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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PEDIATRIA E SAÚDE DA CRIANÇA
MESTRADO EM PEDIATRIA E SAÚDE DA CRIANÇA
CÉLULAS-TRONCO DE CORDÃO UMBILICAL
HUMANO EM MODELO EXPERIMENTAL DE
HIPÓXIA-ISQUEMIA NEONATAL EM RATOS
Simone de Paula
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade
de Medicina da PUC-RS para a obtenção do título de
Mestre em Saúde da Criança
Orientador: Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa
Co-orientador: Prof. Dr. Humberto Holmer Fiori
Porto Alegre, 2007
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Milhares de livros grátis para download.
ii
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
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iii
Dedicatória
DedicatóriaDedicatória
Dedicatória
Aos meus queridos pais, pelo exemplo de
vida, pelo amor, dedicação, confiança e incentivo.
iv
Agradecim
AgradecimAgradecim
Agradecimentos
entosentos
entos
Aos meus orientadores, Dr. Jaderson Costa da Costa e Dr. Humberto Holmer
Fiori, pelo suporte científico, pelo exemplo profissional, pela oportunidade de
aprendizado e pelo incentivo durante a realização desse estudo.
Ao professores do Programa de Pós-gradução em Pediatria da PUC-RS, em
especial, ao Dr. Renato Machado Fiori, pela confiança e pela oportunidade.
Aos queridos colegas e amigos do Laboratório de Neurociências, em especial
a Simone Salamoni, Daniela Abreu, Zuzete Pires, Yanet Alves, Raquel Mattos
Gianina Venturin, ao Ricardo Breda, Samuel Greggio, Affonso Santos Vitola, Mário
Duarte e Davi de Paula, pela acolhida, pela amizade e pelo apoio essencial.
À Dra. Denise Cantarelli Machado e aos biólogos Jeremiah Mistrello Lubianca
e Christian Viezzer, do Centro de Terapia Celular do Instituto de Pesquisas
Biomédicas da PUC-RS, pelo auxílio na separação das células-tronco.
Às secretárias Carla, Ana e Nelcy, pela disposição em sempre ajudar.
Ao Dr. Mário Wagner, pelos ensinamentos metodológicos e pelo auxílio na
análise estatística.
Ao Dr. Alexandre Dolganov, pelo auxílio na elaboração das micropipetas.
Ao. Dr. Léder Xavier, pelo apoio nas avaliações histológicas.
Ao funcionário Tiago Giuliani Lopes, do Laboratório de Anatomia Patológica
do Hospital São Lucas da PUC-RS, pela ajuda nas análises imuno-histoquímicas.
v
Ao Dr. Jefferson Braga, chefe do Laboratório de Cirurgia Experimental da
Faculdade de Medicina da PUC-RS e ao técnico Gilmar, pelo apoio na realização
das cirurgias.
Ao Dr. Martín Cammarota e à Pamela Billig Mello, do Centro de Memória do
Instituto de Pesquisas Biomédicas da PUC-RS, pelas informações e pela ajuda na
realização dos testes comportamentais.
Ao CNPQ, pelo fornecimento da bolsa de estudo, essencial para a dedicação
a esta pesquisa.
À minha família, pelo ajuda e incentivo constantes.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ ix
LISTA DE TABELAS............................................................................................................. x
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ xi
RESUMO............................................................................................................................ xiii
ABSTRACT........................................................................................................................ xiv
CAPÍTULO I
REFERENCIAL TEÓRICO
1 REFERENCIAL TEÓRICO....................................................................................... 17
1.1 Encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal.............................................................. 17
1.1.1 Etiologia.....................................................................................................................................18
1.1.2 Mecanismo patogênico .............................................................................................................18
1.1.3 Manifestações clínicas ..............................................................................................................21
1.1.4 Correlações clínico-patológicas ................................................................................................23
1.1.5 Estratégias neuroprotetoras......................................................................................................25
1.1.6 Modelos animais para o estudo da hipóxia-isquemia neonatal ................................................28
1.2 Células-tronco e doenças do sistema nervoso central.............................................. 30
1.2.1 Células-tronco de cordão umbilical e encefalopatia hipóxico-isquêmica..................................33
1.3 Justificativa .............................................................................................................. 36
1.4 Hipóteses alternativas.............................................................................................. 37
1.5 Objetivos.................................................................................................................. 38
1.6 Referências bibliográficas ........................................................................................ 38
vii
CAPÍTULO II
MATERIAIS E MÉTODOS
2 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 45
2.1 Animais .................................................................................................................... 45
2.2 Fase I (piloto): modelo de hipóxia-isquemia neonatal............................................... 46
2.2.1 Indução da lesão hipóxico-isquêmica .......................................................................................46
2.2.2 Avaliação da memória espacial: labirinto aquático de Morris ...................................................48
2.2.3 Avaliação histológica.................................................................................................................50
2.3 Fase II: uso de células-tronco em modelo experimental de hipóxia-isquemia........... 52
2.3.1 Grupos experimentais ...............................................................................................................52
2.3.2 Obtenção, preparo e administração das células-tronco de cordão umbilical humano .............53
2.3.3 Avaliação da memória espacial: labirinto aquático de Morris ...................................................55
2.3.4 Experimento adicional: avaliação das funções neuromotoras..................................................55
2.3.5 Avaliação histológica.................................................................................................................61
2.4 Análise estatística .................................................................................................... 64
2.5 Cálculo amostral ...................................................................................................... 64
2.6 Aspectos éticos........................................................................................................ 65
2.7 Referências bibliográficas ........................................................................................ 65
CAPÍTULO III
ARTIGO ORIGINAL
ABSTRACT......................................................................................................................... 71
INTRODUCTION ................................................................................................................. 72
MATERIALS AND METHODS ............................................................................................ 73
RESULTS............................................................................................................................ 82
DISCUSSION ...................................................................................................................... 85
REFERENCES .................................................................................................................... 89
viii
CAPÍTULO IV
CONCLUSÕES
CONCLUSÕES ................................................................................................................. 100
CAPÍTULO V
RESULTADOS COMPLEMENTARES
5 RESULTADOS COMPLEMENTARES................................................................... 103
5.1 Resultados da fase I (piloto) no Labirinto Aquático de Morris ................................. 103
5.2 Correlação entre o método de delineamento e a contagem de pontos................... 104
5.3 Avaliação imuno-histoquímica ................................................................................ 104
ANEXO
TERMO DE CONSENTIMENTO........................................................................................ 108
APÊNDICE
BANCO DE DADOS.............................................................................................................. ii
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Figura II-1 - Etapas da indução da lesão hipóxico-isquêmica........................................ 48
Figura II-2 - Labirinto aquático de Morris......................................................................... 49
Figura II-3 - Método de administração intravenosa......................................................... 55
Figura II-4 - Diagrama das etapas do estudo ................................................................... 56
Figura II-5 - Exploração no campo aberto........................................................................ 58
Figura II-6 - Teste do cilindro............................................................................................ 59
Figura II-7 - Deslize no teste da caminhada na grade ..................................................... 60
Figura II-8 - Teste da trave................................................................................................. 61
Figura II-9 - Métodos para estimativa do volume do hemisfério .................................... 63
CAPÍTULO III
Figure 1 - Morris water maze test ..................................................................................... 94
Figure 2 - Gross appearance of rat brain in sham-operated, saline and human umbilical
cord blood groups three weeks after hypoxic-ischemic injury ...................................... 95
Figure 3 - The mean volume of hemisphere in all groups............................................... 96
Figure 4 - Digitized images of Nissl-stained coronal sections of brain rat.................... 97
CAPÍTULO V
Figura V-1 - Latência de escape no labirinto aquático de Morris nos cinco dias de
treino ............................................................................................................................... 103
Figura V-2 - Gráfico de dispersão, mostrando a correlação entre a contagem de pontos
e o método de delineamento para o cálculo do volume ............................................... 104
Figura V-3 - Avaliação imuno-histoquímica do cérebro do rato 7 dias após o
transplante de células-tronco de cordão umbilical humano ........................................ 106
x
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO III
Table 1- Motor performance in three groups of study .................................................... 93
Table 2- Volume analysis of subareas of left and right hemispheres in HUCB cells,
saline and sham-operated groups.................................................................................... 93
CAPÍTULO V
Tabela V-1- Resultados do piloto no labirinto aquático de Morris três semanas após a
indução da lesão.............................................................................................................. 103
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
Σ
ΣΣ
ΣP
Soma dos pontos
µL Microlitros
µm Micrômetros
A Área
A/P Área ponto
AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato
ATP Adenosina trifosfato
BBB Blood brain barrier
CA Corno de Amon
Ca
2+
Cálcio
cm Centímetros
CT Células-tronco
DAB Diaminobenzidina
DP Dia pós-natal
DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
FEPPS Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde
g Gramas
h Hora
HI Hipóxia-isquemia
HUCB Human umbilical cord blood
xii
ip Intraperitoneal
IR Interquartile range
MAB Mouse Anti-human Nuclei Monoclonal Antibody
ml Mililitros
mm
2
Milímetro quadrado
mm
3
Milímetro cúbico
MWM Morris Water Maze
n Sample size
Na
+
Sódio
NMDA N-metil-D-aspartato
O
2
Oxigênio
PBS Phosphate Buffered Saline
PFA Paraformaldeído
PUC-RS Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SD Standard deviation
sec ou s Second ou segundos
T Distância
V (est) Estimativa do volume
xiii
RESUMO
Introdução: A lesão hipóxico-isquêmica neonatal é uma causa importante de
mortalidade e morbidade na infância, levando, freqüentemente, a retardo mental,
epilepsia e paralisia cerebral. O sangue do cordão umbilical humano, rico em
células-tronco adultas, é uma fonte potencial para a terapia celular em perinatologia.
Objetivo: Investigar os efeitos das células-tronco de cordão umbilical humano na
memória de orientação espacial, no desempenho motor e nos desfechos histológicos
em ratos neonatos submetidos à hipóxia-isquemia neonatal (HI).
Métodos: Ratos de 7 dias de vida foram submetidos à oclusão da artéria carótida
direita seguida por exposição a ambiente hipóxico (8% O
2
) por 2 h. Após vinte e
quatro horas, os ratos receberam solução salina ou células-tronco de cordão
umbilical humano por via intravenosa. Um grupo de animais cirurgia-simulada
também foi adicionado. Após três semanas, a memória espacial foi avaliada através
do labirinto aquático de Morris e as avaliações motoras aplicadas foram o campo
aberto, os testes do cilindro, da grade e da trave. Subseqüentemente, os ratos foram
sacrificados para as avaliações histológicas.
Resultados: Ratos com HI mostraram um significativo prejuízo na memória espacial
e uma redução volumétrica do hemisfério ipsilateral à oclusão arterial. Nos testes
motores, os animais submetidos à HI mostraram apenas uma tendência a déficits
nos testes do cilindro e da grade. No entanto, os animais tratados com células-tronco
de cordão umbilical humano não mostraram diferenças estatísticas nos testes
comportamentais e na atrofia cerebral quando comparados ao grupo que recebeu
solução salina.
Conclusão: Este estudo sugere que a injeção intravenosa de células-tronco de
cordão umbilical humano não melhora os desfechos comportamentais e histológicos
em ratos após HI severa. Investigações adicionais, considerando aspectos como
dose, tempo para o transplante, métodos de injeção, uso de imunossupressão e de
terapias associadas são necessárias para avaliar a relevância clínica da terapia
celular na lesão cerebral neonatal.
Descritores: células-tronco, asfixia neonatal, cordão umbilical, modelos animais,
hipóxia-isquemia encefálica.
xiv
ABSTRACT
Introduction: Hypoxic-ischemic injury is an important cause of mortality and
morbidity in infants, often leading to mental retardation, epilepsy and cerebral palsy.
Human umbilical cord blood (HUCB), which is rich in adult stem cells, is a potential
source of cellular therapy in perinatology.
Objective: In this study, we investigated the effects of HUCB cells on motor, spatial
orientation memory and histological outcome in neonate rats subjected to hypoxic-
ischemic (HI) injury.
Methods: Seven-days-old rats underwent right carotid artery occlusion followed by
exposure to 8% O
2
inhalation for 2 h. Twenty-four hours after HI injury, rats received
either saline solution or HUCB cells intravenously. We also added a group of sham-
operated animals. After three weeks, spatial orientation memory was assessed using
Morris Water Maze and motor evaluations were conducted by open-field activity,
cylinder, grid walking and ledged beam walking tests. Subsequently, rats were
sacrificed for histological analyses.
Results: HI rats showed a significant spatial orientation memory impairment and a
volumetric decrease of the ipsilateral hemisphere to arterial occlusion. In motor tests,
animal subjected to HI injury showed only a tendency to deficits in cylinder and grid
walking tests. However, animals that received HUCB cells did not show statistical
difference in behavioral tests and cerebral atrophy when compared to saline group.
Conclusion: The present study suggests that intravenous injection of HUCB cells
does not improve functional and histological outcomes in HI rats with severe brain
damage. Additional investigations, considering aspects as dose, time to
transplantation, delivery methods, immunosuppression and associated therapies are
necessary to assessment the clinical relevance of cellular therapy in neonatal brain
damage.
Key-words: umbilical cord blood, stem cells, hypoxic-ischemic brain injury, asphyxia,
animal models.
CAPÍTULO I
Referencial Teórico
Referencial TeóricoReferencial Teórico
Referencial Teórico
17
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal
A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal é a complicação imediata à
asfixia grave e pode causar variados graus de dano cerebral. A hipóxia corresponde
à falta de oxigênio completa ou parcial em um ou mais tecidos corporais, incluindo a
circulação sangüínea (hipoxemia). A isquemia é a redução ou cessação do fluxo
sangüíneo que leva à hipotensão sistêmica, parada cardíaca ou doença vascular
oclusiva. Já o termo asfixia refere-se ao estado no qual a troca gasosa placentária e
pulmonar é interrompida, levando à progressiva hipoxemia, associada à acidose
metabólica e respiratória.
1
O diagnóstico da asfixia neonatal em recém-nascidos humanos é determinado
por alguns critérios, tais como: 1) acidemia em sangue de cordão umbilical (pH <
7,0); 2) escore de Apgar de 0-3 por mais de 5 minutos; 3) manifestações
neurológicas neonatais; e 4) disfunção orgânica sistêmica.
2
Ressalta-se que, em
muitos estudos, o escore de Apgar tem sido utilizado como critério diagnóstico
principal para a asfixia. No entanto, há uma elevada taxa de resultados falso-
positivos e falso-negativos quando utilizado isoladamente.
3
Estatísticas sugerem uma incidência de asfixia em 2-4 por 1000 nascimentos
a termo. No Brasil, estima-se que a prevalência de asfixia neonatal seja de,
aproximadamente, 2% dos nascidos-vivos.
4
A taxa de mortalidade dos recém-
Capítulo I – Referencial Teórico
18
nascidos asfixiados no período neonatal é de 20 a 50%, e mais de 25% dos
sobreviventes irão exibir incapacidades neuropsicológicas permanentes, incluindo
retardo mental, paralisia cerebral, epilepsia e dificuldade de aprendizagem.
5,6
1.1.1 Etiologia
A causa mais freqüente da encefalopatia hipóxico-isquêmica é a severa
asfixia intra-útero.
7
Segundo Volpe
8
, somente em 10% dos recém-nascidos a
hipóxia-isquemia se instala depois do nascimento, ou seja, cerca de 90% das lesões
cerebrais perinatais têm origem no período intra-útero.
A asfixia intra-útero pode ser causada: 1) pela interrupção do fluxo sangüíneo
umbilical (ex.: compressão de cordão umbilical); 2) pela insuficiente troca gasosa
pela placenta (ex.: descolamento prematuro de placenta); e 3) pela perfusão
placentária inadequada do lado materno (ex.: hipotensão materna). Outras situações
patológicas que levem à hipóxia e à hipoperfusão teciduais pré-natais, perinatais ou
pós-natais também são fatores etiológicos da hipóxia-isquemia neonatal.
7
1.1.2 Mecanismo patogênico
O dano cerebral hipóxico-isquêmico é um processo evolutivo, o qual se inicia
durante o insulto e estende-se no período de recuperação após a ressuscitação
(lesão por reperfusão).
9
O principal mecanismo patogênico atribuído à
neuropatologia da hipóxia-isquemia neonatal é a redução do fluxo sanguíneo
cerebral.
10
Eventos tóxicos interligados, tais como, a falência energética, a
Capítulo I – Referencial Teórico
19
despolarização da membrana, a liberação de aminoácidos excitatórios, o acúmulo de
radicais livres e a apoptose ocorrem simultaneamente e contribuem para a disfunção
celular e a morte neuronal após insultos hipóxico-isquêmicos.
11,12
Em relação às respostas celulares, a redução do fluxo sanguíneo cerebral
inicia uma cascata de eventos bioquímicos deletérios que duram horas ou dias. A
depleção do oxigênio impossibilita a fosforilação oxidativa e ocorre uma mudança
para o metabolismo anaeróbico. Este é um estado de energia ineficiente que resulta
na rápida depleção de reservas de fosfato de alta energia, incluindo a molécula de
adenosina trifosfato (ATP). A redução da síntese de ATP resultante da hipóxia
acentuada altera o equilíbrio iônico através da membrana celular.
10,13
A falência na bomba de íons trancelulares resulta no acúmulo de cálcio (Ca
2+
)
extracelular enquanto que o sódio (Na
+
) entra na célula carregando água (edema
citotóxico). Conseqüentemente, a despolarização da membrana resulta em uma
liberação de neurotransmissores excitatórios, especificamente o glutamanto dos
terminais axônicos. O glutamato, então, ativa os receptores NMDA (N-metil-D-
aspartato), AMPA (α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propionato) e cainato,
resultando no influxo de Na
+
e Ca
2+
para dentro dos neurônios pós-sinápticos, o que
impede a recaptação de glutamato da fenda sináptica. O aumento de Ca
2+
intracelular induz à produção do radical livre óxido nítrico. O efeito combinado de
falência de energia celular, acidose, liberação de glutamato, aumento Ca
2+
Capítulo I – Referencial Teórico
21
meio extracelular e presença de resposta inflamatória intensa com fagocitose. Trata-
se de um processo passivo de morte celular.
9,10
A apoptose decorre da agressão lenta à célula, com inibição parcial da
fosforilação oxidativa, redução do tamanho da célula e ruptura do DNA. A apoptose
é um processo de “suicídio” ativo celular, desencadeado pela ativação de enzimas
do grupo de caspases. A necrose celular é irreversível sob determinadas
circunstâncias; já a apoptose pode ser revertida. Assim, em geral, no centro do
tecido lesado forma-se uma região necrótica e, ao redor, há uma área em que a
evolução pode ser tanto um processo regenerativo quanto a morte definitiva. Trata-
se da chamada “zona de penumbra”, à qual vem se atribuindo importância crescente
nas intervenções terapêuticas.
9,10
1.1.3 Manifestações clínicas
Os achados clínicos da encefalopatia hipóxico-isquêmica irão variar
dependendo do período da lesão, da duração do insulto e dos mecanismos fetais de
adaptação. Complicações sistêmicas da asfixia neonatal freqüentemente ocorrem,
incluindo alterações cardiovasculares, respiratórias, metabólicas e renais. No
entanto, o sistema nervoso central é a estrutura mais afetada.
1,14
As manifestações clínicas agudas dos recém-nascidos a termo com
encefalopatia hipóxico-isquêmica incluem atraso na respiração espontânea ao
nascimento, convulsões, alteração no nível de consciência, alteração do tônus,
Capítulo I – Referencial Teórico
22
apnéia, reflexo de Moro reduzido ou abolido, choro e sucção anormais e repostas
pupilares alteradas.
16
Convulsões no período neonatal ocorrem em 50-70% dos recém-nascidos
asfixiados. O prognóstico é pior nas crianças que apresentam atividade convulsiva
prolongada ou freqüente, particularmente, quando associada a um ultra-som de
crânio ou um eletroencefalograma anormais no final da primeira semana. O padrão
de tônus nas primeiras semanas de vida também parece ser um critério importante
nos desfechos a longo-prazo.
1,17
Sarnat e Sarnat
18
estabeleceram critérios para a classificação da
encefalopatia hipóxico-isquêmica. No estágio I (leve), a criança apresenta-se
hiperalerta; os reflexos tendinosos estão hiperativos e há ausência de convulsões.
No estágio II (moderado), há presença de letargia, fraqueza proximal, redução dos
reflexos primitivos e convulsões. No estágio III (severo), a criança apresenta-se
torporosa e flácida, há ausência de reflexos tendinosos e primitivos e as convulsões
são freqüentes.
17,18
Os neonatos com encefalopatia hipóxico-isquêmica leve geralmente não
apresentam desfechos desfavoráveis a longo-prazo. No entanto, crianças no estágio
moderado da lesão apresentaram seqüelas em 20-25% dos casos. No estágio
grave, 50% dos casos evoluem para óbito e os sobreviventes apresentam seqüelas
incapacitantes, tais como a paralisia cerebral.
17,18
Capítulo I – Referencial Teórico
23
Dados atuais indicam que a lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal
ocorre em aproximadamente 10 a 20% dos casos de paralisia cerebral. Crianças nos
estágios I e II da encefalopatia hipóxico-isquêmica, freqüentemente, exibem déficits
motores específicos dependendo da lesão, tais como a diplegia ou a hemiplegia
espástica, geralmente sem transtornos cognitivos. Já as crianças na categoria III,
usualmente, irão apresentar dificuldades motoras precoces, tais como atrasos no
desenvolvimento neuropsicomotor e podem apresentar déficits cognitivos e
epilepsia.
3
1.1.4 Correlações clínico-patológicas
A presença, severidade e distribuição das lesões neuropatológicas originárias
da hipóxia-isquemia dependem de diversos fatores, incluindo a natureza e a duração
do insulto, a idade gestacional do feto ou recém-nascido e a presença ou ausência
de estresse sistêmico. Fatores vasculares e metabólicos fazem um papel crítico,
considerando que áreas específicas do desenvolvimento cerebral são especialmente
sensíveis à hipóxia-isquemia.
1
A maioria dos episódios de hipóxia-isquemia severa causa lesões variadas a
estruturas de grupos seletivos ao invés de lesões uniformes ou globais.
19
Tais
regiões incluem porções específicas do córtex cerebral, o hipocampo, os gânglios da
base, o tálamo, o tronco encefálico e a substância branca periventricular e
subcortical.
1
Capítulo I – Referencial Teórico
24
Há essencialmente cinco formas de lesão cerebral hipóxico-isquêmica: lesão
cerebral parassagital, leucomalácia periventricular, lesão cerebral isquêmica
multifocal ou focal, status marmoratus e necrose neuronal seletiva.
3,7
A lesão cerebral parassagital refere-se à necrose da substância cinzenta
subcortical adjacente e cortical bilateral. A longo prazo, as crianças apresentam
envolvimento, principalmente, das extremidades proximais e alterações cognitivas no
desenvolvimento. Os déficits intelectuais se relacionam particularmente com as
lesões localizadas posteriormente (regiões parieto-occipital-temporal), consideradas
importantes para as funções auditivas e visuais.
3,7,8
Já a leucomalácia periventricular é a principal lesão isquêmica do neonato
prematuro e refere-se à necrose da substância branca dorsal e lateral ao ventrículo
lateral. As manifestações a longo prazo incluem diplegia espástica, quadriplegia
espástica com déficits visuais e cognitivos.
3,7,8
A lesão cerebral isquêmica multifocal/focal é caracterizada por alterações em
todos os tipos celulares (neurônios, oligodendrócitos e astrócitos) causadas pelo
infarto dentro de uma distribuição vascular. A artéria cerebral média é o território
vascular mais afetado. As manifestações neurológicas, a longo prazo, dependem da
localização da lesão, mas são freqüentes convulsões focais, hemiparesia e
alterações cognitivas no desenvolvimento (em 30% dos casos).
3,7,8
Capítulo I – Referencial Teórico
25
O status marmoratus é a mais rara lesão associada à hipóxia-isquemia
neonatal. Caracteriza-se por lesão neuronal nos gânglios da base e tálamo e,
geralmente, não ocorre isoladamente, mas sim, associada a outras manifestações
neuropatológicas. A correlação clínica relacionada ao envolvimento dos gânglios da
base é a anormalidade extrapiramidal, particularmente a coreoatetose e a
distonia.
3,7,8
A necrose neuronal seletiva coexiste, invariavelmente, com uma ou mais
lesões neuropatológicas e é encontrada mais freqüentemente no córtex cerebral,
hipocampo e cerebelo. A seqüela neurológica inclui quadriparesia espástica, retardo
mental e convulsões.
3,7,8
1.1.5 Estratégias neuroprotetoras
Apesar dos avanços tecnológicos e científicos nos cuidados perinatais dos
recém-nascidos de risco, o manejo clínico de crianças asfixiadas tem sido limitado à
manutenção da oxigenação, ao controle da pressão sanguínea e da homeostase, ao
tratamento das convulsões e ao controle da hipertensão intracraniana. No entanto,
essas medidas não são dirigidas à prevenção ou à interrupção dos mecanismos de
lesão cerebral.
1,3
Em geral, as terapias neuroprotetoras são mais efetivas quando usadas como
proteção ao invés de ressuscitação. Uma terapia protetora é um tratamento que se
inicia antes de um evento adverso potencial; isso requer conhecimento dos fatores
Capítulo I – Referencial Teórico
26
de risco para o insulto cerebral. Já uma terapia de ressuscitação é um tratamento
que se inicia após o dano adverso cerebral.
20
Atualmente, várias estratégias
neuroprotetoras estão sendo avaliadas em modelos animais, na tentativa de reduzir
a morte celular apoptótica e, assim, melhorar os desfechos comportamentais.
21-23
Atualmente, a hipotermia é considerada a terapia mais promissora no
tratamento da síndrome hipóxico-isquêmica. O resfriamento da cabeça tem
mostrado reduzir a extensão da lesão em modelos experimentais, assim como em
estudos clínicos relacionados à isquemia e ao trauma. Os mecanismos potenciais de
neuroproteção da hipotermia incluem inibição da liberação de glutamato, redução do
metabolismo cerebral e inibição da apoptose. No entanto, aspectos como a duração
da terapia, o grau de hipotermia, o momento e o método da intervenção e,
principalmente, os efeitos adversos, tais como a hipoglicemia e a redução da
contratibilidade miocárdica, ainda devem ser considerados.
15,20
Estudos experimentais sobre a hipotermia em lesões cerebrais isquêmicas
também têm sido usados para avaliar o momento apropriado de intervenção,
sugerindo a presença de uma janela terapêutica menor no período neonatal do que
em adultos, indicando um curto período de menos de 6 horas após a lesão por
reperfusão.
10,20
Outras estratégias neuroprotetoras da hipóxia-isquemia neonatal têm sido
descritas experimentalmente incluindo inibidores de aminoácidos excitatórios,
Capítulo I – Referencial Teórico
28
1.1.6 Modelos animais para o estudo da hipóxia-isquemia neonatal
Os objetivos dos modelos animais são: (1) contribuir para o conhecimento dos
mecanismos da injúria; (2) melhorar a compreensão sobre a evolução da injúria e os
seus desfechos; e (3) fornecer um modelo no qual se desenvolvam e se testem
estratégias terapêuticas. Ratos e camundongos são os animais mais comumente
usados em modelos de asfixia perinatal.
26
O modelo experimental mais utilizado para a investigação da hipóxia-isquemia
cerebral neonatal é o proposto por Rice et al., baseado no procedimento de Levine
em ratos adultos
27-32
, que consiste no dano cerebral hipóxico-isquêmico unilateral
em ratos com 7 dias de idade obtido pela associação de oclusão unilateral da artéria
carótida, com subseqüente exposição a ambiente hipóxico. As lesões podem ser
encontradas no hemisfério ipsilateral à oclusão da artéria carótida nas regiões do
córtex cerebral, substância branca periventricular e subcortical, estriado (gânglios da
base) e hipocampo. A região de CA3 (corno de Amon) no hipocampo é a região mais
suscetível, seguida da camada de células granulares, CA1 e hilo.
12,27,31
O cérebro de ratos de 7 dias de idade tem sido histologicamente comparado
ao desenvolvimento cerebral de fetos com 32-34 semanas de idade, ou seja, a
camada cortical está completa, a matriz germinativa está regredindo e há pouca
mielinização na substância branca.
30,31
Capítulo I – Referencial Teórico
29
Os parâmetros fisiológicos do modelo têm mostrado, que durante o insulto, o
filhote de rato torna-se hipóxico e hipocapnéico como resultado da hiperventilação. A
média da pressão sanguínea cai aproximadamente 25% e há uma redução no fluxo
sangüíneo cerebral entre 17 e 40% quando comparado ao controle, especialmente
nas áreas mais vulneráveis ao dano.
26
Neste modelo, as mudanças histopatológicas ocorrem consistentemente e de
uma forma previsível. Além disso, o animal é de fácil manuseio, os estudos são
facilmente desempenhados e o custo financeiro é modesto.
27,31,33
No entanto, deve-
se considerar que o animal não é grande o bastante para permitir freqüentes
mensurações bioquímicas ou avaliar efeitos sistêmicos (cardiovascular, renal e
pulmonar) das intervenções terapêuticas. Também há uma dificuldade na produção
de injúrias da substância branca.
30,33
Aproximadamente 79% dos filhotes de ratos sobrevivem ao experimento e
cerca de 90% dos sobreviventes apresentam danos cerebrais. Infarto do córtex
cerebral ipsilateral e do hipocampo estão presentes em 56% e, dependendo da
duração da sobrevivência pós-asfixia, achados adicionais também são vistos,
incluindo alterações na função neurológica e comportamental.
33
Uma variedade de outros protocolos para indução da asfixia perinatal também
têm sido propostos, porém menos estudados.
5,34-38
Capítulo I – Referencial Teórico
30
1.2 Células-tronco e doenças do sistema nervoso central
As células-tronco representam uma unidade natural do desenvolvimento
embrionário e da reparação tecidual e são um subconjunto de células imaturas,
indiferenciadas e não-especializadas que apresentam a capacidade de se auto-
regenerar e de originar diferentes linhagens celulares.
39
Recentes descobertas revolucionaram a biologia das células-tronco e têm
demonstrado o potencial clínico destas células em uma variedade de doenças
humanas. As células-tronco têm sido encontradas em órgãos como o cérebro e o
coração, previamente conhecidos pela carência de progenitores celulares e de
potencial regenerativo.
40
Vários tipos de células-tronco têm sido identificadas no embrião, no feto e no
tecido adulto. As células-tronco embrionárias são derivadas do blastocisto e são
consideradas pluripotentes, ou seja, apresentam a capacidade de originar mais de
200 tipos diferentes de linhagens celulares. As células-tronco fetais representam os
progenitores celulares originários de órgãos fetais em desenvolvimento. O uso de
células-tronco fetais ou embrionárias origina sérias questões biológicas, éticas e
legais, limitando a utilização destas células na pesquisa clínica.
41
Células-tronco adultas ou somáticas são responsáveis pelo reabastecimento
tecidual ao longo da vida e estão presentes em todos os tecidos. No entanto, em
órgãos como o coração e o cérebro, as células-tronco não parecem ser ativadas
Capítulo I – Referencial Teórico
31
suficientemente para recolocar as células danificadas.
42
Estas células têm sido
utilizadas terapeuticamente por muitos anos em doenças hematológicas malignas,
através do transplante de medula óssea ou de sangue de cordão umbilical.
41,43,44
Atualmente, a maioria das pesquisas clínica e experimental explora o uso das
células-tronco hematopoiéticas para outros tipos de doenças.
45
A manutenção de muitos tecidos e órgãos é dada pelas células-tronco tecido-
específicas que, na presença de estímulos apropriados, se proliferam e se
diferenciam.
46
Atualmente, o termo “plasticidade”, ou seja, a capacidade de tipos
celulares de tecidos adultos se diferenciarem em linhagens celulares das três
camadas germinativas, tem sido proposto.
42
Mezey et al.
47,48
demonstraram em seu
estudo com humanos que células-tronco da medula óssea se transdiferenciaram em
células nervosas no cérebro adulto.
Recentemente, estudos têm demonstrado que o transplante de células-tronco
tem melhorado a função em modelos de isquemia cerebral, doença de Parkinson,
doença de Huntington e traumatismo raquimedular.
41,49,50
No entanto, pouco é
conhecido sobre os mecanismos responsáveis por esta melhora funcional. Acredita-
se que alguns mecanismos estejam envolvidos neste processo, tais como a
transdiferenciação, a fusão celular, o comportamento celular e a produção de fatores
tróficos.
44
Capítulo I – Referencial Teórico
32
O momento adequado para o transplante, a melhor via de administração das
células-tronco (sistêmica versus local e intra-arterial versus endovenosa), o tipo de
célula apropriada e os critérios de seleção dos pacientes ainda são aspectos pouco
conhecidos da terapia celular.
A literatura refere uma variabilidade de intervalos para transplante de células-
tronco pós-isquemia. Muitos estudos demonstram uma recuperação funcional com o
uso de progenitores celulares transplantados nos 3 primeiros dias pós-isquemia. No
entanto, essa recuperação também tem sido encontrada com a liberação tardia das
células-tronco, como por exemplo, um mês pós-insulto.
51,52
Em relação à rota de transplante, Jin et al.
53
demonstraram que todas as vias
de administração das células-tronco resultaram em migração para o sítio de lesão.
No entanto, um número maior de células foi encontrado com o uso do transplante
intracerebral em comparação com a injeção intraventricular e endovenosa.
A via de administração também dependerá do tipo celular administrado e dos
mecanismos de ação das células. Estudos com o uso de células-tronco da medula
óssea
54-56
e do cordão umbilical
57-60
em modelos animais de isquemia têm
demonstrado melhora sensório-motora após a terapia celular. No entanto, poucas
células são encontradas no cérebro e uma pequena porcentagem expressa
marcadores neurais. Acredita-se que as células transplantadas secretem fatores
tróficos para aumentar os mecanismos endógenos de reparação cerebral.
Capítulo I – Referencial Teórico
33
A neurotoxicidade de muitos distúrbios neurológicos pode resultar na morte
das células-tronco transplantadas. Por outro lado, o ambiente neuronal durante a
fase precoce de recuperação na isquemia, por exemplo, pode facilitar o crescimento,
a sobrevivência e a transdiferenciação das células-tronco implantadas.
61,62
1.2.1 Células-tronco de cordão umbilical e encefalopatia hipóxico-isquêmica
Uma das mais promissoras aplicações do sangue de cordão umbilical
humano é a lesão cerebral no período neonatal. A facilidade de coleta, sem riscos
para a gestante e o neonato e o grande número de células disponíveis são as
principais vantagens para a utilização desta fonte de células. Além disso, o sangue
do cordão umbilical pode ser usado terapeuticamente no período perinatal ou
criopreservado para o uso tardio.
63,64
O sangue do cordão umbilical e placentário tem sido reconhecido como uma
fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas para o transplante em pacientes
adultos e pediátricos. As células-tronco do cordão umbilical são mais imaturas e o
sangue do cordão umbilical e placentário é altamente enriquecido commmmi nelndunes
Capítulo I – Referencial Teórico
34
Mecanismos de plasticidade in vitro fortemente sugerem que as células-tronco
de cordão umbilical podem representar uma alternativa viável para a regeneração
cerebral.
62
Alguns estudos sugerem que estas células têm a capacidade de se
transdiferenciarem em progenitores não-hematopoiéticos, incluindo as células
nervosas.
66,68
Pesquisas in vivo também têm demonstrado o potencial dessas
células na melhora funcional após isquemia
60
, esclerose lateral amiotrófica
69
,
traumatismo crânio-encefálico
70
e traumatismo raqui-medular
71
em modelos animais.
No entanto, pesquisas sobre o uso de progenitores celulares do cordão umbilical e
da placenta ainda são escassos.
62
Chen et al.
60
realizaram os primeiros estudos sobre o uso de células-tronco de
cordão umbilical humano em ratos submetidos à oclusão da artéria cerebral média e
demonstraram que a injeção intravenosa de células-tronco auxiliou na melhora dos
animais transplantados. As células-tronco do doador foram detectadas no córtex
afetado, subcórtex e estriado.
Um subseqüente estudo mostrou melhora no comportamento de ratos após 4
meses de oclusão da artéria cerebral média. A migração foi observada apenas no
hemisfério lesado e a melhor recuperação foi correlacionada às altas doses de
células-tronco de cordão umbilical humano infundidas.
57
Os estudos citados acima têm demonstrado que a lesão tecidual é um fator
crítico para “atrair” as células-tronco de cordão umbilical e iniciar o processo de
Capítulo I – Referencial Teórico
36
Também em recente trabalho, Meier et al.
75
demonstraram que a injeção
intraperitoneal de 1 x 10
7
de células mononucleares de cordão umbilical humano 24h
após a lesão hipóxico-isquêmica em roedores neonatos resultou na melhora do
padrão de marcha dos animais. As células-tronco migraram para a região da lesão,
porém não se observou sinais de transdiferenciação.
1.3 Justificativa
A hipóxia-isquemia neonatal é a causa mais importante de dano neurológico
no recém-nascido e resulta em severas morbidades no neurodesenvolvimento, tais
como a paralisia cerebral e a epilepsia. Apesar da significância clínica e
socioeconômica da lesão cerebral neonatal, existem poucas estratégias para reduzir
a morbidade e mortalidade relacionadas a esta doença. O tratamento tem sido
limitado a medidas de suporte e não se dirige à restauração do processo de lesão
cerebral neonatal, visto que o sistema nervoso apresenta uma capacidade de
regeneração auto-limitada em resposta a um insulto.
A terapia celular tem sido utilizada na reparação de tecidos e órgãos lesados,
através da utilização de células-tronco e fatores de proliferação em alvos
terapêuticos considerados incapazes de desenvolver processos regenerativos, tais
como o coração e o cérebro.
A medula óssea e o sangue de cordão umbilical são fontes de células-tronco
com potencial terapêutico para a utilização em diversas doenças, inclusive em
Capítulo I – Referencial Teórico
37
lesões cerebrais. Uma das mais promissoras aplicações do sangue de cordão
umbilical humano é a lesão cerebral no período neonatal, especialmente pela
facilidade de coleta e pelo grande número de células disponíveis.
Diversos estudos em modelos experimentais e em humanos têm mostrado
avanços na recuperação de doenças auto-imunes e lesões do sistema nervoso
central através do transplante de células-tronco adultas. No entanto, ainda se
desconhece o seu potencial terapêutico, especialmente nas lesões neurológicas em
recém-nascidos, exigindo, assim, um estudo experimental para fornecer indicações
prévias sobre a possibilidade das células-tronco apresentarem efeito terapêutico e
segurança.
1.4 Hipóteses alternativas
A memória de orientação espacial, o desempenho motor e as alterações
histológicas são piores em ratos submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia
neonatal se comparados aos animais cirurgia-simulada.
A memória de orientação espacial, o desempenho motor e as alterações
histológicas são melhores nos ratos submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia
neonatal e tratados com células-tronco de cordão umbilical humano se comparados
aos animais lesados e tratados com solução salina.
Capítulo I – Referencial Teórico
38
1.5 Objetivos
O objetivo geral deste estudo é verificar os efeitos da injeção das células-
tronco de cordão umbilical humano em modelo experimental de hipóxia-isquemia
neonatal em ratos.
Os objetivos específicos consistem em:
(1) Testar um modelo experimental de hipóxia-isquemia neonatal em ratos;
(2) Comparar as funções neuromotoras e a memória de orientação espacial
entre os três grupos de estudo: animais hipóxico-isquêmicos tratados com células-
tronco de cordão umbilical humano, hipóxico-isquêmicos tratados com solução salina
e cirurgia-simulada (grupo sham).
(3) Comparar o volume do hemisfério acometido nos três grupos: animais
hipóxico-isquêmicos tratados com células-tronco de cordão umbilical humano,
hipóxico-isquêmicos tratados com solução salina e cirurgia-simulada.
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CAPÍTULO II
Materiais e Métodos
Materiais e MétodosMateriais e Métodos
Materiais e Métodos
2 MATERIAIS E MÉTODOS
No período de outubro de 2005 a março de 2007, realizou-se um estudo em
modelo experimental, randomizado, cego, e controlado. A pesquisa foi dividida em
duas fases experimentais: fase I (piloto), estabelecimento do modelo de hipóxia-
isquemia perinatal; e fase II, utilização de células-tronco de cordão umbilical humano
em modelo experimental de hipóxia-isquemia neonatal.
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Neurociências do Instituto de
Pesquisas Biomédicas da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
(PUC-RS) e no Laboratório de Cirurgia Experimental e Microcirurgia da mesma
instituição.
2.1 Animais
Ninhadas de ratos Wistar provenientes do biotério da Fundação Estadual de
Produção e Pesquisa em Saúde (FEPPS) foram mantidas no alojamento para
animais do Instituto de Pesquisas Biomédicas da PUCRS em ambiente climatizado
(21 ± 1° C), com ciclo claro/escuro de 12 horas, com água e comida ad libitum. Na
terceira semana de vida, os filhotes foram separados de suas mães e, então,
desmamados. As ninhadas utilizadas no estudo foram padronizadas de 8 a 10
animais.
Capítulo II – Materiais e Métodos
46
Os protocolos experimentais utilizados seguiram as normas internacionais de
experimentação com animais de laboratório. Todos os procedimentos foram
realizados tomando os cuidados necessários para reduzir ao máximo o número de
animais empregados e o seu sofrimento.
2.2 Fase I (piloto): modelo de hipóxia-isquemia neonatal
2.2.1 Indução da lesão hipóxico-isquêmica
Para o desenvolvimento de um modelo de hipóxia-isquemia perinatal foram
utilizados 10 filhotes de ratos Wistar no dia pós-natal 7 (DP7), provenientes de uma
única ninhada. Os filhotes foram divididos em dois grupos de estudo: grupo
experimental (n=6) e grupo com cirurgia-simulada (sham) (n=4), considerado
controle.
Os animais do grupo experimental foram submetidos a um modelo de lesão
cerebral hipóxico-isquêmica perinatal previamente descrito por vários autores.
1-7
Os
animais DP7 foram anestesiados com halotano através de uma máscara anestésica.
A artéria carótida comum direita foi identificada através da incisão transversal na
linha média da face anterior do pescoço, isolando o nervo vago, e ocluída
permanentemente em dois locais com linha cirúrgica de seda 7.0 (Figura II-1A),
utilizando-se microscópio cirúrgico durante os procedimentos.
Os animais ficaram em observação sob luz aquecida por 10-15 minutos após
o procedimento cirúrgico e a sutura, quando então, foram devolvidos às suas caixas.
Capítulo II – Materiais e Métodos
47
Após 2-4 horas de recuperação e período de alimentação, os filhotes foram
colocados dentro de uma câmara feita de acrílico transparente (1500mL) e expostos
a ambiente a 8% de oxigênio-92% nitrogênio (White Martins
®
) liberado a 5l/min por 2
horas. A câmara permaneceu imersa parcialmente em água morna (36 - 37ºC) para
manter a temperatura constante dentro dos limites fisiológicos. Um medidor de
oxigênio do ar (MO-890) foi conectado à câmara para monitorar as concentrações no
interior do recipiente (Figura II-1B).
O grupo sham foi constituído de animais controles que foram submetidos aos
mesmos procedimentos cirúrgicos, com exceção da ligadura da artéria carótida e da
exposição a ambiente hipóxico.
Capítulo II – Materiais e Métodos
48
2.2.2 Avaliação da memória espacial: labirinto aquático de Morris
O labirinto aquático de Morris foi descrito há 20 anos para avaliar o
aprendizado e a memória de orientação espacial em roedores e é a principal
ferramenta da neurociência comportamental.
8
Nesta tarefa o animal aprende a
localizar uma plataforma submersa numa piscina utilizando, para isso, dicas
espaciais distribuídas na sala de treino.
OXIGÊNIO 8%
Medidor O
2
8%
O
Banho-maria
A) Oclusão da artéria carótida comum direita
B) Exposição a ambiente hipóxico (8%) por 2 horas
A
rtéria
carótida
Anestesia
inalatória
Figura II-1: Etapas da indução da lesão hipóxico-isquêmica.
Capítulo II – Materiais e Métodos
49
Ao completar 30 dias de vida (aproximadamente três semanas após a
indução da hipóxia-isquemia), os animais iniciaram os treinamentos em uma piscina
circular preta (120 cm de diâmetro x 60 cm de altura) com 25 cm de água a 21-24ºC
conforme previamente descrito.
9,10
A piscina foi dividida virtualmente por quatro
quadrantes e a plataforma de resgate de 8 cm de diâmetro ficou localizada no centro
de um desses quadrantes, fixada a 1 cm do nível da água.
Dicas espaciais sob a forma de cartazes com padrões geométricos foram
fixadas nas paredes em torno da piscina e estavam visíveis ao animal em qualquer
ponto. A sala apresentou iluminação indireta sobre o tanque e as pistas distais nas
paredes (Figura II-2).
Dicas
visuais
Plataforma
Figura II-2: Labirinto aquático de Morris.
Capítulo II – Materiais e Métodos
51
incisão para a fixação de uma cânula de perfusão conectada a uma bomba de
perfusão (Gilson
®
). No átrio direito também foi realizada uma incisão, porém sem a
colocação de uma cânula. Inicialmente foram perfundidos 150ml de solução salina e,
posteriormente, 300ml de solução fixadora de paraformaldeído (PFA) 4% diluído em
tampão fosfato (pH = 7,4). Em seguida, os encéfalos foram cuidadosamente
retirados e a avaliação macroscópica foi realizada por inspeção visual. Considerou-
se que ratos tiveram lesão hipóxico-isquêmica na presença de infarto cístico ou
redução do volume do hemisfério ipsilateral à oclusão da artéria carótida. O cerebelo
e o tronco encefálico foram excluídos das análises.
Após esta avaliação, os encéfalos foram pós-fixados por 24 h em PFA 4%,
crioprotegidos em sacarose 30% (pH 7,4) por 24 h, congelados em nitrogênio líquido
e isopentano e armazenados a -80°C.
Transcorrido o tempo de pós-fixação, fatias de 35µm em corte coronal foram
obtidas usando um criostato (Shandon
®
). Os cortes foram, então, colocados em
lâminas histológicas e submetidos à técnica histológica de Nissl. Para a técnica de
Nissl, os cortes foram hidratados, colocados em uma solução de violeta de cresila
por 30s e cobertos com lamínulas. Avaliações qualitativas com o uso do microscópio
(Olympus BX40) foram realizadas no estudo piloto, observando o tamanho do
hemisfério e a presença de lesões císticas.
Capítulo II – Materiais e Métodos
52
2.3 Fase II: uso de células-tronco em modelo experimental de hipóxia-
isquemia neonatal
2.3.1 Grupos experimentais
Ao completar 7 dias de vida, quatro ninhadas foram submetidas à indução da
hipóxia-isquemia perinatal conforme descrição do item 2.2.1. Após 24h, as ninhadas
foram randomizadas em dois grupos de estudo: o grupo tratado com células-tronco
(HI + CT) e o grupo tratado com solução salina (HI + salina). Com o objetivo de
amenizar uma possível perda amostral excessiva devido ao tratamento com as
células-tronco humanas, ninhadas constituídas de números ímpares de animais
foram divididas em grupos desiguais, sorteando um animal a mais ao grupo HI + CT.
Imunossupressores não foram administrados nos animais do estudo.
O grupo HI + CT (n=15) foi formado de ratos que receberam a injeção de
células-tronco de cordão umbilical humano 24 horas após a lesão por via
endovenosa. O grupo HI + salina (n = 10) foi submetido ao mesmo procedimento,
porém os animais foram tratados com solução salina. Um grupo de 9 animais
cirurgia-simulada (sham) constituído de ratos submetidos aos mesmos
procedimentos cirúrgicos, com exceção da ligadura da artéria carótida e da
exposição a ambiente hipóxico foi adicionado ao estudo.
Ao completar 30 dias de vida (aproximadamente 3 semanas após a
randomização), os animais iniciaram os testes comportamentais e, após, foram
sacrificados para a realização das avaliações histológicas.
Capítulo II – Materiais e Métodos
53
2.3.2 Obtenção, preparo e administração das células-tronco de cordão
umbilical humano
As células-tronco foram obtidas a partir de sangue de cordão umbilical
humano de recém-nascidos do Centro Obstétrico do Hospital São Lucas da PUC-
RS. Os critérios de inclusão para a seleção das mães doadoras voluntárias foram a
concordância na participação do estudo (Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido em anexo), idade entre 18 e 36 anos e pré-natal documentado. Foram
excluídas gestantes com histórico de uso de drogas, doenças infecto-contagiosas,
doenças que possam interferir na vitalidade da placenta (diabetes mellitus,
hipertensão arterial, entre outras), tempo de bolsa rota maior que 18 horas e
prematuridade (idade gestacional < 32 semanas).
O sangue de cordão umbilical e placentário foi coletado das veias umbilicais
logo após o parto (coleta extra-útero), através da utilização de seringas esterilizadas
e heparinizadas. O material coletado foi mantido em temperatura ambiente no
período máximo de 24 horas até o preparo das células-tronco.
Para a separação das células-tronco, o sangue obtido do cordão umbilical
humano foi diluído em meio RPMI 1640 (1:1) (Gibco, EUA). Esta suspensão foi
fracionada em um gradiente de densidade gerado por centrifugação sobre
Histopaque® 1,077g/L (Sigma-Aldrich, EUA) a 400 g durante 30 minutos a 25º C. A
fração mononuclear situada sobre a interface com o Histopaque® foi coletada e
lavada duas vezes com DPBS contendo 1% de Liquemine® (Roche, Suíça). A
Capítulo II – Materiais e Métodos
54
viabilidade celular foi avaliada pelo método de exclusão com Trypan Blue Stain 0,4%
(Gibco, EUA).
A administração das células-tronco nos ratos selecionados foi realizada 24 h
após a indução da lesão, via intravenosa (veia jugular externa). Para isso, os
animais foram anestesiados com halotano e a sutura previamente realizada foi
desfeita. A veia jugular externa foi dissecada e, com o uso de um fio de sutura seda
7.0, a porção mais cranial da veia jugular externa foi ligada a fim de reduzir a
quantidade de sangramento após a punção venosa.
A injeção das células-tronco foi realizada através de uma micropipeta de vidro
com ponta ultra-fina (diâmetro < 5 µm), preparada com o uso de um estirador de
micropipetas MP-87 (Sutter Instrument Company, CA). A micropipeta foi conectada a
um tubo de silicone e a uma seringa de insulina, com 1 x 10
7
células em um volume
de 100µL de DPBS (Figura II-3A). Assim que o refluxo sangüíneo foi percebido no
sistema (Figura II-3B), considerou-se que o mesmo estava adequadamente
posicionado no leito vascular. Seguidamente, uma pressão positiva foi lentamente
aplicada à seringa para que a solução progredisse vagarosamente. Ao término do
conteúdo da seringa, a pipeta foi retirada e, rapidamente, uma microtorunda de
algodão foi posicionada no local, com o objetivo de tamponar qualquer sangramento
adicional. Após a revisão da adequada hemostasia, foi realizada uma nova sutura da
pele com fio de seda 7.0. O mesmo procedimento foi realizado nos animais
selecionados para o grupo salina.
Capítulo II – Materiais e Métodos
55
2.3.3 Avaliação da memória espacial: labirinto aquático de Morris
Os animais dos três grupos do estudo foram destinados às avaliações da
memória de orientação espacial no labirinto aquático de Morris, aos 30 dias de vida,
conforme descrição no item 2.2.2. Todas as análises foram realizadas por um
avaliador cego.
2.3.4 Experimento adicional: avaliação das funções neuromotoras
Após os resultados do teste comportamental, observou-se a necessidade de
avaliar a influência de possíveis déficits motores nos resultados do labirinto aquático
de Morris. Para isso, dois novos grupos de animais foram randomizados em HI + CT
(n=11) ou HI + salina (n=12), provenientes de 4 ninhadas distintas. Oito animais
cirurgia-simulada provenientes de uma única ninhada foram incluídos para o grupo
de animais sadios. O diagrama da Figura II-4 resume as etapas do estudo nos
grupos de avaliação motora e do labirinto aquático de Morris.
Figura II-3: Método de administração intravenosa. A. Micropipeta conectada à seringa. B.
Punção da
veia jugular externa utilizando a micropipeta. Aumento 40x.
A
B
Capítulo II – Materiais e Métodos
56
4 ninhadas ratos W istar
8 - 9 anim ais
Indução da HI neonatal
DP7
2 óbitos
24 h
Random ização
CT ou solução salina
Am ostra
CT = 15
Salina = 10
+
1 ninhada
9 anim ais
cirurgia-sim ulada
Avaliação histológica:
m acro e m icroscópica
1 ninhada
8 anim ais
cirurgia-sim ulada
+
24 h
Indução da HI neonatal
DP7
Random ização
CT ou solução salina
Am ostra
CT = 11
Salina = 12
óbitos (5 CT; 4 salina)
óbitos (3 CT, 4 salina)
DP30
Testes m otores e
Análise m acroscópica
DP30
Labirinto Aquático de M orris
Grupo adicional
CT = 4
Salina = 3
CT = 4
Salina = 3
CT = 5
Salina = 4
CT = 5
Salina = 4
4 ninhadas ratos W istar
8 anim ais
Figura II-4: Diagrama das etapas do estudo.
Capítulo II – Materiais e Métodos
57
As avaliações neuromotoras foram realizadas aos 30 dias de vida (3 semanas
após a randomização) por um avaliador cego e constituíram-se de quatro testes:
exploração no campo aberto, teste do cilindro, teste da caminhada na grade (grid
walking) e o teste da trave (tapered beam walking test), baseados em estudos
prévios em modelos animais de isquemia em roedores neonatos e adultos.
A atividade locomotora e o comportamento exploratório foram avaliados
através da tarefa comportamental Campo Aberto (Open Field). O aparato dessa
avaliação constituiu-se de uma caixa de madeira compensada com dimensões de 40
x 30 cm, circundada por paredes altas de 50 cm e uma parede frontal de vidro
transparente, possibilitando a observação do avaliador (Figura II-5). O assoalho do
campo aberto foi dividido em 12 áreas iguais por linhas pretas.
Os animais foram colocados na sala de experimentação 20 minutos antes do
teste para aclimatização. O experimento foi realizado em uma sala silenciosa e com
pouca iluminação. Durante o experimento, cada rato foi gentilmente colocado dentro
da caixa, de frente para a parede posterior, permanecendo no interior do aparato
para livre exploração por 5 minutos. A variáveis registradas foram o tempo de
locomoção, o número de cruzamentos nas linhas pretas e o comportamento de
rearing, ou seja, o número de vezes em que o animal se colocou no plano vertical,
apoiando-se somente sobre as patas traseiras para exploração do ambiente.
11,12
Capítulo II – Materiais e Métodos
58
O teste do cilindro, desenvolvido por Schallert et al.
13
foi utilizado para avaliar
a assimetria das patas anteriores durante a exploração vertical em um cilindro
transparente. O aparato constitui-se de um cilindro transparente de 15 cm de
Capítulo II – Materiais e Métodos
59
Os resultados foram calculados pelo percentual do uso da pata anterior não-
prejudicada (ipsilateral, direita) em relação ao número total de movimentos e o
percentual do uso da pata anterior prejudicada (contralateral, esquerda) em relação
ao número total de movimentos. O escore de assimetria foi dado como a diferença
entre o percentual do uso da pata anterior não-prejudicada (direita), do percentual do
uso da pata anterior prejudicada (esquerda) para a exploração. Animais com menos
de 10 movimentos foram excluídos da análise.
14-16
O teste da caminhada na grade (Figura II-7) mede a habilidade do animal de
integrar as respostas motoras. A precisão e a colocação correta das patas são
requeridas para completar o teste com sucesso. Os animais foram colocados em
uma grade de arame (35 x 45 cm, com aberturas de 4 cm
2
) suspensa a 100 cm do
A
B
Figura II-6: Teste do cilindro. A. Movimento independe
nte da pata anterior
direita. B. Movimento simultâneo das patas anteriores.
Capítulo II – Materiais e Métodos
60
solo. Durante o período de observação de 1 min, o número de passos e o número de
deslizes das patas posteriores, ou seja, o número de erros para alcançar a grade
(quando a pata passou por entre o espaço vazio da grade) foi registrado através de
vídeo-monitoramento. O resultado foi dado como o escore de deslize, calculando-se
o percentual do número de deslizes em relação ao número de passos dados.
12,17
O teste da trave foi desenvolvido para avaliar a coordenação e o
equilíbrio em roedores através de medida do número de deslizes do animal ao
atravessar uma trave de madeira para alcançar uma caixa escura.
18
O aparato do
teste constituiu-se de uma trave de madeira afilada (140 cm de comprimento, 6 cm
de largura no início e 1,5 cm ao final), com bordas laterais de 1,5 cm cada lado, para
permitir deslizes sem quedas. Ao final da trave foi colocada uma caixa preta (22 x 30
x 26 cm). Um estímulo luminoso foi colocado acima do ponto inicial da trave para
motivar o rato a atravessar a trave. Os ratos foram pré-treinados na trave por três
dias antes do teste, através de três tentativas diárias, com intervalos de 1 minuto.
Figura II-7: Deslize no teste da caminhada na grade.
Capítulo II – Materiais e Métodos
61
No dia do teste, o desempenho do animal foi vídeo-monitorado e o número de
passos, o número de deslizes na superfície vertical (Figura II-8A) e o número de
deslizes na superfície horizontal (Figura II-8B) dos membros posteriores foram
contados. O escore de deslize foi dado como: [(deslizes verticais x 0,5 + deslizes
horizontais)t(passo( )-19.8728(+)-.106492( )-30.5111(d)13.4472(e)2.81021(sl)-12.0421(i)-1.40381(z)10.6383(e)2.80762(s )-19.8715(v)-10.6383(e)2.80762(r)3.21279(t)1.40511(i)-1.40511(c)-10.6383(a)2.80762(i-9.23319(s )-19.8715(+)-11.7447( )-19.8715(d)2.80762(e)2.80762(sl)-1.40511(i)-1.40511z(e)2.81021(( )-30.5098ho)13.4459(o)2.80762(r)-7.42551(i)-12.0434(z)10.6383(o)2.80762(n)2.80762tm)]TJ275.24 0 Td[(a)-7.83068(i)-1.40511(())3.21279]t)1.40511( )-19.8715x( )-19.87151a0 escore fna
Capítulo II – Materiais e Métodos
62
250µm entre as fatias adquiridas. Os cortes obtidos foram colocados em lâminas
histológicas preparadas com poly-L-lysina e submetidos à técnica histológica de
Nissl.
As imagens das lâminas histológicas foram capturadas por uma câmera
digital acoplada em microscópio Olympus BX40 e a um microcomputador com um
software de análise de imagens (Image-Pro Plus 6.1, Media Cybernetics, Silver
Spring, EUA).
A estimativa do volume dos hemisférios foi obtida pelo princípio de Cavalieri
através de dois modos distintos:
22,23
(a) pelo delineamento do hemisfério (Figura II-
9A) com auxílio do cursor; e (b) pela contagem de pontos (Figura II-9B), que
consistiu na sobreposição de uma grade de pontos sobre a imagem digitalizada, em
que cada ponto representou 0,597 mm
2
(área ponto). Foram contados todos os
pontos que se sobrepunham ao hemisfério. Com o objetivo de evitar a
superestimação ou a subestimação do volume, dentre os quatro ângulos dos pontos,
Capítulo II – Materiais e Métodos
63
A estimativa final do volume dos hemisférios (mm
3
) foi obtida pelas seguintes
equações:
Figura II-9
: Métodos para estimativa do volume do
hemisfério. A. Método de delineamento. B. Método de
contagem de pontos.
A
B
Capítulo II – Materiais e Métodos
64
Método de delineamento: V(est) = (A
1
.T) + (A
2
.T)..., em que, V(est) =
estimativa do volume; A = área obtida pelo delineamento do hemisfério; T = distância
entre as secções analisadas.
Método de pontos: V(est) = ΣP.(A/P).T, em que, V(est) = estimativa do
volume; ΣP = soma dos pontos; A/P = área ponto (0,597 mm
2
); T = distância entre as
secções analisadas.
2.4 Análise estatística
Para a comparação entre as médias das variáveis cognitivas, motoras e
histológicas utilizou-se a análise de variância de uma via (ANOVA) ou teste de
Kruskal-Wallis, conforme distribuição das variáveis, seguido do teste de Tukey ou
Dunns, respectivamente. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão para
variáveis de distribuição normal. Para variáveis de distribuição anormal, utilizou-se a
mediana e o intervalo interquartil de 25 a 75%. Valores com p <0,05 foram
considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram
realizadas através de software estatístico SPSS versão 15.0.
2.5 Cálculo amostral
O cálculo do tamanho da amostra foi baseado nos resultados do labirinto
aquático de Morris na fase I (piloto). Considerando um valor de p < 0,05 e com um
Capítulo II – Materiais e Métodos
65
poder de 90% para estimar uma diferença de 40% entre os grupos, calculou-se um
número amostral de, aproximadamente, 10 animais por grupo.
2.6 Aspectos éticos
No presente estudo, os protocolos experimentais utilizados seguiram as
normas internacionais de experimentação com animais de laboratório. Todos os
procedimentos foram realizados, tomando os cuidados necessários para reduzir ao
máximo o número de animais empregados. Os animais receberam cuidados
adequados, foram submetidos ao mínimo possível de desconforto e “stress”. Durante
os procedimentos foram instituídas sedação e analgesia de acordo com a prática
veterinária aceita.
O uso de células-tronco de cordão umbilical humano em modelos animais tem
sido amplamente estudado.
25-29
Nessa pesquisa, a coleta do sangue de cordão
umbilical e placentário não acarretou riscos para a doadora e qualquer impedimento
para este procedimento foi respeitado pela pesquisadora.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUC-RS,
registro CEP 06/030362, em 17 de julho de 2006.
2.7 Referências bibliográficas
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Capítulo II – Materiais e Métodos
66
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CAPÍTULO III
Artigo Original
Artigo OriginalArtigo Original
Artigo Original
Capítulo III –Artigo Original
Cord blood cells in neonatal hypoxia-ischemia
Infusion of Human Umbilical Cord Blood Cells in a Rat Model of Neonatal
Hypoxia-ischemia
Authors:
Simone de Paula
Jaderson Costa da Costa
Humberto Holmer Fiori
Affonso Santos Vitola
Davi de Paula
Samuel Greggio
Pamela Billig Mello
Jeremiah Mistrello Lubianca
Tiago Giuliani Lopes
Léder Leal Xavier
Neuroscience Laboratory, Biomedical Research Institute, Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, BRAZIL
Corresponding author
Jaderson Costa da Costa
Address: Neuroscience Laboratory, Biomedical Research Institute, Pontifical Catholic
University of Rio Grande do Sul (PUCRS), Av. Ipiranga 6690/220, 90610-000
Porto Alegre, RS, Brazil. Tel./fax: + 51 33203312.
E-mail: [email protected]
Key-words: umbilical cord blood, stem cells, hypoxic-ischemic brain injury, asphyxia,
animal models.
Capítulo III – Artigo Original
71
ABSTRACT
Hypoxic-ischemic injury is an important cause of mortality and morbidity in infants,
often leading to mental retardation, epilepsy and cerebral palsy. Human umbilical
cord blood (HUCB), which is rich in adult stem cells, is a potential source of cellular
therapy in perinatology. In this study, we investigated the effects of HUCB cells on
motor, spatial orientation memory and histological outcome in neonate rats subjected
to hypoxic-ischemic (HI) injury. Seven-days-old rats underwent right carotid artery
occlusion followed by exposure to 8% O
2
inhalation for 2 h. Twenty-four hours after
HI injury, rats received either saline solution or HUCB cells intravenously. We also
added a group of sham-operated animals. After three weeks, spatial orientation
memory was assess using Morris Water Maze and motor evaluations were
conducted by open-field activity, cylinder, grid walking and ledged beam walking
tests. Subsequently, rats were sacrificed for histological analyses. HI rats showed a
significant spatial orientation memory deficit and a volumetric decrease of the
ipsilateral hemisphere to arterial occlusion. However, animals that received HUCB
cells did not show statistical difference in behavioral tests and cerebral atrophy when
compared to saline group. The present study suggests that, according to our
experimental design, intravenous injection of HUCB cell does not improve functional
and histological outcomes in HI rats with severe brain damage.
Capítulo III – Artigo Original
72
INTRODUCTION
Capítulo III – Artigo Original
73
mechanisms of cognitive and motor recovery after stem cells transplantation in
perinatal hypoxia-ischemia are poorly understood.
The aim of the present study was to assess effects of HUCB cells on spatial
orientation memory, motor performance and histological outcome in rats following
neonatal hypoxic-ischemic injury.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Ten pregnant Wistar rats from the Fundação Nacional de Pesquisa e
Produção em Saúde were used in accordance with the Guide for the Care and Use
of Laboratory Animals adopted by the National Institute of Health (USA). After normal
delivery, the litter size
was adjusted from 8 to 9 pups per litter. Pups were weaned at
21 days-old. We stipulated the birth day of the rats as day zero.
Neonatal hypoxia-ischemia model
We used the Levine rat model, modified as it was by Rice et al. [18] to
neonatal rats. On postnatal day 7 (weight ranging from 12 to 15g) each animal was
briefly anesthetized with halothane with use of a face mask. The right common
carotid artery was identified through a midline longitudinal neck incision, isolated from
the vagus nerve and internal jugular vein and permanently occluded in two different
Capítulo III – Artigo Original
74
points (distant 4 mm one from another) with 7.0 surgical silk suture. The entire
surgical procedure was completed within 15 min.
After the wound was sutured, animals were put back into their cages and
allowed to recover for 2-4 hours in company of their mother. Rats were then placed
for 2h in a hypoxia chamber, with constant flow of humidified 8% oxygen balanced
with nitrogen.
The hypoxia chamber was kept in a water bath to maintain the ambient
temperature inside the chamber at a normal range (37–38ºC). Following hypoxic
exposure, the pups were returned to their mother for recovery.
Human umbilical cord blood cells separation procedure and
administration
Cord blood collections were obtained ex utero using sterile syringes containing
anticoagulant, immediately after full-term human deliveries. All samples (n=4) were
collected after obtaining written informed consent.
Blood samples were then transported at ambient temperature to the laboratory
and then, isolated and processed within a range of 24 hours after collection. HUCB
was diluted with RPMI medium 1640 (1:1) (Gibco, USA). This suspension was
fractionated on a density gradient generated by centrifugation over a 1.077g/L
Histopaque® solution (Sigma-Aldrich, USA) at 400 g for 30 minutes at room
temperature. The mononuclear fraction situated over the Histopaque® interface was
Capítulo III – Artigo Original
75
collected and rinsed twice with DPBS containing 1 % of Liquemine® (Roche, Swiss).
The cell viability was evaluated by Trypan Blue Stain 0.4% (Gibco, USA) exclusion
method. CD 34+ cells represented in average 0.05% of cord blood mononuclear cells
after flow cytometric analysis.
Twenty four hours after hypoxia-ischemia, randomly selected rats received
either HUCB cells or saline solution, both intravenously. Animals were anesthetized
with halothane, the neck suture was open and left external jugular vein was isolated
and distally occluded with a 7.0 surgical silk suture to prevent excessive bleeding.
Using a glass micropipette (Sutter Instruments Company, CA) with ultra-fine tip
(diameter < 5µm) connected to an insulin syringe, we injected 1 x 10
7
cells
suspended in 100µL total fluid volume into the external jugular vein.
Immunosuppressants were not used in any animal.
Experimental groups
Randomization was performed in the treatment day (24h after hypoxia-
ischemia). Animals were assigned in two experimental groups to receive either saline
or HUCB cells. With the objective of avoiding a possible excessive loss of sample
due to the treatment with human stem cells, litters constituted of odd numbers of
animals were divided in unequal groups, allocating one more animal to the treated
group (HUCB cells). We also added a group of sham-operated animals. Sham-
operated animals were anesthetized with halothane, a midline incision was made in
Capítulo III – Artigo Original
76
the neck, the common carotid artery was isolated, the incision was sutured and they
were later placed in a chamber open to room air during a period of time equivalent to
the hypoxic group animals (2h). The spatial orientation memory was analyzed three
weeks after hypoxic-ischemic lesion and the histological analyses were performed
after the end of behavioral tests. After the results of behavioral tests, we decided to
assess the influence of possible motor deficits on Morris Water task performance. For
this, we added a new set of three study groups: HUCB cells, saline and sham-
operated groups. These groups were subjected to the same methods of study. All
evaluations were performed by a blind investigator.
Morris Water Maze test
The spatial orientation memory performance was evaluated using a Morris
Water Maze (MWM) as previously described [19, 20]. The water maze consists on a
black circular pool (120 cm in diameter) conceptually divided in four equal imaginary
quadrants. The water temperature was 21–24°C. Two centimeters beneath the
surface of the water and hidden from the rat’s view was a black circular platform (8
cm in diameter). It had a rough surface, which allowed rats to climb easily onto it. The
water maze was located in a well-lit white room with several posters and other distal
visual stimuli hanging on the walls to provide spatial cues.
Training in the hidden platform (spatial) version of the MWM was carried out
during five consecutive days. On each day, rats received four consecutive training
Capítulo III – Artigo Original
77
trials in which the hidden platform was kept in a constant location. The mean latency
of finding the platform was measured for individual animals on each day.
A different starting location was used on each trial, which consisted of a swim
followed by a 30-sec platform sit. Rats that did not find the platform within 60 sec
were guided to it by the experimenter and their escape latency was recorded as 60
sec.
To assess long-term memory, 24h after the final trial, the platform was
removed from the maze. In this probe trial, each rat was placed into the water as in
the training trial and time in seconds spend in the quadrant formerly occupied by the
platform (target quadrant) was recorded. During training trials and probe trial,
movements of the animal were monitored and recorded with a video camera fixed to
the ceiling over the center of the maze.
Motor performance
To assess motor performance of experimental groups, we performed a battery
of four tests at the third week after induction of hypoxic-ischemic injury, based in
studies of animal models of neurological disease [21-25]. Animals of the additional
groups were subjected to the following motor tasks: (a) open-field activity; (b) cylinder
test; (c) grid walking test; and (d) tapered/ledged walking test.
Capítulo III – Artigo Original
78
Open-field activity
The open-field activity test was used to assess motor and exploratory
behavior. After acclimatization to the environment, rats were placed in a 40x30 cm
wood box with 50 cm high walls around. The floor was divided into 12 equal squares
by black lines. Animals were placed into the box, in front of posterior wall, and left to
explore the arena freely for a 5-min period. The following parameters were
measured: number of line crossings, the number of rearing and locomotion time.
Cylinder test
Forelimb use was analyzed by videotaping movements of each rat during
vertical exploration in a transparent cylinder. The apparatus measured 15 cm in
diameter and 30 cm in height. Each animal was individually placed in the cylinder and
observed for 5 min. The behavior was scored according to the following criteria: (1)
independent use of the left (impaired, contralateral) or right (non-impaired, ipsilateral)
forelimb for contacting the wall during a full rear to initiate a weight-shifting movement
or to regain center of gravity while moving laterally in a vertical posture and (2)
simultaneous use of both left and right forelimbs for contacting the cylinder wall
during a full rear and for alternating lateral stepping movements along the wall.
Behavior was expressed in terms of percent use of the non-impaired forelimb to the
total number of limb use observation for wall movements; and percent use of the
impaired forelimb to the total number of limb use observation for wall movements.
Capítulo III – Artigo Original
79
Forelimb use asymmetry score was calculated as the percentage non-impaired
forelimb use subtracted from the percentage impaired forelimb use.
Grid walking test
The grid walking test measures the animals’ ability to integrate motor
responses. The rats were placed on a stainless steel grid floor (35 x 45 cm with a
mesh size of 4 cm
2
) elevated 1 m above the floor. For a 1 min observation period, the
total number of steps was counted. The number of foot fault errors, when the animal
misplaced a hindlimb that it falls through the grid, was also recorded.
Tapered/ledged beam walking test
The tapered/ledged beam walking test evaluates balance and coordination of
movement in rats, by measuring the latency and number of footslips of an animal
traversing a narrow beam to reach a darkened goal box [21].
The beam-walking apparatus consisted of a tapered wooden beam (140 cm
long, 6 cm wide at the start and narrowed to 1.5 cm at the end) with ledges on each
side to permit foot faults without falling. The end of the beam was connected to a
black box (22 x 30 x 26 cm). A bright light was placed above the start point to
motivate the rats to traverse the beam. Rats were trained on three consecutive days
(3 trials per day). The rat’s performance in the testing day was videotaped and the
numbers steps on the upper level, slips to the vertical surface of the beam and slips
Capítulo III – Artigo Original
80
to the lower level for hind limbs were counted. The score for each trial was calculated
as follows: [(vertical slips x 0,5 + horizontal slips)/(steps + vertical slips + horizontal
slips)] x 100.The score for the testing day was represented as the mean of three trials
to traverse beam.
Morphological study
After completing behavioral test, animals were deeply anesthetized with
thiopental sodium (0,1ml/100g, i.p.) and perfused transcardially with saline followed
by 4% paraformaldehyde. The brains were removed and stored in the same solution.
Macroscopic assessment was evaluated immediately after dissecting the brain
by gross visual inspection on groups of motor and Morris Water Maze evaluations.
Neonatal rats were considered to have suffered hypoxic-ischemic brain damage
when displaying infarcted area or reduction of volume of hemisphere on the brain
surface ipsilateral to the carotid artery occlusion. The brainstem and cerebellum were
excluded from the study.
In order to obtain, microscopic assessment, coronal sections 50µm thick
through the entire extent of the brain (except cerebellum) were cut using a cryostat
(Shandon
®
), with 250µm intervals, and stained with cresyl violet by the Nissl method.
Cross-sectional areas were captured by a video camera installed in an Olympus
BX40 microscope, interfaced by a software (Image Pro-Plus 6.1, Media Cybernetics,
Silver Spring, USA) run in a personal computer. Images of the hemispheres were
Capítulo III – Artigo Original
81
displayed onto a high-resolution video monitor and its boundaries were outlined for
area measurement. The boundaries were defined in accordance with Paxinos and
Watson atlas [26].
The Cavalieri method was used to determine the estimation volume (mm
3
) of
hemispheres by summation of areas and by multiplication of between-section
distance. Cross-sectional area of hemisphere was obtained outlining edges of each
hemisphere. Ventricular space was subtracted from the measurements. Volume
estimation was performed in about 10 sections for each rat [27, 28].
Microscopic assessment was performed only on the group of Morris Water
Maze test. One sham-operated rat was excluded from the study due to problems with
histological processing of the brains.
Statistical analysis
Quantitative variables with normal distribution were presented as means and
standard deviations (SD) and the comparison among the groups was analyzed by
ANOVA one-way followed by Tukey’s test. Otherwise, variables were presented as
median and interquartile range 25-75 and we used the Kruskal-Wallis test following
Dunn’s comparison. Data were considered significantly different if p < 0.05 between
groups.
Capítulo III – Artigo Original
82
RESULTS
In Water Maze test group, two animals died during the carotid artery occlusion
and six animals (3 saline group and 3 treated group) died during the injection of
HUCB cells or saline solution, due to anesthesia procedures, bleeding or tor
Capítulo III – Artigo Original
83
statistical difference between animals treated with HUCB cells and saline group from
the second to the fifth day of training after post hoc analysis by Tukey’s test.
Analysis of the probe trials (Figure 1B) also showed that the mean of time
spent in target quadrant was significantly different among groups (p <0.05), but this
was due to a longer time spent by sham-operated group when compared with saline-
group. We observed that there was not difference between sham-operated and
HUCB cells group (p=0.15). However, treated rats with HUCB cells spent only 25.5%
of swimming time in target quadrant.
In motor performance, rats with hypoxic-ischemic brain damage presented
only a tendency to forelimb use asymmetry in cylinder test and to higher number of
slips in grid waking test, which were not reduced with HUCB cells injection
Table 1 shows that open-field activity and ledged beam walking tests did not
reveal significant differences between HUCB cells, saline and sham-operated groups.
In the cylinder test at 4 week of age, non-parametric analysis among three study
groups reveled a tendency to forelimb use asymmetry (p = 0.05). Two saline group
rats were excluded because presented less than 10 movements.
We also observed that HUCB cells, saline and sham-operated groups did not
present statistical differences in grid walking test, although there was a tendency (p =
0.07) to higher slip score in rats with hypoxia-ischemia. However, post hoc analyses
Capítulo III – Artigo Original
84
showed high p values between HUCB cells vs. saline groups in cylinder test (p =
0.98) and grid walking test (p=0.34).
HUCB cells transplantation did not reduce the hemispheric atrophy following
hypoxia-ischemia brain damage
Macroscopic assessment of brains (Figure 2) performed in all groups of study
(Water Maze and motor test groups) reveled that 61.5% (n=16) of the animals of
HUCB cells group presented infarct area in right hemisphere compared to 63.6% in
the saline group (n=14). There was no significant difference in Chi-square test
(p=0.88). Behavioral and histological results were not altered by the exclusion of
animals without macroscopic injury (data not shown).
Our results of microscopic assessment in animals treated only with saline
solution showed that neonatal hypoxic-ischemic lesion caused significant decrease in
volume of the hemisphere ipsilateral to carotid occlusion (right) when compared to
contralateral hemisphere (p < 0.001) and when compared to right hemispheres of
sham-operated group (p < 0.01) three weeks after injury.
The group that received HUCB cells also presented right hemisphere volume
significantly reduced when compared to the left hemisphere (p<0.01). However, there
was not statistical difference between right hemispheres of HUCB cells group and of
Capítulo III – Artigo Original
85
sham-operated group. Differences between treatment groups (HUCB cells vs. saline
groups) were not significant either (Figures 3 and 4).
We also assessed the hemisphere volume in three subareas: anterior, middle
and posterior third. Data summarized in table 2 showed that the right hemisphere
volume was reduced in all analyzed subareas in saline and HUCB groups when
compared with contralateral hemisphere. When the right hemisphere of sham-
operated rats was compared with right hemisphere of saline group there was a
difference in middle and posterior third. In all subareas, we did not find differences
between right hemisphere of sham-operated and HUCB cells group. However,
comparison of volume of right hemisphere between treatment groups did not show
significant differences.
DISCUSSION
The results of the present study showed that neonatal hypoxic-ischemic brain
injury induced significant long-term spatial orientation memory deficits and extensive
cerebral atrophy in immature rats. However, intravenous administration of HUCB
cells did not cause improvement in neither behavioral nor histological outcomes.
Similarly to other investigations, our study showed that, in spite of severe brain
damage, motor function tests were less sensitive or not sensitive to detect
sensoriomotor alterations in all hypoxic-ischemic rats [29-32]. Differently of human
Capítulo III – Artigo Original
86
neonates, pups that underwent neonatal hypoxic-ischemic injury did not show
obvious postural or locomotor abnormalities. This can be due to a higher plasticity
degree of neonatal rat brain when compared to the human brain. In addition, studies
have showed that neonate rats with unilateral cerebral ischemia recover significantly
better than adult rats [33, 34]. Small sample size also may explain not significant
differences in cylinder test and grid walking test.
Studies have been demonstrating that injury in brain regions requested for the
process of memory and learning, result in significantly decrease of spatial orientation
memory [29, 30, 32]. Our results showed that Morris Water Maze test was sensitive
to the brain damage in hypoxic-ischemic rats. However, pups treated with HUCB
stem cells and saline-group showed comparable impairments.
Our findings are similar to the study of Mäkinen et al[
Capítulo III – Artigo Original
88
In this study, histological analyses showed that neonatal hypoxia-ischemia
resulted in an extensive infarcted area and that intravenous injection of HUCB cells
also did not change the severity of morphological damage. However, we emphasize
that there was not significant difference in volume of right hemisphere between
HUCB cells and sham-operated group, suggesting a tendency to regeneration. Our
hypothesis is that the sample size was not sufficient and the histological evaluations
follow-up was short. Evidence demonstrates that despite of functional recovery in
neonatal hypoxia-ischemia and stroke animals, there is not a decrease in infarct size
[13, 17, 37]. In addition, most studies have observed that the number of cells that
enter brain is relatively small or absent and the treatment benefit of HUCB stem cells
may be related to the migration activity of progenitor cells [13, 15, 37]. Borlongan et
al. [43] suggests that the few detected intravenous delivered cell grafts, when
compared to intracerebral cell grafts, were not sufficient to produce histological and
functional recovery.
Despite of controversies, immunosuppressive treatment is a key determinant
in long-term graft survival in xenograft paradigms [13, 46]. The mechanisms that lead
to rejection in transplantation to the central nervous system are not completely
understood. Several investigations suggest that the T-cell mediated immune reaction
plays a significant role in graft rejection and that interspecies incompatibility
contributes significantly to phagocytosis of xenogeneic cells by macrophages [47,
48]. We emphasize that we still do not have evidences of HUCB cells migration to
brain and of host immune response to the transplanted cells.
Capítulo III – Artigo Original
89
In addition, the unilateral carotid artery permanent occlusion results in
reduction of cerebral blood flow within the various structures of the hemisphere
ipsilateral to the vascular occlusion [49, 50]. We speculated that low
perfusion in
distal field regions (border zones) may contribute to a migration difficulty of HUCB
cells to injured structures, what may also explain our behavioral and histological
results.
In conclusion, the present study suggests that, according to our experimental
design, hypoxic-ischemic animals with severe brain damage treated with HUCB cells
did not show better histological and functional outcomes. Aspects such as dose,
timing potential of peripheral route of HUCB delivery, the immunosuppression and
use of associated therapies need to be investigated in depth before clinical
application of cellular therapy to optimize neuroprotection and, consequently,
neurobehavioral outcomes.
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Table 1. Motor performance in three groups of study.
Test/Group HUCB cells Saline Sham-operated P value
Locomotion time (sec): means ± SD 107.09 ± 18.61 99.75 ± 18.68 109.13 ± 13.47 0.44
Number of rearing: means ± SD 31.64 ± 10.230 35.75 ± 6.995 29.38 ± 5.706 0.21
Number of crossings: means ± SD 115.55 ± 21.72 113.17 ± 19.05 124.63 ± 12.66 0.40
Ledged beam walking (%): means ± SD 10.94 ± 3.36 8.62 ± 2.05 10.98 ± 4.16 0.15
Grid walking (%): median (IR 25-75%) 16.67 (12.70 – 20.00)
11.24 (9.76 – 15.69) 5.72 (0 – 15.21) 0.07
Cylinder test (%): median (IR 25-75%) 12.90 (1.6 – 26.67) 13.17 (5.45 – 51.19) 2.94 (0 – 6.9) 0.05
Variables with normal distribution are presented as means ± SD and are compared using ANOVA one-
way. Otherwise,
variables are presented as median (interquartile range [IR]) and are compared using the Kruskal-
Wallis test. HUCB = human
umbilical cord blood.
Table 2. Volume analysis of subareas of left and right hemispheres in HUCB cells, saline and sham-operated groups.
Group HUCB cells Saline Sham-operated
Subarea/hemisphere Left Right Left Right Left Right
Anterior volume (mm
3
)
126.44 ± 15.65 96.55 ± 32.12* 123.85 ±31.59 82.92 ± 19.99* 122.71 ± 26.09 109.49 ± 19.23
Midle volume (mm
3
)
225.65 ± 31.10 156.13 ± 76.42† 231.69 ± 37.49 121.32 ± 69.27**#
221.01 ± 31.32 216.04 ±32.94
Posterior volume (mm
3
)
257.29 ± 26.60 179.29 ± 81.35† 255.25 ± 19.23 137.78 ± 72.81**#
217.64 ± 45.23 231.13 ± 19.46
Data expressed as means ± SD. *p<0.05 vs contralateral hemisphere. # p < 0.01 vs right hemisphere of sham-operated rats. †p<0.01 vs
contralateral hemisphere. ** p< 0.001 vs contralateral hemisphere. HUCB = human umbilical cord blood.
Capítulo III – Artigo Original
94
Capítulo III – Artigo Original
95
Figure 2. Gross appearance of rat brain in sham-operated (A), saline (B) and human umbilical
cord blood (C) groups three weeks after hypoxic-ischemic injury. Images were captured after
perfusion and cerebellum was excluded.
Capítulo III – Artigo Original
96
Figure
3
. The mean hemisphere volume in all groups. There was a loss of right
hemisphere
volume
after hypoxia-ischemia induction.
*p < 0.01 vs contralateral hemisphere. ** p < 0.01 vs right hemisphere
of sham-operated group. There was no difference between the two hemispheres in the sham-
operated
rats. Data expressed as means ± DP.
HI + HUCB HI + saline sham-operated
0
100
200
300
400
500
600
700
left hemisphere
right hemisphere
*
*
**
Volume (mm
3
)
Capítulo III – Artigo Original
97
Figure 4. Digitized images of Nissl-stained coronal sections of brain rat. A. Sham-
operated
CAPÍTULO IV
Conclusões
ConclusõesConclusões
Conclusões
4 CONCLUSÕES
1) O modelo animal de hipóxia-isquemia neonatal em ratos resultou em visível
área de infarto no hemisfério ipsilateral à oclusão da artéria carótida direita.
2) Os testes neuromotores não detectaram déficits neurológicos nos animais
submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia. Houve apenas uma tendência à
assimetria de uso das patas anteriores no teste do cilindro e uma tendência a um
maior número de deslizes no teste da grade.
3) Os ratos submetidos ao modelo animal de hipóxia-isquemia neonatal
apresentaram um significativo prejuízo na memória de orientação espacial.
4) O desempenho dos animais tratados com células-tronco de cordão
umbilical humano foi similar ao grupo tratado com solução salina no teste de
memória de orientação espacial.
5) A injeção intravenosa de células-tronco de cordão umbilical humano não
resultou na redução do tamanho da lesão histológica no hemisfério ipsilateral à
oclusão da artéria carótida direita.
CAPÍTULO V
Resultados complementares
Resultados complementaresResultados complementares
Resultados complementares
Capítulo V – Resultados complementares
5 RESULTADOS COMPLEMENTARES
5.1 Resultados da fase I (piloto) no labirinto aquático de Morris
Tabela V.1. Resultados do piloto no labirinto aquático de Morris três semanas após a indução da lesão.
Variável HI (n=6) Sham (n=4) Valor de p**
Latência de escape*(s) 53,17 ± 15,32 12 ± 6,8 0,001
Tempo no quadrante (s) 9,83 ± 3,02 20,50 ± 3,40 0,05
Dados expressos como média ± desvio padrão. *Latência de escape no 6º dia, após retirada da plataforma. HI
(hipóxia-isquemia). ** Teste t de Student.
0 1 2 3 4 5 6
0
10
20
30
40
50
60
HI
Sham
*
*
*
Dias de treino
Latência de escape (s)
Figura V-1: Latência de escape no labirinto aquático de Morris nos cinco dias de treino.
Dados expressos como média ± desvio padrão. *p<0,05. HI (hipóxia-isquemia).
Capítulo V – Resultados Complementares
104
5.2 Correlação entre o método de delineamento e a contagem de
pontos
O resultado do volume dos hemisférios pelo método de delineamento e pelo
método de contagem de pontos mostra uma correlação de Pearson de 0,99
(p<0,01), indicando que ambos os métodos utilizados mostraram estimativas de
volume similares.
5.3 Avaliação imuno-histoquímica
Para a avaliação da migração das células-tronco, um animal submetido ao
modelo de hipóxia-isquemia neonatal foi sacrificado na primeira semana após o
transplante de células-tronco de cordão umbilical humano. Os encéfalos foram
cuidadosamente retirados e congelados em nitrogênio líquido com crioproteção do
isopentano. Cortes coronais de 15µm foram obtidas de um criostato e colocadas em
lâminas histológicas preparadas com poly-L-lysina e armazenadas a -20ºC.
0 100 200 300 400 500 600 700 800
0
200
400
600
800
Contagem de pontos
Delineamento
Figura V-2
: Gráfico de dispersão, mostrando a correlação entre a contagem de pontos e o
método de delineamento para o cálculo do volume.
Capítulo V – Resultados Complementares
105
As fatias adquiridas foram tratadas com o anticorpo monoclonal anti-núcleo
humano (MAB 1281, Chemicon, Canadá) diluído em 1:100. As lâminas foram
lavadas em PBS (salina fosfatada tamponada) por 5 minutos em temperatura
ambiente. O anticorpo anti-camundongo poli-HRP foi usado como anticorpo
secundário por um período de incubação de 45 minutos em temperatura ambiente
(Kit 2762, Chemicon, Canadá). Após lavagem em PBS, a solução de DAB
(diaminobenzidina) foi adicionada por 5 minutos. As células-tronco derivadas de
cordão umbilical humano foram identificadas pela marcação imuno-histoquímica com
o anticorpo MAB1281.
1-3
Resultados preliminares são mostrados na Figura V-3. Observou-se a
presença de algumas marcações do anticorpo MAB1281 (seta) no hemisfério
ipsilateral à oclusão da artéria carótida que posteriormente serão analisadas por
imunofluorescência para confirmação da migração das células transplantadas.
Capítulo V – Resultados Complementares
106
Figura V-3: Avaliação imuno-histoquímica do cérebro do rato 7 dias após o transplante de
células-tronco de cordão umbilical humano. A e B. Presença de algumas marcações MAB
1281+ no hemisfério ipsilateral a oclusão da artéria carótida. C. Controle positivo do anticorpo
MAB 1281 em um tecido neuronal humano. D. Controle positivo do anticorpo MAB 1281 em um
esfregaço de sangue de cordão humano. Barra de calibração 20 µm. Aumento 40x.
Referências bibliográficas
1 Chen J, Sanberg PR, Li Y, Wang L, Lu M, Willing AE, et al. Intravenous
administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke
in rats. Stroke 2001;32:2682-2688.
2 Li Y, Chen J, Chen X, Wang L, Gautam S, Xu Y, et al. Human marrow stromal
cell therapy for stroke in rat: Neurotrophins and functional recovery. Neurology
2002;59:514-523.
3 Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of human
umbilical cord blood ameliorates neurologic deficits in rats with hemorrhagic brain
injury. Ann N Y Acad Sci 2005;1049:84-96.
Anexo
AnexoAnexo
Anexo
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Durante a gravidez, o oxigênio e nutrientes essenciais passam do sangue
materno para o bebê através da placenta e do cordão umbilical. Após o parto, o
sangue que permanece no cordão umbilical e na placenta é geralmente descartado.
Este sangue contém um grande número de células-tronco, que são células jovens,
que conseguem se reproduzir em células de seus respectivos tecidos. Pesquisas em
andamento buscam utilizar essas células na regeneração de órgãos, como o
coração e o cérebro, pois estas células podem se transformar em diversas outras
células, tais como, células sangüíneas, musculares e nervosas (neurônios).
O objetivo deste trabalho é avaliar se as células-tronco de cordão umbilical
humano podem tratar a lesão cerebral de ratos que sofreram asfixia no período do
nascimento.
Para a coleta do sangue, após o nascimento, o cordão umbilical é pinçado
(lacrado com uma pinça) e separado do bebê, cortando a ligação entre o bebê e a
placenta. A quantidade de sangue (cerca de 70 - 100 ml) que permanece no cordão
e na placenta é drenada para uma bolsa de coleta. Em seguida, já no laboratório de
processamento, as células-tronco são separadas e preparadas para o
congelamento. Durante este procedimento de coleta, não há nenhum risco para a
mãe e para o bebê. As equipes de coleta atuam somente com o consentimento do
obstetra, garantindo que nada interfira no parto.
Eu, ......................................................... (responsável) fui informado dos
objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada. Recebi informação a
respeito dos procedimentos e esclareci minhas dúvidas. Sei que minha participação
no estudo é voluntária e gratuita e que em qualquer momento poderei solicitar novas
informações e modificar minha decisão se assim eu o desejar. A mestranda Simone
de Paula certificou-me de que todos os dados desta pesquisa referentes à mim e ao
meu bebê serão confidenciais, bem como o seu tratamento não será modificado em
razão desta pesquisa e terei liberdade de retirar meu consentimento de participação
na pesquisa, face a estas informações. Concordo que as amostras de sangue de
cordão umbilical e placenta obtidas serão utilizadas apenas com finalidade de
pesquisa experimental.
Fui informado que caso existam danos à minha saúde, causados diretamente
pela pesquisa, terei direito a tratamento médico e indenização conforme estabelece
Anexo
109
a lei. Também sei que caso existam gastos adicionais, estes serão absorvidos pelo
orçamento da pesquisa.
Caso tiver novas perguntas sobre este estudo, posso chamar pela Mestranda
Simone de Paula no telefone (51) 84447625. Para qualquer pergunta sobre os meus
direitos como participante deste estudo ou se penso que fui prejudicado pela minha
participação, posso chamar pelo orientador da pesquisa, Dr. Jaderson Costa da
Costa.
Declaro que recebi cópia do presente Termo de Consentimento.
______________________
Assinatura do Paciente
_____________________
Nome do Paciente
___/___/___
_______________________
Assinatura do Pesquisador
Apêndice
ApêndiceApêndice
Apêndice
Apêndice
ii
BANCO DE DADOS
Banco de dados disponibilizado em mídia digital (CD).
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