( PDF ) Avaliação histológica e imunohistoquímica do infiltrado celular em pele perilesional e não-lesional do vitiligo ativo antes e após puvaterapia

Download PDF

ads:

FLÁVIA MARIA NONATO PRETTI ASLANIAN

AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA

DO INFILTRADO CELULAR EM PELE PERILESIONAL

E NÃO-LESIONAL DO VITILIGO ATIVO

ANTES E APÓS PUVATERAPIA

TESE DE DOUTORADO

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Curso de Pós - Graduação - Área de Concentração Dermatologia

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA

DO INFILTRADO CELULAR EM PELE PERILESIONAL

E NÃO-LESIONAL DO VITILIGO ATIVO

ANTES E APÓS PUVATERAPIA

FLÁVIA MARIA NONATO PRETTI ASLANIAN

Tese apresentada ao corpo docente da Faculdade de Medicina da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, Curso de Pós-Graduação em Medicina - Área de

Concentração - Dermatologia – como parte dos requisitos necessários à

obtenção do grau de Doutora em Medicina.

Aprovada por:

Prof.: Márcia Ramos-e-Silva-UFRJ

(Presidente da Banca)

Prof.: Maria Kátia Gomes-UFRJ

Prof.: José Marcos Telles da Cunha-UFRJ

Prof.: Paula Dadalti-UNIGRANRIO

Prof.: Rogério Farias-UFJF

Rio de Janeiro, RJ – Brasil

2007

ads:

Orientadores: Prof

. Absalom Lima Filgueira

Profª. Tullia Cuzzi

Aslanian, Flávia Maria Nonato Pretti

Avaliação Histológica e Imuno-histoquímica do

Infiltrado Celular em Pele Perilesional e Não-Lesional do

Vitiligo Ativo Antes e Após Puvaterapia/ Flávia Maria

Nonato Pretti Aslanian – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade

de Medicina, 2007. 172p. il.

Orientadores: Absalom Filgueira; Tullia Cuzzi.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Faculdade de Medicina, 2007.

1. Vitiligo. 2.Auto-imunidade. 3.Linfócitos. 4.PUVA. 5.

Dermatologia – Teses. I. Filgueira, Absalom .. II.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de

Medicina. III. Título.

DEDICATÓRIA

Aos meus amores, fonte de vida e

inspiração: meu filho Rafael, meu marido

Victor e meus pais, José Luiz e Denise.

AGRADECIMENTOS

Ao Curso de Pós-graduação em Dermatologia da Universidade Federal do Rio

de Janeiro-UFRJ, que viabilizou a realização desta tese;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pelo apoio financeiro à tese, concedendo bolsa de estudos;

Ao Coordenador do curso de Pós-graduação em Dermatologia e orientador

desta tese Prof. Absalom Lima Filgueira, Prof. Titular de Dermatologia da UFRJ, pelo

apoio incondicional em todos os momentos da tese, pela confiança depositada em

mim, pela assistência experiente e motivadora, meu reconhecimento e admiração

especiais;

À Prof.Tullia Cuzzi, orientadora desta tese, Prof. Adjunta de Dermatopatologia

da UFRJ, pela amizade e consideração, pela parceria e ajuda prática e experiente

em todas as análises, fundamentais na solução dos problemas, meu carinho e

admiração especiais;

Ao Prof.Rogério Farias, Vice-diretor e Prof. Adjunto do Departamento de

Morfologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, membro da banca

examinadora, pela imensa ajuda nas análises imuno-histoquímicas, pela amizade,

suporte e incentivo criativo durante toda a tese;

À Prof. Márcia Ramos-e-Silva, Chefe do Serviço de Dermatologia do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF)/UFRJ, membro da banca

examinadora, pelo apoio fundamental ao meu contato profissional nos Emirados

Árabes Unidos e por toda a consideração;

Aos membros da banca examinadora Prof. José Marcos Telles da Cunha, Prof.

Maria Kátia Gomes, e Prof.Paula Dadalti, pela disponibilidade e ajuda na pré-defesa,

momento crucial para o aperfeiçoamento do trabalho;

A toda a equipe do laboratório Anticorpos, em especial à Ivana, pelo carinho e

ajuda experiente e valiosa nos testes imuno-histoquímicos da tese;

À Rosângela Noé, Estatística da Comissão de Investigação Científica do

HUCFF/UFRJ, pela sua assistência importante nas análises estatísticas da tese;

Ao Prof.Ibrahim Galadari, Prof.Titular e Chefe do Serviço de Dermatologia da

Universidade dos Emirados Árabes Unidos, pela co-orientação da tese por quase 2

anos, pela oportunidade de aprendizado na sua clínica particular, e pela amizade;

Ao Prof. Pranab Das, Prof. aposentado do Departamento de Patologia da

Universidade de Amsterdã, e Coordenador do Grupo Internacional de Desordens

Pigmentares, pela colaboração preciosa e experiente nos artigos científicos da tese;

À amiga Daniela Antelo, pela amizade e ajuda preciosa na coleta de biopsias e

acompanhamento dos pacientes, fundamentais para o trabalho; agradeço também

às Dras. Alba Palermo e Sandra Durães, o carinho e a ajuda nas biopsias;

À auxiliar de enfermagem Rosângela, do Setor de Fotodermatologia do

HUCFF/UFRJ, pela amizade e carinho, pela dedicação no atendimento dos

pacientes e ajuda valiosa à tese;

À Gilsara, secretária da Pós-Graduação em Dermatologia do HUCFF/UFRJ,

pela ajuda e atenção, pela amizade singela;

Aos pacientes e voluntários, pelo desprendimento, confiança e participação

ímpar durante a pesquisa, ajudando a aprimorar o conhecimento científico e a

buscar benefícios para a saúde das pessoas.

A Deus, agradeço sobretudo, pela companhia na jornada, sem a qual não

haveria o amor, a luz e a persistência necessárias à realização do trabalho;

Ao meu marido Victor, agradeço pelo amor fiel e companheiro, pelo suporte

afetivo, intelectual e operacional, que me permitiram resolver as dificuldades que

surgiram e prosseguir firme para a realização dos meus objetivos de vida, da família

e do trabalho;

Ao meu filho Rafael, pelo sorriso alegre que ilumina tudo, pelo profundo amor

partilhado, pelo olhar puro, pela paciência de esperar tantos momentos de estudo;

Aos meus pais Denise e José Luiz, pelo seu amor e suporte incondicional em

todos os momentos, nas mudanças, nas incertezas, pela honra de ser sua filha;

Aos meus avós Petrônio e Dolores, padrinhos, eternos amigos, doces,

companheiros e motivadores;

Aos meus sogros Layra e Ruben, pela amizade e carinho constantes, pela

extrema consideração e atenção comigo;

Ao meu irmão Júnior e às cunhadas Elisa e Tatiana, pelo companheirismo e

afeto acolhedores, dando força às realizações;

Aos amigos queridos, pelas experiências partilhadas, pelo carinho e apoio;

À Prof. Rosalind Norden, do Instituto Berlitz, pela doce amizade, motivação e

importante suporte na adaptação aos Emirados Árabes, e pela revisão dos artigos

científicos da tese;

E a todos os que colaboraram de alguma forma para a concretização deste

trabalho.

“Vitiligo é pior do que diabetes. Eu não conheço nenhum médico que

concorde com essa avaliação… Mas eu sou um paciente que convive com

ambas as condições e eu não posso compará-las. Eu sei em algum

momento no futuro eu poderia morrer das complicações físicas do diabetes

tipo 1. Mas em minha experiência, a profunda dor psicológica do vitiligo é

uma força a cada dia mais destrutiva em minha vida..”

Michael Austin, 2004.

RESUMO

Evidências como a associação com condições auto-imunes, auto-anticorpos

circulantes, e presença de linfócitos T ativados melanócito-específicos nas lesões

sugerem que vitiligo seja uma doença auto-imune. Possivelmente uma agressão

imune T-mediada leva à despigmentação. Modificações do infiltrado celular cutâneo,

como aquelas causadas pela puvaterapia (PUVA), induzem repigmentação.

Objetivos: Caracterizar histológica e imunofenotipicamente o infiltrado celular na

pele perilesional (borda ativa) e não-lesional de pacientes com vitiligo ativo

generalizado (não-segmentar), identificando achados inflamatórios e pigmentares,

número de linfócitos e células de Langerhans, e sua expressão para o antígeno

cutâneo leucocitário (CLA), antes e após PUVA.

Metodologia: Ensaio clínico. Avaliação histológica e imuno-histoquímica do infiltrado

celular em borda ativa e pele não-lesional de 22 pacientes com vitiligo, antes e após

30 sessões de PUVA, comparando-os com pele normal de 10 controles saudáveis.

Resultados: Casos de doenças auto-imunes associadas foram observados nos

pacientes e nos seus parentes, principalmente o próprio vitiligo, diabetes mellitus e

tireoidite auto-imune. A histologia mostrou: infiltração linfocítica epidérmica em

alguns casos e redução da pigmentação melânica basal(PMB) em 100% das lesões;

diminuição da PMB na pele não-lesional em 50% dos casos. A imuno-histoquímica

evidenciou: número reduzido de células CD1a+ e aumento do número de linfócitos T

CD8+ na borda e na pele não-lesional dos pacientes. Infiltração linfocítica

intraepidérmica ocorreu apenas nas lesões. A PUVA reduziu o infiltrado de células

CD1a+, T CD4+, CD8+ e CD3+, e CLA+ em toda a pele dos pacientes; entretanto

houve persistência de células CLA+ nas lesões após tratamento.

Conclusões: Vitiligo se apresenta com alterações histológicas e imuno-

histoquímicas não só na pele perilesional, mas também na pele clinicamente

pigmentada dos pacientes. Há freqüente redução da PMB, aumento do número de

linfócitos T CD8+ e reduzido número de células CD1a+ na pele perilesional e

também na pele não-lesional. A principal diferença entre estes 2 sítios é a presença

de linfócitos T CD8+ intraepidérmicos apenas nas lesões. Isto dá suporte adicional à

hipótese de que células T CD8+ melanócito-específicas têm um papel relevante na

destruição de melanócitos, e reforça uma etiopatogenia auto-imune para o vitiligo. A

PUVA promove marcante diminuição do infiltrado celular em toda a pele,

correlacionada com repigmentação, entretanto, a presença significativa de células

CLA+ nas lesões após o tratamento denota persistência de atividade imunológica

após número pequeno (20-30) de sessões.

ABSTRACT

The evidence for vitiligo being an autoimmune disease is supported by its close

association with other autoimmune conditions, circulating auto-antibodies and

activated melanocyte-specific T lymphocytes in the lesions. Possibly a T-mediated

immune aggression causes depigmentation. Modifications in the cutaneous cellular

infiltrate, such as those caused by puvatherapy (PUVA), induce repigmentation.

Objectives: To characterize histologically and immunofenotipically the cellular

infiltrate in the perilesional(active border) and non-lesional skin of patients with active

generalized (non-segmental) vitiligo, identifying inflammatory and pigmentary

findings, the number of lymphocytes, Langerhans cells, and their expression for the

cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA), before and after PUVA.

Methodology: Clinical assay. Histological and immunohistochemical evaluation of

the cellular infiltrate in both, active border and non-lesional skin of 22 vitiligo patients,

before and after 30 PUVA-sessions, compared to 10 healthy controls.

Results: Cases of autoimmune diseases were observed in vitiligo patients and in

their relatives, mainly the proper vitiligo, diabetes mellitus and autoimmune thyroiditis.

The histology showed: intraepidermal lymphocytes in some cases; reduction of the

epidermal basal pigmentation in 100% of the lesions; reduced epidermal basal

pigmentation in 50% of the non-lesional skin. The immunohistochemistry revealed:

reduction of CD1a+ cells and increase of T CD8+ lymphocytes in both, perilesional

and non-lesional skin. Intraepidermal infiltration of lymphocytes occurred only in the

lesions. PUVA reduced the infiltrate of CD1a+, T CD4+, CD8+ and CD3+

lymphocytes and CLA+ cells in the total area of skin, however with persistent CLA+

cells in the lesions.

Conclusions: Vitiligo presents itself with histological and immunohistochemical

alterations not only in the perilesional skin, but also in the normally-pigmented skin of

the patients. A reduced epidermal basal pigmentation, increased number of T CD8+

lymphocytes and reduced number of CD1a+ cells are observed in both, perilesional

and non-lesional skin. The main difference between these 2 sites is the presence of

intraepidermal T CD8+ lymphocytes only in the lesions. It adds support that some

melanocyte-specific CD8+ T cells play a pivotal role in the destruction of melanocytes

and strengthen an autoimmune etiopathology for vitiligo. PUVA markedly diminishes

the cellular infiltrate in the total area of skin, correlated with repigmentation, however,

the significant presence of CLA+ cells in the lesions after the treatment denotes

persistent immunological activity after small number (20-30) of sessions.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................22

2. OBJETIVOS.........................................................................................................25

2.1. GERAL:.....................................................................................................................25

2.2. ESPECÍFICOS:........................................................................................................25

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...........................................................................26

3.1. VITILIGO...................................................................................................................26

3.1.1. Sua origem e épocas antigas................................................................26

3.1.2. Epidemiologia........................................................................................27

3.1.3. Fatores precipitantes.............................................................................28

3.1.4. Características Clínicas.........................................................................28

3.1.5. Achados Histopatológicos .....................................................................31

3.1.6. Teorias Etiopatogênicas........................................................................33

3.2. O SISTEMA IMUNE CUTÂNEO NORMAL E NO VITILIGO............................50

3.2.1. Células T na Pele Sadia........................................................................50

3.2.2. O Patrulhamento da Pele: Linfócitos T e expressão do CLA.................51

3.2.3. CLA e doenças cutâneas.......................................................................53

3.2.4. O Papel imune dos melanócitos............................................................54

3.3. PUVA NO VITILIGO................................................................................................57

3.3.1. Conceito ................................................................................................57

3.3.2. Histórico breve.......................................................................................57

3.3.3. Mecanismos de Ação ............................................................................57

3.3.4. PUVA e efeito sistêmico........................................................................62

3.3.5. Efeitos da radiação ultravioleta no sistema imune cutâneo...................63

3.3.6. Resposta ao tratamento com PUVA......................................................64

3.3.7. PUVA e risco potencial a longo prazo ...................................................64

3.4. OUTROS TRATAMENTOS...................................................................................66

3.4.1. PUVA Tópica.........................................................................................66

3.4.2. UVB-banda estreita (narrow band)........................................................66

3.4.3. Corticoterapia tópica..............................................................................66

3.4.4. Corticoterapia sistêmica ........................................................................67

3.4.5. Calcipotriol tópico isolado ou associado à PUVA..................................67

3.4.6. Novos Imunomoduladores.....................................................................68

3.4.7. Laser excimer 308-nm...........................................................................68

3.4.8. Despigmentantes...................................................................................69

3.4.9. Microenxertos........................................................................................69

3.4.10. Fenilalanina.........................................................................................69

3.4.11. Pseudocatalase ..................................................................................70

3.4.12. Vitamina B12 e ácido fólico oral..........................................................70

3.4.13. Melagenina .........................................................................................70

3.4.14. Coadjuvantes......................................................................................70

4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................72

4.1. DESENHO DO ESTUDO.......................................................................................72

4.2. PARTICIPANTES....................................................................................................72

4.2.1. Casuística..............................................................................................72

4.2.2. Critérios de Inclusão..............................................................................73

4.2.3. Critérios de Exclusão.............................................................................73

4.2.4. Critérios de Inclusão dos Controles.......................................................73

4.2.5. Critérios de Exclusão dos Controles......................................................74

4.3. METODOLOGIA......................................................................................................74

4.3.1. Entrevista e exame clínico.....................................................................74

4.3.2. Exame oftalmológico .............................................................................74

4.3.3. Documentação fotográfica.....................................................................75

4.3.4. Biopsias de pele e avaliação histológica ...............................................75

4.3.5. Avaliação imuno-histoquímica...............................................................76

4.3.6. Tratamento............................................................................................78

4.3.7. Metodologia estatística..........................................................................80

5. RESULTADOS.....................................................................................................81

5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA.......................................81

5.2. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO CONTROLE.......................................84

5.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA PELE PERILESIONAL E

NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES (PRÉ-PUVA) COM A PELE DE

CONTROLES...........................................................................................................

5.4. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PELE PERILESIONAL E NÃO-

LESIONAL DOS PACIENTES COM VITILIGO- ANTES DO TRATAMENTO88

5.5. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA

PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES VERSUS

CONTROLES (PRÉ-TRATAMENTO)..................................................................95

5.6. CARACTERIZAÇÃO DO TRATAMENTO DOS PACIENTES COM PUVA.104

5.7. ILUSTRAÇÃO DE CASOS ..................................................................................106

5.8. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA

PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES, ANTES E

APÓS PUVA...........................................................................................................108

5.8.1 Ilustrações do efeito PUVA sobre o infiltrado cutâneo ...........................114

5.9. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS PÓS-

PUVA NA PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES COM

VITILIGO VERSUS CONTROLES NÃO-TRATADOS ....................................118

6. DISCUSSÃO......................................................................................................125

7. CONCLUSÕES..................................................................................................137

8. SUGESTÕES.....................................................................................................138

REFERÊNCIAS......................................................................................................139

ANEXO 1................................................................................................................154

ANEXO 2................................................................................................................156

ANEXO 3................................................................................................................159

ANEXO 4................................................................................................................160

ANEXO 5................................................................................................................161

ANEXO 6................................................................................................................162

ANEXO 7................................................................................................................171

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.Efeitos dos psoralenos fotoativados no sistema imune cutâneo...................60

Tabela 2. Principais efeitos RUV-mediados nos constituintes do sistema imune

cutâneo............................................................................................................................63

Tabela 3.Descrição dos anticorpos primários utilizados na Imuno-histoquímica........77

Tabela 4. Dose UVA utilizada no Setor de Fotodermatologia-HUCFF, de acordo com

o fototipo do paciente....................................................................................................79

Tabela 5.Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na Pele PL e NL do

vitiligo.............................................................................................................................162

Tabela 6.Análise comparativa da contagem de células CD8+ na Pele PL e NL do

vitiligo.............................................................................................................................162

Tabela 7.Análise comparativa da contagem de células CD4+ na Pele PL e NL do

vitiligo.............................................................................................................................162

Tabela 8.Análise comparativa da contagem de células CD3+ na Pele PL e NL do

vitiligo.............................................................................................................................163

Tabela 9.Análise comparativa da contagem de células CLA+ na Pele PL e NL do

vitiligo.............................................................................................................................163

Tabela 10.Análise do CD1a segundo o grupo- Pele PL...............................................163

Tabela 11.Análise do CD1a segundo o grupo- Pele NL..............................................163

Tabela 12.Análise do CD8 segundo o grupo- Pele PL.................................................164

Tabela 13.Análise do CD8 segundo o grupo- Pele NL.................................................164

Tabela 14.Análise do CD4 segundo o grupo- Pele PL.................................................164

Tabela 15.Análise do CD4 segundo o grupo- Pele NL.................................................164

Tabela 16. Análise do CD3 segundo o grupo- Pele PL.................................................164

Tabela 17.Análise do CD3 segundo o grupo- Pele NL.................................................165

Tabela 18. Análise do CLA segundo o grupo- Pele PL.................................................165

Tabela 19. Análise do CLA segundo o grupo- Pele NL.................................................165

Tabela 20.Contagem de células CD1a+ na Pele PL pré e pós-PUVA .......................165

Tabela 21.Contagem de células CD1a+ na Pele NL pré e pós-PUVA.......................166

Tabela 22.Contagem de células CD8+ na Pele PL pré e pós-PUVA..........................166

Tabela 23.Contagem de células CD8+ na Pele NL pré e pós-PUVA .........................166

Tabela 24.Contagem de células CD4+ na Pele PL pré e pós-PUVA..........................166

Tabela 25.Contagem de células CD4+ na Pele NL pré e pós-PUVA .........................167

Tabela 26.Contagem de células CD3+ na Pele PL pré e pós-PUVA..........................167

Tabela 27.Contagem de células CD3+ na Pele NL pré e pós-PUVA .........................167

Tabela 28.Contagem de células CLA+ na Pele PL pré e pós-PUVA..........................167

Tabela 29.Contagem de células CLA+ na Pele NL pré e pós-PUVA..........................168

Tabela 30.Contagem de células CD1a+ na Pele PL vs controles...............................168

Tabela 31.Contagem de células CD1a+ na Pele NL vs controles...............................168

Tabela 32.Contagem de células CD8+ na Pele PL vs controles.................................168

Tabela 33.Contagem de células CD8+ na Pele NL vs controles.................................168

Tabela 34.Contagem de células CD4+ na Pele PL vs controles.................................169

Tabela 35.Contagem de células CD4+ na Pele NL vs controles.................................169

Tabela 36.Contagem de células CD3+ na Pele PL vs controles.................................169

Tabela 37.Contagem de células CD3+ na Pele NL vs controles.................................169

Tabela 38.Contagem de células CLA+ na Pele PL vs controles .................................169

Tabela 39.Contagem de células CLA+ na Pele NL vs controles.................................170

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1.Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional

e não-lesional dos pacientes com vitiligo...................................................................

Gráfico 2.Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional e

não-lesional dos pacientes com vitiligo......................................................................89

Gráfico 3.Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele perilesional e

não-lesional dos pacientes com vitiligo......................................................................89

Gráfico 4.Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele perilesional e

não-lesional dos pacientes com vitiligo......................................................................90

Gráfico 5. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional e

não-lesional dos pacientes com vitiligo......................................................................90

Gráfico 6. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................96

Gráfico 7. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................96

Gráfico 8. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................97

Gráfico 9. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................97

Gráfico 10. Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................98

Gráfico 11. Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................98

Gráfico 12. Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................99

Gráfico 13. Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles..................................................99

Gráfico 14. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles................................................100

Gráfico 15. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles................................................100

Gráfico 16. Distribuição das lesões dos pacientes e casos de repigmentação com a

terapia PUVA em cada diferente localização..........................................................105

Gráfico 17. Contagem de células CD1a+ na pele perilesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA.........................................................................................109

Gráfico 18. Contagem de células CD1a+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA.........................................................................................109

Gráfico 19. Contagem de células CD8+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA.....................................................................................................

110

Gráfico 20. Contagem de células CD8+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA.........................................................................................

110

Gráfico 21. Contagem de células CD4+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA.....................................................................................................111

Gráfico 22. Contagem de células CD4+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA.........................................................................................111

Gráfico 23. Contagem de células CD3+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA.....................................................................................................

112

Gráfico 24. Contagem de células CD3+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA.........................................................................................

112

Gráfico 25. Contagem de células CLA+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA.....................................................................................................113

Gráfico 26. Contagem de células CLA+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA.....................................................................................................113

Gráfico 27. Contagem pós-PUVA do número de células CD1a+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................119

Gráfico 28. Contagem pós-PUVA do número de células CD1a+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................119

Gráfico 29. Contagem pós-PUVA do número de células CD8+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................120

Gráfico 30. Contagem pós-PUVA do número de células CD8+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................120

Gráfico 31. Contagem pós-PUVA do número de células CD4+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................121

Gráfico 32. Contagem pós-PUVA do número de células CD4+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................121

Gráfico 33. Contagem pós-PUVA do número de células CD3+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................122

Gráfico 34. Contagem pós-PUVA do número de células CD3+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................122

Gráfico 35. Contagem pós-PUVA do número de células CLA+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................123

Gráfico 36. Contagem pós-PUVA do número de células CLA+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados.......................

123

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática do melanócito na camada basal da epiderme.

..........................................................................................................................................56

Figura 2. Adutos monofuncionais ou bi-funcionais (crosslinks) entre o psoraleno e a

base pirimidínica de DNA.............................................................................................58

Figura 3. Distribuição dos pacientes com vitiligo quanto à faixa etária de

aparecimento da doença.............................................................................................81

Figura 4. Distribuição dos pacientes quanto ao tempo de evolução da doença.........81

Figura 5. Biopsias de pele PL (A-B) e NL (C-F) no vitiligo ativo....................................87

Figura 6. Células CD1a+ positivas bem marcadas na epiderme perilesional de

pacientes com vitiligo ativo...........................................................................................91

Figura 7. Pele perilesional com células CLA+ na epiderme e na derme superior

constituindo um infiltrado inflamatório exuberante (100x e 400X).........................92

Figura 8. Pele perilesional(A) e não-lesional (B) do mesmo paciente, mostrando

infiltrado de células CLA+ na epiderme e derme superior (100X).........................93

Figura 9. Pele perilesional (A) e não-lesional (B) com células CLA+ (400X).............94

Figura 10. Presença de células T CD8+ intraepiteliais na borda “ativa” de lesão de

vitiligo.............................................................................................................................102

Figura 11. Pele perilesional com células CLA+ intraepiteliais na topografia de

melanócitos na camada basal da epiderme............................................................103

Figura 12. Padrão de repigmentação folicular em resposta à PUVA..........................106

Figura 13. Padrão de repigmentação folicular na face em resposta à PUVA. ..........106

Figura 14. Pré e pós-PUVA com bom resultado.............................................................107

Figura 15. Pré e pós-PUVA com resultado satisfatório.................................................107

Figura 16. Células CD1a+ na pele perilesional pré(A) e pós-PUVA(B)......................115

Figura 17. Pele perilesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução importante

do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+ (100X)..........116

Figura 18. Pele não-lesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução

importante do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+

(100X)............................................................................................................................117

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Características clínico-laboratoriais dos 22 pacientes com vitiligo

acompanhados no HUCFF/UFRJ...............................................................................83

Quadro 2. Características dos indivíduos do grupo controle..........................................84

Quadro 3. Caracterização da resposta dos pacientes à PUVA...................................104

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

8-MOP

8-metoxipsoraleno

Acs

anticorpos

antígeno

Alfa-MSH

hormônio estimulador de melanócitos

AntiTPO

anticorpos antitireoperoxidase

APCs

células apresentadoras de antígeno

APO-1

receptor apoptótico celular

borda ativa (de lesão)

cálcio

CAT

catalase

grupo de diferenciação (clusters of differentiation)

células de Langerhans

CLA

antígeno cutâneo linfocitário

CMV

citomegalovírus

DHA

dihidroxiacetona

diabetes mellitus

DPVS

dermatite perivascular superficial leve

E-selectina

selectina endotelial

ET-1

endotelina-1

FasL

ligante de Fas

coloração pelo Fontana-Masson

FucTVII

alfa-1,3- fucosiltransferase VII

GM-CSF

fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos

H2O2

peróxido de hidrogênio

coloração pela hematoxilina-eosina

HIV

vírus da imunodeficiência humana

HLA

antígeno leucocitário humano

ICAM-1

molécula de adesão intercelular 1

interleucina

incontinência pigmentar

LFA-1

alfa-1-beta 2 integrina ou antígeno associado à função linfocitária-1

MAO-A

monoamino-oxidase A

MHC

complexo principal de histocompatibilidade

NFAT

fator nuclear de células T ativadas ou nuclear factor of activated T

cells

PCR

reação em cadeia de polimerase

Pele PL

pele perilesional

Pele NL

pele não-lesional

PMB

pigmentação melânica basal

PSGL-1

glicoproteína ligante de p-selectina

PUVA

puvaterapia

risco relativo

RUVA

radiação ultravioleta A

SIDA

síndrome da imunodeficiência adquirida

TMP

Trimetilpsoraleno

TNF

fator de necrose tumoral

TRP-1

proteína relacionada a tirosinase-1

TRP-2

proteína relacionada a tirosinase-2

TUNEL

terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP-biotin nick-end

labeling

Ultravioleta

UVA

ultravioleta A

UVB

ultravioleta B

VAMA

antígenos dos melanócitos associados ao vitiligo

VCAM-1

molécula de adesão célulo-vascular-1

VLA-4

alfa 4-beta 1 integrina ou antígeno de expressão muito tardia (very

late-activation antigen)

1. INTRODUÇÃO

Vitiligo se caracteriza pelo desenvolvimento de máculas brancas, como

resultado da perda de melanócitos. Seu curso natural é imprevisível, mas a

despigmentação freqüentemente progride em áreas expostas da pele,

principalmente na face, alterando a aparência do indivíduo consideravelmente

(NJOO & WESTERHOF, 2001).

A doença é geralmente abordada como um problema estético, mas na

verdade tem repercussões na qualidade de vida dos pacientes, que em muitos

casos melhora paralelamente com o grau de repigmentação obtida com o tratamento

(NJOO e cols., 2000). Além disto, embora existam várias hipóteses para a sua

etiologia, como a neural, a auto-citotóxica e a imunológica (KOVACS, 1998),

crescentes evidências sugerem que vitiligo seja mesmo uma doença auto-imune.

Sua associação com condições auto-imunes (ALKHATEEB e cols., 2003; LABERGE

e cols., 2005), auto-anticorpos antimelanócitos e outros, órgão-específicos

(FARROKHI e cols., 2005), e a presença de linfócitos T ativados melanócito-

específicos nas lesões reforçam esta hipótese. Adicionalmente, fenômenos

imunogenéticos parecem se correlacionar com a duração do vitilligo (ONGENAE e

cols., 2003). Ou seja, quanto maior seu tempo de evolução, maior a probabilidade

dos pacientes desenvolverem subseqüentemente outra doença auto-imune clínica

ou subclínica associada. Isto justifica o seguimento e a investigação das principais

condições que se associam ao vitiligo nestes pacientes (BETTERLE e cols., 1985

apud ONGENAE e cols., 2003).

Estudos mostram a participação da imunidade celular no vitiligo tanto

localmente na pele afetada, quanto no sangue periférico (ONGENAE e cols., 2003).

Infiltrados de linfócitos T CD8-CLA+ intra-epidérmicos têm sido observados em

áreas despigmentadas e perilesionais, particularmente em regiões justapostas a

melanócitos, através de métodos imuno-histoquímicos (AL BADRI e cols., 1993; LE

POOLE e cols., 1996; VAN DEN WINJGAARD e cols., 2000a; WANKOWICZ-

KALINSKA e cols., 2003). Esta análise do infiltrado inflamatório que “acompanha” a

despigmentação tem sugerido uma reação imune mediada por células T (ONGENAE

e cols., 2003), e uma possível destruição dos melanócitos pelos linfócitos T

citotóxicos (LE POOLE e cols., 2004). Linfócitos T citotóxicos circulantes, específicos

para melanócitos, também já foram detectados em altas freqüências em pacientes

com a doença (OGG e cols., 1998). Adicionalmente, a hipopigmentação da pele em

alguns pacientes com melanoma indica um ataque local específico de células T

contra melanócitos na etiopatogenia do vitiligo comum (BECKER e cols., 2002; LEE

& MODLIN, 2005). A presença de células T expressando o antígeno cutâneo

linfocitário (CLA) nas lesões em atividade sugere um recrutamento destas células da

circulação periférica para a pele afetada, e sua participação na resposta imune (AL

BADRl e cols., 1993; LE POOLE e cols., 1996; HANN e cols., 1992). Provavelmente

o sistema imune está envolvido, não via anticorpos citotóxicos, mas por apoptose

induzida pela liberação de citocinas como a interleucina-1 e o TNF-alfa, por linfócitos

T ativados (HUANG e cols., 2002).

Alguns autores observaram alterações histológicas também na pele

clinicamente sã de pacientes com vitiligo, tais como vacuolização da camada basal,

infiltrado mononuclear, degeneração de melanócitos, melanófagos dérmicos,

queratinócitos vacuolizados e material granular extracelular, através de microscopia

óptica e eletrônica (MOELLMANN e cols., 1982; BHAWAN & BHUTANI, 1983; HANN

e cols., 1992; MOSHER e cols., 1999a). Curiosamente, um estudo recente

(WANKOWICZ-KALINSKA e cols., 2003) mostrou uma infiltração intraepidérmica de

células T paralela à perda localizada de melanócitos (“microdespigmentação”), na

pele não-lesional no vitiligo. A existência de uma reação auto-imune na pele

normalmente pigmentada dos pacientes teria implicações importantes, como por

exemplo, insucesso no tratamento cirúrgico com enxertos autólogos de pele

“aparentemente normal”, além da possibilidade de lesões novas nos sítios “não-

lesionais”. Os achados descritos não foram posteriormente confirmados.

A puvaterapia (PUVA), que é possivelmente um dos tratamentos mais

tradicionais do vitiligo (BETHEA e cols., 1999) parece ter como efeito básico a

modulação do sistema imune da pele, em doenças mediadas por células T. Ela é

implicada, por exemplo, como responsável pela morte de linfócitos e efeitos anti-

inflamatórios no linfoma T cutâneo (MATSUMURA & ANANTHAWAMY, 2004; DE

RIE & BOS, 2005). Entretanto, sua atividade imunossupressora no microambiente

cutâneo no vitiligo, especialmente na fase de repigmentação, ainda não foi

amplamente estudada. Não encontramos na literatura estudos mostrando sua ação

sobre linfócitos T-CLA+ no vitiligo em atividade, como já visto na psoríase em

estudos com radiação ultravioleta B (SIGMUNDSDOTTIR e cols., 2003).

Novos estudos sobre a reação imune local no vitiligo poderiam esclarecer

questões importantes, como: Qual o grau de comprometimento imunológico da pele

na doença? A “universalidade” da pele está comprometida? O que difere os sítios

lesionais e não-lesionais dos pontos de vista histológico e do “sistema imune

cutâneo”? Que efeito PUVA sobre o microambiente cutâneo resulta em

repigmentação? Existe um “controle” da doença com o tratamento? As respostas a

estes questionamentos talvez permitam avançar no conhecimento da

etiopatogênese do vitiligo e do papel funcional das células T neste processo.

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL:

• Caracterizar imunofenotipicamente o infiltrado celular na pele

perilesional (borda ativa) e não-lesional de pacientes com vitiligo não-

segmentar, progressivo, comparando os achados nestes 2 segmentos

do tegumento entre si, antes e após 20-30 sessões de fototerapia

(PUVA), e com controles saudáveis.

2.2. ESPECÍFICOS:

• Avaliar histologicamente achados inflamatórios e concernentes à

pigmentação melânica basal na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes, comparando estes 2 segmentos do tegumento entre si, e

com controles.

• Avaliar o infiltrado celular cutâneo por imuno-histoquímica, identificando

os grupos de linfócitos T, as células de Langerhans (CL) e a expressão

do antígeno cutâneo leucocitário (CLA) na pele dos pacientes, tanto em

área lesional quanto não-lesional, comparando estes 2 segmentos do

tegumento entre si, e com controles.

• Avaliar os efeitos da PUVA sobre o infiltrado celular cutâneo,

especialmente grupos de linfócitos T, CL e a expressão do CLA, na

pele perilesional e não-lesional dos pacientes, comparando os achados

imuno-histoquímicos pré e pós-tratamento, e com controles saudáveis.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. VITILIGO

3.1.1. Sua origem e épocas antigas

“Vitiligo” é uma palavra derivada do termo em latim “vitium”, que significa

defeito ou mancha e o sufixo “igo” (MOSHER e cols., 1999a); ou da palavra em

latim “vitelius”, significando “placas brancas de um bezerro” (FITZPATRICK, 1964).

Classicamente é citado em escritos seculares, como a Bíblia Sagrada e o

Alcorão (MOSHER e cols., 1999a). Na Bíblia (1993), há referências a manchas

brancas na pele como sendo “chagas de lepra”, porém em algumas citações a

leucodermia parece se tratar de vitiligo, como: “se a chaga se estendeu por toda a

pele do doente...e o sacerdote que o examinar verificar que a lepra cobre toda a

pele...Como se tornou completamente branco é puro”; ou: “se o cabelo na mancha

branca se tornou branco…” . Outras partes parecem mesmo se referir à hanseníase,

como: “no dia em que se perceber nele a carne viva....a carne viva é impura, é a

lepra”. As características das doenças parecem se misturar em algumas citações.

Estudos da Bíblia original em grego e hebreu mostraram que algumas doenças

despigmentantes agrupadas sob o termo “Zora'at”, traduzido como “lepra”,

correspondem a vitiligo, e a maioria das outras não é lepra (GOLDMAN e cols.,

1966). Uma citação bíblica do livro dos Reis (BÍBLIA, 1993) parece ser uma das

primeiras referências históricas à uma base genética do vitiligo: “a lepra de Naamã

se pegará a ti e à toda a tua descendência para sempre. E Giezi saiu da presença

de Eliseu coberto de um lepra branca como a neve”....(NAIR, 1978).

No livro indiano Atharvaveda (1500 A.C.) são usados os termos “kilas” (“kil”

significa branco, e “as”, jogar fora), e “palita” (“pal” significa cinzento, envelhecido)

referindo-se a manchas brancas na pele. No Manusmriti (200 A.C.), o código de

comportamento de leis da Índia, diz-se que as vítimas do “suitra” (branqueamento

difuso) não eram respeitadas na sociedade. Como o estigma social fazia os

pacientes esconderem suas lesões brancas em vilas na Índia, a doença foi e é

chamada frequentemente de “doença secreta” (KOVACS, 1998).

No livro sagrado muçulmano, o Alcorão (Koran), as palavras “baras” e “bohak”

referem-se à doença com manchas brancas, e envolvem forte discriminação dos

afetados, podendo levar à sua exclusão da vida social e até da própria família.

Portanto, o estigma associado com o vitiligo data de épocas muito antigas,

em que era mais confundido com hanseníase e outras desordens despigmentantes,

e é ainda muito intenso em algumas culturas, como no mundo islâmico (observação

pessoal).

3.1.2. Epidemiologia

Incidência

Vitiligo é uma doença cutânea relativamente comum que ocorre em

aproximadamente 0.1-2% da população mundial (ALKHATEEB e cols., 2003),

embora sua incidência varie de 0.14 a 8.8% em diferentes populações (MOSHER e

cols., 1999a).

Idade

Pode se desenvolver em qualquer idade, mas aproximadamente 50% dos

afetados manifestam a doença antes dos 20 anos, e sua incidência tende a diminuir

com o aumento da idade (LERNER, 1959; KOVACS, 1998). Seu início já foi

detectado desde o nascimento até 97 anos de idade (KORANNE & SACHDEVA,

1988), porém o vitiligo congênito é muito raro (MOSHER e cols., 1999a).

Num estudo sobre o início tardio do vitiligo foi encontrada uma incidência

relativa de vitiligo igual a 2.4% num grupo de 2672 pacientes que frequentavam o

ambulatório de Dermatologia por um período de 10 anos. Dentre os afetados, 6,8%

tinham mais que 50 anos de idade, sendo que a maioria destes (74%) teve início da

doença entre 50-60 anos, e uma minoria (5%) acima de 70 anos. Assim, embora o

pico da incidência esteja entre 10 e 30 anos, a doença é vista também no idoso,

tendendo a ser mais estável, com nenhuma progressão por quase 2 anos de

seguimento, na maioria dos pacientes (DOGRA e cols., 2005).

Incidência racial

Todas as raças são afetadas. Entretanto, o vitiligo parece ser observado mais

em áreas fotoexpostas e em fototipos de pele mais escuros (MOSHER e cols.,

1999a). Um estudo coreano sugere que pessoas racialmente mais pigmentadas têm

uma probabilidade mais elevada de desenvolver vitiligo e maior incidência do que

pessoas com pele clara. A doença tem um impacto social maior nos indivíduos com

tons de pele mais escuros (AHN e cols., 2000), porque neles a despigmentação é

mais aparente (LE POOLE e cols., 2004).

Incidência segundo o sexo

Ambos os sexos são afetados igualmente (MOSHER e cols., 1999a; LIU e

cols., 2005), embora alguns estudos demonstrem prevalência feminina. Isto pode

ser atribuído a uma probabilidade maior das mulheres procurarem atenção médica

para o problema e sua preocupação com a estética (HOWITZ e cols., 1977;

KOVACS, 1998; MOSHER e cols., 1999a).

3.1.3. Fatores precipitantes

Muitos pacientes atribuem o início da sua doença a eventos específicos nas

suas vidas, tais como: estresse emocional intenso, queimadura solar, doença

debilitante, procedimentos cirúrgicos, gravidez, parto e trauma físico. Um estudo

antigo sobre vitiligo no Brasil mostrou que especialmente em áreas localizadas do

corpo, “traumatismo” parece ter um papel preponderante. O autor observou casos

nos quais o processo acrômico ocorria exclusivamente nos joelhos, cotovelos, dorso

de ambos os pés, e margens ulnares das mãos, locais onde o traumatismo é muito

freqüente (COSTA, 1947).

Recentemente, Mason e Gawkrodger (2005) relataram que 22% dos seus

pacientes com vitiligo identificaram espontaneamente fatores que tinham

desencadeado a doença, tais como: gravidez, fricção, queimadura solar, erupção

por droga, dermatite por irritantes, arranhões e coçaduras na pele, e cirurgia. No

entanto, com exceção do fenômeno de Koebner, não há provas consistentes de que

estes fatores sejam causais ou precipitantes de vitiligo (KORANNE & SACHDEVA,

1988; ORTONNE, 2003).

3.1.4. Características Clínicas

Vitiligo é uma desordem cutânea que pode ser congênita ou adquirida, e se

caracteriza por máculas branco-leitosas, acrômicas ou hipocrômicas, bem

circunscritas, geralmente sem nenhuma alteração na textura da pele (LE POOLE e

cols., 1993a; MOSHER e cols., 1999a; VÁZQUEZ-MARTINÉZ e cols., 2006).

Microscopicamente as lesões são desprovidas de melanócitos identificáveis.

Os sítios iniciais de aparecimento da doença geralmente são a pele em torno

dos orifícios do corpo (face: em torno dos olhos, do nariz, da boca, das orelhas),

sobre proeminências ósseas (dorso das mãos e dos pés), áreas fotoexpostas, locais

de trauma repetido, tais como cotovelos, joelhos e tornozelos, áreas de dobras

(axilas e regiões inguinais), ou áreas pigmentadas do corpo (KORANNE &

SACHDEVA, 1988). O envolvimento de mucosas não é infreqüente; a região genital,

mamilos, lábios e gengiva podem ser envolvidos. A afecção na região periungueal

pode ocorrer isoladamente ou associada a lesões em superfícies mucosas (lábios,

pênis distal, mamilos), quando é chamada vitiligo de lábios e pontas/extremidades

(”lip-tip vitiligo”) (MOSHER e cols., 1999a). Raramente o prurido pode ocorrer,

mesmo quando não há nenhuma queimadura solar associada (BLEEHEN &

EBLING, 1998). Cabelo acinzentado pode freqüentemente ser observado sobre as

máculas de vitiligo, o que se denomina “leucotríquia” (MOSHER e cols., 1999a).

Pode haver apenas uma ou centenas de máculas, que podem ser pequenas

ou grandes no tamanho, e em formas diferentes. Geralmente, o vitiligo progride com

o tempo, e então as máculas se ampliam e coalescem. Numa grande coorte de

pacientes (n=4118) na China, Liu e colaboradores (2005) observaram que cerca de

¾ de seus pacientes apresentaram vitiligo focal inicialmente; entretanto, mais da

metade destes casos pioraram e evoluíram para outros tipos clínicos. Quando o

vitiligo se torna extenso de modo que pouco pigmento normal permaneça na pele, as

ilhotas remanescentes de pigmentação normal têm bordas côncavas, como se o

processo fosse ainda evoluir por inteiro. No vitiligo em fase de repigmentação ativa,

as margens perdem seu caráter “impressionista” e transformam-se em formas

“surrealistas” e novamente convexas, representando focos de melanócitos migrando

para dentro da pele afetada pelo vitiligo (MOSHER e cols., 1999a).

De acordo com o padrão característico de distribuição das lesões, o vitiligo é

categorizado nos seguintes grupos (KOVACS, 1998):

1) Vitiligo Generalizado

(não-segmentar) : é a apresentação mais comum da doença,

caracterizada por despigmentação simétrica, bilateral. Os pacientes afetados têm

poucas a muitas máculas espalhadas pelo corpo, envolvendo a face, principalmente

nas áreas periorificiais, pescoço, tronco, superfícies extensoras ou proeminências

ósseas das mãos, punhos e pés, orifícios ou superfícies mucosas. Seu típico curso

é lento, progredindo ao longo de anos. Ocasionalmente pode levar à total

despigmentação. Outras vezes remissão espontânea e repigmentação são

observadas.

2) Vitiligo Focal – máculas despigmentadas numa área localizada, que não seguem

a distribuição de um dermátomo, e são limitadas em tamanho e número. Cerca de

20% das crianças com vitiligo têm este padrão (MOSHER e cols., 1999a);

3) Vitiligo Acrofacial- despigmentação da região distal dos dedos e de áreas

periorificiais, sendo a última num padrão circunferencial (KOVACS, 1998).

Alguns autores incluem as formas focal, acrofacial e acral como entidades

separadas, mas sua história natural e resposta ao tratamento são a mesma, tanto

como entidades isoladas, como quando são parte do vitiligo generalizado. Portanto,

podem ser consideradas como subtipos do vitiligo generalizado (MORELLI, 2000).

4) Vitiligo Segmentar- caracterizado por máculas unilaterais que ocorrem restritas a

um dermátomo, um segmento do tegumento, num padrão assimétrico. Não progride

para vitiligo generalizado (GAUTHIER e cols., 2003a), mas tende a se espalhar mais

rapidamente dentro do segmento (MORELLI, 2000) e ser resistente ao tratamento.

Apresenta início mais precoce (LIU e cols., 2005), curso estável, menos associação

com doenças auto-imunes, e não é familial. Fenômeno de Koebner não ocorre. A

área trigeminal é o sítio mais envolvido. É bem mais comum em crianças (20%) do

que em adultos(5%) (MOSHER e cols., 1999a; HALDER e cols., 1987).

5) Vitiligo Universal

- É um vitiligo difuso no qual há poucas áreas remanescentes de

pigmentação normal da pele. As áreas fotoexpostas são o local inicialmente

afetado na maioria dos pacientes. Tem sido associado com a síndrome de

endocrinopatia múltipla (MOSHER e cols., 1999a).

Além dos grupos acima descritos, há um tipo especial de vitiligo denominado

vitiligo tricrômico

, por Fitzpatrick em 1964. Foi chamado anteriormente de “vitiligo

gradata” (PINKUS, 1959). A lesão característica tem um centro acrômico, uma zona

intermediária de hipocromia, e a pele não-afetada periférica. Resulta em máculas

com 3 tons de cor: marrom, “bronzeado” (marrom mais claro) e branco, no mesmo

paciente, e podem evoluir a uma mácula de vitiligo típico. Geralmente, o pêlo nas

lesões permanece com cor normal, mas nas lesões mais antigas pode ser

despigmentado. As bordas das máculas podem tornar-se hiperpigmentadas. O

fenômeno de Koebner pode ocorrer. Permanece por ser definido se a forma

tricrômica é um fenômeno temporário de vitiligo ativo progressivo ou uma

hipomelanose que mostra um padrão incomum de progressão (HANN e cols., 2000).

Um outro tipo diferente de vitiligo, chamado vitiligo inflamatório é mais raro e

caracterizado por uma borda eritematosa elevada (“angry-red border”), que pode

estar presente já no início da doença ou surgir depois, em torno das clássicas

máculas despigmentadas do vitiligo (VERMA, 2005). Pode se associar com

dermatite atópica (SUGITA e cols., 2006) e ter características histopatológicas

incomuns (nas bordas elevadas) como mudanças psoriasiformes, ampliando a

confusão sobre a participação dos fenômenos inflamatórios no vitiligo (VERMA,

2005).

3.1.5. Achados Histopatológicos

De acordo com Ackerman e colaboradores (2000), vitiligo é

fundamentalmente um processo inflamatório que se inicia com um infiltrado

perivascular superficial leve de linfócitos, e com presença de linfócitos também na

epiderme, acompanhada de leve espongiose. No começo, a junção dermo-

epidérmica está preenchida pelos melanócitos, mas com o tempo eles desaparecem

completamente nos locais afetados. Quando eles desaparecem, nenhuma melanina

é produzida e a pigmentação melânica basal da epiderme estará ausente nas lesões

pela coloração com Fontana-Masson (FM).

Um estudo de microscopia eletrônica revelou diferenças importantes entre as

lesões precoces e lesões tardias de vitiligo (GALADARI e cols., 1993). Graus

variáveis de degeneração de melanócitos juncionais e queratinócitos na borda das

máculas recentes (< 1 ano de evolução) foram observadas. Agentes citotóxicos

contra melanossomos levariam a achados degenerativos em todas as células que

contém essas estruturas (melanócitos ou queratinócitos). Já nas lesões de vitiligo

com duração de 1 a 5 anos houve uma ausência completa de melanócitos e de

pigmentação epidérmica. A conclusão do estudo foi que nas lesões antigas a

repigmentação pode ocorrer somente através dos reservatórios de melanócitos nos

folículos pilosos, por causa da ausência completa de melanócitos nestes casos.

Entretanto, em lesões recentes, a repigmentação pode também ocorrer pela

reativação de melanócitos remanescentes na área. Isto justifica o tratamento do

vitiligo em seus estágios precoces do desenvolvimento.

Resultados similares foram demonstrados por um método imuno-histoquímico

altamente específico para a detecção dos melanócitos (anticorpo NKI-beteb): na

pele afetada, houve ausência de melanócitos ou sua presença ocasional e com

sinais de degeneração; já na pele não-lesional do vitiligo, foram encontrados em

grande número, sem diferença aparente em relação à pele de controles normais (LE

POOLE e cols., 1993a). Outros autores identificaram mudanças histológicas apenas

na pele afetada, tais como: alterações inflamatórias em lesões recentes e mudanças

degenerativas em máculas de longa duração, além de alterações degenerativas nos

nervos e glândulas sudoríparas (GOKHALE & MEHTA, 1983).

Contrariamente, Hann e colaboradores (1992) observaram os seguintes

achados importantes na pele não-lesional de pacientes com vitiligo ativo: mudanças

degenerativas nos melanócitos, alteração vacuolar da camada basal, infiltração

epidérmica e dérmica de linfócitos, e melanófagos na derme superior.

Posteriormente foi descrito que a pele clinicamente sã dos pacientes, em biopsias

realizadas até 15 cm das lesões de vitiligo, apresenta: queratinócitos vacuolados,

material granular extracelular e vacuolização da camada basal da epiderme. Estes

achados sugerem que a pele não-lesional, adjacente ou não à pele vitiligóide,

mostra alterações histopatológicas características, indicando que a imunidade

celular pode estar envolvida na patogênese do vitiligo (MOSHER e cols., 1999a).

De acordo com vários autores, uma infiltração linfocitária epidérmica e/ou

dérmica está presente nas máculas progressivas de vitiligo (NORDLUND &

LERNER, 1982; AL BADRI e cols., 1993; AHN e cols., 1994; LE POOLE e cols.,

1996; VAN DEN WIJNGAARD e cols., 2000a) e no vitiligo inflamatório (HANN e

cols., 2000). Recentemente, foi demonstrado que o infiltrado mononuclear

epidérmico ocorre em 80% das lesões e áreas marginais de vitiligo, cujo tempo de

evolução variou entre 3-12 semanas, sugerindo a infiltração linfocítica epidérmica

como o evento imunológico primário no vitiligo (SHARQUIE e cols., 2004).

Vale frisar que os achados no vitiligo não-segmentar são distintos daqueles

do vitiligo segmentar, que tem características peculiares. E os achados inflamatórios

no vitiligo em atividade divergem daqueles no vitiligo estável. Portanto, atentar para

o grupo/forma clínica que se apresenta é a primeira abordagem para uma avaliação

acurada das lesões. Como o estudo do infiltrado cutâneo e da imunidade celular no

vitiligo estão incluídos nos objetivos deste trabalho, serão melhor discutidos a seguir.

3.1.6. Teorias Etiopatogênicas

A etiopatogenia do vitiligo permanece incerta, mas há várias teorias para

explicá-la, tais como: teoria auto-imune, genética, autocitotóxica, neural, além da

teoria infecciosa, do estresse oxidativo, da melanocitorragia, quebra da tolerância, e

“teoria convergente”, dentre outras.

Há fortes evidências para uma causa auto-imune para o vitiligo, embora a

doença seja heterogênea, e partes das teorias pareçam estar corretas em

determinados subgrupos de pacientes (NORRIS e cols., 1994 apud Morelli, 2000).

Teoria Auto-imune

Esta teoria é baseada na associação freqüente que existe entre vitiligo e

fenômenos auto-imunes (CASTANET & ORTONNE, 1997; ORTONNE, 2003). Há

fatores principais que reforçam essa teoria, e serão melhor explicados a seguir:

1) a detecção de anticorpos (Acs) circulantes antimelanócitos (chamados

genericamente “anticorpos do vitiligo”) em pacientes com vitiligo;

2) a associação de vitiligo com outras doenças auto-imunes;

3) a detecção de Acs órgão-específicos em pacientes com vitiligo e seus

parentes de primeiro grau;

4) a presença de infiltrado linfocitário na borda de lesões de vitiligo;

5) a associação entre melanoma e surgimento de lesões vitiligo-símile;

6) boa resposta clínica a tratamentos “imunossupressores”, como a PUVA,

corticoterapia, e novos imunomoduladores, como o tacrolimus;

7) a associação da doença com alguns marcadores HLA.

Vitiligo e auto-anticorpos

Alguns autores estudaram o envolvimento do componente humoral no

vitiligo, devido à sua associação com doenças auto-imunes e detecção de auto-

anticorpos, tanto nos pacientes como nos seus parentes próximos (CUNLIFFE e

cols., 1968). Naughton e colaboradores (1986) encontraram correlação entre a

extensão da despigmentação e a presença/nível de Acs antimelanócitos (método de

imunoprecipitação), sendo este significativamente mais alto nos grupos com doença

mais extensa (n=32). Curiosamente, o único paciente no grupo com despigmentação

extensa que não apresentou Acs do vitiligo foi um paciente que apresentava

repigmentação espontânea.

Uma correlação entre a incidência e nível de Acs antimelanócitos e a

atividade de doença no vitiligo (ensaio imunoenzimático- ELISA) também foi

descrita. Acs IgG anticélulas pigmentares estiveram presentes em 80% dos

pacientes com vitiligo “ativo”(n=24), mas não foram observados em nenhum dos

pacientes com doença inativa ou em indivíduos normais (HARNING e cols., 1991).

Outro estudo demonstrou Acs antimelanócitos em 17 casos (31%) de vitiligo (n=55)

e ausência no grupo-controle (p<0,0001), além de diminuição significativa dos

valores de C3 e C4 em ¼ dos pacientes comparados ao grupo controle, talvez pelo

seu consumo durante a reação auto-imune (FARROKHI e cols., 2005).

Adicionalmente, foi observada uma marcante destruição de melanócitos na pele

normal enxertada em ratos nudes* quando injetados com fração IgG do soro de

pacientes com vitiligo, reforçando o papel da imunidade humoral na doença. Tal

efeito não ocorreu na pele tratada com IgG de controles (GILHAR e cols., 1995).

Outros achados falam contra o envolvimento da imunidade humoral no

desencadeamento do vitiligo. Morgan e colaboradores (1986) relataram ausência de

Acs antimelanócitos (imunofluorescência indireta com fixação de complemento) em

26 casos de vitiligo estudados, sendo 17 deles vitiligo generalizado. Além disto, já foi

observada uma baixa incidência de Acs do vitiligo em pacientes com melanoma,

ainda que as células pigmentadas do melanoma expressem antígenos do vitiligo,

sugerindo que a liberação destes antígenos não seja a única causa para o achado

de Acs do vitiligo nesta doença acrômica (BYSTRYN & NAUGHTON, 1984). Um

significativo percentual (25 a 30%) de pacientes afetados não apresentam Acs

antimelanócitos, e tais Acs podem ser encontrados em títulos baixos em pequena

percentagem de pacientes sem a doença (CASTANET & ORTONNE, 1997). Além

disto, Acs circulantes de pacientes com vitiligo reconhecem determinantes

antigênicos em outras células, como os queratinócitos (YU e cols., 1993).

Muitos autores têm mostrado uma freqüência aumentada de outras condições

auto-imunes em pacientes com vitiligo e parentes próximos, incluindo Acs órgão-

específicos. Morgan e colaboradores (1986) observaram auto-anticorpos circulantes

* Ratos nudes são ratos nascidos sem o timo e portanto sem linfócitos T. Tumores humanos

freqüentemente crescem nestes ratos. Por razões desconhecidas são desprovidos de pêlo.

em 34,6% dos pacientes com diferentes subtipos de vitiligo (n=26). Dentre os

pacientes com vitiligo generalizado, Acs antitireoidianos (padrão antimicrossomal) e

antinucleares foram encontrados em 36% (15,3% do grupo total); e Acs antimúsculo

liso e antimitocondriais em 9% (3,8% do grupo total). Ao contrário, nenhum caso de

vitiligo segmentar apresentou auto-anticorpos circulantes. Ou seja, essa correlação

descrita entre a forma clínica da doença e a presença de auto-anticorpos (75% dos

pacientes com vitiligo generalizado) mostra que a forma clínica de vitiligo que é

melhor associada com auto-imunidade é o vitiligo generalizado. Mandry e

colaboradores (1996) também encontraram uma freqüência significativamente

aumentada de Acs antitireoglobulina, antimicrossomal, anticélula parietal e

antiadrenal em pacientes com vitiligo quando comparados com controles normais.

A tirosinase tem sido implicada como um auto-antígeno no vitiligo de acordo

com diferentes estudos (SONG e cols., 1994; BAHARAV e cols., 1996; KEMP e

cols., 1997). Auto-anticorpos IgG antitirosinase têm sido observados em pacientes

com vitiligo localizado ou generalizado, e seus títulos são bem maiores na forma

generalizada do que nos pacientes com doença localizada ou controles saudáveis

(BAHARAV e cols., 1996). Contrariamente, outros autores acreditam que outros

auto-antígenos do melanócito que não a tirosinase são alvos importantes da

resposta auto-imune no vitiligo. Kemp e colaboradores (1997) encontraram baixa

freqüência de auto-anticorpos antitirosinase no soro de poucos pacientes (11%) com

vitiligo. Xie e colaboradores (1999) também mostraram que os Acs do vitiligo não

estão dirigidos à tirosinase, pois ocorreram com freqüência igual nos pacientes com

e sem vitiligo.

As moléculas MART-1 e gp-100 são consideradas os antígenos mais

imunogênicos das células melanocíticas, e os linfócitos T que infiltram melanomas

são frequentemente mais reativos com esses 2 antígenos (OYARBIDE-VALENCIA e

cols., 2006).

Vitiligo e doenças associadas

Uma associação com doenças auto-imunes, principalmente doença

tireoidiana (CUNLIFFE e cols., 1968; HEGEDUS e cols., 1994; ZETTINIG e cols.,

2003; LABERGE e cols., 2005), tem sido evidenciada em pacientes com vitiligo,

incluindo crianças e adolescentes. A tireoidite de Hashimoto foi 2,5 vezes mais

freqüente nestes grupos etários com vitiligo do que numa população saudável

pareada por idade e sexo, e geralmente sucede o início do vitiligo (KAKOUROU e

cols., 2005). Os estudos mostram diferentes prevalências de tireoidite auto-imune

coexistindo com vitiligo em adultos, tais como: 19% (ALKHATEEB e cols., 2003),

21% (ZETTINIG e cols., 2003) até 34%(MASON & GAWKRODGER, 2005).

Membros afetados de famílias com múltiplos casos de vitiligo apresentam

elevadas freqüências de tiroidite auto-imune, artrite reumatóide, psoríase, diabetes

mellitus (DM) tipo II, anemia perniciosa e doença de Addison. Isto reflete

provavelmente um componente genético de suscetibilidade auto-imune herdado

nestas famílias (LABERGE e cols., 2005). O DM insulino-dependente é encontrado

em 1-7% dos pacientes com vitiligo (MOSHER e cols., 1999a); a relação inversa

também já foi descrita, de modo que 4,8% de todos os pacientes diabéticos

apresentavam também vitiligo (ALKHATEEB e cols., 2003).

Embora a associação entre psoríase e vitiligo seja conhecida, sua inter-

relação ainda não é bem compreendida. Numa série de 4700 pacientes com

psoríase na Índia, avaliados num período superior a 14 anos, foram encontrados 38

pacientes (0,8%) com vitiligo. Naqueles afetados pelas 2 doenças, a psoríase

ocorreu nas máculas despigmentadas e na pele normal com freqüência igual, sendo

incomum a chamada “co-localização” estrita das duas doenças. Além disto, o início e

o curso da psoríase e do vitiligo foram independentes (SANDHU e cols., 2004).

Entretanto, há relato da ocorrência de lesões psoriásicas confinadas estritamente às

áreas de vitiligo (DHAR e cols., 1998), e de uma possível ligação patogênica entre

as duas doenças, explicadas por auto-imunidade, neuropeptídeos comuns, e

fenômeno de Koebner (MENTER e cols., 1989; PASIC e cols., 2002). No Brasil, foi

observada uma prevalência de 3,06% da associação de vitiligo e psoríase, num

estudo retrospectivo de 740 pacientes submetidos à fototerapia (CASTRO, 2005).

Numa coorte de 3742 casos de vitiligo na China, as principais condições

significativamente associadas à doença em comparação com a população geral

foram: alopecia areata, artrite reumatóide, ictiose, e urticaria crônica. As doenças da

tireóide foram mais freqüentes nas mulheres com vitiligo, e não significativas em

homens afetados. Nestes, mais casos de diabetes (não especificado) foram

identificados, entretanto sem significância estatística. Foi também enfatizado o

achado incomum de vitiligo associado com artrite reumatóide, que embora sendo

válido para a população da China, pode sugerir um papel para o estresse oxidativo

nas duas doenças (LIU e cols., 2005).

Além das doenças previamente citadas, elevadas freqüências do próprio

vitiligo, lupus eritematoso (LE) sistêmico e provavelmente doença inflamatória

intestinal já foram encontradas nos casos de vitiligo generalizado e seus primeiros

parentes de primeiro grau (ALKHATEEB e cols., 2003). A associação de LE e vitiligo

é muito rara e curiosa. Mesmo se for acidental, o aparecimento de lesões de LE em

áreas fotoexpostas de vitiligo pode ser explicada pela fotossensibilidade que é

comum às duas doenças. Entretanto, os pontos comuns entre estas afecções

quando ocorrem na pele não-exposta à luz ainda não foram explicados. O papel do

vitiligo nestes casos excepcionais poderia representar uma desordem mais

complexa da junção dermo-epidérmica, afetando mais do que o sistema

melanocítico e favorecendo subseqüentemente a ocorrência do LE cutâneo

(FORESTIER e cols., 1981).

Outras doenças já foram descritas em associação com vitiligo, tais como:

miastenia gravis (LAMARTINE DE ASSIS e cols., 1983); síndrome de Sezary

(ALCALAY e cols., 1987); esclerodermia (DERVIS e cols., 2004); líquen plano

(RUBISZ-BRZEZINSKA e cols., 1996); líquen plano, líquen escleroso e poroceratose

actínica disseminada num mesmo paciente de 70 anos (GOLCHAI &

RAMEZANPOUR, 2003); cirrose biliar primária e penfigóide bolhoso (HAMILTON &

MCKENZIE, 1978; MARCET e cols., 2002). Adicionalmente, o vitiligo tem sido

evidenciado como um componente de poliendocrinopatias auto-imunes. Há um

relato de vitiligo, tireoidite crônica, anemia perniciosa, concomitantes com DM tipo I

lentamente progressivo, caracterizando a síndrome auto-imune poliglandular tipo III,

por exemplo (SUZUKI e cols., 2004).

Vitiligo e alterações celulares cutâneas

Com relação ao infiltrado celular nas lesões ativas de vitiligo, os estudos

sobre o assunto inicialmente buscaram esclarecer se havia real destruição de

melanócitos nas lesões despigmentadas de vitiligo, ou apenas perda da capacidade

dos melanócitos de produzirem melanina. Le Poole e colaboradores (1993a)

realizaram uma investigação imuno-histoquímica usando um painel de Acs (um

policlonal e 17 monoclonais) direcionados contra melanócitos, incluindo o NKI-beteb,

que é o mais específico, para verificar a presença ou não de melanócitos viáveis nas

lesões, e demonstraram uma ausência de melanócitos na pele lesional de vitiligo,

comprovando a destruição destas células no percurso etiopatogênico da doença.

Nas lesões estacionárias, na qual o processo de destruição já estaria concluído,

nenhum remanescente celular foi achado. Uma vez definido que os melanócitos

estavam “ausentes” das lesões, a repigmentação só poderia ser obtida pela

repopulação das áreas lesadas de 2 formas: através da estimulação da proliferação

e migração de melanócitos de áreas perilesionais e folículos pilosos, ou pelo

transplante autólogo de melanócitos de áreas pigmentadas.

Um estudo de vitiligo tricrômico usando histologia convencional com

hematoxilina-eosina (HE) e imuno-histoquímica com proteína S-100 (e CD1a)

demonstrou que o número de melanócitos é maior na pele pigmentada perilesional,

seguida pela pele marrom clara (intermediária), e depois pela pele lesional

propriamente dita, mas que há ao menos alguns melanócitos na lesão

despigmentada, embora em menor proporção que na pele normal (HANN e cols.,

2000). Este achado foi contrário aos estudos prévios que relataram “ausência” de

melanócitos na lesão de vitiligo, confirmada por microscopia eletrônica (HANN e

cols., 1992) ou imuno-histoquímica (LE POOLE e cols., 1993a). Os achados

descritos no vitiligo tricrômico sugerem uma progressão mais lenta das lesões do

que no vitiligo típico, e esta poderia ser a razão pela qual os melanócitos

permaneçam ainda nas áreas despigmentadas.

Outros estudos se sucederam com o objetivo de identificar a composição do

infiltrado celular na pele do paciente com vitiligo. Al Badri e colaboradores (1993)

compararam a pele das margens de lesões de vitiligo com a pele não-lesional destes

pacientes e com controles sem doença cutânea. Evidenciaram um número bem maior

de linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+ e CLA+ na epiderme e na derme da borda afetada,

do que na pele não-lesional do vitiligo ou de controles saudáveis. Além disto, as

células T CD3+, CD8+ e CLA+ foram mais freqüentes do que as CD4+, mostrando

uma desigualdade no número de linfócitos T helper (CD4+) e T citotóxicos (CD8+) nas

lesões de vitiligo. Os linfócitos T CLA+ se coraram mais na epiderme do que na

derme, e muitos linfócitos expressavam MHC classe II e interferon gama, denotando

sua ativação. Estes achados foram consistentes com a hipótese de destruição de

melanócitos mediada por linfócitos no vitiligo.

Le Poole e colaboradores (1996) investigaram o infiltrado inflamatório na pele

lesional e não-lesional em 3 casos de vitiligo inflamatório, que sabidamente tem

alterações histológicas mais exuberantes. Suas principais observações imuno-

histoquímicas foram: aumento do número de macrófagos CD68+ na pele , aumento

da relação CD8/CD4, e aumento da expressão do CLA nas células que infiltram a

pele. Além disto, foi o primeiro relato de que os linfócitos T CD8+ se encontram numa

posição justaposta aos melanócitos remanescentes no infiltrado, sugerindo o

envolvimento específico destas células na reatividade imune local e destruição de

melanócitos. Embora estes infiltrados sejam bem mais facilmente caracterizados nos

casos de vitiligo inflamatório, estes achados podem ser estendidos aos casos de

vitiligo generalizado, que representam a vasta maioria de pacientes com a doença.

Alguns autores confirmaram o envolvimento in situ de linfócitos T CLA/CD8+ e

macrófagos na destruição de melanócitos no vitiligo generalizado, através de

imuno-histoquímica simples e com dupla marcação (VAN DEN WIJNGAARD e cols,

2000a). Foram encontrados melanócitos degenerados na pele perilesional, e

ausência total de melanócitos NKI-beteb positivos nas lesões de vitiligo. Além de

estarem em maior número na pele afetada (relação CD4/CD8=0.48), as células T

CD8+ estavam justapostas aos melanócitos remanescentes, o que pôde ser

comprovado pela dupla marcação com os Acs NKI-beteb/CD8. Embora a

percentagem total de linfócitos T CLA+ não estivesse aumentada em relação a

controles normais, estes linfócitos foram encontrados agrupados na junção dermo-

epidérmica, onde expressaram granzima-B e perforina, que revelam sua

imunorreatividade e habilidade para participar na citotoxicidade, exatamente nos

locais de interação com melanócitos. Houve também uma redução do número de

células de Langerhans na pele lesional em 7 de 10 pacientes com vitiligo

progressivo, sendo que alguns deles recebiam PUVA, que leva a uma depleção

destas células segundo alguns autores (KAO & YU, 1990; WESTERHOF e cols,

1986).

Mais recentemente foi demonstrada uma secreção predominante de citocinas

do tipo 1 a partir de clones de células CD4+ e CD8+ T perilesionais e também não-

lesionais de pacientes com vitiligo, com alta produção de IFN-gama e TNF-alfa,

sugerindo que o vitiligo é uma doença Th1-mediada. Este estudo de Wankowicz-

Kalinska e colaboradores (2003) confirmou que o infiltrado cutâneo presente na pele

perilesional do vitiligo em atividade é composto predominantemente de linfócitos T

CD8+, em aposição a melanócitos residuais. Ao contrário, no vitiligo estável os

infiltrados de células T se encontram mais profundamente na derme, ao invés de

próximos à junção dermoepidérmica. Os autores descreveram pela primeira vez que

o infiltrado de células T pode estar presente também na pele macroscopicamente

normal no vitiligo ativo, ocasionando uma “microdespigmentação”. Tal

desaparecimento microscópico de melanócitos ocorreria geralmente na presença de

alta percentagem de células T CD4+ quando comparados com a pele perilesional.

Lee e Modlin (2005) também detectaram alta freqüência de linfócitos T

citotóxicos para antígenos de melanócitos em pacientes com vitiligo, denotando um

ataque direto e específico de células T contra melanócitos. A freqüência de clones

de células T “melanócito-específicos” (contra o antígeno Melan-A) se correlacionou

ainda com a extensão da doença, sendo mais alta naqueles com vitiligo mais difuso,

e menor em pacientes com vitiligo estável (pesquisa ex-vivo). Há também uma

associação entre altas freqüências de clones de linfócitos T melan-A-específicos

expressando o antígeno CLA na sua superfície e vitiligo auto-imune. Ao contrário,

em controles assintomáticos, os clones de linfócitos T citotóxicos detectáveis foram

todos CLA-negativos (OGG e cols., 1998). Através da expressão do CLA os

linfócitos T migram para a pele, onde expressam o perfil de citocinas do tipo 1 e

poderiam mediar a apoptose de melanócitos via granzima/perforina (OYARBIDE-

VALENCIA e cols, 2006).

Todos estes dados são consistentes com um papel importante para os

linfócitos T CLA+ na destruição de melanócitos no vitiligo. Conflitantes são os

achados na pele não-lesional do paciente com vitiligo, sendo necessário definir se

há ou não acometimento da pele como um todo ou apenas nas áreas

lesionais/perilesionais.

Vitiligo e lesões de vitiligo associadas a melanoma

Vitiligo pode também ocorrer em pacientes com melanoma, e a relação entre

ambas as doenças tem sido amplamente estudada. A destruição auto-imune de

melanócitos ocorreria tanto no vitiligo associado a melanoma, como no vitiligo

comum (YEE e cols., 2000). Cui e Bystryn (1995) demonstraram que Acs

antimelanócitos presentes em pacientes com melanoma e vitiligo ligam-se a

antígenos semelhantes tanto nos melanócitos normais quanto nas células

pigmentares malignas, sugerindo que o vitiligo e o leucoderma “vitiligo-símile”

associado com melanoma partilham mecanismos fisiopatogênicos auto-imunes

comuns. As 2 formas parecem idênticas histologicamente, porém sua diferença

principal é a distribuição. As lesões de vitiligo que ocorrem nos pacientes com

melanoma são geralmente “centrais”, ou seja, começam no queixo, pescoço, ou no

tronco, por exemplo, e depois se espalham à periferia. Por outro lado, as lesões no

vitiligo generalizado começam geralmente nas regiões distais, como mãos e pés,

para depois envolverem o tronco (CUMMINGS & NORDLUND, 1997).

O melanossomo é a organela que abriga a maioria dos antígenos associados

ao melanoma (MARKS e cols., 2003). Há várias hipóteses sobre os possíveis

antígenos-alvo do ataque de células T no vitiligo, derivados de pesquisas no

melanoma. Linfócitos T que infiltram melanoma reagem com antígenos de

diferenciação melanossomal que também são expressos por melanócitos normais,

tais como: tirosinase, MART-1, glicoproteína-100, proteína relacionada à tirosinase-2

(TRP-2), proteína P e proteína relacionada à tirosinase-1 (TRP-1) (SAKAI e cols.,

1997). Então, linfócitos T que infiltram a pele despigmentada são idênticos aos que

infiltram tumores, sugerindo, portanto, que as mesmas células responsáveis pela

redução de tumor são também responsáveis por despigmentação (BECKER e cols.,

2002).

Pacientes com melanoma metastático que apresentam vitiligo parecem ter uma

sobrevida maior do que a esperada, sendo o aparecimento do vitiligo considerado

um sinal prognóstico positivo. No entanto, ainda não se pode explicar se o vitiligo

levou a um retardo na progressão tumoral, ou se o melanoma levou ao vitiligo

(NORDLUND e cols, 1983). Adicionalmente, pacientes com melanoma tratados com

imunoterapia experimental, cujo alvo são antígenos de diferenciação de melanócitos,

podem desenvolver vitiligo (YEE e cols., 2000). Entretanto, o motivo pelo qual os

linfócitos T são semelhantemente responsáveis por despigmentação no vitiligo,

quando não há aparente justificativa para a quebra da tolerância a auto-antígenos e

não há malignidade, é incerto (LE POOLE e cols., 2004; LEE & MODLIN, 2005).

Vitiligo e boa resposta a agentes imunossupressores

O número de linfócitos T cutâneos parece diminuir durante o uso de terapias

imunossupressivas, como a PUVA e a corticoterapia. Isto se correlaciona com a

melhora de condições com componente auto-imune, como o vitiligo, com tais

tratamentos (CAVANI e cols., 2005).

Vitiligo e Marcadores HLA

Novas lesões podem se desenvolver tipicamente após um evento traumático

na pele, por exemplo exposição ultravioleta, contato com fenóis branqueadores, ou

injúrias cutâneas como queimaduras e cortes. Entretanto, tal despigmentação

ocorrerá apenas num subgrupo de indivíduos suscetíveis ao desenvolvimento do

vitiligo (DAS e cols., 2001). Isto é bem demonstrado por autores que relataram que

a citotoxidade de linfócitos T CD8+ está voltada para melanócitos com HLA

correspondente (OGG e cols., 1998; WANKOWICZ-KALINSKA e cols., 2003).

A associação do vitiligo com alguns alelos HLA em particular também sugere

que a auto-imunidade envolvendo linfócitos T está presente na doença. A natureza

desta associação ainda não foi elucidada, mas parece se relacionar à suscetibilidade

ou proteção contra a doença. Aparentemente a auto-imunidade ocorre quando

linfócitos T “auto-reativos” escapam da sua usual deleção no timo, e mecanismos

regulatórios não bem identificados falham em mantê-los sob controle (quebra da

tolerância). Esses linfócitos T auto-reativos seriam ativados por complexos formados

por auto-peptídeos ligados a certo HLA em particular (complexo HLA-auto-peptídeo),

e disparariam os mecanismos de doença. Na maioria das desordens auto-imunes a

possível fonte destes auto-peptídeos (o “gatilho” exato da doença) permanece um

mistério (KLEIN & SATO, 2000).

Diferentes associações de vitiligo com antígenos HLA têm sido observadas de

acordo com a população étnica estudada e metodologia. Uma associação da doença

com os antígenos HLA DRB1*03, DRB1*04 e DRB1*07 foi descrita em pacientes

com vitiligo na Turquia (41 pacientes e 61 controles). Nenhum alelo “protetor” para

doença foi encontrado neste estudo (TASTAN e cols., 2004). Numa população de

afetados na China (187 pacientes e 237 controles), os alelos -DQA1*0302,-

DQA1*0601, -DQB1*0303 e -DQB1*0503 causaram predisposição à doença,

enquanto que o alelo -DQA1*0501 seria “protetor” contra o vitiligo (YANG e cols,

2005). Considerando os achados em diversas populações, os marcadores HLA mais

freqüentemente associados ao vitiligo têm sido DR4, DRw53 and DQw3

(KOVACS,1998), principalmente DRw53 (HLA-DRB4) (SPRITZ, 2006). Não temos

conhecimento de estudos da associação entre vitiligo e HLA na população brasileira.

Estudos de genotipificação com alta resolução são necessários para localizar

com exatidão os grupamentos alélicos destes haplotipos envolvidos no vitiligo. Uma

característica importante da associação de alelos HLA com doenças auto-imunes é

o “desequilíbrio de ligação”: Quando a tipificação sorológica de um locus HLA

identifica uma associação HLA-doença, é possível que a verdadeira associação seja

com outros alelos ligados ao alelo tipificado, que são herdados conjuntamente.

Hipoteticamente: indivíduos com alelo HLA-DR1 podem mostrar uma probabilidade

maior de herdarem o alelo HLA-DQ2, do que a probabilidade de herdarem estes

alelos separadamente e aleatoriamente (isto é, em equilíbrio) na população. Ou seja,

pode-se encontrar a doença associada a DR1 pela tipificação HLA, mas a

associação causal pode ser na verdade com o DQ2 co-herdado. Este achado refere-

se a conjuntos de genes que tendem a ser herdados juntos como uma unidade

(ABBAS e cols., 2000). Permanece incerto se as associações vitiligo-HLA já

descritas são primárias ou representam na verdade associação do complexo

principal de histocompatibilidade (MHC) com outras doenças auto-imunes

encontradas nos pacientes com vitiligo (SPRITZ, 2006).

Um estudo de ligação gênica incluindo 56 famílias sugere fortemente que a

região 6p21.3-21.4 contém um fator genético principal contribuidor do fenótipo vitiligo

(ARCOS-BURGOS e cols., 2002). E é justamente nesta região que os genes do

sistema HLA e os genes ligados à expressão de TNF são mapeados. Isto se

correlaciona com o achado de associações significativas entre o sistema HLA e a

predisposição ao vitiligo, e com um papel potencial do TNF na etiopatogênese da

doença (PASSERON & ORTONNE, 2005). Moretti e colaboradores (2002)

demonstraram uma expressão significativamente aumentada do TNF-alfa na pele do

vitiligo em comparação com controles, sugerindo que a produção de citocinas pode

estar envolvida no vitiligo e reforçando a hipótese de auto-imunidade.

Adicionalmente, o tacrolimus, que é um imunossupressor tópico usado recentemente

com eficácia no vitiligo, diminui a expressão do TNF-alfa após sua aplicação; este

mecanismo poderia explicar a melhora dos pacientes com seu uso (GRIMES e cols.,

2004).

Conjuntamente, os aspectos supracitados sugerem o envolvimento da

reatividade imune local na destruição de melanócitos no vitiligo.

Teoria Genética

Agregação familial tem sido descrita com freqüência no vitiligo. Estudos

mostram que aproximadamente 20 a 25% dos pacientes com vitiligo têm parentes

próximos afetados (MAJUMDER e cols., 1993; MANDRY e cols., 1996; SPRITZ,

2006), sendo a maioria parentes de primeiro grau (MOSHER, 1999a). Entretanto, a

grande maioria de pacientes com vitiligo não tem história familiar da doença.

Um estudo amplo envolvendo 15685 indivíduos na população geral e 293

casos de vitiligo demonstrou um aumento de 4 a 5 vezes na prevalência da doença

entre parentes próximos (DAS e cols, 1985). Posteriormente, coletando-se dados de

agregação familial da doença em 160 parentes de pacientes afetados definiu-se um

risco relativo (RR) para vitiligo. O acometimento de crianças foi 1,7 vezes mais

freqüente que o de outros parentes. O RR para vitiligo foi: 36 para filhos de pais

afetados, 12 para irmãos, e 7 para pais. Para parentes de segundo grau, o RR

variou entre 1 e 16. Tais achados mostrando risco maior se o parentesco é mais

próximo apontam para o envolvimento de fatores genéticos, porém sem transmissão

mendeliana (monogênica), sugerindo uma herança genética multifatorial (DAS e

cols., 1985; MAJUMDER e cols., 1993; ALKHATEEB e cols., 2003).

Alkhateeb e colaboradores (2003) encontraram uma incidência de 6,1% de

vitiligo em irmãos de afetados, o que significa uma freqüência bem maior que na

população geral. Além disto, quando a doença ocorre idades mais precoces,

encontra-se mais parentes afetados. Ambos os achados reforçam o papel de um

componente genético na patogênese da doença, principalmente nas famílias em que

seu início é precoce. Por outro lado, vitiligo generalizado familial também é

caracterizado por início precoce da doença e um repertório mais amplo de doenças

auto-imunes associadas do que o vitiligo de aparecimento esporádico, o que mostra

que algum fator possa ter sido herdado em tais casos familiais (LABERGE e cols.,

2005). Tais observações de início precoce da doença em casos familiais e redução

do risco de doença com um grau de parentesco mais distante do afetado são

características clássicas de um traço poligênico (SPRITZ, 2006).

Recentemente, diferentes métodos têm sido usados para identificar possíveis

gens de suscetibilidade ao vitiligo, tais como: análise de ligação gênica, análise de

associação de alelos (incluindo pesquisa de marcadores HLA em pacientes e

controles), análise de expressão, etc. Foi sugerido o envolvimento de vários gens

candidatos, que estão distribuídos nos cromossomos 1 (AIS1, PTPN22), 2 (CTLA4),

6 (MHC, ESR), 7 (AIS2), 8 (AIS3), 11 (CAT), 17 (SLEV1), 21(AIRE) e 22 (COMT).

Sinais genéticos de “ligação” ao vitiligo já foram detectados nos cromossomos 1, 4,

6, 7, 8, 14, 17 e 22 . A associação entre vitiligo com alelos HLA (já descrita) também

reforça o papel de componentes imunogenéticos no aparecimento do vitiligo, e

parece ser mais forte em pacientes e familiares com outras desordens auto-imunes

do que em pacientes e famílias com vitiligo isoladamente (SPRITZ, 2006).

Uma análise do desequilíbrio de ligação de marcadores HLA no vitiligo familial

demonstrou que o principal fator genético determinante do vitiligo estaria localizado

no segmento 6p21.3-21.4, estendendo-se através do sistema HLA. Mas não se

sabe se os alelos HLA estariam diretamente envolvidos ou localizados

proximamente do locus ligado à predisposição da doença. O modelo de segregação

complexa (dentre 15 modelos) que se aplicou melhor aos achados foi aquele que

discriminou 2 grupos de pacientes com vitiligo: aqueles com início precoce, co-

segregando com um modelo dominante de herança sem efeitos ambientais, e

aqueles com início tardio da doença, co-segregando com um genótipo recessivo e

influenciado por fatores ambientais (ARCOS-BURGOS e cols, 2002).

Um modelo de herança poligênica aditiva, ou um modelo ambiental, no qual

patogêneses heterogêneas desencadeiam diferentes subtipos de vitiligo parece ser

o mais aceito recentemente. Ainda que a maioria dos tipos de vitiligo esteja

relacionada a fatores genéticos, é incomum que diferentes fenotipos compartilhem o

mesmo loci de suscetibilidade. Fatores ambientais parecem ser mais importantes em

certos casos, como no vitiligo universal (ZHANG e cols., 2004).

O mais amplo estudo de vitiligo em gêmeos até o momento mostrou uma

concordância para vitiligo generalizado entre gêmeos monozigóticos de apenas 23%

(ALKHATEEB e cols., 2003). É um percentual maior que o da população geral, e

bem maior que a incidência de 6,1% em outros irmãos de afetados, falando a favor

da relevância dos genes. Por outro lado, esta “limitada” concordância do achado

entre gêmeos idênticos, que compartilham todos os seus gens, indica que algum

componente não-genético, presumivelmente fatores ambientais, desempenharia um

papel importante na etiopatogênese do vitiligo.

Teoria Neural

Teoria proposta inicialmente por Lerner (1959), segundo a qual há um

mediador neuroquímico melanocitotóxico que é liberado de terminações nervosas

terminais. Baseia-se em alguns achados principais (KOVACS, 1998; MOSHER e

cols., 1999a): 1) os melanócitos são originados da crista neural; 2) redução parcial

ou completa do vitiligo em casos de injúria de nervo; 3) aparecimento de vitiligo em

pele neurologicamente comprometida; 4) vitiligo poupando membros paralisados; 4)

sudorese e vasoconstricção aumentadas nas lesões (aumento da atividade

adrenérgica); 5) despigmentação em modelos animais com lesão de nervo; 6)início

do vitiligo sucedendo períodos de estresse emocional; 7) casos de doença

segmentar (KORANNE & SACHDEVA, 1988).

Al’Abadie e colaboradores (1994) observaram um aumento na reatividade de

Acs contra o neuropeptídeo Y em biopsias de pele de pacientes com vitiligo ativo,

sugerindo o envolvimento deste neuropeptídeo na patogênese da doença. À

microscopia eletrônica, foram descritas degeneração axonal e regeneração em

nervos autonômicos na derme, além de espessamento da membrana basal das

células de Schwann nas lesões, sugerindo um ciclo de dano e reparo do nervo na

gênese do vitiligo (AL’ABADIE e cols., 1995). Pacientes com vitiligo apresentaram

níveis aumentados de noradrenalina na derme e no plasma e níveis reduzidos de

adrenalina, denotando um defeito na biossíntese de catecolaminas. O aumento de

noradrenalina induziria enzimas que degradam catecolaminas, como a monoamino

oxidade A (MAO-A) e catecol-o-metil-transferase (COMT). A MAO-A oxidaria tanto a

noradrenalina quanto a adrenalina a aldeído 3.4-dihidroximandélico de amônia e

peróxido de hidrogênio (R-CH2NH2 + O2 + H2Ot R-CHO + NH3 + H2O2), que é

muito tóxico para melanócitos (SCHALLREUTER e cols., 1996a). Esta expressão

aumentada de catecolaminas e geração de H2O2 seria um fenômeno secundário ou

poderia ser a causa da despigmentação.

Teoria da Auto-Destruição/Auto-Citotoxicidade ou Estresse Oxidativo

Essa teoria postula que produtos intermediários ou metabólitos da síntese de

melanina (análogos da tirosinase e intermediários, como dopa, dopacromo, etc) são

letais para os melanócitos, que, entretanto, normalmente têm um mecanismo

protetor que elimina tais precursores tóxicos. A quebra deste mecanismo permitiria o

acúmulo de indóis e radicais livres destrutivos para melanócitos (LERNER, 1971).

Compostos fenólicos estruturalmente semelhantes à tirosinase podem causar

leucodermas indistingüíveis do vitiligo idiopático, com destruição de melanócitos.

Eles produzem despigmentação por inibição da oxidação enzimática de tirosinase à

dopa e ação letal seletiva nos melanócitos funcionais. Como nem todos os

indivíduos expostos são afetados, provavelmente há uma inabilidade intrínsica da

pele de alguns indivíduos de neutralizar tais melanocitotoxinas (KORANNE &

SACHDEVA, 1988; MOSHER e cols., 1999a). O peróxido de hidrogênio (H2O2)

gerado e acumulado durante a biossíntese de melanina inibe a atividade da catalase

(CAT), enzima que reduz superóxidos à água, resultando em destruição dos

melanócitos. Os níveis de CAT estão diminuídos tanto na pele lesional quanto não-

lesional de pacientes com vitiligo, causando morte celular, e sugerindo que todo o

tegumento pode estar comprometido na doença (SCHALLREUTER e cols., 1991).

Adicionalmente, foi mostrada uma redução do influxo de cálcio (Ca) em melanócitos

nas lesões, se comparados com a pele não-lesional ou com controles

(SCHALLREUTER e cols., 1996b). O acúmulo de Ca extracelular (por transporte

deficiente) leva ao aumento de radicais superóxidos, que inibem a tirosinase, e

podem provocar morte celular (SCHALLREUTER e cols., 1989 apud KOVACS,

1998). O aumento dos níveis de Ca intracelular parece ser um importante

mecanismo pelo qual o tratamento com radiação ultravioleta A (UVA) funciona

(KOVACS, 1998).

Recentemente, estudos evidenciaram um desequilíbrio do sistema

antioxidante/oxidante tecidual (YILDIRIM e cols., 2004), e no sangue (INES e cols.,

2006) de pacientes com vitiligo. Um aumento de espécies de oxigênio reativo (ROS)

intracelular no sangue destes pacientes e de estresse oxidativo levariam a um dano

celular mediado por radicais livres.

Outras Teorias

Defeito intrínseco dos melanócitos

Um possível defeito intrínseco dos melanócitos também poderia ser fator

causal da doença. No entanto, Gilhar e colaboradores (1991 apud CASTANET &

ORTONNE, 1997) mostraram que a pele afetada de vitiligo enxertada em ratos

nudes tornava-se repigmentada após o transplante, sugerindo que uma disfunção

primária de melanócitos não está envolvida na etiologia do processo de

despigmentação.

Teoria Viral/Infecciosa

Infecções virais têm sido implicadas na patogênese de várias doenças auto-

imunes, como um fator desencadeador em indivíduos geneticamente predispostos.

Já foi relatado o aparecimento de vitiligo em pacientes com SIDA e hepatite

(HARSOULIS e cols., 1978), e casos da doença e de alopecia areata em pacientes

com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Mecanismos potenciais para tais

associações incluem: 1) resposta imune contra melanócitos ou células do folículo

piloso infectados pelo HIV (ironicamente respostas “apropriadas”); 2) ativação de

linfócitos B (pelo HIV ou algum vírus associado), que são capazes de sintetizar Acs

contra auto-antígenos nos melanócitos ou folículos pilosos. Entretanto, a pobreza de

casos com essas associações pode significar que a sua ocorrência em pacientes

HIV-soropositivos seja mera coincidência (CHO e cols., 1995).

Um estudo duplo-cego avaliou a presença de genomas virais em biopsias de

pele despigmentada e pele não-lesional de pacientes com vitiligo, usando um painel

de vírus DNA e RNA incluindo herpes simples, varicela-zoster, citomegalovírus

(CMV), Epstein-Barr, HIV, e vírus linfotrópico de células T humano, por reação em

cadeia de polimerase(PCR). CMV-DNA foi identificado em 38% dos pacientes

estudados e ausente nos controles saudáveis, sugerindo que o vitiligo possa ter sido

desencadeado por infecção viral naqueles pacientes (GRIMES e cols., 1996).

Apoptose

Esta teoria baseia-se na indução de apoptose de melanócitos por linfócitos

ativados. Poderia ocorrer por 2 mecanismos principais: 1) produção de citocinas,

como interferon-gama, TNF-alfa e interleucina-1, não só pelos linfócitos, mas

também pelos queratinócitos e melanócitos. Todas as 3 citocinas afetam a

melanogênese, o que sugere que os melanócitos têm receptores para essas

moléculas; 2) liberação de perforina e granzima ou ativação do receptor CD95 ou

APO-1 (receptor apoptótico celular ou receptor FAS, uma das moléculas reguladoras

do processo) nas células-alvo (ARAGANE e cols, 1998; HUANG e cols., 2002).

Uma investigação sobre as moléculas reguladoras de apoptose mostrou que

os melanócitos no vitiligo não são mais suscetíveis à indução de apoptose do que

melanócitos normais em indivíduos controles. Portanto, o vitiligo não ocorreria

devido a um desbalanço de tais moléculas reguladoras (principalmente as proteínas

Bcl-2, de papel “protetor”, e Bax, de papel “pró-apoptótico”). Entretanto, este achado

não exclui completamente a possibilidade de que os melanócitos apresentem um

desequilíbrio entre Bcl-2/Bax imediatamente antes da morte celular (VAN DEN

WIJNGAARD e cols., 2000b).

Um estudo com modelos animais, usando galinhas da linhagem Smyth,

reforçou a hipótese de que o mecanismo apoptótico esteja envolvido no vitiligo auto-

imune. Usando o método TUNEL (terminal deoxynucleotide transferase-mediated

fluorescein-dUTP nick end labeling), que é um método in situ para detectar áreas do

DNA fragmentadas durante apoptose, foi constatado que o número de células

TUNEL+ foi significativamente maior nas penas de galinhas com vitiligo do que nas

de outras galinhas sem vitiligo avaliadas. Além disto, a apoptose foi mais extensa

quando havia despigmentação ativa, sugerindo uma associação estreita entre

apoptose e desaparecimento de melanócitos (WANG & ERF, 2004).

Melanocitorragia

Esta teoria defende que há um “destacamento” crônico de melanócitos da

camada basal, chamado “melanocitorragia”, após fricção da pele no vitiligo

generalizado. Após este desprendimento, há migração transepidérmica e

eventualmente a morte de melanócitos no vitiligo generalizado. Possivelmente está

relacionada à suscetibilidade aumentada ao trauma ou outros tipos de estresse.

Atribuiu-se a esta hipótese a resposta isomórfica (fenômeno de Koebner)

(GAUTHIER e cols., 2003b).

Teoria Convergente

Como geralmente uma única causa não se aplica a todos os casos de vitiligo,

acredita-se numa “teoria convergente”, na qual diferentes fatores causais (estresse,

acúmulo de compostos tóxicos, infecção, auto-imunidade, mutações, ambiente

celular alterado, alteração na proliferação/migração de melanócitos) podem agir

independentemente ou sinergicamente, determinando o mesmo efeito:

desaparecimento de melanócitos (LE POOLE e cols., 1993b; GAUTHIER e cols.,

2003b; LEE & MODLIN, 2005).

3.2. O SISTEMA IMUNE CUTÂNEO NORMAL E NO VITILIGO

3.2.1. Células T na Pele Sadia

Na pele normal, a maioria das células T reside na derme, predominantemente

ao redor de vasos. Linfócitos T intraepidérmicos equivalem a apenas cerca de 2% do

número total de células cutâneas CD3+. A vasta maioria das células T

intraepidérmicas são CD4+ ou CD8+, e raros os linfócitos B. Parece haver uma

predominância de linfócitos T CD8+ na epiderme, onde estão num estado de

“repouso”, enquanto que na derme o componente CD4+ prevalece em número.

Fatores como a região do corpo e exposição solar contribuem também para a

variabilidade no número dessas células. Estudos imuno-histoquímicos mostram

número máximo de células T intraepidérmicas (céls CD3+/centímetro de epiderme)

no tórax, e número mínimo nas regiões plantares. Assim também a relação

CD4/CD8 varia, com predomínio de células CD8+ na maioria do sítios (membros,

glúteo, regiões plantares) e CD4+ na epiderme no tórax (CAVANI e cols., 2005).

A radiação solar em dose fisiológica induz à redução rápida do número de

linfócitos T CD4 e CD8 intraepidérmicos; este efeito persiste por poucos dias e é

seguido pelo influxo de linfócitos T CD4+, que se igualará à pele normal em 15 dias

aproximadamente. Além disto, encontra-se um número mais baixo de células T

intraepidérmicas, predominantemente CD4+, em áreas de exposição crônica à

radiação ultravioleta, comparadas com áreas fotoprotegidas, que são mais ricas em

linfócitos T CD8+ (CAVANI e cols., 2005).

Embora a maioria dos linfócitos pareçam ser células transitórias ou migratórias

na pele normal, não se pode excluir que parte deles sejam células residentes, com

papel biológico não esclarecido. Supõe-se que façam parte da imunovigilância

cutânea, pois reconhecem rapidamente um número grande de antígenos e previnem

contra desenvolvimento de cânceres cutâneos e infecção persistente por patógenos

intracelulares. Além disto, expressam FasL (ligante de Fas), que é um membro da

família do TNF, que pode desencadear a apoptose de células-alvo que expressem

Fas, participando da citotoxicidade mediada por Fas-FasL de células residentes.

Adicionalmente, o número de linfócitos T diminui durante o uso de

imunossupressores, o que se correlaciona com a melhora de doenças auto-imunes,

e com o aparecimento de tumores e infecções cutâneos, quando a imunossupressão

é prolongada (CAVANI e cols., 2005).

3.2.2. O Patrulhamento da Pele: Linfócitos T e expressão do CLA

Os linfócitos T são as células efetoras de respostas imunes adaptativas.

Patrulham a pele e são ativados pelos antígenos coletados por células

apresentadoras de antígeno (APCs). As células de Langerhans (CL) que residem na

pele capturam antígenos periféricos e migram para um linfonodo de drenagem da

pele, onde os apresentam às células T “inocentes” (naive) que ali estão (CAVANI e

cols., 2005). As células T inocentes (que nunca foram ativadas por antígenos) estão

recirculando continuamente entre o sangue e órgãos linfóides, porque elas

expressam níveis elevados de L-selectina, que permite que sejam aderidas e rolem

na parede de vênulas endoteliais nos linfonodos (ROBERT & KUPPER, 1999).

Quando uma célula T “inocente” encontra um antígeno (para qual seja

específico) no linfonodo regional, um receptor apropriado do linfócito T (TCR) é

ativado e ocorre a liberação de sinais e de citocinas co-estimulatórias por APCs,

requeridos para a ativação eficaz das células T. Uma vez ativadas, essas células T

se proliferam, e expressam moléculas de ativação e receptores de quimiocinas,

sofrendo uma transição a células T de memória, caracterizadas por sua habilidade

de reconhecer (“recordar”) o local anatômico onde encontraram primeiramente o

antígeno (CAVANI e cols. , 2005). O subgrupo de células T de memória (CD45RO+)

geradas nos linfonodos que drenam a pele têm habilidade de circular

preferencialmente em direção à pele, e são identificados por terem adquirido uma

glicoproteína de superfície chamada antígeno cutâneo linfocitário (CLA), também

chamado epítopo HECA-452 (ROBERT & KUPPER, 1999) .

CLA é uma glicoproteína de superfície celular de 200kDa, da qual as

metades açúcares sialil Le(a) e sialil Le(x) são os epítopos ativos possíveis (BOS e

cols., 1993). Sua expressão por células T envolve a indução de enzimas de

glicosilação que modificam uma proteína pré-existente, a glicoproteína ligante-1 da

P-selectina (PSGL-1). O antígeno CLA pode ser visto como um “sinalizador” que

orienta linfócitos T de memória à pele. Moléculas da adesão, enzimas e receptores

de quimiocinas também contribuem juntos para o tropismo dos linfócitos T para a

pele como um “código de barras” (SANTAMARIA-BABI, 2004; CAVANI e cols.,

2005). Esta heterogeneidade de fenótipo e função é provavelmente importante para

uma resposta bem sucedida do hospedeiro aos diferentes patógenos/antígenos

encontrados na pele (ROBERT & KUPPER, 1999).

Os estudos a respeito da expressão do CLA na pele normal ou inflamada são

relativamente recentes e controversos. Segundo Hunger e colaboradores (1999), o

CLA é expresso na maioria das células T que infiltram a pele, por uma população

menor de células T no sangue periférico (20%), e é ausente no timo. Eles mostraram

uma proporção elevada (60%) de CD4+, CD8+ e células T CD56+ expressando o

CLA nos linfócitos derivados de um vaso linfático superficial drenando a pele normal,

e mais de 90% das células CD1a+(CL) eram CLA+. Entretanto, no mesmo estudo, a

porcentagem de células CLA+ não mudou após se provocar uma reação inflamatória

na pele pela radiação UV ou por hipersensibilidade de contato induzida na mesma

área, embora o fluxo de linfa e a entrada de células tenham aumentado.

Diversamente, Bos e colaboradores (1993) mostraram uma expressão do CLA em

aproximadamente 16% das células T periféricas e em: 41% das células T CD3+,

44% das CD4+, 31% das CD8+, e 14% das células CD68+. Além disto, os

queratinócitos, as células CD1a+ e células endoteliais não expressaram o CLA em

números significativos. Por causa da expressão do CLA, 10-20% de todas as células

de T de memória migram à pele (SCHWARZ, 2003). Linfócitos T CLA-positivos

podem ser CD4+ ou CD8+, e uma vez ativados podem ser capazes de produzir

citocinas tipo 1 (interferon-gama, interleucina-2, e linfotoxina) ou tipo 2 (interleucinas

4, 5, 10 e 13).

O CLA é um ligante específico para E-selectina, uma molécula da adesão

induzida nas células endoteliais em condições inflamatórias em resposta aos

mediadores pró-inflamatórios como IL-1 e TNF-alfa (PICKER e cols., 1991). A

interação do CLA com a E-selectina media a adesão inicial dos linfócitos T e a

exposição da sua superfície celular à superfície do endotélio nas vênulas pós-

capilares cutâneas, onde agirão quimiocinas. Uma vez aderidos e atados, eles rolam

na superfície endotelial no sentido do fluxo sangüíneo, mas muito mais lentamente,

assim podem superar as forças substanciais exercidas pelo fluxo e ser

extravazados. Receptores de quimiocinas (CXCR2, CXCR3, CCR4, CCR6, CCR10)

foram detectados na superfície de linfócitos T CLA+ e participariam da sua migração

(SANTAMARIA-BABI, 2004). A expressão desses receptores e dos seus respectivos

ligantes pelas células da pele aumentam a especificidade destas células T para a

pele (ROBERT & KUPPER, 1999). E-selectina é expressa em níveis baixos na

microvasculatura cutânea, mas sua expressão aumenta muito durante a inflamação

cutânea. Interações entre selectinas, tais como CLA/E-selectina, VLA-4/VCAM-1

(alfa 4-beta 1 integrina, ou very late antigen, e molécula de adesão célulo-vascular-

1), e LFA-1/ICAM-1 (alfa-1-beta 2 integrina ou antígeno associado à função

linfocitária-1, e molécula de adesão intercelular-1) são requeridas para a migração

transendotelial de linfócitos T circulantes (ROBERT & KUPPER, 1999;

SANTAMARIA-BABI, 2004). Recentemente, mostrou-se que a migração de linfócitos

T CLA+ à pele humana transplantada em ratos pode ser impedida por um anticorpo

anti-selectina. Em tal situação, interferir com o mecanismo específico de migração

de linfócitos para a pele forneceria um benefício terapêutico (BIEDERMANN e cols.,

2002).

3.2.3. CLA e doenças cutâneas

Embora o recrutamento de linfócitos T de memória seja requerido para uma

imunovigilância cutânea bem sucedida, eles também estão envolvidos em algumas

respostas hiperreativas, tais como alergias ou doenças auto-imunes. Mediam várias

doenças cutâneas incluindo vitiligo, além de dermatite de contato alérgica, psoríase,

dermatite atópica, AA, erupção à droga, líquen plano, e também linfoma T e doença

enxerto-hospedeiro (ROBERT & KUPPER, 1999).

Em cada cenário patológico, os linfócitos T CLA+ apresentarão características

fenotípicas diferentes (por exemplo, produção de citocinas e especificidade do

antígeno/alérgeno) relacionadas ao processo imune/inflamatório específico onde

participam (SANTAMARIA-BABI, 2004). No melanoma, os linfócitos que infiltram o

tumor expressam o antígeno CLA, e a destruição imune dos melanócitos no halo-

nevo é associada com a expansão local de linfócitos T CLA+. A exaustão das ações

específicas da células T pode ser precipitada pela ativação induzida da morte celular

de linfócitos T efetores e pela intervenção de células T imunorregulatórias

específicas (T regs), que bloqueiam as APCs e/ou diretamente esfriam a ativação e

proliferação celular (CAVANI e cols., 2005).

O extravazamento de linfócitos CLA+ à pele envolve também interação de

outras moléculas. A citocina IL-12 induz a síntese de uma glicosiltransferase(alfa-

1,3- fucosiltransferase VII ou FucTVII) envolvida na geração do sialil Lewis X, um

carboidrato estruturalmente relacionado ao CLA. Esta indução do CLA nos linfócitos

T leva-os à transição de células “inocentes” a células de memória. Ao contrário, a IL-

4 inibe a expressão de FucTVII. Isso é muito importante para o estudo

farmacológico de substâncias que poderiam reduzir a indução de CLA nos linfócitos

T. A inibição farmacológica da produção IL-12 com os inibidores da fosfodiesterase

4 (por exemplo Rolipram) reduz a geração das células T CLA+ induzidas por um

superantígeno. Pacientes com melanoma que recebem IL-12 experimentaram uma

inundação periférica de linfócitos T CLA+. A inibição da síntese de CLA pode ser

uma maneira de se obter atividade anti-inflamatória cutânea in vivo. Todos estes

aspectos juntos suportam a relevância do antígeno CLA como um alvo terapêutico

para dermatoses mediadas por linfócitos T (SANTAMARIA-BABI, 2004).

Com relação à expressão do CLA no vitiligo, foi observada alta freqüência de

linfócitos T citotóxicos MelanA-específicos restritos ao HLA-A*0201 (A2-MelanA

tetramer+ CTLs), ou seja, em indivíduos HLA-A*0201-positivos com vitiligo.

Inversamente, nenhum linfócito específico semelhante foi identificado em controles

assintomáticos HLA-A*0201-positivos, ou em pacientes com vitiligo e HLA-A*0201-

negativos. Além disso, houve diferença significativa entre o número de linfócitos T

citotóxicos CLA+ entre pacientes e controles (p<0.05). Nos controles assintomáticos

que tinham linfócitos T citotóxicos detectáveis, todos eram CLA-negativos. Ou seja,

linfócitos T citotóxicos autorreativos foram detectados em alta freqüência nos

pacientes com vitiligo, mas somente foram associados com a doença aqueles com

habilidade de migrar para a pele, ou CLA+ (OGG e cols., 1998). Adicionalmente, já

foi relatada a presença de linfócitos T CD8+/CLA+ na pele perilesional de pacientes

com vitiligo, na vizinhança dos melanócitos desaparecidos, como já descrito (LE

POOLE e cols., 1996; VAN DEN WIJNGAARD e cols., 2000a).

O efeito de alguns tratamentos no vitiligo sobre a expressão do CLA

provavelmente influencia os mecanismos etiopatogênicos de doença, e merece

novas pesquisas.

3.2.4. O Papel imune dos melanócitos

A função primordial destas células seria a proteção contra a radiação

ultravioleta. No entanto, estudos recentes vêm mostrando sua participação no

sistema imune cutâneo (OYARBIDE-VALENCIA e cols., 2006). Os melanócitos

podem expressar moléculas HLA classes I e II, e moléculas de adesão como ICAM-1

e VCAM-1 (AL BADRI e cols., 1993; LE POOLE e cols., 1993a). Podem ainda

produzir citocinas como interleucina 1, IL-6, e IL-8 (LE POOLE e cols., 2004) e

suscitar uma resposta imune local. Além disto, podem processar e apresentar

antígenos a células T, no contexto do MHC classe II, o que é facilitado pela sua

natureza dendrítica, sua posição estratégica dentro da pele e sua capacidade

fagocítica (LE POOLE e cols., 1993c apud VAN DEN WIJNGAARD e cols., 2000a;

LE POOLE e cols., 1993d).

Em culturas de melanócitos de pele humana normal, eles foram capazes de

processar e apresentar antígenos de Mycobacterium leprae a linfócitos T, restritos

ao HLA-classe II, e além de elicitar proliferação de linfócitos T, também se tornam

alvo de clones T citotóxicos. Portanto, os melanócitos são células apresentadoras de

antígenos “não-profissionais”, e sem a mobilidade das células de Langerhans e de

APCs profissionais, por isto, talvez estejam envolvidos no seu próprio ataque imune

no vitiligo (LE POOLE e cols., 2004; OYARBIDE-VALENCIA e cols., 2006).

(Fonte: BOLOGNIA e cols., 2003)

Figura 1. Representação esquemática do melanócito na camada basal da epiderme.

3.3. PUVA NO VITILIGO

3.3.1. Conceito

PUVA é uma terapia que combina o uso de psoraleno tópico ou sistêmico

(4,5,8-trimetilpsoraleno-TMP, 8-metoxipsoraleno- 8-MOP e 5-metoxipsoraleno- 5-

MOP) com exposição à luz solar ou a fontes de luz ultravioleta (UV) com ondas

longas de alta intensidade. O espectro de ação biológica para a estimulação da

pigmentação melânica induzida pelo psoraleno está na faixa de 320 a 360 nm, ou

seja, dentro do espectro da radiação UVA (HONIGSMANN e cols., 1999).

O psoraleno deve ser administrado oralmente 1 a 3 horas (sua meia-vida

sérica) antes da fotoexposição, com intervalos de 48 horas entre as tomadas,

utilizando-se como fonte lumínica lâmpadas com predomínio de UVA. O momento

de exposição à radiação UVA deve coincidir com o pico do nível sérico do psoraleno,

que varia com as características de absorção particulares da droga/fabricante. Em

geral, os psoralenos são degradados em cerca de 12 horas. São compostos

lipofílicos, de eliminação hepática e excreção renal (HONIGSMANN e cols., 1999).

3.3.2. Histórico breve

A fotoquimioterapia para o vitiligo pode ter se iniciado desde 2000 a 1500 A.C.

na Índia e no Egito, quando a doença era tratada através da medicina popular com

extratos tópicos de plantas (Bavachee ou Psoralea corylifolia ou Ammi majus Linn),

que continham furocumarínicos fotossensibilizantes e estimuladores da pigmentação

cutânea. Há relatos da terapia do vitiligo com emprego da luz solar e radiação UV

desde 1900 (HONIGSMANN e cols., 1987), mas os primeiros estudos clínicos com

psoralenos tópicos e orais foram descritos a partir de 1948, por El Mofty, na

Universidade do Cairo (EL MOFTY, 1948 apud MATSUMURA & ANANTHAWAMY,

2004).

3.3.3. Mecanismos de Ação

Os psoralenos são furocumarínicos que possuem a propriedade de reagir

com o DNA em 3 etapas. Primeiro, na ausência de radiação UV, o psoraleno se

intercala entre pares de bases de DNA(dupla fita) e liga-se covalentemente a uma

base pirimidínica (principalmente a timina). A absorção de fótons no espectro UVA

resulta na formação dos monoadutos (produtos da fotoadição) 3.4- ou 4.5-

ciclobutano com a base do DNA. Os 4.5-monoadutos podem absorver um segundo

fóton e esta reação leva à formação de um aduto bifuncional, através da ligação

cruzada (cross-link) entre as fitas da dupla hélice com uma 5,6-dupla ligação da

base pirimidínica da fita oposta (HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003).

(Fonte: BOLOGNIA e cols., 2003)

Figura 2. Adutos monofuncionais ou bi-funcionais (crosslinks)

entre o psoraleno e a base pirimidínica de DNA

A conjunção de psoraleno com o DNA epidérmico suprime a síntese de DNA e

a divisão celular (HONIGSMANN e cols., 1999). Ou seja, DNA-psoraleno sofrem

uma reação fotoquímica UVA-induzida, e a formação de fotoadutos mono ou

bifuncionais no DNA resultam na inibição imediata da síntese de DNA e replicação

celular (BETHEA e cols., 1999; HONIGSMANN e cols., 1999, HONIGSMANN &

SCHWARZ, 2003). A fotossensibilização com psoraleno causa também uma

alteração na expressão de citocinas e seus receptores (HONIGSMANN &

SCHWARZ, 2003). Os psoralenos também reagem com RNA, proteínas e outros

componentes celulares (reação fotoquímica indireta), e indiretamente modificam

proteínas e lipídios via reações mediadas pelo oxigênio “singleto”, ou radicais livres

que podem danificar o DNA (KOVACS, 1998; HONIGSMANN e cols., 1999).

O mecanismo exato pelo qual a PUVA induz a repigmentação do vitiligo ainda

não foi bem esclarecido, mas alguns efeitos importantes dos psoralenos fotoativados

sobre o sistema imune cutâneo já foram demonstrados (Tabela 1). Provavelmente, é

um tratamento benéfico no vitiligo por mecanismos variados. O seu efeito

antiproliferativo celular e modulador do sistema imune cutâneo parece ser a base da

fototerapia de dermatoses mediadas pelos linfócitos T (DE RIE & BOS, 2005).

Linfócitos nos infiltrados cutâneos são intensamente suprimidos pela PUVA, com

efeitos variados nos diferentes subtipos de células T. A PUVA é bem mais potente

em induzir apoptose em linfócitos, do que nos queratinócitos, o que pode explicar

sua eficácia no linfoma T cutâneo bem como doenças inflamatórias da pele

(HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003; MATSUMURA & ANANTHAWAMY, 2004).

Kao & Yu (1992) estudaram o efeito PUVA em cultura de melanócitos e in

vivo demonstrando os seguintes achados in vitro: 1) quanto maior a dose de PUVA,

mais significante a inibição do DNA celular e síntese proteica, e a inibição do

receptor do fator de crescimento epidérmico; 2) PUVA depleta antígenos dos

melanócitos associados ao vitiligo (VAMA); 3) PUVA estimula a atividade da

tirosinase, mas o efeito não é dose-dependente. Seus efeitos in vivo mostram

algumas diferenças biológicas. Os principais mecanismos terapêuticos da PUVA no

vitiligo segundo os autores seriam: 1) PUVA estimularia outros componentes da

pele, como queratinócitos, a liberar mediadores inflamatórios, alguns dos quais

agiriam como fatores estimuladores do crescimento de melanócitos, levando à

proliferação de melanócitos no folículo piloso; 2) depletaria a expressão de VAMA

nos melanócitos e também as CL epidérmicas, bloqueando a citotoxicidade celular

dependente de anticorpo contra melanócitos no vitiligo.

Tabela 1.Efeitos dos psoralenos fotoativados no sistema imune cutâneo

Efeitos Autores

Fotoinativação direta de linfócitos T Ullrich, 1991

Indução de linfócitos T-supressores específicos

(antígeno-específicos; ou anticlones T

patogênicos)

Ullrich, 1991; Edelson, 1991

Supressão da produção de IL-2 pelas células T (in

mice)

Okamoto e cols., 1987

Inibição da ligação do fator de crescimento

epidérmico ao seu receptor

Mermelstein e cols., 1989; Kao & Yu,

1992

Redução do número/função das CL (perda de

dendritos; inibição do reconhecimento antigênico)

Friedmann, 1981; Ree, 1982; Kao &

Yu, 1992; Enk e cols., 1993

Imunosupressão sistêmica Morison e cols.,1979; Friedman &

Rogers, 1980; Kao & Yu, 1990;

Ullrich, 1991

Apoptose de células linfóides (associada com

influxo de cálcio)

Marks & Fox, 1991;

Redução da liberação das citocinas IL-1, IL-6, IL-8

e TNF-alfa pelos mononucleares do sangue

periférico (importante ação na psoríase)

Neuner e cols., 1994

Redução dos títulos de auto-anticorpos Ongenae e cols., 2003

*Adaptado de De Rie e Bos, 2005

Outros autores demonstraram que a PUVA estimula a hipertrofia e

proliferação de melanócitos inativos (dopa negativos) foliculares residentes na

bainha da raiz externa dos folículos pilosos assim como de melanócitos nas bordas

das lesões de vitiligo (ORTONNE e cols., 1979; CUI e cols., 1991). O tratamento

estimularia a divisão, proliferação e migração dos melanócitos inativos (dopa

negativos) das partes média e inferior dos folículos pilosos em direção à epiderme

na superfície dos folículos, e depois radialmente para formar a “ilhota” de

repigmentação clinicamente visível nas lesões de vitiligo em repigmentação. Os

melanócitos amadureceriam gradualmente à condição “ativa” durante a migração

para a epiderme onde encontrariam fatores de crescimento melanocítico, ocupando

progressivamente aquela área e produzindo melanina (CUI e cols., 1991).

No seu estado “inativo”, os melanócitos no reservatório folicular não são

capazes de produzir pigmento e também não sofrem os efeitos que levariam à sua

destruição no vitiligo. Mas uma vez ativados, se forem reconhecidos como

melanócitos normalmente-funcionais, poderão ser destruídos rapidamente. Não se

conhece ao certo os sinais que determinam a ativação dos melanócitos foliculares, e

é possível também que essa ativação possa acontecer espontaneamente, já que

alguns pacientes com vitiligo podem repigmentar sem tratamento. O tratamento para

ser eficaz no vitiligo deve não apenas ativar e estimular a migração dos melanócitos

do reservatório, mas também permitir sua sobrevivência na epiderme (MORELLI,

2000).

Adicionalmente, já foi descrito que a PUVA estimula a melanogênese através

da fotoconjugação dos psoralenos no DNA dos melanócitos, mitoses e proliferação

de melanócitos, formação aumentada e melanização de melanossomos,

transferência aumentada de melanossomos para queratinócitos, e ativação e

aumento da síntese de tirosina mediado pela estimulação da atividade do AMP

cíclico (HONIGSMANN e cols., 1999; HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003). O

conjunto de mecanismos citados parece agir sinergicamente, criando um ambiente

local favorável ao crescimento de melanócitos e interrupção dos eventos auto-

imunes possivelmente associados à destruição de melanócitos.

Embora a PUVA claramente iniba o sistema imune, seus mecanismos

imunossupressores não têm sido tão bem estudados quanto os efeitos da radiação

ultravioleta B (UVB) (MATSUMURA & ANANTHAWAMY, 2004), e prevalecem

estudos referentes ao seu emprego na psoríase. Por exemplo, os efeitos do

tratamento com UVB na expressão do CLA nos linfócitos T circulantes na psoríase já

foram estudados, demonstrando marcada redução na sua expressão, associada ao

efeito terapêutico do UVB na psoríase (SIGMUNDSDOTTIR e cols., 2003).

No setor de Fotodermatologia do HUCFF-UFRJ já foi estudado o efeito PUVA

nos linfócitos T circulantes, incluindo a expressão do CLA nestas células. Os

linfócitos T CD4-CLA+ e T CD8-CLA+ não apresentaram diferenças quantitativas

significantes quando comparados antes e após 30 sessões de PUVA. No entanto,

100% dos pacientes apresentaram algum grau de repigmentação, e 80% obtiveram

melhora clínica intensa, sugerindo que algum importante efeito PUVA ocorreu

provavelmente no microambiente cutâneo, estimulando a repigmentação de modo

marcante (ANTELO, 2006).

Não encontramos na literatura até o momento estudos que especifiquem o

efeito da PUVA na expressão do CLA nos linfócitos T do infiltrado cutâneo no vitiligo

ativo.

3.3.4. PUVA e efeito sistêmico

Há algumas evidências de que a PUVA aja não apenas localmente na pele,

mas também sistemicamente, que serão descritas a seguir:

1) O soro de pacientes tratados com PUVA induz a proliferação de

melanócitos e fibroblastos in vitro (ABDEL-NASER e cols., 1997 apud

ABDEL-NASER e cols., 2006);

2) As lesões cutâneas malignas podem ocorrer em áreas não submetidas à

radiação durante a PUVA (STERN e cols., 2002);

3) PUVA induz lentigos na pele lesional e não-lesional do vitiligo, em áreas

expostas e não-expostas (ABDEL-NASER e cols., 2004);

4) Similaridade da PUVA à fotoferese, que age sobre clones de linfócitos T

patogênicos em expansão, fotoativando-os, e produzindo uma reação

imunológica, de modo que quando reinfundidos agem contra células T-não

irradiadas, do mesmo clone patogênico, no linfoma T cutâneo avançado e

em outras desordens auto-imunes, como a rejeição a transplantes;

5) Liberação de citocinas que agem não só localmente, mas também

sistemicamente, após PUVA (NEUNER e cols., 1994).

6) Há uma elevação plasmática de endotelina-1, um potente mitógeno para

melanócitos, no vitiligo, em resposta à PUVA, acompanhada de

hiperpigmentação generalizada e repigmentação, sugerindo que a

liberação de ET-1 esteja envolvida no efeito clínico. Seu efeito mitogênico

generalizado justifica a irradiação total do corpo nos pacientes com vitiligo,

ao invés do tratamento apenas das áreas despigmentadas (ABDEL-

NASER e cols., 2006).

Com base nos achados citados, o estudo imuno-histoquímico dos efeitos

PUVA no microambiente cutâneo, tanto na pele afetada quanto na pele normalmente

pigmentada no vitiligo, é bastante relevante e talvez esclareça as modificações

celulares que ocorrem na fase de melhora da doença com esta modalidade

terapêutica. Também não se sabe por quanto tempo os efeitos imunossupressores

da PUVA podem persistir quando a terapia é descontinuada (BETHEA e cols.,

1999). Este dado contribuiria para o adequado seguimento dos pacientes tratados.

3.3.5. Efeitos da radiação ultravioleta no sistema imune cutâneo

Os efeitos já estudados da radiação UV (RUV) sobre o sistema imune

cutâneo reforçam a hipótese de que a PUVA age sistemicamente (Tabela 2).

Tabela 2. Principais efeitos RUV-mediados nos constituintes do sistema imune cutâneo.

Alvo Resultado

DNA (cromóforo) Formação de dímeros/redução da síntese

Membranas celulares Apoptose (especialmente linfócitos T) e permeabilidade

celular aumentada

Geração de espécies reativas de oxigênio

Queratinócitos Produção > de IL-1 e TNF-alfa (suprimem CL e induzem

imunossupressão)

Produção > de IL-6, IL-8, IL-10 (inibe apresentação de Ag

pelas CL), IL-12, IL-15, GM-CSF* e prostaglandinas(PGE2)

Expressão > de moléculas de adesão (ICAM-1)

Síntese > de alfa-MSH** (inibe resposta imune celular)

Linfócitos T Redução do número de células circulantes e da relação

linfócitos CD4/CD8

Redução da viabilidade

Apoptose

Células de Langerhans Redução do número e função e da expressão de moléculas

de adesão

Macrófagos Influxo para a epiderme e redução da expressão de

moléculas de adesão

Mastócitos Liberação de histamina (dose-dependente)

Fibroblastos Expressão aumentada da matrix metaloproteinase (MMP)-1

Células endoteliais Incerto

Adaptado de De Rie & Bos, 2005

*GM-CSF-fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos; **alfa-MSH- hormônio

estimulador de melanócitos

3.3.6. Resposta ao tratamento com PUVA

É um tratamento clássico e efetivo em cerca de 50% dos casos ou mais,

segundo diferentes estudos (EL MOFTY e cols., 2001; KREUTER e cols., 2001;

KWOK e cols., 2002; HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003). Nenhuma forma de

tratamento do vitiligo é totalmente bem sucedida, mas alguns relatos sugerem que

corticóides tópicos potentes, PUVA e terapia com UVB estão dentre as terapias

mais efetivas para vitiligo generalizado (KOVACS, 1998; ROELANDTS, 2003). A

fotoquimioterapia pode também ser combinada com outros tratamentos

(ROELANDTS, 2003).

Alguns autores não encontraram diferença estatística ao comparar os efeitos

da PUVA oral, UVB-banda estreita ou UVB-banda larga no vitiligo (NJOO e

cols.,1998; EL MOFTY e cols., 2001; SCHERSCHUN e cols., 2001). No entanto, a

dose cumulativa de UVB-banda estreita é geralmente menor quando comparada à

PUVA, e também tem poucos efeitos adversos (WESTERHOF & NIEUWEBOER-

KROBOTOVA, 1997). Os resultados variam muito de um paciente para outro, mas

raramente há repigmentação completa (ROELANDTS, 2003). Por causa dos efeitos

adversos a curto e longo prazo (dose-dependentes), a PUVA vem dando lugar à

fototerapia com UVB-banda estreita como tratamento de primeira escolha no vitiligo

(DE RIE & BOS, 2005). Além disto, a “narrow-band” UVB elimina a necessidade de

um fotossensibilizante (ROELANDTS, 2003). No entanto, ainda existe a limitação do

seu custo.

A PUVA é feita 2 a 3 vezes por semana, por no mínimo 6 meses, e em alguns

casos pode ser indicada por 1 a 3 anos. O início da repigmentação requer cerca de

30 a 50 exposições. Na maioria dos pacientes, as áreas tratadas retém o pigmento

longo tempo após o término do tratamento, o que é desejável ao se implementar

qualquer terapêutica para a doença (BLEEHEN & EBLING, 1998). Os resultados

são geralmente melhores em peles mais escuras (ROELANDTS, 2003).

3.3.7. PUVA e risco potencial a longo prazo

A exposição crônica à PUVA e suas altas doses cumulativas podem resultar

em alterações pigmentares, xerose, perda da elasticidade, formação de rugas, e

ceratoses actínicas, semelhantes à dermatoheliose. Além disto, pode haver

formação profusa de lentigos, denominada “lentiginose-PUVA induzida”, que resulta

de tratamentos prolongados e repetidos, e altas doses cumulativas. Não houve risco

aumentado de melanoma associado com estes lentigos, destacando-se

principalmente o efeito cosmético perturbador (HENSELER e cols., 1981 apud

HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003).

A maior preocupação com regimes de tratamento repetidos e/ou prolongados

é a fotocarcinogênese. A maioria dos dados na literatura que ressaltam este aspecto

foram obtidos de pacientes psoriásicos, que representam o maior grupo recebendo

PUVA. O risco estaria relacionado ao dano no DNA, mas a imunossupressão PUVA-

induzida talvez tenha também algum papel. Os achados correlacionando PUVA e

câncer de pele são controversos. Segundo alguns, o risco de carcinoma

espinocelular é significativamente aumentado em pacientes recebendo PUVA

quando comparados a controles, e a magnitude do risco parece ser dose-

dependente (STERN & LAIRD, 1994; STERN e cols., 2002). Entretanto, Henseler e

colaboradores (1987) observaram que, numa coorte de 1693 pacientes, todos com

tumores tinham história prévia de exposição a outros carcinógenos potenciais, como

metotrexate, e nenhum caso de tumor cutâneo foi observado naqueles que

receberam apenas PUVA, mesmo em doses cumulativas altas como 3000J/cm2.

Num estudo retrospectivo incluindo 5400 pacientes tratados com PUVA dentro de

um período de 20 anos, nenhum caso de câncer genital foi observado, mesmo sem

a proteção da genitália nos períodos de exposição UVA. Por outro lado, dentre os

48 casos diagnosticados de carcinoma espinocelular genital em homens, apenas 1

relatava exposição intensa à PUVA. Isto fez questionar a necessidade de proteger a

genitália durante o tratamento (AUBIN e cols., 2001). Contrariamente outros autores

reforçam a importância da proteção genital durante a exposição UVA, para minimizar

o risco de câncer cutâneo genital (STERN e cols., 2002).

Há pouca informação sobre os efeitos do PUVA a longo prazo em pacientes

com vitiligo. Apenas recentemente um estudo israelense descreveu que dentre 28

pacientes com vitiligo tratados com PUVA por longo período, nenhum caso de

câncer cutâneo foi observado. A dose mediana de radiação recebida foi de 336.8

J/cm2, e o número de tratamentos recebidos por paciente foi 77 (mediana). O tempo

médio desde o início do tratamento foi de 11 anos, e a média de tempo desde o fim

do tratamento foi de 9,4 anos (VUSSUKI, 2006). De qualquer modo, outros fatores

devem ser considerados quando o paciente é submetido à PUVA, como exposição

solar prévia, UVB, e uso concomitante de imunossupressores, além da resposta

individual dos pacientes aos psoralenos e à radiação UVA (HONIGSMANN &

SCHWARZ, 2003).

3.4. OUTROS TRATAMENTOS

3.4.1. PUVA Tópica

Em alguns casos, aplicações tópicas de 8-metoxipsoraleno (8-MOP) a 0,01-

0,2% (em propilenoglicol 5% e etanol 95%), seguidas de exposições semanais a

UVA, determinam mais de 50% de repigmentação após 6 meses de tratamento.

Tem a desvantagem de uma distribuição não-uniforme na pele, e reações

fototóxicas imprevisíveis, como queimaduras e bolhas, além de hiperpigmentação se

aplicada na pele “normal” (BLEEHEN & EBLING, 1998; HONIGSMANN &

SCHWARZ, 2003). Portanto, tem sido mais usado em pacientes com psoríase

palmo-plantar e vitiligo estável limitado (HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003).

3.4.2. UVB-banda estreita (narrow band)

É um tratamento com lâmpadas que emitem radiação UVB, tendo emissão

máxima em 311-312 nm, estimulando a síntese de melanina na pele pelo aumento

da atividade da tirosinase e estímulo à proliferação de melanócitos (STEINER e cols,

2004). É administrado 2 vezes por semana geralmente, e sem fotossensibilizantes.

Produz maior repigmentação na face, e menor nas mãos e pés. Suas vantagens

incluem: menos dermatites fotoalérgicas e fototóxicas, prurido e xerose; sessões

mais curtas; dispensa a fotoproteção pós-tratamento; pode ser usada em grávidas

ou lactantes, indivíduos com disfunção hepática e renal, e crianças (STEINER e

cols, 2004). É considerado seguro e efetivo no vitiligo infantil (NJOO e cols., 2000).

Alguns autores têm mostrado eficácia do tratamento superior à da PUVA

(SCHERSCHUN e cols., 2001), e o consideram a primeira escolha para adultos e

crianças (> 6 anos) com vitiligo generalizado (ROEDLANDTS, 2003; ORTONNE,

2003).

3.4.3. Corticoterapia tópica

Em alguns pacientes com vitiligo localizado, potentes corticóides tópicos

como valerato de betametasona a 0,1% e propionato de clobetasol a 0,05%

produzem repigmentação do vitiligo, mas freqüentemente provocam atrofia cutânea.

(KANDIL, 1974). Por isto, devem ser usados em áreas localizadas e descontinuados

se não houver melhora após 2 meses de uso (ORTONNE, 2003). Pacientes mais

jovens, com pele mais escura e com acometimento de face e pescoço parecem ter

melhor resposta (NJOO e cols., 1998; COCKAYNE e cols., 2002), assim como as

lesões mais recentes (STEINER e cols., 2004). Um estudo sobre o tratamento do

vitiligo infantil no HUCFF mostrou que o “puvasol” (oxsoralen creme a 0,2%

associado à exposição solar) foi mais eficaz do que a hidrocortisona tópica a 1% em

crianças de 2 a 12 anos de idade (n=121) (DIOGO CAMÊLO CAVALCANTI, 1998).

3.4.4. Corticoterapia sistêmica

Usada em pacientes que apresentem rápida progressão das lesões

acrômicas para reduzir a “atividade” de doença, porém tem baixo potencial para

induzir uma repigmentação eficaz quando dada por até 24 semanas. Alternativas

com menos efeitos colaterais são: 1) pulsoterapia oral com dexametasona (10

mg/dia, 2 dias consecutivos, com intervalos de 5 dias sem medicação), por até 24

semanas, ao qual pode-se associar a PUVA com melhores resultados

(RADAKOVIC-FIJAN, 2001); 2) doses baixas diárias de esteróide, como a

prednisolona 0,3mg/kg, por 2 meses, com redução à metade da dose nos 2 meses

seguintes (KIM e cols., 1999).

3.4.5. Calcipotriol tópico isolado ou associado à PUVA

Pode ser mais efetivo que a PUVA ou calcipotriol isoladamente (PARSAD e

cols., 1998; AMEEN e cols., 2001; YALÇIN e cols., 2001; CHIAVÉRINI e cols.,

2002). Os mecanismos envolvidos não são bem conhecidos, podendo envolver a

regulação da melanogênese ou imunomodulação (GLÄSER e cols., 1998; YALÇIN

e cols., 2001; CHIAVÉRINI e cols., 2002). Já foi demonstrada uma alteração na

homeostase do cálcio na pele com vitiligo, e os melanócitos expressam receptores

de vitamina D3. Isto explicaria um efeito positivo do calcipotriol, um metabólito ativo

da vitamina D (PARSAD e cols., 1998; YALÇIN e cols., 2001). Em geral, é usado

depois da PUVA, evitando-se sua interação com UVA (ROELANDTS, 2003), mas um

trabalho mostrou uma rápida repigmentação em casos refratários ao PUVA

isoladamente, com uso do creme 1 hora antes da PUVA, 2 vezes por semana

(ERMIS e cols., 2001 apud ROELANDTS, 2003).

3.4.6. Novos Imunomoduladores

Usados eficazmente no tratamento da dermatite atópica, representam uma

nova modalidade de tratamento em investigação para o vitiligo. Tacrolimus e

pimecrolimus são as principais drogas do grupo (VAN LEENT e cols., 1998;

BEKERSKY e cols., 2001). São inibidores da calcineurina. A calcineurina é uma

fosfatase ativada pelo cálcio, cuja principal ação é clivar o fosfato da subunidade

citoplasmática do NFAT (nuclear factor of activated T cells), que é um fator de

transcrição, permitindo que este NFATc entre no núcleo e promova a expressão de

citocinas. Então, através da inibição do NFAT, essas drogas bloqueiam a expressão

de citocinas necessárias à ativação da imunidade celular (NGHIEM e cols., 2002;

EICHENFIELD, 2002). A supressão de TNF-alfa, que parece ter um papel relevante

na etiopatogênese do vitiligo, após a aplicação de tacrolimus tópico, levaria à

repigmentação (GRIMES e cols., 2004).

Em estudos pequenos, o tacrolimus (0,1%) se mostrou eficaz no vitiligo, se

usado isoladamente ou associado à exposição solar (GRIMES e cols, 2002; SMITH

e cols, 2002; TANGHETTI, 2003 apud STEINER, 2004; KANWAR e cols, 2004). Um

estudo duplo-cego relatou que o tacrolimus (0,1%) é tão eficaz quanto o clobetasol

(0.05%) no tratamento do vitiligo em crianças, porém não produz atrofia e pode ser

usado em pálpebras (LEPE e cols., 2003). Recentemente, estudos maiores têm

comprovado a sua eficácia na doença (em até 89%), principalmente na face e

pescoço (SILVERBERG e cols., 2004).

3.4.7. Laser excimer 308-nm

Tem comprimento de onda próximo ao usado no UVB-banda estreita,

partilhando as mesmas indicações da fototerapia convencional. Tem sido eficaz e

bem tolerado no vitiligo localizado, sendo que lesões nas extremidades e sobre

prominências ósseas não são boas indicações. Sua combinação com tacrolimus ou

corticóide têm mostrado resultados interessantes, mas ainda requerem estudos

prospectivos (PASSERON & ORTONNE, 2006). Um estudo mostrou uma melhora

mais rápida (num período de 2 a 4 semanas) do que aquela obtida com outras

terapias (SPENCER e cols., 2002).

3.4.8. Despigmentantes

Em pacientes com vitiligo extenso e poucas áreas residuais de pigmentação,

cremes branqueadores como monobenziléter de hidroquinona a 20% atuam

destruindo os melanócitos, produzindo despigmentação definitiva. Podem ser

usados 2 vezes ao dia, por 9-12 meses. A resposta inicial ao produto geralmente

leva 1-3 meses e pode ocorrer perda de pigmento em sítios distantes. É um potente

irritante e/ou alérgeno e deve ser testado primeiramente em pequena área. Pode

haver repigmentação folicular em pacientes expostos à luz solar (ORTONNE, 2003).

É aconselhado apenas em pacientes acima de 40 anos, com mais de 50% de área

afetada, sem resposta a outros tratamentos, e que aceitem a despigmentação

irreversível (FITZPATRICK, 1977). Despigmentação com laser de rubi (Q-switched)

pode ser mais rápida do que com tais agentes (THISSEN & WESTERHOF, 1997

apud ORTONNE, 2003).

3.4.9. Microenxertos

O uso de técnicas de enxertos, microenxertos e cultura de melanócitos

autólogos é interessante, mas de resultados limitados (HATCHOME e cols., 1988).

Pode ocorrer transformação vitiligóide da pele implantada nos casos de vitiligo

generalizado e melhor resposta nos casos segmentares (FALABELLA, 1983). Os

critérios de seleção para transplantes autólogos são: vitiligo estável, resposta

insatisfatória a outras terapias, ausência de fenômeno de Koebner, teste de

microenxerto positivo (halo de repigmentação de 1-2mm ao redor da área

transplantada), ausência de tendência a quelóides, idade > que 12 anos

(FALABELLA e cols., 1995).

3.4.10. Fenilalanina

Matéria prima para a síntese de tirosina, produto na cadeia da melanina.

Parece eficaz na repigmentação do vitiligo na face, porém os resultados no tronco e

extremidades são pobres (CAMACHO & MAZUECOS, 1999). Empregada em doses

de 50 a 100mg/Kg/dia, 3 vezes por semana, 1 hora antes de se expor ao sol e/ou

acompanhada de fenilalanina em solução tópica a 10% (ANTONIOU e cols., 1989).

3.4.11. Pseudocatalase

O acúmulo de peróxido de hidrogênio na epiderme com vitiligo e a inativação

da catalase (provavelmente consumida pelo peróxido)se associam à vacuolização in

vitro de melanócitos (estresse oxidativo). Isto se reverteria com a adição de catalase.

Nisto se baseia o uso da pseudocatalase, que removeria as formas reativas do

oxigênio (SCHALLREUTTER & ROKOS, 2005). Schallreuter e colaboradores (2002)

atribuíram à combinação de pseudocatalase creme com exposição solar no Mar

Morto uma rápida repigmentação do vitiligo. No entanto, não se pode atribuir à

substância os resultados já que houve associação com exposição solar, e não há

ensaios clínicos controlados comprovando sua eficácia (ORTONNE, 2003). Um

estudo recente demonstrou a ineficácia de um medicamento contendo Cucumis

melo superóxido dismutase e catalase (Vitix®). Não foi comprovada sua atividade

de pseudocatalase in vivo ou in vitro, nem houve melhora significante no vitiligo

facial após 4 meses de tratamento (SCHALLREUTTER & ROKOS, 2005).

3.4.12. Vitamina B12 e ácido fólico oral

O uso de vitamina B12 (5000 U semanais, injetáveis) e ácido fólico oral

(2mg/dia) em 100 pacientes portadores de vitiligo mostrou repigmentação importante

em 52% dos casos, particularmente nas áreas fotoexpostas, e parada de progressão

da doença em 64% (JUHLEIN & OLSSON, 1997). A exposição solar simultânea

prejudica a avaliação destes resultados.

3.4.13. Melagenina

Extrato hidroalcoólico de placenta humana, cujo ingrediente ativo seria uma

alfa-lipoproteína, associada à radiação UV ou infravermelha. Seu uso não deve ser

recomendado, pois ensaios clínicos feitos com a substância em diferentes países

como Venezuela, México e Índia negam a sua eficácia (ORTONNE, 2003).

3.4.14. Coadjuvantes

- Apoio psicológico- A doença pode levar a constrangimento, ansiedade, perda da

autoconfiança e quadros depressivos. Segundo Porter (1987 apud ONGENAE e

cols., 2006), há 3 tipos principais de pacientes com vitiligo: 1) aqueles com “domínio

ativo” da doença (20%), que cooperam ativamente com o seu aprendizado; 2) os

que manifestam “aceitação passiva” (40%) e ignoram o problema, não se sentem

constrangidos, nem escondem as lesões; 3) e aqueles com “difícil ajuste” (40%), que

experimentam dificuldades em cooperar, se sentem deprimidos e constrangidos,

evitando a interação social. Portanto, uma boa relação médico-paciente,

informações adequadas, apoio à socialização, e eventualmente atendimento

psicoterápico/psiquiátrico são medidas de suporte (ONGENAE e cols., 2006).

- Fotoproteção- importante nos pacientes com constituição muito clara e/ou doença

extensa ou lesões em áreas fotoexpostas, prevenindo queimaduras solares

(MACHADO F

, 1986).

- Dihidroxiacetona (DHA) a 5%- Usada comercialmente em cremes

autobronzeadores, é uma opção terapêutica para as lesões resistentes aos

tratamentos convencionais, como nas extremidades distais. Pode ser usada em dias

alternados, com resultado cosmético satisfatório após 2 semanas (FESQ e cols.,

2001).

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. DESENHO DO ESTUDO

Estudo experimental, ensaio clínico do tipo “pré e pós-tratamento”, com

avaliação do infiltrado celular cutâneo em biopsias de pele perilesional (borda ativa

de lesão) e pele não-lesional de vitiligo (linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+, e CLA+, e

células de Langerhans-CD1a+) antes e após 20-30 sessões de PUVA. As biopsias

dos pacientes foram comparadas com biopsias de pele normal de controles

saudáveis.

Esta tese está vinculada ao projeto “Avaliação da Fotoquimioterapia-PUVA no

tratamento de Psoríase, Vitiligo, Linfoma de Células T Cutâneo, Doença Enxerto

contra Hospedeiro e Esclerodermia” já em andamento no Setor de

Fotodermatologia do HUCFF-UFRJ, sob a coordenação do Professor Absalom Lima

Filgueira.

O estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética do HUCFF-UFRJ.

Todos os pacientes receberam informações detalhadas sobre a natureza da

pesquisa e perspectiva do tratamento que receberiam, e assinaram voluntariamente

um termo de consentimento livre e esclarecido (anexo 1), após o qual foram

iniciados os procedimentos clínicos propriamente ditos. Os indivíduos do grupo

controle foram voluntários saudáveis recrutados da população geral, que também

receberam informações completas sobre a pesquisa, e assinaram o termo de

consentimento livre e esclarecido.

4.2. PARTICIPANTES

4.2.1. Casuística

Foram estudados 22 pacientes com vitiligo generalizado (não-segmentar), em

atividade (progressivo), e 10 controles saudáveis, pareados por idade e sexo. Os

pacientes foram catalogados e selecionados no Setor de Fotodermatologia do

HUCFF-UFRJ, durante o período de fevereiro de 2004 a janeiro de 2006.

4.2.2. Critérios de Inclusão

• Pacientes apresentando vitiligo generalizado, referindo doença “ativa”, em

qualquer parte do corpo, exceto genitália. Todos os pacientes e indivíduos

selecionados deveriam ter idade superior a 18 anos, de ambos os sexos.

OBS: Foram considerados como tendo “doença ativa” os pacientes que tivessem

observado progressão das lesões nos últimos 3 meses, em número ou tamanho;

• Pacientes com qualquer fototipo de pele, de acordo com a classificação de

Fitzpatrick. O critério diagnóstico de vitiligo generalizado foi baseado nos

achados clínicos característicos, definidos pela literatura médica, devido à

ausência de achados patognomônicos da doença.

• Pacientes selecionados que apresentassem exames laboratoriais e exame

oftalmológico pré-fototerapia normais.

4.2.3. Critérios de Exclusão

• Pacientes que tivessem recebido tratamento e/ou apresentado repigmentação

espontânea nos 3 meses prévios à participação no estudo;

• Pacientes com vitiligo “estável”, sem o surgimento de lesões novas nos últimos 3

meses;

• Pacientes apresentando intolerância à PUVA e/ou a medicamentos usados no

tratamento;

• Pacientes grávidas;

• Pacientes com lesões de vitiligo afetando exclusivamente a área genital;

• Pacientes menores de 18 anos de idade.

• Pacientes com outras dermatoses inflamatórias concomitantes, como psoríase e

eczema atópico, ou portadores de imunossupressão (por doenças ou

medicamentos), que pudessem interferir com os achados celulares cutâneos.

4.2.4. Critérios de Inclusão dos Controles

• Indivíduos saudáveis, maiores de 18 anos de idade, pareados por sexo e idade

com o grupo de pacientes com vitiligo, sem doença cutânea ativa, e sem qualquer

outra afecção clínica.

4.2.5. Critérios de Exclusão dos Controles

• História pessoal ou familiar de vitiligo;

• Doenças auto-imunes;

• Dermatoses inflamatórias ativas, principalmente de natureza atópica;

• Gestantes;

• Menores de 18 anos

4.3. METODOLOGIA

Os pacientes foram submetidos à seguinte rotina antes de começar o

tratamento:

4.3.1. Entrevista e exame clínico

Esta etapa incluiu avaliação clínica e seleção de pacientes, preenchimento do

termo de consentimento livre e esclarecido e preenchimento do protocolo de

investigação dos pacientes (anexos). Os parâmetros clínicos mais importantes para

o estudo foram registrados, tais como: idade de aparecimento, tempo de evolução

da doença, extensão das lesões, fatores associados e/ou desencadeadores, etc.

Os seguintes exames laboratoriais de sangue foram realizados como parte da

triagem pré-PUVA, seguida no Setor de Fotodermatologia (assim como a avaliação

oftalmológica): hemograma completo, velocidade de hemossedimentação, provas de

função hepática e renal, e testes de função tireoidiana, tais como: níveis de T4 livre

e TSH. Além disto, foi feita pesquisa de Acs antitireoperoxidase (antiTPO) no

Laboratório de Métodos Especiais do Serviço de Imunologia do HUCFF-UFRJ, pelo

método de ensaio imuno-enzimático, utilizando o kit comercial Immulite (Diagnostic

Products Corporation - DPC). Foram considerados positivos os títulos de antiTPO

iguais ou superiores a 35 U/mL.

4.3.2. Exame oftalmológico

Realizado no Serviço de Oftalmologia do HUCFF-UFRJ, para avaliar algum

tipo de alteração patológica na mácula, antes de começar a ingesta de

psoralenos.

4.3.3. Documentação fotográfica

Foram realizadas fotografias padronizadas com a máquina digital NIKON 7.1

megapixels, em 3 momentos: pré-tratamento, com 15 sessões e ao final das 30

sessões propostas.

4.3.4. Biopsias de pele e avaliação histológica

Antes de serem submetidos à PUVA, foram realizadas 2 biopsias com punch

5mm nos pacientes: 1) na pele perilesional (PL), envolvendo a borda ativa (BA) de

lesão, e 2) na pele não-lesional (NL). A biopsia de pele PL foi feita numa lesão

progressiva, exatamente no limite entre pele lesional e não-lesional, incluindo as 2

metades igualmente dentro do punch. Foi escolhida preferencialmente uma lesão

nos membros superiores, evitando-se as mãos e os pés e lesões sobre

proeminências ósseas, que apresentam repigmentação mais difícil. As biopsias de

pele NL do paciente (controle interno) foram coletadas no dorso, numa área distante

da pele afetada, e pouco visível.

Após serem submetidos à PUVA, foram realizadas 2 novas biopsias nos

pacientes com vitiligo: 1) numa lesão em repigmentação, preferivelmente numa área

próxima à primeira biopsia, também envolvendo pele L e NL; 2) na pele NL, no

dorso. Estas biopsias ocorreram após cerca de 30 sessões de PUVA, respeitando-

se um prazo máximo de até 48 horas após a última sessão, já que mudanças no

número de linfócitos se iniciam 30 minutos após a exposição, são máximas em 12-

16 horas, e voltam aos níveis pré-tratamento cerca de 72 horas após a irradiação. O

prazo dado seria viável para o retorno do paciente ao hospital e permitiria ainda a

detecção dos efeitos celulares da PUVA (MORISON e cols., 1981).

A pele normal de controles foi biopsiada em etapa única, ao início do estudo,

também no dorso, em 10 indivíduos saudáveis (controle externo), pareados por

idade e sexo com os afetados. O grupo controle não recebeu o tratamento.

Todos os espécimes biopsiados, inclusive aqueles de controles, foram

divididos em 2 partes iguais. Nas biopsias de BA foi feito um corte transversal ao

limite entre pele L e NL, incluindo pele L e NL em ambos os fragmentos. As 2

metades de cada biópsia foram fixadas separadamente em formol tamponado a

10%. Uma das metades foi processada por métodos convencionais, incluída em

parafina, e dos blocos de parafina foram obtidas as secções de pele para a

avaliação histológica. A outra metade foi também processada convencionalmente, e

a partir dos blocos de parafina o material foi preparado para os testes imuno-

histoquímicos, conforme será descrito a seguir.

Para o estudo histopatológico as secções histológicas obtidas foram coradas

com HE e pelo método de Fontana-Masson; o estudo foi feito em 1 ou 2 secções do

microscópio óptico, com objetiva de 40X. Os principais parâmetros histológicos

analisados foram aqueles concernentes à inflamação tecidual associada e

alterações na pigmentação da camada basal da epiderme. Nos espécimes

referentes à lesão de vitiligo, consideramos também a presença ou ausência de

borda histologicamente evidente, mostrando a transição entre a área com

pigmentação melânica basal “normal” e a área de perda da pigmentação basal. Além

disto, avaliamos a presença de incontinência pigmentar (IP), que foi referida como:

ausente; focal(+), quando os melanófagos foram observados em menos que 1/3 da

extensão da derme superior no corte analisado; ou IP difusa (++), quando os

melanófagos foram encontrados em área maior que 1/3 da extensão da derme

superficial na secção escolhida.

4.3.5. Avaliação imuno-histoquímica

Foi avaliada a composição do infiltrado celular cutâneo nas biopsias através do

método imuno-histoquímico, usando-se anticorpos primários para: linfócitos T CD3,

CD4 e CD8, células de Langerhans (CD1a), e antígeno cutâneo leucocitário (CLA),

para evidenciar marcadores de ativação nas células do infiltrado cutâneo. Tais

anticorpos primários (tabela 3) foram empregados em todas as amostras, na pele PL

e NL dos pacientes, e na pele dos controles.

Tabela 3.Descrição dos anticorpos primários utilizados na Imuno-histoquímica

Marcador Descrição do Ac especificidade diluição Fonte/

fornecedor

CD1a

Monoclonal mouse

antiCD1a, clone 010,

IgG1

Céls. Langerhans 1:50 *Dako

CD8

Monoclonal mouse Ac

antiCD8, clone

C8/144B, IgG1

Linfócitos T

citotóxicos

1:50 Dako

CD3

Policlonal rabbit anti-

human CD3

CD3 em céls. T 1:500 Dako

CD4

Monoclonal Ac to CD4

(Mouse IgG1-clone

4B12)

Linfócitos T

auxiliares

1:30 BioGenex

CLA

Purified Rat anti-

human CLA

monoclonal Ac (IgM)-

Clone HECA-452

CLA 1:50 BD

Biosciences

Pharmigen

* Dako Corporation-Califórnia-USA

A partir dos blocos de parafina foram obtidos novos cortes histológicos de 5

micrômetros de espessura, que foram colocados em lâminas previamente lavadas

em solução sulfocrômica, emulsionadas com adesivo à base de poli-L-lisina (Poly-L-

Lysine, da marca Sigma, USA, cód. P8920) a 10% e colocadas em estufa a 60ºC

durante 12 horas para melhor aderência do material à superfície da lâmina.

A seguir, o material foi desparafinizado e reidratado, tendo sido colocado estufa

a 60ºC por 20 minutos e, então, em 3 banhos de xilol (5 minutos cada) e em 3

banhos de álcool em concentrações decrescentes de 95%, 70% 50% (5 minutos

cada), conforme procedimento histotécnico usual, em temperatura ambiente.

A atividade da peroxidase endógena foi então inibida, através da imersão do

material em peróxido de hidrogênio a 3% em metanol a 70% durante 20 minutos,

após o qual as lâminas foram lavadas em água destilada.

Nas amostras fixadas em formol foi feita a recuperação antigênica para os

epítopos pesquisados, do seguinte modo: os cortes que reagiriam com os Acs CLA,

CD1a, CD3 e CD8 foram mergulhados em tampão citrato de sódio a 0,01M com pH

igual a 6.0 em banho-maria a temperatura de 97.5ºC por 40 minutos; depois

retirados do banho-maria e deixados resfriando à temperatura ambiente por 20

minutos. Os cortes que reagiriam com o anticorpo CD4 foram mergulhados em

tampão EDTA/TRIS com pH igual a 8.0, e o resto do procedimento foi igual ao

procedimento com os Acs descritos acima.

Após a etapa de recuperação antigênica, as lâminas foram lavadas em água

destilada e colocadas em tampão PBS pH 7.4 com TWIN 20 (marca Sigma

cód.P7949), 3 banhos de 5 minutos cada. Em seguida, os cortes foram incubados

com os anticorpos previamente diluídos em uma solução de PBS-TWIN20+BSA a

0,1% (para bloquear as proteínas inespecíficas). Após 1 hora de reação em

temperatura ambiente, foi aplicado o kit da Dako LSAB (cód. K0690), sendo que ao

fim de cada etapa as lâminas foram lavadas em tampão PBS-TWIN20. Os

reagentes foram empregados conforme as instruções do fabricante, e o sistema

estreptavidina-biotina foi usado para todas as reações (HSU & RAINE, 1981). A

reação positiva foi detectada pela adição do cromógeno diaminobenzidina (DAB-

Dako, cód. K3466), por 30 segundos a 1 minuto em média. Os cortes foram contra-

corados com hematoxilina de Harris, lavados em água corrente, desidratados em

álcool com concentrações crescente 50%, 70%, 90% e P.A. e depois 4 banhos de

xilol, e finalmente as lâminas montadas com goma de Damar (marca Proquímios).

As células positivas foram quantificadas em no mínimo 12 campos de uma

secção, e expressas como o número de células identificadas por campos ao

microscópio óptico, com aumento de 500X (Olympus BX51 objetiva 50x).

O anexo 5 fornece a especificação das principais soluções utilizadas nos testes

imuno-histoquímicos.

4.3.6. Tratamento

Os pacientes selecionados foram submetidos a sessões de PUVA “oral”, 2

vezes por semana, até completarem em média 30 sessões. Após a ingesta da dose

de 0,6 mg/kg de 8-MOP oralmente, 2 horas antes do tratamento, os pacientes

começavam a exposição à radiação UVA (RUVA: 320-400 nm). O medicamento

(Oxsoralen®) foi doado pelo laboratório ICN, lotes 001/03 e 002/03. A dose inicial

para cada paciente foi determinada de acordo com o seu fototipo (HONIGSMANN e

cols., 1999). Entretanto, pacientes com despigmentação extensa pertencentes a

qualquer fototipo iniciaram a dose UVA recomendada para o fototipo I.

O paciente entrava na cabine usando fotoproteção ocular (óculos com proteção

para radiação UVA) e proteção da genitália (roupa íntima). O paciente permanecia

no centro da cabine, expondo toda a pele do corpo (exceto genitália), durante o

tempo estabelecido pelos pesquisadores e controlado pela cabine. Foram

asseguradas as condições de segurança, como a utilização da proteção ocular

durante a exposição à radiação e também após 18-24h da sessão, e uso de loção

fotoprotetora FPS15 nas áreas após a exposição à RUVA. Os pacientes foram

orientados quanto a possíveis complicações como queimaduras, prurido e

intolerância gastrintestinal ao psoraleno.

A tabela 4 mostra as doses UVA usadas no Setor de Fotodermatologia do

HUCFF. Tal protocolo de aplicação de PUVA pelo fototipo está em acordo com a

literatura (HONIGSMANN e cols., 1999; HONIGSMANN & SCHWARZ, 2003). A

dose UVA foi aumentada 0,5 J/cm2, toda vez que as lesões dos pacientes não

apresentassem mais o eritema tardio. A progressão semanal dos joules foi feita de

acordo com a intensidade do eritema. Nos casos sem eritema na mancha, o

aumento foi de 0,5 J/cm

por semana; na mácula com eritema rosado claro, a dose

era mantida e nos casos de eritema violáceo, a dosagem era reduzida em 0,5 J/cm

As dosimetrias de RUVA das unidades foram aferidas uma vez por

semana, de acordo com a orientação do fabricante de cada unidade, para assegurar

a dose de radiação.

Tabela 4. Dose UVA utilizada no Setor de Fotodermatologia-HUCFF, de acordo com o fototipo do

paciente.

Tipo

de pele*

Dose UVA

recomendada (J/cm2)

I Sempre queima, nunca bronzeia 0,5

II Sempre queima, mas às vezes bronzeia 1,0

III Às vezes queima, mas sempre bronzeia 1,5

IV Nunca queima, sempre bronzeia 2,0

V Moderadamente pigmentada 2,5

VI Negro 3,0

Adaptado de HONIGSMANN e cols., 1999

* Os tipos I-IV são determinados pela história; os tipos V e VI, pelo exame físico (descendência

racial).

4.3.7. Metodologia estatística

Em relação aos achados histológicos obtidos ao HE e FM, foram calculados

os valores percentuais de cada achado, e para alguns achados como por exemplo,

proporção de alteração na pigmentação da camada basal no grupo de casos

comparada ao grupo controle, o teste estatístico utilizado foi o teste exato de Fisher,

nível de significância de 5%.

Para a análise dos achados imuno-histoquímicos foram empregados:

- Teste de Mann-Whitney (teste não paramétrico)- para verificar se existe

diferença significativa na contagem de células CD1a+, CD8+, CD3+, CD4+ e CLA+

entre os casos e controles, antes da PUVA, e também após a PUVA.

- Teste dos postos sinalizados de Wilcoxon (teste não paramétrico)- para

verificar se existe variação significativa na contagem de células CD1a+, CD8+,

CD3+, CD4+ e CLA+ da pele com lesão para a pele sem lesão, no grupo dos

pacientes, antes da PUVA; e também para verificar se existe variação significativa

na contagem de tais células positivas na pele com lesão e sem lesão, no grupo dos

pacientes, antes e após PUVA.

O critério de determinação de significância adotado foi o nível de 5%, ou

seja, quando o valor de p ≤ 0,05, então existe significância estatística. A análise

estatística foi processada pelo software estatístico SAS

System 6.04.

Para todas as análises foram pesquisados: número de células positivas

identificadas na epiderme por número de campos contados, na derme por número

de campos contados, e na pele total (ou seja, no somatório de células na epiderme e

na derme) por número de campos contados, na pele perilesional e não-lesional do

vitiligo, e na pele de controles. Nas análises comparativas dos achados foram

utilizadas as médias do número de células positivas em cada setor pesquisado.

5. RESULTADOS

5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA

Foram incluídos 22 pacientes neste estudo. A idade deles variou de 24 a 64

anos (média: 43,5 +11,46 anos), sendo 18 do sexo feminino e 4 do sexo masculino.

A idade no momento do diagnóstico variou de 3 a 54 anos (média: 22,81+ 16,33).

Em 50% dos pacientes a doença surgiu antes dos 20 anos de idade (Figura 3). O

tempo de evolução foi de 1 a 50 anos, com média de 19,77 +15,91. A maioria dos

pacientes apresentavam doença com mais de 5 anos de evolução (Figura 4).

6 casos

27%

5 casos

23%

4 casos

18%

3 casos

14%

1 caso

3 casos

14%

0-10 anos

10-20 anos

21-30 anos

31-40 anos

41-50 anos

51-60 anos

Figura 3. Distribuição dos pacientes com vitiligo quanto à faixa etária de aparecimento da doença

2 casos

3 casos

14%

9 casos

41%

8 casos

36%

Até 1 ano

De 1 a 5 anos

De 5 a 20 anos

Mais 20 anos

Figura 4. Distribuição dos pacientes quanto ao tempo de evolução da doença

Os fototipos estudados foram assim distribuídos: fototipo III-5 casos (22,7%);

fototipo IV-11 casos (50%); fototipo V-6 casos (27,3%). Foi utilizada a “regra dos

nove” para calcular a área corporal afetada estimada, sendo identificados 2 grupos:

pacientes com área acometida > 20% (13 casos- 59,1%) e < 20% (9 casos- 40,9%).

A presença de antiTPO positivo foi detectada em 5 casos (22,7%). Relato de

condições associadas à auto-imunidade, previamente diagnosticadas, que não o

vitiligo, ocorreu em 3 pacientes (13,6%), sendo 2 casos de doença tireoidiana e 1

caso de DM. À exceção desses casos, não foram observadas alterações dignas de

nota nos exames laboratoriais dos outros pacientes incluídos no estudo.

Casos familiais de vitiligo foram descritos por 6 pacientes com a doença, o que

representa um percentual de 27,3%, sendo que a maioria deles relataram mais de 1

caso na família. No total, foram observados 12 casos de vitiligo nas famílias dos

afetados. Predominaram parentes de primeiro grau (irmãos- 4 casos, mãe-3 casos,

pai-1 caso, filho- 1 caso). Outras desordens auto-imunes (excluindo o vitiligo) nas

famílias foram assim distribuídas: DM (não especificado)- 36,4% (8 casos), doença

tireoidiana- 31,8% (7 casos) e alopecia areata- 13,6% (3 casos). Alguns dos

pacientes apresentavam mais de um parente afetado por alguma das doenças

descritas, como por exemplo, diabetes (11 casos no total).

Quando interrogados sobre fatores desencadeantes ou agravantes da doença,

5 pacientes recordaram um evento marcante associado (22.7%), dentre eles: óbito

na família (4 casos) e acidente automobilístico grave (1 caso). Muitos relataram

aparecimento da doença na infância e não lembravam detalhes do início da doença.

Quadro 1 mostra um resumo das características clínico-laboratoriais dos

pacientes com vitiligo selecionados neste estudo.

Quadro 1. Características clínico-laboratoriais dos 22 pacientes com vitiligo acompanhados no HUCFF/UFRJ

Caso Iniciais Sexo Idade atual

(anos)

Idade ao início da

doença (anos)

Evolução

(anos)

Fototipo Area

afetada

Casos

familiais

Parentesco Anti-TPO

(U/ml)

1 AML 1 25 20 5 V

<20%

Sim

mãe/tia paterna

<35

2 ETN 1 64 54 10 IV

>20%

Não

<35

3 VLSM 1 48 11 37 IV

>20%

Não

233

4 AESM 1 52 5 47 IV

>20%

Não

<35

5 SML 1 34 7 27 V

<20%

Não

672

6 FAM 2 31 25 6 III

>20%

Não

<35

7 MASM 1 62 12 50 V

<20%

Não

<35

8 EASJ 1 58 54 4 IV

>20%

Não

<35

9 FCM 1 24 10 14 IV

>20%

Não

431

10 AMSB 1 45 37 8 IV

<20%

Não

<35

11 JAS 1 45 31 14 V

<20%

Sim

mãe/irmão

<35

12 MFC 2 55 25 30 V

<20%

Não

<35

13 MMC 1 46 31 15 IV

<20%

Não

<35

14 GGC 2 31 18 13 IV

>20%

Sim

irmã/sobrinha

<35

15 ALPS 1 40 6 34 IV

>20%

Não

- 101

16 SD 1 51 3 48 IV

>20%

Sim

filho/prima/tio

<35

17 DCC 1 43 10 33 III

>20%

Não

<35

18 JMS 1 53 52 1 III

>20%

Não

<35

19 NDP 1 40 25 15 III

>20%

Sim

2 irmãos/pai

184

20 UDC 2 30 27 3 V

<20%

Sim

mãe

<35

21 SRBES 1 35 15 20 IV

>20%

Não

<35

22 LCNRB 1 45 44 1 III

<20%

Não

- -

*Sexo: feminino-1, masculino-2

5.2. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO CONTROLE

O grupo controle foi composto de 10 pacientes saudáveis, com idade variando de

22 a 55 anos (média: 38,9 anos; DP ± 12,52 ), sendo 8 do sexo feminino (80%) e 2 do

sexo masculino (20%). O quadro 2 mostra a caracterização do grupo.

Quadro 2. Características dos indivíduos do grupo controle

Caso Iniciais Sexo Fototipo Idade (anos)

1 DPF 1 III 45

2 RHSM 1 V 55

3 MNS 1 V 54

4 TA 1 III 31

5 TV 1 II 27

6 VA 2 III 35

7 EAP 2 VI 22

8 MHN 1 VI 52

9 MIA 1 IV 25

10 LGS 1 IV 43

*Sexo: feminino-1, masculino-2

5.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA PELE PERILESIONAL E NÃO-

LESIONAL DOS PACIENTES (PRÉ-PUVA) COM A PELE DE CONTROLES

Os principais achados histológicos nos 3 grupos analisados estão resumidos na

Tabela 5.

Tabela 5.Principais achados histológicos nos grupos estudados (etapa pré-tratamento)

Achados

histológicos

Pele perilesional

Grupo 1

Pele não-lesional

Grupo 2

Controles normais

Grupo 3

¹DPVS leve

95,4% (21 casos) 86,4% (19 casos) 70% (7 casos)

Exocitose

13,6% (3 casos) não observada não observada

Incontinência

pigmentar

²40,9% (9 casos) 90,9% (20 casos) 80% (8 casos)

³PMB reduzida

100% (22 casos) 50% (11 casos) não observada

Dermatite de

interface

não observada não observada não observada

¹Dermatite perivascular superficial leve= discreto infiltrado superficial perivascular de linfócitos;

²considerando apenas aqueles pacientes com completa ausência de pigmentação basal no lado afetado

da biopsia; ³PMB- pigmentação melânica basal; reduzida= áreas de “defeitos” na pigmentação da

camada basal da epiderme.

Os detalhes histológicos da pele perilesional (A-B) e não-lesional do vitiligo (C-F)

estão demonstrados na Figura 5.

Na pele perilesional (borda ativa) de vitiligo (grupo 1) pudemos identificar uma

infiltração epidérmica de linfócitos em poucos casos (imagem 5A). Foi evidenciada

pigmentação melânica residual na camada basal (imagem 5B) em 9 pacientes (40,9%),

e completamente ausente no lado afetado da biopsia no grupo restante (13). Neste

grupo, a IP foi encontrada em 69,2% (9/13) em algum lado da biopsia. Três pacientes

apresentavam ausência de PMB nos 2 lados da borda ativa. Os outros 19 pacientes

(86,3%) tinham uma borda evidente mostrando a transição histológica entre a pele

macroscopicamente normal e a pele com reduzida pigmentação na camada basal da

epiderme.

Considerando a pele clinicamente sã no vitiligo (grupo 2), observamos IP difusa

em 12 casos (54,5%) e focal em 8 casos (36,4%). Houve uma diminuição da PMB na

pele NL de 50% dos pacientes (11/22 casos), quando comparados aos controles (0/10

controles), através da coloração FM (imagens 5C-F). Isto significa uma diferença

estatisticamente significativa, P valor= 0,005 pelo teste de Fisher. A pigmentação basal

da epiderme estava marcantemente reduzida em 3 casos . Comparando os fototipos

dos pacientes com o achado de IP na pele NL dos pacientes com vitiligo encontramos

a seguinte proporção: IP difusa (12 casos no total)- 41,7% eram fototipo V (5 casos),

33,3% eram fototipo IV (4 casos) e 25% fototipo III (3 casos). Dentre os achados de IP

focal (8 casos no total) – 12,5% eram fototipo V (1 caso), 62,5% eram fototipo IV (5

casos) e 25% fototipo III (2 casos). IP ausente foi encontrada apenas no fototipo IV (2

casos).

Nos controles normais (grupo 3) identificamos IP em 80% dos pacientes, sendo

completamente ausente em apenas 2 pacientes, focal em 3 pacientes (<30%), e difusa

em 5 pacientes (50%). Nos casos de IP difusa, 2 pacientes pertenciam ao fototipo IV

(40%), 2 ao fototipo V (40%) e 1 ao fototipo VI (20%) de Fitzpatrick. Não houve

significância estatística quando comparamos a proporção entre IP na pele NL dos

pacientes com vitiligo e nos controles (p = 0,55), usando o teste de Fisher. Entretanto, o

arranjo de melanófagos/grânulos de melanina foi diferente na pele NL em relação ao

grupo controle e também à borda ativa do vitiligo. Na pele NL do vitiligo, os

melanófagos/grânulos de melanina estavam bem mais densamente agrupados quando

comparados ao seu arranjo delicado, fino, nos outros 2 grupos citados.

Figura 5. Biopsias de pele PL (A-B) e NL (C-F) no vitiligo ativo.

A imagem A mostra um infiltrado epidérmico de linfócitos, possivelmente envolvendo um

melanócito residual (coloração HE- 400X); Imagem B- PMB residual numa lesão de vitiligo; grânulos mais

finos de melanina na derme superficial (coloração FM- 400X). Pigmentação melânica basal (PMB) normal

-imagens C e D, e marcadamente reduzida- imagens E e F. Na imagem D, grânulos grosseiros de

melanina na derme superficial (coloração FM-100X e 400X). Perda da PMB- setas. A- paciente 1; B-

paciente 2; C e D- paciente 3; E e F- paciente 4.

5.4. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PELE PERILESIONAL E NÃO-

LESIONAL DOS PACIENTES COM VITILIGO- ANTES DO TRATAMENTO

Foi verificado se existe variação significativa na contagem de células da lesão

ativa para a pele não-lesional dos pacientes com vitiligo. A diferença absoluta (delta)

entre a pele PL e a pele NL foi dada pela fórmula: Diferença absoluta = pele perilesional

– pele não-lesional. O anexo 6 fornece as tabelas com os dados de média, desvio

padrão (DP), mediana, mínimo e máximo da contagem de células na pele PL e na pele

NL, a diferença absoluta e o correspondente nível descritivo (p-valor) para o CD1a,

CD8, CD3, CD4 e CLA, respectivamente. Os gráficos 1 a 5 mostram que não existe

variação significativa na contagem de células CD1a+ (p=0,06), CD8+ (p=0,86), CD4+

(p=0,19), CD3+ (p=0,88), nem CLA+ (p=0,31) na pele total (epiderme + derme/por

número de campos), comparando-se a pele PL e a pele NL dos pacientes. Na

comparação isolada da epiderme e da derme, entre os 2 segmentos (pele PL e pele

NL) no vitiligo, foi verificado um aumento estatisticamente significativo na contagem de

linfócitos T CD8+(p=0.044) e T CD3+(p=0.033) intraepidérmicos na pele perilesional.

Gráfico 1.Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes com vitiligo

Gráfico 2.Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes com vitiligo

Gráfico 3.Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes com vitiligo

Gráfico 4.Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes com vitiligo

Gráfico 5. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional e não-lesional dos

pacientes com vitiligo

5.4.1. Ilustrações da Imuno-histoquímica

Detalhes do infiltrado celular cutâneo em borda ativa de lesão e em pele não-

lesional de pacientes com vitiligo estão demonstrados nas figuras 6, 7, 8 e 9.

Figura 6. Células CD1a+ positivas bem marcadas na epiderme perilesional de pacientes com

vitiligo ativo

Figura 7. Pele perilesional com células CLA+ na epiderme e na derme superior constituindo um

infiltrado inflamatório exuberante (100x e 400X)

Figura 8. Pele perilesional(A) e não-lesional (B) do mesmo paciente, mostrando infiltrado de células CLA+ na epiderme e derme superior

(100X)

lesao

Figura 9. Pele perilesional (A) e não-lesional (B) com células CLA+ (400X)

5.5. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA

PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES VERSUS

CONTROLES (PRÉ-TRATAMENTO)

Foi verificado se existe diferença significativa na contagem de células da pele

(perilesional e não-lesional) entre casos e controles. O anexo 6 fornece as tabelas

com os dados de média, desvio padrão (DP), mediana, mínimo e máximo das

contagens de células na pele segundo o grupo (caso e controle) e o correspondente

nível descritivo (p-valor) para o CD1a (com lesão e sem lesão), CD8 (com e sem

lesão), CD3 (com e sem lesão), CD4 (com e sem lesão) e CLA (com e sem lesão),

respectivamente. Para todas as variáveis foram comparadas as médias, conforme

mostram os Gráfico 6 a 15.

Gráfico 6. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional de pacientes com

vitiligo versus pele de controles

Gráfico 7. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele não-lesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 8. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional de pacientes com

vitiligo versus pele de controles

Gráfico 9. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele não-lesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 10. Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele perilesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 11. Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele não-lesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 12. Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele perilesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 13. Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele não-lesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

100

Gráfico 14. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

Gráfico 15. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele não-lesional de pacientes

com vitiligo versus pele de controles

101

Foi encontrada uma depleção significativa de células CD1a+ na pele total,

principalmente às custas de redução significativa do seu número na epiderme, tanto

na pele PL, quanto na pele NL no vitiligo ativo, em relação a controles normais.

Houve aumento significativo do número de linfócitos T CD8+ na epiderme e

na derme na pele PL de vitiligo ativo, em relação a controles normais. Já na pele NL

do vitiligo, tal aumento foi significativo apenas na derme.

Em relação à contagem de linfócitos CD4+, não houve alteração significativa

nem na epiderme, nem na derme, em nenhum dos segmentos avaliados (pele PL e

pele NL) nos pacientes em relação a controles.

Houve aumento significativo de linfócitos T CD3+ na epiderme da pele PL e

NL de vitiligo em relação aos controles. No entanto, a contagem total de células

CD3+ na pele não foi estatisticamente diferente da pele de controles, em nenhum

dos 2 segmentos biopsiados (pele PL e NL).

Não houve alteração significativa na contagem de células CLA+ (figura 11),

nem na epiderme, nem na derme, na lesão de vitiligo em relação aos controles. Já

na pele NL, houve redução do número de células CLA+ na epiderme em relação aos

controles.

102

Figura 10. Presença de células T CD8+ intraepiteliais na borda “ativa” de lesão de vitiligo

103

Figura 11. Pele perilesional com células CLA+ intraepiteliais na topografia de melanócitos na camada basal da epiderme

104

5.6. CARACTERIZAÇÃO DO TRATAMENTO DOS PACIENTES COM PUVA

A partir desta etapa, foram considerados 20 pacientes para a análise, pois 2

casos (8 e 19) foram excluídos por razões não relacionadas à PUVA. Foi dada

inicialmente uma dose de radiação UVA (RUVA) de 0,41J/cm2 (± 0,05). A dose

média de RUVA até o início da repigmentação foi 11,48 Joules/cm2 (DP ± 20,44), e

ao final do tratamento de cada paciente foi 47,98 J/cm2 (DP± 25,23). O número

médio de sessões até a repigmentação inicial das lesões (notada pelo paciente e

pelos médicos) foi de 9,6 sessões (DP ± 4,76), e o número total de sessões variou

entre 20 e 34 (média= 29) das 30 sessões propostas. A repigmentação mais rápida

foi notada com 4 sessões e a mais lenta com 25. O Quadro 3 mostra as

características da resposta dos pacientes à PUVA.

Quadro 3. Caracterização da resposta dos pacientes à PUVA

Caso

Área

corporal

afetada

Número de

sessões para a

repigmentação

Número de

Joules para a

repigmentação

Número

total de

sessões

Dose

acumulada de

Joules/cm2

<20%

7 6,09 32 35,67

>20%

9 6,93 30 54,3

>20%

9 6,93 30 51,59

>20%

8 6,96 30 61,41

<20%

13 10,01 30 42,35

>20%

12 10,44 30 28,71

<20%

25 97,5 31 117

>20%

11 7,7 26 30,7

<20%

6 4,62 29 67,76

<20%

14 12,18 28 72,53

<20%

9 6,93 33 79,52

<20%

10 7,7 34 43,12

>20%

15 13,05 32 28,48

>20%

8 5,68 29 75,97

>20%

4 2,84 30 45,44

>20%

6 4,26 27 42,95

>20%

8 5,68 20 20,59

<20%

10 7,7 30 23,1

>20%

5 3,55 29 20,59

<20%

4 2,84 25 17,75

Não houve diferença significativa no número médio de sessões para a

repigmentação (p=0,42), total de sessões (p=0,21), número médio de joules para a

repigmentação (p=0,36) e dose acumulada de joules/cm2 (p=0,43) entre pacientes

com área corporal afetada menor ou maior que 20% (teste de Mann- Whitney).

Em relação à resposta clínica à PUVA, observamos ilhotas de repigmentação

105

(perifolicular) em 100% dos pacientes (figuras 12 e 13). Apenas uma das pacientes

apresentou repigmentação mínima com o tratamento, mas apresentava lesões

predominantes nos membros inferiores, sobre proeminências ósseas. A localização

das lesões influenciou a resposta clínica, sendo maior o grau de repigmentação na

face, região cervical e tronco, e menor nos pés, membros inferiores e genitália

(gráfico 16).

Um evento que merece relato é que 2 pacientes apresentaram lesões novas

no curso do tratamento, ao mesmo tempo em que ocorria repigmentação das lesões

iniciais. Ao final do tratamento, havia mais lesões repigmentadas (em número e

extensão) do que lesões novas.

Gráfico 16. Distribuição das lesões dos pacientes e casos de repigmentação com a terapia PUVA em

cada diferente localização

0 5 10 15 20

Face

Mãos

Tronco

Região cervical

MMSS

MMII

Genitália

Pés

Repigmentações Casos

Algum efeito colateral da PUVA foi notado em 77,3% dos pacientes, em

ordem decrescente de freqüência: eritema acentuado, ressecamento da pele,

náuseas e prurido. Queixas menos freqüentes foram: tonturas, vômitos, insônia,

cefaléia, diarréia, queimaduras, depressão. Apesar disto, os pacientes mantiveram o

tratamento, com ajustes da dose de RUVA e uso de medicações sintomáticas

(antieméticos, fotoproteção intensa, emolientes). Dos 20 pacientes que completaram

o protocolo de tratamento, 18 acharam o resultado ótimo, e 2 , bom ou razoável.

106

5.7. ILUSTRAÇÃO DE CASOS

Figura 12. Padrão de repigmentação folicular em resposta à PUVA.

Figura 13. Padrão de repigmentação folicular na face em resposta à PUVA.

107

Figura 14. Pré e pós-PUVA com bom resultado

Figura 15. Pré e pós-PUVA com resultado satisfatório

108

5.8. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA

PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES, ANTES E

APÓS PUVA

Foi verificado se existe variação significativa na contagem de células da pele

com lesão e sem lesão aparente, antes e depois do tratamento, em 20 pacientes. A

diferença absoluta (delta) de antes para depois do tratamento foi dada pela fórmula:

Diferença absoluta = antes do tratamento – depois do tratamento.

O anexo 6 fornece as tabelas com os dados de média, desvio padrão (DP),

mediana, mínimo e máximo da contagem de células na pele antes do tratamento,

depois do tratamento, a diferença absoluta e o correspondente nível descritivo (p-

valor) para o CD1a (com lesão e sem lesão), CD8 (com e sem lesão), CD3 (com e

sem lesão), CD4 (com e sem lesão) e CLA (com e sem lesão), respectivamente. Os

Gráfico 17 a 26 mostram as análises comparativas.

109

Gráfico 17. Contagem de células CD1a+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo antes e

após PUVA

Gráfico 18. Contagem de células CD1a+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

110

Gráfico 19. Contagem de células CD8+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

Gráfico 20. Contagem de células CD8+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

111

Gráfico 21. Contagem de células CD4+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

Gráfico 22. Contagem de células CD4+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

112

Gráfico 23. Contagem de células CD3+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

Gráfico 24. Contagem de células CD3+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

113

Gráfico 25. Contagem de células CLA+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

Gráfico 26. Contagem de células CLA+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo antes

e após PUVA

114

Houve queda significativa na contagem total de células CD1a+ e CD8+ na

pele total e também separadamente na epiderme e derme, do pré para o pós-

tratamento, tanto no segmento PL como NL dos pacientes.

Houve queda significativa na contagem de células CD4+ na pele total, às

custas da redução do seu número na derme, tanto na pele PL quanto na pele NL, do

pré para o pós-tratamento.

Não houve alteração significativa na contagem de linfócitos T CD3+ na pele

total no segmento PL, do pré para o pós-tratamento, mas houve redução significativa

no seu número na epiderme. Já na pele NL, houve redução significativa de células

CD3+ em todos os setores estudados (epiderme, derme e pele total), do pré para o

pós-tratamento.

O número de células CLA+ não se alterou significativamente nem na

epiderme, nem na derme perilesionais, do pré para o pós-tratamento. Já na pele NL

do vitiligo, houve queda significativa no número de células CLA+ na pele total, às

custas da sua redução na derme.

5.8.1 Ilustrações do efeito PUVA sobre o infiltrado cutâneo

As figuras 16, 17 e 18 mostram as alterações observadas após o tratamento

com PUVA e seu possível efeito sobre o infiltrado celular na pele perilesional e não-

lesional no vitiligo.

115

Figura 16. Células CD1a+ na pele perilesional pré(A) e pós-PUVA(B).

Após o tratamento houve redução significativa do número de células CD1a+ na pele dos pacientes

A B

116

Figura 17. Pele perilesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução importante do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+ (100X)

117

Figura 18. Pele não-lesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução importante do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+ (100X)

A B

118

5.9. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS PÓS-

PUVA NA PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES

COM VITILIGO VERSUS CONTROLES NÃO-TRATADOS

Foi verificado se existe diferença significativa na contagem de células da pele

entre os casos de vitiligo após a PUVA, e controles (sem tratamento). O anexo 6

mostra as tabelas com os dados de média, desvio-padrão (DP), mediana, mínimo e

máximo das contagens de células na pele segundo o grupo (caso e controle) e o

correspondente nível descritivo (p-valor) para o CD1a (com lesão e sem lesão), CD8

(com e sem lesão), CD3 (com e sem lesão), CD4 (com e sem lesão) e CLA (com e

sem lesão), respectivamente.

Os gráficos 27 a 36 mostram as análises que verificam se o efeito PUVA

igualou o número de células na pele dos pacientes ao número de células na pele de

controles, ou se tais contagens foram maiores ou menores.