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UFRRJ
INSTITUTO DE FLORESTAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS
E FLORESTAIS
DISSERTAÇÃO
Avaliação da morfologia e lignificação de calos de Eucalyptus grandis
(Hill ex Maiden) sob efeito de cinetina e ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Hulda Rocha e Silva
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE FLORESTAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS E
FLORESTAIS
Avaliação da morfologia e lignificação de calos de Eucalyptus grandis
(Hill ex Maiden) sob efeito de cinetina e ácido 2,4-diclorofenoxiacético
HULDA ROCHA E SILVA
Sob a Orientação do Professor
Heber dos Santos Abreu
Seropédica, RJ
Setembro de 2007
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências, no Curso de Pós-
Graduação em Ciência
s Ambientais e
Florestais, Área de Concentração em
Tecnologia e Utilização de Produtos
Florestais.
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE FLORESTAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS E AMBIENTAIS
HULDA ROCHA E SILVA
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências, no Curso de Pós-graduação em Ciências Ambientais e Florestais, área de
Tecnologia e Utilização de Produtos Florestais.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM -----/-----/------
---------------------------------------------------------------------
Heber dos Santos Abreu Prof. Dr. UFRRJ
(Orientador)
--------------------------------------------------------------------
Selma Ribeiro de Paiva Profª. Drª. UFF
--------------------------------------------------------------------
Jorge Mitiyo Maeda Prof. Dr. UFRRJ
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus e ao Mestre Jesus, pela apoio e amor incondicional,
sempre me fortalecendo nos momentos de desânimo e angústia.
Aos meus pais e fámilia, pelo carinho e incentivo de sempre, em todas as etapas da minha
vida.
Ao meu namorado e amigo Bruno Carvalho e sua família, pelo amor, ajuda e na elaboração
deste trabalho.
Ao meu orientador Professor Heber dos Santos Abreu, por todos estes anos de orientação, e
pela chance de subir mais este degrau.
Aos meus grandes amigos Julia, Henrique, Etiene, Sâmara e Alda pelo incentivo e palavras
de conforto, sempre mostrando novas possibilidades, quando as coisas parecem não ter
solução.
Aos meus grandes amigos e colegas do Laboratório de Biotecnologia da madeira Deise,
Kelly, Beatriz, Regina, Daniel e Bruno, pela ajuda e amizade que me dedicaram neste anos
de convívio. Agradeço em especial, a amiga e bolsista do laboratório Deise, que
acompanhou este trabalho do inicio ao fim, pessoa incrível, sem a qual não finalizaria este
trabalho.
Ao professor Maeda, pela disposição e boa vontade em ajudar nas análises estatísticas e
interpretação das mesmas.
Ao Professor Lelis, pela compreensão e paciência diante das circunstâncias em que se
desenvolveu este trabalho.
Aos meus grandes amigos Itamar, Marília, Conceição e Leonardo pelo apoio e incentivo
constantes para que eu finalizasse este trabalho.
Aos meus grandes amigos e colegas de trabalho Anida, Lucélia, Levi e Marcelo pelo apoio
e compreensão, pelos momentos em que tive que me ausentar do trabalho para que fosse
possível a conclusão deste curso de mestrado.
A CAPES pela bolsa que me foi concedida e FAPERJ pelo financiamento desta pesquisa.
E por fim, porém não com menor importância, agradeço imensamente a esta Universidade
maravilhosa que me recebeu e acolheu com tanto amor durante tantos anos. Me ensinou a
ser e viver melhor, lugar sem o qual jamais teria aprendido tão bem a amar e respeitar meus
semelhantes. MUITO OBRIGADA RURAL!!!!!!!MINHA ETERNA RURAL!!!!!!
RESUMO
SILVA, Hulda Rocha. Avaliação da morfologia e lignificação de calos de Eucalyptus
grandis (Hill ex Maiden) sob efeito de cinetina e ácido 2,4-diclorofenoxiacético,. 2007.
61f. Dissertação. (Mestrado em Ciências Ambientais e Florestais). Instituto de Florestas,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ.
Nesta pesquisa foi testada a influência dos reguladores vegetais 2,4-D e cinetina na
morfologia, desenvolvimento e intensidade de lignificação em células de calos de
Eucalyptus grandis. A partir de explantes de plântulas de E. grandis germinadas in vitro,
foram desenvolvidos calos. Estes calos foram passados para tratamentos contendo
concentrações distintas de 2,4-D e cinetina, num total de 25 tratamentos com 5 repetições.
Após 60 dias de cultivo, os calos foram analisados sob os seguintes aspectos: tamanho,
nível da oxidação, número de calos desenvolvidos, número de calos rizogênicos e
intensidade de lignificação. A oxidação foi mais intensa em balanços favoráveis tanto para
a cinetina, quanto para o ácido 2,4-D, quando os balanços foram equilibrados surgiram
calos friáveis. A formação de calos rizogênicos ocorreu do forma intensa na presença
somente da 2,4-D (µM 11.325) em concentrações altas ou em balanços favoráveis ao 2,4-D
(11.325 cinetina do µM do µM /4.65). A lignificação das células dos calos ocorreu de
forma mais intensa no tratamento com balanço µM 11.35 do µM 2,4-D/4,65 do cinetina.
Espectofotomêtro ultravioleta foi usado para determinação de lignina a 280 nm. Os
espectros foram registrados em amostras tratadas previamente em ácido tioglicólico. Os
resultados mostraram que calos tratados em 11,325 µM e 4,65 µM de cinetina tiveram os
mais altos níveis de lignificação.
Chave de Palavras: Eucalyptus grandis, calo, lignina
ABASTRACT
SILVA, Hulda Rocha. Evaluation of the morphology and lignification in calli of
Eucalyptus grandis (Hill ex Maiden) under effect of Kinetin e 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid. 2007. 61f. Dissertation (Master in Environment and Forest
Science). Instituto de Florestas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica,
RJ.
In this research was tested the influence of the growth regulators (kinetin and 2,4-
dichlorophenoxyacetic (2,4-D)) on the morphology, development and intensity of
lignification of Eucalyptus grandis calli. The calli were obtained from explants originated
of the plants in vitro produced. Those calli were transferred to an experiment with 25
treatments in distinct combinations between kinetin and 2,4-D, with 5 repetitions for each
treatment. After 60 days of calli culture all material were analyzed under the following
aspects: size, level of oxidation, number of calli, number of rooted calli and lignification.
The oxidation showed inversely proportional in agreement with the balances for kinetin and
2,4-D. On equals balanced conditions none oxidation was verified. Rooted calli occurred
with intensively in presence of 2,4-D (11.325 µM) only, and in high concentrations as well
as in favorable balances to 2,4-D (11.325 µM /4.65 µM kinetin). The lignification of the
calli was more intense in the treatment with 11.35 µM of 2,4-D/4.65 µM of kinetin.
Ultraviolet spectrometric was used for lignin determination at 280 nm. The spectra were
registered from samples treated previously with thioglycolic acid. The results showed that
calli treated with balanced concentrations between 2,4-D and Kinetin (11.325 µM /4.65
µM), have the highest lignification levels.
Key words: Eucalyptus grandis, calli, lignin.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição do meio MS modificado para germinação e desenvolvimento
de plântulas de E. grandis ( WATT et al., 1991).
16
Tabela 2. Meio MS modificado para formação de calos de E. grandis
(WATT et al., 1991)
18
Tabela 3. Tratamentos obtidos pelas combinações de 2,4-D e cinetina testadas nos meios
de cultura
19
Tabela 4. Absorbância média por tratamento 21
Tabela 5. Tratamentos que apresentaram calos de E. grandis com maior crescimento 23
Tabela 6. Tratamentos que apresentaram calos de E. grandis com menor crescim 23
Tabela 7. Tratamentos que induziram formação de calos rizogênicos em E. grandis 28
Tabela 8. Tratamentos testados evidenciando os tratamentos perdidos 29
Tabela 9.
Resumo da análise da variância dos dados obtidos em função da concentração
de lignina por tratamento
29
Tabela 10.
Teste de comparação de médias Duncan a 5% de probabilidade para concentração
de lignina
30
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Médias dos tamanhos dos calos nos diferentes tratamentos 22
Figura 2. Análise da variável crescimento de calo nos diferentes tratamentos 24
Figura 3. Análise da variável oxidação e friabilidade 26
Figura 4. Análise do nível de oxidação dos calos de E. grandis 27
Figura 5. Relação entre os tratamentos que induziram calos rizogênicos e número de
calos rizogênicos por tratamento.
27
Figura 6. Análise da variável característica dos calos
28
Figura 7. Teste de comparação de médias Duncan a 5% de probabilidade para
lignificação
30
Figura 8. Relação entre a concentração média de lignina por tratamento em mg/L e
Tamanho médio dos calos em cm
33
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2
2.1 O eucalipto 2
2.2 Lignina 4
2.3 Cultura de Tecidos Vegetais 7
2.4 Hormônios Vegetais 10
2.5 Cinetina 12
2.6 2,4-D (Ácido diclofenociacético) 13
2.7 Interação Cinetina/2,4-D
14
3 MATERIAIS E MÉTODOS
16
3.1 Preparo do meio de cultura para germinação e desenvolvimento de plântulas de
E. grandis
16
3.2 Desinfestação e inoculação das sementes 17
3.3 Preparo do meio de cultura para formação de calos 17
3.4 Cultura e sub-cultura de calos 18
3.5 Transferência dos calos para os diversos tratamentos 19
3.6 Determinação do teor de lignina 20
3.7 Delineamento experimental
21
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
22
4.1 Crescimento do calo para os diferentes tratamentos 22
4.2 Quantidade de calos formados para os diferentes tratamentos 24
4.3 Friabilidade e oxidação para os diferentes tratamentos 25
4.4 Quantidade de calos rizogênicos para os diferentes tratamentos 27
4.5 Lignificação x Tratamentos 28
4.6 Tamanho dos calos e Lignificação 32
4.7 Friabilidade e oxidação para Lignificação 33
5 CONCLUSÕES
34
6 BIBLIOGRAFIA
35
7 ANEXOS
45
Anexo I- Análises estatísticas para concentração de lignina por tratamento
46
Anexo II- Análises estatísticas para tamanho dos calos nos diferentes tratamentos
53
1
1 INTRODUÇÃO
Espécies vegetais têm sido cada vez mais estudadas, numa busca constante por
cadeias produtivas eficientes com produtos de alta qualidade, além da necessidade de
trazerem o rótulo da sustentabilidade ambiental. É neste contexto que ocorre o encaixe
perfeito da biotecnologia vegetal, pois se trata de um conjunto de técnicas que visam
otimizar processos produtivos e promover simultaneamente situações menos agressivas
ambientalmente.
Desta forma, biotecnologias apropriadas seriam aquelas que contribuem com o
desenvolvimento sustentável por: a) serem tecnicamente factíveis no atual contexto de
desenvolvimento técnico-científico do país; b) proporcionarem benefícios mensuráveis aos
destinatários; c) serem ambientalmente seguras, sócio-economicamente e culturalmente
aceitáveis no atual estágio de desenvolvimento do país (GUERRA & NODARI, 2006).
As espécies florestais como as do gênero Eucalyptus, e mais especificamente a
espécie Eucalyptus grandis, por ser a mais plantada no Brasil atualmente (SOUZA et al.,
2004), são muito estudadas no âmbito da biotecnologia florestal, o que se deve
especialmente à rapidez de crescimento e qualidade da madeira que produzem.
A madeira é um dos produtos mais requeridos no mercado. A expectativa de
aumento de consumo da madeira para a próxima década é de aproximadamente 20%, e para
suprir esta demanda, reduzindo simultaneamente a pressão sobre a vegetação nativa faz-se
necessária a obtenção de árvores mais produtivas, resistentes a fatores bióticos e abióticos e
com madeira de alta qualidade, de acordo com a finalidade do uso (ANDRADE et al.,
2006).
O processo de formação da madeira é bastante complexo e envolve muitos eventos
biológicos, que são coordenados por uma série de fatores endógenos (fitohormônios) e
exógenos (fotoperíodo e temperatura) e pela interação de ambos (ANDRADE et al., 2006).
A síntese da lignina, uma das substâncias de maior importância na composição da madeira,
e outras características da madeira merecem uma maior compreensão sobre os fatores que
as influenciam.
Assim, a cultura de células e tecidos surge como uma ferramenta importante para
contribuir no entendimento da influência destes fatores endógenos e exógenos no processo
2
de formação da madeira. Além da oportunidade de desenvolvimento de protocolos para uso
nos mais diversos fins nesta área do conhecimento.
Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo analisar, em ambiente
controlado, a influência dos reguladores vegetais cinetina e 2,4-D (ácido
diclorofenoxiacético) na morfologia, desenvolvimento e intensidade de lignificação de
células de calos de Eucalyptus grandis (Hill ex Maiden), e desenvolver protocolos para
cultura de calos desta espécie.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O Eucalipto
As espécies florestais são de grande importância para a economia, pois oferecem
uma ampla gama de produtos, como madeira para construção, biomassa para a produção de
polpa de celulose e papel, assim como uma série de subprodutos para a indústria de
cosméticos, farmacêutica, alimentícia, etc. (GUIMARÃES et al., 2001). Uma das
características mais desejadas em espécies florestais é uma alta produtividade relacionada
com o crescimento acentuado do tronco, produto mais importante para as indústrias
madeireira e de celulose e papel (GUIMARÃES et al., 2001).
Além da madeira e da celulose, os plantios florestais podem oferecer outros
produtos, como resinas, óleos essenciais e medicamentos, além de colaborarem para o
seqüestro de carbono e contribuírem para a conservação das florestas naturais (SOARES et
al., 2003).
Por tais razões, espécies florestais vêm sendo selecionadas ao longo do tempo pelos
programas de melhoramento, para a obtenção de genótipos mais produtivos, com melhores
características florestais, melhor adaptadas a diferentes condições edafoclimáticas e com
resistência a estresses bióticos e abióticos (GUIMARÃES et al., 2001).
No Brasil, as plantações florestais são compostas, principalmente por espécies de
híbridos e clones de eucalipto (Eucalyptus spp.) e de pinheiro (Pinus spp.), cuja área
3
plantada é de 4,8 milhões de hectares, em especial nos estados de Minas Gerais, São Paulo,
Bahia, Rio Grande do Sul, Paraná e Santa Catarina (MORA & GARCIA, 2000).
O gênero Eucalyptus pertence à família Myrtaceae (ANDRADE, 2006), que é um
dos gêneros predominantes da flora australiana, estendendo-se das áreas subalpinas às
florestas úmidas costeiras, às florestas temperadas e à zona mais árida da Austrália
(JÚNIOR, 2004).
O gênero Eucalyptus cobre a maior área dos reflorestamentos no mundo. Desde que
a madeira de eucalipto passou a ser usada para a produção de celulose e papel, fato ocorrido
na Europa, por volta de 1919, muitas espécies vêm ganhando crescente importância e
tornando-se mundialmente expressivas (JÚNIOR, 2004).
Existem mais de 700 espécies de eucalipto em sua área de ocorrência natural,
porém, somente um pequeno número tem sido utilizado pela indústria. A diversidade de
espécies, que é fator importantíssimo sob a ótica do melhoramento florestal e da seleção de
materiais, permite considerar o eucalipto como potencial fornecedor de uma madeira bem
definida para a produção de múltiplos produtos (TRUGILHO et al., 2007). Essas diversas
espécies de eucalipto possuem em média a seguinte composição química da madeira: 40-62
% de celulose, 12-22 % de hemicelulose e 15-25 % de lignina (HILLIS & BROWN, 1978).
O estudo qualitativo e quantitativo de seus constituintes químicos pode levar à obtenção de
vários outros produtos, tais como as resinas (TRUGILHO et al., 2007 apud SANTOS &
CURVELO, 1999).
O grande número de espécies deste gênero, a grande plasticidade ecológica e a sua
excelente produção, tornou-o matéria-prima de inúmeras indústrias florestais, o que
permitiu um rápido avanço no conhecimento silvicultural e tecnológico de muitas de suas
espécies (FINGER et al., 1993). Além do aproveitamento da madeira como fonte
energética, é usado também para a fabricação de celulose, aglomerado, construção civil e
outros (SCHNEIDER et al, 1996).
A utilização do eucalipto na produção de celulose e papel, a partir dos anos 40,
transformou essa árvore na principal matéria-prima das indústrias do setor (GONZÁLEZ et
al., 2002). A indústria brasileira de papel e celulose tem crescido rapidamente nas últimas
décadas, tornando-se, na década de 90, a sétima maior produtora de celulose, e décima
primeira em produção de papel (ANDRADE, 2006).
4
Nos países onde o eucalipto é plantado comercialmente, sua produtividade é
altamente variável, em função das condições ambientais, da espécie utilizada, da origem ou
procedência do propágulo vegetal e seu grau de melhoramento, do tipo de manejo e
controle dos fatores do meio (JÚNIOR, 2004).
O eucalipto apresenta-se como grande alternativa para produção de madeira nos
próximos anos, e a indústria já aposta na sua disponibilidade para os futuros suprimentos de
matéria-prima (SOARES et al., 2003). No Brasil, a madeira de espécies do gênero
Eucalyptus vem se constituindo em uma das principais fontes de matéria-prima para as
indústrias de base florestal devido, mais uma vez, a sua alta capacidade de adaptação em
diferentes ambientes (TRUGILHO et al., 2007).
Entretanto, espécies de crescimento rápido como o eucalipto, apresentam
determinados obstáculos quanto as suas utilizações, o que justifica investimentos em busca
de soluções capazes de otimizar tecnologicamente a utilização no mais amplo espectro do
mercado consumidor (ABREU et al., 2003).
No Brasil, o Eucalyptus grandis é a espécie florestal mais plantada (SOUZA et al.,
2004), pois, possui excelente resposta silvicultural, como boa forma e rápido crescimento,
além de propriedades desejáveis para usos múltiplos da sua madeira (TOMASELLI, 2000).
Sem falar nas condições favoráveis de clima, solo e a grande oferta de áreas para o plantio,
que fazem do Brasil um dos mais promissores mercados mundiais desta espécie (BIZI et
al., 2005).
O Eucalyptus grandis ocorre naturalmente em solos aluviais ou de origem
vulcânica, nos vales e planícies ao longo da costa leste australiana, estendendo-se até o
limite de Queensland-Nova Gales do Sul (JÚNIOR, 2004). Suas principais utilizações são:
produção de celulose e papel, painéis de fibra e aglomerado, combustível industrial e
doméstico e produtos de serraria (SOARES et al., 2003).
A cultura de tecidos apresenta-se como um método alternativo na propagação de
Eucalyptus grandis e outras espécies do gênero Eucalyptus, por ser uma técnica mais
segura, graças ao maior controle dos fatores envolvidos (HIGASHI et al., 2002).
Entretanto, na propagação in vitro das diversas espécies do gênero Eucalyptus, a grande
variação genotípica em resposta aos meios de cultura constitui importante fator. Isto requer
maiores estudos sobre cultura de tecidos do gênero
. Para tanto, torna-se necessário, dentre
5
outros fatores, conhecer os hormônios vegetais e seu modo de ação (GUIMARÃES et al.,
2001).
2.2 Lignina
A formação da madeira é um processo biológico fundamental com interesse
econômico significativo, visto que a madeira é o quinto maior produto do mercado mundial
(ANDRADE et al., 2006 apud PLOMION et al., 2001). Sua constituição baseia-se
fundamentalmente em componentes macromoleculares: celulose, hemicelulose e lignina,
presentes em porcentuais variáveis (MORAIS et al., 2005).
Depois da celulose, a lignina é o polímero orgânico mais abundante no reino
vegetal (BACHA, 2006), exceto nos vegetais primitivos como fungos, algas e liquens, que
não são lignificados (FENGEL & WEGENER, 1989). Apesar disto, sua modalidade de
síntese e muitos pontos relativos principalmente à sua estrutura, permanecem em dúvida
(DAVIN & LEWIS, 2005; SALIBA et al., 2001), o que não tira o mérito da compreensão
relativamente boa que se tem até o momento.
Atualmente, o paradigma aceito para a estrutura da lignina é que a macromolécula
está presente na madeira na forma de uma rede polimérica tridimensional não cristalina
(SANTOS, 2001). As ligninas são substâncias muito complexas de difícil caracterização
(CARBALLO, 1990), o que se deve à complexidade de sua formação, baseada em unidades
fenilpropanóides interligadas por diferentes tipos de ligações, e também porque sofrem
modificações estruturais durante seu isolamento das paredes celulares (MORAIS, 1992).
Pesquisadores dividem a lignina em três grupos: ligninas de gimnosperma, formadas
pela desidrogenação enzimática do álcool coniferil; ligninas de angiospermas formadas pela
combinação dos álcoois coniferil e sinapil, e lignina de gramíneas, formadas pela
desidrogenação dos álcoois coniferil, sinapil e p-cumaril (GLASSER, 1980).
Ao processo de deposição da lignina nos tecidos vegetais dá-se o nome de
lignificação. A lignificação é um processo bioquímico que abrange a biossíntese de
monolignóis, seu transporte e a polimerização na parede celular. Inicialmente é altamente
mediada por enzimas relacionadas à formação dos precursores nos compartimentos
citoplasmáticos (MONTEIRO et al., 2004).
6
As propriedades aglutinantes da lignina dão consistência fibrosa às madeiras,
revestindo as células do xilema, onde realizam função mecânica de sustentação
(BROWNING, 1967). Além disso, são muito resistentes a hidrólise (HIGUCHI, 1980).
A lignina é detectada em maior quantidade na parede secundária de células,
sobretudo das fibras, vasos e traqueídeos do xilema, dotando-os de rigidez, suporte
mecânico e impermeabilidade, permitindo o transporte de água e solutos (GUIMARÃES et
al., 2001). Ocorre também, em menor quantidade, no periderma associado à suberina onde
age como uma barreira contra patógenos (GUIMARÃES et al., 2001).
Uma rápida deposição de substâncias fenólicas ou de lignina nos sítios de infecção é
considerado um mecanismo de defesa contra o ataque de patógenos (MENZIES et al.,
1991). Desta forma, a lignina resiste ao ataque da maioria dos microrganismos, e mesmo o
processo anaeróbico não tende a atacar todo o anel aromático (LACERDA, 2001), o que faz
da presença da lignina um fator limitante para a degradação da parede celular (JUNG &
VOGEL, 1986).
Segundo MARSCHNER (1986), a resistência pode, particularmente, ser aumentada
por mudanças nas respostas das plantas aos ataques de organismos, aumentando a
lignificação e a síntese de substâncias tóxicas. Tais barreiras físicas, ou mecânicas, incluem
mudanças na anatomia, como células epidérmicas mais espessas e um grau maior de
lignificação (FIORI, 2006).
A lignina também é essencial em diversos processos biológicos, como assegurar a
existência de vias rápidas de circulação de água e minerais, além de propiciar a resistência
necessária para manter a verticalidade do caule principal (ABREU et al., 1999).
A lignificação na parede de células do xilema se dá pela polimerização de
monolignóis sobre uma matriz de substâncias pécticas, microfibrilas de celulose e
hemicelulose formadas anteriormente à deposição da lignina
(
TERASHIMA et al, 2004).
À medida que a planta cresce, se intensifica o processo de lignificação
(ALBRECHT et al., 1987), seguindo uma concentração decrescente da base ao topo
(BUXTON & HORNSTEIN, 1986).
A composição da lignina varia significativamente entre espécies, dentro da espécie e
até mesmo numa única planta, pois há variações de célula para célula de acordo com a
localização da parede celular, conforme o estágio de desenvolvimento da célula e do tecido,
7
e ainda com a influência de estresses ambientais (CAMPBELL & SEDEROFF, 1996;
SALIBA, et al., 2001). Observou-se em eucalipto cultivado na Europa e no Brasil
diferenças na constituição de suas ligninas, devidas, principalmente, às diferentes condições
de solo e de clima (SALIBA et al., 2001).
Tal diversidade também é observada ao se comparar, por exemplo, gramíneas e
leguminosas, quando se observa os efeitos do envelhecimento dos tecidos vegetais
(AMAN, 1993). As gramíneas apresentam um menor teor de lignina que as leguminosas;
no entanto a lignina de gramíneas inibe de forma mais intensa a digestão animal (JUNG,
1989). Além disto, a lignina das leguminosas apresenta-se numa forma mais condensada
(GORDON, 1975).
A pesquisa de DAY et al. (2005), com linhaça (Linum usitatissimum L), sugere que
num mesmo individuo os teores e a composição de lignina mudam em suas diferentes
partes. Assim, provavelmente a lignina presente no caule é diferente da existente na folha
(SAVIOLI & FUKUSHIMA, 2000).
Nutrientes como o boro interfere na síntese de lignina pela formação de complexos
de boratos com certos fenóis, regulando a taxa de fenóis livres e aumentando os fenóis
precursores da síntese de lignina. Portanto, a deficiência de boro nas plantas tem acarretado
menores teores de lignificação (LEWIS, 1980).
Em estudos realizados com Picea abies e com Solanum gilo Raddi, obeservou-se
que deficiência de Ca
2+
desacelera o processo de formação da parede celular, o que se deve
principalmente a diminuição da deposição da lignina e de outros polissacarídeos não
celulósicos (KÄRKÖNEN, 2001 apud MARSCHNER 1986; FIRMINO et al., 2006).
LEE et al. (2007), estudando a relação entre teor de lignificação e estresse hídrico
induzido em trevo branco (Trifolium repens L.), constatou que tal estresse levou a um
aumento das enzimas envolvidas na lignificação. Tal resultado, pode explicar por que
CHRISTIERNIN (2006) observou uma variação no teor de lignina na espécie Populus
balsamifer de acordo com as estações do ano, já que no verão a deposição de lignina no
tecido cambial ocorreu de forma mais intensa.
Algumas características da madeira podem ser influenciadas pela lignificação, por
exemplo, a tensão (PILATE et al., 2004) e compressão (FOSKET, 1994). O surgimento
8
das tensões de crescimento está ligado diretamente à lignificação das paredes celulares
(BOYD, 1972).
O entendimento da formação da lignina e de sua estrutura química parte da
premissa que sua formação deve ser entendida ainda na fase celular, procurando identificar,
através de várias técnicas os fatores que levam a este fenômeno de imensa importância para
as plantas superiores. Uma série de ferramentas tem sido testadas, entre elas a utilização de
cultura de tecidos, observando a influência de uma variada classe de substâncias
(fitorreguladores) e condições ambientais no processo de lignificação.
2.3 Cultura de tecidos vegetais
A cultura de tecidos vegetais compreende um conjunto de técnicas que tem como
princípio o isolamento de um explante (célula, tecido ou um órgão) e seu cultivo sob
condições de plena assepsia, em um meio nutritivo artificial (COSTA, 2006 apud
PASQUAL, 1997).
O sistema de cultura de tecidos vegetais é geralmente utilizado como base no estudo
dos vários processos fisiológicos, bioquímicos, genéticos e estruturais relacionados às
plantas (PASQUAL et al., 1998). Este sistema oferece muitas vantagens, dentre as quais
destacam-se: obtenção de tecidos assépticos, oportunidade de inocular qualquer substância
de forma uniforme em todas as células ao mesmo tempo e produção de material em
quantidade suficiente para análises bioquímicas (KÄRKÖNEN, 2001). Entretanto,
nenhuma destas vantagens se sobrepõe à possibilidade de investigar efeitos fisiológicos de
nutrientes, hormônios vegetais e outros constituintes químicos em células produzidas em
meio de cultura definido e condições ambientais controladas (KÄRKÖNEN, 2001).
Além de tudo, técnicas de cultura de tecidos possibilitam uma multiplicação mais
rápida quando comparadas a outras técnicas de propagação assexuada e também são
consideradas como um pré-requisito para futuros estudos de engenharia genética
(LACORTE, 1991).
O crescimento e o padrão de desenvolvimento da maior parte dos cultivos in vitro
estão diretamente relacionados com a composição do meio e a concentração dos
reguladores de crescimento presentes no meio (CORDEIRO et al., 2004). O meio nutritivo
9
deve estar de acordo com a exigência da planta, porém, o fator chave da multiplicação é a
presença dos reguladores de crescimento vegetal, particularmente citocininas e auxinas
(CORDEIRO et al., 2004 apud GASPAR et al., 1996). As citocininas e auxinas são os
reguladores de crescimento mais utilizados na cultura de tecidos (CALDAS et al., 1990).
Entre os meios de cultura utilizados, o meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) é
o mais usado (SILVA et al., 2006). Entretanto, é importante destacar que, para cada tipo de
célula, há a necessidade de se empregar um meio de cultura específico, que contenha,
adequadamente, os nutrientes e agentes indutores necessários ao desenvolvimento das
células (COSTA, 2006), pois são os meios nutritivos que fornecem as substâncias
essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de
desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998).
Além da composição dos meios de cultura, as condições físicas de incubação, como
a temperatura, umidade, qualidade e duração do período de luz, e o próprio genótipo do
material vegetal cultivado, influem sobre a morfogênese dos tecidos vegetais (GEORGE &
SHERRINGTON, 1984).
A propagação de plantas através da cultura de tecidos tem sido realizada pelo
emprego das culturas de calos, órgãos, células e protoplastos (HIGASHI et al., 2000).
A formação de calos a partir de um explante é denominada calogênese
(VENTURIERI & VENTURIERI, 2004
).
O calo corresponde a uma massa de células
desorganizadas e parcialmente indiferenciadas que variam quanto ao tipo, tamanho,
conteúdo celular e espessura da parede (FLORES et al., 1998), ou seja, é um tecido amorfo
e desorganizado, formado pela intensa atividade de células vegetais (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998).
Para que haja a indução de calo, qualquer tecido vegetal pode ser utilizado como
explante (FLORES et al., 1998). Entretanto, procura-se utilizar explantes que contenham
maior proporção de tecido meristemático ou que apresentem maior capacidade de expressar
a totipotência (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Em geral, induz-se a formação de calos, a partir de explantes cultivados em meio de
cultura contendo auxina, ou com alta relação auxina/citocinina (RIOS, 2004).
A cultura de calo é uma ferramenta biotecnológica extremamente importante. Na
embriogênese somática indireta, a calogênese é uma etapa essencial (FRANCO et al.,
10
2006). A calogênese se divide em três etapas: indução, divisão celular e diferenciação
(STAFFORD & WARREN, 1991)
.
A terceira fase, a diferenciação celular, é onde ocorre a
formação dos produtos do metabolismo secundário (AITCHISON,1977).
Na cultura de tecidos, mais especificamente na indução de calos, são enfrentados
diversos problemas, dentre os quais se destacam a oxidação fenólica e a contaminação.
A oxidação ocorre devido à formação de substâncias fenólicas in vitro, dentre as
quais encontra-se os precursores da lignina, pelo tecido injuriado ou senescente de
essências nativas, especialmente as tropicais, pois possuem alta concentração desses
componentes fenólicos (GEORGE & SHERRINGTON, 1984).
Nas plantas lenhosas, acumulam-se polifenóis e produtos de oxidação, como
melanina, suberina, lignina, cutina e calose em torno da superfície excisada, os quais
modificam a composição do meio de cultivo e a absorção de metabólitos (ANDRADE et
al., 2000).
Por tais motivos, in vitro, a oxidação constitui um dos principais problemas
enfrentados no início do estabelecimento e durante o cultivo de explantes de espécies
lenhosas (COSTA, 2006). Assim, explantes vegetativos da maioria das espécies arbóreas,
são de difícil crescimento e diferenciação in vitro (ANDRADE, 2006). Segundo
ANDRADE et al. (2000), a ocorrência de fenóis, pode estar ligada a processos de regulação
de crescimento, especialmente com as auxinas que, dependendo da concentração endógena
no tecido, resulta na indução dessas substâncias. Além das auxinas, foi observado que em
segmentos nodais de aroeira a presença da citocinina BAP (6-benzilaminopurina),
favoreceu o processo de oxidação fenólica (ANDRADE et al., 2000).
Para inibir ou diminuir a oxidação fenólica, deve-se ter maiores cuidados na
manipulação do explante para evitar danos físicos e químicos no momento da excisão e
desinfestação. A adição de substâncias antioxidantes, como cisteína e ácido ascórbico, além
de adsorventes, como carvão ativado e PVP, também pode ser decisiva na prevenção à
oxidação, a qual é mais acentuada nas fases iniciais de cultivo.
FRANCO et al (2006), estudando a espécie florestal caixeta (Didymopanax
morototoni), observou que ao utilizar a combinação dos reguladores cinetina (0,1 e 1,0
mg/L) e 2,4-D (1,0 e 5,0 mg/L) obteve calos claros e friáveis depois de 20 dias de cultura,
fato que o autor atribui também ao cultivo em ambiente livre de luz.
11
A contaminação por microrganismos é considerada um problema grave, podendo
chegar, inclusive, a ser um fator limitante para o estabelecimento de cultivo in vitro de
certos explantes (RIBAS et al., 2003). Os microorganismos contaminantes competem com
os explantes pelos nutrientes do meio de cultura e provocam danos diretos e indiretos pela
colonização de seus tecidos, podendo eliminar no meio metabólitos tóxicos às plantas
(MONTARROYOS, 2000).
2.4 Hormônios Vegetais
Hormônios vegetais constituem um grupo de ocorrência natural, substâncias
orgânicas que influenciam em processos fisiológicos a baixas concentrações (MONTANS,
2007). Biomoléculas, responsáveis por uma infinidade de importantes eventos nas plantas,
desde a divisão celular, no interior de um tecido, até os fenômenos mais externos e
tangíveis, como o alongamento do caule, floração, frutificação, produção de borracha, entre
outros (VALOIS, 2000).
Estas substâncias controlam o metabolismo, o crescimento e a morfogênese de
plantas superiores por meio de sinais transmitidos de uma parte a outra da planta (TAIZ &
ZEIGER, 2004). Tais sinais funcionam como "mensageiros químicos", influenciando em
muitas partes do desenvolvimento da planta (HARTMANN et al., 1988).
Assim como nos animais, o desenvolvimento das plantas é fundamentalmente
controlado por substâncias reguladoras de crescimento (PERES, 2002). Contudo, raramente
os hormônios vegetais agem sozinhos, mesmo quando uma resposta no vegetal é atribuída à
aplicação de um único regulador, o tecido vegetal que recebeu a aplicação possui
hormônios endógenos que influenciam nas respostas obtidas (CATO, 2006).
O primeiro grupo de hormônios vegetais descoberto pelo homem foi o das auxinas,
que são responsáveis pelo crescimento das plantas, e influenciam diretamente nos
mecanismos de expansão celular (ECHER et al., 2006).
Estes compostos orgânicos podem ser naturais ou sintéticos, e em quantidades
muito pequenas, impedem ou modificam de alguma forma processos morfológicos e
fisiológicos da planta (CASTRO & VIEIRA, 2001). Uma única molécula de hormônio
pode disparar um aumento na concentração de muitas outras moléculas, as quais por sua
12
vez produzem mudanças de desenvolvimento dentro da célula (RAVEN et al., 2001). Um
mesmo hormônio pode produzir respostas diversas em tipos diferentes de tecidos ou em
diferentes fases do desenvolvimento em um mesmo tecido (SALISBURY E ROSS, 1969).
São chamados de reguladores ou biorreguladores vegetais, os hormônios (sejam eles
naturais ou sintéticos) que quando aplicados exogenamente possuem ações similares aos
grupos de hormônios vegetais conhecidos (citocininas, giberelinas, ácido indolil acético,
etileno e outros) (VIEIRA E CASTRO, 2002). Já a mistura de dois ou mais reguladores
vegetais ou reguladores vegetais com outras substâncias (aminoácidos, nutrientes,
vitaminas) é chamada de estimulante vegetal ou bioestimulante (MONTANS, 2007).
Entretanto, é mais adequado considerar os hormônios como reguladores químicos, e não
apenas estimulantes (RAVEN et al., 2001). É importante ressaltar que mesmo os
reguladores artificiais apresentam propriedades químicas semelhantes a dos hormônios
vegetais naturais (TOMBOLATO & COSTA, 1998).
O uso de reguladores é uma prática já difundida principalmente em países com
pequena extensão territorial, onde se faz necessário o uso de tecnologia para a obtenção de
maiores produtividades e de produtos de melhor qualidade (GARCIA, 2006).
O emprego de fitorreguladores como técnica agronômica para otimizar produções
em diversas culturas, tem crescido nos últimos anos (NETO et al., 2004). Para tanto, são
inúmeras as pesquisas realizadas sobre a interferência de reguladores vegetais na
agricultura, destacando-se as áreas de floricultura, de olericultura e de fruticultura
(KLAHOLD et al., 2006).
Os biorreguladores atuam de forma ativa nos processos endógenos da planta, como
complemento ou antagonicamente a tais processos, induzindo respostas, que podem ser
economicamente interessantes (GARCIA, 2006). Desempenham papéis importantes no
desenvolvimento das culturas comerciais, como uniformização da germinação, controle do
desenvolvimento vegetativo, aumento da fixação de flores e frutos e antecipação ou atraso
da maturação (CATO, 2006). Os efeitos destas substâncias sobre as plantas cultivadas, têm
sido pesquisados com a intenção de melhorar qualitativa e quantitativamente a
produtividade das culturas (ALLEONI et al, 2000). Por exemplo, a imersão de sementes em
soluções com reguladores vegetais pode induzir a quebra de dormência, uniformidade na
emergência e modificações morfológicas e fisiológicas das plântulas (CASTRO et al.,
13
1985). A dormência pode ser resultado do balanço hormonal entre promotores e inibidores
de crescimento (WEAVER, 1987).
Os fitorreguladores também são extremamente importantes na cultura de tecidos, já
que o tipo e a concentração destas substâncias no meio de cultura, são fatores determinantes
no crescimento e padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura in vitro
(CALDAS et al., 1998), uma vez que são considerados como os componentes mais críticos
adicionados ao meio de cultura (PERES, 2002).
A escolha do fitorregulador a ser utilizado na cultura in vitro, dependerá do tipo de
morfogênese desejada, de seu nível endógeno no explante no momento da excisão, da
capacidade do tecido sintetizar o regulador durante o período de cultura, e da possível
interação entre os hormônios vegetais endógenos e aqueles adicionados ao meio (SANTOS,
2003).
Estas substâncias são facilmente transportadas para células responsivas, onde estão
diretamente envolvidos com o controle da atividade gênica em nível de transcrição e de
tradução, em um grande número de processos (GUERRA et al., 1999). Células responsivas
são aquelas que possuem sensibilidade, ou seja, possuem competência para responder a um
sinal específico (TREWAVAS, 1981). Os fitohormônios exercem sua ação através do
reconhecimento de receptores específicos presentes em células responsivas, traduzindo
sinais hormonais em eventos bioquímicos e fisiológicos (GUERRA et al., 1999).
Entretanto, se o tecido não está em um estádio responsivo, este não irá responder
adequadamente aos reguladores de crescimento exógenos, não importando em quais
concentrações e combinações esses reguladores são utilizados (ALVES et al., 2004).
O processo de formação da madeira está amplamente ligado aos sinais bioquímicos
dos hormônios controlados por uma biblioteca de genes. Como por exemplo, a participação
dos hormônios vegetais no controle do processo da xilogênese (ZIMMERMANN &
BROWN, 1971).
Na maioria dos casos, os efeitos desejáveis da aplicação dos reguladores vegetais
ocorrem na utilização prática, porém, com entendimento ainda insuficiente do amplo modo
de ação ou processos fisiológicos envolvidos (MONSELISE, 1979).
2.5 Cinetina
14
As citocininas pertencem a uma classe de hormônios associados ao crescimento e
desenvolvimento das plantas, participando no controle da divisão celular, alongamento
celular, crescimento e senescência foliar (NISHIMURA et al., 2004), além de favorecerem
a produção de calo embriogênico (CHÉE & CANTLIFFE, 1988).
Elas podem estimular ou inibir uma variedade de processos metabólicos,
fisiológicos e bioquímicos em plantas superiores (CATO, 2006). Em experimentos com
cultura de tecido, a citocinina estimulou a divisão celular controlando a diferenciação dos
elementos xilemáticos (DALESSANDRO & ROBERTS, 1971).
As citocininas são uma das classes de reguladores de crescimento mais utilizados na
cultura de tecidos (CALDAS et al., 1990), por possuírem grande capacidade de promover
divisão celular atuando no ciclo celular, participando no processo de diferenciação celular e
alongamento, principalmente quando interagem com as auxinas (KLAHOLD et al., 2006).
As citocininas estimulam o crescimento pela expansão mais do que pelo alongamento
(STOYNOVA et al., 2004).
O efeito das citocininas em cultura de tecidos ou órgãos pode variar de acordo com
a substância utilizada, o tipo de cultura, a variedade da planta e da idade do tecido que deu
origem ao explante (ANDRADE, 2006).
Cinetina (KIN), benziladenina (BA) e 6-benzilaminopurina (BAP) são as citocininas
ocasionalmente utilizadas (KRIKORIAN et al., 1990).
Esta pequena molécula denominada cinetina, é derivada da adenina (ou
aminopurina) (TAIZ E ZEIGER, 2004). A cinetina está envolvida na regulação do
crescimento e diferenciação, incluindo a divisão celular, dominância apical, formação de
órgãos, retardamento da quebra de clorofila, desenvolvimento dos cloroplastos, senescência
das folhas, abertura e fechamento dos estômatos, desenvolvimento das gemas e brotações,
metabolismo dos nutrientes e como reguladores da expressão dos genes (VIEIRA &
MONTEIRO, 2002). Aplicações de cinetina podem desencadear a formação de gemas
laterais a partir da dominância apical (TEIXEIRA & MARBACH, 2000).
Em suspensão celular de soja foi mostrado que a zeatina não foi efetiva, que a
benziladenina foi adequada e que a cinetina teve ótimo efeito na formação de embriões
somáticos (PHILLIPS & COLLIN, 1981).
15
Em plantas de manjericão (Ocimum basilicum), tratadas com cinetina, houve maior
taxa de crescimento durante todo o desenvolvimento, enquanto nos tratamentos com outros
reguladores, os resultados foram semelhantes à testemunha (BARREIRA et al., 2006).
2.6 2,4-D (Ácido Diclorofenoxiacético)
As auxinas são sintetizadas nos ápices caulinares, ramos e raízes e transportadas
para outras regiões da planta, sendo caracterizadas, principalmente, pela capacidade de
estimular o alongamento celular, mas também como responsável pela formação inicial das
raízes, diferenciação vascular, tropismo, desenvolvimento de gemas axilares, flores e frutos
(CATO 2006). A primeira aplicação prática da auxina envolve seu efeito promotor na
iniciação de raízes adventícias (RAVEN et al., 2001).
As auxinas desempenham importante papel na junção dos traços vasculares de
folhas em desenvolvimento (RAVEN et al., 2001). Entre os hormônios, a auxina é
certamente a principal classe de hormônio na diferenciação do floema e do xilema
(WARREN & WARREN, 1984).
Em testes com as auxinas ANA (ácido naftaleno acético), AIB (ácido indol-
butírico), AIA (ácido indol acético) e 2,4 –D (ácido diclorofenoxiacético), observou-se a
inibição da formação de embriões (AYUB & GEBIELUCA, 2003). Entretanto, GUERRA
et al. (1999) afirmam que as auxinas estão envolvidas com a indução e a iniciação de
embriões somáticos, e que em muitas espécies, o processo de iniciação se verifica quando
se cultiva o explante em meio com concentração relativamente alta de 2,4-D.
Como auxina, o ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) é um dos mais
freqüentemente utilizados (KRIKORIAN et al., 1990), principalmente em cultura de
tecidos, para indução do calo, e em culturas em suspensão (GASPAR et al., 1996). A
indução da calogênese ocorre em meio com altas concentrações de auxinas
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990), e o 2,4-D é um dos reguladores de crescimento
mais eficazes na indução de calos (AMMIRATO, 1983).
Na verdade, alguns pesquisadores citam que elevados níveis de auxina no meio
promovem desdiferenciação das células e diminui a formação de metabólitos secundários
em algumas culturas, efeito especialmente demonstrado pelo 2,4-D (RAMACHANDRA &
16
RAVISHANKAR, 2002). Em Ipomoea batatas, culturas submetidas a 2,4-D por longos
períodos retiram a capacidade dos embriões se converterem em plantas (GUERRA et al.,
1999).
Os efeitos do 2,4 D também têm sido observados na redução da queda pré-colheita
de frutos (BARROS & RODRIGUES, 1993).
2.7 Interação Cinetina/2,4
D
Dentre os fatores que regulam o processo germinativo, a presença de hormônios e o
equilíbrio entre eles, promotores e inibidores, exercem um papel fundamental (CATO,
2006).
Auxinas, citocininas e interações auxinas/citocininas são consideradas, geralmente,
como sendo as mais importantes para a regulação do crescimento e desenvolvimento
organizado em culturas de células, tecidos e órgãos de plantas, e essas duas classes de
hormônios são geralmente requeridas (GASPAR et al., 1996). Segundo DAVIES (1987), as
citocininas apresentam grande habilidade na indução da divisão celular em culturas de
tecido, juntamente com as auxinas. Para o estabelecimento de um efetivo controle no
crescimento e na diferenciação das culturas in vitro, é preciso um balanço ideal entre
auxinas e citocininas (ANDRADE, 2006).
Além da relação auxina/citocinina, o tipo e a concentração de auxina ou citocinina
também afetam dramaticamente tanto o crescimento como a formação de metabólitos em
cultivo in vitro de plantas (RAMACHANDRA & RAVISHANKAR, 2002). As
concentrações mais utilizadas destes hormônios, normalmente, giram em torno de 0,5 e 5,0
mg/L (AYUB & GEBIELUCA, 2003).
Por meio do uso da razão entre citocinina e auxina pode-se obter calos, raízes ou
ramos. Essa possibilidade de regeneração de plantas a partir de calos é uma ferramenta
biotecnológica comumente utilizada nos dias de hoje para a seleção de plantas com
resistência à seca, estresse por sais, patógenos, herbicidas, etc. (SALISBURY & ROSS,
1992).
Na presença de certas concentrações de citocininas e auxinas as células mantêm-se
indiferenciada (SALISBURY & ROSS, 1969). TAKAHASHI (2002), observou que em
17
meios com razões intermediárias de auxina/citocinina ocorre proliferação celular
desorganizada, como calos.
Auxinas e citocininas atuam sinergicamente para regular divisão celular e
antagonicamente para controlar a formação de gemas e raízes laterais, sugerindo múltiplos
mecanismos de interação (CATO, 2006 apud COENEN & LOMAX, 1997).
Em cultura de tecidos de Tabebuia caraíba, a formação de calos foi favorecida
quando explantes foliares foram encubados em meio MS suplementado com 1,0 mg/L de
2,4-D e 0,2 mg/L de cinetina (LIMA & CAETANO, 2002).
Em segmentos de caule excisado de ervilha também foi observado um efeito
sinérgico de cinetina e auxina na xilogênese (SOROKIN et al., 1962).
Estes dados confirmam a Teoria do Balanço Hormonal, segundo a qual a formação
de calos é favorecida pela combinação de pelo menos uma auxina e uma citocinina
(CALDAS et al., 1990).
3 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia da Madeira do
Departamento de Produtos Florestais do Instituto de Florestas da Universidade Federal Rural
do Rio de Janeiro (UFRRJ).
As sementes usadas para o desenvolvimento das plântulas, que serviram como
fonte de explantes, foram adquiridas no IPEF (Instituto de Pesquisa e Estudos Florestais) da
Escola Superior de Agricultura Luís de Queiroz (ESALQ) Universidade de São Paulo
(USP). Essas sementes foram coletadas no Pomar de sementes por Mudas, Talhão A11A21
do IPEF na cidade de Anhembi, Estado de São Paulo.
3.1 Preparo do meio de cultura para germinação e desenvolvimento de plântulas de
E. grandis
18
Para o desenvolvimento de mudas de E. grandis, foi utilizado meio de cultura MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) modificado para a germinação de sementes e
desenvolvimento de plântulas de E.grandis (Tabela 1) (WATT et al., 1991).
Tabela 1. Composição do Meio MS modificado para germinação e desenvolvimento de
plântulas de E. grandis (WATT et al., 1991).
Macronutrientes
mg/L
Micronutrientes
mg/l Vitaminas mg/L
hormônios µM
(NH
4
)NO
3
1.650
MnSO
4
. 4H
2
O 22,3 myo-inositol 100
AIA
5,71
KNO
3
1.900
ZnSO
4
. 7H
2
O 8,6 ácido nicotínico 5
cinetina 0,2325
CaCl
2
440 H
3
BO
3
6,2 piridoxina. hcl 5
BAP
0,4884
KH
2
PO
4
170 KI 0,83 tiamina. hcl 10
ANA
21,48
MgSO
4
370 NaMoO
4
. 2H
2
O 0,25 biotina 0,1
Ferro
CuSO
4
. 5H
2
O 0,025
pantotenato de
cálcio
0,1
Outros
mg/L
FeSO
4
. 7H
2
O 27,8 CoCl
2
. 6H
2
O 0,025 glicina
2,0 sacarose 30.000
Na
2
EDTA 33,6
Benlate 100
Ágar 7.000
Os componentes do meio de cultura foram pesados em balança de precisão e
colocados em Becker de 1000mL contendo aproximadamente 200mL de água
bidesionizada. O meio foi mantido em agitação contínua para a dissolução dos
componentes e sua completa homogeneização. Depois de colocados todos os componentes
do protocolo, o volume de água foi completado até atingir 1000 mL. A solução foi mantida
em agitação por aproximadamente 10 minutos, e após esse período foi realizada a aferição
do pH, que foi ajustado para 5,7. Em seguida, foi acrescentado ao meio o agar-agar (Vetec),
que foi aquecido até atingir fervura. Após a fervura o meio de cultura foi distribuído em 30
frascos de vidro transparente, próprios para germinação (30 mL por recipiente com tampa
transparente). Os recipientes contendo o meio de cultura foram esterilizados em autoclave
por 30 minutos.
19
Após a esterilização, os frascos foram levados para a capela de fluxo laminar e
ficaram em presença de radiação ultravioleta por 30 minutos. Após esse período seguiu-se a
inoculação das sementes.
3.2 Desinfestação e inoculação das sementes
As sementes de E. grandis foram inicialmente submetidas a uma solução de
hipoclorito de sódio 2,5% por 10 minutos em presença de 0,2 ml/L de tween 20. Em
seguida as sementes foram escorridas em peneira inox forradas com papel filtro e lavadas
5 vezes em água bidesionizada estéril, para garantir a total retirada do hipoclorito de
sódio. Em seguida, as sementes foram imersas em peróxido de hidrogênio 1% por 30
minutos. Decorrido esse período as sementes foram lavadas e seguiram-se as práticas de
inoculação das semente em meio de cultura para germinação e desenvolvimento de
plântulas de E. grandis.
Em capela de fluxo laminar, as sementes foram inoculadas no meio de cultura
preparado como descrito na Tabela 1. Foram colocadas de cinco a dez sementes por
recipiente. Após 21 dias da inoculação das sementes em fotoperíodo de 16 horas a 25
o
C,
as plântulas geradas no meio asséptico, foram usadas como fonte de explantes.
3.3 Preparo do meio de cultura para formação de calos
Para a formação de calos de Eucalyptus grandis foi utilizado meio de cultura MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962) modificado (Tabela 2) (WATT et al., 1991). Os
procedimentos para preparação deste meio são idênticos aos procedimentos de preparação
do meio para germinação e desenvolvimento de plântulas de E. grandis.
Tabela 2. Meio MS modificado para formação de calos de Eucalyptus grandis (WATT et al., 1991)
Macronutrientes
mg/L
Micronutrientes
mg/l Vitaminas mg/L hormônios
µM
(NH
4
)NO
3
1.650
MnSO
4
. 4H
2
O 22,3 myo-inositol 100
AIA
5,71
KNO
3
1.900
ZnSO
4
. 7H
2
O 8,6 ácido nicotínico 5
cinetina 46,5
20
CaCl
2
440 H
3
BO
3
6,2 piridoxina. hcl 5
2,4-D
4,53
KH
2
PO
4
170 KI 0,83 tiamina. hcl 10
MgSO
4
370 NaMoO
4
. 2H
2
O 0,25 biotina 0,1
Outros
mg/L
Ferro
CuSO
4
. 5H
2
O
0,02
5
pantotenato de
cálcio
0,1
PVP
anti-
oxidante
800
FeSO
4
. 7H
2
O 27,8 CoCl
2
. 6H
2
O
0,02
5
glicina
2,0 sacarose 30.000
Na
2
EDTA 33,6
Benlate 100
Ágar 8.000
3.4 Cultura e sub-cultura de calos
Em capela de fluxo laminar os explantes foram inoculados em meio MS para
indução de calos. Com o auxílio de pinça e bisturi esterilizados em estufa e autoclave,
foram retiradas as gemas apicais de cada plântula germinada. Essas gemas apicais foram
usadas como explantes para formação de calos.
Em cada recipiente foram inoculados três explantes. Os recipientes foram
mantidos em ausência de luz à temperatura de 25
o
C. Para garantir a ausência de luz os
recipientes foram enrolados em papel alumínio. Após o período de três semanas o calo
que apresentou menor nível de oxidação, maior friabilidade (capacidades de soltar células
com facilidade) e maior tamanho foi dividido em fragmentos menores (0,3 cm
aproximadamente). Esses fragmentos foram repicados e distribuídos em dez recipientes,
contendo meio de cultura renovado e em ausência de luz. A cada duas semanas o meio de
cultura foi renovado, no total de duas sub-culturas. O procedimento de repicar o material
de um único clone foi para garantir que genótipos diferentes não iriam interferir nos
tratamentos aplicados posteriormente. Experimentos com fotoperíodo foram descartados,
tendo melhores resultados, quanto á oxidação, em ausência total de luz.
3.5 Transferência dos calos para os diversos tratamentos
21
Em capela de fluxo laminar os calos, obtidos de um único clone, foram novamente
repicados e distribuídos (três fragmentos de calos por recipiente) nos meios de cultura
suplementados com diferentes combinações de concentrações dos reguladores de
crescimento 2,4-diclorofenoxiacético e cinetina (Tabela 3). Para efeito de testemunha
foram usadas as concentrações de 0 µM de ácido 2,4 – D e cinetina 0 µM.
Tabela 3. Tratamentos obtidos pelas combinações de 2,4-D e cinetina testadas nos meios de
cultura
2,4D/CINETI
NA (µM)
0
2,325
4,65
11,625
23,25
4,53
T1
4,53/0
T2
4,53/2,32
T3
4,53/4,65
T4
4,53/11,62
T5
4,53/23,25
11,325
T6
11,32/0
T7
11,32/2,32
T8
11,32/4,65
T9
11,32/11,62
T10
11,32/23,25
22,65
T11
22,65/0
T12
22,65/2,32
T13
22,65/4,65
T14
22,65/11,62
T15
22,65/23,25
45,30
T16
45,53/0
T17
45,53/2,32
T18
45,53/4,65
T19
45,53/11,62
T20
45,53/23,25
90,60
T21
90,60/0
T22
90,60/2,32
T23
90,60/4,65
T24
90,60/11,62
T25
90,60/23,25
Os recipientes permaneceram em ausência de luz à temperatura de 25
o
C. Após
duas semanas, os calos foram sub-culturados em meio de cultura renovado. Foram
realizadas três sub-culturas, totalizando 60 dias. Decorrido esse período, os calos foram
retirados do meio de cultura e passados para placas de petri para serem mensurados. Com
auxilio de régua milimétrica, os calos foram medidos para avaliações comparativas. Em
seguida, foi avaliada a variável intensidade de oxidação, onde uma escala de 1 a 5 foi
utilizada, onde: 1= ausência de oxidação; 3= calos parcialmente oxidados e 5= calos
totalmente oxidados (FLORES et al., 2000), além de avaliação de presença e ausência de
raiz nos calos em cada tratamento. Por último, o material foi avaliado quanto ao teor de
lignina.
3.6 Determinação do teor de lignina
22
A determinação de lignina foi realizada de acordo com o método de BRUCE &
WEST (1989). Assim, 1g de calo fresco de cada amostra foi pesado e triturado em 25 ml de
etanol 80% com molfariz, depois o material foi centrifugado a 20.000 rpm por 20 minutos a
25
o
C em uma centrífuga (high speed) de marca Sigma, transferido para placas de petri e
seco à temperatura ambiente.
Depois do material seco, pesou-se 50 mg de cada amostra e transferiu-se para tubos
de vidro, onde foram adicionados 5 ml de HCL 2N e 0,5 ml de ácido tioglicólico. Os tubos
foram fechados e aquecidos em uma estufa a 100
o
C por quatros horas. Em seguida o
material foi esfriado e depois centrifugado a 30.000 rpm por 20 minutos a 4
o
C. O
sobrenadante foi descartado e o material depositado no fundo dos tubos foi lavado uma vez
com 5 ml de água biodesionizada. Este material foi suspenso em 5 ml de NaOH 0,5 N e
agitado lentamente a 25
o
C por 18 horas em um shaker para eliminação do tioglicolato de
lignina. Após as 18 horas, as amostras foram novamente centrifugadas a 30.000 rpm por 20
minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi transferido para tubos testes, onde 1 ml de HCL foi
adicionado. O material ficou em repouso por 4 horas a 4
o
C, e depois foi centrifugado a
30.000 rpm por 20 minutos. O material sólido foi dissolvido em 10 ml de NaOH 0,5N. A
determinação foi realizada utilizando um espectrômetro de ultra violeta em comprimento de
ondas de 280 nm.
O aparelho utilizado para realizar as análises no ultravioleta foi o UV mini 1240 –
UV-Vis spectrophotometer – Shimadzu. Uma curva de calibração foi elaborada com
amostra padrão de lignina de Bjorkman, esta curva teve um coeficiente de determinação
bem próximo de 1 (R
2
=0,8412), o que indica um erro bem próximo de zero. Por meio da
curva de calibração obteve-se a equação abaixo, que possibilitou o calculo da quantidade de
lignina a partir da absorbância de cada amostra (Tabela 4) em mg/L:
ABS:K1.C+K0
ABS=absorbância
K1=0,005094
K0=0,023669
C=Concentração de lignina
23
Tabela 4. Absorbância média por tratamento
Tratamento Absorbância média Tratamento Absorbância média
1 0,7478 12 0,4902
2 0,6888 13 0,3932
4 0,632 14 0,4954
5 0,6452 15 0,385
7 0,7388 16 0,513
8 0,8046 17 0,6034
9 0,3788 18 0,4222
10 0,741 19 0,6314
11 0,478 20 0,6322
3.7 Delineamento Experimental
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 5 (cinco)
repetições, sendo cada unidade experimental constituída por 5 (cinco) frascos próprios para
indução de calos em meio de cultura, contendo três segmentos clonais cada. Utilizou-se um
esquema fatorial 5x5, sendo considerados como fatores, as concentrações do ácido 2,4
diclorofenoxiacético (4,53; 11,32; 22,65; 45,30; 90,60 µM) e cinetina (0; 2,32; 4,65; 11,62;
23,25 µM), perfazendo-se 25 tratamentos. As avaliações foram realizadas após 60 dias de
cultivo, considerando-se as seguintes variáveis: número de calos desenvolvidos por
recipiente, crescimento dos calos (cm), usando-se como parâmetro a maior distância
longitudinal, intensidade de oxidação, presença de raiz e concentração de lignina. Para
a variável intensidade de oxidação, uma escala de 1 a 5 foi utilizada, sendo: 1= ausência de
oxidação; 3= calos parcialmente oxidados e 5= calos totalmente oxidados (FLORES et al.,
2000). Para as variável presença de raiz fez-se uma correlação entre os tratamentos que
apresentaram raiz e as respectivas concentrações de cinetina e ácido 2,4-D. Para análise
dos dados, fez-se uso das equações de regressão utilizando o programa estatístico SAEG
(Anexos I e II).
24
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise de variância para os diferentes tratamentos, mostrou diferenças
significativas para algumas características analisadas. Os resultados demonstraram uma
diferença significativa para a variável crescimento, no aspecto de friabilidade, oxidação e
concentração de lignina. Vale ressaltar, que além das concentrações dos reguladores 2,4-D
e cinetina em cada tratamento, estava presente em todos os tratamentos o regulador de
crescimento Ácido Indolácetico (AIA), na concentração de 5,71 µM.
4.1 Crescimento do calo para os diferentes tratamentos
Nos tratamentos em que as concentrações de ácido 2,4–D foram superiores às
concentrações de cinetina, observou-se um maior crescimento dos calos. O tratamento 21,
onde se obteve calos maiores, estava presente apenas o 2,4-D. A Figura 1 relaciona os
tratamentos com as médias dos tamanhos dos calos de cada tratamento e separa as médias
em grupos representados pelas letras a, b e c de acordo com teste de Kruskal-Wallis a 5%.
ab ab
ab b
b
b
ab
ab
abab
ab
c
ab
ab
a a
b
ab
b
b
bc
ab
ab ab
b
ab
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Tratamentos
Tamanho dos calos (cm)
25
Figura1.
Médias dos tamanhos dos calos nos diferentes tratamentos. Médias com letras
iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis a 5%.
Os melhores resultados para a variável crescimento de calos tiveram crescimento
médio de calos superior a 1,0 cm e foram obtidos com os protocolos, cujas concentrações
são observadas na Tabela 5.
Tabela 5.
Tratamentos que apresentaram calos de
E. grandis
com maior crescimento
N
o
Tratamento
2,4-D
µM
Cinetina
µM
T(21)
a
90,6 0
T(19)
a
45,3 11,625
T(16)
ab
45,3 0
T(20)
ab
45,3 23,25
T(15)
ab
22,65 23,25
T(11)
ab
22,65 0
T(22)
ab
90,6 2,325
Nota: Letras distintas significam que os tratamentos diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade.
Os resultados menos expressivos para a variável crescimento de calos, podem ser
observados na Tabela 6.
Tabela 6-
Tratamentos que apresentaram calos de
E. grandis
com menor crescimento
N
o
Tratamento 2,4-D
µM
Cinetina
µM
T(05)
b
4,53 23,25
T(25)
b
90,6 23,25
T(04)
b
4,53 11,625
T(10)
b
11,325 23,25
T(02)
b
22,65 2,325
T(12)
b
4,53 2,325
26
T(24)
b
90,6 11,625
Nota: Letras distintas significam que os tratamentos diferem entre si pelo teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade.
A Figura 2 compara o tamanho entre os calos obtidos em alguns dos tratamentos
testados.
Figura 2.
Análise da variável crescimento de calo nos diferentes tratamentos. (A) calos
desenvolvidos nas concentrações dos tratamentos: T 21, T 19 e T 5, respectivamente. (B)
calo formados em presença de T15, e (C) calos formados em presença de T16. (D) calos
desenvolvidos em presença de T 21 e T 5; verificam-se ambos os tratamentos com três
calos desenvolvidos. (E) calo formado em condição de T 24 e (F) comparação dos
tamanhos de calos formados em condição de T 5 e T 15.
LIMA & CAETANO (2002), encontraram resultados semelhantes a este trabalho,
em cultura de tecidos de
Tabebuia caraíba,
onde
a
formação de calos
foi favorecida quando
explantes foliares foram inoculados em meio MS suplementado com 4,53 µM.
de ácido 2,4-
D e 0,93 µM de cinetina, indicando que há uma resposta favorável ao crescimento e
desenvolvimentos de calo em balanços hormonais onde as concentrações de auxina são
A
B
C
D
E
F
27
superiores às de citocinina. SOUZA (2007) também encontrou resultado favorável no
desenvolvimento de calo de
E. urophylla
quando o balanço 2,4-D/Cinetina foi favorável ao
2,4-D. Até mesmo em cultura de calos de mandioca (
M. esculenta
Crantz), obteve-se bons
resultados na formação de calos na combinação auxina e citocinina ( LIMA et al
.,
2002).
4.2 Quantidade de calos formados para os diferentes tratamentos
Para o número de calos desenvolvidos por recipiente, os resultados demonstraram
que não houve diferença significativa a 5% de probabilidade, para as diferentes
concentrações de reguladores de crescimento testadas nos protocolos. Todos os tratamentos
desenvolveram, em média, três calos por recipiente. No tratamento testemunha, em que a
concentração de cinetina e ácido 2,4-D era 0 µM., não houve formação de calos, indicando
que apenas a presença do regulador de crescimento Ácido Indol-acético (AIA) na
concentração de 5,71 µM não é o suficiente para o desenvolvimento de calo de
Eucalyptus
grandis
nas condições experimentadas. CALDAS et al., (1998), reforçam a eficiência do
2,4-D e ressaltam a ineficácia do AIA na indução de calos. Mesmo nos tratamentos onde
estava presente apenas o regulador 2,4-D em concentrações mais baixas (4,53 µM.L
-1
. L
-1
),
houve indução de calogênese, evidenciando que a presença, de pelo menos mais este
regulador vegetal, ainda que em pequenas quantidades é essencial para que haja calogênese
de
E. grandis.
Entretanto, LIMA et al. (2002) estudando o efeito dos reguladores vegetais BAP E
ANA em cultivo
in vitro
de mandioca (
Manihot esculenta
Crantz), observou o crescimento
de calos partindo de explantes de segmentos caulinares a partir dos 14 dias de cultivo,
mesmo na ausência de reguladores vegetais.
Os resultados encontrados neste trabalho discordam, em parte, de
GRATTAPAGLIA & MACHADO, (1990), e AMMIRATO (1983), que descrevem que a
indução da calogênese ocorre em meio com altas concentrações de auxinas; uma vez que os
resultados demonstraram que mesmo em concentrações baixas (4,53 µM.L), a auxina foi
capaz de induzir a formação de calos. Segundo PONCHIA & GARDIMAN (1993), o uso
associado de uma citocinina e uma auxina pode levar a bons resultados de multiplicação.
28
4.3 Friabilidade e oxidação para os diferentes tratamentos
Para as variáveis friabilidade e oxidação, apesar do material ter sido cultivado
totalmente em ausência de luminosidade, níveis variados de oxidação foram observados nos
calos provenientes de diferentes concentrações dos reguladores de crescimento. Foi
observado que os calos formados utilizando os protocolos em que as concentrações de
ácido 2,4-D e cinetina eram praticamente iguais, os calos apresentaram-se friáveis e com
coloração predominante branca. Concentrações altas de ácido 2,4-D induziram a formação
de calos maiores, porém, apresentando-se parcialmente ou totalmente oxidados e menos
friáveis, concordando com RAMACHANDRA & RAVISHANKAR (2002), que
observaram que elevados níveis de auxina ácido 2,4-D no meio promovem formação de
metabólitos secundários em algumas culturas. No trabalho desenvolvido por PATNAIK et
al. (1997) níveis elevados de 2,4-D aumentaram consideravelmente a friabilidade de calos
embriogênicos de
Cymbopogon martinii.
GIRI, et al
.
(1993), no entanto, afirmam que a
presença de ácido 2,4-D no meio de cultura está associado a uma maior oxidação do tecido.
Concentrações mais elevadas de cinetina em relação ao ácido 2,4-D também
induziram a formação de calos oxidados e de difícil desagregação. Neste experimento, os
calos que apresentaram resultados menos favoráveis para estas características, foram os
calos cujos meios de cultura foram suplementados com balanços favoráveis tanto para a
cinetina, quanto para o ácido 2,4-D, enquanto balanços mais equilibrados favoreceram a
formação de calos friáveis e menos oxidados (Figura 3). PALÚ et al. (2004), estudando
Acaiá Cerrado (
Coffea arabica
L.), também conseguiram calos de boa qualidade pela
interação entre 2,4-D (9,06 µM) e cinetina (8,835 µM) em proporções muito próximas entre
os hormônios.
29
Figura 3.
Análise da variável oxidação e friabilidade . (A) calo formado em presença de T
5. A coloração mais escura indica maior oxidação e menor friabilidade. (B) calo formado
em presença de T4. (C) calo formado em presença de T19. (D) calo formado em presença
de T15. Nota-se que, entre os tratamentos, este foi o que apresentou melhores resultados,
com calos mais claros e mais friáveis.
Os níveis de oxidação de 1 a 5 baseados na metodologia de FLORES et al. (2000)
são relacionados a cada tratamento na Figura 4.
A
B
C
D
30
y = 0,0255x
2
- 0,5823x + 6,5
R
2
= 0,4484
0
1
2
3
4
5
6
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
00
:0
0
Relação 2,4-D / Cinetina
Nível de Oxidação
Figura 4.
Análise do nível de oxidação dos calos de
E. grandis.
Nível de oxidação
variando de 1 a 5, (1) calo não oxidado, (3)
calo parcialmente oxidado e (5) calo
totalmente oxidado.
4.4 Quantidade de calos rizogênicos para os diferentes tratamentos
Pelos resultados analisados foi possível observar que nos meios de cultura
suplementados com elevadas concentrações de 2,4-D, alguns calos rizogênicos de
E.
grandis
foram formados (Figura 5 e 6).
y = -0,0714x
2
+ 1,1857x - 1,4
R
2
= 0,902
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00 00:00
Relação 2,4-D / Cinetina
Número de calos rizogênicos
20/0 10/0 5/0 2,5/0 1/0 20/0,5 20/1 10/1 20/2,5 5/1 10/2,5 2,5/1 1/0,5 1/1 2/5 1/2,5 1/5
0
/0 1/1 2,5/1 2,5/0 10/0 20/1
31
Figura 5
. Relação entre os tratamentos que induziram calos rizogênicos e número de
calos rizogênicos por tratamento.
Figura 6.
Análise da variável característica dos calos (formação de raízes). (A) calo
formado em condição deT6; (B) calo formado em condição de T8; e (C) calo formado em
condição de T 16. As setas indicam a presença de raiz formada em cada tratamento.
Estes resultados coadunam com a afirmação de KRIKORIAN (1990), que verificou
que quando o nível de citocinina em relação ao de auxina é alto, ocorre à formação de
brotos e na situação oposta, pode ocorrer a formação de raízes. Quando as proporções são
aproximadamente iguais, uma massa de calo é produzida.
Os Tratamentos que desenvolveram calos com raízes estão descritos na Tabela 7.
Tabela 7
. Tratamentos que induziram formação de calos rizogênicos em
E. grandis
N
o
Tratamento 2,4-D
µM.
Cinetina
µM.
T(06) 11,325 0
T(08) 11,325 4,65
T(16) 45,3 0
T(23) 90,6 4,65
4.5 Teor de lignina para os diferentes tratamentos
Durante a etapa de determinação da lignina, foram perdidos 7 tratamentos em
decorrência de pressão e posterior rachadura nos tubos durante a centrifugação. Os
tratamentos perdidos foram: T(3), T(6), T(21), T(22), T(23), T(24), T(25) (Tabela 8). Dessa
forma para manter o trabalho em andamento todos os pontos discutidos que envolvam a
A
B
C
32
lignificação foram baseados apenas em dezoito tratamentos, e não em vinte e cinco como
nos itens anteriores.
Tabela 8
. Tratamentos testados evidenciando os tratamentos perdidos
2,4D/CINETINA
(µM. L
-1
)
0
2,325
4,65
11,625
23,25
4,53
T1
4,53/0
T2
4,53/2,325
*
T4
4,53/11,625
T5
4,53/23,25
11,325
*
T7
11,35/2,325
T8
11,35/4,65
T9
11,35/11,625
T10
11,35/23,25
22,65
T11
22,65/0
T12
22,65/2,325
T13
22,65/4,65
T14
22,65/11,625
T15
22,65/23,25
45,3
T16
45,3/0
T17
45,3/2,325
T18
45,3/4,65
T19
45,3/11,625
T20
45,3/23,25
90,6
*
*
*
*
*
*representam os tratamentos perdidos durante a extração da lignina.
Durante as análises estatísticas, os dados foram submetidos ao teste de Teste de
Lilliefors, onde inicialmente não apresentaram normalidade. Os dados foram transformados
e novamente submetidos ao teste, desta vez apresentando normalidade. Em seguida foi
realizada a análise de variância, onde os resultados foram significativos a 1% (Tabela 9).
Por último os dados foram submetidos ao teste de médias Duncan a 5% de probabilidade,
devido a variabilidade dos dados (Figura 7).
Tabela 9
. Resumo da análise da variância dos dados obtidos em função da concentração de
lignina por tratamento
33
Análise da variância
F.V. G.L. Quadrado Médio
Tratamento 17 0.5771168E-01**
Resíduo 72 0.1806302E-02
C.V.
exp
= 2,097
** significativo a 1%
Figura 7.
Teste de comparação de médias Duncan a 5% de probabilidade para lignificação.
Tratamentos com letras iguais não diferem entre si.
A Tabela 10 compara os resultados para teor de lignina pelo teste de médias Duncan
a 5 % de probabilidade, ordenadas da maior média para a menor, com a finalidade de
facilitar a visualização da influência de cada tratamento no teor de lignificação.
Tabela 10. Teste de comparação de médias Duncan a 5% de probabilidade para concentração de
lignina, ordenado da maior para a menor média
Tratamentos Repetições
Média/Tratamento
Tratamentos Repetições
Média/Tratam
ento
8 5
153,672
a
17 5
113,832
c
1 5
142,152
ab
16 5
96,0774
d
34
7 5
140,928
ab
18 5
95,922
d
10 5
140,858
ab
14 5
92,6504
d
2 5
130,2282
bc
12 5
91,5682
d
5 5
122,01
c
11 5
90,4458
d
19 5
119,9144
c
13 5
72,3752
e
20 5
119,479
c
15 5
71,3384
e
4 5
114,672
c
9 5
69,7154
e
Nota: Tratamentos com letras iguais não diferem entre si a 5% de probalidade
.
O tratamento que apresentou maior concentração média de lignina em mg/L foi o
T(8), o resultado foi bem superior aos outros tratamentos, tanto que difere dos outros
tratamentos a 5% de probabilidade (representado pela letra
a
). Esse tratamento possui um
balanço favorável ao regulador de crescimento 2,4-D, numa proporção de 11,35 µM de 2,4-
D/4,65 µM de cinetina, enquanto que o tratamento que apresentou menor concentração
média de lignina por tratamento em mg/L T9, possui um balanço equilibrado entre o 2,4-D
e a cinetina. Cabe ressaltar, que o T9, ao contrário do T8, não é a única média do seu grupo
estatístico (representado pela letra
e
), ele não difere estatisticamente de outras duas médias,
porém é a média mais baixa do grupo. Souza (2007), testando a influência do 2,4-D, na
lignificação de células em suspensão de
Eucalyptus urophylla,
encontrou seus níveis mais
altos de lignificação quando usou 0 µM de 2,4-D/46,5 µM de cinetina, já os níveis mais
baixos de lignificação foram encontrados com 9,06 µM de 2,4-D/46,5 µM de cinetina. Os
dois resultados são antagônicos aos deste trabalho, pois as concentrações mais altas de
lignina estão associadas a uma quantidade maior de 2,4-D em relação a cinetina, e as mais
baixas ao invés de um balanço favorável a cinetina, caracterizam-se por um balanço
equilibrado. Karkonen (2001), também sugere balanços favoráveis a cinetina (0,05-0,5 µM
de 2,4-D/2,5 µM de cinetina) na indução de lignina extracelular em cultura de células em
suspensão.
A situação contrária ao T8 ocorre no T4, onde a proporção de 2,4-D/cinetina é
inversa, e a concentração média de lignina para este tratamento foi intermediária.
35
A proporção dos hormônios no T8 pode ser a que favoreça a lignificação de forma
mais intensa na espécie
E. grandis
dentre os tratamentos testados. Pereira (2005), também
estudando influência de reguladores vegetais na lignificação de
E. grandis
, porém, em
aplicações realizadas direto na planta, e não a nível celular, como é o caso deste trabalho,
observou que tanto o ácido giberélico e a 6- benzilaminopurina isolados, quanto
combinados entre si, apresentaram diminuição nos níveis de lignificação em relação à
testemunha.
O segundo tratamento com calos mais lignificados, também está isolado em um
grupo estatístico distinto, pois difere a 5% de probabilidade dos outros tratamentos, neste
teste foi usado apenas o regulador 2,4-D a 4,53 µM, concentração que pode ser considerada
baixa se comparada a dos outros tratamentos. Simola
et al
(1992), também encontrou um
resultado semelhante ao usar baixas quantidades de 2,4-D em células de
Picea abies,
quando a concentração de 2,4-D variou de 0-0,5 µM, houve um incremento significativo
no teor de lignina das células. Entretanto, o mesmo autor achou resultados ainda melhores
quanto à lignificação em
Picea abies,
quando usou 0,05 µM de 2,4-D combinado com 2,5
µM de cinetina.
Quando o balanço hormonal foi favorável a cinetina (T10, T5 e T4), ao que parece,
no T10, onde a relação 2,4-D/cinetina foi maior que em T5 e T4, a concentração de lignina
por média de tratamento foi maior. Já nos tratamentos onde as proporções de 2,4-D foram
as maiores entre todos os tratamentos (T17, T18 e T12), as concentrações de lignina em
mg/L por média de tratamento podem ser consideradas de intermediárias a baixas. Um
resultado diferente foi encontrado por Monteiro (2005), que também testou a influência do
2,4-D combinado com ácido jasmônico na lignificação estudando a espécie
Eucalyptus
urophylla
. Em combinações onde as concentrações de 2,4-D foram bem superiores ao ácido
jasmônico houve um incremento alto na percentagem de lignina em relação à testemunha.
Isto mostra, que reguladores vegetais agem de forma diversa, dependendo da espécie em
estudo, da concentração e do tipo do outro regulador com o qual esteja interagindo.
Nos tratamentos onde estão presentes apenas o regulador de crescimento 2,4-D (T1,
T16 e T11), observa-se onde a concentração de 2,4-D foi a mais baixa dos três tratamento
(T1), houve uma concentração muito maior de lignina, enquanto no T16 e T11, apesar de a
concentração do 2,4-D dobrar de um tratamento para o outro, o resultado da concentração
36
de lignina por média de tratamento não difere estatisticamente um do outro. Este resultado
indica que o 2,4-D, quando usado na ausência de cinetina, em concentrações mais baixas,
pode estimular de forma mais intensa a lignificação, do que quando usado na ausência de
cinetina em concentrações mais altas. Monteiro (2005), também testou 2,4-D de forma
isolada em
E
.
urophylla,
e os resultados encontrados foram, mais uma vez, diferentes dos
encontrados neste trabalho. Quando testou uma quantidade relativamente mais baixa de
2,4-D a quantidade de lignina ficou bem abaixo da testemunha (0 µM de ácido jasmônico/0
µM de 2,4-D) e quando a quantidade de 2,4-D dobrou, a percentagem de lignina aumentou
significativamente.
4.6 Tamanho dos calos e Lignificação
Os dois tratamentos com as mais altas concentrações de lignina (T1 e T8),
apresentaram calos com tamanho mediano em relação aos demais. Entretanto, nos
tratamentos T9 e T15, que possuem as mais baixas concentrações de lignina, os calos
também apresentaram tamanho mediano.
Os calos que apresentaram maiores tamanhos em cm, foram submetidos aos
tratamentos T11, T16 e T19. Mas, aparentemente não estão relacionados a uma maior ou
menor quantidade média de lignina por tratamento, já que o T11 e o T16 foram submetidos
a tratamentos que apresentaram concentrações mais baixas de lignina por média de
tratamento, enquanto o T19 apresentou concentração média de lignina por tratamento mais
alta.
Foi encontrada uma correlação pelo método Pearson que indica que em menores
teores de lignificação os calos se desenvolveram mais. Entretanto este valor foi muito baixo
(r =-0,2085), parecendo praticamente não existir correlação entre as duas variáveis. A
figura 8, mostra a dispersão dos dados.
37
y = -0,0028x + 1,0821
R
2
= 0,0435
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 140,0 160,0 180,0
concentração de lignina(mg/L)
tamanho dos calos (cm)
Figura 8:
Relação entre a concentração média de lignina por tratamento em
mg/L
e
tamanho médio dos calos em
cm
por tratamento.
4.7 Friabilidade e oxidação para Lignificação
Foi observado que os calos mais friáveis, claros e de fácil desagregação, pertencem
aos tratamentos onde as concentrações de lignina por média de tratamento foram as mais
baixas. Esses tratamentos possuem uma relação 2,4-D\Cinetina equilibrada, quando
comparadas aos outros tratamentos. Calos muito oxidados e menos friáveis, estão
relacionados a tratamentos onde a concentração média de lignina são de medianas a altas.
Nestes tratamentos a relação 2,4-D/Cinetina é favorável ao 2,4-D, e em alguns casos em
concentrações muito mais altas.
Quando a relação entre os hormônios está favorável a cinetina, as concentrações de
lignina também são altas e os calos oxidados e endurecidos.
Ao que tudo indica, as concentrações de lignina por média de tratamento são
diretamente proporcionais ao nível de oxidação dos calos e vice-versa. Como Sato et al,
2004
apud
George e Sherrington (1984), sugere que entre as substâncias fenólicas,
responsáveis pela oxidação dos tecidos estão os precursores da lignina, pode-se entender,
que de fato a maior intensidade de oxidação fenólica implica em maiores concentrações de
lignina por média de tratamento em mg/L. Além disto, Andrade
et al
, (2000) relata que em
plantas lenhosas, acumulam-se polifenóis e produtos de oxidação, dentre os quais encontra-
se a lignina.
38
5 CONCLUSÕES
A formação de calos de
E. grandis
ocorre com certa facilidade em presença do 2,4-
D ou em combinação com a cinetina. Entretanto, as concentrações de 2,4-D ou dos
balanços 2,4-D/cinetina podem determinar as características destes calos, como níveis de
oxidação, tamanho, presença de raiz e lignificação.
Na prática, os tratamentos testados neste trabalho, constituem-se em protocolos para
indução de calogênese em
E. grandis
e posterior regeneração da espécie
in vitro.
A
finalidade de estudo é que vai definir que protocolo deve ser utilizado.
Os protocolos desenvolvidos neste trabalho podem ser muito úteis para estudos na
área de biotecnologia vegetal, em especial para trabalhos desenvolvidos com espécies
lenhosas. Além disto, este trabalho abre caminho para estudos mais aprofundados sobre a
influência de reguladores vegetais no processo de lignificação em
E. grandis.
O resultados mostram também que células em níveis de calo hospedam um
potencial bioquímico capaz de estabilizar o efeito oxidativo do tecido através da formação
da lignina e que as variações dos tipos e concentrações dos reguladores de crescimento
desencadeiam alterações no processo metabólico que leva ao processo de lignificação.
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7 ANEXOS
Anexo I-
Análises estatísticas para concentração de lignina por tratamento
Anexo II
- Análises estatísticas para tamanho dos calos nos diferentes tratamentos
50
Anexo I-
Análises estatísticas para concentração de lignina por tratamento
D E S C R I Ç Ã O D O A R Q U I V O
Tipo de Leitura -
Microsoft Excel
Variáveis Mínimos Máximos Perdidos Válidos
TRAT 1.000000 18.00000 0 90
REP 1.000000 5.000000 0 90
ABS 0.3590000 0.8570000
0 90
LABS 0.6701918E-
01 0.4449055 0 90
CONC 65.83000 163.6300 0 90
L
CONC 1.818424 2.213863 0 90
Observações Gravadas... 90
Variáveis Totais....... 6
Valores
Perdidos....... 0
51
Procedimento = Estatísticas simples parte -
1
Objetivo = Estatísticas para variáveis contínuas
Variáveis = ABS LABS CONC LCONC
Estatísticas Descritivas
ABS -
_________________________________________________________________________
_____
Número de Observações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
Média Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.583133
Desvio Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.139392
Erro Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.014693
Coeficiente de Variação . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23.904001
Valor Máximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.857000
Valor Mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.359000
Amplitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.498000
Teste de t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39.687219
Probabilidade da Média = 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.000200
Assimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.086880
Probabilidade da Assimetria = 0 . . . . . . . . . . . . . . .
0.491206
Curtose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.826348
Probabilidade da Curtose = 3 . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.277511
Intervalo de Confiança P(0.05) . . . . . . . . . . . . . . . .
0.029240
Amostra Ideal (10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22.628061
_________________________________________________________________________
_____
52
LABS -
_________________________________________________________________________
_____
Número de Observações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
Média Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.246999
Desvio Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.107140
Erro Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.011294
Coeficiente de Variação . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43.376723
Valor Máximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.444906
Valor Mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.067019
Amplitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.377886
Teste de t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21.870792
Probabilidade da Média = 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.000200
Assimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.214268
Probabilidade da Assimetria = 0 . . . . . . . . . . . . . . .
0.478306
Curtose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.834557
Probabilidade da Curtose = 3 . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.278897
Intervalo de Confiança P(0.05) . . . . . . . . . . . . . . . .
0.022474
Amostra Ideal (10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
74.510872
_________________________________________________________________________
_____
CONC -
_________________________________________________________________________
_____
Número de Observações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
53
Média Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
109.882689
Desvio Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27.341808
Erro Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.882080
Coeficiente de Variação . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24.882726
Valor Máximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
163.630000
Valor Mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65.830000
Amplitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
97.800000
Teste de t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38.126181
Probabilidade da Média = 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.000200
Assimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.099681
Probabilidade da Assimetria = 0 . . . . . . . . . . . . . . .
0.489910
Curtose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.836764
Probabilidade da Curtose = 3 . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.279270
Intervalo de Confiança P(0.05) . . . . . . . . . . . . . . . .
5.735338
Amostra Ideal (10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24.518961
_________________________________________________________________________
_____
LCONC -
_________________________________________________________________________
_____
Número de Observações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
90
Média Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.027065
Desvio Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.111736
Erro Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.011778
Coeficiente de Variação . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.512189
Valor Máximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.213863
Valor Mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.818424
54
Amplitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.395439
Teste de t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
172.106438
Probabilidade da Média = 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.000200
Assimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -
0.218986
Probabilidade da Assimetria = 0 . . . . . . . . . . . . . . .
0.477829
Curtose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.852479
Probabilidade da Curtose = 3 . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.281933
Intervalo de Confiança P(0.05) . . . . . . . . . . . . . . . .
0.023438
Amostra Ideal (10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.203246
_________________________________________________________________________
_____
Procedimento = Teste de Lilliefors
Objetivo = Teste para verificação de normalidade
Parâmetro (01) = ABS
Parâmetro (02) = LABS
Parâmetro (03) = CONC
Parâmetro (04) = LCONC
T e s t e
d e L i l l i e f o r s
_________________________________________________________________________
_____
Variáveis Valor Calculado Valor (P=0.05) Valor
(P=0.01)
_________________________________________________________________________
_____
ABS 0.1235 0.093
0.109
_________________________________________________________________________
_____
LABS 0.1013 0.093
0.109
55
_________________________________________________________________________
_____
CONC 0.1241 0.093
0.109
_________________________________________________________________________
_____
LCONC 0.0963 0.093
0.109
_________________________________________________________________________
_____
Procedimento = A
nálise para modelos lineares
Objetivo = Análise de variância
Dependentes = LABS LCONC
Independentes= TRAT
E s t a t í s t i c a s S i m p l e s
Observações Perdidas = 0
Observações Válidas = 90
D i s t r i b u i ç ã o d o s D a d o s
Efeito Código Observações
TRAT 1 5 ------------------------------
TRAT 2 5 ------------------------------
TRAT 3 5 ------------------------------
TRAT 4 5 ------------------------------
TRAT 5 5 ------------------------------
TRAT 6 5 ------------------------------
TRAT 7 5 ------------------------------
TRAT 8 5 ------------------------------
TRAT 9 5 ------------------------------
TRAT 10 5 ------------------------------
TRAT 11 5 ------------------------------
TRAT 12 5 ------------------------------
TRAT 13 5 ------------------------------
TRAT 14 5 ------------------------------
TRAT 15 5 ------------------------------
TRAT 16 5 ------------------------------
56
TRAT 17 5 ------------------------------
TRAT 18 5 ------------------------------
Nome Média Desvio
LABS 0.24700 0.10714
LCONC 2.02706 0.11174
Determinante = 0.1373291E-
03
A n á l i s e d e V a r i â n c i a
LABS
Fontes de Variação G.L. Soma de Quadrado Quadrado Médio F
Signif.
TRAT 17 0.9026504 0.5309708E-01 32.130
0.00000
Resíduo 72 0.1189833 0.1652546E-
02
Coeficiente de Variação = 16.458
D U N C A N
Variável = LABS ( 0.1652546E-
02)
TRAT Descrição Dados Médias Comparações
5%
_________________________________________________________________________
______
7 5 0.4218 A
13 5 0.4146 A
11 5 0.4060 A
9 5 0.3208 B
10
5 0.3098 B
12 5 0.3051 B
16 5 0.2942 B
14 5 0.2900 B
3 5 0.2164 C
15
5 0.2156 C
17 5 0.2117 C
18 5 0.2031 C
4 5 0.1903 C
2 5 0.1619 CD
8
5 0.1316 DE
5 5 0.1315 DE
1 5 0.1266 DE
57
6 5 0.0951 E
_________________________________________________________________________
______
LCONC
Fontes de Variação G.L. Soma de Quadrado Quadrado Médio F
Signif.
TRAT 17 0.9810985 0.5771168E-01 31.950
0.00000
Resíduo 72 0.1300538 0.1806302E-
02
Coeficiente de Variação = 2.097
D U N C A N
Variável = LCONC ( 0.1806302E-
02)
TRAT Descrição Dados Médias Comparações
5%
_________________________________________________________________________
______
6 5 2.1859 A
1 5 2.1524 AB
5
5 2.1489 AB
8 5 2.1471 AB
2 5 2.1147 BC
4 5 2.0864 C
18 5 2.0731 C
17
5 2.0636 C
3 5 2.0592 C
15 5 2.0554 C
14 5 1.9825 D
16 5 1.9777 D
12
5 1.9668 D
10 5 1.9616 D
9 5 1.9563 D
11 5 1.8589 E
13 5 1.8536 E
7 5
1.8431 E
_________________________________________________________________________
______
58
Anexo II
- Análises estatísticas para tamanho dos calos nos diferentes tratamentos
D E S C R I Ç Ã O D O A R Q U I V O
Tipo de Leitura -
Microsoft Excel
Variáveis Mínimos Máximos Perdidos Válidos
TRAT 1.000000 26.00000 0 130
REP 1.000000 5.000000 0 130
TAM 0.3000000 1.500000 0 130
Observações Gravadas... 130
Variáveis Totais....... 3
Valores Perdidos....... 0
Procedimento = Teste de Lilliefors
Objetivo = Teste para verificação de nor
malidade
Parâmetro (01) = TAM
T e s t e d e L i l l i e f o r s
_________________________________________________________________________
_____
Variáveis Valor Calculado Valor (P=0.05) Valor
(P=0.01)
_________________________________________________________________________
_____
TAM 0.1240 0.078
0.090
_________________________________________________________________________
_____
59
Procedimento = Estatísticas simples parte - 1
Objetivo = Estatísticas para variáveis contínuas
Variáveis = TAM
Estatísticas Descritivas
TAM -
_________________________________________________________________________
_____
Número de Observações . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
130
Média Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.786154
Desvio Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.317391
Erro Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.027837
Coeficiente de Variação . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40.372629
Valor Máximo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.500000
Valor Mínimo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.300000
Amplitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.200000
Teste de t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28.241298
Probabilidade da Média = 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.000200
Assimetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.170370
Probabilidade da Assimetria = 0 . . . . . . . . . . . . . . .
0.485576
Curtose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.068222
Probabilidade da Curtose = 3 . . . . . . . . . . . . . . . . .
0.347172
Intervalo de Confiança P(0.05) . . . . . . . . . . . . . . . .
0.054561
Amostra Ideal (10%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62.616129
_________________________________________________________________________
_____
60
Procedimento = Análise Não-paramétrica
Objetivo = Análise de variância não-
parametrica
Dependentes = TAM
Independentes = TRAT
T e s t e d e K r u s k a l -
W a l l i s
Variável = TAM
_________________________________________________________________________
__
TRAT Descrição Média dos Média das
Dados
Dados Ordens
1 ------------------------- 0.78000 63.1000
5
2 ------------------------- 0.48000 29.2000
5
3 ------------------------- 0.82000 68.2000
5
4 ------------------------- 0.34000 11.1000
5
5 ------------------------- 0.32000 8.8000
5
6 ------------------------- 0.96000 90.6000
5
7 ------------------------- 0.70000 54.3000
5
8 ------------------------- 0.86000 73.3000
5
9 ------------------------- 0.86000 73.3000
5
10 ------------------------- 0.36000 13.4000
5
11 ------------------------- 1.02000 *******
5
12 ------------------------- 0.48000 29.2000
5
13 ------------------------- 0.58000 42.8000
5
14 ------------------------- 0.52000 34.7000
5
15 ------------------------- 1.04000 *******
5
61
16 ------------------------- 1.26000 *******
5
17 ------------------------- 0.84000 70.2000
5
18 ------------------------- 0.88000 76.4000
5
19 ------------------------- 1.34000 *******
5
20 ------------------------- 1.10000 *******
5
21 ------------------------- 1.36000 *******
5
22 ------------------------- 1.02000 97.5000
5
23 ------------------------- 0.58000 41.7000
5
24 ------------------------- 0.52000 34.7000
5
25 ------------------------- 0.34000 11.1000
5
26 ------------------------- 1.08000 *******
5
Valor do Teste = 123.005 (P=0.05) = 37.650 (P=0.01) =
44.310
_________________________________________________________________________
__
C o m p a r a ç õ e s M ú l t i p l a s
Classe Classe Diferença Diferença Mínim
a Significativa
Observada (P=0.05) (P=0.01)
1 2 33.90000 87.62309 98.01790
1 3 5.10000 87.62309 98.01790
1 4 52.00000 87.62309 98.0
1790
1 5 54.30000 87.62309 98.01790
1 6 27.50000 87.62309 98.01790
1 7 8.80000 87.62309 98.01790
1 8 10.20000 87.62309 98.01790
1 9 10.20000 87.62309 98.01790
1 10 49.70000 87.62309 98.01790
1 11 37.00000 87.62309 98.01790
1 1
2 33.90000 87.62309 98.01790
1 13 20.30000 87.62309 98.01790
1 14 28.40000 87.62309 98.01790
1 15 38.10000 87.62309 98.01790
1 16 56.00000 87.62309 98.01790
1 17
7.10000 87.62309 98.01790
1 18 13.30000 87.62309 98.01790
1 19 61.40000 87.62309 98.01790
1 20 43.40000 87.62309 98.01790
1 21 60.50000 87.62309 98.01790
1 22 34.40000
87.62309 98.01790
1 23 21.40000 87.62309 98.01790
62
1 24 28.40000 87.62309 98.01790
1 25 52.00000 87.62309 98.01790
1 26 41.30000 87.62309 98.01790
2 3 39.00000
87.62309 98.01790
2 4 18.10000 87.62309 98.01790
2 5 20.40000 87.62309 98.01790
2 6 61.40000 87.62309 98.01790
2 7 25.10000 87.62309 98.01790
2 8 44.10000 87.6230
9 98.01790
2 9 44.10000 87.62309 98.01790
2 10 15.80000 87.62309 98.01790
2 11 70.89999 87.62309 98.01790
2 12 0.00000 87.62309 98.01790
2 13 13.60000 87.62309
98.01790
2 14 5.50000 87.62309 98.01790
2 15 72.00000 87.62309 98.01790
2 16 89.89999 87.62309 98.01790
2 17 41.00000 87.62309 98.01790
2 18 47.20000 87.62309 98.017
90
2 19 95.30000 87.62309 98.01790
2 20 77.30000 87.62309 98.01790
2
21 94.39999 87.62309 98.01790
2 22 68.30000 87.62309 98.01790
2 23 12.50000 87.62309 98.01790
2 24 5.50000 87.62309 98.01790
2 25 18.10000 87.62309 98.01790
2 26
75.20000 87.62309 98.01790
3 4 57.10000 87.62309 98.01790
3 5 59.40000 87.62309 98.01790
3 6 22.40000 87.62309 98.01790
3 7 13.90000 87.62309 98.01790
3 8 5.
10001 87.62309 98.01790
3 9 5.10001 87.62309 98.01790
3 10 54.80000 87.62309 98.01790
3 11 31.90000 87.62309 98.01790
3 12 39.00000 87.62309 98.01790
3 13 25.40000
87.62309 98.01790
3 14 33.50000 87.62309 98.01790
3 15 33.00000 87.62309 98.01790
3 16 50.90000 87.62309 98.01790
3 17 2.00000 87.62309 98.01790
3 18 8.20000 87
.62309 98.01790
3 19 56.30000 87.62309 98.01790
3 20 38.30000 87.62309 98.01790
3 21 55.40000 87.62309 98.01790
3 22 29.30000 87.62309 98.01790
3 23 26.50000 87.62309
98.01790
3 24 33.50000 87.62309 98.01790
3 25 57.10000 87.62309 98.01790
3 26 36.20000 87.62309 98.01790
4 5 2.30000 87.62309 98.01790
4 6 79.50000 87.62309 9
8.01790
4 7 43.20000 87.62309 98.01790
4 8 62.20000 87.62309 98.01790
4 9 62.20000 87.62309 98.01790
4 10 2.30000 87.62309 98.01790
4 11 89.00000 87.62309 98.01790
63
4 12 18.10000 87.62309 98.01790
4 13 31.70000 87.62309 98.01790
4
14 23.60000 87.62309 98.01790
4 15 90.10000 87.62309 98.01790
4 16 108.00000 87.62309 98.01790
4 17 59.10000 87.62309 98.01790
4 18 65.30000 87.62309 98.01790
4 19
113.40000 87.62309 98.01790
4 20 95.40000 87.62309 98.01790
4 21 112.50000 87.62309 98.01790
4 22 86.40000 87.62309 98.01790
4 23 30.60000 87.62309 98.01790
4 24 23.60
000 87.62309 98.01790
4 25 0.00000 87.62309 98.01790
4 26 93.30000 87.62309 98.01790
5 6 81.80000 87.62309 98.01790
5 7 45.50000 87.62309 98.01790
5 8 64.50000
87.62309 98.01790
5 9 64.50000 87.62309 98.01790
5 10 4.60000 87.62309 98.01790
5 11 91.30000 87.62309 98.01790
5 12 20.40000 87.62309 98.01790
5 13 34.00000 87.6
2309 98.01790
5 14 25.90000 87.62309 98.01790
5 15 92.39999 87.62309 98.01790
5 16 110.30000 87.62309 98.01790
5 17 61.40000 87.62309 98.01790
5 18 67.60000 87.62309
98.01790
5 19 115.70000 87.62309 98.01790
5 20 97.70000 87.62309 98.01790
5 21 114.80000 87.62309 98.01790
5 22 88.70000 87.62309 98.01790
5 23 32.90000 87.62309 98.
01790
5 24 25.90000 87.62309 98.01790
5 25 2.30000 87.62309 98.01790
5 26 95.60000 87.62309 98.01790
6 7 36.30000 87.62309 98.01790
6 8 17.30000 87.62309 98.01790
6 9 17.30000 87.62309 98.01790
6 10 77.20000 87.62309 98.01790
6
11 9.50000 87.62309 98.01790
6 12 61.40000 87.62309 98.01790
6 13 47.80000 87.62309 98.01790
6 14 55.90000 87.62309 98.01790
6 15 10.60000 87.62309 98.01790
6 16
28.50000 87.62309 98.01790
6 17 20.40000 87.62309 98.01790
6 18 14.20000 87.62309 98.01790
6 19 33.90000 87.62309 98.01790
6 20 15.90000 87.62309 98.01790
6 21 33.0000
0 87.62309 98.01790
6 22 6.90000 87.62309 98.01790
6 23 48.90000 87.62309 98.01790
6 24 55.90000 87.62309 98.01790
6 25 79.50000 87.62309 98.01790
6 26 13.80000
87.62309 98.01790
7 8 19.00000 87.62309 98.01790
64
7 9 19.00000 87.62309 98.01790
7 10 40.90000 87.62309 98.01790
7 11 45.80000 87.62309 98.01790
7 12 25.10000 87.623
09 98.01790
7 13 11.50000 87.62309 98.01790
7 14 19.60000 87.62309 98.01790
7 15 46.90000 87.62309 98.01790
7 16 64.80000 87.62309 98.01790
7 17 15.90000 87.62309
98.01790
7 18 22.10000 87.62309 98.01790
7 19 70.20000 87.62309 98.01790
7 20 52.20000 87.62309 98.01790
7 21 69.30000 87.62309 98.01790
7 22 43.20000 87.62309 98.01
790
7 23 12.60000 87.62309 98.01790
7 24 19.60000 87.62309 98.01790
7
25 43.20000 87.62309 98.01790
7 26 50.10000 87.62309 98.01790
8 9 0.00000 87.62309 98.01790
8 10 59.90000 87.62309 98.01790
8 11 26.80000 87.62309 98.01790
8 12
44.10000 87.62309 98.01790
8 13 30.50000 87.62309 98.01790
8 14 38.60000 87.62309 98.01790
8 15 27.89999 87.62309 98.01790
8 16 45.80000 87.62309 98.01790
8 17 3
.10001 87.62309 98.01790
8 18 3.10000 87.62309 98.01790
8 19 51.20000 87.62309 98.01790
8 20 33.20000 87.62309 98.01790
8 21 50.30000 87.62309 98.01790
8 22 24.20000
87.62309 98.01790
8 23 31.60000 87.62309 98.01790
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7.62309 98.01790
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98.01790
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9 23 31.60000 87.62309 98.01790
9 24 38.60000 87.62309 98.01790
9 25 62.20000 87.62309 98.0179
0
9 26 31.10000 87.62309 98.01790
10 11 86.70000 87.62309 98.01790
10
12 15.80000 87.62309 98.01790
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65
10 15 87.80000 87.62309 98.01790
10 16 105.70000 87.62309 98.01790
10 17
56.80000 87.62309 98.01790
10 18 63.00000 87.62309 98.01790
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0000 87.62309 98.01790
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62309 98.01790
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.01790
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12 26
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00 87.62309 98.01790
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87.62309 98.01790
13 24 8.10000 87.62309 98.01790
13 25 31.70000 87.62309 98.01790
13 26 61.60000 87.62309 98.01790
14 15 66.50000 87.62309 98.01790
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309 98.01790
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66
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98.01790
14 22 62.80000 87.62309 98.01790
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1790
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1
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3 59.50000 87.62309 98.01790
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15 25 90.10000 87.62309 98.01790
15 26 3.20000 87.62309 98.01790
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16 18 4
2.70000 87.62309 98.01790
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16 21 4.50000 87.62309 98.01790
16 22 21.60000 87.62309 98.01790
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87.62309 98.01790
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87.62309 98.01790
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9 98.01790
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90
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19
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67
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87.62309 98.01790
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.62309 98.01790
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25 26 93.30000 87.62309
98.01790
_________________________________________________________________________
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Trat
Média
21 1.36ª
19 1.34ª
16 1.26ªb
20 1.1ªb
26 1.08ªb
15 1.04ªb
11 1.02ªb
22 1.02ªb
6 0.96ªb
18 0.88ªb
8 0.86ªb
9 0.86ªb
17 0.84ªb
3 0.82ªb
1 0.78ªb
7 0.7ªb
13 0.58ªb
23 0.58ªb
14 0.52ªb
24 0.52 b
2 0.48 b
12 0.48 b
10 0.36 b
4 0.34 b
25 0.34 b
5 0.32 b
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