( PDF ) Atenuação do processo de lignificação em células de Eucalyptus urophylla S. T. Blake, em suspensão, por 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético)

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UFRRJ

INSTITUTO DE FLORESTAS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS E

FLORESTAIS

DISSERTAÇÃO

Atenuação do processo de lignificação em células de Eucalyptus

urophylla S. T. Blake, em suspensão, por 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético).

Kelly Carla Almeida de Souza

2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE FLORESTAS

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS E

FLORESTAIS

ATENUAÇÃO DO PROCESSO DE LIGNIFICAÇÃO EM CÉLULAS DE

EUCALYPTUS UROPHYLLA S. T. BLAKE, EM SUSPENSÃO, POR 2,4-D

(ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO)

KELLY CARLA ALMEIDA DE SOUZA

Sob a Orientação do Professor

Heber dos Santos Abreu

Dissertação submetida como

requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre em Ciências, no

Curso de Pós-Graduação em

Ciências Ambientais e Florestais,

Área de Concentração em

Tecnologia e Utilização de

Produtos Florestais.

Seropédica, RJ

Fevereiro de 2007

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A Deus, simplesmente por tudo

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Aos meus pais Wilson e Janice,

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OFEREÇO

Ao meu amor Marcio,

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pelo companheirismo de sempre

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DEDICO

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, ao Programa de Pós-graduação em

Ciências Ambientais e Florestais e a Capes;

Ao Prof. Dr. Heber pela orientação, pela oportunidade de desenvolver esse projeto e por

todo apoio;

Aos amigos Hulda, Deise, Regina, Beatriz, Bruno, Mariana e Ana Luiza pela amizade e

pelo grande trabalho em equipe que desenvolvemos no laboratório (LBM);

As minhas grandes amigas Natália, Mariza e Vanessa pelo grande incentivo;

Ao técnico de laboratório Daniel Chalita pela ajuda prestada nas análises;

Ao secretário do DPF, Mendes, pelos inúmeros favores prestados;

A Prof. Dra. Maria Raquel Figueiredo do Laboratório de Produtos Naturais-

Farmanguinhos -FIOCRUZ por permitir a realização da análise no infravermelho

Aos técnicos Alan (FIOCRUZ) e Carlão (PQ-UFRRJ) pela ajuda na análise no

infravermelho;

Ao técnico Eli do Departamento de Química (UFRRJ) pelo apoio;

Ao Prof. Maeda do Departamento de Silvicultura (UFRRJ) pela grande ajuda nas

análises estatísticas;

Ao técnico de laboratório José Carlos pela ajuda;

A todos os professores, alunos e funcionários do Instituto de Florestas que, de alguma

forma, colaboraram para a realização deste trabalho.

OBRIGADA!

RESUMO

SOUZA, Kelly Carla Almeida de. Atenuação do processo de lignificação em células

de Eucalyptus urophylla S. T. Blake, em suspensão, por 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético). 2007. 51p. Dissertação. (Mestrado em Ciências Ambientais e

Florestais). Instituto de Florestas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,

Seropédica, RJ.

A cultura de células em suspensão é uma técnica muito eficiente para o estudo de

metabólitos secundários. Através da utilização do 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético), regulador de crescimento com habilidade de reprimir o

metabolismo dos fenilpropanóides, foi realizado um processo de lignificação de células

em suspensão de Eucalyptus urophylla a fim de identificar a concentração de 2,4-D

mais eficiente para atenuar a produção de lignina in vitro. Este trabalho foi

desenvolvido no laboratório de Biotecnologia da Madeira (IF-UFRRJ) onde calos de

Eucalyptus urophylla foram produzidos e transferidos para o meio MS líquido

suplementado com cinco diferentes tratamentos de 2,4-D (T1: 1 mg/L; T2: 2 mg/L; T3:

4 mg/L; T4: 5 mg/L; T5: 0 mg/L) sem agentes antioxidantes. Por análises no

infravermelho e no ultravioleta comprovou-se que em meio MS líquido as células foram

capazes de produzir lignina. O tratamento 2 com 2 mg/L de 2,4-D foi o mais adequado

para produzir quantidades menores de lignina, ao contrário do tratamento 5 com 0 mg/L

de 2,4-D, no qual a ausência deste fitorregulador não reprimiu a produção de lignina.

Esta pesquisa abre portas para o estudo da lignina de Eucalyptus urophylla permitindo

conhecer melhor o processo de formação desta substância de grande complexidade e de

grande importância na área florestal.

Palavras chave: calo, lignina, suspensão celular

ABSTRACT

SOUZA, Kelly Carla Almeida de. Attenuating of lignification process in Eucalyptus

urophylla S.T. Blake, in suspension, by 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid).

2007. 51p. Dissertation (Master in Environment and Forest Science). Instituto de

Florestas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ.

The suspension cell culture is an efficient tecnique to the study of secondary metabolics.

Through the utilization of 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid), growth regulator

with ability to restrain the phenylpropanoid metabolism, was carried a process of

lignification of suspension cells of Eucalyptus urophylla in order to identify the most

efficient 2,4-D concentration to attenuate the lignin production in vitro. This work was

developed in the Wood Biotechnology Laboratory (IF-UFRRJ) where callus of

Eucalyptus urophylla were produced and transfered to the medium supplemented liquid

MS with five different treatments of 2,4-D (T1: 1 mg/L; T2: 2 mg/L; T3: 4 mg/L; T4: 5

mg/L; T5: 0 mg/L) without antioxidants agents. Infrared and ultraviolet analyses proved

that, in medium liquid MS, the cells were capable to produce lignin. The treatment 2

with 2 mg/L of 2,4-D was better to produce little amounts of lignin than treatment 5

with 0 mg/L of 2,4-D, in which the absence of this growth regulator did not restrain the

lignin production. This research opens new ways for the study of the Eucalyptus

urophylla lignin allowing a better knowledge of the formation process of this substance,

which has a great complexity and importance in the forest area.

Key words: callus, cell suspension, lignin

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1- Estruturas moleculares dos precursores majoritários ---------------- 4

da lignina

Figura 2- Caminho proposto para a biossíntese da lignina ----------------------5

Figura 3- Estrutura molecular do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)-----8

Figura 4- Perfil estrutural do desenvolvimento de mudas ----------------------16

de Eucalyptus urophylla no meio MS

Figura 5- Cultura de calo: (A) Escolha do explante; (B e C) Corte do--------17

explante; (D) Inoculação do explante no meio pra calo;

(E) Calo formado de Eucalyptus urophylla

Figura 6- Preparação da amostra para análise no -------------------------------21

no infravermelho: (A) 2 mg da amostra;

(B) Os 5 tratamentos; (C) 200 mg de KBr; (D e E)

A amostra sendo macerada com KBr; (F) Os tratamentos

prontos para análise no infravermelho

Figura 7- Ilustração das amostras de lignina padrão de Björkman ------------23

para a curva de calibração (as cores azuis são ilustrações

para melhor identificar que à medida que a concentração

diminui a cor fica mais clara)

Figura 8- Curva de Calibração de lignina padrão ------------------------------- 23

(Gallesia gorazema) de Björkman

Figura 9- Calo do Eucalyptus urophylla - foto tirada ---------------------------25

no Laboratório de Anatomia da Madeira

através de uma lupa binocular modelo STEMI

2000C w10x/21 455042, obtido a partir de explante

foliar, após 90 dias de inoculação no meio de cultura.

Figura 10- Espectro no infravermelho de calos oriundos do -------------------27

tratamento 1 da suspensão (1 mg/L de 2,4-D).

Figura 11- Espectro no infravermelho de calos oriundos -----------------------27

do tratamento 2 da suspensão (2 mg/L de 2,4-D)

Figura 12- Espectro no infravermelho de calos oriundos do -------------------28

tratamento 4 da suspensão (5 mg/L de 2,4-D)

Figura 13- Espectro no infravermelho de calos oriundos do -------------------28

tratamento 5 da suspensão (0 mg/L de 2,4-D)

Figura 14- Diferença de coloração entre os tratamentos da --------------------32

suspensão de Eucalyptus urophylla após o método

de BRUCE & WEST (1989)

Figura 15- Soluções preparadas com lignina padrão de ------------------------32

Gallesia gorazema (Björkman): curva de calibração

Figura 16- Espectro em ultravioleta de lignina padrão -------------------------33

de Gallesia gorazema (Björkman) na concentração

de 150 mg/L

Figura 17- Espectros dos cinco tratamentos com diferentes ------------------ 34

concentrações de 2,4-D na suspensão celular

Figura 18- Espectro das repetições de cada tratamento ------------------------ 35

Figura 19- Gráfico de tratamentos e suas respectivas -------------------------- 39

concentrações de lignina

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1- Meio MS modificado para germinação de Eucalyptus---------------16

urophylla (WATTet al., 1991)

Tabela 2- Meio MS utilizado para indução de calos ----------------------------18

de Eucalyptus urophylla (WATT et al., 1991)

Tabela 3- Meio MS modificado para formação de células em -----------------19

suspensão de Eucalyptus grandis (WATT et al., 1991)

Tabela 4- Diferentes tratamentos variando as concentrações ------------------19

de 2,4-D

Tabela 5- Pontos característicos de lignina em cada tratamento -------------29

Tabela 6- Atribuição dos principais sinais de absorção no ------------------- 30

infravermelho de lignina

Tabela 7- Regiões características de grupamentos metoxilas ------------------31

no infravermelho

Tabela 8- Valores de absorbância de cada tratamento a 280 nm ------------ 33

Tabela 9- Concentração de lignina em cada tratamento ------------------------37

Tabela 10- Quadro da Análise de Variância ------------------------------------ 38

Tabela 11- Teste de médias (Tukey) -------------------------------------------- 38

SUMÁRIO

Página

1 INTRODUÇÃO ------------------------------------------------------------ 1

2 REVISÃO DE LITERATURA ------------------------------------------- 3

2.1 Lignina ------------------------------------------------------------------- 3

2.2 Biossíntese das ligninas ------------------------------------------------- 4

2.3 Fitorreguladores em meio de cultura ---------------------------------- 7

2.4 Calogênese e células em suspensão----------------------------------- 10

2.5 Lignificação e células em suspensão -------------------------------- 13

3 MATERIAL E MÉTODOS --------------------------------------------- 15

3.1 Assepsia ------------------------------------------------------------------ 15

3.2 Inoculação das sementes ----------------------------------------------- 15

3.3 Cultura de calos --------------------------------------------------------- 16

3.4 Células em suspensão --------------------------------------------------- 18

3.5 Determinação de lignina ------------------------------------------------ 19

3.5.1 Teste de Wiesner ------------------------------------------------------ 19

3.5.2 Infravermelho ---------------------------------------------------------- 20

3.5.3 Ultravioleta------------------------------------------------------------- 21

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ---------------------------------------- 24

4.1 Calogênese e suspensão celular ---------------------------------------- 24

4.2 Análise no infravermelho--------------------------------------------- 26

4.3 Análise no ultravioleta------------ ----------------------------------- 31

5 CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------- 40

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------ 41

1 INTRODUÇÃO

A lignina é definida como um grupo de substâncias que apresenta função

relevante no Reino Vegetal, conferindo resistência às plantas por atuarem como agente

cimentante, de condução, de defesa, como barreira física e química contra fatores

bióticos e abióticos. Sua existência foi imprescindível na adaptação das plantas, há

milhares de anos atrás, no período que as espécies aquáticas passaram para o ambiente

terrestre (STUMPF & CONN, 1981). A lignina desenvolveu formas de suporte para as

plantas se erguerem em direção oposta à gravidade. À medida que as plantas foram

evoluindo, a composição da lignina foi modificando-se e tornando-se menos complexa

sob o ponto de vista estrutural, apresentando uma estrutura mais linear, como é o caso

das ligninas de angiospermas (ABREU et al., 1999).

O estudo do processo de atenuação do processo de lignificação em células em

suspensão de Eucalyptus urophylla visa o melhor entendimento da biossíntese da

lignina, ou seja, a formação desta substância.

O Eucalyptus urophylla é uma espécie tropical originária da Indonésia, onde

ocorre naturalmente, apresenta porte elevado, forte dominância apical; a casca pode ser

parcialmente rugosa a espessa fibrosa, de coloração marrom quando seca e quase negra

quando úmida. As folhas das plantas adultas são alongadas, estreitas e pecioladas, sendo

introduzida no Brasil por Edmundo Navarro de Andrade (PIGATO & LOPES, 2001).

Os frutos podem apresentar dois tipos de formas: campanulada ou hemisférica em

altitudes superiores a 1000 m; cônico em altitudes inferiores a 1000 m (MARTIN &

COSSALTER, 1976). É uma espécie que apresenta reprodução cruzada.

Atualmente várias aplicações de técnicas de biotecnologia celular de plantas têm

sido utilizadas, a começar pela clonagem seguida pela cultura de células, a qual inclui

suspensões celulares em meio líquido. A suspensão celular apresenta grande

importância para a produção de metabólitos especiais entre outros, como é o caso da

lignina, a qual pode ser produzida em meio líquido através da liberação de monolignóis

e peroxidase.

A cultura de células em suspensão fornece excelentes informações para o estudo

do metabolismo secundário; simples alterações no meio de cultura freqüentemente

resultam em expressões de uma via metabólica específica. Uma dessas informações é a

via dos fenilpropanoídes, que participa da formação de várias substâncias como

flavonóides e lignina.

O metabolismo dos fenilpropanoídes tem sido bem estudado através de cultura

de células em suspensão de soja (Glicine max L.) por HAHLBROCK et al., (1980).

HOSEL et al., (1982) foram capazes de induzir a lignificação nas células desta espécie

por modificação na concentração de reguladores de crescimento no meio de cultura. O

mesmo ocorreu em pinus (Pinus taeda), na qual foi realizado um estudo da lignificação

através da técnica de cultura de células em suspensão variando a concentração do

fitorregulador 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) (EBERHARDT et al., 1993).

A cultura de células desenvolveu papel semelhante quanto à indução da

lignificação em células de pinus (Pinus radiata) (MOLLER et al., 2006). Em

Arabidopsis L. a técnica de suspensão celular foi eficiente para o estudo da biossíntese

de um outro produto do metabolismo secundário, o ascorbato, um derivado do ácido

ascórbico (DAVEY et al., 1999).

Outras pesquisas sobre culturas de células foram realizadas com espécies de

gimnospermas e angiospermas, nas quais a lignificação foi aparentemente induzida por

várias maneiras, inclusive com mudanças nos reguladores de crescimento, tipo de meio

de cultura e ativação por fungos (NIMZ et al., 1975; RAMSDEN & NORTHCOTE,

1987; ROBERT et al., 1989; CAMPBELL & ELLIS, 1992).

A biotecnologia tem por finalidade subsidiar vários tipos de trabalhos. A técnica

de cultura de tecidos permite avaliar os efeitos fisiológicos dos nutrientes, dos

reguladores de crescimento e de outros constituintes químicos pertinentes ao processo

de formação dos precursores e da formação da lignina.

Os artigos relacionados à cultura de células em suspensão são realizados

mediante a utilização de vários protocolos. Um dos meios mais utilizados para tal é o

meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), que tem mostrado bons resultados nos

trabalhos com culturas de Eucalyptus (TORRES & CALDAS, 1990). Por sua vez a

utilização do meio LD (LAINÉ & DAVID, 1994) tem mostrado eficiente produção de

calos, conjunto de células de crescimento desordenado, na espécie Eucalyptus

urophylla.

No meio de cultura utilizado é imprescindível que haja um balanço entre os

reguladores de crescimento, ou seja, uma combinação eficiente entre auxinas e

citocininas. No entanto, esta combinação também depende da espécie, do tipo e da idade

do tecido utilizado na cultura. Ao utilizar explantes de plantas adultas, as respostas a um

regulador de crescimento são diferentes em relação ao tecido jovem. Os explantes

foliares de Eucalyptus urophylla, ao serem submetidos a fitorreguladores, respondem de

forma considerável através da produção de calos.

A formação de calos tem sido obtida de forma considerável através do uso do

regulador de crescimento 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), uma auxina sintética

que auxilia no desenvolvimento do calo.

Uma das dificuldades em estudar os processos que acompanham a lignificação

em plantas lenhosas é que as células diferem muito entre si no desenvolvimento da

parede (como a composição do polímero, espessura, entre outros).

A lignificação é um processo que tem sido muito estudado em calos e em células

em suspensão, sendo induzida por balanço hormonal, atividades enzimáticas, utilização

de fungos como agentes ativadores desse processo, para os mais variados fins

(MOLLER et al., 2006). Um dos aspectos mais relevantes no estudo da lignificação é o

entendimento de como esse processo se inicia permitindo obter informações sobre o

tipo de lignina formada em cada espécie.

Os objetivos do trabalho foram: (1) desenvolver um protocolo para o estudo do

processo de lignificação em células de Eucalyptus urophylla em suspensão; (2)

identificar e quantificar a lignina através de análises no infravermelho e no ultravioleta;

(3) verificar a concentração mais adequada de 2,4-D para evitar ou diminuir a

ocorrência do processo de lignificação em cultura de células em suspensão da espécie

em questão, fazendo uso das técnicas que a biotecnologia oferece.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Lignina

Lignina é uma denominação para macromolécula de origem fenilpropanoídica

de unidade constitucional básica (C

)

distribuída amplamente

entre os vegetais

superiores (LEWIS & SARKANEN, 1998), com propriedades caracterizadas pela ação

cimentadora da parede celular, considerada depois da celulose, como o polímero natural

renovável que detém cerca de 30% dos carbonos da biosfera (FENFEL & WEGENER,

1984).

A lignificação é um processo que começa na parede primária e na lamela média

se estendendo através da parede secundária em direção ao lúmen (DONALDSON,

2001).

O fenômeno da lignificação também é uma resposta ativa das plantas a invasão

por patógenos (HAMMERSCHIMDT & KUC, 1982; BUSAM et al., 1997-b; STICHER

et al., 1997) e acumulam-se evidências de que se constitui em importante mecanismo de

defesa (VANCE et al., 1980; HAMMERSCHIMDT & KUC, 1982; AGRIOS, 1997;

BUSAM et al., 1997-a; STICHER et al., 1997).

A lignina é formada pela oxidação desidrogenativa dos álcoois p-cumarílico,

coniferílico e sinapílico (Figura 1) (BOUDET et al., 1995; WHETTEN et al., 1998).

A fase final da biossíntese da lignina é denominada desidrogenação enzimática

de precursores monolignóis, gerando os radicais fenóxidos (FREUDENBERG, 1959).

A lignina pode ser diferente entre espécies, tecidos, estágios de desenvolvimento

e localização celular. Essas variações podem resultar das diferenças das atividades

enzimáticas com o substrato específico das Angiospermas e Gimnospermas (LEWIS &

YAMAMOTO, 1990).

Assim, a lignina possui composição diferente para Pteridófitas, Gimnospermas,

Angiospermas (Monocotiledôneas e Dicotiledôneas). O teor de lignina corresponde a

um total em média de 30% para coníferas e 25% para dicotiledôneas de zona temperada

(MENDES & ALVES, 1986).

A lignina é detectada em maior quantidade na camada S2 da parede secundária,

sobretudo nas fibras, vasos e traqueídeos do xilema, dotando-os de rigidez, suporte

mecânico, impermeabilidade, permitindo o transporte de água e solutos. Ela também é

encontrada, em menor quantidade, na periderme associada à suberina onde age como

uma barreira contra patógenos (STUDART-GUIMARÃES et al, 2003).

OMe

MeO

álcool p-cumarílico álcool coniferílico álcool sinapílico

Figura 1. Estruturas moleculares dos precursores majoritários da lignina

2.2 Biossíntese das ligninas

Em 1933, ERDTMAN postulava que a lignina era formada por desidrogenação

enzimática dos álcoois p-hidróxido cinamílico, coniferílico e sinapílico. Esta hipótese

foi, mais tarde, confirmada e elaborada por um dos experimentos de FREUDENBERG

(1959) através da polimerização do álcool p-hidróxido cinamílico in vitro com a enzima

lacase ou peroxidase (GRISEBACH, 1977).

A biossíntese da lignina pode ser dividida em duas etapas, a enzimática e a semi-

enzimática. No primeiro caso a fenilalanina amônio liase (FAL), cinamato 4-hidroxilase

(C4H), e ácido cafeico O-metiltransferase (COMT), assim como enzimas específicas

como cinamoil-CoA redutase (CCR) e cinamil álcool desidrogenase (CAD) são enzimas

do caminho fenilpropanoíde (RAMOS et al., 2001).

A biossíntese das ligninas (Figura 2) envolve uma adequação coordenada de três

fases biossintéticas: a fase pré-corísmica, a fase fenilpropanoídica e a fase da

polimerização da lignina. A fase pré-corismíca é a via responsável pela formação dos

ácidos chiquímico e corísmico, os quais são importantes em uma variedade de produtos

essenciais (HERRMANN, 1995).

N H

Fenilalanina

FAL↓→ NH3

Ácido cinâmico

↓

O H

→

O H

→

O H

OMe

→

O H

OMe

→

O H

OMe

MeO

Ácido p-cumárico Ácido cafeico Ácido ferúlico Ácido 5-hidroxiferúlico Ácido sinapílico

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

CoA-S

O H

→

CoA-S

O H

→

CoA-S

O H

OMe

→

CoA-S

O H

OMe

→

CoA-S

O H

OMe

MeO

p-cumaril-CoA cafeil-CoA ferulil-CoA 5-hidroxiferulil-CoA sinapil-CoA

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

O H

→

O H

→

O H

OMe

→

O H

OMe

→

O H

OMe

MeO

p-cumaraldeído aldeído cafeil coniferaldeído 5-hidroxiconiferaldeído sinalpadeído

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

O H

→

O H

→

O H

OMe

→

O H

OMeOH

→

OMeMeO

álcool p-cumaril álcool cafeil álcool coniferílico álcool 5- hidroxiconiferílico álcool sinapílico

↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Peroxidase/Lacase Peroxidase/Lacase Peroxidase/Lacase

Peroxidase/Lacase

↓----------------------------------------------------------------------------------------------------------------↓

LIGNINA

Figura 2. Caminho proposto para a biossíntese dos precursores da lignina (BOERJAN, et al., 2003)

A via geral dos fenilpropanoídes começa com a formação a partir da presença de

fenilalanina e envolve sucessivas reações de hidroxilação de anéis aromáticos, seguidas

de O-metilação fenólica e conversão do grupo carboxílico a álcool (BOERJAN, et al.,

2003) resultando no ácido cinâmico (BARBER & MITCHELL, 1997). O primeiro

passo dessa via inicia-se com uma reação catalisada pela enzima fenilalanina amônio-

liase (FAL) pela eliminação do grupo NH

da fenilalanina ou do ácido orogênico

(RAMOS, et al., 2001; LEWIS & SARKANEN, 1998) para resultar em monolignóis.

Nas plantas esta enzima está localizada tanto no citoplasma quanto nas organelas. O

metabolismo dos fenilpropanoídes é definido como a seqüência de reações envolvendo

a conversão da fenilalanina para ativar o ácido cinâmico (HAHLBROCK &

GRISEBACH, 1975).

A reação de formação do ácido cinâmico também pode ser catalisada por outra

enzima, a tirosina amônio-liase (TAL), ou seja, quando ocorre eliminação do grupo NH

do ácido aminado tirosina. Estas enzimas catalisam a trans-eliminação da amônia da

fenilalanina ou da tirosina para formar o ácido trans cinâmico e o p-trans cinâmico

(WHETTEN et al., 1998).

Essa transaminação, troca da carbonila pelo grupo NH

, ocorre no ácido

orogênico. Há interesse em formar grupos NH2, os quais fazem parte dos ácidos

aminados fenilalanina e tirosina, substâncias iniciais no processo de formação da

lignina. Essas enzimas são enzimas regulatórias “chaves” e um dos principais pontos de

controle do metabolismo secundário dos vegetais (BELL, 1981).

A FAL é uma enzima tetramérica, com dois sítios ativos por molécula

(BOLWELL, 1988). Aparentemente, as isoenzimas isoladas individualmente

apresentam cinética de Michaelis-Menten, mas em conjunto apresentariam

cooperatividade negativa (WHETTEN & SEDEROFF, 1995).

Sua atividade é influenciada por vários fatores externos e internos, como:

hormônios, níveis de nutrientes, luz, infecção por patógenos e ferimentos. A invasão de

fungos, por exemplo, induz a transcrição do RNAm que codifica para essa enzima,

aumentando assim sua síntese “de novo” e, conseqüentemente, estimulando a produção

de substância fenólica (JONES, 1984).

A partir do ácido cinâmico são produzidos diversos fenilpropanoídes simples,

via uma série de reações de hidroxilação, metilação e desidratação, tais como os ácidos

p-cumárico, cafeico, ferúlico, sinápico e as cumarinas simples, além dos ácidos

salicílico, benzóico e p-hidroxibenzóico que, embora tenham perdido uma cadeia lateral

de carbono, também se originam do cinamato e p-cumarato (DIXON & PAIVA, 1995).

O ácido cumárico sofre uma hidroxilação na posição 3 pela p-cumarato-3-

hidroxilase e forma o ácido cafeico. Enzimas que podem atuar nesta reação de

hidroxilação in vitro têm sido purificadas, mas não existem evidências que suportam a

via fisiológica destas enzimas na biossíntese de monolignóis in vivo (WHETTEN &

SEDEROFF, 1995).

Através da enzima O-metiltransferase (OMT) o ácido cafeico sofre uma

metilação na hidroxila de posição 3 para produzir o ácido ferúlico.

O ácido ferúlico pode ser ativado pelo 4-cumarato-CoA ligase (4CL) através da

conjugação com a coenzima A e os tioésteres CoA, presumidos como intermediários da

síntese do álcool coniferílico e do álcool p-cumarílico, respectivamente. Um destino

alternativo para o ácido ferúlico é a hidroxilação na posição 5 por outra enzima

hidroxilase (P450), a ferulato-5-hidroxilase. O ácido 5-hidroxiferúlico pode ser metilado

pela enzima O-metiltransferase produzindo, dessa maneira, o ácido sinápico. Em muitos

casos o ácido sinápico, no entanto, tem sido mostrado como um substrato pobre para

purificar enzimas in vitro (GROSS et al., 1975; KUTSUKI et al., 1982; LÜDERITZ et

al., 1982; VOO et al., 1995).

Tanto o ácido cumárico, o ferúlico quanto o sinápico são transformados em

álcoois p-cumarílico, coniferílico e sinapílico, respectivamente, os quais sofrem uma

polimerização oxidativa resultando na lignina.

Neste processo de polimerização atuam as enzimas lacases ou peroxidases e

isoenzimas correspondentes. A participação destas enzimas na formação da lignina foi

também estimada por HARKING & OBST (1973).

2.3 Fitorreguladores em meio de cultura

A adição de fitorreguladores no meio de cultura tem o objetivo principal de suprir

as possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes que se

encontram isolados das regiões produtoras na planta-matriz. Ao mesmo tempo, a adição

de fitorreguladores estimula certa resposta como o alongamento ou a multiplicação da

parte aérea. Essa resposta depende do estado fisiológico dos explantes, o que está

relacionado com a época do ano e com o estado geral da planta-matriz (ALTMAN &

GOREN, 1977).

Segundo XU & BEWLEY (1992), as auxinas, em particular o ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4-D) (Figura 3), são extremamente importantes na indução da

calogênese e células embriogênicas e na posterior remoção da auxina do meio de cultura.

Estas células embriogênicas formam embriões somáticos. Além disso, o 2,4-D possui

uma aplicação relevante no estudo da lignificação através de células em suspensão de

várias espécies e com os mais variados objetivos (EBERHARDT et al., 1993).

As auxinas são hormônios vegetais produzidos principalmente nas regiões apicais

que, transportados para outros locais da planta, participam do seu crescimento e

diferenciação. Esses fitorreguladores podem ser necessários para complementar o teor

endógeno ou suprir as necessidades de meristemas isolados (SMITH & MURASHIGE,

1970). Estes autores sugerem que as zonas produtoras de auxina não são propriamente os

meristemas, e sim os primórdios foliares e as folhas em expansão. Isto poderia explicar a

razão pela qual a auxina não é tão necessária quando gemas maiores são utilizadas para

cultivo.

Quantidades excessivas de auxina sintética 2,4-D (ácido 2,4-

diclorofenoxiacético) tendem a estimular a formação de calo.

As auxinas são utilizadas em concentrações muito baixas para reativar o ciclo da

célula e iniciar a formação do embrião. Porém, um outro regulador tem se mostrado

muito eficiente, é o caso do TDZ [1-fenil-3-(1,2,3- tiadiazol-5-il)uréia], uma citocinina

sintética que induz a acumulação de auxinas e citocininas endógenas no tecido

(MURTHY et al., 1995).

As auxinas são muito utilizadas, principalmente em experimentos de

micropropagação, pois são incorporadas ao meio de cultura para promover a formação

de calos, crescimento de células em suspensão, além de regular a morfogênese,

especialmente associada às citocininas.

As citocininas e auxinas são os reguladores de crescimento mais utilizados na

cultura de tecidos (CALDAS et al., 1990). As concentrações influenciam na

multiplicação in vitro, onde normalmente a melhor faixa fica entre 0,5 e 5,0 mg/L para

ambos fitorreguladores (MORALES et al., 1999). Segundo LITZ & JARRET (1991),

freqüentemente se induz a formação de calos em explantes cultivados em meio

contendo auxina, ou com uma alta relação citocinina / auxina em proporções iguais.

Para o estabelecimento de um eficiente controle no crescimento e na

diferenciação das culturas in vitro, é necessário um adequado balanço entre auxinas e

citocininas (WAGNER JUNIOR et al., 2003). Normalmente, as concentrações de

auxinas são inferiores as das citocininas, mantendo o balanço auxina /citocinina menor

que 1 (PIERIK, 1990).

Quando o nível de auxina em relação ao de citocinina é alto, ocorre a formação

de raízes. Na situação oposta, ocorre a formação de brotos e quando as proporções são

aproximadamente iguais, uma massa de calo é produzida (KRIKORIAN, 1995).

GRATTAPAGLIA & MACHADO (1990) descreveram a indução da calogênese

em meio de cultura com altas concentrações de auxinas, sendo 2,4-D um dos

reguladores de crescimento mais eficazes na indução de calos (AMMIRATO, 1983).

Figura 3. Estrutura molecular do ácido 2,4-diclorofenoxiacético

Alguns autores citam a influência do TDZ na formação de calos.

HUETTEMAN & PREECE (1993) citam o TDZ (tidiazuron) como um excelente

estimulante para formação de calos em concentrações iguais ou maiores que 1,0 mM.

WILHELM (1999) menciona que concentrações mais altas dessa citocinina

proporcionam a produção de calos mais volumosos.

Segundo KANEDA et al., (1997) a melhor performance do TDZ pode estar

relacionada a maior atividade citocinínica ou a forma de ação diferente de outras

citocininas durante o processo de desdiferenciação e rediferenciação celular, como

também ao fato de o TDZ induzir a acumulação de auxinas e citocininas endógenas no

tecido (MURTHY et al., 1995).

Assim como o TDZ apresenta respostas consideráveis para a formação de calos,

o 2,4-D se mostrou eficiente ao permitir formação de calos em todos os tratamentos

com concentrações variando de 0 a 15 µM em duas cultivares de morangueiro, exceto

naqueles isentos das auxinas 2,4-D (FLORES et al., 1998).

Embora o 2,4-D tenha se mostrado eficiente na produção de calos, MURTHY et

al., (1998) cita a melhor performance do TDZ em relação a outros reguladores de

crescimento na proliferação de tecido calogênico.

VELHO et al., (1988) e FERREIRA et al., (2001) mostraram que o cupuaçu não

tem apresentado dificuldades para gerar calos usando-se o meio MS com a adição de

baixas concentrações de 2,4-D, sendo a eficiência na emissão de calos aumentada pela

adição de ANA (ácido α-naftalenoacético).

De acordo com VENTURIERI & VENTURIERI (2004), o TDZ não produziu

melhoras na indução de calos desejáveis para virem a ser aproveitados para a

organogênese ou embriogênese somática do híbrido de Theobroma grandiflorum x

Theobroma obovatum diferentemente do que foi observado para o cacau por LI et al.,

(1998).

No entanto, ALVES et al., (2004) citam que os melhores resultados para

calejamento foram constatados nos tratamentos com os reguladores de crescimento TDZ

e ANA. A vantagem da utilização dos reguladores de crescimento TDZ e ANA foi

citada por LU (1993), cujos estudos indicaram que o TDZ apresenta maior eficiência na

presença de ANA. Contudo, esse autor afirma que longas exposições ao TDZ não são

recomendadas, pois podem causar hiper-hidricidade, crescimento anormal de gemas e

dificuldade no enraizamento.

Segundo LUCZKIEWICZ et al., (2002), modificações no tipo e na concentração

da auxina no meio de cultura, provaram que o 2,4-D foi o regulador de crescimento que

estimulou o crescimento de calos de Rudbeckia hirta L.

de forma mais acentuada. Uma

outra correlação direta entre crescimento de calos e concentração de auxina foi

observada na presença de ANA e IBA (ácido indol-3-butírico).

Conforme AKITA et al., (2000), as células dos calos provenientes dos

segmentos de hipocótilos de beterraba (Beta vulgaris) tiveram um crescimento rápido e

uniforme na presença de 10

-7

M de 2,4-D, sendo esta auxina eficiente na produção de

metabólitos secundários como a betacianina.

De acordo com PALÚ et al., (2004) houve uma interação significativa entre 2,4-

D e a cinetina na indução de calos para a cultivar Acaiá Cerrado (uma cultivar de café -

Coffea arabica L.), enquanto que para massa fresca dos calos, somente houve efeito

significativo dos fatores isolados. Segundo estes mesmos autores, o aumento da

produção de calos ocorreu até a concentração de 2 mg/L de 2,4-D, ponto a partir do qual

este regulador de crescimento passou a inibir a calogênese, provavelmente devido ao

efeito fitotóxico promovido por concentrações superiores. A melhor resposta para

indução de calos foi promovida pela interação entre 2,4-D (2 mg/L) e cinetina (1,9

mg/L).

As concentrações dos fitorreguladores variam muito de espécie para espécie e

em função do que se quer obter. Em alguns casos a concentração de 0,5 mg/L de 2,4-D

produz calos, no entanto HUAN et al., (2004), trabalhando com indução de calos e

regeneração de plantas através de estruturas de embriões somáticos em Cymbidium,

perceberam a morte de todos os explantes quando utilizou somente 2,4-D ou combinado

com TDZ.

Níveis elevados de 2,4-D aumentaram consideravelmente a friabilidade de calos

embriogênicos de Cymbopogon martinii (PATNAIK et al., 1997), e segundo BARUAH

& BORDOLOI (1989), suplementos orgânicos, como a caseína hidrolisada, não foram

necessários para a produção de calos embriogênicos friáveis

Calos formados em meio MS suplementado com 1,0 mg/L de 2,4-D e 0,5 mg/L

de cinetina foram capazes de atuar na biossíntese de lignina, após tratamento com os

ácidos sinápico e ferúlico (HAMADA et al., 2003). Isso mostra que o 2,4-D é de grande

importância na calogênese por ser capaz de produzir calos para os mais diversos

objetivos.

FALCO et al., (1996) trabalhando com cana de açúcar, tiveram respostas

consideráveis ao inocular segmentos foliares no meio MS suplementado com 1, 2 ou 3

mg/L de 2,4-D, para indução de calos.

2.4 Calogênese e células em suspensão

Um calo consiste de uma massa desorganizada de células e parcialmente

diferenciada que varia quanto ao tipo, tamanho, conteúdo e espessura da parede celular.

Traqueídeos, células parenquimáticas, tecido cambial e periderme podem ser formados

durante a calogênese (NARAYANASWAMY, 1977). Freqüentemente um calo é

formado a partir de explante de raízes, de folhas ou de caule. Ao utilizar a técnica de

cultura de tecido, a formação de calos pode ser induzida em vários tecidos ou órgãos de

plantas que não são usualmente responsáveis pelo desenvolvimento de calos (STREET,

1969).

Embora maior ênfase tenha sido dada para tecidos de angiospermas, a formação

de calos tem sido observada também em Gimnospermas e Pteridófitas (YEOMAN &

MACLEOD, 1977).

Através de injúrias mecânicas, calos podem ser produzidos por tecidos de

plantas contaminados por certos microrganismos (BRAUN, 1954).

Em geral, o crescimento de calo envolve uma complexa relação entre o material

utilizado como explante, a composição do meio de cultura e a condição propícia para

simular o ambiente natural das plantas durante o período de incubação. O

estabelecimento dos calos a partir dos explantes pode ser dividido em três fases:

indução, divisão celular e diferenciação. Durante a fase de iniciação, o metabolismo é

estimulado e as células se preparam para a divisão. O tempo de duração desta fase

depende principalmente do estado fisiológico do explante, assim como da condição do

meio de cultura. Na seqüência, existe uma fase de ativação da divisão celular, na qual o

explante é revertido para um estágio meristemático. A terceira fase envolve o

aparecimento da diferenciação celular e a expressão da trajetória de metabólitos para a

formação de produtos secundários (AITCHISON, 1977). Certos aspectos da

acumulação de produtos secundários, como resposta da diferenciação da cultura de

calos, têm sido revisados (YEOMAN et al., 1982).

Alguns calos são fortemente lignificados e passam a apresentar uma textura mais

rígida, fazendo com que estes sejam divididos com maior facilidade em pequenos

fragmentos. Quando são facilmente separados são denominados calos friáveis. Podem

apresentar colorações amareladas, brancas, verdes ou pigmentadas com antocianina,

essa pigmentação pode ser uniforme em toda a extensão do calo, ou algumas regiões

podem permanecer sem pigmento (DODDS & ROBERTS, 1985).

Um dos grandes problemas que envolvem a cultura de calos é a oxidação,

principalmente quando se trabalha com espécies lenhosas. Entretanto, várias substâncias

podem ser usadas como antioxidante. O PVP (antioxidante PoliVinilPirrolidona), por

exemplo, é uma poliamida utilizada em cromatografia de separação de ácidos

aromáticos, aldeídos e fenóis pela sua função adsorvente por meio de ligações de ponte

de hidrogênio, o que previne a oxidação e a polimerização, além de adsorver os

produtos da oxidação fenólica, ou seja, as quinonas (TEIXEIRA, 2001).

Para prevenir a oxidação em explantes de oliveira, RUGINI (1990) adicionou

200 mg/L de glutationa reduzida. Visando inibir a oxidação fenólica, SÖNDAHL &

SHARP (1977) adicionaram 10 a 50 mg/L de cisteína-HCl ao meio de cultura. Um

outro antioxidante utilizado com menor freqüência é o ditiotreitol (ZIV & HALEVY,

1983).

A oxidação é observada pelo escurecimento que pode ocorrer antes mesmo dos

calos serem formados, ainda na fase do estabelecimento dos explantes quando os

tecidos são lesados, tornando-se um sério problema.

Para reduzir o escurecimento, diversas técnicas são utilizadas durante o preparo

do explante e do meio de cultura bem como na fase de incubação das culturas. Segundo

PASQUAL et al., (1997), a oxidação é menos severa em meios de cultura com baixas

concentrações de sais. Substâncias antioxidantes, como o ácido cítrico e o ácido

ascórbico, são também utilizadas para reduzir a oxidação em cultura in vitro. Estas

agem pela remoção do oxigênio de outras moléculas (varredor de peróxido de

hidrogênio) e também atuam por mecanismos alternativos. Provavelmente, o ácido

cítrico atua como um agente quelante, retendo íons de metal, que são necessários para

ativar enzimas oxidativas (PASQUAL et al., 1997).

Para prevenir a ação polifenólica em bananeira (Musa AAB.), UTINO et al.,

(2001) adicionaram ácido cítrico, ácido ascórbico e carvão ativado, separadamente, ao

meio. Os autores verificaram que o ácido ascórbico foi mais efetivo do que o ácido

cítrico e o carvão ativado, na concentração de 25 mg/L. Dentre estes, o ácido ascórbico

tem sido o mais utilizado (VUYLSTEKE & DE LANGHE, 1985; GUPTA, 1986;

LAMEIRA, 1987; SOUZA & GONÇALVES, 1996). O escurecimento de explantes é

mais visível em meio sólido, pois as substâncias fenólicas exudadas para o meio

acumulam-se ao redor do explante.

Assim, uma prática eficiente para evitar a oxidação dos tecidos é transferir os

explantes, freqüentemente, para um novo meio. O intervalo entre transferências deve ser

ajustado de acordo com o grau de oxidação, pois o escurecimento é particularmente

mais intenso na fase inicial do estabelecimento e decresce com o tempo (PASQUAL et

al., 1997; VUYLSTEKE, 1989), porém pode levar tanto o explante como o calo à

morte.

LANDA et al. (2000) inocularam explantes foliares de pequizeiro (Caryocar

brasiliense Camb.) tanto na presença quanto na ausência de luz e observaram que a

formação de calos na presença de luz foi melhor que no escuro inicialmente, porém a

partir do vigésimo dia de inoculação o desenvolvimento dos calos cultivados no escuro

foi melhor até a avaliação final aos 60 dias. Entretanto, com intuito de obter a

biotransformação de substâncias fenólicas a partir de células em suspensão de

Catharanthus roseus, SHIMODA et al., (2002), fizeram a indução de calos na presença

de luz.

Para copaíba (Copaifera sp), a formação de calos apresentou respostas em total

ausência de luz num período de 45 dias (OLIVEIRA et al., 2001). Já a espécie Fragaria

sp (morangueiro) teve seus explantes inoculados no meio de indução de calos em um

fotoperíodo de 16 h (FLORES et al., 1998).

Suspensão de células é um procedimento artificial de crescimento de células

vegetais, onde as células são isoladas a partir de calos em meio de cultura líquido.

A produção de metabólitos secundários de interesse comercial a partir de

culturas bacterianas influenciou na cultura de células em suspensão a partir de regiões

das plantas onde esses metabólitos são produzidos (BERLIN, 1988; SAKUTA &

KOMAMINE, 1987), embora existem muitos insucessos na produção de produtos

secundários (BERLIN, 1988). A principal razão para estes insucessos é a falta de

conhecimento sobre os mecanismos reguladores da formação destes metabólitos

(SAKUTA & KOMAMINE, 1987).

Quando a estabilidade genética é alcançada é necessário classificar as diferentes

linhagens de calos de acordo com as suas respostas para prover uma eficiente produção

de metabólito. Portanto, cada calo deve ser analisado separadamente pela sua

velocidade de crescimento, assim como as concentrações dos metabólitos intra e

extracelulares. Isso permite uma avaliação da produtividade de cada célula, logo

somente as melhores serão levadas para a etapa de célula em suspensão (BOURGAUD,

et al., 2001).

Comparado ao crescimento cinético da célula, o qual é usualmente uma curva

exponencial, muitos metabólitos secundários são produzidos durante a fase de platô, ou

seja, quando o crescimento fica constante. Esta falta de produção durante os estágios

anteriores pode ser explicada pela alocação do carbono principalmente distribuído pelo

metabolismo primário (construção das estruturas da célula e respiração) quando o

crescimento é muito ativo. Por outro lado, quando o crescimento pára, o carbono não é

mais requerido em grandes quantidades para o metabolismo primário e as substâncias

especiais são mais ativamente sintetizadas. Isto pode ser freqüentemente observado em

muitas novas atividades enzimáticas, aparecendo durante a fase de platô. Isto tem

levado muitos autores a explicar a possível diferenciação bioquímica das células quando

a fase de crescimento termina (PAYNE et al., 1991). No entanto, alguns produtos

secundários são conhecidos por ter um crescimento associado com células

indiferenciadas, como é o caso das betalaínas e dos carotenóides.

Células em suspensão constituem um bom material biológico para o estudo das

vias biossintéticas. Realmente, comparado com culturas de calos, a suspensão permite a

recuperação de grandes quantidades de células a partir de enzimas que podem ser mais

facilmente isoladas (DOUGALL, 1981). Muitas estratégias podem ser usadas para

aumentar a produção de metabólitos secundários, mas a elicitação é usualmente uma das

mais sucedidas. Isto consiste em aplicar estresse físico ou químico na cultura de célula

em suspensão que dará início a produção de metabólitos secundários que não são

produzidos normalmente. Isto é feito com ativadores bióticos (micélio de fungo

patogênico, extratos de proteínas, entre outros) ou abióticos (temperatura, luz UV,

metais pesados, pH, etc.) (BOURGAUD, et al., 2001).

Suspensão celular tem sido também adotada como uma ferramenta no estudo da

fisiologia de todos os tipos de outros processos celulares, por exemplo, divisão celular,

respiração, sinalização hormonal, armazenamento, e transporte (LEGUAY & GUERN,

1975; NISHINARI & YAMAKI, 1976; VOGEL & BRODELIUS, 1984; SNAPE, et al.,

1989; NEUMAN & ZENK, 1986; DEUS-WINK & MENDE, 1987; BLOM, et al.,

1991; HOEFNAGEL, et al., 1993).

Após serem formados, os calos são transferidos para o meio MS líquido para

iniciação de cultura em suspensão (MURASHIGE & SKOOG, 1962). Durante o

processo de formação de calos e células em suspensão, os metabólitos primários e

secundários são formados e muitas vezes excretados ao meio de crescimento. Essa

técnica permite o desenvolvimento de experimentos in vitro para sanar algumas

questões relacionadas ao sistema de polimerização das ligninas e a participação das

proteínas estruturais neste processo.

Independentemente da espécie a ser utilizada é essencial que as células da

suspensão se dividam e se multipliquem ativamente. A divisão celular é um componente

do ciclo celular, e possui as seguintes fases: G1, S, G2, M e citocinese (STREET &

OPIK, 1970).

Este processo é utilizado para a obtenção e proliferação de células em meio

líquido, sob condição de agitação contínua, para evitar possíveis gradientes nutricionais

e gasosos no meio de cultura, além de ser uma técnica eficiente de multiplicação rápida.

As suspensões celulares têm uma grande aplicação para os estudos de bioquímica,

genética, citologia, fisiologia vegetal e fitopatologia, também sendo um tipo de cultivo

empregado na produção de metabólitos secundários ou material clonal em escala

comercial pela utilização de biorreatores (PEREIRA & MELO, 2004).

Há um tempo atrás se considerava que células não diferenciadas como cultura de

calos ou de células em suspensão, não eram eficazes para estudo de qualquer tipo de

metabólito secundário (KRIKORIAN & STEWARD, 1969). No entanto, ZENK (1991)

demonstrou que essa teoria estava errada ao observar que cultura de células de Morinda

citrifolia produziu 2,5 g de antraquinona por litro de meio de cultura.

A cultura de células em suspensão também tem sido usada não só para produção

ou estudo de metabólitos secundários, mas também para estudos de resistência a

bactérias em determinadas culturas, como é o caso do algodão (Gossipium hirsutum L.)

(KOBAYASHI & VIEIRA, 2000).

Para o estudo de embriogênese somática de Cymbopogon martinii a partir de

células em suspensão, a concentração de 13,6 µM de 2,4-D foi eficiente (PATNAIK et

al., 1997). Para induzir resistência a bactérias em algodão, a concentração de 0,5 mg/L

de 2,4-D mostrou resultados satisfatórios. No entanto, para regeneração in vitro de

amendoim (Arachis villosulicarpa Hoehne), o meio líquido para suspensão foi

suplementado com 1,0 mg/L de BAP (6-benzilaminopurina) (MANSUR et al., 1993).

A ausência de luz em cultura de células em suspensão de cana-de-açúcar

(Saccharum sp.) visando a regeneração de plantas para estudos histológicos foi também

estudada (FALCO et al., 1996).

Células em suspensão oriundas de calos subcultivados mostraram as mesmas

características na produção de pigmentos que indicavam metabólitos secundários, como

a betalaína, tendo a cultura em suspensão mantido suas propriedades por mais de 5 anos

(AKITA et al., 2000). Para a produção de bisfenol A (produto largamente usado para a

produção de plásticos, poliéster, entre outros) a partir de células em suspensão de

Eucalyptus perriniana não foram mencionadas subculturas das células em suspensão

(HAMADA et al., 2002). No entanto, para a análise das respostas de hortelã (Mentha)

em diferentes concentrações de 2,4-D foram feitas subculturas a cada duas semanas

(YANG et al., 1999).

Segundo FALCO et al. (1996), trabalhando com cana de açúcar, o período de

três meses foi, de uma forma geral, adequado para obter uma completa regeneração

desta planta, em suspensão.

TABATA (1977) tem mencionado que metabólitos secundários em culturas de

células vegetais foram acumulados durante a fase estacionária em muitos casos.

O uso de 2,4-D para a produção de substâncias fenólicas a partir de células em

suspensão também foi citado com eficiência na resposta que esta auxina provoca em

hortelã na descrição do processo de crescimento da célula (YANG et al., 1999).

Para a detecção da produção ou não de uma determinada substância produzida

pela cultura de células em suspensão muitas análises são realizadas, como ressonância

magnética de

C ou de

H, que foram usados para caracterizar substâncias derivadas de

lignina produzidas em cultura de pinus (EBERHARDT et al., 1993).

2.5 Lignificação e células em suspensão

O estudo do processo de lignificação através de cultura de calos e de células em

suspensão pode estar relacionado a vários objetivos diferentes, um deles é a

caracterização in situ da lignina de uma determinada espécie, como em Pinus taeda

(EBERHARDT et al., 1993).

MOLLER et al., (2006) utilizaram a técnica de suspensão celular para observar

os aspectos enzimáticos e topoquímicos da lignificação.

O estudo da lignificação através da cultura de células em suspensão foi usado

por KARKÖNEN et al. (2002), para mensurar a atividade de um número de enzimas

envolvidas no processo de formação da lignina, pois a cultura de células é um modelo

adequado para estudar esse processo, uma vez que as células ficam soltas umas das

outras no meio de cultura líquido.

A utilização de alguns reguladores de crescimento tem sido muito associada ao

estudo da lignificação, como é o caso do 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e do

BA (6-benziladenina) no meio de cultura para suspensão celular pelos efeitos destas

substâncias na lignificação, os quais permitem que as células se formem em grandes

agregados influenciando na formação da lignina (KUBOI & YAMADA, 1978).

A lignificação também pode ser induzida em culturas de células pela

combinação do ANA (ácido α-naftalenoacético) com o BA (benzilaminopurina), sendo

este sistema utilizado para investigar a relação entre atividades enzimáticas e a

lignificação. Em cultura de células de salsa (Petroselinum hortense) e de trigo (Triticum

aestipum), a atividade enzimática coincidiu com a lignificação, sendo possível observar

a presença desse tipo de enzima em todas as culturas de células lignificadas (HOSEL et

al., 1982).

Muitos estudos têm sido realizados sobre a limitação da digestabilidade e a

utilização de forrageiras, devido às características da parede celular e aos efeitos

causados pela composição da lignina nos ruminantes. A partir disso, surgiu a idéia de

alterar a estrutura da lignina, por manipulações na via biossintética, modificando a

digestabilidade da parede celular. Essas alterações podem ser realizadas através de

técnicas de suspensões celulares para influenciar no processo de lignificação e com isso

alterar as enzimas que estão associadas a formação da parede celular (RALPH et al.,

2005).

Algumas substâncias são utilizadas para promover o processo de lignificação no

meio de cultura como é caso dos dilignóis, que promoveram a lignificação nos

traqueídeos de zinia (Zinnia), na qual a biossíntese de monolignol foi bloqueada por um

inibidor da fenilalanina amônio liase (FAL) sugerindo que os dilignóis podem atuar

diretamente na polimerização da lignina (TOKUNAGA et al., 2005).

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia da Madeira, do

Departamento de Produtos Florestais, do Instituto de Florestas, da Universidade Federal

Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).

As sementes de Eucalyptus urophylla para produção de explantes foram

adquiridas do IPEF (IPEF-ESALQ), Piracicaba-SP.

3.1 Assepsia

Esta etapa consistiu na desinfestação das sementes, sendo de muita importância

por permitir a obtenção de um tecido descontaminado sem levá-lo à morte quando

isolado, pois várias substâncias com ação germicida são utilizadas. Algumas gotas de

detergente foram comumente adicionadas às soluções a base de cloro para melhorar o

contato destas com os tecidos, como é o caso do Tween 20, o qual é mais utilizado em

concentrações de 0,01 a 0,05% (v/v). Neste caso, as sementes de Eucalyptus urophylla

foram submetidas às seguintes condições de assepsia na capela de fluxo laminar:

desinfestação em hipoclorito de sódio 1% na presença de 0,2 mL/L de Tween 20 por 20

minutos em um becher, em repouso. Em seguida as sementes foram lavadas de 3 a 5

vezes em água bidesionizada e autoclavada e desinfestadas na presença de peróxido de

hidrogênio por 30 minutos em repouso (é necessário que a solução cubra as sementes).

Após a desinfestação final com o peróxido de hidrogênio, as sementes foram inoculadas

ao meio de cultura para germinação.

3.2 Inoculação das sementes

Após a etapa de desinfestação, as sementes foram inoculadas no meio de cultura

MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) (Tabela 1) para germinação e posterior

desenvolvimento das plântulas (Figura 4), sendo colocadas 20 a 25 sementes por

recipiente. O recipiente utilizado foi o vidro de maionese com tampa e capacidade de

220 ml de capacidade, para cada recipiente foi utilizado 50 ml do meio de cultura. As

sementes foram submetidas a um fotoperíodo de 16/8 horas (16h no claro e 8h no

escuro) a uma temperatura de 25ºC. As mudas geradas foram utilizadas como fonte de

explantes.

Para a germinação de E. urophylla foi utilizado um protocolo estabelecido por

WATT et al., (1991), que obteve resultados satisfatórios a partir da utilização deste

meio modificado para germinação.

Tabela 1. Meio MS modificado para germinação de Eucalyptus urophylla (WATT et

al., 1991).

Macronutrientes mg/L Micronutrientes mg/L Vitaminas mg/L Hormônios mg/L

(NH

)NO

1650 MnSO

.4H

O 22,3 Mio-inositol 100 Cinetina 0,05

KNO

1900 ZnSO

.4H

O 8,6 Ácido nicotínico 5 AIA 1

CaCl

.2H

O 440 H

6,2 Piridoxina.HCl 5 BAP 0,11

MgSO

.7H

370

0,83

Tiamina.HCl

Ácido

naftalenoacético 4

170

MoO

.2H

0,25

Glicina

Ferro

CuSO

.5H

0,025

Pantotenato de

cálcio 0,1

Sacarose

30.000

EDTA.2H

O 33,6 CoCl

.6H

O 0,025 Biotina 0,1 Agar 8 g/L

FeSO

.7H

27,8

pH 5,7

Benlate

(fungicida) 100

Figura 4. Perfil estrutural do desenvolvimento de mudas de Eucalyptus urophylla obtidas a partir da

germinação de sementes em meio MS modificado aos 30 dias.

3.3 Cultura de calos

Os explantes foliares foram retirados das plântulas que apresentaram maior vigor

(Figura 5). Após 30 dias no meio MS, esses explantes foram inoculados no meio MS

modificado para formação de calos de Eucalyptus urophylla na ausência de luz por 90

dias (Tabela 2) a uma temperatura de 25ºC. Foram colocados 5 explantes por vidro de

maionese contendo 50 ml do meio. Por vidro eram colocados explantes do mesmo vidro

da germinação, ou seja, de um vidro de maionese com as mudas germinadas eram

retirados 5 explantes, não misturou-se explantes de vidros de germinações diferentes.

Figura 5. Cultura de calo: (A) Escolha do explante; (B e C) Corte do explante; (D) Inoculação

do explante no meio para calo; (E) Calo formado de Eucalyptus urophylla

C D

Tabela 2. Meio MS utilizado para indução de calos de Eucalyptus urophylla (WATT et

al., 1991).

Macronutrientes mg/L Micronutrientes mg/L Hormônios mg/L

(NH

)NO

1650 MnSO

.4H

O 22,3 Cinetina 0,1

KNO

1900 ZnSO

.4H

O 8,6 AIA 10

CaCl

.2H

O 440 H

6,2 BAP -

MgSO

.6H2O

370

0,83

Ácido

naftoacético -

170 Na

MoO

.2H

O 0,25 2,4- D 1

PO - CuSO

.5H

O 0,025

MgSO

.7H

O - CoCl

.6H

O 0,025 Sacarose 30.000

Ferro

Vitaminas

pH 5,7

EDTA. 2H

O 33,6 Mio-inositol 100 Fitagel 4 g/L

FeSO

.7H

27,8

Ácido nicotínico

0,5

Benlate

(fungicida) 100

Piridoxina.HCl 0,5 PVP 800

Tiamina.HCl 0,1

Glicina 2,00

Para evitar problemas com contaminação fúngica foi adicionado, ao meio de

cultura para indução de calos e para germinação, 100 mg/L do fungicida Benlate no

meio de cultura antes deste ser autoclavado.

Por se tratar de uma espécie lenhosa foi necessário levar em consideração a

possibilidade de ocorrer oxidação devido à liberação de substâncias fenólicas no

momento do corte dos explantes. Para sanar este problema utilizou-se 800 mg/L de PVP

(polivinilpirrolidona) (ação antioxidante) no meio para indução de calos, seguindo o

protocolo (Tabela 2). O PVP fornece resultados satisfatórios no combate a oxidação.

Após 90 dias no mesmo meio de cultura, no qual os calos se desenvolveram,

estes foram transferidos para o meio MS de cultura de células em suspensão.

3.4 Células em suspensão

No momento em que os calos se apresentaram com tamanhos adequados (em

torno de 1,0 cm de diâmetro) e livres de contaminação e de oxidação, o que ocorreu

após 90 dias, estes foram transferidos para o meio MS modificado para cultura de

células em suspensão na ausência de agentes antioxidantes (Tabela 3).

Foi realizado um experimento em meio MS para células em suspensão com

diferentes concentrações da auxina sintética 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético)

(Tabela 4). Para cada tratamento foram feitas 3 repetições e cada vidro de maionese

continha 50 mL de meio líquido, no qual foram colocados 5 calos obtidos do mesmo

vidro.

Tabela 3. Meio MS modificado para formação de células em suspensão de Eucalyptus

urophylla (WATT et al., 1991)

Macronutrientes

mg/L

Micronutrientes

mg/L

Vitaminas

mg/L

(NH

)NO

1650 MnSO

.4H

O 22,3 Mio-inositol 100

KNO

1900

ZnSO

.4H

8,6

Ácido

nicotínico 0,8

CaCl

.2H

O 440 H

6,2 Piridoxina.HCl

0,8

MgSO

.6H

O 370 KI 0,83 Tiamina.HCl 0,1

170 Na

MoO

.2H

O 0,25 Glicina 2

Ferro

CuSO

.5H

O 0,025

Hormônios

EDTA 33,6 CoCl

.6H

O 0,025

Cinetina 10

FeSO

.7H

O 27,8 AIA 1

2,4- D 5

Sacarose 30.000

pH 5,7

Benlate 100

Tabela 4. Tratamentos variando as concentrações de 2,4-D

Tratamento Concentração de 2,4-D

T1 1 mg/L

T2 2 mg/L

T3 4 mg/L

T4 5 mg/L

T5 0 mg/L

Os calos foram submetidos a agitação em torno de 125 rpm na ausência total de

luz por 90 dias, sendo que, por questão de adaptação ao meio, no primeiro dia no meio

líquido os calos ficaram em repouso, sendo colocados em agitação somente a partir do

segundo dia. No final deste tempo as células se encontraram individualizadas e o líquido

da suspensão se apresentou com uma certa viscosidade.

3.5 Determinação de lignina

3.5.1 Teste de Wiesner

O teste de Wiesner (LIN & DENCE, 1992) foi realizado através da marcação de

cinco spots na cromatofolha indicando o seu respectivo tratamento, e com o capilar foi

colocado em cada spot uma pequena alíquota do líquido da suspensão celular. Quando

cada spot se apresentou seco, colocou-se com o capilar uma alíquota do reagente de

Wiesner sobre cada spot. Em seguida esperou-se um tempo aproximado de 30 minutos

para verificar a mudança de cor em cada tratamento. É preciso ressaltar que o reagente

de Wiesner indica a presença de fenóis nas amostras quando estas, após o contato com o

reagente, se tornam de coloração rosada-violeta, revelando a possível presença de fenóis

no meio. Esse teste é uma resposta qualitativa da detecção de fenóis. Neste teste

somente foi testada uma alíquota representando cada tratamento, não foram feitas

repetições.

3.5.2 Infravermelho

A análise no infravermelho consiste na análise qualitativa da lignina, obtida

através dos espectros resultantes do infravermelho, realizada no Instituto de Química da

UFRRJ e no Laboratório de Produtos Naturais –Farmanguinhos - FIOCRUZ.

Foram retirados 2 mg de cada amostra das células em suspensão, as quais foram

secas ao ar através do procedimento de BRUCE & WEST (1989) após a etapa de

maceração na presença de etanol, vista na análise no ultravioleta. A esta quantidade de

células adicionou-se 200 mg de brometo de potássio (KBr). Esta mistura foi macerada

para que a amostra ficasse bem homogênea permitindo uma melhor leitura do aparelho

(Figura 6). O espectro foi obtido por técnica de reflectância difusa com transformada de

Fourier Ft – IR Nexus 670 FT – IR, e o programa utilizado foi o OMNIC. A análise no

infravermelho também foi obtida pelo aparelho Perkin-Elmer.

Figura 6. Preparação da amostra para análise no infravermelho: (A) 2 mg da amostra; (B) Os 5

tratamentos; (C) 200 mg de KBr; (D e E) A amostra sendo macerada com KBr; (F) Os tratamentos

prontos para análise no infravermelho.

3.5.3 Ultravioleta

A análise no ultravioleta (UV) consiste na análise quantitativa da lignina em

células em suspensão. Uma curva de calibração (Figuras 7 e 8) foi elaborada com

amostra padrão (lignina de Björkman de Gallesia gorazema – método de Björkman)

(LIN & DENCE, 1992).

F E

B A

O aparelho utilizado para fazer a análise no ultravioleta foi o UV mini 1240 –

UV-Vis spectrophotometer – Shimadzu.

A obtenção da lignina foi possível através das células retiradas do meio em

suspensão, as quais foram transferidas para placas de Petri e a etapa da quantificação da

lignina foi realizada pelo método de BRUCE & WEST (1989):

1º- Separação de 0,8 g de material fresco (células que foram transferidas para a placa de

Petri);

2º- Extração em 20 mL de etanol 80% em almofariz;

3º- Centrifugação a 20.000 rpm por 20 minutos (em temperatura ambiente = 25ºC);

4º- Transferência desse material para uma placa de Petri com etanol, filtração (através

de um funil), lavagem (com o próprio etanol, foi colocado etanol no material que

precipitava e possibilitou a retirada do etanol) e secagem ao ar (o resíduo insolúvel em

álcool foi usado para determinação das ligninas);

5º- Uso de 50 mg do resíduo seco, sendo colocado em tubo de vidro onde se adiciona 4

mL de HCl 2N e 0,4 mL de ácido tioglicólico;

6º- Selamento e aquecimento do tubo em uma estufa a 100ºC por 4 h;

7º- Em seguida o material foi resfriado e centrifugado a 30.000 rpm por 20 minutos a

4ºC;

8º- O sobrenadante foi descartado e o material depositado no fundo foi lavado uma vez

com 4 mL de água bidesionizada;

9º- Este material foi ressuspenso em 4 mL de NaOH 0,5N e agitado lentamente a 25ºC

por 18 h em um agitador em velocidade baixa ( no mesmo agitador que serviu para

agitar o meio de cultura) para extrair o tioglicolato de lignina;

10º- A amostra foi novamente centrifugada a 30.000 rpm por 20 minutos a 4ºC;

11º- O sobrenadante foi transferido para um tubo teste onde 0,8 mL de HCl foi

adicionado e ficou em repouso por 4 h a 4ºC (em repouso dentro da centrífuga, onde foi

possível manter essa temperatura);

12º- Centrifugação a 30.000 rpm por 20 minutos;

13º- O material sólido foi dissolvido em 8 mL de NaOH 0,5N;

14º- A absorbância do material no ultravioleta foi mensurada a 280 nm.

As concentrações de lignina para a curva de calibração foram feitas da seguinte

maneira:

1º- 8 mg de NaOH em 400 mL de H

O = NaOH 0,5N;

2º- Solução estoque de 150 mg/L: 15 mg de lignina de Björkman diluídos em 100 mL

de NaOH 0,5N;

3º- Solução de 100 mg/L: em 10 mL dessa solução estoque de lignina de 150 mg/L

foram adicionados 5 mL da solução de NaOH 0,5N;

4º- Solução de 50 mg/L: em 10 mL da solução estoque de lignina de 150 mg/L foram

adicionados 20 mL da solução de NaOH 0,5N;

5º- Solução de 25 mg/L: em 10 mL da solução estoque de lignina de 150 mg/L foram

adicionados 50 mL da solução de NaOH 0,5N;

6º - Separou-se 10 mL de cada uma dessas diluições, ao todo foram 4 vidros com suas

respectivas concentrações de lignina padrão (Björkman);

7º- O branco foi feito com 10 mL de NaOH 0,5N.

Figura 7. Ilustração das amostras de lignina padrão de Björkman para a curva de calibração (as cores

azuis são ilustrações para melhor identificar que à medida que a concentração diminui a cor fica mais

clara)

Figura 8. Curva de calibração da lignina padrão (Gallesia gorazema) de Björkman

0,5

1,5

25 50 100 150

Concentração de lignina (mg/L)

Absorbância

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Calogênese e suspensão celular

A germinação das sementes no meio MS modificado (MURASHIGE &

SKOOG, 1962) visando a utilização dos explantes para formação de calos foi muito

eficiente, cerca de 95% das sementes germinaram. Além disso, este meio de cultura

propiciou um bom desenvolvimento das plântulas, ou seja, as folhas se apresentaram

com uma maior superfície permitindo a obtenção de explantes maiores e com isso a

sobrevivência destes na etapa posterior de indução a calogênese.

Após a germinação das sementes e inoculação dos explantes no meio MS

modificado para indução de calos de

Eucalyptus urophylla,

os calos foram formados

(Figura 9). Alguns apresentaram certa friabilidade, outros, não. Cerca de 50% dos calos

eram friáveis, os calos que não eram friáveis apresentaram uma superfície mais rígida,

as células não se soltavam facilmente umas das outras, sendo esta uma característica

típica de calo de espécie lenhosa. O tempo de 90 dias foi adequado para a obtenção de

calos com capacidade de serem utilizados na fase de células em suspensão, tanto no que

diz respeito ao tamanho (cerca de 1,0 cm de diâmetro) quanto o baixo nível de oxidação.

Neste trabalho o índice de contaminação foi muito baixo, sendo irrelevante na

fase de calogênese, sendo o benlate, o fungicida responsável por esse resultado.

Embora os calos de espécies lenhosas, como os de

Eucalyptus urophylla

apresentem grande de nível de oxidação, o uso do PVP reduziu de forma considerável o

índice de oxidação, cerca de 30% dos calos oxidaram.

Essa resposta positiva com relação a um índice pequeno de oxidação ocorreu

porque os calos foram submetidos a um regime de total ausência de luz e o meio de

cultura para indução de calos era constituído de PVP (polivinilpirrolidona), um

antioxidante que mostrou-se muito eficiente. A ausência de luz para indução de calos

apresentou boas respostas também para

Copaifera sp

. (OLIVEIRA et al., 2001).

A escolha do PVP para controlar a oxidação de calos de

Eucalyptus urophylla

teve como referência o fato dessa substância prevenir a oxidação e a polimerização

(TEIXEIRA, 2001).

Os calos não foram subculturados, pois apresentaram inicialmente crescimento

muito lento. No entanto, ao deixar os calos no meio de cultura por um período maior (90

dias) em condição de total ausência luz, houve um crescimento considerado permitindo

a passagem para a cultura de células em suspensão.

Figura 9. Calo do Eucalyptus urophylla tirada no LBM através de uma lupa binocular modelo STEMI

2000C w10x/21 455042, obtido a partir de explante foliar, após 90 dias de inoculação no meio de cultura.

O balanço hormonal entre auxina e citocinina do meio de cultura MS para

indução de calos, 2,4-D (1 mg/L) e cinetina (0,1 mg/L), respectivamente, forneceu bons

resultados para a formação de calos de

Eucalyptus urophylla,

mostrando a eficiência do

2,4-D para esta atividade, tal como citado por MURASHIGE & SKOOG (1962). Além

disso, é preciso ressaltar que no meio para indução da calogênese também havia uma

outra auxina que estava certamente contribuindo para esse balanço hormonal, o AIA (10

mg/L)

Eucalyptus urophylla

foi a espécie escolhida pela sua capacidade de

crescimento

in vitro

, suas plântulas apresentaram um bom desenvolvimento de forma

rápida, não precisando esperar muito para retirar os explantes das gemas foliares, o

período de 30 dias após a inoculação das sementes no meio de cultura foi suficiente para

a obtenção de explantes.

Um dos problemas mais freqüentes na retirada dos explantes é o fato destes não

sobreviverem quando são muito pequenos, isso porque devem ser retirados no início do

desenvolvimento da planta enquanto o tecido meristemático está bem ativo. No caso do

Eucalyptus urophylla

este problema foi resolvido pelo rápido crescimento permitindo

que os explantes fossem retirados bem jovens, porém com um tamanho (cerca de 0,5

cm) que permitiu sua sobrevivência.

Quando os calos encontraram-se com um tamanho adequado (cerca de 1 cm),

livre de contaminação e sem oxidação muito intensa, foram transferidos para o meio de

cultura MS líquido para a etapa de suspensão celular. Ao se tratar do estudo de alguns

metabólitos secundários, esta técnica tem se mostrado muito eficiente, pois possibilita a

liberação de substâncias no meio líquido.

O meio de cultura MS líquido contendo 10 mg/L de cinetina meio foi

suplementado com 2,4-D em 5 diferentes concentrações e o fungicida Benlate. A

escolha dessa auxina sintética se deu pela sua aparente habilidade de diminuir alguns

aspectos do metabolismo dos fenilpropanoídes em outras culturas estudadas (ZENK et

al., 1975; OZEKI et al., 1990).

A eficiência do 2,4-D no estudo da lignificação pode estar relacionada ao fato,

tal como observado por EBERHARDT et al., (1993), que meios de culturas

suplementados com 2,4-D favoreceram inicialmente somente a formação de parede

primária, que não é lignificada. Neste trabalho, a utilização do 2,4-D no meio líquido

mostrou que essa auxina pôde produzir quantidades baixas ou elevadas dependendo da

sua concentração, sendo este fato comprovado pelas análises realizadas no

infravermelho e no ultravioleta.

A suspensão celular foi de grande valia para o estudo do processo de lignificação

em células de

Eucalyptus urophylla

suspensas na presença da auxina sintética 2,4-D. O

meio líquido permitiu uma maior influência deste regulador de crescimento nos calos

fazendo com que houvesse o processo de lignificação que foi comprovado por análise

no infravermelho para detectar os grupos funcionais característicos da lignina, e análise

no ultravioleta, onde a concentração da lignina foi determinada em cada tratamento.

Para dar início às análises de detecção de fenóis no meio de cultura, realizou-se

o teste de Wiesner, o qual mostrou mudança de coloração para rosa-violeta indicando a

presença de fenóis nas amostras referentes aos diferentes tratamentos com 2,4-D. Com

isso, levou-se a pesquisa em diante para comprovar se havia ou não lignina nas amostras

através dos espectros no infravermelho.

4.2 Análise no infravermelho

O objetivo da análise no infravermelho foi certificar a presença de lignina nas

células em suspensão.

Quando se trata do espectro de um polímero, especialmente de produtos naturais,

pode-se concluir que dois ou mais produtos são idênticos porque seus espectros são

muito similares. No entanto, existem diferenças significantes no espectro da lignina em

função do tipo de método utilizado para o isolamento da mesma, as duas maiores

categorias podem ser reconhecidas como espectro de lignina do grupo guaiacila e do

grupo guaiacila-siringila (HERGERT, 1960).

Devido à natureza amorfa da lignina, a complexidade das unidades monoméricas

individuais, e a ordem irregular nas quais essas unidades são ligadas, não é possível

aplicar uma teoria de grupo para interpretação do espectro de lignina, entretanto, os

sinais próximos a 1230 (unidade guaiacila) e a 1360 (unidade siringila) revelaram que

as ligninas formadas possuem uma composição G:S.

Para cada tratamento foi obtido um espectro, no qual foram ressaltados os picos

que indicavam a presença de lignina (Figuras 10, 11, 12 e 13). Esses espectros foram

obtidos através de células em suspensão pré-extraídas com etanol. O tratamento 3 (4

mg/L de 2,4-D) não teve seu espectro obtido no infravermelho por ter havido perdas de

células, as quais foram utilizadas para a análise no ultravioleta para quantificação da

lignina. Essa perda do tratamento 3 ocorreu por contaminação fúngica.

Figura 10. Espectro no infravermelho de calos oriundos do tratamento 1 da suspensão (1 mg/L de 2,4-

D).

Figura 11. Espectro no infravermelho de calos oriundos do tratamento 2 da suspensão (2 mg/L de 2,4-D).

Figura 12. Espectro no infravermelho de calos oriundos do tratamento 4 da suspensão (5 mg/L de 2,4-D).

Figura 13. Espectro no infravermelho de calos oriundos do tratamento 5 da suspensão (0 mg/L de 2,4-D).

Foi possível notar que não houve muita diferença entre os espectros da lignina e

segundo a tabela de sinais de absorção no infravermelho (HERGERT, 1960), alguns

sinais são característicos da lignina, indicando de forma qualitativa, através dos

espectros, que o processo de lignificação ocorreu nas células, ou seja, indica apenas a

presença de lignina e não a sua intensidade em cada tratamento. Os sinais mais

característicos em cada tratamento estão descritos na tabela a seguir (Tabela 5).

Tabela 5.

Sinais característicos de lignina em cada tratamento.

Tratamento Sinais característicos de lignina no

infravermelho

Concentração de 2,4-D

T1 1500, 1451, 1380, 1258 1,0 mg/L

T2 1500, 1450, 1378, 1241 2,0 mg/L

T3 *

T4 1500, 1450, 1380, 1236 5,0 mg/L

T5 1500, 1518, 1422, 1320, 1241 -

Quantidade de amostra insuficiente para a realização desta análise em função da posterior

análise no ultravioleta de quantificação. O espectro não foi registrado no infravermelho devido as perdas

mencionadas no texto anterior.

O sinal de 1500 cm

-1

, presente em todos os tratamentos, confirmou a presença de

lignina em todas as amostras.

O espectro no infravermelho da lignina de Björkman de

Gallesia gorazema

como padrão, revelou a presença de vários sinais entre 3500-700 cm

-1

, dentre os quais

especial atenção foi dada àqueles localizados entre 1800 e 700 cm

-1

(ABREU &

OERTEL, 1999). Nesta região, a presença dos sinais em 1328 e 1268 cm

-1

, e suas

respectivas intensidades, justificam a existência de alta concentração de unidades

guaiacilas (ABREU, 1997).

A região de maior interesse no espectro no infravermelho é também aquela mais

comum para substâncias orgânicas em geral, compreendidas entre 4.000 e 700 cm

-1

. A

caracterização dos sinais de absorção no infravermelho se fez principalmente de modo

empírico, por comparação com dados da tabela 6, que mostra os principais sinais de

absorção no infravermelho de lignina. Os espectros também revelaram sinais de

celulose e hemicelulose.

Tabela 6.

Atribuição dos principais sinais de absorção no infravermelho de ligninas

(LIN & DENCE, 1992).

Guaiacila Guaiacila-Siringila Grupamento de origem

3425-3400 3450-3400 Deformação axial do OH.

2920-2820 2940-2835

Deformação axial de C-H aromático metílico e

metilênico.

1715 1715-1710

Deformação axial de C=O de cetonas não

conjugadas e grupos carboxílicos.

1675-1660 1660

Deformação axial de C=O de cetonas conjugadas

com anel aromático.

1605 1595 Vibrações do anel aromático.

1515 1505 Vibrações do anel aromático.

1430 1425 Vibrações do anel aromático.

1470-1460 1470-1460

Deformação angular assimétrica C-H de grupos

metila metileno.

1370 1370-1365 Deformação simétrica C-H.

1270 1275

Respiração do anel guaiacila com deformação C-

O (fenólico e metoxila).

1230 1235-1230 Deformação C-O fenólico.

1140 1143

Deformação angular C-H aromático no plano, do

tipo guaiacila.

1130

Deformação angular C-H aromático no plano, do

tipo siringila.

1125 1120

Deformação axial de C-O de álcoois secundários e

éteres alifáticos.

1035 1035

Deformação angular C-H aromático no plano, do

tipo guaiacila e deformação axial assimétrica de C-

O de álcoois primários.

970 970

Deformação angular simétrica fora do plano =C-

915

Deformação angular simétrica fora do plano C-H

aromático.

815 835

Deformação angular simétrica fora do plano C-H

aromático.

750-770 750-770

Deformação angular simétrica fora do plano C-H

aromático.

Ao analisar a tabela 7 com os sinais característicos e comparar com os sinais

encontrados nos espectros das amostras de células de

Eucalyptus urophylla

após os

tratamentos com 2,4-D na suspensão celular, foi possível identificar que existem sinais

característicos nos tratamentos indicando que houve o processo de lignificação nas

células de

E. urophylla

Tabela 7.

Regiões características de grupamentos metoxílicos no infravermelho.

Sinais característicos-

teórica cm

-1

Sinais característicos-

experimental cm

-1

Atribuição

2920-280 2700-300 Deformação de C-H

metílico

1470-1460 1450-1470 Deformação angular

assimétrico de grupos

metílicos

1330-1325 1330-1335 Anel siringila com

deformação de C-O

1275-1270 1275-1280 Anel guaiacila com

deformação de C-O

A análise no infravermelho confirmou a ocorrência do processo de lignificação

nas células de

Eucalyptus urophylla

em suspensão, porém não foi suficiente para a

verificação do melhor tratamento com 2,4-D. Para obter a informação sobre a

concentração de lignina mais adequada foi feita uma análise no ultravioleta, a qual

permitiu obter uma resposta melhor quanto a eficiência do 2,4-D por indicar a

concentração dessa auxina que produziu a maior e a menor quantidade de lignina.

4.3 Análise no ultravioleta

O ultravioleta foi de grande importância para a análise de determinação da

concentração de lignina em células de

Eucalyptus urophylla

em suspensão, pois

permitiu não só a confirmação da presença de lignina nas células como a determinação

da concentração da mesma para cada tratamento, permitindo observar qual a

concentração de 2,4-D foi mais adequada para evitar o processo de lignificação levando

em consideração que todos os tratamentos possuíam a quantidade de cinetina do meio

MS de 10 mg/L.

As amostras após terem passado pela quantificação de lignina pelo método de

BRUCE & WEST (1989) apresentaram diferenças entre si que puderam ser observadas

visualmente, pois a coloração de cada amostra foi diferente, sendo umas mais

acentuadas que as outras dando uma idéia de diferença nas concentrações (Figura 14).

Esse método também foi utilizado para extração de lignina de

Capsicum annuum

(NUÑEZ-FALENIUS & OCHOA-ALEJO, 2005).

Figura 14. Diferença de coloração entre os tratamentos da suspensão de Eucalyptus urophylla

após o método de BRUCE & WEST (1989)

Ao observar as amostras foi possível verificar que realmente houve uma relação

entre a coloração da amostra e a concentração de fenóis, notou-se que a cor das

amostras foi ficando mais escura à medida que a concentração aumenta. Para a

determinação da concentração da lignina nas células em suspensão, usou-se a lignina de

Björkman de

Gallesia gorazema

como referência nas concentrações de 150, 100, 50 e

25 mg/L (Figura 15) e a partir dela uma curva de calibração foi elaborada.

Figura 15. Soluções preparadas com lignina padrão de Gallesia gorazema (Bjorkman): curva de

calibração

T1 T2 T3 T4 T5

50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L 200 mg/L

A determinação da concentração da lignina foi obtida na absorbância de 280 nm

tal como realizado por GOULD (1982) (Tabela 8).

Tabela 8.

Valores de absorbância de cada tratamento de células de

E. urophylla

a 280

Tratamento Concentração de

2,4-D

Repetição Absorbância a 280

1 1 mg/L 1 0,5989

1 1 mg/L 2 *

1 1 mg/L 3 0,3832

2 2 mg/L 1 0,1191

2 2 mg/L 2 *

2 2 mg/L 3 *

3 4 mg/L 1 1,8716

3 4 mg/L 2 *

3 4 mg/L 3 0,8135

4 5 mg/L 1 0,3652

4 5 mg/L 2 1,2252

4 5 mg/L 3 *

5 0 mg/L 1 2,3284

5 0 mg/L 2 2,6079

5 0 mg/L 3 2,2292

Tratamento contaminado por fungo e excluído da análise

O espectro da lignina padrão de Björkman mostrou sinais em 236 nm (Figura

16). Segundo LANDIM & RUGGIERO (1999), os espectros de UV (ultravioleta) de

ligninas abrangem máximos por volta de 280 a 230 nm que é composto de sinais de

absorção de unidades fenilpropílicas, que constituem o polímero de lignina.

Figura 16. Espectro em ultravioleta de lignina padrão de Gallesia gorazema (Bjorkman) na

concentração de 150 mg/L

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

0 200 400 600 800 1000 1200

Comprimento de onda (nm)

Absorbância

Os espectros de cada tratamento foram obtidos e comparados com o espectro da

lignina padrão (Figura 17).

Figura 17. Espectros dos cinco tratamentos com diferentes concentrações de 2,4-D na suspensão celular

-0,5

0,5

1,5

2,5

0 500 1000 1500

Comprimento de onda (nm )

Absorbância

0,5

1,5

2,5

0 500 1000 1500

Com primento de onda (nm)

Absorbância

-1

0 500 1000 1500

Comprimento de onda (nm )

Absorbância

-0,5

0,5

1,5

0 500 1000 1500

Comprimento de onda (nm )

Abosrbância

-0,5

0,5

1,5

2,5

3,5

0 500 1000 1500

Com primento de onda (nm)

Aborbância

T1 T2

T3 T4

É interessante ressaltar os espectros das repetições de cada tratamento (Figura

18), isso porque em alguns casos, como nos tratamentos 4 e 5, houve uma diferença

considerável na concentração de lignina entre o tratamento e sua repetição. Embora os

espectros sejam muito semelhantes, a diferença está na absorbância de cada amostra, no

entanto o sinal característico de lignina esteja presente em todos eles.

todos eles.

Figura 18. Espectro das amostras de repetições de cada tratamento de células em suspensão de

Eucalyptus urophylla

-0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

0 500 1000 1500

Comprimento de onda (nm )

Absorbância

0,5

1,5

2,5

0 500 1000 1500

Com primento de onda (nm)

Abosrbância

-0,5

0,5

1,5

2,5

3,5

0 500 1000 1500

Comprimento de onda (nm )

Aborbância

0 500 1000 1500

Com primento de onda (nm)

Absorbância

-1

0 500 1000 1500

Com rprim ento de onda (nm )

Absorbância

T1b T3b

T4a T5a

T5b

Essa diferença dentro dos tratamentos, nas suas repetições, talvez esteja

relacionada ao fato das células utilizadas para análise no ultravioleta não serem

totalmente iguais, pois os calos não foram clonados. Cada calo foi obtido de um

explante a partir de uma semente diferente, além disso, existe o fato de que a

reprodução do

E. urophylla

ocorre através da fecundação cruzada, ou seja, pela

presença de dois genótipos diferentes, influenciando na resposta de produção de lignina

em um mesmo tratamento.

A intensidade de absorção no ultravioleta de lignina de angiosperma na região

de 280 nm depende da proporção de unidades de siringil propano (S) para guaiacil

propano (G), mas essa proporção não é eficaz para quantificar lignina. A mensuração

exata da proporção de S/G usando a análise em ultravioleta é difícil porque os valores

máximos de comprimento de onda das unidades de S e de G são similares (270 e 280

nm, respectivamente). No entanto, alguns autores têm observado mudanças na

proporção S/G a partir do espectro de absorção no UV (FERGUS & GORING, 1970;

YOSHIDA et al., 2002).

Embora a suspensão celular tenha sido realizada com diferentes tratamentos, o

comportamento dos espectros foi praticamente o mesmo nas cinco diferentes

concentrações de 2,4-D.

A curva de calibração teve um coeficiente de determinação (R

) bem

próximo de 1, isso indicou que o erro foi bem próximo de zero. A curva de calibração

apresentou uma equação que permitiu calcular a quantidade de lignina em cada

tratamento em mg/L, onde y é a absorbância a 280 nm (Tabela 9).

= 0,0119

+ 0,0355

↓ ↓

ABS [Lignina]

Tabela 9.

Concentração de lignina nas amostras de células em suspensão de

Eucalyptus urophylla

em cada tratamento

Tratamento Concentração de 2,4-D Concentração de lignina

(mg/L)

T1 1 mg/L 47,3445

T1A 1 mg/L 38,2815

T1B 1 mg/L 29,2184

T2 2 mg/L 7,0252

T2A 2 mg/L 7,0252

T2B 2 mg/L 7,0252

T3 4 mg/L 154,2941

T3A 4 mg/L

109,8361

T3B 4 mg/L 65,3781

T4 5 mg/L 27,7058

T4A 5 mg/L 99,9747

T4B 5 mg/L 63,8403

T5 0 mg/L 192,6806

T5A 0 mg/L 220,0504

T5B 0 mg/L 184,3445

A análise de variância (Tabela 10) dos efeitos dos diversos tratamentos na

concentração de lignina apresentou significância ao nível de 1% de probabilidade. Por

conseguinte, pelo teste de Tukey (Tabela 11) o tratamento 5 com 0 mg/L de 2,4-D teve

a maior concentração de lignina sendo discrepante em relação aos demais tratamentos.

O contrário ocorreu com o tratamento 2, com 2 mg/L de 2,4-D, apresentando a menor

concentração de lignina (Figura 19), que não difere estatisticamente das concentrações

1,0 e 5,0 mg/L.

Essa diferença na ocorrência do processo de lignificação mostrou ser mais

acentuada em alguns tratamentos como no T5 de forma discrepante e seguida do T4 e

T3, e a menor concentração no T2 pode ser devido ao fato da síntese e acúmulo de uma

substância específica na cultura de células depender de uma série de fatores como o

estado de diferenciação das células, a composição do meio de cultura e as condições

ambientais, entre outros, (NUÑEZ-FALENIUS & OCHOA-ALEJO, 2005) e não

somente ser influenciada pelo tipo de fitorregulador utilizado no meio.

Tabela 10.

Quadro resumo da análise de variância em função dos valores obtidos pela

quantificação da lignina no ultravioleta através da curva de calibração

FV GL QM Fc Significância

Tratamento 4 16739.41

22.540

0.00005

Resíduo 10 742.6538

FV: Fator de Variação

GL: Grau de Liberdade

QM: Quadrado médio

Fc: Calculado

Tabela 11.

Teste de médias (Tukey) realizado com as concentrações de lignina para

cada tratamento

Tratamento Médias Concentração de

2,4-D

5 199,0252

0,0 mg/L

3 109,8361

4,0 mg/L

4 63,8403

5,0 mg/L

1 38,2815

1,0 mg/L

2 7,0252

2,0 mg/L

Nota: Valores seguidos de mesma letra não diferem entre si ao nível de 5% de significância.

Figura 19. Concentrações de lignina em função dos diferentes tratamentos de 2,4-D

Esse resultado foi possível devido a análise no ultravioleta, haja visto que a

relação entre concentração e absorbância é diretamente proporcional, segundo a Lei de

LAMBERT & BEER (USP, 2007).

As concentrações de lignina não foram proporcionais a concentração da auxina

2,4-D, pois a maior quantidade de lignina foi obtida na ausência deste fitorregulador, o

contrário ocorreu no tratamento 2, uma concentração mediana entre todos os

tratamentos testados, em que a concentração de lignina foi mínima. Considerando que

os tratamentos 3, 4 e 1 foram iguais estatiscamente, achou-se melhor comparar apenas o

tratamento 5 com o tratamento 2 comprovando o fato de que a auxina sintética 2,4-D

impediu a formação de fenilpropanoídes, de lignina. Esse fato também foi observado

por EBERHARDT et al., (1993) ao trabalhar com

Pinus taeda

100

150

200

250

T5 T3 T4 T1 T2

Diferentes tratamentos com 2,4-D

Concentração de Lignina

(mg/L)

5 CONCLUSÕES

O protocolo para o estudo da lignificação em cultura de células de

Eucalyptus

urophylla

em suspensão consiste do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)

líquido modificado para suspensão suplementado com auxina sintética 2,4-D sem

antioxidantes.

A análise no infravermelho permitiu estimar a presença de unidades siringila e

guaiacila na lignina das células de

Eucalyptus urophylla

A concentração mais adequada de 2,4-D para atenuar o processo de lignificação

em cultura de células em suspensão de Eucalyptus urophylla é de 2,0 mg/L, a qual

produziu 7,0 mg/L de lignina na solução obtida para realização na análise do

ultravioleta.

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