1988) Considerations for population monitoring using

cytogenetic techniques, International Commission for Protection against Environmental

Mutagens and Carcinogens (ICPEMC publication 14). Mutat. Res., 204, 379-406.

Cefalu,W.T., Bell-Farrow,A.D., Stegner,J., Wang,Z.Q., King,T., Morgan,T. and Terry,J.G.

(1999) Effects of chromium tripicolinate on insulin sensitivity in vivo. J. Trace Elem.

Exp. Med., 12, 71- 83.

Christensen,J.M. (1995) Human exposure to toxic metals: factors influencing

interpretation of biomonitoring results. Sci. Total Environ., 166, 89-135.

Cid,M.G., Loria,D., Vilensky,M., Miotti,J.L. and Matos,E. (1991) Leather tanning workers:

chromossomal aberrations in peripheral lymphocytes and micronuclei in exfoliated cell

in urine. Mutat. Res., 259, 197-201.

Collins,A.R., Dobson,V.L., Dusinská,M., Kennedy,G. and Stetina,R. (1997) The Comet

assay: what can it really tell us? Mutat. Res., 375, 183-193.

Constantini,S.A., Merler,E. and Saracci,R. (1990) Epidemiologic studies on carcinogeneic

risk and occupational activities in tanning, leather and shoe industries. Med. Lav., 81,

184-211.

Crome,P. (2003) What`s different about older people. Toxicology, 192, 49-54.

Delf,J.H., Baan,L. and Roza,R.A. (1998) Biological effect markers for exposure to

carcinogenic compounds and their relevance for risk assessment. Crit. Rev. Toxicol

28, 477-510.

Environmental Protection Agency (EPA) (1998) Toxicological review of trivalent

chromium. In Support of Summary Information on the Integrated Risk Information

(IRIS). On-line:

http://epa.gov/iris

Faust,F., Kassie,F., Knasmüller,S., Kevekordes,S. and Mersch-Sundermann,V. (2004)

Use of primary blood cells for the assessment of exposure to occupational

genotoxicants in human biomonitoring studies. Toxicology, 198, 341-350.

Fenech,M., Dreosti,I.E. and Rinaldi,J.R. (1997) Folate, vitamin B12, homocysteine status

and chromosome damage rate in lymphocytes of older man. Carcinogenesis, 18, 1329-

1336.

Fenech,M., Aitken,C. and Rinaldi,J. (1998) Folate, vitamin B12, homocysteine status and

DNA damage in young Australian adults. Carcinogenesis, 19, 1163- 1171.

Fenech,M., Titenko-Holland,N., Chang,W.P., Zeiger,E. and Bonassi,S. (1999) The Human

Micronucleus Project – An international colaborative study on the use of the

micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutat. Res., 428, 271-

283.

Fernandes,M.A.S., Mota,I.M., Silva,M.T.L., Oliveira,C.R., Geraldes,C.F.G.C. and

Alpoim,M.C. (1999) Human Erythrocytes are protected against chromate-induced

peroxidation. Ecotoxicol. Environ. Safety, 43, 38-46.

Finley,B.L., Scott,P.K., Norton,R.L., Gasgas,M. and Paustenbach,D.J. (1996) Urinary

chromium concentrations in humans following ingestion of safe doses of hexavalent

and trivalent chromium: implications for biomonitoring. J. Toxicol. Environ. Health, 48,

479-499.

Hamamy,H.A., Al-Hakkak,Z.S. and Hussain,A.F. (1987) Chromosome aberrations in

workers a tannery in Iraq. Mutat. Res., 189, 395-398.

Hartwig,A. (1998) Carcinogenicity of metal compounds: possible role of DNA repair

inhibition. Toxicol. Lett., 102, 235-239.

International Agency for Research on Cancer (IARC) (1987) Leather tanning and

processing. IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals

to humans, Vols. 25, Suppl. 7, Lyon. pp. 232. On-line:

http://www.inchen.org/pages/iarc.html

Ishikawa,H., Tian,Y. and Yamauchi,T. (2003) Influence of gender, age and lifestyle factors

on micronuclei frequency in healthy Japanese population. J. Occup. Health, 45, 179-

181.

Ishikawa,H., Yamamoto,H., Tian,Y., Kawano,M., Yamauchi,T and Kazuhito,Y. (2004)

Evidence of association of the CYP2E1 genetic polymorphism with micronuclei

frequency in human peripheral blood. Mutat. Res., 546, 45-53.

Khan,M.F., Wu,X., Kaphalia,B.S., Boor,P.J. and Ansari,G.A.S. (1997) Acute

hematopoietic toxicity of aniline in rats. Toxicol. Lett., 92, 31-37.

Kornhauser,C., Wrobel,K., Malacara,J.M., Nava,L.E., Gomez,L. and Gonzales,R. (2002)

Possible adverse effect of chromium in ccupational exposure of tannery workers. Ind.

Health, 40, 207-212.

Krishnan,K. and Pelekis,M. (1995) Hematotoxic interaction: occurrence, mechanism and

predictability. Toxicology, 105, 355-364.

Landi,S., Iazzolino,E. and Barale,R. (2000) Are baseline frequencies of SCEs, CAs, and

MN in human lymphocytes related to hematological values? Mutat. Res., 469, 159-166.

Majer,B.J., Laky,B., Knasmüller,S. and Kassie,F. (2001) Use of the micronucleus assay

with exfoliated epithelial cells as a biomarker for monitoring individuals at elevated risk

of genetic damage and in chemoprevention trials. Mutat. Res., 489, 147-172.

Medeiros,M.G., Rodrigues,A.S., Batoréu,M.C., Laires,A., Rueff,J. and Zhitkovich,A. (2003)

Elevated levels of DNA – protein crosslinks and micronuclei peripheral lymphocytes of

tannery workers exposed to trivalent chromium. Mutagenesis, 18, 19-24.

Migliore,L., Parrini,M., Sbrana,I., Biagini,C., Battaglia,A. and Loprieno,N. (1991)

Micronucleated lymphocytes in people occupationally exposed to potential

environmental contaminants: the age affect. Mutat. Res., 256, 13-20.

Montanaro,F., Ceppi,M., Demers,P.A., Puntoni,R. and Bonassi,S. (1997) Mortality in a

cohort of tannery workers. Occup. Environ. Med., 8, 588-591.

Norma Regulamentadora N°7 (1994) Segurança e Medicina do Trabalho – NR-7 –

programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional. Portaria GM/SSSTb n. 24 –

(DOU 30.12.94).

Norppa,H., Heikanen,H., Pfaffli,P. and Virtanen,H. (1992) Increased micronuclei in buccal

mucosa cells but not in blood lymphocytes of formaldehyde exposed workers.

Pharmacol. Toxicol., 70, 22-27.

Norppa,H. (1997) Cytogenetic markers of susceptibility: Influence of polymorphic

carcinogen-metabolizing enzymes. Environ. Health Perspect., 105, 829-835.

Okada,S. (1996) Iron-induced tissue damage and cancer: the role of reactive oxygen

species-free radicals. Pathol. Int., 46, 311-332.

Pan,T.C., Wu,W.J., Huang,K.C., Wei,B.L. and Ko,Y.C. (1996) Biological monitoring for

chromium exposure in the workplace. Jap. J. Toxicol. Environ. Health, 42, 301-306.

Pitarque,M., Vaglenov,A., Nosko,M., Hirvonen,A., Norppa,H., Creus,A. and Marcos,R.

(1999) Evaluation of DNA damage by Comet assay in shoe-workers exposed to

toluene and other organic solvents. Mutat. Res., 441, 115-127.

Pitarque,M., Vaglenov,A., Nosko,M., Pavlova,S., Petkova,V., Hirvonen,A., Creus,A.,

Norppa,H. and Marcos,R. (2002) Sister chromatid excahanges and micronuclei in

peripheral lymphocytes of shoe factory workers exposed to solvents. Environ. Health

Perspect., 110, 339-404.

Rao,J.R., Kanthiamathi,M., Tahnikaivelan,P., Sreeram,K.L., Ramesh,R., Ramalingam,S.,

Chandrababu,N.K., Nair,B.U. and Ramasani,T. (2004) Pickle-free chrome tanning

using a polymeric synthetic tanning agent for cleaner leather processing. Clean

Technol. Environ. Policy, 6, 243-249.

Rajaram,R., Nair,B.U. and Ramasami,T. (1995) Chromium(III) induced abnormalities in

human lymphocyte cell proliferation: evidence for apoptosis. Biochem. Biophys. Res.

Commun., 210: 434-440.

Salama,S.A., Serrana,M. and Au,W.W. (1999) Biomonitoring using accessible human

cells for exposure and health risk assessment. Mutat. Res., 436, 99-112.

Santos,A.M.M.M., Correa,A.R., Alexim,F.M.B. and Peixoto,G.B.T. (2002) Panorama do

setor de couro no Brasil. Banco Nacional para o Desenvolvimento Social (BNDES)

Setorial, Rio de Janeiro, n.16, p. 65-84.

Sbrana,I., Caretto,S. and Battaglia, A. (1991) Chromossomal aberration of workers in

tannery industries. Mutat. Res., 242, 331-336.

Seoane,A.I. and Dulout,F.N. (2001) Genotoxic ability of cadmium, chromium and nickel

salts by kinetochore staining in the cytokinesis-blocked micronucleus assay. Mutat.

Res., 490, 99-106.

Shaham,J., Gurvich,R. and Kaufman,Z. (2002) Sister chromatid exchange in pathology

staff occupationally exposed to formaldehyde. Mutat. Res., 514, 115–123.

Silva,J., Freitas,T.R.O., Heuser,V.D., Marinho,J.R. and Erdtmann,B. (2000) Genotoxicity

Biomonitoring in Coal Regions Using Wild Rodent Ctenomys torquatus by Comet

Assay and Micronucleus Test. Environ. Mol. Mutagen., 35, 270-278.

Simpson,J.R. and Gibson,R.S. (1992) Hair, serum, and urine chromium concentrations in

former employed of the leather tanning industry. Biol. Trace Elem. Res., 32, 155-159.

Singh,N.P., McCoy,M.T., Tice,R.R. and Schneider,E.L. (1988) A simple technique for

quantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res., 175, 184-

191.

Snow,E.T. (1994) Effects of chromium on DNA replication in vitro. Environ. Health

Perspect., 102, 41-44.

Stern,F.B. (2003) Mortality among chrome leather tannery workers: an update. Am. J. Ind.

Med., 44, 197-206.

Stupar,J., Vrtovec,M., Kocijancic,A. and Gantar,A. (1999) Chromium status of tannery

workers in relation to metabolic disorders. J. Appl. Toxicol., 19, 437-446.

Tice,R.R., Agurell,E., Anderson,D., Burlinson,B., Hartmann,A., Kobayashi,H., Miyamae,Y.,

Rojas,E., Ryu,J.C. and Sasaki,Y.F. (2000) Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for

in vitro and in vivo Genetic Toxicology Testing. Environ. Mol. Mutagen., 35, 206-221.

Titenko-Holland,N., Jacob,R., Shang,N., Balaraman,A. and Smith,M.T. (1998) Micronuclei

in lymphocytes and expholiated buccal cells of postmenopausal women with dietary

changes in folate. Mutat. Res., 417, 101-114.

Tolbert,P.E., Shy,C.M. and Allen,J.W. (1992) Micronuclei and other nuclear anomalies in

buccal smears: method development. Mutat. Res., 271, 69-77.

Veyalkin,I.V. and Milyutin,A.A. (2003) Proportionate cancer mortality among workers in

the Belarussian tanning industry. Am. J. Ind. Med., 44, 637-42.

World Health Organization (WHO) (2001) Environmental Health Criteria 222: Biomarkers

in risk assessment: Validity and validation. IPCS (International Program on Chemical

Safety), Geneva. On-line:

http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc222.htm

Ying,C.J., Yan,W.S., Zhao,M.Y., Ye,X.L., Xie,H., Yin,S.Y. and Zhu,X.S. (1997) Micronuclei

in nasal mucosa, oral mucosa and lymphocytes in students exposed to formaldehyde

vapor in anatomy class. Biomed. Environ. Sci., 10, 451-455.

4. CAPÍTULO II

Influence of metabolizing gene polymorphisms on genotoxicity in Brazilian Tannery

workers.

Vanina Dahlström Heuser

, Juliana da Silva

*, Kátia Kvitko

, Paula Rohr

& Bernardo

Erdtmann

1,3

Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGGBM),

Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre-RS, Brazil.

Laboratório de Genética Toxicológica, Programa de Pós-Graduação em Ensino de

Ciências e Matemática (PPGECIM), Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Canoas-

RS, Brazil.

Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul (UCS), Caxias do Sul-RS,

Brazil.

*Correspondence to: Juliana da Silva, Programa de Pós-Graduação em Ensino de

Ciências e Matemática (PPGECIM), Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Prédio 14,

Sala 230, Rua Miguel Tostes 101, Bairro São Luís, CEP 92420-280, Canoas-RS, Brazil.

E-mail:

[email protected]

Grant sponsors: CNPq, FAPERGS, GENOTOX

A SER ENVIADO PARA A REVIST A TOXICOLOGY LETTERS

Abstract

Biomarkers have received considerable interest as tools for detecting human

genotoxic exposure, being classified as those of exposure, effects and susceptibility. The

present study was carried out in a group of 45 male Tannery wo rkers exposed to

chromium, alkalis, acids, dyes and organic solvents. Forty healthy males were used as

controls. As biomarkers of exposure we obtained data on chromium in urine,

methemoglobin, hemoglobin and reparable DNA damage measured by Comet assay.

Micronucleus (MN) frequency in binucleated lymphocytes (BNL) and in exfoliated buccal

cells (EBC) were considered biomarkers of early effect, while individual variations of the

genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1 and CYP2E1 were used as biomarkers of

susceptibility. Our results show a slight but not significant increase in chromium excretion

in urine and methemoglobin levels in Tannery workers when compared with the control

group. The mean levels of hemoglobin were lower in Tannery workers in relation to

controls (P < 0.05). The analysis indicated a slight increase in DNA damage in Tannery

workers, but a statistically significant increase was observed in BNLMN (P < 0.05) and

NPB (P < 0.001) in relation to control group. A positive correlation was also found

between age and BNLMN frequencies in Tannery workers (r = 0.514, P < 0.01). No

difference was found between controls and Tannery workers regarding EBCMN

frequencies. The results of the current study shows that Tannery workers with the

CYP2E1*1A/*1A (the wild type) had increased values in DNA damage measured by

Comet assay in comparison to CYP2E1 variant genotypes (*1A/*5B or *5B/*5B) (P <

0.03), while in the control group the CYP1A1 variant genotype (*1A/*2C or *2C/*2C)

seems to increase the baseline of nucleoplasmic bridges (NPB) when compared to

CYP1A1 wild (*1A/*1A) genotype (P < 0.05). Our biomarkers of susceptibility suggest the

modulation of the genotoxicity by the analyzed enzymes of the CYP450 system in the

Tannery workers studied, since the different GST genotypes investigated did not influence

the level of cytogenetic damage between groups.

Keywords: Occupational exposure, Tannery-worker, Comet assay; Micronucleus test

(MN), Trivalent chromium (Cr(III)), Metabolizing genes.

1. Introduction

In spite of employees engaged in the tanning and finishing of leather being

potentially exposed to numerous carcinogens (Stern, 2003), leather tanning and

processing entail exposures that are not classifiable as to carcinogenicity to humans

(IARC, 1987). However, there have been several reports on the increased mortality from

cancers in Tannery workers (Constantini et al., 1990; Battista et al., 1995; Montanaro et

al., 1997; Stern, 2003; Veyalkin and Milyutin, 2003) but the results of these studies are

controversial. Similarly, several studies have reported the increase in DNA-protein

crosslinks, micronuclei (MN) in peripheral blood lymphocytes (Medeiros et al., 2003),

micronucleated exfoliated bladder cells and elevated chromosomal aberration (CA) rates

in Tannery workers (Cid et al., 1991; Sbrana et al., 1991), while others have found no

significant increase in chromosome damage (Hamamy et al., 1987; Migliore et al., 1991).

People employed in leather tanning industries can be exposed to higher-than-

normal level of chromium, mostly trivalent chromium (Cr(III)) (ASTDR, 2002a), either

inorganic Cr(III) compounds or chromium bound to proteins (leather dust) (Stupar et al.,

1999). Thus, in most of studies, exposure to chromium was pointed out as the main

genotoxic agent in tanneries. Little toxic effects is attributed to Cr(III) when present in very

large quantities while hexavalent chromium (Cr(VI)) has been found biologically active

(Pan et al., 1996). As soon as it was realized that Cr(VI) entails a high potential risk of

cancer it was completely replaced with the less dangerous Cr(III) in tannery industry.

However, there are still hazardous chemicals like alkalis, acids, dyes or solvents, mainly

formaldehyde, which must be used in several tannery departments and, although Cr(III) is

considered to be of much lower toxicity, the risk involved in chronic exposure is uncertain

(EPA, 1998; Medeiros et al., 2003). Concentrations of chromium in blood, serum, urine

and hair have long been used in biological monitoring of environmentally and

occupationally exposed populations, as biomarkers of exposure (Simpson and Gibson,

1992; Rajaram et al., 1995; Pan et al., 1996; EPA, 1998; Stupar et al., 1999; Medeiros et

al., 2003).

During the last few years, genotoxicity biomarkers have received considerable

interest as tools for detecting human genotoxic exposure and effects, especially in health

surveillance programs dealing with occupational exposure to chemical carcinogens

(Pitarque et al., 2002). Increasing attention has recently been focused on genetic

polymorphisms that could modulate biomarker response to genotoxic carcinogens

(Norppa, 1997; Autrup, 2000; Pavanello and Clonfero, 2000; Norppa, 2001). Any

polymorphisms that affect xenobiotic metabolism or cellular response to DNA damage

could, in principle, modify individual sensitivity to genotoxins, increasing the susceptibility

(Norppa, 2003). Some of the cytogenetic biomarkers are believed to represent events in a

causal pathway to disease; their occurrence may be viewed as indicative of having

significantly increased risk for disease (Cebulska-Wasilewska, 2003). Thus, biomarkers

are classified as those of exposure, effects and susceptibility (WHO, 2001). However,

biomarker studies are still not generating the type of reliable information needed for

precise risk assessment. Some of the problems are due to inconsistent observation of

biological effects from similarly exposed populations, lack of predictable dose-response

relationship and existence of interindividual variations in response to exposure (Au et al.,

1998).

In our recent study (Heuser et al., in prep) tannery workers from both Drum

Workshop and Finishing Workshop presented increased values of cytogenetic damage

measured by MN and nucleoplasmic bridges (NPB) in peripheral lymphocytes. We also

observed a positive correlation between age and MN frequency in exposed groups, and a

decrease in hemoglobin levels of Finishing workers, so the possible influence of chromium

in iron metabolism and methemoglobin formation are discussed. However, chromium

concentration in urine was not significantly different in any of the groups, and no

correlations were found between the chromium, hemoglobin, methemoglobin and

cytogenetic parameters analyzed. Thus, although it may not be possible to point out a

single genotoxic agents at the workplace, we concluded that the presence of potentially

genotoxic substances besides chromium, such as organic solvents, mainly formaldehyde,

may have contributed to the cytogenetic lesions reported. In the p resent study, we

evaluated if individual variations of the genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP1A1 and

CYP2E1 and if their diverse ability to metabolize the xenobiotics could modify individual

susceptibility to the observed genotoxic effects.

2. Materials and Methods

2.1. Study subjects

This study was approved by the Brazilian National Ethical Committee on Research

(Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP) and informed written consent was

obtained from each individual prior to the start of the study.

The study was carried out in a group of 45 male workers from 3 tannery industries

from Estância Velha, in Rio Grande do Sul State (RS). The control group consisted of 40

healthy males from the same area, without previous occupational exposure to any

substances able to cause mutagenic and or genotoxic effects.

All the individuals examined in the study lived in or near the city of Novo Hamburgo

and were required to answer a Portuguese version of a questionnaire from the

International Commission for Protection against Environmental Mutagens and

Carcinogens (Carrano and Natarajan, 1988) and participate in a face-to-face

questionnaire which included standard demographic data (age, gender, etc.) as well as

questions relating to medical issues (exposure to X-rays, vaccinations, medication, etc.),

life style (smoking, coffee, alcohol, diet, etc.) and their occupation (number of hours

worked per day, time exposed to chromium, acids, and organic solvents, use of protective

measures, etc.). In all the groups, individuals who smoked more than 5 cigarettes/day for

at least 1 year were considered smokers. The characteristics of the three groups are

presented in Table I.

Blood and urine samples were obtained from Tannery workers on the same da y

during a normal shift during the workers periodical medical examinations by the nurses by

Vida Laboratory (laboratory of Clinic Analysis, Estância Velha, RS). For the control group,

2.2.2. Comet assay

The alkaline Comet assay was performed as described by Singh et al. (1988) with

the modifications suggested by Tice et al. (2000). Blood cells (5 µl) were embedded in 95

µl of 0.75% low-melting point agarose and when the agarose had solidified the slides were

placed in lysis buffer (2.5M NaCl, 100mM EDTA and 10mM Tris; pH 10.0-10.5) containing

freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) for a

minimum of 1 hour and a maximu m of two weeks. After treatment with lysis buffer, the