( PDF ) Alterações nos níveis de ansiedade de camundongos c57bl/6 expostos à nicotina e/ou etanol durante adolescência

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

ALTERAÇÕES NOS NÍVEIS DE ANSIEDADE DE CAMUNDONGOS C57BL/6

EXPOSTOS À NICOTINA E/OU ETANOL DURANTE ADOLESCÊNCIA

Fernanda Barbosa Nunes Coelho

Dissertação submetida à Universidade do

Estado do Rio de Janeiro para a obtenção

do grau de Mestre em Fisiopatologia

Rio de Janeiro

2007

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Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

ALTERAÇÕES NOS NÍVEIS DE ANSIEDADE DE CAMUNDONGOS C57BL/6

EXPOSTOS À NICOTINA E/OU ETANOL DURANTE ADOLESCÊNCIA

Fernanda Barbosa Nunes Coelho

Dissertação submetida à Universidade do

Estado do Rio de Janeiro para a obtenção do

grau de Mestre em Fisiopatologia

Orientadora:

Profa. Dra. Yael de Abreu Villaça

Co-orientador:

Prof. Dr. Cláudio Carneiro Filgueiras

Rio de Janeiro

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Nunes, Fernanda

Alterações nos níveis de ansiedade de camundongos C57BL/6 expostos à

nicotina e/ou etanol durante adolescência / Fernanda Nunes. – 2007.

x, 93 p.: il.

Orientadora: Yael de Abreu Villaça

Co-orientador: Cláudio Carneiro Filgueiras

Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Centro

Biomédico, Faculdade de Ciências Médicas.

1. Adolescência. 2. Ansiedade. 3. Nicotina. 4. Etanol. I. Abreu-Villaça, Yael. II.

Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Centro Biomédico. Faculdade de

Ciências Médicas. III. Título.

iii

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

CENTRO BIOMÉDICO

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

ALTERAÇÕES NOS NÍVEIS DE ANSIEDADE DE CAMUNDONGOS C57BL/6

EXPOSTOS À NICOTINA E/OU ETANOL DURANTE ADOLESCÊNCIA

Fernanda Barbosa Nunes Coelho

Orientadora:

Profa. Dra. Yael de Abreu Villaça

Co-orientador:

Prof. Dr. Cláudio Carneiro Filgueiras

Aprovada 25 de junho 2007 pela banca examinadora:

Profa. Dra. Penha Cristina Barradas

Prof. Dr. Marcos Rochedo Ferraz

Prof. Dr. Rogério Arena Panizzutti

Rio de Janeiro

2007

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais Jorge e Mônica e minha irmã Lívia pelo apoio e incentivo, os

quais foram fundamentais para eu conseguir chegar até aqui.

A minha orientadora Yael por todo apoio durante a realização deste trabalho e por todas

orientações, no mais amplo sentido, que foram muito importantes em vários momentos. Ao

meu co-orientador Cláudio, por todo apoio e atenção. Tenho certeza que a viagem será

ótima, mas saiba que você vai fazer muita falta! Ao Alex por todo apoio e incentivo

expressos da forma mais carinhosamente ácida. Aos três por tudo, por estarem sempre

presentes, me auxiliando nesta caminhada até aqui, mas principalmente, pela amizade.

Aos meus queridos amigos de laboratório: Andréia, Anderson, Carla, Mabel, Monique,

Fabíola, pelo carinho de sempre, pelos momentos memoráveis (muitos ainda virão) e pela

força, principalmente nesta fase final. Enfim, a todos os membros do laboratório de

Neurofisiologia.

A minhas amigas Flávia Alvim e Denise Oliveira, pela amizade, pelos abraços nas horas

difíceis e por contribuírem de forma substancial nos bons momentos.

As minhas amigas Giselle e Liana, pela força e por sempre me apoiarem e vibrarem

comigo a cada conquista.

Aos meus amigos da UNI-RIO, por 7 anos de pura alegria e amizade. Carine, Maíra,

Priscila, Cristovam, Iuri, Alexandre (sua ajuda nessa reta final foi muito importante) e

todos os demais “biologistas”, é muita gente, por isso, sintam-se todos citados.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

FIGURA 1 Fotos do aparelho de teste de comportamento LCE 25

FIGURA 2 Médias de ingesta/peso de fêmeas e machos 31

FIGURA 3 Médias dos valores de peso de fêmeas e machos 32

FIGURA 4 Médias de Tempo BA e %Tempo BA dos animais 34

testados em PN45

FIGURA 5 Médias de Entradas BA e %Entradas BA dos animais 35

testados em PN45

FIGURA 6 Médias de Entradas BA+BF dos animais testados em PN45 35

FIGURA 7 Médias de Tempo BA e %Tempo BA dos animais 36

testados em PN50

FIGURA 8 Médias de Entradas BA e %Entradas BA dos animais 37

testados em PN50

FIGURA 9 Médias de Entradas BA+BF dos animais testados em PN50 37

FIGURA 10 Médias de Tempo BA e %Tempo BA dos animais 38

testados em PN75

FIGURA 11 Médias de Entradas BA e %Entradas BA dos animais 39

testados em PN75

FIGURA 12 Médias de Entradas BA+BF dos animais testados em PN75 39

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ANOVA análise de variância

Entradas BA entradas nos braços abertos

%Entradas BA percentual de entradas nos braços abertos

Entradas BA+BF entradas nos braços abertos + entradas nos braços fechados

F valor do F de Fisher

LCE labirinto em cruz elevado

ms milisegundos

nAChRs receptores nicotínicos acetilcolínicos

P valor de prova

r coeficiente de correlação de Pearson

rANOVA análise de variância com repetição

PN45 45º dia de vida pós-natal

PN50 50ºdia de vida pós-natal

PN75 75ºdia de vida pós-natal

Tempo BA tempo nos braços abertos

%Tempo BA tempo nos braços abertos

vii

SUMÁRIO

Página

LISTA DE ILUSTRAÇÕES v

LISTA DE ABREVIAÇÕES vi

RESUMO ix

ABSTRACT x

1 - INTRODUÇÃO 1

1.1 Adolescência 1

1.2 Alterações neurais durante a adolescência 3

1.3 Adolescência e uso de drogas 5

1.3.1 Nicotina 6

1.3.2 Álcool 11

1.3.3 Associação entre nicotina e etanol 15

1.4 Ansiedade e o uso de nicotina e etanol 18

2 - OBJETIVOS 21

3 - MATERIAIS E MÉTODOS 22

3.1 Animais 22

3.2 Formação dos grupos experimentais 22

3.3 Ingesta de líquido, peso corporal e consumo de nicotina 23

3.4 Teste comportamental 24

3.5 Variáveis quantificadas 26

3.6 Análise estatística 27

4 - RESULTADOS 30

4.1 Efeitos da ingesta/peso, consumo de nicotina e peso corporal 30

4.2 Análise global das medidas de ansiedade 33

4.3 Efeitos de ansiedade 34

5 - DISCUSSÃO 40

5.1 Resumo dos resultados 40

5.2 Considerações metodológicas 41

5.2.1 Camundongos C57BL/6 41

viii

5.2.2 Labirinto em cruz elevado 42

5.2.3 Doses e vias de administração 43

5.2.4 Efeito do consumo de nicotina e da ingesta/peso 44

5.2.5 Efeitos da nicotina na atividade locomotora 45

5.3 Efeitos ansiolíticos durante a exposição na adolescência 45

5.4 Efeito ansiogênico durante o período de retirada 47

5.5 Neurobiologia das interações nicotina × etanol 49

6 - CONCLUSÃO 52

7 - BIBLIOGRAFIA 53

8 - ANEXO: Artigo XX

YAEL ABREU-VILLAÇA, FERNANDA NUNES,

FABÍOLA DO E. QUEIROZ-GOMES, ALEX C. MANHÃES,

CLÁUDIO C. FILGUEIRAS.

Combined Exposure to Nicotine and Ethanol in Adolescent Mice

Differentially Affects Anxiety Levels during Exposure, Short Term

and Long Term Withdrawal.

Neuropsychopharmacology, aceito para publicação, 2007.

RESUMO

O consumo de bebidas alcoólicas e o hábito de fumar são freqüentemente iniciados

durante a adolescência. Essa associação pode ser explicada pelos efeitos comportamentais

cumulativos da nicotina e do etanol, particularmente aqueles relacionados à ansiedade.

Entretanto, apesar dos dados epidemiológicos a respeito desta relação, existem poucos

estudos animais com foco na neurobiologia da dupla exposição (nicotina e etanol) durante

a adolescência. Neste trabalho foram avaliados através do uso do teste de labirinto em cruz

elevado os efeitos de curto e longo prazo da exposição à nicotina (NIC) e/ou etanol

(ETOH) durante a adolescência (30º ao 45º dia de vida pós-natal) em quatro grupos

experimentais utilizando camundongos machos e fêmeas da cepa C57BL/6: 1) exposição

concomitante a NIC [solução de nicotina free base (50µg/ml) em solução de sacarina a 2%

administrada via oral] e ETOH [solução de etanol (25%, 2g/kg) i.p. a cada dois dias], 2)

exposição à nicotina, 3) exposição ao etanol, 4) exposição ao veículo. Camundongos da

cepa C57BL/6 foram escolhidos para o estudo por beberem bem nicotina na concentração

utilizada neste estudo. Durante a exposição (45º dia de vida pós-natal, PN45), os resultados

indicam que o etanol foi ansiolítico durante a adolescência destes camundongos e que a

nicotina reverteu este efeito. Um curto período de tempo de retirada da droga (PN50)

evidenciou efeitos sexo-dependentes; a exposição à nicotina e/ou etanol foi ansiogênica

apenas para fêmeas. Apesar de nem os efeitos da nicotina nem do etanol persistirem após

um mês o término da exposição (PN75), os efeitos da dupla exposição ocasionaram uma

reposta ansiogênica. Os resultados sugerem que a redução da resposta aos efeitos

ansiolíticos do etanol em adolescentes humanos simultaneamente expostos à nicotina pode

levar a consumo maior de etanol. Adicionalmente, o aumento nos níveis de ansiedade

durante um longo período de retirada (nicotina e etanol) pode facilitar recaídas ao uso

destas drogas.

ABSTRACT

Smoking and consumption of alcoholic beverages are frequently associated during

adolescence. This association could be explained by the cumulative behavioral effects of

nicotine and ethanol, particularly those related to anxiety levels. However, despite

epidemiological findings, there have been few animal studies of the basic neurobiology of

the combined exposure in the adolescent brain. In the present work we assessed, through

the use of the elevated plus maze, the short and long term anxiety effects of nicotine (NIC)

and/or ethanol (ETOH) exposure during adolescence (from the 30

to the 45

postnatal

day) in four groups of male and female C57BL/6 mice: 1) Concomitant NIC [nicotine free

base solution (50µg/ml) in 2% saccharin to drink] and ETOH [ethanol solution (25%,

2g/kg) i.p. injected every other day] exposure; 2) NIC exposure; 3) ETOH exposure; 4)

Vehicle. C57BL/6 mice were selected because they readily consume nicotine in the

concentration used in the present study. During exposure (45

postnatal day: PN45), our

results indicated that ethanol was anxiolytic in adolescent mice and that nicotine reverted

this effect. Short term drug withdrawal (PN50) elicited sex dependent effects: exposure to

nicotine and/or ethanol was anxiogenic only for females. Although neither nicotine nor

ethanol effects persisted up to one month post-exposure (PN75), the co-administration

elicited an anxiogenic response. Our results suggest that the deficient response to the

anxiolytic effects of ethanol in adolescents co-exposed to nicotine may drive higher

ethanol consumption. Additionally, increased anxiety during long term smoking and

drinking withdrawal may facilitate relapse to drug use.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Adolescência

A adolescência inclui todo processo de transição da infância para a idade adulta.

Desta forma, a adolescência não é sinônimo de puberdade. A puberdade é uma fase mais

discreta durante a qual alterações fisiológicas e neuroendócrinas associadas com a

maturação sexual ocorrem. A puberdade é apenas uma das alterações ontogenéticas que

ocorrem durante a adolescência com sua duração compreendida dentro do processo de

adolescência, variando consideravelmente entre humanos (Dubas, 1991).

O limite temporal da adolescência não é de fácil definição. Em algumas espécies é

difícil caracterizar quando a transição para adolescência começa a acontecer e quando o

indivíduo passa de adolescente a adulto. Em roedores como ratos e camundongos, as

primeiras alterações associadas à adolescência podem ocorrem já a partir do vigésimo dia

de vida pós-natal (PN20) e as últimas mudanças podem ocorrer até PN55. Em primatas não

humanos, a adolescência ocorre geralmente entre 2 e 4 anos de vida (Lewis, 1997); em

humanos, a adolescência é comumente definida como a segunda década de vida (Petersen

et al., 1996), além disso, alguns autores consideram idades acima de 25 anos “adolescência

tardia” (Baumrind, 1987).

Adolescentes de várias espécies diferem comportamentalmente de indivíduos mais

jovens e mais velhos. Estudos com roedores têm mostrado que adolescentes exibem

diferenças quando comparados com adultos em relação a medidas de ansiedade, depressão

e reatividade ao stress (Adriani e Laviola, 2004; Slawecki , 2005). De fato, alguns estudos

mostram que ratos adolescentes podem exibir níveis menores ou maiores de ansiedade em

análises comportamentais quando comparados com adultos (Cheeta et al., 2001; Doremus

et al., 2003; Elliott et al., 2005; Genn, 2003; Imhof et al., 1993; Primus e Kellog, 1989;

Slawecki, 2005; Walker et al., 2004). Durante adolescência, roedores apresentam elevados

níveis de busca pela novidade (Adriani et al., 1998), impulsividade (Adriani e Laviola,

2003) e comportamento de risco (Macri’et al., 2002), assim como redução de resposta ao

stress (Adriani e Laviola, 2000). Ratos adolescentes exibem aumento no comportamento

exploratório e na busca de novidade em relação a ratos em outras idades (Spear et al.,

1980; Spear, 2000). Em humanos, a adolescência é caracterizada por traços

comportamentais como labilidade emocional, impulsividade e comportamento de risco que

estão associadas com o aumento de vulnerabilidade para transtornos neuropsiquiátricas,

incluindo doenças afetivas e vício (Andersen, 2003; Arnett, 1999; Spear, 2000; Teicher et

al., 2003; Volkow e Li, 2005; Wallace et al., 2003).

De modo geral, as alterações comportamentais observadas durante a adolescência são

consistentes com a necessidade do adolescente de explorar novos domínios e estabelecer

novas relações durante o processo de independência dos pais (Spear, 2002). O aumento no

valor atribuído pelo adolescente à interação social com indivíduos fora do círculo familiar

contribui para promover a independência destes adolescentes em relação aos pais (Spear,

2000). O aumento do comportamento de risco é observado numa variedade de espécies e

pode servir como oportunidade de explorar novos comportamentos e situações, o que por

sua vez aumenta a probabilidade de experimentação de comportamentos propícios à

repetição (positive reinforcements), os quais estão associados ao uso de drogas.

Alguns trabalhos começam a explicar porque os adolescentes podem se comportar

“de forma madura na segunda e ter atitudes imprudentes na terça”, ou seja, apresentarem

comportamentos instáveis. Neurocientistas têm descrito que o cérebro adolescente está

passando por uma remodelação que pode ser responsável pela propensão dos adolescentes

a correr riscos, buscar novas experiências e pela dificuldade em impedir comportamentos

imprudentes. Esta pode ser uma das razões pelas quais é três a quatro vezes mais provável

morrer durante a adolescência quando comparada com a infância (Powell, 2006).

Durante a adolescência, o desenvolvimento neural ocorre em regiões associadas com

motivação, impulsividade e vício. A impulsividade e busca pela novidade são traços

comportamentais transicionais que podem ser explicados, em parte, por mudanças na

maturação dos sistemas corticais frontais e subcorticais monoaminérgicos. As mudanças

no desenvolvimento dos circuitos neurais envolvidos no controle de impulsos têm

implicações significativas para entender o comportamento adolescente (Chambers et al.,

2003).

1.2. Alterações neurais durante a adolescência

O cérebro durante a adolescência está em transição. Regiões neurais como o córtex

pré-frontal e outras regiões de projeções dopaminérgicas do prosenencéfalo, apresentam

alterações proeminentes durante a adolescência. Dada a importância dessas regiões

cerebrais na modulação de mecanismos de recompensa associados ao uso de drogas (Koob,

1992a) e de respostas a agentes estressores (Dunn e Kramarcy, 1984) e a associação entre

ambos (Goeders, 1997; Piazza et al., 1991), não é surpresa constatar que adolescentes

respondem de formas diferentes a drogas de abuso, agentes estressores e a interação entre

ambos, quando comparados com animais adultos ou mais maduros (Spear, 2002).

O cérebro apresenta maior grau de desenvolvimento durante a infância e relativa

estabilidade na idade adulta, sendo seu desenvolvimento pontuado por rápidas

transformações neurais durante a adolescência (Spear, 2000). Esta metamorfose do cérebro

adolescente é caracterizada não apenas pela continuada maturação do sistema neural, mas

também pela perda de aproximadamente metade do número de conexões sinápticas em

algumas regiões neurais (Rakic et al, 1994), perda esta que pode servir para refinar as

conexões e aumentar a eficiência cerebral durante a adolescência (Chugani, 1996).

Uma região cerebral que é altamente modificada em várias espécies durante

adolescência é o córtex pré-frontal, área fortemente relacionada com habilidades cognitivas

(Diamond, 1991). O volume do córtex pré-frontal diminui durante a adolescência tanto em

humanos (Jernigan et al., 1991) quanto em ratos (Van Eden et al., 1990). Além disso,

também tem foi demonstrada em humanos (Huttenlocher, 1984) e primatas não-humanos

(Zecevic et al., 1989) a eliminação de sinapses no córtex pré-frontal e outras regiões

corticais. Outros autores descrevem ainda um aumento de projeções dopaminérgicos no

córtex pré-frontal de adolescentes humanos e ratos (Kalsbeek et al., 1988), decorrente da

substancial reorganização que o sistema dopaminérgico sofre durante a adolescência.

A região dorsolateral do córtex pré-frontal, área relacionada ao controle de impulsos,

também está sofrendo contínuos processos de mudanças durante a adolescência (Giedd,

2004; Sowell et al., 2001). Alterações relacionadas à maturação durante a adolescência

também são evidentes em outras regiões cerebrais como hipocampo de roedores (Dumas e

Foster, 1998; Wolfer e Lipp, 1995) e humanos (Benes, 1989). Durante este período, estas

áreas cerebrais apresentam proliferação e maturação de terminais axonais e sinapses

(Stamford, 1989; Teicher et al., 1995).

Em alguns testes comportamentais, a performance dos adolescentes é igual a dos

adultos. Entretanto, o que se observa é que para uma mesma tarefa, o cérebro adolescente

age como um cérebro adulto desempenhando uma tarefa muito mais difícil, logo, eles

despendem mais trabalho para atingir essa igualdade de performance (Powell, 2006).

1.3. Adolescência e uso de drogas

Alguns estudos sugerem a ocorrência de mudanças drásticas no desenvolvimento

cerebral durante a adolescência que poderiam predispor um indivíduo a experimentar

substâncias como álcool, drogas ilícitas e tabaco (Laviola et al.; 1999; Spear 2000;

USDHHS, 1988). De fato, adolescentes são mais propensos a uma variedade de

comportamentos de risco, incluindo o uso de drogas (Martin et al., 2002). Diversos estudos

mostram que é nesse período que freqüentemente ocorre o primeiro uso de drogas como

álcool e tabaco (Grant et al., 1987; Kandel e Yamaguchi, 1985; Nelson et al., 1995;

Webster et al.,1994). Dois comportamentos envolvidos na iniciação do uso de drogas são a

impulsividade ou um desejo por novidades e experiências excitantes (sensation seeking).

Intensa busca pela novidade, característica do período da adolescência, tem sido associada

a um maior consumo de drogas de abuso (Abreu-Villaça et al., 2006; Spear, 2000). Estudos

em humanos têm encontrado forte correlação entre altas taxas de busca por sensações

novas e uso de drogas, incluindo álcool e nicotina (Zuckerman, 1994). Adicionalmente, a

dependência ao álcool e à nicotina tem sido associada a altos níveis de impulsividade

(Mitchell, 1999; Poulos et al., 1998;).

Existem também evidências 0 T7eAdicde

Apesar das causas que levam o adolescente a iniciar e dar continuidade ao consumo

de drogas não estarem ainda estabelecidas, sabe-se que a idade do primeiro contato com

compostos psicoativos é crítica, havendo maior probabilidade de se passar do estágio de

uso para abuso se o consumo tiver início durante a adolescência. Desta forma, o

desenvolvimento do vício está associado com um contato precoce com a droga (Robins e

Przybeck, 1985). Indivíduos que não iniciam o uso destas drogas durante a adolescência

raramente iniciam o uso em idades posteriores (Chen e Kandel, 1995; Kandel e Logan,

1984). Como o cérebro durante a adolescência continua passando por processos de

crescimento e mudanças consideráveis, existe um interesse muito grande a respeito das

conseqüências a longo prazo do uso de drogas durante este período crítico (Barron et al.,

2005). Estudos clínicos têm sugerido que podem existir conseqüências marcantes em

decorrência ao uso crônico de drogas durante a adolescência, incluindo álcool (Grant e

Dawson, 1997) e mais recentemente nicotina (Jacobsen et al., 2005). O desenvolvimento

de modelos animais de exposição a drogas de abuso durante a adolescência têm sido

extremamente interessante, pois permite a investigação destas questões (Barron et al.,

2005).

1.3.1 Nicotina

O tabagismo é a principal causa de morte evitável e doenças em países em

desenvolvimento. A nicotina é considerada o componente primário do tabaco que

estabelece e mantém a dependência apesar das conseqüências prejudiciais (Di Chiara,

2000; Stolerman e Shoaib, 1991). Apesar dos efeitos do tabaco em relação à saúde e da

capacidade viciante da nicotina serem bem conhecidos, mais de 4500 adolescentes iniciam

o hábito de fumar todos os dias somente nos Estados Unidos (American Lung Association,

2002; Gilpin et al., 1999). Estima-se que mais de seis milhões de crianças eventualmente

irão morrer prematuras em decorrência de doenças relacionadas ao hábito de fumar

somente nos Estados Unidos (American Lung Association, 2002; CDC, 1998).

Aproximadamente um terço da população mundial é constituída por fumantes e a

maioria iniciou o hábito de fumar durante a adolescência (Mansvelder e McGehee, 2002).

Estudos mostram que a probabilidade de parar de fumar na idade adulta diminui

substancialmente quando o hábito de fumar é iniciado durante a adolescência (Klein et al.,

2004) e que o consumo de cigarros diários é maior em indivíduos que iniciam o hábito na

adolescência quando comparados com indivíduos que iniciam o hábito de fumar na idade

adulta (Chen e Millar, 1998; Nelson et al., 1995; Pierce e Gilpin, 1996). Adicionalmente,

adolescentes já expressam sintomas de dependência à nicotina após o consumo de apenas

alguns cigarros (Di Franza et al., 2000).

Após um ano do início do hábito de fumar, a maioria dos adolescentes fumantes

relatam tentativas de parar. Entretanto, devido aos efeitos adversos da abstinência, 97%

desses adolescentes fumantes ainda continuam a fumar e, dois anos mais tarde, a maioria

destes fumantes se dizem dependentes (Mc Neill, 1991). Os sinais e sintomas descritos por

fumantes que tentaram parar de fumar são em geral: irritabilidade, ansiedade, depressão,

aumento de fome e ganho de peso, agitação, distúrbios do sono e intensa vontade de usar

novamente (Malin, 2001). Um dos sintomas mais freqüentemente mencionados por

fumantes durante o período de retirada da nicotina é o aumento do nível de ansiedade

(Kassel e Unrod, 2000).

Enquanto numerosos estudos têm explorado as conseqüências da exposição fetal ou

na idade adulta à nicotina nas últimas décadas, os primeiros artigos abordando efeitos da

nicotina no sistema nervoso durante a adolescência foram publicados somente em 1999

(Trauth et al, 1999). Desde então, vários estudos em animais experimentais vem

demonstrando que o consumo de nicotina durante a adolescência produz alterações

neurocomportamentais persistentes (Brielmaier et al., 2007; Nolley e Kelley, 2007;

Slawecki et al., 2004; Slawecki e Ehlers, 2002; Trauth et al., 2000a). Além disso, a

exposição à nicotina durante a adolescência, também resulta em mudanças da atividade

neurofisiológica em adultos (Slawecki et al., 2003).

Recentes estudos utilizando roedores adolescentes expostos à nicotina proporcionam

suporte neuroquímico e comportamental para a hipótese da adolescência como período

crítico (Abreu-Villaça et al., 2003, Adriani et al.,2002; Klein, 2001; Laviola et al., 2003;

Miao et al., 1998). De fato, diversos estudos têm mostrado diferenças de respostas

comportamentais entre roedores adultos e adolescentes (Brielmaier et al., 2007; Doremus

et al., 2004; Elliott et al., 2005; Kota et al., 2007; Wilmouth e Spear, 2006). Alguns efeitos

da nicotina parecem depender do sexo. Foi demonstrado que ratos machos adolescentes

expostos à nicotina apresentam maior risco de consumo de opióides e nicotina na idade

adulta (Adriani et al., 2003). Adicionalmente, ratos fêmeas são mais sensíveis aos efeitos

ansiolíticos da nicotina quando comparadas a ratos machos (Cheeta et al., 2001).

Mecanismos de ação neuroquímicos da nicotina

A nicotina, um alcalóide natural presente nas folhas de tabaco, é o principal

responsável pelo vício do tabaco (Benowitz, 1992; Dani et al., 2001). É amplamente aceito

que todos os principais efeitos comportamentais da nicotina, incluindo reforço e estímulos

aversivos, são mediados pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) localizados

no cérebro (Dani e De Biasi, 2001; Wonnacott et al., 2005). Os nAChRs são canais

pentaméricos catiônicos ligantes e estão localizados em sítios pré e pós sinápticos no

sistema nervoso central e periférico (Leonard e Bertrand, 2001; Sargent, 2000). Em

mamíferos, já foram clonadas 8 subunidades α (α2 a α7, α9 e α10) e 3 subunidades β (β2 a

β4) (Elgoyhen et al., 1994, 2001; Lindstrom et al., 1996; McGehee e Role, 1995; Sargent,

1993; Tassonyi et al., 2002). Os nAChR podem modular a liberação de

neurotransmissores, ação sináptica e atividade neuronal através de alterações em estados

funcionais (Aramakis e.Metherate, 1998; Dani et al., 2000; Gopalakrishnan et al., 1997;

Nishizaki e Sumikawa, 1998)melhorar a frase, desempenhando um papel importante em

muitos processos fisiológicos e patológicos incluindo o desenvolvimento neuronal,

aprendizado e memória e respostas de reforço induzidas por drogas de abuso

(Gopalakrishnan et al., 1997; Jang et al., 2002; Levin e Simon, 1998; Salamone e Zhou,

2000). Há evidências de que nAChRs também estão envolvidos em processos como

ansiedade (File et al., 2000; Ross et al., 2000), controle do sono (Domino e Yamamoto,

1965; Salin-Pascual et al., 1999), antinocicepção (Marubio et al., 1999) e funções do

sistema nervoso autônomo (Xu et al., 1999a, b; De Biasi, 2002). Adicionalmente, nAChRs

podem estar envolvidos em transtornos neurológicas como epilepsia noturna,

esquizofrenia, Parkinsonismo e Alzheimer (Dani De Biasi, 2001; Leonard et al., 2001;

Levin e Simon, 1998; Moulard et al., 2001; Rusted et al., 2000).

Apesar da nicotina ser a principal substância responsável pelo vício de fumar, os

mecanismos moleculares envolvidos neste processo ainda são pouco conhecidos. Em

particular, tem sido sugerido que tanto a dessensibilização quanto a upregulation de

nAChRs têm papel nos mecanismos de vício (Buisson e Bertrand, 2001, 2002; Dani e De

Biasi, 2001; Quick e Lester, 2002).

A dessensibilização é uma característica geral de canais do tipo portão dependentes

de neurotransmissores, e pode ser definida como uma diminuição ou perda de resposta

biológica destes canais em resposta a uma estimulação prolongada ou repetitiva. A

dessensibilização representa uma forma clássica do comportamento alostérico de proteínas,

no qual o receptor está distribuído entre um número discreto de conformações. Agonistas

estabilizarão preferencialmente um ou mais estados (Carr et al., 1989). Após a exposição a

um agonista, o tempo de curso de dessensibilização será governado por taxas constantes de

transição, mas de forma geral, devido aos estados dessensibilizados terem maior afinidade

pelos agonistas, após um tempo, todos os receptores serão dessensibilizados (Wang e Sun,

2005). Para nAChRs, a dessensibilização pode ser descrita como um declínio na resposta à

nicotina após uma exposição repetitiva à nicotina. O início da dessensibilização é tempo- e

concentração-dependente (Garrido et al.,2001; Karlin, 2002).

A upregulation de nAChRs, que pode ser definida como o aumento do número e/ou

afinidade de nAChRs é observada em cérebros de fumantes e animais expostos à nicotina.

De fato, foi demonstrado que exposições por curtos períodos de tempo (2 dias) e com

doses que produzem níveis plasmáticos de nicotina correspondentes a fumar 2 cigarros, já

causam upregulation de nAChRs (Abreu-Villaça et al., 2003a). Acredita-se que a

upregulation constitui uma resposta celular à dessensibilização (Fenster et al., 1999).

Contudo, não se sabe se as mudanças ocorridas são acompanhadas por um aumento de

função dos receptores (Buisson e Bertrand, 2002). Os subtipos de receptores nicotínicos

mais abundantes presentes no cérebro e que sofrem upregulation após exposição à

nicotina, são α4β2 e α7 (Abreu-Villaça et al., 2003, 2004 Buisson e Bertrand, 2002).

Acredita-se ainda que mecanismos de upregulation e dessensibilização estão

envolvidos na regulação de monoaminas do cérebro. A nicotina aumenta a liberação de

dopamina na área tegmental ventral, área esta que desempenha papel central nos efeitos de

reforço da droga (Dani e De Biasi, 2001). Atualmente, as formas mais efetivas nas

tentativas de interromper o hábito de fumar, envolvem métodos alternativos de liberação

de nicotina (e.g. adesivos transdermais, gomas de mascar ou sprays nasais), os quais são

administrados com doses gradativamente menores, resultando numa diminuição

progressiva da captação de nicotina pelo organismo (Buisson e Bertrand, 2002). A redução

progressiva da concentração de nicotina no sangue e no cérebro parece ajudar pacientes a

escapar dos processos de vício induzidos pela droga (Buisson e Bertrand, 2002).

1.3.2 Álcool

Estudos epidemiológicos sugerem que a idade na qual se inicia o consumo de álcool

pode influenciar profundamente na probabilidade de desenvolver transtornos no consumo

de substâncias de abuso em momentos futuros (Clark et al., 1998; Duncan et al., 1997;

Gant e Dawson, 1997). O início precoce do uso de álcool tem sido mostrado em diversos

estudos prospectivos e retrospectivos como um poderoso preditor de uso tardio e

dependência de álcool (Deykin et al., 1987; Fergusson et al., 1994; Friedman e Humphrey,

1985; Grant e Dawson, 1997; Hawkins et al., 1997; Prescott e Kendler, 1999; Rachal et al.,

1982).

As razões que determinam a alta prevalência do uso de álcool pelos adolescentes

ainda não estão claras. Alguns autores relatam que os níveis de stress são um dos fatores

que podem predizer o uso e abuso de álcool e outras drogas por humanos adolescentes

(Baer et al., 1987; De Wit et al., 1999; Deykin et al., 1987; Johnson e Pandina, 1993;

Tschann et al., 1994; Wills, 1986). Outra possibilidade é que os adolescentes podem exibir

insensibilidade a algumas conseqüências negativas decorrentes ao uso de álcool, durante e

após o consumo. De fato, alguns trabalhos com modelos animais, mostram que os

adolescentes são menos sensíveis que os adultos a diversos efeitos do etanol, incluindo

efeito hipnótico (Little et al., 1996; Silveri e Spear, 1998), hipotermia (Silveri e Spear,

2000), perda do controle motor (White et al., 2002a), alterações na marcha (Little et

al.,1996), dificuldade em se relacionar com outras pessoas (Varlinskaya e Spear, 2002a),

alterações no estado de ansiedade (Varlinskaya e Spear, 2002a), analgesia (Hernandez e

Spear, 2003), sedação (Ernst et al., 1976; Keir e Deitrich, 1990; Little et al., 1996; Moy et

al., 1998; Silveri e Spear, 1998) e letalidade (Hollstedt e Rydberg, 1977). Em

contrapartida, adolescentes são mais sensíveis em relação aos adultos a determinados

efeitos restritivos do etanol, incluindo a indução de danos na função de receptores NMDA

(N-Metil-D-Aspartato) e LTP (long term potentiation ou potenciação de longo prazo)

hipocampais (Swartzwelder et al., 1995a, 1995b), assim como dano na performance em

tarefas de memória espacial (Markwise et., 1998). Diferentes taxas de desenvolvimento

dos sistemas neurais envolvidos em diferentes efeitos do etanol podem contribuir para o

mosaico de diferenças de idade em relação à sensibilidade ao etanol (Spear e Varlinskaya,

2005).

Os adolescentes não são imunes ao desenvolvimento de dependência ao álcool,

cigarros e outras drogas. Adolescentes que usam quantidades substanciais podem exibir

uma variedade de sintomas de dependência ao álcool, incluindo evidências de tolerância,

aumento progressivo de consumo, dificuldade em diminuir a quantidade de bebida ingerida

e parar de beber (Pollock e Martin, 1999). Adicionalmente, uma vez dependentes, a

freqüência de recaída para adolescentes se aproxima daquela de adultos alcoolistas, apesar

do tempo de abuso por adolescentes ser muito menor quando comparado com adultos

(Brown, 1993). Estudos demonstram que animais experimentais que são geneticamente

mais suscetíveis a consumir etanol voluntariamente podem rapidamente auto-administrar

etanol durante a adolescência, mas que características do meio também influenciam o

consumo (ver por ex. Barron et al., 2005). Similarmente, tem sido demonstrado que em

humanos, fatores genéticos e epigenéticos influenciam o desenvolvimento do alcoolismo

(Barron et al., 2005). Adicionalmente, o contato inicial com etanol durante a adolescência

pode aumentar a probabilidade de consumo durante a idade adulta, tornar mais difícil

abandonar o vício, além de aumentar a probabilidade de recaídas durante a abstinência.

Além disso, para estes indivíduos, o contato com etanol durante a adolescência pode ter um

impacto significante nos sistemas neurais envolvidos nos mecanismos de recompensa em

relação ao etanol (Barron et al., 2005), como ativação do sistema mesocorticolímbico

dopaminérgico (Larsson e Engel, 2004).

Numerosos estudos têm demonstrado que o cérebro adolescente pode ser mais

vulnerável aos efeitos do álcool (Slawecki e Roth, 2004; Spear e Varlinskaya, 2005; Yttri

et al., 2004). Diversos estudos animais sugerem que a exposição ao etanol durante a

adolescência pode prejudicar o desenvolvimento normal de processos neurais, os quais

podem estar envolvidos em mudanças subseqüentes nas respostas de adultos em relação ao

etanol (Crews et al., 2000; Mc Bride et al., 2005; Sircar e Sircar, 2005; White e

Swartzwelder, 2004; White et al., 2002;).

Os sintomas dos efeitos de retirada do etanol estão bem estabelecidos tanto em

humanos como em modelos animais. Os efeitos do período de retirada são mais severos

após exposição crônica e pouco tempo após o início do período de retirada. Estes sintomas

incluem: náusea, tremores, hipertermia, taquicardia, irritabilidade, hiperventilação,

ansiedade e insônia (Finn e Crabbe, 1997; Roelofs, 1985, Metten e Crabbe, 1996).

Mecanismos de ação neuroquímicos do etanol

Ao contrário da nicotina, não se conhece nenhum receptor específico para o etanol.

Inversamente, o etanol tem sua ação inicial numa variedade de alvos nas membranas

celulares e sinais intracelulares de transdução, induzindo efeitos em receptores de

neurotransmissores e neurohormônios e canais iônicos voltagem-dependentes e

dependentes da ligação a substâncias químicas (Koob et al., 1998). Desta forma, o etanol

exerce seu efeito através de interações dose-dependentes com diversos sistemas neurais,

incluindo GABAérgico, glutamatérgico, dopaminérgico, serotonérgico e sistemas opióides

(Eckardt et al., 1998). Muitos desses sistemas neurais ainda estão em maturação durante a

adolescência. Assim, pode-se supor que o cérebro do adolescente ainda é vulnerável a

efeitos deletérios da exposição a agentes externos; entre estes o etanol.

A inibição da via excitatória glutamatérgica pelo etanol, especialmente a do receptor

NMDA, pode ser uma importante causa dos efeitos neurotóxicos (Tsai e Coyle, 1998),

particularmente intoxicação, sintomas de abstinência (Koob et al., 1998) e episódios de

perda de memória (Tsai e Coyle, 1998).

Os receptores GABAérgicos e glutamatérgicos estão entre os mais importantes alvos

de sítio de ligação para os efeitos comportamentais do etanol. Entretanto, os dados da

literatura a respeito da modulação do etanol nestes receptores têm sido controversos

(Moriguchi et al., 2007). Dados na literatura sugerem que a potencialização da atividade do

receptor GABA depende da combinação das subunidades dos receptores (Wafford e

Whiting, 1992; Wafford et al., 1990, 1991), viabilidade celular (Aguayo et al., 2002), tipos

celulares (Mori et al., 2000; Sapp e Yeh, 1998) e processamentos que ocorrem após a

tradução, incluindo fosforilação do receptor (Harris et al., 1995). Drogas como

benzodiazepínicos e barbitúricos, utilizadas no tratamento de retirada do etanol, agem

primariamente nos receptores GABA (Enoch e Goldman, 2001).

Os nAChRs têm sido reconhecidos como importantes sítios de ação do etanol. Os

nAChRs estão localizados no corpo celular, regiões pré-terminais e pré-sinápticas

GABAérgicas e em outros neurônios em diferentes regiões cerebrais como o córtex e

hipocampo. A ativação destes nAChRs têm mostrado aumentar a liberação sináptica de

GABA, glutamato, e outros neurotransmissores (Alkodon et al.,1997, 1999, 2000;

Colquhoun e Patrick, 1997; Genzen e McGehee et al., 2003, 2005; Gray et al., 1996;

Lindstrom, 1997; Mansvelder et al., 2002; Role e Berg, 1996; Wonnacout, 1997; Yang et

al., 1996). Diversos efeitos comportamentais do etanol que parecem requerer componentes

dos receptores GABAa e receptores dopaminérgicos, incluindo recompensa e reforço

(Blomqvist et al., 1997; Koob et al., 1998; Pontieri et al., 1996), podem estar em parte

relacionados com a modulação dos nAChRs (Alkodon e Albuquerque, 2001, 2002;

Amtage et al., 2004; Cao et al., 2005; Kiyosawa et al., 2001; Li e Eisenach, 2002; O’Leary

e Leslie, 2003; Rao et al., 2003). Desta forma, a modulação dos nAChRs causada pelo

etanol pode levar a uma cascata de eventos sinápticos envolvendo múltiplos

neurotransmissores, que resulta em várias mudanças comportamentais.

Amplas evidências indicam que o sistema mesocorticolímbico dopamérgico está

envolvido no sistema de recompensa cerebral e que a dopamina está diretamente ou

indiretamente envolvida na ação de reforço aguda do etanol em animais experimentais

assim como em humanos (Engel et al., 1999; Koob, 1992a; Tupala et al., 2001; Volkow,

1996; Wise e Rompre, 1989). Entretanto, outros sistemas de neurotransmissores incluindo

GABA, glutamato, serotonina e peptídeos opióides também parecem participar do perfil de

orquestração de recompensa do etanol (Engel et al., 1992; Koob,1992). Vale ressaltar que

alterações comportamentais devidas à exposição ao etanol são determinadas por fatores

relacionados ao indivíduo, sendo estes não apenas de origem genética, mas também podem

envolver estados hormonais assim como a idade do indivíduo (Engel et al., 1985; Fahlke,

1994).

1.3.3 Associação entre nicotina e etanol

Nicotina e álcool são as drogas mais usadas e abusadas. O uso de álcool é

freqüentemente acompanhado pelo uso de outras substâncias psicoativas, particularmente o

tabaco. Dados epidemiológicos mostram uma maior incidência de fumantes entre os

alcoolistas (Rezvani and Levin, 2002). Diversos estudos têm demonstrado que 80% a 90%

dos alcoolistas fumam (Burling e Ziff, 1988; Crowley et al., 1974; Dreher e Fraser, 1967).

O consumo de álcool entre fumantes é duas vezes maior do que entre os não fumantes

(Carmody et al., 1985) e estima-se que o alcoolismo seja de 10 a 14 vezes mais comum

entre fumantes quando comparados com não fumantes (Di Franza e Guerrera, 1990), além

do consumo diário de cigarros por alcoolistas ser maior do que o consumo por fumantes

não alcoolistas (Rezvani e Levin, 2002).

Adolescentes que usam drogas normalmente são usuários de várias drogas, o que

pode contribuir para vários efeitos adversos. Os sintomas de retirada em adolescentes

podem ser mais severos do que os sintomas observados em usuários de uma única droga de

abuso. De fato, a maioria dos adolescentes usuários de drogas são classificados como

dependentes de mais de um tipo de droga de abuso (Stewart e Brown, 1995).

Aproximadamente 85% dos adolescentes participantes de tratamento para desintoxicação,

também são fumantes (Brown, 1993), sendo que foi descrito que o intenso consumo de

álcool e cigarros exacerba os sintomas de retirada de outras drogas (Stewart e Brown,

1995).

Adicionalmente, álcool e nicotina têm sido considerados freqüentemente como

drogas de “porta de entrada” para o consumo de outras drogas, com a maioria dos

indivíduos iniciando o uso destas drogas antes de iniciar o uso de maconha e outras drogas

ilícitas (Spear, 2000). Entretanto, essa seqüência de uso pode não refletir uma associação

causal entre o uso destas drogas e o uso futuro de drogas ilícitas e pode refletir uma

variedade de outros fatores como diferenças associadas à idade do primeiro contato e

sensibilidade a drogas (Merrill et al., 1999).

O uso de drogas de abuso é motivado por diversos fatores, incluindo experimentação,

pressão de companheiros, auto-medicação para problemas psicológicos (por exemplo,

ansiedade e depressão) e dependência. Conseqüentemente, a forte associação entre o

consumo de álcool e o fumo de cigarros está provavelmente atribuída a múltiplos fatores,

incluindo ações farmacológicas comuns a ambos, álcool e nicotina (Little, 2000).

Estudos apontam que nicotina e etanol compartilham importantes mecanismos

neuroquímicos de ação nos sistemas de recompensa cerebrais que podem ser afetados pelo

consumo de nicotina durante a adolescência, o que pode tornar o indivíduo mais inclinado

a desenvolver um abuso futuro de álcool e/ou outras drogas (Blomqvist et al., 1996; Smith

et al., 1999). A exposição à nicotina em ratos durante um curto período de tempo durante a

adolescência apresenta como resultado um aumento de consumo de álcool na idade adulta

(Tsui et al., 2001). Uma via crucial para ação de drogas de abuso é o sistema mesolímbico

dopaminérgico, associado com sensações de prazer. Esta via tem origem na área do

tegumento ventral do mesencéfalo e projeta para o núcleo accumbens, sistema límbico e

córtex orbitofrontal. A amígdala, hipocampo e córtex medial pré-frontal enviam projeções

excitatórias para o núcleo accumbens (Koob et al., 1998). Embora os mecanismos exatos

da ação de drogas de abuso no sistema mesolímbico dopaminérgico não estejam

estabelecidos, acredita-se que estas drogas, atuando direta ou indiretamente em células

dopaminérgicas, causem alterações persistentes, as quais seriam responsáveis, pelo menos

em parte, pelas reações adversas associadas à abstinência.

Uma vez que a nicotina é um análogo da acetilcolina, seus alvos primários e

mediadores celulares são os nAChRs, receptores ionotrópicos amplamente distribuídos no

sistema nervoso. O etanol por sua vez, tem influência direta na função de vários canais

iônicos ativados por neurotransmissores, incluindo os nAChRs (para revisão: Grant KA,

1994). Além disso, tem sido demonstrado que o aumento da liberação de dopamina no

núcleo accumbens pelo álcool parece requerer ativação de receptores nicotínicos na área do

tegumento ventral (Harris, 1999). Em conjunto, estes dados sugerem que o nAChR pode

ser um sítio de interação entre nicotina e etanol.

Adicionalmente, foi demonstrado que etanol potencializa o fluxo de íons estimulado

por agonistas em nAChRs (Aistrup et al., 1999; Cardoso et al., 1999) e que o aumento da

atividade locomotora induzido pelo etanol, assim como a estimulação dos sistemas

dopaminérgicos do mesencéfalo envolvem a ativação de nAChRs (Blomqvist et al., 1992;

Soderpalm et al., 2000). Apesar destes achados, tem havido relativamente poucos estudos

animais com foco na neurobiologia básica da exposição combinada a nicotina e álcool no

cérebro adolescente e, enquanto alguns estudos sugerem que a nicotina tem um efeito

modulador nas alterações causadas pelo etanol através de suas ações nos sistemas

colinérgicos, outros trabalhos mostram que não há interação entre os efeitos das duas

drogas e outros ainda mostram que há potencialização dos efeitos com a dupla exposição

(Bachtell e Ryabinin, 2001; Penland et al., 2001; Tizabi et al., 2003; Tizabi et al., 2002).

1.4. Ansiedade e o uso de nicotina e etanol

Anatomicamente, a expressão comportamental da ansiedade está associada com uma

interrelação entre o sistema límbico e estruturas corticais: sistema septo-hipocampal,

amígdala, hipotálamo e mesencéfalo (Bergink et al., 2004). Dentre estas áreas, a amígdala

e suas projeções eferentes desempenham um papel de extrema importância no processo de

ansiedade e estão envolvidas na aquisição, consolidação e expressão do medo

condicionado (Walker e Davis, 2002). O hipocampo e núcleo septal são duas regiões do

sistema límbico que têm sido associadas ao controle da ansiedade, especialmente na

expressão da ansiedade em resposta à pistas espaciais (File et al., 2000). Além dessas

estruturas, o núcleo da rafe, estrutura do mesencéfalo com alta concentração de neurônios

serotoninérgicos, também parece desempenhar papel no controle da ansiedade (Briley et

al., 1990), como mostram resultados nos quais o efeito ansiolítico pode ser induzido pela

diminuição dos níveis de ativação serotonérgica nesta área. A ansiedade é um sintoma

comum de dependência física e sintomas de retirada de diversas drogas de abuso.

Dados epidemiológicos revelam que tem sido encontrada alta taxa de fumantes entre

indivíduos com transtornos psiquiátricas, incluindo aqueles com transtornos de ansiedade

(Lasser et al., 2000). Algumas evidências dão suporte a idéia de que a ansiedade é um

sintoma que aumenta a probabilidade de se iniciar o hábito de fumar (Morissete et al.,

2007). Estudos com fumantes adultos têm mostrado que o tabaco pode reduzir a ansiedade,

sendo que este efeito é normalmente atribuído à nicotina presente nos cigarros (Kassel e

Unrod, 2000). Assim, tem sido sugerido que fumantes continuam a fumar a fim regular seu

estado de ansiedade (Gilbert et al., 1989; Picciotto et al, 2002; Pomerleau, 1986). Em

contraste, fumantes adolescentes relatam aumento dos níveis de ansiedade durante a

exposição, apesar de ser sugerido que a ansiedade também é sintoma de retirada da

nicotina (Hughes et al, 2000a; Parrot, 2003). Como tem sido descrito que os níveis de

ansiedade desempenham papel na continuidade do vício, é razoável sugerir que os níveis

de ansiedade associados com o fumo e abstinência podem desempenhar importante papel

no uso de tabaco pelos adolescentes. Evitar os efeitos da retirada da nicotina como

ansiedade tem sido sugerido como um importante fator que contribui para a manutenção do

hábito de fumar em humanos (Koob et al., 1993; Watkins et al., 2000). Desta forma,

modelos com roedores têm sido utilizados com o objetivo de verificar esta relação

utilizando como teste comportamental, entre outros, o labirinto em cruz elevado

(Wilmouth e Spear, 2006).

Estudos mostram que a nicotina pode afetar os níveis de ansiedade de diferentes

formas (Picciotto et al., 2002). Em roedores, tem se mostrado que a nicotina pode ser

ansiogênica, ansiolítica ou não causar alterações nos níveis se ansiedade (Broni et al.,

1993; Irvine et al., 1999, 2001a, b; Ouagazzal et al., 1999). Estas diferenças dependem da

dose, tempo entre as injeções e teste, a forma de administração e do teste comportamental

utilizado (Salas et al., 2003). A influência da nicotina nos níveis de ansiedade é complexa e

pode estar relacionada com o aumento de liberação de diferentes neurotransmissores em

uma variedade de estruturas cerebrais. É bem conhecido que os nAChRs pré-sinapticos

modulam a liberação não apenas de acetilcolina, como também noradrenalina, dopamina,

GABA, serotonina, glutamato (Wonnacott, 1997) assim como neuropeptídeos, entre eles,

hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), hormônio liberador de corticotropina (CRH),

neuropeptídeo Y (NPY) e colecistocinina (CCK). De fato, estudos anteriores demonstram

que estes neurotransmissores desempenham papel na patogênese da ansiedade (para

revisão: Bergink et al., 2004).

O efeito ansiolítico do álcool tem sido amplamente reconhecido como importante

fator para o abuso de álcool. O consumo excessivo de álcool por pacientes ansiosos ocorre

provavelmente devido as propriedades ansiolíticas do álcool, o que leva a hipótese de que a

ansiedade pode ser um fator crítico na etiologia do consumo de álcool (Colombo et al,

1995). Os efeitos ansiolíticos do etanol associados à administrações forçadas ou agudas

(Bilkey-Gorzo et al, 1998; Ferreira et al, 2000; Hall et al, 1998; Martijena et al, 2001;

Varliskaya e Spear, 2002) ou consumo voluntário de etanol (Colombo et al, 1995; Gallate

et al, 2003) têm sido extensivamente descritos em diferentes testes com roedores.

Adicionalmente, em contraste com os efeitos descritos durante a exposição, a ocorrência de

efeitos ansiogênicos durante a retirada do etanol têm sido relatados (Kliethermes, 2005).

Estudos recentes têm demonstrado que os efeitos do etanol são dependentes da idade de

exposição, como as diferenças de efeito descritas entre adultos e adolescentes. Estudos

anteriores sugerem que roedores adolescentes são hiposensíveis aos efeitos do etanol, os

quais podem ser fatores determinantes da ingesta. Entre estes efeitos estão a redução da

ansiedade durante a exposição e o efeito ansiogênico durante a retirada (Doremus et al,

2003; Spear e Varlinskaya, 2005; Varlinskaya e Spear, 2004a,b). Entretanto, os efeitos do

etanol relacionados a comportamentos como ansiedade ainda são controversos.

Particularmente, em contraste com dados prévios, estudos recentes têm demonstrado que o

etanol causa uma resposta ansiogênica maior após a exposição durante a adolescência

(Popovic et al, 2004; Slawecki et al, 2004; Slawecki e Ehlers, 2005).

Apesar de dados epidemiológicos indicarem uma forte associação entre o consumo

de tabaco e etanol (Carmody et al, 1985; Dawson, 2000; Di Franza e Guerrera, 1990;

Grant, 1998; Larsson e Engel, 2004), existem poucas informações a respeito das

conseqüências comportamentais em relação às interações entre nicotina e etanol. Mais

importante, não temos conhecimento de estudos em modelos animais com o objetivo de

verificar efeitos da dupla exposição à nicotina e ao etanol durante a adolescência, período

em que o consumo de tabaco e álcool tem início; desta forma, este estudo tem como

objetivo verificar se a nicotina e o álcool interagem alterando o comportamento do

camundongo adolescente.

2. Objetivos

¾ Verificar alterações na expressão comportamental da ansiedade durante o período

de exposição ao etanol e/ou nicotina.

¾ Verificar se os efeitos da dupla exposição nicotina+álcool são mais severos que a

exposição em separado à nicotina ou ao etanol.

¾ Verificar se as alterações comportamentais persistem no período de retirada das

drogas até a idade adulta.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais

Para este trabalho foram utilizados 263 camundongos da cepa C57BL/6 (135 machos

e 128 fêmeas) de 55 ninhadas. Os animais foram criados e mantidos no biotério de

camundongos do Laboratório de Neurofisiologia da Universidade do Estado do Rio de

Janeiro num ciclo diário de 12 horas claro/escuro (claro a partir das 14 horas), temperatura

controlada e mantida em torno de 21º C, com livre acesso à água e comida. Os

experimentos descritos a seguir foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética para o

Cuidado e Uso de Animais Experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara

Gomes da UERJ e estão de acordo com a declaração de Helsinki e com o Guia de cuidados

e uso de animais de laboratório adotado e promulgado pelo Instituto Nacional de Saúde.

3.2. Formação dos grupos experimentais

Após o nascimento, as ninhadas eram reduzidas a um máximo de oito filhotes a fim

de permitir suporte nutricional adequado a todos os animais. Ao completarem 25 dias de

vida pós-natal (PN25), os animais eram desmamados e separados por sexo; os irmãos do

mesmo sexo permaneceram juntos até PN29, quando eram individualizados.

Os animais iniciaram a exposição ao etanol e/ou nicotina em PN30. Com duração de

15 dias, período que abrange a adolescência destes animais, a exposição era encerrada em

PN45. Desta forma, um estudo completo do impacto da exposição à nicotina e ao etanol

durante a adolescência requereu 4 grupos experimentais:

Grupo exposto à nicotina e etanol (NIC+ETOH)

Nicotina free base (50μg/ml) (Sigma, St Louis, MO) foi diluída em sacarina a 2% e

administrada na água que os animais bebiam (única fonte de água).

O etanol foi administrado via intraperitoneal (i.p.), 2g/Kg de etanol, em solução

salina a 25% e as injeções aplicadas a cada dois dias.

Grupo exposto à nicotina (NIC)

Neste grupo os animais foram expostos à nicotina e receberam injeções de salina.

Nicotina free base (50μg/ml) (Sigma, St Louis, MO) foi diluída em sacarina a 2% e

administrada na água que os animais bebiam (única fonte de líquido).

A salina foi administrada via intraperitoneal (i.p.) de acordo com o peso de cada

animal e as injeções ocorreram a cada dois dias.

Grupo exposto ao etanol (ETOH)

Neste grupo os animais foram expostos ao etanol e receberam solução de sacarina a 2%.

O etanol foi administrado via intraperitoneal (i.p), 2g/Kg de etanol, em solução salina

a 25% e as injeções aplicadas a cada dois dias.

A solução de sacarina a 2% foi administrada na água que os animais bebiam (única

fonte de líquido).

Grupo Controle (VEH)

Neste grupo os animais receberam solução de sacarina a 2% na água que os animais

bebiam (única fonte de líquido) e injeções intraperitoneais (i.p)de salina a cada dois dias.

3.3. Ingesta de líquido, peso corporal e consumo de nicotina

A ingesta de líquido e o peso dos animais foram medidos diariamente durante o

período de exposição. A razão entre a ingesta e o peso do animal (ingesta/peso) foi

calculada para todos os grupos de tratamento a fim de detectar possíveis alterações na

ingesta de solução em relação ao peso do animal durante o período de tratamento.

Para os grupos NIC e NIC+ETOH foi quantificado o consumo diário de nicotina

(mg/kg). O consumo diário de solução foi multiplicado pela dose de nicotina (nicotina free

base; 50μg/ml) para ser dividido pelo peso corporal correspondente ao dia da ingesta,

sendo assim, temos:

Sendo:

NICOTINA

DIAi

: consumo de nicotina (em μg/g ou em mg/Kg) no dia i;

DOSE: 50μg de nicotina / ml de sacarina a 2%;

INGESTA

DIAi

: volume (em ml) de solução ingerido no dia i

PESO

DIAi

: peso do animal (em g) no dia i

3.4. Teste comportamental

Cada animal foi submetido ao teste do labirinto em cruz elevado em uma das

seguintes idades: durante a exposição (PN45), cinco dias (PN50) ou um mês (PN75) após o

término da exposição. Ao término do período de exposição, todos os animais testados em

PN50 e PN75 retornavam ao consumo normal de água até a data do teste.

Labirinto em cruz elevado (LCE)

O teste de labirinto em cruz elevado (LCE) é um dos mais populares testes em uso

atualmente dentre os testes comportamentais utilizados para se quantificar os níveis de

ansiedade em animais experimentais (Carobrez e Bertoglio, 2005). O LCE foi validado

DIAi

PESO

INGESTADOSE

NICOTINA

para uso em espécies como ratos (Pellow et al., 1985) e camundongos (Lister, 1987). As

expressões comportamentais observadas no teste LCE representam uma combinação de

comportamentos exploratórios e de esquiva, assim como de atividade geral (Carobrez e

Bertoglio, 2005).

O LCE consiste em um aparelho de acrílico pintado de cinza constituído por 4 braços

- 2 abertos (BA) e 2 fechados (BF) - dispostos em forma de cruz e elevado 50 cm do chão.

As medidas do aparelho são: braços abertos com 5 cm de largura e 29 cm de comprimento

sem paredes e braços fechados com 5 cm de largura, 29 cm de comprimento e 15 cm de

altura (Fig. 1).

Braço Aberto (BA)

Braço Fechado

(BF)

Braço Aberto (BA)

Braço Fechado

(BF)

Figura 1: Foto em vista superior do labirinto em cruz elevado.

Antes do início de cada teste, as gaiolas dos animais foram transportadas para a sala

de teste onde os animais foram ambientados por 10 minutos. Para realização dos testes, os

animais foram colocados sempre na interseção entre os braços, com a cabeça na direção de

um dos braços fechados. A duração do teste foi de 10 minutos. Após o término de cada

teste, o labirinto era limpo com um pano umedecido com água com o intuito de eliminar

excretas e minimizar odores que pudessem interferir no comportamento dos demais

animais a serem testados. Os testes foram realizados na fase escura, numa sala com

proteção acústica e gravados por uma câmera de vídeo (VHS) posicionada a 1m acima do

labirinto para análise posterior.

3.5. Variáveis quantificadas

A partir das imagens gravadas, foram quantificados o tempo de permanência dos

animais nos braços abertos e braços fechados assim como número de entradas nos braços

abertos e braços fechados; para tal foi utilizado o programa ACC PlusM 102 Avaliação

Computadorizada de Comportamento (desenvolvido no Laboratório de

Neurofisiologia/DCF/IBRAG/UERJ). A partir destas medidas, foram quantificados o

percentual de tempo nos braços abertos e o pe

Percentual de entradas nos braços abertos (%Entradas BA): Foi calculado a partir

da razão entre o número de entradas nos braços abertos e a soma do número de entradas

nos braços abertos e braços fechados (BF): %Entradas BA = Nº de entradas / Total de

entradas BA+BF.

Medida de atividade

Com o objetivo de verificar se a atividade locomotora é afetada pela a nicotina e/ou

etanol, a soma do número de entradas nos braços abertos e número de entradas nos braços

fechados (Entradas BA+BF), foi utilizada como medida de atividade geral (Cruz et al.,

1994; Pellow et al., 1985; Rodgers et al., 1995; Rodgers e Dalvi, 1997).

3.6. Análise estatística

Análise dos dados de peso, ingesta, ingesta/peso e ansiedade

Os dados são apresentados como médias e erros padrão. Para reduzir a probabilidade

de erro estatístico do tipo 1 que pode resultar de testes repetidos, os resultados foram

analisados inicialmente usando uma ANOVA global de repetição (ANOVAr) para todos os

fatores (

TRATAMENTO de nicotina e/ou etanol, IDADE e SEXO), sendo os resultados log-

transformados toda vez que a variância era heterogênea . Para o consumo de nicotina, os

efeitos da nicotina e/ou etanol no peso corporal e na ingesta/peso, o DIA foi considerado

como fator de repetição. As

MEDIDAS DE ANSIEDADE (TEMPO BA, %TEMPO BA,

ENTRADAS BA, %ENTRADAS BA) também foram tratadas como medidas de repetição,

visto que cada medida foi obtida do mesmo animal.

ANOVAs de menor ordem foram utilizadas toda vez que interações de

TRATAMENTO com outros fatores foram detectadas. Essas determinações foram feitas

antes de ser decidido se haveria separação por sexo dentro de cada grupo de tratamento.

Diferenças entre grupos individuais ou diferenças entre as idades foram analisadas

utilizando FPLSD ( Fisher Protected Least Significant Difference) como teste post-hoc.

Entretanto, toda vez que não havia interação entre TRATAMENTO e outros fatores, apenas

o efeito do TRATAMENTO era considerado. O valor de significância assumido foi de

p<0,05 para o efeito do tratamento e p<0,1 para interações. Foi avaliado também se efeitos

do TRATAMENTO detectados em ANOVAs de menor ordem eram mantidos após a

subdivisão dos fatores de interação (Snedecor e Cochran, 1967).

O desenho do estudo requereu duas formas diferentes de análise do efeito do

tratamento com nicotina e/ou etanol. Para comparar os quatro grupos tratados (VEH, NIC,

ETOH, NIC+ETOH) entre si, uma análise unidimensional com o fator TRATAMENTO foi

utilizada. Para determinar se a nicotina interfere com os efeitos do etanol ou vice versa, ou

seja, se há interação entre os efeitos da exposição à nicotina e etanol, uma análise

bidimensional foi utilizada com um fator correspondendo ao tratamento com nicotina

(NICOTINA) e o outro correspondendo ao tratamento com etanol (ETANOL). Neste

formato, efeitos mais-que-aditivos (sinergistas) e menos-que-aditivos aparecem como

interações significativas entre as duas dimensões de tratamento (

NICOTINA×ETANOL),

enquanto que efeitos aditivos não apresentam interações significativas (Abreu-Villaça et al,

2004a, 2004b, 2007; Rhodes et al., 2003).

ANOVAs univariadas (TRATAMENTO, IDADE E SEXO usados como fatores) foram

utilizadas para avaliar alterações de atividade (Entradas BA+BF).

Considerando que os animais tinham livre acesso à solução de nicotina, variações na

quantidade de nicotina ingerida são esperadas. A normalidade da distribuição de média de

consumo diário de nicotina foi testada pelo teste Kolmogorov-Smirnov para uma amostra

(K-S). A fim de verificar se houve associações significativas entre a quantidade total de

nicotina ingerida e as variáveis comportamentais, foram calculados coeficientes de

correlação de Kendall’s (τ).

4. RESULTADOS

4.1. Efeitos da ingesta/peso, consumo de nicotina e peso corporal

Como indicado pela ANOVAr, ingesta/peso corporal aumentou durante o

experimento (DIA: F=90,6, df=14, P<0,0001; 1º ao 5º dia: 0,26 ± 0,004 ml/g; 6º ao 10º dia:

0,32 ± 0,003 ml/g; 11º ao 15º dia: 0,35 ± 0,003 ml/g); entretanto, este aumento não foi

dependente do tratamento (não houve interação DIA × TRATAMENTO). Foi detectado

efeito do TRATAMENTO (F=8,4, df=3, P<0,0001) e interação entre TRATAMENTO ×

SEXO (F=3,3, df=3, P<0,02) (Fig. 2). Após a separação por sexo (ANOVA de menor

ordem), o efeito do TRATAMENTO foi encontrado apenas para as fêmeas (F=8,5, df=3,

P<0,0001), com o seguinte ordenamento dos grupos: VEH>NIC=ETOH>NIC+ETOH. A

exposição à nicotina proporcionou uma redução significativa na ingesta/peso em relação ao

grupo VEH (P<0,004; FPLSD), provavelmente devido a um efeito aversivo ao gosto da

solução de nicotina específico para fêmeas. Uma redução semelhante (uma vez que

NIC=ETOH, P=0,43, FPLSD) também foi identificada para o grupo ETOH quando

comparado com o grupo VEH (P<0,02, FPLSD), indicando que as injeções de etanol

também afetam negativamente a ingesta de líquido. As fêmeas que sofreram dupla

exposição (NIC+ETOH), apresentaram uma redução significativa de ingesta/peso em

relação ao grupo NIC (P<0,04, FPLSD), ETOH (P<0,02) e VEH (P<0,0001, FPLSD),

refletindo efeito aditivo da nicotina e do etanol (ANOVA bidimensional não detectou

interação NICOTINA × ETANOL).

FÊMEAS

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

123456789101112131415

Dia

Ingesta/Peso

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

MACHOS

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

123456789101112131415

Dia

Ingesta/Peso

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

FÊMEAS

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

123456789101112131415

Dia

Ingesta/Peso

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

MACHOS

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

123456789101112131415

Dia

Ingesta/Peso

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Figura 2. A) Os valores de ingesta/peso das fêmeas diferiram entre os grupos experimentais. A exposição à nicotina

proporcionou uma redução significativa na ingesta/peso em relação ao grupo VEH. Redução semelhante foi identificada

para o grupo ETOH quando comparado com o grupo VEH . As fêmeas que sofreram dupla exposição (NIC+ETOH),

apresentaram uma redução significativa de ingesta/peso em relação ao grupo NIC, ETOH e VEH. B) Não houve

diferença significativa entre os valores de ingesta/peso dos machos dos 4 grupos experimentais.

Os dados de consumo de nicotina também indicaram um efeito do DIA (F=39,1,

df=14, P<0,0001) evidenciado por um aumento de consumo de nicotina ao longo do

experimento (1º ao 5º dia: 12,4 ± 0,2 mg/Kg, 6º ao 10º dia: 15 ± 0,2 mg/Kg, 11º ao 15º dia:

16,5 ± 0,2 mg/Kg). Foram encontradas interações de TRATAMENTO × SEXO (F=2,8,

df=1, P<0,1) e DIA × TRATAMENTO × SEXO (F=1,5, df=14, P<0,09). Após a separação

dos grupos por sexo, foi encontrado efeito de tratamento apenas para as fêmeas (F=4,9,

df=1, P<0,04), com redução no consumo de nicotina para o grupo NIC+ETOH quando

comparado com o grupo NIC restrito ao terceiro (P<0,04, FPLSD) e nono (P<0,03,

FPLSD) dia de exposição. Tal como esperado, o consumo de nicotina nos grupos NIC e

NIC+ETOH variaram de animal para animal. As distribuições dos dados de consumo

foram claramente normais em ambos os grupos (NIC K–S: Z=0.6, P>0.1; NIC + ETOH K–

S: Z=0.7, P>0.1). A análise dos coeficientes de correlação de Kendall indicaram que as

variações no total de nicotina consumida nos grupos NIC e NIC+ETOH não estavam

associadas a nenhuma das variáveis comportamentais (τ<0.1, P>0.1 em todos os casos).

Apesar das diferenças do efeito de TRATAMENTO e SEXO na ingesta/peso e no

consumo de nicotina, o ganho de peso (Fig. 3) não foi afetado pelo TRATAMENTO

(nenhuma interação foi observada).

FÊMEAS

12345678910111213141516

Dia

Peso (g)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

MACHOS

12345678910111213141516

Dia

Peso (g)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

FÊMEAS

12345678910111213141516

Dia

Peso (g)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

MACHOS

12345678910111213141516

Dia

Peso (g)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Figura 3. O ganho de peso não foi afetado pelo tratamento.

4.2. Análise global das medidas de ansiedade

Considerando os quatro tipos de tratamento em uma rANOVA unidimensional,

foram encontradas interações de TRATAMENTO × IDADE (F=3,6, df= 6, P<0,002),

TRATAMENTO × IDADE × SEXO (F=2,0, df=6, P<0,06), TRATAMENTO × MEDIDAS

DE ANSIEDADE

(F=2,0, df=9, P<0,04), TRATAMENTO × MEDIDAS DE ANSIEDADE ×

IDADE (F=3,3, df=18, P<0,0001), TRATAMENTO × MEDIDAS DE ANSIEDADE ×

IDADE × SEXO (F=2,1, df=18, P<0,007).

Considerando os tratamentos com NICOTINA e ETANOL como fatores separados

numa ANOVA bidimensional, foram encontradas interações que indicam efeitos seletivos:

ETANOL × IDADE (F=2,6, df=2, P<0,08), ETANOL × IDADE × SEXO (F=2,4, df=2,

P<,0,09), ETANOL × MEDIDAS DE ANSIEDADE × IDADE × SEXO (F=2,3, df=6,

P<0,04), NICOTINA × MEDIDAS DE ANSIEDADE (F=2,2, df=3, P<0,09), NICOTINA ×

MEDIDAS DE ANSIEDADE × IDADE × SEXO (F=2,0, df=6, P<0,07). Além disso, houve

interação entre os dois tratamentos (ETANOL × NICOTINA: F=3,9, df=1, P<0,05) e entre

os dois tratamentos e as medidas de ansiedade (ETANOL × NICOTINA × MEDIDAS DE

ANSIEDADE

: F=3,0, df=3, P<0,04). Dada a interação de cada tipo de tratamento com o

tipo de medida de ansiedade e com a idade, os dados foram re-analisados separando-os por

tipos de medidas e por idades. Foram encontradas interações do tratamento com o sexo,

dessa forma, este fator foi mantido na análise a fim de verificar se as interações

permaneciam detectáveis.

4.3. Efeitos de ansiedade

Em PN45 (Figs. 4 e 5), com a análise unidimensional, foram encontrados efeitos de

TRATAMENTO para o Tempo BA (F=3,3, df=3, P<0,03) e para o %Entradas BA (F=3,7,

df=3, P<0,02). A exposição ao etanol gerou um aumento do Tempo BA (P<0,02, FPLSD)

e do %Entradas BA (P<0,01,FPLSD) em relação ao grupo VEH, refletindo uma resposta

ansiolítica. Os animais que receberam dupla exposição, apresentaram redução nos valores

de Tempo BA (P<0,007, FPLSD) e no %Entradas BA (P<0,003, FPLSD) quando

comparados com o grupo ETOH. Houve também uma tendência de diminuição de Tempo

BA para grupo NIC+ETOH quando comparado com o grupo NIC (P=0,06, FPLSD). Na

análise bidimensional (tratamento com NICOTINA e ETANOL considerados como fatores

separados na ANOVA), foram encontradas interações NICOTINA × ETANOL para Tempo

BA (F=9,1, df=1, P<0,004), e % Entradas BA (F=8,9,df=1, P<0,004), indicando um efeito

menos que aditivo da NICOTINA e ETANOL. Os efeitos ansiolíticos do etanol foram

reduzidos pela co-exposição à nicotina. Não foram encontrados efeitos do SEXO ou

interações

TRATAMENTO × SEXO.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

***

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

***

Figura 4. PN45 A exposição ao etanol gerou um aumento de Tempo BA (A) em relação ao grupo VEH, refletindo uma

resposta ansiolítica. Os animais que receberam dupla exposição, apresentaram redução nos valores de Tempo BA

quando comparados com o grupo ETOH. * = P<0,05; ** = P<0,01.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas B

** **

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas B

** **

Figura 5. PN45 A exposição ao etanol gerou um aumento no %Entradas BA (B) em relação ao grupo VEH, refletindo

uma resposta ansiolítica. Os animais que receberam dupla exposição, apresentaram redução nos valores de %Entradas

BA quando comparados com o grupo ETOH. ** = P<0,01.

Para o total de Entradas BA+BF (Fig. 6), a ANOVA detectou efeito do

TRATAMENTO (F=4,3, df=3, P<0,008). De acordo com dados prévios (Saito et al, 2005;

Ulusu et al, 2005), a exposição apenas à nicotina gera um aumento da atividade motora

(NIC>VEH, P<0,02; NIC>ETOH, P<0,05; FPLSD). Todavia, o tratamento com etanol

reverteu o aumento da atividade motora gerado pela nicotina, como indicado pela diferença

significativa entre os valores dos grupos NIC e NIC+ETOH (NIC> NIC+ETOH, P<0,002;

FPLSD) e um efeito menos que aditivo da NICOTINA e ETANOL detectado pela interação

entre estes dois fatores na ANOVA bidimensional (F=3,4, df=1, P<0,06).

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA+BF

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA+BF

Figura 6. PN45 A exposição apenas à nicotina gerou um aumento da atividade motora. Todavia, o tratamento ao etanol

reverteu o aumento da atividade motora gerado pela nicotina como indicado pela diferença significativa entre os grupos

NIC e NIC+ETOH. * = P<0,05; ** = P<0,01.

Em PN50 (Figs. 7 e 8), considerando o TRATAMENTO como fator unidimensional

na ANOVA, foram encontradas interações de TRATAMENTO × SEXO para Tempo BA

(F=2,3, df=3, P<0,09) e %Tempo BA (F=2,5, df=3, P<0,07). Após a separação por sexo,

foi encontrado efeito de TRATAMENTO apenas para as fêmeas: Tempo BA (F=3,6, df=3,

P<0,03), %Tempo BA (F=4,2, df=3, P<0,02). As fêmeas que receberam nicotina (Tempo

BA: P<0,01, %Tempo BA: P<0,005; FPLSD), etanol (Tempo BA: P<0,02, %Tempo BA:

P<0,01; FPLSD) ou dupla exposição (Tempo BA: P<0,05, %Tempo BA: P<0,03; FPLSD),

apresentaram redução nos valores quando comparados com o grupo VEH evidenciando

uma resposta ansiogênica. Considerando o tratamento de NICOTINA e ETANOL como

fatores independentes na ANOVA bidimensional, as fêmeas apresentaram interação

NICOTINA × ETANOL para Tempo BA (F=5,0, df=1, P<0,03) e %Tempo BA (F=5,9,

df=1, P<0,02), indicando assim um efeito menos que aditivo da NICOTINA e ETANOL.

Não houve interações significativas em relação às medidas de atividade (Entradas BA+BF,

Fig. 9).

MACHOS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

FÊMEAS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

MACHOS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

FÊMEAS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

MACHOS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

FÊMEAS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

MACHOS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

FÊMEAS

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

Figura 7. PN50 Somente as fêmeas que receberam nicotina, etanol ou dupla exposição, apresentaram redução nos

valores de Tempo BA (A) e %Tempo BA (B) quando comparados com o grupo VEH, evidenciando uma resposta

ansiogênica. * = P<0,05; ** = P<0,01.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas B

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas B

Figura 8. PN50 Não houve diferenças significativas entre os grupos em relação às medidas Entradas BA e %Entradas

BA.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA+BF

Figura 9. PN50 Não houve diferenças significativas entre os grupos em relação às medidas Entradas BA+BF.

Em PN75, um mês após o término da exposição (Figs. 10 e 11), considerando o

TRATAMENTO como fator unidimensional, a ANOVA detectou efeito do TRATAMENTO

para todas as medidas de ansiedade: Tempo BA (F=3,2, df=3, P<0,03) e %Tempo BA

(F=3,0, df=3, P<0,04), Entradas BA (F=3,5, df=3, P<0,02) e %Entradas BA (F=2,8, df=3,

P<0,05). Os animais que sofreram dupla exposição apresentaram redução dos valores

quando comparados com os grupos VEH (Tempo BA: P<0,02; %Tempo BA: P<0,04;

Entradas BA e %Entradas BA: P<0,03; FPLSD), NIC (Tempo BA: P<0,02; %Tempo BA:

P<0,009; Entradas BA: P<0,003; %Entradas BA: P<0,02, FPLSD) e ETOH (Tempo BA: e

%Entradas BA: P<0,02; FPLSD), indicando desta forma, uma resposta ansiogênica em

conseqüência à dupla exposição.

Considerando os tratamentos com NICOTINA e ETANOL como fatores separados

(análise bidimensonal), foram identificadas interações entre estes fatores para Tempo BA

(F=2,8, df=1, P<0,1), Entradas BA (F=3,5, df=1, P<0,07), %Entradas BA (F=3,3, df=1,

P<0,08). A interação entre os dois tratamentos indica que o efeito da dupla exposição não

pode ser explicado estatisticamente pela soma dos efeitos individuais de ambos. Apesar de

não provocarem, quando utilizados isoladamente, alterações nas medidas de ansiedade, o

uso concomitante da nicotina e do álcool resulta em redução significativa no Tempo BA

(F=2,8, df=1, P<0,1), Entradas BA (F=3,5, df=1, P<0,07) e %Entradas BA: (F=2,9, df=1,

P<0,08) quando comparados aos resultados do grupo VEH, revelando um efeito sinergista

da nicotina e etanol. O efeito da dupla exposição no %Tempo BA foi indistinguível de um

simples efeito aditivo da dupla exposição à nicotina e ao etanol.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Tempo BA (s)

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Tempo BA

Figura 10. PN75 Os animais que sofreram dupla exposição apresentaram redução dos valores de Tempo BA quando

comparados com os grupos VEH, NIC e ETOH (A), e de %Tempo BA quando comparados com os grupos VEH e NIC

(B), indicando desta forma, uma resposta ansiogênica em conseqüência à dupla exposição. * = P<0,05; ** = P<0,01.

Para o total de entradas BA+BF (Fig. 12), a ANOVA detectou efeito do

TRATAMENTO (F=2,9, df=3, P<0,04). A exposição somente à nicotina provocou um

aumento na atividade locomotora quando comparado com o grupo NIC+ETOH (P<0,007;

FPLSD). Entretanto, não houve diferenças entre os outros grupos. A análise bidimensional

não indicou interação entre NICOTINA × ETANOL, corroborando o fato de que os efeitos

da dupla exposição foram indistinguíveis de um simples efeito aditivo da duas drogas.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

%Entradas BA

Figura 11. PN75 Os animais que sofreram dupla exposição apresentaram redução dos valores de Entrada BA quando

comparados com os grupos VEH e NIC (A), e de %Entradas BA quando comparados com os grupos VEH, NIC e ETOH

(B), indicando desta forma, uma resposta ansiogênica em conseqüência à dupla exposição. * = P<0,05; ** = P<0,01.

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA+BF

VEH NIC ETOH NIC+ETOH

Entradas BA+BF

Figura 12. PN75 A exposição somente à nicotina provocou um aumento da atividade locomotora quando comparado

com o grupo NIC+ETOH. Não houve diferença entre os outros grupos. ** = P<0,01.

5. DISCUSSÃO

O uso de álcool é freqüentemente acompanhado pelo uso de outras substâncias

psicoativas, principalmente o tabaco. Dados epidemiológicos mostram que os alcoolistas

têm maior incidência de fumantes (mais de 85%, a maior taxa entre qualquer subgrupo

populacional) e que alcoolistas que fumam consomem mais cigarros por dia do que não

fumantes (Collins, 1990; Collins et al., 1988, 1995, 1996; El Fakahany et al., 1983;

Yoshida et al., 1982). Adicionalmente, estudos mostram que o início do hábito de fumar e

beber ocorre freqüentemente durante a adolescência, período no qual alterações

neuroadaptativas, hormonais e comportamentais ocorrem (Lopez et al., 2001).

Considerando-se que o consumo de álcool e tabaco freqüentemente estão associados

(Hughes, 1995), é importante entender a relação entre nicotina e etanol. Neste trabalho,

proporcionamos evidências experimentais para interações funcionais entre nicotina e etanol

na regulação de respostas comportamentais, em especial comportamentos relacionados à

ansiedade em camundongos adolescentes.

5.1. Resumo dos resultados

Para os animais testados em PN45, o etanol mostrou uma resposta ansiolítica com

aumento de Tempo BA e %Entradas BA dos animais do grupo ETOH em relação ao grupo

controle. Os animais que sofreram dupla exposição NIC+ETOH, quando comparados com

os animais do grupo ETOH, apresentaram uma diminuição no Tempo BA e %Entrada BA,

mostrando que a dupla exposição nicotina+etanol reverteu o efeito ansiolítico do etanol.

Para os animais testados em PN50, as fêmeas expostas à nicotina, etanol e

nicotina+etanol, apresentaram uma diminuição de Tempo BA em relação ao grupo

controle, retratando um efeito ansiogênico tanto da nicotina quanto etanol durante o

período de retirada.

Para os animais testados em PN75, a dupla exposição NIC+ETOH gerou uma

diminuição de Tempo BA, %Tempo BA, Entradas BA e %Entradas BA, indicando uma

reposta ansiogênica. Entretanto, a exposição somente ao etanol, ou a nicotina, não gerou

alterações nas medidas de ansiedade.

5.2. Considerações metodológicas

5.2.1. Camundongos C57BL/6

Ratos e algumas cepas de camundongos demonstram aversão ao gosto da nicotina.

Além de ser uma das cepas mais usadas para estudos de efeitos comportamentais

relacionados à nicotina (Siu e Tyndale, 2007), a C57BL/6 foi escolhida por ser uma cepa

que consome nicotina na concentração utilizada neste estudo. A administração de nicotina

via oral tem demonstrado gerar respostas comportamentais (Adriani et al, 2002, 2004;

Gaddnas et al, 2001) e alterações neuroquímicas, incluindo a

upregulation dos receptores

nicotínicos (Nuutinen et al, 2005; Sparks e Pauly, 1999), alteração nos níveis e

metabolismo de monoaminas (Gaddnas et al, 2000; Tammimaki et al, 2006; Vihavainen et

al, 2006), assim como alterações na expressão de genes envolvidos na plasticidade

sináptica induzidas por drogas de abuso (Marttila et al, 2006), doença de Alzheimer

(Gutala et al, 2006) nesta e em outras cepas. Contudo, a cepa C57BL/6 é conhecida por

apresentar características particulares, como alto consumo voluntário de etanol (Belknap et

al., 1993; Crawley et al., 1997) o que deve ser levado em consideração em estudos que

envolvam a administração desta substância, mesmo que os mecanismos envolvidos nesta

característica específica da cepa não sejam bem conhecidos (Crabbe et al., 1999). Apesar

das peculiaridades desta cepa, foram observadas diferenças significativas entre os grupos

deste estudo. Estes resultados indicam que existem aspectos fundamentais da

neurobiologia destes animais que são afetados pelo tratamento, os quais devem ser melhor

avaliados em futuras investigações. Futuros estudos de bases biológicas de interações entre

álcool e nicotina são necessários e o uso de outras cepas e espécies podem provir dados

valiosos.

5.2.2. Labirinto em cruz elevado

Modelos animais de ansiedade são amplamente utilizados para pesquisas de drogas

ansiolíticas assim como mecanismos cerebrais envolvidos na ansiedade (Graeff et al.,

1998). Dentre os testes comportamentais para se quantificar os níveis de ansiedade em

animais experimentais, o labirinto em cruz elevado é um dos mais populares testes in vivo

em uso atualmente (Carobrez e Bertoglio, 2005). A popularidade do teste, com cerca de

2500 ou mais artigos publicados (Web of Science, 2005), se deve a numerosas vantagens: é

um teste econômico, rápido, além da simplicidade de desenho e sensibilidade bidirecional

a drogas (sensível a efeitos ansiolíticos ou ansiogênicos) e do fato de não requerer

procedimentos de teste muito cansativos, privação de comida/água ou uso de choques

elétricos (Pellow et al., 1985; Rodgers et al., 1997). O LCE foi validado em espécies como

ratos (Pellow et al., 1985) e camundongos (Lister, 1987), e mais recentemente espécies

como porquinhos da índia (Rex et al., 1994), cobaias (Hendrie et al., 1994) e hamsters

sírios (Yannielli et al., 1996). Os roedores de forma geral evitam as áreas abertas do

labirinto, as quais presume-se sejam as mais aversivas e mostram preferência pelas partes

fechadas e protegidas pelas paredes do aparelho.

As expressões comportamentais observadas no teste LCE representam uma

combinação de comportamentos exploratórios e de esquiva, assim como de atividade geral,

todos os quais influenciados por fatores genéticos e ambientais. Como conseqüência, os

resultados obtidos no LCE podem ser fortemente influenciados pelas condições e

procedimentos de teste utilizados, sendo essencial reconhecer e controlar essas variáveis

quando o LCE é utilizado para analisar a ansiedade em animais. (Carobrez e Bertoglio,

2005). A partir das vantagens da aplicabilidade do LCE e de sua validade como teste para

modelos de ansiedade animal, o LCE foi utilizado neste estudo como ferramenta para

medir níveis de ansiedade de camundongos expostos ao etanol e/ou nicotina durante a

adolescência.

5.2.3. Doses e vias de administração

Apesar da concentração da nicotina utilizada no presente estudo parecer alta, a

absorção de nicotina na cavidade bucal produz níveis plasmáticos de cotinina, metabólito

da nicotina, (Klein et al, 2003; Klein et al, 2004; Sparks e Pauly, 1999) comparáveis com

aqueles encontrados em fumantes adolescentes (Binnie et al, 2004; Caraballo et al, 2004;

Wood et al, 2004). Em relação ao etanol, de acordo com estudos prévios em roedores

adolescentes, mesmo doses moderadas como a utilizada neste estudo, resultam em níveis

sanguíneos bem acima dos limites permitidos para um indivíduo dirigir (Silveri e Spear,

2000). Estudos anteriores descrevem que os níveis plasmáticos de etanol estão reduzidos

em animais que recebem exposição simultânea de etanol e nicotina (Chen e Harle, 2005;

Gilbertson e Barron, 2005; Nowak et al, 1987; Scott et al, 1993). Desta forma, pode ser

sugerido que o efeito menos que aditivo da exposição combinada de nicotina e etanol

descrita no presente estudo pode ser conseqüência de uma redução nos níveis plasmáticos

de etanol. Entretanto, esta redução foi descrita apenas em animais que receberam etanol via

oral, o que sugere que esta redução está relacionada a um atraso no esvaziamento gástrico

induzido pela nicotina (Chen e Harle, 2005; Gilbertson e Barron, 2005; Nowak et al, 1987;

Scott et al, 1993), levando a um aumento de metabolização do etanol pela álcool

desidrogenase gástrica (Oneta et al, 1998). De fato, outros estudos indicam que a nicotina

cronicamente utilizada não altera a concentração de etanol se este for administrado de

modo intravenoso (Hisaoka e Levy, 1985). Não podemos excluir a ocorrência de interações

metabólicas entre nicotina e etanol; contudo, uma vez que neste trabalho foram utilizadas

injeções intraperitoneais de etanol, é pouco provável que apenas interações metabólicas

possam explicar os dados obtidos. Adicionalmente, evidências que interações entre

nicotina e etanol não têm origem farmacocinéticas provêm de estudos que mostram que a

nicotina não influencia na taxa de eliminação do etanol e vice versa (Collins et al, 1988).

5.2.4. Efeito do consumo de nicotina e da ingesta/peso

A exposição à nicotina e a etanol causou uma redução de ingesta/peso apenas em

fêmeas. Além disso, a redução observada no grupo NIC+ETOH refletiu efeitos aditivos, o

que indica que as fêmeas do grupo NIC+ETOH receberam um pouco menos de nicotina

que as fêmeas do grupo NIC. Apesar de não podermos excluir a possibilidade que

diferenças no consumo de nicotina entre grupos possam influenciar os resultados, apenas

para as medidas de Tempo BA e %Tempo BA na idade de PN50, os resultados dos machos

diferiram das fêmeas, como indicaram as interações TRATAMENTO×SEXO. Entretanto,

para ambas as variáveis, nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos NIC e

NIC+ETOH em relação a ambos os sexos. A ausência de efeito de sexo ou interações para

todas as outras medidas de ansiedade, a presença de efeitos sinergistas da exposição

combinada em PN75, a ausência na diferença de peso corporal e ausência de associação

entre as variações nas quantidades de nicotina ingerida e variáveis comportamentais,

indicam que as alterações nos níveis de ansiedade descritos neste trabalho não podem ser

explicadas pelas diferenças na ingesta/peso e/ou consumo de nicotina entre os grupos.

5.2.5. Efeitos da nicotina na atividade locomotora

Os resultados deste trabalho estão de acordo com estudos prévios que mostram que

camundongos são sensíveis aos efeitos de ativação locomotora da nicotina (Saito et al,

2005; Ulusu et al, 2005). Como a alteração na atividade poderia influenciar as medidas de

ansiedade, além do número absoluto de entradas nos braços abertos, foi calculado o

percentual de entradas nos braços abertos. Toda vez que eram encontradas alterações

significativas no valor absoluto de entradas nos braços abertos, também foram encontradas

alterações similares no percentual de entradas nos braços abertos, logo, mudanças nas

medidas de ansiedade, não refletem mudanças na atividade locomotora.

5.3. Efeitos ansiolíticos durante a exposição na adolescência

Os efeitos ansiolíticos do etanol têm sido amplamente descritos (Bilkei-Gorzo et al.,

1998; Colombo et al., 1995; Ferreira et al., 2000; Gallate et al., 2003; Hall et al., 1998;

Martijena et al., 2001; Martin-Garcia e Palares, 2005; Varlinskaya e Spear, 2002). De fato,

apesar de estudos anteriores sugerirem que adolescentes são menos sensíveis que adultos

aos efeitos ansiolíticos do etanol (Varlinskaya e Spear, 2002), recente estudo (Hefner e

Holmes, 2007) indica que camundongos adolescentes C57BL/6J exibem um aumento de

sensibilidade aos efeitos ansiolíticos do etanol quando comparados com adultos. Nossos

resultados indicam que o etanol reduz ansiedade durante a adolescência, reforçando a

hipótese que a ansiedade pode ser um fator crítico na etiologia no consumo de álcool

(Colobo et al., 1995). Adicionalmente, nossos resultados indicam que o período de

suscetibilidade inclui a adolescência, período no qual o uso de álcool normalmente

começa.

A nicotina tem sido descrita como ansiogênica ou ansiolítica (Adriani et al., 2004;

Brioni et al., 1993; Cheeta et al., 2001; Elliot et al., 2004; Marco et al., 2006; Ouagazzal et

al., 1999; Slawecki et al., 2003). Contudo, um estudo recente descreve que a nicotina

durante a adolescência não altera o estado de ansiedade em ratos (Marco et al., 2006).

Nossos resultados corroboram este estudo, uma vez que apesar de termos achado uma

tendência de aumento da ansiedade devido à exposição à nicotina durante a adolescência,

esta não alcançou significância estatística.

Adicionalmente, nossos resultados indicam que os efeitos ansiolíticos do etanol

foram reduzidos pela co-exposição à nicotina durante a adolescência. Tendo em vista

estudos prévios, nos quais as interações entre etanol e nicotina encontradas em roedores

adultos sugerem efeitos ansiolíticos aditivos ou sinergistas (dependendo do genótipo) (Cao

et al., 1993), assim como a falta de evidências de efeitos interativos de nicotina e etanol

durante a segunda semana de vida pós-natal (Gilbertson e Barron, 2005), os resultados

deste trabalho evidenciam a adolescência como período crítico de interações entre nicotina

e etanol, com efeitos únicos quando comparados com períodos como idade adulta e pré-

puberdade. Mais especificamente, a exposição à nicotina durante a adolescência parece

reverter os efeitos ansiolíticos do consumo de etanol. Tendo em vista nossos resultados,

sugerimos que adolescentes que co-abusam tabaco e etanol, consomem mais etanol a fim

de atingir níveis desejáveis no alívio da ansiedade. Neste sentido, estudos experimentais

com roedores têm demonstrado que a nicotina aumenta a auto-administração de etanol e

que essa resposta é suprimida pela mecamilamina (Le et al., 2000), um antagonista do

receptor, o que evidencia o envolvimento dos receptores nicotínicos na modulação do

consumo de etanol.

5.4. Efeito ansiogênico durante o período de retirada

Ansiedade é reconhecida como sintoma de retirada do tabaco (Hughes et al., 2000;

Hughes, 2007; Parrot, 2003). Neste sentido, o fato dos machos não apresentarem este

sintoma durante os cinco dias de retirada em relação à exposição à nicotina, foi algo

surpreendente. Em relação à nicotina, alterações comportamentais em machos eram

esperadas, visto que foi demonstrado anteriormente que eles demonstram modificações

mais persistentes nos sistemas colinérgicos, alvo primário da nicotina, após a exposição

durante a adolescência (Trauth et al., 1999; 2000a). Inversamente, nossos resultados

mostram que os níveis de ansiedade em fêmeas são claramente afetados durante um curto

período de retirada, de acordo com dados prévios encontrados em ratos expostos a esta

droga durante a adolescência (Trauth et al., 2000b). Além disso, estudos prospectivos com

fumantes sugerem que o aumento da ansiedade é um fator determinante de recaídas durante

tentativas de abandonar o vício somente para mulheres adolescentes (Dudas et al., 2005).

Em relação ao etanol, é bem estabelecido que o processo de retirada gera resposta

ansiogênica (File et al., 1993; Kliethermes, 2005). Entretanto, apesar do fato dos

adolescentes poderem ser hiposensíveis a manifestações ansiogênicas durante o período de

retirada, estes resultados não foram dependentes do sexo (Doremus et al., 2003;

Varlinskaya e Spear, 2004), o que está em contraste com nossos resultados, os quais

demonstram que os níveis de ansiedade estão aumentados apenas nas fêmeas. Em vista das

diferenças de sexo descritas acima, nossos resultados sugerem que fêmeas adolescentes são

mais suscetíveis às alterações nos níveis de ansiedade induzidas pela nicotina e etanol.

aumento de ansiedade (Slawecki, 2004) quanto hiposensibilidade aos efeitos de longo

prazo do etanol (Spear e Varlinskaya, 2005) devido a exposição durante a adolescência. A

ausência de efeitos de ansiedade um mês após exposição ao etanol suportam estes últimos

achados e estão de acordo com o fato de adolescentes diferirem comportamentalmente de

animais mais velhos (Spear, 2002).

A dupla exposição nicotina+etanol causou uma resposta ansiogênica um mês após a

exposição, revelando um efeito sinergista da nicotina e do etanol. De fato, ao que tudo

indica, os resultados deste trabalho constituem a primeira evidência experimental que o co-

abuso não tem um simples efeito aditivo nos níveis de ansiedade após um longo período de

retirada. Se um efeito similar ocorre após adolescentes co-abusarem nicotina e etanol,

sugerimos que o efeito sinergista pode facilitar recaída ao uso de drogas durante um

período de retirada de álcool e tabaco.

5.5. Neurobiologia das interações nicotina × etanol

O desenvolvimento do cérebro continua durante a adolescência sendo caracterizado

por uma contínua maturação dos sistemas neurais as quais abrangem neuroproliferação,

apoptose e severa perda de conexões sinápticas (Altman e Bayer, 1990; Bayer et al., 1982;

Bayer et al., 1983; Huttenlocher, 1990; McWilliams e Lynch, 1983; Rakic et al., 1994).

Mais especificamente, a maturação dos sistemas colinérgicos envolvidos em aprendizado,

memória e respostas a psicoestimulantes, é consolidada durante o período periadolescente

(Matthews et al., 1974; Nadler et al., 1974; Zahalka et al., 1993) e um aspecto importante

deste período é que a estimulação neural induz o rearranjo sináptico (Scheetz e

Constantine-Paton, 1994), o que indica que o cérebro adolescente é vulnerável a

substâncias estimulantes do sistema nervoso central. Sendo um análogo da acetilcolina, os

receptores nicotínicos colinérgicos são os primeiros mediadores celulares dos efeitos da

nicotina (Abreu-Villaça et al., 2003; 2004b). Em relação ao etanol, este influencia

diretamente a função de vários canais ionotrópicos, incluindo os receptores nicotínicos

(Grant, 1994). Desta forma, os receptores nicotínicos são um sítio de ação no qual nicotina

e etanol podem interagir. Corroborando estes dados, tem sido demonstrado que o etanol

aumenta o fluxo de íons induzido por agonistas através dos receptores nicotínicos (Aistrup

et al., 1999; Cardoso et al., 1999) e que a estimulação do sistema mesolímbico

dopamínérgico induzida pelo etanol envolve a ativação dos receptores nicotínicos

(Soderpalm et al., 2000). Apesar destes achados, existem relativamente poucos estudos

animais de neurobiologia básica de exposição combinada à nicotina e etanol e, enquanto

alguns estudos sugerem que a nicotina tem um efeito modulador nos efeitos do etanol

através de ações colinérgicas, outros mostram ausência de interações e alguns trabalhos

demonstram aumento de efeito (Bachtell e Ryabinin, 2001; Penland et al., 2001; Tizabi et

al., 2002; Tizabi et al., 2003). Desta forma, novos trabalhos devem ser realizados para

testar o papel dos sistemas colinérgicos nas alterações nos níveis de ansiedade associadas

com a exposição à nicotina e ao etanol durante a adolescência. Adicionalmente, evidências

neuroquímicas suportam a idéia de que outros substratos neurobiológicos também podem

estar envolvidos nos efeitos de ansiedade relacionados à exposição ao etanol e nicotina

durante a adolescência. Em relação a estes dados, ambos, nicotina e etanol (Cousins et al.,

2002; Grant, 1994; Slotkin, 2002; Valenzuela, 1997) interferem com os sistemas

GABAérgicos e serotoninérgicos, e ambos os sistemas apresentam evidências de mediar

parcialmente os efeitos de ansiedade (Cryan e Kaupmann, 2005; Lowry et al., 2005).

As regiões cerebrais afetadas durante a adolescência pela exposição à nicotina

(Abreu-Villaça et al, 2003; Slawecki e Ehlers, 2002; Trauth et al, 2000a) e etanol (Pascual

et al, 2007; White e Swartzwelder, 2004), incluem córtex e hipocampo. De fato, diversos

estudos têm demonstrado que os sistemas serotoninérgicos e dopaminérgicos do

hipocampo e córtex medeiam efeitos de ansiedade em modelos animais (Menard and Treit,

1999; Rex et al., 1997; Serra et al., 1999), os quais sugerem que alterações nessas regiões

cerebrais podem contribuir para alterações comportamentais observadas no presente

estudo. É importante notar a grande quantidade de evidências relacionadas à ação do fator

de liberação de corticotropina (CRF) na amígdala em respostas relacionadas à ansiedade.

De fato, o aumento de liberação de (CRF) na amígdala representa um mecanismo

envolvido nas respostas ansiogênicas e aversivas do período de retirada (Menard e Treit,

1999; Merali et al., 1998; Wiersma et al., 1995) comum a drogas de abuso como a nicotina

(Slawecki et al., 2005) e etanol (Merlo Pich et al, 1995; Rivier, 1996).

O fato da nicotina e etanol afetarem sistemas de neurotransmissores similares,

determina a possibilidade de interações menos que aditivas ou sinergistas entre os dois

tratamentos e, de fato, ambos os tipos de interações foram observadas no presente trabalho.

De forma geral, durante a exposição, o tratamento combinado induziu efeitos menos que

aditivos. O efeito ansiolítico do etanol foi reduzido pela co-exposição com a nicotina.

Durante a retirada, inicialmente, a exposição combinada induziu aumento nos níveis de

ansiedade, os quais refletiram efeitos menos que aditivos; entretanto, um mês após

exposição, o resultado ansiogênico refletiu principalmente efeitos sinergistas de nicotina e

etanol.

6. CONCLUSÕES

O consumo de nicotina e etanol entre humanos adolescentes é um severo problema

de saúde pública. Os efeitos deste consumo podem ser detectáveis ainda na idade adulta.

Desta forma, é importante caracterizar alterações comportamentais compartilhadas por

estas duas drogas a fim de compreendermos os mecanismos envolvidos na co-

administração de nicotina e etanol. Os resultados deste trabalho mostram que o etanol é

ansiolítico na adolescência de camundongos e que a nicotina reverte este efeito. Desta

forma, é possível que, em contraste com alguns estudos prévios (Cao et al, 1993; deFiebre

and Collins, 1992), em nosso modelo experimental, a associação entre o consumo de

nicotina e etanol não possa ser explicada por efeitos acumulativos de ansiedade. Pode ser

interessante estudar em adolescentes humanos, os quais podem ajustar o consumo de

acordo com sua vontade, se a redução do efeito ansiolítico do etanol causado pela co-

exposição ao tabaco gera um maior consumo de etanol.

Adicionalmente, apesar de nem os efeitos da nicotina nem do etanol persistirem após

um mês da exposição, os dados deste trabalho fornecem evidências que adolescentes que

consomem nicotina e etanol juntamente, tornam-se adultos ansiosos num longo período de

abstinência destas drogas. Ansiedade é um fator crítico para o uso uma vez que atua como

uma força que motiva a continuidade do consumo (Colombo et al., 1995; Gilbert et al.,

1989; Picciotto et al., 2002; Pomerleau, 1986). Desta forma, nossos resultados indicam que

nicotina e etanol interagem durante a adolescência alterando os níveis de ansiedade mesmo

na idade adulta. Se um efeito similar ocorrer após o co-abuso de tabaco e etanol em

adolescentes humanos, isto pode facilitar recaídas ao uso de drogas após longos períodos

de retirada de álcool e tabaco.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXO

Artigo:

YAEL ABREU-VILLAÇA, FERNANDA NUNES, FABÍOLA DO E. QUEIROZ-

GOMES, ALEX C. MANHÃES, CLÁUDIO C. FILGUEIRAS.

Combined Exposure to Nicotine and Ethanol in Adolescent Mice Differentially

Affects Anxiety Levels during Exposure, Short Term and Long Term Withdrawal.

Neuropsychopharmacology, aceito para publicação, 2007.

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